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Cromatografa de lquidos

La cromatografa de lquidos tiene un potencial de aplicaciones ms amplio debido a que el 85 por


ciento de los compuestos conocidos no lo son suficientemente voltiles o estables como para ser
separados por cromatografa de gases.

La riqueza acumulada por la teora de la cromatografa en especial de parte de la cromatografa de


gases, ha conducido al desarrollo de los mtodos de cromatografa de lquidos de alta eficiencia
(HPLC, high performance liquid chromatography) que rivaliza en eficiencia con la cromatografa de
gases y permite hacer separaciones y mediciones en cuestin de minutos.

La aplicacin de la HPLC en la industria de la farmacutica se convirti en el pilar de los


laboratorios farmacuticos en la dcada de 1970, y hoy en da en el mercado de nuevos
instrumentos de HPLC es mayor que el ms maduro de la cromatografa de gases.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 604 Cromatografa de lquidos

La cromatografa de lquidos es importante porque la mayora de los compuestos no son


suficientemente voltiles para que se les pueda aplicar la cromatografa de gases. La
cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC) utiliza una presin elevada para forzar al
disolvente a que pase por una columna que contiene partculas muy finas, consiguiendo as
separaciones de gran resolucin

El equipo de HPLC que se muestra a continuacin consta de un sistema de suministro de


disolvente, una vlvula de inyeccin de muestra, una columna de alta presin, un detector y un
ordenador para controlar el equipo y visualizar los resultados
Anlisis Qumico Cuantitativo, 3 edicin, Daniel C. Harris. Pg. 608 Cromatografa de lquidos.
Equipo para una cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC) Anlisis Qumico Cuantitativo,
3 edicin, Daniel C. Harris. Pg. 608 Cromatografa de lquidos.

Cromatografa de lquidos de alta eficiencia.

En 1964 J. Calvin Giddings, de la universidad de Utah publico el artculo Comparacin entre el


limite terico de capacidad de separacin en la cromatografa de gases y de lquidos. Hasta esos
das la cromatografa de lquidos convencional se haca en columnas grandes y con alimentacin
por gravedad

Giddings previo que el desempeo de la cromatografa de lquidos sera mejor si se pudieran usar
partculas pequeas, bajo mayor presin de flujo. Un par de aos despus Csaba Horvart y su
colega S. R. Lipsky de la universidad de Yale construyeron el primer equipo de HPLC, y lo llamaron
Cromatografa de lquidos de alta presin.

Hasta los primeros aos de 1970, con el desarrollo de la tecnologa para producir pequeas
partculas de slice silanizadas, que fue posible usar las columnas de volumen pequeo y mayor
longitud que permitieron un funcionamiento con alta resolucin. Hoy en da, a este mtodo se le
llama cromatografa de lquidos de alta eficiencia.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 604,605 Cromatografa de lquidos de
alta eficiencia.

Principios.

La cromatografa de lquidos clsica ha


sido sustituida en gran medida por la
tcnica, mucho ms poderosa y
analticamente til, de la cromatografa de
lquidos de alta eficiencia.

La rapidez de distribucin de solutos entre


la fase estacionaria y la fase mvil, en la
cromatografa de lquidos tradicional, est
controlada por difusin principalmente.

La difusin en los lquidos es en extremo


lenta, en comparacin con los gases. Para
minimizar la difusin y el tiempo requerido
para el movimiento de los componentes de
la muestra hacia los sitios de interaccin en
la columna y desde stos, deben
satisfacerse dos criterios.

1 La figura muestra los componentes bsicos de un sistema de HPLC


Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 605 Cromatografa de lquidos de alta
eficiencia, principios

El primero es que el material de empaque debe estar finamente dividido y tener una alta
regularidad esfrica para permitir una ptima homogeneidad y densidad de empaque; en segundo
lugar, la fase estacionaria debe estar en forma de una pelcula delgada y uniforme, sin lugares para
el estancamiento. La primera condicin permite tener menor valor de A en la ecuacin de Van
Deemter (menor difusin por arremolinamiento) y la segunda da como resultado un valor pequeo
de C (transporte de masa ms rpido entre las fases, necesario para tener gran rapidez de flujo).
Debido a que la difusin molecular en lquidos es pequea, el trmino B de la ecuacin 19.8 es
pequeo. Por tanto, el aumento perjudicial en H a tasa baja lenta no sucede.

Cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia.


Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d.
Christian Pg. 606, Cromatografa de
lquidos.

