JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 1, Issue of January 3, pp.

304310, 2003

Molecular Basis of Bone Morphogenetic Protein-15 Signaling in Granulosa Cells

R. Kelly Moore, Fumio Otsuka and Shunichi Shimasaki

La protena morfognica sea 15 (BMP-15), es un factor de crecimiento de los ovocitos que

pertenece a la sper familia del factor de crecimiento transformante B, recientemente se ha
demostrado que es necesario para la fertilidad femenina normal en los mamferos. Hemos
demostrado previamente que BMP-15 regula la proliferacin y la diferenciacin (GC) clulas
de la granulosa; a saber, BMP-15 promueve la mitosis GC, suprime la expresin del receptor
de la hormona estimulante del folculo (FSH), y estimula la expresin del ligando kit. Aunque el
papel de BMP-15 en la reproduccin femenina ha merecido progresivamente mucha atencin,
no hay nada conocido hasta la fecha sobre la va de sealizacin y de los receptores de BMP-
15. El uso primario de GC de rata y una lnea celular humana GC, COV434, ahora hemos
descubierto que la administracin de BMP-15 produce una fosforilacin rpida y transitoria,
por tanto, la activacin de la va Smad1 / 5/8. BMP-15 tambin estimul la actividad del
promotor de un constructo indicador sensible BMP-selectiva, lo que demuestra an ms la
estimulacin de Smad1 / 5/8 en la sealizacin por BMP-15. En contraste, la estimulacin de
la BMP-15 en la fosforilacin de Smad2 era muy dbil. Para identificar los receptores de BMP-
15, que utiliz los dominios extracelulares recombinantes de factor de crecimiento
transformante individual? receptores de la superfamilia y encontraron que la activina similar al
receptor de la quinasa-6 dominio extracelular es ms eficaz co-inmunoprecipit con BMP-15,
mientras que el tipo de receptores BMP II de dominio extracelular fue ms eficaz en la
inhibicin de la BMP-15 de la bioactividad de la produccin de progesterona FSH inducida e
incorporacin GC timidina. Tambin se investig si la activacin de la va MAPK es necesaria
para la actividad biolgica de la BMP-15 y se encontr que la adicin de U0126, un inhibidor
de ERK1 / 2 fosforilacin, suprime la actividad de BMP-15 en mitosis GC pero no en la
produccin de progesterona inducida por FSH, lo que sugiere una cascada de sealizacin en
la proliferacin selectiva GC y la diferenciacin. En nuestros estudios anteriores in vitro en
ratas utilizando BMP-15 clulas recombinantes identificados de la granulosa (GCS) como el
tipo de clula diana predominante para BMP-15 (4). Estos estudios tambin identificaron tres
importantes funciones biolgicas de BMP-15 en el ovario (4-6). (I) BMP-15 es un potente
estimulador de la mitosis GC; (Ii) BMP-15 inhibe la expresin de mRNA del receptor de FSH
en los GC, lo que resulta en la supresin posterior de la sntesis de progesterona inducida por
FSH as como la expresin inducida por FSH de una batera de mRNAs en GC; y (iii) BMP-15
estimula la expresin de ARNm de ligando kit en GCs. Adems, se encontr que la actividad
biolgica de BMP-15 para ser inhibida por folistatina, que est altamente expresado por GCs
en los folculos en desarrollo (7, 8).
La importancia de la BMP-15 en la fertilidad del ganado ovino fue ejemplificado por la
demostracin de que ocurren naturalmente mutaciones en el gen BMP15 en Inverdale (FecX I)
y Hanna (FecXH). En ovejas causaron un aumento en la tasa de ovulacin en los
heterocigotos debido, en parte, a una aumento de la sensibilidad de FSH GCs pero caus la
infertilidad en los homocigotos debido a un bloque en la etapa primaria de la foliculognesis
(9). Los ratones con deleciones especficas en el gen BMP15 son subfrtiles, lo que
demuestra la importancia de la BMP-15 de la fecundidad en el ratn, as (10). El TGF?
superfamilia se compone de ms de 30 miembros, que se clasifican en la superfamilia en
base a la homologa estructural (1, 11). Una caracterstica comn de la mayora de los
miembros de la superfamilia TGFB es la presencia de siete restos de cistena conservados,
seis de las cuales forman una estructura caracterstica "cistena nudo" y uno de los cuales
forma un puente disulfuro entre dos subunidades, haciendo que la molcula de un dmero
unido covalentemente (12). Curiosamente, BMP-15 y su homlogo ms cercano, GDF-9, que
es tambin un factor de ovocitos derivados, son nicos entre la sper familia TGFB en que
carecen de la cuarta cistena conservado, que es responsable de la dimerizacin de las
subunidades (1). Por lo tanto, no se sabe si la BMP-15 existe dmeros como de forma no
covalente con enlaces o como monmeros.
