Producción de Insulina Recombinate Mediante Ingeniería Genética

UNIVERSIDAD
CATLICA DE CUENCA
UNIDAD ACADMICA DE INGENIERA QUMICA,

BIOFARMACIA, INDUSTRIAS Y PRODUCCIN
FACULTAD DE BIOFARMACIA
Informe del Curso de Graduacin previo a la obtencin del Ttulo de

Qumico Farmaceuta
MONOGRAFA DE PRODUCCIN DE INSULINA

RECOMBINANTE MEDIANTE INGENIERA GENTICA
Autora: JIMENA MORENO ORTIZ.
Director: Ing. Willian Peralta Izquierdo.
CUENCA ECUADOR
2012
Jimena Moreno O. i
AGRADECIMIENTO:
Expreso mis ms sinceros agradecimientos:
Ante todo y sin lugar a duda, primero a Dios, por

darme refugio entre sus manos y brindarme la
sabidura e inteligencia para lograr uno de mis sueos.
A mis padres GONZALO MORENO Y TERESA
ORTIZ quienes con amor, paciencia y consejos me
supieron guiar por el camino del xito, de igual
manera a mis hermanos Santiago, Gonzalo,
Francisco y de manera muy especial, gracias
infinitas a mi hermana MARA EUGENIA, quin
ha sido mi pilar fundamental a lo largo de mi
formacin profesional, estoy segura que sin su
comprensin y apoyo incondicional no hubiera
culminado esta etapa de mi vida.
Dejo constancia de mi agradecimiento al Ing. Santiago
Gmez, Decano de la Facultad y a todas sus
Autoridades por haberme dado la oportunidad de
pertenecer a tan noble Institucin; a sus distinguidos
catedrticos, Dr. Diego Andrade por compartirme sus
sabios conocimientos con los cuales podr
desempearme como una profesional competente, al
Ing. Ren Sarmiento, quien siempre ha apoyado al
bienestar y progreso de cada estudiante, a mi querido
Director de Monografa Ing. William Peralta por sus
consejos como catedrtico pero sobre todo como amigo.
Jimena Moreno O. ii
DEDICATORIA:
Dedico todos estos aos que llevaron consigo

mi sacrificio y trabajo, a mi Hermana MARA
EUGENIA MORENO ORTIZ, a quin quiero con
toda mi alma, porque ha sido mi compaera y
amiga inseparable, la incondicional que
siempre crey en m y ms an en esos
momentos difciles de mi Vida.
Tambin dedico a mis PADRES que me

alentaron plenamente en el transcurso de mi
poca de estudio, quienes hoy tienen la
satisfaccin de un deber cumplido.
Jimena Moreno O. iii

INTRODUCCIN
Actualmente la Biotecnologa y las novedosas Tcnicas de Recombinacin

Gentica, ocupan el primer lugar en la elaboracin de productos farmacuticos.
Esta metodologa incluye la manipulacin y ordenamiento de segmentos de
cidos nucleicos, con el objetivo de producir sustancias destinadas al
diagnstico, prevencin y tratamiento de patologas que afectan a los seres
vivos.
Es importante sealar que en muchos casos la obtencin de estas sustancias

por va natural se hace muy difcil en funcin de la fuente empleada para su
extraccin, pudiendo resultar arriesgado e insuficiente para los requerimientos
mundiales, puesto que todo organismo, an el ms simple, contiene una
enorme cantidad de informacin, la cual esta almacenada en macromolculas
de ADN. Este ADN est dividido en gran cantidad genes que llevan la
informacin necesaria para que la clula sintetice una protena, controlando
todos los aspectos de la vida de cada organismo, incluyendo metabolismo,
forma, desarrollo y reproduccin; siendo as, el genoma el responsable de las
caractersticas del individuo.
Propiedades importantes del ADN, hacen posible la evolucin ya que se divide

y fusiona con el ADN de otro individuo de la misma especie, para lograr
descendencia diversificada. No importa lo diferente que sean dos especies, el
ADN que contengan ser de la misma naturaleza.
Siguiendo este razonamiento, y teniendo en cuenta muchas percepciones hacen

posible que el gen de una especie pueda funcionar y manifestarse en otra
completamente distinta, como es el caso de la produccin de Insulina
Recombinante mediante Escherichia coli.
Las perspectivas que se establecen de nuevos descubrimientos varan desde un

mundo maravilloso sin enfermedades, con un increble rendimiento agrcola y
ganadero, todo tipo de nuevos frmacos, hasta un mundo catastrfico; pero la
realidad es y ha sido diferente puesto que el ser humano ya, se est
beneficiando con las diversas aplicaciones de la Ingeniera Gentica.
Es por esto que el objetivo de esta monografa es la creacin de una fuente

prctica de conceptos bsicos a cerca del tema, con el fin de hacer una
herramienta til para comprensin del estudiante y el logro para la obtencin
del ttulo de Qumico Farmacutico.
Jimena Moreno O. iv
CONTENIDO
CAPTULO I ................................................................................................................................. 1
1.1.- Qu es la ingeniera gentica? ................................................................................................... 1
1.2.- Tcnicas biotecnolgicas ............................................................................................................ 1
1.3.- Tecnologa del adn recombinante ............................................................................................... 2
1.4.- Protenas recombinantes ............................................................................................................. 5
1.5.- Caractersticas generales de replicacin ..................................................................................... 7
CAPTULO II.............................................................................................................................. 10
2.1.- Qu es la insulina? .................................................................................................................. 10
2.2.- Estructura de la insulina ............................................................................................................ 11
2.3.- Produccin de la insulina en el ser humano .............................................................................. 12
2.4.- Papel que desempea la insulina en el organismo humano ...................................................... 13
CAPTULO III ............................................................................................................................ 15
3.1.- Cdigo gentico ........................................................................................................................ 15
3.2.- Metodologa .............................................................................................................................. 17
3.4.- Qu es un codn? .................................................................................................................... 20
3.5.- Asignacin de codones a aminocidos concretos ..................................................................... 22
3.6.- Qu es un vector? .................................................................................................................... 23
Tipos de vectores........................................................................................................................... 24
a) Vector de clonacin............................................................................................................... 24
b) Vector lanzadera .................................................................................................................... 24
c) Vector de expresin............................................................................................................... 24
d) Vector de reposicin.............................................................................................................. 24
3.7.- Transformacin en un husped de escherichia coli................................................................... 26
3.8.- Produccin de la insulina recombinante ................................................................................... 30
CAPTULO IV ............................................................................................................................ 35
4.1.- La insulina a nivel industrial ..................................................................................................... 35
4.2.- Produccin de hormonas en otras bacterias .............................................................................. 39
4.3.- La biotecnologa para diagnosticar y rastrear enfermedades genticas .................................... 40
4.4.- Influencia de su produccin en la sociedad. ............................................................................. 44
CONCLUSIONES . ......................................................................................................................... 48
BIBLIOGRAFA . ........................................................................................................................... 49
Jimena Moreno O. v
Captulo I
Ingeniera Gentica
1.1.- QU ES LA INGENIERA GENTICA?
La ingeniera gentica puede definirse como:
La manipulacin deliberada de la informacin gentica, con miras al anlisis gentico

o al mejoramiento de la especie.
Ms concretamente es:
Un conjunto de metodologas, nacidas de la Biologa Molecular que permite transferir

genes de un organismo a otro y expresarlos en organismos diferentes al de su origen; es
decir, es la produccin intencionada de nuevos genes y alteracin de genomas, mediante
la sustitucin o adicin de material gentico nuevo.
De esta manera, organismos relativamente simples tales como las bacterias o levaduras
pueden ser inducidos a fabricar grandes cantidades de protenas humanas, incluyendo los
interferones y las interleuquinas.
Este campo de la ciencia se dedica a investigar la posibilidad de recombinar artificialmente

genes o grupos de genes para producir nuevas combinaciones que no aparecen
biolgicamente. Por ejemplo, es posible aislar genes que especifican dos protenas
diferentes a partir de dos especies distintas de organismos, y unirlos entre s para dar lugar a
una nueva combinacin.
La ingeniera gentica es una tcnica que consiste en la introduccin de genes en el genoma

de un individuo que carece de ellos, esto se realiza a travs de las enzimas de restriccin
que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos; denominndose ADN
recombinante, el que se ha formado cuando se intercala un segmento de ADN extrao en un
ADN receptor.
Ejemplo, la integracin de un ADN vrico en un ADN celular.
1.2.- TCNICAS BIOTECNOLGICAS
Ingeniera gentica:
Es la ms conocida de las tcnicas biotecnolgicas, persigue la modificacin del
patrimonio hereditario de un organismo introduciendo o seleccionando en su haber gnico
uno o varios genes pertenecientes a un organismo de una especie distinta, para dotarlo de
Jimena Moreno O. 1
capacidades que antes no tena, con el fin de que al reproducirse produzca sustratos
modificados tiles para un determinado uso o funcin.
El proceso puede emplearse en bacterias o en clulas eucariotas vegetales o animales.
Existen varias tcnicas para la ingeniera gentica, como la electroforesis en gel, sondas,
amplificacin del gen, vectores, y, la ms conocida de ellas, la tcnica ADN recombinante.
La ingeniera gentica incluye un conjunto de tcnicas biotecnolgicas, entre las que

destacan:
La tecnologa del ADN recombinante;

La secuenciacin del ADN;
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Fusin de materiales celulares:

Consiste en extraer plsmidos (inclusin intracelular que se considera tiene una
funcin gentica, especialmente una molcula de ADN procedente del cromosoma
bacteriano que determina rasgos no fundamentales para la viabilidad del organismo, aunque
de algn modo cambia la capacidad del organismo para adaptarse) con caractersticas
interesantes de diferentes clulas e incorporarlos, sin modificacin, en un microorganismo
que rene, entonces, las caractersticas de los organismos originales.
Fermentacin:
Aqu los microorganismos naturales o alterados genticamente se cultivan en cubas
de fermentacin. Gracias a los productos fermentados, la biotecnologa proporciona una
alimentacin ms rica en vitaminas, fcil de digerir y sabrosa.
Ingeniera enzimtica:
Investiga y desarrolla mejores condiciones para incrementar el rendimiento de la
fermentacin.
1.3.- TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE
La tecnologa del ADN recombinante constituye una suma de tcnicas siendo las ms
importantes:
La rotura especfica del ADN mediante nucleasas de restriccin, que facilita el

aislamiento y la manipulacin de los genes individuales.
La secuenciacin rpida de todos los nucletidos de un fragmento purificado de
ADN, que posibilita determinar los lmites de un gen y la secuencia de aminocidos
que codifica.
La hibridacin de los cidos nucleicos que hace posible localizar secuencias
determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas molculas
de unirse a secuencias complementarias de otros cidos nucleicos.
Jimena Moreno O. 2
La clonacin del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de
ADN se integre en un elemento gnico auto-replicante (plsmido o virus) que habita
en una bacteria, de tal manera que una molcula simple de ADN puede ser
producida generando muchos miles de millones de copias idnticas.
La ingeniera gentica mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN
produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a
clulas u organismos.
El proceso de produccin de un ADN recombinante comienza con la identificacin desde

un organismo de una secuencia de ADN de inters con el fin de propagarlo en otro
organismo que carece de la secuencia y, por ende, del producto proteico de esa secuencia
de ADN. As se pueden producir cantidades ilimitadas de la protena codificada por el
dicho gen.
En trminos simples, el procedimiento consiste en:
Localizacin de genes y sus funciones.

