RELACIN, UN NUEVO AGENTE ANTIBACTERIANO

DIRIGIDO A LA RESPUESTA ESTRICTA

Resumen necesidad de desarrollar nuevos
antibiticos que apuntan a
La bsqueda de objetivos celulares
componentes clave de los procesos
bacterianos para el desarrollo de
bacterianos esenciales. La respuesta
nuevos antibiticos se ha convertido
pleiotrpica a la inanicin, conocida
en un desafo importante en la lucha
como la respuesta estricta,
contra las bacterias patgenas
proporciona un objetivo potencial, ya
resistentes. Presentamos un nuevo
que es crucial para la activacin de
compuesto, Relacin, diseado para
estrategias de supervivencia como la
inhibir (p) la produccin de ppGpp por
fase estacionaria, la esporulacin y la
la enzima bacteriana ubicua RelA que
formacin de biofilm [1 - 4]. Adems,
desencadena la respuesta estricta. La
la respuesta estricta se ha
relacina inhibe RelA in vitro y reduce
demostrado recientemente para
(p) la produccin de ppGpp in vivo.
mediar la tolerancia a los antibiticos
Por otra parte, Relacin afecta a la
en las bacterias de nutrientes
entrada en fase estacionaria en
limitados [5]. La respuesta estricta es
bacterias Gram positivas, lo que lleva
inducida por la acumulacin de las
a una reduccin dramtica en la
molculas de sealizacin bacteriana
viabilidad celular. Cuando se aade
59trifosfato-39-difosfato y 59-39-bis-
Relacin a las clulas esporulantes de
difosfato, denominadas
Bacillus subtilis, perturba fuertemente
colectivamente (p) ppGpp [6]. La
la formacin de esporas
sntesis de (p) ppGpp se ha
independientemente del tiempo de
caracterizado como una transferencia
adicin. La formacin de esporas
de pirofosfato dependiente de
tambin se ve impedida en la bacteria
ribosomas de los fosfatos b y c de un
patgena Bacillus anthracis que
donante de ATP al grupo hidroxilo 39
causa la enfermedad aguda del
de GTP o GDP [7].
ntrax. Finalmente, la formacin de
biofilms multicelulares es En las bacterias Gram negativas (p)
marcadamente alterada por Relacin. ppGpp es mayormente sintetizado
Por lo tanto, establecemos que por RelA e hidrolizado por SpoT,
Relacin, un nuevo anlogo ppGpp, mientras que en las bacterias Gram
interfiere con las estrategias de positivas una enzima bifuncional,
supervivencia bacteriana a largo Rel / Spo, tanto sintetiza e hidrlisis
plazo, colocndolo como un nuevo (p) ppGpp [8, 9]. Tras la privacin de
agente antibacteriano atractivo. nutrientes, Rel protenas se unen a
los ribosomas bloqueados por tRNA
Introduccin
sin carga y catalizar la sntesis de (p)
La aparicin de bacterias resistentes ppGpp [10]. Se ha propuesto que las
a mltiples frmacos dicta la protenas Rel salto entre estancado
ribosomas con el fin de lograr la (p) Resultados
ppGpp concentracin necesaria para
Basado en la estructura cristalina
inducir a la Respuesta estricta [10].
Rel / Spo [13], diseamos Relacin
Un informe reciente, sin embargo,
(Figura 1A), un anlogo basado en
propone que RelA realmente sintetiza
29-desoxiguanosina de ppGpp, en el
ppGpp slo despus de que se
que los restos de pirofosfato
disocia del ribosoma [11]. Las
originales en las posiciones 59 y 39
protenas Rel comprenden dos
se sustituyeron por dipptidos de
dominios principales: un dominio
glicilglicina unidos al anillo de azcar
cataltico localizado En el N-terminal y
por un puente de carbamato (vase el
un dominio regulador en el C-terminal
Texto S1, Figura S1A y S1B). El
[12]. El anlisis de la estructura
modelado de la unin de Relacin al
cristalina del dominio N-terminal de
sitio Rel / Spo sintetasa muestra que
Rel / Spo de Streptococcus
ocupa un volumen considerable de la
equisimilis (S. equisimilis) revel dos
bolsa de unin y forma un intervalo
Conformaciones con estados
de enlaces de hidrgeno e
hidrolasa y sintetasa opuestos [13].
interacciones hidrofbicas (Figura
Adems, se encontr que el dominio
S1C), proporcionando una base
N-terminal contena dos Subunidades
estructural para el efecto inhibidor de
catalticas: N-terminal que hidroliza
Relacin.
(p) ppGpp y C-terminal que cataliza
su sntesis [12]. Para investigar la actividad biolgica
de Relacin, primero evaluamos su
Cuando ppGpp se acumula dentro de
potencial inhibidor sobre la actividad
la clula bacteriana afecta
(p) ppGpp sintetasa de RelA y Rel /
Transcripcin y una pltora de
Spo purificada de Escherichia coli (E.
actividades fisiolgicas [14 - 16]. De
coli) y Deinococcus radiodurans (D.
hecho, la activacin de muchos
radiodurans), respectivamente. Se
genes inducidos por el estrs es
demostr que la relacina inhibe
parcialmente o Totalmente
ambas protenas Rel de una manera
dependiente de ppGpp [17, 18]. La
dependiente de la dosis.
importancia de (p) ppGpp Como un
Sorprendentemente, a la mayor
regulador de la supervivencia
concentracin de Relacin, las
bacteriana nos llev a desarrollar una
enzimas Rel de bacterias Gram
serie De los anlogos ppGpp no
negativas y positivas fueron inhibidas
hidrolizables [19] potencialmente
en aproximadamente 100% y 80%,
dirigidos Rel protenas. Aqu
respectivamente (Figura 1B y 1C). En
presentamos Relacin, un potente
particular, la sntesis de ppGpp y
inhibidor de Rel Protenas.
pppGpp por ambas protenas Rel se
Demostramos que Relacin inhibe
inhibi de forma similar (Figura S2A y
RelA y Rel / Spo In vitro e impide el
S2B). A continuacin, examinamos el
crecimiento, la esporulacin y la
efecto de Relacin sobre la interaccin
formacin de Bacterias Gram
entre Rel / Spo y ribosomas
positivas.
estancados. Los ribosomas
purificados de D. radiodurans se
incubaron con Rel / Spo en presencia
de concentraciones crecientes de
Relacin, y se examin la cantidad
relativa de molculas Rel / Spo
asociadas con complejos 70S.
