A Disperso Gentica E De Pequenas Molculas Do Eixo Aid / Rad51 Protege Igualmente Os Ratos No

Diabticos No Obesos Do Diabetes Tipo 1 Atravs Da Expanso De Linfcitos B Regulamentares.

Introduo

Os linfcitos B desempenham um papel fundamental no desenvolvimento da diabetes tipo 1 (T1D) servindo

como um subconjunto de APCs preferencialmente de clulas T patognicas autorreativas. Como resultado de
sua importncia patognica, as terapias direcionadas aos linfcitos B Receberam considervel interesse como
possveis intervenes T1D. Infelizmente, as intervenes T1D dirigidas a linfcitos B At data no conseguiu
parar a morte da clula b. Os autoanticorpos IgG que marcam os seres humanos em risco futuro para T1D
indicam que os linfcitos B produzidos sofreram os processos de maturao de afinidade de recombinao de
interruptor de classe e, possivelmente, hipermutao somtica. Este estudo descobriu que a ablao mediada
por CRISPR / Cas9 do gene da citidina desaminase induzida pela ativao da recombinao de interruptor de
classe / induo de hipermutao somtica inibe o desenvolvimento de T1D no modelo de rato NOD. A ativao
induzida de Citidina desaminase induz rupturas de DNA do genoma de largura que, se no forem reparadas
atravs de clulas homlogas mediadas por recombinao de RAD51, resultam na morte de linfcitos B.
Tratamento com o inibidor de RAD51 4,49-diisotiocianatostilbeno-2, 29-dissulfnico cido tambm inibiu
fortemente o desenvolvimento de T1 em ratos NOD. As abordagens de gentica e de pequenas molculas
Linfcitos B CD73 + que exercem atividade reguladora suprimindo respostas de clulas T diabetognicas. Assim,
um primeiro CRISPR / Cas9- Mediada por modificao gentica identificou o eixo AID / RAD51 como um alvo
para um potencial clinicamente traduzvel Farmacolgica que pode bloquear o desenvolvimento de T1D
convertendo os linfcitos B em uma doena CD73 + inibitria regulatria Estado.
Embora a destruio auto-imune de clulas b pancreticas produtoras de insulina subjacentes ao
desenvolvimento de diabetes tipo 1 (T1D) seja finalmente mediada pela atividade combinada de clulas T CD4
+ e CD8 +, evidente no modelo de rato NOD e, provavelmente, em seres humanos, que Os linfcitos B
desempenham um papel patognico chave adicional (1-9). Estudos em ratinhos NOD indicam que os linfcitos
B contribuem para T1D por ser o subconjunto de APCs que mais eficientemente suporta a expanso de
respostas de clulas T patognicas (10-12). Isto devido presena de linfcitos B que expressam molculas
de Ig ligadas membrana plasmtica capazes de capturar e internalizar eficientemente auto-antignios de
clulas b para subsequente processamento e apresentao a clulas T diabetognicas. Populaes semelhantes
de linfcitos B patognicos tambm provavelmente contribuem para o desenvolvimento de T1D em seres
humanos, A presena de autoanticorpos especficos de Ag em clulas B circulantes que so biomarcadores
crticos para identificar indivduos com alto risco de doena futura.
A maioria dos autoanticorpos em seres humanos com ou em risco para T1D de um isotipo IgG, indicando que
os linfcitos B que os produziram foram submetidos a maturao por afinidade. A maturao o processo que
ocorre nos centros germinativos (GCs) pelos quais os linfcitos B sofrem diversificao de Ig e Clonal. A
diversificao de Ig ocorre atravs da hipermutao somtica (SHM) e da recombinao de switch de classe
(CSR), enquanto que a seleo clonal resulta da interao competitiva com o auxiliar folicular T (Tfh). As
presses seletivas dentro dos GCs resultam na expanso preferencial dos linfcitos B com maior afinidade para
o seu Ag cognato. Em doenas auto-imunes, tais como T1D, os processos aberrantes de seleo levam
expanso dos linfcitos B auto-reativos, que podem se tornar clulas secretoras de autoanticorpos ou reter sua
Ig de superfcie para servir como APCs potencialmente mais eficazes. Embora achados anteriores sugerem que
a maturao por afinidade importante para a patognese da T1D (16), a importncia dos processos CSR / SHM
para a progresso da doena ainda no foi elucidada. Alm disso, no est claro se os linfcitos B devem
submeter-se CSR / SHM para se tornarem APCs autoreativas eficazes que suportam a patognese da T1D.
Devido ao seu papel no suporte de respostas de clulas T patognicas, tem havido um interesse considervel
em determinar se as abordagens dirigidas a linfcitos B poderiam proporcionar uma interveno T1D eficaz.
Um ensaio clnico descobriu que o tratamento transitrio com o rituximab Ab especfico para CD20, que esgota
os linfcitos B, permitiu a preservao precoce (1 y), mas no a longo prazo (2 y), da produo de peptdeo C
em pacientes com T1D de incio recente. A falta de proteo a longo prazo pode ser atribuda, pelo menos em
parte, recuperao dos linfcitos B aps tratamento com rituximab transitrio. No entanto, em murganhos
NOD, os linfcitos B infiltrantes de ilhus pancreticos perdem a expresso da superfcie celular de CD20 e,
assim, so rendidos resistentes pletio por um anticorpo anti-CD20 murino semelhante ao rituximab (18).
Estes resultados indicam a necessidade de identificar estratgias alternativas que possam proporcionar uma
abordagem de interveno T1D mais eficaz dirigida a linfcitos B.
No presente estudo, avaliamos a contribuio da CSR / SHM para o desenvolvimento de T1D e se o
direcionamento especfico dos linfcitos B submetidos a esses processos poderia proporcionar uma interveno
teraputica eficaz. Como primeira etapa, utilizamos a tecnologia CRISPR-Cas9 para retiragem direta, em
camundongos NOD, do gene de citidina-desaminase induzido pela ativao (Aicda) necessrio para iniciar
processos CSR / SHM (19-21). A retiragem de Aicda inibiu significativamente o desenvolvimento de T1D.

A protena de citidina desaminase induzida por activao (AID) codificada por Aicda inicia SHM e CSR induzindo
mutaes pontuais e rupturas de dsDNA em sequncias de genes Ig. Adicionalmente, a AID gera DSBs em outras
partes ao longo do genoma (22, 23) que so normalmente reparadas pela recombinao homloga mediada
pelo complexo RAD51 (HR). Na ausncia de FC, os linfcitos B nos quais o SHM / CSR foi iniciado sofrem morte
celular (23). A pequena molcula 4,49 diisotiocianatostilbeno-2, 29-cido dissulfnico (DIDS) inibe RAD51-
mediada HR (23). A DIDS tem sido utilizada como agente modelo em estudos anteriores, indicando que o
bloqueio de RAD51 poderia ser considerado uma interveno para a eliminao de linfomas de clulas B AID +
(23). ). Neste estudo, usamos o tratamento DIDS para determinar se o direcionamento do eixo AID / RAD51
poderia fornecer uma interveno dirigida a linfcitos B para T1D. Interessantemente, a disrupo gentica e
mediada por DIDS do eixo AID / RAD51 aumentou o nmero de linfcitos B CD73 + que exerceram processos
reguladores que suprimem activamente a T1D. Juntos, estes estudos indicam que as terapias capazes de
expandir os linfcitos B reguladores, potencialmente incluindo aqueles que visam processos de maturao de
afinidade, podem finalmente representar estratgias de interveno T1 clinicamente traduzveis.

Materiais e mtodos

Ratos

Os ratinhos NOD e C57BL / 6J (B6) so mantidos no Laboratrio Jackson em condies livres de agentes
patognicos. Utilizou-se a tecnologia CRISPR-Cas9 para gerar directamente ratinhos NOD. Aicda2 / 2 por
microinjeco citoplasmtica de zigotos NOD / ShiLtDvs com 100 ng / ml de ARNm de Cas9 e 50 ng / ml dos
seguintes ARN de guia nico (sgRNAs), com as letras maisculas Sendo o complemento para a sequncia
genmica alvo: 59gaaattaatacgactcactataggAGTCACGCTGGAGACCGATAgttttagagctagaaatagc-39 ou 59-
gaaattaatacgactcactataggACTTCTTTTGCTTCATCAGAgttttagagctagaaatagc39. Tendo como alvo o exo 1 ou 2,
respectivamente, de Aicda. ( Figura 1). Os sgRNAs do xon 1 e 2 foram microinjetados em 47 e 39 zigotos,
respectivamente. Estes zigotos microinjectados foram ento transplantados para trs e duas fmeas
receptoras, respectivamente. O DNA da cauda da prognie sobrevivente foi sequenciado e identificou 100 e
14,3% de eficincia de direcionamento para o xon 1 (14/14) e xon 2 (2/14). Os ratinhos fundadores de
mosaico identificados como portadores de uma mutao na regio alvo de Aicda foram retrocruzados para
ratinhos NOD / ShiLtDvs. A prognie N1 resultante foi pesquisada quanto a mutaes transmitidas pela linha
germinal por amplificao por PCR do xon 1 com os iniciadores 59-TCACACAACAGCACTGAAGC-39 e 59-
ACCCAAAAGACCTGAGCAGA-39 ou xo 2 com os iniciadores: 59 CGCTCAGCTACCTTGCCTAT-39 e 59-
CGAAGTCCAGTGAGCAGGA-39. Os produtos de PCR foram purificados e analisados por sequenciao num
analisador de DNA ABI 3730 (Applied Biosystems) utilizando o iniciador direto ou inverso. As sequncias
mutantes foram separadas do tipo selvagem (WT) utilizando o pacote Poly Peak Parser para R. Uma deleo de
2 pb juntamente com uma insero de 309 pb foi selecionado para uma linha que alveja o xon 1 e uma deleo
de 13 pb foi selecionado para uma linha direcionando o xon 2. Os mutantes N1 foram cruzados para fixar as
mutaes homozigose, aps o que as linhas foram mantidas por acasalamentos irmo-irm. Os murganhos
mutantes foram genotipados por polimorfismos de comprimento de amplificao utilizando os mesmos
iniciadores utilizados para sequenciao. ( Figura 1). Os ratos foram comparados por idade e sexo para
experimentao, mas no foi realizado um mtodo de randomizao especfico para formar grupos
experimentais. O Comit Institucional de Cuidados e Uso Animal do Laboratrio Jackson aprovou todos os
protocolos envolvendo ratos.

