Reaccin en cadena de la

polimerasa
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por
sus siglas en ingls (polymerase chain reaction), es una tcnica de
biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.1 Su objetivo
es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN
particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una
nica copia de ese fragmento original, o molde.

Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es

que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una
muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una
enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin
cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la
amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy
extendida, sobre todo en el mbito de la investigacin forense, con el
consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo
dicha tcnica.

Fundamento e importancia
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean
ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las
hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin
y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para
poder duplicarlas nuevamente. La reaccin en cadena de la
polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus
Corporation en California, en la dcada de 1980. Inicialmente la
tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al
realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas
polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo
(95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN) suponen la
inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN
polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados
a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres
vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus
aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se
emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras
capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).

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Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un
aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los
tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada
etapa de la reaccin. Muchos termocicladores modernos hacen uso
del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos
simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para
PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena
conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el
equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema
que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin
sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores ms antiguos
carecan de este sistema y solucionaban el problema de la
condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la
mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos.
Actualmente existen algunos termocicladores que utilizan o pueden
utilizar aceite mineral en el tubo de PCR como los termocicladores de
nueva generacin de flujo de are.

Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente

indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica
para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la
clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN,
el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos
hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas
forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de
enfermedades infecciosas.

Reactivos
Para realizar la tcnica se necesitan:[]

Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sustratos para

polimerizar nuevo ADN.

Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que

son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN.
Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos,
normalmente de dieciocho a veintids, que permiten que la
polimerasa inicie la reaccin. Deben estar enfrentados y no a mucha
distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir,
corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la
secuencia que se desea replicar.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado

comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin
divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para
mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de

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 Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan
como cofactores de la polimerasa.

Iones monovalentes, como el potasio.

Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el

funcionamiento de la ADN polimerasa.

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura

ptima alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).

ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en

cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Ciclo de amplificacin
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35
cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele
consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se
realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de
ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado
"hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final
del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje.
Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen
de gran variedad de parmetros. Estos incluyen la enzima usada para
la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y de los dNTP
en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como
la longitud del ADN que se desea amplificar.[2]

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de realizar

la reaccin de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el
sistema del termociclador aplicar calor a la parte de arriba del vial
que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que
empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que
no incluan este sistema tenan que poner unas gotas de aceite dentro
del vial. El objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa
caliente, es evitar la condensacin de la muestra, ya que en el
eppendorf se encuentran dos fases:lquido y gas. Al condensarse la
muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando
la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso fsico,
conservando casi intacto el volumen de la muestra.

Inicio
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-
96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable

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extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es
necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor.

Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas
de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la
forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que
tenga la cadena, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos,
raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de
sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin.

Alineamiento o unin del cebador

A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el
cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde.
Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40
segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los
puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-
ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar
a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la
cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a
ser amplificada.

Extensin o elongacin de la cadena

Acta la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial
necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una
nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los
dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-
fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de
ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso
depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la
temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente
72 C). El tiempo de extensin depende tanto de el ADN polimerasa
usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a
amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura
ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.

Elongacin final

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Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C
durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura
que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente
ampliado.

Conservacin
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo
indefinido para conservar la reaccin a corto plazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-

100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el
termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto,

se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de
ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor
medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao:
tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para
fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de
forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje
fluorescente, la electroforesis capilar.[3] El/los tamao/s de los
productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso
molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao
conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.