USP 39-NF 34 Contenido iii

Contenido
VOLUMEN 1 Artculos Nuevos que Aparecen en USP 39 Ausentes
en USP 38 y sus Suplementos .......... xxxviii

Artculos Incluidos en USP 38 Ausentes

en USP 39 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxix
Declaracin de la Misin y Prefacio . . vii
Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

Integrantes del Ciclo de Revisin

2010-2015 ....................... xiii Advertencias
Funcionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . 1

junta Directiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii

Captulos Generales
Consejo de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
Ver pgina 63 para detalles del contenido
Comits de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv
Pruebas y Valoraciones Generales . . . . . . . . . . . 67
Grupos Asesores ........................ xxii
Requisitos Generales para Pruebas y
In Memriam .......................... xxii Valoraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Miembros y Delegados de la Conven- Aparatos para Pruebas y Valoraciones . . . . . . . 114
cin de la Farmacopea de los
Estados Unidos de Amrica, a partir Pruebas Microbiolgicas . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
del 31 de mayo de 2015 . . . . . . . . . . xxiii Pruebas y Valoraciones Biolgicas . . . . . . . . . . 154
Reconocimiento para los Donantes de Pruebas y Valoraciones Qumicas . . . . . . . . . . . 243
Materiales de Referencia y de
Monografas en 2014 ............. xxx Pruebas y Determinaciones Fsicas . . . . . . . . . . 454

Informacin General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 820

Acta Constitutiva .................. xxxii Suplementos Dietticos ................. 2213
Gobierno de la USP ................ xxxiii
Estatutos ............................. xxxiii Reactivos, Indicadores y
Normas y Procedimientos ................ xxxiii Soluciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2279

Polticas de la USP ...................... xxxiii Especificaciones de Reactivos . . . . . . . . . . . . . 2284

Indicadores y Papeles Indicadores de

Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2366
Incorporaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxvii Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2369
Artculos Incorporados a USP 39 mediante Soluciones Amortiguadoras . . . . . . . . . . . . 2369
Suplementos ......................... xxxvii
iv Contenido USP 39-NF 34

Soluciones Colorimtricas 2370

Soluciones Reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2371 ndice

Soluciones Volumtricas. . . . . . . . . . . . . . . 2381 ndice Combinado de USP 39 y NF 34 . . . . . . . 1-1
Columnas Cromatogrficas . . . . . . . . . . . . . . 2391

Tablas de Referencia VOLUMEN 3

Envases para Dispensar Cpsulas y Tabletas . . 2397

Descripcin y Solubilidad Relativa de Artculos Gua para los Captulos Generales . . . . vii
de la USP y del NF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2408

Solubilidades Aproximadas de Artculos de la Advertencias

USP y del NF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2472
,
Pesos At om1cos ...................... . 2481 Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . xi

Masas Atmicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2484

Tabla Alcoholimtrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2486

Tabla de Viscosidad Intrnseca . . . . . . . . . . . . 2488

USP 39
Equivalencias de Temperatura . . . . . . . . . . . . 2490

Monografas
ndice Monografas Oficiales de USP 39, 1-Z ...... 4705
ndice Combinado de USP 39 y NF 34 . . . . . . . 1-1

ndice
ndice Combinado de USP 39 y NF 34 ....... 1-1

VOLUMEN 2
VOLUMEN 4
Gua para los Captulos Generales . . . . vii
Gua para los Captulos Generales. . . . vii

Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . xi Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales .......... xi

USP 39
Suplementos Dietticos
Monografas Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6919
Monografas
Monografas Oficiales de USP 39, A-H ...... 2493
USP 39-NF 34 Contenido v

Excipientes
NF 34
Excipientes USP y NF, Agrupados por
Categora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7645

Incorporaciones
Monografas
Artculos Nuevos que Aparecen en NF 34
Ausentes en NF 33 y sus Suplementos . . . . 7643 Monografas Oficiales de NF 34. . . . . . . . . . . 7655

Artculos Nuevos que Aparecen en NF 34 . . . 7643

Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7644

ndice
ndice Combinado de USP 39 y NF 34 ....... 1-1
USP 39
Misin y Prefacio
USP 39-NF 34 y sus
Suplementos
Este apartado brinda informacin sobre la Convencin de
la Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP), as
como tambin informacin general sobre la 39. revisin de men 7 incluye secciones de preliminares (Misin y Prefacio,
la Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP 39) y la
34. edicin del Formulario Nacional (NF 34) y sus Suplemen-
tos. Los textos de USP 39-NF 34 sern oficiafes a partir del
1 de mayo de 2016, los textos del Primer Suplemento de
USP 39-NF 34 sern oficiales a partir del 1 de agosto de
2016 y los textos del Segundo Suplemento de USP 39-NF 34
sern oficiales a partir del 1 de diciembre de 2016, a me-
nos que se indique algo diferente.
DECLARACIN DE LA MISIN
Los compendios USP-NF se publican en cumplimiento con
la misin de la USP: Mejorar la salud en todo el mundo a
travs de normas pblicas y programas relacionados que ayu-
den a garantizar la calidad, seguridad y beneficio de Jos medi-
camentos y alimentos.
HISTORIA
La USP tiene una historia rica, que remonta a 1820
cuando once mdicos se reunieron en la Cmara de Sena-
dores del Capitolio de los EE.UU. para establecer una farma-
copea para los EE.UU. Puede aprender ms sobre la historia
de la USP y los acontecimientos ms importantes, dirigin-
dose al sitio Web de la USP (http://www.usp.org/about-usp/
our-history).
CONTENIDO DE LOS COMPENDIOS USP-NF
Los compendios USP-NF contienen monografas de sus-
tancias (ingredientes) y productos para artculos oficiales re-
conocidos en los compendios USP-NF (ver Advertencias y Re-
quisitos Generales 2.20 Artculos Oficiales). Salvo escasas
excepciones, todos los artculos sobre los que existen mono-
grafas en los compendios USP-NF se comercializan legal-
mente en los EE.UU. o estn contenidos en artculos que se
comercializan legalmente. Los compendios USP-NF tambin
incluyen monografas para preparaciones magistrales.
Una monografa de los compendios USP-NF de una sus-
tancia, producto o preparacin oficial puede constar de va-
rios componentes, incluido el nombre del artculo, la defini-
cin, las condiciones de envasado, almacenamiento y otros
requisitos, y una especificacin. Los captulos generales pro-
porcionan los procedimientos gue se citan con frecuencia, a
veces con criterios de aceptacion, con el fin de compilar en
un solo lu9ar informacin repetitiva que se aplica a muchas
monograf1as. Para mayor informacin sobre normas en las
monografas y captulos generales de los compendios
USP-NF ver Advertencias y Requisitos Generales, 3. 7O Aplicabi-
lidad de las Normas.
Las monografas y captulos generales, nuevos, eliminados
y revisados de esta edicin se indican en el apartado
Incorporaciones.
Misin y Prefacio vii
Organizacin de los Compendios USP-NF-Los com-
pendios USP-NF se publican en cuatro volmenes. El Volu-
Integrantes, sitios Web y pginas del Gobierno de la USP e
Incorporaciones/Lista Detallada). Asimismo, incluye Adverten-
cias y Requisitos Generales, Captulos Generales, captulos ge-
nerales de Suplementos Dietticos, Reactivos y Tablas de Refe-
rencia. El Volumen 2 incluye monografas de la USP
correspondientes a las letras A-H y el Volumen 3 incluye mo-
nografas de la USP correspondientes a las letras 1-Z. El Volu-
men 4 incluye monografas de Suplementos Dietticos, Incor-
poraciones del NF/Lista Detallada, Excipientes y monografas
del NF. Para facilitar el uso y referencias convenientes, todos
los cuatro volmenes incluyen el ndice combinado, as
como las Advertencias y Requisitos Generales y la Gua para
los Captulos Generales. Los captulos generales especficos
para los suplementos dietticos se incluyen por orden nu-
mrico con los dems captulos generales en la USP. Las
monografas de excipientes se presentan por lo general en
el NF, pero pueden tambin aparecer en la USP, con la refe-
rencia cruzada correspondiente cuando tambin son frma-
cos. El apartado Excipientes (Volumen 4) presenta una tabla
de los excipientes organizados por categora funcional.
Suplementos-Los Suplementos de USP-NF se rigen por
un programa de publicacin estndar anual: el Primer Suple-
mento se publica en febrero y se oficializa el 1 de agosto. El
Segundo Suplemento se publica en junio y se oficializa el 1
de diciembre. Los usuarios de los productos impresos de la
USP deben conservar los Suplementos y verificar la seccin
de "Official Text" (Texto Oficial) del sitio Web de la USP
para contar con el texto oficial actualizado. La versin en
lnea de los compendios USP-NF se actualiza con cada Suple-
mento o con la revisin anual. Cada vez que se publica una
nueva edicin o Suplemento durante la suscripcin vigente,
se publica una nueva versin electrnica. El Indice de cada
Suplemento es acumulativo e incluye citas de la revisin
anual y, en el caso del Segundo Suplemento, citas del Primer
Suplemento. Los dos Suplementos se incluyen en la siguiente
edicin anual, junto con las nuevas revisiones oficiales que
hayan sido adoptadas con posterioridad al Segundo Suple-
mento de la edicin previa de los compendios.
Revisiones de USP-NF-Los compendios USP-NF se revi-
san en forma continua mediante un proceso excepcional de
participacin pblica e interaccin sustancial entre la USP y
sus partes interesadas, tanto a nivel nacional como interna-
cional. Las revisiones se presentan anualmente, como Revi-
siones de Normas en USP-NF y en los Suplementos semestra-
les, y como Revisiones Aceleradas en el sitio Web de la USP
[Fe de Erratas, Anuncios de Revisin Intermedia (lnterim Revi-
sion Announcement (IRA) y Boletines de Revisin (Revision Bul-
letins)].
Revisiones de Normas-El proceso de revisin de normas
de la USP requiere la publicacin de las propuestas de la
revisin en el Pharmacopeial Forum (PF) durante un perodo
de notificacin y comentarios de 90 das y, despus de la
aprobacin del Comit de Expertos pertinente de la USP, se
publica la revisin en los prximos compendios USP-NF o
Suplemento, segn corresponda. Aprenda ms sobre el pro-
viii Misin y Prefacio USP 39

ceso de desarrollo y revisin en el sitio Web de la USP Tipo de Revisin Smbolo Subndice
(http://www.usp.org/usp-nf/development-process). Anuncio de texto nuevoec1RA01-;"1- (IRA 01-jul-2016) *
Revisiones Aceleradas-Se usa el proceso de Revisin Ace- Revisin Inter- 2016)

lerada para oficializar revisiones de USP-NF en forma ms media

rpida que a travs del proceso de Revisin de Normas de la Boletn de texto nuevoe CBR01-eoe- (BR 01-ene-2016)*
USP. Apr~nda ms S?bre los Boletines de Revisin, .Anl!ncios Revisin 2016)
de Rev1sion Intermedia (IRA) y Fe de Erratas, y el cnteno para Texto eliminado e(IRAOl-jul-2016) (IRA 01-jul-2016) *
cada uno y la implementacin de cada uno en el sitio Web 1 S (USP39) 0 1 S (USP39/
de la USP (http://www.usp.org/usp-nf/official-text).
.A..lo.(USP39) usp39**
Modificacin de Referencias Farmacopeicas-En oca-
Texto adoptado texto nuevo., srusPJ9! 1 S o 25 (edicin
siones, la USP y sus Comits de Expertos consideran necesa- anual de la USP)*
en los
rio modificar los ttulos de los captulos generales o de tex-
tos similares que pudieran estar referidos en otras normas en Suplementos
los compendios USP-NF. Cuando esto sucede, el personal de Texto adoptado texto nuevo,.1usPJ9J Edicin anual de la
en USP-NF usp**
la USP lleva a cabo un riguroso proceso para identificar y
actualizar tales referencias. Dichas actualizaciones pueden re- Armonizacin +texto nacional remanen-
alizarse mediante una revisin de rutina, o para casos en los te o texto no armoniza-
que una actualizacin no representa un cambio significativo do+
en el estndar en cuestin, mediante una actualizacin di- Erratas texto nuevoe crnR01-;"1- (ERR 01-jul-2016)
recta de la referencia en dicha norma sin necesidad de aviso 2016)
ni periodo de comentarios. En todos los casos, la USP publi- Referencias a ca- texto nuevoe (AFOl-my- (AF Ol-may-2016)
car en su sitio Web un aviso en el que se indique el cambio ptulos 2016)
de la fuente, cualquier referencia resultante y si dichas refe- texto nuevo e (Oficial 01-dic- (Oficial 01-dic-2016)
rencias se actualizarn a travs de una revisin de rutina o 201
una actualizacin directa.
* Un nmero o fecha en subndice indica el IRA, el Boletn de Revisin o
Actualizacin de la Informacin Qumica-Las actuali- el Suplemento donde la revisin apareci por primera vez.
zaciones de la seccin de Informacin Qumica al principio **Un ejemplo de una revisin que se oficializ en los compendios
de las monografas se realizan continuamente y no se identi- USP-NF sera usp39.
fican con smbolos de revisin. Los nombres qumicos y los
pesos molecu_lares se actualizan cuando la monografa s~ .so- La siguiente tabla presenta los smbolos y fechas oficiales
mete a revision para que correspondan con la fuente oficial, para los IRA y los Suplementos de los compendios USP 39-NF
Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus si- 34.
glas en ing!s). Las estructuras qumicas se actualizan de
forma continua.
Los nombres qumicos por lo general reflejan las conven- Fechas Oficiales y Smbolos
ciones al momento del desarrollo o revisin de la monogra- Para los Anuncios de Revisin Intermedia y los Suplementos de los
fa. Si las reglas de nomenclatura de CAS o IUPAC han su- Compendios USP 39-NF 34
frido cambios importantes, los nombres qumicos pueden Anuncio de
revisarse o agregarse para reflejar dichas reglas. Los pesos Revisin
moleculares se derivan de la frmula qumica y se basan en Suple- Intermedia
la tabla de pesos atmicos. Los pesos atmicos son los reco- mento Propuesto Fecha Oficial Smbolos
mendados por IUPAC y reflejan la composicin isotp.ica de 42(1) 1 de julio de 2016 ye(IRA 01-jul-2016)
material terrestre normal. Cuando se presenten cambios en 1 de agosto de 2016 y.1 S (USP39)
los valores recomendados por IUPAC, se entiende que los
cambios en los pesos moleculares se realizarn dentro del 42(2) 1 de septiembre de 2016 YCIRA 01-sep-2016)

tiempo esperado. 42(3) 1 de noviembre de 2016 YCIRA Ol-nov-2016)

La representacin grfica de las estructuras de compues- 2 1 de diciembre de 2016 y.25 (USP39)

tos qumicos tiene como propsito ayudar visualmente a es- 42(4) 1 de enero de 201 7 ye(IRA 01-ene-2017)
tablecer la identidad qumica y se entiende que representa 42(5) 1 de marzo de 2017 ye(IRA 01-mar-2017)
una de muchas formas posibles de representar la molcula. USP 42(6) 1 de mayo de 201 7
La introduccin de una representacin grfica as como 40-NF
Y<IRA 01-may-2017)

cambios que resulten en la misma informacin qumica, p.

ej., una molcula quiral invertida o agregando una estruc-.
tura molecular, se puede agregar fuera del proces.o de revi-
sin. Asimismo, se entiende que para el tautomensmo, la
molcula representada puede ser uno de los tautmeros,
pero se entiende que la intencin es representar todos los
ismeros en equilibrio. Los centros estereognicos represen-
tados con enlaces sin realce implican mezclas de estereme-
ros-enantimeros, diasteremeros, epmeros (anmeros), cial. Estos conos tambin estarn vinculados a las Revisiones
entre otros.
Dependien<:!o del mon:iento <:Je estas actualizaciones, l~
usuarios podnan notar d1ferenc1as en una estruc~ura qu1m1ca
entre las publicaciones del PF y de los compendios USP-NF,
as como entre la versin impresa y en lnea de los compen-
dios USP-NF.
Texto Sombreado y Smbolos-El texto sombreado se
usa para identificar el texto que ha sido modificado, agre-
gado o eliminado desde su ltima publicacin. Los smbolos
identifican el inicio y el final de cada revisin o de texto no
armonizado. La siguiente tabla resume los tipos de s~bc;ilos
y los subndices relacionados que se usan en las publicacio-
nes de la USP:
35
Asimismo, en la versin en lnea de los compendios
USP-NF las monografas y captulos generales que han sido
revisad~s, pero que an no se han publ!cado en los .c?m-
pendios USP-NF nj s~s Supler:ientos (p.ej., COl)l<? Rev1s1one~.
Aceleradas) incluiran iconos vinculados a la pagina en el s1t10
Web de la USP donde se puede revisar el nuevo texto ofi-
Aceleradas [p.ej., Boletines de Revisin (Revision Bulletins),
Anuncios de Revisin Intermedia (/RAs) y Fe de Erratas] y Ar-
monizacin en Etapa 6 (ver a continuacin la seccin Activi-
dades de Armonizacin).
Comentarios-Para las revisiones que se publican para su
revisin y comentarios pblicos en ~I PF, la propuesta pue~e
oficializarse o, en su defecto, repubhcarse en el PF par~ revi-
sin y comentarios adicionales. Si se reciben comentarios
adicionales, estos son considerados e incorporados por el
Comit de Expertos segn corresponda. Para los casos en
los que las propuestas se oficialicen sin necesidad de repu~
blicacin en el PF, se publica un resull!en de los comei:t~rnos
recibidos junto con las respuestas pertinentes del Com1te de
USP 39
Expertos en el apartado Comentarios del sitio Web de la USP
al momento de la publicacin de la revisin.
Los Comentarios no forman parte del texto oficial y no
estn destinados para su aplicacin por parte de autoridades
reglamentarias, sino gue explican los fundamentos de las
respuestas del Comite de Expertos a los comentarios pbli-
cos. En caso de discrepancia entre el contenido de los Co-
mentarios y el texto oficial, el texto oficial prevalecer. En
caso de controversia o cuestionamiento sobre la interpreta-
cin, prevalecer el lenguaje del texto oficial, de manera
nica e independiente de los Comentarios.
Presentaciones Impresas y Electrnicas-Para ms in-
formacin sobre los formatos disponibles de los compendios
USP-NF ver Advertencias y Requisitos Generales, 2.1 O Texto
Oficial.
Traducciones de USP-NF-Los compendios USP-NF se en-
cuentran disponibles en ediciones en espaol, ruso y chino.
El mantenimiento de la edicin en espaol sigue el mismo
enfoque de revisin que la edicin en ingls; las dems tra-
ducciones estn basadas en revisiones anteriores de los com-
pendios USP-NF.
Estndares de Referencia USP-EI uso de los Estndares
de Referencia USP promueve la calidad uniforme de los me-
dicamentos y sustenta la fiabilidad y uniformidad para aqu-
llos que llevan a cabo los anlisis para el cumplimiento de
las normas y dems usuarios de los compendios USP-NF,
incluidos fabricantes, compradores y autoridades reglamen-
tarias. Los Estndares de Referencia USP se citan en procedi-
mientos especficos tanto en monografas como en captulos
generales. La USP oficializa este material a travs de estudios
meticulosos de caracterizacin y de anlisis colaborativos,
seguidos por la revisin y aprobacin del uso farmacopeico
del material de referencia por parte de los Comits de Ex-
pertos del Consejo de Expertos. El Catlogo USP, que lista la
coleccin de Estandares de Referencia USP, y ms informa-
cin sobre uso y almacenamiento, se encuentra disponible
en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/reference-
standards). Este programa se beneficia de una amplia contri-
bucin voluntaria de materiales adecuados y de datos de
prueba ye_rtinentes por parte de fabricantes de productos
farmaceut1cos.
RGANOS DE GOBIERNO, DE ESTABLECIMIENTO DE
NORMAS Y DE ASESORAMIENTO DE LA USP
Los rganos de gobierno, de establecimiento de normas y
de asesoramiento de la USP incluyen la Convencin de la
USP, la Junta Directiva, el Consejo de Expertos y sus Comi-
ts de Expertos, Paneles de Expertos y personal. Otros cuer-
pos de voluntarios incluyen Foros de Partes Interesadas y
Equipos de Proyecto, que ofrecen a partes interesadas la
oportunidad de contribuir, mediante consejos y recomenda-
ciones, hacia el avance de las normas y procesos de la USP.
Aprenda ms sobre la composicin y trabajo de la Conven-
cin de la USP, la Junta Directiva, los Comits de Expertos y
los Paneles de Expertos en el sitio Web de la USP (http://
www.usp.org/about-usp/leadership/governance). Aprenda
ms sobre los Foros de Partes Interesadas y Equipos de Pro-
yecto en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/meet-
ings-courses/stakeholder-forums). La seccin Integrantes in-
cluye un listado actualizado de los Delegados de la
Convencin de la USP con derecho a voto y de los miem-
bros y enlaces gubernamentales ante el Consejo de Expertos
y sus Comits de Expertos y Paneles de Expertos.
Trabajo Conjunto con la Administracin de Alimentos
y Medicamentos de los Estados Unidos (Food and Drug
Administration o FDA)-Conforme a lo especificado por la
ley de los EE.UU., la USP trabaja con el secretario del De-
partment of Health and Human Services (Secretara de Salud
y Asuntos Sociales), principalmente a travs de la FDA. La
USP trabaja de distintas formas con dicha agencia, pero la
interaccin principal se da mediante el Programa de Enlaces
Gubernamentales. El Programa de Enlaces Gubernamentales
Misin y Prefacio ix
permite que representantes de la FDA y otras agencias ~u
bernamentales participen en las reuniones de los Comites de
Expertos y de los Paneles de Expertos, con lo que se facilita
la interaccin entre el personal gubernamental y los Comits
de Expertos. El personal de los Centros de la FDA responsa-
ble de revisar las actividades farmacopeicas proporciona
oportunidades y vnculos especficos para el intercambio de
comentarios. La Office of Policy for Pharmaceutical Quality
(Oficina de Poltica para la Calidad Farmacutica) en el
Center for Drug Evaluation and Research (Centro de Evalua-
cin e Investigacin de Medicamentos) es el contacto princi-
pal para los temas farmacopeicos entre la FDA y la USP.
NORMAS Y PROCEDIMIENTOS
Documentos Rectores-Las normas de los compendios
USP-NF gozan de un gran reconocimiento porque son nor-
mas autorizadas, tienen fundamento cientfico y se estable-
cen a travs de un proceso transparente y fiable. Ver la sec-
cin Acta Constitutiva en este libro; los Estatutos (http://
www.usp.org/about-usp/leadership/bylaws) y las Normas y
Procedimientos del Consejo de Expertos (http://www.usp.org/
about-usp/leadership/policies-rules). Colectivamente, estos
documentos sirven como principios rectores de las activida-
des referentes al establecimiento de normas para el personal
y los colaboradores voluntarios de la USP.
RECONOCIMIENTO LEGAL
Reconocimiento de los Compendios USP-NF-Los com-
pendios USP-NF estn reconocidos por la legislacin y cos-
tumbre en muchos pases del mundo. En los EE.UU., la Ley
FD&C (Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosmticos)
define el trmino "compendio oficial" para referirse a la USP
oficial, al NF oficial, a la Farmacopea Homeoptica de los Esta-
dos Unidos de Amrica oficial o a cualquiera de sus suple-
mentos. Las normas de USP-NF desempean un papel en las
disposiciones sobre adulteracin y rotulacin incorrecta
(m1sbranding) de la Ley FD&C, las cuales se aplican tambin
a productos biolgicos, que constituyen un subconjunto de
medicamentos byo la Public Health Service Act (Ley de Ser-
vicios de Salud Publica) (ver Advertencias y Requisitos Genera-
les, 2.30 Reconocimiento Legal).
La FDA requiere que los nombres de los artculos que no
son oficiales se distingan y diferencien claramente de cual-
quier otro nombre reconocido en un compendio oficial. Los
medicamentos con un nombre reconocido en USP-NF tam-
bin se considerarn rotulados incorrectamente a menos
que cumplan con las normas farmacopeicas de envasado y
etiquetado (para mayor informacin ver Advertencias y Re-
quisitos Generales, 3.10.1 O Aplicabilidad de las Normas a Pro-
ductos Farmacuticos, Frmacos y Excipientes.
Medicamentos-El objetivo de la USP es contar con mo-
nografas de frmacos y medicamentos en los compendios
USP-NF para todos los medicamentos legalmente comerciali-
zados en los EE.UU., incluyendo medicamentos qumicos y
biolgicos, y sus ingredientes. La USP tambin desarrolla
monografas para productos teraputicos legalmente comer-
cializados no aprobados por la FDA; p.ej., medicamentos an-
teriores a 1938, medicamentos de venta libre comercializa-
dos bajo el sistema de Monografas de Medicamentos de
Venta Libre de la FDA (FDA OTC Monograph System), su-
plementos dietticos y preparaciones magistrales. Cuando
corresponda, el cumplimiento de lo estipulado en una mo-
nografa de USP-NF, ser obligatorio en todo momento du-
rante la vida de un artculo, desde su produccin hasta su
caducidad.
Productos Biolgicos-En los EE.UU., los productos bio-
lgicos se consideran un subconjunto de medicamentos, in-
dependientemente de que estn aprobados por la FDA de
conformidad con la Ley FD&C [y se les conceda una solici-
tud de medicamento nuevo (NDA, por sus siglas en ingls)]
x Misin y Prefacio
o de conformidad con la Public Health Service Act [la Ley
PHS, por la que reciben una licencia de productos biolgi-
cos (BLA, por sus siglas en in~ls)]. Como resultado, todos
los productos biolgicos considerados por la Ley PHS estn
sujetos a los requisitos reglamentarios para medicamentos
de la Ley FD&C, lo que significa que tienen que cumplir
con las disposiciones sobre adulteracin y rotulacin inco-
rrecta (misbranding) de la Ley FD&C, incluyendo los requisi-
tos farmacopeicos de USP-NF. Lo anterior se aplica de la
misma manera a los productos biolgicos aprobados por la
va "351 (a)" de larga data de la Ley PHS, as como por la
nueva va "351 (k)" para productos biosimilares agregada
por la reforma de la legislacin de salud de 201 O [Biologics
Price Competition and lnnovation Act, Title VII, Subtitle A of
the Patient Protection and Affordable Care Act, Public Law
111-148 (Ley sobre Innovacin y Precios Competitivos para
Productos Biolgicos, Ttulo VII, Subttulo A de la Ley de
Proteccin y Cuidados de la Salud Accesibles para el Pa-
ciente, Ley Pblica 111-148)].
Suplementos Dietticos-Las enmiendas a la Ley FD&C
de la Ley de Salud y Educacin sobre Suplementos Dietti-
cos de 1994 establecen que se puede considerar a un suple-
mento diettico un alimento rotulado incorrectamente (mis-
branded) si dicho suplemento est cubierto por las
especificaciones de un compendio oficial (es decir, los com-
pendios USP-Nf), declara cumplir con dichas especificacio-
nes y no cumple con las mismas. En esto difiere de un pro-
ducto farmaceutico, para el cual la conformidad con la
norma farmacopeica aplicable es obligatoria sin necesidad
de aseverarlo.
Preparaciones Magistrales-La preparacin magistral
implica la preparacin, mezclado, ensamblaje, alteracin,
envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo u
otro artculo, derivado de una orden de un profesional de la
salud o como iniciativa a dicha orden, basndose en los
patrones rutinarios de administracin regularmente observa-
dos. La USP proporciona captulos generales y monografas
para preparaciones magistrales. Aprenda ms sobre prepara-
ciones magistrales en el sitio Web de la USP (http://www.
usp.org/usp-healthcare-professionals/compounding).
Dispositivos Mdicos-La Seccin 201 (h) de la Ley
FD&C define como dispositivo a un instrumento, aparato,
artculo similar, o componente de los mismos, reconocido
en USP-NF. La Seccin 502(e) de la Ley FD&C, en ausencia
de una designacin de la FDA, define el nombre establecido
de un dispositivo como el ttulo oficial en un compendio
oficial. A pesar de estas disposiciones reglamentarias, no se
cuenta con un reconocimiento del papel de la USP para
establecer normas farmacopeicas para dispositivos mdicos
c<;>mparable al que existe para medicamentos y productos
b1ologicos. De acuerdo con la Food and Drug Administra-
tion Modernization Act of 1997 (Ley de Modernizacin de
la Administracin de Alimentos y Medicamentos de 1997),
el Center for Devices and Radiological Health (Centro para
Dispositivos y Salud Radiolgica) reconoce normas naciona-
les e internacionales, entre las que se incluyen alsunas prue-
bas y valoraciones de la USP para dispositivos medicos.
Nomenclatura-Para informacin sobre el proceso de
desarrollo de nomenclaturas, el Comit de Expertos sobre
Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado, y el trabajo de la
USP con el Consejo de Nombres Adoptados en los Estados
Unidos (USAN, por sus siglas en ingls), ver el sitio Web de
la USP (http://www.usp.org/usp-nf/development-process/
compendial-nomenclature).
Nombres Qumicos y Nmeros de Registro CAS-Los
subttulos qumicos que aparecen en las monografas son los
nombres empleados en los ndices del Chemical Abstracts
Service (Servicio de Resmenes Qumicos; CAS, por sus si-
glas en ingls) de la American Chemical Society (Sociedad
Qumica de los Estados Unidos). Slo se incluyen en las mo-
no~rafas cuyos ttulos especifican sustancias que constituyen
entidades qumicas definibles. El primer subttulo es la forma
invertida del nombre qumic9 sistemtico desarrollado por el
CAS para los propsitos del Indice Colectivo (Collective In-
USP 39
dex o CI). El segundo subttulo, que se presenta en forma
no invertida, es un nombre IUPAC preferido (PIN) sancio-
nado y empleado por la lnternational Union of Pure and
Applied Chemist~ (Unin Internacional de Qumica Pura y
Aplicada o IUPAC). Los nombres IUPAC preferidos tambin
son usados por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS).
En ocasiones, se proporciona un tercer subttulo por razones
histricas o cuando el sinnimo emplea una convencin no-
minal alternativa pero equivalente. Las monografas con sub-
ttulos qumicos generalmente incluyen tambin los nmeros
de registro CAS. Estos nmeros entre corchetes funcionan
de manera independiente de la nomenclatura como indica-
dores numricos invariables de sustancias qumicas singula-
res, no ambiguas, en el registro CAS y, por consiguiente,
son convenientes y gozan de un uso difundido.
ACTIVIDADES DE ARMONIZACIN
Grupo de Debate Farmacopeico-La USP armoniza las
monografas de excipientes y los captulos generales farma-
copeicos en el Grupo de Debate Farmacopeico (PDG, por
sus siglas en ingls). Este grupo incluye representantes de la
Farmacopea Europea, de la Farmacopea Japonesa y de la
Farmacopea de los Estados Unidos de America, as1 como de
la OMS (como observador). De acuerdo con la definicin
del PDG, "un captulo general farmacopeico u otro docu-
mento farmacopeico est armonizado cuando una sustancia
o un producto farmacutico, que se analiza segn el proce-
dimiento armonizado del documento, produce los mismos
resultados y se lle:ia a la misma decisin respecto de acep-
tarlo o rechazarlo . El sitio Web de la USP contiene informa-
cin sobre el PDG, incluyendo la historia, el procedimiento
de trabajo del PDG, un glosario y una lista de las monogra-
fas y captulos generales que han completado las etapas de
1-6 del proceso de armonizacin farmacopeica que resulta
en texto aprobado de Armonizacin en Etapa 6 de USP
(http://www.usp.org/usp-nf/harmonization).
Otras Actividades de Armonizacin-La USP participa
en diversas actividades de armonizacin que incluyen a to-
das las farmacopeas. Estas actividades, actualmente en desa-
rrollo, se enfocan en Buenas Prcticas Farmacopeicas y nor-
mas pblicas ptimas para todos los medicamentos.
OTROS COMPENDIOS DE LA USP
USP Compounding Compendiu~EI USP Compounding
Compendium es un compendio electrnico que incluye todos
los captulos generales que se encuentran en los compen-
dios USP-NF relacionados con la preparacin magistral, ade-
ms de captulos generales de sustento a los que se hace
referencia en los captulos de preparacin magistral y en las
Advertencias y Requisitos Generales USP-NF. El propsito del
USP Compounding Compendium es proporcionar acceso con-
veniente a los captulos generales para los profesionales en-
cargados de la preparacin magistral.
USP Herbal Medicines Compendiu~EI USP Herbal Medi-
cines Compendium (HMC) es un compendio en lnea que
ayudar a garantizar la calidad de los ingredientes botnicos
usados en los medicamentos botnicos. Las monografas del
HMC proporcionan especificaciones de calidad-pruebas,
procedimientos y criterios de aceptacin-con procedimien-
tos analticos vafidados y materiales de referencia relaciona-
dos que facilitan la evaluacin del cumplimiento. El HMC
puede ayudar a fabricantes de ingredientes, fabricantes de
productos botnicos, agencias reglamentarias y otras partes
interesadas en la evaluacin del cumplimiento de los ingre-
dientes botnicos medicinales con normas pblicas indepen-
dientes y para controlar la calidad de artculos que se co-
mercializan internacionalmente. El HMC est disponible en
https://hmc.usp.org.
USP Dietary Supplements Compendiu~EI Dietary Supple-
ments Compendium combina, en dos volmenes, las normas
USP 39
USP-NF para suplementos dietticos, normas e informacin
del Food Chemicals Codex, documentos reglamentarios y de
la industria, as como otras herramientas y recursos. Se pu-
blica cada dos aos en una edicin impresa de tapa dura.
Food Chemicals Codex-EI Food Chemica/s Codex (FCC) es
un compendio reconocido internacionalmente de normas de
monografas y pruebas de pureza y calidad para ingredien-
tes alimenticios, p.ej. conservantes, saborizantes, colorantes
y nutrientes. El FCC se publica cada dos aos, con suple-
mentos cada seis meses, y est disponible en formato im-
preso y electrnico. Las revisiones propuestas al FCC estn
disponibles para su revisin y comentario pblico a travs
del FCC Forum, al cual se puede acceder de manera gratuita
en forum.foodchemicalscodex.org.
OTROS RECURSOS DE LA USP
Chromatographic Columns-Esta exhaustiva publicacin
de referencia, previamente titulada "Chromatographic Rea-
gents (Reactivos Cromatogrficos)", ofrece informacin deta-
flada necesaria para llevar a cabo los procedimientos croma-
togrficos incluidos en los compendios USP-NF. La
publicacin Chromatographic Columns lista los nombres co-
merciales de los reactivos para columna citados en todas las
Misin y Prefacio xi
propuestas de procedimientos analticos nuevos o revisados
para cromatografa de gases o de lquidos publicados en el
PF desde 1980. La publicacin Chromatographic Columns
tambin ayuda a mantener un registro de los reactivos que
se usaron para validar los procedimientos analticos que se
han oficializado. El listado de reactivos para columna con
sus marcas se actualiza bimestralmente y se publica en el
sitio Web de la USP.
USP Dictionary-EI USP Dictionary of USAN and lnterna-
tional Drug Names ofrece, en un solo volumen, los Nombres
Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en
ingles) ms actualizados para los frmacos; los nombres
USP-NF oficiales; las denominaciones comunes, los nombres
comerciales y qumicos; las frmulas grficas; las frmulas y
los pesos moleculares; los nmeros de registro CAS y las
designaciones por cdigo; los fabricantes de frmacos; y las
categoras farmacolgicas y teraputicas. El USP Dictionary
ayuda a asegurar la exactitud de los siguientes puntos: eti-
quetado del producto; informes, artculos y corresponden-
cia; solicitudes reglamentarias de la FDA y prospectos de
productos farmacuticos. Se publica anualmente. Para ma-
yor informacin sobre el USP Dictionary ver el sitio Web de
la USP (http://www.usp.org/usp-nf/development-process/
compendial-nomenclature).
USP 39 Integrantes / Comits xiii

Integrantes

2010-2015 Ciclo de
Revisin
Funcionarios de la Convencin de la USP, junta
Directiva, Consejo de Expertos, Comits de
Expertos, Paneles de Expertos y Grupos Asesores

Upper Gwynedd, PA
Jeffrey L. Sturchlo, Ph.D.
Funcionarios (2010-2015) Representante At Large
Timothy R. Franson, B.S. Pharm., M.D. New York, NY
Presidente Gail R. Wllensky, Ph.D.
Washington, DC Representante At Large
Ren H. Bravo, M.D., F.A.A.P. Bethesda, MD
Presidente Saliente Ron T. Plervincenzi, Ph.D.
San Luis Obispo, CA Director Ejecutivo, Febrero 20 74-presente
John E. Courtney, Ph.D. (ex-officio)
Tesorero Rockville, MD
Bethesda, MD
Susan S. de Mars, J.D.
Secretaria Consejo de Expertos (2010-2015)
Rockville, MD Ron T. Piervincenzi, Ph.D.
Presidente, Consejo de Expertos
Rockville, MD
Junta Directiva (2010-2015) James E. Akers, Ph.D.
Thomas R. Temple, B.S. Pharm., M.S., F.A.Ph.A. Presidente, Captulos Generales-Microbiologa
Presidente Leawood, KS
Representante At-Large Gregory E. Amldon, Ph.D.
Des Moines, IA Presidente, Captulos Generales-Anlisis Fsico
Carolyn H. Asbury, Ph.D., Sc.M.P.H. Ann Arbor, MI
Representante del Inters Pblico Lawrence H. Block, Ph.D.
New York, NY Presidente, Monografas-Excipientes
Robert L. Buchanan, Ph.D. Pittsburgh, PA
Representante At Large Matthew W. Borer, Ph.D.
College Park, MD Presidente, Estndares de Referencia
Thomas E. Menighan, B.S. Pharm., M.B.A., Sc.D., lndianapolis, IN
F.A.Ph.A. Glgi S. Davldson, B.S.Pharm., DICVP
Representante At Large Presidente, Preparacin Magistral
Washington, DC Raleigh, NC
Robert M. Russell, M.D. James E. DeMuth, Ph.D.
Representante del Sector Medicina Presidente, Captulos Generales-Formas Farmacuticas
Arlington, MA Madison, WI
Kiran Mazumdar-Shaw Andrew G. Ebert, Ph.D.
Representante At Large Presidente, Monografas-Ingredientes Alimenticios
Bangalore, India Sandy Springs, GA
Marilyn K. Speedle, Ph.D. Mary G. Foster, Pharm.D., BFA
Representante del Sector Farmacia Presidente, Captulos Generales-Envasado,
Minneapolis, MN Almacenamiento y Distribucin
Stephen P. Spielberg, M.D., Ph.D. Philadelphia, PA
Representante del Sector Medicina Antony Raj Gomas, Ph.D.
xiv Comits / Integrantes USP 39

