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1
Departamento de Agronoma. E.T.S.I.A.M. Universidad de Crdoba. Avda. Menndez Pidal s/n.
14080. Crdoba. E-mail: ag2lemol@uco.es
2
Departamento de Produccin Animal. E.T.S.I.A.M. Universidad de Crdoba. Avda. Menndez Pidal s/n.
14080. Crdoba.
RESUMEN
KEY-WORDS: Fat content Fatty acids Moisture NIRS
Olea europaea L. Plant breeding.
Anlisis de aceituna intacta mediante espectroscopia
en el infrarrojo cercano (NIRS): una herramienta de utili-
dad en programas de mejora de olivo.
sas (Panford y de Man, 1990; Pazdernik et al., 1997; origen (Catalua, Toscana y Jan) y pertenecientes
Prez-Vich et al., 1998; Velasco y Becker, 1998). al grupo de mayor rendimiento graso (Rallo, 1995).
En el sector del aceite de oliva, la tecnologa En total se recogieron 287 muestras, cada una pro-
NIRS tambin se ha aplicado al anlisis del conteni- cedente de un genotipo.
do graso y humedad del orujo, subproducto genera- Los frutos as recogidos se deshuesaron y se
do en la obtencin de aceite, para controlar el grado sec la pulpa en estufa a 105oC durante 42 horas,
de agotamiento del mismo en los sistemas de extrac- tiempo que se considera suficiente para asegurar la
cin de dos fases (Garca et al., 1996; Hermoso et al., deshidratacin de cualquier tipo de aceituna, tritura-
1999). Ms recientemente, Jimnez et al. (2000) han da o entera (del Ro y Romero, 1999). As se deter-
aplicado la tecnologa NIRS para la determinacin del min la humedad de la pulpa y el porcentaje de
contenido graso y humedad en aceituna, a partir de aceite en pulpa seca mediante Resonancia Magnti-
muestras molidas que proporcionaban un granulado ca Nuclear (RMN).
fino y homogneo. Este es el nico trabajo relativo al Para determinar la composicin de cidos grasos
anlisis de aceitunas que se ha encontrado en la lite- se utiliz el procedimiento desarrollado por Garcs y
ratura cientfica NIRS consultada. Mancha (1993). Dicho mtodo permite realizar, a
La potencialidad del anlisis NIRS hacen del mis- partir de muestras de pulpa de aproximadamente 50
mo un posible instrumento de gran utilidad en pro- mg, la digestin de tejido fresco, transmetilacin de
gramas de mejora gentica, siendo sta una de las los lpidos y extraccin de los steres metlicos de
aplicaciones que ha tenido la tecnologa NIRS en los cidos grasos en una sola etapa. Se prepararon
agricultura (Batten, 1998). La informacin cientfica 10 muestras por genotipo que posteriormente se
disponible seala que la precisin de los modelos analizaron por cromatografa gaseosa.
predictivos NIRS depende en gran medida de las ca-
ractersticas del conjunto de muestras usadas para 2.2. Anlisis espectroscpico NIR
generar la relacin matemtica entre los datos es-
pectroscpicos y los valores de referencia. Dichas Todas las muestras se analizaron usando un ins-
caractersticas hacen referencia entre otras al nme- trumento DA-7000 Diode Array VIS/NIR Spectropho-
ro, intervalo de variacin y representatividad de las tometer (Perten Instruments). El DA-7000 es un
muestras en la poblacin futura sobre la que aplicar espectrofotmetro de matrices de diodos de canal
la tecnologa. En este sentido, los genotipos de las paralelo que utiliza dos matrices para cubrir simult-
progenies de los cruzamientos suelen representar neamente las longitudes de onda de 400 a 950 y de
un muestreo de amplio intervalo de variabilidad, por 950 a 1700 nm, proporcionando por tanto medidas
lo que constituyen un conjunto particularmente apro- simultneas NIR/VIS en el infrarrojo cercano (NIR) y
piado para la necesaria calibracin. Recprocamen- en el visible (VIS). Utiliza detectores de silicio para la
te, una vez establecidas las ecuaciones de regin visible (400-950 nm) e InGaAs (Indio-Galio-
calibracin y la capacidad predictiva del mtodo para Arsnico) para la regin NIR (950-1700 nm), con
los diferentes componentes estudiados, las caracte- una resolucin espectral de 5 nm, por lo que en total
rsticas reseadas del NIRS, en particular su carc- registra 261 valores de reflectancia. Aproximada-
ter no destructivo y versatilidad para determinar los mente 500 g de aceitunas de cada genotipo se man-
componentes del producto, aconsejan su uso para la tuvieron congeladas a -20oC hasta su utilizacin.
