UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICO

BIOLGICAS Y FARMACUTICAS
INMUNOLOGA
6o B

PROBLEMARIO
RESPUESTA ANTGENO - ANTICUERPO

DOCENTE:

DR. JOS FRANCISCO ZAMBRANO ZARAGOZA.

ALUMNOS:

VARGAS SOLS JORGE ALBERTO.

GUADARRAMA DELGADILLO LUIS CARLOS.

INSTRUCCIONES: Resuelva cada uno de los siguientes problemas, en equipos de dos
personas. Para los textos utilice letra arial de 12 puntos, espaciado sencillo, texto
justificado. Las grficas, dibujos, as como los resultados de regresin (donde se
requiera) debern ser insertados como imagen.

1. Las etiquetas de cuatro frascos (A, B, C y D) de conjugados de Hapteno-

acarreador de perdieron accidentalmente. Sin embargo, se saba que cada
frasco contena 1) Hapteno 1-acarreador 1 (H1-A1), 2) Hapteno 1- acarreador 2
(H1-A2), 3) Hapteno 2 acarreador 1 (H2-A1) y 4) Hapteno 2 acarreador 2
(H2-A2). El acarreador 1 tiene un peso molecular de 60,000 daltones y el
acarreador 2 uno mayor, de 120,000 daltones. Suponga que tiene un
anticuerpo anti-H1 y uno anti-H2 (ambos de conejo) y marcadores de peso
molecular de 150,000, 100,000 y 80,000 daltones. Utilice western-blot para
determinar el contenido de cada frasco y muestre los patrones de
reconocimiento que cabra esperar de 1, 2, 3 y 4. Su respuesta tambin debe
indicar que anticuerpo o combinacin de anticuerpos se utilizara para cada
prueba, as como la explicacin de su razonamiento.

A B C D
H1-A1 H1-A2 H2-A1 H2-A2
70kDa 130kDa 70kDa 130kDa
A1-60kDa
A2-120kDa

R: Si aplicarn a todos los frascos Anti-H1 precipitando dos de las frascos (A y B), los
cuales se diferenciarn uno del otro debido al acarreador (A1 y A2) correspondiente al
frasco por sus diferentes PM por Western-Blot, dando las bandas respectivas de A y B
de 70 y 130 kDa aproximadamente (correspondiente al peso del hapteno con su
acarreador correspondiente). Los frascos no precipitados (ya identificados como
posibles C y D), y al estar disponibles para la reaccin Anti-H2 precipitarn y se
diferenciarn C del D por el PM definido por el acarreador.

2. Usted obtiene una preparacin de albmina srica bovina (BSA) purificada

de suero normal de bovino. Para determinar si en la preparacin de BSA
quedan algunas otras protenas sricas decide utilizar western-blot.
a) Qu antgeno utilizara para preparar el antisuero necesario para
detectar la impureza en la preparacin de BSA?
R: Se utilizar suero bovino al cual previamente se le extrajo el BSA,
suero el cual contendr toda impureza que podra incluirse en la muestra
 de BSA no pura. Si en el western blot no se presentan bandas en la
muestra, significa que no existen tales impurezas en dicha muestra.
b) Asumiendo que la preparacin de BSA es pura, dibuje en patrn de
reconocimiento en western-blot, que cabra esperar, si utilizar el
anticuerpo preparado en el inciso A.

En ambos casos, esplique su razonamiento.

Se llega a la conclusin de que al ser pura la solucin de BSA, usando

anticuerpos afines a las impurezas que hay en el suero bovino, las cuales
presuntamente no estn presentes en la solucin, y al no poderse unir y
generar reaccin antignica, no habr formacin de bandas en el western
blot.