RT-PCR e anlise de expresso gentica

Os linfcitos B foram purificados a partir de ratinhos fmea NOD ou B6 de 8 semanas de idade. O ARN total foi
extrado utilizando um RNeasy Micro Kit (QIAGEN). Os iniciadores para Aicda RT-PCR (26) so 59-
CAGGGACGGCATGAGACCT-39 e 59-TCAGCCTTGCGGTCTTCACA-39 e iniciadores para Gapdh so 59-GAGAA-
ACCTGCCAAGTATGATGAC-39 e 59-TGATGGTATTCAAGAGAGTAGGGAG-39 (27). Utilizou-se RNA para sintetizar
ADNc com um kit MessageSensor RT (Thermo Fisher) e Random Decamers (Invitrogen). Utilizou-se o poder
SYBR Green (Applied Biosystems) para determinar a expresso de Aicda e Gapdh. A PCR quantitativa (qPCR) foi
executada utilizando um Applied Biosystems ViiA7, e os dados foram analisados utilizando o software A & B
RUO.
Monitoramento do desenvolvimento de T1D

O desenvolvimento de T1D foi avaliado por monitorizao semanal de glicosria com Ames Diastix (Bayer), com
incio da doena definido por duas leituras consecutivas 0,25% (corresponde a glicemia de 300 mg / dl).

Avaliao histolgica da insulite

Os escores de insulite mdia quantitativa foram determinados pelo mtodo de clculo descrito anteriormente
(28). Resumidamente, o pncreas fixo de Bouin foi seccionado em trs nveis no-sobrepostos. As lminas foram
coradas com al-diehido fucsina e H & E. As ilhotas foram marcadas por um observador cego da seguinte forma:
0, sem leses visveis; 1, aglutinados leucocticos no invasivos peri-insulares; 2,, 25% de destruio de ilhus;
3, 25-75% destruio de ilhus; E 4, 75-100% de destruio de ilhus. A pontuao final foi determinada
dividindo a pontuao cumulativa para cada pncreas pelo nmero de ilhotas totais ($ 20 por rato) examinadas.
Se no foram encontradas ilhotas contendo clulas b em trs seces, o rato analisado recebeu uma pontuao
de insulite de 4. A pontuao final de insulite incorpora a proporo de ilhotas em ratinhos analisados que
sofreram cada nvel de destruio.

Isolamento leucocitrio associado a ilhus

Os leuccitos infiltrados associados a ilhotas foram isolados para citometria de fluxo, como descrito
anteriormente (18).

Ensaio de CSR in vitro

Os linfcitos B esplnicos foram purificados utilizando MicroBeads anti-CD43 (Miltenyi Biotec), de acordo com
o protocolo do fabricante. Os linfcitos B purificados foram cultivados a uma concentrao de 13 106 clulas
por mililitro em RPMI 1640 (Life Technologies) suplementado com L-glutamina 2 mM (Life Technologies), 2-ME
71,5 mM (BP176-100, Fisher Scientific), 100 U (Sigma-Aldrich), 100 mg / ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich)
e 10% (v / v) de FBS inactivado pelo calor (Atlanta Biologicals) sob estimulao com IL-4 recombinante de
murganho (25 ng / Ml, PeproTech) e anti-CD40 (1 mg / ml, BD Biosciences) ou LPS (25 mg / ml, Sigma-Aldrich)
a 37 C (5% CO2) durante 48 h. s 48 h, as culturas foram reestimuladas como descrito acima. s 72 h, as
culturas foram diludas com o meio de volta para 112 106 clulas por mililitro. A troca de classe para o isotipo
IgG1 foi quantificada por anlise citomtrica de fluxo aps 96 horas totais em cultura.

Citometria de fluxo

Os leuccitos entre as amostras indicadas foram fenotipados por citometria de fluxo utilizando a
instrumentao LSRII SORP (BD Biosciences) ou Attune Cytometer (Thermo Fisher Scientific), e os dados foram
analisados utilizando o software FlowJo (TreeStar). Para experincias Aicda2 / 2, as suspenses de clulas nicas
de esplencitos foram lisadas com tampo de Gey para remover RBCs, como descrito anteriormente (29). Para
todas as experincias, utilizou-se iodeto de propdio ou DAPI para discriminao viva / morta. Todas as anlises
foram feitas em clulas singletes (vivas) fechadas; Gating estratgias so mostradas na Fig. 2A, 2B. Para
expericias baseadas em DIDS, antes da libertao singuleto / vivo, as culas TER-119 + foram excluas
(Figura 2C suplementar) atrav de estratias de bloqueio em vez dos procedimentos de lise. Os seguintes
anticorpos conjugados com fluorocromo (clones) foram utilizados para estes estudos: CD95 (J02), GL-7 (GL7),
CD43 (S7), CD69 (H1.2F3), CD21 (7G6), CD45.1 (A20) , CD62 (MEL-14), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), B220 (RA3-
6B2), CD4 (GK1,5), CD23 (B3B4), TER-119 (TER119) e estreptavidina (todas da BD Biosciences); CXCR5 (L138-
D7), CD21 (7G6), IgD (11-26c.2a), CD80 (16-10A1), GL-7 (GL7), CD73 (TY / 11.8), CD39 (Duha59), CD45.1 (A20),
PD-1 (RMP1-30), PD- L2 (TY25), CD4 (GK1.5), CD23 (B3B4), B220 -6B2), e TCRb (H57-597) (todos da BioLegend);
CD19 (1D3), IgM (II / 41), CD45.1 (A20), E CD44 (IM7) (todos da eBioscience); CD8a (53-6,7), CD19 (1D3) e CD16
/ CD32 (2,4G2) (todos da Tonbo Biosciences); E IgG1 (1070-09) (SouthernBiotech). Os subgrupos de linfcitos B
esplnicos foram caracterizados por citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente (30).
Istipo Ig do soro ELISA

A quantificao dos istipos de Ig srica foi realizada conforme descrito (31). Os Abs de Revestimento foram os
seguintes: IgG1, IgG2b, IgG3 e IgM (SouthernBiotech). O Ab de deteco era anti-ratinho de cabra acoplado a
fosfatase alcalina (South-ernBiotech). Os padres de Ab incluam IgG1 e IgG2b (SouthernBiotech) e IgG3 e IgM
(Sigma-Aldrich). As placas foram analisadas usando um Infinite M200 Pro executando o software Magellan 7.0
(Tecan).

Transferncias adoptivas

Os linfcitos B esplnicos e as clulas T foram purificados por depleo negativa das populaes CD11b +, CD11c
+, TER-119 + e CD3 + e, em alguns experimentos, CD73 + (para a purificao dos linfcitos B) ou CD11b +,
CD11c +, TER-119 + E clulas B220 + (para purificao de clulas T), utilizando Abs conjugado com biotina e
MicroBeads de estreptavidina (Miltenyi Biotec). Os receptores de NOD-scid foram injectados i.v. Com os
linfcitos B e / ou clulas T indicados e foram monitorizados para o desenvolvimento de T1D. Utilizaram-se os
seguintes Abs especficos biotinilados: CD11b (M1 / 70), CD11c (HL3), CD3 (145-2C11), TER-119 (TER119) e
B220 (RA3-6B2) (todos da BD Biosciences). O CD73 (TY / 11,8) foi obtido da BioLegend.

Ensaio de supresso de clulas T mediado por linfcitos B CD73 +

Os linfcitos B de ratinhos NOD.Aicda2 / 2 ou NOD de 6 a 8 semanas de idade foram purificados a partir de

baos agrupados e de ndulos linfticos pancreticos (PLN) por depleo negativa de clulas CD11b +, CD11c
+, CD3 + e TER-119 + Biotin Binder Dynabeads (Invitrogen). Os linfcitos B CD73 + e CD732 dos reservatrios
purificados foram ento classificados directamente em HyClone FBS (GE Healthcare Life Sciences) inactivado
por calor utilizando um classificador SORP FACSAria II (BD Biosciences) equipado com um bocal de 85 mm. As
clulas T CD4 + CD732 foram purificadas a partir de baos de ratinhos NOD com 6-8 semanas de idade por
depleo negativa de clulas CD11b +, CD11c +, TER-119 +, B220 +, CD8 + e CD73 + Estreptavidina MicroBeads
(Miltenyi Biotec) e o Abs. As clulas T CD4 + CD732 purificadas foram marcadas com 5 mM Cell Proliferation
Dye eFluor 670 (eBioscience). Os linfcitos B ordenados e as clulas T marcadas foram lavados trs vezes com
meio X-VIVO 20 isento de soro (Lonza) para remover o soro residual e foram cocultivados sob estimulao com
anti-CD40 solvel (1 mg / ml), anti-CD3 (5 mg / ml) e anti-CD28 solvel (2 mg / ml, todos da BD Biosciences) na
presena de AMP 10 mM e 0 ou 100 mM a, b-metilenadenosina 59-difosfato (APCP), todos da Sigma- Aldrich)
em meio X-VIVO 20 isento de soro suplementado com HEPES 10 mM (Lonza), piruvato de sdio 1 mM (Life
Technologies), 2-ME 71,5 mM (Fisher Scientific), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (Ambos
da Sigma-Aldrich) e aminocidos no essenciais (Lonza) a 37 C durante 4 dias. A proliferao de clulas T foi
avaliada por citometria de fluxo, e os dados foram analisados utilizando o software FlowJo. A supresso
percentual foi calculada relativamente ao ndice de proliferao mdio de clulas T na presena de linfcitos B
CD732 com AMP 0 mM e APCP 0 mM.

Medio ELISA da produo de IL-10

Os linfcitos B CD73 + ou CD732 foram classificados como descrito acima e cultivados a 5,03 105 clulas por
mililitro em meio X-VIVO 20 com 0 ou 10 mg / ml de LPS (Sigma-Aldrich) durante 3 dias. A concentrao de IL-
10 em sobrenadantes de cultura foi determinada utilizando um kit ILISA ELISA MAX de rato (BioLegend).