Clonacin del ADN, y su posterior almacenamiento en genotecas.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Utilizacin de vectores de expresin.
Una molcula de ADN contiene miles de genes, para aislar el gen se debe partir de su
producto. El ms inmediato es el cido ribonucleico mensajero (ARNm), con este fin se
seleccionan aquellas clulas en que el gen se exprese en mayor cantidad y de ellas se asla
el correspondiente ARNm.
Se convierte la informacin almacenada en el ARNm en un segmento de ADN, utilizando

las transcriptasas inversas de los virus. Una vez conseguido esto, se emplean las enzimas
ADN polimerasas para convertir el filamento simple de ADN en un segmento de doble
hlice, a este se le denomina ADN complementario (ADNc).
http://biotecnologiagrupo3.blogspot.com/2011/05/marco-teorico.html
Una vez conseguido el ADNc correspondiente, se introduce en un plsmido o plasmidio,

contiguo se utilizan enzimas de restriccin, cada una con capacidad para reconocer una
secuencia especfica de bases en el ADN.
Jimena Moreno O. 3
Estas enzimas cortan el ADN en diversos fragmentos y pueden dejar extremos colgantes
(de cadena simple) que tienden a asociarse nuevamente con nucletidos complementarios,
por lo que se les llama extremos pegajosos.
http://biotecnologiagrupo3.blogspot.com/2011/05/marco-teorico.html
La accin posterior de una enzima llamada ligasa hace posible la unin del ADNc con el
plsmido y logra que la molcula recombinante sea estable.
http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/Recombinant_DNA_Technology/05t.html
El plsmido recombinante se introduce en un hospedador, ya sean vegetales, animales o

una bacteria, Una vez en el interior del hospedador, el plsmido se reproduce, y con l, el
ADNc. Cuando la bacteria se divide, lega copias a las dos bacterias hijas, aunque tambin
es posible que slo una se quede con todas las copias.
De entre todas las bacterias, se identifica

cules portan plsmido recombinante,
mediante un marcador.
http://cristinagccmc.blogspot.com/2011/03/tema-4-cmc-
avances-de-la-genetica.html
Jimena Moreno O. 4
1.4.- PROTENAS RECOMBINANTES
En ingeniera gentica o tecnologa del ADN recombinante, se utilizan enzimas para cortar
y aislar un gen determinado que tiene informacin para fabricar una protena particular e
introducirlo en las clulas de un organismo distinto del inicial.
En consecuencia, este organismo tendr ADN recombinante a partir del cual fabricar una
nueva protena, a la cual se la denomina protena recombinante
Tenemos:
a) Endonucleasas de restriccin:
Enzimas bacterianas que reconocen secuencias especficas del ADN, y cortan la cadena
cada vez que esta secuencia aparece; es una Enzima de restriccin que puede reconocer
una secuencia caracterstica de nucletidos de una molcula de ADN y cortar el ADN
en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio no muy
lejano a ste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restriccin cuentan con entre 4 y
12 pares de bases, con las que son reconocidos.
La importancia de estas enzimas radica en su gran especificidad de reconocimiento de una

secuencia corta de ADN dplex y la consiguiente hidrlisis de un enlace fosfodister en
cada hebra, en secuencias concretas para iniciar la clonacin.
http://proyectogrupo4sesion2011.wikispaces.com/Definici%C3%B3n+de+T%C3%A9rminos+-+Transg%C3%A9nicos
Estas enzimas se agrupan en tres familias de acuerdo a sus propiedades:
Tipo I = Endonucleasa y metilasa en una misma protena (en distintas subunidades)

Tipo II = Endonucleasa (metilasa en una protena independiente)
Tipo III = Endonucleasa y metilasa en una misma protena (en distintas subunidades)
El mecanismo de corte de ADN se realiza a travs de la ruptura de dos enlace fosfodister

en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de ADN. stos pueden ser romos (cuando
los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados, estos ltimos tienen tendencia a
Jimena Moreno O. 5
volver a unirse de modo espontneo ya que los extremos se pueden unir a otros extremos
coincidentes que pueda haber en la cercana. Los fragmentos de ADN obtenidos de este
modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas.
Extremos cohesivos. Extremos romos.
http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci%C3%B3n
b) ADN ligasas:
Enzimas que pegan fragmentos nuevos y antiguos de ADN, que forma enlaces
covalentes entre el extremo 5 de una cadena polinucleotdica y el extremo 3 de
otra cadena polinucleotdica. Tambin se denomina enzima de unin de
polinucletidos.
Esta enzima cataliza la formacin de puentes fosfodister entre los extremos adyacentes 3'
OH y 5' fosfato en el ADN. Para la actividad la enzima requiere iones Mg++ y una unin
covalente derivada del ATP en el caso de la ADN ligasa necesita del bacterifago T4, este
puede unir covalentemente molculas de ADN con extremos cohesivos compatibles y
tambin fragmentos de ADN con extremos sin punta.
http://proyectogrupo4sesion2011.wikispaces.com/Definici%C3%B3n+de+T%C3%A9rminos+-+Transg%C3%A9nicos
c) Transcriptasas inversas:
Enzimas virales que puede invertir la direccin normal de la transferencia de

informacin. Normalmente, la informacin gentica contenida en el ADN se
transcribe a una molcula de ARN y luego se traduce a una protena. La
transcriptasa inversa sintetiza ADN a partir del ARN.
Conocida como ADN polimerasa

dependiente de ARN ya que transcribe
una sola cadena de ARN en una sola
cadena de ADN y ayuda a la formacin de
una doble hlice de ADN una vez que el
ARN ha experimentado una transcripcin
inversa en una sola cadena de ADNc. http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema1.htm
Jimena Moreno O. 6
1.5.- CARACTERSTICAS GENERALES DE REPLICACIN
Las propiedades de la replicacin son bsicamente iguales en todos los seres vivos, y
siendo as que la mayora de los estudios se han realizado en Escherichia coli, se describir
el proceso a nivel del organismo bacteriano; y a continuacin, se indicarn algunas
caractersticas propias de organismos eucariotas.
1) La replicacin es un proceso semi-conservador.
Cada cadena de la molcula de ADN parental acta de molde para la sntesis de una nueva
cadena producindose dos nuevas molculas de ADN, cada molcula nueva posee una
cadena vieja y una nueva.
2) La replicacin comienza en un punto del ADN.
Las dos cadenas de ADN se replican al mismo tiempo y comienzan en un punto

denominado origen. En dicho punto el ADN parental se desenrolla y forma una estructura
de lazo cuyos extremos se denominan horquillas de replicacin. En el caso del
cromosoma circular bacteriano, el punto inicial de la replicacin es un gen denominado
oriC.
http://www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema3.htm
3) La replicacin es bidireccional.
Comenzada en un punto de la molcula de ADN el proceso se desarrolla hacia los dos

extremos de la cadena; en cada lazo, los extremos u horquillas de replicacin avanzan en el
proceso de sntesis hasta completar la copia.
4) La sntesis de ADN se desarrolla en direccin 5' 3'.
La direccin en que actan las enzimas es fija y nica de 5' a 3'. Esto determina que la
cadena molde ha de tener la direccin 3' 5', para que la nueva cadena en formacin,
complementaria y anti-paralela tenga la direccin 5' 3' coincidente con el sistema de
trabajo de la enzima.
Jimena Moreno O. 7
Al ser la horquilla de replicacin bidireccional, el sistema descrito implicara que la otra
cadena parental 5' 3' debera estar siendo copiada en direccin 3' 5', situacin
imposible debido a la limitacin de las enzimas sintticas, este problema es obviado debido
a que, la sntesis de ADN es semi-discontinua.
http://www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema3.htm
En una cadena, la inicialmente comentada en el punto anterior, la replicacin es continua y

en la segunda la sntesis es discontinua, ya que se formaba una cadena nueva continua
(tambin denominada conductora) en la que la sntesis se desarrolla en la misma direccin
de la enzima o de la horquilla de replicacin; mientras que la otra cadena nueva era
discontinua (tambin denominada cadena rezagada o retrasada) ya que su sntesis se
realizaba en contra de la direccin de la horquilla mediante fragmentos de Okazaki, que
son secuencias formadas por unos centenares o miles de nucletidos dependiendo de la
clula.
Fases de la replicacin
1) Fase de inicio
El origen de la replicacin es una porcin de ADN que contiene una secuencia

caracterstica de bases. Este segmento es reconocido por una protena denominada ADN-A.
2) Fase de elongacin
La elongacin consiste en la formacin del cebador y la sntesis de la cadena de ADN. El

proceso se caracteriza por no desarrollarse de forma idntica en ambas hebras. La sntesis
en la cadena conductora o continua requiere nicamente que acte la primasa formando un
cebador de ARN de unos 10 a 60 nucletidos, para a continuacin penetrar la ADN
polimerasa III y realizar la polimerizacin de desoxirribonucletidos.
En la cadena retrasada se forma un conjunto proteico en el que se localizan siete protenas

distintas adems de la primasa (primosoma). Este grupo se desplaza a lo largo del molde de
la hebra retrasada en direccin 5' 3' sintetizando a intervalos un corto cebador de ARN, al
que se unir ADN formado por la ADN polimerasa III. El hecho de que las direcciones de
trabajo de la primasa y la polimerasa sean contrarias a la direccin de crecimiento de la
hebra, y de que el proceso sea uniforme en ambas hebras, viene justificado por el hecho de
Jimena Moreno O. 8
que la ADN polimerasa III es una protena dimrica. Esta enzima obliga a la cadena molde
de la hebra retrasada a formar un bucle sobre la misma, de esta forma, la direccin de
sntesis es la misma en ambas hebras.
Al ir desarrollndose la polimerizacin el bucle aumenta hasta contactar con el fragmento
de Okazaki previo, forzando a la polimerasa a separarse o disociarse y a recomenzar de
nuevo el proceso dnde se ha formado el nuevo cebador y ella crear el nuevo bucle.
En una fase posterior se eliminan los segmentos de ARN cebador, por accin de la
actividad exonucleasa 5'3' de la ADN polimerasa I, quien tambin se encarga de rellenar
los trozos ocupados por el cebador. Por ltimo, la ADN ligasa une los segmentos
catalizando la formacin de un enlace fosfodister.
3) Fase de terminacin
En el caso de Escherichia coli con un cromosoma circular, las dos horquillas de la