Western Blot anlisis revel que
Relacin aumenta los niveles de Rel /
Spo bloqueado en los ribosomas
(Figura 2A], lo que sugiere que la
presencia de Relacin reduce el grupo
de protenas molculas disponibles
para (p) ppGpp re-sntesis [10]. Para
investigar ms a fondo si los
ribosomas son realmente necesarios
para la actividad de Relacin,
aprovechamos una protena mutante
RelA (RelAC638F), que ejerce su
actividad de una manera
independiente del ribosoma. Relacin
era igualmente capaz de inhibir la
protena mutante (Figura 2B], lo que
indica una directa Relacin RelA-
interaccin.
A continuacin, examin la influencia
de Relacin en (p) ppGpp produccin
en clulas vivas en la induccin de la
Respuesta Respuesta. Para ello, se
incubaron clulas de la bacteria
formadora de esporas Gram positivo
Bacillus subtilis (B. subtilis) con
Relacin y se trataron con hidroxamato
de serina (SHX) para simular la
inanicin de aminocidos [20,21].
Posteriormente, los niveles
acumulados de (p) ppGpp se
controlaron a partir de extractos
celulares. En lnea con la actividad
inhibitoria observada in vitro, Relacin
marcadamente redujo (p) ppGpp
produccin in vivo (Figura 1D].
Curiosamente, aunque Relacin se
encontr para inhibir completamente
la actividad de purificada RelA de la
bacteria Gram negativa E. coli (Figura
1B), no se observ ningn efecto
obvio del compuesto sobre la sntesis
bacteriana (pp) ppGpp (Figura S2C).
Esto es ms probable debido a la
incapacidad de Relacin para penetrar
en la clula de E. coli y alcanzar su
objetivo.
Resumen del autor
El desarrollo de nuevos agentes
antibacterianos se ha convertido en la
principal demanda de lucha contra las
bacterias patgenas. La identificacin
de nuevos objetivos celulares
inexplorados en este combate es
esencial para prevenir un posible
retorno a la era pre-antibitica. Los
antibiticos tradicionales apuntan
componentes celulares esenciales
tales como ribosomas y
constituyentes de la pared celular,
hacindolos efectivos sobre todo
durante el crecimiento bacteriano. Sin
embargo, la capacidad de las
bacterias para residir en la naturaleza
en etapas duraderas establece la
necesidad de hacer frente a estas
estrategias de supervivencia
alternativas. En este informe,
presentamos un nuevo antibitico,
denominado Relacin, que apunta a la
Respuesta Rigorosa, un proceso
requerido para la transicin a fase
estacionaria, crucial para la
supervivencia bacteriana. La relacina
inhibe las abundantes enzimas Rel de
bacterias que sintetizan las molculas
de sealizacin requeridas
Para activar la respuesta estricta.
Encontramos que Relacin perturba el
cambio en fase estacionaria en
bacterias Gram positivas y conduce a
la muerte celular. Adems, Relacin
inhibe la esporulacin y la formacin
de biofilm, estrategias adicionales de
supervivencia bacteriana a largo
plazo. La ubicuidad de las enzimas
Rel entre las bacterias, combinada
con la ausencia de homlogos
conocidos en las clulas de
mamferos, fortalece el potencial de
Relacin para convertirse en un
antibitico teraputico.
Relacin reduce la supervivencia de
bacterias Gram positivas
Habiendo comprobado que Relacin
afecta a la produccin de (P) ppGpp
in vivo por las clulas de B. subtilis y
dado el papel vital de la Respuesta
estricta en la supervivencia
bacteriana, se investig la Impacto de
Relacin en el crecimiento celular y la
viabilidad. Curiosamente, en el
Presencia de Relacin, las clulas
exhibieron una fase logartmica
extendida Como se indica por el
aumento de OD Valores, lo que
implica que No entraron
correctamente en la fase estacionaria
(Figura 3A). De nota, Se observ un
fenmeno similar para el mutante
spoT nulo de Helicobacter pylori [22].
Este fracaso condujo a una sustancial
Muerte celular despus de 24 horas,
con una IC estimada 600 de 200 mM,
segn se controla mediante la
reduccin en las unidades
formadoras de colonias (Figuras 3B y
S3). Adems, despus de 48 horas,
las El efecto de la Relacina,
reduciendo el nmero de colonias por
Aproximadamente cinco rdenes de
magnitud en relacin con (Figura 3C).
Un patrn de viabilidad similar se
observ en Sin tratar B. subtilis
clulas que carecen de Rel / Spo
(Figura 3C], lo que sugiere Que esta
enzima es de hecho el objetivo
principal de la accin de Relacin. En
consonancia con esta observacin, la
supervivencia de la cepa mutante No
se vio afectada por la adicin de
Relacin (Figura 3C). Notablemente, El
efecto de Relacin sobre la
supervivencia no es probable que
dependa de Formacin de esporas,
ya que slo unas pocas esporas, si
Sin tratar. Por otro lado, la aparicin
de muertos Tanto las clulas
desintegradas como las clulas
desintegradas aumentaron (Figura
S4). De acuerdo con la Incapacidad
de Relacin para perturbar (p)
produccin de ppGpp en E. coli
(Figura S2C), no se detect ningn
efecto sobre el crecimiento y la
viabilidad en Estas clulas.
