Técnicas Analíticas e Instrumentación

ANALISIS
FASE FASE FASE

PREANALITICA ANALITICA POSTANALITICA
Recoleccin Reactivos
Estndares
Identificacin Medicin de
Volumen volmenes Clculos
Alcuotas Recipientes Transcripcin
Mezclado
Preservacin Tiempo de reaccin Transmisin
Transporte Temperatura Interpretacin
Conservacin de incubacin
Instrumentos
Tratamiento Analista
TCNICAS ANALTICAS MS FRECUENTEMENTE
UTILIZADAS EN QUIMICA CLNICA
2
Conceptos del proceso
Un anlisis es un proceso que proporciona
informacin fsica o qumica sobre los
constituyentes de un espcimen.
Una medida es la determinacin experimental de

las propiedades fsicas o qumicas de una
sustancia.
Una tcnica es cualquier principio fisico o qumico

que puede utilizarse para estudiar una sustancia.
3
Conceptos del proceso
Un mtodo es la aplicacin de una tcnica para
determinar una sustancia especfica en una
determinada matriz.
Un procedimiento es un conjunto escrito de

instrucciones que detalla la aplicacin de un
mtodo.
Un protocolo es un conjunto de instrucciones

escritas estrictas que concretan el procedimiento
que debe seguirse.
4
Fase analtica
Anlisis
Anlisis Qumico
Instrumental Resultado
5
Ejemplos de Instrumentos Analticos
Balanza pHmetro Microondas Refractmetro
Espectrofotmetro GC HPLC AA
IR HRMN Turbidimetro Fluormetro

TCNICAS ANALTICAS MS FRECUENTEMENTE UTILIZADAS EN
QUIMICA CLNICA
1. Tcnicas espectroscpicas
2. Tcnicas electroqumicas
3. Tcnicas de separacin
4. Radiactividad
5. Biologa molecular
7
Tcnicas espectroscpicas
Espectroscopia de absorcin molecular Uv-
vis.
Espectroscopia de fluorescencia.
Espectroscopia de luminiscencia.
Espectroscopia de dispersin.
Espectroscopia atmica
8
Espectroscopia de absorcin molecular Uv-vis
En los laboratorios clnicos se utilizan las tcnicas

espectroscpicas para la determinacin cuantitativa de
muchas sustancias en los medios biolgicos.
Ms del 90% de las determinaciones que se realizan en

Qumica Clnica tienen como paso final la lectura de una
absorbancia o una transmitancia.
Los mtodos de anlisis de espectroscopia de absorcin

molecular miden la concentracin de las sustancias en
disolucin por la absorcin de luz que presentan estas o sus
derivados a determinadas longitud de onda.
(Ley de Lambert-Beer)
A acl
21
Fase analtica
Anlisis
Anlisis Qumico
Instrumental Resultado
22
Para determinar la concentracin de un compuesto se mide su

absorbancia, si el compuesto absorbe, transformndolo en otro que
absorba o hacindolo que forme parte de una reaccin por medio
de su reaccin con los reactivos adecuados (reactivos qumicos o
sistemas enzimticos en combinacin con los primeros).
A + B C+ D Reaccin auxiliar
D+PQ+R Reaccin indicadora
La reaccin en que se transforma la sustancia que se determina se

denomina auxiliar.
La reaccin utilizada para la medida se denomina indicadora.
23
Fase Analtica
Reaccin
Anlisis auxiliar
Subsiguiente
Qumico Reaccin
indicadora
Precedente
24
Las reacciones indicadoras pueden ser subsiguientes o

precedentes:
Reaccin subsiguiente: se mide un producto de la reaccin

auxiliar.
A + B C+ D Reaccin auxiliar
D+PQ+R Reaccin indicadora
Ejemplo: Acido rico, mtodo de la uricasa
Acido rico 2 H 2O uricasa

alantona CO2 H 2O2
H 2O2 cromgeno compuesto coloreado 4 H 2O
peroxidasa
25
Reacciones precedentes son aquellas en las que la reaccin

proporciona una sustancia que a su vez reacciona de forma
estequiomtrica con la sustancia que quiere analizarse en la
reaccin auxiliar, lo cual da lugar a un producto medible.
U + V X+ Y Reaccin indicadora
A+Y B+C Reaccin auxiliar
Ejemplo: Urea, mtodo de diacetilmonoxima