evaluacin de un elevado nmero de muestras, lo
que suele ser un requerimiento caracterstico de los 2.3. Mtodos quimiomtricos utilizados
programas de mejora gentica.
El objetivo de este trabajo es evaluar el potencial Las calibraciones NIRS se desarrollaron utilizan-
de la tecnologa NIRS para su incorporacin al an- do el programa quimiomtrico NIRCAL, software re-
lisis de aceitunas intactas y obtener las ecuaciones comendado para el tratamiento quimiomtrico de
de calibracin NIRS para el anlisis de algunas ca- datos obtenidos con el equipo PERTEN DA-7000.
ractersticas de inters. Para desarrollar las ecuaciones de calibracin se uti-
liz la regresin PLS (Partial Least Squares), que re-
2. MATERIAL Y METODOS duce los datos espectrales a una serie de variables
fundamentales (trminos de regresin o factores
2.1. Muestras de aceitunas y mtodos de PLS) que tienen en cuenta tanto los valores espec-
anlisis de referencia trales como los valores de referencia. Dado que el
software NIRCAL no permite validacin cruzada, el
Para la realizacin de este trabajo se han utiliza- colectivo de muestras se dividi en dos grupos, uno
do muestras de aceitunas recogidas en plantas de de calibracin (al que se destinaron el 70% de las
semilla procedentes de cruzamientos recprocos en- muestras) y otro de validacin (con el 30% restante).
tre las variedades Arbequina, Frantoio y Picual, No se ha utilizado ningn mtodo de deteccin e in-
variedades productivas en sus respectivas reas de terpretacin de datos aberrantes (outliers) y, por tan-
Vol. 54. Fasc. 1 (2003) 43
Tabla I
Estadsticos en calibracin y validacin para los componentes del rendimiento graso
Aceite pulpa seca (%) 0.92 1.67 0.83 2.20 15.4 2.5
Predic c in NIRS
Dat os referenc ia
Los mejores resultados para los pretratamientos
90
ensayados, tambin se obtuvieron seleccionando el
rango de longitudes de onda entre 900-1500 nm y
Hu m e da d e n pu lp a (%)
80
aplicando la segunda derivada. Al igual que para los
70 componentes del rendimiento graso, ningn otro de
60 los pretratamientos probados mejor los resultados.
En la Tabla II se resumen los principales resulta-
50
dos obtenidos en la calibracin ptima para la com-
40
posicin de cidos grasos. Las ecuaciones de mayor
1 11 21 31 41 51 61 71
G e n otip os (e n ord e n cr e cie n te )
precisin se obtienen para el cido oleico y linoleico
con valores de R2 y r2 mayores o muy prximos a 0.8
y valores de RER mayores o muy prximos a 10. En
Predic c in NIRS
este caso los valores de RPD (relacin entre la des-
Dat os referenc ia viacin tpica de los datos de referencia del colectivo
90 de prediccin y el error tpico de prediccin) no al-
Ace ite e n p u lp a se ca (%)
80
canzaron el valor mnimo de 3 sealado como pti-
mo en la bibliografa (Williams y Sobering, 1996), si
70
bien es de sealar que este lmite fue establecido
60 fundamentalmente para productos bajos en hume-
50
dad, analizados en forma molida y con objetivos dife-
rentes a los deseados en nuestro caso. Para el resto
40
1 11 21 31 41 51 61 71
de cidos grasos, las ecuaciones obtenidas fueron
G e n otip os (e n ord e n cr e cie n te )
adecuadas para el cido palmtico (el otro cido gra-
so mayoritario en aceite de oliva) con valores de r2
Figura 2 de 0.58 y de baja precisin para los cidos palmito-
Valores predichos (NIRS) y valores de referencia para la leico y esterico.