Presidente, USP Medicines Compendium-Sur Asia Peggy Casanova, M.Sc.; Ofelia Espejo, Ph.D.; Lidiette
Hyderabad, India Fonseca Gonzlez, M.Sc.; Jos Juarez Eyzaguirre, Ph.D.;
Dennls K.J. Goreckl, B.S.P., Ph.D. Monica l. Hirschhorn, M.Sc.; Jos Maria Parisi, M.Sc.;
Presidente, Monografas-Suplementos Dietticos Luisa Fernanda Ponce D'Len Quiroga, Ph.D.; Osear
Saskatoon, SK, Canada Quattrocchi, M.Sc.; Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.;
Jean F. Huxsoll, Ph.D. Caroline R. Weinstein-Oppenheimer, Ph.D.
Presidente, Monografas-Productos Biolgicos y
Biotecnologa 2
Emeryville, CA Comits de Expertos de la Farmacopea
Eugene J. McGonigle, Ph.D. de los Estados Unidos de Amrica
Presidente, Monografas-Molculas Pequeas 4
Langhorne, PA
Michael G. Mulkerrln, Ph.D. Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado
Presidente, Monografas-Productos Biolgicos y THOMAS P. REINDERS, PHARM.D., Presidente
Biotecnologa 1 Mary B. Baker, M.B.A., Pharm.D.; Lawrence H. Block,
Redwood City, CA Ph.D.; Dawn M. Boothe, D.V.M., Ph.D.; Mrunal S.
Bernard A. Olsen, Ph.D. Chapekar, Ph.D.; Stephanie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.;
Presidente, Monografas-Molculas Pequeas 3 Steven J. Dentali, Ph.D.; Dennis E. Doherty, M.D.;
West Lafayette, IN Abraham G. Hartzema, Pharm.D., Ph.D., MSPH; William
Robert E. Osterberg, Ph.D. M. Heath, B.S. Pharm., MBA; William M. Heller, Ph.D.;
Presidente, Toxicologa Kent T. Johnson, M.S.; Donald S. MacLean, Ph.D.; Joan
Vienna, VA C. May, Ph.D.; Ginette A. Pepper, R.N., Ph.D., FAAN;
Ernest Parente, Ph.D. Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Debora J. Simmons, R.N.,
Presidente, Monografas-Molculas Pequeas 2 M.S.N.; R. William Soller, Ph.D.; Kailas Thakker, Ph.D.;
Overland Park, KS Thomas Tice, Ph.D.; Theodore G. Tong, Pharm.D.;
Dhananjay Patankar, Ph.D. Jeanne Tuttle, B.S.Pharm.; Ping Wang, M.S.; Anthony
Presidente, USP Medicines Compendium-Productos Wong, M.D., Ph.D.
Biolgicos
Bangalore, India Panel de Expertos en Directrices Modelos para
Thomas P. Reinders, Pharm.D. Medicare-CONCLUIDO
Presidente, Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado DAVID H. CAMPEN, M.D., Presidente
Richmond, VA Nancy Jo Braden, M.D.; Chester B. Good, M.D., MPH;
Maria lnes R.M. Santoro, Ph.D. Roy Guharoy, Pharm.D., MBA; Raymond Hohl, M.D.,
Presidente, USP Medicines Compendium-Amrica Latina Ph.D.; Arthur l. Jacknowitz, Pharm.D.; Ronald P.
Sao Paulo, Brazil Jordan, R.Ph., APhA; Rice C. Leach, M.D., MSHSA;
Robert R. Singer, M.Sc. David B. Lorber, M.D., FCCP; Raymond C. Love,
Presidente, Estadstica Pharm.D., FASHP; Philip Marcus, M.D., MPH; Gary
Union City, CA Matzke; Joel S. Mindel, M.D.; Mark Noga, Pharm.D.;
Jlasheng Tu, Ph.D. Charles D. Ponte, Pharm.D.; N. Lee Rucker, MSPH;
Presidente, USP Medicines Compendium-Asia Oriental Melody Ryan, Pharm.D., MPH; Joanne G.
Nanjing, Jiangsu, China Schwartzberg, M.D.; Brian K. Solow, M.D.; Robert L.
Glenn A. Van Buskirk, Ph.D. Talbert, Pharm.D.; Dennis P. West, Ph.D.
Presidente, Monografas-Molculas Pequeas 1
Basking Ridge, NJ Panel de Expertos en Etiquetado de Envases de
Wesley E. Workman, Ph.D. Medicamentos de Venta Bajo Receta
Presidente, Captulos Generales-Anlisis Biolgico JOANNE G. SCHWARTZBERG, M.D., Y GERALD MCEVOY, PHARM.
Chesterfield, MO D., Ca-Presidentes
Tlmothy J. Wozniak, Ph.D. Cindy Brach, MPP; Joan E. Kapusnik-Uner, Pharm.D.;
Presidente, Captulos Generales-Anlisis Qumico Sandra Leal, Pharm.D.; Linda L. Lloyd, M.Ed.; Melissa
lndianapolis, IN A. Madigan, Pharm.D.; Ruth M. Parker, M.D.; Thomas
P. Reinders, Pharm.D.; William H. Shrank, M.D.;
Patricia E. Sokol, R.N., J.D.; Darren K. Townzen, MBA;
Comits de Expertos (2010-2015) Jeanne Tuttle, Pharm.D.; Michelle D. Wiest, Pharm.D.;
Michael S. Wolf, Ph.D., MPH
[Nota-El siguiente listado de Comits de Expertos
incluye los Paneles de Expertos que asesoran a Comits Panel de Expertos en Pronunciacin
de Expertos especficos. El listado de Paneles de WILLIAM M. HELLER, PH.D., Presidente
Expertos y sus miembros representa a aquellos Paneles Mary B. Baker, Pharm.D.; Stephanie Y. Crawford,
formados y aprobados en su totalidad a partir de mayo Ph.D.; David F. Long, Ph.D.; Joan C. May, Ph.D.;
Anthony Palmieri, Ph.D.; Thomas P. Reinders, Pharm.
de 2015. Los Paneles de Expertos se forman y D.
desintegran continuamente durante todo el ciclo de
revisin de la USP, por lo que en un futuro se publicarn Monografas-Molculas Pequeas 1
otras listas de miembros.] GLENN A. VAN BUSKIRK, PH.D., Presidente
Jay C. Brumfield, Ph.D.; Elizabeth B. Cariello; David A.
Fay, Ph.D.; Rupa lyer, M.S.; Amy J. Karren, N.R.C.M.;
Paneles de Expertos para el Comit Assad J. Kazeminy, Ph.D.; Huiyi Li, Ph.D.; Raphael M.
Ornaf, Ph.D.; Jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; David F. Schuck,
Ejecutivo del Consejo de Expertos Ph.D.; Nhan L. Tran, Ph.D.; Danny L. Tuck, Ph.D.
Monografas-Molculas Pequeas 2
Panel de Expertos para la Traduccin al Espaol ERNEST PARENTE, PH.D., Presidente
ENRIQUE FEFER, PH.D., Presidente Mahmoud M. H. Al Omari, Ph.D.; Allan D. Bokser, Ph.D.;
Shrikant N. Dhumal, Ph.D.; Tina M. Engel, Ph.D.; Maria
USP 39
lnes R.M. Santoro, Ph.D.; Dennis A. Stephens, Ph.D.;
Luciano Virgili, Ph.D.; Yuwen Wang, Ph.D.; Bo Wen,
Ph.D.; Joseph E. Yakupkovic, Ph.D.; Patrick N. Yat, Ph.D.;
Louis W. Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Acetaminofeno de Venta
Libre
KYLEN WHITAKER, PH.D., Presidente
Tina M. Engel, Ph.D.; David A. Fay, Ph.D.; Saulius A.
Gylys; Michael T. Rankin, M.S.; David H. Rogers,
Ph.D.; Gregory K. Webster, Ph.D.
Panel de Expertos en Acetaminofeno-
CONCLUIDO
DAVID A. FAY, PH.D., Presidente
G~eg J. Davies; Tina M. Engel, Ph.D.; Saulius A. Gylys;
C11fford J. Herman, Ph.D.; Poonam Pall, M.S.; Greg A.
Roberts, M.A.; David H. Rogers, Ph.D.; Gregory K.
Webster, Ph.D.; Kylen W. Whitaker, Ph.D.
Monografas-Molculas Pequeas 3
BERNARD A LSEN, PH.D., Presidente
Richard A. Blessing, M.S.; Thomas A. Broadbent, Ph.D.;
Nicholas Cappuccino, Ph.D., M.B.A.; lan C.hung, Ph.D.;
John E. Darnels, M.S., M.B.A.; Jeffrey S. Fle1tman, Ph.D.;
Yuri Goldberg, Ph.D., O.Se.; Pauline M. Lacroix, M.Sc.;
Julie K. Lorenz, Ph.D.; Mark G. Papich, D.V.M., M.S.;
Donald M. Parsons, Ph.D.; David G. Reed, M.B.A.;
Thomas W. Rosanske, Ph.D.; Joseph G. Stowell, Ph.D.;
Cathy L. Wood
Monografas-Molculas Pequeas 4
EUGENE J. McGONIGLE, PH.D., Presidente
Lakshmi Prasad Alaparthi, Ph.D.; Mark S. Bailey; Josep M.
de Ciurana; Alain Duguet, Ph.D.; Quanyin Gao, Ph.D.;
Jerome M. Lewis, M.B.A., Ph.D.; Osear Liu, Ph.D.; Marian
L. Meyer, M.B.A., ~.h.D.; Coln Minchom, Ph.D.; Patrick
A. Noland, M.S.; V11aya Ramesh, B.Pharm.; Hemant
Kumar Sharma, Ph.D.; Michael J. Skibic, M.S.; William J.
Taraszewski, Ph.D.; Michiel M. Van Oort, Ph.D.; Martn J.
Williamson, Ph.D.; Steve S. Zigler, Ph.D.
Monografas-Productos Biolgicos y
Biotecnologa 1
MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Parastoo Azadi, Ph.D.; Christopher J.
Burns, Ph.D.; Frederic Carriere, Ph.D.; Charles S. Craik,
Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.; Helene Gazzano-
Santoro, Ph.D.; Anne M. Jespersen, Ph.D.; Kristian
Johansen, Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Barbara Mulloy,
Ph.D.; Harold N. Rode, Ph.D.; Martn Schiestl, Ph.D.;
Yeowon Sohn, Ph.D.
Panel de Expertos en Heparina Bovina no
Fraccionada
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Tania Andrade, B.S. Pharm.; Irene Bartoli, B.Sc.; Leticia
Maria Bertot, Pharm.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Marco
Guerrini, Ph.D.; Kristian Johansen, Ph.D.; Robert
Linhardt, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Marilene Nuss
Rangel; Zachary Shriver, Ph.D.; Pearle Torralba, Ph.D.;
Christian Viskov, Ph.D.
Panel de Expertos en Valoraciones Biolgicas de
Eritropoyetina-CONCLUIDO
CHRISTOPHER J. BURNS, PH.D., Y MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D.,
Ca-Presidentes
Jan Amstrup, Ph.D.; Evangelos Bakopanos, Ph.D.; Jill
A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Helene Gazzano-Santoro,
Ph.D.; Martn Schiestl, Ph.D.
Panel de Expertos en Glucagn
HAROLD RODE, PH.D., Presidente
Integrantes / Comits xv
Jan Amstrup, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.; Adrian
F. Bristow, Ph.D.; Anne M. Jespersen, Ph.D.; Elizabeth
Clark Kramer, Ph.D.
Panel de Expertos en Insulina
HAROLD RODE, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Wilfried P. Arz, Ph.D.; Matthew
W. Borer, Ph.D.; Chris J. Burns, Ph.D.; Helene
Gazzano-Santoro, Ph.D.; Morten Hach, M.S.; Anne M.
Jespersen, Ph.D.; Elizabeth Clark Kramer, Ph.D.;
Martin Schiestl, Ph.D.
Panel de Expertos en Heparinas de Bajo Peso
Molecular
ELAINE GRAY, PH.D., Y EDWARD K. CHESS, PH.D., Co-
Presidentes
Christopher P. Bryant, Ph.D.; lshan Capila, Ph.D.;
Venkatesan S. Chidambaram, Ph.D.; Soby M. Fennell;
Gyongyi S. Gratzl, Ph.D.; Kristian Johansen, Ph.D.;
Barbara Mulloy, Ph.D.; Anna K.Y. Nordin; Bruna
Parma, M.Sc.; Patrick A. Rousseau, Ph.D.; Zachary
Shriver, Ph.D.; Christian Viskov, Ph.D.
Panel de Expertos en Preparaciones
Farmacuticas Enzimticas
FREDERIC CARRIERE, PH.D., Presidente
Anisha Akula, Ph.D.; Gregory M. Beck, Ph.D.; Charles
S. Craik, Ph.D.; Luigi Ghidorsi; Andreas Koerner;
Thomas Langdon; Claus Middelberg, Ph.D.; Tibor
Sipos, Ph.D.
Panel de Expertos en Pptidos Teraputicos
MICHAEL R. DEFELIPPIS, PH.D., Presidente
lvo F. Eggen, Ph.D.; Brian P. Gregg, M.B.A.; Marion
King, Pll.D.; Paul Matejtschuk, Ph.D.; Narendra R.
Patel, M.Sc.; Marie-Aimee Plancquaert, Ph.D.; Harold
Rode, Ph.D.; Raimon Rubires, Ph.D.; Firuz Shakoori,
Ph.D.; Ved P. Srivastava, Ph.D.; Aleksander Swietlow,
Ph.D.; Michael S. Verlander, D.Phil.
Panel de Expertos en Heparinas no Fraccionadas-
CONCLUIDO
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Edward K. Chess, Ph.D.; Huihong Fan, Ph.D.; Gyongyi
S. Gratzl, Ph.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Kristian Johansen,
Ph.D.; Jian Liu, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Zachary
Shriver, Ph.D.; Pearle Torralba, Ph.D.; Christian Viskov,
Ph.D.
Monografas-Productos Biolgicos y
Biotecnologa 2
JEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; Merry L. Bain, M.S.; Barbara E.
Blum, Ph.D., M.P.H.; Pamela Clark, M.O., J.D.; Elaine
Gray, Ph.D.; Deepak Jain, Ph.D.; Christopher Mason,
Ph.D., FRCS; Brian K. Nunnally, Ph.D.; Nicole M. Provost,
Ph.D.; William E. Tente, M.S.; Peter J. Vandeberg, Ph.D.;
Darin J. Weber, Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D.
Panel de Expertos en Clulas CD-34 Positivas
NICOLE M. PROVOST, PH.D., Presidente
Ruud Hulspas, Ph.D.; Elizabeth l. Read, M.O.; Michael
D. Rosu-Myles, Ph.D.; Luisa Saraiva, Ph.D.; Richard J.
Stebbings, Ph.D.; D. Robert Sutherland, M.Sc.; Lili
Wang, Ph.D.; Albertus W. Wognum, Ph.D.
Panel de Expertos en Anlisis de Protenas
Plasmticas
TIMOTHY K. HAYES, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; Joseph Bertolini, Ph.D.; Elaine
Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Dorothea
Sesardic, Ph.D.; Derek G. Toth, M.S.; Peter J.
Vandeberg, Ph.D.
xvi Comits / Integrantes
Panel de Expertos en Factores de Coagulacin
Derivados de Plasma y Recombinantes-
CONCLUIDO
jEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; Gretchen A. Elliott, M.S.; Elaine
Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Michael jankowski
Panel de Expertos en Tejidos y Productos
Derivados de Tejidos
DEEPAK ]AIN, PH.D., y WILLIAM E. TENTE, M.S., Ca-Presidentes
Merry L. Bain, M.S.; Barbara E. Blum, Ph.D., M.P.H.;
Robert Buehler, Ph.D.; Frederick Cahn, Ph.D.;
Shannon L.M. Dahl, Ph.D.; Steven Goldstein, Ph.D.;
John E. Kemnitzer, Ph.D.; Alyce Linthurst Jones, Ph.D.;
Timothy Neja, M.B.A; Darin J. Weber, Ph.D.; Wesley E.
Workman, Ph.D.
Captulos Generales-Anlisis Qumico
TIMOTHY J. WOZNIAK, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Christopher Burgess,
Ph.D.; Geoffrey P.R. Carr, Ph.D., FRSC; Pei Chen, Ph.D.;
Thomas J. DiFeo, Ph.D.; John W. Dolan, Ph.D.; Edward J.
Fletcher; john P. Hammond, FRSC; john V. Hinshaw,
Ph.D.; Paul R. Keller, Ph.D.; Nancy Lewen; Todd D.
Maloney, Ph.D.; Nuno Matos; Ganapathy Mohan, Ph.D.;
Greg A. Pennyroyal; Melissa M. Phillips, Ph.D.; Osear A.
Quattrocchi, M.Sc.; Timothy L. Shelbourn, M.S., M.B.A.;
Teri C. Soli, Ph.D.; Daniel D. Traficante, Ph.D.; Bruno A.R.
Vrebos, Ph.D.
(761) Panel de Expertos en Resonancia Magntica
Nuclear (NMR)-CONCLUIDO
DANIEL D. TRAFICANTE, PH.D., Presidente
Andreas Kaerner, Ph.D.; Andrew C. Kolbert, Ph.D., M.
T.M.; Yue Luo, Ph.D.; Joseph Ray, Ph.D.; Susan
Reutzel-Edens, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A.,
M.S.; Christina Szabo, Ph.D.; Fred Xi, Ph.D.
Panel de Expertos en Quimiometra
PEI CHEN, PH.D., y NUNO MATOS, Ca-Presidentes
Chunsheng Cai, Ph.D.; Robert Tom Cambron, Ph.D.;
Peter de B. Harrington, Ph.D.; Mark J. Henson, Ph.D.;
Yang (Angela) Liu, Ph.D.; Zhenqi (Pete) Shi, Ph.D.;
Yvan C.D. Vander Heyden, Ph.D.; Stanislav O.
Zakharkin, Ph.D.; Lin Zhang, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas Elementales
NANCY LEWEN, Presidente
Charles Barton, Ph.D., DABT; Courtney M. Callis,
MPH, DABT; Steven J. Dentali, Ph.D.; Anna M. Fan,
Ph.D., DABT; Edward james Fletcher; Bruce A. Fowler,
Ph.D., A.T.S.; Roland Frotschl; Assad J. Kazeminy,
Ph.D.; Richard Ko, Pharm.D., Ph.D.; Melissa M.
Phillips, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A., M.S.
Panel de Expertos en Adulteracin de
Suplementos Dietticos con Frmacos y Anlogos
de Frmacos
DENNIS K.J. GORECKI, PH.D., Presidente
joseph Betz, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; Hans Geyer,
Ph.D.; Jana B. Hildreth, B.S.; lkhlas A. Khan, Ph.D.;
Hwee-Ling Koh, Ph.D.; Cynthia L. Morris-Kukoski,
Pharm.D.; james Neal-Kababick, B.S.; Olivier P. Rabin,
Ph.D.; John W. Spink, Ph.D.; Darryl M. Sullivan;
Nicole T. Vu, Ph.D.; Kate Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Espectrometra de Masas-
CONCLUIDO
PAUL R. KELLER, PH.D., Presidente
Parastoo Azadi, Ph.D.; Timothy R. Baker, Ph.D.;
Geoffrey P.R. C~rr, Ph.D., FRSC; Roy ~obson, Ph.D.;
Kenneth D. Gre1s, Ph.D.; Douglas E. K1ehl, M.Sc.;
Mike S. Lee, Ph.D.; ]un Wheeler, Ph.D.; Li Zang, Ph.D.
USP 39
Panel de Expertos en Modernizacin de Pruebas
de Identificacin
NANCY LEWEN, Presidente
Michelle R. Adamson; Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.;
Geoffrey P.R. Carr, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; jonathan
W. DeVries, Ph.D.; Maryna Dmitriieva, Ph.D.; Michael
Hornig, Ph.D.; Bernard A. Olsen, Ph.D.; jeffrey S.
Rohrer, Ph.D.; Anne M. Warner, Ph.D.
Panel de Expertos en Disolventes Residuales
OSCAR A. QUATIROCCHI, M.Sc., Presidente
Coleman C. Chasteen, M.S.; john Connelly, Ph.D.;
john V. Hinshaw, Ph.D.; Elizabeth C. Hoogendoorn,
M.S.; Bruce P. Johnson, Ph.D.; Eric C. Kesslen, Ph.D.;
Elizabeth Kovacs; Paul W. Lockwood, M.S.; Gregory P.
Martin, M.S.; Ganapathy Mohan, Ph.D.; Yuwen
Wang, Ph.D.
Panel de Expertos en Atributos del Agua Estril
Envasada-CONCLUIDO
ANTHONY c. BEVILACQUA, PH.D., Presidente
Dennis R. Jenke, Ph.D., M.B.A.; Max S. Lazar; Timothy
J. McGovern, Ph.D.; Rostyslaw O. Slabicky; Teri C.
Soli, Ph.D.
Panel de Expertos en Agua para Uso Analtico
TERI C. Sou, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc.,
M.Sc.; Max S. Lazar; Nancy Lewen; Bruno Rossi, M.S.
Panel de Expertos en Agua para Uso Farmacutico
TERI C. Sou, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc.,
M.Sc.; Max S. Lazar; Rostyslaw O. Slabicky
Panel de Expertos en Espectrometra de
Fluorescencia de Rayos X-CONCLUIDO
TIMOTHY L. SHELBOURN, M.B.A., M.S., Presidente
Lora L. Brehm; W. Tim Elam; George J. Havrilla;
Andrew J. jensen; Riitta Kaijansaari, M.Sc.; John 1.H.
Patterson, Ph.D.; Rene E. Van Grieken, Ph.D.; Bruno
A.R. Vrebos, Ph.D.
Captulos Generales-Anlisis Fsico
GREGORY E. AMIDON, PH.D., Presidente
Fahad Al-Jenoobi, Ph.D.; Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.;
Shaukat Ali, Ph.D.; Graham Buckton, Ph.D., D.Sc., FRSC;
David J. Goldfarb, Ph.D.; Bruno C. Hancock, Ph.D.; Ravi
Harapanhalli, Ph.D.; Xiaorong He, Ph.D., M.B.A.;
Stephen W. Hoag, Ph.D.; Ronald G. lacocca, Ph.D.;
Gregory P. Martin, M.S.; Richard Meury; Prabu Nambiar,
M.B.A., Ph.D.; james A. Ponto, M.S.; Sally W. Schwarz,
M.S.; Changquan C. Sun, Ph.D.; Kevin A. Swiss, Ph.D.;
Allen C. Templeton, Ph.D.; Dale Eric Wurster, Ph.D.;
Geoff G.Z. Zhang, Ph.D.
(1059) Panel de Expertos en Desempeo de
Excipientes
GREGORY E. AMIDON, PH.D., Y ERIC A. SCHMITI, PH.D., Co-
Presidentes
Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Lawrence H. Block, Ph.D.; Patrick Deluca, Ph.D.; Carl
Frey, M.S.; Xiao.rong He, Ph.D., M.B.A.; .stephen W.
Hoag, Ph.D.; M1chelle A. Long, Ph.D.; Richard C.
Moreton, Ph.D.; Prabu Nambiar, Ph.D., M.B.A.; james
A. Ponto, M.S.; Kent Sternitzke, Ph.D.; Kevin A. Swiss,
Ph.D.; Sean V. Taylor, Ph.D.
Panel de Expertos en (821) Identificacin y
Valoracin de Radionucleldos, y (1821) Teora y
Prctica de la Radioactividad y (1823)
Medicamentos para Tomografa de Emisin de
Positrones
SALLY W. SCHWARZ, M.S., Presidente
USP 39
Cathy Sue Cutler, Ph.D.; Jonathan M. Fitzsimmons,
Ph.D.; Paula M. jacobs, Ph.D.; Thijs Kroon, Pharm.D.;
Jerome M. Lewis, Ph.D.; Roger Moroney, M.S.; James
A. Ponto, M.S.; Duann V. Thistlethwaite, B.S.; Steven
S. Zigler, Ph.D.
Panel de Expertos en Buenas Prcticas de
Documentacin
KIM c. HUYNH-BA, M.S., Presidente
Kathleen V. Brady, B.S.; Frank J. Diana, Ph.D.; Lisa
An~ Fink, ~BA; Craig Hamilton,, Ph.D.; .Judy Lin, M.S.;
Anian K. M1ttal, M.Pnarm.; Kevm A. Sw1ss, Ph.D.
Panel de Expertos en Medicamentos para
Tomografa de Emisin de Positrones-
Preparacin Magistral-CONCLUIDO
STEVEN S. ZIGLER, PH.D., Presidente
Samuel C. Augustine, Pharm.D., FAPhA; Marc
Berridge, Ph.D.; Joseph C. Hung, Ph.D., BCNP;
Donald R. Kinney; Maxim Kiselev, Ph.D.; Neale Scott
Mason, Ph.D.; Steve Mattmuller, M.S., R.Ph.; Sally W.
Schwarz, M.S.; Jean-Luc Vanderheyden, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas en Productos
Farmacuticos
PRABU NAMBIAR, PH.D., M.B.A., Presidente
Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Steven W. Baertschi, Ph.D.; Judy P. Boehlert, Ph.D.;
Robert G. Bui~e,. Ph.D.; Greg J. Davies~ Xi~orong He,
Ph.D., M.B.A., K1m C. Huynh-Ba, M.S., M1chael
Koberda, Ph.D.; Robert E. Osterberg, Ph.D.; Ernest
Parente, Ph.D.; David H. Rogers, Ph.D.; Mary W.
Seibel; Kevin A. Swiss, Ph.D.
Panel de Expertos en Microscopa Electrnica de
Barrido-CONCLUIDO
RONALD G. IACOCCA, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Marc Mamak, Ph.D.; Richard Meury;
James P. Vitarelli, Ph.D.
Panel de Expertos en Validacin y Verificacin
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente
Kimber L. Barnett, Ph.D.; Christopher Burgess, Ph.D.;
Todd Cecil, Ph.D.; Pal!I D. Curry, Ph.D.; Joachim
Ermer, Ph.D.; Gyongy1 S. Gratzl, Ph.D.; John P.
Hammond, FRSC; Elizabeth Kovacs; David J. LeBlond,
Ph.D.; Rosario LoBrutto, Ph.D.; Anne K. McCasland-
Keller, Ph.D.; Pauline L. McGregor, Ph.D.; Phil
Nethercote, Ph.D.; Allen C. Templeton, Ph.D.; David
P. Thomas, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel
Panel de Expertos en Pesas y Balanzas
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente
Dirk Ahlbrecht; Cesar D. Bautista, Jr., Ph.D.; Klaus
Fritsch, Ph.D.; Robert Mielke; David Sebastian
Pattavina, M.S.; Allen C. Templeton, Ph.D.
Captulos Generales-Anlisis Biolgico
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Robert G. Bell, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.;
Gary C. du Moulin, Ph.D.; Barry D. Garfinkle, Ph.D.;
Timothy K. Hayes, Ph.D.; Christopher Jones, Ph.D.;
Kenneth R. Miller, Ph.D.; Anthony R. Mire-Sluis, Ph.D.;
Elizabeth l. Read, M.D.; Anthony A.G. Ridgway, Ph.D.;
John A. Saldanha, Ph.D.; Junzhi Wang, Ph.D.; Teruhide
Yamaguchi, Ph.D.; Lynn C. Yeoman, Ph.D.
(1050) Panel de Expertos en Evaluacin de la
Seguridad Viral en Productos Biotecnolgicos
Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano
o Animal
ROBERT G. BELL, PH.D., Presidente
Johannes Bluemel, Ph.D.; Jeri Ann Boose, Ph.D.;
Houman Dehghani, Ph.D.; Yuling L. Li, Ph.D.;
Integrantes / Comits xvii
Raymond Nims, Ph.D.; Mark Plavsic, Ph.D.; Michael
Rubino, Ph.D.
(1102-1105) Panel de Expertos en Mtodos de
Pruebas Inmunolgicas-CONCLUIDO
KENNETH R. MILLER, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Yadira Hernandez Rodriguez,
Ph.D.; Rakesh Kakkar, Ph.D.; Kelledy Manson; Hersh
Mehta, Ph.D.; Patrick Niven; Steven J. Swanson, Ph.D.
(1240) Panel de Expertos en Pruebas Virales para
Plasma Humano Destinado como Intermediario
de Fabricacin-CONCLUIDO
JOHN A SALDANHA, PH.D., Presidente
Albrecht Groener, Ph.D.; Mary Gustafson, Ph.D.;
Douglas C. Lee, Ph.D.; Hannelore M. Willkommen,
Ph.D.
Panel de Expertos en Captulos Generales sobre
Valoraciones Biolgicas-CONCLUIDO
ROBERT R. SiNGER, M.Sc., Presidente
Janice D. Callahan, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini,
Ph.D.; David M. Lansky, Ph.D.; David J. LeBlond,
Ph.D.; Karen J. Roberts, R.Ph.; Timothy Schofield, M.
A.
Panel de Expertos en Crioconservacln-
CONCLUIDO
)AMES MOLDENHAUER, M.S., Presidente
Allison Hubel, Ph.D.; Elizabeth l. Read, M.D.; Yvonne
A. Reid, Ph.D.; Glyn Stacey, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas Gllcoconjugadas-
CONCLUIDO
CHRISTOPHER )ONES, PH.D., Presidente
Paolo Costantino; Didier A. Giffroy, Ph.D.; Suresh
Karupothula, Ph.D.; Jeremy P. Kunkel, Ph.D.;
SureshBabu Rajan, M.Pharm; Nei! Ravenscroft, Ph.D.;
Mary L. Retzlaff, Ph.D.; Marsha R1chmond, Ph.D.;
Philippe Talaga, Ph.D.
Panel de Expertos en Anlisis de Gllcoprotenas y
Glicanos
CHRISTOPHER )ONES, PH.D., Presidente
Parastoo Azadi, Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.;
Gary Rogers, Ph._D.; jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; Martin
Sch1estl, Ph.D.; ]1hong Wang, Ph.D.; Zhuchun Wu,
Ph.D.; Rebecca A. Zangmeister, Ph.D.
Panel de Expertos en Medicin de Protena de
Clulas Husped-CONCLUIDO
ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Oliver Anderka, Ph.D.; Svetlana
Bergelson, Ph.D.; Heather A. Boux, Ph.D.; John S.
lvancic, Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Kesh Prakash,
Ph.D.; Martin Vanderlaan, Ph.D.; David C. Wylie,
Ph.D.
Panel de Expertos en lnmunogenicidad-
CONCLUIDO
ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente
Viswanath Devanarayan, Ph.D.; Boris Gorovits, Ph.D.;
Shalini Gupta, Ph.D.; Eugene Koren, M.D., Ph.D.;
Valerie Quarmby, Ph.D.; Susan Richards, Ph.D.; Gopi
Shankar, Ph.D.; An Song, Ph.D.; Meena
Subramanyam, Ph.D.; Steven J. Swanson, Ph.D.;
Bonnie Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Anticuerpos Monoclonales
Recombinantes de Uso Teraputico-CONCLUIDO
ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente
Michel P. Byrne, Ph.D.; Mary E.M. Cromwell, Ph.D.;
Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Michael R. DeFelippis,
Ph.D.; Siegfried Giess, Ph.D.; Steffen Gross; Alka
xviii Comits / Integrantes
Kamra, Ph.D.; ]oseph Kutza, Ph.D.; Kenneth R. Miller,
Ph.D.; Michael G. Mulkerrin, Ph.D.; Martin Schiestl,
Ph.D.; Dieter Schmalzing, Ph.D.; Yeowon Sohn, Ph.D.;
Robin Christopher Thorpe, Ph.D.; David C. Wylie,
Ph.D.
Panel de Expertos en ADN Residual en Productos
Obtenidos por Biotecnologa
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Pascal R. Anger; Jon R. Borman; Audrey Chang, Ph.D.;
Thomas E. Haemmerle, Ph.D.; Scott Kuhns, Ph.D.;
Junzhi Wang, Ph.D.; Weihong Wang, Ph.D.; ]udith
Zhu-Shimoni, Ph.D.
Panel de Expertos en Medicin de Protena Total
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Methal Albarghouthi, Ph.D.; Matthew W. Borer,
Ph.D.'. Olivier C. Germay, .Ph.D.; Anne M. ]espersen,
Ph.D., Lars Nygaard, M.S., Wendy R. Safell-Clemmer,
M.S.; Martin Schiestl, Ph.D.; William M. Skea, Ph.D.;
Lynn C. Yeoman, Ph.D.
Panel de Expertos en Pruebas para la
ldentlficacion por Resonancia Magntica Nuclear
(NMR) de Vacunas Polisacridos
CHRISTOPHER ]ONES, PH.D., Presidente
Chitrananda Abeygunawardana, Ph.D.; Yves Aubin,
Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Cristiana Campa, Ph.D.;
Thomas P. ]acques, Ph.D.; Michael T. ]ones, Ph.D.;
]eremy P. Kunkel, Ph.D.; Neil Ravenscroft, Ph.D.;
Philippe Talaga, Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas Para Uso Humano-
Vacunas Virales
BARRY D. GARFINKLE, PH.D., Presidente
John G. Aunins, Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Mark
Galinski; Lucy Gisonni-Lex; ]ohn D. Grabenstein,
Ph.D.; ]oan C. May, Ph.D.; Brian K. Nunnally, Ph.D.;
Cecile Maria Ponsar, Ph.D.; Silke M. Schepelmann,
Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D.
Captulos Generales-Formas Farmacuticas
]AMES E. DEMUTH, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Paul D. Curry, ]r., Ph.D.; Mario A.
Gonzalez, Ph.D.; Vivian A. Gray; Ralph A. Heasley, Ph.D.;
Anthony J. Hickey, Ph.D., O.Se.; Michael E. Houghton;
Munir A. Hussain, Ph.D.; Johannes Kraemer, Ph.D.; David
F. Long, Ph.D.; John W. Mauger, Ph.D.; ]olyon P.
Mitchell, Ph.D., FRSC; Beverly Nickerson, Ph.D.; Alan F.
Parr, Pharm.D., Ph.D.; Guirag Poochikian, Ph.D.; Galen
W. Radebaugh, Ph.D., R.Ph.; ]ohn G. Shabushnig, Ph.D.;
Raymond D. Skwierczynski, Ph.D.; ]ason A. Suggett,
Ph.D., M.B.A.; Kailas Thakker, Ph.D.; Thomas R. Tice,
Ph.D.; Sailesh Varia, Ph.D.; Mehran Yazdanian, Ph.D.
(1) Panel de Expertos en Inyectables-CONCLUIDO
]OHN G. SHABUSHNIG, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Lori Alquier, M.S.; Diane ]. Burgess,
Ph.D.; David F. Driscoll, Ph.D.; David F. Long, Ph.D.;
Thomas R. Tice, Ph.D.; Martn Woodle, Ph.D.
(771) Panel de Expertos en Preparaciones
Oftlmicas
ASHIM K. MITRA, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Cynthia M. Bach, M.S.; ]effrey S.
Fleitman, Ph.D.; Seshadri Neervannan, Ph.D.; Stacey
M. Platzer; Satish K.. Singh, Ph.D.; Thomas R. Tice,
Ph.D.; George W. Tin, Ph.D.
(787) Panel de Expertos en Partculas en Inyec-
tables Biofarmaceuticos
DALE S. ALDRICH, Presidente
Mary E.M. Cromwell, Ph.D.; Paul D. Curry, Ph.D.;
Jolyon P. Mitchell, Ph.D., FRSC; Linda O. Narhi, Ph.D.;
USP 39
Alla Polozova; Dean C. Ripple, Ph.D.; ]ohn G.
Shabushnig, Ph.D.; Satish K. Singh, Ph.D.; Lisa A.
Wenzler Savin, Ph.D.
(788) Panel de Expertos en Partculas en
Inyectables
DALE S. ALDRICH, Presidente
Dan Berdovich; Lew Brown, B.S.; Kevin Dahl, Ph.D.;
Robert Gavin, M.S.; Dean Ripple, Ph.D.
Panel de Expertos en Cpsulas Rellenas con
Lquido
VIVIAN A GRAY, Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; ]ean-Luc Coln, Ph.D.; joe Fotso,
Ph.D.; Munir A. Hussain, Ph.D.; Vi N. Schmidt, M.S.;
Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala,
M.Pharm., M.B.A.
Panel de Expertos en Pruebas de Desempeo de
Formas Farmacuticas Semislidas
KAILAS THAKKER, PH.D., Presidente
Eric Beyssac, Ph.D.; Robert G. Buice, Ph.D.; Bryan
Crist; james E. De Muth, Ph.D.; Geoffrey N. Grove,
Ph.D.; L. Thomas Hall, Ph.D.; ]ohn S. Heaney;
Matthew Kersey, .Ph.D.; Hans-Jue.rc:en Knitter; Patricia
L. Lee, M.S.; Patnck C. Mahn; W11iam M. Rosenthal;
Steve W. Shaw
Panel de Expertos en los Criterios de Solubilidad
para Frmacos de Uso Veterinario
MARIO A GONZALEZ, PH.D., Presidente
Mike Apley, DVM, Ph.D.; Bryan Crist; Robert P.
Hunter, M.S., Ph.D.; Mark G. Papich, M.S., D.V.M.;
Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; ]im E. Riviere, DVM,
Ph.D., O.Se.
Panel de Expertos en el Uso de Enzimas en la
Prueba de Disolucin de Cpsulas de Gelatina
VIVIAN A GRAY, Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; ]oan M. Dalla Riva Toma, Ph.D.;
Luigi Ghidorsi; ]ian-Hwa Guo, Ph.D.; Feixue Han,
Ph.D.; Jian-Hwa Han, Ph.D.; Christopher T. Hosty;
]ianmei D. Kochling, Ph.D.; ]ohannes Kraemer, Ph.D.;
Thomas Langdon; Steven R. Leinbach; Gregory P.
Martin, M.S.; Steven M. Meyerhoffer, Ph.D.; Richard
C. Moreton, Ph.D.; Krishnaswamy S. Raghavan, Ph.D.;
Edward Shneyvas, Ph.D.; ]ason A. Suggett, Ph.D.;
Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala,
M.Pharm., M.B.A.; Hu Wang, M.S.
Panel de Expertos en Inspeccin Visual de
Parenterales
RUSSELL E. MADSEN, M.S., Presidente
Dale S. Aldrich; ]ohn D. Ayres, M.O., J.D.; Roy Cherris;
John G. Shabushnig, Ph.D.; Deborah Shnek, Ph.D.
Captulos Generales-Microbiologa
]AMES E. AKERS, PH.D., Presidente
james P. Agalloco, M.S., M.B.A.; Dilip Ashtekar, Ph.D.;
Anthony M. Cundell, Ph.D.; Russell E. Madsen, M.S.;
Karen Z. McCullough, M.S.; Jianghong Meng, Ph.D.;
Leonard W. Mestrandrea, Ph.D.; Rainer F. Newman,
M.S.; Donald C. Singer, M.S.; Scott V.W. Sutton, Ph.D.;
Edward C. Tidswell, Ph.D.
(81) Panel de Expertos en Valoracin
Microbiana-Antibiticos-CONCLUIDO
THOMAS B. MAY, PH.D., Presidente
David L. Gibbs, Ph.D.; Amy J. Karren, RM/SM; Nilesh
Prabhakar Shinde, M.S.; Brenda Sullivan
Panel de Expertos en Modernizacin de
Valoraciones Microbiolgicas
]AMES E. AKERS, PH.D., Presidente
USP 39
Mark R. Coleman, Ph.D.; Gerald M. jensen, Ph.D.;
Ronald G. Lauback; jeremy Lebel; Fred J. Marsik,
Ph.D.; Edgar L. Mendaros; Elizabeth A. Monnot-
Chase, Ph.D.; jorn Thyme, D.V.M.; Glenn A. Van
Buskirk, Ph.D.
Captulos Generales-Envasado, Almacenamiento
y Distribucin
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Chris Chandler, Pharm.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.;
Shirley A. Feld, M.Sc.; Dana M. Guazzo, Ph.D.; Dennis R.
jenke, M.B.A., Ph.D.; Daniel J. Malinowski; Daniel L.
Norwood, M.S.P.H., Ph.D.; Kevin E. O'Donnell; Devinder
Pal, M.Pharm.; Diane M. Paskiet; Michael A. Ruberto,
Ph.D.; Marv D. Shepherd, Ph.D.; Sarah Skuce; Li Xiong,
Ph.D.
(381) Panel de Expertos en Tapones Elastomrlcos
para Inyectables
DIANE M. PASKIET, Presidente
Douglas J. Ball, M.S., DABT; Michael N. Eakins, Ph.D.;
Ronald G. lacocca, Ph.D.; Renaud J.G. Janssen, Ph.D.;
Dennis R. Jenke, Ph.D.; Heinz Kirchmeyer, Ph.D.;
Philippe LeGall, M.S.; Daniel L. Norwood, Ph.D.;
Michael A. Ruberto, Ph.D.; Wai (John) Wong, Ph.D.;
Lisa M. Yoest, M.S.
(659) Panel de Expertos en Requisitos de
Envasado y Almacenamiento
CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Y SHIRLEY ANN FELD, M.SC., Co-
Presidentes
Eleanor Freeman, B.S.; Kevin E. O'Donnell; Devinder
Pal, M.Pharm.; Robert H. Seevers, Ph.D.; Li Xiong,
Ph.D.
(671) Panel de Expertos en Envases-Pruebas de
Desempeo-CONCLUIDO
DAN J. MALINOWSKI, Presidente
Yisheng Chen, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Mary
G. Foster, Pharm.D., BFA; Hugh E. Lockhart, Ph.D.;
Dennis P. O'Reilly; Frank D. Witulski, M.S.; Li Xiong,
Ph.D.
(1118) Panel de Expertos en Dispositivos de
Monltoreo-Tlempo, Temperatura y Humedad-
CONCLUIDO
CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Presidente
Thaddeus Prusik, Ph.D.; Robert H. Seevers, Ph.D.;
David A. Ulrich, M.S.; lsmail Uysal, Ph.D.
(1207) Panel de Expertos en Envasado de
Productos Estriles-CONCLUIDO
DANA M. GUAZZO, PH.D., Presidente
James P. Agalloco, M.S., M.B.A.; James E. Akers,
Ph.D.; Peter Buus; Shu-chen Chen; Ronald Forster,
Ph.D.; Lee E. Kirsch, Ph.D.; Ronald Mueller; Donald C.
Singer, M.S.; David Walker
(1664) Panel de Ex11ertos en Lmites y Buenas
Prcticas de Lixlvlables-CONCLUIDO
DANIEL L. NORWOOD, PH.D., Presidente
Michael N. Eakins, Ph.D.; Dennis R. Jenke, Ph.D.,
M.B.A.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; james O. Mullis,
M.S.; Lee M. Nagao, Ph.D.; Diane M. Paskiet; Michael
A. Ruberto, Ph.D.; Cheryl Stults, Ph.D.
Panel de Expertos en Blocompatlbllidad de los
Materiales Usados en Sistemas de Envasado,
Dispositivos Mdicos e Implantes
DANIEL L. NORWOOD, PH.D., Presidente
Douglas J. Ball, M.S.; Stephen A. Barat, Ph.D.; William
P. Beierschmitt, Ph.D.; Denise Bohrer, Ph.D.; Tage C.
G. Carlson, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Jill A.
Integrantes /Comits xix
Glosson, B.A.; Douglas E. Kiehl, M.Sc.; Anita Y.
Sawyer, M.S.
Panel de Expertos en Materiales para Ensayos
Clnicos (Buenas Prcticas de Distribucin)
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Rafik H. Bishara, Ph.D.; Glaucia K. Braga, Ph.D.;
Steven A. jacobs, M.B.A.; Martin Jeiven, M.S.; Claude
Jolicoeur, B.S.; Desiree Valentine, M.B.A.
Panel de Expertos en Buenas Prcticas de
Distribucin-CONCLUIDO
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Gl~ucia K. Brag_a, Ph.D.; Chr~s Chandler, Pharm.D.;
M1chael N. Eal<ins, Ph.D.; Shirley A. Feld, M.Sc.;
Patricia C. Kienle, R.Ph., M.P.A.; William A. Mixon,
M.S.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Devinder Pal, M.
Pharm.; Marv D. Shepherd, Ph.D.; Sarah M. Skuce
Panel de Expertos en Sistemas Plsticos Usados en
la Fabricaclon de Medicamentos
DENNIS R. JENKE, PH.D., Presidente
Denise G. Bestwick, B.S.; Weibing Ding, Ph.D.;
Michael N. Eakins, Ph.D.; Jerold (Jerry) M. Martin,
M.Sc.; Daniel L. Norwood, Ph.D.; Diane M. Paskiet;
Cheryl L.M. Stults, Ph.D.; Ken M. Wong, M.Sc.
Estndares de Referencia
MATIHEW w. BORER, PH.D., Presidente
Bianca Avramovitch, Ph.D.; Adrian F. Bristow, Ph.D.;
A_ntony Raj Gomas, Ph.D.; Shaohong )in; Catherine A.
R1mmer, Ph.D.; lffaaz M. Salahudeen, Ph.D.; Ma
Shuangcheng, Ph.D.; Ralph E. Sturgeon, Ph.D.; Robert L.
Watters, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel; Xinyue Xiao, M.S.
Estadstica
ROBERT R. SINGER, M.Sc., Presidente
Bruno Boulanger, Ph.D.; Richard K. Burdick, Ph.D.; David
J. Christopher, M.S.; David ). LeBlond, Ph.D.; Anthony G.
Okinczyc, M.P.H., M.B.A.; Dennis Sandell, Ph.D.;
Timothy Schofield, M.A.; Charles Y. Tan, Ph.D.; Harry
Yang, Ph.D.
Panel de Expertos en Uniformidad de Contenido
con Muestras de Gran Tamao
DENNIS SANDELL, PH.D., Presidente
james S. Bergum, Ph.D.; Myron B. Diener, M.S.;
Walter Hauck, Ph.D., Jeffrey Hofer, M.S.; Gregory L.
Lamer, M.S.
Toxicologa
ROBERT E. STERBERG, PH.D., Presidente
Charles Barton, Ph.D.; Joseph F. Borzelleca, Ph.D.; john
Doull, Ph.D., M.D.; Marion Ehrich, Ph.D.; Gregory L.
Erexson, Ph.D., DABT; Bruce A. Fowler, Ph.D., ATS; Bo Li,
Ph.D.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; Michel Mikhail,
Ph.D.; Jeffrey P. Smith, Ph.D.
Comit de Expertos del Formulario
Nacional
Monografas-Excipientes
LAWRENCE H. BLOCK, PH.D., Presidente
Kenneth S. Alexander, Ph.D., Ed.Sp.; Fernando A.
Alvarez-Nunez, Php.; Shireesh. P. Apte, P~.D.; Tim D.
Cabelka, Ph.D.; Bnan A.C. Carhn, Ph.D.; Richard N.
Cawthorne, Ph.D.; Jian-Hwa Guo, Ph.D.; Felicitas Guth,
Ph.D.; Mary C. Houck, Ph.D.; William J. Lambert, Ph.D.;
Philip H. Merrell, Ph.D.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Eric
J. Munson, Ph.D.; Paul B. Myrdal, Ph.D.; Yihong Qiu,
Ph.D.; Venkatramana Rao, Ph.D.; jiasheng Tu, Ph.D.;
Richard H. Wendt, Ph.D.
xx Comits / Integrantes
(1197) Panel de Expertos en Buenas Prcticas de
Distribucin para Excipientes Farmacuticos a
Granel
GREGORY E. AMIDON, PH.D., Y RICHARD C. MORETON, PH.D.,
Ca-Presidentes
Lawrence H. Block, Ph.D.; William Dale Carter, M.S.;
Zak T. Chowhan, Ph.D.; Marc Fages; Elizabeth
Ferguson-Brown; Mary G. Foster, Pharm.D., BFA;
Linda A. Herzog, M.B.A.; Ashok V. Katdare, Ph.D.;
Zakiya Kurdi, Ph.D.; Edward G. Malawer, Ph.D., CQA;
Frank Milek, Ph.D.; Becca Mitchell; Dwight Mutchler;
Carnet E. Peck, Ph.D.; Mike Schultz, R.Ph.; Alexa
Smith, M.S.; Glenn Sokoloski; Kelly Taylor; jiasheng
Tu, Ph.D.
Panel de Expertos en Glicerina
TIM D. CABELKA, PH.D., Presidente
Lawrence H. Block, Ph.D.; Carlos E. Bortolotto, B.S.;
Frances K. Byrne, M.S.; lan A. Duncan, Ph.D.; Balaji V.
Kadri, M.Pharm., M.Sc., MBA; Tanja Natterer; Marian
J. Rinken, Ph.D.; Gwen E. Rucker, B.S.; David A.
Sharknas, B.S.; Hong Zhou, Ph.D.
Panel de Expertos en Povidonas
BERNHARD D. FUSSNEGGER, PH.D. Y CARL PERINI, M.S., Co-
Presidentes
Lawrence H. Block, Ph.D.; Feng Chen, Ph.D.; David J.
Filiar, MBA; Edward G. Malawer, Ph.D.; Syed A.A.
Rizvi, Ph.D.; john W. Spink, Ph.D.; Fan Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Talco
LAWRENCE H. BLOCK, PH.D., Presidente
Detlef Beckers, Ph.D.; jocel_yne Ferret, Ph.D.; Gregory
P. Meeker, M.S.; Aubrey M1ller, M.D., M.P.H.; Robert
E. Osterberg, Ph.D.; Dilip M. Patil, M.S.; julie W. Pier,
M.S.; Steve Riseman, Ph.D.; Martin S. Rutstein, Ph.D.;
Gary P. Tomaino; Drew Van Orden, M.S., M.A.; james
S. Webber, Ph.D.
Comit de Expertos en Informacin Teraputica y
Sustento al Formulario
NANCY jo BRADEN, M.D., Presidente
Marialice S. Bennett, B.S.Pharma, RPh, FAPhA; Andrea
Brassard, Ph.D., FNP-C, FAANP; Judith P. Clark, B.S.;
Babette S. Edgar, Pharm.D., M.B.A.; Chester B. Good,
M.D., MPH, FACP; William M. Heath, B.S. Pharm.,
MBA; Raymond j. Hohl, M.D., Ph.D.; Raymond C.
Love, Pharm.D., BCPP; Robert J. Meyer, M.D.; Seth
M. Powsner, M.D.; Marcus M. Reidenberg, M.D.; N.
Lee Rucker, M.S.P.H.; Melody Ryan, Pharm.D., MPH;
Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Robert L. Talbert, B.S.,
Pharm.D.; J. Russell Teagarden, D.M.H., M.A.
Comit de Expertos de la USP y del
Dietary Supplements Compendium
Monografas-Suplementos Dietticos y Medicinas
Herbarias
DENNIS K.J. GRECKI, B.S.P., PH.D., Presidente
Marilyn L. Barrett, Ph.D.; ]oseph M. Betz, Ph.D.; Michael
S. Bradley, M.S.; ]osef A. Brinckmann; James R. Brooks,
Ph.D.; Robert L. Chapman, Ph.D.; De-an Guo, Ph.D.; Bill
J. Gurley, Ph.D.; Sukhdev Swami Handa, Ph.D.; David C.
Hopp, Ph.D.; Scott A. Jordan, Ph.D.; Joy A. joseph, M.S.;
A. Douglas Kinghorn, Ph.D., O.Se.; Richard Ko,
Pharm.D., Ph.D.; Raimar Libenberg, Ph.D.; Tieraona Low
Dog, M.D.; Gail B. Mahady, Ph.D.; Robin j. Marles,
Ph.D.; Guido F. Pauli, M.D., Ph.D.; Zhongzhi Qian, M.S.;
Eike Reich, Ph.D.; Paul L. Schiff, jr., Ph.D.; Fabio M.B.
Soldati, Ph.D.; Edward H. Waysek, Ph.D.; Wayne R. Wolf,
Ph.D.
USP 39
Panel de Expertos para la Revisin de Arginina
]AMES R. BROOKS, PH.D., Presidente
Marilyn Barrett, Ph.D.; Louis Cantilena, M.D.; Rebecca
B. Costello, Ph.D.; johanna T. Dwyer, O.Se., RD; Mary
L. Hardy, M.D.; Scott A. jordan, Ph.D.; Robin Marles,
Ph.D.; Ronald J. Maughan, Ph.D.; Robert Osterberg,
Ph.D.; Bruce E. Rodda, Ph.D.; Robert R. Wolfe, Ph.D.;
jorge Zuniga, Ph.D.
Panel de Expertos para la Revisin de Beta-
Alanina
RICHARD Ko, PHARM.D., PH.D., Presidente
Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Rebecca B. Costello,
Ph.D.; William j. Evans, Ph.D.; Mary L. Hardy, M.D.;
Scott A. jorda~, Ph.D.; Rona.ld J. Ma~ghan, Ph.D.;
janet W. Rankin, Ph.D.; Abb1e E. Sm1th, Ph.D.
Panel de Expertos en el Modelado de Seguridad
de Suplementos Dietticos
MARY L. HARDY, M.D., Presidente
VA Shiva Ayyadurai, Ph.D., SMVS, SMME; Louis
Cantilena, M.D.; Mary Avis Fox, Ph.D., MPH; Scott A.
jordan, Ph.D.; Diane R. Mould, Ph.D.; Mkaya
Mwamburi, M.D., Ph.D, M.A.; Robert E. Osterberg,
Ph.D.; Charles Yoe, Ph.D.
Panel de Expertos en Revisiones Basadas en
Evidencia
TIERAONA Low DOG, M.D., Presidente
Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Stephanie Chang, M.D.,
M.P.H.; Mei Chung, Ph.D.; Rebecca B. Costello,
Ph.D.; Dennis K.j. Gorecki, Ph.D.; Scott A. jordan,
Ph.D.
Panel de Expertos en Suplementos Dietticos de
Liberacin Prolongada
jOY A ]OSEPH, M.S., Presidente
Charles Barton, Ph.D.; joseph F. Borzelleca, Ph.D.;
Michael S. Bradley, M.S.; james R. Brooks, Ph.D.;
Marion Ehrich, Ph.D.; Vivian A. Gray; Carol S.
johnston, Ph.D.; Raimar Loebenberg, Ph.D.; Alexander
G. Schauss, Ph.D.; Elizabeth A. Yetley, Ph.D.
Panel de Expertos en Herbal Medicines
Compendium-Asia Oriental
ZHONGZHI QIAN, M.S., Presidente
Kai shun Bi, Ph.D.; Shilin Chen, Ph.D.; De-an Guo,
Ph.D.; Shen Ji, Ph.D.; Brad WC Lau, M.S., Ph.D.; Clara
Bik San Lau, Ph.D.; Ping Li, Ph.D.; Rui Chao Lin,
Ph.D.; Shangmei Shi, B.S.; Pengfei Tu, Ph.D.; Zheng-
Tao Wang, Ph.D.; Yang-Chang Wu, Ph.D.; Shishan Yu,
Ph.D.; Zhao Zhonzhen, Ph.D.
Panel de Expertos en Herbal Medicines
Compendium-Sur Asia
SUKHDEV SWAMI HANDA, PH.D., Presidente
Amit Agarwal; C.K. Katiyar, Ph.D.; Rasadah Mat Ali,
Ph.D.; D.G. Naik, Ph.D.; Sankaran Natarajan, Ph.D.;
M.K. Raina, Ph.D.; Neeraj Tandon, Ph.D.
Comit de Expertos del Food Chemicals
Codex
Monografas-Ingredientes Alimenticios
ANDREW G. EBERT, PH.D., Presidente
Michael H. Auerbach, Ph.D.; janet L. Balson, M.S.; Hans
K. Biesalski, M.D., Ph.D.; Simon Brooke-Taylor, Ph.D.;
Richard C. Cantrill, Ph.D.; junshi Chen, M.D.; Grady W.
Chism, Ph.D.; Roger A. Clemens, Dr.P.H.; jonathan W.
~eVries, Ph.D.; john w.. Finley, Ph.D.; Carl .Frey, M.S.;
E1nat Haleva, Ph.D.; Lon L. Klopf, Ph.D.; D1ane B.
McColl, j.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; joseph A. Scimeca,
USP 39
Ph.D.; Fereidoon Shahidi, Ph.D.; Karina R. Vega-Villa,
Ph.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Ingredientes Alimenticios-
Adulterantes Intencionales
)ONATHAN w. DEVRIES, PH.D., Presidente
Paul Brent, Ph.D.; Susan M. Brown, M.E.A.;
Christophe A. Cavin, Ph.D.; Henry Chin, Ph.D.; Robin
Churchill, Ph.D.; Karen Everstine, Ph.D., M.P.H.;
Hazen Frederick Cale, Ph.D.; Shaun Kennedy; Petra
Lutter, Ph.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; John Spink,
Ph.D.; Saskia van Ruth, Ph.D.; Carl Winter, Ph.D.;
Yongning Wu, M.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Calidad y Autenticidad de
Aceite de Oliva
RICHARD c. CANTRILL, PH.D., Presidente
Diego Garcia-Gonzalez, Ph.D.; Claudia Guillaume,
M.Sc.; Zohar Kerem, Ph.D.; Paul H. Miller, B.A.;
Agusti J. Romero, Ph.D.; Selina Wang, Ph.D.
Comit de Expertos de la USP y del USP
on Compounding
Preparacin Magistral
GIGI S. DAVIDSON, B.S.PHARM., DICVP, Presidente
Lisa D. Ashworth, R.Ph.; Gus S. Bassani, Pharm.D.;
Edmund ). Elder, )r., Ph.D.; Maria do Carmo M. Garcez,
B.S.Pharm.; Deborah R. Houston, Pharm.D.; Patricia C.
Kienle, M.P.A.; Keisha D. Lovoi, B.S.Pharm.; Linda F.
McElhiney, Pharm.D.; William A. Mixon, M.S.; David W.
Newton, Ph.D.; Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; R~gina F.
Peacock, Ph.D.; Robert P. Shrewsbury, Ph.D.; Ke1th St.
John, M.S.
Panel de Expertos en Preparacin Magistral con
Frmacos Peligrosos
PATRICIA c. KIENLE, M.P.A., Presidente
Thomas H. Connor, Ph.D.; Eric Kastango, M.B.A., B.S.
Pharm.; Melissa A. McDiarmid, M.D., MPH; Kenneth
R. Mead, Ph.D.; Martha Polovich, Ph.D.; Lucille A.
Power; james T. Wagner
Panel de Expertos en Preparacin Magistral-
Preparaciones Estriles
)AMES E. AKERS, PH.D., Y GiGI S. DAVIDSON, B.S. PHARM.,
DICVP, Ca-Presidentes
Michael W. Anneken, B.S. Pharm., R.Ph.; Byron
Ashworth; )effrey A. Clanton, M.S.; Cynthia T. Culmo,
B.S.; Gordon M. Ely; Brenda S. )ensen, CPhT, M.B.A.;
Patrick A. Lester, B.S. Pharm., DVM, M.S.; Paul N.
Limberis, B.S.; Lisa A. McCartney, BMS; Elizabeth A.
Monsees, RN, MSN, MBA; Barbara M. Soule, RN,
MPA, B.S.; Matthew Stanton, Pharm.D.; Marc H.
Stranz, Pharm.D.; William A. Stuart, B.S.; Vaiyapuri
Subramaniam, Pharm.D.; Angela W. Yaniv, Pharm.D.
Comits de Expertos del USP Medicines
Compendium
USP Medicines Compendium-Productos
Biolgicos
DHANANJAY PATANKAR, PH.D., Presidente
Sriram V. Akundi, Ph.D.; Mahesh K. Bhalgat, Ph.D.; )ason
B. Bock, Ph.D.; Daniel Silva Guedes, Ph.D.; Gye Mee
)ang, M.S.; Sridevi Khambhampaty, Ph.D.; Jaeok Kim,
M.S.; Young-Phil Lee, Ph.D.; Rustom S. Mody, Ph.D.;
Venkat R. Mukku, Ph.D.; Venkata Ramana, Ph.D.;
Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.; Li Shi, Ph.D.; Dongmei
Su, Ph.D.; Utpal Tatu, Ph.D.; Meenu Wadhwa, Ph.D.
Integrantes /Comits xxi
Panel de Expertos en Protenas Teraputicas
RUSTOM S. MODY, PH.D., Presidente
Sriram V. Akundi, Ph.D.; Sanjay Bandyopadhyay, Ph.D.;
jaby )acob, Ph.D.; Dhananjay Patankar, Ph.D.; Venkata
Ramanna, Ph.D.; Alok Sarma, Ph.D.; Gul Raj Soni, Ph.D.;
Meenu Wadhwa, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas
MAHESH K. BHALGAT, PH.D., Presidente
Sunil Gairola, Ph.D.; Gaurav Gupta, Ph.D.; Sunil Gupta,
M.D.; Mei Mei Ho, Ph.D.; Suresh Karupothula, Ph.D.; K.
Anand Kumar, Ph.D.; Y.U.B. Rao, Ph.D.; Anil Sood,
M.Sc.; Ajay Kumar Tahlan, M.D.
USP Medicines Compendium-Asia Oriental
)IASHENG Tu, PH.D., Presidente
Ying Chen, B.S.; Zhonggui He, Ph.D.; Fangwen Shuai;
Qiaofeng Tao, Ph.D.; Hao Wang, Ph.D.; Weibing Wang;
Yue-Sheng Wang, Ph.D.; Hongyan Xie; Luo Zhuoya,
Ph.D.
USP Medicines Compendium-Amrica Latina
MARIA INES R.M. SANTORO, PH.D., Presidente
Maria Alice Bockelmann, Ph.D.; Mauro Cesar de Faria, B.
Se., MBA; Elizabeth lgne Ferreira, Ph.D.; )os Aparcio
Brittes Funck, Ph.D.; Ana Mara Camero Collado, B.Sc.;
Silvia Susana Giarcovich, Ph.D.; Patricia Soledad Carrea
Gonzlez, M.Sc.; Mara Catalina Daz Gutirrez, B.Sc.;
Osear Quattrocchi, M.Sc.; Jaime-Humberto Rojas, M.Sc.;
Graciela Aguilar Gil Samaniego, B.Sc.; Silvia Storpirtis,
Ph.D.
USP Medicines Compendium-Estados Recientemente
Independizados (ERl)-Rusia-CONCLUIDO
ALLA A. MIKHAYLOVA, M.S., Presidente
Farid Aliyev, Ph.D.; Svetlana O. Chikalova, M.S.;
Konstantin V. Dubinin, Ph.D.; Victoriya Georgiyants,
Ph.D.; Lilit Ghazaryan; Tea Jikia, Ph.D.; Oiga Maklakova,
MBA; Siarhei l. Marchanka, Pharm.D.; Oiga G. Potanina,
D.Sc.; Andrey Prokhorov, M.D.; Mirzohidjon M. Qodirov,
M.S.; Sergii Sur, M.D., Ph.D.; Anna V. Titova, Ph.D.;
Valiantsina V. Tsimoshyna; Ardak U. Tulegenova, D.Sc.;
Ramenskaya Calina Vladislvovna, Ph.D.
USP Medicines Compendium-Sur Asia
ANTONY RAJ GOMAS, PH.D., Presidente
Rajiv Desai, Ph.D.; Manish Gangrade, Ph.D.; Sushil
Gangwal, Ph.D.; Farnaz Malik, Ph.D.; Mangesh Arvind
Mantri, Ph.D., MBA; Petla Naidu, Ph.D.; Sheikh M.
Rahman, Ph.D.; Zahid Saeed, B.Pharm.; Mohammad
Tahir Siddique, M.Sc., MBA; Sukhdev Singh, M.Sc.;
Sukumar Sinha, Ph.D.; Saji Thomas, Ph.D.
Enlaces Gubernamentales ante los
Comits de Expertos y los Paneles de
Expertos
Enlaces de la Administracin de Alimentos y
Medicamentos de los EE.UU. (FDA)
Rajiv Agarwal, Ph.D.; Ali Al-Hakim, Ph.D.; Om Anand, Ph.D.;
Juan Arciniega, D.Sc.; Jane A. Axelrad, ).D.; Anamitro
Banerjee, Ph.D.; Steven R. Bauer, Ph.D.; )onathan Bray, B.S.;
Michael R. Brent, Ph.D.; Lucinda F. Buhse, Ph.D.; Teresa T.
Cain, Ph.D.; )ohn H. Callahan, Ph.D.; Tura C. Camilli, Ph.D.;
Steven Casper, Ph.D.; Wiley A. Chambers, M.D.; Jane
Chang, Ph.D.; Donna F. Christner, Ph.D.; )ohn F. Cipollo,
Ph.D.; Carolyn Cohran, Ph.D.; Thomas Colatsky, Ph.D.; )erry
Cott, Ph.D.; Mike Darj, Ph.D.; Mamata De, Ph.D.; lan F.
DeVeau, Ph.D.; Shulin Ding, Ph.D.; Cory D. Evans, Ph.D.;
Raafat M. Fahmy, Ph.D.; Patrick Faustino, Ph.D.; Daniel
Folmer, Ph.D.; Rick L. Friedman, M.S.; Michael Scott
Furness, Ph.D.; Zongming Gao, Ph.D.; Tapash Ghosh, Ph.D.;
xxii Comits / Integrantes
Devinder S. Gill, Ph.D.; Lillie D. Golson, Pharm.D.; Yin Guo,
Ph.D.; Michael Hadwiger, Ph.D.; Bruce D. Harris, Ph.D.;
William Hess; Laura S. Huffman, M.S.; Gregory W. Hunter,
Ph.D.; Mai Huynh, M.S.; Robert lser, M.S.; joseph E.
Jablonski, Ph.D.; Lauren Jackson, Ph.D.; David S. Kaplan,
Ph.D.; John F. Kauffman, Ph.D., M.B.A.; David A. Keire,
Ph.D.; Michael C. Kennedy, Ph.D.; Andrea K. Kerrigan, M.S.;
Mansoor A. Khan, R.Ph., Ph.D.; Loice C. Kikwai, Ph.D.;
Robert H. King, Ph.D.; Donald N. Klein, Ph.D.; Bogdan
Kurtyka, Ph.D.; Stephen E. Langille, Ph.D.; Sau L. Lee, Ph.D.;
Robm Levis, Ph.D.; Tsai-lien Lin, Ph.D.; Richard Lostritto,
Ph.D.; Ragine Maheswaran, Ph.D.; lngrid Markovic, Ph.D.;
Ewa Marszal, Ph.D.; Gerald E. Marti, M.D., Ph.D.; Marilyn N.
Martinez Pelsor, Ph.D.; Dorota Matecka, Ph.D.; Jeffrey B.
Medwid, Ph.D.; Randa Melhem, Ph.D.; Janis R.
Messenheimer, D.V.M.; John Metcalfe, Ph.D.; Yana Mille, R.
Ph.; Tahseen Mirza, Ph.D.; Amit K. Mitra, Ph.D.; Sanja
Modric, D.V.M., Ph.D.; Magdi M. Mossoba, Ph.D.; Laxma
Nagavelli, Ph.D.; Linda L. Ng, Ph.D.; Mickey Parish, Ph.D.;
Suhas Patankar, Ph.D.; Frank Perrella, Ph.D.; Kristina E.
Peters, Pharm.D.; Erika A. Pfeiler, Ph.D.; Laura C. Pogue,
Ph.D.; Vaikunth Prabhu, Ph.D.; CAPT Kimberly Rains, Pharm.
D.; Rahdika Rajagopalan, Ph.D.; Sam e;;. Raney, Ph.D.; Andre
S. Raw, Ph.D.; Snanaz Read, Ph.D.; Bnan D. Rogers, Ph.D.;
Allen Rudman, Ph.D.; R. Duane Satzger, Ph.D.; Peter Scholl,
Ph.D.; Paul Schwartz, Ph.D.; Suzanne J. Sechen, Ph.D.; Paul
Seo, Ph.D.; Rakhi Shah, Ph.D.; jannavi Srinivasan, Ph.D.; Ann
Stohlman, D.V.M.; Yichun Sun, Ph.D.; Neeru Takiar, M.S.;
Jennifer Thomas, J.D.; Ram C. Tiwari, Ph.D.; Paula R.
Trumbo, Ph.D.; Yiying Tsai, Pharm.D., M.P.H.; Saleh A.
Turujman, Ph.D.; Willie F. Vann, Ph.D.; Perry Wang, Ph.D.;
Russell Wesdyk, M.B.A.; Steven Wolfgang, Ph.D.; Jo H.
Wyeth, Pharm.D.; Li Xia, Ph.D.; Betsy jean Yakes, Ph.D.;
Susan Zuk, Ph.D.
Otros Enlaces Gubernamentales
Brazllian Pharmacopeial Commission
Gerson Pianetti, Ph.D.; Monica Soares, Ph.D.
Chinese Pharmacopeial Commlssion
Zhongping Guo; Peng Han
Federal Commission for the Protection against
Sanitary Risk (COFEPRIS), Mexico
Gregorio Tecuapetia
Health Canada
Victoria Kyeyune
National lnstitute for Quality Control In Health
(INCQS), Brazll
Filipe Silva, Ph.D.
The Saudi Food and Drug Authority (Saudi FDA),
Saudi Arabia
Ali M. Al Homaidan, Ph.D.
U.S. Centers for Diease Control and Prevention
Melissa Schaefer, M.D.; Nadine Shehab, Pharm.D., MPH
U.S. Centers for Medicare and Medicaid Servlces
Marie E. Manteuffel, Pharm.D., M.P.H.
USP 39
U.S. National lnstitute of Standards and
Technology (NIST)
Val R. Miller, Ph.D.
Grupos Asesores
[Nota-El Director Ejecutivo puede nombrar
organismos asesores para apoyar la labor del Consejo de
Expertos y de la Convencin, y para asesorar al personal
interno en asuntos relacionados con polticas. El
siguiente listado de Grupos Asesores y sus miembros
representa a aquellos Grupos formados y aprobados en
su totalidad a partir de mayo de 2015. Los Grupos
Asesores se forman y desintegran continuamente
durante todo el ciclo de revisin de la USP, por lo que
en un futuro se publicarn otras listas de miembros.]
Grupo Asesor para Titular Monografas-CONCLUIDO
Robert S. Beardsley, R.Ph., Ph.D.; Micnael Cohen, R.Ph.;
Marjorie Coppinger; Mary Jo Goolsby, Ed.D., M.S.N., C.A.E.;
Chandraprakash Kasireddy, Ph.D.; Barbara Kochanowski,
Ph.D.; Murray Kopelow, M.D., F.R.C.P.C.; Gary Matzke,
Pharm.D.; Linda F. McElhiney, Pharm.D., R.Ph.; David
Newton, Ph.D.; Annette Perschke, R.N., M.S.N.; Marjorie
Phillips, M.S.; Peter H. Rheinstein, J.D., M.S.; Elliott M.
Sogol, P~p., R.~h.; Vaiyapuri ~ubramaniam, Pharm.D.,
M.S.; Ph1hp Trav1s; Mark Wiggms, M.S.
Grupo Asesor de Leche Descremada en Polvo
ROBERT MAGALETTA, PH.D., Presidente
Grant Abernethy, Ph.D.; Marti Bergana, Ph.D.; Sneh
Bhandari, Ph.D.; jack Cappozzo, M.S.; Kuanglin Chao,
Ph.D.; Jonathan DeVries, Ph.D.; Gerard Downey, Ph.D.;
Stephen Ellison, Ph.D.; George Greene; Einat Haleva,
Ph.D.; James M. Harnly, Ph.D.; Peter de B. Harrington,
Ph.D.; Steven Holroyd, Ph.D.; William J. Hurst; Gregory
A. lsraelson; Moon S. Kim, Ph.D.; Petra Lutter, Ph.D.; Bill
MacLuckie, Ph.D.; Andrew Mackey, Ph.D.; Carmen
Martin-Hernandez; Anitra Payne; Benjamn B. Perston,
Ph.D.; Jianwei Qin; Joseph P. Romano; Roman Romero,
Ph.D.; Catherine Shaw; Suqin Sun, B.S.; John Szpylka,
Ph.D.; Paul Wehling; Jinchuan Yang, Ph.D.; Steven
Zbylut, Ph.D.; Caro! Zyrbko, Ph.D.
In Memriam
La USP extiende su reconocimiento a los siguientes
Voluntarios Expertos quienes fallecieron durante el ciclo
2010-2015:
Robert G. Bursey, Ph.D. (Monografas-Comit de
Expertos de Ingredientes Alimenticios)
Mark C. Roman, Ph.D. (Comit de Expertos de Captulos
Generales-Anlisis Qumico)
Ashwani Kumar Sahu, M.Sc. (Panel de Expertos en
Vacunas)
James A. Shea, Ph.D. (Panel de Expertos en Buenas
Prcticas de Documentacin)
Ranga Velagaleti, Ph.D. (Monografas-Comit de
Expertos de Ingredientes Alimenticios)
Karen Wheless, M.S. (Comit de Expertos de Captulos
Generales-Anlisis Qumico)
USP 39 Integrantes/ Miembros xxiii

