Instituto Tecnolgico El Llano, Aguascalientes

Divisin de Estudios de Posgrado e Investigacin

Maestra en Ciencias en Biotecnologa Agropecuaria

Practica no. 3

Electroforesis en gel de Agarosa

Alumna: Ing. Martha Xochilt Soltero Beltran

Profesor: Dr. Luis Lorenzo Valera Montero

Materia: Biologa Molecular

El Llano, Ags., 13 de Abril de 2010.

INTRODUCCIN
 La electroforesis en gel se usa mucho para separar cidos
nuclecos con mas molecular diferente (o sea, longitud del
nucletido). Las molculas pequeas de DNA o RNA con unos cuantos
o cientos de nucletidos o menos casi siempre se separan por
electroforesis en gel de poliacrilamida. Las molculas ms grandes
tienen problemas por la poliacrilamida de enlaces cruzados y por lo
general se fraccionan en gel de agarosa que es ms poroso. La
agarosa es un polisacrido extrado de un alga marina; se disuelve
con un amortiguador caliente y se vierte en un molde y se gelatiniza
con un simple descenso en la temperatura. La separacin de
molculas mayores de 25kb suele hacerse mediante la tcnica de
electroforesis de campo con pulsos en la que la direccin del campo
elctrico en el gel se cambia en forma peridica, lo que ocasiona que
las molculas de DNA se reorienten durante la migracin.

Despus de la electroforesis, los fragmentos de DNA en el gel se

visualizan empapando el gel en una solucin de colorante, como
bromuro de etidio. Este se intercala en la doble hlice y hace que las
bandas de DNA presenten fluorescencia cuando se ven con radiacin
ultravioleta. La sensibilidad de la electroforesis en gel es tan alta que
molculas de DNA o RNA que difieren por un solo nucletido pueden
separarse por esta tcnica, una caracterstica que dio origen a un
mtodo invaluable para la secuenciacin de DNA (Karp, 2008).

MATERIAL: REACTIVOS:

Micropipetas (0.2mL y 1mL) Gel de Agarosa

Papel Absorbente Solucin Madre Buffer SB20X
Vasos de Precipitado Colorante de Carga
Puntas para Pipeta Bromuro de Etidio
Guantes de Ltex Hidrxido de Sodio
Cmara de Electroforesis Acido Brico
Fotodocumentador
Peine
Fuente de poder.
Matraz Earlenmayer
Probetas
Buffer SB20X

Primero se hicieron clculos para preparar el Buffer SB 20X, aunque ya

estaba preparado.
Se preparo agregando 2gr de hidrxido de sodio a L de agua
destilada y se ajusto a ph 8.0 con Acido Brico. Una vez que se hizo
esto se realizo una dilucin para dejar el Bufer a 1X que es el que se va
a emplear (Se ponen 950mL de agua destilada + 50mL de Buffer SB 20X)

Preparacin del gel.

1. Preparar una solucin de agarosa al 1.2% en buffer SB.

2. Fundir la solucin en horno de microondas al 80% de poder.
3. Preparacin del portageles.
4. Sellar ambos extremos del portageles con Diurex.
5. Colocar el peine a 1 cm. del extremo del portageles y a 1-2 mm de
la base del mismo.
6. Vaciar la agarosa a una temperatura que se soporte y dejar
solidificar a temperatura ambiente con cuidado de no mover.
7. Despus se sumerge el gel dentro de la cmara de electroforesis
que contenga el buffer SB 1X.

Preparacin de la muestra.

1. Cortar un pedazo delgado de papel parafilm.

2. Colocar 2l de la muestra previamente purificada.
3. Agregar 6 l del colorante del frente de corrida (buffer de carga).
4. Mezclar con la micropipeta.
5. Tomar los 8l y colocarlos en el pozo del gel.
6. Corrimiento electrofortico.
7. Aplicar corriente al gel, 120V durante 30 min o hasta que la lnea
de corrida llegu a la mitad.
Nota la molcula de ADN tiene carga negativa.

8. Se apaga el aparato, se saca el gel como si se desmoldara una

gelatina con sumo cuidado.
Tincin

Despus de la separacin electrofortica, sumergir en una

solucin de bromuro de etidio durante 15 min.

Visualizacin en el fotodocumentador

1. Se pone la memoria.
2. Se enciende la luz blanca.
3. Se coloca dentro el Gel en el centro y se cierra.
4. Enfocar y se enciende la Luz UV.
5. Se observa y se toman fotografas para compararlas con el testigo.

RESULTADOS

Carril 1 Solo

Carril 2 Muestra 1 Phitophtora infestans (Dr. Valera)

Carril 3 Solo

Carril 4 Muestra 2 Phitophtora infestans (Dario)

Carril 5 Muestra 3 Planta (Fabiola)

Carril 6 Muestra 4Pulgon (Daniel)

Carril 7 Muestra 5 Raz (Xochilt)

Carril 8 Muestra 6 Hoja (Alicia)

BIBLIOGRAFA

Karp, G., 2008, Biologia Celular y Molecular, Conceptos y

Experimentos. 5 Edicin, Editorial Mc Graw Hill, China, pp. 754