Espectrofotmetro

Dulcezita Monzerrat Ramos Gonzlez

La palabra espectrofotmetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen,
y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotmetro, construido
mediante procesos avanzados de fabricacin, es uno de los principales instrumentos
diagnsticos y de investigacin desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de
la luz y su interaccin con otras sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En
general, la luz de una lmpara de caractersticas especiales es guiada a travs de un
dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar
por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con
la intensidad de la luz que incidi en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia
de la muestra, que depende de factores como la concentracin de la sustancia.

Propsito del equipo

En la fsica ptica que sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre
valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones. Tambin
es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y
microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o
espectrofotmetro de masa. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz
monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha
muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:
1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra
2. Indicar indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la
muestra.

Principios de operacin

Como principio bsico se considera que la luz es una forma de energa electromagntica, que
en el vaco tiene una velocidad constante [C] y universal de aproximadamente 3x108 m/s. En
cualquier otro medio (transparente) por el que pase la luz, su velocidad ser ligeramente
inferior y podr calcularse mediante la siguiente ecuacin:

0 =

donde:
v= velocidad a travs del medio por el que pasa la luz
n= ndice de refraccin del medio, cuyo valor oscila, por lo general, entre 1,0 y 2,5
La energa electromagntica dispone de una muy amplia gama de longitudes de onda.
Algunos ejemplos se muestran en la siguiente tabla:

la luz, al pasar o interactuar con diversos medios, presenta una serie de fenmenos, entre los
que destacan la reflexin, refraccin, difraccin, absorcin, difusin, polarizacin y otros que
son utilizados en diversos instrumentos y dispositivos. La siguiente tabla muestra los rangos
de longitud de onda en donde se utiliza el espectro luminoso para realizar pruebas de
espectrofotometra.

Con respecto a la interaccin de la luz con la materia, el siguiente esquema ayuda a entender
la complejidad de los fenmenos que ocurren:
El esquema muestra que la radiacin incidente[Io] sufre una serie de transformaciones. Parte
de la misma se refleja [Ir], parte se transmite [It], parte se difunde [Id] y parte se absorbe e
incide directamente en fenmenos como la fluorescencia [If]. Los fenmenos en los que se
basa la espectrofotometra son principalmente la absorcin y la transmisin. Para entender
cmo se utilizan, es necesario adicionalmente tener en cuenta la ley de Beer Lambert.
1.- Ley de Lambert:
Esta ley establece que cuando pasa luz monocromtica por un medio homogneo, la
disminucin de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio,
lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida disminuye exponencialmente
al aumentar aritmticamente el espesor del medio absorbente (Fig. 2):

Fig.2.Ley de Lambert

La siguiente relacin matemtica da cuenta de esta ley: P / P0 = ekb

Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida b : Espesor del medio
absorbente
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la luz
incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza del medio.

2.- Ley de Beer :

La intensidad de un haz de luz monocromtica disminuye exponencialmente al aumentar
aritmticamente la concentracin de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a travs
de un medio homogneo (Fig. 3).

Fig.3.Ley de Beer
La relacin matemtica que da cuenta de esta ley se muestra a continuacin:
P / P0 = e-kc
donde :
Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida
c : Concentracin de la solucin
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la luz
incidente, de la concentracin de la solucin, y frecuentemente, de la naturaleza del medio.
Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer
log P0 / P = a b c A = a b c
A = log P0 / P = - log T
donde :
a : Absortividad b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c : Concentracin de la solucin P/Po= T : Transmitancia

Los trminos absorbancia y transmitancia son definidos a continuacin:

Transmitancia (T): Es la razn entre la luz monocromtica transmitida (P) por una muestra
y la energa o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energa radiante incidente como la
transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.
T = P / P0 = 10-abc %T = 100 P / P0
Se acostumbra a considerar la transmitida como la razn de la luz transmitida por la muestra
y la luz transmitida por un estndar arbitrario. Este estndar puede ser el lquido (solvente)
en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analtico (solucin que contiene todos los
componentes de la solucin problema menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida
arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estndar no es necesariamente 100%,
es necesario especificar el estndar con el cual la muestra es comparada.

Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energa radiante absorbida por una sustancia
pura o en solucin. Matemticamente, corresponde al logaritmo negativo de la
transmitancia.T, transmitancia expresada como fraccin decimal %T, transmitancia
expresada como porcentaje.
A = - log T = 2 log %T
Pero T = P / P 0 = 10-abc

Entonces A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc

A=abc

Esta ecuacin indica que la absorbancia es una funcin lineal de la concentracin, donde a
es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a, depende de las
unidades de b y c. Si la concentracin c est expresada en moles por litro y la longitud de la
cubeta b en centmetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar () . Luego
A=bc

Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparacin entre la muestra
problema y un estndar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje
de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.
Seleccin de longitud de onda de trabajo.
La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en la cual
la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es mxima, y recibe la denominacin de
Lambda mximo (max). Para seleccionar el max., se hace un espectro de absorcin o curva
espectral, y que consiste en una grfica de la absorbancia de una solucin de la sustancia
absorbente de concentracin adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se
determina el max. (Fig.4).

Fig.4.Curva espectral

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera

que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se
realizan en la zona visible del espectro electromagntico (380 a 800nm). En el caso de
sustancias no coloreadas, las mediciones se realizan en la regin ultravioleta del espectro
electromagntico (200 a 380nm).
Curva de Calibracin.
Uno de los mtodos ms utilizados para determinar la concentracin de una muestra
problema, es el mtodo de la curva de calibracin. Esta curva de calibracin es una grfica
que relaciona la concentracin de al menos cinco soluciones de estndar de concentraciones
conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda mxima ( max)
(Fig.5).

Fig.5.Curva de calibracin

Una vez obtenida la grfica se determina la funcin matemtica que presenta dicha recta a
travs del tratamiento estadstico de regresin de los mnimos cuadrados, la cual relaciona la
absorbancia y la concentracin de un analito. La siguiente ecuacin matemtica corresponde
a dicha funcin:

A = m c + n (Ecuacin 1)

A : Absorbancia.
n : Intercepto de la recta
m : Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la muestra y
el espesor b de la cubeta.
Luego se mide la absorbancia de la solucin problema y se interpola su valor en la grfica o
se reemplaza en la ecuacin (1), para obtener el valor de concentracin del analito. La
concentracin de la solucin problema debe estar comprendida en el rango de concentracin
que comprende la curva de calibracin. Si la concentracin de la solucin problema es menor
que la concentracin del estndar ms diluido, debe usarse el mtodo de adicin estndar,
que consiste en adicionar un volumen determinado de un estndar concentrado a la solucin
problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de las
obtenidas para la curva de calibracin. En el caso contrario, si la concentracin del analito es
mayor que la concentracin del estndar ms concentrado la solucin problema deber ser
diluida.

Fig.6.Interpolacion grfica

Al hacer la curva de calibracin, se debe emplear la longitud de onda de mxima absorbancia

(max.), para obtener una recta con la mxima pendiente y as tener mayor sensibilidad y
precisin al hacer las mediciones. La medicin de la absorbancia de la solucin problema
debe hacerse a la misma longitud de onda que fue hecha la curva de calibracin.

Componentes
El esquema que se presenta a continuacin describe la interrelacin de los diversos
componentes de un espectrofotmetro. Los ms importantes son los siguientes:

1. La fuente luminosa
2. El monocromador
3. El portador de muestras
4. El sistema detector
5. El sistema de lectura
 Fig.7.Componentes del espectrofotmetro

Fuente luminosa
Dependiendo del tipo de espectrofotometra, la fuente luminosa puede ser una lmpara con
filamento de tungsteno para luz visible, o una lmpara de arco de deuterio para luz
ultravioleta. Algunos fabricantes han diseado espectrofotmetros con lmparas
intermitentes de xenn de alta duracin que emiten luz en el rango de la luz visible y
ultravioleta. La lmpara o lmparas vienen montadas de fbrica en una base que permite
asegurar una determinada posicin, para que se mantengan las condiciones de ajuste ptico
y enfoque cuando est en operacin o se requiere reemplazarla. La energa radiante tpica
que emite una lmpara de tungsteno est entre los 2 600 y los 3 000 K (grados Kelvin).
Monocromador
Est compuesto por un conjunto de elementos. En general, dispone de una rendija o ranura
de entrada que limita la radiacin lumnica producida por la fuente y la confina en un rea
determinada, un conjunto de espejos para pasar la luz a travs del sistema ptico, un elemento
para separar las longitudes de onda de la radiacin lumnica, que puede ser un prisma o una
rejilla de difraccin, y una rendija de salida para seleccionar la longitud de onda con la cual
se desea iluminar la muestra. Las rejillas de difraccin tienen la ventaja de eliminar la
dispersin no lineal y son insensibles a los cambios de temperatura.
Portador de muestras
Est diseado para sostener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo de luz de
longitud de onda determinada por el monocromador. El elemento que contiene la muestra es
una celda o cubeta, por lo general, rectangular. Las celdas o cubetas se fabrican de vidrio, si
se requieren efectuar estudios en el rango de los 340 a los 1 000 nm y de slice, si el anlisis
est en el rango comprendido entre los 220 y los 340 nm. Tambin hay celdas en materiales
plsticos como estireno o poliestireno. El portador de muestras lo disean los fabricantes de
acuerdo al tipo de espectrofotmetro y de muestra a analizar, por ello se encuentran
portadores de muestra con microceldas, aunque tambin tubos de ensayo y otras variantes
como las celdas de flujo continuo.