La actividad biolgica de Relacin se
explor adicionalmente en bacterias
Gram positivas no formadoras de
espuma. El tratamiento del
estreptococo del grupo A (GAS) con
Relacin revel que, aunque la tasa de
crecimiento slo fue ligeramente
afectada, la viabilidad celular se
redujo en gran medida despus de 24
horas (Figura S5A y S5B). Este efecto
txico se mejor despus de 48 horas
(Figura 3D) y se asoci con la
formacin de colonias muy pequeas.
Adems, como se observ para B.
subtilis, entrando fase estacionaria
fue perturbado por Relacin en la
bacteria de crecimiento
extremadamente lento D. radiodurans
(Figura S5C). Adems, la adicin de
Relacin a las clulas de D.
radiodurans disminuy la viabilidad
bacteriana, como se indica mediante
el ensayo de eficacia de la
galjanoplastia llevado a cabo despus
de 56 y 72 horas de incubacin
(Figura S5D). Por lo tanto, se
estableci que Relacin funciona como
un agente antibacteriano que impide
la entrada en fase estacionaria y
provoca la muerte bacteriana.
Relacin perturba estrategias de
supervivencia a largo plazo
Adems de cambiar a fase
estacionaria algunas bacterias, como
los bacilos, responden a la limitacin
de nutrientes mediante la produccin
de esporas latentes altamente
resistentes como una estrategia para
la supervivencia a largo plazo [23 -
25]. La entrada en la esporulacin se
desencadena por una disminucin de
la GTP intracelular piscinas, en parte
debido a la conversin de GTP en (p)
ppGpp por RelA [26]. Al inicio de la
esporulacin, se genera un septo
asimtrico, dividiendo la clula en una
clula madre nutritiva y un
compartimiento ms pequeo de
forespore que se convierte en una
espora. Posteriormente, el forespore
es engullido por la clula madre para
formar una espora completamente
madura. Sorprendentemente, cuando
los nutrientes estn disponibles la
espora puede convertir rpidamente
en una clula que crece activamente
[23 - 25]. Para explorar si Relacin
afecta la esporulacin, se indujeron
clulas de B. subtilis a esporular en
presencia o ausencia de Relacin y se
monitoriz la progresin de
esporulacin observando la formacin
de septos polares. De hecho, la
esporulacin se inhibi en gran
medida, con septos asimtricos
exhibidos por slo 8% y 0,5% de las
clulas tratadas con 200 mM y 1 mM
de Relacin, respectivamente. En
comparacin, el 47% de las clulas
no tratadas mostraron los septos
polares en el mismo punto de tiempo
(Figura 4A). En lnea con estas
observaciones, Relacin redujo el
nmero de clulas que expresan
temprano (SpoIIE), medio (SpoIIQ) y
finales (SspE) esporulacin de
protenas especficas a lo largo del
proceso [25] (Figuras 4B y S6).
Posteriormente, se midi una cada
de cinco veces en la formacin de
esporas resistentes al calor maduras
a la concentracin de Relacina ms
alta (Figura 4A y 4C).
Sorprendentemente, la adicin de
Relacin a clulas esporuladas en
diferentes puntos de tiempo, hasta
seis horas despus de la induccin
de la esporulacin, inhibi
fuertemente la formacin de esporas
independientemente del tiempo de
adicin (Figura 4E). Estos hallazgos
indican que la seal ppGpp es crucial
a lo largo de toda la ruta de
esporulacin, y demuestran la
potencia de Relacin para impedir este
proceso. Es importante destacar que
la formacin de esporas en la
bacteria patgena Bacillus anthracis,
el agente causante de la enfermedad
del ntrax, fue inhibida por Relacin de
una manera similar (Figura 4D),
estableciendo el compuesto como un
inhibidor general del proceso de
esporulacin de Bacilli.
Dado que se ha informado de que las
clulas mutantes relA fallar en formar
adecuadamente las estructuras de
biopelculas multicelulares [2], el
efecto de Relacin sobre la capacidad
de las clulas de B. subtilis para
producir biofilms se evalu. De
hecho, se visualiz una pelcula
interrumpida en la interfaz aire /
lquido de los cultivos celulares
permanentes cultivados en presencia
del compuesto (Figura 5A). Es
importante destacar que el efecto
sobre la formacin de biofilm se
encontr ser dependiente de la dosis
(Figura 5A]. De acuerdo con esta
observacin, Relacin tambin inhibi
el desarrollo de biofilm en medio
slido, dando lugar a la formacin de
colonias con alteracin de la
morfologa que eran ms pequeos
en tamao que los no tratados
(Figura 5B]. Para visualizar el
ensamblaje celular dentro de la
pelcula de biofilm en mayor
resolucin con el tratamiento con
Relacin, aprovechamos una cepa que
albergaba el promotor rrnE fusionado
a gfp.

Figura 1. Relacina inhibe la actividad de las protenas Rel. (A)

Estructura qumica de Relacin. (B-C) La relacina inhibe (p) la sntesis
de ppGpp in vitro. Los autoradiogramas representativos de la
cromatografa en capa fina de PEI que muestran una disminucin en
(p) ppGpp marcada a partir de un precursor de 32P-GTP mediante
RelA (E. coli) (B) purificado o Rel / Spo (D. radiodurans) (C) con
aumento Concentraciones de Relacina, segn se indica (ver Materiales
y Mtodos). Se muestra el promedio de duplicados de un experimento
representativo. Las barras de error representan el rango (D) Relacin
inhibe (p) la sntesis de ppGpp en clulas vivas de B. subtilis (PY79).
La acumulacin de (p) ppGpp en respuesta a la inanicin de
aminocidos, inducida por la adicin de SHX, se monitoriz en
ausencia o presencia de concentraciones crecientes de Relacina, como
se indica. El nivel de (p) ppGpp se determin usando cromatografa en
capa fina de PEI como en (B-C) (vase Materiales y Mtodos). Se
muestra el promedio de duplicados de un experimento representativo.