3. Ud.,Cuantifica la concentracin de protenas de un antgeno denominado

p30qfb por el mtodo de Bradford, para lo que construye una curva de
estndar (5 puntos) con BSA. (0, 1, 2.5, 5 y 10 L de BSA de 1 mg/mL). Los
resultados de absorbancia a 595 nm que obtiene son los siguientes:

tubo Concentracin absorbancia

BSA (mg/ml)
1 0 0
2 1 0.122
3 2.5 0.325
4 5 0.458
5 10 0.758

De la muestra (p30qfb), coloca 2 L de una dilucin 1:15 para la

determinacin. La absorbancia que obtiene es de 0.148
 a. Determine la concentracin de protenas de la p30qfb y diga cmo
preparar una solucin con 30 g de p30qfb para inmunizar un ratn
(volumen de inmunizacin 200 L), para la obtencin de anticuerpos
monoclonales.
Se calculan las concentraciones de cada solucin de la siguiente manera:
Ci Vi
Cf =
Vf

Ci= Concentracin inicial de la solucin (mg/mL).

Vi = Volumen que se ha tomado de la solucin inicial (mL).
Vf = Volumen final de la solucin (mL).
Cf= Concentracin final de la solucin (mg/mL).

Se requiere convertir de l a ml usando el siguiente factor de conversin:

1 mL
n mL=n L
1000 L

Vi (L) Vi (ml)
0 0
1 0.001
2.5 0.0025
5 0.005
10 0.010

Se calculan las concentraciones finales de p30qfb en la solucin

Vi (ml) Ci (mg/ml) Vf (ml)

0 1 1
0.001
0.0025
0.005
0.010

Sustituyendo:

Vi (ml) Cf (mg/ml)
0 0
0.001 0.001
0.0025 0.0025
 0.005 0.005
0.010 0.010

Se construye la grfica con los datos anteriores y a partir de esta obtener la regresin
lineal

X Y
[BSA] (mg/ml) Absorbancia
0 0
1.00x10-3 0.122
2.50x10-3 0.325
5.00x10-3 0.458
1.00x10-2 0.758

Al conocer las coordenadas de la grfica, se realiza la siguiente regresin lineal:

Regression estatics
Multitple R 0.98191269
R square 0.96412391
Adjusted R Square 0.952203188
Standard error 0.064829098
observations 5

df SS MS F Significance
 F
Regression 1 0.339114764 0.339114764 80.68758996 0.00291262
Residual 3 0.012608436 0.004202812
Total 4 0.3517232

coefficient Standard T stat p- Lower Upper

s error value 95% 95%
Intercep 0.063 0.042 1.506 0.229 -0.07 0.196
t
BSA 72.906 8.116 8.983 0.003 47.076 98.736
(mg/ml)

Con los datos de la regresin tenemos la R mltiple, y R2 indica la confiabilidad de la

grfica. El valor p es menor a la significancia, por lo tanto se puede concluir que la
pendiente es diferente de cero y por lo tanto hay una relacin entre los BSA y las
absorbancias.

Con la ecuacin de la recta de la grfica 1 (y = 0.1852x - 0.223) se puede obtener la

concentracin de protenas de la solucin d e p30qfb.

yb
x=
m

0.148+0.223
x=
0.1852

Concentracin de p30qfb= 0.1782

Ahora se calcular la concentracin de la muestra despejando Ci

Cf Vf
Ci=
Vi

Concentracin inicial de protenas en p30qfb= 178.20 mg/mL.

Luego, para preparar la solucin de 30microgramos de p30qfb se convierten las

unidades de micro a mili gramos

1mg
n mg=n g
1000 g
n g= Nmero de g que se desean convertir.

n mg= Nmero de mg resultantes de la conversin.

Se obtiene una concentracin de 0.03 mg

Se realiza una dilucin con un volumen final de 1 ml. Con la concentracin calculada
anteriormente. Se calculara el vol. Inicial de muestra despejando Vi

Cf Vf
Vi=
Ci

Con los datos:

Cf= 0.03mg/mL

Vf= 1mL

Ci= 178.20mg/ml

El volumen inicial de muestra es 1.68x10-4 y se completa a 1mL para obtener una

concentracin final de 0.03 mg/ml

Despus de realizar el procedimiento de fusin, seleccin de hibridomas y

clonacin, obtiene una clona que produce un anticuerpo de clase IgG que
denomina QFB.313.

b. Realiza la titulacin del anticuerpo por ELISA, para lo cual, sensibiliza

una placa de poliestireno con una solucin de p30qfb (30 g/mL),
Despus del proceso de bloqueo, adiciona diferentes diluciones del Ab
QFB.313 y deja interaccionar durante una hora a 37C. Lava la placa tres
veces y adiciona un anticuerpo anti-ratn conjugado a HRP. Repite la
incubacin y el lavado y revela con H2O2-OPD y despus de 15 minutos
detiene la reaccin con H2SO4 8N. Lee la absorbancia a 490 nm y los
resultados que obtiene son los siguientes (Valores brutos):

1/dilucin de mAb QFB .313 A490nm

1600 1.5
3200 1.5
6400 1.5
12800 1.385
25600 1.209
51200 1.106
102400 0.845
204800 0.525
409600 0.15
 A490 nm control Negativo = 0.095

Haga un grfico de los resultados, determine la ecuacin de la recta y

calcule el ttulo del anticuerpo, definido ste como la dilucin con la que
se obtiene el 50% de la interaccin mxima, medida como absorbancia
(redondee sin decimales el resultado final).

Utilizando una regresin lineal se obtienen los datos de las siguientes tablas:

Estadsticas de regresin
Coeficiente de correlacin mltiple 0.958574151
Coeficiente de determinacin R^2 0.918864404
R^2 ajustado 0.902637284
Error tpico 0.151481483
Observaciones 7

El valor p indica que si hay relacin entre la Absorbancia y la dilucin, pero los dems
valores son muy bajos que el error del modelo sera muy alto. Entonces la grfica no es
confiable y ser necesario realizar modificaciones.
Se alteraron los valores de x al aplicar un log10 y se logr aumentar la confiabilidad a
un 92.45%.
Con la ecuacin de la recta de la grfica) es posible calcular aproximadamente el ttulo
del anticuerpo.

Ec. Recta: y = -3.342ln(x) + 6.1115

y6 .1115
ln ( x)=
3.342 Ec. (10)

y6.1115
x=e
3.342 Ec. (11)

Se sustituye Y, y se obtiene un resultado de 4.9742.

c. Posteriormente, realiza un ensayo competitivo para determinar la

especificidad del mAb QFB.313, para lo cual mezcla 0.1 g del Ab
QFB.313 con diferentes cantidades del antgeno p30qfb o de otro
antgeno (no relacionado) denominado BGM. Esta mezcla la utiliza
como anticuerpo primario para realizar un ensayo de ELISA similar
al descrito en el prrafo (a) y obtiene los siguientes resultados
(valores brutos):
 A490 nm

[g Ag]
adicionado p30qfb BGM
0 0.65 0.65
1 0.615 0.65
2.5 0.466 0.65
5 0.348 0.65
10 0.245 0.65
15 0.111 0.65
20 0.105 0.65
A490 nm. Control negativo = 0.095

Haga un grfico de los resultados.

Cules son sus conclusiones de este experimento? R: El anticuerpo QFB.313 es

especfico para el antgeno p30qfb y no para BGM.

Nota: Este inciso no requiere regresin, por lo que el 10% correspondiente

a ese rubro pasar a la explicacin del problema.

d. Finalmente, para calcular la constante de afinidad del mAb QFB.313,

utiliza el mtodo descrito por Beatty et al (1987)*, basado en la ley de
accin de masas. Para ello, sensibiliza una placa de poliestireno con
el equivalente a diferentes cantidades de p30qfb (3, 2, 1.5, 1 y 0.5 g).
Despus de bloquearlas, se incubaron con diferentes
concentraciones del mAb QFB.313 (5 diluciones dobles seriadas,
iniciando con 3.0 g/mL) y se prosigui con el ensayo de manera
similar a lo descrito en el inciso (A) y obtiene las absorbancias a 490
nm. Los resultados de absorbancia obtenidos (brutos) se muestran
en la siguiente tabla:
 [Ag] g
[mAb]
g/mL 3 2 1.5 1 0.5
3 0.852 0.795 0.704 0.68 0.48
Dilucin 1 0.725 0.674 0.601 0.515 0.362
Dilucin 2 0.625 0.574 0.525 0.45 0.295
Dilucin 3 0.566 0.515 0.466 0.395 0.225
Dilucin 4 0.498 0.455 0.405 0.325 0.185
Dilucin 5 0.45 0.395 0.385 0.265 0.136

