EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE CIDO GIBERELCO A PARTIR DE

BACTERIAS NATIVAS DEL GENERO Azospirillum sp AISALADA DE SUELOS

DEL DEPARTAMENTO CORDOBA

CARMEN LUCA LUNA RAMOS

MIGUEL EDUARDO MONTOYA RAMOS

DIRECTORA:
Ph.D CECILIA LARA MANTILLA

UNIVERSIDAD DE CRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA
PROGRAMA DE QUMICA
MONTERA-2014
 INTRODUCCIN

El crecimiento normal de las plantas es ocasionado en forma armnica por

sustancias que funcionan como hormonas. Los principales grupos de ellas son las
Auxinas, Giberilinas, Citoquininas, Etileno e inhibidores de crecimiento. Estos
compuestos actan en bajas proporciones. Durante el desarrollo fenolgico de las
plantas, estas varan de acuerdo con el estado de desarrollo, mediante un
delicado balance hormona-inhibidor. Una forma de ataque del patgeno consiste
en alterar ese equilibrio, ya sea mediante la obtencin de reguladores de
crecimiento, para aumentar su concentracin y as crear los inhibidores de esas
hormonas (Aguilar-Piedras, J.J. 2008).

Las Giberilinas (GAs), como reguladores de crecimiento estn estrechamente

asociadas a la promocin de la germinacin de las semillas, crecimiento del tallo,
inducir la brotacin de yemas y el desarrollo de los frutos. Existen varios tipos de
Giberilinas, siendo las ms comunes: Giberelina A1 (GA1), cido Giberelco (GA3),
Giberelina A4 (GA4), Giberelina A7 (GA7) y Giberelina A9 (GA9). Qumicamente son
un grupo de diterpenoides que se definen ms por su estructura que por su
actividad biolgica, contrario a lo que ocurre con las auxinas y las citoquininas
(Yamaguchi y Kamiya 2000).

nicamente las Giberilinas biolgicamente activas pueden cumplir con estas

funciones, las Giberilinas no bioactivas existen en el tejido vegetal como
precursores de las formas bioactivas o como metabolitos desactivados. Se ha
dilucidado que existe una necesidad estructural, como requerimiento para la
afinidad con el recientemente descubierto receptor de Giberilinas en arroz (GID1),
y sus homlogos en otras especies (Nakajima et l. 2006). Parece ser que la
regulacin de la biosntesis de Giberilinas y de sus receptores, y vas de
sealizacin dependen de la especie de estudio (Yamaguchi 2008).

Por tal razn, se ha recurrido a la biotecnologa que es una herramienta

que permite manipular microorganismos con potencial biofertilizante, debido a
que una de sus principales funciones es suministrar nutrientes como el
nitrgeno, que se hace disponible a las plantas mediante la accin de
bacterias que habitan en el suelo naturalmente con la capacidad de fijar el
elemento presente en la atmsfera y fijarlo en las races de las plantas.
Teniendo en cuenta lo anterior es importante el estudio de bacterias nativas
productoras de Giberilinas que a futuro puedan ser utilizadas en la agricultura.
 ANTECEDENTES

En algunos estudios de campo realizados con cereales se ha llegado a observar

una promocin del crecimiento vegetativo (Kapulnik et al, 1983). Tambin se ha
reportado un efecto a simple vista sobre el crecimiento de varios vegetales como
tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), berenjena (Solanum melongena L.),
pimiento (Capsicum annuum) y algodn (Gossypium barbadense) (Bashan et al.
1989)

Bashan & Levanony (1990), Summer (1990), Fages (1994), Okon y Labandera-
Gonzlez (1994), citados por Dobbelaere et al. (2001), concluyen que la
inoculacin con Azospirillum sp. Increment significativamente de un 5-30 % en el
rendimiento de materia seca foliar, granos y protena foliar, as como en el
desarrollo radical, en alrededor de 60 -70 % de los experimentos en campo.

Richards eta, (2001) dice que las Giberilinas son hormonas que regulan el
crecimiento y desarrollo de las plantas; a travs de la promocin de la divisin y
elongacin celular Matusa-gttgens y Hedden, (2009).

Weaver (1996) afirma que las Giberilinas son las nicas sustancias qumicas
capaces de promover floracin en plantas, que de otro modo permaneceran
vegetativas, al remplazar condiciones ambientales especficas que controlan la
formacin de flores. Sin embargo, Salisbury y Ross (1994) mencionan que
tambin las Citoquininas han estimulado la formacin de flores en algunas
variedades de crisantemo (Dedranthema sp.) con el empleo de una combinacin
de Citoquininas (Benziladenina) y AG5.
Ngamau (2001) prob aplicaciones de BAP (Benzilaminopurina) y/o AG3 sobre
plantas de la variedad Green Goddess` de Z. aethiopica. Estas promovieron la
emergencia temprana e incrementaron el nmero de brotes visibles y el desarrollo
de estos. De Pascale et al. (2003) demostr que la Giberilinas adelant floracin
en aproximadamente 100 das respecto al testigo.

Luria y Weiss (2005) concluyeron que se increment el nmero de brotes y se

obtuvo hasta cinco veces ms flores con tratamientos combinados de BA y AG3.
Reiser (1998) report que aplicaciones de AG3 en Z. aethiopica y Z. Green
Goddess` incrementaron el nmero de flores por planta de 1.3 a 3.4 y de 1.3 a 3.8,
respectivamente.

(Woodger et al. 2004; Balaguera-Lpez et al. 2009a; Balaguera-Lpez et al.

2009b) dice; que existen muchos estudios sobre la estimulacin de la germinacin
mediante el uso de giberelinas GA3 en semillas de tomate.
 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La giberelina es un tipo de regulador de crecimiento vegetal que afecta a una

amplia variedad de fenmenos de desarrollo en las plantas, incluidas la elongacin
celular, la germinacin de las semillas en muchas especies, y en cereales
movilizan reservas para el crecimiento inicial de la plntula, estimulan la divisin
celular y afecta tanto a las hojas como a los tallos ya que incrementa la
extensibilidad de la pared. Esta se est usando para incrementar el tamao del
fruto en viedos de uvas sin pepitas, haciendo que el racimo se elonge y
permitiendo que la uva este ms ventilada reduciendo as las probabilidades de
infeccin por brotitis (Ueguchi-Tanaka et l. 2007).

Crdenas (2007), confirm estos hallazgos al aislar a partir de suelos y pastos

del Valle del Cesar este tipo de microorganismo. Evalu la inoculacin de
esta bacteria en semillas de pasto Panicum mximum Jacq C.V; aislada de
suelos algodoneros del Cesar. Esta inoculacin aument hasta 20 % en
protena cruda y 45% en materia seca comparada con las plantas
fertilizadas con fuentes nutricionales qumicas bajo condicin de invernadero.

Actualmente los altos costos de los fertilizantes qumicos, as como de los

problemas de contaminacin que ocasionan, han generado otras formas de
produccin, en donde se incentiven a la prctica de nuevas tecnologas. Estudios
de costos de produccin sealan la reduccin en la utilizacin de agroqumicos por
los agricultores en los ltimos ocho aos, debido a los altos costos que generan
estos insumos, para lograr el mximo rendimiento de los cultivos (Laria et al.,
2003).

Los fertilizantes qumicos han sido benficos para el sector agrcola; no obstante,
el abuso en su utilizacin genera residuos que producen salinizacin, problemas
en el drenaje, compactacin del suelo y disminucin de la actividad microbiana
comprometida en la nutricin vegetal. Cada ao se incrementa la cantidad de
fertilizantes aplicados debido a la menor eficiencia de adsorcin en el suelo y
absorcin por la planta, aumentando los costos de produccin. Asimismo, se
genera un problema ambiental debido a la produccin de gases txicos que se
desprenden de los fertilizantes como los xidos de nitrgeno que daan la capa de
ozono (Lara et al, 2007).

