AISLAMIENTO DE Lysinibacillus sphaericus (ORDEN: BACILLALES) PARA SU USO

COMO CONTROLADOR BIOLGICO

Denia Milla Salinas & Fabricio Cspedes Pasin
1Laboratorio de Microbiologa. Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV). Facultad de
Ciencias Biolgicas, Lima, Per.

INTRODUCCIN
La mayora de personas padecen de infecciones transmitidas por los artrpodos vectores. Entre ellos,
los culcidos son sin duda los de mayor importancia higinico-sanitaria porque constituyen uno de los
problemas prioritarios de salud en casi todas las regiones tropicales y subtropicales (Turell et al. 2006,
Ngoagouni et al. 2015). Sin embargo, el principal problema de salud en materia de vectores, lo es sin
lugar a duda, la malaria; se estima a escala mundial 500 millones de casos reportados y tres millones
de muertes cada ao (un milln son nios menores de cinco aos). Se considera la enfermedad ms
extendida, siendo endmica en unos 100 pases en va de desarrollo (Dia et al. 2003).
En el Per una de las enfermedades con mayor tasa de incidencia de trasmisin por vectores es el
dengue. Se considera como la ms importante de las enfermedades virales transmitidas por mosquitos
a nivel planetario (Beserra et al. 2006, Luciano et al. 2007, Arenas & Carvajal 2012) y se estima que
cada ao se presentan entre 50-100 mil de casos de Dengue y de 250 000 a 500 000 casos de Dengue
Hemorrgico dependiendo de la actividad epidmica (Guzmn et al. 1999, Guzmn & Kour 2002).
Los estudios con bacterias con actividad insecticida contra larvas de mosquitos fueron reportados en
la dcada de 1960, muchos han sido descritos, con el ser ms potente aislado de Lysinibacillus
sphaericus (antes y mejor conocido como Bacillus sphaericus), es una bacteria Gram positiva del
suelo, mesfila, esporulante aerobia, ubicua, cosmopolita, con un esporangio terminal y una espora
esfrica, posee propiedades insecticidas.
Este organismo es muy importante, ya que puede ser utilizado como una toxina insecticida similar a
la producida por Bacillus thuringiensis, que controla el crecimiento de mosquitos. Algunos estudios
mencionan que esta bacteria invade las larvas a travs del tubo digestivo y es capaz de producir
septicemias fatales.
El objetivo de la presente investigacin es el aislamiento de Lysinibacillus sphaericus como controlador
biolgico de enfermedades transmitidas por insectos vectores.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El principal problema de salud es el calentamiento del planeta y la intensificacin de los fenmenos
meteorolgicos extremos y climatolgicos como los huaicos que ha dejado este ao muchas provincias
afectadas con enfermedades por transmisores vectores, lo cual es alarmante ya que su incidencia va
en aumento y se ha registrado en la mayora de las provincias del Per.

JUSTIFICACIN E IMPORTANCIA
Una de las preocupaciones ambientales sobre el uso de insecticidas qumicos sintticos es la
evolucin de la resistencia de los vectores a estos. Por ello su importancia para el desarrollo de la
bacteria Lysinibacillus sphaericus como agente de control alternativo y as poder erradicar de manera
eficaz y reducir la poblacin de especies de vectores de enfermedades que hoy en da se est
suscitando, as como los mosquitos Anopheles, Culex y Aedes que transmiten enfermedades como la
malaria, el dengue, el chikungunya, la fiebre amarilla entre otras enfermedades trasmitidas por
vectores. As mismo esta bacteria tiene la capacidad de matar las larvas de mosquitos presentes en
el agua que es rica en materia orgnica. A su vez sta aplicacin podra dar lugar a nuevos productos
insecticidas potentes y compatibles con el medio ambiente para controlar una variedad de plagas y
vectores de enfermedades de insectos.