Tratamentos DIDS

A partir das 6, 8 ou 10 semanas de idade, os ratos NOD fmeas foram injectados i.p. Semanalmente com 0, 10
ou 50 mg / kg de DIDS (CAS 67483-13-0, Santa Cruz Biotechnology) durante os perodos de tempo indicados. O
veculo era bicarbonato de potssio 0,1 M. Status de autoanticorpos de insulina Os autoanticorpos de insulina
srica (IAAs) foram detectados como descrito como parte do Workshop Internacional sobre Lies de Modelos
Animais para Diabetes de Tipo 1 Humano (32).
Preparao da biblioteca de repertrio de Ig

A preparao bibliogrfica e a anlise de dados para o seqenciamento do repertrio de Ig foram realizadas

conforme descrito anteriormente (33), com pequenas alteraes. Resumidamente, os ratinhos NOD / ShiLtDvs
fmeas receberam semanalmente DIDS (50 mg / kg) ou tratamento de veculo de 8 a 16 semanas de idade,
aps o que os linfcitos B de PLN (CD45.1 + CD19 + B220 +) foram purificados separadamente utilizando um
FACSAria II. Igualmente, purificaram-se linfcitos B residentes de PLN a partir de ratinhos NOD no manipulados
com 8 semanas de idade e ratinhos NOD.Aicda2 / 2 como controlos. As clulas purificadas foram lavadas com
PBS, ressuspensas em Tampo RLT e congeladas por presso. O RNA total foi purificado utilizando um RNeasy
Micro Kit (QIAGEN). O nmero total de ARN determinado, utilizando o Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit (Agilent),
para todas as amostras foi de 10. O ARN total foi transcrita inversamente utilizando a transcritase reversa
SMARTScribe (Takara) com iniciadores especficos do isotipo IgH (1 mM cada) IgHG1 / 2 : 59-
CAGGGATCCAKAGTTC-39, IgHG3: 59-CAGGGCTCCATAGTTC-39, IgHM: 59-GATGACTTCAGTGTTGT-39 e IgHD:
59-AGTGGCTGACTTCCAA-39; E adaptador de interruptor de molde 1 mM 59-
AAGCAGUGGTAUCAACGCAGAGUNNNNUNNNNUNNNNUCTTrGrGrGrG-39, U, desoxiuridina) para introduzir
uma sequncia identificadora molecular nica (UMI) para a extremidade 39 de cada molcula de cDNA. As
reaces de transcrio reversa foram estabelecidas como se segue: 5 ml de ARN e 2 ml de iniciadores
especficos de isotipo IgH (10 mM cada) foram aquecidos a 72 C durante 3 min e depois incubados a 42 C
durante 3 min para recozir Primers. Em seguida, adicionaram-se os seguintes componentes a cada reaco para
uma concentrao final de 13 tampo de primeira cadeia, DTT 2 mM, adaptador de interruptor de 59 modelos
1 mM e 1 mM cada dNTP (Invitrogen), RNaseOUT 40U (Invitrogen) e 200 U SMARTScribe Reverse Transcriptase.
O ADNc foi em seguida tratada com 5 U de ADN-glicosilase de uracilo (New England Biolabs) para degradar
adaptador interruptor placa tempe- residual e, em seguida, purificado utilizando um Kit de NucleoSpin gel e
purificao de PCR (Takara). Primeiro foi efectuada PCR utilizando cDNA equivalentes a 2,5 ng de ARN e platina
superfi ADN Polimerase (Invitrogen) com os seguintes iniciadores: M1SS: 59-AAGCAGTGGTATCAACGCA-39,
mIGG12_r2: 59-ATTGGGCAGCCCTGATTAGTGGATAGACHGATG-39, mIGG3_r2: 59-
ATTGGGCAGCCCTGATTAAGGGATAGACAGATG-39, mIGM_r2 : 59-
ATTGGGCAGCCCTGATTGGGGGAAGACATTTGG-39, e mIGD_r2: 59-
ATTGGGCAGCCCTGATTCTCTGAGAGGAGGAAC-39. A primeira PCR dutos foram purificados utilizando um kit de
purificao de PCR e NucleoSpin gel e, em seguida, amplificado, usando platina superfi ADN polimerase para
introduzir sample- cdigos de barras duplo-finais especficos, com os iniciadores M1S: 59- (N) 4-6 (XXXXXX) CA-
GTGGTATCAACGCAGAG- 39 e Z: 59- (N) 4-6 (XXXXXX) ATTGGGCAGCCCTGATT-39, em que XXXXXX representa
um cdigo de barras de 6 nt especfico de amostra. Os segundos produtos de PCR foram purificados utilizando
um kit NucleoSpin Gel e PCR Purification. Para cada amostra, 300 ng de produto purificado segunda PCR foi
utilizado para a preparao da biblioteca de sequenciao individual utilizando um Kit NEBNext Ultra II da
biblioteca de ADN Prep com NEBNext singleplex Oligos para Illumina (New England Biolabs). As concentraes
para cada biblioteca foram determinadas utilizando um kit de ensaio Qubit dsDNA BR (Life Technologies);
Juntou-se uma quantidade igual de cada biblioteca e administrou-se num gel de agarose a 1,5%, e extraiu-se
uma banda de 600-800 pb e extraiu-se utilizando um Kit NucleoSpin Gel e PCR Purification. bibliotecas reunidas,
extraiu-gel foram ento qualidade controlada usando um Kit de Bioanalyzer alta sensibilidade (Agilent) e
quantificados por qPCR utilizando um Kit o Biblioteca de quantificao / Illumina GA / ABI Prism com o
controlo interno Illumina (ambos a partir de Kapa Biosystems).

Seqenciamento de repertrio de Ig e anlise de dados

As bibliotecas de sequenciao foram cravadas com um controlo PhiX Control v3 a 30% e carregadas a uma
concentrao de 10 pM para sequenciao emparelhada de 400 + 225 pb assimtrica executada utilizando um
sequenciador MiSeq executando um Kit Reagente MiSeq v3 (todos da Illumina). Os dados de sequenciao
foram processados usando MIGEC (34), como se segue. Primeiro, as leituras em bruto foram demultiplexadas
com base nos dois cdigos de barras de 6 nt de cada amostra e, em seguida, divididas em grupos de
identificadores moleculares (MIGs) consistindo em leituras compartilhando a mesma UMI. MIGs consistindo de
menos de cinco leituras foram descartados. Em seguida, utilizando apenas as primeiras leituras, as sequncias
de consenso foram determinadas independentemente para leituras de 59 e 39 leituras dentro de cada MIG.
59- e 39-end read consenso seqncias foram ento mescladas usando o MiTools Merge Utility
(https://github.com/milaboratory/mitools), com a mnima seqncia semelhana definida para 70% para
leituras com sobreposio partes, para gerar full- Comprimento para cada MIG. Utilizando MiXCR (35), as
sequncias de Ig de comprimento completo foram ento mapeadas para as sequncias da linha germinativa de
referncia de ratinho, e os alinhamentos resultantes foram utilizados para reunir clontipos. Na montagem de
clontipos, foi utilizada uma probabilidade de mutao especfica de 1024 para a correo baseada em
frequncia de PCR ou erros de seqenciamento. Os clonetipos montados foram ento exportados para anlise
de diversidade usando VDJtools (36). As estimativas de diversidade clonotpica foram calculadas com base na
sequncia de nucletidos de CDR3 e utilizao de segmentos V e J.

Anlise estatstica

Todos os grficos e estatsticas foram gerados usando Prism 6 (GraphPad) ou Excel (Microsoft). As anlises
estatsticas especficas esto listadas nas respectivas legendas. As anlises de teste de Mann-Whitney, Wilcoxon
e t foram todas duas colunas.

Resultados

Os linfcitos NOD B apresentam maior expresso de Aicda e sua ablao retarda significativamente o
desenvolvimento de T1D. Os linfcitos B em camundongos NOD podem sofrer CSR / SHM, aumentando sua
capacidade de processar e apresentar epitopos autoantignicos para clulas T diabetognicas. Contudo,
desconhece-se se a CSR e a SHM so contribuintes naturalmente importantes para a actividade diabetognica
dos linfcitos B em ratinhos NOD e, por extenso, em seres humanos susceptveis a doenas. Uma descoberta
inicial que suporta esta possibilidade foi que os nveis basais de expresso de Aicda necessrios para induzir CSR
/ SHM foram mais elevados nos linfcitos B de NOD do que naqueles de ratinhos B6 no auto-imunes (Fig. 1A).
Estes dados suportam a presena de um nvel de linha de base significativamente mais elevado de linfcitos B
que expressam Aicda activado por auto-antignio em ratinhos NOD do que em controlos B6 e so consistentes
com observaes anteriores de que os GCs so expandidos em estirpes auto-imunes (37). Em seguida, testou-
se se a expresso de Aicda pelos linfcitos NOD B era crtica para a sua actividade diabetognica. Utilizou-se a
tecnologia CRISPR-Cas9 para direccionar directamente o exo 1 ou 2 (contendo um potencial local de partida
alternativo) de Aicda em zygotes NOD (Fig. 1A-D suplementar). Isto permitiu a subsequente gerao de bases
de fundo de NOD puro contendo o alelo Aicda alvo do exo 1 (Linha 1) ou exo 2 (Linha 26) num estado
homozigtico (Figura 1A-D suplementar). Em seguida, avaliamos a capacidade dos linfcitos B purificados das
linhagens 1 ou 26 para se submeter CSR ao isotipo IgG1 aps a estimulao de anti-CD40 e IL-4 in vitro.
Semelhante ao caso relatado para um material de fundo B6 (22), os linfcitos B das linhagens 1 e 26 NOD.Aicda2
/ 2 mostraram diminuio significativa da CSR (Fig. 1B, 1C). Foram tambm efectuadas anlises para confirmar
que a capacidade reduzida dos linfcitos NOD.Aicda2 / 2B para se submeterem RSE no era o resultado de
mutaes fora do alvo causadas por CRISPR-Cas9. Para fazer isso, cada NOD. A linha Aicda2 / 2 foi cruzada com
o material B6.Cg-Aicda, tm1Hon / HonRbrc estabelecido, e os linfcitos B purificados dos hbridos F1 resultantes
foram testados quanto capacidade de RSE. A observao de CSR reduzida similarmente em prognies F1 para
cada linha demonstra que este fentipo o resultado de nossa nova interrupo direta em NOD de Aicda (Fig.
1E, 1F).

Em seguida, comparamos a taxa feminina de desenvolvimento T1D para cada linha NOD.Aicda com a de
controles WT NOD. Ambos NOD. As linhas de Aicda2 / 2 exibiram taxas significativamente reduzidas
semelhantes de T1D (Fig. 1D). Os ratinhos NOD.Aicda + / 2 heterozigticos desenvolveram T1D a uma taxa
intermdia (dados no apresentados). Curiosamente, as linhagens 1 e 26 NOD.Aicda2 / 2 ratos restantes livre
de T1D aberto no final do estudo de incidncia ainda eram caracterizados por nveis significativos de insulite
(Fig. 1E). Em seguida, comparamos a cintica da progresso da insulite em camundongos NOD e NOD.Aicda2 /
2 fmeas aos 7, 11 e 18 semanas de idade. A progresso da insulite no foi retardada na Linha 1 NOD. Aicda2 /
2 (Fig. 1F, 1G), indicando que isso no poderia explicar a sua resistncia T1D. Juntos, estes dados indicam que,
apesar da presena continuada de leuccitos infiltrando ilhus em ratinhos NOD.Aicda2 / 2, a natureza
diabetognica destas clulas foi alterada por ablao gentica de AID.

