En biologa molecular, un gen reportero (llamado a menudo slo como reportero) es un gen

que los investigadores vinculan a una secuencia regulatoria de otro gen de inters en
bacterias, cultivos celulares, animales o plantas. Ciertos genes son elegidos como reporteros
porque las caractersticas otorgadas por el gen en la expresin de los organismos los hacen
fciles de identificar y medir, o porque son marcadores seleccionables. Los genes reporteros
son usualmente usados para indicar si un determinado gen ha sido tomado o expresado en la
clula o una poblacin de organismos.

Genes reporteros comunes

Para introducir un gen reportero dentro de un organismo, los cientficos colocan el gen
reportero y el gen de inters en la misma construccin de ADN (creada artificialmente) para
ser insertado dentro de la clula o el organismo. Para clulas procariotas o bacterias en
cultivo, esto es usualmente en forma de una molcula de ADN circular llamada plsmido. Esta
es importante como gen reportero que no es nativamente expresado en la clula u organismo
bajo el estudio.

Comnmente son usados genes reporteros que provocan caractersticas visualmente

identificables que implican protenas luminescentes y fluorescentes.Algunos ejemplos incluyen
un gen que codifica para la protena verde fluorescente de medusa (GFP, green fluorescent
protein), la cual provoca que en las clulas que la expresan resplandezcan con color verde
bajo una luz azul, la enzima luciferasa, la cual cataliza una reaccin con la luciferina para
producir luz, y la protena fluorescente roja de el gen dsRed.

Un reportero comn en bacterias es el gen E. coli lacZ, el cual codifica para la protena beta-
galactosidasa.

Usos[editar]
Clonacin[editar]
En experimentos de clonacin gnica, este compuesto es usado como indicador de
aquellas clulas que expresan la enzima -galactosidasa, codificada en el gen lacZ del opern
lac.
X-gal es hidrolizado por la -galactosidasa a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol. Este
ltimo es oxidado a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-ndigo, un compuesto azul insoluble. De este
modo, si X-gal y un inductor de la -galactosidasa (normalmente IPTG) son disueltos en el
medio de agar de una placa de cultivo, las colonias crecidas en la placa que posean un
gen lacZ funcional podrn ser claramente distinguidas por su coloracin azul. Adems de su
color caracterstico, la volatilizacin del grupo indol produce un mal olor caracterstico.
Cuando el clonaje de un gen en un vector plasmdico se est realizando en un laboratorio, X-
gal es usado de esta manera para visualizar las colonias de bacterias transformadas que no
han captado el vector con el gen. Habitualmente se utilizan para este fin clulas de la
bacteria E. coli, que no pueden producir la enzima -galactosidasa. Una vez transformadas,
las bacterias que portan el plsmido con el gen recombinante no son capaces de producir la
enzima -galactosidasa debido a que la regin que sintetiza a la enzima se parte para dar
paso a la secuencia recombinante. Las bacterias que tengan el plsmido pero ste no tengan
la secuencia recombinante pueden romper el X-gal presente en el agar del medio, tornndose
sus colonias de color azul. Las bacterias que han sido transformadas, no pueden procesar X-
gal y permanecen con su coloracin blanca natural.
El vector plasmdico que porta el opern lac, se puede disear de modo que la secuencia del
gen de inters a clonar se coloque especficamente en el marco de lectura del gen lacZ. Al
insertar la secuencia de esta manera, se interrumpe el gen lacZ y el opern se vuelve incapaz
de sintetizar la enzima -galactosidasa funcional. De este modo, las bacterias que porten el
plsmido sin la secuencia recombinante insertada, producirn -galactosidasa activa y sern
de color azul, mientras que las que no porten el plsmido o aquellas que lleven el vector
recombinante, sern blancas. De las blancas, las primeras, las no transformantes, se eliminan
aadiendo un antibitico al medio (ampicilina, kanamicina, etc.) para el cual el plsmido
aporta resistencia, de modo que podemos seleccionar las colonias recombinantes que portan
el vector con nuestra secuencia, sencillamente por su color.
Muchos vectores de clonacin comerciales como los pGem-T, portan el gen lacZ, una forma
truncada de la -galactosidasa. Estos vectores requieren formas especficas de E. coli como
transformantes (tales como la cepa DH5) para expresar una forma funcional de -
galactosidasa por un mecanismo denominado complementacin .
La Luciferasa se usa principalmente como un gen reportero en estudios sobre la regulacin de
la transcripcin. El gen de inters, de un promotor, enhancer o silenciador, se inserta upstream
del gen de luciferasa de lucernago modificado (luc) en un plsmido. El plsmido recombinante
se transfecta a un vector de expresin en un sustrato que contiene Mg2+ y ATP. La cantidad
de luz producido depende de la expresin del elemento upstream o promotor de inters.
Luciferasa de renilla sirve como control cuando est ligado en otro vector y bajo el control de
un promotor constitutivo en la misma clula. Segn las distintas especies de animales la
composicin qumica de la luciferasa y de la luciferina vara, lo que produce colores distintos.

