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Ao del buen servicio al ciudadano

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA


FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA AMBIENTAL

PREPARACIN - DILUCIN DE MUESTRAS AMBIENTALES. ENUMERACIN


DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES.

TERCER LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL- BO-112

JHOSEP ARTETA LAYMITO- 20162549 B

LUIS ANTHONY FERNANDEZ SORIANO 20161213 K

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTN MARTNEZ VILA

Lima, Per
de Mayo de 2017
UNIVERCIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
FACULTAD DE INGENIERIA

INDICE

I. RESUMEN......................................................................................3
I. ABSTRACT.....................................................................................3
II. INTRODUCCIN..............................................................................3
III. OBJETIVOS.....................................................................................4
A. OBJETIVO GENERAL:..........................................................................................4
B. OBJETIVOS ESPECFICOS:....................................................................................4
IV. MARCO TERICO.........................................................................4
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL....................................................6
B. METODOLOGA.............................................................................................7
VII. CONCLUSIONES...........................................................................8
VIII. RECOMENDACIONES....................................................................9
IX. FUENTES DE INFORMACIN............................................................9
BIBLIOGRAFA.....................................................................................9
X. ANEXOS.......................................................................................10

I. Resumen presencia de colonias y proceder a su


respectivo recuento de bacterias viables y
La tercera experiencia de laboratorio nos
analizar si es apta para el consumo humano.
permiti determinar el nmero de bacterias
existentes en la muestra de pescado en el
I. Abstract
cual empleamos una serie de disoluciones en
correctas medidas y en condiciones de The third laboratory experience allowed us to
esterilidad donde se podr determinar la determine the number of bacteria in the fish

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sample in which we used a proceed to their respective bacterial count
series of solutions in correct measurements Feasible and to analyze whether it is fit for
and under sterile conditions where we can human consumption
determine the presence of colonies and

II. Introduccin
Para considerar si la muestra de carne de pescado es apta para el consumo humano se
procede a realizar un anlisis microbiolgico que nos permitir determinar el nmero de
bacterias en la muestra y analizar si es apta para el consumo humano.

El recuento total de bacteria en placa es til para obtener una idea del grado de frescura,
dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. En el caso de los mesfilos aerbicos se
incluyen todas las bacterias mohos y levaduras capaces de desarrollarse en temperaturas
determinadas.

Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o


sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora
patgena. El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos
alimentos.

III. Objetivos
a. Objetivo General:
Determinar la carga microbiana asociada a la muestra de pescado para evaluar
su calidad higinica sanitaria.
b. Objetivos Especficos:
Determinar si el producto alimenticio est en condiciones aptas para el
consumo humano.
Aplicar en la prctica las tcnicas de preparacin y dilucin de muestras para
conseguir un adecuado recuento de microorganismos aerobios mesfilos.
Familiarizarse con mtodos directos para la obtencin de microorganismos
utilizando el mtodo de recuento de colonias en placa.

IV. Marco Terico


MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS

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La cuantificacin de este grupo microbiano permite estimar de forma general
la carga microbiana presente en una muestra, si bien no aporta datos concretos sobre el tipo de
especies predominantes. No obstante, su conocimiento siempre es interesante, ya que su valor es
reflejo de la calidad sanitaria y, adicionalmente, suele proporcionar informacin con respecto a la
existencia de prcticas incorrectas, tales como vertidos o manipulacin inadecuada. Sin embargo,
los datos derivados del recuento de la microbiota aerobia mesfila no deben ser considerados
como parmetros absolutos en cuanto a su valor indicador, ya que un resultado elevado no ha de
ir necesariamente unido a la presencia de microorganismos patgenos o toxinas ni, por el
contrario, un bajo recuento en el nmero de colonias de estas caractersticas se relaciona siempre
con la ausencia de microbiota patgena.
Por tanto, y considerando las reservas anteriormente comentadas, es necesario siempre
determinar la cantidad de microorganismos aerobios mesfilos y extraer las conclusiones
adecuadas de dicha informacin, sin que ello signifique obviar otros anlisis de mayor
especificidad y vala.
TCNICAS DE RECUENTO BACTERIANO
Para el recuento de microorganismos presentes en una muestra de alimento, suelo, agua, aire,
cultivos, entre otros, existen diferentes mtodos o tcnicas. Algunas de estas tcnicas son directas
y permiten un recuento de todas las clulas, tanto vivas como muertas. Las medidas directas
incluyen los recuentos directos al microscopio, recuento en placa, o el nmero ms probable
(NMP).
Otras son las indirectas y miden una propiedad de la masa de las clulas como son la turbidez,
peso seco o una actividad metablica.
FASES DEL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO
Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo:
1. La fase lag en la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en
marcha su maquinaria metablica para poder crecer activamente.