Diacetilmonoxima H 2O
H
Diacetilo Hidroxilamina

Diacetilo Urea
H
Derivado diaznico
26
La medida de la concentracin se realiza con 2 tipos de

mtodos: punto final y cinticos.
Mtodos de Punto Final (mtodo de equilibrio): se incuba la

disolucin reaccionante con la muestra, el tiempo necesario
para que se complete la reaccin o se alcance el equilibrio.
En los mtodos cinticos o de medida de la velocidad de

reaccin, la variacin de la absorbancia se determina con el
tiempo, que se relaciona con la concentracin.
27
Fase analtica
Tcnica Tcnica
Qumica Instrumental Resultado
28
Fotocolorimetra:
- Incide un haz de luz monocromtico perpendicularmente a un tubo de solucin
coloreada.
- Parte de energa incidente (I0) es absorbida por la solucin y otra transmitida (I1)
- I1 depende de c= concentracin solucin(moles / L)

l= distancia atravesada por la luz
-Segn la ley de Lambert-Beer:
= coeficiente de absortividad molar del mensurando
I0 = I1 x 10-x x c
I0 = 10-x x c
I1
Log I0 = x x c
I1
x x c= A A= absorbancia
y = cte
A=k x c Ec. de una recta que pasa por origen.
As se puede determinar
A = acl la concentracin de la
solucin problema.
29
Fuente: Dra. Yania Surez Prez MAESTRIA LABORATORIO CLINICO
Espectrofotmetro
Es un instrumento que se usa para medir
la absorbancia de una muestra en funcin
de la longitud de onda de la radiacin
electromagntica.
El espectrofotmetro consta de los

siguientes componentes clave: fuente,
dispositivo de dispersin, rea de muestra
y uno o ms detectores.
Fuente genera radiacin electromagntica: Puede que genere luz de longitudes de

onda entre 400-700 nm, o bien para la zona ultravioleta (200-400 nm).
El dispositivo de dispersin: selecciona una determinada longitud de onda.
El rea de muestra es donde se contiene el material bajo estudio.
El detector sirve para medir la intensidad de la radiacin.

31
Lmpara Lmpara de
VIS UV-VIS
de W W y D2
Filtros Cubetas Cromadores

para la de vidrio, (prismas y Cubetas de
dispersin plstico o redes de cuarzo
de la luz cuarzo difraccin)

34
35
36
37
38
39
40
Hitachi 704
Hitachi 717
Hitachi 902 Modular P - 800

Fase Analtica
Curva de
calibracin
Con
estandard
Factor de
Tcnica calibracin
Absorbancia
Instrumental
Sin Coeficiente de
estndar extincin molar
42
Mtodos de punto final
Estndar: es una preparacin que contiene una concentracin
conocida de un elemento o sustancia especfica.
Usualmente son slidos que cumplen con las siguientes

caractersticas:
Tienen composicin conocida
Deben tener elevada pureza.
Debe ser estable a temperatura ambiente.
Debe ser posible su secado en estufa.
No debe absorber gases.
Debe reaccionar rpida y estequiomtricamente con el
titulante.
Debe tener un peso equivalente grande.
43
Standard Soluciones standar
Estndar primario: la masa puede determinarse
exactamente pesando la sustancia pura.
Solucin estndar primario: solucin estndar de

concentracin conocida. Se prepara pesando el estndar
primario y disolviendo en un solvente adecuado.
Standard secundario: la masa slo puede determinarse por

medio de anlisis qumicos.
Soluciones estndar secundario: se prepara disolviendo un

estndar secundario en un solvente apropiado.
44
Curva de calibracin
La concentracin tambin puede obtenerse