RT PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR,

del ingls Reverse transcription polymerase chain reaction), tambin reaccin en cadena de
la polimerasa con transcriptasa reversa, es una variante de la PCR,
una tcnica de laboratorio comnmente usada en biologa molecular para generar una gran
cantidad de copias de ADN, proceso llamado "amplificacin". En la RT-PCR, se retrotranscribe
una hebra de ARN en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa
inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante una PCR tradicional. El
trmino PCR en transcripcin reversa no debe confundirse con la PCR en tiempo real,
tambin denominada PCR cuantitativa (Q-PCR), que en ocasiones, por una mala traduccin
del ingls, se abrevia de la misma manera (RT-PCR, por Real Time-PCR).

La amplificacin exponencial mediante PCR en transcripcin reversa supone una tcnica

altamente sensible, que puede detectar un nmero de copias de ARN muy bajo.

Los principales usos de la RT-PCR estn relacionados con el campo del diagnstico
molecular y con la investigacin cientfica. Puede utilizarse como mtodo de deteccin
molecular de genes, para estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (por
ejemplo, el VIH) o el virus de la gripe (el virus de la influenza)).
Otro de sus usos se relaciona con la cuantificacin de la expresin gnica, mediante la
combinacin de esta tcnica con el anlisis de Northern blot.

Una de las caractersticas ms importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc

generado ya no lleva los intrones que s tendra el ADN original. De este modo, al expresar el
ADNc producto de la RT-PCR, se generar un ARNm formado exclusivamente por exones.
Esto ha permitido darle a esta tcnica uno de sus usos ms importantes: insertar
genes eucariota en organismos procariota.[cita requerida]

Anlisis en serie de la expresin gnica

El Anlisis en Serie de la Expresin Gnica (o SAGE, Serial Analysis of Gene Expression)
es una tcnica de la Biologa Molecular que permite conocer y cuantificar la expresin de
los genes en la clula, mediante la medicin de los ARNm que estn presentes en esta en un
momento determinado. Esto permite crear perfiles de expresin de cada clula en
determinadas situaciones, ya sea en circunstancias normales de la clula o en momentos en
que se ve afectada por alguna enfermedad. De esta manera se pueden comparar estos
perfiles y determinar que genes estn siendo apagados o activados, y as determinar cual
puede ser la causa de esto.

La base de la tcnica est en el uso de "tags" de ADNc que son pequeos fragmentos de
ARNm que han sido transformadas a ADNc. En la tcnica original, pequeas secuencias de 8
a 14 pb son extradas de cada ADNc (transcrito) para ser sequenciadas. En SuperSAGE, su
ms avanzada versin se obtienen "tags" de 26 pb, mucho ms precisos y verstiles. Estos
"tags" representan a un ARNm presente en la clula en un momento determinado. De esta
manera se puede realizar una secuenciacin de estas pequeas hebras, diferenciando a un
ARNm de otro, utilizando las bases de datos de secuencias de ARNm, y de esta manera se
puede saber la cantidad de ARNm (expresin) que hay y a qu protena codifica,
identificndose su importancia. De esta manera se permite un anlisis rpido de la expresin,
conservndose un alto nivel de precisin.
La tcnica fue desarrollada por el Dr. Victor Velculescu del Centro de Oncologa de la Johns
Hopkins University, y se present el 20 de octubre de 1995 en la revista Science. SuperSAGE,
su ms avanzada versin, ha sido desarrollada por Hideo Matsumura et al. en el 2003 en la
revista PNAS.