Fases estacionarias:

Fases estacionarias: Las micro partculas en la HPLC original eran de gel de slice o de almina,
irregulares, porosas, de 10 nm o menos. Desde entonces se han desarrollado partculas esfricas
que se pueden empacar en forma ms homognea y permiten alcanzar mayor eficiencia. Las
partculas son de slice de alta pureza, con bajo contenido de trazas de metales, y su dimetro
tpico es de 5 a 10 nm; sin embargo, las partculas de 3 nm se estn usando cada vez ms en la
cromatografa de alta velocidad. Los tamaos de poro estn en el intervalo de 60 a 100 , aunque
se usan tamaos de poro de 300 o ms con biomolculas ms grandes, que les permiten
penetrar los poros.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 606 fases estacionarias.
Las partculas pequeas aseguran mayor eficacia pero requieren
mayor presin.
La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamao de
las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas en HPLC
es de 3-10 nm, la siguiente figura ilustra el aumento de la resolucin que se
consigue al disminuir el tamao de partcula al pasar de 10 a 5 nm. Se puede
ver como los picos s hacen ms estrechos y como se resuelve un pico nuevo
del ultimo pico del cromatograma.

Cuantas ms pequeas son las partculas, mayor es el nmero de platos. Una razn por la cual
las partculas Cromatogramas de una sola muestra, obtenidos con una columna empaquetada con partculas
pequeas de slice de a) 10nm y b) 5 nm de diametro
originan mejor es que permiten un flujo ms uniforme a travs de la columna, reduciendo as el
trmino de camino mltiple A de la ecuacin de van Deemter.

Otra razn es que el camino que debe recorrer el soluto en su difusin en la fase mvil que hay
entre las partculas es del orden del tamao de las partculas, cuanto ms pequeas son las
partculas menor es la distancia en la que deben difundirse el soluto en la fase mvil. La desventaja
que tienen las partculas pequeas es la resistencia que ofrecen al flujo de disolvente.
Anlisis Qumico Cuantitativo, 3 edicin, Daniel C. Harris. Pg. 609 Cromatografa de lquidos.

Las partculas de slice tienen grupos silanol, SiOH, superficiales. stos se usan
para unir qumicamente fases estacionarias mediante reacciones de
silanizacin con clorosilanos:
Ms o menos la mitad de los grupos silanol se unen qumicamente, y el resto se
recubre con grupos trimetilsililo para hacerlos inertes. Tambin Zorbax
prepara partculas en las que los enlaces siloxano estn protegidos por
impedimento estrico de parte de los voluminosos grupos ter-butilo.

Grupo ter-
butilo
Que son ms grandes que los dos grupos metilo en el agente derivatizante de
organoclorosilano. Las fases no polares enlazadas ms comunes (para
cromatografa de fase inversa) son las que poseen C18 y C8 (se mostraron
antes); el ms popular es C18 (llamado ODS, de octadecilsilano); el C8 tiene
hidrofobicidad intermedia y el C18 es no polar. Tambin son tiles los grupos
fenilo. Las partculas con C5 se usan para HPLCmasas debido a sus bajas
propiedades de sangrado.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 607 fases estacionarias.

Instrumentacin para cromatografa de liquidos:

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre
2 y 10 nm que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de liquidos, se requieren
presiones de algunos cientos de kg- fuerza por centmetros cuadrado. Como consecuencia de
estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticados y caro
que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. En la siguiente figura se muestra un esquema
de los componentes fundamentales de un Cromatgrafo de liquidos de alta eficiencia tpico.

Ilustracin 1Esquema de un aparato de HPLC


Sistemas de
inyeccin de muestra:

Vlvula de inyeccin usada en HPCL, existen bucles de muestra


intercambiables.

A menudo el factor limitante en la precisin de las medidas en Cromatografia de liquidos es la


reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problemas se acenta
por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas, por ello los
volmenes que se emplean han de ser muy pequeos de unas pocas dcimas de micro litro a tal
vez 500 nl, adems se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.

El medio ms simple y antiguo para la introduccin de las muestras implicaba la inyeccin con una
jeringa a travs de un elastmero que se cierra hermticamente. Con esta finalidad se utilizaban
microjeringas capaces de resistir presiones de hasta 1500 psi. En las inyecciones a flujo
determinado, el flujo de disolvente se detiene momentneamente, se retira el conector de la
cabeza de la columna y la muestra se inyecta directamente en el relleno de la cabeza de la
columna despus se retira el accesorio y el sistema se vuelve a presurizar.

Principios de anlisis instrumental Quinta edicin, Skoog. Holler. Nieman. Pg. 791 Sistemas de
inyeccin de muestra.

