CLONAJE DE DNA RECOMBINANTE

Los trminos clonar, clonaje, clonacin, derivan de clon palabra que define a un conjunto de
celular derivadas de una nica clula progenitora y por lo tanto poseedoras de idntico
contenido gentico. Clonar un DNA recombinante significa aislar y disponer de un clon de
clulas que sean portadoras de una misma molcula de DNA recombinante.
El clonaje de DNA recombinante abre la puerta a aplicaciones de enorme inters, tales como
el aislamiento y amplificacin de secuencias genticas, el estudio de regiones genmicas
medias y grandes e, incluso de genomas completos, la produccin de protenas y otros
compuestos de alto valor a partir de sistemas celulares heterlogos o la creacin de tipos
celulares y organismos con nuevas actividades.
PANORAMICA GENERAL DE LA TECNOLOGIA DEL CLONAJE DE DNA
Esta transferencia de una molcula de DNA al interior de una clula es la esencia del clonaje
y establece un lmite muy significativo: marca un cambio radical en la metodologa
experimental (de in vitro a in vivo) y define el acceso a un nuevo bloque de mtodos que se
mueve alrededor de la clula como sistema receptor de un DNA exgeno.
Despus de esta transferencia, el DNA aparece localizado en el interior de una clula, que
puede ser del mismo tipo que aquella de donde se extrajo o no, y donde puede ser sensible
a cualquiera de los muchos sistemas moleculares presentes.
El objetivo fundamental del clonaje es que el DNA extrao se mantenga en el sistema celular
receptor, lo cual implica que conserve su integridad, es decir que no sea degradado por
enzimas celulares, y que d lugar a copias que alcancen a todas las celular del cultivo, es
decir que se replique y se reparta o propague adecuadamente.
El segundo objetivo: la clula hospedadora producir los productos codificados en el DNA
extrao que pueden ser valiosos en s mismos o pueden ser la causa de comportamientos
especiales de la clula receptora.
El xito de los mtodos d clonaje depende bsicamente de las relaciones que se establezcan
entre la clula receptora y la molcula construida in vitro y transferida a su interior, ya que
marcan el desarrollo de los procesos posteriores, tanto del mantenimiento estable del
recombinante en el cultivo como de su posible expresin.
As est experimentacin se desarrolla alrededor de unos elementos principales que pueden
ser considerados como protagonistas del proceso, y que son:

Adems, destacan dos etapas particulares dentro de la experimentacin general del clonaje:

EL DNA PASAJERO
En ocasiones no se conoce detalle alguno de su estructura y por ello nos e le exige una
participacin activa en el proceso; en otros casos se utiliza como soporte de una informacin
para la sntesis de un producto proteico.se le conoce como DNA pasajero, extrao o forneo,
recordando su ubicacin en el interior de un recombinante.
El ADN se extrae de su fuente biolgica natural, una vez purificado y, en su caso,
caracterizado y manipulado, se une al DNA vector para formar el DNA recombinante y ser
clonado. Tras su clonaje y amplificacin, puede recuperarse del cultivo y separarse del vector
para su estudio y anlisis.
La amplia metodologa actual permite incorporar a este esquema cualquier tipo de DNA
como pasajero del clonaje, as:
EL DNA VECTOR
Es el principal responsable del experimento al depender de le tanto la supervivencia del
recombinante en el cultivo transformado como la expresin del pasajero en sus clulas.
Se trata de una molcula de DNA encargada de recibir al DNA pasajero y acompaarle en su
transferencia al interior celular; all es responsable de que el recombinante replique y de que
sus copias se repartan correctamente entre las clulas descendientes de la primera.
El DNA vector transporta distintos tipos de marcadores fenotpicos para la seleccin de
clulas as como diversas seales para expresin del pasajero. Los vectores son por ello
construcciones complejas, molculas quimricas formadas a partir de la unin de regiones
de muy diferentes procedencias, naturales o sintticas y colocadas en un orden y sentido
especficos.
TIPOS DE DNA VECTOR
En muchos casos, un vector es especfico para un determinado tipo de clula, en otros
el vector es activo en tipos celulares no muy diferentes, se dice que presenta un rango
de hospedador amplio.