Otras variantes de la tcnica, como el LongSAGE o el MicroSAGE, aunque stas slo

presentan pequeas variaciones al SAGE tradicional en donde el tamano del "tag" es todava
pequeo: SAGE 14 pb y LongSAGE 18 pb. SuperSAGE, con "tags" de 26 pb, permite ptima
anotacin, y anlisis de nuevos transcriptos en conjuncin con tcnicas como extensin hacia
los extremos (3'-y 5'-RACE).

Procedimiento[editar]
La tcnica bsicamente se desarrolla de la siguiente manera:

1. Se extrae todo el ARNm de una muestra, mediante cualquier mtodo de purificacin.

2. Aprovechando la caracterstica del ARNm de tener una cola de Adeninas en el extremo 3'
(poli A), se utiliza un soporte con colas de Timina para provocar la unin de los ARNm al
soporte. Estas Timinas cumplen la funcin de Partidores o Primers para poder sintetizar ADNc
a partir de los ARNm por medio de una Transcriptasa inversa. Esto tiene como ventaja la
mayor estabilidad del ADNc frente al ARNm.

3. Se corta el ADNc a una distancia determinada a partir del soporte de timinas por medio de
una enzima de restriccin, dejando extremos cohesivos en el sitio de corte.

4. En este extremo adhesivo se une una molcula llamada "linker", la cual posee una enzima
de restriccin tipo II que corta nuevamente el ADNc, esta vez dejando un extremo romo. Aqu
se obtiene por primera vez un "tag" de ADNc (ARNm), unido a las secuencias que han
permitido las hibridaciones.

5. Se unen dos "tags" para formar un "ditag", es decir, dos tags junto a dos molculas "linkers"
distintas (linker A y linker B). Posteriormente, se procede a amplificar por PCR (Reaccin en
cadena de la polimerasa) para obtener una mayor cantidad de ditags y favorecer la
secuenciacin.

6. Los ditags se cortan con la primera enzima de restriccin para eliminar los "linkers" y dejar a
los ditags puros y con un extremo adhesivo, permitiendo la unin de estos en una gran hebra
de ADNc (ditags) o concatenado de ADNc. ste concatenado se pasa luego a un vector de
clonamiento para obtener mltiples copias de ste.

7. Por ltimo, se procede a secuenciar este concatenado de ditags, identificando cuntos tags
hay en total de cada ARNm, y se procede a identificar qu protena codifican, mediante el uso
de alguna base de datos. Este es el paso ms largo de todos, y dependiendo de la cantidad
de ARNm que se est analizando puede durar desde semanas hasta incluso meses.
Chip de ADN
Un chip de ADN (del ingls DNA microarray) es una superficie slida a la cual se une una
coleccin de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy
variables y pueden ser de vidrio, plstico e incluso de silicona. Los chips de ADN se usan para
analizar la expresin diferencial de genes, y se monitorean de manera simultnea los niveles
de miles de ellos. Su funcionamiento consiste, bsicamente, en medir el nivel
de hibridacin entre la sonda especfica (probe, en ingls), y la molcula diana (target), y se
indican generalmente mediante fluorescencia y a travs de un anlisis de imagen, lo cual
indica el nivel de expresin del gen.

Suelen utilizarse para identificar genes con una expresin diferencial en condiciones distintas.
Por ejemplo, para detectar genes que producen ciertas enfermedades mediante la
comparacin de los niveles de expresin entre clulas sanas y clulas que estn
desarrollando ciertos tipos de enfermedades.

Antecedentes histricos[editar]
La tecnologa del chip de ADN tiene su origen en una tcnica muy usada en biologa
molecular, el Southern blot. En la era pregenmica la biologa estudiaba los genes
individualmente, uno a uno, por lo que los poda estudiar a fondo. Lo que caracteriza la era
postgenmica no es lo que se puede medir sino la cantidad de mediciones simultneas que se
pueden realizar. Para cumplir este objetivo y poder estudiar muchos genes a la vez fue
necesario un cambio de paradigma: con los mismos recursos, obtener una imagen de menor
resolucin pero con una perspectiva ms general.

Fabricacin[editar]
Los chips de ADN se fabrican usando una gran variedad de tecnologas. El gran desarrollo de
esta tcnica ha llegado al normalizarse el uso de robots que se encargan de la mayor parte
del proceso de manipulacin de los chips (sintetizar el ADN molde que se une al chip, unirlo,
aadir los reactivos necesarios, etctera).