replicacin se encuentran en el extremo contrario al origen terminando as la replicacin y
necesitando, nicamente, la presencia de una topoisomerasa para la separacin de las dos
molculas.
http://enfermeraeninmunologaygentica.blogspot.com/2011/04/fases-del-proceso-de-la-replicacion.html
Jimena Moreno O. 9
Captulo II
La Insulina
2.1.- QU ES LA INSULINA?
Es una hormona polipeptdica formada por 51aminocidos, producida y secretada por las
clulas Beta de los Islotes de Langerhans del pncreas, en forma de precursor inactivo
(proinsulina), el cual es procesado en el Aparato de Golgi donde es modificada, generando
la forma activa, Insulina.
http://diabetesdm.blogspot.com/2009/03/insulina.html
La insulina ayuda al cuerpo a usar y a

almacenar glucosa,la cual se produce
durante la digestin de los alimentos, para
luego secretarla hacia la sangre en cada
comida, y as permitir al cuerpo usar la
glucosa como energa para las funciones
diarias bsicas, como moverse y respirar.
http://diabetesdm.blogspot.com/2009/03/insulina.html
Gran nmero de estudios demuestran que la insulina es una alternativa segura, efectiva,
bien tolerada y aceptada para el tratamiento a largo plazo de la diabetes tipo I y II, incluso
desde el primer da del diagnstico.
Jimena Moreno O. 10
2.2.- ESTRUCTURA DE LA INSULINA
La insulina es una hormona de naturaleza proteica con un peso molecular aproximado de

6000 Daltones, formada por 2 cadenas polipeptdicas que en total tienen 51 aminocidos.
La cadena A tiene 21 aminocidos y la cadena B 30 aminocidos. Ambas cadenas se
encuentran unidas por 2 puentes de disulfuro ubicados entre los aminocidos A-7/ B-7, y
A-20/ B-19. Adems la cadena A, tiene tambin un puente interno de disulfuro entre los
aminocidos A-6/ A-11.
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Genenzima/Genenzima.htm
La integridad de la molcula es indispensable para ejercer las acciones farmacolgicas. Las

cadenas A o B, separadas luego de la destruccin enzimtica de los puentes de disulfuro,
carecen completamente de acciones farmacolgicas. Los aminocidos de las posiciones B-
22 y B-30, son indispensables para el mantenimiento de las acciones metablicas de la
insulina. Las acciones de crecimiento, se relacionan con los aminocidos A-4; A- 20, A-21,
B-10, B-13, y B-26.
http://masbiologia2bct.blogspot.com/2010/11/insulina.html
Estructura primaria de la Insulina: consta de dos cadenas de aminocidos enlazadas por

puentes disulfuro entre las cistenas
Jimena Moreno O. 11
2.3.- PRODUCCIN DE LA INSULINA EN EL SER HUMANO
Un pncreas funcionando normalmente puede fabricar y liberar diariamente de 40 a 50

unidades de insulina. Adems, tiene varios cientos de unidades almacenadas y disponibles
para ser segregadas cuando se necesitan.
La insulina se produce en el Pncreas en los Islotes de Langerhans, mediante unas clulas

llamadas Beta, cuyo gen responsable de la sntesis est en el brazo corto del cromosoma 11.
Las clulas beta fabrican insulina en diferentes etapas.
La primera es que la insulina se sintetiza en los ribosomas del retculo endoplsmico

rugoso de las clulas beta de los islotes, como pre-pro-insulina, que tiene 109
aminocidos. Este precursor pierde enzimticamente algunos aminocidos, y se
transforma en proinsulina de 83 aminocidos de cadena nica en espiral.
La segunda es que la proinsulina, se transforma en insulina en el aparato de Golgi

de las clulas beta, por un proceso enzimtico que genera cantidades equimolares,
de insulina y un pptido conector o pptido C. Este pptido C est formado de 32
aminocidos distribuidos en dos cadenas polipeptdicas A y B, una de 21
aminocidos y otra de 30, unidas por dos puentes de disulfuro.
http://www.gimolimpo.com/Paginas/LA%20INSULINA.htm
Adicionalmente, existe captacin de zinc, formndose molculas de zinc-insulina.
Siguiente el pptido C se acumula en grnulos secretorios ligados al aparato Golgi,

en el citoplasma celular, la progresin de estos grnulos hacia la membrana
plasmtica, se hace a travs de microtbulos impulsados por filamentos ciliares
contrctiles y gradientes de potencial electroqumico.
Para que finalmente los grnulos se fusionan a la membrana celular y son secretados
por exocitosis con participacin del calcio como activador de los microtbulos, K, y
Zn. La insulina en forma de monmeros, junto al pptido C, estos son difundidos
hacia los capilares en forma equimolar.
Jimena Moreno O. 12
La insulina se almacena en las clulas Beta en grnulos secretorios, que se preparan
para liberarla en la circulacin sangunea, en respuesta al estmulo de una
concentracin creciente de glucosa en sangre. Tambin existe una pequea
secrecin de proinsulina (10% de la insulina).
http://diabetesmellituskarinapacheco.blogspot.com/2011/12/adn-recombinate-insulina-humana-versus.html
El pptido C no tiene ninguna funcin conocida. Sin embargo, se segrega en las mismas
cantidades que la insulina y, de hecho, circula en la sangre ms tiempo que la insulina, por
lo que es un preciso marcador cuantitativo del funcionamiento de las clulas Beta. As,
unos niveles normales de pptidos C indican una secrecin relativamente normal del
pncreas.
2.4.- PAPEL QUE DESEMPEA LA INSULINA EN EL ORGANISMO

HUMANO
En general, la insulina es una hormona que estimula los procesos anablicos e inhibe los
catablicos.
Aunque las ms conocidas se relacionan con el metabolismo de los carbohidratos, no son
de menor importancia las que ejerce sobre el metabolismo lipdico o el de las protenas, ya
que a corto plazo aumenta la oferta de sustratos en el interior celular para el
almacenamiento de energa y a medio plazo provoca un incremento de las actividades
enzimticas relacionadas con la formacin de reservas energticas.
Las funciones de la insulina son muy variadas.
Jimena Moreno O. 13
a) Sobre el metabolismo de los hidratos de carbono, la insulina aumenta el transporte de
glucosa a travs de la membrana plasmtica de las clulas en la mayora de los tejidos,
excepto en el cerebro, los tbulos renales, la mucosa intestinal, las propias clulas B
pancreticas y los eritrocitos.
b) En el hgado, la insulina estimula la sntesis de glucgeno inhibiendo la gluconeognesis y la

glucogenolisis, por lo tanto una hormona hipoglucemiante.
c) La insulina favorece el transporte de los cidos grasos y su captacin por la clula adiposa
para ser almacenados. Estos cidos grasos proceden de los quilomicrones y lipoprotenas
liberados por el hgado, en el que tiene lugar una alta actividad lipognica por efecto de esta
hormona. As, los cidos grasos libres que entran al hgado se derivan hacia la esterificacin,
provocando un efecto anticetognico y, por otro lado, se sintetizan de nuevo cidos grasos
libres y colesterol a partir del acetil-CoA. Tiene tambin una importante accin inhibidora
sobre la lipasa del tejido adiposo sensible a esta hormona, impidiendo que se liberen cidos
grasos a la sangre y sean transportados a otros tejidos.
d) El efecto de la insulina sobre la sntesis de protenas ocurre en un plazo de horas o das, ya

que la sntesis aumenta por efecto directo de la insulina sobre la maquinaria ribosmica.
Claramente su efecto sobre la sntesis proteica se observa en el hgado y en el pncreas,
donde la insulina aumenta la sntesis de albmina y amilasa, respectivamente. En el msculo
estimula el transporte de ciertos aminocidos a travs de la membrana celular. Al mismo
tiempo, favorece la sntesis de enzimas relacionados con el almacenamiento de glcidos,
lpidos y protenas; e inhibe las enzimas proteolticas y la salida de aminocidos de la clula.
Adems, es importante el papel de la insulina y los pptidos estructuralmente relacionados
con ella sobre el crecimiento del cartlago y hueso potenciando la captacin de aminocidos
distintos en cada caso, por lo que se consideran sinergistas.
e) La insulina tiene otros efectos importantes como la estimulacin de la captacin de fosfato,

potasio y magnesio por las clulas desde el espacio extracelular. Es tambin esencial su
papel en la reabsorcin de sodio, potasio y fosfato por los tbulos renales.
f) Finalmente, la insulina potencia la termognesis inducida por el alimento.
http://www.uned.es/pea-nutricion-y-dietetica-I/guia/enfermedades/diabetes/manual_el_indice_glucemi.htm
Jimena Moreno O. 14
Captulo III
Insulina Recombinante
3.1.- CDIGO GENTICO
Es el conjunto de pautas que rigen la transferencia de la informacin contenida en al