Diversas levaduras
En gran nmeros de plantas
Distintos tipos de clulas o en embriones animales
Existen vectores mixtos, construidos para que acten en ms de un tipo de clula.
Finalmente, deben distinguirse dos tipos de vectores segn su capacidad de actuacin
sobre el pasajero que transportan:

EL DNA RECOMBINANTE
Es la molcula que resulta de la unin del DNA vector y el DNA pasajero. Su amplificacin,
anlisis y expresin para por su transferencia al interior de una clula hospedadora, es decir
su clonaje. Una vez clonado, puede recuperarse del cultivo y conservarse como DNA puro.
La sntesis del DNA recombinante se basa en la unin del DNA vector y el DNA pasajero
mediante la accin de la DNA- ligasa
CELULA HOSPEDADORA
Ha de recibir DNA recombinante y colaborar a su replicacin, se utiliza como un laboratorio
capaz de realizar procesos enzimticos muy diferentes. Los experimentos pioneros utilizaron
a E. COLI como clula hospedadora. Sin embargo esta bacteria tiene sus limitaciones, el
trabajo con pasajeros eucariotas puede demandar en ocasiones sistemas celulares tambin
eucariotas, las posibilidades de modificacin gentica controlada que derivan de esta
tecnologa han desviado la atencin hacia otros muchos organismos para su utilizacin como
receptores del recombinante. Hoy puede decirse que cualquier tipo celular puede ser usado
como hospedador.
TRANSFERENCIA DE DNA A LA CELULA HOSPEDADORA
Proceso conocido genricamente como TRANSFORMACION (en bacterias) O TRANSFECCION
(en eucariotas), se consigue por diferentes procedimientos.
La eleccin del procedimiento ms adecuado depende fundamentalmente de la naturaleza
de la clula receptora, as como de la recombinante que se transfiere.
ANALISIS DE CLONES
Tras la etapa de transferencia de DNA, procede analizar el resultado de ese proceso a fin de
aislar el clon o clones que persiguen. Este analisis se elaboran en diferentes niveles.

La seleccin de aquellos clones que han aceptado el DNA exgeno.

La deteccin de clones con DNA recombiante.
La identificacion de un clon particular a partir de una biblioteca de clones.
SELECCIN DE TRANSFORMANTES: Los procedimientos de transformacin de DNA
donde una eficacia muy variable en muchos casos el rendimiento es tan bajo que la
mayoria de las celulas sometidas al proceso no llegnaa captar ninguna molecula de DNA,
las celulas transformadas son minoria y resultan imposible localizarlas y aislarlas del
resto.
Este problema se ha resulto utilizando marcadores genticos que permiten una
seleccin fenotipica de las clulas transformadas o transformantes.
DETECCIN DE RECOMBINANTES: La identificacion y seleccin de celulas transformadas
se onsigue utilizando un marcador incorporado a la molecula del DNA vector.pero la
sintesis del recombianante, catalizada por la DNA- ligasa, conduce a la formacion de una
serie de subrpoductos entre los que se encuentra el vecotr reconstruido,la
 transformacion celular se lleva a cabo con la mezcla que resulta de la reaccion de ligasa,
por lo que se conseguiran celulas transformadas por la molecula recombinante y
tambien celulas transformadas por el vector, y ambos tipos de celulas rean
seleccionables al contener en su interior el gen marcador. Interesa poder distinguir entre
ambos tipos de transformantes y poder detectar entre ellos aquellos que han sido
transformados por el DNA reacombinante. Una forma de identificar recombinantes se
basa en la inactivacion de un marcador por la insercion del pasajero, ademas siempre
existe la alternativa larga y costosa de aislar el DNA presente en diferentes clones y
analizarlo por restriccion para identificar la presencia del recombinante buscado.
LA EXPRESIN DE GENES CLONADOS: Esto requiere de la participacin de seales
especificas que promueven el proceso, que son incorporados al DNA vector dando lugar
a los denominados vectores de expresin. Estas seales han de ser reconocidas por la
maquinaria de expresin de la clula hospedadora lo que plantea la necesidad de utilizar
seales especificas para esa clula. La expresin de una secuencia extraa en la clula
hospedadora puede ser inconveniente, nociva e incluso letal. Esto obliga a tener muy en
cuenta los sistemas de regulacin de la expresin gentica que pueden, o deben
intervenir en el proceso.
LOGROS Y APLICACIONES GENERALES DE LA TECNOLOGA DEL CLONAJE DE DNA
El clonaje de DNA se ha impuesto como tecnologa esencial e insustituible para el desarrollo
de la ciencia bsica y aplicada. A continuacin los resultados ms significativos y
transcendentes de esta metodologa.

El aislamiento de un fragmento puro de DNA a partir del clonaje de un pasajero mixto.

La amplificacion de secuencias puras clonadas.
La expresin de secuencias en sistemas celulares heterlogos.
Las aplicaciones derivadas de ellos son muy variadas , entre las reas ms beneficiadas por
esta metodologa se cuentan: