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Metodologie Chimiche e Biochimiche

c.i. Biochimica Generale


A.A. 2013-2014

elisabetta.chiaradia@unipg.it 075 585 771


Biochimica e biologia molecolare Metodologie biochimiche
Principi e tecniche - Nuova edizione Italiana Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo
Wilson, K. , Walker, J., Raffaello Cortina Casa Editrice Ambrosiana. Distrib.Zanichelli
Editore

R. Reed, D.Holmes, J. Weyers, A.Jones A J Ninfa, . P Ballou


Metodologie di base per le scienze Metodologie di base per la biochimica
biomolecolari e la biotecnologia
ESAME Metodologie chimiche e biochimiche
Propedeuticit: Chimica generale e organica

Scritto - domanda aperta su argomenti del programma


>18/30 Piena sufficienza lesame si ritiene superato -possibili domande per
chiarimenti su errori o inesattezze dellelaborato

16/30<voto<17/30 nei casi di esito non completamente sufficiente, per la


Colloquio integrativo definizione del voto finale, qualora lesame di
Propedeutica e biochimica generale sia stato superato
15 Insufficiente

A SCELTA DELLO STUDENTE (al momento dellappello)

ORALE
18/30 < voto < 30/30 SUPERATO

N.B solo per la sessione di febbraio, se si ottiene un voto > 18/30 in uno dei 3 appelli
previsti, lesame si ritiene superato per lintera sessione anche se Propedeutica
Biochimica e Biochimica generale verr sostenuto negli appelli successivi della
stessa sessione ENTRO FEBBRAIO VA VERBALIZZATO
ESAME

CHIMICA generale e organica


Propedeutica Biochimica e Biochimica generale

Metodologie chimiche e biochimiche

BIOCHIMICA GENERALE
(Voto unico )
verbalizzazione
Tutto ci che oggi sappiamo e studierete deriva da
osservazioni e da esperimenti di ricercatori che ci
hanno preceduto
Fasi di un progetto di ricerca

Scegliere largomento della ricerca dopo opportuna ricerca


bibliografica
Formulare unipotesi su cui investigare
Disporre della metodologia e delle attrezzature e di fondi per
svolgere lattivit sperimentale
Progettare un esperimento e far si che i risultati siano
riproducibili, accurati e precisi
Stesura del protocollo sperimentale
Eseguire lEsperimento
Analisi dei risultati ottenuti in modo da validare o negare lipotesi
di partenza
Interpretazione dei risultati
Comunicazione e divulgazione dei Risultati (Congressi, riviste
nazionali e internazionali)
Approccio sperimentale

Analitico classico
Il sistema viene scomposto nelle analisi delle propriet
sue componenti elementari linterazione tra le componenti

Olistico

Il sistema viene analizzato OMICS


Genomica,Proteomica,
nella sua totalit Trascrittomica
Metabolomica.
Comprendere e spiegare i principi che
regolano i processi vitali mediante lo
studio strutturale e funzionale delle
MOLECOLE

Le macromolecole sono simili tra loro


Le vie metaboliche sono comuni
Le cellule sono diversificate
Le specie sono innumerevoli

Dna-Rna-Proteine-Lipidi-Glucidi
peculiarit funzionali diversificate
..cosa studieremo.
le principali tecniche utilizzate per la
separazione, lidentificazione, la caratterizzazione
e la valutazione quantitativa delle biomolecole.

Analisi cliniche
Analisi batteriologiche Fisiologia, alimentazione,
Analisi sierologiche microbiologia. Ispezione degli
Analisi degli alimenti alimenti etc
METODICHE utilizzate in Chimica e Biochimica

Isolare e
recuperare la Identificare e
maggior quantit quantificare
possibile del piccole quantit
composto con un del composto
elevato grado di
purezza
Campione biologico matrice di partenza

Analisi da effettuare
Metodiche ANALITICHE

QUALITATIVE QUANTITATIVE

Identificazione di un Determinazione
analita o dei componenti della concentrazione
di una miscela delle molecole in
campioni biologici
TECNICHE PREPARATIVE TECNICHE ANALITICHE

PRECIPITAZIONE SPETTROSCOPIA
FRAZIONATA
DIALISI
CENTRIFUGAZIONE
ESTRAZIONE
DISTILLAZIONE

CROMATOGRAFIA

ELETTROFORESI

Tec. ENZIMATICHE
Soluzioni
Preparare una soluzione- I step di qualsiasi
metodolodologie biochimica

Concentrazione Osmolarit

pH Forza ionica
Soluzione Liquide

Ottenute solubilizzando in un liquido,


gas, solidi o altri liquidi.
Solvente Soluto
Componente maggioritario Componente minoritario si
Si trova nello stato di trova in uno stato di
aggregazione della soluzione aggregazione diverso da quello
della soluzione

Soluto B
Soluto A

SOLVENTE
Valore Simbolo Nome
10-1 l dl decilitro
Valore Simbolo Nome
10-2 l cl centilitro
10-1 g dg decigrammo
10-3 l ml millilitro
10-2 g cg centigrammo
10-6 l l microlitro
10-3 g mg milligrammo
10-9 l nl nanolitro
10-6 g g microgrammo
10-12 l pl picolitro
10-9 g ng nanogrammo
10-15 l fl femtolitro
10-12 g pg picogrammo
10-18 l al attolitro
10-15 g fg femtogrammo
10-18 g ag attogrammo
Concentrazione Composizione quantitativa di
gr una soluzione
n moli n = ------
PM n
Molalit: m = ------
Q
n Q = kg di solvente
Molarit: M = ------
V
V = L di soluzione
msoluto
ppm = ------- 106
ni mtot
Frazione molare: Xi = --------
ntot Parti di soluto per un
milione di parti di soluzione

Composizione percentuale
% p/p gr di soluto/100 grammi di soluzione
% p/v gr di soluto/100 ml di soluzione
% v/v volume di soluto/100 ml di soluzione
Concentrazione Composizione quantitativa di
una soluzione

gr
n moli n = ------
PM

Molarit:

n
M = ------
V
V = L di soluzione
Concentrazione Composizione quantitativa di
una soluzione

gr
n moli n = ------
PM

Molalit:

n
m = ------
Q
Q = kg di solvente
Concentrazione Composizione quantitativa di
una soluzione

gr
n = ------
n moli
PM

Frazione molare:

ni
Xi = --------
ntot
Concentrazione Composizione quantitativa di
una soluzione

Composizione percentuale
% p/p
gr di soluto/100 grammi di soluzione
% p/v
gr di soluto/100 ml di soluzione
% v/v
volume di soluto/100 ml di soluzione
Concentrazione Composizione quantitativa di
gr una soluzione
n moli n = ------
PM n
Molalit: m = ------
Q
n Q = kg di solvente
Molarit: M = ------
V
V = L di soluzione
msoluto
ppm = ------- 106
ni mtot
Frazione molare: Xi = --------
ntot Parti di soluto per un
milione di parti di soluzione

Composizione percentuale
% p/p gr di soluto/100 grammi di soluzione
% p/v gr di soluto/100 ml di soluzione
% v/v volume di soluto/100 ml di soluzione
Il passaggio di una specie in soluzione consiste nella
formazione di legami deboli tra le molecole del soluto e
quelle del solvente

Deve essere possibile riottenere con


solo mezzi fisici i componenti inalterati

Pu essere influenzato dalla temperatura

Legami deboli??????
Miscibilit
Il solvente ed il soluto devono essere
miscibili tra loro

Le particelle di solvente e di soluto devono


essere strutturalmente e chimicamente simili

simile scioglie simile


Soluti polari o ionici in solventi polari
Soluti apolari in solventi apolari
Lacqua un ottimo solvente per i
soluti polari
104
H H
+ +

in grado di formare :
legami idrogeno con solidi
molecolari
Interazioni ioni dipolo con i
solidi ionici
H2O Cristallo ionico

guscio di
+ solvatazione
Cl-
Cl- Na+ Cl- Na+ Na+
Cl-
Na+ Cl- Na+ Cl-

Na+ Na+ Cl- Na+ Cl-


idratazione
Na+ Cl- Na+ Cl- Na+
-
Esano - CH3CH2CH2CH2CH2CH3
CH3(CH2)4CH3
H
C

H2O
H2O

H
+ Alcool etilico -
C O CH3CH2OH- etanolo
-

H
+
C O
-
Solubilit
Quantit di soluto che pu essere sciolta in 100 gr di
solvente ad una determinata temperatura

I componenti della soluzione si disperdono luno


nellaltro in proporzioni variabili

Soluzione concentrate Soluzioni diluite


Soluzione Satura
La quantit di soluto pari a quella prevista dalla sua
solubilit - la massima quantit di soluto che il solvente
in grado di sciogliere a quella temperatura

Corpo di fondo

Corpo di fondo
Preparare una soluzione
200 ml di soluzione 1 M di NaCl

gr necessari? (PM NaCl = 58.4)

n
M = ------ gr/58.4
V 1 = ----------- = 11.64 gr
0.2

Pesare 11.64 grammi di cloruro di sodio

Aggiungere una H2O in quantit inferiore al


volume finale desiderato
Discliogliere

Aggiungere altro solvente fino ad ottenere 200 ml


Pesare il Sceglie la bilancia da utilizzare il base alla
soluto quantit desiderata

bilancia tecnica

B
bilancia analitica
beuta

Ancoretta
magnetica

becker
Agitatore magnetico
Misurare il volume raggiunto dopo il passaggio in soluzione del
soluto e aggiungere altro solvente fino ad ottenere il volume
desiderato
In laboratorio le soluzioni da
usare si possono preparare
diluendo soluzioni
madri

M= n/V
preparare 500 mL di una soluzione 0.5M di NaCl
partendo da una soluzione madre di NaCl 2.5M

Ci * Vi = Cf * Vf
2.5 * X = 0.5 * 500 M= n/V
X=100 mL n=MV

Oppure

Ci/Cf= fattore di diluizione(FD)


Vf / FD =Vi

2.5/0.5 = 5
500/5= 100mL
Molarit = Concentrazione
Propriet propriet delle soluzioni che
dipendono dalla concentrazione
colligative del soluto non dalla sua natura.

Abbassamento della pressione di vapore

Innalzamento ebullioscopico
keb kcr
Teb = keb Ci
Benzene 2,53 4,9
Etere dietilico 2,02 1,8
Alcool etilico 1,22 1,9
Abbassamento crioscopico Acqua 0,512 1,86

Tcr = - kcr Ci

Pressione osmotica p=CRT


Propriet colligative

soluzioni di elettroliti

Bisogna considerare la concentrazione totale di


tutti gli ioni piuttosto che della concentrazione
dellelettrolita.

labbassamento criscopico di una soluzione di NaCl 0,1 M


(circa) il doppio di quello di una soluzione di glucosio 0,1 M.

NaCl si dissocia in ioni Na+ e Cl-, cio in due


particelle che contribuiscono entrambe a tale
propriet colligativa.
In generale per le principali propriet colligative si pu scrivere:

Tb= i Kb m
Tf= i Kf m
p = i M R T

in cui i il numero di ioni provenienti da ogni unit formula.

NaCl Na+ + Cl- i=2

K2SO4 2K+ + SO42- i=3

Fe2(SO4)3 2Fe3+ + 3SO42- i=5

Le propriet colligative sono rigorosamente vero solo per


soluzioni molto diluite.
GLI ELETTROLITI SONO QUEI COMPOSTI CHE IN
SOLUZIONE SI DISSOCIANO PARZIALMENTE O
COMPLETAMENTE IN CATIONI ED ANIONI
ionizzazione

Elettroliti forti Elettroliti deboli


(NaCl) (amminoacidi, proteine, acidi
nucleici...)
Il grado di ionizzazione delle
macromolecole (proteine, acidi nucleici...)
dipende dai gruppi funzionali ionizzabili e
la loro funzione dipende dal grado di
ionizzazione ad un determinato pH
Pressione osmotica

Pressione osmotica
pressione che occorre
A B
esercitare su A per
bloccare il flusso osmotico
soluzione solvente puro

Legge di vant Hoff

pV = n RT p = RTC
n RT (C= molarit)
p= V
Soluzioni ipotonica
Soluzioni isotonica
Soluzioni ipertonica
Legge di vant Hoff
pV = n RT p = RTC
(C= molarit)
Pressione osmotica- La pressione che occorre applicare alla soluzione per bloccare
il passaggio del solvente
Pressione osmotica
membrana semipermeabile
(fa passare solo il solvente)
Pressione osmotica

A B

soluzione solvente puro


flusso di solvente
(osmosi)

Pressione osmotica
pressione che occorre esercitare sulla
sol A per bloccare il flusso osmotico
soluzioni colloidali micellari

formate da aggregati di
molecole (saponi)
aggregati di molecole (micelle)
esiste una netta separazione tra
una parte liofila e una parte
liofoba
possono essere cationiche,
anioniche, zwitterioniche o neutre
Soluzioni Colloidali
fase dispersa solido in uno stato di
suddivisione pi o meno spinto
fase disperdente componete maggioritario
Le particelle della fase dispersa
macromolecole dimensione compresa
aggregati di molecole tra 1 (5-10) m (10-6 m)
particelle colloidali e 1 nm (10-9 m)

> 1 m = sospensione

< 1 nm = soluzioni
soluzioni colloidali micellari

formate da aggregati di
molecole (saponi)
aggregati di molecole (micelle)
esiste una netta separazione tra
una parte liofila e una parte
liofoba
possono essere cationiche,
anioniche, zwitterioniche o neutre
la stabilit soluzioni colloidali
micellari dovuta a due fattori

la carica elettrica della micella


l'idratazione dei suoi gruppi polari o ionici.

..che impediscono il contatto diretto tra micelle evitando l


aggregazione e quindi flocculazione le micelle rimangono
stabilmente disperse in nel mezzo.
Concentrazione Critica Micellare
(c.m.c., critical micellar concentration).

Le micelle sono in equilibrio termodinamico con i monomeri

La formazione delle micelle si verifica in un


campo di concentrazioni piuttosto ristretto

c< cmc c< cmc


i singoli monomeri galleggiano Aumenta il numero di
allinterfaccia aria fase aggregati
disperdente
Soluzioni neutre [H3O+] = [OH-] pH = 7

Soluzioni acide [H3O+] > [OH-]


pH < 7

Soluzioni basiche [H3O+] < [OH-]


pH > 7
Succhi Gastrici pH = 1.0 - 3.0
Succo di Limone pH = 2.2 - 2.4
Aceto pH = 2.4 - 3.4
Urina pH = 4.8 - 7.0
Latte pH = 6.4 - 7.0
Saliva Umana pH = 7.0 - 7.3
Sangue Umano pH = 7.3 - 7.5
Uova Fresche pH = 7.6 - 8.0
Acqua di Mare pH = 7.8 - 8.3
Bicarbonato di Sodio (soluzione) pH = 8.4
Carbonato di calcio (soluzione) pH = 9.4
Detergenti con Ammoniaca pH = 10.5
11.9
Brsted e Lowry
Non possibile distinguere in modo assoluto le
sostanze in acide e in basiche

acido1 + base2 base1 + acido2

Un acido tanto pi forte quanto pi forte la base a cui


cede il protone
Una base tanto pi forte quanto pi forte lacido a cui
sottrae il protone
La forza degli acidi e delle basi va confrontata rispetto
ad una stessa sostanza di riferimento
trasferiscono un protone allacqua, che lo
Acido debole accetta, dando luogo ad un equilibrio

AH + H2O A- + H3O+
[A-]eq [H3O+]eq
Ka =
[AH]eq [H2O]eq

strappano un protone allacqua, che lo


Base debole cede, dando luogo ad un equilibrio

B + H2O BH + OH-
[BH]eq [OH-]eq
Kb =
[B]eq [H2O]eq
Acido forte pH = - log [H3O+]
AH + H2O A- + H3O+
pH = - log [AH]