Las barras de error representan el rango. Doi: 10.1371 /
journal.ppat.1002925.g001

Figura 2. El efecto de Relacin sobre la interaccin Rel-ribosomas. (A)

Relacin inhibe la disociacin de Rel / Spo del ribosoma. La cantidad
relativa de Rel / Spo (D. radiodurans) unida a ribosomas purificados se
cuantific despus de la adicin de niveles crecientes de Relacin. Las
molculas Rel / Spo asociadas con los complejos 70S se detectaron por
anlisis de transferencia Western (ver Materiales y Mtodos).
Histograma indica el promedio de dos repeticiones biolgicas
independientes. Las barras de error representan el rango. (B)
Inhibicin independiente del ribosoma de la sntesis (p) ppGpp. Se
trat la protena RelAC638F (E. coli) independiente de ribosomas,
constitutivamente activa, con concentraciones crecientes de Relacina,
como se indica (ver Materiales y Mtodos) en presencia o ausencia de
ribosomas aislados. Se muestra el promedio de duplicados de un
experimento representativo. Las barras de error representan el rango.
Doi: 10.1371 / journal.ppat.1002925.g002

Este promotor se encontr ser pelculas de biofilm por microscopa

constitutivamente activa [27], y por lo de barrido lser confocal revel que
tanto informes de viabilidad celular y las clulas no tratadas formaban
localizacin. La observacin de capas homogneas de biofilm,
mientras que las pelculas celulares Respuesta Rigorosa a lo largo de
tratadas contenan grandes lagunas, este proceso. Finalmente,
indicando su estado desintegrado demostramos que Relacin afecta la
(Figura 5C). Por otra parte, la tincin produccin de comunidades de
de la biopelcula con yoduro de biofilms multicelulares, formadas en
propidio (PI), indicativo de clulas respuesta a condiciones desafiantes.
inviables, mostr la seal de ser ms Tomados en conjunto, presentamos
alto dentro de la biopelcula tratada evidencia de que Relacin impide las
(Figura 5E]. Por ltimo, la vas de supervivencia bacteriana a
cuantificacin de la fluorescencia largo plazo, colocando el compuesto
GFP de las pelculas recuperadas como un nuevo agente antibacteriano
revel una clara reduccin en la prometedor.
biomasa viable sobre el tratamiento
Utilizando la estructura cristalina de
con Relacin, ya que el nivel de
Rel / Spo de S. equisimilis, pudimos
fluorescencia medido se redujo
modelar la interaccin de Relacin con
significativamente (Figura 5D). En
residuos de aminocidos localizados
conjunto, concluimos que Relacin
dentro del sitio Rel / Spo sintetasa.
interfiere con la formacin de biofilm,
Este anlisis produjo la identificacin
una va bacteriana alternativa de
de un supuesto modo de unin de
desarrollo.
Relacin, presumiblemente adoptando
la conformacin mostrada en la
Figura S1C. En esta conformacin,
Discusin
Relacin forma una red de enlaces de
En este informe, establecimos hidrgeno y las interacciones
Relacin como un nuevo agente hidrofbicas que son ms propensos
antibacteriano. Al interferir a proporcionar una unin ms eficaz
especficamente con la activacin de en comparacin con los inhibidores
la respuesta estricta, Relacin perturba previamente identificados que
el cambio en fase estacionaria en muestran menor actividad [19].
varias bacterias Gram positivas
ensayadas y conduce a la muerte
bacteriana. Aunque Relacin no afect
el crecimiento y la supervivencia de la
E. coli Gram negativa, se encontr
que efectivamente inhibe la E. coli
RelA in vitro, lo que implica que la
mejora de la entrega de Relacin a
bacterias Gram negativas puede
conducir a un resultado efectivo. Se
encontr que la relacina bloqueaba
todas las etapas ensayadas de la
esporulacin de B. subtilis,
demostrando la esencialidad de la
Figura 3. Relacina afecta el
crecimiento bacteriano y la
supervivencia. (A) Relacin influye en
la entrada en fase estacionaria. Se
muestran las curvas de crecimiento
Tipo B. subtilis (PY79) cultivadas en
medio CH a 37uC en ausencia o
presencia de concentraciones
crecientes de Relacina a~nadidas a
OD600 0,2. (SEGUNDO) Relacina
ejerce un efecto txico. La viabilidad
de las clulas de B. subtilis (PY79)
se evalu contando unidades
formadoras de colonias (CFU)
despus de 24 horas de incubacin
En medio CH a 37uC en ausencia o
presencia de concentraciones
crecientes de Relacina a~nadidas a
OD600 0,2. Se muestra un
experimento representativo, En el
que SD se calcul a partir de al
menos tres repeticiones para cada
concentracin. (C) Efecto a largo
plazo del tratamiento con Relacin. El
efecto de Relacin (2 mM). Sobre la
viabilidad de clulas de B. subtilis
silvestres (PY79) o clulas DrelA
(ME215). Las clulas se incubaron
en medio CH a 37 C, y la viabilidad
fue Determinada contando unidades
formadoras de colonias (CFU). Se
aadi relacina a OD600 0,2. Se
muestra un experimento
representativo, en el que SD fue
Calculado a partir de al menos tres
repeticiones para cada punto. (D) El
efecto txico de Relacin en GAS. El
efecto de Relacin (2 mM) en la
viabilidad del tipo salvaje GAS
(JRS4), incubado en THY medio a
37uC, se evalu como en (C).
Y las interacciones hidrfobas que
tienen ms probabilidades de
proporcionar Un enlace ms eficaz
en comparacin con los
identificados previamente
Inhibidores de menor actividad [19].
La relacina parece dirigirse
especficamente a las protenas Rel,
ya que el efecto de El compuesto
fue casi indetectable cuando se
prob en Rel / Spo Clulas
mutantes. Consistentemente, la
actividad de Relacin in vivo result
en una En la sntesis de (p) ppGpp.
Dado que ppGpp inhibe la enzima
Inosina monofosfato
deshidrogenasa, causa que el GTP
celular Niveles a disminuir [28]. Los
niveles intracelulares de GDP / GTP
son Conocidos para determinar la
iniciacin de varias Vas como la
esporulacin y la formacin de
biofilm [26, 29, 30] Que de hecho se
mostr influenciado por Relacin.