ARNm y en definitiva en el ADN para la sntesis de protenas; describe la correlacin entre
dos lenguajes informativos que son: la secuencia de los nucletidos en el ARNm y la
secuencia de aminocidos en el polipptido.
http://eluniversobajoelmicroscopio.blogspot.com/2012/01/codigo-genetico.html
Es decir el cdigo gentico establece correspondencia entre los 64 posibles tripletes de

bases del ARNm y los 20 aminocidos de las protenas.
4 nucletidos 20 aminocidos
Cdigo
Jimena Moreno O. 15
Esta informacin se transmite de una
generacin a otra mediante la produccin
de rplicas exactas del cdigo.
http://quimica4m.blogspot.com/2009/05/sintesis-de-una-
proteina-y-codigo.html
Caractersticas:
Es casi universal, pues lo utilizan casi todos los seres vivos conocidos. Solo existen
algunas excepciones en unos pocos tripletes en bacterias, protozoarios, micoplasmas y
las mitocondrias.
No es confuso, pues cada triplete tiene su propio significado
Todos los tripletes tienen sentido, bien codifican un aminocido o bien indican
terminacin de lectura.
Est degenerado, pues hay varios tripletes para un mismo aminocido, es decir codones
sinnimos, como es el caso del Triptfano y Metionina que estn codificados por un
nico codn.
Es unidireccional, pues los tripletes se leen en el sentido 5-3.
La correspondencia entre nucletidos y aminocidos se hace mediante codones.
Carece de solapamiento, es decir los tripletes no comparten bases nitrogenadas.
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Codigo/Codigo%20genetico.htm
Jimena Moreno O. 16
Gracias a la gentica molecular, se han
distinguido 22 cdigos genticos, que se
diferencian del llamado cdigo gentico
estndar por el significado de uno o ms
codones.
http://quimica4m.blogspot.com/2009/05/sintesis-de-una-
proteina-y-codigo.html
3.2.- METODOLOGA
Ya que el cdigo gentico es un conjunto de normas por las que la informacin codificada
en el material gentico se traduce en protenas en las clulas vivas, tambin define la
relacin entre secuencias de tres nucletidos, llamadas codones, y los aminocidos. Un
codn se corresponde con un aminocido especfico. El ARN se basa en transportar un
mensaje del ADN a la molcula correspondiente
La secuencia del material gentico se compone de cuatro bases nitrogenadas distintas, que
tienen una funcin equivalente a letras en el cdigo gentico:
En el ADN En el ARN
Adenina (A) Adenina (A)
Timina (T) Uracilo (U)
Guanina (G) Guanina (G)
Citosina (C) Citosina (C)
http://smcg.ccg.unam.mx/enp-unam/01-IntrodYEvolucion/structfuncDNA.pdf
La Transferencia de informacin en el genoma de un organismo se encuentra en el ADN

o, en el caso de algunos virus, en el ARN. La porcin de genoma que codifica varias
protenas se conoce como gen. Esos genes que codifican protenas estn compuestos por
Jimena Moreno O. 17
unidades de trinucletidos llamadas Codones, cada uno de los cuales codifica un
aminocido.
http://www.fedaes.org/quees/ataxiafriedreich/XXPORTU.htm
Cada subunidad nucleotdica est formada por un fosfato, una desoxirribosa y una de las
cuatro posibles bases nitrogenadas. Las bases purnicas Adenina (A) y Guanina (G) son
ms grandes y tienen dos anillos aromticos. Las bases pirimidnicas Citosina (C) y Timina
(T) son ms pequeas y slo tienen un anillo aromtico.
En la configuracin en doble hlice, dos cadenas de ADN estn unidas entre s por puentes
de hidrgeno en una asociacin conocida como emparejamiento de bases, adems estos
puentes siempre se forman entre una (A) de una cadena y una (T) de la otra y entre una (C)
de una cadena y una (G) de la otra. Esto quiere decir que el nmero de residuos A y T ser
el mismo en una doble hlice y lo mismo pasar con el nmero de residuos de G y C.
En el ARN, la (T) se sustituye por (U), y la desoxirribosa por una ribosa.
Cada gen codificante de una protena se transcribe en una molcula plantilla, que se conoce
como ARN mensajero (ARNm), que a su vez se traduce en ribosoma, en una cadena
polipeptdica.
http://www.hartnell.edu/tutorials/biology/translation.html
En el proceso de traduccin se necesita un ARN de transferencia (ARNt) especfico para

cada aminocido, al cual se une covalentemente guanosina trifosfato como fuente de
energa y ciertos factores de traduccin.
Jimena Moreno O. 18
Los ARNt tienen anti-codones complementarios a los codones del ARNm y se pueden
cargar covalentemente en su extremo 3' terminal CCA con aminocidos. Los ARNt
individuales se cargan con aminocidos especficos por las enzimas llamadas
aminoacilARNtsintetasas, que tienen alta especificidad tanto por aminocidos como por
ARNt.
La alta especificidad de estas enzimas es motivo fundamental del mantenimiento de la

fidelidad de la traduccin de protenas.
Sntesis Proteica
1 2
3 4
http://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/6299/1/4.2%20C%C3%B3digo%20gen%C3%A9tico%20y%20s%C3%ADntesis
%20de%20prote%C3%ADnas%20PRISCILA.pdf
Jimena Moreno O. 19
Hoy en da es relativamente fcil conocer la correspondencia entre aminocidos de una
protena y tripletes de nucletidos de ARNm que los codifican, mediante una simple
comparacin entre ambos. La informacin obtenida previamente en la que se basa el
conocimiento del Cdigo Gentico es por un lado; lo referente al ARNt, el cual a pesar de
no ser elemento propiamente dicho del Cdigo, es esencial para entender la
correspondencia entre el ARNm y la protena. Por otro lado es el ribosoma, donde se da la
sntesis proteica.
3.4.- QU ES UN CODN?
Es un Triplete de bases de ADN o ARNm que codifica para un aminocido especifico en la

cadena polipeptdica durante la sntesis de protenas o determina el cese de dicha sntesis.
http://www.sesbe.org/evosite/evo101/IIIC2ReviewDNA.shtml.html
Los codones del cdigo son tripletes?
Para poder codificar los 20 aminocidos naturales se necesita que cada aminocido venga
especificado por una secuencia de 3 nucletidos llamada Tripletes o Codn.
El triplete es la caracterstica que define la naturaleza general del cdigo. Hay 64
combinaciones diferentes de codones que sean posibles con tripletes de tres nucletidos: los
64 codones estn asignados a aminocidos o a seales de parada en la traduccin.
Ejemplo.- Tenemos una secuencia de ARN, UUUAAACCC, la lectura del fragmento

empezara en la primera U (convenio 5' a 3'), por lo que nos dara tres codones que seran
UUU, AAA y CCC, cada uno de los cuales especfica un aminocido. Esta secuencia de
ARN se traducir en una secuencia aminoacdica de tres aminocidos de longitud. Debido a
que el Cdigo Gentico es redundante se puede hasta 6 codones diferentes codificar para el
mismo aminocido.
Adaptadores
La lectura de la secuencia de codones es dada por el ARNm, el cual ejerce un papel de

adaptador de la informacin gentica a la secuencia de las protenas. Este mecanismo lo
hace como estructuras activas especializadas, es decir formando los aminoacil-tARNs, que
dirige los aminocidos hacia el ARNm que est situado en el ribosoma. En este orgnulo
se da la interaccin del triplete de bases del anti-codn con el codn determinado durante la
traduccin; por lo que: un codn determina a un aminocido.
Jimena Moreno O. 20
Emparejamientos codn-anti-codn
http://www.monografias.com/trabajos82/codigo-genetico/codigo-genetico2.shtml
Hiptesis
Los tripletes no se solapan

Una de las propuestas iniciales para la distribucin de los codones en el ARNm fue que
tripletes contiguos compartieran nucletidos.
En una hiptesis solapante, la secuencia del primer triplete restringe las posibles secuencias
del segundo y estas a su vez del tercero, as sucesivamente, por lo que la secuencia de
aminocidos de las protenas estara condicionada y no podra ser cualquiera.
JSE LUQUE/NGEL HERREZ. Texto ilustrado de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica, Publicacin ELSEVIER SCIENCE, Madrid-
Espaa 2002.Captulo 3 Expresin Gnica.
Bajo esta hiptesis la alteracin de una base afecta a varios codones, lo que producira
alteraciones en ms de un aminocido; en la realidad esto no se cumple y se demuestra que
Jimena Moreno O. 21
la hiptesis solapante es incorrecta, ya que los tripletes nunca comparten nucletidos, no
se solapan; siendo as para el Cdigo Gentico de todos los seres vivos.
3.5.- ASIGNACIN DE CODONES A AMINOCIDOS CONCRETOS
Durante la traduccin, el ribosoma aade un aminocido al polipptido en formacin por

cada tres bases del ARN mensajero (un codn). Esta asignacin se hace mediante el
reconocimiento codn / anti-codn, donde una molcula de ARN transferente, portadora de
un aminocido concreto, se asigna a cada codn del ARN mensajero.
Ejemplo.- Al codn "AUG" se le acopla el anti-codn "UAC" del ARNt, y de esta forma se
aade la metionina a la nueva protena. Luego el ARNt vuelve al citoplasma para buscar
unirse a otra metionina.
Cada nucletido tiene un solo complemento, "A" y "U" son complementos, y tambin "G"
y "C". De esta forma cada codn tiene un solo anti-codn, y cada anti-codn tiene un solo
codn. Sin embargo, algunos aminocidos tienen varios codones y por lo tanto anti-
codones asociados.
El codn AUG codifica para metionina, y adems sirve como sitio de iniciacin; el primer
AUG en un ARNm codifica el sitio donde se inicia la traduccin de protenas.
Codn de Inicio.- Generalmente el codn AUG, el que codifica a la metionina es el

responsable de la incorporacin del aminocido correspondiente al polipptido, al mismo
tiempo acta fe forma especfica como codn de inicio en la mayora de los cosas; es decir
que en la sntesis de la mayora de protenas comienza en un codn AUG, explicando as
que la metionina siempre ocupa la posicin inicial o N-terminal de cualquier polipptido
recin sintetizado.
Codn de terminacin.- Los codones UAA, UAG y UGA no codifican aminocido

alguno, sino que causan la finalizacin de la sntesis proteica, por lo tanto se los denomina
codones de terminacin, de paro, de stop, o tambin codones sin sentido.
La presencia de 3 codones de terminacin en un total de 64 indicara, que estadsticamente

la sntesis no se alargara ms all de unos 20 aminocidos. Sin embargo la regin
estructural de los genes para protenas contiene una frecuencia mucho menor de codones de
terminacin.
La regin del ADN comprendida entre un codn de inicio y uno de terminacin se llama
marco abierto de lectura.
Jimena Moreno O. 22
3.6.- QU ES UN VECTOR?
Son molculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan
insertados que denominamos inserto.
Para que un vector sirva, debe ser una molcula debe ser capaz de replicarse junto con el
fragmento de ADN que transporta y tener secuencias de reconocimiento que permitan la
insercin del fragmento de ADN a clonar. Los vectores que transportan un fragmento
insertado se denominan vectores recombinantes.
http://www.arrakis.es/~ibrabida/viginsercion.htmlhttp://uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.pdf
Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restriccin, la cual se
mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/Recombinant_DNA_Technology/05t.html
Caractersticas generales de los plsmidos como vectores de clonado
Hay muchos vectores de clonacin, que difieren en la especificidad de la clula husped,