Miembros y Delegados de
la Convencin de la
Farmacopea de los Estados
Unidos de Amrica a partir
del 31 de mayo de 2015
Indiana University School of Medicine, David R. Jones, Ph.D.
Instituciones Acadmicas y joan C. Edwards School of Medicine Marshall University, Gary
Asociaciones Vinculadas- O. Rankin, Ph.D.
johns Hopkins University School of Medicine, Daniel M. Ashby,
Asociaciones Acadmicas M.S., FASHP
Keck School of Medicine of University of Southem California,
American Association of Colleges of Nursing, Ginette A. Paul D. Holtom, M.O.
Pepper, Ph.D. Loma Linda University School of Medicine, John N. Buchholz,
American Association of Colleges of Osteopathic Medicine, An- Ph.D.
thony J. Silvagni, O.O., Pharm.D., M.Sc., FACOFP, FAFPE Louisiana State University Schoo/ of Medicine, Kurt J. Varner,
American Association of Colleges of Pharmacy, Lucinda L. Ph.D.
Maine, Ph.D., R.Ph. Louisiana State University Schoo/ of Medicine at Shreveport,
Association of American Medica/ Colleges, David W. Henry R. McKnight, B.S., M.S., Pharm.D.
Nierenberg, M.O. Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, Jawed
Association of American Veterinary Medica/ Colleges, Dawn M. Fareed, Ph.D.
Boothe, D.V.M., Ph.D., M.S. Mayo Medica/ School, Peter J. Post, Pharm.D., R.Ph.
Association of Faculties of Pharmacy of Canada, Raimar Loe- Medica/ University of South Carolina College of Medicine,
benberg, Ph.D. Kenneth D. Tew, Ph.D.
Meharry Medica/ College School of Medicine, Clivel G.
Instituciones Acadmicas y Charlton, Ph.D.
Mercer University School of Medicine, Wayne Glasgow, Ph.D.
Asociaciones Vinculadas- Michigan State University College of Human Medicine, Rami B.
lbrahim, M.Sc., Pharm.D., BCPS, BCOP
Universidades y Facultades de Morehouse School of Medicine, Ward Kirlin, Ph.D.
Medicina Mount Sinai School of Medicine, ]oel S. Mindel, M.O., Ph.D.
New York Medica/ College, Mario A. lnchiosa, Ph.D.
Baylor College of Medicine, Lynn C. Yeoman, Ph.D. New York University School of Medicine, Lewis S. Nelson,
Bastan University School of Medicine, Carol T. Walsh, Ph.D.
M.O.
Brody School of Medicine at East Carolina University, Abdel A. Northeast Ohio Medica/ University College of Medicine, Werner
Abdel-Rahman, Ph.D., FAHA Geldenhuys, Ph.D.
Case Western Reserve University School of Medicine, Walter B. Northwestern University Feinberg School of Medicine, Steven
Geho, M.O., Ph.D. M. Belknap, M.O.
Chicago Medica/ School at Rosalind Franklin University of Medi- Ohio State University College of Medicine, Robert J. Weber,
cine and Science, Ann K. Snyder, Ph.D.
Pharm.D., M.S.
Columbia University College of Physicians and Surgeons, Ru- Pennsylvania State University College of Medicine, Kelly D.
dina Odeh-Ramadan, Pharm.D. Karpa, Ph.D., R.Ph.
Ponce School of Medicine, Leon Ferder, M.O.
Creighton University Schoo/ of Medicine, Peter W. Abel, Ph.D.
Duke University School of Medicine, Sharon L. Ellison, Pharm. Rutgers, the State University of New jersey, New jersey Medica/
D. School, Deborah Lazzarino, Ph.D.
East Tennessee State University james H. Quillen College of Rutgers, the State University of New jersey, Robert Wood john-
Medicine, Kenneth E. Ferslew, Ph.D. son Medica/ School, Susan Goodin, Pharm.D., FCCP,
Eastern Virginia Medica/ School, Senthil Kumar Rajasekaran, BCOP
M.O. Saint Louis University School of Medicine, Heather Macarthur,
Florida State University College of Medicine, Graham A. Ph.D., B.Sc.
Patrick, Ph.D. San juan Bautista School of Medicine, Marielis E. Rivera Ruiz,
Geisel School of Medicine at Dartmouth, Lionel D. Lewis, M.O. Ph.D.
Georgetown University School of Medicine, Thomas G. Sidney Kimmel Medica/ College at Thomas jefferson University,
Sherman, Ph.D. Walter Kraft, M.O., M.S., FACP
Howard University College of Medicine, Robert E. Taylor, M.O., Southern Jllinois University School of Medicine, Carl Faingold,
Ph.D., FACP Ph.D.
xxiv Miembros/ Integrantes
SUNY at Buffalo School of Medicine and Biomedical Sciences,
Paul J. Kostyniak, Ph.D., DABT
SUNY Downstate Medica/ Center College of Medicine, ]acob V.
Aranda, M.D., Ph.D., FRCPC
SUNY Upstate Medica/ University, David F. Lehmann, M.D.,
Pharm.D.
Temple University School of Medicine, Alan Cowan, Ph.D.
Texas A&M Hea/th Science Center College of Medicine, D.
Samba Reddy, Ph.D., R.Ph. . University of Tennessee, Memphis College of Medicine, Trevor
Texas Tech University Health Sciences Center School of Medi-
cine, Peter Syapin, Ph.D.
The Warren Alpert Medica/ Schoo/ of Brown University, Wayne
D. Bowen, Ph.D.
Tufts University School of Medicine, Ross W. Thompson, M.S.,
R.Ph.
Tulane University School of Medicine, David W. Busija, Ph.D.,
M.D. (Hon.)
Uniformed Services University of the Hea/th Sciences, Louis R.
Cantilena, M.D., Ph.D.
Universidad Central del Caribe Schoo/ of Medicine, Harry
Mercado, M.D.
University of Alabama at Birmingham School of Medicine,
Richard J. Whitley, M.D.
University of Arizona College of Medicine, Hillary A. Franke,
M.D., M.S.
University of Arkansas for Medica/ Sciences College of Medicine,
Paul L. Prather, Ph.D., B.S.
University of California Davis School of Medicine, Timothy E.
Albertson, M.D., M.P.H., Ph.D.
University of California San Francisco School of Medicine, Linda
L. Liu, M.D.
University of Chicago Pritzker School of Medicine, Michael L.
Maitland, M.D., Ph.D.
University of Cincinnati College of Medicine, Marianne F. lvey,
Pharm.D., M.P.H., FASHP
University of Connecticut Hea/th Center School of Medicine,
Kimberly J. Metcalf, Pharm.D.
University of Hawaii john A. Burns Schoo/ of Medicine, Robert
A. Nichols, Ph.D.
University of 11/inois College of Medicine at Chicago, Randal A.
Skidgel, Ph.D.
University of lowa Carver College of Medicine, Donald E. Le-
tendre, Pharm.D.
University of Kansas School of Medicine, Sam J. Enna, Ph.D.
University of Kentucky College of Medicine, Lisa A. Cassis,
Ph.D.
University of Louisvil/e School of Medicine, Peter P. Rowell,
Ph.D.
University of Maryland School of Medicine, Margaret M.
McCarthy, Ph.D.
University of Massachusetts Medica/ Schoo/, Roy Guharoy,
Pharm.D., M.B.A., FCP, FCC, FASHP
University of Miami Miller School of Medicine, ]oshua D. Len-
chus, D.0., R.Ph., FACP
University of Michigan Medica/ School, Paul F. Hollenberg,
Ph.D.
University of Mississippi School of Medicine, Deborah S. Minor,
Pharm.D., FAHA
University of Missouri-Kansas City School of Medicine, james
M. Wooten, Pharm.D.
University of Nebraska College of Medicine, L. Charles Murrin,
Ph.D.
University of Nevada School of Medicine, lain L. Buxton,
Pharm.D.
University of New Mexico Health Sciences Center School of
Medicine, Arti Prasad, M.D.
University of North Dakota School of Medicine and Hea/th
Sciences, James E. Porter, Ph.D.
University of Oklahoma College of Medicine, Pramod K.
Chetty, M.D.
University of Pennsylvania School of Medicine, Patrick J.
Brennan, M.D.
University of Pittsburgh School of Medicine, Dennis P.
Swanson, M.S.
USP 39
University of Puerto Rico School of Medicine, Miguel A.
Marrero, M.D.
University of South Alabama College of Medicine, ]ack A. Di-
Palma, B.S., M.D.
University of South Carolina School of Medicine, Kenneth B.
Walsh, Ph.D.
University of South Florida Morsani College of Medicine, Shu-
feng Zhou, M.D., Ph.D.
W. Sweatman, Ph.D.
University of Texas Medica/ School at Houston, Gary C.
Rosenfeld, Ph.D.
University of Utah Schoo/ of Medicine, Richard J. Sperry, M.D.,
Ph.D.
University of Virginia School of Medicine, Robert J. Meyer,
M.D.
University of Washington School of Medicine, Suzanne M. Al-
len, M.D., M.P.H.
University of Wisconsin School of Medicine and Public Health,
F. Michael Hoffmann, Ph.D.
Vanderbilt University School of Medicine, C. Michael Stein,
M.D.
Virginia Commonwealth University School of Medicine,
Dominic A. Sica, M.D.
Wake Forest University School of Medicine, Kathy P. Bricker,
Pharm.D., BCPS
Washington University School of Medicine in St. Louis, Evan D.
Kharasch, M.D., Ph.D.
Wayne State University School of Medicine, Stephen A. Lerner,
M.D.
Wright State University Boonshoft School of Medicine, Khalid
M. Elased, Ph.D., R.Ph.
Ya/e University School of Medicine, Seth Powsner, M.D.
Instituciones Acadmicas y
Asociaciones Vinculadas-
Universidades y Facultades de
Farmacia
Auburn University Harrison School of Pharmacy, William R. Ra-
vis, Ph.D.
Butler University College of Pharmacy and Health Sciences, Su-
dip K. Das, Ph.D.
Campbell University Schoo/ of Pharmacy, Antoine Al-Achi,
M.S.Pharm., Ph.D., M.S.
Chicago State University College of Pharmacy, Duc P. Do,
Ph.D.
Creighton University School of Pharmacy and Health
Professions, J. Christopher Bradberry, Pharm.D.
Drake University College of Pharmacy and Health Sciences,
Abebe E. Mengesha, Ph.D.
Duquesne University Mylan School of Pharmacy, Ira S. Buck-
ner, Ph.D.
Ernest Mario School of Pharmacy at Rutgers University, Long-
qin Hu, Ph.D.
Ferris State University College of Pharmacy, Kim E. Hancock,
Ph.D.
Florida A & M University College of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, Mandip Sachdeva, Ph.D.
Hampton University School of Pharmacy, Chengan Du, Ph.D.,
M.P.H.
Howard University College of Pharmacy, Nursing and Allied
Hea/th Sciences, Emmanuel O. Akala, Ph.D.
ldaho State University College of Pharmacy, Kevin W.
Cleveland, Pharm.D.
Lake Erie Col/ege of Osteopathic Medicine School of Pharmacy,
Sachin S. Devi, B.Pharm., Ph.D.
Loma Linda University School of Pharmacy, W. William
Hughes, Ph.D.
Long /s/and University Arnold and Marie Schwartz Col/ege of
Pharmacy and Health Sciences, David R. Taft, B.S.Pharm.,
Ph.D.
USP 39
Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences-
Boston, David A. Williams, Ph.D.
Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences School
of Pharmacy-Worcester, Robert Campbell, Ph.D., M.S.
Mercer University College of Pharmacy and Health Sciences, J.
Grady Strom, Ph.D.
Midwestern University Chicago College of Pharmacy, Anna Ka-
bakov, Pharm.D.
Midwestern University College of Pharmacy-Glendale, Bill J.
Bowman, Ph.D., R.Ph.
North Dakota State University College of Pharmacy, Nursing
and Allied Sciences, Jagdish Singh, Ph.D.
Northeastern University Bouve College of Health Sciences
School of Pharmacy, Mansoor M. Amiji, Ph.D.
NOVA Southeastern University College of Pharmacy, Hamid H.
Omidian, Ph.D., M.Sc., B.Sc.
Ohio Northern University Raabe College of Pharmacy, Jenelle
L. Sobotka, Pharm.D.
Oregon State University College of Pharmacy, J. Mark
Christensen, Ph.D.
Pacific University College of Health Professions School of
Pharmacy, Susan M. Stein, R.Ph., M.S.
Palm Beach Atlantic University Gregory School of Pharmacy,
Adwoa O. Nornoo, B.Pharm., M.S., Ph.D.
Purdue University School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Stephen R. Byrn, Ph.D.
Roseman University of Health Sciences College of Pharmacy,
Mark C. Decerbo, Pharm.D., BCPS, BCNSP
Samford University McWhorter School of Pharmacy, John J.
Arnold, Ph.D., B.S.
Shenandoah University Bemard f. Dunn School of Pharmacy,
Nina Hengen, M.D., Ph.D.
South Carolina College of Pharmacy, James J. Sterrett, Pharm.
D., BCPS
South Dakota State University College of Pharmacy, David L.
Helgeland, B.S.Pharm., M.B.A., Ed.D.
South University School of Pharmacy, S. Craig Dyar, Ph.D.
Southern //Jinois University Edwardsville School of Pharmacy,
William M. Kolling, Ph.D.
Southwestem Oklahoma State University School of Pharmacy,
Shelly Stockton, Ph.D.
St. john's University College of Pharmacy and Allied Health
Professions, Abu Serajuddin, Ph.D.
St. Louis College of Pharmacy, John Pieper, Pharm.D.
SUNY at Buffalo Schoo/ of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Alfred T. Reiman, R.Ph.
Temple University School of Pharmacy, Michael Borenstein,
Ph.D.
Texas Southern University College of Pharmacy and Health
Sciences, Dong Liang, Ph.D.
Texas Tech University Health Sciences Center Schoo/ of
Pharmacy, Arthur A. Nelson, Ph.D., R.Ph.
The Ohio State University Col/ege of Pharmacy, Robert W.
Brueggemeier, Ph.D.
The University of Arizona College of Pharmacy, Michael Ma-
yersohn, Ph.D.
The University of lowa College of Pharmacy, Mickey L. Wells,
Ph.D.
The University of Louisiana at Monroe College of Pharmacy,
Sami M. Nazzal, Ph.D.
The University of North Carolina at Chapel Hill Eshelman
School of Pharmacy, Dennis M. Williams, Pharm.D.
The University of Texas at Austin College of Pharmacy, Janet C.
Walkow, Ph.D.
The University of Toledo College of Pharmacy, Kenneth S.
Alexander, R.Ph., Ph.D.
Tauro University California College of Pharmacy, Alison
McCormick, Ph.D.
University of Arkansas far Medica/ Sciences College of
Pharmacy, Mark Estes, Pharm.D.
University of California San Diego Skaggs School of Pharmacy
and Pharmaceutical Sciences, Grace M. Kuo, Pharm.D.,
Ph.D., M.P.H.
Integrantes / Miembros xxv
University of California San Francisco School of Pharmacy,
Leslie Z. Benet, Ph.D.
University of Cincinnati james L. Winkle College of Pharmacy,
Pankaj B. Desai, Ph.D.
University of Colorado Skaggs School of Pharmacy, Peter J.
Rice, Pharm.D., Ph.D.
University of Connecticut School of Pharmacy, Peter J. Tycz-
kowski, R.Ph., M.B.A.
University of Florida College of Pharmacy, Rhonda Cooper-De-
Hoff, Pharm.D., M.S., FAHA
University of Georgia College of Pharmacy, Gurvinder Singh
Rekhi, Ph.D., M.S.
University of Houston College of Pharmacy, F. Lamar Pritchard,
Ph.D.
University of 11/inois at Chicago Col/ege of Pharmacy, Stepha-
nie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.
University of Kansas School of Pharmacy, Christian Schoneich,
Ph.D.
University of Kentucky College of Pharmacy, Eric J. Munson,
Ph.D.
University of Maryland School of Pharmacy, Natalie D.
Eddington, Ph.D.
University of Michigan College of Pharmacy, Gregory E. Ami-
don, B.S., Ph.D.
University of Minnesota College of Pharmacy, Marilyn K. Spee-
die, Ph.D.
University of Mississippi School of Pharmacy, Michael A.
Repka, D.D.S., Ph.D.
University of Missouri-Kansas City School of Pharmacy, Cydney
E. McQueen, Pharm.D.
University of Nebraska Medica/ Center College of Pharmacy,
Michael F. Powell, B.S. Pharm, M.S.
University of New Mexico College of Pharmacy, Lynda S. We-
lage, B.S., Pharm.D.
University of Oklahoma College of Pharmacy, Vibhudutta
Awasthi, Ph.D., M.Pharm.
University of Pittsburgh School of Pharmacy, Michael A. Ze-
maitis, Ph.D.
University of Rhode lsland College of Pharmacy, David R.
Worthen, Ph.D., J.D.
University of Sao Paulo College of Pharmacy, Prof. Terezinha
de Jesus Andreoli Pinto
University of Southern California School of Pharmacy, Stan G.
Louie, Pharm.D.
University of Tennessee Health Science Center College of
Pharmacy, Laura A. Thoma, Pharm.D., B.S.
University of the Pacific Thomas j. Long School of Pharmacy
and Health Sciences, Xiaoling Li, Ph.D.
University of the Sciences in PhiTadelphia, Philadelphia College
of Pharmacy, Daniel A. Hussar, Ph.D.
University of Utah College of Pharmacy, John W. Mauger,
Ph.D.
University of Washington School of Pharmacy, Thomas K. Haz-
let, Pharm.D., Dr.P.H.
University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy, James E.
DeMuth, Ph.D., R.Ph.
University of Wyoming School of Pharmacy, Kurt Dolence,
Ph.D.
Virginia Commonwealth University/Medical College of Virginia
School of Pharmacy, Phillip M. Gerk, Pharm.D., Ph.D.
Washington State University College of Pharmacy, Danial E.
Baker, Pharm.D., FASHP, FASCP
Wayne State University Eugene Applebaum College of
Pharmacy and Health Sciences, Sheila M. Wilhelm,
Pharm.D.
West Virginia University School of Pharmacy, Arthur l. Jackno-
witz, Pharm.D.
Western University of Health Sciences College of Pharmacy, Su-
nil Prabhu, Pharm.D., R.Ph.
Wilkes University Nesbitt School of Pharmacy, Harvey A.
Jacobs, Ph.D.
Xavier University of Louisiana College of Pharmacy, Tarun K.
Manda!, Ph.D.
xxvi Miembros / Integrantes
Instituciones Acadmicas y
Asociaciones Vinculadas-
Universidades y Facultades de
Medicina Osteoptica
NOVA Southeastem University College of Osteopathic Medicine
Nicole Cook, Ph.D., M.P.H. '
Organizaciones de Consumidores
y Otras Organizaciones que
Representan el Inters Pblico
AARP, Leigh Purvis
Alzheimer's Association, William Thies, Ph.D.
American Autoimmune Related Diseases Association, Virginia T.
Ladd, R.T.
Amer(can Cancer Society, Mark Clanton, M.D., M.P.H.
Amer~can Diabetes Association, jane L. Chiang, M.D.
American Hea/th Quality Association, Kenneth Mishler, R.Ph.,
Pharm.D.
American Heart Association, Robert Lee Page 11, Pharm.D.,
M.S.P.H., FCCP, FAHA, FASHP FASCP BCPS CGP
Arthritis Foundation, john H. Klippel, M.. ' Min1stry of Health of the Republic of Belarus, Liudmila Reuts-
Center for Science in the Public lnterest David G. Schardt
M.S. I '
Consumers Union, Lisa L. Gill, B.A.
ECRI lnstitute, jeffrey C. Lerner, Ph.D.
Jnstitute for Safe Medication Practices, Michael R. Cohen, R.
Ph., M.S., Sc.D., FASHP
Nat(onal Consur:iwrs Lea9ue, Rebecca Burkholder, ).D.
Nat1onal Counol on Pat1ent lnformation and Education
William R. Bullman, M.A.M. ' Russell, B.S.Pharm.
National Organization for Rore Disorders, Diane E. Dorman
Nqt!onal Os~eoporosis Foundation, Amy Porter
W1//1am }. Clinton Foundation, Rodger W. Stringham, Ph.D.
Organismos, Divisiones y
Asociaciones Gubernamentales
Vinculados
Agency for Healthcare Research and Qualitv Scott R. Smith
Ph.D. ,, I National lnstitute of Metrology, Quality and Technology, Valnei
Argen.tin.e Pharmacopoeia, Hctor A. Giuliani, Pharm.D.
Asso~1.at1on of Food and Drug Officials, Cynthia T. Culmo
Braz1/1an Pharmacopoeia Commission, Mnica da Luz Car-
valho Soares
Brazil's National lnstitute of Quality Control in Health Filipe
Soares Quirino Silva, Ph.D. ' M.S., FASHP
British Pharmr;icopoeia Commission, james Pound
Centers for D1sease Control and Prevention, Cindy P.
Dougherty, Pharm.D.
Centers for Medicare & Medicaid Services Jeffrey A. Kelman
M.D. I I
China National Center for Food Safety Risk Assessment, junshi
Chen, M.D.
Chinese Pharmacopoeia Commission, Zhang Wei
Department of Veterans Affairs Veterans Health Administration
Timothy ). Stroup, R.Ph.
European Directorate for the Quality of Medicines and
HealthCare, Susanne Keitel
FDA Center for Biologics Evaluation and Research, john G.
Bishop 111
FDA Center for Devices and Radiological Health, Marilyn M.
Lightfoote, M.D., Ph.D.
FDA Center for Drug Evaluation and Research, Pallavi Nithya-
nandan, Ph.D.
FDA Center for Food Safety and Applied Nutrition, Daniel E.
Folmer, Ph.D.
USP 39
FDA Center for Veterinary Medicine, janis R. Messenheimer,
D.V.M.
Federal Commission for Protection Against Sanitary Risks, Rocio
del Carmen Alatorre Eden-Wynter, M.C.
Federal Service on Surveillance in Healthcare of Russian Federa-
tion, Valentina F. Kosenko, Ph.D., Pharm.
Food and f!~ugs Authority, Ghana, Eri.c .Karikari-Boateng, M.S.
Food, Medicine and Hea/th Care Admin1stration and Control
Authority of Ethiopia, Yehulu Denekew Alamneh, B.Sc.,
M.A.
Genera! Directorate of Medicines, Suppfies and Drugs, Laura
Ceron, Q.F.
Health Canada, Karen Reynolds
Health Canada, Food Directorate, Barbara Lee
Health Canada, Natural and Non-prescription Health Products
Directorate, Bruce Randall
lndian Pharmacopoeia Commission, G.N. Singh, Ph.D.,
M.Pharm.
lndonesi~n Pharmacopo~ia_ Commission, Augustine Zaini, M.S.
lntemat1onal Trade Admin1stration-U.S. Department of Com-
merce, james D. Rice, B.A., M.A.
}apan's Ministry of Health Labour and Welfare,
Pharmaceuticals and Medica/ Devices Agency, Nobuo
Uemura
jo~dr;in Food and Drug Administration, Dr. Lubna R. Qusous
M~m.stry of Food and Drug Safety, Dr. jin-Ho Wang
kaya, Pharm.D.
Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan, Mirzohidjon
Kodirov, Ph.D.
Morocco's Directorate of Medicines and Pharmacy, Laila
Hakkou
National Agency for Food and Drug Administration and Con-
t1yt, Dr. Mo.ni~a H. Eimunjeze
Nat1onal Assoc1at1on of Boards of Pharmacy, Elizabeth Scott
National Center for Quality Control, Ofelia del Rosario Villalva
Rojas, Q.F.
National Centre for Expertise of Drugs, Medica/ Products and
Medica/ Equipment, Ardak U. Tufegenova, Ph.D.
National Drug Authority of Uganda, Gordon Katende
Sematiko
National Health Surveillance Agency, Lais Santana Dantas B.S.
National lnstitute for Biologica/ Standards and Control Adrian
F. Bristow, Ph.D. '
National lnstitute of Drug and Food Surveillance, Eduardo Ver-
gel Bayona
Smarc;aro da Cunha, Ph.D.
National lnstitute of Standards and Technology, Michael J. Tar-
lov, Ph.D.
Nat(onal lnst(tutes for Food and Drug Control, Bo Li, Ph.D.
Nat1onal lnst1tutes of Health, Robert DeChristoforo, R.Ph.,
Perman~nt Commission _of the Pharmacopoeia of the United
Mex1can States, Mana del Carmen Becerril-Martinez
Pharmacopoeia of Chinese Taipei, jaw-jou Kang, Ph.D.
Pharmacy Council of India, Bhojraj Suresh, M.Pharm., Ph.D.,
D.Sc.
Philippine Pharmacopeia, Maria Lourdes C. Santiago,
B.S.Pharm., M.S.Pharm.
Saud Food and Drug Authority, Abdullah S. Alhomoud, M.S.
State Administration of Ukraine on Medicinal Products Andrii
' V. Shovkovyi '
Tan;ania Food and Drugs Authority, Yonah H. Mwalwisi
Thm Pharmacopoeia Committee, Kornvika Charupant, Ph.D.
The Pharmacy Board of Sierra Leone, Wiltshire C.N. johnson,
B.Pharm. (Hons) USL., M.Sc (Brad UK), MPSSL,
FPCPharm
Therapeutic Goods Administration of Australia, Vivienne Christ,
B.App.Sc., MASM
Ukrainian Scientific Pharmacopoeial Center for Quality of Medi-
cines, Oleksandr l. Gryzodub, Ph.D.
United Stqtes Agency for lntemational Development, Anthony
F. Boni
USP 39
United States Air Force-Office of the Surgeon General, Deborah
Myers, R.Ph., M.B.A.
United States Department of Health and Human Services,
Donald Wright, M.D., M.P.H.
United States Food and Drug Administration-Offce of the
Commissioner, Jingyee Kou, Ph.D.
United States Navy Bureau of Medicine and Surgery-Office of
the Surgeon General, Thinh V. Ha, Pharm.D., M.B.A., M.S.
United States Pub/ic Health Service-Office of the Surgeon Gene-
ral, Christina H. Lee, Pharm.D.
Vietnamese Pharmacopoeia Commission, Luc Thi Thu Hang,
Ph.D.
Otras Asociaciones Profesionales
y Cientficas de Profesionales de
la Salud
AACC lnternational, Amy Hope
Academy of Managed Care Pharmacy, Edith A. Rosato, R.Ph.,
IOM
Academy of Nutrition and Dietetics, Kathryn M. Camp, M.S.,
RD, CSP, LN
American Academy of Allergy, Asthma and lmmunology,
Michael R. Nelson, M.D., Ph.D.
American Academy of Neurology, jack J. Chen, Pharm.D.,
FASCP, FCCP
American Academy of Nurse Practitioners, jan Towers, Ph.D.,
NP-C
American Academy of Ophthalmology, Wiley A. Chambers,
M.D.
American Academy of Pediatrics, Hank Farrar, M.D.
American Academy of Physician Assistants, Marie-Michele
Leger, M.P.H., PA-C
American Academy of Veterinary Pharmacology and
Therapeutics, Carol A. Davis, Ph.D.
American Association of Pharmaceutical Scientists, Christopher
McCurdy, Ph.D., R.Ph.
American Botanical Council, Mark Blumenthal
American Chemica/ Society, Denise L. Creech
American College of Clinical Pharmacology, Stephen N. Keith,
M.D., M.S.P.H.
American College of Clinical Pharmacy, C. Edwin Webb,
Pharm.D., M.P.H.
American College of Physicians, Brian L. Strom, M.D.
American Dental Association, Eugenio D. Beltrn-Aguilar, D.
M.D., M.P.H., M.S., Dr.P.H.
American Dental Education Association, Vahn A. Lewis,
Pharm.D., Ph.D.
American Geriatrics Society, Todd P. Semla, M.S., Pharm.D.,
BCPS, FCCP, AGSF
American Medica/ Association, Barry D. Dickinson, Ph.D.
American Nurses Association, Rita Munley Gallagher, Ph.D.,
R.N.
American Optometric Association, Jimmy D. Bartlett, O.D.
American Pharmacists Association, Thomas E. Menighan,
R.Ph., M.B.A., FAPhA
American Public Health Association, Deborah K. Walker, Ed.D.
American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics,
Patricia W. Slattum, Pharm.D., Ph.D.
American Society for Microbiology, Amy L. Leber, Ph.D.
American Society for Nutrition, Robert M. Russell, M.D.
American Society for Parenteral and Entera/ Nutrition, Gordon
S. Sacks, Pharm.D., BCNSP, FCCP
American Society for Pharmacology and Experimenta/
Therapeutics, Jan M. Kitzen, Ph.D.
American Society for Quality, Donald C. Singer, M.S.
American Society of Anesthesiologists, H.A. Tillmann Hein,
M.D., Ph.D.
American Society of Consultant Pharmacists, Arnold E. Clay-
man, Ph.D., FASHP
American Society of Health-System Pharmacists, Paul W. Abra-
mowitz, Pharm.D., FASHP
Integrantes / Miembros xxvii
American Veterinary Medica/ Association, Donald C. Sawyer,
D.V.M., Ph.D.
Argentine Association of Industrial Pharmacy and Biochemistry,
Federico Montes de Oca, M.B.A.
Brazilian National Association of Compounding Pharmacists,
Maria do Carmo Garcez
Calibration and Validation Group, Herman Lam, Ph.D.
Canadian Pharmacists Association, Perry Eisenschmid, M.B.A.
Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Neal M. Davies,
B.Sc. Pharm., Ph.D., R.Ph.
Drug lnformation Association, Susan A. Cantrell, B.S.Pharm.,
R.Ph., CAE
European Federation for Pharmaceutical Sciences, Hendrik J. de
Jong, Ph.D.
lnfusion Nurses Society, Mary C. Alexander, C.R.N.I., M.A.,
R.N., CAE, FAAN
lnstitute of Food Technologists, William Fisher, M.S.
lnternational Academy of Compounding Pharmacists, Matthew
Kopacki, B.S.Pharm.
lnternational Council of Nurses, David C. Benton, RGN, RMN,
BSC, MPhil, FFNF, FRCN
lnternational Society for Cellular Therapy, Joseph C. Laning,
Ph.D.
lnternational Society for Pharmaceutical Engineering, Stephen
M. Tyler, M.S.
National Alliance of State Pharmacy Associations, Rebecca P.
Snead, R.Ph., B.S.Pharm.
National Community Pharmacists Association, Carolyn C. Ha,
Pharm.D.
National Pharmaceutical Association, Barry A. Bleidt, Ph.D.,
Pharm.D.
National Pharmacy Technician Association, Michael J.
johnston, CPhT
New jersey Pharmaceutical Quality Control Association,
Barbara J. Ferguson, B.A.
Pan American Pharmaceutical Federation, Maria Elena
Girard-Cuesy
Parenteral Drug Association, /ne., Richard M. Johnson, M.Sc.
Regulatory Affairs Professionals Society, Sherry L. Keramidas,
Ph.D., CAE
Society of Critica/ Care Medicine, Timothy S. Yeh, M.D.,
FCCM
Society of Nuclear Medicine and Molecular lmaging, )effrey P.
Norenberg, Pharm.D.
Western Compendia/ Discussion Group, Assad J. Kazeminy,
Ph.D.
Asociaciones Profesionales y
Cientficas de Profesionales de la
Salud-Sociedades Mdicas
Estatales de los Estados Unidos de
Amrica
California Medica/ Association, Charles W. Maas, M.D.,
M.P.H.
Connecticut State Medica/ Society, Eric B. Einstein, M.D.
Hawaii Medica/ Association, Jone Geimer-Flanders, D.0.
Indiana State Medica/ Association, Daria Schooler, M.D., R.Ph.
towa Medica/ Society, Harold W. Miller, M.D.
Kansas Medica/ Society, Tracie Collins, M.D., M.P.H.
Maine Medica/ Association, Stevan Gressitt, M.D.
Massachusetts Medica/ Society, Bruce G. Karlin, M.D.
MedChi-Maryland State Medica/ Society, Peter H. Rheinstein,
M.D., ).D., M.S.
Medica/ Association of the State of Alabama, Allan R.
Goldstein, M.D.
Medica/ Society of New jersey, joseph N. Micale, M.D.
Medica/ Society of the District of Columbia, Kim A. Bullock,
M.D.
Medica/ Society of the State of New York, Richard S. Blum,
M.D.
xxviii Miembros / Integrantes
Minnesota Medica/ Association, Robert K. Meiches, M.O.,
M.B.A.
Missouri State Medica/ Association, Thomas L. Holloway
Montana Medica/ Association, Jean Branscum
New Mexico Medica/ Society, ]erry D. Mclaughlin, M.O.
North Dakota Medica/ Association, Robert (Rob) W. Beattie,
M.O.
Pennsylvania Medica/ Society, Ralph Schmeltz, M.O., FACP,
FACE
Puerto Rico Medica/ Association, Rolance G. Chavier-Roper,
M.O.
Rhode lsland Medica/ Society, Peter A. Hollmann, M.O.
South Dakota State Medica/ Association, E. Paul
Amundson, M.O.
Tennessee Medica/ Association, John J. lngram 111, M.O.
Texas Medica/ Association, Kevin H. McKinney, M.O., FACE,
FACP
Utah Medica/ Association, Michelle S. McOmber, B.S., M.B.A.
West Virginia State Medica/ Association, Kevin W. Yingling,
M.O., R.Ph., FACP
Wisconsin Medica/ Society, Thomas M. Derrig, M.O.
Asociaciones Profesionales y
Cientficas de Profesionales de la
Salud-Asociaciones
Farmacuticas Estatales de los
Estados Unidos de Amrica
Alabama Pharmacy Association, Valerie A. Oakley, Pharm.D.
Alaska Pharmacists Association, Amber L. Briggs, Pharm.D.
Arizona Pharmacy Association, Kelly Ridgeway
Arkansas Pharmacists Association, Kristen G. Riddle, Pharm.D.
California Pharmacists Association, ]on R. Roth, CAE
Colegio de Farmaceuticos de Puerto Rico, Milagros Morales,
R.Ph.
Colorado Pharmacists Society, Val Kalnins, R.Ph.
Connecticut Pharmacists Association, Peter J. Sposato, R.Ph.,
B.C.N.P.
Delaware Pharmacists Society, Kenneth (Kevin) Musto, R.Ph.
Florida Pharmacy Association, Michael A. Mon, J.D., R.Ph.,
FAPhA
Georgia Pharmacy Association, Larry L. Braden, B.S., R.Ph., D.
Se.
Hawaii Pharmacists Association, Ronald T. Taniguchi,
Pharm.D.
ldaho State Pharmacy Association, Pam Eaton
Jllinois Pharmacists Association, Norman A. Hoback,
B.S.Pharm.
Indiana Pharmacists Alliance, Daniel D. Degnan 111, Pharm.D.,
M.S.
lowa Pharmacy Association, Thomas R. Temple, R.Ph., M.S.
Kansas Pharmacists Association, Michael Larkin
Kentucky Pharmacists Association, Patricia R. Freeman, Ph.D.
Louisiana Pharmacists Association, Randall Brooks, B.S.
Maine Pharmacy Association, Laurier A. Lamie, R.Ph.
Maryland Pharmacists Association, Matthew G. Shimoda,
Pharm.D.
Massachusetts Pharmacists Association, Steven D. Geoffroy,
R.Ph.
Michigan Pharmacists Association, Eric D. Roath, Pharm.D.
Minnesota Pharmacists Association, Lowell ]. Anderson, O.Se.,
FAPhA, FFIP
Mississippi Pharmacists Association, Kimsey O'Neal, Pharm.D.
Missouri Pharmacy Association, Ron L. Fitzwater, CAE, M.B.A.
Montana Pharmacy Association, Lori Morin, M.B.A., Pharm.D.
Nebraska Pharmacists Association, Samuel C. Augustine,
Pharm.D., FAPhA
New Hampshire Pharmacists Association, Elizabeth A.
Robertson, R.Ph.
New jersey Pharmacists Association, Steve H. Zlotnick,
Pharm.D.
USP 39
New Mexico Pharmacists Association, William G. Troutman,
Pharm.D.
North Carolina Association of Pharmacists, Stephen F. Eckel,
Pharm.D., M.H.A.
North Dakota Pharmacists Association, Michael D. Schwab
Ohio Pharmacists Association, Amela S. Bennett, R.Ph.
Oklahoma Pharmacists Association, Wiley L. Williams, J.D.
Oregon State Pharmacy Association, joshua Free, Pharm.D.,
M.B.A.
Pennsylvania Pharmacists Association, George R. Haynes,
Pharm.D., Ph.D.
Pharmacists Society of the State of New York, Tracy R. Russell,
CAE
Pharmacy Society of Wisconsin, Susan M. Kleppin, R.Ph.,
FASHP
Rhode /stand Pharmacists Association, John Grossomanides,
Pharm.D.
South Carolina Pharmacy Association, Craig Burridge, M.S.,
CAE
South Dakota Pharmacists Association, Leonard J. Petrik,
Pharm.D.
Tennessee Pharmacists Association, Micah Cost, Pharm.D.,
M.S.
Texas Pharmacy Association, Eric H. Frankel, MSE, Pharm.D.
Utah Pharmacists Association, Adam W. ]ones
Virginia Pharmacists Association, Marianne R. Rollings, R.Ph.
Washington D.C. Pharmacy Association, Michael J. Kim,
Pharm.D.
Washington State Pharmacy Association, ]eff Rochon,
Pharm.D.
West Virginia Pharmacists Association, Patty ]ohnston, B.S.
Wyoming Pharmacy Association, William H. Rathburn, R.Ph.
Asociaciones de Fabricantes,
Comerciales y Afiliadas
American Chemistry Council, Michael P. Walls, Esq.
American Herbal Products Association, Maged H. Sharaf, Ph.D.
American Hospital Association, John R. Combes, M.O.
Animal Hea/th Jnstitute, Richard A. Carnevale, V.M.D.
Association of the European Self-Medication lndustry, Christelle
Anquez-Traxler
Biotechnology lndustry Organization, Earl S. Dye, Ph.D.
Bulk Drug Manufacturers Association, Airra Krishna Reddy,
B.Sc.
Compressed Gas Association, Michael B. Tiller, B.S., B.A.
Consumer Health Products Canada, Adam C. Kingsley, B.Sc.,
NP, CAE
Consumer Healthcare Products Association, john Punzi, Ph.D.
Council for Responsible Nutrition, James C. Griffiths, Ph.D.
Egyptian Chamber of Pharmaceutical lndustry, Abdulla Molok-
hia, Ph.D.
European Generic Medicines Association, Julie Marechal-Jamal,
M.S.
Flavor and Extract Manufacturers Association, John H. Cox,
J.D.
Food Marketing Jnstitute, Catherine M. Polley, R.Ph.
Generic Animal Drug Alliance, Stephanie Batliner
Generic Pharmaceutical Association, David R. Gaugh, R.Ph.
Grocery Manufacturers Association, Shannon M. Cooksey,
M.S., PMP
Healthcare Distribution Management Association, Karen J.
Ribler
lndian Drug Manufacturers' Association, Daara B. Patel,
B.Com., D.l.M.M.
lnternational Dairy Foods Association, ]ohn T. Allan 111, B.S.,
M.S.
lnternational Federation of Pharmaceutical Manufacturers and
Associations, Caroline Mendy
lnternational Food Additives Council, Robert Rankin
lnternational Generic Pharmaceutical Alliance, Nicholas
Cappuccino, Ph.D.
USP 39 Integrantes / Miembros xxix

fnternational Pharmaceutical Excipients Council of the

Americas, Priscilla Zawislak . Organismos No Gubernamentales
Mexico's National Chamber of the Pharmaceut1cal lndustry, para el Establecimiento de
J. Rivelino Flores, M.Sc.
National Association of Chain Drug Stores, Alex J. Adams, Normas y Determinacin de
Pharm.D.
Personal Care Products Council, Beth Anne Lange, Ph.D., B.S.
Conformidad
Pharmaceuticaf Care Management Association, Greg S.
Accreditation Council far Pharmacy Education, Dimitra V. Trav-
Johnson, B.A. .
Pharmaceuticaf Research and Manufacturers of Amenca, J. los, Pharm.D., BCPS . . .
American Type Culture Collect1on, El1zabeth J. Kerngan, B.A.
Mark Wiggins, B.S., M.S. . .
Sao Paulo State Pharmaceutical Manufacturers Assooat1on, AOAC Jnternational, E. james Bradford, ph.D. .
Nelson dos Santos, jr. Association far the Advancement of Medica/ lnstrumentat1on,
The joint Commission, jeannell M. Mansur, B.S. Pharm., joseph Carl Lewe.lling, B.A.,. M.A. .
Chilean Pharmacope1a Foundat1on1 Carohne R.
Pharm.D. /
The jordanian Association of Manufacturers of Pharmaceut1ca s Weinstein-Oppenheimer, Ph.D. .
& Medica/ Appliances, Hanan J. Sboul, M.B.A., CAE Clinical and Laboratory Standards lnst1tute, Luann Ochs, M.S.
URAC, Kylanne Green, R.N., N.P.
xxx Donantes / Integrantes USP 39

Reconocimiento para los

Donantes de Materiales de
Referencia y de
Monografas en 2014
La USP reconoce y agradece el apoyo de las empresas que Eli Lilly and Company
han participado en el establecimiento de las normas USP Emcure Pharmaceuticals Ltd.
mediante el aporte de informacin para el desarrollo de Erfa Canada 2012 lnc.
nuevas monografas o la donacin de candidatos a materia- Erregierre S.P.A
les de referencia. La siguiente lista incluye a las empresas Euromed
que aportaron monografas propuestas en 2014 o que do- Evonik Rexim (Nanning) Pharmaceutical Co. Ltd
naron candidatos a materiales de referencia establecidos Excella GMBH
como Estndares de Referencia USP durante 2014. Exova, lnc
Abbvie lnc. Fermion
ACell, lnc. Ferrer Health Tech
ACS Dobfar Fresenius Kabi Oncology Limited
Actavis ple. Garuda lnternational, lnc.
Ajinomoto North America, lnc. Gattefosse SA
Almirall S.A. GE Healthcare lnc.
Amano Enzyme USA Co., Ltd. Gedeon Richter USA
Apicore LLC GlaxoSmithKline
Apotex, lnc. Glenmark Pharma Ltd.
Arcadia Biosciences, lnc. Gnosis S.p.A.
Archer Daniels Midland Company - ADM Golden-Shell Biochemical Co., Ltd.
Arevipharma GmbH Helsinn Chemicals SA
Arista Industries lnc. Henan Dongtai Pharm. Co., Ltd.
Astellas Pharma lncorporated Hoffman-Laroche lnc.
AstraZeneca lnc. Hope Pharmaceuticals
Aurobindo Pharma Ltd. Hospira, lnc. - North America
BASF Corporation Hovione Farmaciencia SA
Baxter Healthcare Corporation Hunan Normal University
Bayer Pharma AG Huntsman Advanced Materials
BCN Peptides SA lmpax Laboratories lnc.
Beneo Group lndena SPA
Bioriginal Food & Science Corp lnterchem Corp.
Boehringer lngelheim Pharma GMBH & Co. KG lpca Laboratories Ltd.
Bristol-Myers Squibb janssen Pharmaceutical
C.E. Roeper GmbH jinan jinda Pharmaceutical Chemistry Co., Ltd.
Cadila Healthcare Limited JMC Corporation
Camag johnson & johnson - USA
Cambrex Corporation jost Chemical Company
Canadian Phytopharmaceuticals Corp. jubilant Generics Ltd.
China Medical Association of Minorities Kemin Human Nutrition and Health
Cipla Ltd. Kobayashi Perfumery Co., Ltd.
Claris Lifesciences Ltd. Lake Chemical Pvt. Ltd.
Cognis Deutschland GmbH & Co. Lite Technologies, Ltd.
Colorcon, lnc. Lonza AG
Cosma S.P.A. Lundbeck Pharmaceutical
Covidien Lupin Pharma
Croda lnc. Lusochimica SPA
CU Chemie Uetikon GMBH Mallinckrodt Pharmaceuticals
Cyanotech Mangalam Drugs & Organics Ltd.
Danisco A/S Mantrose-Haeuser Co. lnc.
Dishman Group McDermott, Will & Emery
Divis Laboratories Ltd. McNeil Consumer Healthcare - A Division of johnson &
Dow Chemical Co. johnson lnc.
Dr. Reddy's Laboratories Limited Medichem
DSM Nutritional Products, lnc. Merck and Co., lnc.
DSM Sinochem Pharmaceuticals Merial
Eisai Food and Chemical Co., Ltd. MSN Laboratories, Ltd.
USP 39 Integrantes / Donantes xxxi

Mylan Laboratories Limited Sigma-Aldrich

Natural Remedies Solvay Pharmaceuticals
NIBSC SST Corporation
Novartis Pharma AG Sterling S.N.1.F.F. Italia SpA
Nutrasweet Strides Arcolab Limited
Palsgaard, lnc. Sun Pharmaceutical Industries Ltd.
Par Pharmaceutical Companies, lnc. Suven Lite Sciences Ltd.
PennConsult Symrise, lnc
Pfizer Synkem
Pharmavite LLC Teva Pharmaceuticals Industries Ltd. - Israel
Plantex USA lnc. The Chao Center
Polymed Therapeutics, lnc. ThermoFisher Scientific
Procos SpA Thomas Swan & Co., Ltd.
PuraPharm lnternational (H.K.) Ltd. Torrent Pharmaceuticals Ltd.
Reckitt Benckiser Group Trifarma SPA
Recordati SPA UCB, lnc. North America
Sandoz lnc. Unichem Laboratories Ltd.
Sangrose Laboratories Pvt. Ltd. University of Macau
Sanofi Aventis Deutchland GmbH Upsher-Smith Laboratories, lnc.
Sasol North America lnc. Uquifa Italia S.P.A.
Schwabe North America Verdure Sciences
Scino Pharm Taiwan, Ltd. Wockhardt Ltd.
Sequent Scientific Limited Wuhan Wuyao Pharmaceutical Co., Ltd.
Shaanxi Jia He Phytochem Co., Ltd Zhejiang Apeloa Jiayuan Pharmaceutical Co., Ltd.
Shanghai lnstitute of Materia Medica (SIMM) Zhe1iang Hangzhou Xinfu Pharmaceutical Co., Ltd.
Sicor Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd.
Sifavitor SPA Zhe1iang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd.
xxxii Acta Constitutiva USP 39

Acta Constitutiva
En mayo de 1900 la Convencin le orden a la junta
Directiva que constituyera la asociacin de la USP conforme
a la legislacin del Distrito de Columbia (Estados Unidos de
Amrica). La creacin de la asociacin se vio retrasada de-
bido a que la legislacin del Distrito de Columbia exiga que
la mayora de los funcionarios firmantes del Certificado de
Constitucin fueran residentes del Distrito, por lo que fue
necesario designar representantes que cumplieran con tal
requisito. No obstante, se procedi a elaborar el Acta Cons-
titutiva, que se firm e inscribi definitivamente el 11 de
julio de ese mismo ao. A continuacin figura el texto del
certificado original:

Certificado de Constitucin

Por el presente, los suscriptos, ciudadanos de los Estados Unidos, mayores de edad y en su mayora ciudadanos del
Distrito de Columbia, constituyen una asociacin que se denominar Convencin de la Farmacopea de los Estados Unidos de
Amrica (The United States Pharmacopeial Convention), segn lo dispuesto en los artculos 545 a 552 inclusive, de las Leyes
Revisadas de los Estados Unidos para el Distrito de Columbia y su enmienda aprobada por Ley del Congreso, aprobada el da
23 de abril de 1884.
Esta Asociacin se constituye por un plazo de novecientos noventa y nueve aos. Su objeto es promover y fomentar la
ciencia y el arte de la medicina y la farmacia mediante la realizacin de investigaciones, experimentos y otros procedimientos
adecuados destinados a seleccionar y denominar materiales que puedan utilizarse apropiadamente como medicamentos y
frmacos, incluyendo frmulas para su preparacin; establecer normas y directivas uniformes para quienes practican la
medicina y la farmacia en los Estados Unidos, que les permitan determinar con exactitud la identidad, el contenido y la
pureza de tales medicamentos y frmacos, y otros propsitos afines y similares; e imprimir y distribuir en general, a intervalos
adecuados, las mencionadas frmulas y los resultados de dichas selecciones, denominaciones y determinaciones de ndole
similar, entre los miembros de esta Asociacin, farmacuticos y mdicos generalmente de los Estados Unidos, as como entre
quienes tengan inters en la farmacia y en la medicina.
La administracin y control de los asuntos, fondos y bienes de la Asociacin durante su primer ao de existencia estarn
a cargo de una junta Directiva, integrada por los siete miembros siguientes:

ALBERT E. EBERT GEORGE W. SLOAN

SAMUEL A.D. SHEPPARD HORATIO C. WOOD
WILLIAM S. THOMPSON CHARLES RICE
CHARLES E. OHME

En fe de lo cual firmamos y sellamos el presente documento este sptimo da del mes de julio del ao 1900.
WILLIAM S. THOMPSON (SELLO] WILLIAM M. MEW (SELLO]
G. LLOYD MAGRUDER (SELLO] FRANK M. CRISWELL [SELLO]
]OHN T. WINTER (SELLO] MURRAY G. MOTIER [SELLO]
THOMAS C. SMITH (SELLO]
USP 39 Gobierno de la USP xxxiii

Gobierno de la USP

Estatutos

Los Estatutos de USP para el perodo 2015-2020 estn disponibles en el sitio electrnico http://www.usp.org/about-usp/
leadershp/bylaws.

Normas y Procedimientos

Las Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos para el perodo 2015-2020 estn disponibles en el sitio electr-
nico http://www. usp. org/about-usp/leadership/polcies-rules/rules-procedures-council-experts.

Polticas de la USP

Las polticas de la USP estn disponibles en el sitio electrnico http://www.usp.org/about-usp/leadershp/polcies-rules.

 FARMACOPEA DE LOS
USP 39 ESTADOS
, UNIDOS DE
AME RICA

Oficial desde el 7 de mayo de 20 76

TRIGSIMA NOVENA REVISIN

 2016 The United States Pharmacopeial Convention
12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852
Todos Jos derechos reservados.
USP 39 Incorporaciones xxxvii

Incorporaciones

Artculos Incorporados a USP 39 mediante

Suplementos

Primer Suplemento (1 de agosto de 2015)

CAPTULOS GENERALES

(202) Identificacin de Aceites Fijos por Cromatografa en
Capa Delgada
(203) Procedimiento de Cromatografa en Capa Delgada de
Alta Resolucin para Identificacin de Artculos de Origen
Botnico
(1 064) Identificacin de Artculos de Origen Botnico
por Cromatografa en Capa Delgada de Alta
Resolucin
(1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseo y Validacin
de Ensayos para Detectar Anticuerpos Neutralizantes
Antifrmacos
(1229 .11) Esterilizacin en Fase de Vapor
(1663) Evaluacin de Sustancias Extrables Relacionadas con
Envases Farmacuticos y Sistemas de Administracin
(1664) Evaluacin de Sustancias Lixiviables en Medicamentos
Relacionadas con Envases Farmacuticos y Sistemas
de Administracin
(1664.1) Medicamentos Nasales y para Inhalacin Oral

SUPLEMENTOS DIETTICOS

Aceite de Semilla de Borraja, Cpsulas Extracto de Menaquinona-7 de Bacillus subtilis ssp. subtilis
Aceite de Semilla de Lino, Cpsulas Metilcobalamina
Menaquinona-7 Raz y Rizoma de Notoginseng
Menaquinona-7, Cpsulas Raz y Rizoma de Notoginseng en Polvo
Menaquinona-7, Preparacin Extracto Seco de Raz y Rizoma de Notoginseng
Menaquinona-7, Tabletas

MONOGRAFAS DE USP

Malato de Almotriptn Levetiracetam, Inyeccin

Almotriptn, Tabletas Diclorhidrato de Levocetirizina
Amlodipino, Valsartn e Hidroclorotiazida, Tabletas Metaxalona
Anastrozol, Tabletas Metaxalona, Tabletas
Buprenorfina, Solucin Bucal, Preparacin Magistral Clorhidrato de Minociclina, Tabletas de Liberacin
Veterinaria Prolongada
Diclofenaco Sdico y Misoprostol, Tabletas de Liberacin Norelgestromina
Retardada Clorhidrato de Selegilina, Gel Tpico, Preparacin Magistral
Clorhidrato de Epirubicina, Inyeccin Tadalafilo, Suspensin Oral, Preparacin Magistral
Galantamina, Cpsulas de Liberacin Prolongada Clorhidrato de Tramado!, Suspensin Oral, Preparacin
Galantamina, Solucin Oral Magistral Veterinaria
Fumarato de lbutilida Voriconazol, Solucin Oftlmica, Preparacin Magistral
lmiquimod, Crema Veterinaria
xxxviii Incorporaciones USP 39

MONOGRAFAS DE USP
Zonisamida, Suspensin Oral, Preparacin Magistral

Segundo Suplemento (1 de diciembre de 2015)

CAPTULOS GENERALES

(212) Anlisis de Oligosacridos (11 32) Medicin de Protena Residual de Clulas

Husped en Productos Biofarmacuticos
(1025) Pancreatina (1223.1) Validacin de Mtodos Alternativos para
Valoraciones Microbiolgicas de Antibiticos

SUPLEMENTOS DIETTICOS

Semilla de Alholva Espirulina, Tabletas

Semilla de Alholva en Polvo Fruto de Esquisandra del Norte de China
Extracto en Polvo de Semilla de Alholva Fruto de Esquisandra del Norte de China en Polvo
Espirulina Aceite de Onagra, Cpsulas

MONOGRAFAS DE USP

Amlodipino y Valsartn, Tabletas Famciclovir, Suspensin Oral, Preparacin Magistral

Andamiaje de Fibrona de Seda Lamivudina, Tabletas
Andamiaje de Vejiga Porcina Lamotrigina, Tabletas de Liberacin Prolongada
Dipropionato de Beclometasona, Solucin Oral, Diclorhidrato de Levocetirizina, Tabletas
Preparacin Magistral Lopinavir y Ritonavir, Solucin Oral
Cisaprida, Inyeccin, Preparacin Magistral Veterinaria Marbofloxacino, Suspensin Oral, Preparacin
Cisaprida, Suspensin Oral, Preparacin Magistral Veterinaria Magistral Veterinaria
Ciclosporina, Solucin Oftlmica, Preparacin Clorhidrato de Propafenona, Cpsulas de Liberacin
Magistral Veterinaria Prolongada
Enrofloxacino, Suspensin Oral, Preparacin Benzoato de Rizatriptn, Tabletas
Magistral Veterinaria Benzoato de Rizatriptn, Tabletas de
Ezetimiba Desintegracin Oral
Ezetimiba, Tabletas Tartrato de Tolterodina

Artculos Nuevos que Aparecen en USP 39 Ausentes en USP 38 y sus

Suplementos

[NOTA-Los artculos que se incluyen en esta lista se marcan en el libro con los siguientes smbolos .a.usr39. Esto se aplica
tanto a los artculos nuevos como a secciones de artculos existentes que han tenido revisiones.]

CAPTULOS GENERALES

(129) Procedimientos Analticos para Anticuerpos
Monoclonales Recombinantes de Uso Teraputico
(162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftrica
en lnmunoglobulinas Humanas
(503.1) cido Trifluoroactico en Pptidos
(580) Valoracin de Vitamina C
(661.1) Materiales Plsticos de Construccin
(661.2) Sistemas de Envases Plsticos para Uso Farmacutico
(855) Nefelometra, Turbidimetra y Comparacin Visual
(914) Viscosidad-Mtodos por Medida de Presin
(1661) Evaluacin de Sistemas de Envases Plsticos y sus
Materiales de Construccin con Respecto a su Impacto
sobre la Seguridad del Usuario
(1730) Espectroqumica de Plasma-Teora y Prctica
(1735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X-
Teora y Prctica
(1 771) Productos Oftlmicos-Pruebas de Desempeo
USP 39
SUPLEMENTOS DIETTICOS
Raz de Astrgalo
Raz de Astrgalo en Polvo
Extracto Seco de Raz de Astrgalo
MONOGRAFAS DE USP
Acetato de Abiraterona
Acetato de Abiraterona, Tabletas
Clorhidrato de cido Aminolevulnico
Aprepitant
Aprepitant, Cpsulas
Aripiprazol, Tabletas
Aripiprazol, Tabletas de Desintegracin Oral
Calcipotrieno
Calcipotrieno, Ungento
Candesartn Cilexetilo e Hidroclorotiazida, Tabletas
Clorhidrato de Ciclobenzaprina, Cpsulas de
Liberacin Prolongada
Dalteparina Sdica
Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de
Fenilefrina, Tabletas
Entecavir
Entecavir, Tabletas
Artculos Incluidos en USP 38 Ausentes en USP 39
CAPTULOS GENERALES
(361) Valoracin de Barbitricos
MONOGRAFAS DE USP
Cpsulas que Contienen por lo Menos Tres de los Siguientes
Frmacos-Acetaminofeno y Sales
de Clorfeniramina, Dextrometorfano y Fenilpropanolamina
Solucin Oral que Contiene por lo Menos Tres de los
Siguientes Frmacos-Acetaminofeno y Sales de Clorfe-
niramina, Dextrometorfano y Fenilpropanolamina
Tabletas que contienen por lo Menos Tres de los Siguientes
Frmacos-Acetaminofeno y Sales de Clorfeniramina,
Dextrometorfano y Fenilpropanolamina
Maleato de Clorfeniramina y Clorhidrato de Fenilpropano-
lamina, Cpsulas de Liberacin Prolongada
Maleato de Clorfeniramina y Clorhidrato de Fenilpropano-
lamina, Tabletas de Liberacin Prolongada
Incorporaciones xxxix
Condroitina Sulfato de Sodio de Tiburn
5-Hidroxi-L-triptfano
Eszopiclona
Eszopiclona, Tabletas
Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas
Fluconazol en Cloruro de Sodio, Inyeccin
Propionato de Fluticasona y Salmeterol, Aerosol
para Inhalacin
Propionato de Fluticasona y Salmeterol,
Polvo para Inhalacin
Micofenolato de Sodio
cido Micofenlico, Tabletas de Liberacin Retardada
Montelukast Sdico, Grnulos Orales
Montelukast Sdico, Tabletas
Montelukast Sdico, Tabletas Masticables
Paliperidona
Sitagliptina, Tabletas
Fosfato de Sitagliptina
Teriparatida
Bitartrato de Fenilpropanolamina
Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Cpsulas
Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Cpsulas de
Liberacin Prolongada
Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Solucin Oral
Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Tabletas
Clorhidrato de Fenilpropanolamina, Tabletas de
Liberacin Prolongada
Sulfato de Guanadrel
Sulfato de Guanadrel, Tabletas
Insulina Humana Cinc, Suspensin
Insulina Humana Cinc de Accin Prolongada, Suspensin
Lipresina, Solucin Nasal
Sulfato de Protamina para Inyeccin
xi Lista Detallada USP 39

LISTA DETALLADA

Advertencias Generales, Monografas, Captulos Generales, Reactivos y

Tablas Afectadas por Cambios que Aparecen en USP 39

Los nmeros de pgina se refieren a USP 3 9. Nota-Las siguientes listas indican, entre parntesis, seguido del ttulo de la seccin
o subseccin, si la seccin es nueva o si la subseccin se agreg o elimin de una seccin ya existente. Las entradas que aparecen
sin ninguna designacin de la forma "nueva," "agregada," o "eliminada," tienen cambios en la redaccin que se incluyeron en el
texto oficial existente.