humedad de la pulpa y el contenido de aceite en pulpa seca La representacin grfica de los resultados obte-
para cada uno de los genotipos del colectivo de validacin.
nidos en el colectivo de validacin para los cidos
oleico y linoleico (Figura 4) indica que las mayores
sultando ambos colectivos muy similares para los diferencias entre los datos de referencia (REF) y los
distintos cidos grasos evaluados. Los mayores ran- valores predichos (NIRS) se observan para valores
gos de variacin se tienen para el cido oleico y lino- bajos de cido oleico y altos de linoleico. Dichos va-
leico, siendo menores para el resto de cidos grasos lores corresponden a las mismas muestras (genoti-
analizados (Figura 3). Al igual que para la humedad pos) dada la alta correlacin existente entre dichos
o el contenido de aceite de la pulpa, el programa de cidos grasos. No obstante, los valores medios fue-
mejora proporciona genotipos con amplios intervalos ron prcticamente idnticos en ambos colectivos
de variacin en su composicin acdica, por lo que (65.58 REF vs 65.56 NIRS para el contenido de cido
son muy adecuados para las calibraciones NIRS. oleico y 12.00 en ambos colectivos para el contenido
de cido linoleico).
Tabla II
Estadsticos de calibracin y validacin para los cidos grasos analizados
C a lib ra c i n V a lid a c i n
25 20
Frec uenc ia (% )
Frec uenc ia (% )
20
15
15
10
10
5 5
0 0
8 10 12 14 16 18 20 8 10 12 14 16 18 20
P almtic o (% ) P almtic o (% )
C a lib ra c i n V a lid a c i n
30 30
Frec uenc ia (% )
Frec uenc ia (% )
25
20 20
15
10 10
5
0 0
0 1.5 3 4.5 6 7.5 9 0 1.5 3 4.5 6 7.5 9
P almitole ico (% ) P almitole ico (% )
C a lib ra c i n V a lid a c i n
50 60
Frec uenc ia (% )
Frec uenc ia (% )
40 50
40
30
30
20
20
10 10
0 0
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
E ste rico (% ) E ste rico (% )
C a lib ra c i n V a lid a c i n
20 25
Frec uenc ia (% )
Frec uenc ia (% )
15 20
15
10
10
5 5
0 0
42 48 54 60 66 72 78 84 42 48 54 60 66 72 78 84
O le ico (% ) O le ico (% )
C a lib ra c i n V a lid a c i n
15 15
Frec uenc ia (% )
Frec uenc ia (% )
10 10
5 5
0 0
0 4 8 12 16 20 24 28 0 4 8 12 16 20 24 28
Linole ico (% ) Linole ico (% )
Figura 3
Histogramas de variabilidad para los diferentes cidos grasos analizados en los colectivos de calibracin y de validacin.
20
lores similares para la determinacin del contenido
15
de aceite a partir de fruto intacto (Misra et al., 2000).
10
En cuanto a la composicin en cidos grasos, los
resultados obtenidos indican una alta precisin en
5
las calibraciones para la composicin de los cidos
0
1 11 21 31 41 51 61 71 81
oleico y linoleico y adecuada para el palmtico. Para
G e n oti po s (e n o rde n cre ci e n te )
los cidos palmitoleico y esterico se obtuvo baja
precisin, probablemente debido al menor rango de
Figura 4 variabilidad disponible para estos cidos grasos, la
Valores predichos (NIRS) y valores de referencia para los inadecuada cobertura de dicho rango (Figura 3) y los
cidos oleico y linoleico para cada uno de los genotipos mayores errores del mtodo de referencia para es-
del colectivo de validacin.