Curiosamente, Tambin observamos
que el tratamiento con Relacin
result en una gran disminucin En
la capacidad Rel / Spo de disociarse
de los ribosomas in vitro. Esta
Deficiencia podra explicarse por el
modelo propuesto por Wendrich Et
al., [10] en los que la rpida
acumulacin de ppGpp durante
amino El hambre cida se atribuye a
la capacidad de RelA para 'saltar'
entre Ribosomas. Este salto
potencial es probablemente una
consecuencia de la Sntesis de (p)
ppGpp que libera RelA del ribosoma,
Liberndolo para otro ciclo de
sntesis. La aparicin de resistencia
bacteriana a la actual serie de
Agentes antimicrobianos exige el
desarrollo de estrategias novedosas
Para erradicar las bacterias
patgenas. El antibitico celular
tradicional Incluyen ribosomas,
constituyentes de la pared celular y
componentes Sntesis de cidos
nucleicos [31]. Estos objetivos
celulares son principalmente Activa
durante la fase vegetativa
bacteriana, haciendo disponible la
Antibiticos eficaces principalmente
durante el crecimiento. Sin
embargo, la capacidad de Bacterias
para que residan en la naturaleza
dentro de las comunidades Las
esporas duraderas, as como a ser
persistente a los antibiticos
Tratamiento [32], establece la
necesidad de abordar estos modos
alternativos. En En este sentido,
Relacin afecta especficamente a la
Respuesta Va crucial para la
activacin de estrategias de
supervivencia bacteriana. Puesto
que Relacin puede persistir durante
un perodo relativamente largo de
tiempo, y Incluso algunos das
despus de la adicin, podra
convertirse en un Valioso
antagonista de estos enfoques de
supervivencia a largo plazo. Tomado
Conjuntamente, Relacin puede
combinarse con antibiticos
actualmente Uso, para erradicar
poblaciones bacterianas no
homogneas con clulas Residiendo
en diversos ciclos de vida. Los
componentes celulares, que se
conservan Bacterial y crucial para la
supervivencia celular, proporcionan
Antimicrobianos atractivos, siempre
y cuando carezcan de eucariotas
Contrapartes Uno de estos objetivos
es el altamente conservado
bacteriano De la divisin celular de
tipo tubulina FtsZ, que proporciona
la base El montaje de la maquinaria
de divisin [33]. De hecho, una
Inhibidor de FtsZ con actividad
potente y selectiva contra
Staphylococci se ha descrito [34].
De manera similar, el La ubicuidad
de las enzimas Rel entre las
bacterias, combinada Ausencia de
(p) ppGpp sintetasas conocidas en
clulas de mamfero [35, 36],
fortalecer el potencial de Relacin
para convertirse en un Antibitico
teraputico. La profunda influencia
de Relacin en el largo La
supervivencia bacteriana a largo
plazo hace que sea un compuesto
atractivo para servir como Un
andamio para generar una serie de
nuevos agentes antibacterianos.
Materiales y mtodos
Sntesis y modelizacin de
Relacin
Sntesis de Relacin y un modelo
estructural para su interaccin Con
Rel / Spo (p) ppGpp sintetasa
vinculante bolsillo se describen en
Detalles Texto S1.
Condiciones de crecimiento
bacteriano
Las cepas bacterianas utilizadas en
este estudio se describen en la
Tabla S1. La construccin del
plsmido se describe en el Texto S1.
Todos los mtodos generales Para B.
subtilis se llevaron a cabo como se
describe anteriormente [37].
SEGUNDO. Subtilis clulas fueron
cultivadas en la casena hidrolizada
(CH) a 37uC [37], A menos que se
indique lo contrario. GAS se cultiv
a 37C Sin agitacin en medio Todd-
Hewitt suplementado con 0,2%
Extracto de levadura (THY) [38]. Las
clulas de D. radiodurans R1 se
cultivaron en TYG que contiene:
0,5% de triptona, 0,3% de extracto
de levadura y 0,1% De glucosa a
30C con agitacin. Las clulas de E.
coli se cultivaron a 37uC en LB
medio. Los cultivos se inocularon a
una OD _ {600} de 0,05 usando Un
cultivo durante la noche cultivado
en el mismo medio, a menos que se
indique diferentemente.
Condiciones de esporulacin y
colonia de biofilm y plula
Formacin se describen en el texto
S1.
Purificacin de protenas Rel
y ribosomas crudos
Purificacin de RelA o RelA-C638F de
E. coli (CF9467) Albergando DrelA y
sobreexpresando pQE30-RelA o
pQE30- RelA-C638F,
respectivamente, se llev a cabo
como se ha descrito anteriormente
[19]. La purificacin de Rel / Spo de
D. Radiodurans R1 fue Realizadas en
condiciones idnticas; Sin embargo,
la protena fue Expresada en clulas
E. coli BL21 CodonPlus (Stratagene).
De nota, Rel / Spo de D.
Radiodurans R1, es el nico largo
conocido Protena activa purificada
de bacterias Gram positivas.
Aislamiento de Ribosomas crudos
(que contienen 70S, mRNA, tRNA)
de E. coli (CF9467) se llev a cabo
como se describe anteriormente
[19]. Aislamiento De ribosomas
crudos de D. Radiodurans se llev a
cabo en un Similar con las
siguientes modificaciones: D.
radiodurans R1 Las clulas se
cultivaron en LB (+) durante la
noche a 30 C, las clulas se
diluyeron 1: 100 en medio LB (+) y
se incubaron a 30C para 48 horas.