MARCO TERICO (ANTECEDENTES)

El aumento en la incidencia de enfermedades de inters en salud pblica como malaria, dengue y
fiebre amarilla asociado a los efectos secundarios del uso de plaguicidas qumicos y la resistencia
generada, ha impulsado a la bsqueda de nuevas alternativas para la erradicacin de sus vectores.
Una opcin viable como bacteria entomopatgena es Lysinibacillus sphaericus, descrito por primera
vez en el ao de 1904 por Neide y Meyer (Colin R. Harwood, Bacillus: taxonomy. Biotechnology
Handbooks: New York.1989), quienes descubrieron una bacteria que por sus caractersticas de
esporulacin la llamaron Bacillus sphaericus. En 1965, investigadores de California, a partir de una
larva enferma del mosquito Culiseta incidens, aislaron la primera cepa de esta bacteria (Organizacin
Mundial de la Salud (OMS)). Desde entonces en diferentes partes del mundo se han aislado varias
cepas de esta bacteria que son patgenas para las larvas de mosquitos, encontrando la cepa 1593
aislada de larvas enfermas de Culex quinquefasiatus recogidas en drenajes contaminados en
Rawasari, Jakarta, Indonesia, en junio de 1974. Actualmente, la cepa que se utiliza con mayor
aceptacin en Centro Amrica y en el mundo, es Bacillus sphaericus 2362, la cual fue aislada por J.
Weiser en Nigeria en la dcada de 1980 (Gua para la implementacin y demostracin de alternativas
sostenibles de control integrado de la malaria en Mxico Y Amrica Central. ed. 1. 2004).
MATERIALES Y MTODOS
Para la obtencin de las cepas se realizaron muestreos en campo obteniendo las bacterias de larvas
moribundas o muertas de mosquitos, de aguas estancadas. Se hicieron diluciones decimales seriadas
hasta 10-6 que se calentaron a 80C durante 30 minutos y se sembraron 0.1 mL por diseminacin en
medio Agar Triptona Soya (TSA).
De las placas de TSA con crecimiento se tomaron muestras de las colonias con caractersticas
diferentes y se pasaron a placas por agotamiento para su purificacin. Se le realiz una observacin
microscpica con tincin de Gram para comprobar la pureza y determinar las caractersticas
micromorfolgicas y tintoriales de los mismos, as como la presencia de esporas. Los aislados puros
se conservaron en tubos de agar nutriente y glicerol al 15 %.
Para determinar su actividad enzimtica, se trabajar con el siguiente diseo experimental: Se
utilizarn larvas de mosquitos del gnero Culex o Aedes aegypti en estados II, III y IV. En una placa
de Petri conteniendo 20 ml de agua se agregaron 20 larvas de un mismo estado por ensayo; a ella se
agrega 20-50 l del agente larvicida para ensayar (esporas-cristal). Se incub a temperatura ambiente
(28 C) y a las 24 h se realiz el recuento de larvas vivas. Todos los experimentos se realizarn por
duplicado y con el respectivo control sin tratamiento. Se calcular tanto el porcentaje de mortalidad
como la LC50 (Concentracin Letal 50: que equivale a la cantidad de la sustancia utilizada como
agente txico, esporas-cristal, necesaria para obtener un 50 % de mortandad en los organismos
utilizados como blanco de la toxina).

