SUMRIO

1-introduo.................................................................................2

2- Dessoro a laser....................................................................3

3- Ionizao por electrospray.......................................................3

4- MALDI......................................................................................4

5- Determinao precisa da massa molar de protenas..............4

6- Checagem da pureza de protenas e peptdeos.....................4

7- identificao de isoformas proteicas.......................................5

8- Confirmao da sequencia completa de aminocidos............5

9- Sequenciamento de protenas por MS/MS.............................6

10- Identificao de protenas.....................................................7

11- bibliografia............................................................................8

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INTRODUO

A espectroscopia de massa um mtodo emergente na quantificao de

protenas . Assim como a caracterizao das protenas um passo muito
importante na anlise protemica, a quantificao especfica de uma protena
tambm . Vrias tcnicas j foram implementadas para a quantificao por
MS. No geral, istopos pesados e estveis, como carbono (13C) ou nitrognio
(15N), so adicionados a uma amostra (peptdeos ou protenas), enquanto
seus correspondentes leves (12C e 14N) so adicionados a uma segunda
amostra (controle interno). Devido a diferena de massa das amostras,
possvel analisar a razo de intensidade entre os do pico de cada amostra, que
ir corresponder a sua abundncia relativa. Um segundo mtodo pode ser feito
atravs de MALDI (ionizao e dessoro a laser assistida por matriz). Ou seja,
as abordagens utilizando MS so vrias, e as amostras podem ser analisadas
tanto quantitativamente quanto qualitativamente, esse mtodo requer pessoas
especializadas na utilizao do instrumento e do valores de massa com
preciso de 0.001 %. Este tipo de preciso essencialmente importante
quando se quer determinar modificaes pstraducionais devido ao tamanho,
polaridade e baixa volatilidade dos peptdeos e protenas, sua anlise por
espectrometria de massa s se tornou realmente til aps a descoberta da
tcnica de ionizao por dessoro, a PDMS em 1974 e FAB em 1981

Os espectrmetros de massa revolucionaram o campo das cincias conhecido

como Qumica de Protenas, pois permitem a identificao de protenas com
relativa facilidade, Ao se conhecer uma massa molecular com grande preciso
(1/ 40000), torna-se possvel compar-la com as sequencias das ORF
conhecidas do genoma e, assim, identificar qual ORF geraria protena com
aquela massa molecular. Esse procedimento bastante preciso, mas nem
sempre suficiente. Os equipamentos com ESI geram fragmentos das
molculas; assim, com o auxlio de softwares adequados, compara-se no
somente a massa da protena inteira, mas tambm a dos fragmentos gerados.
Hoje tem-se genomas completamente sequenciados. A pergunta a ser ento
respondida quando e em que condies as clulas expressam certas
protenas. Sabe-se que as clulas apresentam mecanismos intricados de
controle. Esse controle normalmente feito por protenas que se expressam
nos diferentes estgios do desenvolvimento de um organismo. Com a
espectrometria de massa possvel identificar as protenas em baixa
concentrao e em poucos dias. Com os mtodos bioqumicos tradicionais
pode levar meses ou anos.

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Dessoro a laser

A palavra dessoro (desorption, em ingls) refere-se ao fenmeno de retirada

de substncias adsorvidas ou absorvidas por outras. No caso da
espectrometria de massa, a protena ou a mistura proteica ou peptdica

em estudo misturada a uma matriz cida e irradiada com um feixe de laser,

cuja energia causa a dessoro da molcula. A matriz cida transfere prtons
para as molculas de protena, fazendo que fiquem ionizadas positivamente. A
dessoro das molculas de matriz e de protena faz que elas passem para o
estado gasoso. Estar na forma ionizada e no estado gasoso condio para
que uma molcula possa ser analisada por espectrometria de massa. A
principal tcnica empregada na anlise de protenas baseada no fenmeno da
dessoro a laser conhecida como MALDI sigla em ingls para
matrixassisted laser desorption ionization.