Control Negativo = 0.065

CTRL Abs Max = 0.800 (indica la mxima absorbancia obtenida, y representa el 100%
de interaccin [Ag-Ab]).

i. Determine la ecuacin de la recta para cada una de las cantidades

de Ag utilizadas, utilizando los datos de absorbancia vs
concentracin de mAb QFB.313.
Tabla:

[Ag] g
[mAb] 3 2 1.5 1 0.5
g/mL
3 0.852 0.795 0.704 0.68 0.48
1.5 0.725 0.674 0.601 0.515 0.362
0.75 0.625 0.574 0.525 0.45 0.295
0.375 0.566 0.515 0.466 0.395 0.225
0.1875 0.498 0.455 0.405 0.325 0.185
0.09375 0.45 0.395 0.385 0.265 0.136

Grfica:
 ii. Utilizando la ecuacin de la recta, calcule la concentracin del
mAb necesario para obtener el 50% de la unin con el Ag, con
respecto al CTRL Abs Max.
Datos obtenidos de cada una de las ecuaciones de la recta mostradas
en la grfica:

[Ag]
3g/ml 2g/ml 1.5g/ml 1g/ml 0.5g/ml
50% de CTLR de mx. Abs (y) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Pendiente (m) 0.1297 0.1273 0.1061 0.1286 0.1099
Ordenada al origen (b) 0.4916 0.4427 0.4099 0.3118 0.1723
[mAb] (g/ml) (x)
Para calcular [mAb] solo es necesario sustituir los datos de cada una de las [Ag]

yb
x=
m

[Ag]
3g/ml 2g/ml 1.5g/ml 1g/ml 0.5g/ml
[mAb] (g/ml) (x) 0.7062 0.3354 0.0933 0.6858 2.072

iii. Calcule la constante de afinidad del mAb QFB.313, para lo cual

seleccione los dos valores ms cercanos de la concentracin de
mAb calculada al 50% de la unin (inciso b), [Ab1(50%)] y
[Ab2(50%)], para utilizarlos en la siguiente ecuacin:

Ka 1/2(2[ Ab 1(50 ) ] [ Ab 2(50 ) ] )

* Valor absoluto
Nota: La concentracin a sustituir en la frmula anterior debe ser expresada en
molaridad (M). Para ello, considere lo siguiente:

- 1 molcula de IgG equivale a 2.490795x10-16 mg

- Molaridad = moles/litro

* Beatty, J. D., Beatty, B. G. & Vlahos, W. G. (1987). Measurement of monoclonal antibody affinity by non-
competitive enzyme immunoassay. Journal of Immunological Methods 100(12): 173-179.

Los dos valores ms cercanos de la concentracin de mAb calculada al 50% son

0.7062 y 0.6858.

0.7062 g 0.001 mg 1 molcula IgG 1mol 1000 mL 9 Mole

mAb 150 = =4.707 x 10
1 ml 1 g 16 23
2.490795 x 10 mg 6.023 x 10 molculas 1 L Litro

0.6858 g 0.001 mg 1 molcula IgG 1 mol 1000mL 9 Mole

mAb 250 = =4.571 x 10
1 ml 1 g 16 23
2.490795 x 10 mg 6.023 x 10 molculas 1 L Litro

Sustituyendo la ecuacin 5 de la constante de afinidad se obtiene la siguiente ecuacin:

1 8 1
Ka= =18.38235294 x 10 M
2(2 ( 4.707 x 10 M ) ( 4.571 x 10 M ) )
9 9 (Constante de

afinidad para el mAb QFB.313.)