NOD.Aicda2 / 2 linfcitos B totais so numericamente aumentados, e os subgrupos GC e semelhantes memria

so proporcionalmente expandidos

Inicialmente investigar a base para a resistncia T1D de NOD. Aicda2 / 2, comparmos-os com os controlos de
WT para a presena de vrias populaes de linfcitos B imaturos e maduros dentro de baos e PLNs. As
estratgias de bloqueio para estudos de citometria de fluxo subsequentemente descritos esto ilustradas na
Fig. 2. Os murganhos da linha 1 foram utilizados para todos os estudos subsequentes devido a uma melhor
proclividade de reproduo e facilidade de genotipagem em comparao com os murganhos Line 26
igualmente resistentes a T1D. Os processos de seleo para podar os linfcitos B auto-reativos operam no
estdio imaturo de transio-1 (T1) no bao (38). A frequncia dos linfcitos T1 B esplnicos aumentada em
ratinhos NOD.Aicda2 / 2, enquanto que as clulas subsequentes de transio-2 (T2) no estdio de
desenvolvimento so diminudas (Fig. 2A). Uma alterao na proporo de clulas T1 / T2 pode reflectir o
aumento da separao tolerognica de linfcitos B autorreativos em ratinhos NOD.Aicda2 / 2 (39).
Alternativamente, esta alterao pode ser o resultado da diminuio da susceptibilidade dos linfcitos Aicda2
/ 2B apoptose no estdio T1 (40). Apesar da distribuio diferente dos subconjuntos T1 e T2, o rendimento
total dos linfcitos B esplnico e PLN B foi maior nos camundongos NOD.Aicda2 / 2 do que nos controles WT
(Fig. 2B). De acordo com os relatrios de ablao de AID em outras estirpes (41), os linfcitos Fas + GL7 + GC B
foram expandidos nos baos e PLN dos ratinhos NOD.Aicda2 / 2 (Fig. 2C, 2D). Isto est correlacionado com os
grandes tamanhos de GC observados em baos de ratinhos Aicda2 / 2 (dados no apresentados). Alm disso,
as propores de linfcitos B esplnicos de tipo memria CD80 + e PD-L2 + (42) foram aumentadas em NOD.
Aicda2 / 2 (Figura 2E). Alm disso, o perfil de istopos do soro dominado por IgM dos camundongos NOD.Aicda2
/ 2 paralelo ao de outras cepas Aicda2 / 2 (Fig. 2F), bem como aqueles observados em pacientes com
deficincia de AID (43). Finalmente, as percentagens de linfcitos B entre leuccitos infiltrantes de ilhus
(CD45.1 +) foram semelhantes em ratinhos NOD e NOD.Aicda2 / 2 (Fig. 2G). As propores de linfcitos B
infiltrando-ilhotas em camundongos NOD.Aicda2 / 2 expressando a ativao de CD69 e marcadores de memria
semelhantes a CD80 ou PD-L2 (42) foram semelhantes e maiores, respectivamente, do que aqueles em
controles de NOD (Figura 2H). Juntos, estes dados indicam que a ablao gentica de AID em ratinhos NOD
aumenta o nmero de linfcitos B perifricos apresentando um GC mais predominante e fentipo semelhante
a memria.

A ablao de AID em camundongos NOD expande populaes de clulas T, mas no afeta diretamente sua
atividade diabetognica

As clulas T so os ltimos mediadores da destruio de clulas B em T1D. Portanto, ns testamos se as clulas

T em T1D-resistente NOD. Os ratinhos Aicda2 / 2 foram quantitativa e / ou qualitativamente distintos daqueles
em controlos NOD. Surpreendentemente, os rendimentos das clulas T CD4 + e CD8 + esplnicas foram
aumentados em ratinhos NOD.Aicda2 / 2 (Fig. 3A).

Correspondente com aumento dos linfcitos GC B, as clulas CXCR5 + PD-1 + Tfh totalmente activadas tambm
foram expandidas em baos e PLN de ratinhos NOD.Aicda2 / 2 (Fig. 3B, 3C). Embora expandido numericamente,
procurou-se determinar se a actividade diabetognica intrnseca de clulas T em ratinhos NOD.Aicda2 / 2 estava
diminuda. As clulas T NOD purificadas ou NOD.Aicda2 / 2 no diferiram na sua capacidade de transferir T1D
para receptores NOD-scid deficientes em linfcitos (Fig. 3D). Juntos, estes dados indicam que a ablao gentica
de AID em ratinhos NOD conduz a uma expanso das clulas T perifricas e Tfh subconjunto e a proteco da
doena observada no devida a uma diminuio do seu potencial diabetognico.
FIGURA 1. Os linfcitos NOD B expressam espontaneamente nveis elevados de Aicda e a ablao deste gene
inibe o desenvolvimento de T1D. (A) Os linfcitos B purificados de baos individuais de ratinhos fmeas NOD (n
= 3) e B6 (n = 3) de 8 semanas de idade foram testados quanto expresso de Aicda atravs de qPCR. Os dados
so representativos de trs experincias independentes. (B) Grficos de citometria de fluxo representativos que
mostram a mudana de classe para IgG1 de linfcitos B purificados de NOD e NOD. Aicda2 / 2 Linhas 1 e 26
ratinhos estimulados em cultura com anti-CD40 (1 mg / ml) e IL-4 murina (25 ng / ml) durante 96 h; Os dados
quantitativos reunidos a partir de trs experimentos (NOD = 7, Linha 1 = 5, Linha 26 = 5) so resumidos em (C).
(D) Incidncia de T1D feminino em controlos de NOD em comparao com ratos NOD.Aicda2 / 2 Line 1 (p,
0,0001) e NOD.Aicda2 / 2 Line 26 (p = 0,001). (E) Escores de insulite em uma escala de 0 (sem leso visvel) a 4
(75-100% de destruio de ilhotas) para fmeas NOD.Aicda2 / 2 Linhas 1 e 26 camundongos remanescentes
livres de T1D evidente no final do estudo de incidncia de doena . (F) Insulite para fmea NOD e NOD.Aicda2 /
2 Linha 1 ratos com 7, 11 e 18 semanas de idade. (G) Ilhu representativo para cada nvel de pontuao de
insulite. As setas apontam para a infiltrao linfoctica de ilhotas. Barra de escala, 200 mm. Todos os grficos
de barras e grficos de disperso mostram uma mdia de 6 SEM. O teste t de Student foi utilizado para
determinar o valor de p mostrado para a expresso de gene, e o teste de MannWhitney foi utilizado para a
mudana de classe. Os valores de p para a incidncia de T1D foram determinados utilizando os testes de log-
rank de MantelCox.

As clulas T NOD transferem T1D de forma adoptiva de forma menos eficiente na presena de linfcitos B
deficientes em Aicda caracterizados por um subconjunto CD73 + expandido

Tal como descrito acima, quando transferido na ausncia de linfcitos B, as clulas T purificadas de doadores
NOD.Aicda2 / 2 induziram eficientemente o desenvolvimento de T1D em receptores de NOD-scid. Isto indicou
que a resistncia T1D em NOD. Aicda2 / 2 ratinhos no resulta de um efeito intrnseco das clulas T. Assim,
avaliamos como os linfcitos B deficientes em AID podem influenciar tais efectores patognicos. Para testar
inicialmente isto, foram transferidos nmeros iguais de clulas T esplnicas NOD purificadas e linfcitos B
esplnicos NOD ou NOD.Aicda2 / 2 purificados para receptores NOD-scid. As clulas T NOD induziram T1D muito
menos eficientemente em receptores NOD-scid quando cotransferred com linfcitos Aicda2 / 2 B do que
quando cotransferred com linfcitos WT B (Fig. 4A). Estes resultados indicaram que os linfcitos Aicda2 / 2B
podem suprimir activamente as respostas de clulas T diabetognicas.

CD39 e CD73 so ectoenzimas que catalisam a converso de ATP extracelular em AMP e depois em adenosina,
respectivamente. H evidncias de que alteraes na via metablica purinrgica CD39 / CD73 desempenham
um papel importante em vrias doenas autoimunes (44). A sinalizao da adenosina atravs do receptor A2a
da adenosina (A2aR) pode inibir a sinalizao TCR e prevenir a ativao celular (45). Num modelo de colite
murina, a expresso de CD73 assinala um subconjunto de linfcitos B com a capacidade de suprimir as respostas
das clulas T atravs da produo de adenosina (46). Assim, comparmos a extenso em que os linfcitos B de
murganhos NOD intactos e com deficincia de Aicda expressam CD39 e / ou CD73. Os nveis de linfcitos CD73
+ B foram maiores nos baos, PLNs e ilhotas de camundongos NOD.Aicda2 / 2 em comparao com os controles
NOD (Fig. 4B, 4C). Observamos maiores propores de linfcitos B CD73 + que coexpressaram ou no o CD39
nos baos, PLNs e ilhotas de NOD. Aicda2 / 2 em comparao com os controles NOD, mas no encontraram
diferenas na frao CD39 + CD732 (Fig. 4D-F). Juntos, estes dados indicam que a capacidade das clulas T de
NOD para induzir o desenvolvimento de T1D reduzida na presena de linfcitos NOD.Aicda2 / 2 B, que contm
um subconjunto CD73 + expandido que foi anteriormente referido como exercendo actividade reguladora (46)

FIGURA 2. Os linfcitos NOD.Aicda2 / 2 B so numericamente aumentados e apresentam um fentipo de GC

mais predominante do que os dos controlos de NOD. (A) Anlises de citometria de fluxo comparando os
subgrupos de linfcitos T (B220 + CD19 + CD212 CD232), T2 (B220 + CD19 + CD21hi CD23 +), zona marginal
(MZ; B220 + CD19 + CD21hi CD232) e subgrupos de linfcitos B foliculares (FO; B220 + CD19 + CD21 + CD23 +)
em 8 -wk-old fmea NOD e NOD.Aicda2 / 2 ratos (n = 8 por grupo, um representante de trs experimentos). (B)
A enumerao de linfcitos B totais (CD45.1 + B220 + CD19 +) no bao e PLN de ratinhos NOD.Aicda2 / 2 de 7-
10 semanas de idade (n = 21) comparados com os controlos de NOD (n = 19) Quatro experimentos individuais.
(C) Grficos de contorno de citometria de fluxo representativos mostrando eventos de clulas monocelulares
vivas com linfcitos B para anlise de linfcitos B esplnicos e PLN GC (Fas + GL7 +) em camundongos NOD e
NOD.Aicda2 / 2 fmeas de 7 semanas de idade; Os dados quantitativos (n = 7 por grupo) de uma experincia
so resumidos em (D). (E) Porcentagem de clulas CD80 + ou PD-L2 + entre linfcitos B esplnicos ou PLN em
ratinhos fmeas NOD (n = 8) e NOD.Aicda2 / 2 (n = 10) de 10 semanas de uma experincia. (F) Quantificao,
por ELISA, de istipos de Ig de soro em camundongos NOD macho de 6 a 7 semanas de idade (n = 7) e ratinhos
NOD.Aicda2 / 2 (n = 10) reunidos a partir de duas experincias. (G) Anlise de clulas B220 + infiltrando-ilhotas
entre leuccitos CD45.1 + em ratinhos NOD fmeas com 10-12 semanas de idade (n = 18) e ratinhos NOD.Aicda2
/ 2 (n = 16) reunidos a partir de cinco experincias. (H) Propores de linfcitos B infiltrando ilhus com um
fentipo CD69 +, CD80 + ou PD-L2 + em ratinhos NOD fmeas com 10-12 semanas de idade (n = 18 para CD69
e CD80, n = 13 para PD-L2) ou NOD.Aicda2 / 2 ratinhos (n = 16 para CD69 e CD80, n = 14 para PD-L2) reunidos
a partir de cinco experincias. Todos os grficos de barras mostram mdia 6 SEM. Todos os valores de p foram
calculados utilizando anlises de MannWhitney.
Os linfcitos B CD73 + em ratinhos NOD.Aicda2 / 2 exercem actividade reguladora suprimindo respostas de clulas
T diabetognicas