como es:
* El tamao de los insertos que pueden transportar
* El nmero de copias que producen
* El nmero y tipo de genes marcadores que contienen.
Jimena Moreno O. 23
Sitios de restriccin nicos
Marcadores genticos
(Permiten seleccin pBR322
de transformantes) 4361 bp
Origen de replicacin
Tamao pequeo
(Mayor eficiencia de transformacin)
http://lnx.futuremedicos.com/Revista_future/Articulos&Trabajos/Basicas/bq/clonacion_DNA.htm
Tipos de vectores
A) Vector de clonacin
Molcula de ADN originada en un virus, en un plsmido, o en la clula de un organismo
superior en el que se puede integrar otro fragmento de ADN sin que pierda la capacidad de
auto-replicacin.
B) Vector lanzadera
Pequeo plsmido capaz de producir transfeccin en clulas de dos especies diferentes.
Poseen dos orgenes de replicacin, cada uno adecuado a un tipo celular; y los genes
requeridos para la replicacin que no les proporcionan las clulas hospedadoras.
C) Vector de expresin
Pequeo plsmido que contiene un lugar de clonaje mltiple flanqueado por una o dos
secuencias promotoras, los cuales se requieren para transcribir los fragmentos de ADN
insertados en el lugar de clonaje mltiple.
D) Vector de reposicin
Vector de clonaje que tiene un par de lugares ruptura flanqueando una secuencia
dispensable; durante el clonaje esta secuencia se reemplaza por una de ADN exgeno.
Jimena Moreno O. 24
Ejemplos de vectores
Plsmidos.- Son molculas de ADN circular o lineal que se replican y transmiten

independientemente del cromosoma, su tamao va de 1 kb a 250 kb y contienen de 2
hasta 30 genes.
Fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y an son ampliamente usados, proceden
de molculas de ADN de doble cadena extra cromosmicas que se encuentran de manera
natural y que se replican autnomamente dentro de las clulas bacterianas.
http://genemol.org/biomolespa/plasmidos/plasmidos-01.html
Episoma: Si el plsmido posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le

denomina episoma. Dentro de este grupo de plsmidos se encuentran los factores de
fertilidad o plsmidos F, que regulan el proceso de conjugacin bacteriana.
pUC18
Es un plsmido muy utilizado, ya que presenta unas caractersticas que son muy
beneficiosas:
- Es pequeo, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente
grandes (de unos 10.000 pares de bases).
- Tiene un origen de replicacin y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos
de ADN insertado por clula.
- Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para
enzimas de restriccin que se han agrupado en una regin denominada polylinker o
sitio mltiple de clonacin.
- Permite la identificacin sencilla de los plsmidos recombinantes, ya que contiene
un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se
inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a
colonias de color blanco.
Bacterifago lambda ().- Para ser utilizado de vector, el tercio central de su

cromosoma puede ser reemplazado por ADN forneo, sin que ello afecte a la capacidad
del fago de infectar clulas y formar calvas.
Jimena Moreno O. 25
Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una
enzima de restriccin, con la misma enzima de restriccin cortamos el fragmento de ADN
de inters y los unimos con una ADN ligasa.
Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cpsides proteicas del
fago, y se introducen en clulas husped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores
se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de
ADN de inters en la clonacin.
Los vectores fgicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb (kilo bases).
Csmidos.- Los csmidos son vectores hbridos utilizando partes del cromosoma de
lambda y de plsmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el
empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica.
Contienen secuencias plasmdicas necesarias para la replicacin y genes de resistencia a

antibiticos y pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.
YAC.- Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telmeros en
sus extremos, un origen de replicacin y un centrmero. Estos componentes estn
unidos a genes marcadores de seleccin y a un grupo de enzimas de restriccin para
insertar ADN exgeno.
Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100
a 1000 kb.
BAC.- Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plsmido de

fertilidad (factor F) de bacterias.
El factor F es un plsmido que se replica independientemente y que transfiere informacin
gentica durante la conjugacin bacteriana.
Los BAC pueden transportar insertos de hasta 300 kb.
3.7.- TRANSFORMACIN EN UN HUSPED DE ESCHERICHIA COLI
La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme utilidad, que nos

permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su forma circular o sper enrollada
en casi cualquier tipo de bacteria. El mtodo ms utilizado para transformar E. coli, por su
simplicidad.
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-
biolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACI%C3%93N%20E%20COLI%2
0CON%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
Jimena Moreno O. 26
El proceso por el cual un vector plasmdico es introducido y mantenido de forma estable en
una bacteria se denomina transformacin. Para detectar la transformacin, el ADN
introducido llevar un marcador seleccionable en el medio adecuado.
En la bacteria E. coli este proceso no ocurre de forma natural y ha de inducirse en el

laboratorio. Para facilitar este proceso, se tratan las bacterias con calcio incubando en fro
(a unos 4 C) lo cual estimula la apertura de poros que facilitan la entrada de ADN
exgeno. A estas bacterias susceptibles de incorporar ADN exgeno las denominamos
bacterias competentes y por ltimo se usa un vector plasmdico.
Clonacin de ADN en Escherichia coli.
Para replicar el ADN clonado se pueden utilizar distintos tipos de clula husped. Uno de
los huspedes ms utilizados es la cepa de laboratorio K12 de E. coli, esta y otras cepas de
E. coli se utilizan como husped ya que estn bien caracterizadas genticamente y pueden
aceptar un amplio espectro de vectores, incluyendo los plsmidos, los fagos y los csmidos.
Huspedes de expresin microbiano E. coli
Ventajas
Gran cantidad de vectores a usar
Altsima eficiencia de transformacin
Fermentaciones muy bien conocidas
Recuperacin y lisis celular muy sencilla
Desventajas
Problemas de contaminaciones con pirgenos
A veces baja expresin
No glicosila las protenas
Protenas no se exportan
PROCEDIMIENTO
Si se utiliza un plsmido como vector, el procedimiento precisan varios pasos:
1) El ADN que se va a clonar se asla y se trata con una enzima de restriccin para
crear fragmentos que acaben en secuencias especficas.
2) Estos fragmentos se ligan a molculas de plsmido que han sido cortadas con la
misma enzima de restriccin, obtenindose un vector recombinante.
3) El vector recombinante se transfiere a clulas husped bacterianas, generalmente

por transformacin, un proceso en el que las molculas de DNA cruzan la
membrana de la clula husped transfirindose a su interior.
4) La clula husped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formar colonias.
Puesto que las clulas de cada una de las colonias provienen de una sola clula
Jimena Moreno O. 27
inicial, todas las clulas de la colonia, y los plsmidos que contienen, son
genticamente idnticas, o clones. Se rastrean las colonias para identificar las que
han incorporado el plsmido recombinante.
Los vectores plasmdicos penetran en las clulas de E. coli mediante un proceso de

transformacin inducido por cloruro clcico o mediante electroporacin a 3-24 kV /cm, que
es eficaz en bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNA-recombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf
Resumen:
Los vectores plasmdicos se aslan y se cortan con una enzima de restriccin.
El ADN a clonar se corta con la misma enzima de restriccin, produciendo una
coleccin de fragmentos.
Estos fragmentos se reparten entre los vectores y se transfieren a huspedes
bacterianos para su replicacin.
Las clulas bacterianas que contienen plsmidos pueden identificarse por
crecimiento en un medio selectivo, y pueden aislarse.
El ADN clonado puede recuperarse del husped bacteriano para nuevos anlisis.
Jimena Moreno O. 28
Ejemplo de transformacin con el Plsmido pBluescript (pBL).
La introduccin de ADN exgeno en las bacterias competentes es un proceso muy ineficaz,

y por ello es necesario utilizar un mtodo que nos permita identificar al reducido nmero de
bacterias que han incorporado y mantenido de forma estable el plsmido con el que las
hemos transformado.
Con este objetivo a los plsmidos se les ha dotado de un sistema de seleccin, que en el
caso de pBL consiste en un gen de resistencia a la ampicilina. Este gen confiere a las
bacterias transformadas con el plsmido un fenotipo fcilmente diferenciable: slo las
bacterias que han incorporado el plsmido sern capaces de crecer en presencia del
antibitico ampicilina cuando son sembradas en una placa Petri conteniendo medio de
cultivo con el mencionado antibitico.
http://www.genomics.agilent.com/files/manual/212205_a01.pdf
Este esquema del vector plasmdico p Bluescript II sk (-) indica;
- El origen de replicacin (pUC ori)

- El gen que confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina
- El origen de replicacin del bacterifago filamentoso f1 (f1 (-) ori)
- El promotor del gen lac (P lac)
- El gen lacZ que codifica para la b-Galactosidasa (lacZ)
- El sitio de clonaje mltiple (MCS), que aparece descrito con mayor detalle debajo
del esquema del vector.
Jimena Moreno O. 29
3.8.- PRODUCCIN DE LA INSULINA RECOMBINANTE
La produccin de insulina humana en E. coli a partir de 1980 y su aprobacin para uso

clnico en 1982 revolucionaron la biotecnologa.
La insulina es el primer caso de protena producida por ingeniera gentica, esto fue posible
por el desarrollo de tcnicas que permitieron transferir informacin gentica de un
organismo a otro y expresar esa informacin en el organismo husped.
Biologa Molecular
Mtodo tradicional
http://www.fq.edu.uy/~microbio/MGral/T2008/IngGen2008color.pdf
La biotecnologa est presente en la vida cotidiana, y ofrece sus beneficios. La salud

humana es uno de los aspectos que se ha visto favorecido a partir de los avances cientficos
logrados en las ltimas dcadas.
En la actualidad, varios laboratorios farmacuticos producen insulina humana, tanto a partir

de levaduras, como de bacterias (Escherichia coli); y sin ningn riesgo para la salud, es
decir que la vida de millones de diabticos en el mundo depende de la insulina humana
recombinante.
Jimena Moreno O. 30
En 1978 se logr la clonacin en donde se produjeron una gran cantidad de copias idnticas
de bacterias capaces de producir insulina, introduciendo el gen para la insulina en clulas
distintas a donde es producida su naturaleza propia.
http://www.publicaciones.ujat.mx/publicaciones/kuxulkab/ediciones/27/05_Producci%C3%B3n%20de%20insulina%20a%20partir%
20de%20organismos%20bacterianos.pdf
http://www.educa2.madrid.org/cms_tools/files/6046b373-a0b6-4737-8f6b-4553dfefcd53/11.-%20Genetica%20bacteriana.pdf
Jimena Moreno O. 31
La estrategia seguida para la produccin de insulina humana recombinante, es en primer
lugar; sintetizar qumicamente las cadenas de ADN con las secuencias correspondientes a
las cadenas de glicocola y fenilalanina, siendo necesarias 63 nucletidos para la primera y
90 para la segunda, ms un triplete para sealar el fin de la traduccin.
Adems, para facilitar la separacin de los productos sintetizados, se aadi a cada gen el
triplete correspondiente a la metionina
http://www.iqb.es/d_mellitus/historia/historia07.htm
Los genes sintticos A y B se insertaron por separado en el gen bacteriano responsable de la