Base forte

B + H 2O BH + OH- pOH = - log [OH-]


pOH = - log [B]
Kw= [H3O+]eq [OH-]eq = 1,0 10-14 M (25C)

[H3O+]eq = [OH-]eq = 1,0 10-7 M


pH = - log [H3O+]eq = - log 1,0 10-7 = 7

Soluzioni neutre [H3O+]eq = [OH-]eq

Soluzioni acide [H3O+]eq > [OH-]eq

Soluzioni basiche [H3O+]eq < [OH-]eq

Soluzioni neutre pH=7 Soluzioni acide pH <7 Soluzioni basiche pH >7


La conoscenza del pKa dellindicatore consente di avere un
riferimento sullintervallo di pH in cui avviene il
cambiamento di colore (viraggio) e di conseguenza una
stima approssimativa del pH della soluzione

Uno degli indicatori pi noti il tornasole, rosso a pH acido


e blu a pH basico

Limpiego di stick impregnati con vari indicatori che hanno


pKa differenti consente una stima abbastanza accurata del
valore del pH della soluzione in cui essi sono immersi
Indicatori di pH

Alcuni acidi e basi deboli di natura organica hanno la propriet di avere un colore diverso
quando sono in forma dissociata rispetto a quando sono in forma indissociata.
Indicatori Acido-Base
sostanze colorate
in genere acidi deboli di natura organica
caratterizzate dallavere due diverse colorazioni
una propria della forma molecolare indissociata
(HIn)
laltra propria della forma ionizzata (In-)

HIn + H2O In- + H3O+


colore della forma colore della forma [In-] [H3O+]
molecolare ionizzata KHIn=
HIn
Indicatori Acido-Base
HIn + H2O In- + H3O+ [In-] [H3O+]
colore della forma
KHIn=
colore della forma
ionizzata HIn
molecolare

Laggiunta di una piccola quantit di indicatore ad una


soluzione

HIn + H2O In- + H3O+

Lequilibrio sar pi o meno spostato verso destra


a seconda dellacidit della soluzione
Laggiunta di una piccola quantit di indicatore ad una soluzione

Lequilibrio sar pi o meno spostato verso


HIn + H2O In- + H3O+
destra a seconda dellacidit della soluzione

[In-]
[H3O+] = Ki [HIn] pH = p Ki + log
[In-] [HIn]

[HIn]
=1 pH=pK punto di viraggio
[In-]

La soluzione assume colore intermedio tra quello In- e


Hin

[HIn] [HIn] < 1/10


>10
[In-] [In-]
[H 3O ] [HA] giallo

Ka
[A ] rosso
Quando [H3O+] >> Ka la soluzione appare gialla

Quando [H3O+] << Ka la soluzione appare rossa

Quando [H3O+] Ka la soluzione appare arancione

pKa = - log10 Ka

pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Esempi:
pKa
fenolftaleina

pKa
blu di
bromotimolo
pKa
metil arancio

pKa
rosso fenolo

pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Metilarancio

Blu di bromotimolo

Fenolftaleina
Misura la f. e. m. di una cella ad alta resistenza formata da
due elettrodi ad idrogeno, uno di riferimento immerso in una
soluzione a pH noto , mentre laltro , elettrodo di misura
immerso in una soluzione di cui si vuole determinare il pH

Elettrodo di riferimento
immerso in una soluzione
a pH noto

Elettrodo di misura
immerso in una soluzione di
cui si vuole determinare il pH
Ecella(f.e.m.)= Er -E m
Il cuore del sistema un
elettrodo il cui potenziale
dipende dal pH

Lo strumento traduce la differenza di potenziale


in un valore di pH
Elettrodo di riferimento Elettrodo di misura
immerso in una soluzione a pH noto immerso in una soluzione di cui si
vuole determinare il pH

Tra le superfici della sottile membrana di vetro si crea una differenza


di potenziale
che funzione della differenza di pH esistente fra la
soluzione interna (a pH noto) e quella esterna (a pH
incognito).