A pesar de la importancia establecida de BMP-15 en la fertilidad femenina, los receptores y
vas de sealizacin de BMP-15 an tienen que ser identificados. Los receptores para la
mayora de los miembros de la superfamilia TGFB consisten en dos subconjuntos
estrechamente relacionadas de transmembrana serina / treonina quinasa de receptores, los
receptores de tipo II y el tipo I (13). Hasta la fecha, siete de tipo I y cinco receptores de tipo II
se han identificado en los mamferos. Tras la unin de TGF-dimrica los miembros de la
superfamilia de tipo I especfica y los receptores de tipo II, los complejos de receptores causan
la fosforilacin de molculas de sealizacin intracelulares denominadas Smads, que luego se
translocan al ncleo y regulan la transcripcin de genes diana (14-16).
Las Smads regulados por el receptor pueden ser agrupadas en dos subconjuntos; Smad2 y
Smad3 se activan mediante TGF? y activina, mientras que Smad1, Smad5, y Smad8 son
activados por BMPs. Para esta sealizacin que se produzca, el ligando debe unirse tanto a
los receptores tipo I y II, pero la especificidad de la ruta de sealizacin de Smad, que es
estimulado por un TGF-particular? ligando superfamilia, es determinada por el receptor de tipo
I (17). Adems de la sealizacin Smad, estudios recientes han demostrado que la mitogen-
activated protena quinasa (MAPK) la familia de molculas de sealizacin pueden modular la
transduccin de seales de TGF? miembros de la superfamilia a travs de la diafona con la
va Smad en ciertas circunstancias fisiolgicas (18).
Actualmente, no hay nada sabe acerca de los receptores o va de sealizacin de BMP-15.
Dada la estructura nica de BMP-15 en comparacin con otros miembros de la superfamilia
TGF, es posible que BMP-15 usa receptores nicos y de sealizacin; sin embargo, se ha
especulado que BMP-15 puede utilizar uno o ms de los receptores de activina establecido,
TGF ?, o BMP, y puede estimular una posterior va de sealizacin Smad (19-21). La
presencia de receptores de activina, que incluyen Act-II, ActRIIB, y activin receptor de la
quinasa-4 (ALK-4, tambin llamados ACTR-IB) receptores y BMP, que incluyen ActR-II,
BMPR-II, ALK-3 (BMPR-IA), ALK-6 (BMPR-IB), y ALK-2 (ActR-IA), as como molculas de
Smad se han identificado en GCs en varias especies de mamferos (19, 20, 22 a 29); sin
embargo, hay una escasez de los informes que demuestran la activacin funcional del estas
vas en cualquier modelo de GC. De las molculas de MAPK, extracelular-quinasa regulada
por seales 1/2 (ERK1 / 2) se expresan en GC y han sido ms estrechamente asociada con la
regulacin de la funcin GC (30-34).
En el presente estudio, investigamos si de BMP-15 puede utilizar previamente identificados
los receptores de la superfamilia TGF-B y pueden activar las vas especficas de sealizacin
Smad. Tambin investigamos si las molculas ERK1 / 2 sealizacin desempean un papel
en la mediacin de las actividades biolgicas de BMP-15. Para estos estudios, se utilizan dos
modelos de GC, primaria rata GCs de folculos antrales tempranos y una lnea celular humana
GC, COV434 (35). El modelo GC primarios de rata est bien establecida y se usa para
elucidar la actividad biolgica de recombinante BMP-15 por nuestro laboratorio (4-6). Las
clulas COV434 son una lnea celular humana inmortalizada GC que ha conservado la
capacidad de producir estradiol a la estimulacin FSH, lo que demuestra la presencia de
receptores de FSH funcionales (36).
RESULTADOS
Hemos demostrado previamente que recombinantes BMP-15 exhibe actividades biolgicas
especficas de rata primaria GC (4-6). Para investigar las vas de sealizacin de BMP-15, se
someti en primer lugar a lisados de GC primarios de ratas que fueron expuestas a BMP-15,
BMP-6, BMP-7, o activina-A a SDS-PAGE / anlisis de inmunotransferencia utilizando un
antisuero PS-1, que ha sido validado para detectar especficamente fosfo-Smad1 / 5/8.
