Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

1.-Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz Erlenmeyer
que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua
peptonada al 0.1%.
2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora estril o
pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la
licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal. Esta
es la dilucin primaria.
3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo
que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir
esta operacin tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe utilizar una
pipeta estril para cada dilucin
4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de
la muestra, utilizando una pipeta estril.
5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa
dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y mantenerlos a 45C.
6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar,
1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en membrana, o bien
esterilizar la solucin a 121C1C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo
conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45C se le deber adicionar 0.3
mL del cido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaucin de que no toque la
muestra antes de agregar el medio de cultivo.
7. Despus de la acidificacin, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir
el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potencimetro.
8. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa
acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45C. El
tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el momento en que es
vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.
9. Homogeneizar las cajas y tener un control incubar a 25C
12. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus
de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna
de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien
aisladas, considerar la cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso las de 3 das. En
este caso, se informa el perodo de incubacin en los resultados de los anlisis. 13.
Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodn,
para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos que se hayan
desarrollado.
14. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras
obtenidas.
15. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das de
incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente). 16. Considerar las cuentas de placas
con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de
la dilucin. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g
o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 251C
durante 5 das. 18. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas
observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.
19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difcil
contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 das de
incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar el periodo de incubacin de
3 4 das, en los resultados del anlisis

Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos.

Aislamiento selectivo.
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estril.
2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estril.
3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estril al 0.1% o solucin amortiguadora de fosfatos
0.1M de pH 7.2. 4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos
en licuadora a velocidad mnima.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el nmero de diluciones est en funcin de la
procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo
diluyente
. 6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1 , 10-2 , 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird
Parker.
7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio
estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo de inoculacin por
extensin en superficie). 8. Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea
absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 9. Invertir las placas e incubar a
35 1 C. durante 45 a 48 h. 10.Despus de incubar, observar las colonias caractersticas de
este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). stas se presentan como: colonias negras,
circulares, brillantes, convexas, lisas con dimetro de 1 a 2 mm, muestran una zona circular
opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

Recuperacin de la cepa.
1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias tpicas de S. aureus, si no es
posible, seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra ms diluidas, no
obstante que contengan ms de 150 colonias.
2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias tpicas, tambin pueden ser utilizadas y al
reportar se deber agregar la nota de valor estimado. 3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el
nmero de colonias a evaluar, tomando en cuenta el nmero de colonias tpicas de S. aureus
obtenidas en el agar Baird-Parker: As mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas
cuantitativas y cualitativas; dentro de estas ltimas estn comprendidas la coagulasa y la
termonucleasa. 4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son
caractersticas de este microorganismo, utilizando asa bacteriolgica recta estril, en caldo
infusin cerebro corazn. 5. Incubar a 35 1 C durante 24 h.
Mtodo del Dilucin y vertido en placa
En condiciones aspticas, realizar tres diluciones decimales a partir de la suspensin: tomar 1.0
mL e inocular el tubo 10-1 ; subir y bajar la suspensin, tres veces, con la misma pipeta para
homogenizar la dilucin. Repetir la operacin hasta concluir con la dilucin 10-3 5. A partir de la
dilucin 10 . -3 , agitar y tomar 1.0 mL y depositar en una caja Petri vaca (por duplicado).
Repetir con la dilucin 10-2 y 10-1 6. Verter, en cada caja el medio de agar cuenta estndar
previamente fundido (aproximadamente 20 mL) y a una temperatura de 45 C. .
. Homogeneizar cuidadosamente; para ello mezclar el inculo con el medio, colocando la caja
sobre la mesa y girar 5 veces en el sentido de las manecillas del reloj, 5 veces en sentido
inverso, 5 veces haca adelante atrs y 5 en sentido horizontal. 8. Dejar solidificar e invertir las
cajas. 9. La caja Petri etiquetada como Control no es inoculada con la muestra. 10. Incubar a
37 C durante 24 horas. 11.Al trmino de la incubacin, hacer el recuento de las Unidades
Formadoras de Colonia (UFC)/mL. Las colonias pueden encontrarse sobre, inmersas y debajo del
medio de cultivo.

Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y

Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple (nmero ms
probable o NMP)

.2.1 Prueba presuntiva

9.2.1.1 Inoculacin. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentracin. Usar una pipeta estril para
tranferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es lquida o 10 ml de la dilucin primaria inicial, en el caso de otros productos.

9.2.1.1.1 Tomar tres tubos de concentracin sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una pipeta estril para
transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra si es lquida o 1 ml de la dilucin primaria en el caso de otros
productos.

Preparar 3 series de 5 tubos con caldo lactosado [2] y [1] 6 de medio y 3muestra ml 8
mLmedio 0.8 y 0.08
Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales. Transferir de 2 a 3 asadas de cada
tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a tubos con caldo EC. Agitar suavemente
los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua
con circulacin durante 24 a 48 h. Registrar como positivos todos los tubos en donde se
observe crecimiento y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.

Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales Transferir de 2 a 3 asadas de cada

tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a tubos que contiene caldo de bilis verde
brillante (brila), con campana de Durham. Agitar suavemente los tubos para su
homogeneizacin. Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.. Registrar como positivos aquellos
tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de
incubacin de 24 a 48 h.

Mtodo para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos.

El siguiente mtodo se basa en el anlisis de 25.0 g de la muestra, que se considera como una
unidad analtica, en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse
siempre que se mantenga la misma proporcin de 1:9 en el medio de preenriquecimiento.
1. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de
preenriquecimiento y agitar suavemente. 2. Transferir 1.0 mL del cultivo de
preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1 mL, estril) a un tubo con 10.0 mL de
cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento: Caldo tetrationato (antes de su
uso, deber activarse aadiendo al medio base 0.2 mL de solucin yodo-yoduro de potasio
y 0.1 mL de solucin de verde brillante al 0.1 %) Caldo selenito cistina
2. . Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo
Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados
debern incubarse los medios de enriquecimiento a 42C por el mismo periodo 3.
 Aislamiento diferencial. NOTA La metodologa descrita en esta seccin deber realizarse
para cada uno de los caldos de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los
cultivos desarrollados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo
VassiliadisRappaport. 1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado.
2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiolgica estril y sembrar en
estra por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes
medios selectivos: a) Agar XLD b) Agar VB c) Agar HK d) Agar SB e) Agar SS f) Agar Mac
Conkey 3. Incubar las cajas ya sembradas en posicin invertida a 35 2 C durante 24 2 h. 4.
Observar las caractersticas macroscpicas de las colonias en los medios slidos
selectivos. 5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de
acuerdo con las caractersticas especficas de desarrollo en cada uno de los medios
(Consultar el Cuadro 1). 6. Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C, las placas con medios
selectivos por si es necesario tomar ms colonias. 7. Realizar una tincin de Gram a las
colonias sospechosas. 8. Registrar las caractersticas morfolgicas tanto macroscpicas
como microscpicas; anotando la forma de la colonia, su color, color del medio
circundante, morfologa al Gram, etc. 9. Realizar una purificacin de las colonias
seleccionadas, sembrando nuevamente en estra por agotamiento en cuadrantes en cajas
de Petri conteniendo un medio idntico del que se tom la colonia. 4. Pruebas bioqumicas
preliminares
3. Pruebas bioqumicas KIA y LIA