construyendo una curva patrn con soluciones
de concentracin conocida, llamada Curva de
Calibracin.
Qu es una curva de calibracin?
Se trata de una curva de referencia construida a partir

de la respuesta de cantidades conocidas de un
analito ante una reaccin.
45
Se utiliza para determinar la cantidad del analito (ej. protenas) presente en
una muestra incgnita.
Se relaciona la concentracin del

analito con la intensidad de color
que genera una reaccin.
La relacin mientras sea lineal

cumple con la ley de Lambert-
Beer.
La intensidad del color se puede

determinar por el mtodo
fotocolorimtrico.
46
Construccin de la curva de calibracin:
Preparar varias concentraciones lo ms exactas posibles (soluciones
calibradoras) de lo que se desea analizar, a partir de una solucin patrn o
estndar. (ej. ONF 5x 10-4 M).
Para la preparacin de los calibradores (sustancias qumicas de certificada

pureza) se debe utilizar un diluyente puro el cual debe ser medido con
exactitud.
A cada tubo se le agrega la solucin patrn ( ej. : estndar de glicgeno 0.025%

p/v) en diferentes concentraciones dependiendo del rango del mtodo, excepto
el blanco.
Todos los tubos debern tener el mismo volumen final, por lo que hay que
diluir con agua destilada, y agitar.
Luego se agrega el reactivo: ej. reactivo de Biuret.
47
Se mide la variacin de color en el espectrofotmetro , ajustando a cero la
maquina con el blanco antes de medir la absorbancia.
Al final se obtienen las absorbancias para las diferentes

concentraciones de los patrones y se puede hacer la curva de calibracin. As se
puede obtener el factor de calibracin.
Cundo no se cumple la ley de L-B?
A partir de concentraciones 0.01M hay

desviaciones de linealidad.
radiacin no monocromtica.
Existencia de otros equilibrios en la

solucin (acido-base, formacin de
complejos) ya que se modifican la
concentracin de la sustancia estudiada.
48
Validacin de la Curva de Calibracin
Para validar los resultados obtenidos de un experimento

se deben tener en cuenta los siguientes factores:
Los clculos que se realizan para las mediciones deben
incluir la menor cantidad de pipetas y micropipetas.
Preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia
de inters.
La construccin de la curva debe incluir los intervalos de
confianza.
49
50
Regresin lineal: Mtodo para obtener la relacin ms precisa entre
la variable independiente y los mltiples valores que puede tomar la
variable dependiente.
Permite encontrar la ecuacin de la recta que mejor asocia los

valores de las mediciones experimentales presentes en la curva de
calibracin.
Y = seal medida
X = variable independiente
a = coeficiente lineal
b = coeficiente angular
51
Ejemplo: DETERMINACION DE LA GLICEMIA
Solucin patrn de glucosa 0.2 mg/ml rango :0.01- 0.2mg
Se preparan 4 tubos con diferentes concentraciones de glucosa a partir de la

solucin patrn.
Entonces si: 0.2 mg1ml x=0.25ml
0.05mg X
-Se hace lo mismo para todas las concentraciones, quedando:
Tubo 1 2 3 4 blanco Muestra

problema
Glucosa 0.2 0.25 0.5 0.75 1 - -
mg/ml (ml)
Mg glucosa 0.05 0.1 0.15 0.2 - -
Muestra - - - - - 1
problema
(ml)
H2 O 0.75 0.5 0.25 1 1 -
Despus se mezclan y se ponen a hervir por 10 minutos, luego se sacan y sin
agitar se enfran.
Se agregan 1 ml de reactivo de somogyi a todos los tubos. 52
Se mezcla nuevamente y se agregan 7 ml de agua destilada
Mezclar y determinar absorbancia a 540 nm, y se obtiene:

Tubos mg de Glucosa Absorbancia (540
nm)
0,0 0
Como la ec. es y = 5.4667x
1
0,05 0,27
Pendiente= 5.4667= k= factor
2
3 0,1 0,56 de calibracin.
4 0,15 0,79
5 0,2 1,11 Como la muestra problema tiene