Conforme mencionado acima, a expresso de CD73 pode marcar uma populao de linfcitos B supressores.
Os linfcitos B Aicda2 / 2 enxertados em receptores NOD-scid retm a expresso aumentada de CD73 (Fig. 5A).
Assim, avaliamos se os linfcitos B CD73 + expandidos em ratinhos NOD.Aicda2 / 2 exercem efeitos supressores
de T1D em experincias de transferncia adoptiva. As clulas T NOD purificadas transferiram T1D para
receptores NOD-scid com uma eficincia significativamente maior quando misturados com linfcitos Aicda2 /
2 B que tinham sido esgotados do subconjunto CD73 + (Figura 5B). Em seguida, realizou-se estudos in vitro para
determinar se os linfcitos NOD B deficientes em Aicda exercem efeitos supressores sobre tais efectores
patognicos atravs da actividade reguladora mediada pelo subconjunto CD73 + expandido. Os linfcitos B
CD73 + e CD732 ordenados de ratinhos NOD ou NOD.Aicda2 / 2 foram cultivados com clulas T CD4 + WT CD732
CD4 + anti-CD40 estimuladas com CD3, e AMP, com ou sem o inibidor CD73 APCP. Numa base por clula, os
linfcitos CD73 + B de murganhos NOD intactos e deficientes em AID suprimiram a proliferao de clulas T
igualmente e numa extenso significativamente maior do que o subconjunto CD732 na presena de AMP; A
adio de APCP diminuiu este efeito (Fig. 5C, Figura 3A suplementar).Tem sido relatado anteriormente que os
linfcitos B com uma capacidade de suprimir o desenvolvimento de T1D em ratinhos NOD principalmente faz-
lo atravs da secreo de IL-10 (47). De modo semelhante, a populao de linfcitos B CD73 + expandida em
ratinhos NOD.Aicda2 / 2, que exibem a capacidade de suprimir respostas de clulas T diabetognicas, segregam
nveis significativamente mais elevados de IL-10 sob estimulao LPS do que as suas contrapartes CD732 (Figura
5D) . Juntos, estes resultados indicam que o desenvolvimento diminudo de T1D em ratinhos NOD.Aicda2 / 2
devido, pelo menos em parte, a uma expanso de linfcitos B CD73 + com a capacidade de suprimir respostas
de clulas T patognicas. Os linfcitos CD73 + B suprimem as respostas das clulas T atravs da gerao de
adenosina por esta ectoenzima e potencialmente pela sua capacidade de secretar IL-10 aps a estimulao.
Esses resultados coletivos tambm indicam que a ablao gentica de AID inibe o desenvolvimento de T1D em
camundongos NOD aumentando quantitativamente, em vez de mudar qualitativamente, os linfcitos B CD73 +
imuno-reguladores.

FIGURA 3. Os nmeros de clulas CD4 + nT de fentipo total perifrico e GC so aumentados em ratinhos NOD
Aicda2 / 2. (A) Os rendimentos das clulas T CD4 (CD45.1 + TCRb + CD4 +) e CD8 (CD45.1 + TCRb + CD8 +)
esplnicas ou PLN-residentes em 7DWW-old female NOD (n = 19) e NOD Aicda2 / 2 (n = 21) ratinhos agrupados
a partir de quatro experincias. (B) Grficos de contorno de citometria de fluxo representativos mostrando
eventos fechados de clulas T CD4 vivas unicelulares para anlise de clulas Tfh esplnicas e PLN cheias (CXCR5
+ PD-1 +) em camundongos fmeas com 7 semanas de idade, com dados quantitativos (n = 7 Por grupo)
resumido em (C), um representante de trs experimentos. (D) desenvolvimento de T1D em receptores NODscid
injectados com 2,5 3 106 clulas T purificadas de ratinhos fmeas NOD.Aicda2 / 2 ou NOD fmeas de 7-8
semanas de idade. Todos os grficos de barras mostram mdia 6 SEM. Todos os valores de p em grficos de
barras foram calculados utilizando a anlise de MannWhitney. O valor de p da incidncia de T1D foi calculado
utilizando a anlise de MantelCox.

O tratamento com DIDS diminui a diversidade de repertrio de Ig de linfcitos NOD B

Os resultados dos nossos estudos genticos mostram que os processos dependentes da AID desempenham um
papel importante nas contribuies dos linfcitos B para o desenvolvimento de T1D em ratinhos NOD. Inibindo
a reparao de RAD51 mediada por RAD51 de AID iniciado off-alvo DSBs, o tratamento com a pequena molcula
DIDS induz a morte de linfcitos B em que SHM e CSR processos foram iniciados (23). Portanto, ns
hipotetizamos que o direcionamento da via AID / RAD51 pelo tratamento com DIDS pode proporcionar uma
interveno eficaz de T1D dirigida a linfcitos B. Para testar inicialmente essa possibilidade, estimulamos
linfcitos NOD B purificados com anti-CD40 e IL-4 na presena de veculo ou 150 mM de DIDS in vitro.
Semelhante ao caso dos murganhos de controlo B6, aps 4 d de estimulao, foram recuperados menos
linfcitos NOD B de culturas contendo DIDS (Figura 6A). Adicionalmente, foram recuperados menos linfcitos
B estimulados com anti-CD40 / IL-4 a partir de culturas contendo (E) -5-acetamido-2- (4- (3-isopropiltioureido)
-2-sulfonatostriilo) benzenossulfonato, outro inibidor RAD51 de pequena molcula Que 1500 vezes mais
potente do que DIDS (Figura 6A, Figura 4 suplementar).

Em seguida, determinou-se se o tratamento com DIDS afectou o repertrio Ig de ratinhos NOD de uma maneira
semelhante ablao gentica de AID. Raciocinou-se que a incapacidade dos linfcitos NOD.Aicda2 / 2 B de
iniciar os processos CSR / SHM resultaria numa diminuio do gene de Ig que codifica a diversidade do
repertrio em relao aos controlos WT. Por extenso, tambm hipotetizamos que a perturbao mediada por
DIDS do eixo AID / RAD51 recapitularia tais diminuies na diversidade de repertrio de Ig. Por conseguinte,
utilizando protocolos estabelecidos (33), utilizou-se sequenciao de alto rendimento para caracterizar ARNm
de IgH de comprimento total a partir de linfcitos B purificados residentes de PLN de NOD e NOD individuais de
8 semanas de idade.

Aicda2 / 2, bem como a partir de ratinhos NOD tratados com veculo ou 50 mg / kg DIDS de 8 a 16 semanas de
idade. Para minimizar as sobreavaliaes da diversidade, o protocolo utiliza a transcrio reversa de comutao
de molde para incorporar uma IHM de 12 pb na extremidade 39 de cada molcula de cDNA. Isto permite a
correco dos erros de sequenciao e de PCR agrupando mltiplas leituras provenientes de molculas de cDNA
simples para formar leituras de consenso. As anlises de rarefao e estimativa da diversidade de Chao
extrapolada (48) revelaram diminuio da diversidade de IgH entre os linfcitos B dos camundongos NOD
tratados com NOD.Aicda2 / 2 e DIDS em comparao com os controlos NOD no tratados e tratados com
veculo, respectivamente (Fig. 6B, 6C). Para garantir que o vis de amostragem resultante de variveis na
profundidade de seqenciamento no foi responsvel pelas diferenas observadas na diversidade, cada
amostra foi amostrada abaixo de 500 leituras de consenso. Aps 500 iteraes de reamostragem, os linfcitos
B tratados com Aicda2 / 2 e DIDS apresentaram diminuio da diversidade, conforme medido pela estimativa
da diversidade observada e da diversidade total do limite inferior (Efron-Thisted) (49), em comparao com
seus respectivos controles (Fig. 6D, 6E). Juntos, os dados in vitro e in vivo indicam que os linfcitos NOD B so
to susceptveis DIDS como anteriormente relatado para os da estirpe B6 (23), eo tratamento com esta
pequena molcula diminui a diversidade do repertrio IgH de uma forma semelhante ablao Aicda.
FIGURA 4. As clulas T NOD transferem T1D adoptivamente de forma menos eficiente na presena de linfcitos
B deficientes em Aicda caracterizados por uma expanso do subconjunto CD73 +. (A) Desenvolvimento de T1D
em receptores de NOD-scid injectados com 2,5 3 106 clulas T purificadas de doadores de NOD fmeas de 7-8
semanas de idade misturadas com 2,5 3 106 linfcitos B de ratinhos NOD de 7-8 semanas de idade (n = 10 ) Ou
NOD Aicda2 / 2 ratinhos (n = 9). (C) Quantificao da percentagem de clulas CD73 + entre os linfcitos B do
bao, PLN e islote em 7 Ratinhos NOD de 12 semanas de idade (bao / PLN: n = 15, ilhotas: n = 18) e ratinhos
NOD.Aicda2 / 2 (bao / PLN: n = 17, ilhotas: n = 16). Os dados do bao e PLN so reunidos a partir de trs
experincias; Os dados dos ilhus so reunidos a partir de cinco experincias. Quantificao da percentagem de
clulas CD39 + CD73 +, CD39 + CD732 e CD392 CD73 + entre os linfcitos B (B), PLN (E) ou islote (F) B220 + CD19
+ em ratinhos NOD fmeas com 7-12 semanas de idade (bao / PLN : N = 15, ilhotas: n = 7) e ratinhos NOD.Aicda2
/ 2 (bao / PLN: n = 17, ilhotas: n = 8) reunidos a partir de duas experincias individuais. O valor de p da incidncia
de T1D foi calculado utilizando a anlise de MantelCox. Todos os valores de grfico de barras p foram calculados
utilizando a anlise de Mann-Whitney, e todos os grficos de barras mostram uma mdia de 6 SEM.