soluzione tampone (cio a pH noto) nella


quale posto un filo di platino necessario
per il collegamento elettrico

I due elettrodi sono collegati al pHmetro,


nel quale un'apposita amplificazione della
differenza di potenziale viene evidenzia
tramite segnale analogico e misurata in mV.
Ecella(f.e.m.)= Er -E m
1) Un elettrodo indicatore di misura
2) Un elettrodo di riferimento
3) Un registratore e misuratore di potenziale

Lelettrodo di misura un
elettrodo a vetro sensibile
alla [H+]

Lelettrodo di riferimento
non sensibile alla variazione
della [H+]
la superficie esterna di vetro dellelettrodo deve essere sempre idratata

lelettrodo di norma lasciato immerso in una soluzione

La sottile membrana di vetro molto fragile e quindi bisogna aver cura


di non romperla n graffiarla, e nemmeno di causarvi un accumulo di
elettricit statica per strofinamento

Dopo aver utilizzato lelettrodo con soluzioni proteiche o gelatinose,


necessario lavare con cura la membrana perch un eventuale deposito
di queste sostanze diminuirebbe lefficacia della misura

V = cost 2.303 RT/F pH


La taratura richiede lutilizzo di due soluzioni a pH diverso

Di norma si effettua prima la taratura con un tampone a


pH 4 a pH 7 e poi con uno a (se il campione si presuppone
acido) oppure (se ci si aa pH 10 spetta un campione basico)

Dopo la taratura, lelettrodo a pH semplicemente


immerso nella soluzione in esame e fornir una misura
rapida ed accurata del pH
Rappresentazione schematica dei principali
costituenti chimici del plasma ematico e del
liquido cellulare

pH di alcuni liquidi biologici

Cl-
Soluzioni Tampone

Il loro pH non varia se vengono moderatamente diluite o


se ad esse si aggiungono moderate quantit di un acido o
di una base forte
Composizione

tampone acido
acido debole + la sua base coniugata
acido poliprotico con un suo sale di monosostituzione

tampone basico

base debole + il suo acido coniugato


Soluzioni che si oppongono a variazioni del proprio pH
causate da perturbazioni esterne

Aggiunta di ACIDI

Aggiunta di BASI

Diluizioni

acido debole + il suo sale CH3COOH + CH3COONa


Due sali di acido poliprotico NaH2PO4 + Na2HPO4
base debole + il suo sale NH3 +NH4Cl
Composizione = acido debole e la sua base coniugata

AH Aggiunta di una base forte


AH + NaOH A- + H2O + Na+

A- Aggiunta di un acido forte


HCl + A- AH + Cl-

AH + H2O A- + H3O+

[A-] [H3O+]
Ka =
[AH]
[A-]
pH =pKa+log pH =pKa+log [accettore H +]

[AH] [donatoreH+]

Capacit tampone
pKa-1 < pH < pKa+1

MAX Potere tampone pH= pKa

acido debole e la sua base coniugata in


concentrazioni uguali [AH] =[A-]
Una soluzione tampone pu essere preparata in due modi
diversi:

Aggiungendo direttamente l'acido (o la base) debole ed il


suo sale
Esempio: acido acetico ed acetato di sodio, oppure
ammoniaca e cloruro di ammonio (Henderson-Hasselbach)

Aggiungendo l'acido (o la base) debole ed una base (o un acido)


forte
Esempio: acido acetico ed idrossido di sodio, oppure ammoniaca
ed acido cloridrico
Come si prepara un tampone?

acido debole + il suo sale CH3COOH + CH3COONa


Due sali di acido poliprotico NH3 +NH4Cl
base debole + il suo sale NaH2PO4 + Na2HPO4
Acidi poliprotici e basi poliacide
possono cedere o astrarre pi di protone

1. H3PO4 H+ + H2PO4- Ka1 = 7,1 10-3

2. H2PO4- H+ + HPO42- Ka2 = 6,3 10-8

3. HPO42- H+ + PO43- Ka3 = 4,2 10-13

A ciascun equilibrio corrisponde un valore di Ka.