Muestra problema - 0,41 una A de 0.41, y como k= 5.4667
podemos calcular la
Curva de Calibracin concentracin del analito:
y = 5,4667x
Absorbancia (540 nm)
1,4 c=A/k c= 0.41/ 5.4667

1,2
1
0,8 c= 0.0749 mg/ ml
0,6
0,4
0,2
0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
mg de Glucosa 53
54
Uso de soluciones standard
La concentracin del espcimen viene dada por
Ae
ce cst
Ast
Donde: ce = concentracin del analito

Ae = absorbancia del desconocido
Ast = absorbancia del estndar
cst = concentracin del estndar
55
Uso de soluciones standard
Constante = F
Ae
ce cst
Ast
F = factor de calibracin
ce Ae F
Es una buena prctica de laboratorio correr el standard

peridicamente.
56
Sin soluciones standard
Alternativamente puede obtenerse la concentracin sin

utilizar soluciones estndar, conociendo el coeficiente de
extincin molar del compuesto ():
A = cl
1
ce * Ae
l
donde ce = concentracin del analito
= coeficiente de extincin molar del compuesto
Ae = absorbancia del desconocido
ce K Ae
57
K =factor por el que hay que multiplicar la absorbancia y

que debe incluir la dilucin:
1 Vt
K Pe
l Ve
Donde:
Vt = volumen total de la mezcla de reaccin
Ve = volumen del espcimen
Pe = peso molecular del espcimen.
58
Ejercicio 1
59
Ejercicio 2
60
Soluciones blanco
Los orgenes de dicha absorbancia son:
Contaminacin de los reactivos.
Presencia de sustancias que reaccionan de igual forma a
la muestra.
Color de los reactivos
Conocidas tambin como Blancos de reactivo.
Tienen como finalidad determinar la absorbancia

de la solucin final derivada de los reactivos.
61
Soluciones blanco
Usos de los blancos:
Ajuste a 100 % T u O.000 de absorbancia con agua

destilada/solvente.
Aproblema = Aleda Ablanco
Ajuste a 100 % T u 0.000 de absorbancia con el

reactivo.
62
Mtodos cinticos
En los mtodos cinticos o de medida de la velocidad
de reaccin, la variacin de la absorbancia se
determina con el tiempo, que se relaciona con la
concentracin.
Los mtodos de medida pueden ser enzimticos y no

enzimticos.
Las reacciones de primer orden o de seudoprimer

orden son las ms empleadas en las determinaciones
cinticas de la concentracin de las sustancias.
63
Mtodos cinticos
Se caracterizan siempre por
presentar curvas de
concentracin/tiempo exponenciales.
La variacin de la absorbancia es
directamente proporcional a la
concentracin inicial del sustrato, si
se mantienen constantes los tiempos
de medida t1 y t2.
Los analizadores automticos son

sistemas muy adecuados para los
anlisis cinticos. Son rpidos y
menos sensibles a interferencias
externas (turbidez y color del
espcimen) que los de punto final.
64
Medida de las actividad enzimtica
Como las enzimas estn presentes en cantidades tan bajas y
mezcladas con otras sustancias en el plasma, se aprovecha su
propiedad de catalizar reacciones qumicas para medir la
actividad enzimtica y no la concentracin.
La medicin de la actividad de una enzima implica siempre

medidas de la velocidad de reaccin.
Se mide mediante la formacin de productos o el

agotamiento de sustratos durante un intervalo de tiempo.
65
Medida de la actividad enzimtica
66
Al efectuar la determinacin de la
actividad enzimtica se obtiene
una curva progreso con tres
fases:
1. retraso,
2. velocidad inicial,
3. velocidad reducida.
La reaccin sigue un curva

exponencial.
67
Una vez mezclados la enzima
sus sustratos y cofactores, la
velocidad de reaccin
aumenta rpidamente (fase de
retraso), hasta alcanzar un
valor en el que permanece
constante (velocidad inicial) y
la concentracin del producto
aumenta en forma lineal. Esta
es la fase en la cual debe
determinarse la actividad de la
enzima.