b-galactosidasa presente en un plsmido. Los plsmidos recombinantes se introdujeron en
E. coli donde se multiplicaron, fabricando un ARNm que tradujo una protena quimrica,
en la que una parte de la secuencia de la b-galactosidasa estaba unida por una metionina a
la cadenas de glicocola o de fenilalanina de la insulina. Como ninguna de las cadenas de
insulina contiene metionina, esto se aprovech para separar las cadenas de la insulina del
resto de protena quimrica rompindola con bromuro de ciangeno un producto qumico
que separa la protena de fusin de la -galactosidasa; es decir destruye la metionina.
Una vez purificadas las dos cadenas, se unen mediante una reaccin que forma puentes
disulfuro y se obtiene insulina humana pura, siendo el producto final, insulina humana
biosinttica idntica en todos los aspectos a la insulina purificada del pncreas humano.
Si bien estos son los pasos a seguir para la obtencin de insulina recombinante, si se inserta
en el plsmido bacteriano el gen entero de la insulina, se obtendra como resultado la pre-
proinsulina, por lo que para evitar estas dificultades se sintetizan qumicamente las
secuencias de ADN correspondiente a las cadenas polipeptdicas A y B que se insertan
separadamente en un gen bacteriano.
Jimena Moreno O. 32
En una explicacin ms detallada se ve que en el proceso bacteriano original, se
construyeron genes sintticos de las subunidades mediante sntesis de oligonucletidos, con
63 nucletidos para A y 90 para B. Cada oligonucletido sinttico se insert en un vector
en una posicin adyacente al gen que codifica la forma bacteriana de la enzima -
galactosidasa.
Cuando se transferan a un husped bacteriano, el gen lacZ y el oligonucletido sinttico

adyacente se transcriban y se traducan como una unidad denominada polipptido de
fusin, contenan la secuencia aminoacdica de una de las subunidades de la insulina.
Las protenas de fusin se purificaban de los extremos bacterianos y se trataban con

bromuro de ciangeno. Cuando se mezclan las dos subunidades se unen espontneamente,
formando una molcula de insulina intacta y activa.
KLUG WILLIAM S. Conceptos de Gentica, 8 ed. Pearson Educacin, 2006. Captulo 22 Aplicaciones y tica de la biotecnologa.
Jimena Moreno O. 33
Despus de asegurarse de que el gen transferido se expresa, se producen grandes cantidades
de la bacteria transformada, y la protena humana se recupera y se purifica.
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=3&note=21
Jimena Moreno O. 34
Captulo IV
Ingeniera Gentica en la Industria y Sociedad
4.1.- LA INSULINA A NIVEL INDUSTRIAL
La primera protena recombinante aprobada como medicamento fue justamente la insulina,

en 1982, para el tratamiento de pacientes con diabetes mellitus. Hasta ese entonces los
pacientes deban inyectarse insulina extrada del pncreas de vacas o cerdos.
Despus de la comercializacin de la insulina por la compaa Eli Lilly en Estados Unidos,

se han desarrollado distintos mecanismos de penetracin de la insulina al organismo, de
modo de procurar una mejor calidad de vida a quienes necesitan del suministro exgeno de
la misma, evitando su introduccin al organismo por inyeccin.
http://www.biopositivizate.com/docs/ASEBIO_BIOTECNOLOGIA_Y_SALUD.pdf
Algunas de estos avances consisten en el desarrollo de insulina cuya va de entrada al

organismo es la inhalacin, o preparaciones en cpsulas que contienen en su interior
insulina, protegiendo a la molcula de la accin de los jugos gstricos que haban impedido
histricamente su administracin oral, lo cual fue desarrollada por cientficos de la India en
el ao 2004.
Hay que destacar que la insulina fue una de las primeras protenas cristalizadas, y la
primera en ser secuenciada, es por eso que hoy varios laboratorios farmacuticos producen
insulina humana, tanto a partir de bacterias como a partir de levaduras, de una manera ms
simple y sin ningn riesgo para la salud.
La Biotecnologa y la Industria Farmacutica en nuestra vida cotidiana
Los medicamentos que se venden en la farmacia se producen de diversas maneras. Las

molculas simples se producen por sntesis qumica, mientras que las molculas complejas
Jimena Moreno O. 35
generalmente deben ser purificadas a partir de microbios, plantas o animales. Los
inconvenientes de esta estrategia son los bajos rendimientos de produccin y el riesgo de
contaminacin del frmaco con toxinas o patgenos, como los virus.
Es por eso que en el caso de medicamentos proteicos, la industria farmacutica ha optado

por el camino de la ingeniera gentica o metodologa del ADN recombinante. Mediante
esta tecnologa se pueden obtener grandes cantidades de una protena, completamente
aislada de los componentes celulares del organismo de origen.
Esto se consigue por introduccin de un gen en un organismo hospedador fcil de cultivar,

este organismo se denomina entonces "organismo genticamente modificado" y la protena
obtenida, "protena recombinante".
Insulinas producidas por plantas
Otra manera de produccin de insulinas mediante ingeniera gentica es el uso de plantas o

animales como productor a gran escala. En tal sentido, la empresa canadiense de
biotecnologa SemBioSys Genetics, ha desarrollado una planta transgnica que produce
insulina. La hormona se obtiene de cultivos de crtamo, una planta oleaginosa que se ha
modificado genticamente con el gen humano productor de insulina.
Los primeros ensayos con animales han demostrado que la hormona fabricada a partir de
esta planta es equivalente, desde el punto de vista qumico, estructural y funcional, a la
insulina humana farmacutica.
Las pruebas tambin confirman que la insulina producida en crtamo es fisiolgicamente
equivalente a la hormona humana, por lo que podra ser empleada para tratar a personas con
diabetes tipo 1.
Se estima que si los prximos ensayos son positivos, este tipo de insulina producida por
plantas transgnicas podra estar en el mercado en tres aos; siendo el primer frmaco que
se obtiene de una planta modificada genticamente; permitiendo reducir los costes de
produccin de insulina en ms de un 40% y acelerar su fabricacin, ya que SemBioSys
Genetics cuenta con cultivos de este tipo en Canad, Estados Unidos, Mxico y Chile.
Jimena Moreno O. 36
Insulinas producidas por animales transgnicas
En 2007, Argentina se convirti en el nico pas del mundo capaz de producir insulina
humana con vacas transgnicas. Nacieron cuatro terneras sin parangn: todas ellas tienen
en sus clulas el gen que les permite producir en su leche esta hormona que se utiliza para
tratar la diabetes. Si bien la insulina fabricada en vacas transgnicas no est an en el
mercado, la dinasta Patagonia (el nombre con que se conoce a estas terneras), representa
un nuevo hito en el desarrollo de una plataforma tecnolgica para la produccin de
medicamentos: el llamado tambo farmacutico.
En el caso de la insulina obtenida en animales transgnicos, ha sido obtenida recientemente

empleando cabras y ganado vacuno; producindose en la leche de los mismos. Es de
destacar que la obtencin de insulina humana en la leche de vaca ha sido desarrollada por el
laboratorio de Biosidus de la Argentina, y que slo hay dos multinacionales farmacuticas
que producen la insulina a partir de leche, empleando cabras. Este tipo de investigacin y
de desarrollo biotecnolgico posiciona a la Argentina en un nivel muy privilegiado en la
biotecnologa a nivel internacional; estimndose que el medicamento podra estar en el
mercado en pocos aos.
Estos animales transgnicos son portadores del gen de la insulina de manera inocua,
expresndose en el tejido mamario.
En caso del desarrollo biotecnolgico de la empresa Biosidus, las terneras denominadas

Patagonia I, II, III y IV nacieron entre Febrero y Marzo de 2007. Son terneras de Raza
Jersey que poseen en su material gentico el gen del precursor de Insulina humana. Una vez
que hayan alcanzado su madurez sexual sern estimuladas para estudiar los niveles de este
precursor en su leche. La leche con el precursor de insulina humana es slo una etapa
intermedia del proceso de produccin.
El paso siguiente a partir de la obtencin de dicho precursor ser la optimizacin del
proceso de aislamiento y purificacin, a escala industrial, de la insulina humana a partir de
leche bovina.
Biorreactor
La glndula mamaria es un Biorreactor de alta productividad pues constituye un tejido

especializado para la eficiente produccin de protenas. Aprovechando esta capacidad,
mediante el uso de herramientas de biologa molecular, es posible colocar la informacin
gentica de una protena humana para que sea producida en altas cantidades en la leche.
Para ello, el gen del precursor de insulina humana fue programado para que slo se active
en las glndulas mamarias del animal.
Esta estrategia gentica permite que un gen, que se encuentra presente en todas las clulas
de un organismo, se muestre activo o encendido solo en un tejido predeterminado y no en
otro. Para evitar los posibles efectos que la insulina pueda ocasionar sobre la fisiologa de
los animales transgnicos, se dise un precursor modificado, inactivo en los bovinos, para
que luego de obtenido en la leche se pudiera recuperar su forma farmacutica activa. A
partir del precursor de la insulina humana presente en la leche; el cual tiene un agregado de
Jimena Moreno O. 37
un pequeo fragmento de protena en la molcula, hace que cambie su estructura espacial y
la inactiva en el animal.
De esta manera, el proceso productivo consistir en la obtencin del precursor en la leche,
su procesamiento molecular para la obtencin de la molcula activa y su purificacin final
para la obtencin del producto farmacutico.
Es as como la glndula mamaria de estos animales se convierte en un verdadero
Biorreactor especfico y de alta productividad.
Exhaustivas pruebas de seguridad y eficacia permitirn, durante ese perodo, cumplir con
todos los requisitos regulatorios indispensables para obtener la aprobacin del producto por
la autoridad competente. Ser entonces que se habrn logrado las condiciones necesarias
para llevar al mercado farmacutico un nuevo producto de aplicacin en medicina humana.
Jimena Moreno O. 38
Beneficios de la produccin de insulina en plantas y animales transgnicos
El director ejecutivo de SemBioSys, Dr. Marcelo Criscuolo, explic que el tratamiento con
insulina, al igual que otros basados en la accin de protenas con baja actividad especfica,
como la hormona de crecimiento humana o los anticuerpos monoclonales, requieren un
sistema de produccin de alta escala para poder abastecer la demanda de los mismos a un
costo razonable.
Para ser efectivo, el tratamiento con insulina requiere su administracin cotidiana, lo que
significa un muy elevado costo para el paciente y para todo el sistema de salud. Esta
estrategia de produccin ofrece sustanciales mejoras en los rendimientos finales, sobre todo
cuando se la compara con aquellos sistemas desarrollados en bacterias o clulas en cultivo.
Tomando el ejemplo de Biosidus, la obtencin de estos nuevos animales transgnicos

representa un gran avance en los planes de investigacin y desarrollo de esta empresa
donde han trabajado ms de 50 cientficos en el proyecto, y resalta su alta capacidad
cientfica y tecnolgica, ubicndola entre las mejores empresas innovadoras a nivel
mundial.
Este tambo farmacutico permitir una alternativa tecnolgica de alta productividad y
bajo costo para abastecer esta enorme y creciente demanda.
La obtencin de insulina humana recombinante mediante mtodos ms eficientes como los