Sistema detector
El sistema de deteccin puede estar diseado con fotoceldas, fototubos, fotodiodos o
fotomultiplicadores. Esto depende de los rangos de longitud de onda, de la sensibilidad y de
la velocidad de respuesta requeridas. El sistema de deteccin recibe la energa lumnica
proveniente de la muestra y la convierte en una seal elctrica proporcional a la energa
recibida. La seal elctrica puede ser procesada y amplificada, para que pueda interpretarse
a travs del sistema de lectura. En la tabla que se incluye a continuacin, se presenta un
resumen de las ventajas y desventajas de los dispositivos normalmente usados en los sistemas
de deteccin.

Sistema de lectura
La seal que sale del detector recibe diversas transformaciones. Se amplifica y se transforma
para que su intensidad resulte proporcional al porcentaje de transmitancia/absorbancia.
Existen sistemas de lectura de tipo anlogo (muestra la magnitud leda sobre una escala de
lectura) o digital (muestra la magnitud leda en una pantalla). Los indicadores de tipo anlogo
reciben tradicionalmente el nombre de metros. Su exactitud depende, entre otros factores, de
la longitud de la escala y del nmero de divisiones que tenga. (Mientras ms divisiones, ms
exacto). Su principal desventaja es que pueden ser mal ledos, por la fatiga de los operadores
o errores, cuando disponen de varias escalas, al tratar de identificar las escalas sobre las que
deben realizar la lectura. Los indicadores digitales usualmente presentan los resultados en
una pantalla, en forma de caracteres alfanumricos luminosos. Esto los hace menos
propensos a que se cometan errores de lectura.
Prismas.
El prisma, tal y como se ha mencionado con anterioridad separa la radiacin policromtica
en bandas angostas y a diferentes ngulos. Para dirigir la radiacin de longitud de onda
seleccionada a la abertura de salida (slit) se hace girar el prisma por medio de un mecanismo
acoplado para este fin. Para una alta resolucin de la radiacin prolicromtica (buena
separacin angular de la radiacin de diferentes longitudes de onda), se requiere que la
dispersin sea lo mayor posible. La dispersin se defina como d/dla variacin en ngulo
de dispersin con respecto a la variacin en longitud de onda. Esta es la mayor desventaja de
un prisma; la dispersin en un prisma es mayor para longitudes de onda cercanas a sus bandas
de absorcin, y como la mayora de los prismas absorbe radiacin UV, la dispersin se
incrementa para longitudes de onda cortas.
Rejillas
Las rejillas como medio de dispersin de la luz son muy superiores a los prismas. Hasta hace
pocos aos una de las desventajas de este tipo de dispersor era su costo. Actualmente se ha
desarrollado la tecnologa para la elaboracin de rejillas de difraccin en grandes cantidades
y con aceptable calidad, lo cual ha trado como consecuencia un menor precio y un
desplazamiento casi total a la utilizacin de rejillas de difraccin como elementos de
resolucin de haces policromticos. Una de las desventajas de las rejillas dispersoras es la
produccin de radiacin extraa, as como de espectros de segundo y tercer orden, pero estos
efectos pueden ser minimizados con el uso de filtros y un adecuado diseo del instrumento.
En los instrumentos ms modernos y de mejor calidad las rejillas de difraccin han sustituido
casi por completo el uso de los prismas como monocromadores.

Lentes y espejos

La radiacin es colimada y enfocada por lentes y espejos. El material de los lentes debe ser
por supuesto trasparente a la radiacin utilizada. En el Infrarrojo se utilizan espejos, ya que
la mayora de los materiales no son suficientemente trasparentes a la radiacin Infrarroja y
causan significantes prdidas de energa. Tambin en espectroscopa Visible y UV se
emplean con frecuencia los espejos como elementos o partes del monocromador.

Referencias

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[ebook] Chihuahua: Universidad Autnoma de Chihuahua, pp.4-5. Available at:
http://www.fcq.uach.mx/index.php/docencia/columna-2/.../15-analisis-instrumental?...
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Facultad de Qumica UNAM, (2017). FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRA. 1st
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http://depa.fquim.unam.mx/amyd/.../PRACTICA6ESPECTROFOTOMETRIA_21576.pdf
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