68
Posteriormente la velocidad
disminuye y el tiempo es
mayor (velocidad reducida),
la proporcionalidad no se
mantiene debido a diversos
factores que incluyen la
disminucin de la
concentracin del sustrato,
efectos de la inhibicin del
producto, desnaturalizacin
de la enzima, entre otros.
69
Mtodos de medicin de la actividad enzimtica
Tiempo fijo (punto final, anlisis en 2 puntos)
Se incuba la enzima con el

sustrato un tiempo determinado
y se mide la variacin de la
absorbancia durante ste.
Se supone que la medida se la

realiza en la parte lineal de la
reaccin, donde la velocidad y ,
por tanto, la actividad enzimtica
son proporcionales al tiempo de
medicin.
70
Mtodos de medida de la actividad enzimtica
Velocidad de reaccin (puntos mltiples)

Se mide la variacin de la
absorbancia en la unidad de
tiempo, para lo cual se
toman varias lecturas en el
curso de la reaccin.
Es ms prctico ya que
cualquier desviacin de la
linealidad es detectable.
71
Medida de las actividades enzimticas
Factor de conversin 1 mol/l = 106 U/l = 106 mU/ml

72
73
74
75
Ejercicio 3
3. A partir de los siguientes datos obtenidos en un laboratorio
al procesar una muestra de suero de un paciente para
determinar ALP, determine la actividad de la enzima.
Datos Valor
Absorbancia inicial 0.100
Absorbancia (1 min) 0,135
Volumen total de la mezcla de reaccin 1,020 ml
Volumen de muestra 0,020 ml
18.50 x 103 L.mol-1.cm-1
Longitud de paso de luz 1 cm
76
Ejercicio 3
77
Ejercicio 3
78
Expresin de resultados
Se ha expresado de muchas maneras: g/l, mg/l, mg/ml, g %,
mg/100 ml, mg/dl, ppm.
Durante muchos aos las determinaciones enzimticas

recibieron valores basados en unidades arbitrariamente
elegidas.
La IUB recomend el uso de la Unidad enzimtica (U) que

presenta desventajas: los valores obtenidos por un mtodo no
son generalmente convertibles.
79
Todos los procesos qumicos de los organismos biolgicos
estn gobernados por las leyes fundamentales de la qumica.
1.0 mmol de Hb + 4.0 mmol de O2 que contiene 40 mmol de Fe 34.0 mmol de

bilirrubina
Los resultados de las mediciones deben expresarse con

magnitudes y unidades relacionadas con tomos, iones o
molculas.
La OMS adopt la resolucin WHA 30.39 que recomendaba el

uso del Sistema Internacional de Unidades (SI).
80
La norma emitida por el Instituto Ecuatoriano de
Normalizacin INEN, indica la aplicacin del
Sistema Internacional de Unidades (SI).
El item 5.8.3 de la Norma 15189 Laboratorios

Clnicos. Requisitos particulares relativos a la
calidad y la competencia establece que el
Informe de laboratorio debe incluir:
h) los resultados del anlisis expresados en unidades
SI o unidades trazables al SI.
81
Ventajas:
Proporciona un lenguaje comn entre varias disciplinas cientficas.
Numerosas revistas cientficas exigen el uso del sistema SI para
expresar las mediciones en los trabajos publicados en ellas.
En los protocolos de anlisis que se adjuntan a los kits comerciales, ya
se incluye esta forma de expresin de resultados.
Desventajas:
Reemplazar o revisar instrumentos.
Proporcionar nuevas tabla de valores de referencia.
Adaptacin del mdico a nuevas cifras.
82
Magnitudes y unidades
Magnitud Unidad Abreviatura
Cantidad de sustancia (n) Mol -
Concentracin de cantidad de sustancia Mol/Litro mol /L
Actividad cataltica (z) Katal kat
Concentracin de actividad cataltica (b) Katal/Litro kat/L
cantidad de sustancia
Concentracin de cantidad de sustancia
volumen de muestra
actividad cataltica
Concentracin de actividad cataltica
volumen de muestra
83
Informe de laboratorio
Debe contener para cada determinacin una informacin
exhaustiva y no ambigua.
Debe incluir datos: sistema (tipo de muestra primaria),