(851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz (eli-

Advertencias y Requisitos minado), 754
Generales (855) Nefelometra, Turbidimetra y Comparacin
Visual (nuevo), 777
Advertencias Generales, 3 (914) Viscosidad-Mtodos por Medida de Pre-
Introduccin; 1. Ttulo y Revisin; 2. Estado Ofi-
sin (nuevo), 806
cial y Reconocimiento Legal; 3. Cumplimiento
de las Normas; 4. Monografas y Captulos Ge- Informacin General
nerales; 5. Componentes de las Monografas; 6.
Prcticas y Procedimientos de Prueba; 8. Trmi- (1045) Artculos Obtenidos por Biotecnologa (eli-
nos y Definiciones; 9. Prescripcin y Dispensa- minado), 990
cin; y 1O. Conservacin, Envasado, Almacena- (1059) Desempeo de Excipientes, 1150
miento y Etiquetado lntroduccion, Tabletas y Cpsulas, y Lquidos
Orales
Captulos Generales (1251) Pesada en una Balanza Analtica, 1969
Introduccin y Calificacin
(1661) Evaluacin de Sistemas de Envases Plsti-
cos y sus Materiales de Construccin con Res-
Pruebas y Valoraciones Generales pecto a su Impacto sobre la Seguridad del Usua-
rio (nuevo), 2002
Equipos para Pruebas y Valoraciones (1730) Espectroqumica de Plasma-Teora y Prc-
(21) Termmetros (eliminado), 117 tica (nuevo), 2064
(1735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos
Pruebas y Valoraciones Biolgicas X-Teora y Prctica (nuevo), 2071
(129) Procedimientos Analticos para Anticuerpos (1771) Productos Oftlmicos-Pruebas de Desem-
Monoclonales Recombinantes de Uso Teraputico peo (nuevo), 2136
(nuevo), 219
(162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftrica en
lnmunoglobulinas Humanas (nuevo), 239 Suplementos Dietticos
Pruebas y Valoraciones, Qumicas
(411) Valoracin de Acido Flico, 339 (2040) Desintegracin y Disolucin de Suplemen-
(503) Acido Actic,o en Pptidos, 383 tos Dietticos, 2240
INTRODUCCION Prueba de Ruptura para Cpsulas Blandas y
Mtodo 2 (agregada) Disolucin
REQUISITOS ADICIONALES
Estndares de Referencia USP
(503.1) Acido Trifluoroactico en Pptidos
Reactivos, Indicadores y
(nuevo), 384 Soluciones
(580) Valoracin de Vitamina C (nuevo), 440
Pruebas y Determinaciones Fsicas
(661) Sistemas de Envases Plsticos y sus Reactivos
Materiales de Construccin, 527
Title, Introduccin y Alcance
(661.1) Materiales Plsticos de Construccin Especificaciones de Reactivos
(nuevo), 528 Reactivos, Introduccin, 2280
(661.2) Sistemas de Envases Plsticos para Uso , 6. Pruebas Generales para Reactivos
Farmacutico (nuevo), 541 ~cido Frmico al 98 por ciento (nuevo), 2289
(670) Envases-Componentes Auxiliares, 545 ~cido Litoclico, 2290
Introduccin y Desecantes (agregada) Acido Quenodesoxiclico, 2292
(711) Disolucin, 578 Bromelina, 2303
Introduccin Citrato de Calcio, 2308
(730) Espectroqumica de Plasma, 601 3-Cloropropano-1,2-diol (nuevo), 2311
(751) Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmi- Qesmosterol (nuevo), 2314
cos (eliminado), 620 ~ter Benclico (nuevo), 2323
(771) Productos Oftlmicos-Pruebas de Calidad, Eter Laurlico de Polioxietileno 1O, 2323
632 Fosfato de Sodio y Amonio Tetrahidrato, 2326
(790) Partculas Visibles en Inyectables, 658 Fumarato de Estearilo Sdico (nuevo), 2328
Introduccin lsobutirato de Pregnenolona (nuevo), 2333
USP 39
Latosterol (nuevo), 2334
1-Monodecanoil-rac-glicerol (nuevo), 2337
1-Monooctanoil-rac-glicerol (nuevo), 2337
Nitrato Cprico Hidrato, 2338
Nitrato de Torio, 2338
2-Pirrolidona (nuevo), 2345
Politetrafluoroetileno (nuevo), 2346
Sulfato de Calcio, Dihidrato, 2355
Soluciones Volumtricas
Arsenito de Potasio, Dcimo Normal (O, 1 N),
2383
Edetato Disdico, Dcimo Molar (O, 1 M) (nueva),
2384
Edetato Disdico, Veinteavo Molar (0,05 M),
2384
Nitrato de Plata, Dcimo Normal (O, 1N), 2387
Permanganato de Potasio, Dcimo Normal (O, 1
N), 2388
Tiosulfato de Sodio, Dcimo Normal (O, 1 N),
2390
Columnas Cromatogrficas
L8, 2391
L1O, 2391
L11, 2391
L20, 2391
L65, 2393
L78, 2394
L88 (nueva), 2394
L92 (nueva), 2394
L93 (nueva), 2394
L94 (nueva), 2394
Tablas de Referencia
Especificaciones del Envase para Cpsulas y
Tabletas
Acetato de Abiraterona, Tabletas (nueva), 2397
cido Micofenlico, Tabletas de Liberacin Retar-
dada (nueva), 2397
Aprepitant, Cpsulas (nueva), 2398
Aripiprazol, Tabletas (nueva), 2398
Aripiprazol, Tabletas de Desintegracin Oral
(nueva), 2398
Bromuro de Piridostigmina, Tabletas, 2398
Candesartn Cilexetilo e Hidroclorotiazida, Table-
tas (nueva), 2398 . . .,
Citrato de Orfenadnna, Tabletas de L1berac1on
Prolongada, 2399
Clorhidrato de Ciclobenzaprina, Cpsulas de Libe-
racin Prolongada (nueva), 2399
Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de
Fenilefrina, Tabletas (nueva), 2400
Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas (nueva), 2400
Clorhidrato de Propoxifeno, Cpsulas (eliminada),
2400
Clorhidrato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Ta-
bletas (eliminada), 2400
Clorhidrato de Propoxifeno, Aspirina y Cafena,
Cpsulas (eliminada), 2400
Entecavir, Tabletas (nueva), 2402
Eszopiclona, Tabletas (nueva), 2402
Montelukast Sdico, Tabletas (nueva), 2404
Montelukast Sdico, Tabletas Masticables (nueva),
2404
Napsilato de Propoxifeno, Tabletas (eliminada),
2404
Napsilato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Table-
tas (eliminada), 2404 ..
Napsilato de Propoxifeno y Aspirina, Tabletas (eli-
minada), 2404
Sitagliptina, Tabletas (nueva), 2405
Lista Detallada xli
Descripcin y Solubilidad Relativa de Artculos de
la USP y del NF
Acetato de Abiraterona (nueva), 2409
Aluminometasilicato de Magnesio, 2416
Aluminosilicato de Magnesio, 2416
Aprepitant (nueya), 241 7
Clorhidrato de Acido Aminolevulnico (nueva),
2425
Entecavir (nueva), 2437
Eszopiclona (nueva), 2438
Etilparabeno Sdico (nueva), 2439
Fosfato de Sitagliptina (nueva), 2442
Micofenolato Sdico (nueva), 2452
Monocaprilato de Glicerilo (nueva), 2452
Monocaprilocaprato de Glicerilo (nueva), 2452
Paliperidona (nueva), 2457
Monografas (USP 39)
Acetato de Abiraterona (nueva), 2497
Acetato de Abiraterona, Tabletas (nueva), 2498
Alopurinol, 2606
IMPUREZAS
Impurezas Orgnicas
REQUISITOS ADICIONALES
Estndares de Referencia USP
Sulfato de Aluminio y Acetato de Calcio para So-
lucin Tpica, ?673
VALORACION
Sulfato de Aluminio Tetradecahidrato y Ace-
tato de Calcio Monohidrato
Clorhidrato de cido Aminolevulnico (nueva),
2715
Fosfato de An~azolina, 281 O
DEFINICION ,
IDENTIFICACION
Prueba B,
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Orgnicas
PRUEBAS ESPECIFICAS
Intervalo o Temperatura de Fusin, Clase la
(eliminada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estndares de Referencia USP
Aprepitant (nueva), 2831
Aprepitant, Cpsulas (nueva), 2833
Aripiprazol, Tabletas (nueva~, 2843 . ,
Aripiprazol, Tabletas de Desmtegrac1on Oral
(nueva), 2845
Acido Ascrbi~o, Tabletas, 2853
DEFINICIOt-J
VALORACION
Procedimiento 7 y Procedimiento 2
(agregada) _
PRUEBAS DE DESEMPENO
Disolucin y Desintegracin (agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Etiquetado (agregada) y Estndares de Refe-
rencia USP (agregada)
Sulfato de Atropin;t, Ungento Oftlmico, 2899
IDENTIFICACION
ldentification-Bases Orgnicas Nitrogena-
das, Prueba A,
PRUEBAS ESPECIFICAS
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada)
. Bacitracina, 2931 ,
IDENTIFICACION
Prueba A y Pryeba B (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Composicin de Bacitracina
REQUISITOS ADICIONALES
xlii Lista Detallada USP 39

Envasado y Almacenamiento Gluconato de Calcjo, 3138

Bacitracina, Ungen~o Oftlmico, 2934 IDENTIFICACION
PRUEBAS ESPECIFICAS Absorcin en el Infrarrojo, Prueba B
Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi- IMPUREZAS
nada), Partculas Metlicas en Ungentos Of- Lmite de Hierro
tlmicos (eliminada) y Otros Requisitos Calcipotrieno (nueva), 3152
(agregada) Calcipotrieno, Ungento (nueva), 3154
REQUISITOS ADICIONALES Candesartn Cilexetilo e Hidroclorotiazida, Table-
Envasado y Almacenamiento tas (nueva), 3164
Bacitracina Cinc,,2936 , Clorhidrato de Ciclobenzaprina, Cpsulas de Libe-
INFORMACIOl)J QUIMICA racin Prolongada (nueva), 3366
IDENTIFICACION Ciprofloxacino,, Ungento Oftlmico, 3418
Prueba A y Pneba B (agregada) VALORACION
PRUEBAS ESPECIFICAS Procedimiento
Composicin de Bacitracina, Contenido de PRUEBAS DE DESEMPEO
Cinc y Pruebas de Esterilidad Llenado Mnirro (eliminada)
REQUISITOS ADICIONALES PRUEBAS ESPECIFICAS
Envasado y Almacenamiento Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos
Bacitracina Cinc y Sulfato de Polimixina B, Un- (eliminada) y Otros Requisitos (agregada)
gento Oftlmico, 2939 Cloranfenicol, l)ngento Oftalmico, 3523
VALORACION VALORACION
Bacitracina Procedimiento,
PRUEBAS DE DESEMPEO PRUEBAS ESPECIFICAS
Llenado Mnirro (eliminada) Llenado Mnimo (eliminada), Partculas Me-
PRUEBAS ESPECIFICAS tlicas en Ungentos Oftlmicos (eliminada)
Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi- y Otros Requisitos (agregada)
nada); Partculas Metlicas en Ungentos Of- Cloranfenicol y Sulfato de Polimixina B, Ungento
tlmicos (eliminada); Pruebas de Esterilidad; Oftlmico, 352,5
Otros Requisitos (agregada) VALORACION
REQUISITOS ADICIONALES Cloranfenicol ,
Envasado y Alma~enamiento PRUEBAS ESPECIFICAS
Benzocana, Solucif>n Otica, 2976 Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos
IDENTIFICACION (eliminada) y Otros Requisitos (agregada)
Prueba A,y Prueba B (agregada) Clorhidrato de Clortetraciclina, Ungento Oftl-
VALORACION mico, 3578
Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPEO
IMPUREZAS Llenado Mnirro (eliminada)
Impurezas Orgnicas (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
REQUISITOS ADICIONALES Determinacin de Agua, Mtodo/ (eliminada);
Estndares de Referencia USP (agregada) Partculas Metlicas en Un9entos Oftlmicos
Benzocana, Tablet9s de Disolucin Bucal, 2978 (eliminada); y Otros Requisitos (agregada)
IDENTIFICACION Clotrimazol, lnsert9s Vaginales, 3582
Prueba A, 1DENTI FICACION
VALORACION Prueba 8,(agregada)
Procedimiento VALORACION
IMPUREZAS Procedimiento
Impurezas Orgnicas (agregada) IMPUREZAS
REQUISITOS ADICIONALES Impurezas Orgnicas (agregada)
Envasado y Almacenamiento y Estndares de REQUISITOS ADICIONALES
Referencia USP Estndares de Referencia USP
Benzocana y Men~ol, Aerosol Tpico, 2981 Clotrimazol, SolucLn Tpica, 3584
IDENTIFICACION IDENTIFICACION
Prueba A, Prueba A,y Prueba B (agregada)
VALORACION VALORACION
Benzocana y Mentol Procedimiento
IMPUREZAS IMPUREZAS
Impurezas Orgnicas (agregada) Impurezas Orgnicas (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS REQUISITOS ADICIONALES
Otros Requisitos (eliminada), Prueba de Pre- Estndares de Referencia USP
sin (agregada) y Prueba de Fuga Clotrimazol, Tabletas de Disolucin Bucal, 3585
(agregada) IDENTIFICACION
REQUISITOS ADICIONALES Prueba A,y Prueba B (agregada)
Estndares de Referencia USP VALORACION
Budesnida, 306} , Procedimiento
INFORMAQON QUIMICA IMPUREZAS
VALORACION Impurezas Orgnicas (agregada)
Procedimiento REQUISITOS ADICIONALES
IMPUREZAS Estndares de Referencia USP
Procedimiento 7: Lmite de 2 7-Acetato de Bu- Cloxacilina Sdica,, 3590
desnida (eliminada), Procedimiento 2: L- IDENTIFICACION
mite de 7 1-Cetobudesnida (eliminada), Pro- Prueba B (agregada) e Identificacin-Prue-
cedimiento 3 (eliminada) e Impurezas bas Geneafes, Sodio, Prueba C
Orgnicas (agregada) VALORACION
REQUISITOS ADICIONALES Procedimiento
Estndares de Referencia USP IMPUREZAS
USP 39 Lista Detallada xliii

Impurezas Orgnicas (agregada) Prueba 8 (agregada) e Identificacin-Prue-

PRUEBAS ESPECIFICAS bas Geneafes, Sodio, Prueba C
Pruebas de Esterilidad VALORACION
REQUISITOS ADICIONALES Procedimiento
Estndares de Referencia USP IMPUREZAS
Dalteparina Sdica (nueva), 3667 Impurezas Orgnicas (agregada)
Fosfato Sdico de ,Dexametasona, Crema, 3716 REQUISITOS ADICIONALES
IDENTIFICACION Estndares de Referencia USP
Prueba 8,(agregada) Clorhidrato de ,Difenhidramina, Cpsulas, 3806
VALORACION VALORACION
Procedimiento Procedimiento
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Estndares de Referencia USP Impurezas Orgnicas (agregada)
Fosfato Sdico de Dexametasona, Inyeccin, REQUISITOS ADICIONALES
3717 , Envasado y Almacenamiento, y Estndares de
IDENTIFICACION Referencia USP
Prueba 8,(agregada) Clorhidrato de ,Difenhidramina, Inyeccin, 3808
VALORACION VALORACION
Procedimiento Procedimiento
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Envasado y Almacenamiento, y Estndares de Impurezas Orgnicas (agregada)
Referencia USP REQUISITOS ADICIONALES
Fosfato Sdico de Dexametasona, Solucin Oftl- Envasado y Almacenamiento, y Estndares de
mica, 3718 , Referencia USP
IDENTIFICACION Clorhidrato de Difenhidramina, Solucin Oral,
Prueba 8,(agregada) 3809 ,
VALORACION IDENTIFICACION
Procedimiento Prueba A,
REQUISITOS ADICIONALES VALORACION
Envasado y Almacenamiento, y Estndares de Procedimiento
Referencia USP IMPUREZAS
Fosfato Sdico de Dexametasona, Ungento Of- Impurezas Orgnicas {agregada)
tlmico, 3719 , PRUEBAS DE DESEMPENO
IDENTIFICACION Volumen de El]trega (agregada)
Prueba 8,(agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
VALORACION pH (agregada), Pruebas de Recuento Micro-
Procedimiento biano y Pruebas de Microorganismos Especfi-
PRUEBAS DE DESEMPEO cos (agregada)
Llenado Mnir110 (eliminada) REQUISITOS ADICIONALES
PRUEBAS ESPECIFICAS Envasado y Almacenamiento, y Estndares de
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos Referencia USP
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de
REQUISITOS ADICIONALES Fenilefrina, Tabletas (nueva), 3811
Envasado y Almacenamiento, y Estndares de Divalproex Sdico, Cpsulas de Liberacin Retar-
Referencia USP dada, 3875
Diclofenaco Potsic;:o, Tabletas, 3769 PRUEBAS DE DESEMPEO
IDENTIFICACION Disolucin
Prueba 8, Sulfato de Efedrinq, Inyeccin, 3989
VALORACION IDENTIFICACION
Procedimiento Prueba 8,
IMPUREZAS VALORACION
Impurezas Orgnicas Procedimiento
Diclofenaco Sdico, Tabletas de Liberacin Pro- IMPUREZAS
longada, 3772 , Impurezas Orgnicas (agregada)
IDENTIFICACION REQUISITOS ADICIONALES
Prueba 8, Envasado y Almacenamiento, y Estndares de
VALORACION Referencia USP
Procedimiento Maleato de Enalapril, Tabletas, 4012
IMPUREZAS PRUEBAS DE DESEMPENO
Impurezas Orgnicas Disolucin
REQUISITOS ADICIONALES Entecavir (nueva), 4033
Envasado y Almacenamiento Entecavir, Tabletas (nueva), 4035
Diclofenaco Sdico, Tabletas de Liberacin Retar- Clorhidrato de Epitetraciclina, 4047
dada, 3774 , IDENTIFICACION
IDENTIFICACION Absorcin en el Infrarrojo, Prueba A (agre-
Prueba 8, gada) y t;rueba 8 (agregada)
VALORACION VALORACION
Procedimiento Procedimiento
IMPUREZAS IMPUREZAS
Impurezas Orgnicas Lmite de 4-Epjanhidrotetraciclina (agregada)
REQUISITOS ADICIONALES PRUEBAS ESPECIFICAS
Envasado y Almacenamiento 4-Epianhidrotetraciclina (eliminada)
Dicloxacilina Sdic,a, 3783 REQUISITOS ADICIONALES
IDENTIFICACION Estndares de Referencia USP
Eritromicina, Ungento Oftlmico, 4079
xliv Lista Detallada USP 39

VALORACIN Procedimiento
Procedimiento IMPUREZAS
PRUEBAS DE DESEMPEO Impurezas Orgnicas
Llenado Mnirr,o (eliminada) Halcinnida, Cremp, 4604
PRUEBAS ESPECIFICAS IDENTIFICACION
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos Prueba A y Prueba B (agregada)
(eliminada), Determinacin de Agua, Mtodo IMPUREZAS
I (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Impurezas Orgnicas (agregada)
REQUISITOS ADICIONALES REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Estndares de Envasado y Almacenamiento
Referencia USP Halcinnida, Ung,ento, 4606
Eszopiclona (nueva), 4156 IDENTIFICACION
Eszopiclona, Tabletas (nueva), 4157 Prueba A y Prueba B (agregada)
Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas (nueva), 4236 IMPUREZAS
Fluconazol, Inyeccin, 4340 Impurezas Orgnicas (agregada)
Fluconazol en, Dextrosa, Inyeccin, 4344 REQUISITOS ADICIONALES
DEFINICION , Envasado y Almacenamiento
IDENTIFICACION Acetato de Hidrocortisona, Ungento Oftlmico,
Prueba d? Dextrosa, Prueba B (agregada) 4652 ,
VALORACION PRUEBAS ESPECIFICAS
Procedimiento Partculas (eliminada), Otros Requisitos
IMPUREZAS (a9regada) y Llenado Mnimo (eliminada)
Impurezas Orgnicas Procedimiento 1: Para ldoxuridma, Ungel)to Oftlmico, 4716
Impurezas No Polares; Impurezas Orgnicas PRUEBAS ESPECIFICAS
Procedimiento 2: Para Impurezas Potares; Im- Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos
purezas Orgnicas: Procedimiento 3 (elimi- (eliminada) y Otros Requisitos (agregada)
nada); Impurezas Orgnicas: Procedimiento 4 lodixanol, 4788 ,
(eliminada) IDENTIFICACION
REQUISITOS ADICIONALES Prueba B y Procedimiento, Prueba C
Etiquetado (eliminada) (eliminac:ja)
Fluconazol en Cloruro de Sodio, Inyeccin VALORACION
(nueva), 4347 Procedimiento
Fluorescena Sdiq1, 4383 IMPUREZAS
IDENTIFICACION Lmite de Yoduro Libre; Lmite de Calcio (eli-
Prueba C, minada); Yodo Libre (eliminada), Lmite de
VALORACION Amina Aromtica Libre; Lmite de Metano/,
Procedimiento Alcohol lsopropfico y Metoxietanol (elimi-
IMPUREZAS nada); Lmite de 2-Metoxietanol (agregada);
Acriflavina e Impurezas Orgnicas (agregada) Impurezas Orgnicas; Impurezas Orgnicas,
REQUISITOS ADICIONALES Procedimiento 2 (eliminada); Lmite de Com-
Estndares de Referencia USP puesto Relacionado E de lodixanol e Impu-
Propionato de Fluticasona y Salmeterol, Aerosol reza H de lodi~anol (agregada)
para Inhalacin (nueva), 4433 PRUEBAS ESPECIFICAS
Propionato de Fluticasona y Salmeterol, Polvo Pruebas de Recuento Microbiano y Pruebas
para Inhalacin (nueva), 4439 de Micro01;ganismos Especficos (eliminada) y
Gentamicina y Acetato de Prednisolona, Un- Rotacin Optica, Rotacin Especfica
gento Oftlmico,,4531 (eliminada)
IDENTIFICACION REQUISITOS ADICIONALES
Cromatografa en Capa Delgada, Prueba A Envasado y Almacenamiento
VALORACION lohexol, 4799 ,
Acetato de Prednisolona IDENTIFICACION
PRUEBAS DE DESEMPEO Prueba B; Prueba de Identificacin por Cro-
Llenado Mnirr,o (eliminada) matografa en Capa Delgada, Prueba C (eli-
PRUEBAS ESPECIFICAS minada); y Procedimiento, Prueba D
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos (eliminac:ja)
(eliminada), Determinacin de Agua, Mtodo VALORACION
I (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Procedimiento
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Envasado y Almacenamiento, Lmite de Compuestos fnicos; Yodo Libre (eli-
Sulfato de Gentamicina, Ungento Oftlmico, minada); Lmite de Yoduro Libre; Impurezas
4535 Orgnicas; Lmite de Metano/, Alcohol /sopro-
IDENTIFICACIN plico y Metoxietanol (eliminada); Lmite de
Cromatografa en Cap_a Delgada, Prueba A 2-Metoxietanol (agregada); Lmite de
PRUEBAS DE DESEMPENO 3-Cloro-1,2-Propanodiol (eliminada);
Llenado Mnirr,o (eliminada) Lmite de 3-Cloropropano-1,2-diol (agre-
PRUEBAS ESPECIFICAS gada); y Lmit? de Amina Aromtica Libre
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos PRUEBAS ESPECIFICAS
(eliminada), Determinacin de Agua, Mtodo Rotacin Optica, Rotacin Especfica
I (eliminada) y Otros Requisitos (agregada) (eliminada)
REQUISITOS ADICIONALES REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Envasado y Almacenamiento, y Estndares de
Halcinnida, 4603, Referencia USP
IDENTIFICACION Ketorolaco Tromet9mina, Inyeccin, 4909
Prueba B,(agregada) IDENTIFICACION
VALORACION Prueba A y Prueba B (agregada)
USP 39 Lista Detallada xlv

VALORACIN Impurezas Orgnicas

Procedimiento rylicofenolato de Sodio (nueva), 5340
IMPUREZAS Acido Micofenlico, Tabletas de Liberacin Retar-
Impurezas Orgnicas (agregada) dada (nueva), 5341
REQUISITOS ADICIONALES Montelukast Sdico, Grnulos Orales (nueva),
Estndares de Referencia USP 5413
Ketorolaco Tromet9mina, Tabletas, 4911 Montelukast Sdico, Tabletas (nueva), 5415
IDENTIFICACION Montelukast Sdico, Tabletas Masticables (nueva),
Prueba A,y Prueba B (agregada) 5417
VALORACION Sulfato de Neomicina, UngQento Oftlmico, 5483
Procedimiento PRUEBAS DE DESEMPENO
PRUEBAS DE DESEMPEO Llenado Mnim,o (eliminada)
Uniformidad de Unidades de Dosificacin PRUEBAS ESPECIFICAS
IMPUREZAS Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi-
Impurezas Orgnicas nada), Partculas Metlicas en Ungentos Of-
Letrozol, Tabletas, 4950 _ tlmicos (eliminada) y Otros Requisitos
PRUEBAS DE DESEMPENO (agregada)
Disolucin Sulfato de Neomicina y Fosfato Sdico de
Clorhidrato de Lid9cana, 5008 Dexametasona, Cr~ma, 5485
IDENTIFICACION IDENTIFICACION
Absorcin, en el Infrarrojo, Prueba A Prueba B,
VALORACION VALORACION
Procedimiento Fosfato de Dexametasona
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
Impurezas Orgnicas (agregada) Estndares de Referencia USP
PRUEBAS ESPECIFICAS Sulfato de Neomicina y Fosfato Sdico de
Intervalo o Temperatura de Fusin Dexametasona, SoJucin Oftlmica, 5487
(eliminada) IDENTIFICACION
REQUISITOS ADICIONALES Prueba B,
Envasado y Almacenamiento, y Estndares de VALORACION
Referencia USP Fosfato de Dexametasona
Loratadina, Tabletas, 5062 REQUISITOS ADICIONALES
PRUEBAS DE DESEMPEO Estndares de Referencia USP
Disolucin Sulfato de Neomicina y Fosfato Sdico de
IMPUREZAS Dexametasona, Uf)gento Oftlmico, 5488
Impurezas Orgnicas IDENTIFICACION
Meloxicam, 5) 66 Prueba B,
DEFINICION VALORACION
IDENTIFICACIN Fosfato de Dexametasona
Prueba B, PRUEBAS DE DESEMPEO
VALORACION Llenado Mnim,o (eliminada)
Procedimiento PRUEBAS ESPECIFICAS
IMPUREZAS Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi-
Impurezas Orgnicas, Procedimiento 7 e Im- nada), Partculas Metlicas en Ungentos Of-
purezas Orgnicas, Procedimiento 2 tlmicos (eliminada) y Otros Requisitos
REQUISITOS ADICIONALES (agregada)
Estndares de Referencia USP REQUISITOS ADICIONALES
Clorhidrato de ,Memantina, 5172 Estndares de Referencia USP
VALORACION Sulfato de Neomicina y Sulfato de Polimixina B,
Procedimiento Ungento Oftlmico, 5495_
IMPUREZAS PRUEBAS DE DESEMPENO
Impurezas Orgnicas Llenado Mnim,o (eliminada)
Mentol, 5181 PRUEBAS ESPECIFICAS
IMPUREZAS Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi-
Compuestos Relacionados nada); Pruebas de Esterilidad; Partculas Me-
Mesalamina, 5200, tlicas en Ungentos Oftlmicos (eliminada);
IDENTIFICACION y Otros Requisitos (agregada)
Prueba B,y Prueba C (eliminada) Sulfato de Neomicina y Sulfato de Polimixina B
VALORACION con Dexameta~ona, Ungento Oftlmico, 5497
Procedimiento VALORACION
IMPUREZAS Dexametasona
(loruros y Sulfatos, Sulfatos; Contenido de PRUEBAS DE DESEMPEO
Acido 3-Aminosaliclico y Otras Impurezas Re- Llenado Mnim,o (eliminada)
lacionadas; y Contenido de Anilina, 2-Amino- PRUEBAS ESPECIFICAS
fenol y 4-Aminofenol Determinacin de Agua, Mtodo lb (elimi-
REQUISITOS ADICIONALES nada); Pruebas de Esterilidad; Partculas Me-
Estndares de Referencia USP tlicas en Ungentos Oftlmicos (eliminada);
Metocarbamol, 5294 y Otros Requisitos (agregada)
IMPUREZAS Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B y
Impurezas Orgnicas Bacitracina, Ungento Oftlmico, 5500
Metocarbamol, Inyeccin, 5295 PRUEBAS DE DESEMPENO
IMPUREZAS Llenado Mnim,o (eliminada)
Lmite de Aldehdos PRUEBAS ESPECIFICAS
Metocarbamol, Tabletas, 5296 Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi-
IMPUREZAS nada); Pruebas de Esterilidad; Partculas Me-
xlvi Lista Detallada USP 39

tlicas en Ungentos Oftlmicos (eliminada); VALORACIN

y Otros Requisitos (agregada) Procedimiento
Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B y IMPUREZAS
Bacitracina Cinc, Ungento_ Oftlmico, 5501 Impurezas Orgnicas (agregada)
PRUEBAS DE DESEMPENO PRUEBAS ESPECIFICAS
Llenado Mnif11o (eliminada) Pruebas de Esterilidad
PRUEBAS ESPECIFICAS REQUISITOS ADICIONALES
Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi- Estndares de Referencia USP
nada); Partculas Metlicas en Ungentos Of- Clorhidrato de Oxitetraciclina y Sulfato de Polimi-
tlmicos (eliminada); y Otros Requisitos xina B, Ungento Oftlmicg, 5728
(agregada) PRUEBAS DE DESEMPENO
REQUISITOS ADICIONALES Llenado Mnimo (eliminada); Partculas Me-
Envasado y Almacenamiento tlicas en Ungentos Oftlmicos (eliminada);
Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B, Determinacin de Agua, Mtodo 1 (elimi-
Bacitracina Y. Acetato de Hidrocortisona, Un- nada); y Otro~ Requisitos (agregada)
gento Oftalmico, 5508 PRUEBAS ESPECIFICAS
VALORACION Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos
Acetato de Hidrocortisona (eliminada)
PRUEBAS DE DESEMPEO REQUISITOS ADICIONALES
Llenado Mnif110 (eliminada) Envasado y Almacenamiento
PRUEBAS ESPECIFICAS Paliperidona (nueva), 5743
Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi- Bromuro de Pancuronio, Inyeccin, 5755
nada); Pruebas de Esterilidad; Partculas Me- IMPUREZAS
tlicas en Un9entos Oftlmicos (eliminada); Impurezas Orgnicas
y Otros Requisitos (agregada) REQUISITOS ADICIONALES
Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B, Envasado y Almacenamiento
Bacitracina Cinc e Hidrocortisona, Ungento Of- Paroxetina, Tabletas de Liberacin Prolongada,
tlmico, 551 O , 5777 ,
VALORACION VALORACION
Hidrocortisona Procedimiento
PRUEBAS DE DESEMPEO PRUEBAS DE DESEMPEO
Llenado Mnif11o (eliminada) Disolucin
PRUEBAS ESPECIFICAS IMPUREZAS
Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi- Impurezas Orgnicas
nada); Partculas Metlicas en Ungentos Of- REQUISITOS ADICIONALES
tlmicos (eliminada); y Otros Requisitos Etiquetado (agregada) y Estndares de Refe-
(agregada) rencia USP
Sulfato de Neomicina, Sulfato de Polimixina B, Bromuro de Piridostigmina, Tabletas, 5892
Bacitracina Cinc y Acetato de Hidrocortisona, Un- IMPUREZAS
gento Oftlmico, 5511 Impurezas Orgnicas (agregada)
VALORACION REQUISITOS ADICIONALES
Acetato de Hidrocortisona Envasado y Almacenamiento, y Estndares de
PRUEBAS DE DESEMPEO Referencia USP
Llenado Mnif110 (eliminada) Propofol, Emulsin Inyectable, 6058
PRUEBAS ESPECIFICAS IMPUREZAS,
Determinacin de Agua, Mtodo I ~elimi Lmite de Acidos Grasos Libres
nada); Pruebas de Esterilidad; Part1culas Me- Clorhidrato de Propoxifeno (eliminada), 6062
tlicas en Ungentos Oftlmicos (eliminada); Clorhidrato de Propoxifeno, Cpsulas (eliminada),
y Otros Requisitos (agregada) 6064
REQUISITOS ADICIONALES Clorhidrato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Ta-
Envasado y Almacenamiento bletas (eliminada), 6065
Citrato de Orfe,nadrina, Inyeccin, 5647 Clorhidrato de Propoxifeno, Aspirina y Cafena,
VALORACION Cpsulas (eliminada), 6066
Procedimiento Napsilato de Propoxifeno (eliminada), 6068
IMPUREZAS Napsilato de Propoxifeno, Suspensin Oral (elimi-
Impurezas Orgnicas nada), 6069
REQUISITOS ADICIONALES Napsilato de Propoxifeno, Tabletas (eliminada),
Envasado y Almacenamiento, y Estndares de 6069
Referencia USP Napsilato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Table-
Citrato de Orfenadrina, Tabletas de Liberacin tas (eliminada), 6070
Prolongada, 5~49 Napsilato de Propoxifeno y Aspirina, Tabletas (eli-
VALORACION minada), 6071
Procedimiento Sulfato de Protaminsi, Inyeccin, 6081
PRUEBAS DE DESEMPEO PRUEBAS ESPECIFICAS
Disolucin pH (eliminada)
IMPUREZAS Clorhidrato de Ral9xifeno, Tabletas, 6129
Impurezas Orgnicas IDENTIFICACION
REQUISITOS ADICIONALES Absorcin en el lnfrarrpjo, Prueba A
Envasado y Almacenamiento, y Estndares de PRUEBAS DE DESEMPENO
Referencia USP Disolucin
Oxacilina Sdica, ~664 REQUISITOS ADICIONALES
IDENTIFICACION Etiquetado (agregada)
Absorcin en el Infrarrojo, Prueba A (agre- Ritonavir, 6206 ,
gada); Prueba B; e Identificacin-Pruebas PRUEBAS ESPECIFICAS
Generales, Sodio, Prueba C Difraccin de Rayos X (eliminada)
USP 39 Lista Detallada xlvii

Sacarina Sdica, 6~47 Prueba A,y Prueba B (agregada)

INTRODU,CCION VALORACION
DEFINICION , Sulfacetamida Sdica y Acetato de
IDENTIFICACION Prednisolona
Prueba C PRUEBAS DE DESEMPEO
IMPUREZAS Llenado Mnirro (eliminada)
Impurezas Orgnicas, Procedimiento 7: Lmite PRUEBAS ESPECIFICAS
de Toluenosuff9namidas Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos
PRUEBAS ESPECIFICAS (eliminada) y Otros Requisitos (agregada)
Prueba para Sustancias Fcilmente Carboni- Telmisartn e Hidroclorotiazida, Tabletas, 6491
zables; Acidez o Alcalinidad; Transparencia PRUEBAS DE DESEMPEO
de la Solucin, y Color de la Solucin Disolucin
REQUISITOS ADICIONALES REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento, y Etiquetado Etiquetado (agregada)
Salicilamida, 6251 , Teriparatida (nueva), 6528
IDENTIFICACION Tetraciclina, 6546 ,
Prueba B,y Prueba C (eliminada) IDENTIFICACION
VALORACION Prueba C (eliminada) e ldentificacin-Tetra-
Procedimiento ciclinas, fy1todo //, Prueba D (eliminada)
IMPUREZAS VALORACION
Impurezas Orgnicas Procedimiento
PRUEBAS ESPECIFICAS IMPUREZAS
Intervalo o Temperatura de Fusin Impurezas Orgnicas
(eliminada) REQUISITOS ADICIONALES
REQUISITOS ADICIONALES Estndares de Referencia USP
Estndares de Referencia USP Clorhidrato de Tetraciclina, 6549
Simvastatina, Tabl~tas, 6307 IDENTIFICACION
IDENTIFICACION Prueba B; Identificacin-Pruebas Generales,
Prueba A,y Prueba B (agregada) Cloruros, Prueba C; Procedimiento, Prueba D
VALORACION (eliminada); e ldentificacin-Tetraciclinas,
Procedimiento Mtodo IJ, Prueba E (eliminada)
IMPUREZAS VALORACION
Impurezas Orgnicas (agregada) Procedimiento
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Estndares de Referencia USP Impurezas Orgnicas
Sitagliptina, Tabletas (nueva), 6312 PRUEBAS ESPECIFICAS
Fosfato de Sitagliptina (nueva), 6313 Pruebas de Esterilidad
Cloruro de Sod)o, Ungento Oftlmico, 6330 REQUISITOS ADICIONALES
VALORACION Etiquetado y Estndares de Referencia USP
Procedimiento Clorhidrato de ,Tetraciclina, Cpsulas, 6551
PRUEBAS DE DESEMPEO VALORACION
Llenado Mnirro (eliminada) Procedimiento
PRUEBAS ESPECIFICAS IMPUREZAS
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos Impurezas Orgnicas
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
REQUISITOS ADICIONALES Prdida por Secado (eliminada)
Envasado y Almacenamiento REQUISITOS ADICIONALES
Salicilato de S,adio, 6349 Estndares de Referencia USP
DEFINICION , Clorhidrato de Tetraciclina, Ungento Oftlmico,
IDENTIFICACION 6557 ,
Identificacin-Pruebas Generales, Sodio, IDENTIFICACION
Prueba B,y Prueba C (agregada) Prueba A (agregada)_
VALORACION PRUEBAS DE DESEMPENO
Procedimiento Llenado Mnirro (eliminada)
IMPUREZAS PRUEBAS ESPECIFICAS
Impurezas Orgnicas (agregada) Determinacin de Agua, Mtodo I (elimi-
REQUISITOS ADICIONALES nada); Partculas Metlicas en Ungentos Of-
Estndares de Referencia USP tlmicos (eliminada); Otros Requisitos
Salicilato de Sodio, Tabletas, 6350 (agregada)
IDENTIFICACION REQUISITOS ADICIONALES
Identificacin-Pruebas Generales, Sodio, Estndares de Referencia USP
Prueba A,y Prueba B Tiroides, 6624
VALORACION IMPUREZAS
Procedimiento Lmite de Yoduros Inorgnicos
IMPUREZAS Tiroides, Tabletas, p625
Impurezas Orgnicas (agregada) IDENTIFICACION
REQUISITOS ADICIONALES Prueba A (agregada)
Estndares de Referencia USP REQUISITOS ADICIONALES
Sulfacetamida Sdiqi, Ungento Oftlmico, 6382 Etiquetado (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS Tobramicina, Ungyento Oftlmico, 6640
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos IDENTIFICACION
(eliminada) y Otros Requisitos (agregada) Cromatografa en Cap__a Delgada, Prueba A
Sulfacetamida Sdica y Acetato de Prednisolona, PRUEBAS DE DESEMPENO
Ungento Oftlmis:o, 6384 Llenado Mnirro (eliminada)
IDENTIFICACION PRUEBAS ESPECIFICAS
xlviii Lista Detallada USP 39

Pruebas de Esterilidad; Determinacin de Etiquetado (agregada) y Estndares de Refe-

Agua, Mtodo I (eliminada); Partculas Met- rencia USP (agregada)
licas en Un9entos Oftlmicos (eliminada); y Condroitina Sulfato ,de Sodio, 7057
Otros Requisitos (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
Tobramicina y Dexametasona, Ungento Oftl- Lmite de Disacridos /nespecficos
mico, 6643 , Condroitina Sulfato de Sodio de Tiburn (nueva),
IDENTIFICACION 7062
Cromatografa en Cap_a Delgada, Prueba A Aceite de Semilla ge Lino, 7215
PRUEBAS DE DESEMPENO IDENTIFICACION
Llenado MninJo (eliminada) Identificacin de Aceites Fijos por Cromato-
PRUEBAS ESPECIFICAS grafa en Capa Delgada, Prueba B
Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos (agregada)
(eliminada); Pruebas de Esterilidad; Determi- IMPUREZAS
nacin de Agua, Mtodo I (eliminada); y Grasas y Aceites Fijos, Trazas de Metales
Otros Requisitos (agregada) (eliminada)
Tolcapona, 66~5 REQUISITOS ADICIONALES
VALORACION Etiquetado (agregada) y Estndares de Refe-
Procedimiento rencia USP (agregada)
IMPUREZAS Aceite de Onagra,,7275
Impurezas Orgnicas IDENTIFICACION
PRUEBAS ESPECIFICAS Identificacin de Aceites Fijos por Cromato-
Absortividad (eliminada) grafa en Capa Delgada, Prueba B
REQUISITOS ADICIONALES REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Etiquetado (agregada) y Estndares de Refe-
Tolcapona, Tableta>, 6656 rencia USP (agregada)
IDENTIFICACION 5-Hidroxi-L-triptfano (nueva), 7366
Absorci11 en el Infrarrojo, Prueba A Vitaminas Hidrosolubles, Cpsulas, 7391
VALORACION CO,NTENIDO
Procedimiento Acido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
PRUEBAS DE DESEMPEO Calcio (elin;iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
Disolucin minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
IMPUREZAS cio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina,
Impurezas Orgnicas Mtodo 7; Biotina,, Mtodo 2; Cianocobala-
REQUISITOS ADICIONALES rpina, Mtodo 2; Acido Flico, Mtodo 7;
Envasado y Almacenamiento Acido Flico, Mtodo 2; Pantotenato de Cal-
Clorhidrato de ,Trihexifenidilo, 6736 cio, Mtodo 7; Pantotenato de Calcio, M-
VALORACION todo 2; Pantotenato de Calcio, Mtodo 3;
Procedimiento Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Pirido-
IMPUREZAS xina, Riboflavina y Tia mina, Mtodo 7; Tia-
Impurezas Orgnicas mina, Mtodo 2; Niacina o Niacinamida,
PRUEBAS ESPECIFICAS Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y Tia-
Contenido de Cloruros (eliminada) y pH mina, Mtodo 3
(agregada) CONTAMINANTES
REQUISITOS ADICIONALES Ausencia de Microorganismos Especficos
Estndares de Referencia USP Vitaminas Hidrosolubles, Tabletas, 7405
Ungento Oftlmicq Lubricante Suave, 6769 CO,NTENIDO
PRUEBAS ESPECIFICAS Acido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Homogeneidad (eliminada), Partculas Met- Calcio (elin;iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
licas en Ungentos Oftlmicos (eliminada) y minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
Otros Requisitos (agregada) cio y Ascorbato de Sodio (agregada)
Valina, 6785 CONTAMINANTES
IMPUREZAS Ausencia de Microorganismos Especficos
Compuestos Relacionados Vitaminas Hidrosolubles con Minerales, Cpsulas,
REQUISITOS ADICIONALES 7417
Estndares de Referencia USP CO,NTENIDO
Zalepln, 6890 Acido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
IMPUREZAS Calcio (elin;iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
Impurezas Orgnicas minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
REQUISITOS ADICIONALES cio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina,
Estndares de Referencia USP Mtodo 7; Biotina, Mtodo 2; Cianocobala-
minp, Mtodo 7; Cianocobajamina, Mtodo
2; Acido Flico, Mtodo 7; Acido Flico, M-
Mono9rafas (Suplementos todo 2; Pantotenato de Calcio, Mtodo 7;
Dietticos) Pantotenato de Calcio, Mtodo 2; Pantote-
nato de Calcio, Mtodo 3; Niacina o Niacina-
Raz de Astrgalo (nueva), 6961 mida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y
Raz de Astrgalo en Polvo (nueva), 6964 Tiamina, Mtodo 7; Tiamina, Mtodo 2; Nia-
Extracto Seco de Raz de Astrgalo (nueva), 6966 cina o Niacinamida, Clorhidrato de Pirido-
Aceite de Semilla ge Borraja, 6985 xina, Riboflavif)a y Tiamina, Mtodo 3
IDENTIFICACION PRUEBAS ESPECIFICAS
Identificacin de Aceites Fijos por Cromato- Ausencia de Microorganismos Especficos
grafa en Capa Delgada, Prueba B Vitaminas Hidrosolubles con Minerales, Tabletas,
REQUISITOS ADICIONALES 7448
CONTENIDO
USP 39
cido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
cio y Ascorbat9 de Sodio (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Ausencia de Microorganismos Especficos
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cpsulas,
7515
CONTENIDO
cido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
cio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina,
Mtodo 7; Biotina,, Mtodo 2; Cianocobala-
tpina, Mtodo 2; Acido Flico, Mtodo 7;
Acido Flico, Mtodo 2; Pantotenato de Cal-
cio, Mtodo 7; Pantotenato de Calcio, M-
todo 2; Pantotenato de Calcio, Mtodo 3;
Niacina o Niacinamida, Clorhidrato de Pirido-
xina, Riboflavina y Tia mina, Mtodo 7; Tia-
mina, Mtodo 2; Niacina o Niacinamida,
Clorhidrato de Piridoxina, Ribof/avina y Tia-
mina, Mtodo 3
CONTAMINANTES
Ausencia de Microorganismos Especficos
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Solucin
Oral, 7535
CONTENIDO
cido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
cio y Ascorbato de Sodio (agregada)
CONTAMINANTES
Ausencia de Microorganismos Especficos
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas,
7545
CONTENIDO
cido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
cio y Ascorbato de Sodio (agregada)
Lista Detallada xlix
CONTAMINANTES
Ausencia de Microorganismos Especficos
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Mine-
rales, Cpsulas, 7564
CO,NTENIDO
Acido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
cio y Ascorbato de Sodio (agregada); Biotina,
Mtodo 7; Biotina, Mtodo 2; Cianocobala-
minp, Mtodo 7; Cianocobajamina, Mtodo
2; Acido Flico, Mtodo 7; Acido Flico, M-
todo 2; Pantotenato de Calcio, Mtodo 7;
Pantotenato de Calcio, Mtodo 2; Pantote-
nato de Calcio, Mtodo 3; Niacina o Niacina-
mida, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina y
Tiamina, Mtodo 7; Tiamina, Mtodo 2; Nia-
cina o Niacinamida, Clorhidrato de Pirido-
xina, Riboflavina y Tiamina, Mtodo 3
CONTAMINANTES
Ausencia de Microorganismos Especficos
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Mine-
rales, Solucin Oral, 7593
CONTENIDO
cido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
cio y Ascorbato de Sodio (agregada)
CONTAMINANTES
Ausencia de Microorganismos Especficos
Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Mine-
rales, Tabletas, 7608
CONTENIDO
cido Ascrbico (eliminada); Ascorbato de
Calcio (elin:iinada); Ascorbato de Sodio (eli-
minada); Acido Ascrbico, Ascorbato de Cal-
cio y Ascorbato de Sodio (agregada)
CONTAMINANTES
Ausencia de Microorganismos Especficos
USP 39
Advertencias y Requisitos
Aplicables a las Normas, Pruebas,
Valoraciones y Otras Especificaciones
de la Farmacopea de los Estados Unidos
1. Ttulo y Revisin ....................... 3
2. Estado Oficial y Reconocimiento
Legal ................................... 3
2. H:i. Texto Oficial ........................... 3
2.20. Artculos Oficiales ....................... 3
2.30. Reconocimiento Legal .................... 3
3. Cumplimiento de las Normas ........... 4
3.1 O. Aplicabilidad de las Normas ................ 4
3.20. Indicacin de Cumplimiento ................ 5
4. Monografas y Captulos Generales ..... 5
4.1 O. Monografas ........................... 5
4.20. Captulos Generales ...................... 5
S. Componentes de las Monografas ...... 6
5.1 O. Frmulas Moleculares ..................... 6
5.20. Sustancias Agregadas ..................... 6
5.30. Descripcin y Solubilidad .................. 6
5.40. Identidad ............................. 7
5.50. Valoracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
5.60. Impurezas y Sustancias Extraas ............. 7
5.70. Pruebas de Desempeo ................... 7
5.80. Estndares de Referencia USP ............... 8
6. Prcticas y Procedimientos de
Prueba ................................. 8
6.1 O. Prcticas Seguras de Laboratorio ............. 8
6.20. Procedimientos Automatizados .............. 8
6.30. Mtodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes .............. 8
6.50. Preparacin de Soluciones ................. 9
6.60. Unidades Necesarias para Completar una
Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Advertencias Generales 1
Generales
6.70. Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
6.80. Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
7. Resultados de Pruebas ................. 9
7.1 O. Interpretacin de los Requisitos .............. 9
7.20. Reglas para Redondeo ................... 1O
8. Trminos y Definiciones ............... 1 o
8.1 O. Abreviaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O
8.20. Aproximadamente ..................... 1O
8.30. Contenido de Alcohol ................... 1O
8.40. Pesos Atmicos ....................... 1 O
8.50. Determinaciones con Blancos ............. 1 O
8.60. Concomitantemente .................... 1O
8.70. Desecador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O
8.80. Logaritmos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O
8.90. Cepas Microbianas ..................... 1O
8.1 OO. Inapreciable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1O
8.11 O. No menos de (NLT) y No ms de (NMT) ..... 1 O
8.120. Olor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.130. Por ciento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.140. Concentraciones Porcentuales ............. 11
8.150. Presin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.160. Tiempo de Reaccin .................... 11
8.170. Peso Especfico ....................... 11
8.180. Temperaturas ........................ 11
8.190. Tiempo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.200. Transferir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.21 O. Vaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.220. Desecador al Vaco ..................... 11
8.230. Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.240. Pesos y Medidas ...................... 11
9. Prescripcin y Dispensacin ........... 12
9.10. Uso de Unidades Mtricas ................ 12
9.20. Cambios en Volumen .................... 13
2 Advertencias Generales USP 39

1 O. Conservacin, Envasado, Almacena- 10.1 O. Envasado y Almacenamiento .............. 1 3

10.20. Etiquetado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3
miento y Etiquetado ................... 13
USP 39 Advertencias Generales 3

ADVERTENCIAS Y
REQUISITOS GENERALES
La seccin de Advertencias y Requisitos Generales (en lo 2. ESTADO OFICIAL Y RECONOCIMIENTO LEGAL
sucesivo, Advertencias Generales) presenta las suposiciones 2.10. Texto Oficial
bsicas, definiciones y condiciones que se usan por defecto
para la interpretacin y aplicacin de la Farmacopea de los
Estados Unidos de America (USP, por sus siglas en ingls) y
del Formulario Nacional (NF, por sus siglas en ingls).
Los requisitos establecidos en estas Advertencias Generales
se aplican a todos los artculos reconocidos en la USP y en el
NF (en lo sucesivo, los "compendios") y a todos los captu-
~'~ii~~,nerales, a menos que se especifique algo diferente.

!-~

1. TTULO Y REVISIN
El ttulo completo de esta publicacin (que consiste en
cuatro volmenes e incluye sus Suplementos) es: Farmacopea
de los Estados Unidos de Amrica, Trigsima Novena Revisin
y Formulario Nacional, Trigsima Cuarta Edicin. Estos ttulos
pueden abreviarse a USP 39, a NF 34, y a USP 39-NF 34. La
Farmacopea de los Estados Unidos, Trigesima Novena Revi-
sin, y el Formulario Nacional, Trigsima Cuarta Edicin, re-
emplazan a todas las revisiones anteriores. Cuando se em-
plean las siglas "USP", "NP' o "USP-NP' sin ningn otro
calificativo, las mismas se refieren nicamente a USP 39, NF
34, y a sus Suplementos, durante el tiempo que estos com-
pendios estn vigentes. Los mismos ttulos, sin ninguna dis-
tincin, se aplican tanto a la presentacin impresa como a
la electrnica de este contenido. Aunque la USP y el NF se
publican en forma conjunta y comparten estas Advertencias
Generales, cada uno de ellos constituye por s mismo un
compendio separado.
Esta revisin es oficial a partir del 1 de mayo de 2016, a
menos que se indique algo diferente mediante un texto
especfico.
Los Suplementos de la USP y el NF se publican
peridicamente.
2.20. Artculos Oficiales
Un artculo oficial es un artculo reconocido en la USP o el
NF. Se considera que un artculo est reconocido e incluido
en un compendio cuando se publica su monografa en el
compendio y se le asigna una fecha oficial a la misma en
forma especfica o general.
El ttulo especificado en una monografa es el ttulo oficial
para ese artculo. Los nombres que se consideren sinnimos
de ttulos oficiales no pueden ser utilizados para sustituir a
los nombres oficiales.
Los artculos oficiales incluyen tanto sustancias oficiales
como productos oficiales. Una sustancia oficial es un frmaco,
excipiente, ingrediente diettico u otro ingrediente, o un
componente de un dispositivo terminado para el cual el t-
tulo de la monografa no incluye indicacin alguna sobre la
naturaleza de la forma terminada.
Un producto oficial es un producto farmacutico, suple-
mento diettico, preparacin magistral, o dispositivo termi-
nado para el cual se provee una monografa.
2.30. Reconocimiento Legal
Los compendios USP y NF estn reconocidos por las legis-
laciones y reglamentaciones de muchos pases del mundo.
Las autoridades reglamentarias pueden hacer cumplir las
normas presentadas en la USP y el NF; no obstante, debido
a que el reconocimiento de los compendios USP y NF puede
variar de pas a pas, se recomienda que los usuarios conoz-
can las legislaciones y reglamentaciones aplicables. En los
Estados Unidos, de acuerdo con la Federal Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y
Cosmticos o FDCA), tanto la USP como el NF estn recono-
cidos como compendios oficiales. Un medicamento con un
nombre reconocido en USP-NF debe cumplir con las normas
farmacopeicas de identidad o se le considerar adulterado,
4 Advertencias Generales USP 39

rotulado incorrectamente (misbranded) o ambos. Ver, p.ej.,

la FDCA 501 (b) y 502(e)(3)(b); ver tambin las reglamen-
taciones de la FDA, el Ttulo 21 del CFR 299.5(a&b). Para
evitar que se les considere adulterados, los medicamentos
deben cumplir adems con las normas farmacopeicas de
contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el
etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento
difiere. Ver, p.ej., FDCA 501 (b) y Ttulo 21 del CFR
299.5(c). Asimismo, para evitar que se les considere rotula-
dos incorrectamente, los medicamentos reconocidos en los
compendios USP-NF deben tambin envasarse y etiquetarse
de conformidad con las normas farmacopeicas. Ver la FDCA
502(g).
Un suplemento diettico que declara cumplir con las es-
pecificaciones de USP se considerar como un alimento in-
correctamente rotulado (misbranded food) si incumpliera
con las mismas. Ver la FDCA 403(s)(2)(D).
La ejecucin de las normas USP es responsabilidad de la
FDA y dems autoridades gubernamentales en los EE.UU. y
ciernas pases. La USP no desempea ningn papel en la
ejecucion de las normas.

3. CUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS

3.10.

a recuen-
cia e ana isis y e muestreo se eja 1 re a as preferencias
o instrucciones de aqullos que llevan a cabo los anlisis
para determinar el cumplimiento con las normas y a los
dems usuarios de USP-NF, incluidos fabricantes, compra-
dores o autoridades reglamentarias.
Los productos oficiales se preparan de acuerdo con los
principios reconocidos de buenas prcticas de fabricacin y
a partir de ingredientes que cumplan con las normas de USP
o NF, siempre que existan normas para dichos ingredientes
(para suplementos dietticos, ver la seccin 3.10.20).
Las sustancias oficiales se elaboran segn principios reco-
nocidos de buenas prcticas de fabricacin con ingredientes
que cumplen con las especificaciones establecidas para ase-
gurar que las sustancias resultantes cumplan con los requisi-
tos de las monografas oficiales.
3.10.1 O. Aplicabilidad de las Normas a Productos
Farmacuticos, Frmacos y Excipientes
Las normas correspondientes de los compendios USP o NF
se aplican a cualquier artculo comercializado en los Estados
Unidos que (1) se reconozca en el compendio y (2) que se
destine o etiquete para su uso como medicamento o como
ingrediente de un medicamento. Dichos artculos (productos
farmacuticos, frmacos y excipientes) incluyen medicamen-
tos para humanos (ya sea dispensados con receta, "de venta
libre" o de otro tipo), as como medicamentos para anima-
les. Las normas correspondientes se aplican a dichos artcu-
los, independientemente de que se agregue o no la deno-
minacin "USP" o "NF". Las normas se aplican por igual a
los artculos con ttulos oficiales o nombres derivados por
transposiciones de las palabras que componen los ttulos ofi-
ciales, o por transposicin en el orden de los nombres de
dos o mas ingredientes activos en los ttulos oficiales, o
cuando se usen sinnimos con la intencin o efecto de su-
gerir un grado significativo de identidad con el ttulo o
nombre oficial.
3.10.20. Aplicabilidad de las Normas a Dispositivos
Mdicos, Suplementos Dietticos y a sus Componentes e
Ingredientes
Un artculo reconocido en la USP o el NF debe cumplir
con las normas farmacopeicas si el artculo es un dispositivo
mdico, componente destinado para un dispositivo mdico,
USP 39
suplemento diettico, ingrediente diettico, u otro ingre-
diente destinado para su incorporacin en un suplemento
diettico, y si declara en su etiquetado el cumplimiento con
los compendios USP o NF.
En general, los suplementos dietticos se elaboran con in-
gredientes que cumplen con las normas de los compendios
USP, NF, o Food Chemicals Codex. Cuando no existen tales
normas, las sustancias pueden usarse en suplementos diet-
ticos siempre que hayan mostrado ser de grado alimenticio
de calidad aceptable utilizando otros procedimientos
adecuados.
3.20. Indicacin de Cumplimiento
Un producto farmacutico, frmaco o excipiente puede
usar la denominacin "USP" o "NF" junto a su ttulo oficial
o en otra parte de la etiqueta nicamente cuando: (1) existe
una monografa en el compendio especificado y (2) el art-
culo cumple con la identidad estipulada en el compendio
correspondiente.
Cuando se determina que un producto farmacutico, fr-
maco, preparacin magistrat.. usn? o excipiente difiere de las
normas USP o NF pertinentes de contenido, calidad, o pu-
reza al aplicar las pruebas, procedimientos y criterios de
aceptacin establecidos en el compendio correspondiente,
estas diferencias deben indicarse de forma clara en la
etiqueta.
Cuando un producto farmacutico, frmaco, 4prEiParacin
magistral ... usP39 o excipiente no cumple con la identidad esti-
pulada en los compendios USP o NF o se le ha agregado
una sustancia que interfiere con las pruebas y procedimien-
tos establecidos, se le debe asignar un nombre diferente y
totalmente distinto de cualquier otro nombre reconocido en
los compendios USP o NF.
Un dispositivo mdico, suplemento diettico o ingrediente
o componente de un dispositivo mdico o suplemento die-
ttico puede usar la denominacin "USP" o "NF" junto a su
ttulo oficial o en otra parte de la etiqueta, nicamente
cuando: (1) existe una monografa en el compendio especi-
ficado y (2) el artculo cumple con las normas de la mono-
grafa y dems normas aplicables en el compendio
correspondiente.
La denominacin "USP" o "NF" en la etiqueta de un art-
culo no debe ni puede interpretarse como un aval por parte
de la USP ni tampoco debe interpretarse como una confir-
macin por parte de la USP de que tal artculo cumple con
las normas pertinentes de la USP. La USP puede iniciar una
accin legal si se declara o presenta un artculo como un
artculo oficial en uno de los compendios de la USP y sta
determina que tal aseveracin no fue hecha de buena fe.
La denominacin "USP-NF" puede usarse en la etiqueta
de un artculo, siempre que dicha etiqueta tambin lleve
una frase tal como "Cumple con las normas NF publicadas
por la USP", indicando el compendio particular que corres-
ponde aplicar.
Cuando se usan las siglas "USP " "NF " o "USP-NF" en la
etiqueta de un artculo para indic1ar que' el artculo cumple
con las normas farmacopeicas, las siglas deben aparecer
junto al ttulo oficial del artculo. Las siglas no debern apa-
recer dentro de smbolos, como por ejemplo crculos, cua-
drados etc., y debern estar en letras maysculas.
Si un suplemento diettico no cumple con todos los re-
quisitos farmacopeicos aplicables, pero contiene uno o ms
ingredientes dietticos u otros ingredientes reconocidos en
los compendios USP o NF, se puede indicar que tales ingre-
dientes individuales cumplen con las normas USP o NF o
que son de calidad USP o NF siempre y cuando la denomi-
nacin se limite a los ingredientes individuales y no se insi-
ne que el suplemento diettico cumple con las normas en
USP.
Cambio en la redacdn:
4. MONOGRAFAS Y CAPTULOS GENERALES
Advertencias Generales 5
4.1 O. Monografas
Las monografas establecen el nombre, definicin, especi-
ficaciones y dems requisitos relacionados con el envasado,
almacenamiento y etiquetado del artculo. Las especificacio-
nes consisten en pruebas, procedimientos y criterios de
aceptacin que ayudan a asegurar la identidad, contenido,
calidad y pureza del artculo. Para los requisitos generales
relacionados con secciones especficas de la monografa, ver
la seccin 5, Componentes de las Monografas.
Debido a que, en ocasiones, las monografas no propor-
cionan normas para todas las caractersticas relevantes, algu-
nas sustancias oficiales pueden ajustarse a las normas USP o
NF, pero diferir en lo que respecta a propiedades no norma-
lizadas que son relevantes para su uso en preparaciones es-
pecficas. Para asegurar la 4 reemplazabilidad 4 uSP39 en esos
casos, se recomienda a los usuarios comprobar la equivalen-
cia funcional o determinar tales caractensticas antes de su
uso.
4.10.1 O. Aplicabilidad de los Procedimientos de Prueba
Una sola monografa puede .inclu.ir n:is de una pr1Jel;>a,
procedimiento y/o criterio de oceptdn. para el mismo~ atti~
buto. A menos que se especifique de. otro modo en la mq~
nografa1 todas las pruebas son requisitos~ En algunos casos,
las instrucciones. de la monografa permiten la seleccic;n. de
pruebas que reflejen.atributos de artculos producidos~!'
diferentes fabrkantes; talescomodistintas formas polmrfi-:
cas, impurezas, hidratos y disolucin. Las instrucciones. de
las monografas indican las pruebas, proce.dimientqs ,y/o cri
terios de aceptacin qt.Je se deben usar, y el requisJto de
etiquetado correspondiente ..a.vse19
El orden en el que se presentan estas pruebas en la mo-
nografa se basa en el orden en el que fueran aprobadas por
el Comit de Expertos pertinente para su inclusin en la
monografa. La Prueba 1 no es necesariamente la prueba
para el producto innovado.r o. para el productode r.efE~ren
cia. Dependiendo de las instrucciones de la monografa,
por lo regular no se. requiere una.declaracin en el etque~
tado s se usa la Prueba 1 ;.a.usPY
4.10.20. Criterios de Aceptacin
Los criterios de aceptacin consideran errores analticos y
variaciones inevitables durante la fabricacin y preparacin
magistral, as como el deterioro hasta un grado considerado
aceptable en condiciones prcticas. La existencia de criterios
de aceptacin farmacopeicos no constituye razn para ase-
verar que una sustancia oficial cuya pureza se aproxima al
100 por ciento "excede" la calidad farmacopeica. De igual
manera, el hecho de que un artculo se haya preparado
usando criterios ms estrictos que los especificados en la
monografa no constituye una razn vlida para aseverar
que el artculo "excede" los requisitos farmacopeicos.
Un producto oficial debe formularse con la intencin de
suministrar el 100 por ciento de la cantidad de cada ingre-
diente declarado en la etiqueta. Cuando debido a requisitos
legales aplicables, se requiera que la cantidad mnima de
una sustancia presente en un suplemento diettico sea ma-
yor que el criterio de aceptacin inferior permitido por la
monografa, el criterio de aceptacin superior de la mono-
grafa puede incrementarse en una cantidad
correspondiente.
Los criterios de aceptacin especificados en las monogra-
fas individuales y en los captulos generales para preparacio-
nes magistrales se basan en los atributos de calidad que se
espera podran caracterizar un artculo preparado magistral-
mente a partir de frmacos e ingredientes a granel de
acuerdo con los procedimientos establecidos o con los prin-
cipios reconocidos de buenas prcticas de preparacin ma-
gistral descritos en estos compendios.
4.20. Captulos Generales
A cada captulo general se le asigna un nmero que apa-
rece entre parntesis angulares junto al ttulo (p.ej.: Croma-
tografa (621 )). Los captulos generales pueden contener lo
siguiente:
Descripciones de pruebas y procedimientos para su apli-
cacin en monografas individuales,
6 Advertencias Generales
Descripciones y especificaciones de condiciones y prc-
ticas de preparacion magistral,
Informacin general para la interpretacin de requisitos
farmacopeicos,
Descripciones de prcticas generales de almacena-
miento farmacutico, dispensacin y envasado, o
Guas generales para fabricantes de sustancias oficiales o
productos oficiales.
Cuando una monografa hace referencia a un captulo ge-
neral, los criterios de aceptacin pueden presentarse des-
pus de dos puntos.
Algunos captulos pueden servir como descripciones gene-
rales introductorias de una prueba o tcnicas analticas. Ade-
ms, pueden hacer referencia a otros captulos generales
que contengan tcnicas, detalles de los procedimientos y,
en ocasiones, criterios de aceptacin.
Cambio en la redaccin;
5. COMPONENTES DE LAS MONOGRAFAS
5.10. Frmulas Moleculares
Las frmulas moleculares de los ingredientes activos que
se usan en la definicin del contenido requerido de un art-
culo farmacopeico tienen por objeto designar las entidades
qumicas, tal como aparecen en el nombre qumico com-
pleto del artculo, con una pureza absoluta (100 por ciento).
5.20. Sustancias Agregadas
Las sustancias agregadas se presumen inadecuadas para
su inclusin en un artculo oficial y por lo tanto quedan
prohibidas, si ""usP39 su presencia afecta negativamente la
biodisponibilidad, la eficacia teraputica o la seguridad del
artculo oficial; o "'us?19 interfieren con las pruebas o valora-
ciones prescritas para determinar el cumplimiento de las
normas farmacopeicas (ver 3.2() Indicacin de Cumpl,
miento),1>.usm.
El aire contenido en el envase de un artculo oficial puede
extraerse o reemplazarse por dixido de carbono, helio, ar-
gn o nitrgeno, o una mezcla de estos gases, siempre que
sea apropiado. No es necesario declarar en el etiquetado el
uso de alguno de dichos gases.
5.20.1 O. Sustancias Agregadas 1.usP:~, en Sustancias
Oficiales
Las sustancias oficiales pueden contener nicamente las
s,us~an~i~s agregadas especfjcas pe~mitidas por la n;onogra-
f1a 1nd1v1duaL Tales sustancias agreg:das .no debetan exce-
der la cantidad requerida para lograr el. e(ec;:to. deseado ....:usi>39
Si se permite tal adicin, la etiqueta debe indicar los nom-
bres y las cantidades de las sustancias agregadas.
5.20.20. Sustancias Agregadas ,.t.:(Ex~lpiii!ntes e Relativa de Artculos de la USP y del NF. La tabla de referencia
lngr:edientes)1.usPJJ1 en Productos Oficiales
A menos que se especifique algo diferente en la monogra-
fa individual, pueden agregarse sustancias y excipientes
adecuados tales como agentes antimicrobianos, bases far-
macuticas, transportadores, recubrimientos, saborizantes,
conservantes, estabilizantes y vehculos a un producto oficial
para mejorar su estabilidad, utilidad o apariencia, o para fa-
cilitar su preparacin.
Se pueden emplear excipientes y sustancias agregadas ex-
clusivamente para impartir color a los productos oficiales,
excepto para aqullos destinados a la administracin paren-
teral u oftlmica, siempre que cumplan con las reglamenta-
ciones de la FDA para el uso de coorantes y que sean ade-
cuadas en todos los otros aspectos. (Ver tambin Sustancias
Agregadas en Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 )).
En la preparacin de ungentos y supositorios, se pueden
variar las proporciones de las sustancias que constituyen la
base para mantener la consistencia adecuada en diferentes
condiciones climticas, siempre que no se vare la concen-
tracin de los ingredientes activos y que no se afecte la
biodisponibilidad, la eficacia terapeutica o la seguridad de la
preparacin.
USP 39
5.20.20.1. En Preparaciones Magistrales
Las preparaciones magistrales para las que se proporciona
una composicin completa deben contener nicamente los
ingredientes indicados en las frmulas, a menos que se ex-
cepte especficamente en este documento o en la mono-
grafa individual. Se pueden presentar desviaciones en los
procesos especificados o en los mtodos de preparacin ma-
gistral, pero no en sus ingredientes o proporciones, siempre
que la preparacin final cumpla con las normas pertinentes
y se prepare siguiendo el proceso especificado.
Cuando la monografa de una preparacin magistral exige
una cantidad de un ingrediente expresada con respecto a la
sustancia seca, no es necesario secar el ingrediente antes de
utilizarlo, siempre que se tome debida cuenta del agua u
otras sustancias voltiles presentes en la cantidad utilizada.
Existen formulaciones de alcohol especialmente desnatura-
lizado que se usan de acuerdo con los estatutos y reglamen-
taciones federales de la Interna! Revenue Service, (IRS, por
sus siglas en ingls, Oficina de Recaudacin de Impuestos
del Gobierno de los Estados Unidos). Una formulacin apro-
piada de alcohol especialmente desnaturalizado puede susti-
tuir al Alcohol en la fabricacin de preparaciones farmaco-
peicas destinadas para uso interno o para uso tpico,
siempre que el desnaturalizante sea voltil y no quede en el
producto terminado. Un producto terminado destinado a
aplicacin tpica sobre la piel puede contener alcohol espe-
cialmente desnaturalizado, siempre que el desnaturalizante
sea un ingrediente normal en la preparacin o una sustancia
agregada permitida; en ambos casos, el desnaturalizante se
debe identificar en la etiqueta de la preparacin tpica.
Cuando se indique un proceso en la monografa individual,
toda preparacin elaborada magistralmente con alcohol des-
naturalizado debe ser idntica a la que se obtiene mediante
el proceso indicado.
5.20.20.2. En Suplementos Dietticos
Pueden agregarse ingredientes adicionales a los productos
de suplementos dietticos siempre que tales ingredientes:
(1) cumplan con los requisitos reglamentarios aplicables y
(2) no interfieran con las valoraciones y las pruebas prescri-
tas para determinar el cumplimiento de las normas
farmacopeicas.
5.30. Descripcin y Solubilidad
Una prueba cuantitativa de solubilidad se considerar
como una prueba de pureza, nicamente cuando se des-
cribe y designa como tal en una monografa.
Una monografa puede incluir informacin relacionada
con la descripcin del artculo. La informacin de "descrip-
cin y solubilidad" correspondiente a un artculo tambin
aparece en la tabla de referencia Descripcin y Solubilidad
indica slo las propiedades de los artculos que cumplen con
las normas de la monografa. La tabla de referencia est
destinada principalmente para aqullos que usan, elaboran y
dispensan frmacos y/o artculos relacionados. Aunque la in-
formacin proporcionada en las monografas y la informa-
cin en la tabla de referencia puede ayudar indirectamente
a la evaluacin preliminar de un artculo, dicha informacin
no constituye en s misma una norma o prueba de pureza.
La solubilidad aproximada de una sustancia farmacopeica
se indica mediante uno de los siguientes trminos
descriptivos:
Partes de Disolvente
Requeridas para
Trmino Descrintivo 1 Parte de Soluto
Muv soluble Menos de 1
Fcilmente soluble De 1a10
Soluble De 10 a 30
Moderadamente soluble De 30 a 100
Poco soluble De 100 a 1000
USP 39
Partes de Disolvente
Requeridas para
Trmino Descrintivo 1 Parte de Soluto
Muv noca soluble De 1000 a 1 O 000
Prcticamente insoluble o Mayor que o igual a
Insoluble 10000
5.40. Identidad
La prueba farmacopeica bajo el ttulo Identidad o Identifi-
cacin se proporciona como una ayuda para verificar la
identidad de los artculos segn se indica, p.ej., en la eti-
queta de sus envases, y para establecer si se trata del art-
culo nombrado en USP-NF. La prueba de Identidad o Identi-
ficacin para un artculo en particular puede comprender
uno o ms procedimientos. Cuando se lleva a cabo una
prueba farmacopeica de Identidad o Identificacin, se deben
cumplir todos los requisitos de todos los procedimientos es-
pecificados para satisfacer los requisitos de la prueba. El in-
cumplimiento de un artculo con los requisitos de una
prueba de Identidad o Identificacin prescrita (es decir, que
no cumpla con los requisitos de todos los procedimientos
especificados que componen dicha prueba) indica que el
artculo est rotulado incorrectamente y/o adulterado.
5.50. Valoracin
Las pr~ebas de va_loracin para preparaciones ma_gistrales
no han sido concebidas para evaluar una preparacion ma-
gistral antes de su dispensacin, sino como pruebas oficiales
para casos en los que exista duda o controversia acerca de
la conformidad de la preparacin con las normas oficiales.
5.50.10. Unidades de Potencia (Biolgica)
Para las sustancias que no pueden ser caracterizadas com-
pletamente por medios qumicos o fsicos, o que requieren
la confirmacin de la funcionalidad o de una estructura ter-
ciaria, puede ser necesario expresar las cantidades de divi-
dad biolgica en unidades de potencia biolgica, definidas
por un estndar de referencia designado como patrn ofi
cial. Para casos en los que los materiales de referencia se
han discontinuado, las unidades internacionales de potencia
pueden definirse en trminos de masa molecular, como en
el caso de las vitaminas A, D y E.
Cuando se encuentran disponibles, los Estndares Biolgi-
cos Internacionales de la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS) definen las Unidades Internacionales (UI). Las mono-
grafas de la USP hacen referencia a las unidades asgnada,s
por tos Estndares de Referencia USP directamente c<;>mo
Unidades Internacionales (UI) o como "Unidades USP". Para
ah:)UnOS productos biolgicos, las unidades de potencia. se
asignan en comparacin con el correspondiente Estriqar de
los Estados Unidos de Amrica (U.S. Standard) establecido
po~ la FDA (ver Pr?ductos Bol9cos {1041)), ~x~stan o no
Unidades Internacionales o Unrdades USP def1n1das. Se .debe
tener en cuenta que para el etiquetado relacionado con el
producto, P..ej., en envases, no se requiere utilizar la frase
completa / Unidades USP [nombre del producto]" que apa-
rece en muchas monografas de la USP en la . seccion de
etiquetado. El trmino "Unidades USP" se puede utilizafen
el etiquetado del producto de conformidad con los requisi-
tos farmacopeicos de la USP, siempre y cuando sea cl(!rp {!
partir del contexto que el volumen se declara en trminos
de Unidades USP [nombre del producto]. En dichos casos;
debe ser claro que "Unidades USP" y "Unidades USP [nom-
bre del producto]" comparten el mismo significado ....uspj9
5.60. Impurezas y Sustancias Extraas
Las pruebas para determinar la presencia de sustancias ex-
traas e impurezas se establecen para limitarlas a cantidades
que no sean objetables en las condiciones normales de em-
pleo del artculo (ver tambin Impurezas en Frmacos y Pro-
ductos Farmacuticos (1 086)).
Adems de las pruebas prescritas en la monografa indivi-
dual, se deben aplicar otras pruebas y criterios de acepta-
cin adecuados para detectar y controlar impurezas que pu-
dieran resultar de cambios en los mtodos de
procesamiento o que provengan de fuentes externas,
cuando su presencia no concuerde con las buenas prcticas
Advertencias Generales 7
de fabricacin o las buenas prcticas farmacuticas
aplicables.
5.60.10. Otras Impurezas en los Artculos de la USP y el
NF
Cuando una monografa de los compendios USP o NF in-
cluye una valoracin o prueba de impurezas orgnicas cro-
matogrfica, diferente de una prueba de disolventes resi-
duales, y el procedimiento de la monografa no detecta una
impureza presente en la sustancia, se deben expresar la can-
tidad e identidad de la impureza, si fueran ambas conoci-
das, bajo el encabezado Otra(s) lmpureza(s) en el etiquetado
(certificado de anlisis) de la sustancia oficial.
La presencia en una sustancia oficial de cualquier impu-
reza no declarada en el etiquetado constituye una desvia-
cin de la norma si el contenido es de O, 1 % o mayor. La
suma de las Otras Impurezas combinada con las impurezas
detectadas por los mtodos de la monografa no puede ex-
ceder del 2,0% (ver Impurezas Comunes (466)), a menos
que en la monografa se indique algo diferente.
Las siguientes categoras de frmacos quedan excluidos de
los requisitos de Otras Impurezas:
productos de fermentacin y derivados semisintticos
obtenidos a partir de ellos,
radiofrmacos,
productos biolgicos,
productos obtenidos por biotecnologa,
pptidos,
productos botnicos y
productos crudos de origen animal o vegetal.
No debe incluirse ninguna sustancia conocida como t-
xica en Otras Impurezas.
5.60.20. Disolventes Residuales en los Artculos de la USP
y el NF
Todos los artculos de los compendios USP y NF estn su-
jetos al control pertinente de disolventes residuales, incluso
cuando la prueba no est indicada en la monografa indivi-
dual. Los disolventes que se empleen durante los procesos
de fabricacin deben ser de calidad adecuada. Asimismo, se
debe tomar en consideracin la toxicidad y el nivel residual
de cada disolvente y limitar los disolventes conforme a los
principios definidos y los requisitos especificados en Disol-
ventes Residuales (467), segn los mtodos generales indica-
dos en dicho captulo u otros mtodos adecuados.
5.60.30 Impurezas Elementales en Medicamentos y
Su>lemer:itos '?ietticC!s USP
Con vigencia a partir qel 1 de enero de 2018, se contro-
larn las impurezas elementales en los medicamentos ofidac
les de_ ~cuerdo conlos principios definidos y los requisitos
espec1t1Cados en Impurezas Elemental~s-lmites {232). Con
vigencia a partir del 1 de enero .de 2018, se controlarn los
contaminantes elementales en los suplementos dietticos
oficiales de acuerdo con los prindpios definidos y los requi
sitos especificados en Contaminantes Elementa~s .en Suple-
mentos Dietticos (2232). Tambin, coh vigencia a partir del
1 de enero de 2018, el captulo Metales Pesados {231) ser
eliminado, as como todas las. referencias a dicho captulo
gue se encuentren en 1os captulos. generales y las monogra-
f1as. La USP permitir la adopcin temprana de los requisitos
de los captulos {232) y {2232). Adems, si el captulo (232)
o el (2232/, segn corresponda, se implementan por com-
p!et9 ~n lo ql;Je respecta a un medicamento o suplemento
d1etet1co particular antes del 1 de enero de 2018, dicho
producto y sus ingredientes ya no necesitarn cumplir con
los requisitos aplicables del captulo {231) para ser conside-
rados por la USP en cumplimiento con los requisitos de
USP-NF. (BR Ol-abt-2015)
5.70. Pruebas de Desempeo
Cuando las determinaciones de uniformidad de contenido
se hayan efectuado usando la misma metodologa analtica
e~pecifi~ada en la Valorac(~n, tomando debida cuenta de las
d1ferenc1as en la preparac1on de la muestra, el promedio de
todas las determinaciones individuales de uniformidad de
contenido puede usarse como el resultado de la Valoracin.
8 Advertencias Generales
5.80. Estndares de Referencia USP
Los Estndares de Referencia USP son materiales autnti-
cos que han sido aprobados como adecuados para su uso
como estndares de comparacin en las pruebas y valora-
ciones de la USP o el NF. (Ver Estndares de Referencia USP
(11 )). Cuando una rrueba o valoracin de los compendios
USP o NF indique e uso de un Estndar de Referencia USP,
slo se considerarn concluyentes los resultados obtenidos
usando el Estndar de Referencia USP especificado. Cuando
un procedimiento exija el uso de un artculo oficial y no de
un Estndar de Referencia USP como material de referencia,
se debe utilizar una sustancia que satisfaga todos los reque-
rimientos indicados para dicho artculo en la monografa ofi-
cial. Si alguna norma nueva de la USP o del NF requiere el
uso de un Estndar de Referencia USP nuevo que an no
est disponible, dicha parte de la norma que contiene el
requisito no ser oficial hasta que el material de referencia
USP especificado est disponible.
Salvo que la etiqueta del estndar de referencia indique
una potencia o contenido especficos, se asume que el es-
tndar de referencia tiene una pureza del 100,0% para la
flicacin oficial. A menos que se indique algo diferente en
e procedimiento de la monografa individual o en un cap-
tulo general, los Estndares de Referencia USP deben usarse
de acuerdo con las instrucciones de sus etiquetas.
Cqmbio en la redaccin:
6. PRCTICAS Y PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA
6.1 O. Prcticas Seguras de Laboratorio
Al realizar procedimientos farmacopeicos, se deben seguir
prcticas seguras de laboratorio, las cuales incluyen medidas
precautorias, equipo de proteccin y prcticas de trabajo
acordes a las sustancias qumicas y procedimientos usados.
Antes de realizar cualquier procedimiento descrito en los
compendios, el analista debera conocer los peligros asocia-
dos con las sustancias qumicas y las tcnicas y medios de
proteccin contra dichos riesgos. Estos compendios no tie-
nen como objetivo describir tales peligros o medidas de
proteccin.
6.20. Procedimientos Automatizados
Los procedimientos automatizados y manuales que em-
plean los mismos fundamentos qumicos se consideran
equivalentes.
6.30. Mtodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados
Se pueden usar mtodos y/o procedimientos alternativos
que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud,
sensibilidad, precisin, selectividad o adaptabilidad a la au-
tomatizacin o a la reduccin de datos computarizados o en
otras circunstancias especiales. Dichos mtodos y procedi-
mientos alternativos se deben validar segn se describe en
el captulo general Validacin de Procedimientos Farmacopei-
cos (1225) y se debe demostrar que proporcionan resultados
equivalentes o mejores. Solamente aquellos resultados obte-
nidos por los mtodos y procedimientos suministrados en
los compendios sern concluyentes.
Se recomienda remitir a la USP los procedimientos alter-
nativos para su evaluacin como reemplazos potenciales o
para agre$Jarlos a las normas (ver la seccin 4. 7O,
Monograf1as).
En ciertos captulos generales se indica que el texto en
cuestin est armonizado con el texto correspondiente de la
Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa y que estos
textos son intercambiables. Por ello, si el cumplimiento de
un requisito de una sustancia o preparacin fuera determi-
nado usando un mtodo intercambiable de una de estas
farmacopeas, tambin debera cumplir los requisitos de la
USP. Sin embargo, si apareciera una diferencia, o en el caso
de controversia, slo el resultado obtenido mediante el pro-
cedimiento y/o mtodo dado en la USP ser concluyente.
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes
USP 39
A menos que se especifique algo diferente, todos los cl-
culos se efectan con respecto a la sustancia "tal como se
encuentra".
Se pueden realizar los procedimientos de las pruebas so-
bre la sustancia sin secar o sin incinerar y calcular los resul-
tados con respecto a la sustancia seca, anhidra o incinerada
siempre que la monografa indique una prueba para Prdida
por Secado, Determinacin de Agua o Prdida por Incineracin,
respectivamente. Cuando la presencia de humedad u otro
material voltil puede interferir con el procedimiento, la mo-
nografa individual especifica que es necesario secar la sus-
tancia con anterioridad, paso que es obligatorio.
La expresin "exenta de disolventes" significa que se de-
ben corregir los clculos por la presencia de disolventes co-
nocidos, segn se determinan usando los mtodos descritos
en Disolventes Residuales (467), a menos que la monografa
proporcione una prueba de lmite de disolventes residuales.
La expresin "previamente secada(o)" sin otro calificativo
si9nifica que la sustancia se debe secar segn se indica en
Perdida por Secado (731) o Determinacin de Agua (921) (de-
terminacin gravimtrica).
Cuando se indique secar al vaco sobre un desecante, se
debe utilizar un desecador al vaco, una pistola para secado
al vaco u otro instrumento apropiado para secado al vaco.
6.40.1 O. Incinerar hasta Peso Constante
"Incinerar hasta peso constante" significa que deber con-
tinuarse la incineracin a 800 25, a menos que se indique
algo diferente, hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
gunda de las cuales se realiza despus de un periodo adicio-
nal acorde con la naturaleza y cantidad del residuo, no difie-
ran en ms de 0,50 mg por g de sustancia tomada.
6.40.20. Secado hasta Peso Constante
"Secado hasta peso constante" significa que deber conti-
nuarse el secado hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
gunda de las cuales se realiza despus de un periodo adicio-
nal de secado acorde con la naturaleza y cantidad del
residuo, no difieran en ms de 0,50 mg por g de sustancia
tomada.
6.50. Preparacin de Soluciones
6.50.10. Filtracin
Cuando en un procedimiento se indica "filtrar" sin otro
calificativo, el lquido se debe pasar a travs de un papel de
filtro adecuado o dispositivo equivalente hasta que el fil-
trado sea transparente. Dados fos posibles efectos del filtro,
se pueden desechar los volmenes iniciales del filtrado.
6.50.20. Soluciones
A menos que se especifique de otro modo, todas las solu-
ciones deben prepararse con Agua Purificada. Las soluciones
para mediciones cuantitativas deben prepararse usando ana-
litos medidos o pesados con exactitud (ver la seccin 8.20,
Aproximadamente).
Una expresin tal como "(l en 1 O)" significa que 1 parte
en volumen de un lquido debe diluirse con, o que 1 parte
en peso de un slido debe disolverse en, una cantidad sufi-
ciente de diluyente o disolvente para que el volumen de la
solucin final sea de 1 O partes medidas en volumen. Expre-
siones similares a "(20:5:2)" significan que los nmeros res-
pectivos de partes, medidas en volumen, de los lquidos se-
alados deben mezclarse, a menos que se indique algo
diferente.
6.50.20.1. Ajuste de Soluciones
Cuando un procedimiento exige una concentracin espe-
cfica, se puede usar una solucin con otra normalidad o
molaridad, siempre que se tenga en cuenta la diferencia en
la concentracin y no se aumente el error de la medicin.
En las pruebas y valoraciones se pueden tomar cantidades
proporcionalmente mayores o menores que los especificados
de las sustancias a analizar y los correspondientes Estndares
de Referencia, siempre y cuando las mediciones resulten con
una exactitud equivalente o mejor.
A menos que se indique algo diferente, las concentracio-
nes de analitos deben prepararse de modo que queden den-
tro del diez por ciento (10%) del valor indicado. En el caso
USP 39
"'.a.usm de que un procedimiento se adapte al intervalo de
trabajo de un instrumento, las concentraciones de las solu-
ciones pueden diferir del valor indicado en ms de diez por
ciento (10%), realizando los cambios apropiados en los cl-
culos asociados. Todo cambio realizado debe quedar dentro
del intervalo validado del instrumento.
Cuando se indica el ajuste del pH mediante un cido o
base y no se indica la concentracin, se pueden usar con-
centraciones apropiadas de dicho cido o base.
6.50.20.2. Soluciones Reactivo
La informacin acerca de las Soluciones Reactivo (SR) se
encuentra en el apartado Soluciones Reactivo en la seccin
Reactivos, Indicadores y Soluciones de los compendios
USP-NF. El uso de una Solucin Reactivo alternativa o cam-
bios en la Solucin Reactivo utilizada puede requerir de
validacin.
6.50.20.3. Soluciones Indicadoras
Cuando se especifica el uso de una SR indicadora en un
procedimiento, se deben agregar aproximadamente 0,2 mL
3 gotas de dicha solucin, a menos que se indique algo
diferente.
6.60. Unidades Necesarias para Completar una Prueba
A menos que se especifique algo diferente, se debe tomar
un nmero suficiente de unidades para asegurar un resul-
tado analtico adecuado.
6.60.1 O. Tabletas
Cuando en el procedimiento de una monografa de Table-
tas se indica pesar y reducir a polvo fino no menos de un
cierto nmero de Tabletas, se entiende que se debe pesar y
reducir a polvo un nmero contado de Tabletas. La porcin
tomada de Tabletas reducidas a polvo debe ser representa-
tiva del total de Tabletas y pesada con exactitud.
6.60.20. Cpsulas
Cuando en el procedimiento de una monografa de Cp-
sulas se indique vaciar, tan completamente como sea posi-
ble, el contenido de no menos de cierto nmero de Cpsu-
las, se entiende que se debe abrir cuidadosamente un
nmero contado de Cpsulas y se debe retirar cuantitativa-
mente, combinar, mezclar y pesar con exactitud el conte-
nido de las mismas. La porcin tomada del contenido de las
Cpsulas debe ser representativo del contenido total de las
Cpsulas y pesado con exactitud.
6.70. Reactivos
La ejecucin adecuada de las pruebas y valoraciones far-
macopeicas y la confiabilidad de los resultados dependen,
en parte, de la calidad de los reactivos utilizados en estos
procedimientos. A menos que se especifique algo diferente,
se deben usar reactivos que cumplan con lo establecido en
las especificaciones de la edicin vigente de Reagent Chemi-
cals publicada por la American Chemical Society (ACS).
Cuando tales especificaciones no existan o cuando por dis-
tintas razones la pureza requerida de un reactivo fuera dife-
rente, se suministran especificaciones farmacopeicas de reac-
tivos de calidad aceptable (ver la seccin Reactivos,
Indicadores y Soluciones en USP-NF). Los reactivos no trata-
dos por ninguna de estas especificaciones deben ser de
grado adecuado para la realizacin del mtodo de valora-
cin o prueba en cuestin.
La inclusin en los compendios de estos reactivos, indica-
dores y soluciones empleadas como reactivos, no implica
que tales sustancias tengan utilidad teraputica. Cualquier
referencia a la USP o el NF en sus etiquetados debe incluir
tambin el trmino "reactivo" o "grado reactivo". La USP
puede proveer reactivos en caso de que no se encuentren
comercialmente disponibles.
6.80. Equipo
A menos que se indique algo diferente, la especificacin
de un tamao o tipo definido de recipiente o de aparato es
slo una recomendacin. Es posible usar otras dimensiones
o tipos siempre que sean adecuados para el uso pretendido.
6.80.10. Aparatos de Medicin
Cuando se indique el uso de matraces volumtricos u
otros dispositivos para medir, pesar o clasificar en forma
Advertencias Generales 9
exacta, se deben emplear estos equipos u otros que posean,
al menos, una exactitud equivalente.
6.80.10.1. Pipeta
Cuando se especifica el uso de una pipeta, sta se puede
sustituir por una bureta adecuada. Cuando se indica el uso
de una pipeta calibrada "para contener", sta se puede sus-
tituir por un matraz volumtrico adecuado.
6.80.10.2. Proteccin contra la Luz
Cuando se indique el uso de recipientes con proteccin
actnica o resistentes a la luz, se pueden utilizar recipientes
especialmente tratados para proteger el contenido contra la
luz, o recipientes transparentes que se hayan recubierto o
envuelto adecuadamente para volverlos opacos.
6.80.20. Instrumentos
Es posible sustituir el instrumento especificado por otro
instrumento siempre que el instrumento sustituto se base en
los mismos principios fundamentales de operacin y tenga
una sensibilidad y exactitud equivalente o mayor; tales ca-
ractersticas se deben calificar como apropiadas. Si se men-
cionara una marca o un proveedor de un material, un ins-
trumento o una pieza de equipo, o el nombre y la direccin
de un fabricante o distribuidor (por lo general pueden apa-
recer como notas al pie de pgina), esta informacin se
brinda slo por conveniencia y no implica aprobacin, aval
o certificacion.
6.80.20.1. Columnas y Tubos Cromatogrficos
El trmino "dimetro" se refiere al dimetro interno (DI).
6.80.20.2. Otros Tipos de Tubos y Tuberas
El trmino "dimetro" se refiere al dimetro externo (DE).
6.80.20.3. Bao de Vapor
Cuando se indique e uso de un bao de vapor, se usa
vapor vivo fluente u otra fuente de calor regulado a una
temperatura equivalente.
6.80.20.4. Bao de Agua
A menos que se especifique algo diferente, un bao de
agua requiere agua en ebullicin vigorosa.
6.80.30. Dispositivos de Medicin de Temperatura
Los dispositivos de medicin de temperatura adecuados
para las pruebas Farmacopeicas cumplen con especificacio-
nes que son rastreables a un estndar del National lnstitue
of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas
y Tecnologa de los EE.UU. o NIST) o equivalente. Los dispo-
sitivos de medicin de temperatura pueden ser del tipo li-
quido en vidrio o un tipo de indicador de temperatura an-
logo o digital, tal como un dispositivo de temperatura con
resistencia, termistor o termopar. La estandarizacin de ter-
mmetros se lleva a cabo en una frecuencia de anlisis esta-
blecida con una temperatura estndar rastreable al NIST.
Por ejemplo, se puede consultar la edicin vigente de las
normas El de la American Society of Testing of Materials
(Sociedad Estadounidense para el Anlisis de Materiales o
ASTM) para termmetros de lquido en vidrio.
7. RESULTADOS DE PRUEBAS
7.10. Interpretacin de los Requisitos
Los resultados analticos observados en el laboratorio (o
los calculados a travs de determinaciones experimentales)
se comparan con los criterios de aceptacin especificados
para determinar si el artculo cumple con los requisitos
farmacopeicos.
El valor de informe, que por lo general se obtiene combi-
nando valores de varias determinaciones individuales, se
compara con los criterios de aceptacin. El valor de informe
es el resultado final de un procedimiento completo de medi-
cin, segn se ha documentado.
Cuando los criterios de aceptacin se expresan de forma
numrica en estas Advertencias Generales mediante la espe-
cificacin de un lmite superior y/o inferior, los valores per-
mitidos incluyen a los valores especificados, pero no los va-
lores fuera del lmite o lmites. Los criterios de aceptacin se
consideran significativos hasta el ltimo dgito sealado.
1 O Advertencias Generales
7.10.5. Concentraciones Nominales en Ecuaciones
Cuando se especifica una "concentracin nominal", calcu-
lar la concentracin basndose en la cantidad declarada en
la etiqueta. En los procedimientos de valoracin, la correc-
cin por contenido de agua tpicamente se indica en la De-
finicin y en la etiqueta del Estndar de Referencia USP. Para
otros procedimientos, la correccin por contenido y/o po-
tencia valorados se realiza antes de usar la concentracion en
la ecuacin provista en la monografa.
7.10.10. Equivalencia en Procedimientos Volumtricos
Las instrucciones de los procedimientos volumtricos con-
cluyen con una declaracin de equivalencia entre el peso
del analito y cada mL de solucin volumtrica normalizada.
En tales equivalencias, se entender que el nmero de cifras
significativas en la concentracin de la solucin volumtrica
corresponde al del nmero de cifras significativas en el peso
del analito. Siempre que corresponda, se deben hacer co-
rrecciones en todas las valoraciones volumtricas basndose
en la determinacin con un blanco (ver Volumetra (541 )).
7.20. Reglas para Redondeo
Los valores observados o calculados deben redondearse al
mismo nmero de decimales que el expresado para el l-
mite. No deber efectuarse el redondeo antes de concluir
los clculos correspondientes para obtener el valor de in-
forme. Los clculos intermedios (p.ej., la pendiente de la
curva de linealidad) pueden redondearse para propsitos de
informe, pero si se requiere realizar clculos adicionales se
deben utilizar los valores originales sin redondear. Los crite-
rios de aceptacin son nmeros fijos y no se redondean.
Cuando se requiere redondear una cifra, se considera so-
lamente el dgito que se encuentra a la derecha del ltimo
lugar decimal en la expresin del lmite. Si este dgito es
menor de 5, se elimina sin cambiar el dgito que lo precede.
Si este dgito es igual o mayor a 5, se elimina y el d1gito
que lo precede se aumenta en 1 .
Cambio en la redaccin:
8. TRMINOS Y DEFINICIONES
8.1 O. Abreviaturas
ER corresponde a un Estndar de Referencia USP.
SC corresponde a una Solucin Colorimtrica.
SR corresponde a una Solucin Reactivo.
SV corresponde a una Solucin Volumtrica estandari-
zada de conformidad con las instrucciones provistas en
la monografa individual o en la seccin Reactivos, Indi-
cadores y Soluciones de USP-NF.
8.20. Aproximadamente
El trmino "aproximadamente" indica una cantidad que
puede variar dentro del 1 0%.
Si se especifica una medicin como "medida con exacti-
tud" o "pesada con exactitud" se deben seguir las especifi-
Ejemplos de Redondeo de Valores Numricos
oara Comnaracin con los Reouisitos
Reouisito Farmacooeico Valor Sin Redondear
Lmite de valoracin 298,0% 97,96%
97,92%
97 95%
Lmite de valoracin Sl 01,5% 101,55%
101,46%
10145%
Prueba de lmite S0,02% 0,025%
0,015%
o 027%
Prueba de lmite S3 ppm 3,5 ppm
3,4 ppm
2,5 ppm
USP 39
caciones de los captulos generales Aparatos Volumtricos
(31) y Balanzas (41 ), respectivamente.
8.30. Contenido de Alcohol
Los porcentajes de alcohol, como los indicados en Conte-
nido de Alcohol, son porcentajes en volumen de C2HsOH a
15,56. Cuando se exige el uso de alcohol, alcohol etlico o
etanol en una frmula, prueba o valoracin, se debe usar el
artculo de la monograf1a Alcohol de la USP. Cuando se hace
referencia a "C2HsOH", significa etanol absoluto (100 por
ciento). Cuando un procedimiento exige alcohol deshidra-
tado, alcohol absoluto o alcohol anhidro, se debe usar el
artculo de la monografa Alcohol Deshidratado de la USP.
8.40. Pesos Atmicos
Los pesos atmicos usados para calcular pesos molecu-
lares y los factores en las valoraciones y en otras partes
donde stos aparezcan, son los establecidos por la Commis-
sion on Atomic Weights and lsotopic Abundances de la IU-
PAC (Comisin de Pesos Atmicos y Abundancias Isotpicas
de la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada).
8.50. Determinaciones con Blancos
Cuando se indique realizar "cualquier correccin necesa-
ria" por medio de una determinacion con un blanco, tal
determinacin debe efectuarse usando las mismas cantida-
des de los mismos reactivos tratados de la misma manera
que la solucin o mezcla que contiene la porcin de sustan-
cia en anlisis, pero omitiendo dicha sustancia.
8.60. Concomitantemente
El trmino "concomitantemente" indica que las determi-
naciones o mediciones deben efectuarse en sucesin
inmediata.
8.70. Desecador
La instruccin "en un desecador" indica el uso de un reci-
piente cerrado hermticamente, de tamao y diseo ade-
cuados, que mantiene una atmsfera de bajo contenido de
humedad mediante un desecante adecuado, por ejemplo,
cloruro de calcio anhidro, perclorato de magnesio, pent-
xido de fsforo o gel de slice. Ver tambin la seccion 8.220,
Desecador al Vaco.
8.80. Logaritmos
Los logaritmos empleados son logaritmos en base 1 O.
8.90. Cepas Microbianas
Cuando se cita e identifica una cepa microbiana por el
nmero de catlogo de la American Type Culture Collection
(Coleccin Estadounidense de Cultivos de Referencia o
ATCC), la cepa especfica debe emplearse directamente o, si
se hacen cultivos sucesivos, no deben usarse ms de cinco
pasajes a partir de la cepa original.
8.100. Inapreciable
El trmino "inapreciable" indica una cantidad que no ex-
cede de 0,50 mg.
8.110. No menos de (NLT) y No ms de (NMT)
Las siglas en ingls "NLT" (not less than) significan y se
traducen como "no menos de". Las siglas en ingls "NMT"
Resultado Redondeado Cumnle
98,0% S
97,9% No
98 0% S
101,6% No
101,5% S
101 5% S
0,03% No
0,02% S
003% No
4 ppm No
3 ppm S
3 ppm S
USP 39 Advertencias Generales 11

(not more than) significan y se traducen como "no ms

de".
8.120. Olor
Los trminos "inodoro," "prcticamente inodoro," "con
un dbil olor caracterstico" y expresiones semejantes, indi-
can la evaluacin de una cantidad adecuada de material re-
cientemente abierto despus de la exposicin al aire durante
15 minutos. La asignacion de un olor es slo descriptiva y
no deber considerarse como una norma de pureza para un
lote particular de un artculo.
8.130. Por ciento
La expresin "por ciento" usada sin otros calificativos
significa:
Porc.e~t.aje peso en peso, para mezclas de slidos y
sem1sohdos;
Porcentaje peso en volumen, para soluciones o suspen-
siones de slidos en lquidos;
Porcentaje volumen en volumen, para soluciones de l-
quidos en lquidos; y . esos y e 1 as
Porcentaje peso en volumen, para soluciones de gases En general, se emplea el Sistema Internacional de Unida-
en lquidos. des (SI) para pesos y medidas, de acuerdo con lo estable-
Por ejemplo, una solucin al 1 por ciento se prepara disol- cido y revisado por la Confrence gnrale des poids et mesu-
viendo 1 g de un slido o semislido, o 1 mL de un lquido, res (Conferencia General de Pesos y Medidas). A los fines de
en disolvente suficiente para obtener 100 mL de solucin. los compendios, el trmino "peso' se considera como sin-
8.140. Concentraciones Porcentuales nimo de "masa".
Las concentraciones porcentuales se expresan segn se in- La molalidad se representa por medio del smbolo m pre-
dica a continuacin: cedido por un nmero que es el nmero de moles de soluto
Porcentaje Peso en Peso (p/p) se define como el nmero contenidos en 1 kilogramo de disolvente.
de g de un soluto en 100 g de solucin. La molaridad se representa por medio del smbolo M pre-
Porcentaje Peso en Volumen (p/v) se define como el n- cedido por un nmero que es el nmero de moles de soluto
mero de g de un soluto en 100 mL de solucin. contenidos en una cantidad de disolvente suficiente para
Porcentaje Volumen en Volumen (v/v) se define como el preparar 1 litro de solucin.
nmero de mL de un soluto en 100 mL de solucin. La normalidad se representa por medio del smbolo N
precedido por un nmero que es el nmero de equivalentes
8.150. Presin de soluto contenidos en una cantidad de disolvente sufi-
La presin se determina usando un manmetro o bar- ciente a a re arar 1 litro d solucin
n:etro adecuado, calibrado en trminos de la presin ejer-
cida por una columna de mercurio de la altura indicada.
8.160. Tiempo de Reaccin
El tiempo de reaccin es de 5 minutos a menos que se
especifique algo diferente.
8.170. Peso Especfico Unidades Smbolo Comentarios
El P.e~o. especfico es el peso de una sustancia en aire a Lonnitud
2~ d1v1d1do por el peso de un volumen igual de agua a la
metro m
misma temperatura.
centmetro cm
8.180. Temperaturas
A menos que se indique algo diferente, las temperaturas milmetro mm
se expresan en grados centgrados (Celsius) y todas las me- Anteriormente referido
diciones se hacen a 25. Cuando se especifica calor mode- micrmetro 11m como micrn
rado, se indica toda temperatura no mayor de 45 (113 F). Anteriormente se usaba
8.190. Tiempo el smbolo m (para
A menos que se especifique algo diferente, las reglas para nanmetro nm milimicrn)
redondeo, segn se describen en la seccin 7.20, Reglas nastrim lnual a O 1 nm
para Redondeo, se aplican a todos los tiempos especificados. Masa
8.200. Transferir kiloaramo ka
El t~r~ino "transferir" indica una manipulacin aramo a
cuant1tat1va. miliaramo ma
8.210. Vaco El smbolo g se usa en
El trmino "al vaco" especifica la exposicin a una pre- la USP y el NF para re-
sin menor de 20 mm de mercurio (2,67 kPas), a menos presentar microgra-
que se indique algo diferente. mos, pero los
8.220. Desecador al Vaco microgramos se pue-
Un "desecador al vaco" es un desecador gue mantiene den representar como
una atmsfera de baja humedad a una presion reducida de "mcg" para propsi-
no ms de 20 mm de mercurio (2,67 kPas) o a la presin tos de etiquetado y
indicada en la monografa individual. prescripcin. El trmi-
8.230. Agua no "gamma", simboli-
8.230.10. Agua como Ingrediente de un Producto Oficial zado por la letra
Cuando aparece como un ingrediente en un producto ofi- griega y, se usa con
cial, el agua cumple con los requisitos de la monografa de frecuencia para desig-
agua adecuada en la USP o el NF. nar al microgramo en
microgra- la literatura de bioqu-
mo ua mica.
12 Advertencias Generales USP 39

Unidades Smbolo Comentarlos Unidades Smbolo Comentarlos

nanoaramo na voltio V
oicoaramo milivoltio mV
Tambin referido como hercio Hz Unidad de frecuencia
la unidad de masa kilohercio kHz
atmica unificada y es meaahercio MHz
igual a 1 /12 veces la
electronvol-
masa de un tomo no
tio eV
enlazado de carbono-
dalton Da 12. kiloelec-
tronvoltio keV
kilodalton kDa
megaelec-
Tiemoo
tronvoltio MeV
seaundo s
Radiacin
minuto min
Unidad del SI para la
hora h actividad de radionu-
Volumen becnuerelio Ba cleidos
1 L es igual a 1000 kilobecque-
cm 3 (centmetros c- relio kBn
litro L bicos). megabec-
decilitro dL auerelio MBa
1 ml es igual a 1 cm 3, gigabec-
en ocasiones se deno- auerelio GBa
mililitro ml mina ce. Unidad para la activi-
microlitro uL dad de radionucleidos
Tempera- que no forma parte
tura curio Ci del SI.
Celsius C milicurio mCi
Cantidad microcurio uCi
de Sus- nanocurio nCi
tanda Otros
Histricamente referido aceleracin
como peso molecular debida a Usada para expresar la
en gramos o peso la grave- velocidad de centrifu-
mol mol atmico en aramos dad al.!'"111 aacin.
milimol mmol revolucio- Usada para expresar la
micromol u mol nes por velocidad de centrifu-
femtomol fmol minuto rom aacin.
Tambin referido como
peso equivalente en
gramos. Se usa en el Prefl)os Seleccionados del SI
clculo de concentra-
Nombre Smbolo Factor
cin de sustancia en
unidades de normali- nina G 109
dad. Esta unidad ac- mena M 106
tualmente ya no kilo k 10 3
representa la de uso deci d 10-1
preferido en qumica centi e 10-2
eauivalente Ea analtica o metroloaa. 10-3
mili m
mili- 10_,;
micro u
equivalen-
nano n 1 o-
te mEa
oico D 10-12
Presin osmtica de
una solucin, relacio- femto f 10-15
nada con la concen-
tracin de una
os mol Osmol sustancia
miliosmol mOsmol
Presin 9. PRESCRIPCIN Y DISPENSACIN
oascal Pa 9.1 O Uso de Unidades Mtricas
kilooascal kPa Las prescripciones de artculos farmacopeicos se escribirn
libras por usando unidades mtricas para indicar la cantidad y/o con-
pulgada tenido deseados, a menos que se indique algo diferente en
cuadrada osi la monografa individual (ver tambin la seccin 5.50. 7O,
milmetro Unidades de Potencia [Biolgica]). Si la prescripcin de una
de mer- cantidad se hace en otro sistema de medidas, se debe dis-
curio mmHn lnual a 133 322 Pa pensar slo una can crita usando
Unidades
el ema m
elctricas
amoerio A
USP 39 Advertencias Generales 13

9.20 Cambios en Volumen 10.10. Envasado y Almacenamiento

En la dispensacin de medicaciones prescritas, pueden ob-
viarse los pequeos cambios de volumen que se producen
debido a variaciones en la temperatura ambiente.
Cambio en la redaccin:
10. CONSERVACIN, ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y
ETIQUETADO
.11.vSP39
Todos los artculos en los compendios USP o NF estn
sujetos a los requisitos de envasado y almacenamiento espe-
cificados en el captulo general Requisitos de Envasado y Al-
macenamiento (659), a menos que se provean requisitos dis-
tintos en una monografa "'individual..,usp39.
"'10.20. Etiquetado
Todos los artfcul()s en la .USP o el NF estn sujetos a los
requisitos de etiquetado especificados en el capitul <7), a
menos que se provean requisitos diferentes en una mono-
grafa inaividual...,usP39
USP 39 Gua de los Captulos Generales / Diagrama de Captulos 15

Diagrama de Captulos
Gua de Diagramas-Captulos Generales USP 1
Artculos Oficiales
Frmacos Activos No Complejos-Pruebas Universales: Ver Diagrama 7a
Frmacos Activos No Complejos-Pruebas Especficas: Ver Diagrama 7b
Frmacos Biolgicos de Origen Natural y Recombinante: Ver Diagrama 2
Excipientes-Pruebas Universales: Ver Diagrama 3a
Excipientes-Pruebas Especficas: Ver Diagrama 3b
Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Universales: Ver Diagrama 4a
Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Especficas: Ver Diagrama 4b
Medicamentos Biolgicos de Origen Natural y Recombinante: Ver Diagrama 5
Vacunas: Ver Diagrama 6
Sangre y Hemoderivados: Ver Diagrama 7
Productos Derivados de Clulas, Genes y Tejidos: Ver Diagrama 8
Ingredientes de Suplementos Dietticos: Ver Diagrama 7 7
Productos de Suplementos Dietticos: Ver Diagrama 72
Preparacin Magistral-Sustancia/Preparacin/Dispensacin: Ver Diagrama 73
Dispositivos Mdicos
(691) Algodn
(861) Suturas-Dimetro
(871) Suturas-Sujecin de Agujas
Generalmente Aplicables
Elementos Bsicos
(1058) Calificacin de Instrumentos Analticos
(1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel
(1151) Formas Farmacuticas
(1196) Armonizacin Farmacopeica
(1224) Transferencia de Procedimientos Analticos
(1225) Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
(1226) Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos
Distribucin de Medicamentos: Ver Diagrama 9
Microbiologa-Productos No Estriles: Ver Diagrama 7Oa
Microbiologa-Productos Estriles: Ver Diagrama 7Ob

1 Esta tabla y los Diagramas 1-13 que se presentan a continuacin tienen la finalidad de ser una gua de los captulos en esta publicacin. Es probable que no
incluyan la informacin completa y no pretenden cumplir con las expectativas de los artculos o limitar la aplicacin de las pruebas a cualquier artculo en los
compendios USP-NF.