FIGURA 5. Os linfcitos B CD73 + deficientes em AID expandidos exercem actividade de tipo regulador suprimindo
respostas de clulas T diabetognicas. (A) Nveis de enxerto esplnico de linfcitos CD73 + B de NOD (n = 9) ou
NOD Os doadores de Aicda2 / 2 (n = 8) foram misturados com clulas T de NOD (2,5 3 106 de cada tipo de clula)
4 semanas aps o transferem para receptores de NOD-scid. Resultados de um experimento. (B) Desenvolvimento
de T1D em receptores de NOD-scid injectados com 2,5 3 106 clulas T purificadas de ratinhos NOD fmeas de 7-
8 semanas de idade misturados com 2,5 3 106 linfcitos B totais ou CD73-esgotados purificados a partir de 7-8
semanas de fmeas NOD Aicda2 / 2 doadores.(C) Um total de 1,0 3 105 clulas T CD4 + purificadas com depleo
de CD73 a partir de ratinhos NOD macho 7-10 semanas de idade foram marcadas com Proliferao de Clulas
tintura eFluor 670 e co-cultivadas durante 4 d com 1,0 3 105 CD73 + ou CD732 linfcitos B a partir de baos de
NOD macho reunidas 7-10 semanas de idade (n = 6 rplicas biolgicas) ou NOD Aicda2 / 2 (n = 10 replicados
biolgicos) os ratos sob condies de estimulao que consistem em solvel anti CD40 (1 mg / ml), placa-ligado
anti-CD3 (5 mg / ml), e anti-CD28 solvel (2 mg / ml), com 0 (linha de base) ou a AMP 10 mM, na presena ou
ausncia de APCP 100 mM. Quantificao da supresso percentual da linha de base. (D) Um total de 5 3 104
NOD (n = 5 repeties biolgicas) purificadas ou NOD.Aicda2 / 2 (n = 10 repeties biolgicas) CD73 + ou
linfcitos B CD732 foram cultivadas durante 3 d com 0 ou 10 mg / ml LPS, e os nveis de IL-10 do sobrenadante
de cultura foram medidos por ELISA. A supresso in vitro mediada por CD73 e os dados de produo de IL-10
apresentados so combinados a partir de trs e duas experincias individuais, respectivamente. Todos os
grficos de barras mostram mdia 6 SEM. O valor de p do estudo de incidncia de T1D foi calculado usando a
anlise de MantelCox. O teste de Wilcoxon foi realizado para o ensaio de supresso. A anlise de MannWhitney
foi realizada para a produo de IL-10.

A inibio molecular do eixo AID / RAD51 inibe o desenvolvimento de T1D

Em seguida, testmos se o tratamento in vivo com DIDS exercia efeitos protectores de T1D em ratinhos NOD.
A partir das 6, 8 ou 10 semanas de idade, os ratinhos NOD fmeas receberam i.p. Injeces de veculo ou DIDS
a 10 mg / kg (dose baixa) ou 50 mg / kg (dose elevada, 6 e 8 semanas apenas para iniciar). Independentemente
do tempo de incio ou da dose, o tratamento com DIDS exerceu fortes efeitos protetores T1D at 24 semanas
de idade, altura em que a incidncia da doena em controlos atingiu 90% (Fig. 7A-C).A presena de IAAs um
critrio importante que usado para identificar humanos em alto risco futuro de T1D para incluso em possveis
ensaios de interveno de doena (13). Assim, imediatamente antes do incio do tratamento, o soro foi
recolhido a partir de ratinhos representados na Fig. 7A e retrospectivamente digitado para IAAs. importante
notar que o tratamento com DIDS impediu a progresso para a T1D aberta quando iniciado em ratinhos IAA +
NOD (IAA +: veculo 2/3, DIDS 0/9, IAA2: veculo 6/7, DIDS 0/11) (Figura 7D). Adicionalmente, os ratinhos NOD
tratados com DIDS a partir de 8 semanas de idade tinham nveis diminudos de insulite em comparao com os
controlos (Fig. 7E). Estes dados colectivos indicam que o tratamento com DIDS inibe a progresso para T1D
evidente, mesmo quando iniciado em ratinhos NOD que j tinham desenvolvido elevados nveis contnuos de
autoimunidade de clulas B marcados pela presena de IAAs.

O tratamento com DIDS altera os perfis de linfcitos B de uma forma semelhante quela provocada pela ablao
de Aicda

Para investigar inicialmente como o reagente pode desencadear a proteco T1D, os ratinhos NOD tratados
com DIDS de 8 a 16 semanas de idade foram avaliados quanto a alteraes fenotpicas nas populaes de
linfcitos B. Conforme observado aps ablao gentica de AID, os ratinhos NOD tratados com DMS de 50 mg
/ kg de 8 a 16 semanas de idade foram caracterizados por um aumento do nmero total de linfcitos esplnicos
e PLN B (Fig. 8A). Adi- cionalmente, semelhante ao caso provocado pela ablao gentica da AID, o tratamento
com DIDS conduziu expanso dos compartimentos de linfcitos B esplnicos e PLN GC (Fig. 8B). Os linfcitos
B tambm foram proporcionalmente aumentados entre os linfcitos infiltrantes de ilhus (Fig. 8C). Alm disso,
os ratos NOD.Aicda2 / 2 fenocpicos aumentaram as propores de linfcitos CD73 + B, esplnicos, PLN e
residentes de ilhotas com potencial capacidade imunossupressora pelo tratamento com DIDS (Fig. 8D). Alm
disso, o aumento provocado por DIDS nos linfcitos CD73 + B das ilhotas ocorreu nas subpopulaes CD73 +
CD39 + e CD73 + CD392 (Fig. 8E). Finalmente, os linfcitos B infiltrantes de ilhus apresentaram nveis
semelhantes de CD69, mas aumentaram a expresso de CD80 e PD-L2 (Fig. 8F). Isto tambm foi semelhante
expanso de linfcitos B com um fentipo similar memria dentro das ilhotas de camundongos NOD.Aicda2
/ 2. Apesar desta expanso observada de linfcitos B semelhantes a memrias infiltrao de ilhus em ratinhos
tratados com DIDS, as anlises de citometria de fluxo de linfcitos B residentes em medula ssea revelaram
que, em relao aos controlos tratados com veculo, o tratamento com DIDS conduziu a uma diminuio
proporcional da Hardy F) linfcitos B (Fig. 8G, Fig.2F Suplementar).

Os efeitos do tratamento DIDS nos linfcitos B indirectamente suprimem as respostas das clulas T diabetognicas
O tratamento com DIDS e a ablao gentica de Aicda provocam alteraes fenticas semelhantes em linfcitos
NOD B. Embora no tenha sido provocada pela ablao de Aicda, consideramos importante determinar se o
tratamento com DIDS afecta directamente a capacidade diabetognica das clulas T de NOD. As clulas T CD4
+ e CD8 + totais aumentaram numericamente nos PLNs, mas no nos baos, de ratinhos tratados com DIDS (Fig.
9A). Conforme observado na ablao gentica de AID, as propores de clulas Tfh aumentaram nos baos e
PLNs de ratinhos NOD tratados com DIDS (Fig. 9B). A proporo de clulas T totais diminuiu entre leuccitos
infiltrantes de ilhus (Fig. 9C) aps tratamento com DIDS. Adicionalmente, houve uma diminuio na proporo
do subconjunto CD8 + entre as clulas T infiltrativas de ilhus (Fig. 9D). As clulas T CD4 + apresentaram maior
expresso de CD69 aps tratamento com DIDS (Fig. 9E). O tratamento com DIDS no alterou significativamente
a expresso CD69 das clulas T CD8 + das ilhotas, mas aumentou ligeiramente os nveis de IL-7Ra (Fig. 9E).
Finalmente, em comparao com os controlos tratados com veculo, em ratinhos tratados com DIDS, as clulas
T CD4 + infiltrantes de ilhus tinham um fentipo de memria central naive diminudo e aumentado, enquanto
que as clulas T CD8 + tinham um efector diminudo e um fenotipo de memria central aumentado (Fig. 9F).
Juntos, estes dados indicam que o tratamento com DIDS reduz as clulas T CD8 + efetoras e dirige a acumulao
de clulas T CD4 + e CD8 + de memria central dentro das ilhotas de ratinhos NOD. Em seguida, testmos se o
tratamento com DIDS tinha efeitos duradouros sobre a actividade diabetognica das clulas T. Os ratos NOD
fmeas, tratados uma vez por semana com veculo ou DIDS de 50 mg / kg de 8 a 16 semanas de idade, tornaram-
se ento doadores de clulas T esplnicas purificadas que foram transferidas para receptores NOD-scid que
foram subsequentemente monitorizados para desenvolvimento T1D. As clulas T de ratinhos tratados com DIDS
transferiram T1D para receptores de NOD-scid com eficincia significativamente menor em comparao com
os de dadores de controle (Fig. 9G). Ns imaginamos duas explicaes possveis para este resultado: os linfcitos
B nos doadores tratados com DIDS expandem as populaes de clulas T autorreativas menos eficientemente
do que nos ratinhos tratados com veculo e os DIDS podem actuar directamente para suprimir a actividade das
clulas T diabetognicas.

Para distinguir entre as possibilidades acima, testou-se o efeito directo de DIDS sobre a funo diabetognica
de clulas T de NOD na ausncia de linfcitos B. As clulas T esplnicas purificadas de ratinhos NOD fmeas de
5 a 6 semanas de idade foram transferidas para recipientes de NOD-scid. A partir de 3 d pstransfer, os
receptores de NOD-scid iniciaram semanalmente 50 mg / kg de DIDS ou tratamento com veculo e foram
monitorizados para desenvolvimento de T1D. Aps o enxerto com clulas T NOD, os receptores NOD-scid
tratados com DIDS ou veculo desenvolveram T1D a uma taxa equivalente (Fig. 9H). Estes resultados indicam
que o tratamento com DIDS no afecta directamente a actividade diabetognica das clulas T NOD. Assim, a
capacidade reduzida de clulas T de ratinhos NOD tratados com DIDS para transferir T1D de forma adotiva no
pode ser atribuda a uma reduo directa na sua patogenicidade; Em vez disso, provavelmente devido DIDS
limitar a capacidade dos linfcitos B para suportar a expanso de efectores patognicos.
FIGURA 6. DIDS diminui a expanso in vitro e a diversidade de utilizao de Ig de linfcitos NOD B. (A)
Rendimentos celulares de linfcitos B purificados a partir de ratinhos B6 ou NOD (n = 3 repeties biolgicas por
grupo) cultivados durante 96 h (13 106 clulas por mililitro) com anti-CD40 (1 mg / ml) e IL-4 murina (25 ng /
ml) na presena do veculo, 150 mM de DIDS ou 100 nM de (E) -5-acetamido-2- (4- (3-isopropiltioureido) -2-
sulfonatostyryl) benzenossulfonato. Os dados so representativos de uma das trs experincias. (B) Um total de
136 000-400 000 linfcitos B PLN purificados dos grupos experimentais NOD indicados foi sequenciado para a
diversidade de utilizao do gene de IgH (n = 3 ratinhos por grupo) numa experincia. As sequncias com codes
de paragem precoce ou mutaes de mudana de quadro foram filtradas para exibir apenas clones "funcionais".
Os dados so apresentados num grfico de rarefao mostrando a diversidade clonal como uma funo de
molculas de cDNA nicas sequenciadas. As linhas slidas e tracejadas so regies interpoladas e extrapoladas,
respectivamente, com pontos que indicam o tamanho exato da amostra e a diversidade observada. A rea
sombreada representa o intervalo de confiana de 95%. (C) ndice de estimativa da diversidade do caos.
Diversidade observada (D) e estimativa de Efron-Thisted (E) aps 500 iteraes de downsampling para 500
leituras. As parcelas de disperso mostram 6 SEM mdias. Os valores de p foram calculados utilizando o teste t
de Student.