componente que se determina, magnitud usada o medida,
valor numrico, unidad SI.
Pueden agregarse datos: estado del paciente, valores de

referencia.
Los componentes deben designarse con propiedad para evitar

confusiones (estado de la sustancia en el fluido o sistema.)
84
85
86
87
Espectrofotmetro
88

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ANALISIS

FASE FASE FASE

Una medida es la determinacin experimental de

Una tcnica es cualquier principio fisico o qumico

Un procedimiento es un conjunto escrito de

Un protocolo es un conjunto de instrucciones

Balanza pHmetro Microondas Refractmetro

IR HRMN Turbidimetro Fluormetro

En los laboratorios clnicos se utilizan las tcnicas

Ms del 90% de las determinaciones que se realizan en

Los mtodos de anlisis de espectroscopia de absorcin

Para determinar la concentracin de un compuesto se mide su

La reaccin en que se transforma la sustancia que se determina se

La reaccin utilizada para la medida se denomina indicadora.

Las reacciones indicadoras pueden ser subsiguientes o

Reaccin subsiguiente: se mide un producto de la reaccin

Ejemplo: Acido rico, mtodo de la uricasa

Acido rico 2 H 2O uricasa

Reacciones precedentes son aquellas en las que la reaccin

Ejemplo: Urea, mtodo de diacetilmonoxima

La medida de la concentracin se realiza con 2 tipos de

Mtodos de Punto Final (mtodo de equilibrio): se incuba la

En los mtodos cinticos o de medida de la velocidad de

- I1 depende de c= concentracin solucin(moles / L)

El espectrofotmetro consta de los

Fuente genera radiacin electromagntica: Puede que genere luz de longitudes de

El dispositivo de dispersin: selecciona una determinada longitud de onda.

El rea de muestra es donde se contiene el material bajo estudio.

El detector sirve para medir la intensidad de la radiacin.

Filtros Cubetas Cromadores

Fuente: Dra. Yania Surez Prez MAESTRIA LABORATORIO CLINICO

Hitachi 902 Modular P - 800

Usualmente son slidos que cumplen con las siguientes

Solucin estndar primario: solucin estndar de

Standard secundario: la masa slo puede determinarse por

Soluciones estndar secundario: se prepara disolviendo un

La concentracin tambin puede obtenerse

Qu es una curva de calibracin?

Se trata de una curva de referencia construida a partir

Se relaciona la concentracin del

La relacin mientras sea lineal

La intensidad del color se puede

Para la preparacin de los calibradores (sustancias qumicas de certificada

A cada tubo se le agrega la solucin patrn ( ej. : estndar de glicgeno 0.025%

Luego se agrega el reactivo: ej. reactivo de Biuret.

Al final se obtienen las absorbancias para las diferentes

Cundo no se cumple la ley de L-B?

A partir de concentraciones 0.01M hay

Existencia de otros equilibrios en la

Para validar los resultados obtenidos de un experimento

Permite encontrar la ecuacin de la recta que mejor asocia los

Solucin patrn de glucosa 0.2 mg/ml rango :0.01- 0.2mg

Se preparan 4 tubos con diferentes concentraciones de glucosa a partir de la

Tubo 1 2 3 4 blanco Muestra

Mezclar y determinar absorbancia a 540 nm, y se obtiene:

5 0,2 1,11 Como la muestra problema tiene

1,4 c=A/k c= 0.41/ 5.4667

La concentracin del espcimen viene dada por

Donde: ce = concentracin del analito

Es una buena prctica de laboratorio correr el standard

Alternativamente puede obtenerse la concentracin sin

K =factor por el que hay que multiplicar la absorbancia y

Tienen como finalidad determinar la absorbancia