La columna:

El equipo HPLC utiliza columnas de acero o de plstico de una


longitud de 5-30 cm y un dimetro interior de 1-5 mm. Las
columnas son caras y se degradan con facilidad por el polvo, o
las partculas de las muestras o dl disolvente. Por eso se
protege la entrada de la columna con una columna corta, la
precolumna que contiene la misma fase estacionaria que la
columna analtica. Las partculas finas y solutos que se adsorben
con fuerza quedan retenidos en la precolumna, que hay que
remplazar peridicamente.

Calentando una columna cromatografica, de ordinario, disminuye


la viscosidad del disolvente reducindose as la presin
requerida o permitiendo un mayor caudal. Al aumentar la
temperatura se acortan los tiempos de retencin, y mejora la
resolucin, porque aumenta la velocidad de difusin de los
solutos. Sin embargo, aumentando la temperatura se puede
degradar la fase estacionaria y reducir la vida de la columna. Si
no se controla la temperatura de la columna, esta podra fluctuar
con la temperatura ambiente. Usando un horno a una
temperatura a pocos grados por encima de la temperatura
ambiente se mejora la reproducibilidad de los tiempos de
retencin, y la Columna de HPLC provista de precisin del anlisis cuantitativo.
precolumna cambiable, para
retener por adsorcin las
impurezas de forma irreversible.
Las fritas de titanio distribuyen el
lquido de forma uniforme por
todo el dimetro de la columna.
Anlisis Qumico Cuantitativo, 3 edicin, Daniel C. Harris. Pg. 610 Cromatografa de lquidos,
columnas

Los tramos rectos de tubo de acero inoxidable permiten la construccin de columnas excelentes.
Son de varios dimetros y longitudes, los cuales dependen de la aplicacin. En general, el dimetro
interno tiene 3.9 o 4.6 mm. Una columna de 4.6 mm de dimetro, bien empacada con partculas de
5 nm (dp) debe tener un nmero de platos del orden de 60 000 a 90 000 placas/metro, a flujos de 1
mL/min. Una columna convencional de 15 cm de longitud con 4.6 mm de dimetro interior tiene 15
000 platos, con partculas de 3 nm, 9 000 platos con partculas de 5 nm y 5 000 platos con
partculas de 10 nm. Las partculas menores se limitan a longitudes de 25 cm o menos, por las
grandes cadas de presin. Con 25 cm es posible tener 50 000 placas a una presin de 5 000 psi, y
con mezclas de agua-metanol. Pueden resolver 50 a 100 mximos, que es ms o menos el lmite
superior de la cromatografa de lquidos de alta eficiencia convencional. Ms adelante se ver que
puede hacerse cromatografa rpida con columnas de mayor dimetro y cortas, pero las columnas
delgadas producen mayor resolucin.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 611 Columna.

Columnas para HPLC (Cortesa de Walters Corporation)

Columnas analticas: La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tiene una
longitud de entre 10 y 30 cm. Por lo comn las columnas son rectas y se pueden alargar, si es
necesario, acoplando dos o ms columnas. En algunas ocasiones se pueden encontrar columnas
configuradas con forma helicoidal aunque el resultado es una cierta prdida de eficacia. El
dimetro interno de las columnas es a menudo de cuatro a 10 nanmetros y los tamaos de las
partculas de los rellenos ms comunes son de 5 a 10 nm. Tal vez la columna mas frecuentemente
utilizada es la de 25 c de longitud y 6.6 mm de dimetro interno, y rellena con partcula de 5nm.
Este tipo de columnas tiene de 40000 a 60000 platos/metro.
Principios de anlisis instrumental Quinta edicin, Skoog. Holler. Nieman. Pg. 792
Cromatografia de liquidos.

Precolumnas: Para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolumna
que elimina no solo la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes si no tambin
componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria, en cromatografa
liquido-liquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as
minimizar las prdidas de esta en la columna analtica.
Principios de anlisis instrumental Quinta edicin, Skoog. Holler. Nieman. Pg. 793
Cromatografia de liquidos.

Columnas termostatizadas: En muchas aplicaciones no se necesita un


control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperaturas
ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la
columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen mejores
Cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan
actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la
columna a decimas de grado centgrado, desde la temperatura ambiente hasta
100 0 150 C. Para poder controlar con precisin la temperatura, las columnas
tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un bao a
temperatura constante.
Principios de anlisis instrumental Quinta edicin, Skoog. Holler. Nieman. Pg. 793
Cromatografia de liquidos.