Os linfcitos B CD73 + expandidos pelo tratamento com DIDS suprimem as respostas das clulas T diabetognicas

Ns testamos se coinfusion de linfcitos B de controle ou tratados com DIDS NOD ratos afetados
diferencialmente a capacidade de diabetogenic T clulas para transferir doena para NOD-scid receptores. NOD
fmeas foram injectadas uma vez por semana, de 8 a 16 semanas de idade, com veculo ou 50 mg / kg DIDS. As
clulas T esplnicas purificadas dos ratinhos tratados com veculo foram ento cotransferidas em recipientes
de NOD-scid com nmeros iguais de linfcitos B purificados totais de dadores tratados com veculo ou DIDS. Tal
como anteriormente referido, semelhante ao caso dos ratinhos NOD.Aicda2 / 2, o tratamento com DIDS
expande as populaes de linfcitos B CD73 +. Por conseguinte, tambm transferimos clulas T de controlos
tratados com veculo com linfcitos B desprovidos de CD73 de ratinhos tratados com DIDS. O desenvolvimento
de T1D foi significativamente diminudo em receptores de NOD-scid de clulas T patognicas coinfused com
linfcitos B totais de dadores tratados com DIDS em comparao com dadores tratados com veculo (Fig. 10A).
No entanto, a depleo do subconjunto CD73 + aumentou significativamente a capacidade dos linfcitos B de
dadores tratados com DIDS para suportar o desenvolvimento de T1D em receptores de NOD-scid coinfused
com clulas T patognicas (Fig. 10A). Assim, semelhante ao caso com a ablao gentica de AID, o tratamento
DIDS de ratinhos NOD induz um aumento quantitativo em linfcitos B CD73 + com uma capacidade para
suprimir activamente o desenvolvimento de T1D (Fig. 10A). Em seguida, testmos se a populao CD73 +
expandida pelo tratamento com DIDS pode suprimir directamente as respostas das clulas T. Numa base
percelular, os linfcitos B CD73 + de ratinhos tratados com veculo e DIDS suprimiram igualmente a proliferao
de clulas T em resposta estimulao anti-CD3 e anti-CD28 numa extenso significativamente maior do que
o subconjunto CD732 na presena de AMP (Fig. 10B). Este efeito supressor foi diminudo aps a adio de APCP
(Fig. 10B, Fig. 3B suplementar). Finalmente, examinamos a produo de IL-10 por linfcitos B CD73 + e CD732
classificados de ratinhos tratados com veculo e DIDS. Surpreendentemente, os linfcitos B CD73 + de
murganhos tratados com DIDS produziram menos IL-10 aps a estimulao com LPS do que os dos controlos
tratados com veculo (Fig. 10C). Estes resultados indicam que o direccionamento farmacolgico da actividade
de RAD51 inibe o desenvolvimento de T1D em ratinhos NOD de uma maneira semelhante quela provocada
pela ablao de Aicda, incluindo um aumento quantitativo de linfcitos B reguladores CD73 + (Bregs).

FIGURA 7. O tratamento com DIDS inibe o desenvolvimento de T1D. A partir de 6 (A), 8 (B) ou 10 (C) sem de
idade, camundongos NOD fmeas foram tratados com veculo ou DIDS (10 ou 50 mg / kg) numa base semanal
e monitorizados para desenvolvimento T1D. Os valores de p foram calculados utilizando a anlise de Mantel-
Cox. (D) O soro foi colhido a partir da coorte de ratinhos em (A) no incio do tratamento e tipificado
retrospectivamente para IAAs. O grfico representa a percentagem de ratinhos IAA + ou IAA2 em cada grupo de
tratamento que avanou ou no para T1D (IAA + DIDS: n = 9, IAA + Veculo: n = 3, IAA2 DIDS: n = 11, IAA2 Veculo:
n = 7) . Os valores de p foram calculados utilizando o teste exato de Fisher. (E) Escores de insulina para ratinhos
fmeas NOD tratados semanalmente a partir das 8 semanas de idade com veculo (n = 10) ou DIDS numa dose
de 10 mg / kg (n = 8) ou 50 mg / kg (n = 14). Os dados mostram mdia 6 SEM. Os valores de p foram calculados
utilizando a anlise de Mann-Whitney.

Discusso
Demonstrou-se que a interrupo do eixo AID / RAD51, por meios genticos ou farmacolgicos, inibe
fortemente o desenvolvimento de T1D em camundongos NOD, e esta proteo devida, pelo menos em parte,
expanso de populaes especficas de linfcitos B CD73 + com capacidade de regular Respostas de clulas T
patognicas. Adicionalmente, ns fornecemos a primeira evidncia, a nosso conhecimento, que, embora os
processos de CSR e de SHM sejam processos linfcitos intrnsecos B importantes na patognese de T1D, a sua
ausncia no diminui o desenvolvimento de clulas T autorreativas. Embora as clulas T purificadas de ratinhos
NOD.Aicda2 / 2 sejam eficazes na transferncia adoptiva de T1D para receptores NOD-scid, a inibio de
processos CSR e SHM conduz a uma expanso de Bregs que controlam estes efectores. Esses achados revelam
uma ligao inesperada entre o bloqueio de processos de maturao por afinidade dependente de AID / RAD51
e o desenvolvimento de Breg. Deste modo, a ruptura do eixo AID / RAD51 pode representar um meio
previamente no realizado de expanso in vivo de Breg.

FIGURA 8. O tratamento com DIDS altera os perfis de linfcitos B de uma forma semelhante quela provocada
pela ablao de Aicda. NOD fmeas camundongos foram tratados com veculo ou 50 mg / kg DIDS de 8 a 16
semanas de idade. (A) Rendimento dos linfcitos esplnicos totais e PLN CD19 + B220 + (n = 7 veculos, n = 8
DIDS, combinados a partir de duas experincias). (B) Percentagem de linfcitos B esplnicos e PLN GC (Fas + GL7
+) (n = 7 veculo, n = 8 DIDS, combinados a partir de duas experincias). (C) Percentagem de leuccitos B220 +
entre clulas CD45.1 + de ilhotas (combinadas a partir de duas experincias). (D) Percentagem de linfcitos B
CD73 + entre os linfcitos B220 + CD19 + B (n = 7 Veculo Bazo / PLN, n = 8 DIDS Spleen / PLN, n = 13 Veculo
Islet, n = 14 DIDS Islet; (E) Percentagem de clulas CD73 + CD39 +, CD732 CD39 + e CD73 + CD392 entre linfcitos
de ilhotas B220 + (veculo n = 13, n = 14 DIDS combinadas a partir de duas experincias). (F) Percentagem de
clulas CD69 +, CD80 + e PD-L2 + entre as clulas B220 + de ilhotas (veculo n = 13, n = 14 DIDS, combinadas a
partir de duas experincias). (G) Propores dos subconjuntos de linfcitos B Hardy D (B220 + CD432 IgM2 IgD2),
fraco E (B220 + CD432 IgM + IgD2) e fraco F (B220 + CD432 IgM + IgD +) na medula ssea (uma experincia).
A anlise de MannWhitney foi realizada para todos os grficos de grficos de barra e disperso; Os dados so
mdia 6 SEM.
FIGURA 9. Os efeitos de DIDS sobre linfcitos B indirectamente suprimem respostas de clulas T diabetognicas.
NOD fmeas camundongos foram tratados semanalmente com 50 mg / kg DIDS ou veculo de 8 a 16 semanas
de idade. (A) Percentagem de clulas T CD4 + e CD8 + entre os leuccitos vivos TER-1192 ou PLN (no-RBCs) (n
= 7 Veculos, n = 8 DIDS, combinados a partir de duas experincias). (B) Quantificao da percentagem de clulas
Tfh completas entre clulas CD4 + TCRb + no bao e PLN (n = 7 Veculos, n = 8 DIDS, combinadas a partir de duas
experincias). (C) Percentagem de leuccitos TCRb + entre clulas CD45.1 + dentro das ilhotas. (D) Percentagem
de clulas CD4 + ou CD8 + entre clulas T de ilhotas (veculo n = 13, n = 14 DIDS, combinadas a partir de duas
experincias). (E) Percentagem de clulas CD69 + e IL-7Ra + entre as clulas T CD4 + e CD8 + das ilhotas (veculo
n = 13, n = 14 DIDS, combinadas a partir de duas experincias). (F) Percentagem de clulas T CD4 + e CD8 + naive
(CD442 CD62L +), efetora (CD44 + CD62L2) e memria central (CD44 + CD62L +) nos ilhus de camundongos
DIDS- ou tratados com veculo (veculo n = 13, n = 14 DIDS; Combinado a partir de dois experimentos). (G)
Ratinhos NOD fmeas foram injectados com veculo ou 50 mg / kg DIDS de 8 a 16 semanas de idade. As clulas
T esplnicas foram ento purificadas a partir de cada grupo de tratamento e transferidas (3 3 106) para
receptores de NOD scid (n = 16 por grupo) que foram subsequentemente monitorizados para desenvolvimento
de T1D. (H) Um total de 2,5 3 106 linfcitos T purificados de ratinhos NOD fmeas com 6 semanas de idade foi
transferido para ratos NOD-scid que subsequentemente iniciaram tratamento semanal com DIDS de 0 ou 50 mg
/ kg (n = 10 por grupo) e Foram monitorados para T1D. Os valores de p do estudo de incidncia foram calculados
utilizando a anlise de Mantel-Cox. A anlise de Mann-Whitney foi realizada para todos os grficos de barras;
Dados mostram mdia 6 SEM.