que aporta la tecnologa de plantas y animales transgnicos permitir abaratar los costos de
produccin sin deterioro de la calidad del producto.
4.2.- PRODUCCIN DE HORMONAS EN OTRAS BACTERIAS
La Insulina, la Somatostatina, el interfern, la hormona del crecimiento, la FSH; no son

modelos de produccin mediante Ingeniera Gentica del ADN recombinante sino tenemos
tambin la produccin de: Factores de crecimiento, interleukinas, receptores, vacunas,
anticuerpos monoclonales, enzimas, hemoglobina, etc. utilizando distintos vectores y segn
la complejidad de la protena a producir, se elegir un organismo u otro como es las
levaduras, bacterias, insectos, clulas de mamferos.
Protenas recombinantes a partir de bacterias
Las protenas sintetizadas a partir de bacterias son las ms fciles de aislar, puesto que es
ms fcil cultivarlas que otros organismos.
Sin embargo, las bacterias no realizan splicing y tampoco glicosilan ni realizan todas las
modificaciones pos-traduccionales necesarias para la funcin de la protena.
Jimena Moreno O. 39
Protenas recombinantes a partir de levaduras
Las levaduras son organismos eucariotas con los que podemos trabajar fcilmente en un
mbito industrial.
La levadura s realiza glicosilacin, pero de forma distinta a como la realizamos los
humanos. Debido a ello estas protenas pueden ocasionar problemas de inmuno respuesta.
Protenas recombinantes a partir de clulas de insectos
Otro de los sistemas utilizados son clulas de insecto. En este caso, podemos aceptar dos
variedades de producir estas protenas:
En primer lugar, podemos poner esas clulas en un medio especial e inocular con
bculo-virus, que no resultan malvolos para los humanos, es decir no los infectan.
En segundo lugar podemos utilizar insectos completos para la produccin de la

protena. En estas alternativas, la glicosilacin sigue siendo un problema, puesto que
suele ser distinta. Los humanos realizamos glicosilaciones complejas que no son
capaces de hacer los insectos y muchas veces, se buscan mutantes que sean capaces
de glicosilar de forma parecida a los humanos.
Protenas recombinantes a partir de cultivos celulares
En este caso, se est utilizando cultivos en los que si la protena se excreta, se purifica el
lquido y si es intracelular, rompemos las clulas y purificamos. Para el escalado, hay que
tener en cuenta que las clulas crecen por adhesin.
Si utilizamos clulas de mamfero, ya se acerca mucho a la glicosilacin de los humanos,
ser en este caso bastante complejo esas modificaciones post-traduccionales, pero no sern
idnticas en muchos casos.
Los inconvenientes es que suelen ser cultivos lentos, y adems aumentando en gran medida
el riesgo de contaminacin fngica y bacteriana. Hay que saber que la glicosilacin del
hombre y del mono es distinta al resto de mamferos, de modo que no producimos el gal-
alfa-1,3-gal como azcar terminal. Y es que la glicosilacin vara en cada tejido, son como
etiquetas que las clulas realizan para llevar sus protenas de un lado a otro de la clula.
Adems son marcadores y ayudan a determinar el plegamiento, estructura y funcin de la
protena.
4.3.- LA BIOTECNOLOGA PARA DIAGNOSTICAR Y RASTREAR

ENFERMEDADES GENTICAS
Con el objetivo de estudiar y erradicar las enfermedades, la Biotecnologa ha desarrollado

en las ltimas dcadas una serie de aplicaciones mdicas en las que se destacan:
Biloga Molecular Tecnologas Protemicas
Jimena Moreno O. 40
Aplicaciones Genmicas Metodologa Bioinformtica
Terapia Gnica Bioingeniera
Farmacologa Medicina Regenerativa
Terapia Celular
Las nuevas tcnicas de Genmica, Protemica y Bioinformtica permiten detectar la

presencia de un gen o una protena responsable de una patologa
GENMICA.-Estudia los genes que conforman el ser humano como es su secuencia,
funcin y participacin en el desarrollo de enfermedades mediante tcnicas de PCR, Chips
de ADN y Kits de diagnstico.
PROTEMICA.- Estudia las protenas que conforman el ser humano: su secuencia,

estructura, funcin y participacin en el desarrollo de enfermedades
BIOINFORMATICA.- Hace uso de bases de datos y procesos algortmicos para

evaluaciones a gran velocidad como herramienta para estudiar enfermedades.
Jimena Moreno O. 41
TERAPIA GNICA.- Se basa en la modificacin de genes de una clula o de un tejido
enfermo, con el propsito de aliviar o eliminar la enfermedad.
Consiste en la adicin de genes teraputicos a las clulas para la produccin de una protena
deficiente/alterada o dar nuevas propiedades a las clulas, por ejemplo inducir una
respuesta inmune.
TERAPIA CELULAR.- Es un conjunto de tcnicas que se basan en la sustitucin de

clulas enfermas por clulas sanas.
Jimena Moreno O. 42
MEDICINA REGENERATIVA.- Busca la reparacin o regeneracin de rganos daados
a travs de mtodos puramente biolgicos. Se basa en el uso y manipulacin de clulas
vivas, creando sustitutos biolgicos para implantarlos en el cuerpo y as reparar, remplazar,
mantener o mejorar la funcin de un rgano o tejido.
Las tcnicas de Medicina regenerativa esperan ofrecer esperanzas en el tratamiento de
enfermedades degenerativas, como el Alzheimer o el Parkinson, antes del 2025.
INGENIERA GENTICA.- La Biotecnologa participa en la creacin de una nueva

generacin de vacunas ms seguras y eficaces. Vacunas elaboradas por medio de la
Ingeniera Gentica con virus modificados por para que no generen reacciones adversas, o
elaboradas con protenas obtenidas del virus, para evitar inyectar el virus entero; se usan
para el diagnstico clnico de infecciones virales o tipos de tumores.
Muchas enfermedades genticas se pueden diagnosticar en estadios prenatales usando la

biotecnologa. Los mtodos ms amplios para la deteccin de estas enfermedades son la
amniocentesis y la extraccin de vellosidades corinicas
En la amniocentesis, se utiliza una aguja para extraer fluido amnitico el cual es analizado
para detectar enfermedades cromosmicas y genticas.
Jimena Moreno O. 43
En la extraccin de vellosidades corinicas, se inserta un catter en el tero, se extrae una
pequea muestra de tejido del corin fetal; entonces se utiliza para realizar anlisis
citogenticos, bioqumicos y basados en AND recombinante.
SECTOR FARMACUTICO.- La biotecnologa aporta un nuevo desarrollo de frmacos

ms eficaces y especficos:
Sustitucin de procesos fsico-qumicos por biolgicos en la obtencin de

frmacos, como sntesis de vitaminas por fermentacin bacteriana, plantas y
animales como biofactoras.
Obtencin efectiva de sustancias antitumorales, protenas, factores de crecimiento,
anticuerpos monoclonales, vacunas
Diseo de frmacos especializados para tipos de pacientes determinados

permitiendo la asistencia individualizada.
Desarrollo de nuevas soluciones para enfermedades incurables gracias a los nuevos

descubrimientos en genmica y protemica
Menor coste y tiempo de produccin de los frmacos.
4.4.- INFLUENCIA DE SU PRODUCCIN EN LA SOCIEDAD.
Pues aunque parezca increble, hasta no hace mucho se usaban insulinas procedentes del
pncreas de ciertos animales.
Los primeros fueron los perros, de ellos se consigui aislar y producir por primera vez
insulina, all por el ao 1920 y tambin en ellos fue probada su efectividad, esta insulina
obtenida de los perros era escasa y contena demasiadas impurezas que provocaban graves
reacciones alrgicas.
Entonces lleg el turno a los bueyes (insulina bovina) y finalmente a los cerdos (insulina
porcina). Fue esta ltima la insulina de cerdo, la que estuvo en auge en todo el mundo hasta
la dcada de 1980, pues es prcticamente idntica a la insulina humana solo se diferencian
en un aminocido.
Jimena Moreno O. 44
Gracias a ella se salvaron millones vidas de personas diabticas. An hoy en da se sigue
comercializando en algunos pases.
Pero la gran revolucin en el proceso de fabricacin de insulina artificial se produjo en la

dcada de 1980, gracias a la ingeniera gentica y a la bacteria Escherichia coli que se
convirti en una verdadera fbrica de insulina, y lo que es ms importante, en grandes
cantidades.
Tambin se obtiene, de forma similar, a partir de una levadura: Sacharomces cerevisae y

asa con ello se garantiza el consumo mundial de insulina.
Recientemente, en 2007, una empresa de biotecnologa canadiense ha conseguido producir

insulina similar a la insulina humana a partir de una planta, el crtamo, modificada
genticamente con un gen humano. Aseguran que con ella se podran reducir un 40% los
costes de produccin y acelerar su fabricacin.
Usos de la biotecnologa
Tcnicas de identificacin forense.- Consiste en someter el ADN de una clula a la accin

de enzimas de restriccin, obtenindose una coleccin de fragmentos de diferentes
tamaos. Una sonda (secuencia de ADN marcada radiactivamente) especfica se unir a
determinados fragmentos en determinadas posiciones. Si el procedimiento se lleva a cabo
en zonas del ADN que sean polimrficas, esto constituye una especie de huella de
identificacin que es distinta a la de otro individuo, pues otro ADN, sometido a la accin
del mismo conjunto de enzimas de restriccin, rendir una serie de fragmentos diferente del
anterior, unindose la sonda entonces a otros, en diferentes posiciones. Esta huella gentica
es de amplio uso en criminologa y pruebas de paternidad siendo su fiabilidad altsima. Se
denomina anlisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccin o PLFR.
Tcnicas de diagnstico/ Proyecto Genoma Humano (PGH).- El genoma es el contenido

del material gentico de un organismo biolgico en un juego completo de cromosomas.
La perspectiva del PGH en medicina se basa en el postulado de que todas las enfermedades,
excepto el trauma, tienen un componente gentico. Las tcnicas de diagnstico consisten en
detectar anomalas genticas incluso antes de que se manifieste el fenotipo de la
enfermedad. Es importante tener en cuenta, que mediante esta tcnica se ha avanzado en el
diagnstico y pronstico de determinadas enfermedades genticas, pero que esto no va
necesariamente de la mano del desarrollo de terapias eficaces para solucionar el problema
por lo que el conocimiento del riesgo de manifestar una determinada enfermedad gentica
puede ser una carga innecesaria para el paciente.
Terapias gnicas.- Es la administracin de material gentico en un paciente con la