Medicin (p) de la sntesis
ppGpp in vitro
Para la medicin (p) de la sntesis
ppGpp por RelA, RelA-C638F o
Protenas Rel / Spo in vitro: 1 mg de
protena Rel purificada, 20 mg de
Ribosomas aislados y 10 mCi de a-
32P marcado GTP, se mezclaron En
un tampn [GTP 0,5 mM, ATP 4 mM,
Tris-HCl 50 mM (PH 7,4), DTT 1 mM,
MgCl _ {2} 10 mM, KCl 10 mM y 27
mM (NH _ {4}) _ {2} SO _ {4}]
hasta un volumen final de 20 ml sin
o con Cantidades crecientes de
Relacin como se indica. Las
reacciones fueron Se detuvo
mediante la adicin de 5 ml de
cido frmico. Cada reaccin fue (5
ml) y se separaron en placas de TLC
de celulosa PEI (Merck) Usando
KH2PO4 1,5 M como fase mvil. Las
placas se autorradiografiaron
Utilizando el Fijix Bas100
PhosphorImager (Japn). (P) se
midi la seal ppGpp usando el
software TINA 2.0 (Raytest,
Strauben-Hardt). La cantidad total
de (p) ppGpp fue la suma de
Seales de ppGpp y pppGpp.
Medicin (p) de la sntesis
ppGpp in vivo
Se cultivaron clulas B. subtilis
(PY79) o E. coli (W3110) en MOPS
Glucosa medio mnimo [39]
suplementado con todos los amino
Excepto glutamina y glutamato. A
OD _ {600} 0,1, las clulas fueron
Suplementado con H3 32PO4 y se
incubaron durante 45 minutos,
Despus de lo cual se aadi
Relacin a las concentraciones
indicadas. Las clulas se incubaron
durante 15 minutos adicionales. A
continuacin, amino Se indujo el
hambre por adicin de serina-
hidroxamato (SHX, Sigma) 1 mg / ml
[20]. Se retiraron muestras de diez
Minutos despus de la adicin de
SHX y se analizaron para su (p)
ppGpp
Figura 4. Relacina influye en el
proceso de esporulacin en Bacilli.
(A) La relacina inhibe la
esporulacin. Imgenes
microscpicas de esporulacin de
tipo salvaje B. Subtilis (PY79) en
ausencia o presencia de Relacina,
a~nadida en el tiempo 0 de
esporulacin a las concentraciones
indicadas. Paneles superiores:
clulas a t = 2 horas De
esporulacin teida con el colorante
de membrana fluorescente FM1-43.
Las flechas indican la posicin de los
septos polares. Paneles inferiores:
imgenes de contraste de fase de
Clulas a t = 24 horas de
esporulacin. Las barras de escala
corresponden a 1 mm. (B) La
relacina inhibe la expresin de la
protena de esporulacin media
SpoIIQ. Fluorescencia Imgenes
microscpicas de clulas de B.
subtilis (PE128) que albergan
spoIIQ-gfp a t = 4 horas de
esporulacin, en ausencia (paneles
superiores) o presencia (paneles
inferiores) De Relacin (1 mM),
a~nadido en el tiempo 0 de
esporulacin. Se muestran el
contraste de fase (rojo), la
fluorescencia GFP (verde) y las
imgenes de superposicin. Barra
de escala
Corresponde a 1 mm. (C-D) Relacin
inhibe la formacin de esporas de
Bacilli. La formacin de B. subtilis
resistente al calor (PY79) (C) y B.
anthracis (Sterne) (D) Se control en
ausencia o presencia de Relacina,
a~nadida a las concentraciones
indicadas en el tiempo 0 de
esporulacin (vase el texto S1). Se
muestran Representativos, en los
que SD se calcul a partir de al
menos tres repeticiones para cada
concentracin. (E) Relacina aadida
en diferentes puntos temporales
Durante la esporulacin inhibe la
formacin de esporas. La inhibicin
de la formacin de esporas por
clulas de B. subtilis (PY79) de tipo
salvaje se evalu despus de la
adicin de Relacion (1 mM) en los
momentos indicados de
esporulacin. La inhibicin se
determin usando un ensayo de
resistencia trmica (vase el texto
S1) y se expres en relacin con Sin
tratar. Se muestra un experimento
representativo, en el que SD se
calcul a partir de al menos tres
repeticiones para cada punto de
tiempo. Doi: 10.1371 /
journal.ppat.1002925.g004
Medicin de la asociacin Rel / Spo-
70S
La reaccin se llev a cabo como se
ha descrito anteriormente para
Midiendo (p) la sntesis de ppGpp in
vitro, sin la adicin de GTP
radiomarcado, con o sin cantidades
crecientes de Relacina como se
indica. Las reacciones se
centrifugaron durante 4 horas a
35.000 g (4uC), fracciones
ribosmicas se separaron en un
12% SDS - electroforesis en gel de
poliacrilamida, transferida a PVDF
(Millipore Bedford) y se procesaron
para la inmunorreaccin Usando
anticuerpo anti-His de ratn (1:
10.000; Amersham). Las protenas
inmunorreactivas se detectaron
usando una quimioluminas

Microscopio fluorescente Figura 5. Relacina afecta la

La microscopa de fluorescencia se
llev a cabo como se ha descrito
anteriormente [40]. Se retiraron
muestras (0,5 ml) de un cultivo
dado, se centrifugaron Brevemente,
y se resuspendieron en 10 ml de
PBS61 (tampn fosfato Salino)
suplementado con 1 mg / ml de
tincin de membrana FM1-43 o FM4-
64 (Molecular Probes, Invitrogen).
Las clulas fueron visualizadas y
Fotografiado utilizando un
microscopio Axioplan2 (Zeiss)
equipado con Cmara CoolSnap HQ
(Photometrics, Roper Scientific) o
una Microscopio Axioobserver Z1
(Zeiss) equipado con un CoolSnap
Cmara HQII (Photometrics, Roper
Scientific).
formacin de biofilm en Bacillus
subtilis. (A) La relacina inhibe la
formacin de biofilm de la pelcula.
Las clulas de tipo B. subtilis (3610)
silvestres Se indujeron a formar
biofilms en cultivos permanentes
lquidos en ausencia o presencia de
Relacina a las concentraciones
indicadas (vase el Texto S1).