OBJETIVOS
Al conocer la capacidad biolarvicida altamente potencial y eficaz para el control biolgico de Anopheles
spp., Aedes spp. y Culex spp., se busca contribuir al manejo de enfermedades de inters en salud
pblica como malaria, fiebre amarilla y dengue, ya que al ser estas cepas nativas ofrecen mejores
condiciones de adaptacin y eficacia.
Adems de realizar a las cepas nativas de Lysinibacillus sphaericus su identificacin microscpica,
macroscpica y bioqumica, y su caracterizacin molecular para identificar los genes que codifican
para sus protenas txicas, en este caso la protena larvicida (toxina binaria Bin A y Bin B), para ratificar
el poder txico y proporcionar un aporte eficaz en los programas de control epidemiolgico de vectores,
mediante el biocontrol, el cual garantiza mantener el equilibrio en el medio ambiente, al no producir
efectos adversos en la naturaleza ni en el humano; as como el aporte a nivel cientfico que contribuye
con campos de investigacin en nuestro pas.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Arenas, V.R. & Carvajal, P.L. 2012. Influencia de los cambios climticos en la definicin del
sexo en el Aedes aegypti y su implicacin en las epidemias de dengue. Revista Facultad de
Salud, 4: 11-24.
2. Beserra, E.B.; de Castro, F.P.Jr.; dos Santos, J.W.; Santos, T.S. & Fernandes, C.R. 2006.
Biology and thermal exigency of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) from four bioclimatic
localities of Paraiba. Neotropical Entomology, 35: 853-860.
3. Dia, I.; Diop, T.; Rakotoarivony, I.; Kengne, P. & Fontenille, D. 2003. Bionomic of
Anopheles gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. funestus Giles and An. nili (Theobald)
(Diptera: Culicidae) and Transmission of Plasmodium falciparum in a Sudano-Guinean Zone
(Ngari, Senegal). Journal of Medical Entomology, 40: 279-283
4. Luciano, P.G.C.; Ricardo, J.P.; Ferreira, A.C.; Francisco, J.; Rodrigo, L.F. & Jos, L.
2007. Efficacy of fish as predators of Aedes aegypti larvae under laboratory conditions. Revista
de Sade Pblica, 41: Disponible en: [http://www.scielosp.org/pdf/rsp/v41n4 /en_5930.pdf]
[Consulta 25 de marzo 2008].
5. Guzmn, M.G. & Kour, G. 2002. Dengue: an update. The Lancet Infectious Diseases, 2:33-
42.
6. Guzmn, M.G.; Kour, G.F. & Bravo, J. 1999. La emergencia de la fiebre hemorrgica del
dengue en las Amricas. Reemergencia del dengue. Revista Cubana de Medicina Tropical,
51: 5-13.
7. Turell, M.J.; Dohm, D.J.; Fernndez, R.; Calampa, C. & O'Guinn, M.L. 2006. Vector
competence of Peruvian mosquitoes (Diptera: Culicidae) for a subtype IIIC virus in the
Venezuelan equine encephalomyelitis complex isolated from mosquitoes captured in Peru.
Journal of the American Mosquito Control Association, 22:70-75.
8. Ngoagouni, C.; Kamgang, B.; Nakoun, E.; Paupy, C. & Kazanji, M. 2015. Invasion of
Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) into central Africa: what consequences for emerging
diseases? Parasites & Vectors, 8:191.
9. Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Lucha Biolgica Contra los Vectores de
Enfermedades. Sexto Informe del Comit de Expertos de la OMS en Biologa de los Vectores
y Lucha Antivectorial. (1982). Serie de Informes Tcnicos No. 679;39.
10. Charles J, Delcluse A, Nielsen-LeRoux. Entomopathogenic bacteria: from laboratory to
field application. ed. Kluwer Academic Publisher. 2000 p. 253273.
11. Baumann L, Broadwell AH, Baumann P. Sequence analysis of the mosquitocidal toxin genes
encoding 51.4- and 41.9-kilodalton proteins from Bacillus sphaericus 2362 and 2297. J
Bacteriol. 1988; 70:2045-2050.
12. Pei G, Oliveira CM, Yuan Z, Nielsen-LeRoux C, Silva-Filha MH, Yan J, Regis L.
Development of Culex quinquefasciatus resistance to Bacillus sphaericus strain IAB59 needs
long term selection pressure. Biological Control. 2007; 42:155160.
13. Rojas J, Mazzarri M, Sojo M, Ysrael G. Evaluacin de la efectividad de Bacillus sphaericus
cepa 2362 sobre larvas de Anopheles nueztovari. Invest. cln; 2001; 42:131-146.
14. Maldonado-Blanco M. Control de Aedes aegypti con microorganismos. RESPYN. 2005;6.
15. Reinert DJ, Carpusca I, Aktories K, Schulz GE. Structure of the Mosquitocidal Toxin from
Bacillus sphaericus. J Mol Biol. 2006; 357:1226-1236.
16. SilvaFilha, MH - Peixoto, CA Immunocytochemical localization of the Bacillus sphaericus
binary toxin components in Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) larvae midgut. 2003;
77:138146.