Diagrama la. Frmacos Activos No Complejos-Pruebas Universales

Impurezas
Identifica- Disolventes
Captulo Descripcin cln Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(7) Etiquetado

(11) Estndares de Referencia USP

(81) Antibiticos-Valoraciones Microbio-
lqicas
(181) Identificacin-Bases Orgnicas Ni-
trogenadas
(191) Identificacin-Pruebas Generales

(193) ldentificacin-Tetraciclinas
(19 7) Pruebas de Identificacin Espectrofo-

tomtrica
(201) Prueba de Identificacin por Croma-
tografa en Capa Delgada
(202) Identificacin de Aceites Fijos por
Cromatografa en Capa Delgada
1 6 Diagrama de Captulos J Gua de los Captulos Generales USP 39

Diaqrama la. Frmacos Activos No Compleios-Pruebas Universales (Continuacin)

Impurezas
Identifica- Disolventes
Captulo Descripcin cin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(203) Procedimiento de Cromatografa en
Capa Delgada de Alta Resolucin para
Identificacin de Artculos de Origen Bot-
nico
(206) Aluminio

(211) Arsnico

(221) Cloruros y Sulfatos

(223) Dimetilanilina

(2 31 ) Metales Pesados

(232) Impurezas Elementales-Lmites

(233) Impurezas Elementales-Procedi-
mientos
(241) Hierro

(251) Plomo

(261) Mercurio

(281) Residuo de Incineracin

(291) Selenio

(351) Valoracin de Esteroides

(391) Valoracin de Epinefrina

(401) Grasas y Aceites Fijos
(425) Antibiticos-Va/oracin Yodomtri-

ca
(451) Volumetra con Nitrito

(461) Determinacin de Nitrgeno

(466) Impurezas Comunes

(467) Disolventes Residuales

(471) Combustin en Matraz con Oxgeno

(511) Valoracin de un Esteroide Aislado

(541) Volumetra

(621) Cromatografa

(659) Requisitos de Envasado y Almacena-
miento
(730) Espectroqumica de Plasma

(731) Prdida por Secado

(733) Prdida por Incineracin
(735) Espectrometra de Fluorescencia de

Rayos X
(736) Espectrometra de Masas

(761) Espectroscopa de Resonancia Mag-
ntica Nuclear
(781) Rotacin ptica

(801) Po/orografa

(852) Espectroscopa de Absorcin Atmica

(853) Espectroscopa de Fluorescencia

(854) Espectroscopa en el Infrarrojo Medio

(855) Nefelometra, Turbidimetra y Com-
paracin Visual
(85 7) Espectroscopa Ultravioleta-Visible

(941 ) Caracterizacin de Slidos Cristali-
nos y Parcialmente Cristalinos por Difrac-
cin de Rayos X sobre Polvo (DRXP)

USP 39 Gua de los Captulos Generales / Diagrama de Captulos 1 7

Diagrama la. Frmacos Activos No Complejos-Pruebas Universales (Continuacin)

Impurezas
Identifica- Disolventes
Captulo Descripcin cin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(1064) Identificacin de Artculos de Or-
gen Botnico por Cromatografa en Capa
Delgada de Alta Resolucin

(1086) Impurezas en Frmacos y Produc-
tos Farmacuticos
(1119) Espectroscopa en el Infrarrojo Cer-
cano
(1120) Espectroscopa Raman
(1223.1) Validacin de Mtodos Alternati-

vos para Valoraciones Microbiolgicas de
Antibiticos

(1730) Espectroqumica de Plasma-Tea-
ra y Prctica
(1735) Espectrometra de Fluorescencia de
Rayos X-Teora y Prctica
(1736) Aplicaciones de la Espectrometra
de Masas
(1 761 ) Aplicaciones de la Espectroscopa
de Resonancia Magntica Nuclear
(1852) Espectroscopa de Absorcin Atmi-
ca-Teora y Prctica
(1853) Espectroscopa de Fluorescencia-
Teora y Prctica
(1854) Espectroscopa en el Infrarrojo Me-
dio-Teora y Prctica
(1857) Espectroscopa Ultravioleta-Visi-
ble-Teora y Prctica
Diagrama 1 b. Frmacos Activos No Complejos-Pruebas Especficas
Caracterizacin Contenido
Captulo Fisicoqumica Equipamiento de Agua
(31) Aparatos Volumtricos

(41) Balanzas

(268) Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de
Nitrgeno
(301) Capacidad Neutralizan te de cido

(429) Medicin del Tamao de Partcula por Di-
fraccin de Luz
(541) Volumetra
(616) Densidad Aparente y Densidad por Asenta-

miento de los Polvos
(631) Color y Acromatismo

( 641 ) Totalidad de la Disolucin

( 651 ) Temperatura de Solidificacin

(695) Cristalinidad

(699) Densidad de Slidos

(721) Intervalo de Destilacin
(731) Prdida por Secado

(735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X

(741) Intervalo o Temperatura de Fusin

(761) Espectroscopia de Resonancia Magntica
Nuclear
(776) Microscopa ptica

(781) Rotacin ptica

(785) Osmolalidad y Osmolaridad

18 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 1 b. Frmacos Activos No Complejos-Pruebas Especficas (Continuacin)

Caracterizacin Contenido
Captulo Fisicoqumica Equipamiento de Agua
(786) Estimacin de la Distribucin del Tamao de
Partcula por Tamizado Analtico
(791) pH

(811) Finura de Polvos

(821) Radioactividad

(831) ndice de Refraccin

(841) Peso Especfico

(846) rea Superficial Especfica

(881 ) Resistencia a la Tensin

(891) Anlisis Trmico
(911) Viscosidad-Mtodos Capilares

(912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios

(913) Viscosidad-Mtodo de Bola Rodante

(9 21 ) Determinacin de Agua
(941) Caracterizacin de Slidos Cristalinos y Par-
ca/mente Cristalinos por Difraccin de Rayos X
sobre Polvo (DRXP)

(1051) Limpieza de Material de Vidrio

(1119) Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano

(1120) Espectroscopia Raman

(11 71) Anlisis por Solubilidad de Fases

(1251) Pesada en una Balanza Analtica

(1730) Espectroqumica de Plasma-Teora y Prc-
tica
(1735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos
X-Teora y Prctica
(1761) Aplicaciones de fa Espectroscopia de Reso-
nancia Magntica Nuclear
(1911) Reometra

Diagrama 2. Frmacos Biolgicos de Origen Natural y Recombinante
Equi- Impurezas
Id en ti- pa- Relaciona- Relaciona- Carac-
Descrlp- fica- Seguri- Valora- Flslco- mlen- das con el das con el teriza-
Captulo cin cin dad cin qumica to Proceso Producto cln
( 7) Etiquetado

(11) Estndares de Referencia
USP
(31) Aparatos Volumtricos

(41 ) Balanzas
(61) Examen Microbiolgico de
Productos No Estriles: Pruebas
de Recuento Microbiano

(62) Examen Microbiolgico de
Productos No Estriles: Pruebas
de Microorganismos Especficos

(63) Pruebas para Micoplasmas

(71) Pruebas de Esterilidad

(81) Antibiticos-Va/oraciones
Microbiolgicas
(85) Prueba de Endotoxinas Bac-
terianas
(8 7) Pruebas de Reactividad Bio-
lgica, In Vitro
(88) Pruebas de Reactividad Bio-
lgica, In Vivo
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 19

Dia!Jrama 2. Frmacos Biolgicos de Origen Natural y Recombinante (Continuacin)

Equi- Impurezas
ldenti- pa- Relaciona- Relaciona- Carac-
Descrlp- fica- Seguri- Valora- Fsico- mien- das con el das con el teriza-
Captulo cin cin dad cin qumica to Proceso Producto cin
(111) Diseo y Anlisis de Va/o-
raciones Biolgicas
(121) Valoracin de Insulina
(121.1) Procedimientos Analti-

cos Fisicoqumicos para lnsu/i-
nas

(126) Pruebas de Identidad Bio-
lqica de Somatropina
(129) Procedimientos Analticos
para Anticuerpos Monoclonales
Recombinantes de Uso Tero-
putico
(191) Identificacin-Pruebas
Generales
(197) Pruebas de Identificacin
Espectrofotomtricas
(208) Valoracin de Anti-Factor
Xa y Anti-Factor /la para Hepa-
rinas No Fraccionadas y Hepari-
nas de Bajo Peso Molecular
(209) Determinaciones de Peso
Molecular de Heparinas de Bajo
Peso Molecular

(212) Anlisis de Oligosacridos

(231) Metales Pesados

(232) Impurezas Elementales-
Lmites
(233) Impurezas Elementales-
Procedimientos
(467) Disolventes Residuales

(503) cido Actico en Pptidos

(503.1) cido Trifluoroactico en
Pptidos
(541) Volumetra

(621) Cromatografa

(631) Color y Acromatismo

(695) Cristalinidad

(730) Espectroqumica de Plas-
ma
(731) Prdida por Secado

(736) Espectrometra de Masas

(761) Espectroscopa de Reso-
nancia Magntica Nuclear
(781) Rotacin ptica

(786) Estimacin de la Distribu-
cin del Tamao de Partcula
por Tamizado Analtico

(831) ndice de Refraccin

(852) Espectroscopa de Absor-
cin Atmica
(853) Espectroscopa de Fluores-
cencia
(854) Espectroscopa en el lnfra-
rrojo Medio
20 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

o1a!lrama 2 f'armacos B10 I' .

og1cos de o.rigen Natura ., )
y Recom bl nante (Continuacion

Equl- Impurezas
ldentl- pa- Relaciona- Relaciona- Carac-
Descrlp- fica- Segurl- Valora- Flslco- mien- das con el das con el teriza-
Captulo cln cin dad cln qumica to Proceso Producto cin
(855) Nefelometra, Turbidime-
tra y Comparacin Visual
(857) Espectroscopa Ultraviole-
ta-Visible
(921) Determinacin de Agua

(1025) Pancreatina
(1030) Captulos de Va/oracio-

nes Biolgicas-Informacin
General y Glosario

(1032) Diseo y Desarrollo de
Va/oraciones Biolgicas
(1033) Validacin de Valorado-
nes Biolgicas
(1034) Anlisis de Valoraciones
Biolgicas
(1041) Productos Biolgicos
(1044) Crioconservacin de C-

lulas
(1048) Calidad de Productos
Biotecnolgicos: Anlisis de la
Construccin Expresable en C-
lulas Usadas para la Produccin
de Productos Protenicos Obte-
nidos con ADN Recombinante
(1052) Artculos Obtenidos por
Biotecnologa-Anlisis de Ami-
nocidos

(1053) Electroforesis Capilar

(1054) Artculos Obtenidos por
Biotecnologa-lsoelectroenfo-
que

(1055) Artculos Obtenidos por
Biotecnologa-Mapeo de Pp-
ti dos

(1056) Artculos Obtenidos por
Biotecnologa-Electroforesis en
Gel de Poliacrilamida

(1057) Artculos Obtenidos por
Biotecnologa-Valoracin de
Protenas Totales

(1065) Cromatografa Jnica

(1084) Anlisis de Glicoprotenas
y Glicanos-Consideraciones
Generales

(1102) Mtodos de Pruebas In-
munolgicas-Consideraciones
Generales

(1103) Mtodos de Pruebas In-
munolgicas-Ensayo por In-
munoadsorcin Ligado a Enzi-
mas (ELISA)
(1104) Mtodos de Pruebas In-
munolgicas-Anlisis por In-
munotransferencia

(1105) Mtodos de Pruebas In-
munolgicas-Resonancia de
Plasmn Superficial

USP 39 Gua de los Captulos Generales / Diagrama de Captulos 21

Diagrama 2. Frmacos Biolgicos de Origen Natural y Recombinante (Continuacin)

Equi- Impurezas
ldenti- pa- Relaciona- Relaciona- Carac-
Descrip- fica- Seguri- Valora- Fisico- mlen- das con el das con el teriza-
Captulo cin cln dad cln qumica to Proceso Producto cln
(1113) Caracterizacin, ldentifi-
cacin y Tipificacin de Cepas
Microbianas

(1121) Nomenclatura

(1125) Tcnicas Basadas en ci-
dos Nucleicos-Generalidades
(1126) Tcnicas Basadas en ci-
dos Nucleicos-Extraccin, De-
teccin y Secuenciacin

(1127) Tcnicas Basadas en ci-
dos Nucleicos-Amplificacin
(1128) Tcnicas Basadas en ci-
dos Nucleicos-Micromatrices
(1129) Tcnicas Basadas en ci-
dos Nucleicos-Genotipificacin
(1130) Tcnicas Basadas en ci-
dos Nucleicos-Enfoques para
Detectar Trazas de cidos Nu-
cleicos (Anlisis de ADN Resi-

dual)
(11 32) Medicin de Protena Re-
sidual de Clulas Husped en
Productos Biofarmacuticos

(1180) Plasma Humano

(1181) Microscopa Electrnica
de Barrido
(1211) Esterilizacin y Garanta
de Esterilidad de Artculos Far-
macopeicos

(1229) Esterilizacin de Artculos
Farmacapeicos
(1229.4) Esterilizacin de Lqui-
dos por Filtracin
(1251) Pesada en una Balanza
Analtica
(1736) Aplicaciones de la Espec-
trometra de Masas
(1761) Aplicaciones de la Espec-
troscopa de Resonancia Mag-
ntica Nuclear

(1852) Espectroscopa de Absor-
cin Atmica-Teora y Prctica
(1853) Espectroscopa de Fluo-
rescencia-Teora y Prctica
(1854) Espectroscopa en el In-
frarrojo Medio-Teora y Prcti-
ca

(1857) Espectroscopa Ultraviole-
ta-Visible-Teora y Prctica
Diagrama 3a. Excipientes-Pruebas Universales
Impurezas
Disolventes
Captulo Descripcin Identificacin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(7) Etiquetado
(181) Identificacin-Bases Orgni-

cas Nitrogenadas
22 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

1 1entes-p rue bas

D"1agrama 3a. Exc1p1 u. ., )
mversa es (Contmuac1on
Impurezas
Disolventes
Captulo Descripcin Identificacin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(191) Identificacin-Pruebas Gene-
rafes
(197) Pruebas de Identificacin Es-
pectrofotomtricas
(201) Prueba de Identificacin por
Cromatografa en Capa Delgada
(202) Identificacin de Aceites Fijos
por Cromatografa en Capa Delga-
da

(203) Procedimiento de Cromato-
grafa en Capa Delgada de Alta Re-
solucin para Identificacin de Art-
culos de Origen Botnico
(206) Aluminio
(211 ) Arsnico

(221 ) Cloruros y Sulfatos

(226) 4-Epianhidrotetraciclina

(228) xido de Etileno y Dioxano

(231) Metales Pesados
(232) Impurezas Elementales-Lmi-
tes
(233) Impurezas Elementales-Pro-
cedimientos
(241) Hierro

(251) Plomo
(261) Mercurio

(281) Residuo de Incineracin
(291) Selenio
(311) Valoracin de Alginatos

(345) Valoracin de cido Ctrico/
Citrato y Fosfato
(401) Grasas y Aceites Fijos

(425) Antibiticos-Va/oracin Yo-
domtrica
(431) Determinacin de Grupos Me-
taxi/o
(461) Determinacin de Nitrgeno
(466) Impurezas Comunes
(467) Disolventes Residuales
(469) Etilenglicol, Dietilenglicol y
Trietilenglico/ en Sustancias Etoxila-
das

(471) Combustin en Matraz con
Oxgeno
(541) Volumetra

(621) Cromatografa

(730) Espectroqumica de Plasma
(731) Prdida por Secado

(733) Prdida por Incineracin
(735) Espectrometra de Fluorescen-
ca de Rayos X
(736) Espectrometra de Masas

(781) Rotacin ptica

(801 ) Po/orografa

USP 39 Gua de los Captulos Generales / Diagrama de Captulos 23

Diagrama 3a. Excipientes-Pruebas Universales (Continuacin)

Impurezas
Disolventes
Captulo Descripcin Identificacin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(852) Espectroscopa de Absorcin
Atmica
(853) Espectroscopa de Fluorescen-
cia
(854) Espectroscopa en el Infrarrojo
Medio
(855) Nefelometra, Turbidimetra y
Comparacin Visual
(85 7) Espectroscopa Ultravioleta-Vi-
sible
(941 ) Caracterizacin de Slidos
Cristalinos y Parcialmente Cristali-
nos por Difraccin de Rayos X so-
bre Polvo (DRXP)
(1064) Identificacin de Artculos de
Origen Botnico por Cromatografa
en Capa Delgada de Alta Resolu-
cin
(l 086) Impurezas en Frmacos y
Productos Farmacuticos
(l 091) Etiquetado de Ingredientes
Inactivos
(1119) Espectroscopa en el lnfrarro-
jo Cercano
(1730) Espectroqumica de Plas-
ma-Teora y Prctica
(l 735) Espectrometra de Fluores-
cencia de Rayos X-Teora y Prcti-
ca

(1736) Aplicaciones de la Espectro-
metra de Masas
(1852) Espectroscopa de Absorcin
Atmica-Teora y Prctica
(1853) Espectroscopa de Fluores-
cencia-Teora y Prctica
(1854) Espectroscopa en el lnfrarro-
jo Medio-Teora y Prctica
(1857) Espectroscopa Ultravioleta-
Visible-Teora y Prctica
1 ientes-Pruebas Espec1'fi cas
D agrama 3 b . Exc1p1
Caracterizacin Agua para Uso Funcionalidad/
Captulo Flslcoqumlca Equipamiento Farmacutico1 Seguridad/BPF
(31) Aparatos Volumtricos

(41) Balanzas

(268) Porosidad Mediante
Adsorcin-Desorcin de Ni-
trgeno

(301) Capacidad Neutrali-
zante de cido
(429) Medicin del Tamao
de Partcula por Difraccin
de Luz

(541) Volumetra
(616) Densidad Aparente y

Densidad por Asentamiento
de los Polvos

1 Ver Microbiologa (Diagrama 7O).
24 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 3b. Excipientes-Pruebas Especificas (Continuacion)

Caracterizacin Agua para Uso Funcionalidad/
Captulo Flslcoqumlca Equipamiento Farmacutico 1 Seguridad/BPF
(631) Color y Acromatismo
( 641) Totalidad de la Disolu-

cin
(643) Carbono Orgnico To-
tal
(645) Conductividad del
Agua
( 651 ) Temperatura de Solidi
ficacin
(695) Cristalinidad

(699) Densidad de Slidos

(721) Intervalo de Destilacin

(731) Prdida por Secado
(735) Espectrometra de Fluo-

rescencia de Rayos X
(741) Intervalo o Temperatu-
ro de Fusin
(761) Espectroscopa de Reso-
nancia Magntica Nuclear
(776) Microscopa ptica

(781) Rotacin ptica
(785) Osmolalidad y Osmola-

ridad
(786) Estimacin de la Distri-
bucin del Tamao de Part-
cu/a por Tamizado Analtico

(79l)pH

(811) Finura de Polvos

(821) Radioactividad

(831) ndice de Refraccin

(841 ) Peso Especfico
(846) rea Superficial Espec-

fica
(881) Resistencia a la Tensin

(891) Anlisis Trmico

(911) Viscosidad-Mtodos
Capilar
(912) Viscosidad-Mtodos
Rotatorios
(913) Viscosidad-Mtodo de
Bola Rodante
(921) Determinacin de Agua
(941) Caracterizacin de Sli-

dos Cristalinos y Parcialmen-
te Cristalinos por Difraccin
de Rayos X sobre Polvo

(DRXP)
(1051) Limpieza de Material
de Vidrio
(1059) Desempeo de Exci-
pientes
(1074) Guas para la Evalua-
cin de la Seguridad Biolgi-
ca de los Excipientes

1 Ver Microbiologa (Diagrama 1O).
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 25

Diagrama 3b. Excipientes-Pruebas Especficas (Continuacin)

Caracterizacin Agua para Uso Funcionalidad/
Captulo Fisicoqumlca Equipamiento Farmacutico 1 Seguridad/BPF
(l 078) Buenas Prcticas de
Fabricacin para Excipientes
Farmacuticos a Granel

(1 080) Excipientes Farmacu-
ticos a Granel-Certificado
de Anlisis

(1097) Procedimientos para
el Muestreo de Polvos a Gro-
ne!

(1119) Espectroscopa en el
Infrarrojo Cercano
(1174) Fluidez de Polvos

(1195) Gua sobre Cambios
Significativos en Excipientes
Farmacuticos a Granel

(1197) Procedimientos para
el Muestreo de Polvos a Gro-
ne/

(1230) Agua para Uso en He-
modilisis
(1231) Agua para Uso Far-
macutico
(1251) Pesada en una Balan-
za Analtica
(1644) Teora y Prctica de
Mediciones de Conductivi-
dad Elctrica de Soluciones

(1730) Espectroqumica de
Plasma-Teora y Prctica
(1735) Espectrometra de
Fluorescencia de Rayos X-
Teora y Prctica

(1761) Aplicaciones de la Es-
pectroscopa de Resonancia
Magntica Nuclear

(1911) Reometra
1 Ver Microbiologa (Diagrama 1O).

Diagrama 4a. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Universales
Impurezas
Disolventes
Captulo Descripcin Identificacin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(7) Etiquetado

(81) Antibiticos-Valoraciones
Microbiolgicas
(191) Identificacin-Pruebas
Generales
(19 7) Pruebas de Identificacin
Espectrofotomtricas
(201) Prueba de Identificacin
por Cromatografa en Capa
Delgada

(202) Identificacin de Aceites Fi-
jos por Cromatografa en Capa
Delgada

(203) Procedimiento de Croma-
tografa en Capa Delgada de
Alta Resolucin para Identifica-
cin de Artculos de Origen Bo-

tnico
26 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

D"1agrama 4 a. M e d'1camentos Act1vos

. e1os-p rue b as umversa
No Comp1. . ., )
es (C ontinuaoon
Impurezas
Disolventes
Captulo Descripcin Identificacin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(227) 4-Aminofenol en Medica-
mentos que Contienen Acetami-
nofeno

(232) Impurezas Elementales-
Lmites
(233) Impurezas Elementales-
Procedimientos
(281) Residuo de Incineracin

(341) Agentes Antimicrobia-
nos-Contenido
(351) Valoracin de Esteroides

(391) Valoracin de Epinefrina

(413) Anlisis de Impurezas en
Gases Medicina/es
(415) Valoracin de Gases Med-
cinales
(451) Volumetra con Nitrito
(461) Determinacin de Nitrge-

no
(466) Impurezas Comunes

(467) Disolventes Residuales
(501) Sales de Bases Orgnicas

Nitrogenadas
(541) Volumetra

( 611 ) Determinacin de Alcohol

(621) Cromatografa

(730) Espectroqumica de Plas-
ma
(733) Prdida por Incineracin

(735) Espectrometra de Fluores-
cencia de Rayos X
(736) Espectrometra de Masas

(781) Rotacin ptica

(801) Po/orografa
(852) Espectroscopa de Absor-

cin Atmica
(853) Espectroscopa de Fluores-
cencia
(854) Espectroscopa en el lnfra-
rrojo Medio
(855) Nefelometra, Turbidime-
tra y Comparacin Visual
(857) Espectroscopa Ultraviole-
ta-Visible
(1064) Identificacin de Artculos
de Origen Botnico por Croma-
tografa en Capa Delgada de
Alta Resolucin
(1065) Cromatografa Jnica
(1086) Impurezas en Frmacos y

Productos Farmacuticos
(1121) Nomenclatura

(1223.1) Validacin de Mtodos
Alternativos para Va/oraciones
Microbiolgicas de Antibiticos

USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 27

Diagrama 4a. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Universales (Continuacin)

Impurezas
Disolventes
Captulo Descripcin Identificacin Valoracin Orgnicas Inorgnicas Residuales
(1730) Espectroqumica de Plas-
ma-Teora y Prctica
(1735) Espectrometra de Fluo-
rescencia de Rayos X-Teora y
Prctica

(1736) Aplicaciones de la Espec-
trometra de Masas
(1852) Espectroscopa de Absor-
cin Atmica-Teora y Prctica
(1853) Espectroscopa de Fluo-
rescencia-Teora y Prctica
(1854) Espectroscopa en el In-
frarrojo Medio-Teora y Prcti-
ca

(1857) Espectroscopa Ultraviole-
ta-Visible-Teora y Prctica
Diagrama 4b. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Especficas
Pruebas de Desempeo
Mucosa Mucosa (7
Conteni- superficies
Equipa- do de Parente- lnhalato- de mem-
Captulo miento Agua Oftlmica 1 Nasal ral Oral Tpica ria brana)
(1) Inyectables
(2) Medicamentos Ora-

/es-Pruebas de Calidad
del Producto

(3) Medicamentos Tpi-
cos y Transdrmicos-
Pruebas de Calidad del
Producto
(4) Medicamentos para
Mucosas-Pruebas de
Calidad del Producto

(5) Medicamentos Nasa-
les y para Inhalacin-
Informacin General y
Pruebas de Calidad del

Producto
(31) Aparatos Volumtri-
CDS
(41) Balanzas
(71) Pruebas de Esterili-

dad
(85) Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas
(87) Pruebas de Reactivi-
dad Biolgica, In Vitro
(88) Pruebas de Reactivi-
dad Biolgica, In Vivo
(151) Prueba de Pirge-
nos
(301) Capacidad Neutra-
lizante de cido
(381) Tapones Elastom-
ricos para Inyectables
(541) Volumetra

1 Ver Microbiologa (Diagrama 10).
28 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

D1aqrama 4 b . Med"1camentos Activos No eomp 1. , )

eos-Prue bas Espec1T 1cas Continuacion
Pruebas de Desempeo
Mucosa Mucosa (7
Contenl- superficies
Equipa- do de Parente- lnhalato- demem-
Captulo miento Aqua Oftlmlca 1 Nasal ral Oral Tpica ria brana)
(601) Medicamentos Na-
sales y para Inhalacin:
Pruebas de Calidad de
Desempeo de Aeroso-
les, Atomizadores y Poi-
vos
(602) Propelentes

( 60 3) Aerosoles Tpicos

(604) Velocidad de Fuga

(697) Contenido en Enva-
ses para Inyectables
( 701 ) Desintegracin
(705) Atributos de Cali-

dad para Tabletas Cuyo
Etiquetado Indica Ranu-
rada Funcional
( 711 ) Disolucin
(724) Liberacin de Fr-

macos
(729) Distribucin del Ta-
mao de Glbulos en
Emulsiones Inyectables
de Lpidos
(731) Prdida por Secado

(751) Partculas Metlicas
en Ungentos Oftlmi-
CDS

(771) Productos Oftlmi-
cos-Pruebas de Calidad
(785) Osmolalidad y Os-
molaridad
(787) Partculas Subvisi-
bles en Inyectables de
Protenas Teraputicas

(788) Partculas en lnyec-
tables
(789) Partculas en So/u-
ciones Oftlmicas
( 790) Partculas Visibles
en Inyectables
(791) pH

(891) Anlisis Trmico
(905) Uniformidad de

Unidades de Dosificacin
(921) Determinacin de
Agua
(1005) Emisin Acstica

(1051) Limpieza de Ma-
teria/ de Vidrio
(1087) Disolucin lntrn-
seca Aparente-Procedi-
mientas de Pruebas de
Disolucin para Disco
Rotatorio y Disco Esta-
cionario
1 Ver Microbiologa (Diagrama 7O).
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 29

Diagrama 4b. Medicamentos Activos No Complejos-Pruebas Especficas (Continuacin)

Pruebas de Desempeo
Mucosa Mucosa (7
Conteni- superficies
Equipa- do de Parente- lnhalato- de mem-
Captulo miento Agua Oftlmical Nasal ral Oral Tpica ria brana)
(1 088) Evaluacin In Vivo
e In Vitro de Formas Far-
macuticas

(1090) Evaluacin de De-
sempeo del Producto
Farmacutico-Biodispo-
nibilidad, Bioequivalen-

cia y Disolucin
(1092) Procedimiento de
Disolucin: Desarrollo y
Validacin

(1094) Cpsu/as-Prue-
bas de Disolucin y Atri-
butos de Calidad Re/a-
cionados
(1113) Caracterizacin,
Identificacin y Tipifica-
cin de Cepas Microbio-
nas
(1216) Friabilidad de las
Tabletas
(1217) Fuerza de Ruptura
de las Tabletas
(1229) Esterilizacin de
Artculos Farmacopeicos
(1229 .2) Esterilizacin
con Calor Hmedo de L-
quidos Acuosos

(1229.3) Monitoreo de la
Biocarga
(1229.4) Esterilizacin de
Lquidos por Filtracin
(1251) Pesada en una
Balanza Analtica
( 1601 ) Productos para
Nebulizacin-Pruebas
de Caracterizacin

(1724) Medicamentos Se-
mis/idos-Pruebas de
Desempeo

(1 771) Productos Ohl-
micos-Pruebas de De-
sempeo

(1 787) Medicin de Part-
cu/as Subvisibles en In-
yectables de Protenas
Teraputicas
(1 788) Mtodos para la
Determinacin de Part-
cu/as en Inyectables y
Soluciones Oftlmicas
1 Ver Microbiologa (Diagrama 10).
30 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 5. Medicamentos Biolgicos de Origen Natural y Recombinante

Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentifl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrip- Segurl- Valo- Flsico- con el das con el
Captulo cacin rizacin miento Mise. cin dad racin qumica Proceso Producto
(1) Inyectables

( 7) Etiquetado
(11) Estndares de Re-

ferencia USP
(31) Aparatos Volum-
tricos
(41) Balanzas
(61) Examen Microbio-

lgico de Productos
No Estriles: Pruebas
de Recuento Microbio-

no
(62) Examen Microbio-
lgico de Productos
No Estriles: Pruebas
de Microorganismos

Especficos
(63) Pruebas para Mi-
coplasmas
(71) Pruebas de Esterili-
dad
(85) Prueba de Endoto-
xinas Bacterianas
(87) Pruebas de Reacti-
vidad Biolgica, In Vi-
tro

(88) Pruebas de Reacti-
vidad Biolgica, In Vi-
vo

(89) Enzimas Usadas
como Materiales Auxi-
liares en Ja Fabrica-
cin de Productos Far-

macuticos
(90) Suero Fetal Bovi-
no-Atributos de Cali-
dad y Pruebas de Fun-
cionalidad
(111) Diseo y Anlisis
de Valoraciones Biol-
gicas

(121) Valoracin de In-
sulina
(121.1) Procedimientos
Analticos Fisicoqumi-
cos para Insulinas

(123) Pruebas de /den-
tidad Biolgica de
Glucagn

(124) Valoraciones Bio-
lgicas de Eritropoye-
tina

(126) Pruebas de /den-
tidad Biolgica de So-
matropina

USP 39 Gua de los Captulos Generales / Diagrama de Captulos 31

o1agrama 5 , )
Me dicamentos Bi o I'oqi cos d e Ori1gen Natura y Recom b"mante ( Continuacion
Impurezas
Helado-
nadas Relaciona-
ldentifi- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Seguri- Valo- Fislco- con el das con el
Captulo eacin rizacin miento Mise. cin dad racin qumica Proceso Producto
(129) Procedimientos
Analticos para Anti-
cuerpos Monoclonales
Recombinantes de

Uso Teraputico
(1 30) Atributos de Cali-
dad de la Protena A
(151) Prueba de Pir-
genos
(191) Identificacin-
Pruebas Generales
(197) Pruebas de /den-
tificacin Espectrofoto-
mtricas

(208) Valoracin de
Anti-Factor Xa y Anti-
Factor /la para Hepa-
rinas No Fraccionadas
y Heparinas de Bajo
Peso Molecular
(209) Determinaciones
de Peso Molecular de
Heparinas de Bajo Pe-
so Molecular
(212) Anlisis de Oligo-
sacridos
(231) Metales Pesados
(232) Impurezas Ele-

mentales-Lmites
(233) Impurezas Ele-
mentales-Procedi-
mientas

(341) Agentes Antimi-
crobianos-Contenido
(467) Disolventes Resi-
duales
(503) cido Actico en
Pptidos
(541) Volumetra

(621) Cromatografa
(631) ColoryAcroma-

tismo
(660) Envases-Vidrio

( 661 ) Sistemas de En-
vases Plsticos y sus
Materiales de Cons-
truccin
( 661.1) Materiales
Plsticos de Construc-
cin

(661.2) Sistemas de
Envases Plsticos para
Uso Farmacutico

(671) Envases-Prue-
bas de Desempeo
(695) Cristalinidad

32 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

D1aqrama 5. Medi camentos B1o I'oq1i cos d e o.rigen Natura y ., )

Recom b"mante Contmuaoon
Impurezas
Relaclo-
nadas Relaciona-
ldentifl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Segurl- Valo- Fislco- con el das con el
Captulo cacln rizacln miento Mise. cln dad racin qumica Proceso Producto
(697) Contenido en En-
vases para Inyectables
(730) Espectroqumica
de Plasma
(731) Prdida por Se-
cado
(736) Espectrometra
de Masas
(761) Espectroscopa
de Resonancia Mag-
ntica Nuclear

(781) Rotacin ptica

(785) Osmolalidad y
Osmolaridad
(786) Estimacin de la
Distribucin del Ta-
mao de Partcula por
Tamizado Analtico
(787) Partculas Subvi-
sibles en Inyectables
de Protenas Terapu-
ticas
(788) Partculas en In-
yectables
(791) pH

(831) ndice de Retrae-
cin
(852) Espectroscopa
de Absorcin Atmica
(853) Espectroscopa
de Fluorescencia
(854) Espectroscopa
en el Infrarrojo Medio
(855) Nefelometra,
Turbidimetra y Com-
paracin Visual

(857) Espectroscopa
Ultravioleta-Visible
(921) Determinacin
de Agua
(1024) Suero Bovino

(1025) Pancreatina
(1030) Captulos de

Valoraciones Biolgi-
cas-lnformacin Ge-
neral y Glosario
(1032) Diseo y Desa-
rrollo de Valoraciones
Biolgicas

(1033) Validacin de
Valoraciones Biolgi-
cas

(1034) Anlisis de Va-
/oraciones Biolgicas
(1041) Productos Biol-
gicos
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 33

Diaqrama 5. Medicamentos B1o I'oq1cos

. de Oriqen Natura y Recom b.mante (Continuacion)
Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentifi- Caracte- Equipa- Pruebas Descrip- Seguri- Valo- Fislco- con el das con el
Captulo cacln rizacln miento Mise. cin dad racin qumica Proceso Producto
(1044) Crioconserva-
cin de Clulas
(1050) Evaluacin de
la Seguridad Viral en
Productos Biotecnol-
gicos Obtenidos de L-
neas Celulares de Ori-

gen Humano o Ani-
mal
(l 052) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Anlisis de Ami-
nocidos
(1053) Electroforesis
Capilar
(1054) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-lsoelectroenfo-
que
(1055) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Mapeo de Ppti-
dos
(1056) Artculos Obte-
nidos por Biotecno/o-
ga-Electroforesis en
Gel de Poliacrilamida
(1057) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Va/oracin de
Protenas Totales
(1065) Cromatografa
fnica
(1084) Anlisis de Gli-
coprotenas y G/ica-
nos-Consideraciones
Generales
(1102) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Consideraciones
Generales
(1103) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Ensayo por In-
munoadsorcin Liga-

do a Enzimas (ELISA)
(1104) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Anlisis por In-
munotransferencia
(1105) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Resonancia de
Plasmn Superficial
(11 06) Ensayos de In-
munogenicidad-Di-
sea y Validacin de
lnmunoensayos para
Detectar Anticuerpos
Antifrmacos
34 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Dlaarama 5. Medicamentos Blolalcos de Orlaen Natural y Recomblnante (Continuacion)

Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentlfl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Segurl- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo eacin rlzacin miento Mise. cin dad racin aumlca Proceso Producto
(1106.1) Ensayos de
lnmunogenicidad-
Diseo y Validacin
de Ensayos para De-
tectar Anticuerpos

Neutralizantes Anti-
frmacos
(1111) Examen Micro-
biolgico de Productos
No Estriles: Criterios
de Aceptacin para
Preparaciones Forma-

cuticos y Sustancias
de Uso Farmacutico
(1113) Caracteriza-
cin, Identificacin y
Tipificacin de Cepas
Microbianas
(1121 ) Nomenclatura
(1125) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Generalidades

(1126) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Extraccin, De-
teccin y Secuencia-

cin
(1127) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Amplificacin

(1128) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Micromatrices

(1129) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Genotipificacin

(1130) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Enfoques para
Detectar Trazas de
cidos Nucleicos

(Anlisis de ADN Resi-
dual)
(1132) Medicin de
Protena Residual de
Clulas Husped en
Productos Biofarma-

cuticos
(1181) Microscopa
Electrnica de Barrido
(1211) Esterilizacin y
Garanta de Esterili-
dad de Artculos Far-
macopeicos
(1229) Esterilizacin de
Artculos Farmacopei-
cos

(1229 .4) Esterilizacin
de Lquidos por Filtra-
cin

USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 35

Diagrama 5. Medicamentos Biolgicos de Origen Natural y Recombinante (Continuacin)

Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentifl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrip- Seguri- Valo- Fisico- con el das con el
Captulo cacin rizacin miento Mise. cin dad racin qumica Proceso Producto
(1251) Pesada en una
Balanza Analtica
(1660) Envases de Vi-
drio-Eva/uacin de fa
Durabilidad de la Su-
perficie Interna
(1661) Evaluacin de
Sistemas de Envases
Plsticos y sus Mate-
ria/es de Construccin
con Respecto a su lm-

pacto sobre la Seguri-
dad del Usuario
(1663) Evaluacin de
Sustancias Extrables
Relacionadas con En-
vases Farmacuticos y
Sistemas de Adminis-
tracin
(1664) Evaluacin de
Sustancias Lixiviables
en Medicamentos Re-
lacionadas con Enva-
ses Farmacuticos y

Sistemas de Adminis-
tracin
(1736) Aplicaciones de
la Espectrometra de
Masas

(1761) Aplicaciones de
la Espectroscopa de
Resonancia Magnti-
ca Nuclear
(1787) Medicin de
Partculas Subvisibles
en Inyectables de Pro-
tenas Teraputicas
(1 788) Mtodos para
la Determinacin de
Partculas en Inyecta-
bles y Soluciones Of-

tlmicas
(1852) Espectroscopa
de Absorcin Atmi-
ca-Teora y Prctica

( 185 3) Espectroscopa
de Fluorescencia-
Teora y Prctica

(1854) Espectroscopa
en el Infrarrojo Me-
dio-Teora y Prctica

( 185 7) Espectroscopa
Ultravioleta-Visible-
Teora y Prctica

36 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 6. Vacunas
Impurezas
Re lacio-
nadas Relaciona-
ldentifi- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Seguri- Valo- Fisico- con el das con el
Captulo eacin rizacln miento Mise. cln dad racin qumica Proceso Producto
(1) Inyectables
(11) Estndares de Re-

ferencia USP
(31) Aparatos Volum-
tricos
(41) Balanzas

(63) Pruebas para Mi-
cap/asmas
(71) Pruebas de Esterili-
dad
(81) Antibiticos-Va-
/oraciones Microbiol-
gicas

(85) Prueba de Endoto-
xinas Bacterianas
(88) Pruebas de Reacti-
vidad Biolgica, In Vi-
VD

(90) Suero Fetal Bovi-
no-Atributos de Ca/i-
dad y Pruebas de Fun-
cionalidad
(111) Diseo y Anlisis
de Valoraciones Biol-
gicas

(151) Prueba de Pir-
genos
(341) Agentes Antimi-
crobianos-Contenido
( 621 ) Cromatografa

(660) Envases-Vidrio
(661 ) Sistemas de En-

vases Plsticos y sus
Materiales de Cons-
truccin
( 661 .1) Materiales
Plsticos de Construc-
cin

(661.2) Sistemas de
Envases Plsticos para
Uso Farmacutico

(671) Envases-Prue-
bas de Desempeo
( 69 5) Cristalinidad
(697) Contenido en En-
vases para Inyectables
(731) Prdida por Se-
cado
(736) Espectrometra
de Masas
( 761 ) Espectroscopa
de Resonancia Mag-
ntica Nuclear

(786) Estimacin de la
Distribucin del Ta-
mao de Partcula por
Tamizado Analtico
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 37

D"1ag rama 6Vacunas (Contmuaoon

" )
Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentifi- Caracte- Equipa- Pruebas Descrip- Seguri- Valo- Fisico- con el das con el
Captulo cacin rizacin miento Mise. cin dad racin qumica Proceso Producto
(787) Partculas Subvi-
sibles en Inyectables
de Protenas Terapu-
ticas
(788) Partculas en In-
yectables
(790) Partculas Visi-
bles en Inyectables
(791) pH
(852) Espectroscopa
de Absorcin Atmico
(85 3) Espectroscopa
de Fluorescencia
(854) Espectroscopa
en el Infrarrojo Medio
(855) Nefelometra,
Turbidimetra y Com-
paracin Visual

(857) Espectroscopa
Ultravioleta-Visible
(921) Determinacin
de Agua
(1024) Suero Bovino
(1030) Captulos de
Valoraciones Biolgi-
cas-/nformacin Ge-
neral y Glosario
(1032) Diseo y Desa-
rrollo de Va/oraciones
Biolgicas

(1033) Validacin de
Valoraciones Biolgi-
cas

(1034) Anlisis de Va-
/oraciones Biolgicas
(1041) Productos Biol-
gicos
(1044) Crioconserva-
cin de Clulas
(1052) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Anlisis de Ami-
nocidos
(1053) Electroforesis
Capilar
(1054) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-lsoelectroenfo-
que
(1055) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Mapeo de Ppti-
dos
(1056) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Electroforesis en
Gel de Poliacrilamida
38 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

, )
D1aqrama 6. Vacunas (Continuacion
Impurezas
Relaclo-
nadas Relaciona-
ldentifi- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Seguri- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo cacln rlzacln miento Mise. cln dad racin qumica Proceso Producto
(1057) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Valoracin de
Protenas Totales
(1065) Cromatografa
fnica
(1084) Anlisis de G/i-
coprotenas y Glica-
nos-Consideraciones
Generales
(11 02) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Consideraciones
Generales
(1103) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Ensayo por In-
munoadsorcin Liga-

do a Enzimas (ELISA)
(1104) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Anlisis por In-
munotransferencia
(1105) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Resonancia de
Plasmn Superficial
(1113) Caracteriza-
cin, Identificacin y
Tipificacin de Cepas
Microbianas
(1121) Nomenclatura
(1126) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Extraccin, De-
teccin y Secuencia-

cin
(1127) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Amplificacin

(1128) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Micromatrices

(1129) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Genotipificacin

(1130) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Enfoques para
Detectar Trazas de
cidos Nucleicos

(Anlisis de ADN Resi-
dual)
(1211) Esterilizacin y
Garanta de Esterili-
dad de Artculos Far-
macopeicos
(1229) Esterilizacin de
Artculos Farmacopei-
cos

USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 39

,, )
DI aarama 6 V acunas (Contmuaoon
Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentifi- Caracte- Equipa- Pruebas Descrip- Seguri- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo cacln rizacin miento Mise. cin dad racin qumica Proceso Producto
(1229 .4) Esterilizacin
de Lquidos por Filtra-
cin

(1234) Vacunas para
Uso Humano-Vacu-
nas de Polisacridos y
G/icoconjugados
(1235) Vacunas para
Uso Humano-Cans-
deraciones Generales

(1237) Mtodos de
Pruebas Virolgicas
(1238) Vacunas para
Uso Humano-Vacu-
nas Bacterianas

(1251) Pesada en una
Balanza Analtica
(1660) Envases de Vi-
drio--Evaluacin de la
Durabilidad de la Su-
perficie Interna
(1661) Evaluacin de
Sistemas de Envases
Plsticos y sus Mate-
ria/es de Construccin
con Respecto a su lm-

pacto sobre la Seguri-
dad del Usuario
(1663) Evaluacin de
Sustancias Extrables
Relacionadas con En-
vases Farmacuticos y
Sistemas de Adminis-
tracin
(1664) Evaluacin de
Sustancias Lixiviab/es
en Medicamentos Re-
/acionadas con Enva-
ses Farmacuticos y

Sistemas de Adminis-
tracin
(1 736) Aplicaciones de
la Espectrometra de
Masas

(1761) Aplicaciones de
la Espectroscopa de
Resonancia Magnti-
ca Nuclear
(1 787) Medicin de
Partculas Subvisibles
en Inyectables de Pro-
tenas Teraputicas
(1 788) Mtodos para
Ja Determinacin de
Partculas en Inyecta-
bles y Soluciones Of-

tlmicas
(1852) Espectroscopa
de Absorcin Atmi-
ca-Teora y Prctica

40 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 6. Vacunas (Continuacin)

Impurezas
Relaclo-
nadas Relaciona-
ldentlfi- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Seguri- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo e acin rlzacln miento Mise. cln dad racin qumica Proceso Producto
(1853) Espectroscopa
de Fluorescencia-
Teora y Prctica

(1854) Espectroscopa
en el Infrarrojo Me-
dio-Teora y Prctica

(185 7) Espectroscopa
Ultravioleta-Visible-
Teora y Prctica

DI agrama 7 sangre y Hemoderva
1 d os
Impurezas
Relaclo-
nadas Relaciona-
ldentlfl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrip- Segurl- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo cacln rlzacln miento Mise. cln dad racin qumica Proceso Producto
(1) Inyectables
(11) Estndares de Re-

ferencia USP
(31) Aparatos Volum-
tricos
(41) Balanzas
(51 ) Pruebas de Efica-

cia Antimicrobiana
(61) Examen Microbio-
lgico de Productos
No Estriles: Pruebas
de Recuento Microbio-

no
(62) Examen Microbio-
lgico de Productos
No Estriles: Pruebas
de Microorganismos

Especficos
(71) Pruebas de Esterili-
dad
(85) Prueba de Endoto-
xinas Bacterianas
(87) Pruebas de Reacti-
vidad Biolgica, In Vi-
tro

(88) Pruebas de Reacti-
vidad Biolgica, In Vi-
VO

(111) Diseo y Anlisis
de Valoraciones Biol-
gicas

(151) Prueba de Pir-
genos
(191) Identificacin-
Pruebas Generales
(197) Pruebas de /den-
tificacin Espectrofoto-
mtricas

USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 41

DI agrama 7 sangrey Hemod e rlva dos (Con t'muaoon

Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentlfl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrip- Segurl- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo cacln rlzacln miento Mise. cln dad racin qumica Proceso Producto
(208) Valoracin de
Anti-Factor Xa y Anti-
Factor /la para Hepa-
rinas No Fraccionadas
y Heparinas de Bajo
Peso Molecular
(209) Determinaciones
de Peso Molecular de
Heparinas de Bajo Pe-
so Molecular
(341) Agentes Antimi-
crobianos-Contenido
(621) Cromatografa
(631) ColoryAcroma-

tismo
(660) Envases-Vidrio
(661) Sistemas de En-
vases Plsticos y sus
Materiales de Cons-
truccin
(661.1 ) Materiales
Plsticos de Construc-
cin

(661.2) Sistemas de
Envases Plsticos para
Uso Farmacutico

(671) Envases-Prue-
bas de Desempeo
(695) Cristalinidad
(697) Contenido en En-

vases para Inyectables
(731) Prdida por Se-
cado
(736) Espectrometra
de Masas
(761) Espectroscopa
de Resonancia Mag-
ntica Nuclear

(785) Osmolalidad y
Osmolaridad
(787) Partculas Subvi-
sibles en Inyectables
de Protenas Terapu-
ticas
(788) Partculas en In-
yectables
(790) Partculas Visi-
bles en Inyectables
(791) pH
(852) Espectroscopa

de Absorcin Atmica
(853) Espectroscopa
de Fluorescencia
(854) Espectroscopa
en el Infrarrojo Medio
42 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

DI agrama 7 ., )
sangrey Hemode rivados (Contmuacion
Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentlfl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Seguri- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo cacln rlzacln miento Mise. cin dad racin qumica Proceso Producto
(855) Nefelometra,
Turbidimetra y
paracin Visual
Com-

(85 7) Espectroscopa
Ultravioleta-Visible
(921) Determinacin
de Agua
(1030) Captulos de
Valoraciones Biolgi-
cas-lnformacin Ge-
neral y Glosario
(1032) Diseo y Desa-
rrol/o de Valoraciones
Biolgicas

(1033) Validacin de
Valoraciones Biolgi-
cas

(1034) Anlisis de Va-
/oraciones Biolgicas
(1035) Indicadores Bio-
lgicos para Esteriliza-
cin

(1041 ) Productos Biol-
gicos
(1044) Crioconserva-
cin de Clulas
(1052) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Anlisis de Ami-
nocidos
(1053) Electroforesis
Capilar
(1 054) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-lsoe/ectroenfo-
que
(1055) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Mapeo de Ppti-
dos
(1056) Artculos Obte-
nidos por Biotecno/o-
ga-Electroforesis en
Gel de Poliacrilamida
(1057) Artculos Obte-
nidos por Biotecnolo-
ga-Valoracin de
Protenas Totales
(1065) Cromatografa
fnica
(1102) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Consideraciones
Generales
(1103) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Ensayo por In-
munoadsorcin Liga-

do a Enzimas (ELISA)
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 43

D aqrama 7. Sanqre y Hemoder1vad os (Contmuacion)

Impurezas
Relaclo-
nadas Relaclona-
ldentlfl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Segurl- Valo- Flslco- con el das con el
Captulo cacin rlzacln miento Mise. cln dad racin aumlca Proceso Producto
(1104) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Anlisis por In-
munotransferencia
(1105) Mtodos de
Pruebas lnmunolgi-
cas-Resonancia de
Plasmn Superficial
(1106) Ensayos de In-
munogenicidad-Di-
seo y Validacin de
lnmunoensayos para
Detectar Anticuerpos
Antifrmacos
(1106.1) Ensayos de
lnmunogenicidad-
Diseo y Validacin
de Ensayos para De-
tectar Anticuerpos

Neutralizantes Anti-
frmacos
(1111) Examen Micro-
biolgico de Productos
No Estriles: Criterios
de Aceptacin para
Preparaciones Forma-

cuticas y Sustancias
de Uso Farmacutico
(111 3) Caracteriza-
cin, Identificacin y
Tipificacin de Cepas
Microbianas
(1116) Control Micro-
biolgico y Monitoreo
de Ambientes de Pro-
cesamiento Asptico
(1121) Nomenclatura
(1125) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Generalidades

(11 30) Tcnicas Basa-
das en cidos Nuclei-
cos-Enfoques para
Detectar Trazas de
cidos Nucleicos

(Anlisis de ADN Resi-
dual)
(1180) Plasma Huma-
no
(1211) Esterilizacin y
Garanta de Esterili-
dad de Artculos Far-
macopeicos
(1229) Esterilizacin de
Artculos Farmacopei-
cos

(1229 .4) Esterilizacin
de Lquidos por Filtra-
cin

(1237) Mtodos de
Pruebas Virolgicas
44 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 7. Sangre y Hemoderlvados (Continuacin)

Impurezas
Relacio-
nadas Relaciona-
ldentlfl- Caracte- Equipa- Pruebas Descrlp- Segurl- Valo- Flsico- con el das con el
Captulo cacln rlzacln miento Mise. cln dad racin qumica Proceso Producto
(1240) Anlisis de Virus
en Plasma Humano
para Fabricacin Pos-
terior
(1251) Pesada en una
Balanza Analtica
(1660) Envases de Vi-
dra-Evaluacin de la
Durabilidad de Ja Su-
perficie Interna
(1661) Evaluacin de
Sistemas de Envases
Plsticos y sus Mate-
ria/es de Construccin
con Respecto a su fm-

pacto sobre fa Seguri-
dad del Usuario
(1663) Evaluacin de
Sustancias Extrabfes
Relacionadas con En-
vases Farmacuticos y
Sistemas de Adminis-
tracin
(1664) Evaluacin de
Sustancias Lixiviables
en Medicamentos Re-
facionadas con Enva-
ses Farmacuticos y

Sistemas de Adminis-
tracin
(1736) Aplicaciones de
la Espectrometra de
Masas

(1761) Aplicaciones de
Ja Espectroscopa de
Resonancia Magnti-
ca Nuclear

(1787) Medicin de
Partculas Subvisibles
en Inyectables de Pro-
tenas Teraputicas
(1788) Mtodos para
la Determinacin de
Partculas en Inyecta-
bles y Soluciones Of-

tlmicas
(1852) Espectroscopa
de Absorcin Atmi-
ca-Teora y Prctica

(1853) Espectroscopa
de Fluorescencia-
Teora y Prctica

(1854) Espectroscopa
en el Infrarrojo Me-
dio-Teora y Prctica

(1857) Espectroscopa
Ultravioleta-Visible-
Teora y Prctica

USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 45

Diagrama 8. Productos Derivados de Clulas, Genes y Tejidos

Pruebas Universales Pruebas Especflcas1,2
Cuestlo-
nes Mi-
croblol-
glcas y de Cuestiones Cuestlo-
ldentlfl- Biocompa- Esterlll- de nes del Equipa- Caracterl-
Captulo cacln Valoracin tibilldad dad Produccin Producto miento zacln
(1) Inyectables

(11) Estndares de Rete-
renda USP
(31) Aparatos Volumtri-
cos
(41) Balanzas
(61) Examen Microbiol-

gico de Productos No Es-
triles: Pruebas de Re-
cuento Microbiano
(62) Examen Microbiol-
gico de Productos No Es-
triles: Pruebas de Micro-
organismos Especficos
(63) Pruebas para Mico-
plasmas
(71) Pruebas de Esteril-
dad
(85) Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas
(87) Pruebas de Reactivi-
dad Biolgica, In Vitro
(88) Pruebas de Reactivi-
dad Biolgica, In Vivo
(90) Suero Fetal Bovino-
Atributos de Calidad y
Pruebas de Funcionali-
dad
(92) Factores de Crec-
miento y Citokinas Usa-
dos en la Fabricacin de
Productos de Terapia Ce-

fular
(111) Diseo y Anlisis de
Valoraciones Biolgicas
(151) Prueba de Pirge-
nos
(161) Dispositivos Mdi-
cos-Pruebas de Endoto-
xinas Bacterianas y Pir-
genos
(381) Tapones Elastomri-
cos para Inyectables
( 621) Cromatografa
(785) Osmolalidad y Os-

molaridad
(787) Partculas Subvisi-
bles en Inyectables de
Protenas Teraputicas

(788) Partculas en lnyec-
tables
(79l)pH
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensin.

2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacutico.
46 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 8. Productos Derivados de Clulas, Genes y Tejidos (Continuacin)

Pruebas Universales Pruebas Especficasl,2
Cuestio-
nes Mi-
crobiol-
gicas y de Cuestiones Cuestio-
ldentlfl- Blocompa- Esterill- de nes del Equipa- Caracteri-
Captulo cacln Valoracin tlbilidad dad Produccin Producto miento zacin
(797) Preparacin Magis-
trol-Preparaciones Est-
riles

(905) Uniformidad de
Unidades de Dosificacin
(911) Viscosidad-Mto-
dos Capilares
(912) Viscosidad-Mto-
dos Rotatorios
(913) Viscosidad-Mto-
do de Bola Rodante
(1024) Suero Bovino

(1027) Citometra de Flu-
jo
(1030) Captulos de Va/o-
raciones Biolgicas-In-
formacin General y Glo-
sario
(1031) Biocompatibilidad
de los Materiales Usados
en Envases de Medica-
mentas, Dispositivos M-

dicos e Implantes
(1032) Diseo y Desarro-
/lo de Valoraciones Biol-
gicas

(1033) Validacin de Va-
/oraciones Biolgicas
(1034) Anlisis de Valora-
ciones Biolgicas
(1041) Productos Biolgi-
CDS
(1043) Materiales Auxilia-
res para Productos Ce/u-
lares, Gnicos y de lnge-
niera Tisular
(1044) Crioconservacin
de Clulas
(1 046) Productos Deriva-
dos de Clulas y Tejidos
(1047) Productos de Tero-
pa Gnica
(1 048) Calidad de Pro-
duetos Biotecnolgicos:
Anlisis de la Construc-
cin Expresab/e en Clu-
las Usadas para la Pro-
duccin de Productos
Protenicos Obtenidos
con ADN Recombinante
(1049) Calidad de Pro-
duetos Biotecnolgicos:
Pruebas de Estabilidad
de Productos Biotecnol-

gicos o Biolgicos
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a Ja Tensin.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacutico.
USP 39 Gua de fas Captulos Generales/ Diagrriia dE' Capfrl~ 47

Diagrama 8. Productos Derivados de Celulas, Genes y TeId os (Continuacion

' )

Pruebas Universales Pruebas Especficas 1, 2

Cuestio-
nesMi-
crobiol-
gicas y de Cuestiones Cuestio-
ldentlfi- Biocompa- Esterili- de nes del Equipa- Caracteri-
Captulo cacin Valoracin tibilidad dad Produccin Producto miento zacin
(1 050) Evaluacin de la
Seguridad Viral en Pro-
duetos Biotecnolgicos
Obtenidos de Lneas Ce-
/u/ares de Origen Huma-
no o Animal
(1051) Limpieza de Mate-
ria/ de Vidrio
(1052) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Anlisis de Aminocidos

(105 3) Electroforesis Capi-
lar
(1054) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
lsoe/ectroenfoque

(1055) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Mapeo de Pptidos

(1056) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida
(105 7) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Valoracin de Protenas
Totales
(1074) Guas para Ja Eva-
luacin de la Seguridad
Biolgica de Jos Excipien-
tes
(1084) Anlisis de G/ico-
protenas y Glicanos-
Consideraciones Genera-
les
(1086) Impurezas en Fr-
macos y Productos Far-
macuticos

(11 02) Mtodos de Prue-
bas Inmunolgicas-
Consideraciones Genera-
les
(1103) Mtodos de Prue-
bas Inmunolgicas-En-
sayo por lnmunoadsor-
cin Ligado a Enzimas

(ELISA)
(1104) Mtodos de Prue-
bas Inmunolgicas-
Anlisis por lnmuno-
transferencia
(1113) Caracterizacin,
Identificacin y Tipifica-
cin de Cepas Microbio-
nas
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensin.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacutico.
48 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 8. Productos Derivados de Clulas, Genes y Telldos (Continuacin)

Pruebas Universales Pruebas Especficas 1,2
Cuestlo-
nes MI-
croblol-
glcas y de Cuestiones Cuestlo-
ldentlfl- Blocompa- Esterlll- de nes del Equipa- Caracterl-
Captulo cacln Valoracin tlbllldad dad Produccin Producto miento zacln
(1116) Control Microbio-
lgico y Monitoreo de
Ambientes de Procesa-
miento Asptico
(1121) Nomenclatura

(1126) Tcnicas Basadas
en cidos Nucleicos-Ex-
traccin, Deteccin y Se-
cuenciacin
(1127) Tcnicas Basadas
en cidos Nucleicos-
Amplificacin

(1128) Tcnicas Basadas
en cidos Nucleicos-Mi-
croma trices

(1129) Tcnicas Basadas
en cidos Nucleicos-
Genotipificacin

(1130) Tcnicas Basadas
en cidos Nucleicos-En-
foques para Detectar
Trazas de cidos Nuclei-
cos (Anlisis de ADN Re-
sidual)
(1151) Formas Farmacu-
ticas
(1184) Pruebas de Sensi-
bilizacin
(1208) Pruebas de Esterili-
dad-Validacin de Sis-
temas Aisladores

(1 211 ) Esterilizacin y
Garanta de Esterilidad
de Artculos Farmacopei-
cos
(1227) Validacin de Re-
cuperacin Microbiana
en Artculos Farmacopei-
cos
(1229) Esterilizacin de
Artculos Farmacopeicos
(1229.3) Monitoreo de la
Biocarga
(1229.4) Esterilizacin de
Lquidos por Filtracin
(1237) Mtodos de Prue-
bas Virolgicas
(1251) Pesada en una Ba-
lanza Analtica
(1285) Preparacin de
Muestras Biolgicas para
Anlisis Histolgico e In-
munohistoqumico
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensin.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacutico.
USP 39 Gua de los Captulos Generales / Diagrama de Captulos 49

Diagrama 8. Productos Derivados de Clulas, Genes y Telldos (Continuacin)

Pruebas Universales Pruebas Especiflcas1,2
Cuestlo-
nesMI-
croblol-
glcas y de Cuestiones Cuestlo-
ldentlfl- Blocompa- Esterlll- de nes del Equipa- Caracterl-
Capitulo cacln Valoracin tlbllldad dad Produccin Producto miento zacln
(1285 .1 ) Tincin con He-
motoxilina y Eosina de
Cortes de Tejidos para
Examen Microscpico

(1787) Medicin de Part-
cu/as Subvisibles en In-
yectables de Protenas
Teraputicas

(1788) Mtodos para la
Determinacin de Part-
cu/as en Inyectables y
Soluciones Oftlmicas
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensin.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacutico.