intencin de corregir un defecto gentico especfico. Se puede utilizar para curar
enfermedades hereditarias y adquiridas y se puede llevar a cabo en clulas somticas o en
clulas de la lnea germinal. En USA las enfermedades hereditarias para las cuales se
encuentra aprobado el uso de la terapia gnica son enfisema pulmonar, fibrosis qustica,
hipercolesterolemia familiar e inmunodeficiencia combinada severa (nios burbuja).
Jimena Moreno O. 45
Entre las enfermedades adquiridas, son factibles de tratar en dicho pas mediante terapia
gnica SIDA y algunos tipos de cncer.
Clonacin y transferencia nuclear.- El clon es la copia fiel del original. Este

procedimiento lleva a cabo la particin de un embrin, o separacin de blastmeros toti-
potentes (clulas toti-potenciales son aquellas capaz de dar origen a un individuo completo)
en embriones pre-implantatorios de 2-32 clulas. Esta tcnica conlleva muchas
controversias y dudas de ndole valrica.
Clulas madre embrionarias y de adultos.-Despus de la fecundacin, el embrin

unicelular tiene la capacidad de empezar a desarrollar un individuo humano completo; sin
embargo, durante las sucesivas divisiones celulares el ADN va sufriendo una serie de
plegamientos que hacen ilegible la informacin de numerosos genes. Estas clulas con
plegamientos de su ADN no dan lugar a un embrin completo sino a estirpes celulares
diferenciadas, denominndolas clulas pluripotenciales. Cuando estas clulas
pluripotenciales son capaces de multiplicarse y proporcionar as clulas con el fin de
reparar y renovar los tejidos donde pertenecen, se denominan clulas multipotenciales.
Estas clulas estn presentes en la mayora de los rganos de los seres humanos adultos y
su funcin es renovar las poblaciones de clulas que van envejeciendo.
Las clulas pluripotenciales y las multipotenciales se consideran clulas madre o
stemcells.
La utilizacin teraputica de clulas madre intenta reparar tejidos daados utilizando
mecanismos similares a los que de forma natural usa el organismo para este fin. El debate
tico es si utilizar clulas madre embrionarias o clulas madre de un individuo adulto. Hoy
en da existen estudios prometedores en relacin a la utilizacin de clulas de mdula sea
para la recuperacin del sistema inmunolgico y hematopoytico en pacientes tratados con
quimioterapia como en pacientes con neoplasias hematolgicas.
Tcnicas reproductivas.- Se han utilizado en algunos animales con el fin de mejorar las
especies. El proyecto Proteoma Humano, consiste en analizar, desde todo punto de vista,
las protenas que conforman el cuerpo del ser humano. Est sometido tambin a
cuestionamientos ticos y se encuentra an en etapa de proyecto.
Aplicaciones de la ingeniera gentica.- Actualmente, se presta mucha atencin a los
posibles usos prcticos del ADN recombinado. En general, existe entre la poblacin un
cierto "miedo" a los experimentos genticos. Pero hay que decir que el clonado de genes y
su expresin en forma de productos proteicos por clulas de E. coli o de levaduras hace
posible la produccin comercial de muchas protenas de utilidad prctica que, de otro
modo, son muy difciles de obtener en abundancia. Los genes de algunas protenas
necesarias en medicina han sido clonados.
La insulina, que se obtena a partir de pncreas de cerdo, se puede hoy obtener de cultivos
bacterianos que contienen el gen humano clonado, con lo cual proporcionan una insulina
con la misma secuencia de aminocidos que la humana, cosa que no ocurra con la insulina
porcina, lo que hace a la insulina obtenida en E. coli utilizar actualmente en el tratamiento
de la diabetes mellitus, al igual como ocurre con la hormona de crecimiento
(somatotropina) que se administra a pacientes que padecen enanismo.
Jimena Moreno O. 46
Los interferones, agentes antivirales naturales y potenciales anticancergenos, pueden
aislarse a partir de leucocitos de la sangre, pero el rendimiento es de tan solo 1 microgramo
por litro, y por ello son productos muy caros. Los genes de los interferones pueden ser
clonados y expresados en bacterias, que crecen con facilidad y producen interfern en
grandes cantidades. Tambin podran producirse en gran cantidad varias protenas de
utilidad en agricultura.
La incorporacin de los genes de las enzimas y de otras protenas, que participan en la
fijacin de nitrgeno en los genomas de las plantas de cultivo que normalmente no fijan el
elemento, podra tener un xito mundial absoluto.
La Biotecnologa lleva a una nueva concepcin de

la Medicina, desde una Medicina orientada a los
sntomas; a una nueva Medicina personalizada
orientada a la respuesta teraputica de cada
individuo y a la prevencin de enfermedades.
Jimena Moreno O. 47
CONCLUSIONES
GENERAL
He logrado crear un texto educativo detallado y de fcil comprensin, mediante la
investigacin y recopilacin de informacin efectiva y certera a cerca de la Produccin
de Insulina Recombinante a travs de tcnicas de Ingeniera Gentica, alcanzando a
tener nuevos conocimientos para mi desarrollo y adelanto profesional, como personal.
ESPECIFCAS
Consegu una concepcin especfica de algunas definiciones
fundamentales de Ingeniera Gentica y Biotecnologa.
Ampli mis conocimientos sobre todo lo que es insulina y su desempeo

en el organismo humano.
Describ como se realiza la produccin de la Insulina Recombinante, sus

tcnicas y metodologa.
Logr explicar cmo es la influencia de la Ingeniera gentica en la

industria y sociedad.
Jimena Moreno O. 48
BIBLIOGRAFA
JSE LUQUE - NGEL HERREZ. Texto ilustrado de Biologa

Molecular e Ingeniera Gentica, Publicacin ELSEVIER SCIENCE,
Madrid-Espaa 2002.
KLUG WILLIAM S. Conceptos de Gentica, 8 ed. Pearson

Educacin, 2006.
www.bioetica.org
http://www.biotech.bioetica.org/clase2-2.htm
http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol36_s_02/D%20Publicaciones%20Tecnologia.pdf
www.cultek.com
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%20
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http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis/Docencia/Genet/Guion.pdf
http://www.med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/dnarec07.pdf
http://www.monografias.com/trabajos14/insulina/insulina.shtml
http://www.publicaciones.ujat.mx/publicaciones/kuxulkab/ediciones/27/05_Producci
%C3%B3n%20de%20insulina%20a%20partir%20de%20organismos%20bacterianos
.pdf
http://www.slideshare.net/biogelete/t16-el-adn-y-la-ingeniera-gentica
http://www.uco.es/
Jimena Moreno O. 49

Producción de Insulina Recombinate Mediante Ingeniería Genética

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UNIVERSIDAD

UNIDAD ACADMICA DE INGENIERA QUMICA,

Informe del Curso de Graduacin previo a la obtencin del Ttulo de

MONOGRAFA DE PRODUCCIN DE INSULINA

Autora: JIMENA MORENO ORTIZ.

Director: Ing. Willian Peralta Izquierdo.

Expreso mis ms sinceros agradecimientos:

Ante todo y sin lugar a duda, primero a Dios, por

Dedico todos estos aos que llevaron consigo

Tambin dedico a mis PADRES que me

Jimena Moreno O. iii

Actualmente la Biotecnologa y las novedosas Tcnicas de Recombinacin

Es importante sealar que en muchos casos la obtencin de estas sustancias

Propiedades importantes del ADN, hacen posible la evolucin ya que se divide

Siguiendo este razonamiento, y teniendo en cuenta muchas percepciones hacen

Las perspectivas que se establecen de nuevos descubrimientos varan desde un

Es por esto que el objetivo de esta monografa es la creacin de una fuente

1.1.- QU ES LA INGENIERA GENTICA?

La ingeniera gentica puede definirse como:

La manipulacin deliberada de la informacin gentica, con miras al anlisis gentico

Un conjunto de metodologas, nacidas de la Biologa Molecular que permite transferir

Este campo de la ciencia se dedica a investigar la posibilidad de recombinar artificialmente

La ingeniera gentica es una tcnica que consiste en la introduccin de genes en el genoma

Ejemplo, la integracin de un ADN vrico en un ADN celular.

1.2.- TCNICAS BIOTECNOLGICAS

La ingeniera gentica incluye un conjunto de tcnicas biotecnolgicas, entre las que

La tecnologa del ADN recombinante;

Fusin de materiales celulares:

1.3.- TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

La rotura especfica del ADN mediante nucleasas de restriccin, que facilita el

El proceso de produccin de un ADN recombinante comienza con la identificacin desde

En trminos simples, el procedimiento consiste en:

Localizacin de genes y sus funciones.

Se convierte la informacin almacenada en el ARNm en un segmento de ADN, utilizando

Una vez conseguido el ADNc correspondiente, se introduce en un plsmido o plasmidio,

El plsmido recombinante se introduce en un hospedador, ya sean vegetales, animales o

De entre todas las bacterias, se identifica

La importancia de estas enzimas radica en su gran especificidad de reconocimiento de una

Estas enzimas se agrupan en tres familias de acuerdo a sus propiedades:

Tipo I = Endonucleasa y metilasa en una misma protena (en distintas subunidades)

El mecanismo de corte de ADN se realiza a travs de la ruptura de dos enlace fosfodister

Extremos cohesivos. Extremos romos.

Enzimas virales que puede invertir la direccin normal de la transferencia de

Conocida como ADN polimerasa

1) La replicacin es un proceso semi-conservador.

2) La replicacin comienza en un punto del ADN.

Las dos cadenas de ADN se replican al mismo tiempo y comienzan en un punto

Comenzada en un punto de la molcula de ADN el proceso se desarrolla hacia los dos

4) La sntesis de ADN se desarrolla en direccin 5' 3'.

En una cadena, la inicialmente comentada en el punto anterior, la replicacin es continua y

El origen de la replicacin es una porcin de ADN que contiene una secuencia

La elongacin consiste en la formacin del cebador y la sntesis de la cadena de ADN. El

En la cadena retrasada se forma un conjunto proteico en el que se localizan siete protenas

En el caso de Escherichia coli con un cromosoma circular, las dos horquillas de la

La insulina ayuda al cuerpo a usar y a

La insulina es una hormona de naturaleza proteica con un peso molecular aproximado de

La integridad de la molcula es indispensable para ejercer las acciones farmacolgicas. Las

Estructura primaria de la Insulina: consta de dos cadenas de aminocidos enlazadas por

Un pncreas funcionando normalmente puede fabricar y liberar diariamente de 40 a 50

La insulina se produce en el Pncreas en los Islotes de Langerhans, mediante unas clulas

Las clulas beta fabrican insulina en diferentes etapas.

La primera es que la insulina se sintetiza en los ribosomas del retculo endoplsmico

La segunda es que la proinsulina, se transforma en insulina en el aparato de Golgi

Adicionalmente, existe captacin de zinc, formndose molculas de zinc-insulina.