Ionizao por electrospray

Ionizao por electrospray (ESI) Esta ionizao envolve a produo de ons

atravs da formao de um spray da soluo contendo o analito em um campo
eltrico. uma tcnica de ionizao considerada branda que possibilita a
anlise de biomolculas grandes na sua forma intacta, como protenas e DNA.
O eletrospray cria gotculas carregadas atravs de um processo de
nebulizao. O solvente (em geral uma mistura de gua e solvente orgnico
50:50) removido a medida que as gotculas entram no espectrmetro de
massas. O processo de ionizao no ESI ocorre devido aplicao de um forte
campo eltrico que age sobre a superfcie da gotcula. medida que o solvente
evapora na regio de alto vcuo, o tamanho da gotcula diminui gradativamente
at que sobre somente os ons livres do solvente. Molculas pequenas em
geral produzem ons monocarregados (com uma carga). Porm molculas
grandes como as protenas adquirem mltiplas cargas no processo de 3
ionizao. Essa caracterstica possibilita que molculas grandes possam ser
analisadas pelos espetrmetros de massas que em geral trabalham na faixa de
massa mxima de 2000 a 3000 Da. Por exemplo, protenas so analisadas no
modo de ionizao positivo pela adio de prtons. O nmero de resduos
bsicos na protena (principalmente lisina e arginina) determina o nmero
mximo de prtons que a molcula adquire. A distribuio de resduos bsicos
nas protenas tal que os mltiplos picos dos ons de uma protena [cada uma
com (M+nH)n+] em geral so centrados em torno de m/z 1000. Uma protena
grande com massa de 100 000 Da aparece como mltiplos ons com m/z
centrado em torno de 1020 Da. No exemplo, a protena com m/z de 1027.6
aparece com 100 prtons e, portanto sua massa M determinada resolvendo a

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seguinte conta (M+100)/100 = 1027.6, onde M=102 760-100=102 660. Esses
ons com mltiplas cargas podem ser processadas pelo computador resultando
ao final em um nico pico indicando a massa molecular da protena.

MALDI

A ionizao/desoro a laser assistida por matriz (MALDI) produz ons

protonados em fase gasosa pela excitao do analito que recebe energia
proveniente da absoro da energia do laser pelo componente presente na
matriz. A matriz constituda por um composto orgnico que absorve energia
na regio do comprimento de onda do laser (337 nm para laser de nitrognio e
355 nm para laser de Nd-YAG). Esta matriz misturada junto com a amostra.

A amostra co-cristalizada junto com a matriz adicionada em excesso. Pulsos

de laser de alguns nano-segundos de durao incidem sobre a amostra
causando uma rpida excitao e vaporizao da matriz cristalina que
acompanhada da ejeo simultnea do analito para a fase gasosa. Esses ons
na fase gasosa entram no analisador de massas do tipo TOF e so detectados.
A vantagem do MALDI a habilidade de produzir ons de molculas grandes na
forma intacta carregadas na sua grande maioria com uma ou duas cargas. O
TOF o melhor analisador a ser utilizado com o MALDI pois possui uma faixa
de deteco de massas ilimitada. Protenas de massas de at 400000 Da j
foram precisamente determinadas

Determinao precisa da massa molar de protenas

A espectrometria de massa uma das tcnicas analticas mais precisas

existentes. Consegue-se facilmente 5 ou 6 algarismos significativos nas
medidas de massa molar, com erros que podem chegar a apenas 0,001 % em
equipamentos de alta resoluo. A ttulo de comparao, na eletroforese em
gel, tcnica ainda muito utilizada para separao de misturas proteicas e
medidas de massas molares de protenas, conseguem-se erros de no mnimo 5
%. A preciso dos espectrmetros de massa tanta que possvel distinguir
duas molculas de 10.0 u que diferem entre si pela presena de apenas 1
carbono-13 (13C) na molcula, o carbono-12 (12C) o istopo mais abundante
na natureza. A espectrometria de massa , portanto, entre todas as tcnicas
existentes, a que possibilita a determinao mais precisa da massa molar de
protenas e peptdeos.

Checagem da pureza de protenas e peptdeos

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O estado de pureza de protenas e de peptdeos um aspecto extremamente
importante em qumica de protenas. A checagem dessa pureza pode ser feita
utilizandose a espectrometria de massa. De maneira geral, a existncia de um
pico nico em espectros de MALDI ou no espectro reconstrudo de ESI indica a
presena de apenas uma forma molecular. A presena de dois ou mais picos
demonstra a existncia de isoformas ou de contaminantes.