Los chips de ADN se pueden usar para detectar ARN, que puede traducirse o no en protenas.
Los cientficos se refieren a esta clase de anlisis como anlisis de expresin o anlisis del
transcriptoma, y tiene por objeto establecer un patrn o perfil de los genes transcritos
presentes en un tipo de clulas determinado.1 Se suele retrotranscribir el ARN a ADN para
estos casos, de manera que lo que se utiliza como muestra es ADNc.

El uso de chips de ADN para estudiar la expresin de diversos genes se public en 1995, 2 en
la prestigiosa revista cientfica Science, y el primer organismo eucariota con todo el genoma
(Saccharomyces cerevisiae) dispuesto en un chip de ADN se public en 19973 en la misma
revista.
Tipos[editar]

Microarrays de dos canales[editar]

Diagrama de una experimento tpico de chip de ADN con doble canal

En este tipo de chips de ADN (en ingls spotted microarrays), las sondas
son oligonucletidos, ADN complementario (ADNc) o pequeos fragmentos de reaccin en
cadena de la polimerasa, que corresponden con ARN mensajero (ARNm). En este tipo de chip
de ADN se utilizan preparaciones de ADNc obtenido a partir de dos muestras biolgicas
distintas; por ejemplo, de clulas cultivadas en dos distintas condiciones. El ADNc de cada
muestra se marca con un fluorforo diferente, y las dos preparaciones de ADNc marcadas se
mezclan e hibridan sobre el mismo chip de ADN. Una vez realizado este primer paso, se
procede al escaneo del resultado y a la visualizacin del mismo. De esta forma se pueden
detectar genes que se activan o se reprimen en distintas condiciones. La contrapartida de
estos experimentos es que no se pueden observar niveles absolutos en la expresin y
requieren qPCR para un anlisis cuantitativo absoluto.

Chips de oligonucletidos de ADN[editar]

En los chips de oligonucletidos de ADN o micromatrices de canal nico, las sondas se

disean a partir de una secuencia conocida o un ARNm predicho. Estos chips de ADNs dan
estimaciones del nivel de expresin, pero en una misma matriz no pueden observarse
distintas condiciones, por lo que por cada condicin se debe utilizar un chip.

Idea principal: las sondas se sintetizan in situ (en el chip).

No estn basadas en la hibridacin competitiva. Esto quiere decir: un chip, una muestra. Las
secuencias se construyen en la superficie del chip mediante el elongamiento secuencial de
una cadena en crecimiento con un solo nucletido utilizando fotolitografa.

GeneChips de Affymetrix[editar]

Affymetrix es la compaa lder en este tipo de chips.

Se denominan genricamente "GeneChips".

Cada gen representado por un conjunto de secuencias cortas que lo caracterizan.

Algunos chips: genomas completos con ms de 50.000 grupos de sondas.

Chips de ADN para genotipado[editar]

Los chips de ADN pueden utilizarse para "leer" las secuencias de un genoma particular en
determinadas posiciones. Los SNP arrays son un tipo particular de matrices que se utilizan
para identificar variaciones individuales y a travs de poblaciones. Los oligonucletidos
pequeos son capaces de identificar polimorfismos de un slo nucletido (en
ingls SNPs, single nucleotide polymorphisms) que podran ser los responsables de
variaciones genticas dentro de una poblacin, la fuente de susceptibilidad a distintas
enfermedades genticas e incluso a ciertos tipos de cncer. En general, la aplicacin de estas
tcnicas de genotipado es forense, ya que son rpidas en descubrir o medir la predisposicin
de enfermedades o incluso permitir el uso de ciertos medicamentos para tratar ciertas
enfermedades segn sea el ADN del enfermo o donante. Los chips de ADN de SNPs tambin
se utilizan para la identificacin de mutaciones somticas en cncer, sobre todo la prdida
de heterocigosis, la amplificacin o la delecin de regiones de ADN en el genoma individual de
pacientes afectados, es decir, la deteccin de aberraciones cromosmicas.

Aplicaciones[editar]
Los chips de ADN se han aplicado al estudio de casi cualquier tipo de problema biolgico. El
nmero de publicaciones anuales es muy alto y contina creciendo. Algunas de sus
aplicaciones ms frecuentes son:

Estudio de genes, que se expresan diferencialmente en condiciones diversas

(sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados).

Clasificacin molecular en enfermedades complejas. Identificacin de genes

caractersticos de una patologa (firma o signature).

Prediccin de respuesta a un tratamiento.

Deteccin de mutaciones y polimorfismos de un nico gen (SNP).