4. Ud. desea comparar la frecuencia de PMN pacientes con una enfermedad

autoinflamatoria crnica con un grupo control (su hiptesis es que los
pacientes con enfermedad autoinflamatoria tienen mayor nmero de PMN
en sangre perifrica que los sujetos sanos). Para ello, lisa los eritrocitos de
una muestra de sangre perifrica de 30 pacientes y 30 sujetos clnicamente
sanos, y realiza el marcaje de superficie utilizando los siguientes
anticuerpos:
i. Anti-CD16-FITC
ii. ANTI-CD11b-PE
iii. ANTI-CD14-PERCP

Y detecta las poblaciones celulares por citometria de flujo.

a) En el siguiente esquema, indique las poblaciones celulares que

obtendra, de una muestra representativa, utilizando solo los criterios de
tamao y granularidad. Encierre la poblacin en la que encontrara los
PMN. Explique.
 R: La proporcin relativa de linfocitos, macrfagos y granulocitos se
determina fcilmente a partir de grficas de tamao (Forwar Scatter FSC)
contra complejidad celular (Side Scatter SSC).
El FSC brinda informacin correspondiente al volumen de partcula, mientras
que el SSC est dado por la complejidad interna de la molcula.

Granulocitos

Monocitos

Linfocitos

b) De la poblacin seleccionada en el inciso a, analiza con los marcadores

FSC y CD14-PERcP. Dibuje en el esquema siguiente, las poblaciones que
se obtendran, de una muestra representativa, con esos marcadores, y
encierre la poblacin en la que se encontraran los PMN. Explique.
R: CD14 es una glicoprotena de membrana unida a glicofosfatidilinositol
(GPI) de 53-55kDa tambin conocida como receptor de LPS. El CD14 se
expresa a niveles elevados en monocitos y macrfagos, y a niveles ms bajos
en granulocitos. Por lo que slo estos dos tipos de clula se visualizarn, pero
esta vez los PMN estarn del lado izquierdo por su baja expresin de CD14.

Granulocitos

Monocitos

c) Finalmente, de la poblacin encerrada en el inciso b, hace el anlisis

con dos marcadores. Dibuje las poblaciones que se obtendran, de una
muestra representativa, y encierre la que corresponde a los PMN.
Explique.
 Linfocitos
Granulocito
s

d) Los valores de PMN que obtiene de los dos grupos de estudio son los
siguientes:

% de PMN
ENFERMOS SANOS
84.00 61.80 61.80 67.40
74.80 64.30 66.00 71.00
57.40 72.70 52.40 62.50
79.60 89.20 71.80 60.60
72.00 91.70 58.40 95.30
61.50 79.00 47.00 45.70
79.90 40.10 61.50 95.10
53.50 60.20 98.00 61.80
68.30 91.80 58.80 75.20
23.60 71.50 55.10 77.00
45.80 63.20 76.10 86.80
60.50 71.10 51.10 74.80
78.70 72.10 88.70 58.10
87.60 83.90 69.90 87.60
83.90 81.60 93.40 62.70

1) Cul es su conclusin con respecto a los % de PMN en

los dos grupos? Explique
R: Realizando una prueba de hiptesis con una Z
comparativa de dos medias, estadsticamente se comprob
que en promedio la poblacin de PMN en pacientes
enfermos es mayor en comparacin a los pacientes sanos.
Resultado de esperarse con los conocimientos tericos con
respecto a la actividad antiinflamatoria de los neutrfilos, en
 una enfermedad auto inflamatoria crnica son requeridos en
gran abundancia.

2) Qu prueba estadstica utiliz? Por qu?

R: Se utiliz la prueba estadstica de Z de dos medias
poblacionales, porque estamos comparando dos medias
poblacionales de muestras grandes independientes.

ENFERMOS SANOS
Sx: 15.75 (15.75)^2: 248.06 Sx: 14.99 (14.99)^2: 224.70
X : 70.17 X : 69.72

Juego de hiptesis: Tomando en cuenta el valor Z, se busc en su

respectiva tabla este resultado, con un alfa de
Ho: X 1 X 2
95% (0.05), y un valor p de 0.5478, un valor
crtico de 1.64.
Ha: X 1> X 2
CONCLUSIN: Se encontr evidencia
estadstica suficiente para indicar que los
Estadstico de prueba: pacientes con enfermedad autoinflamatoria
tienen mayor nmero de PMN en sangre
2
X 1X 70.1769.72
Z= = =0.11

248.06 224.70
2 2
s1 s2 +
+
n n 30 30