Culturas Fueron fotografiados
despus de 3 das. La barra de
escala corresponde a 5 mm. (B)
Relacin inhibe la formacin de
colonias de biofilm. Las clulas de B.
subtilis (3610) de tipo salvaje fueron
Inducida a formar biofilms en medio
slido, en ausencia o presencia de
Relacin (1 mM) (vase el texto S1).
Las colonias se fotografiaron
despus de 24 horas. La barra de
escala corresponde a 3 mm. (C) La
relacina provoca la desintegracin
del biofilm. B. subtilis (YA224)
clulas que albergan PrrnE-gfp
fusin se indujeron a formar Biofilm
en cultivos permanentes lquidos en
ausencia o presencia de Relacin (1
mM) como se indica (vase el Texto
S1). Los biofilms se visualizaron
despus de 3 das usando
Microscopa confocal (ver Materiales
y Mtodos). La seal verde
corresponde a GFP producida a
partir de PrrnE. La barra de escala
corresponde a 50 mm. (D) Relacin
Reduce la biomasa del biofilm. Las
clulas de B. subtilis (YA224) que
albergan la fusin de PrrnE-gfp se
indujeron para formar biofilm en
cultivos permanentes lquidos en
ausencia o Presencia de Relacin (1
mM) como se indica. Las pelculas
de biofilm se desintegraron y la
biomasa celular se evalu mediante
mediciones de fluorescencia GFP y
Se visualiza en unidades arbitrarias
[AU] (vase el texto S1). Se muestra
el promedio de dos repeticiones
biolgicas independientes. Las
barras de error representan el
rango. (MI)
La relacina conduce a la muerte
celular dentro del biofilm. B. subtilis
(YA224) clulas que albergan PrrnE-
gfp fusin se indujeron a formar
biofilm en estado lquido Cultivos en
ausencia o presencia de Relacin (1
mM) como se indica (vase el texto
S1). Despus de 3 das, los biofilms
se tieron con PI para indicar la
muerte celular y Observado por
microscopa confocal (ver Materiales
y Mtodos). Se muestra la
fluorescencia GFP producida a partir
de PrrnE (verde), tincin PI (rojo) y
superposicin
Imgenes. La barra de escala
corresponde a 50 mm.
Doi: 10.1371
journal.ppat.1002925.g005
Microscopa confocal de barrido
lser
Para la observacin de pelculas de
biofilm, el medio de pelculas de 3
das En placas de microplaca se
retir suavemente y se PBS 61 con o
sin 10 mg / ml de PI (Molecular
Probes,Invitrogen). Las clulas
fueron visualizadas y fotografiadas
Usando un microscopio confocal de
fluorescencia de barrido lser
LSM700 (Zeiss).
El control del sistema y el
procesamiento de imgenes se Zen
2009 (Zeiss) y MetaMorph 7.2r4
(Molecular Devices)Softwares
informacin de soporte
Figura S1 Sntesis de Relacin, un
nuevo anlogo ppGpp.
(A) Estructura qumica de ppGpp.
(B) Sntesis qumica de Relacin.
Condiciones de reaccin: i)
anhdrido Boc, THF / sodio acuoso
Bicarbonato, RT, 4 horas 77%; Ii)
Alcohol benclico, p-toluenosulfnico
cido, tolueno, reflujo, 5 horas,
95%; Iii) HOBT / HBTU, DMF
DIEA, RT, durante la noche. 98%; Iv)
50% de TFA en DCM, RT, 30
minutos, 86%; V) a) cloruro de
trimetilsililo, piridina, 0uC, 1 hora, b)
anhdrido isobutrico, RT, 4 horas,
87%; Vi)
a) CDI, Acetonitrilo, RT, durante la
noche, b) (4), DCM, DIEA, RT, 20
horas,
48%; Vii) H _ {2}, Pd al 10% / C,
metanol, 3 horas, RT, 30 psi, 80%.
(DO)
Bases estructurales de unin e
/ inhibicin de Rel / Spo por Relacin.
UN Modelo putativo que describe
cmo Relacin (palos, coloreados de
acuerdo a El esquema cpk) se une
en el sitio de unin al PIB conocido
de Rel / Spo Protena de
Streptococcus equisimilis (se
muestra como blanco transparente
Superficie y dibujos animados).
Relacin tambin forma contactos
adicionales con Rel / Spo en el sitio
activo. El PIB se muestra en lneas
negras para
Comparacin y residuos de Rel / Spo
que forman enlaces de hidrgeno
Los contactos con el PIB se
muestran en representacin
palpable (vase el texto S1).
La alta afinidad de Relacion puede
explicarse por la extensa Contactos
formados entre el ligando y el
receptor. El ligando Ocupa un
volumen considerable de la bolsa de
encuadernacin, incluyendo
Tanto los sitios vinculantes del PIB,
como las regiones adicionales. en
adicin
A una gama de enlaces de
hidrgeno mediada por el conjunto
muy polar Bolsillo, el grupo
isobutirilo hidrofbico contacta con
un Hidrfobo se muestra como
puntos negros.
(TIF)
Figura S2 Efecto de Relacin sobre (p)
ppGpp sntesis.
(A) Relacin inhibe RelA in vitro. La
cantidad relativa de ppGpp Y
pppGpp producido por RelA
purificado (E. coli) en ausencia o La
presencia de Relacina en las
concentraciones indicadas se
calcul De autorradiogramas de
cromatografa en capa fina de PEI,
correspondiendo
A la figura 1B. Se muestra el
promedio de duplicados de un
Representativo. Las barras de error
representan el rango. (SEGUNDO)
Relacin inhibe Rel / Spo in vitro. La
cantidad relativa de ppGpp
Y pppGpp producido por Rel / Spo
purificado (D. radiodurans) en el
Ausencia o presencia de Relacin a
las concentraciones indicadas fue
Calculado a partir de
autoradiogramas de cromatografa
en capa fina de PEI,
Correspondiente a la figura 1C. Se
muestra el promedio de
Duplicados de un experimento
representativo. Las barras de error
representan la distancia. (C) La
relacina no inhibe (p) la sntesis de
ppGpp en E. vivo. Coli. La
acumulacin de (p) ppGpp en
respuesta al aminocido De hambre,
inducido por SHX, se control en
ausencia o Presencia de
concentraciones crecientes de
Relacin. El (p) ppGpp Se determin
mediante cromatografa en capa
fina de PEI de Radiomarcado (p)
ppGpp (vase Materiales y
Mtodos). Histograma Indica el
promedio de dos repeticiones
biolgicas independientes. Error
Barras representan el rango.