Es por esto, que como una alternativa a los fertilizantes qumicos est la
posibilidad de utilizar bacterias propias del suelo, que como parte de su
metabolismo incrementan la fertilidad y benefician a las plantas, pueden contribuir
con la disminucin de fertilizantes de sntesis qumica, en la generacin de nuevas
tcnicas de produccin agrcola, enfocada al uso eficiente de los recursos que
tiendan a una agricultura sostenible, limpia y de bajo impacto agrcola,
contribuyendo con el mejoramiento de las condiciones medioambientales,
econmicas y sociales. Una alternativa viable que contribuye favorablemente con este
propsito es el uso de los biofertilizantes, los cuales recuperan la fertilidad y productividad
del suelo y permiten darle a las plantas los nutrimentos necesarios para su crecimiento
contribuyendo en este sentido a mejorar la calidad de los cultivos para su produccin
agrcola. Desde el punto de vista de una agricultura sostenible, los fertilizantes biolgicos
constituyen un medio econmicamente viable y ecolgicamente aceptable al reducir
costos a los productores con acceso limitado a fertilizantes de sntesis qumica (Dalla et
al, 2004).

En este trabajo buscamos mostrarles porque no es bueno utilizar agroqumicos o

fertilizantes qumicos y si es de gran importancia usar productos de origen natural
como lo es la giberelina, ya que ayuda a minimizar los costos de produccin y
maximizar mucho ms las ganancias en los agricultores del departamento. Y de
esta manera ayudar a prevenir mucho ms la contaminacin que dejan estos
agroqumicos por el uso excesivo que se les da.
 JUSTIFICACIN

Debido a la problemtica mundial existente hoy en da por el uso indiscriminado de

productos fertilizantes de sntesis qumica, se han implementado con el paso de
los aos soluciones amigables y sostenibles que permitan disminuir el efecto
adverso generado por dichas aplicaciones; de all que naci el uso de productos
biofertilizantes basados en la potencializacin de procesos naturales donde los
actores principales son los microorganismos promotores de crecimiento vegetal
(Aguilar-Piedras, 2008).

Las plantas para su desarrollo, no solo realizan procesos fotosintticos o toman

sustancias minerales del suelo, tambin llevan a cabo en su interior una serie de
procesos fisiolgicos que ayudan a dicho desarrollo. De la misma manera, las
plantas tambin se ven afectadas y de cierta forma reguladas por algunos de los
procesos que ocurren en el suelo, la mayora de los cuales se llevan a cabo por
los microorganismos (Pedraza et al. 2008; Molina-Favero et al. 2008).

El desarrollo normal de una planta depende de la interaccin de factores externos:

luz, nutrientes, agua y temperatura, e internos: hormonas. Una definicin global
del termino hormona, es considerar bajo este nombre a cualquier producto
qumico de naturaleza orgnica, que sirve de mensajero y que es producido en
una parte de la planta, tiene como blanco otra parte de ella (Conney & Nonhebel,
1991).

Dentro de las bacterias que producen se tiene el gnero Azospirillum; este se

caracteriza por ser un microorganismo promotor de crecimiento vegetal, que ha
sido ampliamente estudiado, a partir de sus capacidades para generar efectos
benficos por su inoculacin a distintas especies vegetales. Sin embargo an falta
informacin a nivel gentico y bioqumico, de la regulacin y capacidad de cada
uno de sus componentes enzimticos presentes en procesos como la produccin
de Auxinas. (Carreo-Lpez et al. 2000; Costacurta et al. 994; Ryu & Patten, 2008;
Sergeeva, et al. 2007; Pedraza et al. 2004; Contesto et al. 2010).
Azospirillum ha sido ampliamente estudiado como bacteria promotora de
crecimiento vegetal, ya que tiene la capacidad por un lado, de producir sustancias
como siderforos, definidos como molculas de bajo peso molecular que
presentan una alta afinidad por Fe generando un efecto quelante en ste,
igualmente tiene la capacidad de producir bacteriocinas como sustancias
antimicrobianas que generan un efecto de control contra patgenos que puedan
llegar a atacar a las plantas (revisado en Baca, 2009; Somers et al. 2005; Borisov
et al. 2007).