tos cidos grasos. La experiencia en desarrollo de
calibraciones NIRS en diferentes productos agroali-
stos se utilizaron equipos de filtros que utilizan un li- mentarios y en particular en grasas y aceites (Garri-
mitado nmero de longitudes de onda y que, por tan- do et al., en prensa) indica que la precisin y
to, slo son adecuados para determinar exactitud de las ecuaciones obtenidas para los ci-
caractersticas bsicas como la humedad o la grasa dos palmtico, palmitoleico y esterico seran perfec-
total para una aplicacin concreta. En este trabajo se tamente mejorables con una estrategia orientada a
ha utilizado un equipo de espectro continuo (400- la obtencin de una distribucin ms homognea en
1700 nm) que proporciona informacin de un mayor la cobertura del rango, tratando de equilibrar el n-
nmero de longitudes de onda, lo que permite deter- mero de muestras existentes por cada 0.5-1% del
minar compuestos ms especficos como los dife- rango. Este tipo de distribucin, frente a la natural
rentes cidos grasos. obtenida en los colectivos utilizados en nuestro tra-
Los resultados obtenidos en este trabajo indican bajo, sin duda incrementar la precisin y exactitud
una alta precisin en las calibraciones para hume- de los modelos predictivos.
dad y contenido de aceite en pulpa seca, con resul- En distintos trabajos en semillas oleaginosas se
tados muy similares a los obtenidos en orujo han obtenido valores similares del coeficiente de de-
(Garca-Mesa et al., 1996) y aceituna triturada (Jim- terminacin, error tpico de prediccin y RER para la
nez et al., 2000). Las pequeas diferencias con los mayora de cidos grasos. En semillas intactas de
resultados obtenidos en dichos trabajos no parecen colza, Reinhardt et al. (1996) obtuvieron un coefi-
justificar la necesidad de molienda previa de la ciente de determinacin de 0.80 y error tpico de pre-
muestra. diccin de 2.03 para el cido oleico. Velasco y
Tambin en otras especies vegetales se han ob- Becker (1998) obtuvieron mejores resultados con
tenido resultados similares. En semillas oleaginosas, coeficientes de determinacin de 0.99 y 0.97, y erro-
Panford et al. (1990) obtuvieron valores del coefi- res tpicos de prediccin de 3.21 y 1.69 para los ci-
ciente de determinacin de 0.94-0.99 para el conte- dos oleico y linoleico respectivamente. Para otros
nido graso de nueve tipos diferentes de semillas cidos grasos analizados, como palmtico y esteri-
oleaginosas (algodn, cacahuete, colza, crtamo, co, con menor variabilidad en el conjunto de calibra-
lino, soja, girasol, ssamo y palma) a partir de mues- cin se obtuvieron peores resultados. En girasol
tras molidas. Para el contenido de aceite se han ob- Prez-Vich et al. (1998) obtuvieron coeficientes de
tenido valores similares del coeficiente de determinacin en torno a 0.80 y errores estndar de
determinacin y error tpico de prediccin en semi- prediccin muy altos (hasta 8.75 para oleico), aun-
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que los resultados mejoraron sustancialmente traba- Spectroscopy in Agriculture, Chapter 19. Roberts et al.
jando con semillas sin cscara y harinas. Peores re- (Eds.). Monograph. Crop Science Society of America.
Madison. USA.
sultados se obtuvieron con semillas de soja Hermoso, M.; Uceda, M.; Garca-Ortiz, A.; Jimnez, A.;
(Pazdernik et al., 1997), con coeficientes de determi- Beltrn, G. (1999). Preliminary results of NIR on-line
nacin de apenas 0.4-0.5 para oleico y linoleico. En measure of oil content and humidity in olive cakes from
todos los casos los mejores resultados se obtuvieron the two phases decanter. Acta Hortic. 474, 717-719.
para aquellos cidos grasos con mayor variabilidad, Jimnez, A.; Izquierdo, E.; Rodrguez, F.; Dueas, J.I.;
principalmente oleico y linoleico. Tambin para el Tortosa, C. (2000). Determinacin de grasa y humedad
en aceitunas mediante medidas de reflectancia en
contenido en cido linolnico o ercico se obtuvieron infrarrojo cercano. Grasas y Aceites 51, 311-315.
buenos resultados en aquellas especies ricas en es- Panford, J.A.; De Man, J.M. (1990) . Determination of oil
tos cidos grasos, como colza o soja. content of seed by NIR: Influence of fatty acid
Resultados ms precisos se han obtenido en ca- composition on wavelength selection. J. Am. Oil Chem.
libraciones desarrolladas para los principales cidos Soc. 68, 473-482.