(TIF)
Figura S3 Efecto de la Relacina en la
supervivencia de B. subtilis Crecido
en medio mnimo. La supervivencia
de B. subtilis de tipo salvaje (PY79)
cultivadas en medio S7 mnimo se
determin mediante UFC contando
despus de 9 y 24 horas de
incubacin en ausencia O presencia
de Relacin (2 mM), como se indica.
Se aadi Relacion al OD600 0,2. Se
muestra un experimento
representativo, en el que SD Se
calcul a partir de al menos tres
repeticiones para cada punto.
(TIF)
Figura S4 El efecto txico de Relacin
es visible. (A - B) B.
Subtilis (PY79) clulas fueron
cultivadas en medio CH a 37uC en
ausencia
(Paneles superiores) y presencia
(paneles inferiores) de Relacin (1
mM), se a~nadi
A OD600 0,2. Las clulas se tieron
con indicadores de viabilidad SYTO9
(Verde, destaca las clulas vivas) y
PI (rojo, destaca las clulas
muertas) en
9 horas (A) y 24 horas (B) de
incubacin. Se muestra el contraste
de fase
Imgenes (paneles de la izquierda)
y imgenes de fluorescencia de
superposicin de Live / Dead
(derecha Paneles). Cabe destacar
que algunas de las clulas
desintegradas no se tieron con
Cualquiera de los colorantes. La
barra de escala corresponde a 1
mm.
(TIF
Figura S5 Relacina afecta el
crecimiento y la supervivencia de
Bacterias Gram positivas. (A) Efecto
de la Relacina en el crecimiento
De GAS. Se muestran curvas de
crecimiento de GAS de tipo natural
(JRS4)
Clulas cultivadas a 37uC sin
agitacin en medio THY en el
Ausencia o presencia de
concentraciones crecientes de
Relacin
Aadido a OD600 0,2. (B) Efecto de
Relacin en la supervivencia de GAS.
El efecto de Relacin, en las
concentraciones indicadas, en
Supervivencia de las clulas GAS
(JRS4) cultivadas a 37uC sin
agitacin en
THY medio se determin por el
recuento de UFC de
Y cultivos no tratados. Se aadi
relacina a OD600 0,2.
Se muestra un experimento
representativo, en el que SD fue
Calculado a partir de al menos tres
repeticiones para cada
concentracin. (C) Efecto de Relacin
sobre el crecimiento de D.
radiodurans. Se muestran Curvas de
crecimiento de tipo D. radiodurans
R1 cultivadas en TYG
Medio a 30 C en ausencia o
presencia de Relacina en el
Concentraciones indicadas aadidas
a OD600 0,2. (D) Efecto de Relacin
sobre la supervivencia de D.
radiodurans. El efecto de Relacion,
en el Concentraciones indicadas,
sobre la supervivencia de D.
radiodurans de tipo salvaje R1
cultivadas a 30 C en medio TYG se
determin mediante CFU de los
cultivos tratados y no tratados.
Relacion fue Aadido a OD600 0,2.
Se muestra un experimento
representativo, en
Que se calcul a partir de al menos
tres repeticiones para cada punto.
(TIF)
Figura S6 Efecto de Relacin sobre la
expresin de Y esporulacin tarda
protenas especficas. (A)
Fluorescencia Imgenes
microscpicas de clulas de B.
subtilis (SB201) que albergan spoIIE-
gfp
Fusin a t = 2 horas de
esporulacin, en ausencia (paneles
superiores) Y presencia (paneles
inferiores) de Relacin (1 mM),
aadido al tiempo 0 De
esporulacin. Se muestran las
clulas teidas con membrana FM4-
64 Colorante (rojo), fluorescencia
SpoIIE-GFP (verde) y imgenes de
superposicin.
La barra de escala corresponde a 1
mm. (B) Microscopa de
fluorescencia Imgenes de B.
subtilis (ES7) clulas que albergan
sspE-gfp fusin en T = 5 horas de
esporulacin, en ausencia (paneles
superiores) y Presencia (paneles
inferiores) de Relacin (1 mM),
aadido en el tiempo 0 de
Esporulacin. Se muestran el
contraste de fase (rojo), la
fluorescencia SspE-GFP (Verde) y
imgenes de superposicin. La
barra de escala corresponde a 1
mm.
(TIF)
Texto S1 Informacin suplementaria,
incluida una tabla As como
procedimientos experimentales valiosa y discusiones,
adicionales y Referencias. especialmente a A. Rosenberg
(DOCX) Y E. Segev para las cepas
Expresiones de gratitud contribuyentes y G. Mamou para la
Agradecemos a R. Losick (Harvard ayuda tcnica. Relacin es objeto de
U), A. Rouvinski (Hebreo U) y B. una solicitud provisional de patente:
Traag (Harvard U) para comentarios aplicacin No. 61 / 431,902 01/2011
sobre los manuscritos. Estamos
agradecidos a M.
Ravins (Hebreo U), C. Bloque y R.
Nir-Paz (Centro Mdico
Hadassah)Para obtener ayuda
tcnica. Damos las gracias a C.
Bloque (Hadassah Medical Center),
M. Cashel (NIH), E. Hanski (Hebreo
U) y R. Rudner (Hunter College) por
Proporcionando cepas. Estamos en
deuda con los miembros del Ben-
Yehuda Laboratorio, para ayuda