INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE HUICHAPAN

INGENIERIA EN INNOVACION AGRICOLA SUSTENTABLE

PRCTICA 2. Cuantificacin de Clorofilas

Dr. Josu Addiel Venegas Snchez
Bioqumica.
Callejas Polo Alondra, Cervantes Flores Jos Antonio, Hernndez Reyes
Lourdes Gisel, Ramrez Godoy Jos

Las clorofilas son una familia de pigmentos de color verde que se encuentran en las
cianobacterias y en todos aquellos organismos que contienen cloroplastos en sus
clulas (plantas y protistas), es crtica en la fotosntesis, proceso que permite a los
organismos absorber energa a partir de la luz solar y transformarla en compuestos
orgnicos y oxgeno. La clorofila a utiliza para estimar la biomasa planctnica, y
todas las plantas verdes la contienen.

Constituye entre el 1 y 2% del peso seco de las algas planctnicas y el producto de

degradaciones: clorofilides, feoforbides y feofitinas.

La estructura de las molculas de clorofila:

Un anillo de porfirina que contiene

magnesio y cuya funcin es
absorber la luz. Una cadena
hidrfoba de fitol cuya funcin es
mantener la clorofila integrada en la
membrana fotosinttica.

Figura 1. Estructura de las molculas de clorofila

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Las clorofilas tienen tpicamente dos grupos de

absorcin en el espectro visible:

En la zona de la luz azul (400500 nm)

En la zona roja del espectro (600700
nm).

Las clorofilas reflejan la parte media de

color verde (500600 nm)

Figura 2. Ondas de la clorofila

La clorofila absorbe la energa solar necesaria para iniciar el ciclo fotosinttico de

muchas plantas y bacterias.

La molcula de clorofila puede absorber un fotn de estas longitudes de onda al

excitar un electrn de los que ocupan los orbitales moleculares que forman los
dobles enlaces conjugados C=C y C=N de la estructura central que rodea al tomo
de magnesio. Existen dos tipos principales de clorofila, la clorofila a y la clorofila b,
que se diferencian por la presencia de un grupo CH3 o CHO, respectivamente, en
uno de los anillos C4N. La presencia de este grupo funcional altera ligeramente la
estructura y energa de los dobles enlaces conjugados, dando lugar a espectros de
absorcin distintos para cada tipo de clorofila. As, la clorofila a en disolucin
alcohlica presenta mximos de absorcin en 430 nm y 662 nm, mientras que la
clorofila b los presenta en 453 nm y 642 nm. La posicin exacta de estos mximos
depende del disolvente que se utilice.
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OBJETIVO Y DESARROLLO DE LA PRACTICA

El objetivo de esta parte de la grfica es extraer los pigmentos de cloroplastos de

un material vegetal y determinar la cantidad de clorofila contenida en el mismo.

EXTRACCION DE PIGMENTOS:

PROTOCOLO 1. Extraccin con acetona

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas, con 5 ml de acetona

al 80%, disgregando el tejido vegetal en un mortero, de modo que los pigmentos
salgan al exterior y se disuelvan en acetona. Cuando la acetona est bien verde, el
macerado se introduce en un tubo de centrifuga de plstico y se centrifuga a 2000
rpm durante 10 minutos. Despus de centrifugar se obtiene un sobrenadante verde
que contiene los pigmentos. Ajustar el volumen final a 6ml con acetona al 80%.

PROTOCOLO 2. Extraccin con etanol

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas cortando las hojas
en segmentos de aproximadamente 5 cm que se introducen en un tubo de ensayo
con 6 ml de etanol al 80% de modo que los segmentos queden bien sumergidos en
el etanol. Incubar durante 20 minutos en un bao a 80 para que las clorofilas salgan
al exterior y se disuelvan en el etanol. Al cabo de este tiempo los segmentos debern
quedar totalmente decolorados y el etanol queda de color verde.

Medida de clorofila:

Se toman 0.5 ml del sobrenadante de cada uno de los extractos y se diluye hasta 5
ml con acetona al 80% en la extraccin con acetona al 80% en la extraccin con
acetona (protocolo 1) y con etanol al 80% en la extraccin con etanol (protocolo 2).
Despus se mide en un espectrofotmetro a longitudes de onda de 645 y 663 nm.

Para calculas las clorofilas totales aplicaremos la siguiente formula:

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RESULTADOS Y DISCUSIN

Hicimos las mediciones del macerado de acetona centrifugado en el

espectrofotmetro y tuvimos que realizar una disolucin en acetona, ya que el
primer resultado nos daba un valor de 3.000.

Tomamos .5 ml de la solucin ya obtenida y lo dems lo echamos en el contenedor

de residuos, realizamos la disolucin en 5 ml de agua, y ya con la disolucin
obtenida, tomamos un poco de la misma y, limpiamos con acetona la cubita de
cuarzo negra, una vez limpia la llenamos de la nueva disolucin y la introducimos
una vez ms al espectrofotmetro a una longitud de onda de 645, fui ah donde nos
dio el segundo resultado de 0.08, ya menor de 1.000.

Figura 3. Espectrofotmetro midiendo 0.208 (figura 3)

Una vez con el resultado, sacamos la cubita de cuarzo, e introducimos otra

transparente con acetona dentro para as resetear el espectrofotmetro, para poder
cambiar la onda a 663 y obtener el siguiente resultado que fue de 0.463.
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Figura 4. Espectrofotmetro midiendo 0. 463 (figura 4)

En la extraccin con etanol tuvimos que hacer tambin una sola disolucin, y hacer
el procedimiento anterior para obtener en la onda 645 un valor de 0.186.

Figura 5. Espectrofotmetro midiendo 0. 186 (figura 5)

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Reseteamos o limpiamos el Espectrofotmetro para poder medir ahora en onda 663,

siendo as nos dio el resultado de 0.320.

Figura 6. Espectrofotmetro midiendo 0. 320 (figura 6)

CONCLUSIN
Se extrajeron de forma correcta los pigmentos siguiendo correspondientemente la
metodologa de referencia y al finalizar el anlisis de los resultados, observamos
que nuestras muestras fueron ms claras que las de los otros equipos, pues
creemos que se debi a que le agregamos un poco ms de lquido a nuestra
muestra quedando as ligeramente ms clara, as mismo observamos tambin
distintos pigmentos fotosintticos separados.

ANEXOS

Figura 7. 0.05 g de hojas frescas (figura 7)

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Figura 8. Disgregacin del tejido

vegetal en mortero (figura 8)

Figura 9. Medicin de acetona y alcohol para realizar las soluciones (figura 9)

Figura 10. Centrifuga a 2000 rpm (figura 10)