Las Giberilinas son un grupo de diterpenoides que se definen ms por su

estructura que por su actividad biolgica, contrario a lo que ocurre con las auxinas
y las citoquininas (Yamaguchi y Kamiya 2000).

Las Giberilinas biolgicamente activas, actan como reguladores esenciales del

desarrollo de las plantas, y cubren todos los aspectos de la historia de vida de las
plantas, modulando varias respuestas del crecimiento como la germinacin de
semillas, el crecimiento del tallo, la partenocarpia, la expansin foliar, la
elongacin de la raz, la floracin y la liberacin de enzimas hidrolticas en algunos
tejidos (Ueguchi-Tanaka et l. 2007). nicamente las Giberilinas biolgicamente
activas pueden cumplir con estas funciones, las giberelinas no bioactivas existen
en el tejido vegetal como precursores de las formas bioactivas, o como
metabolitos desactivado (Castro-Guerrero, et al, 2011).

La necesidad de sustituir la agricultura convencional a base de agroqumicos por

una agricultura sostenible menos agresiva con el medio ambiente, ha llevado a la
Investigacin y desarrollo de nuevos productos que sean biotecnolgicamente
viables con un impacto mnimo para el ecosistema y para la salud humana,
permitiendo aumentar la calidad nutricional y rendimientos de los cultivos dentro
de tecnologas ms amigables con el ambiente.

Es por esto, que se hace necesario adoptar una estrategia de manejo sustentable
a travs de mecanismos que favorezcan la implementacin de los inoculantes
biolgicos, buscando opciones econmicas las cuales promuevan la reduccin de
los costos de su produccin. Comprender esta situacin, nos lleva a buscar y
desarrollar tecnologas limpias y menos costosas que permitan mejorar la calidad
de los cultivos supliendo los nutrimentos necesarios para su produccin (Young,
2008).

Es por esto, que esta investigacin se realizara para buscar una alternativa que
optimice los procesos para mejorar la produccin y generar inoculantes biolgicos
con la misma calidad y estabilidad que los fertilizantes nitrogenados en el
mercado, contribuyendo de esta forma al desarrollo de tecnologas integrales para
la conservacin del suelo y la nutricin de los cultivos de pasto y pueda ser
rentable
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la produccin de cido giberelco a partir de bacterias nativas del

genero Azospirillum sp aisladas de suelos del departamento de Crdoba.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Multiplicar y cuantificar las bacterias nativas de genero Azospirillum sp;

Bacilos y Azotobacter, existentes en el banco de cepas del laboratorio de
Biotecnologa GRUBIODEQ, teniendo en cuenta las condiciones
nutricionales de crecimiento.

Evaluar la produccin del cido giberelco por el mtodo de reactivo cido

fosfomolbdico (folling-wu).

Seleccionar las mejores bacterias teniendo en cuenta la produccin de

cido giberelco.
 MARCO TERICO

BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO

Definicin

Las bacterias promotoras de crecimiento en vegetales (PGPRs) son un grupo de

diferentes especies de bacterias que pueden incrementar el crecimiento y
productividad vegetal (Bashan y Holgun, 1998). Dentro de los microorganismos
promotores de crecimiento vegetal se clasifican una gran variedad de gneros
dentro de los cuales se incluyen Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas,
Bacillus, Rhizobium (Baca, 2009; Klopper, 1993).

Son capaces de colonizar los diferentes sistemas radicales de las plantas y

promover el crecimiento de stas, pueden alterar el crecimiento de los tejidos
vegetales directa o indirectamente; indirectamente las PGPR juegan un papel
importante en la disminucin o prevencin de otros fitopatgenos que puedan
atacar las plantas, mientras que las directamente las PGPR promueven el
crecimiento de la planta al sintetizar compuestos (por ejemplo reguladores del
crecimiento vegetal) que le facilita a la planta la toma de nutrientes del ambiente
(Gray & Smith, 2004).