Despus de una exposicin de 1 h de las GCs a BMP-15 (100 ng / ml), haba un aumento
pronunciado en la fosfo-Smad1 / 5/8, que tambin se observ en los lisados de GCs tratados
con 100 ng / ml BMP 6 y BMP-7 (Fig. 1A). En contraste, los lisados sin tratar (control) GCs y
GCs tratadas con 100 ng / ml de activina-A no mostraron ninguna cantidad significativa de
fosfo-Smad1/5/8. Una estimulacin similar de la va Smad1/5/8 por BMP-15, BMP-6 y BMP-7,
pero no por la activina-A. Se observ en una lnea celular humana GC, COV434 (Fig. 1B). El
mismo fosfo-Smad1 / 5/8 respuesta a estos factores de crecimiento tambin se observ en
clulas CHO-K1 (datos no presentados), lo que indica una estimulacin de BMP-15 en esta
va no se limita a los GC. Para caracterizar an ms la respuesta BMP-15 en clulas COV434,
analizamos el curso temporal de la presencia de fosfo-Smad1 / 5/8 despus de la
administracin de BMP-15. La presencia de fosfo-Smad1 / 5/8 fue evidente tan pronto como
15 min despus de la administracin de BMP-15, aument a 30 min, y alcanz un mximo de
1 h, y por 4 h era apenas detectable (Fig. 2). Los lisados de rata primaria GCs y clulas
COV434 expuestas a BMP-15, BMP-6, BMP-7, o activina-A tambin se sometieron a SDS-
PAGE / inmunotransferencia utilizando el antisuero PS-2, que es especfico para fosforilados
Smad2. En los lisados de GCs primarios de rata tratados con activina-A, una muy dbil seal
PS-2 era detectable, mientras que las PS-2 seales en las clulas tratadas con BMP-15,
BMP-6 y BMP-7 fueron indistinguibles de la de los controles no tratados (datos no mostrados).
Sin embargo, en los lisados de clulas COV434 que fueron expuestos a la activina-A, hubo un
aumento pronunciado de fosfato Smad2, mientras que el tratamiento con BMP-15, -6, -7 y
tuvo poco efecto sobre los niveles de fosfato Smad2 (Fig . 3).
Para demostrar an ms la activacin funcional de la Smad1 / 5/8 va por la BMP-15, las
clulas COV434 fueron transfectadas transitoriamente con un constructo reportero
transcripcional, p EVent2- Luc, que se ha demostrado que responden especficamente a la
sealizacin de BMP en clulas P19, C3H10T1 / 2, clulas y embriones de Xenopus (38-40).
El tratamiento con BMP-15 a 100 ng / ml produjo un aumento 3.3- veces en la actividad
EVENT2-luciferasa en comparacin con los controles no tratados (Fig. 4).
Los receptores de la superfamilia TGFB identificados hasta la fecha, BMPR-II, Act-II, ALK-3,
ALK-6, y ALK-2 han sido implicados en la activacin de la / 5/8 va Smad1 (14); por lo tanto, la
hiptesis de que uno o ms de estos receptores pueden estar involucrados en la activacin de
BMP-15 en la va Smad1 / 5/8. Para caracterizar la capacidad de unin bioqumica, se utiliz
protenas quimera receptor-ECD / Fc para estudios de co-inmunoprecipitacin con BMP-15. El
uso de un anticuerpo anti-FLAG monoclonal conjugado a perlas de agarosa, se analiz la
capacidad de BMP-15 para unirse a cada receptor-ECD. SDS-PAGE / anlisis de
inmunotransferencia del receptor quimera -ECD antes de la inmunoprecipitacin mostraron
que hubo una cantidad similar de inmunorreactiva ECD en cada grupo y que el individuo
receptor-ECD tena los patrones de migracin de SDS-PAGE nicas (Fig. 5A). El BMPR-II-
ECD migra a 65-75 kDa, ActR-II-ECD migra a 50-60 kDa, ALK-3-ECD migra a 55-65 kDa, y
ALK-6-ECD y ALK-2-ECD migrar a 50-55 kDa. estudios de co-inmunoprecipitacin con BMP-
15 revel que, de los cinco candidatos receptor-quimeras ECD, ALK-6 co-inmunoprecipitacin
fue claramente superior a los otros candidatos (Fig. 5B). La capacidad relativa de cada
receptor-ECD a coimmunoprecipitation con BMP-15 se encontr que era aproximadamente
como sigue: ALK-6-ECD ALK-2-ECDB ActR-II-ECDB BMPR-II-ECD ?? ALK-3-ECD. Con el fin
de asegurarse de que el co-inmunoprecipitacin era debido a la unin del receptor de ECD a
BMP-15, y no directamente a la anti-FLAG-agarosa, el receptor-ECD se inmunoprecipitaron
en ausencia de BMP-15. En estos estudios, no haba detectable inmunoprecipitada receptor-
ECD, que indica que el co-inmunoprecipitacin observado fue debido a la unin del receptor
de ECD a BMP-15 especfica.