Diagrama 9. Distribucin de Medicamentos

Distribucin Reenvasa-
Capitulo Fabricante Transportista Mayorista de Muestras dor Farmacia Mdico
(7) Etiquetado
(17) Etiquetado de Envases de

Medicamentos de Venta Bajo
Receta Mdica

(87) Pruebas de Reactividad Bio-
lgica, In Vitro
(88) Pruebas de Reactividad Bio-
/qica, In Vivo
(381) Tapones Elastomricos pa-
ra Inyectables
(659) Requisitos de Envasado y
Almacenamiento
(660) Envases-Vidrio
(661) Sistemas de Envases Pls-

ticos y sus Materiales de Cons-
truccin

(661 .1 ) Materiales Plsticos de
Construccin
(661.2) Sistemas de Envases
Plsticos para Uso Farmacuti-
co

(670) Envases-Componentes
Auxiliares
(671) Envases-Pruebas de De-
sempeo
(698) Volumen de Entreqa
(735) Espectrometra de Fluores-

cencia de Rayos X
(755) Llenado Mnimo
(1066) Ambientes Fsicos que Fa-

vorecen el Uso Seguro de los
Medicamentos

(1079) Buenas Prcticas de Al-
macenamiento y Distribucin
para Medicamentos

(1118) Dispositivos de Manito-
reo-Tiempo, Temperatura y
Humedad

50 Diagrama de Captulos / Gua de los Captu/051 Generales USP 39

DI agrama 9 DI strfbucon " )

I' de Me di cament os (Continuac1on
Distribucin Reenvasa-
Captulo Fabricante Transportista Mayorista de Muestras dor Farmacia Mdico
(1136) Envasado y Reenvasa-
do-Envases Unitarios
(1151) Formas Farmacuticas
(1152) Medicamentos Veterina-

rios Usados en Alimentos para
Animales

(11 77) Buenas Prcticas de En-
vasado
(11 78) Buenas Prcticas de
Reenvasado
(1191) Consideraciones sobre
Estabilidad en la Prctica de
Dispensacin

(1265) Informacin Escrita de los
Medicamentos Recetados-
Guas

(1660) Envases de Vidrio-Eva-
luacin de la Durabilidad de la
Superficie Interna

(1661) Evaluacin de Sistemas
de Envases Plsticos y sus Ma-
teriales de Construccin con
Respecto a su Impacto sobre la

Sequridad del Usuario
(1663) Evaluacin de Sustancias
Extra/bles Relacionadas con En-
vases Farmacuticos y Sistemas
de Administracin
(1664) Evaluacin de Sustancias
Lixiviables en Medicamentos
Relacionadas con Envases Far-
macuticos y Sistemas de Admi-

nistracin

Diagrama 10a. Mlcroblolog1a-Productos No Esteriles

Ausencia de Microorganismos
Captulo Recuento Microbiano Objeta bles
(61) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Prue-
bas de Recuento Microbiano
(62) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Prue-
bas de Microorganismos Especficos
(63) Pruebas para Micoplasmas
(61 O) Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos pa-

ra Productos Nasales e Inhaladores No Estriles
(1111) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles:
Criterios de Aceptacin para Preparaciones Farmacuticas y
Sustancias de Uso Farmacutico

(111 3) Caracterizacin, Identificacin y Tipificacin de Ce-
pas Microbianas
(1115) Control de Biocarga de Frmacos y Medicamentos
No Estriles
(2021) Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nu-
tricionales y Dietticos
(2022) Procedimientos Microbiolgicos para Comprobar la
Ausencia de Microorganismos Especficos-Suplementos
Nutricionales y Dietticos

(2023) Atributos Microbiolgicos de los Suplementos Nutri-
cionales y Dietticos No Estriles
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 51

o1agrama 10b 1
MI ero bl oog1a-p ro d uctos Ester
' 11 es
Pro- Montaje 2 Esterilizacin Final
Prue- cesa-
bas mi en- Este- xi- Fase
de Es- Mico- to Fil- riliza- Calor Ra- do de Fase de
terili- plas- Asp- tra- Mon- cln H- Calor dla- Etile- Lqui- Va-
Captulo dad ma tico cln taje Otro Final medo Seco cln no da por
(55) Indicadores Biolgi-
cos-Pruebas de Resis-
tencia

(63) Pruebas para Mico-
plasmas
(71) Pruebas de Esterili-
dad
(151) Prueba de Pirge-
nos
(1035) Indicadores Bio-
lgicos para Esteriliza-
cin

(1072) Desinfectantes y
Antispticos
(1112) Determinacin
de Actividad de Agua
en Productos Forma-
cuticos No Estriles
(1113) Caracterizacin,
Identificacin y Tipifica-
cin de Cepas Micro-
bianas
(1116) Control Micro-
biolgico y Monitoreo
de Ambientes de Proce-
samiento Asptico
(111 7) ptimas Prcti-
cas de Laboratorio Mi-
crobiolgico

(1207) Envasado de Pro-
duetos Estriles-Eva-
luacin de Integridad

(1208) Pruebas de Este-
rilidad-Validacin de
Sistemas Aisladores

(1209) Esterilizacin-
Indicadores e Integra-
dores Qumicos y Fsico-
qumicos
(1211) Esterilizacin y
Garanta de Esterilidad
de Artculos Farmaco-
peicos
(1222) Productos Far-
macuticos con Esterili-
zacin Terminal-Libe-
racin Paramtrica
(1223) Validacin de
Mtodos Microbiolgi-
cos Alternativos

(1229) Esterilizacin de
Artculos Farmacopeicos
(1229 .1) Esterilizacin
con Vapor de Agua por
Contacto Directo

1 Para los lmites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas.
2 Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico.
52 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulas Generales USP 39

D agrama 10b.Mero blo 1og1a-Productos Ester " )

' 11es 1 (Contmuaoon
Pro- Monta)e2 Esterlllzacln Flnal
Prue- cesa-
bas mlen- Este- xl- Fase
de Es- Mico- to Fii- rlllza- Calor Ra- do de Fase de
terlll- plas- Asp- tra- Mon- cln H- Calor dla- Et lle- Lqul- Va-
Captulo dad ma tlco cln taje Otro Final medo Seco cln no da por
(1229 .2) Esterilizacin
con Calor Hmedo de
Lquidos Acuosos

(1229.3) Monitoreo de
la Biocarga
(1229.4) Esterilizacin
de Lquidos por Filtra-
cin

(1229.6) Esterilizacin
en Fase Lquida
(1229.7) Esterilizacin
por Gases
(1229.8) Esterilizacin
por Calor Seco
(1229.1 O) Esterilizacin
por Radiacin
(1229 .11 ) Esterilizacin
en Fase de Vapor
1 Para los lmites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinos Bacterianas.
2 Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico.

Diagrama 11. Ingredientes de Suplementos D1etetlcos

No
Botnicos Botnicosl,2
Segurl- Caracteriza-
Identifica- dad/ cln Valoracin de
Captulo Descripcin cln Contenido Pureza Flslcoqumlca Otro Vitamlnas3
(7) Etiquetado
(91) Valoracin de Pantotenato de

Calcio
(115) Valoracin de Dexapantenol
(171) Valoracin de Actividad de Vita-
mina B,,
(197) Pruebas de Identificacin Espec-
trofotomtricas
(201) Prueba de Identificacin por
Cromatografa en Capa Delgada
(202) Identificacin de Aceites Fijos
por Cromatografa en Capa Delgada
(203) Procedimiento de Cromatogra-
fa en Capa Delgada de Alta Resolu-
cin para Identificacin de Artculos
de Oriqen Botnico
(211) Arsnico

(231) Metales Pesados
(233) Impurezas Elementales-Proce-

dimientos
(251) Plomo

(261) Mercurio

(281) Residuo de Incineracin
(401) Grasas y Aceites Fijos
(411 ) Valoracin de cido Flico
1 Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnologa (Diagrama 2).

2 Para Minerales, Aminocidos y Metabolitos no complejos, ver Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
3 Ver tambin Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 7).
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 53

., )
DI agrama 11 . 1ngredl entes de sup1ementos DI eteticos (Continuac1on
No
Botnicos Botnicos 1,2
Segurl- Caracteriza-
Identifica- dad/ cln Valoracin de
Captulo Descripcin cln Contenido Pureza Fislcoqumlca Otro Vitaminas3
(441) Valoracin de Niacina o Niaci-
namida
(451) Volumetra con Nitrito
(461) Determinacin de Nitrgeno

(467) Disolventes Residuales
(481) Valoracin de Riboflavina
(5 31) Valoracin de Tia mina

(541) Volumetra

(551 ) Valoracin de Vitamina E

(561) Artculos de Origen Botnico
(563) Identificacin de Artculos de

Origen Botnico
(565) Extractos Botnicos

(571) Valoracin de Vitamina A
(581) Valoracin de Vitamina D
(591) Determinacin de Cinc
( 611) Determinacin de Alcohol

( 621) Cromatografa

(730) Espectroqumica de Plasma
(731) Prdida por Secado
(733) Prdida por Incineracin
(735) Espectrometra de Fluorescencia

de Rayos X
(736) Espectrometra de Masas
(761) Espectroscopa de Resonancia

Magntica Nuclear
(776) Microscopa ptica

(79l)pH
(852) Espectroscopa de Absorcin

Atmica
(853) Espectroscopa de Fluorescencia
(854) Espectroscopa en el Infrarrojo

Medio
(855) Nefelometra, Turbidimetra y
Comparacin Visual
(85 7) Espectroscopa Ultravioleta-Visi-
ble
(1064) Identificacin de Artculos de
Origen Botnico por Cromatografa
en Capa Delgada de Alta Resolucin

(1065) Cromatoqrafa fnica
(111 3) Caracterizacin, Identificacin

y Tipificacin de Cepas Microbianas
(1181) Microscopa Electrnica de Ba-
rrido
(1225) Validacin de Procedimientos
Farmacopeicos
(1226) Verificacin de Procedimientos
Farmacopeicos
1 Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnologa (Diagrama 2).
2 Para Minerales, Aminocidos y Metabolitos no complejos, ver Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
3 Ver tambin Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
54 Diagrama de Captulos /Gua de los Captufos;Generales USP 39

" )
'1cos (Contmuac1on
Diagrama 11. lngredi entes d e Sup ementos D etet
No
Botnicos Botnicos 12
Segurl- Caracteriza-
Identifica- dad/ cln Valoracin de
Captulo Descripcin cln Contenido Pureza Flslcoqumlca Otro Vltamlnas3
(1736) Aplicaciones de la Espectrome-
tra de Masas
(1761) Aplicaciones de la Espectrosco-
pa de Resonancia Magntica Nu-
clear

(1852) Espectroscopa de Absorcin
Atmica-Teora y Prctica
(1853) Espectroscopa de Fluorescen-
cia-Teora y Prctica
(1854) Espectroscopa en el Infrarrojo
Medio-Teora y Prctica
(1857) Espectroscopa Ultravioleta-Vi-
sible-Teora y Prctica
(2021) Pruebas de Recuento Micro-
biano---Suplementos Nutricionales y
Dietticos

(2022) Procedimientos Microbiolgi-
cos para Comprobar la Ausencia de
Microorganismos Especficos-Suple-
mentas Nutricionales y Dietticos
(2023) Atributos Microbiolgicos de
Jos Suplementos Nutricionales y Die-
tticos No Estriles

(2030) Informacin Complementaria
para Artculos de Origen Botnico
(2232) Contaminantes Elementales
en Suplementos Dietticos
(2250) Deteccin de Suplementos
Dietticos Irradiados
1 Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnologa (Diagrama 2).
2 Para Minerales, Aminocidos y Metabolitos no complejos, ver Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
3 Ver tambin Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).

DI agrama 12 p ro d uctos d e sup1ementos DI etet

'1 cos
Pruebas Universales Pruebas Especficas
Impurezas Seg u-
Valora- Dlsolven- Pruebas rldad/
Descrip- Identifica- cln/ Org- lnorg- tes Resl- Equipa- de Desem- Pu re-
Captulo cln cln Contenido nlcas nicas duales miento peo za
(7) Etiquetado

(31 ) Aparatos Volumtricos

(41 ) Balanzas
(91) Valoracin de Pantote-

nato de Calcio
(171) Valoracin de Actividad
de Vitamina B,,
(191) Identificacin-Pruebas
Generales
(197) Pruebas de Identifica-
cin Espectrofotomtricas
(201) Prueba de Identifica-
cin por Cromatografa en
Capa Delgada

(202) Identificacin de Acei-
tes Fijos por Cromatografa
en Capa Delgada

USP 39 Gua de/Qt(aptulos Generales/ Diagrama de Captulos 55

Dlaqrama 12. Productos de Suplementos Dlet.

t1cos (Continuacion)
Pruebas Universales Pruebas Especficas
Impurezas Segu-
Valora- Dlsolven- Pruebas rldad/
Descrip- Identifica- cln/ Org- lnorg- tes Resi- Equipa- de Desem- Pu re-
Captulo cln cln Contenido nlcas nlcas duales miento peo za
(203) Procedimiento de Cro-
matografa en Capa Delga-
da de Alta Resolucin para
Identificacin de Artculos de

Origen Botnico
(211 ) Arsnico

(231) Metales Pesados

(251) Plomo

(261) Mercurio

(281 ) Residuo de Incineracin
(411 ) Valoracin de cido F-

lico
(441) Valoracin de Niacina
o Niacinamida
(451) Volumetra con Nitrito

(466) Impurezas Comunes

(467) Disolventes Residuales

(5 31 ) Valoracin de Tia mina

(541 ) Volumetra

(551) Valoracin de Vitamina
E
(561) Artculos de Origen Bo-
tnico
(563) Identificacin de Artcu-
Jos de Origen Botnico
(565) Extractos Botnicos
(571) Valoracin de Vitamina

A
(581) Valoracin de Vitamina
D
(621) Cromatografa
(730) Espectroqumica de

Plasma
(733) Prdida por Incinera-
cin
(735) Espectrometra de Fluo-
rescencia de Rayos X
(736) Espectrometra de Ma-
sas
(776) Microscopa ptica

(781) Rotacin ptica

(801) Polarografa
(852) Espectroscopa de Ab-

sordn Atmica
(85 3) Espectroscopa de Fluo-
rescencia
(854) Espectroscopa en el In-
frarrojo Medio
(855) Nefelometra, Turbidi-
metra y Comparacin Vi-
sual

(85 7) Espectroscopa Ultra-
violeta-Visible
56 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos.,Generales USP 39

, )
D1aqrama 12. Prod uctos d e Sup' ementos D1etet1cos Continuacion
Pruebas Universales Pruebas Especficas
Impurezas Seg u-
Valora- Dlsolven- Pruebas ridad/
Descrip- Identifica- cin/ Org- lnorg- tes Resi- Equipa- de Desem- Pu re-
Captulo cin cin Contenido nicas nlcas duales miento peo za
(1051) Limpieza de Material
de Vidrio
(1064) Identificacin de Art-
culos de Origen Botnico por
Cromatografa en Capa Del-
gada de Alta Resolucin
(l 065) Cromatografa Jnica

(1086) Impurezas en Frma-
cos y Productos Farmacuti-
CDS

(1094) Cpsulas-Pruebas de
Disolucin y Atributos de
Calidad Relacionados

(1113) Caracterizacin, /den-
tificacin y Tipificacin de
Cepas Microbianas

(1151) Formas Farmacuticas

(1216) Friabilidad de las Ta-
bletas
(1251) Pesada en una Balan-
za Analtica
(1736) Aplicaciones de la Es-
pectrometra de Masas
(1852) Espectroscopa de Ab-
sorcin Atmica-Teora y
Prctica

(1853) Espectroscopa de
Fluorescencia-Teora y
Prctica

(1854) Espectroscopa en el
Infrarrojo Medio-Teora y
Prctica

(185 7) Espectroscopa Ultra-
violeta-Visible-Teora y
Prctica

(2021) Pruebas de Recuento
Microbiano-Suplementos
Nutricionales y Dietticos

(2022) Procedimientos Micro-
biolgicos para Comprobar
la Ausencia de Microorga-
nismos Especficos-Suple-
mentas Nutricionales y Die-
tticos
(2023) Atributos Microbiol-
gicos de los Suplementos
Nutriciona/es y Dietticos
No Estriles
(2030) Informacin Comple-
mentara para Artculos de
Origen Botnico

(2040) Desintegracin y Di-
solucin de Suplementos
Dietticos

(2091) Variacin de Peso de
Suplementos Dietticos
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 57

Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietticos (Continuacin)

Pruebas Universales Pruebas Especficas
Impurezas Seg u-
Valora- Disolven- Pruebas ridad/
Descrip- Identifica- cin/ Org- lnorg- tes Resl- Equipa- de Desem- Pu re-
Captulo cin cin Contenido nicas nlcas duales miento peo za
(2232) Contaminantes Ele-
mentales en Suplementos
Dietticos

(2250) Deteccin de Suple-
mentas Dietticos Irradiados
(2750) Prcticas de Fabrica-
cin para Suplementos Die-
tticos

Diagrama 13. Preparacin Magistral-Sustancia/Preparacin/Dispensacin
Impurezas
Rela-
clona- Relaclo-
Equl- das nadas
Caracterl- pa- con el con el
Descrip- ldentifl- Valora- Enva- zacln Flsl- Segurl- mlen- Proce- Produc-
Captulo Global cln cacln cln sado coqumlca dad to so to
(7) Etiquetado
(11) Estndares de Rete-

renda USP
(31) Aparatos Volumtri-
CDS
(41) Balanzas

(61) Examen Microbiol-
gico de Productos No
Estriles: Pruebas de Re-
cuento Microbiano
(62) Examen Microbiol-
gico de Productos No
Estriles: Pruebas de Mi-
croorganismos Especfi-

CDS

(71) Pruebas de Esterili-

dad
(81) Antibiticos-Va/o-
raciones Microbiolgicas
(85) Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas
(87) Pruebas de Reactivi-
dad Biolgica, In Vitro
(88) Pruebas de Reactivi-
dad Biolgica, In Vivo
(111) Diseo y Anlisis
de Valoraciones Biolgi-
cas

(191) Identificacin-
Pruebas Generales
(197) Pruebas de ldentifi-
cacin Espectrofotom-
tricas

(201) Prueba de ldentifi-
cacin por Cromatogra-
fa en Capa Delgada

(202) Identificacin de
Aceites Fijos por Croma-
tografa en Capa Delga-
da
58 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Diagrama 13. Preparacion Maalstral-Sustancla/Preparac-on/Dlspensaclon (Continuacion) -

Impurezas
Rela-
clona- Relacio-
Equl- das nadas
Caracterl- pa- con el con el
Descrip- ldentlfl- Valora- En va- zacln Flsl- Segurl- mlen- Proce- Produc-
Captulo Global cln cacln cln sado coqumlca dad to so to
(203) Procedimiento de
Cromatografa en Capa
Delgada de Alta Resolu-
cin para Identificacin
de Artculos de Origen
Botnico
(231) Metales Pesados

(541) Volumetra

(621) Cromatografa
(659) Requisitos de Enva-

sado y Almacenamiento
(660) Envases-Vidrio
( 661) Sistemas de Enva-

ses Plsticos y sus Mate-
ria/es de Construccin

(661.1) Materiales Plsti-
cos de Construccin
(661.2) Sistemas de En-
vases Plsticos para Uso
Farmacutico

(671) Envases-Pruebas
de Desempeo
(730) Espectroqumica de
Plasma
(731) Prdida por Secado
(736) Espectrometra de

Masas
(761) Espectroscopa de
Resonancia Magntica
Nuclear

(781) Rotacin ptica
(786) Estimacin de la

Distribucin del Tamao
de Partcula por Tami-
zado Analtico
(795) Preparacin Magis-
traf-Preparaciones No
Estriles

(797) Preparacin Magis-
tral-Preparaciones Es-
t riles

(823) Frmacos para To-
mografa de Emisin de
Positrones para Uso en
Preparaciones Magistra-
les, Investigacin Clnica
y Estudios Cientficos
(831) ndice de Retrae-
cin
(852) Espectroscopa de
Absorcin Atmica
(853) Espectroscopa de
Fluorescencia
(854) Espectroscopa en
el Infrarrojo Medio
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 59

., M ag1stra 1- ., )
DI agrama 13 p reparac1on sustanc1a
. /P reparac1on
,, /D"1spensacI'on (Contmuaoon
Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
Equi- das nadas
Caracteri- pa- con el con el
Descrip- ldentlfi- Valora- Enva- zacln Fisi- Seguri- mien- Proce- Produc-
Captulo Global cin cacln cln sado coqumica dad to so to
(855) Nefelometra, Tur-
bidimetra y Compara-
cin Visual

(85 7) Espectroscopa Uf-
travioleta-Visible
(9 21 ) Determinacin de
Agua
(1015) Aparatos Auto-
matizados de Sntesis
Radioqumica

(1031) Biocompatibilidad
de los Materiales Usa-
dos en Envases de Med-
comentos, Dispositivos

Mdicos e Implantes
(l 052) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Anlisis de Aminocidos

(1053) Electroforesis Ca-
pilar
(l 054) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
lsoelectroenfoque

(1055) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Mapeo de Pptidos

(1056) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida
(1057) Artculos Obteni-
dos por Biotecnologa-
Valoracin de Protenas
Totales
(1064) Identificacin de
Artculos de Origen Bo-
tnico por Cromatogra-
fa en Capa Delgada de

Alta Resolucin
(1065) Cromatografa l-
nica
(1066) Ambientes Fsicos
que Favorecen el Uso
Seguro de los Medica-
mentas
(1113) Caracterizacin,
Identificacin y Tipifica-
cin de Cepas Microbio-
nas
(1121) Nomenclatura
(1136) Envasado y Reen-

vasado-Envases Unita-
ros

(1151) Formas Forma-
cuticas
60 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales USP 39

Dlaarama 13. Preparacin Maalstral-Sustancla/Preparacln/DlsPensacln (Continuacin)

Impurezas
Rela-
clona- Relaclo-
Equi- das nadas
Caracterl- pa- con el con el
Descrip- ldentlfl- Valora- En va- zacln Flsl- Segurl- mien- Proce- Produc-
Captulo Global cln cacln cin sado coaumlca dad to so to
(11 52) Medicamentos
Veterinarios Usados en
Alimentos para Anima-
les
(1160) Clculos en la
Prctica Farmacutica
(1163) Garanta de Cali-
dad en la Preparacin
Magistral

(1176) Balanzas y Apa-
ratos Volumtricos para
Prescripciones

(1191) Consideraciones
sobre Estabilidad en la
Prctica de Dispensa-
cin
(1229) Esterilizacin de
Artculos Farmacopeicos
(1229.2) Esterilizacin
con Calor Hmedo de
Lquidos Acuosos

(1229.3) Monitoreo de la
Biocarqa
(1229.4) Esterilizacin de
Lquidos por Filtracin
(1229.6) Esterilizacin en
Fase Lquida
(1229.7) Esterilizacin
por Gases
(1229.8) Esterilizacin
por Calor Seco
(1229 .1 O) Esterilizacin
por Radiacin
(1229 .11) Esterilizacin
en Fase de Vapor
(1231) Agua para Uso
Farmacutico
(1251 ) Pesada en una
Balanza Analtica
(1265) Informacin Escri-
ta de los Medicamentos
Recetados-Guas

(1660) Envases de Vi-
drio-Eva/uacin de la
Durabilidad de la Super-
ficie Interna
(1661) Evaluacin de Sis-
temas de Envases Plsti-
cos y sus Materiales de
Construccin con Res-
pecto a su Impacto so-

bre la Seguridad del
Usuario
USP 39 Gua de los Captulos Generales/ Diagrama de Captulos 61

Diagrama 13. Preparacin Magistral-Sustancia/Preparacin/Dispensacin (Continuacin)

Impurezas
Rela-
clona- Re lacio-
Equi- das nadas
Caracterl- pa- con el con el
Descrip- ldentlfl- Valora- Enva- zacin Fisi- Seguri- mien- Proce- Produc-
Captulo Global cin cacln cln sado coqumlca dad to so to
(1663) Evaluacin de
Sustancias Extrables Re-
lacionadas con Envases
Farmacuticos y Siste-

mas de Administracin
(1664) Evaluacin de
Sustancias Lixiviables en
Medicamentos Relacio-
nadas con Envases Far-
macuticos y Sistemas
de Administracin
(1736) Aplicaciones de la
Espectrometra de Ma-
sas

(1 761) Aplicaciones de la
Espectroscopa de Reso-
nancia Magntica Nu-
clear
(1852) Espectroscopa de
Absorcin Atmica-
Teora y Prctica

(1853) Espectroscopa de
Fluorescencia-Teora y
Prctica

(1854) Espectroscopa en
el Infrarrojo Medio-
Teora y Prctica

(185 7) Espectroscopa UI-
travioleta-Visible-Teo-
ra y Prctica

USP 39
Gua para los Captulos
Generales
(Para obtener la lista alfabtica completa de los captulos generales de esta Farmacopea, consulte "Captulos Generales" en el
PRUEBAS V VALORACIONES GENERALES
Requisitos Generales para
Pruebas y Valoraciones
(1) Inyectables ............................. 57
(2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad del
Producto ............................. 71
(3) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas
de Calidad del Producto .................. 76
(4) Medicamentos para Mucosas-Pruebas de
Calidad del Producto ..................... 82
(5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin-
Informacin General y Pruebas de Calidad
del Producto .......................... 86
(7) Etiquetado ............................. 95
(11) Estndares de Referencia USP .............. 101
Aparatos para Pruebas y Valoraciones
(1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos
de Venta Bajo Receta ................... 104
(21) Termmetros ......................... 107
(31) Aparatos Volumtricos ................... 107
(41) Balanzas ............................. 108
Pruebas Microbiolgicas
(51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana .......... 109
(55) Indicadores Biolgicos-Pruebas de Resistencia ... .
...................................... 112
(61) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles:
Pruebas de Recuento Microbiano .......... 115
(62) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles:
Pruebas de Microorganismos Especficos ..... 122
(63) Pruebas para Micoplasmas ................ 130
(71) Pruebas de Esterilidad ................... 136
Pruebas y Valoraciones Biolgicas
(81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas .... 144
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas .......... 163
(87) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro ..... 169
(88) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo ..... 171
(89) Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares en
la Fabricacin de Productos Farmacuticos .... 1 77
(90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y
Pruebas de Funcionalidad ................ 180
(91) Valoracin de Pantotenato de Calcio ......... 184
(92) Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la
Fabricacin de Productos de Terapia Celular ... 186
Gua para los Captulos Generales 63
ndice.)
(111) Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas ... 190
(115) Valoracin de Dexpantenol ............... 207
(121) Valoracin de Insulina .................. 208
(121.1) Procedimientos Analticos Fisicoqumicos
para Insulinas ....................... 211
(123) Pruebas de Identidad Biolgica de Glucagn .. 213
(124) Valoraciones Biolgicas de Eritropoyetina ..... 216
(126) Pruebas de Identidad Biolgica de
Somatropina ........................ 218
(129) Procedimientos Analticos para Anticuerpos Mono-
clonales Recombinantes de Uso Terapeutico .. 218
(1 30) Atributos de Calidad de la Protena A ....... 220
(151) Prueba de Pir9enos ................... 228
(161) Dispositivos Medicos-Pruebas de Endotoxinas
Bacterianas y Pirgenos ................ 229
(162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftrica en
lnmunoglobulinas Humanas ............. 218
(1 71) Valoracin de Actividad de Vitamina B11 ..... 230
Pruebas y Valoraciones Qumicas
Pruebas de Identificacin
(181) Identificacin-Bases Orgnicas Nitroge-
nadas ............................. 233
(191) Identificacin-Pruebas Generales .......... 233
(193) ldentificacin-Tetraciclinas .............. 237
(197) Pruebas de Identificacin Espectrofoto-
mtrica ............................ 237
(201) Prueba de Identificacin por Cromatografa en
Capa Delgada ....................... 239
(202) Identificacin de Aceites Fijos por Cromato-
grafa en Capa Delgada ................ 239
(203) Procedimiento de Cromatowafa en Capa
Delgada de Alta Resolucion para Identifi-
cacin de Artculos de Origen Botnico .... 239
Pruebas de Lmite
(206) Aluminio ............................ 240
(207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro de
Enoxaparina Sdica ................... 241
(208) Valoracin de Actividad Anti-Factor Xa y
Anti-Factor lla para Heparinas No Fraccionadas y
de Bajo Peso Molecular ................ 246
(209) Determinaciones de Peso Molecular de
Heparinas de Bajo Peso Molecular ......... 250
(211) Arsnico ............................ 252
(212) Anlisis de Oligosacridos ............... 252
(221) Cloruros y Sulfatos .................... 254
(223) Dimetilanilina ........................ 255
(226) 4-Epianhidrotetraciclina ................. 255
64 Gua para los Captulos Generales
(227) 4-Aminofenol en Medicamentos que Contienen
Acetaminofeno ...................... 256
(228) xido de Etileno y Dioxano .............. 257
(231) Metales Pesados ...................... 260
(232) Impurezas Elementales-Lmites ........... 262
(233) Impurezas Elementales-Procedimientos ..... 265
(241) Hierro .............................. 269
(251) Plomo ............................. 270
(261) Mercurio ............................ 271
(267) Porosimetra por Intrusin de Mercurio ...... 274
(268) Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin
de Nitrgeno ....................... 277
(271) Prueba para Sustancias Fcilmente Carbo-
nizables ........................... 281
(281) Residuo de Incineracin ................. 281
(291) Selenio ............................. 282
Otras Pruebas y Valoraciones
(301) Capacidad Neutralizante de cido ......... 282
(311) Valoracin de Alginatos ................. 284
(341) Agentes Antim[crobianos-Contenido ....... 285
(345) Valoracin de Acido Ctrico/Citrato y Fosfato .. 288
(351) Valoracin de Esteroides ................. 289
(371) Valoracin de Cobalamina con Marcador
Radioactivo ......................... 290
(381) Tapones Elastomricos para Inyectables ...... 291
(391) Valoracin de Epinefrina ................. 297
(401) Grasas y Aceite,s Fijos ................... 298
(411) Valoracin de Acido Flico ............... 313
(413) Anlisis de Impurezas en Gases Medicinales ... 313
(415) Valoracin de Gases Medicinales ........... 314
(425) Antibiticos-Valoracin Yodomtrica ....... 317
(429) Medicin del Tamao de Partcula por
Difraccin de Luz ..................... 318
(431) Determinacin de Grupos Metoxilo ........ 323
(441) Valoracin de Niacina o Niacinamida ....... 325
(451) Volumetra con Nitrito .................. 330
(461) Determinacin de Nitrgeno ............. 330
(466) Impurezas Comunes ................... 331
(467) Disolventes Residuales .................. 333
(469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol
en Sustancias Etoxiladas ................ 348
(471) Combustin en Matraz con Oxgeno ....... 350
(481) Valoracin de Riboflavina ................ 350
(501) ~ales de Bases Orgnicas Nitrogenadas ...... 351
(503) Acjdo Actico en Pptidos ............... 352
(503.1) Acido Trifluoroactico en Pptidos ........ 352
(511) Valoracin de un Esteroide Aislado ......... 352
(525) Dixido de Azufre ..................... 353
(531) Valoracin de Tiamina .................. 358
(541) Volumetra .......................... 359
(551) Valoracin de Vitamina E ................ 362
(561) Artculos de Origen Botnico ............. 370
(563) Identificacin de Artculos de Origen
Botnico ........................... 384
(565) Extractos Botnicos .................... 397
(571) Valoracin de Vitamina A ................ 400
(580) Valoracin de Vitamina C ................ 405
(581) Valoracin de Vitamina D ................ 405
(591) Determinacin de Cinc ................. 415
Pruebas y Determinaciones Fsicas
(601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin:
Pruebas de Calidad de Desempeo
de Aerosoles, Atomizadores y Polvos ....... 416
(602) Propelentes .......................... 442
(603) Aerosoles Tpicos ..................... 444
(604) Velocidad de Fuga ..................... 445
(61 O) Mtodos de Muestreo Microbiolgico
Alternativos para Productos Nasales
e Inhaladores No Estriles ............... 445
(611) Determinacin de Alcohol ............... 447
USP 39
(616) Densidad Aparente y Densidad por Asenta-
miento de los Polvos .................. 449
(621) Cromatografa ........................ 453
(631) Color y Acromatismo ................... 464
(641) Totalidad de la Disolucin ............... 465
(643) Carbono Orgnico Total ................. 466
(645) Conductividad del Agua ................. 467
(651) Temperatura de Solidificacin ............. 471
(659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento ... 472
(660) Envases-Vidrio ....................... 481
(661) Sistemas de Envases Plsticos y sus Materiales de
Construccin ....................... 487
(661.1) Materiales Plsticos de Construccin ...... 487
(661.2) Sistemas de Envases Plsticos para Uso
Farmacutico ....................... 487
(670) Envases-Componentes Auxiliares .......... 494
(671) Envases-Pruebas de Desempeo .......... 497
(691) Algodn ............................ 505
(695) Cristalinidad ......................... 507
(696) Caracterizacin de Slidos Cristalinos por Micro-
calorimetra y Calorimetra de Disolucin .... 507
(697) Contenido en Envases para Inyectables ...... 51 O
(698) Volumen de Entrega ................... 511
(699) Densidad de Slidos ................... 514
(701) Desintegracin ....................... 516
(705) Atributos de Calidad para Tabletas Cuyo
Etiquetado Indica Ranurado Funcional ...... 519
(711) Disolucin .......................... 520
(721) Intervalo de Destilacin ................. 531
(724) Liberacin de Frmacos ................. 532
(729) Distribucin del Tamao de Glbulos en
Emulsiones Inyectables de Lpidos ........ 538
(730) Espectroqumica de Plasma .............. 541
(731) Perdida por Secado .................... 549
(733) Prdida por Incineracin ................ 549
(735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X .. 550
(736) Espectrometra de Masas ................ 555
(741) Intervalo o Temperatura de Fusin ......... 561
(751) Partculas Metlicas en Ungentos
Oftlmicos ......................... 564
(755) Llenado Mnimo ...................... 564
(761) Espectroscopa de Resonancia Magntica
Nuclear ............................ 565
(771) Productos Oftlmicos-Pruebas de Calidad ... 575
(776) Microscopja Optica .................... 575
(781) Rotacin Optica ...................... 578
(785) Osmolalidad y Osmolaridad .............. 579
(786) Estimacin de la Distribucin del Tamao de
Partcula por Tamizado Analtico .......... 582
(787) Partculas Subvisibles en Inyectables de
Protenas Teraputicas ................. 586
(788) Partculas en Inyectables ................ 589
(789) Partculas en Soluciones Oftlmicas ......... 593
(790) Partculas Visibles en Inyectables ........... 594
(791) pH ................................ 595
(795) Preparacin Magistral-Preparaciones No
Estriles ............................ 599
(797) Preparacin Magistral-Preparaciones
Estriles ............................ 608
(801) Polarografa ......................... 657
(811) Finura de Polvos ...................... 661
(821) Radioactividad ........................ 662
(823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Posi-
trones para Uso en Preparaciones Magistrales,
, Investigacin Cl~~ica y Estudios Cientficos ... 674
(8 31) Indice de Refracc1on ................... 684
(841 ) ~eso Especfico ....................... 685
(846) Area Superficial Especfica ................ 686
(851 ) Espectrofotometra y Dispersin de Luz ...... 690
(852) Espectroscopa de Absorcin Atmica ....... 698
(853) Espectroscopa de Fluorescencia ........... 702
(854) Espectroscopa en el Infrarrojo Medio ....... 709
(855) Nefelometna, Turbidimetra y Comparacin
Visual ............................. 709
(857) Espectroscopa Ultravioleta-Visible .......... 713
USP 39
(861) Suturas-Dimetro .................... 720
(871) Suturas-Sujecin de Agujas .............. 721
(881) Resistencia a la Tensin ................. 722
(891) Anlisis Trmico .............. ... : ; ..... 723
(905) Uniformidad de Unidades de Dos1f1cac1on .... 727
(911) Viscosidad-Mtodos Capilares ............ 731
(912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios ........... 733
(91 3) Viscosidad-M~todo de Bola R?dante .... ; ... 738
(914) Viscosidad-Metodos por Medida de Pres1on .. 738
(921) Determinacin de Agua ................. 740
(941) Caracterizacin de _Sli~os Cristali_nos . ,
y Parcialmente Cristalinos por D1fracc1on
de Rayos X sobre Polvo (DRXP) ........... 744
INFORMACIN GENERAL
(1005) Emisin Acstica ..................... 752
(101 O) Datos Analticos-Interpretacin y Trata-
miento ........................... 756
(1015) Aparatos Automatizados de Sntesis
Radioqumica ....................... 772
(1024) Suero Bovino ........................ 774
(1025) Pancreatina ......................... 774
(1027) Citometra de Flujo : .... : . ; . : ......... 788
(1030) Captulos de Valoraciones B1olog1cas-lnfor-
macin General Glosario ............. 806
(1031) Biocompatibilida de los Mate.ria le~ ~sacios en
Envases de Medicamentos, D1spos1t1vos
Mdicos e Implantes ................. 818
(1032) Diseo y Desarrollo de Valoraciones
Biolgicas ......................... 829
(1033) Validacin de Valoraciones Biolgicas ...... 849
(1034) Anlisis de Valor~c~ones Biolgica_s..... ; ..... 866
(1035) Indicadores Biolog1cos para Estenl1zac1on .... 880
(1041) Productos Biolgicos .................. 885
(1043) Ma,teriales Auxiliares _pa_ra ~roductos Celulares,
Genicos y de lngen1ena Tisular .......... 886
(1044) Crioconservacin de Clulas ............. 895
(1 045) Artculos Obtenidos por Bi?tecnologf~ ...... 909
(1046) Productos Derivados de Celulas y Tejidos .... 925
(1047) Productos de Terapia Gnica . ; . : ..... ; .... 958
(1048) Calidad de Productos Biotecnolog1cos: Anal1s1s de
la Construccin Expresable en Clulas Usadas
para la Produccin de Produ~tos Protenicos
Obtenidos con ADN Recombinante ....... 990
(1049) Calidad de Productos Biotecno~gicos: ?r~ebas
de Estabilidad de Productos B1otecnolog1cos
o Biol9icos ........................ 993
(1050) Evaluacion, d~ la Seguri~ad Viral ~n Productos
Biotecnolog1cos Obtenidos de Lineas
Celulares de Origen Humano o Animal .... 998
(1051) Limpieza de Material de Vidrio ... , ..... 1012
(1052) Artculos Obtenidos por Biotecnolog1a-
Anlisis de Aminocidos .............. 101 2
(1053) Electroforesis Capilar ................. 1026
(1054) Artculos Obtenidos por Biotecnologa-
lsoelectroenfoque ................... 1034
(1055) Artculos Obtenidos por Biotecnologa-
Mapeo de Pptidos .......... , ...... 1037
(1056) Artculos Obtenidos por Biot.ecn_olo~1a
Electroforesis en Gel de Pohacnlam1da .... 1043
(1057) Artculos Obtenidos por Biotecnologa-
Valoracin de Protenas Totales ......... 1050
(1058) Calificacin de Instrumentos Analticos .... 1055
(1059) Desempeo de Excipientes ............. 1061
(1061) Color-Medicin Instrumental . _. ..... ; .. 1083
(1064) Identificacin de Artculos de Origen Botan1co
por Cromato~rafa en Capa Delgada de
Alta Resolucion .................... 1086
(1065) Cromatografa lnica ................. 1086
(1066) Ambientes Fsicos que Favorecen el Uso
Seguro de los Medicamentos .......... 1089
(1072) Desinfectantes y Antispticos ........... 1097
Gua para los Captulos Generales 65
(1074) Guas para la Evaluacin de la Seguridad
Biolgica de los Excipientes ............ 1103
(1078) Buenas Prcticas de Fabricacin para Excipientes
Farmacuticos a Granel ............... 1107
(1079) Buenas Prcticas de Almacenamiento y
Distribucin para Medicamentos ....... 1125
(1080) Excipientes Farmacuticos a Granel-
Certificado de Anlisis ................ 11 36
(1084) Anlisis de Glicoprotenas y Glicanos-
Consideraciones Generales ............ 1144
(1086) Impurezas en Frmacos y Productos
Farmacuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1155
(1087) Disolucin Intrnseca Apar~nte~~rocedi-
mientos de Pruebas de D1soluc1on para
Disco Rotatorio y Disco Estacionario ..... 1158
(1088) Evaluacin In Vivo e In Vitro de Formas
Farmacuticas ..................... 1163
(1090) Evaluacin de Desempeo del Producto Fa_rma-
cutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia
y Disolucin .............. : ........ 1175
(1 091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos ...... 1184
(1092) Procedimiento de Disolucin: Desarrollo
y Validacin ....................... 1184
(1094) Cpsulas-Prueb~s de Disol_ucin y
Atributos de Calidad Relacionados ....... 1193
(1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos
a Granel ......................... 1202
(11 02) Mtodos de Pruebas Inmunolgicas-
Consideraciones Generales ............ 1216
(1103) Mtodos de Pruebas Inmunolgicas-
Ensayo por lnmunoadsorcin Ligado a
Enzimas (ELISA) .................... 1225
(1104) Mtodos de Pruebas lnmunolg_icas-
Anlisis por lnmunotransferenc1a ........ 1236
(11 05) Mtodos de Pruebas l~munolgi~as-
Resonancia de Plasmon Superficial ....... 1249
(11 06) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseo y
Validacin de lnmunoensayos para Detectar
Anticuerpos Antifrmacos ............. 1266
(11 06.1) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseo y
Validacin de Ensayos para Detectar
Anticuerpos Neutralizantes Antifrmacos .. 1266
(1111) Examen Microbiolgico de Pr~ductos No
Estriles: Criterios de Aceptacin para
Preparaciones Farmacuticas y Sustancias
de Uso Farmacutico ................ 1284
(1112) Determinacin de Actividad de A9ua en
Productos Farmacuticos No Esteriles ..... 1285
(1113) Caracterizacin, Identificacin y
Tipificacin de Cepas Mi_crob1anas ........ 1288
(1115) Control de Biocarga de Farmacos y Medi-
camentos No Estriles ................ 1293
(1116) Control Microbiolgico Y. Monito~eo. de
Ambientes de Procesamiento Asept1co .... 1300
(111 7) ptimas Prcticas de Laboratorio
Microbiolgico ..................... 1 314
(1118) Dispositivos de Monitoreo-Tiempo,
Temperatura y Humedad ............. 1321
(1119) Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano .... 1 328
(1120) Espectroscopa Raman ................ 1335
(1121) Nomenclatura ..... , ................. 1343
(1125) Tcnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Generalidades .... , ................ 1 346
(1126) Tcnica~ Basadas ~~ Acidos Nuc~ei~C?s
Extraccion, Detecc1on,y Secuenc1ac1on ..... 1352
(1127) Tcnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Amplificacin ..... , ................. 1 362
(1128) Tcnicas Basadas en Acidos Nucle1cos-
Micromatrices .... ,. ........ : ....... 1373
(1129) Tcnicas Basadas en Acidos Nucle1cos-
Genotipificacin ... , ........ : ....... 1380
(1130) Tcnicas Basadas en Acidos Nucle1c9s-
Enfoques para Detectar Trazas de Acidos
Nucleicos (Anlisis de ADN Residual) ..... 1 385
66 Gua para los Captulos Generales
(11 32) Medicin de Protena Residual
de Clulas Husped en Productos
Biofarmacuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1385
(11 36) Envasado y Reenvasado-Envases
Unitarios ......................... 1388
(1151) Formas Farmacuticas ................ 1398
(1152) Medicamentos Veterinarios Usados en
Alimentos para Animales .............. 1424
(1160) Clculos en la Prctica Farmacutica ...... 1426
(1163) Garanta de Calidad en la Preparacin
Magistral ......................... 1441
(1171) Anlisis por Solubilidad de Fases ......... 1447
(1174) Fluidez de Polvos .................... 1450
(1176) Balanzas y Aparatos Volumtricos para
Prescripciones ..................... 1454
(11 77) Buenas Prcticas de Envasado ........... 1456
(1178) Buenas Prcticas de Reenvasado ......... 1459
(1180) Plasma Humano .................... 1462
(1181) Microscopa Electrnica de Barrido ....... 1487
(1184) Pruebas de Sensibilizacin ............. 1497
(1191) Consideraciones sobre Estabilidad en la
Prctica de Dispensacin ............. 1509
(1195) Gua sobre Cambios Significativos en
Excipientes Farmacuticos a Granel ...... 1514
(1197) Buenas Prcticas de Distribucin para
Excipientes Farmacuticos a Granel ...... 1526
(1207) Envasado de Productos Estriles-Evaluacin
de Integridad ...................... 1551
(1208) Pruebas de Esterilidad-Validacin de Sistemas
Aisladores ........................ 1553
(1209) Esterilizacin-Indicadores e Integradores
Qumicos y Fisicoqumicos ............ 1558
(1211) Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de
Artculos Farmacopeicos .............. 1561
(1216) Friabilidad de las Tabletas .............. 1566
(1217) Fuerza de Ruptura de las Tabletas ........ 1567
(1222) Productos Farmacuticos con Esterilizacin
Terminal-Liberacin Paramtrica ....... 1571
(1223) Validacin de Mtodos Microbiolgicos
Alternativos ....................... 1575
(1223.1) Validacin de Mtodos Alternativos para
Valoraciones Microbiolgicas de
Antibiticos ...................... 1575
(1224) Transferencia de Procedimientos Analticos .. 1579
(1225) Validacin de Procedimientos Farma-
copeicos ......................... 1581
(1226) Verificacin de Procedimientos Farma-
copeicos ......................... 1587
(1227) Validacin de Recuperacin Microbiana en
Artculos Farmacopeicos .............. 1588
(1229) Esterilizacin de Artculos Farmacopeicos ... 1593
(1229 .1) Esterilizacin con Vapor de Agua por
Contacto Directo ................. 1598
(1229.2) Esterilizacin con Calor Hmedo de
Lquidos Acuosos ................. 1602
(1229.3) Monitoreo de la Biocarga ............ 1607
(1229.4) Esterilizacin de Lquidos por Filtracin ... 161 O
(1229.6) Esterilizacin en Fase Lqurda .......... 1618
(1229.7) Esterilizacin por Gases .............. 1621
(1229.8) Esterilizacin por Calor Seco .......... 1624
(1229 .10) Esterilizacin por Radiacin .......... 1626
(1229 .11) Esterilizacin en Fase de Vapor ........ 1626
(1230) Agua para Uso en Hemodilisis .......... 1631
(1231) Agua para Uso Farmacutico ........... 1632
(1234) Vacunas para Uso Humano-Vacunas
de Polisacridos y Glicoconjugados ...... 1662
(1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones
Generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1680
(1237) Mtodos de Pruebas Virolgicas ......... 1698
(1238) Vacunas para Uso Humano-Vacunas
Bacterianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 720
(1240) Anlisis de Virus en Plasma Humano para
Fabricacin Posterior ................ 1 734
(1241) Interacciones Agua-Slido en Sistemas
Farmacuticos ..................... 1745
USP 39
(1251) Pesada en una Balanza Analtica ......... 1750
(1265) Informacin Escrita de los Medicamentos
Recetados-Guas ................... 1755
(1285) Preparacin de Muestras Biolgicas para
Anlisis Histolgico e lnmunohisto-
qumico ......................... 1757
(1285.1) Tincin con Hematoxilina y Eosina de Cortes
de Tejidos para Examen Microscpico .. 1762
(1601) Productos para Nebulizacin-Pruebas de
Caracterizacin .................... 1765
(1644) Teora y Prctica de Mediciones de
Conductividad Elctrica de Soluciones .... 1768
(1660) Envases de Vidrio-Evaluacin de la
Durabilidad de la Superficie Interna ...... 1776
(1661) Evaluacin de Sistemas de Envases Plsticos
y sus Materiales de Construccin
con Respecto a su Impacto sobre la
Seguridad del Usuario ............... 1776
(1663) Evaluacin de Sustancias Extrables Relacionadas
con Envases Farmacuticos y Sistemas de
Administracin .................... 1776
(1664) Evaluacin de Sustancias Lixiviables en
Medicamentos Relacionadas con Envases
Farmacuticos y Sistemas de
Administracin .................... 1776
(1664.1) Medicamentos Nasales y para Inhalacin
Oral ............................ 1776
(1724) Medicamentos Semislidos-Pruebas de
Desempeo ....................... 1 781
(1730) Espectroqumica de Plasma-Teora y
Prctica .......................... 1567
(1 735) Espectrometra de Fluorescencia de
Rayos X-Teora y Prctica ............ 1567
(1 736) Aplrcaciones de la Espectrometra de
Masas ........................... 1795
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopa de
Resonancia Magntica Nuclear ......... 1818
(1771) Productos Oftlmicos-Pruebas de
Desempeo ....................... 1567
(1787) Medicin de Partculas Subvisibles en
Inyectables de Protenas Teraputicas ..... 1840
(1788) Metodos para la Determinacion de Partculas
en Inyectables y Soluciones Oftlmicas .... 1855
(1852) Espectroscopa de Absorcin Atmica-Teora
y Prctica ........................ 1870
(1853) Espectroscopa de Fluorescencia-Teora
y Prctica ........................ 1880
(1854) Espectroscopa en el Infrarrojo Medio-Teora
y Prctica ........................ 1890
(1857) Espectroscopa Ultravioleta-Visible-Teora
y Prctica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1900
(1911) Reometra ......................... 191 O
SUPLEMENTOS DIETTICOS
(2021) Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos
Nutricionales y Dietticos ............. 191 7
(2022) Procedimientos Microbiolgicos para Comprobar
la Ausencia de Microorganismos Especficos-
Suplementos Nutricionales y Dietticos ... 1922
(2023) Atributos Microbiolgicos de los Suplementos
Nutricionales y Dietticos No Estrrles .... 1929
(2030) Informacin Complementaria para Artculos de
Origen Botnico .................... 1932
(2040) Desintegracin y Disolucin de Suplementos
Dietticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1942
(2091) Variacin de Peso de Suplementos
Dietticos ........................ 1950
(2232) Contaminantes Elementales en Suplementos
Dietticos ........................ 1951
(2250) Deteccin de Suplementos Dietticos
Irradiados ........................ 1955
(2750) Prcticas de Fabricacin para Suplementos
Dietticos ........................ 1958
USP 39 Requisitos Generales/ (1) Inyectables 67

Captulos Generales
Pruebas y Valoraciones Generales

Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones

(1) INYECTABLES

(Este captulo ser oficial hasta el 30 de abril de 2016)

Ver (1) Medicamentos Inyectables y en Implantes (Parenterales}--Pruebas de Calidad del Producto

INTRODUCCIN
Los artculos parenterales son preparaciones destinadas a la inyeccin a travs de la piel u otro tejido externo, en lugar de la
va alimentaria, administrando las sustancias activas que contienen directamente en un vaso sanguneo, rgano, tejido o lesin,
usando la fuerza de la gravedad u otra fuerza. Los artculos parenterales se preparan meticulosamente mediante mtodos dise-
ados para garantizar el cumplimiento de los requisitos establecidos por la Farmacopea en lo referente a esterilidad, pirgenos,
partculas y otros contaminantes. Cuando corresponde, contienen inhibidores del crecimiento de microorganismos. Una inyec-
cin es una preparacin destinada para la administracin parenteral, y/o para reconstituir o diluir un artculo antes de su admi-
nistracin parenteral.

NOMENCLATURA Y DEFINICIONES

Nomenclatura1

La siguiente nomenclatura corresponde a cinco tipos generales de preparaciones apropiadas y destinadas para la administra-
cin parenteral. Pueden contener amortiguadores del pH, conservantes y otras sustancias agregadas.
1. Inyeccin de [FRMACO]-Preparaciones lquidas que son frmacos o sus soluciones. [NOTA-En los ttulos de las monogra-
fas y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexacin, este nombre aparece en forma invertida, como [FRMACO],
Inyeccin.]
2. [FRMACO} para Inyeccin-Slidos secos que al agregarles vehculos adecuados constituyen soluciones que cumplen con
todos los requisitos para Inyecciones.
3. Emulsin Inyectable de [FRMACO]-Preparaciones lquidas de frmacos disueltos o dispersos en un medio emulsionante
adecuado. [NOTA-En los ttulos de las monografas y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexacin, este nombre
aparece en forma invertida, como [FRMACO], Emulsin Inyectable.]
4. Suspensin Inyectable de [FRMACO]-Preparaciones lquidas de slidos suspendidos en un medio lquido adecuado.
[NOTA-En los ttulos de las monografas y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexacin, este nombre aparece
en forma invertida como [FRMACO], Suspensin Inyectable.]

1 El Comit de Nomenclatura de Frmacos de la USP ha adoptado esta nomenclatura para implementarla mediante revisiones suplementarias de USP 34-NF 29.
Para los ttulos de las monografas oficiales vigentes de la forma [FRMACO] Estril que no hayan sido revisados todava, la siguiente nomenclatura contina en uso
en esta Farmacopea: (1) los frmacos, o sus soluciones o emulsiones, aptas para inyeccin, llevan ttulos de la forma [FRMACO], Inyeccin; (2) los slidos secos o
lquidos concentrados que no contengan amortiguadores del pH, diluyentes ni otras sustancias agregadas y que, al aadir los disolventes adecuados, constituyen
soluciones que cumplen con los requisitos para Inyecciones en todos los aspectos, y que se distinguen mediante ttulos de la forma [FRMACO] Estril; (3) las
mismas preparaciones descritas en (2) excepto que stas contienen uno o ms amortiguadores del pH, diluyentes, u otras sustancias agregadas, y que se
identifican por ttulos de la forma [FRMACO] para Inyeccin; (4) slidos suspendidos en un medio lquido adecuado y que no son para inyeccin por va
intravenosa o intratecal, se identifican por ttulos de la forma [FRMACO], Suspensin Estril; y (5) slidos secos que, al agregarles vehculos adecuados, forman
preparaciones que cumplen con todos los requisitos para las Suspensiones Estriles y se distinguen por ttulos de la forma [FRMACO] Estril para Suspensin.
68 (1) Inyectables/ Requisitos Generales USP 39

5. [FRMACO] para Suspensin Inyectable-Slidos secos que al aadirles vehculos adecuados constituyen preparaciones que
cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables.

Definiciones

PRODUCTOS BIOLGICOS

Las definiciones Farmacopeicas de preparaciones estriles para uso parenteral no se aplican generalmente en el caso de pro-
ductos biolgicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Biolgicos (1041 )).