Historia de Azospirillum Sp; Azotobacter y Bacilos: Spirillum lipoferum, ahora

llamado Azospirillum, fue descrito por primera vez en 1925 por Martinus Willem
Beijerinck, luego de lo cual la bacteria permaneci en el olvido por varias dcadas.
Las observaciones de Juan Jos Pea-Cabriales y Johanna Dbereiner en 1973,
inician la poca moderna de este microorganismo.

Hiltner en 1904, observ por primera vez la acumulacin de microorganismos en la

zona radical y propuso el trmino rizsfera. Los exudados radiculares,
conformados por sustancias diversas crean alrededor de las races, un ambiente
nutricional enriquecido que favorece el crecimiento bacteriano.
El gnero Azotobacter pertenece a las familias Azotobacteraceae que agrupa
bacterias Gram negativas, quimioheterotrofas, aerobias estrictas, capaces por s
solas, de fijar nitrgeno molecular. (Holt, et al, 1994; Ramos, 1992; Espn, 2000).

Fue descrito por primera vez por Beijerinck (1901) y en la actualidad incluye seis
especies: A. chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armeniacus
y A. paspali (Ramos, 1992).

El gnero Bacillus, es un grupo extenso y muy heterogneo que abarcaba ms de

80 especies de bacterias (Euzeby, 2008), permaneci intacto hasta el ao 2004,
cuando fue dividido en varias familias y gneros en base a estudios del RNA de
cadena simple (Blackwood et al, 2004).

Generalidades Gnero Azospirillum sp; Azotobacter; Bacilos: El gnero

Azospirillum sp, es una bacteria Gram negativa, perteneciente a la subclase alfa
de las proteobacterias, en el orden de las Rhodospirillaceae, dentro de sus
principales caractersticas.

Las bacterias del gnero Azospirillum sp, tienen la capacidad de producir auxinas,
citoquininas y giberelinas en medios de cultivo. No obstante, el mecanismo
analizado con mayor amplitud ha sido la produccin de auxinas, que puede
modificar el contenido de fitohormonas de las plantas conduciendo a la
estimulacin del crecimiento de las mismas, como el caso del cido Indol Actico
(AIA), el cual induce al aumento de pelos radiculares, logrando una mayor
captacin de nutrimentos.

Las bacterias del gnero Azotobacter forman un grupo especial de

microorganismos fijadores de nitrgeno, se multiplican rpidamente y
proporcionan muchas ventajas, como regular el crecimiento de las plantas,
producir hormonas vegetales y favorecer la solubilidad de la materia orgnica
agregada al suelo como abono (Mishustin & Shilnikova, 1969; Ramos, 1992).

Existe considerable evidencia que apoya el rol especifico de Bacillus sp. En la

solubilizacin del fosforo. Sin embargo, no todos los ensayos de laboratorio o de
campo han dado resultados positivos. La eficiencia de la inoculacin variara con
el tipo de suelo, el cultivar especfico y otros numerosos parmetros. El contenido
de P en el suelo sera probablemente uno de los factores cruciales en determinar
la efectividad del inoculante (Rodrguez y Fraga, 1999).

Metabolismo de Azospirillum sp; Azotobacter; Bacilos: Las especies de

Azospirillum sp, difieren en su capacidad para utilizar diferentes compuestos como
fuentes de carbono y nitrgeno. Estas bacterias usan para su crecimiento unos
pocos monosacridos y disacridos as como alcoholes polihidroxilados, y
principalmente diversos cidos orgnicos tales como mlico y succnico y algunos
aminocidos (Hartmann & Burris, 1988). Para el uso de diferentes fuentes de
carbono, tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen todas las enzimas de la va
de Embden-Meyerhof-Parnas y de la va de Entner-Doudoroff (Westby et al, 1983),
as como todas las enzimas del ciclo de los cidos tricarboxlicos (Martnez et al,
1984). Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer
autotrficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5-
difosfato carboxilasa (Tilak et al, 1986).

La capacidad de Azotobacter de estimular el crecimiento de las plantas ha sido

comprobada por numerosos investigadores. Adems de la fijacin de nitrgeno,
otras propiedades tales como la capacidad de solubilizar fosfatos, la produccin de
reguladores del crecimiento, vitaminas, sideroforos y sustancias antifungicas son
considerados como responsables del efecto positivo sobre los vegetales.