Ka1 > Ka2 > Ka3.
Come si dovrebbe fare un tampone acetato 0.1 M pH 4.75

Calcolare i rapporti tra sale ed acido sulla base della eq. di Henderson-
Hasselbach: pH=pKa+log ([A-]/[AH])

Preparare una soluzione 0.1 M di sodio acetato


Prepare una soluzione 0.1 M di acido acetico

Mischiare le due soluzioni e controllare il pH

In realta il pH ottenuto non e mai quello teorico: per la influenza della


temperatura e la presenza di altri ioni in soluzione (es. bicarbonato)

.ma il tampone acetato 0.1 M pH 5.0 si fa anche

Preparare una soluzione di Acido Acetico 0.1 M (Acido Acetico glaciale


99.7%, PM 60.05, d=1.052 g/ml) Portarla a pH 4.75 con NaOH o KOH 10 N
(Attenzione!)

LAc. Acetico 0.1 M si mette in un beker, ci si mette unancoretta magnetica e


lo si mette sopra un agitatore magnetico. Si infila lelettrodo del pHmetro e si
aggiunge NaOH con una pipetta pasteur controllando il pH.
pKa indica la
forza relativa di
un acido o di una
base debole

Pi forti sono gli


acidi maggiori
sono le loro
costanti di
dissociazioni,
minore il valore
di pK
Quindi importante conoscere il valore di pKa per capire in che
range di pH lacido/base debole esercitano il proprio potere
tampone
studio strutturale e funzionale delle MOLECOLE
.misura della concentrazione delle Molecole

METODO

Propriet fisiche della molecola

Stabilit della molecola

Esame critico di procedure disponibili

Potere risolutivo
strumentazione
costo
SCOPO
SCELTA DEL MATERIALE DI PARTENZA cruciale

Scegliere se possibile il materiale di partenza che


contenga quantit elevate della molecola di interesse
e facilmente reperibile

. Ovviamente se il vostro progetto di ricerca non pone gi dei limiti.


SOLUZIONI IMPIEGATE PER FRAZIONAMENTO E OMOGENEIZZAZIONE

devono mantenere il pi possibile lintegrit degli organelli e delle molecole

MANTENIMENTO DEL pH
- Variazioni anche minime del pH possono portare a cambiamenti nella
permeabilit delle membrane, nella stabilit delle strutture
macromolecolari o nelle propriet funzionali di proteine ed enzimi

LA TEMPERATURA

Le operazioni di omogenizzazione devono essere effettuate


senza aumento di temperatura - soluzioni mantenute in ghiaccio;
manipolazioni in camera fredda; centrifugazioni a 4C etc.

MANTENIMENTO DELLA PRESSIONE OSMOTICA


La pressione osmotica del medium deve essere analoga a quella
intracellulare . per prevenire lo shock osmotico degli organuli e la loro lisi.

Inibire enzimi degradativi


Inibitori di proteasi , inibitori di nucleasi
emulsione uniforme e stabile ottenuta
OMOGENENATO
per frammentazione di cellule e tessuti

OMOGENEIZZAZIONE

Rottura delle membrane e pareti cellulari, con rilascio dei componenti


intracellulari

E un processo empirico, che necessita di ottimizzazione a seconda


del tipo di analisi che si intende effettuare.

Scelta del materiale di partenza


Metodo di rottura delle cellule Coltura

Propriet chimico-fisiche delle cellulare


o tessuto

soluzioni impiegate
Metodi non meccanici
Lisi osmotica
La membrana si rompe a causa di alterazioni
dellosmolarit
Congelamento e scongelamento
la membrana si rompe a causa dellaumento di volume
dovuto alla formazione dei cristalli di ghiaccio
Enzimi litici
Enzimi che degradano la parete cellulare e nel caso
di tessuti degradano la matrice extracellulare
Solventi organici
Toluene
Detergenti
SDS,Tween 20,Triton X-100, Sulfobetaine,
chaps
Lisi per osmosi

Cellule fragili si lisano per la differenza di pressione osmotica tra interno


ed esterno,(anche le membrane degli organelli possono rompersi).
Shock osmotico
Metodi non mecc