A checagem de pureza por espectrometria de massa um mtodo

consideravelmente mais sensvel e, devido a sua grande preciso, bem mais
fidedigno que outros mtodos existentes, como a cromatografia lquida, HPLC,
sigla em ingls para high performance liquid chromatography ,e a eletroforese.

Identificao de isoformas proteicas

Isoformas proteicas so protenas que tm a mesma funo, mas so

codificadas por genes distintos e apresentam pequenas diferenas em sua
sequencia. Por exemplo, o fator de transformao beta (TGF-B) existe em trs
verses ou isoformas (TGF-B1, TGFB2, e TGF-B3), cada uma delas capaz
de disparar uma cascata de sinalizao que comea no citoplasma e termina
no ncleo da clula. Essas isoformas so bastante difceis de separar pelos
mtodos usuais utilizados na purificao de protenas. Sua presena pode ser
demonstrada por meio da espectrometria de massa, desde que suas massas
molares sejam distintas. A ocorrncia de um pico nico cromatogrfico que
produza dois picos distintos e prximos em um espectro de massa sugere a
presena de isoformas proteicas, que pode ser confirmada por meio de
tcnicas de identificao de protenas.

Confirmao da sequencia completa de aminocidos

Se a massa molar calculada a partir de uma sequencia de aminocidos de uma

protena ou peptdeo, determinada experimentalmente, for igual quela
determinada por espectrometria de massa, pode-se concluir que a sequencia
em questo est correta. Cabe ressaltar que a existncia de aminocidos
isobricos, ou seja, aminocidos que possuem a mesma massa molar ou
massas molares muito prximas.

Sequenciamento por espectrometria de massa (CID-MS/MS). O espectro de

MS/MS rico em informaes de sequencia. A diferena de massa entre os
diversos picos pode auxiliar na deduo da sequencia do peptdeo, uma vez
que as ligaes preferencialmente clivadas pelo processo CID so as
peptdicas. Espera-se obter, em um espectro de MS/MS, picos
correspondentes s fragmentaes da cadeia peptdica em diferentes
posies, determinando as sries A, B, C, X, Y e Z, cujas massas auxiliam na

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deduo da sequencia do peptdeo. As sries B e Y, correspondentes aos
fragmentos provenientes da fragmentao apenas das ligaes peptdicas

Sequenciamento de protenas por MS/MS

Trabalhos de sequenciamento por espectrometria de massa so conduzidos

normalmente em equipamentos conjugados, ou seja, que possuem pelo menos
dois analisadores de massa. Tais equipamentos associam dois analisadores de
massa em srie e, por isso, a tcnica conhecida como MS/MS por aluso
espectrometria de massa (MS, sigla em ingls para mass spectrometry)
seguida de outra espectrometria de massa. Equipamentos tpicos de MS/MS
incluem espectrmetros de eletropulve- rizao com triplo quadripolo ou com
um quadripolo e um analisador TOF (Q-TOF), equipamentos do tipo
aprisionamento de ons (ion trap) e equipamentos com ionizao do tipo MALDI
com dois analisadores TOF (MALDI-TOF-TOF).

Nesse tipo de anlise, uma amostra de peptdeo puro ou mesmo uma mistura
de peptdeos obtidos por digesto enzimtica injetada no espectrmetro de
massa. No caso mais complexo de mistura de peptdeos, um peptdeo de
interesse selecionado no 1 filtro de massa, introduzido e acelerado em uma
cmara de coliso, onde existe uma corrente gasosa de um gs inerte, como
nitrognio ultrapuro. As colises entre as molculas do on peptdico e do gs
inerte provocam a fragmentao da cadeia polipeptdica. Esse fenmeno
chamado de dissociao induzida por coliso ,CID, sigla em ingls para
collision induced dissociation. As ligaes mais lbeis so justamente as
ligaes peptdicas, seguidas pelas demais ligaes da cadeia principal. Assim,
um espectro dessa fragmentao rico em informaes de sequencia Existe
uma nomenclatura para descrever os diversos fragmentos peptdicos passveis
de serem obtidos por CID-MS/ MS ,que auxilia na interpretao dos espectros
de MS/MS.