Algunos autores postulan que la produccin de auxinas y otros reguladores del

crecimiento vegetal podran ser el mecanismo principal que explicara los efectos
beneficiosos de Azotobacter (Zahir et al., 2005).
Efectos de factores fisicoqumicos sobre Azospirillum sp; Azotobacter, Bacilos:
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo ptimo y bajo
condiciones adecuadas de incubacin, ocurre un incremento en el nmero de
clulas en perodos muy cortos. En algunas especies se alcanza la poblacin
mxima en 24 horas, en cambio, en otras se necesita un perodo ms prolongado
para alcanzar el mximo desarrollo; para determinar el desarrollo se necesita
medir cuantitativamente la poblacin de clulas al tiempo de sembrar y
nuevamente despus de la incubacin. El ciclo de desarrollo de las poblaciones
bacterianas es el procedimiento ms importante en la multiplicacin de los
microorganismos (Peoples & Craswell, 1992).

pH: Azospirillum sp; el Azotobacter y los Bacilos, tiene un crecimiento ptimo en

un rango de pH de 6,5 -7,0. Si el microorganismo no cuenta con el pH
correspondiente, esto provocara la inhibicin de su crecimiento y desarrollo
(Snchez, 1964

Temperatura: Muchas especies de Azospirillum sp; Azotobacter y Bacilos,

requieren una temperatura ptima de crecimiento cercana a los 30 C, excepto
para Azospirillum largimobile que presenta una temperatura de 28 C y
Azospirillum halopraeferens 41 C. La modificacin de la temperatura, tiene un
efecto notable sobre un proceso. Si el valor utilizado no es adecuado puede
disminuir o an impedir la formacin de un metabolito determinado (Scragg, 2000).

Adems, la temperatura puede modificar los requerimientos nutritivos de algn

microorganismo, lo que significa que al modificarse el valor de un factor puede
cambiar los requerimientos de otro.

LA GIBERELINA: Son reguladores del crecimiento de las plantas superiores que

regulan numerosos aspectos del desarrollo vegetal. Ellas promueven el
crecimiento celular debido a que incrementan la hidrlisis de almidn, fructanos y
sacarosa con lo que se originan molculas de fructosa y glucosa.
Las respuestas que producen o modulan las Giberilinas afectan tanto la regulacin
del crecimiento reproductivo de la planta (Azcon & Bieto, 2000). Ellas son
determinantes en el control de la elongacin del tallo, tambin modifican
sustancialmente los procesos reproductivos de los vegetales, participando en el
control del induccin de la floracin, en la produccin, crecimiento, y desarrollo de
los frutos. As mismo sustituyen los requerimientos de luz o frio que precisan
muchas de las semillas para germinar (Azcon & Bieto, 2000; Salisbury, 1994).

Para determinar las Giberilinas se usa el mtodo Reactivo de folling-Wu (cido

fosfomolbdico); es un mtodo utilizado en la deteccin de Giberilinas, como un
mtodo sencillo y practico de deteccin, basado en la reaccin de reduccin que
presenta el cido molbdico frente a soluciones de cido giberelco a diferentes
concentraciones. La reaccin de reduccin ocasiona un cambio de color del
reactivo a azul mostrando la reduccin ocasionada por la presencia de Giberilinas
en la solucin (Graham & Henderson, 1960)

DETECCIN COLORIMETRICA DE GIBERELINAS: REACTIVO CIDO

FOSFOMOLBDICO (FOLLING-WU) (Graham & Henderson, 1960)

La reaccin colorimtrica a base del reactivo Folling Wu (cido fosfomolbdico),

es un mtodo utilizado en la deteccin de Giberilinas, como un mtodo sencillo y
practico de deteccin, basado en la reaccin de reduccin que presenta el cido
mlibdico frente a soluciones de cido giberlico a diferentes pH. La reaccin de
reduccin ocasiona un cambio de color del reactivo a azul mostrando la reduccin
ocasionada por la presencia de Giberilinas en solucin.
 METODOLOGA

El trabajo se realizar en el laboratorio de Biotecnologa del Departamento de

Qumica, (GRUPOBIODEQ) de la universidad de Crdoba.