Soluzion
e
ipertoni
ca Il contenuto
cellula cellulare si
La
concentra
cellula
collassa
Soluzion
e
ipotonic
a

La cellula si
rigonfia
fino a scoppiar
perch parlo di tamponi e non di H2O

Rispettare lintegrit delle molecole che si


vogliono estrarre, isolare
Sostanze in grado di facilitare la lisi
cellulare o la disgregazione tissutale
Inibire enzimi litici per la molecola di
interesse
Detergenti
DETERGENTI
Detergenti ionici
Sodio Dodecil Solfato

Detergenti non- ionici

Triton X100

Tween 20

Detergenti zwitterionici
CHAPS
Concentrazione Critica Micellare
(c.m.c., critical micellar concentration).

Le micelle sono in equilibrio termodinamico con i monomeri

La formazione delle micelle si verifica in un


campo di concentrazioni piuttosto ristretto

c< cmc c< cmc


i singoli monomeri galleggiano Aumenta il numero di
allinterfaccia aria fase aggregati
disperdente
Digestione enzimatica
Metodo costoso

Enzimi
degradano la parete cellulare - lieviti batteri
degradano la matrice extracellulare - tessuti

Digestione enzimatica- La parete cellulare dei


batteri e dei lieviti pu essere digerita con
enzimi (lisozima, zimoliasi).

Disgregazione enzimatica di tessuto- uno o pi enzimi


digestivi che agiscono a livello delle giunzioni cellula-
cellula/ cellula-matrice extracellulare/ degradano la
matrice extracellualare
tripsina collagenasi pepsina
ialuronidasi neuraminidasi dispasi
Omogeneizzazione
Deve preservare lintegrit dei componenti rilasciati

Caratteristiche del tampone da utilizzare.


pH simile a quello intracellulare
forza ionica simile a quella intracellulare
Deve contenere
Saccarosio che impedisce la lisi degli
organuli cellulari e stabilizza le proteine che
derivano a siti idrofobici
EDTA chelante di ioni metallici e di
Ca++(attivatore di proteasi)
Inibitori delle proteasi
Riducenti
Detergenti

E importante che la temperatura rimanga costante


Omogeneizzatore Ultra-turrax

Rotori-stativi

Mantenere il materiale organico deve essere mantenuto a basse temperature


Omogeneizzatore potter

le cellule o i frammenti di
tessuto vengono lacerate
contro la parete del tubo di
vetro daforze frizionali
generate dalla rotazione un
pestello in teflon o vetro . Lo
spaziotra pestello e pareti del
cilindro di 50-500 mm (tight-
fitting).

Manuale Dounce

Motore elettrico Potter-Elvejham

Mantenere il materiale organico a bassa temperatura


French Press
Le cellule vengono mantenute in
una camera dacciaio dotata di
un piccolo forellino. Pistone

Allinterno della camera chiusa


e svuotata daria viene
Camera di
esercitata, mediante un
compressione
pistone, una pressione idraulica.

Raggiunta la pressione
desiderata la camera viene
aperta e le cellule per effetto Valvola a

della diminuzione di pressione si spillo

espandono e scoppiano.

Lomogenato viene raccolto


facendo passare il contenuto
della camera attraverso il
forellino.
Sonicazione

Nella sospensione viene immersa la sonda metallica di un sonicatore,


che vibrando in grado di emettere onde sonore ad altissima
frequenza. Le cellule vengono rotte dalle elevate pressioni locali
indotte da queste onde. Svantaggi: sviluppo di calore (si rimedia
lavorando con le soluzioni in bagno di ghiaccio e programmando il
funzionamento pulsato, cio intermittente, della sonda), pericolo di
danni per ludito delloperatore ( neces- sario usare cuffie).

Le onde sonore con una frequenza > 16.000 Hz,


FILTRAZIONE procedimento fisico per separare le
particelle solide dal liquido o
particelle di dimensioni diverse.

filtri di natura e selettivit


diverse trattengono particelle
disperse in un liquido
DIALISI
una membrana semipermeabile lascia passare molecole
di piccole dimensioni, ma non macromolecole
DIALISI