As vantagens do sequenciamento por MS/MS em relao aos mtodos

qumicos incluem a grande rapidez ,um experimento de MS/ MS pode ser feito
em menos de 5 min, o mesmo trabalho em um sequenciador automtico pode
demorar at dois dias , o baixssimo custo,enquanto o sequenciamento qumico
utiliza diversos reagentes de alto custo, a tcnica de MS/MS gasta
praticamente somente nitrognio , e a grande sensibilidade ,sequenciamento
qumico na ordem de picomol; MS/MS na ordem de femtomol. As desvantagens
so a difcil interpretao dos espectros, os resultados no costumam ser to

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claros como no sequenciamento qumico , e a grande dificuldade para se
distinguir os aminocidos isobricos. Aminocidos que possuem massas
molares muito prximas, tais como glutamina e lisina, fenilalanina e sulfxido
de metionina, bem como alguns aminocidos e dipeptdios, ou mesmo dois
dipeptdios, podem ser distinguidos em espectrmetros de massa mais
precisos.

Atualmente, existem programas que selecionam automaticamente os peptdeos

de interesse para fragmentao, tcnica chamada de CID dependente de
dados (data-dependent CID), ou mesmo que permitem que todos os peptdeos
que entram no espectrmetro de massa sejam fragmentados ao mesmo tempo,
mtodo conhecido como multiplexao. Esses programas tornam o
sequenciamento por MS/MS completamente automatizvel.

Sequenciamento de protenas por espectrometria de massa usando o

fenmeno do decaimento ps-fonte postsource decay (PSD)

Na espectrometria de massa com ionizao por dessoro a laser e anlise por

tempo de vo (MALDITOF), uma frao grande de ons do analito sofre
deteriorao durante o vo post-source decay (PSD) dentro do
espectrmetro de massa, aps o desligamento da fonte de laser. Dessa forma,
o espectro obtido de peptdeos de tamanho mdio (at 2.800 u) rico em
informaes de sequencia, apesar de o padro de clivagem ser diferente
daquele obtido por dissociao induzida por coliso. O mecanismo de ativao
parece ser determinado por eventos de coliso entre os ons e as molculas
neutras, no campo de acelerao. Essa tcnica de sequenciamento ficou
conhecida como PSD e s pode ser usada em equipamentos do tipo MALDI.

Identificao de protenas

A identificao de protenas um procedimento de capital importncia na

abordagem protemica. Um dos procedimentos utilizados para identificar
protenas em bancos de sequencias sem a necessidade de sequenciar a
protena em estudo a chamada impresso digital do mapa peptdico
(peptide mass fingerprint). Nesse mtodo, feita uma digesto enzimtica ou
qumica da protena, in vitro, seguida de uma anlise espectromtrica dos
peptdeos obtidos. As massas molares desses fragmentos peptdicos so ento
comparadas com massas de peptdeos provenientes de digestes tericas, in
silico, de protenas depositadas em bancos de sequencias. A identificao
probabilstica e a porcentagem de cobertura dos peptdeos da amostra com
relao protena pareada um dos principais parmetros de identificao

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Geralmente, o equipamento de escolha nesse caso o MALDI-TOF. O mtodo
da impresso digital do mapa peptdico praticamente infalvel e
particularmente til na identificao de protenas de espcies com genomas
pequenos e completamente sequenciados. Entretanto, o ndice de insucesso
na identificao aumenta medida que se aumenta o nmero de registros
confrontados no banco de dados utilizado na busca. Para protenas isoladas de
espcies cujo genoma no est sequenciado, necessrio usar bancos de
dados ampliados (sem restrio taxonmica). Nesse caso, imperativo utilizar
fragmentos de sequencia (sequence tags) para uma identificao mais
confivel, geralmente obtidos em equipamentos do tipo MALDI-TOF-TOF.

Bibliografia

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protinas O papel-chave da espectrometria de massa na era ps-genmica.
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Acesso em :18/05/2017

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Acesso: 18/05/2017