Esta investigacin se realizara siguiendo una serie de etapas; estas son:

1. PRIMERA ETAPA: Multiplicar las bacterias nativas de gnero Azospirillum

sp; Bacillus y Azotobacter sp, existentes en el banco de cepas del
laboratorio de Biotecnologa GRUBIODEQ, teniendo en cuenta las
condiciones nutricionales de crecimiento para cada gnero.

Obtencin de las muestras:

Se utilizaran cepas aisladas pertenecientes al banco de muestras del laboratorio

de Biotecnologa GRUBIODEQ de la Universidad de Crdoba. Los
microorganismos sern activados utilizndose como medio de cultivo: Nfb; de
acuerdo a lo anterior, se comenzar con la inoculacin de los microorganismos y
seguidamente se har una dilucin de dicho inculo (Solucin madre), para as
determinar la cantidad de clulas de las que se partir teniendo en cuenta sus
condiciones nutricionales para cada gnero.

Aislamiento:
Para el aislamiento de bacterias de los gnero Azotobacter sp, Azospirillum sp, y
Bacillus. Se proceder de la siguiente manera: una vez colectadas las muestras,
se harn sucesivas diluciones y luego se sembraran pequeas cantidades de
estas diluciones en cajas de petri con medio de cultivo (Nfb, selectivo para cada
gnero) descrito por (DBEREINER et al 1976). Posteriormente se realizara el
proceso de incubacin de las muestras pasadas 72 horas se efectuara los conteos
de las colonias propias del gnero (Snchez, 1990, Holt et al 1994).

MEDIO DE CULTIVO NFB (Dobereiner et al, 1997)

El medio de cultivo que se utiliza para realizar los bioensayos de crecimiento, ser
el NFB, que se usa en la multiplicacin de bacterias del gnero Azospirillum sp,
Bacillus y Azotobacter sp. El cul es preparado pesando 0.25g K2HPO4, 0.025g
FeSO4*7H2O, 0.005g MnSO4*H2O, 0.05g MgSO4*7H2O, 0.01g NaCl, 0.005g
CaCl2, 0.001g Na2M0O4, utilizando como fuente de carbono succinato; para un
volumen total de 500mL de agua destilada y ajustamos el pH entre 6.6 a 7.0.
Luego lo colocamos en autoclave por un tiempo de 20 minutos a una temperatura
de 121C aproximadamente, dejamos enfriar a temperatura ambiente e
inoculamos los diferentes microorganismos

SEGUNDA ETAPA: Evaluacin de la produccin del cido Giberelco

por el mtodo de reactivo cido fosfomolbdico (folling-wu).

Para la identificacin de los microorganismos aislados se realizar ensayos

utilizando patrones de Giberelina a diferentes concentraciones (2.5 ppm, 5.0 ppm,
25 ppm, 30 ppm, 50 ppm y 80 ppm).

DETECCIN COLORIMETRICA DE GIBERELINAS: REACTIVO CIDO

FOSFOMOLBDICO (FOLLING-WU) (Graham & Henderson, 1960)
La determinacin de cido giberlico con el reactivo Folling-Wu, se realiza a partir
de soluciones stock de Giberilinas comercial Merck; a diferentes concentraciones,
buscando establecer una curva de calibracin para la deteccin de GA 3 en base al
reactivo.

Se separarn 500mL del reactivo Folling-Wu, a partir de 35g de cido molibdico y

5g de Tugstanato de Sodio fueron agregados a un Becker de 1L, luego se agreg
200 cc de NaOH al 10% y despus 200 cc de agua destilada. Calentar
vigorosamente el contenido del frasco por 40 minutos para remover cualquier
rastro de amonio presente en el cido molibdico.

Dejar enfriar y diluir la mezcla hasta 350 cc con agua destilada y agregar 125 cc
de cido fosfrico al 85%. Finalmente la mezcla fue transferida a un matraz de
500 cc y aforada con agua destilada.