A ablao de AID e DIDS direccionada para RAD51 resulta na acumulao de linfcitos B CD73 + capazes de
suprimir as clulas T, pelo menos em parte atravs da produo de adenosina (Figuras 5C, 10B). Estudos
anteriores demonstraram que a sinalizao de adenosina atravs de A2aR inibe a regulao descendente de
clulas T CD8 + de IL-7Ra, impedindo a diferenciao de clulas T de memria para efectores (50). Por
conseguinte, a alterao nas populaes de clulas T CD8 + infiltrando ilhus em ratinhos NOD tratados com
DIDS de um efetor para um fentipo de memria central (Fig. 9F), emparelhado com uma expresso aumentada
de IL-7Ra (Figura 9E), suporta ainda a concluso Que, neste sistema, as clulas T diabetognicas so suprimidas
atravs de um mecanismo mediado pela adenosina. Por conseguinte, apesar de no excluir a possibilidade de
outras vias de supresso independentes de adenosina que no se sobrepem, a populao de linfcitos B CD73
+ expandidos em ratinhos NOD deficientes em AID ou tratados com DIDS parece inibir em grande parte
respostas de clulas T diabetognicas atravs de um mecanismo que dependente de Atividade desta
ectoenzima. Deve tambm notar-se que, embora os linfcitos B com depleo de CD73 de ratinhos tratados
com DIDS pudessem suportar a capacidade de clulas T patognicas coinfundidas para transferir T1D para
receptores de NOD-scid, o fizeram com menos eficincia do que os linfcitos B totais do controlo tratado com
veculo Doadores. Isto poderia indicar que, para alm da expanso de CD73 + Bregs, o tratamento com DIDS
diminui a capacidade de outras populaes de linfcitos B em murganhos NOD para suportar a actividade das
clulas T diabetognicas. Isto poderia incluir o tratamento de DIDS suportando a expanso de Bregs de CD732
capazes de suprimir clulas T atravs de mecanismos independentes de adenosina. Se este for o caso, o
mecanismo pelo qual esses Breg de CD732 medeiam a supresso provavelmente independente da IL-10,
porque esta populao produz pouco da citocina em resposta estimulao.

Desconhece-se por que os linfcitos B CD73 + de murganhos tratados com DIDS produzem menos IL-10 induzida
por LPS do que os dos controlos.A secreo de IL-10 tem sido reconhecida como um meio principal de supresso
imune mediada por Breg (51). No entanto, tambm h relatos de Bregs capazes de suprimir o lpus eritematoso
sistmico eo desenvolvimento experimental de encefalomielite auto-imune atravs de mecanismos
independentes da IL-52 (52). A produo de IL-10 pelos linfcitos B requer estimulao forte, enquanto a
gerao de adenosina pelos linfcitos B CD73 + constitutiva, desde que seu substrato esteja presente (46). A
capacidade dos linfcitos B de murganhos NOD tratados com DIDS para inibir as respostas de clulas T
diabetognicas (Fig. 10A, 10B), apesar da produo reduzida de IL-10 (Fig. 10C), suporta a concluso de que tais
efeitos protectores da doena so em grande parte O resultado da produo de adenosina mediada por CD73.
Esta observao consistente com um relatrio sugerindo que a produo de adenosina mediada por Breg
pode desempenhar um papel mais importante na imunossupresso do que a secreo de IL-10 (46).
Adicionalmente, deve notar-se que os linfcitos B IL-102/2 tm expresso CD73 reduzida, sugerindo que esta
citoquina provavelmente regula directamente a expresso de CD73 pelos linfcitos B (46). Por conseguinte, o
tratamento com DIDS de ratinhos feitos geneticamente deficientes na expresso de IL-10 ou tratados com um
Ab bloqueando esta citocina no discriminaria as contribuies reguladoras da produo de adenosina mediada
por CD73 e a aco directa por IL-10. A futura criao de linfcitos B CD732 / 2 NOD camundongos ir ajudar a
desacoplar as contribuies reguladoras individuais fornecidos pela gerao de adenosina e secreo de IL-10.
Este estudo centrou-se no papel do eixo AID / RAD51 nos processos de afinidade-maturao GC contribuindo
para T1D. Contudo, a via da AID demonstrou desempenhar um papel importante nos linfcitos B fora do
ambiente do GC esplnico ou dos gnglios linfticos. Por exemplo, a AID tem sido implicada na tolerncia central
dos linfcitos B em cepas de fundo C57BL / 6 e BALB / c (53). Outro estudo demonstrou um papel da AID na
tolerncia central e perifrica dos linfcitos B humanos (54). Contudo, discernir a contribuio da AID para estes
processos em ratinhos NOD complicada por defeitos especficos da estirpe na tolerncia central dos linfcitos
B (55). Portanto, o efeito do direcionamento de AID / RAD51 sobre a tolerncia central de linfcitos B em NOD
no claro e merece uma investigao adicional. Alm disso, a manipulao da AID afeta os linfcitos B
associados ao intestino e altera a microflora intestinal (56). Alteraes da microflora do intestino podem afetar
drasticamente o desenvolvimento de T1D (57). Assim, justificado examinar o impacto da interrupo do eixo
AID / RAD51 na homeostase GALT. Adicionalmente, a ruptura do eixo AID / RAD51 poderia, possivelmente,
resultar numa diminuio da capacidade para eliminar a infeco. Devido poltica institucional, no podemos
infectar ratos com micrbios no The Jackson Labo- ratory. Por conseguinte, os possveis efeitos da focalizao
do eixo AID / RAD51 na capacidade de eliminar agentes patognicos tero de ser objecto de investigao de
outros investigadores. Alm disso, devem ser investigados agentes que possam aumentar especificamente o
CD73 + Bregs sem afetar o eixo AID / RAD51. Um ensaio clnico de linfcitos pan-B mediado por rituximab
anterior no travou permanentemente a morte celular (17). Estudos em ratinhos NOD indicam que isto pode
dever-se, pelo menos em parte, regulao descendente da expresso de CD20 na superfcie celular por
isfilificao de linfcitos B (18). Isto proporciona uma explicao provvel para a razo pela qual a imunoterapia
anti-CD20 apenas protege ratinhos NOD de T1D se iniciada antes do desenvolvimento de IAA. Outros estudos
forneceram evidncias de que a expanso de Breg tem potencial para conferir efeitos inibidores de T1D fortes,
e os regimes de depleo de linfcitos pan-B podem esgotar essas populaes protetoras (58). Nossos
resultados fornecem a primeira indicao, ao nosso conhecimento, de que futuros agentes farmacuticos
clinicamente aplicveis, direcionados ao eixo AID / RAD51, poderiam converter alguns linfcitos B em um
fentipo regulador CD73 + protetor de T1D. Alm disso, uma vez que esta terapia imunomoduladora mantm
a sua eficcia, mesmo quando iniciada num estdio de desenvolvimento T1D autoanticorpo tardio tardio,
tambm representa uma melhoria significativa em relao a estratgias anteriores de interveno de doena
alvo de linfcitos B.

FIGURA 10. Os linfcitos B CD73 + em ratinhos tratados com DIDS so supressores de T1D. NOD fmeas
camundongos foram tratados semanalmente com 50 mg / kg DIDS ou veculo de 8 a 16 semanas de idade. (A)
NOD scid receptores foram infundidos com 2 3 106 clulas T esplnicas purificadas de dadores tratados com
veculo misturadas com um nmero igual de linfcitos B esplnicos purificados do veculo (Total VB), linfcitos B
esgotados CD73 de ratinhos tratados com DIDS (CD732 DB) ou linfcitos B totais de ratinhos tratados com DIDS
). Os receptores de NOD scid foram ento monitorizados para desenvolvimento de T1D durante 8 semanas. (B)
Um total de 1,0 3 105 clulas NOD T foi marcado com Cell Proliferation Dye eFluor 670 e co-cultivado durante 4
d com 1,03 105 CD73 + ou CD732 B linfcitos de pool de bovinos tratados com veculo (n = 6 repeties
biolgicas) ou DIDS (N = 6 repeties biolgicas) sob condies de estimulao consistindo em anti-CD40 solvel
(5 mg / ml) e anti-CD28 solvel (2 mg / ml) com anti-CD40 solvel (1 mg / ml) 0 (linha de base) ou AMP 10 mM
na presena ou ausncia de APCP 100 mM. Quantificao da percentagem de supresso da linha de base. (C)
Um total de 1 3 105 linfcitos B CD73 + ou CD732 purificados de camundongos NOD tratados com veculo ou
DIDS (n = 6 repeties biolgicas por grupo) foram cultivados durante 3 d com LPS a 10 mg / ml e o sobrenadante
de cultura IL -10 foram medidos por ELISA. A supresso in vitro mediada por CD73 e os dados de produo de IL-
10 apresentados so combinados a partir de duas experincias individuais. Todos os grficos de barras mostram
mdia 6 SEM. O valor de p do estudo de incidncia foi calculado utilizando a anlise de Mantel-Cox. O teste de
Wilcoxon foi realizado para ensaio de supresso. A anlise de Mann-Whitney foi realizada para a produo de
IL-10.

Em resumo, estes estudos mostram que o bloqueio gentico ou farmacolgico de processos de afinidade de
linfcitos B em ratinhos NOD conduz a desvio para um fentipo regulador de CD73 + capaz de inibir o
desenvolvimento autoimune de T1D. Por conseguinte, o direccionamento farmacolgico do RAD51 para
bloquear a actividade dos linfcitos B diabetognicos, directamente ou convertendo-os num estado
imunorregulador, pode finalmente representar uma abordagem de interveno de doena clinicamente
traduzvel. Como RAD51 um complexo multiproteico, esta rea da via AID tem outros alvos potenciais que
podem ser explorados. A identificao e uso de agentes farmacolgicos que bloqueiam potencialmente a
atividade da AID como uma nova abordagem de interveno T1D tambm devem ser explorados. Estes estudos
tambm indicam que necessria mais investigao sobre o papel da via imunorreguladora purinrgica na
patognese T1D.

Alm disso, esta via tambm poderia representar um alvo imunomodulador potencial clinicamente relevante
para o tratamento de vrias outras doenas auto-imunes, quer atravs do aumento da produo de adenosina
quer atravs da administrao de agonistas A2aR. Juntos, esses estudos iniciais revelam que o direcionamento
teraputico do eixo AID / RAD51 nos linfcitos B uma rea de pesquisa no realizada anteriormente para o
desenvolvimento da terapia T1D.

Agradecimentos
Agradecemos ao pessoal do grupo de Genome Technologies do Laboratrio Jackson, do grupo de Tecnologias
de Engenharia Gentica, do servio de Citometria de Fluxo e da Research Animal Facility, pelo apoio tcnico.
Tambm agradecemos Susanne Sattler (Imperial College, Londres, Reino Unido) para reviso crtica do
manuscrito.

Divulgaes
K.D.M. um fundador e accionista em Cyteir Therapeutics, Inc. K.D.M., M.G.H., e C.M.L. Contm a Patente dos
Estados Unidos No. US20130184342 A1: "Mtodos e composies para tratamento de cancro e doena
autoimune". Os outros autores no tm conflitos de interesses financeiros.