A continuacin utiliza el receptor-ECD / Fc quimera para determinar si estas protenas pueden
inhibir los efectos biolgicos de BMP-15 en primaria rata GCs. Para este fin, primero
evaluaron los efectos de BMP-15 en la produccin de progesterona inducida por FSH en
presencia y en ausencia del receptor-ECD / Fc quimera (Fig. 6). La adicin de BMP-15 (30
ng / ml) provoc una cada del 38% en la produccin de progesterona inducida por FSH en
comparacin con FSH sola. Curiosamente, el efecto inhibidor de BMP-15 en la sntesis de
progesterona por inducida FSH fue casi completamente abolida por BMPR-II-ECD. ActR-II-
ECD y ALK-6-ECD tambin invierten los efectos de la BMP-15; Sin embargo, sus efectos no
fueron tan pronunciadas como BMPR-II-ECD. ALK-3-ECD no tuvo efecto sobre la supresin
de BMP-15, la produccin de progesterona inducida por FSH. Adems, aunque no se
muestra, ALK-2-ECD solo (en ausencia de BMP-15) suprimi la sntesis de progesterona
inducida por FSH en un 46% y no tena ningn efecto observable sobre la accin de la BMP-
15. Por lo tanto, no fue posible determinar los efectos de este receptor-ECD de BMP-15
propiedades andrognica.
Para evaluar adicionalmente la capacidad especfica del receptor de la ECD para inhibir la
actividad biolgica de BMP-15, se realiz un ensayo de incorporacin de timidina. En este
anlisis, similar al ensayo de esteroides, BMPR-II-ECD era ms eficaz en la inhibicin de la
actividad biolgica de la de BMP-15 (Fig. 7). Para verificar la especificidad de los ECD
receptor-en este sistema, se examin la capacidad de estos receptores de ECD-para inhibir la
incorporacin de timidina inducida por BMP-7 y la activina-A. BMPR-II-ECD era ms eficaz en
la inhibicin de la incorporacin de timidina inducida por BMP-7 seguido de ActR-II-ECD. El
receptor de tipo I ECD fueron menos eficaces que el receptor de tipo II ECD. Por el contrario,
ActR-II-ECD inhibi completamente la activina-A inducida por la incorporacin de timidina,
mientras que el otro receptor-ECD tena slo un pequeo efecto. Dado que el tipo II de
receptores-ECD fueron ms eficaces que el receptor de tipo I-ECD en la inhibicin de la
incorporacin de timidina inducida por BMP-15, BMP-7, y la activina-A, se compararon los
efectos de respuesta a dosis de estos receptores de ECD usando ensayos de timidina de
incorporacin (Fig. 8). BMPR-II-ECD inhibe la actividad biolgica de BMP-15 de una manera
dependiente de la dosis y fue significativamente ms potente que ActR-II-ECD; inducida por
BMP-7 incorporacin de timidina fue igualmente inhibida por BMPR-II-ECD y ActR-II-ECD; y
ActR-II-ECD fue significativamente ms eficaz en la inhibicin de activina-A actividad biolgica
que BMPR-II-ECD.
Desde ERK1 / 2 sealizacin se ha demostrado que actuar ya sea como un transductor
positivo de la sealizacin de BMP o como un antagonista de la sealizacin de Smad
inducida por BMP, dependiendo del tipo de clula (18), se investig si las molculas ERK1 / 2
tambin juegan un papel en la sealizacin de BMP-15 en las redes GSM usando U0126, un
inhibidor selectivo de ERK1 / 2 fosforilacin. La adicin de U0126 (3B M) a los cultivos de la
CG de la rata GC primarios no tuvo ningn efecto significativo sobre los niveles basales de la
incorporacin de timidina, pero caus una reduccin de la BMP-15 la incorporacin de timidina
inducida cuando se aade en 1 y 3B M (Fig. 9). Nos determina adems si la inhibicin de
ERK1 / 2 fosforilacin tambin media en los efectos de la BMP-15 sobre la produccin de
progesterona GC. Como se inform anteriormente (30), la adicin de U0126 (3B M) inhibi
FSH inducida por la produccin de progesterona, al igual que BMP-15 (100 ng / ml) (Fig. 10).
Sin embargo, U0126 no tuvo ningn efecto sobre la inhibicin de BMP-15 de la sntesis de
progesterona.