Pazdernik, D.L.; Killam, A.S.; Orf, J.H. (1997). Analysis of
grasos a partir de aceites, especialmente por los va- amino and fatty acid composition in soybean seed,
lores mucho ms bajos del error tpico de prediccin using Near Infrared Spectrooscopy. Agron. J. 89,
y ms altos del RER, como se ha puesto de mani- 679-685.
fiesto en trabajos con mezclas de distintos aceites Prez-Vich, B.; Velasco, L.; Fernndez-Martnez, J.M.
(Chen y Chen, 1995) o girasol (Prez-Vich et al., (1998). Determination of seed oil content and fatty acid
composition in sunflower through the anlisis of intact
1998). No obstante, los resultados son lgicamente sedes, husked sedes, meal and oil by Near Infrared
poco comparables ya que en estos casos se trata de Reflectance Spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 75,
analizar una matriz mucho ms simple constituida 547-555.
prcticamente por cidos grasos y sin interferencias Rallo, L., (1995). Seleccin y mejora gentica del olivo en
de otros constituyentes (principalmente agua) como Espaa. Olivae 59, 46-53.
en el caso de la aceituna entera. Reinhardt, T.C.; Paul, C.; Rbbelen, G. (1996). Quantitative
analysis of fatty acids in intact rapeseed by NIRS en
Los resultados obtenidos en este trabajo indican Near Infrared Spectroscopy: The Future Waves, p.
por tanto que la tecnologa NIRS puede ser de gran uti- 323-327. Davies, A.M.C.; Williams, P.C. (Eds.). NIR
lidad para reducir el coste y tiempo requerido para eva- Publications. Chichester. UK.
luar el elevado nmero de genotipos que genera el Ro, C. del; Romero, A.M. (1999). Whole, unmilled olives
programa de mejora de olivo, consiguindose la sufi- can be used to determine their oil content by Nuclear
Magnetic Resonance. HortTechnology 9, 675-680.
ciente precisin para seleccionar genotipos en base Sato, T., Kawano, S. y Iwamoto, M. (1991). Near infrared
al rendimiento graso y contenido de cido oleico, dos spectral pattners of fatty acid analysis from fats and oil.
de los objetivos ms importantes en dicho programa. J. Am. Oil Chem. Soc. 68, 827-833.
Shenk, J. S.; Westerhaus, M. O. (1995). Analysis of
AGRADECIMIENTOS Agricultural and Food Products by Near Infrared
Reflectance Spectroscopy. Monograph. NIRSystems,
Los autores quieren expresar su agradecimiento Inc., 12101 Tech Road, Silver Spring, MD 20904.
al Centro de Investigacin y Formacin Agraria Ven- Velasco, L.; Prez-Vich, B.; Fernndez-Martnez, J.M.
(1998). A rapid and simple approach to identify
ta del Llano de Mengbar (Jan) donde se realizaron different sunflower oil types by means of Near-Infrared
los anlisis de composicin acdica por cromatogra- Reflectance Spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 75,
fa de gases. 1883-1888.
Velasco, L.; Becker, H. (1998). Estimating the fatty acid
composition of the oil in intact-seed rapeseed
BIBLIOGRAFA (Brassica napus L.) by Near Infrared Reflectance
Barranco, D.; Rallo, L. (2000). Olive cultivars in Spain. Spectroscopy. Euphytica 101, 221-230.
HortTechnology 10, 107-110. Velasco, L.; Mllers, C.; Becker, C. (1999). Estimation of
Batten, G.D. (1998). An appreciation of the contribution of seed weight, oil content and fatty acid composition in
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105-114. Near Infrared Reflectance Spectroscopy. Euphytica
Chen, Y.S y Chen, A.O (1995). Quality analysis and purity 106, 79-85.
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orujos de dos fases mediante infrarrojo cercano.
Grasas y Aceites 47, 317-322.
Garrido, A.; Prez, M.D.; Garca-Olmo, J. (En prensa). Recibido: Mayo 2002
Applications in Fats and Oils Analysis en Near Infrared Aceptado: Octubre 2002