Una vez preparadas las soluciones de reguladores de crecimiento se realiz la

evolucin del reactivo, a una proporcin de 3mL de la muestra por 1.8mL del
reactivo, el tiempo de relacin ser de 60 minutos, a bao en ebullicin. El tiempo
cero ser estimado luego de 2min de sumergidos los tubos, pasados los 60min se
retirarn del bao y se dejan enfriar en un bao de hielo por unos 5 minutos
aproximadamente.

De igual forma, tomaremos 10mL del inculo a las diferentes concentraciones y se

proceder a medir en el espectrofotmetro Espectronic Thermo GENESYS 20 a
una longitud de onda de 770nm. Lo anterior se har por triplicado.

TERCERA ETAPA: Seleccionar las mejores bacterias teniendo en cuenta

la produccin de cido giberelco.

Se evaluar que mtodo es el ms efectivo y preciso en la seleccin de las

mejores bacterias en la produccin de cido giberelco, teniendo en cuenta
precisin, repetitividad, reproducibilidad.

Precisin: La precisin mide el grado de acuerdo entre los resultados analticos

obtenidos de una serie de mediciones repetidas del mismo analito realizadas en
las condiciones previstas en el mtodo. La precisin refleja los errores aleatorios
que se producen cuando se utiliza un mtodo. (Validacin de mtodos analticos
AEFI 2001)

Se analizarn parmetros como:

Repetibilidad: esta se evaluar haciendo mediciones sobre 4 muestras de igual

concentracin, a las cuales se les aplicar el procedimiento analtico bajo las
mismas condiciones operativas (analista, equipo y reactivos).

Reproducibilidad: se realizar a diferentes tiempos y en das diferentes y con el

mismo analista

Esta se evaluar haciendo mediciones sobre cada muestra por triplicado.

La precisin del mtodo analtico se expresar como el coeficiente de variacin

(CV) de una serie de medidas y se calcular matemticamente con la siguiente
ecuacin:

CV (%) = S/X * 100 (Ec. 1)

Dnde:

S= desviacin estndar.
X=media aritmtica de los resultados.
 RECURSOS

MATERIALES Y REACTIVOS

Horno Tugstanato de sodio NaCl

Caja de Petri Hidrxido de sodio MgSO4*7H2O

Pipeta Analtica cido fosfrico MnSO4*H2O

Vidrio de Reloj GA3 de grado analtico Frasco lavador

Espectrofotmetro FeCl3*6H2O Gradilla

Gnesis 20

Pipeta de vidrio HCl Agua destilada

Autoclave Agar Pera

Becker CaCl2 campana de

esterilizacin

Tubos de ensayo FeSO4*7H2O Balanza analtica

 Esptula K2HPO4 Agitador de vidrio

RECURSO HUMANO: Ph.D Cecilia Lara Mantilla.

INFRAESTRUCTURA

Laboratorio de investigacin en biotecnologa GRUBIODEQ (Programa de

Qumica, Universidad de Crdoba).

RECURSOS ECONMICOS

GRUBIODEQ (Programa de qumica, Universidad de Crdoba).

PRESUPUESTO

RUBROS FUENTE DE VALOR TOTAL

FINANCIACIN

REACTIVOS $7000.000

Los recursos estn

disponibles en el laboratorio
VIDRIERA $4000.000
de investigacin en
biotecnologa GRUBIODEQ
(Programas de Qumica;
EQUIPOS:
Universidad de Crdoba).
Autoclave, $9000.000
espectrofotmetro,
horno, balanza
analtica, Campana de
 esterilizacin.

VALOR TOTAL $11000.000

CRONOGRAMA

TIEMPO (MESES)
ACTIVIDAD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

REVISIN
BIBLIOGRFICA

RECOLECCIN DE
LA MATERIA PRIMA

CULTIVO DE
MICROORGANISMOS

CUANTIFICACIN DE
GIBERELNAS CON
REACTIVO DE
FOLLING-WU

ANLISIS E
INTERPRETACIN
DE RESULTADOS

REDACCIN DEL
INFORME FINAL

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