2. La fase exponencial.

3. La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no


significa que no se dividan algunos, sino que la aparicin de nuevos individuos se
compensa por la muerte de otros.

4. La fase de muerte en la que el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma


exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO


Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parmetros. No debemos olvidar
que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan de
forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos podemos medir el resto. Entre los
mtodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar:

TURBIDEZ

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Se basa en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen
microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las clulas en suspensin
y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un espectrofotmetro que mide la cantidad
de luz que transmite una solucin o un cultivo lquido de clulas microbianas. A mayor masa de
clulas en un cultivo, mayor ser su turbidez, y menor la cantidad de luz que se transmitir de
manera que la lectura en el espectrofotmetro ser mayor. Se utiliza en cultivos densos.

RECUENTO DE COLONIAS O RECUENTO ESTNDAR EN PLACA

Es un mtodo muy utilizado cuando se necesita determinar el tamao de la poblacin bacteriana


de una muestra. El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno
desarrollar una colonia visible. Pero debido a que una muestra no es totalmente homognea con
respecto a su composicin microbiolgica, es posible que una colonia se origine de un
microorganismo o de cientos de ellos, dando en este ltimo caso un recuento menor del real.
Tambin es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan crecer en las
condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.). En este caso el recuento
tambin ser inferior al real. Lo que s se sabe es que cada colonia observada se form a partir de
por lo menos un microorganismo. Esta es una condicin necesaria y suficiente. Entonces la
colonia es considera una unidad formadora de colonia (ufc) a los efectos de los clculos.
Se admite, por lo tanto, que, en los mtodos de recuento de microorganismos vivos, son
inevitables los errores. Especialmente cuando se examinan muestras pequeas, es posible
cometer grandes errores.

RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA DE PROFUNDIDAD

Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 35C sobre placa de Petri que contiene
una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la
muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan
tanto dentro del agar como en la superficie. Es un mtodo generalmente utilizado para el recuento
de microorganismos anaerobios facultativos o microaerfilos.

RECUENTO EN PLACA DE SIEMBRA POR EXTENSIN EN SUPERFICIE

Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la muestra sobre la superficie de


un medio de cultivo en placa Petri. En este mtodo todas las colonias crecen sobre la superficie
del medio. Generalmente se utiliza esta tcnica para el recuento de bacterias aerobias.
a. MATERIALES Agar PLATUED COUNT. Es un medio de cultivo
similar al agar nutritivo utilizado para el recuento
de grmenes viables. Hay autores que tambin
Licuadora y vaso de licuadora
utilizan en esta prueba el medio de cultivo agar
Balanza
lactosado con purpura de bromocresol.
Cuchillo
Pinza
V. Procedimiento Experimental
Esptula estril
Tijera
Placas Petri de vidrio
Balanza
Pipeta bacteriolgica de 10ml
Pipeta bacteriolgica de 1ml
Refrigeradora
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Tubos de ensayo
Matraz
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a. METODOLOGA

b.1. Recuento Estndar en Placa o Pour Plate o Recuento en Placa por Siembra de
Profundidad
MTODO 1
1.1. Dilucin
Procedimientos:
1. Pesar 10gr. de muestra en condiciones de asepsia.
2. Homogenizar con 90ml. de solucin diluyente (AP) en licuadora.
3. Realizar disoluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml. de solucin diluyente.
4. Depositar 1.0ml.de cada disolucin en cajas de Petri estriles.

1.2. Siembra:
Procedimientos:
1. Adicionar de 15 a 20 ml de agar (APC) triptona extracto de levadura fundido y enfriado a
45C en placas de Petri estriles conteniendo inculo de 1ml por dilucin.
2. Incubar las cajas en posicin invertida a 35C por 48 horas.
3. Homogenizar la muestra y el agar mediante rotacin y vaivn.
4. Adicionar control de esterilidad:
- Ms 1ml de AP estril y APC (15-20ml)
- Ms APC (15-20ml)
5. Contar aquellas placas que tengan entre 30 a 300 colonias y reportar con ufc/gr.

Recuento en Placa de Siembra por extensin en Superficie o Diseminacin

MTODO 2
Dilucin:
Procedimientos:
1. Pesar 10gr de muestra en condiciones de asepsia.
2. Homogenizar con 90ml de solucin diluyente (AP) en licuadora.

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3. Realizar disoluciones decimales empleando tubos con 9.0ml de solucin
diluyente.
4. Adicionar previamente de 15 a 20ml de agar (APC) triptona extracto de levadura fundido y
enfriado a 45C en placas Petri estriles y dejar solidificar el APC.
5. Depositar 0,1 ml de cada disolucin en cajas Petri estriles.
Siembra:
Procedimientos:
1. Para la siembra por diseminacin emplear la esptula de Drigalsky.
2. Dejar secar superficie de placa por 10min.
3. Incubar las cajas en posicin invertida a 35 C por 72h.
4. Adicionar control de esterilidad:
- Ms 1ml de AP estril y APC (15-20ml)
- Ms APC (15-20ml)
5. Contar aquellas placas que tengan entre 30 a 300 colonias y reportar con ufc/gr.

VI. RESULTADOS

METODO DILUCION N DE COLONIAS


1 10-1 +300
1 10-2 266
1 10-3 135
1 10-4 87
1 10-5 33
1 APC 187
1 APC + AP 0
2 10-1 +300
2 10-2 224
2 10-3 116
2 10-4 14
2 10-5 3
2 APC 190
2 APC + AP 3

VII. CONCLUSIONES

Existen diversos mtodos para contar colonias, el que se utiliza ms es el Pour Plate; sirve para
hacer el anlisis cuantitativo como el cualitativo.

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VIII. RECOMENDACIONES

Se debe esterilizar los materiales previamente en autoclave (120C, 30).


Hacer uso del mechero para mantener estril los objetos y el medio que se va a
emplear.
Se debe realizar la inoculacin con una pipeta estril de 1,0 ml.
Se debe hacer uso del Asa de Digrasky para extender el inoculo lquido.

IX. FUENTES DE INFORMACIN

Bibliografa

Medios de cultivo para Microbiologa . (1981). Barcelona: ADSA = MICRO.


Romero Martines , M., Esquivel Len , J. I., Alvarado Cruz, F. G., Montes de Oca, R. C., &
Rangel Valdez, M. L. (6 de junio de 2012). Microbiologia. Obtenido de
Microbiologia: http://realisaciondeanalisis.blogspot.pe/

X. ANEXOS

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X.APENDICE
DIAGRAMA DE FLUJO

MTODO 1
1. DILUCION

Pesar 10 gr de Realizar disoluciones decimales


muestra en empleando tubos con 9 ml de
condiciones de solucin diluyente

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Muestra 9,0 ml 9,0 ml 9,0 ml 9,0 ml 9,0 ml

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Homogenizar con 90
ml de solucin
diluyente AP en la 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
licuadora

2. SIEMBRA

Depositar 1,0 ml de cada solucin en las


placas Petri

Agregar de 15-20 ml de agar (APC) en las placas


Petri estriles

Homogenizar la muestra
AP mediante rotacin

AP + APC Incubar las cajas en posicin invertida a 35C por

MTODO 2
1 DILUCION

Pesar 10 gr de Realizar disoluciones decimales


muestra en empleando tubos con 9 ml de
condiciones de solucin diluyente

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Muestra 9,0 ml 9,0 ml 9,0 ml 9,0 ml 9,0 ml

Homogenizar con 90
ml de solucin
diluyente AP en la
10
licuadora
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10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

2. SIEMBRA

Depositar 1,0 ml de cada solucin en las


placas Petri

Agregar de 15-20 ml de agar (APC) en las placas


Petri estriles

Homogenizar la muestra
mediante rotacin Y
AP haciendo uso del Asa de
Digrasky

Incubar las cajas en posicin invertida a 35C por


AP + APC

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