INGREDIENTES

Vehculos y Sustancias Agregadas

Vehculos Acuosos-Los vehculos para Inyecciones acuosas cumplen con los requisitos de la Prueba de Pirgenos (151) o
de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), segn corresponda. El Agua para Inyeccin se emplea generalmente como vehcu-
lo, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. El cloruro de sodio se puede agregar en cantidades
suficientes para convertir la solucin resultante en isotnica; y la Inyeccin de Cloruro de Sodio, o la Solucin de Ringer Inyectable,
pueden reemplazar parcial o totalmente al Agua para Inyeccin, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. Para condiciones aplicables a otros adyuvantes, ver Sustancias Agregadas en este captulo.
Otros Vehculos-Los aceites fijos empleados como vehculos para Inyecciones no acuosas son de origen vegetal, son ino-
doros o prcticamente inodoros, y no tienen ningn olor que sugiera rancidez. Cumplen con los requisitos de la prueba para
Parafina Slida en Aceite Mineral, mantenindose el bao fro a 1O, tienen un ndice de Saponificacin entre 185 y 200 (ver
Grasas y Aceites Fijos (401 )), tienen un ndice de Yodo entre 79 y 141 (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )), y cumplen con los requi-
sitos de las pruebas siguientes.
Materia lnsaponificable (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No ms de 1,5%
ndice de Acidez (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No ms de 0,2
ndice de Perxido (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No ms de 5,0
Determinacin de Agua, Mtodo le (921 ): No ms de O, 1 %
Lmite de Cobre, Hierro, Plomo y Nquel-[NoTA-La prueba para nquel se requiere nicamente si el aceite ha sido sometido
a hidrogenacin o si se ha usado un catalizador de nquel durante el procesamiento.] Proceder segn se indica en la seccin
Trazas de Metales en Grasas y Aceites Fijos (401 ). No se encuentra ms de 1 ppm de cobre; no se encuentra ms de 1 ppm de
hierro; no se encuentra ms de 1 ppm de plomo; y no se encuentra ms de 1 ppm de nquel.
Los monoglicridos o diglicridos sintticos de cidos grasos se pueden emplear como vehculos, siempre que sean lquidos,
se mantengan transparentes cuando se enfran a 1 O y presenten un ndice de Yodo no mayor de 140 (ver Grasas y Aceites Fijos
(401 )).
Se pueden emplear estos y otros vehculos no acuosos, siempre que sean seguros, en el volumen de la Inyeccin administra-
da y siempre que no interfieran con la eficacia teraputica de la preparacin o con su respuesta a las valoraciones y pruebas
especificadas.
Sustancias Agregadas-Se pueden agregar sustancias adecuadas para aumentar la estabilidad o la utilidad de las inyeccio-
nes, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, siempre que sean inocuas en las cantidades admi-
nistradas y no interfieran con la eficacia teraputica o con las respuestas a las valoraciones o pruebas especificadas. No se pue-
den agregar colorantes a una solucin destinada a la administracin parenteral con el nico propsito de conferir color a la
preparacin terminada (ver adems Sustancias Agregadas en Advertencias Generales y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )).
Debe tenerse especial cuidado en la eleccin y empleo de sustancias agregadas en las preparaciones para inyeccin que se
administran en un volumen superior a 5 ml. A menos que se especifique algo diferente, prevalecen los siguientes lmites mxi-
mos: 0,01 % para agentes que contengan mercurio y para compuestos tensoactivos catinicos; 0,5% para clorobutanol, cresol,
fenal y sustancias de tipo similar; y 0,2% para dixido de azufre, o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito, o metabisulfi-
to de potasio o de sodio.
A las preparaciones destinadas para inyeccin que se presenten en envases multidosis, independientemente del mtodo de
esterilizacin empleado, se les debe agregar una sustancia o una mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento
de microorganismos, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) hay instrucciones diferentes en la mono-
grafa individual; (2) la sustancia contiene un radionucleido con una vida media fsica de menos de 24 horas; o (3) los ingre-
dientes activos son antimicrobianos. Tales sustancias se emplean en concentraciones que impidan el crecimiento o la existencia
de los microorganismos en las preparaciones para inyeccin. Tales sustancias cumplen adems con los requisitos de Pruebas de
Eficacia Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ). Los procesos de esterilizacin han de ser usados aun-
que se empleen dichas sustancias (ver adems Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos (1211 )). Se pue-
de extraer el aire del envase, o desplazarlo con un gas qumicamente inerte. Cuando as se especifique en una monografa, el
etiquetado debe incluir informacin sobre la sensibilidad al oxgeno del artculo.
USP 39 Requisitos Generales/ (1) Inyectables 69

ETIQUETAS Y ETIQUETADO

Etiquetado

NOTA-Ver las definiciones de "etiqueta" y "etiquetado" en la seccin 10.40, Etiquetado del apartado 1 O. Conservacin, Enva-
sado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales.
La etiqueta indica el nombre de la preparacin; en el caso de una preparacin lquida, el contenido porcentual de frmaco o
la cantidad de un frmaco en un volumen especificado; en el caso de una preparacin seca, la cantidad de ingrediente activo;
la va de administracin; una declaracin de las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad; el nombre y el domi-
cilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor; y un nmero de lote identificativo. El nmero de lote puede proporcio-
nar todo el historial de fabricacin del envase especfico, incluyendo todas las operaciones de fabricacin, llenado, esteriliza-
cin y etiquetado.
Cuando una monografa individual permita variar las concentraciones de los ingredientes activos en la preparacin parente-
ral de gran volumen, se indica la concentracin de cada ingrediente nombrado en el ttulo oficial como si fuera parte del ttulo
oficial, es decir, Dextrosa 5%, Inyeccin; o Dextrosa (5%) y Cloruro de Sodio (0,2%), Inyeccin.
El etiquetado incluye la siguiente informacin si no se especifica la frmula completa en la monografa individual: (1) En el
caso de una preparacin lquida, el contenido porcentual de cada ingrediente o la cantidad de cada ingrediente en un volu-
men especificado, salvo que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado o para hacer isotnica la solucin se puedan
declarar por el nombre y una indicacin acerca de su efecto; y (2) en el caso de una preparacin seca u otra preparacin a la
que se va a agregar un diluyente antes de utilizarla, la cantidad de cada ingrediente, la composicin del diluyente o diluyentes
recomendados [slo el nombre o nombres, si la frmula se especifica en la monografa individual], la cantidad que se va a
emplear para alcanzar una concentracin especfica de ingrediente activo y el volumen final de la solucin as obtenida, una
breve descripcin del aspecto fsico de la solucin reconstituida, instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solucin
reconstituida y una fecha de caducidad que limite el perodo durante el cual se espera que la solucin reconstituida tenga la
potencia requerida o declarada si se ha almacenado segn se indica.
Los envases de Inyecciones destinadas a dilisis, hemofiltracin o soluciones de irrigacin y que contienen un volumen de
ms de 1 L declaran que el contenido no est destinado para infusin intravenosa.
Las Inyecciones destinadas para uso veterinario declaran ese fin.
El envase se etiqueta de modo que una superficie suficiente del envase quede sin cubrir en toda su longitud o circunferencia
para permitir la inspeccin del contenido.

CONTENIDO DE SUSTANCIA ACTIVA Y VOLUMEN TOTAL DE PRODUCTOS FARMACUTICOS INYECTABLES MONODOSIS Y

MULTIDOSIS

Para productos farmacuticos inyectables monodosis y multidosis, el contenido de sustancia activa por el volumen total de-
be ser la expresin principal y prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida inmediatamente por el contenido de
sustancia activa por mL entre parntesis. Para envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido de sustan-
cia activa por fraccin de mL debe ser la nica expresin de contenido. El contenido por mL debe expresarse como mg/mL, y
no como mg/1 ml.
Los siguientes formatos son aceptables para contenidos de ms de 1 mL:
Contenido total de sustancia activa/volumen total: 500 mg/1 O mL
Contenido de sustancia activa/mL: 50 mg/mL
o
Contenido total de sustancia activa/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL
Contenido de sustancia activa/mL: 5000 Unidades/mL
El siguiente formato es aceptable para contenidos de menos de 1 mL: 12,5 mg/0,625 mL
Existen, no obstante, algunas excepciones para la expresin del contenido de sustancia activa por volumen total. En algunos
casos, la expresin principal y prominente del contenido total de un frmaco por envase puede no ser efectiva en la preven-
cin de errores en la administracin y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Un ejemplo de ello es el uso de la lidocana u
otros medicamentos similares empleados como anestsicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por por-
centaje (p.ej., 1%, 2%), o un anestsico local en combinacin con epinefrina que se expresa como una relacin (p.ej.,
1:100 000). En tales casos, se debe expresar el contenido total de sustancia activa: por ejemplo, 1% (100 mg/1 O mL). Los sli-
dos secos, los cuales deben ser reconstituidos, deben tambin seguir este formato, con la excepcin de que slo se debe indi-
car el contenido total del frmaco y no el contenido de sustancia activa/volumen total o el contenido de sustancia activa/ml.

Aluminio en Preparaciones Parenterales de Gran Volumen (PPGV), Preparaciones Parenterales de

Pequeo Volumen (PPPV) y Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de
Nutricin Parenteral Total (NPT)

(a) El contenido de aluminio de las PPGV usadas en terapia de NPT no debe exceder de 25 g por L (g/L).
70 (1) Inyectables / Requisitos Generales USP 39

(b) El prospecto del envase de las PPGV usadas en terapia de NPT debe declarar que el producto farmacutico no contiene
ms de 25 g de aluminio por L. Esta informacin debe incluirse en la seccin "Precauciones" del etiquetado de todas las
PPGV usadas en terapia de NPT.
(c) Si la cantidad mxima de aluminio en las PPPV y en los EGF es 25 g por L (g/L) o menos, en lugar de declarar la canti-
dad exacta de aluminio que contiene cada uno, tal como en el prrafo (d), la etiqueta del envase primario de las PPPV y
los EGF usados en la preparacin de preparaciones parenterales de NPT (con las excepciones que se indican ms adelante)
pueden declarar: "No contiene ms de 25 g/L de aluminio". Si la PPPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del
envase primario puede declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto ad-
junto, la concentracin de aluminio no ser ms de 25 g/L".
(d) El nivel mximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todas las PPPV
y los EGF usados en la preparacin de artculos parenterales para NPT y emulsiones inyectables. El contenido de aluminio
debe declararse de la siguiente manera: "No contiene ms de _ g/L de aluminio". La etiqueta del envase primario de
todas las PPPV y los EGF que son polvos liofilizados usados en la preparacin de soluciones de NPT deben declarar lo si-
guiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentracin de aluminio
no ser ms de_ g/L." Este contenido mximo de aluminio debe declararse como el ms alto entre los tres niveles si-
guientes:
(1) El nivel ms alto de las partidas producidas durante los ltimos tres aos.
(2) El nivel ms alto de las ltimas cinco partidas.
(3) El nivel mximo con respecto a los niveles histricos, pero slo hasta completar la produccin de las primeras cinco
partidas despus del 26 de julio de 2004.
El prospecto adjunto en los envases de todas las PPGV, PPPV y los EGF usados en la preparacin de productos para NPT
debe contener una declaracin de advertencia. Esta advertencia debe estar incluida en la seccin "Advertencias" del etiqueta-
do y debe declarar lo siguiente: "ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser txico. El aluminio puede
alcanzar niveles txicos con la administracin parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en
particular tienen mayor riesgo debido a la inmadurez de sus riones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de
calcio y fosfato que contienen aluminio. Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos
prematuros, que reciben niveles de aluminio por va parenteral mayores de 4 g a 5 g por kg por da, acumulan aluminio a
niveles asociados con la toxicidad sea y del sistema nervioso central. La acumulacin en los tejidos puede ocurrir incluso con
niveles ms bajos de administracin de productos para NPT".

ENVASADO

Envases para Inyecciones

Los envases, incluyendo los cierres, para preparaciones para inyecciones no deben ejercer sobre el contenido ninguna accin
fsica o qumica que pueda alterar de alguna manera la concentracin, calidad o pureza ms all de los requisitos oficiales en
condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso. Los envases deben estar hechos de un
material que permita la inspeccin del contenido. Por lo general, el tipo de vidrio preferible para cada preparacin
se indica en la monografa individual. A menos que se diferente en la individual, se
envasar las (ver

Para definiciones de envases monodosis y multidosis, ver las secciones 10.20.70 y 10.20.11 O, "''n"'r"'''"rn<> 1nr<>
tencias Generales. Los envases con los establecidos en Envases-Vidrio

Los envases deben estar o de tal modo que impidan la contaminacin o la prdida del contenido. La vali-
dacin de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminacin por penetracin de microorganismos o de
impurezas qumicas o fsicas. Adems, el envase debe ser capaz de mantener las cantidades totales y relativas o concentracio-
nes especificadas de solutos y del vehculo cuando se expone a condiciones extremas previstas en la fabricacin y procesa-
miento, almacenamiento, transporte y distribucin. Los cierres para envases multidosis deben permitir la extraccin del conte-
nido sin quitar o destruir el cierre. El cierre debe permitir la penetracin de una aguja y el cerramiento de inmediato luego de
retirarla, protegiendo el envase de la contaminacin. La validacin de la integridad del envase multidosis debe incluir una veri-
ficacin de que un envase de ese tipo impide la contaminacin microbiana o la prdida del contenido del producto en las
condiciones previstas de mltiples entradas y usos.
Los envases para venoclisis en tndem (piggyback containers) son por lo general envases de infusin intravenosa empleados
para administrar una segunda infusin a travs de un conector de algn tipo o a travs de un inyector en el equipo de admi-
nistracin del primer lquido, evitndose as la necesidad de inyectar en otro sitio al paciente. Los envases para venoclisis en
tndem son tambin conocidos como envases de infusin secundaria.
USP 39 Requisitos Generales/ (1) Inyectables 71

Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin

El uso de un sistema de cierre negro en un vial [p.ej., una tapa negra de fcil desprendimiento adherida al casquillo (tapa
"flip-off") y un casquillo negro para sostener el cierre elastomrico] o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre
el estrechamiento del cuello de una ampolla se reserva slo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin y est
prohibido su uso en cualquier otra inyeccin.

Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes

Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales
con una declaracin de advertencia impresa en los casquillos o en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la
tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o
la tapa) la declaracin: "Advertencia: Agente Paralizante" o "Agente Paralizante" (dependiendo del tamao del sistema de cie-
rre). Alternativamente, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripcin, de manera que permita la visualizacin
de la declaracin de advertencia sobre el casquillo de cierre.

Envases para Slidos Estriles

Los envases, incluyendo los cierres, para slidos secos destinados para uso parenteral no deben ejercer sobre el contenido
ninguna accin fsica o qumica que altere de alguna manera el contenido, la calidad o la pureza ms all de los requisitos
oficiales, en condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso.
Un envase para un slido estril debe permitir la adicin de un disolvente adecuado y la extraccin de porciones de la solu-
cin o suspensin resultante de tal modo que se mantenga la esterilidad del producto.
Cuando la Valoracin en una monografa indica un procedimiento para la Solucin muestra, donde se deba tomar el conteni-
do total extrable de un envase monodosis con una jeringa y aguja hipodrmica, se extraer ese contenido en la forma ms
completa posible con una jeringa hipodrmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a ex-
traer, y provista con una aguja nmero 21 de una longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la precaucin de expe-
ler cualquier burbuja de aire, y se descargar en un recipiente para dilucin y valoracin.

Contenido del Envase

Cada envase de inyeccin debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de fr-
maco. Dicha extraccin se debe realizar de acuerdo a las instrucciones del etiquetado, si fueran provistas.

DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE INYECCIN EN LOS ENVASES

Esta seccin est armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas
farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a esta seccin armonizada. Una porcin del presen-
te texto (ver ms adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; est marcada con
smbolos (+.) para especificar este hecho.
Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las prepara-
ciones viscosas y aceitosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosa-
mente justo antes de extraer el contenido. El contenido seguidamente se enfra a una temperatura de 20-25C antes de medir
el volumen. Las formulaciones de slidos estriles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de
retirar su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o solucio-
nes, segn sea apropiado .
Envases Monodosis-Seleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 1O mL o ms, 3 envases si el volumen nominal es
ms de 3 mL y menos de 1 O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Tomar individualmente el contenido
total de cada envase seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y
provista con una aguja nmero 21 de longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire de la jerin-
ga y la aguja, y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada "para
contener" ms que "para verter" los volmenes marcados) de un tamao tal que el volumen que se va a medir ocupe al me-
nos el 40% de su volumen graduado. Alternativamente, el volumen del contenido, en mL, puede calcularse como la masa, en
g, dividida por la densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de una cantidad suficiente
de envases puede combinarse para obtener el volumen requerido para la medicin, siempre que, para cada envase, se emplee
un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 1O mL o ms se puede determinar abrindolos
y vaciando el contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado.
El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de enva-
ses con un volumen nominal de 2 mL o menos, no es menor que la suma de los volmenes nominales de los envases que se
toman colectivamente.
72 (1) Inyectables/ Requisitos Generales USP 39

Envases Multidosis-Para Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un nmero especfico de dosis de un volu-
men determinado, seleccionar 1 envase y proceder segn se indica para los envases monodosis, empleando el mismo nmero
de conjuntos diferentes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos
de la dosis indicada.
Inyecciones en Cartuchos o Jeringas Prellenadas-Seleccionar 1 envase si el volumen es 1O mL o ms, 3 envases si el
volumen nominal es ms de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Si fuera necesario,
equipar los envases con los accesorios requeridos para su uso (aguja, mbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados
tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la aguja, empujando el mbolo en forma lenta y continua. Determi-
nar el volumen, en mL, calculado como la masa, en g, divida por la densidad.
El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal.
Soluciones Intravenosas de Gran Volumen-Para soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a
una probeta graduada seca, de una capacidad tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen
nominal de la probeta. Medir el volumen transferido.
El volumen no es menor que el volumen nominal.

Etiquetado en los Casquillos y las Tapas de Sobresello

Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fcilmente las indicaciones del eti-
quetado que comunican mensajes de seguridad importantes crticos para evitar situaciones de amenaza de muerte inminente
y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser sencillas, concisas y des-
provistas de toda informacin no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no deben incluir ninguna
informacin para que aqullos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr este propsito se requie-
re un enfoque sistemtico para el etiquetado de los productos inyectables, tal que asegure que los casquillos y tapas de sobre-
sello-un rea de estos productos debe ser de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de estos medica-
mentos-sean reservados para comunicar mensajes crticos de seguridad. En consecuencia:
1. Slo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (crculo) del casquillo y/o la tapa de sobresello
de un vial que contenga un producto inyectable. La indicacin precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la
tapa pero puede aparecer solamente en la tapa, si el casquillo de sobresello es transparente y la indicacin precautoria
debajo de la tapa es fcilmente legible. Una indicacin precautoria es aqulla destinada a prevenir una situacin de ame-
naza de muerte inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si fuera necesario.
Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias son los siguientes, entre otros: "Advertencia-Agente Paralizante" y
"Diluir Antes de Usar". El texto de la indicacin precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea fcilmente
visible en condiciones normales de uso.
2. Si no es necesaria una indicacin precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello,
debe quedar en blanco.
3. Otras declaraciones o caractersticas que incluyen, entre otros, nmeros o letras de identificacin, como por ejemplo n-
meros de cdigos, nmeros de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en
la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (crculo) de los casquillos o las tapas de sobresello
de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o caractersticas en la falda del cas-
quillo no deben distraer o interferir con la indicacin precautoria de la superficie superior.

Envasado y Almacenamiento

El volumen de inyeccin en envases monodosis proporciona la cantidad especificada para administracin parenteral de una
vez y en ningn caso es ms que el volumen suficiente para permitir la extraccin y administracin de 1 L.
Las preparaciones destinadas para administracin intrarraqudea, intracisternal o peridural se envasan slo en envases mono-
dosis.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, un envase multidosis contiene un volumen de Inyec-
cin suficiente para permitir la extraccin de no ms de 30 ml.
Las siguientes inyecciones estn exentas de la restriccin de 1 L de los requisitos anteriores relacionados con el envasado:
1. Inyecciones envasadas para uso extravascular como soluciones de irrigacin o dilisis peritoneal.
2. Inyecciones envasadas para uso intravascular como nutricin parenteral o como lquido de reemplazo o sustitucin para
ser administrado en forma continua durante una hemofiltracin.
Las inyecciones envasadas para uso intravascular que pudieran usarse como lquido durante una hemodilisis u otros proce-
sos de reemplazo mediante administracin intermitente, continua o en bolo, deben cumplir con la restriccin de 1 L a menos
que se trate de una excepcin mencionada anteriormente.
Cuando se declara que las inyecciones estn destinadas para uso veterinario, stas estn exentas de los requisitos de envasa-
do y almacenamiento en lo referente a las limitaciones para envases monodosis y de las limitaciones de volumen para los enva-
ses multidosis.
USP 39 Requisitos Generales / (1) Medicamentos Inyectables 73

MATERIA EXTRAA Y PARTCULAS

Los artculos destinados a la administracin parenteral deben prepararse de una manera diseada para excluir partculas, se-
gn se define en Partculas en Inyectables (788), y otras materias extraas, segn corresponda para la forma farmacutica. Cada
envase final de todas las preparaciones parenterales debe inspeccionarse en la medida de lo posible para detectar la presencia
de materia extraa y partculas observables (de ahora en adelante denominadas "partculas visibles") en su contenido. El pro-
ceso de inspeccin debe estar diseado y calificado para asegurar que todos los lotes de todas las preparaciones parenterales
estn prcticamente exentos de partculas visibles. La calificacin del proceso de inspeccin debe realizarse en referencia a las
partculas en el rango visible de un tipo que puede surgir del proceso de fabricacin o llenado. Debe desecharse todo envase
cuyo contenido presente indicios de partculas visibles. La inspeccin para detectar partculas visibles puede realizarse cuando
se lleva a cabo la inspeccin para detectar otros defectos crticos, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuan-
do se caracteriza el aspecto de un producto liofilizado.
Cuando la naturaleza del contenido o el sistema de cierre del envase permite solamente una inspeccin limitada del conteni-
do total, la inspeccin del 100% de un lote debe completarse con la inspeccin de contenidos reconstituidos (p.ej., secos) o
contenidos extrados (p.ej., de un envase mbar oscuro) de una muestra de envases del lote.
Todas las Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis y las Inyecciones de pequeo volumen estn sujetas a los
procedimientos microscpicos o de oscurecimiento de luz y a los lmites de partculas subvisibles especificados en Partculas en
Inyectables (788), a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. Un artculo envasado como Inyec-
cin, ya sea de gran volumen o de pequeo volumen, cumple con los requisitos expuestos para Inyecciones de pequeo volu-
men cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos, si la monografa individual incluye una prueba para
Partculas en Inyectables (788); cumple con los requisitos expuestos en Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis
cuando la etiqueta del envase indica que contiene ms de 100 ml.

ESTERILIDAD

Pruebas de Esterilidad-Las preparaciones para inyeccin cumplen con los requisitos en Pruebas de Esterilidad (71 ).

SOLUCIONES RECONSTITUIDAS

Los slidos secos cuyas soluciones reconstituidas se preparan para inyeccin llevan ttulos de la forma [FRMACO] para Inyec-
cin. Ya que estas formas farmacuticas se reconstituyen en el momento en el que las usar el profesional de salud intervinien-
te, no se incluyen las pruebas y normas para la solucin reconstituida para su administracin en las monografas individuales
para slidos secos o lquidos concentrados estriles. Sin embargo, a los efectos de garantizar la calidad de las preparaciones
inyectables en el momento de ser administradas, se proporcionan las siguientes pruebas no destructivas para demostrar la apti-
tud de las soluciones reconstituidas cuando se preparan inmediatamente antes de usar.
Totalidad y Transparencia de la Solucin-Reconstituir la solucin segn se indica en el etiquetado suministrado por el
fabricante para la forma farmacutica seca estril.
A: El slido se disuelve completamente, sin dejar ningn residuo visible como materia no disuelta.
B: La solucin reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua
Purificada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar.
Partculas-Reconstituir la solucin segn se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante para la forma farmacu-
tica seca estril: la solucin est esencialmente libre de partculas extraas que se puedan observar en una inspeccin visual.

(1) MEDICAMENTOS INYECTABLES Y EN IMPLANTES

(PARENTERALES)-PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO

(El captulo se oficializar el 7 de mayo de 20 76)

(El nombre actual del captulo es (1) Inyectables)

INTRODUCCIN

Los medicamentos parenterales incluyen inyectables e implantes que se inyectan a travs de la piel u otro tejido de barrera
externo, o que se implantan dentro del cuerpo para permitir la administracin directa del frmaco activo en los vasos sangu-
neos, rganos, tejidos o lesiones. Los inyectables se pueden presentar como formas farmacuticas de liberacin inmediata o
prolongada. Los medicamentos parenterales en implantes son formas farmacuticas de accin prolongada que proveen una
liberacin continua de los frmacos activos durante periodos que van de meses a aos. Para la liberacin sistmica, se pueden
74 (1) Medicamentos Inyectables/ Requisitos Generales USP 39

implantar por va subcutnea, mientras que para la administracin local, se pueden implantar en una parte especfica del cuer-
po. Los medicamentos parenterales se pueden administrar por va intravenosa, intraventricular, intraarterial, intraarticular, sub-
cutnea, intramuscular, intratecal, intracisternal e intraocular.
Las formas farmacuticas parenterales se pueden presentar como soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos estriles para
soluciones y suspensiones (incluyendo liposomas), implantes (incluyendo micropartculas) y productos que consten de un fr-
maco y un dispositivo, tales como los estents para elucin de frmacos. Para descripciones adicionales de formas farmacuticas
que caen dentro de la categora general de medicamentos parenterales dirigirse a las secciones posteriores de este captulo y al
captulo Formas Farmacuticas (1151) 1 El captulo Nomenclatura (1121) 1 provee informacin para establecer los nombres y ttu-
los de monografas USP de medicamentos parenterales.
El captulo (1) provee las directrices generales para la revisin y el desarrollo de monografas individuales y no pretende
reemplazar a stas ltimas. El captulo (1) provee listas de pruebas de calidad del producto comnmente requeridas de una
manera concisa y coherente. El captulo se divide en cuatro secciones principales: (1) pruebas universales de calidad del pro-
ducto que son aplicables a formas farmacuticas parenterales; (2) pruebas especficas de calidad del producto que deben te-
nerse en cuenta adems de las pruebas universales; (3) pruebas de calidad del producto para formas farmacuticas especficas
donde se citan todas las pruebas aplicables (universales y especficas) para la forma farmacutica especfica; y (4) pruebas de
desempeo del producto.
Siempre que existan, las monografas harn referencia al captulo (1) o a partes especficas del mismo. Si no se cuenta con
una monografa especfica para un medicamento (monografa inexistente), los captulos generales proveen las pruebas de cali-
dad que pueden ser usadas por los fabricantes hasta que la USP desarrolle la monografa de la forma farmacutica.
Las definiciones Farmacopeicas de preparaciones estriles para uso parenteral pueden no ser aplicables a algunos productos
biolgicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Biolgicos (1041 )1 ). No obstante,
algunos medicamentos biolgicos terminados cuyas monografas contienen el trmino"lnyeccin" en el ttulo deben cumplir
con los requisitos del captulo (1) o las secciones del mismo que se especifiquen en la monografa.

Pruebas de Calidad y de Desempeo del Medicamento

Los procedimientos y criterios de aceptacin para las pruebas de medicamentos parenterales se dividen en dos categoras:
(1) aqullos que evalan los atributos de calidad del producto, p.ej., identificacin, esterilidad y partculas, y estn incluidas en
este captulo y (2) aqullos que evalan el desempeo del producto, p.ej., liberacin in vitro del frmaco desde el medicamen-
to. Mientras que las pruebas de calidad evalan la integridad de la forma farmacutica, las pruebas de desempeo evalan el
desempeo (biodisponibilidad) que tendra el producto luego de administrarlo al paciente. Una prueba de desempeo del
producto, es decir, una prueba de liberacin de frmacos para suspensiones, emulsiones, polvo para suspensin (incluyendo
micropartculas y liposomas) y estents para elucin de frmacos, debe llevarse a cabo usando procedimientos apropiados.

Cambio en la redaccin:

PRUEBAS COMUNES DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACUTICAS

PARENTERALES

PRUEBAS UNIVERSALES

A continuacin se citan las pruebas universales que son aplicables a las formas farmacuticas parenterales.
Descripcin: Se debe proveer una descripcin cualitativa de la forma farmacutica. Los criterios de aceptacin deben incluir
la apariencia final aceptable. Si el color cambia durante el almacenamiento, puede resultar apropiado realizar un procedimien-
to cuantitativo o semicuantitativo para evaluar el color. Esta seccin especifica el contenido o la cantidad declarada del artculo
(ver Etiquetado (7)). El captulo (1121 )1 ofrece informacin adicional sobre trminos y definiciones de uso comn.
Identificacin: Las pruebas de identificacin se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.40. Las pruebas de identifica-
cin deben establecer la identidad de los frmacos presentes en el artculo y deben distinguirlo de compuestos con estructura
estrechamente relacionada que podran estar presentes. La prueba de identidad ms concluyente es el espectro de absorcin
IR (ver Espectroscopa de Absorcin Atmica (852), Espectroscopa de Fluorescencia (853), Espectroscopa en el Infrarrojo Medio
(854), Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano {856), Espectroscopa Ultravioleta-Visible (857>t (Aroi-moy- 2016 y Pruebas de Identifica-
cin Espectrofotomtrica (197)). Cuando no es posible obtener un espectro IR adecuado, se pueden usar otros mtodos analti-
cos. Los mtodos espectrofotomtricos Raman o de infrarrojo cercano tambin podran ser aceptables como nica prueba para
la identificacin de los constituyentes en el medicamento formulado (para mayor informacin ver Espectroscopa en el Infrarrojo
Cercano (1119) 1 y Espectroscopa Raman (1120) 1 ). La identificacin realizada nicamente mediante un solo tiempo de retencin
cromatogrfico no se considera especfica. Sin embargo, puede ser aceptable el uso de dos procedimientos cromatogrficos en
los que la separacin se basa en principios diferentes o en una combinacin de pruebas en un solo procedimiento (ver Croma-

1 Todos los captulos con nmeros superiores a <1000> son nicamente para fines informativos. Dichos captulos pueden resultar tiles, aunque no son obligato-
rios.
USP 39 Requisitos Generales/ (1) Medicamentos Inyectables 75

tografa (621) y Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada (201 )). Los captulos Identificacin-Pruebas Genera-
les (191) y Espectrometra de Masas (736) ofrecen informacin adicional con respecto a las pruebas de identificacin.
Valoracin: Se debe usar una prueba especfica e indicadora de estabilidad para determinar la concentracin (contenido) del
medicamento. Para los casos en los que se justifique el uso de una valoracin no especfica, se deben usar otros procedimien-
tos analticos complementarios para lograr la especificidad. Se debe usar un procedimiento especfico cuando exista evidencia
de la interferencia de los excipientes con la valoracin no especfica.
Impurezas: Las pruebas para Impurezas se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.60. Todos los artculos deben ser
analizados para asegurar que cumplen con los requisitos.
Materia extraa y partculas: Los artculos destinados para administracin parenteral deben prepararse de una manera dise-
ada para excluir partculas conforme a lo definido en Partculas Subvisibles en Inyectables de Protenas Teraputicas (787), Part-
culas en Inyectables (788) y Partculas en Soluciones Oftlmicas (789), as como para excluir otras partculas segn resulte apro-
piado para la forma farmacutica. Se debe inspeccionar cada uno de los envases finales de todas las preparaciones parenterales
en la medida de lo posible para detectar la presencia de materia extraa y partculas observables (en lo sucesivo denominadas
partculas visibles) en su contenido. El proceso de inspeccin debe estar diseado y calificado para asegurar que todos los lotes
de todas las preparaciones parenterales estn esencialmente exentos de partculas visibles, conforme a lo definido en Partculas
Visibles en Inyectables (790). La calificacin del proceso de inspeccin debe realizarse en referencia a las partculas en el rango
visible y a aquellas partculas que puedan surgir del proceso de fabricacin o llenado. Debe desecharse todo envase cuyo con-
tenido presente indicios de partculas visibles. La inspeccin para detectar partculas visibles puede realizarse al momento de
examinar otros defectos crticos, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuando se caracteriza el aspecto de un
producto liofilizado.
Cuando la naturaleza del contenido o el sistema envase-cierre del envase permita solamente una inspeccin limitada del
contenido total, la inspeccin del 100% de un lote debe complementarse con la inspeccin de contenidos reconstituidos
(p.ej., liofilizados) o contenidos extrados (p.ej., de un envase mbar oscuro) de una muestra de envases del lote.
Las inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis, las inyecciones de pequeo volumen y los empaques a granel
para farmacias (PBP, por sus siglas en ingls) estn sujetos a los procedimientos microscpicos o de obstruccin de luz y a los
lmites de partculas subvisibles especificados en el captulo (788), a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. Un artculo envasado como inyeccin, ya sea de gran volumen o de pequeo volumen, cumple con los requisitos
establecidos para inyecciones de pequeo volumen cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos. Cum-
ple con los requisitos establecidos para inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis cuando la etiqueta del envase
indica que contiene ms de 100 ml.
Esterilidad: La esterilidad de todos los medicamentos destinados para administracin parenteral debe confirmarse usando los
mtodos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) o por un mtodo alternativo aprobado.
Endotoxinas bacterianas: Todos los artculos destinados para administracin parenteral deben prepararse de forma tal que
se limiten las endotoxinas bacterianas conforme a lo definido en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) o Prueba de Pirgenos
(151 ).
Contenido del envase: Se debe determinar el contenido del envase cuando resulte apropiado (ver el captulo propuesto de
pruebas generales Contenido en Envases para Inyectables (697)).
Sustancias lixiviables y extrables: El sistema de envase no debe interactuar fsica o qumicamente con la preparacin de
forma que se altere su contenido, calidad o pureza ms all de los requisitos oficiales o establecidos. El sistema de envase debe
cumplir con los requisitos de Elastomricos ), de Envasado Almacenamiento (659), En-
vases-Vidrio (660), Materiales Plsticos de
Construccin (661.1) y Sistemas de Envases Plsticos para Uso Farmacutico (661.2). Se encontrar informacin adicional
con respecto al anlisis de sistemas de envases en Evaluacin de Sustancias Extrables Relacionadas con Envases Farmacuticos y
Sistemas de Administracin (1663) y Evaluacin de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacuticos
y Sistemas de Administracin (1664).
Integridad del cierre del envase: El sistema de envase debe cerrarse o sellarse de modo tal que prevenga la contaminacin
o la prdida de contenido. La validacin de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminacin por penetra-
cin de microorganismos o la adquisicin o prdida de cualquier parmetro fsico o qumico que se considere necesario para
proteger el producto (ver Envasado de Productos Estriles-Evaluacin de Integridad (1207)).
Etiquetado: Todos los artculos destinados para administracin parenteral deben cumplir con los requisitos de etiquetado de-
finidos en el captulo (7).

Pruebas Especficas
Adems de las pruebas universales citadas anteriormente, se pueden considerar las siguientes pruebas especficas para cada
caso y, cuando resulte apropiado, se hace referencia a las mismas en la monografa USP-NF.
Propiedades fisicoqumicas: stas incluyen propiedades como Osmolalidad y Osmolaridad (785), pH (791 ), Peso Especfico
(841) y Viscosidad-Mtodos Capilares (911 ).
Uniformidad de unidades de dosificacin: Esta prueba es aplicable a medicamentos parenterales y formas farmacuticas
envasadas en envases unitarios. Incluye tanto la masa de la forma farmacutica como el contenido de la sustancia activa en la
misma (ver Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905)).
76 (1) Medicamentos Inyectables/ Requisitos Generales USP 39

Vehculos y sustancias agregadas: Existen otros vehculos, acuosos y no acuosos, aparte de los tratados a continuacin. To-
dos los vehculos deben ser adecuados para el uso que se les pretende dar y no deben impactar la calidad del medicamento.
Vehculos acuosos-Los vehculos acuosos deben cumplir con los requisitos del captulo (151) o del (85), segn se especifique
en la monografa. El vehculo de uso ms general es el Agua para Inyeccin. Se puede agregar cloruro de sodio o dextrosa para
isotonizar la solucin resultante; y la Inyeccin de Cloruro de Sodio, o la Solucin de Ringer Inyectable pueden reemplazar
parcial o totalmente al Agua para Inyeccin.
Vehculos no acuosos-Los aceites fijos son una clase de Vehculos no acuosos. Los aceites fijos empleados como vehculos son de
origen vegetal e inodoros. Cumplen con los requisitos de la prueba de Parafina Slida en la monografa de Aceite Mineral con
el bao de enfriamiento mantenido a 1O.
Asimismo, cumplen con los requisitos de las siguientes pruebas:
ndice de Saponificacin (ver el captulo Grasas y Aceites Fijos (401 )): Entre 185 y 200
ndice de Yodo (ver el captulo (401 )): Entre 79 y 141
Materia lnsaponificable (ver el captulo (401 )): No ms de 1,5%
ndice de Acidez (ver el captulo (401 )): No ms de 0,2
ndice de Perxido (ver el captulo (401 )): No ms de 5,0
Agua, Mtodo le (del captulo Determinacin de Agua (921 )): No ms de 0, 1%
Lmite de Cobre, Hierro, Plomo y Nquel: [NOTA-La prueba para nquel no se requiere si el aceite no ha sido sometido a
hidrogenacin, o si no se ha usado un catalizador de nquel durante el procesamiento.] Proceder segn se indica en el
captulo (401 ), Trazas de Metales o Impurezas Elementales-Procedimientos (233). Cumplen con los requisitos en Impurezas
Elementales-Lmites (232).
Los monoglicridos o diglicridos sintticos de cidos grasos se pueden emplear como vehculos, siempre que sean lquidos, se
mantengan transparentes cuando se enfran a 1O y presenten un ndice de Yodo no mayor de 140.
Sustancias Agregadas-Se pueden agregar sustancias adecuadas a preparaciones para incrementar la estabilidad o la utilidad, a
menos que se prohban en la monografa. No se pueden agregar colorantes a una preparacin con el nico propsito de con-
ferir color a la preparacin terminada (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.20 y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51)).
Debe tenerse especial cuidado en la eleccin y uso de sustancias agregadas en preparaciones con volmenes superiores a 5
ml. Los siguientes lmites prevalecen a menos que se indique de otro modo:
Mercurio y agentes catinicos tensoactivos: No ms de 0,01 %
Clorobutanol, cresol, fenol y sustancias similares: No ms de 0,5%
Dixido de azufre o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito o metabisulfito de potasio o sodio: No ms de 0,2%
Conservante antirnicrobiano: Se deben agregar agentes antimicrobianos a las preparaciones destinadas para inyeccin en
envases multidosis, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) existen instrucciones diferentes en la mono-
grafa individual; (2) la sustancia contiene un radio istopo con una vida media fsica menor que 24 horas; o (3) los ingredien-
tes activos son antimicrobianos. Tales sustancias deben cumplir con los requisitos del captulo Pruebas de Eficacia Antimicrobia-
na (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ).
Contenido de agua: El contenido de agua en productos liofilizados debe determinarse siempre que sea apropiado (ver el
captulo Determinacin de Agua (921 )).
Reactividad biolgica: Los medicamentos en implante y las combinaciones frmaco/dispositivo que contienen un material
polimrico deben cumplir con los requisitos de Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo (88).
Distribucin de tamao de glbulos: La emulsiones deben cumplir con los requisitos de Distribucin del Tamao de Glbulos
en Emulsiones Inyectables de Lpidos (729).
Contenido de Aluminio: 25 g/L para parenterales de gran volumen usados en terapia de nutricin parenteral total (TPN,
por sus siglas en ingls). Los parenterales de pequeo volumen y los empaques a granel para farmacias usados para preparar la
terapia de nutricin parenteral total deben declarar en la etiqueta del envase inmediato el nivel mximo de aluminio en la fe-
cha de caducidad si el nivel mximo excede de 25 g/L.
Totalidad y transparencia de soluciones: Las siguientes pruebas se llevan a cabo para demostrar la aptitud de las soluciones
reconstituidas que se preparan antes de su administracin. Reconstituir la solucin segn se indica en el etiquetado suministra-
do por el fabricante:
El slido se disuelve completamente, sin dejar ninguna materia sin disolver.
La solucin reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua Puri-
ficada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar. Las soluciones de protena pueden presentar una
opalescencia inherente.
La solucin reconstituida est exenta de partculas que se puedan observar durante la inspeccin visual (ver el captulo Part-
culas Visibles en Inyectables (790)).

PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACUTICAS PARENTERALES

ESPECFICAS

A continuacin se citan las pruebas de calidad del producto para las formas farmacuticas especficas. Los captulos especfi-
cos referidos para la prueba pueden encontrarse en las secciones Pruebas Universales y Pruebas Especficas. Cuando no est dis-
ponible una prueba farmacopeica, se debe usar un procedimiento validado con criterios de aceptacin.
USP 39 Requisitos Generales/ (1) Medicamentos Inyectables 77

Soluciones

Una solucin es una forma farmacutica lquida transparente y homognea que contiene una o ms sustancias qumicas
(p.ej., frmacos o excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disolventes miscibles entre s.
Las soluciones destinadas para administracin parenteral (p.ej., mediante inyeccin o para irrigacin) deben ser estriles y bio-
compatibles con el sitio de administracin al que estn destinadas. Esto incluye considerar factores tales como tonicidad, pH,
pirogenicidad, partculas extraas y compatibilidad fisicoqumica, entre otros.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para soluciones para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Propiedades Fisicoqumicas: Peso Especfico, Viscosidad, pH, Osmolaridad y Osmolalidad
- Conservantes Antimicrobianos

Polvos Estriles para Solucin

Los polvos estriles para solucin (tambin referidos como polvos estriles para inyeccin) estn formados por frmacos y
otros componentes tales como ingredientes para formulaciones secas para asegurar la estabilidad qumica y fsica de la presen-
tacin dentro de un envase para uso final. Se puede proveer un diluyente estril acompaante o compartimentos de diluyente
para facilitar la reconstitucin al volumen final deseado.
El artculo estril para inyeccin se presenta en diversas formas: polvo liofilizado destinado para solucin final, slidos pulveri-
zados destinados para solucin final, o slidos secos que al reconstituirlos forman lquidos viscosos.
La descripcin debe incluir una seccin que describa la facilidad de dispersin y la reconstitucin. La forma farmacutica es
un slido homogneo que se reconstituye fcilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dispersin se comple-
ta agitando suavemente.
A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estriles para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Propiedades Fisicoqumicas: Peso Especfico, Viscosidad, pH, Osmolaridad y Osmolalidad
Lo siguiente se aplica a soluciones reconstituidas:
Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905): Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificacin, cada unidad
en una partida debe contener una cantidad de frmaco cercana a la cantidad declarada dentro de un intervalo estrecho.
Las unidades de dosificacin se definen como formas farmacuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis
de frmaco en cada unidad. Para formas farmacuticas lquidas, los analistas deben realizar la valoracin usando una can-
tidad de material reconstituido bien mezclado, retirado de un envase individual en condiciones normales de uso, expresar
los resultados como dosis entregada y calcular el valor de aceptacin.
Prdida por Secado (731 ): El procedimiento establecido en este captulo determina la cantidad de materia voltil de cual-
quier tipo expelida en las condiciones especificadas.
Determinacin de Agua (921 ): El contenido de agua o de disolvente puede tener efectos importantes sobre la reconstitu-
cin y la estabilidad. Para los artculos que requieren un control del contenido de agua o de disolvente, los analistas deben
llevar a cabo uno de los mtodos siguientes o reemplazarlo por uno que resulte adecuado.
Aspecto: Los analistas deben evaluar el nivel y la variacin de la unidad para los siguientes parmetros:
- Color del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
- Textura y Homogeneidad del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
- Presencia de Material Extrao: Se deben rechazar todas las unidades con material extrao.
- Tamao y Distribucin de Partcula (Polvo Seco): La evaluacin de la forma apropiada y cristalinidad de los slidos en
polvo es una medida del control y uniformidad del proceso.
Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por Tamizado Analtico (786): Este captulo se puede usar para polvos
sueltos.
Cristalinidad: Se puede caracterizar la cristalinidad de un material para determinar si cumple con el requisito de cristalinidad
cuando ste se indique en la monografa individual de un frmaco.
Microscopa ptica (776): La cristalinidad se puede caracterizar mediante microscopa de luz polarizada para evaluacin
cualitativa del tamao, la forma y la cristalinidad de slidos. A menos que se especifique de otro modo en la monografa
individual, los analistas deben montar una muestra slida en aceite mineral sobre un portamuestras de vidrio limpio o cu-
breobjetos y deben examinar la mezcla usando un microscopio polarizante: Las partculas presentan birrefringencia (colo-
res derivados de la interferencia) y posiciones de extincin cuando se gira la platina del microscopio.
Vehculos y diluyentes: Las pautas para reconstitucin y suspensin de polvos secos se encuentran en las monografas espe-
cficas. Cuando existe un diluyente especfico envasado para su uso con un producto en particular el cual no est incluido en
una monografa, entonces el artculo final se prepara con dicho diluyente.
78 (1) Medicamentos Inyectables / Requisitos Generales USP 39

Suspensiones
Las suspensiones parenterales son formas farmacuticas lquidas que contienen partculas slidas en un estado de dispersin
uniforme. Las suspensiones para administracin parenteral deben ser estriles y compatibles con el sitio de administracin. Se
debe tomar en cuenta el pH y la pirogenicidad, adems de que se deben identificar lmites apropiados. Las evaluaciones de
estabilidad fsica de las suspensiones parenterales deben incluir evaluaciones para confirmar que el intervalo del tamao de
partcula de la materia suspendida no cambie con el tiempo y para confirmar que los slidos en la preparacin se pueden re-
suspender con facilidad para obtener una preparacin uniforme.
Para las suspensiones inyectables se requiere el cumplimiento con las pruebas para soluciones inyectables adems de las si-
guientes pruebas, a menos que se justifique algo diferente:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Propiedades Fisicoqumicas: pH
- Uniformidad de Unidades de Dosificacin
- Conservantes Antimicrobianos

Liposomas
Los liposomas son medicamentos singulares con propiedades nicas que pueden estar en forma de solucin o suspensin.
Los liposomas son dispersiones acuosas de lpidos anfiflicos y tienen baja solubilidad en agua. Se organizan como una lmina
de dos capas que encierra un compartimiento acuoso interno y se conocen como vesculas de bicapa lipdica. Los liposomas
pueden tener una sola bicapa lipdica (vescula unilaminar) o pueden tener una estructura multicapa parecida a una cebolla
(vescula multilaminar). Los lpidos anfiflicos comprenden una cabeza compuesta por un grupo hidratado en la interfase de
agua de la bicapa unido a un grupo hidrfobo que forma el interior de la bicapa mediante la asociacin con el grupo hidrfo-
bo de lpidos de la lmina opuesta de la bicapa. Las propiedades fsicas del liposoma y su bicapa pueden variar ampliamente
dependiendo de la composicin lipdica, la composicin acuosa y la temperatura con respecto a los puntos de transicin de
fase de los componentes acilo. Debido al compartimiento acuoso central, una prueba simple para determinar la presencia de
liposomas en una dispersin de lpidos sirve para determinar la presencia de una fase acuosa atrapada.
Un medicamento liposmico consta del frmaco, los componentes del liposoma y otros ingredientes inactivos pero crticos
tales como una dispersin acuosa, a menos que el contenido sea un producto liofilizado.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para liposomas:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Propiedades Fisicoqumicas: pH
- Composicin de Lpidos y cidos Grasos, incluyendo el grado de insaturacin y la especificidad de la posicin en las
cadenas laterales acilo y productos de degradacin crticos tales como lisolpidos2
- Tamao de Partcula 2
- Distribucin del Tamao de Partcula de Vesculas Liposomales 2
- Laminalidad 2
- Composicin de Fosfolpidos2
- Porcentaje de Lpidos Libres vs. Porcentaje de Lpidos Encapsulados 2
- Frmaco Libre vs. Frmaco Encapsulado
- Fuerza lnica y Fuerza Osmtica2

Polvos Estriles para Suspensin

Los polvos estriles para suspensiones estn formados por frmacos y otros componentes tales como ingredientes para for-
mulaciones secas para asegurar la estabilidad qumica y fsica de la presentacin dentro de un envase para uso final. Se puede
proveer un diluyente estril acompaante o compartimentos de diluyente para facilitar la reconstitucin al volumen final de-
seado.
El artculo estril inyectable se puede presentar de diversas formas: polvo liofilizado destinado a suspensin final, slidos pul-
verizados destinados a suspensin final o micropartculas que mantienen su integridad y que se administran en forma de sus-
pensin estril. La descripcin debe incluir una seccin que describa la facilidad de dispersin y la reconstitucin. La forma
farmacutica es un slido homogneo que se reconstituye fcilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dis-
persin se completa agitando suavemente.
A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estriles para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Endotoxinas Bacterianas

2 Cuando no est disponible una prueba farmacopeica, se debe usar un procedimiento validado con criterios de aceptacin.
USP 39 Requisitos Generales/ (1 > Medicamentos Inyectables 79

- Propiedades Fisicoqumicas: pH, Osmolaridad y Osmolalidad

Lo siguiente se aplica a suspensiones reconstituidas:
Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905): Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificacin, cada unidad
en una partida debe contener una cantidad de frmaco cercana a la cantidad declarada dentro de un intervalo estrecho.
Las unidades de dosificacin se definen como formas farmacuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis
de frmaco en cada unidad. Para formas farmacuticas lquidas, los analistas deben realizar la valoracin usando una can-
tidad de material reconstituido bien mezclado, retirado de un envase individual en condiciones normales de uso, expresar
los resultados como dosis entregada y calcular el valor de aceptacin.
Prdida por Secado (731 ): El procedimiento establecido en este captulo determina la cantidad de materia voltil de cual-
quier tipo expelida en las condiciones especificadas.
Determinacin de Agua (921 ): El contenido de agua o de disolvente puede tener efectos importantes sobre la reconstitu-
cin y la estabilidad. Para los artculos que requieren un control del contenido de agua o de disolvente, los analistas deben
llevar a cabo uno de los mtodos siguientes o reemplazarlo por uno que resulte adecuado.
Aspecto: Los analistas deben evaluar el nivel y la variacin de la unidad para los siguientes parmetros:
- Color del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
- Textura y Homogeneidad del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
- Presencia de Material Extrao: Se deben rechazar todas las unidades con material extrao:
- Tamao y Distribucin de Partcula (Polvo Seco): La evaluacin de la forma apropiada y cristalinidad apropiada de los
slidos en polvo es una medida de control y uniformidad del proceso.
Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por Tamizado Analtico (786): Este captulo se puede usar para polvos
sueltos.
Cristalinidad: Se puede caracterizar la cristalinidad de un material para determinar si cumple con el requisito de cristalinidad
cuando ste se indique en la monografa individual de un frmaco.
Microscopa ptica (776): La cristalinidad se puede caracterizar mediante microscopa de luz polarizada para evaluacin
cualitativa del tamao, la forma y la cristalinidad de slidos. A menos que se especifique de otro modo en la monografa
individual, los analistas deben montar una muestra slida en aceite mineral sobre un portamuestras de vidrio limpio o cu-
breobjetos y deben examinar la mezcla usando un microscopio polarizante: Las partculas presentan birrefringencia (colo-
res derivados de la interferencia) y posiciones de extincin cuando se gira la platina del microscopio.
Vehculos y diluyentes: Las pautas para reconstitucin y suspensin de polvos secos se encuentran en las monografas espe-
cficas. Cuando existe un diluyente especfico envasado para su uso con un producto en particular el cual no est incluido en
una monografa, entonces el artculo final se prepara con dicho diluyente.
Micropartculas: Algunas micropartculas se proveen como polvos estriles que deben reconstituirse en forma de suspensin
antes de la inyeccin. Las principales preparaciones de micropartculas deben reconstituirse en forma de suspensin inyectable.
Para los requisitos de las pruebas de calidad, consultar la seccin Implantes.

Emulsiones

Las emulsiones para formas farmacuticas parenterales son preparaciones lquidas de frmacos disueltos o dispersados en un
medio de emulsin adecuado. Las emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite por lo regular atrapan al frmaco.
Las emulsiones por lo general son formas farmacuticas lquidas homogneas, turbias y de color blanco que contienen una o
ms sustancias qumicas (p.ej., frmacos y excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disol-
ventes miscibles entre s. Las emulsiones destinadas para administracin intravenosa deben ser estriles y compatibles con el
sitio de administracin al que est destinado.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para emulsiones inyectables:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Propiedades Fisicoqumicas: pH, Osmolaridad y Osmolalidad
- Distribucin del Tamao de Glbulos
- Cantidad de Glbulos de Grasa (lpidos) 2
- Porcentaje de Lpidos Libres vs. Porcentaje de Lpidos Encapsulados 2
- Frmaco Libre vs. Frmaco Encapsulado

Implantes

Los implantes para liberacin prolongada estn compuestos por una matriz de frmaco y excipiente polimrico que puede o
no tener una membrana externa de control de velocidad. El excipiente polimrico debe ser biocompatible pero puede o no ser
biorreabsorbible. Algunos implantes se fabrican con metal de grado mdico con una bomba osmtica en su interior que pro-
duce la liberacin prolongada del frmaco. Los implantes deben ser estriles y, por lo general, en forma de cilindro, aunque
tambin se usan otras formas. Los disolventes usados para disolver la formulacin pueden conducir a la esterilizacin, por lo
que el mtodo de prueba de esterilidad interno debe demostrar que la preparacin de la muestra no provoca la esterilizacin
de la muestra de prueba.
80 (1) Medicamentos Inyectables / Requisitos Generales USP 39

Los implantes en forma de cilindro para administracin sistmica por lo general se proveen en un dispositivo de insercin
para administracin subcutnea o local, tal como administracin ocular local. Asimismo, los implantes se pueden implantar
quirrgicamente para administracin local, p.ej., administracin ocular.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para implantes:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Uniformidad de Unidades de Dosificacin
Dependiendo del medicamento, pueden ser necesarias las siguientes pruebas:
Contenido de Agua
Geles in situ: Los geles estriles in situ son preparaciones lquidas que estn destinadas para inyectarse en sitios teraputicos
especficos. Por lo regular, estn compuestos por polmeros en disolventes orgnicos y, al momento de su inyeccin, los disol-
ventes emigran del sitio, dejando una masa gelificada. Las preparaciones se pueden inyectar tal como se encuentran, al mo-
mento de su reconstitucin, a partir de la formacin in situ, o a partir de catlisis iniciada qumicamente que resulta en la for-
ma final.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para geles in situ:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Propiedades Fisicoqumicas: Viscosidad
- Conservantes Antimicrobianos
- Contenido y Actividad del Iniciador Catalizador2
- Monmero Residua12
- Tiempo de Formacin del Ge12
Micropartculas: Micropartculas reabsorbibles inyectables para liberacin prolongada con un dimetro generalmente de 20
a 100 m. Estn compuestas por frmacos incluidos dentro de un excipiente polimrico biocompatible y biorreabsorbible,
p.ej., excipientes de polister. Las micropartculas se proveen como polvos estriles en un vial o jeringa.
justo antes de su administracin intramuscular o subcutnea, el polvo de micropartculas debe suspenderse en un vehculo
acuoso para inyeccin (diluyente). El vehculo para inyeccin por lo regular est formado por Agua para Inyeccin, agente ten-
soactivo y mejorador de viscosidad, y puede contener un compuesto que ajuste la osmolalidad, p.ej., un azcar con o sin un
compuesto que controle el pH, p.ej., un cido. El vehculo para inyeccin debe ser estril y debe analizarse de acuerdo a los
requisitos para soluciones destinadas para administracin parenteral.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para micropartculas para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Uniformidad de Unidades de Dosificacin
- Contenido de Agua
- Disolventes Residuales
Dependiendo del medicamento, pueden ser necesarias las siguientes pruebas:
Distribucin del Tamao de Partcula
Propiedades Fisicoqumicas: pH, Osmolalidad y Osmolaridad

Estents para Elucin de Frmacos

Los estents para elucin de frmacos son estents, metales diminutos o estructuras de polmeros que se usan para mantener
las arterias abiertas despus de una intervencin mdica, en los cuales se incorpora un frmaco en el interior o sobre la plata-
forma del estent. Los estents para elucin de frmacos por lo regular tienen dos componentes de anlisis: (1) pruebas funcio-
nales que por lo general son mtodos de la American Society for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense para Ensayos
y Materiales o ASTM) que estn fuera del alcance de este captulo y (2) pruebas analticas.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para estents para elucin de frmacos:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
- Uniformidad de Unidades de Dosificacin. El contenido de la sustancia activa en la forma farmacutica es aplicable
para estents para elucin de frmacos envasados en envases unitarios. La prueba se puede realizar mediante unifor-
midad de contenido o variacin de peso (ver el captulo Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905)). Siempre que
se justifique adecuadamente, el nmero de estents requerido para esta prueba puede ser menor que el recomendado
en el captulo (905).
- Reactividad Biolgica
- Partculas
- Espesor(es) del Recubrimiento 2
- Robustez del Recubrimiento y Susceptibilidad a la Ruptura o Expansin 2
- Frmaco Libre vs. Frmaco Encapsulado2
- Morfologa (superficie y seccin cruzada) 2
USP 39 Requisitos Generales / (2) Medicamentos Orales 81

- Polidispersin2
- Cociente de Copolmero 2
- Punto de Transicin Vtrea 2
- Adhesin del Recubrimiento a la Superficie del estent2
- Prueba de Reaccin del Tejido 2
- Peso Molecular del Polmero 2

PRUEBAS DE DESEMPEO DEL PRODUCTO

Una prueba de desempeo para inyectables y productos implantados debe tener la capacidad de medir la liberacin de fr-
macos a partir de las formas farmacuticas fabricadas. Asimismo, debe ser reproducible y confiable, y, aunque no se trata de
una medicin de biodisponibilidad, la prueba de desempeo debe ser capaz de detectar cambios en las caractersticas de libe-
racin del frmaco del producto terminado. Estos cambios tienen el potencial de alterar el desempeo biolgico del frmaco
en la forma farmacutica, y pueden estar relacionados con ingredientes activos o inactivos/inertes en la formulacin, con atri-
butos fsicos o qumicos de la formulacin terminada, con variables de fabricacin, con los efectos de transporte y almacena-
miento, con efectos de envejecimiento y con otros factores de formulacin crticos para las caractersticas de calidad del medi-
camento terminado.
Favor de consultar el captulo Procedimiento de Disolucin: Desarrollo y Validacin (1092) al desarrollar la prueba de liberacin
de frmacos, al seleccionar el medio de liberacin de frmacos, el aparato o el procedimiento y el mtodo analtico. Las prue-
bas de desempeo del producto pueden servir para una gran variedad de propsitos en el desarrollo del producto y en el mo-
nitoreo del medicamento posterior a la aprobacin. Asimismo, proveen garanta sobre el desempeo equivalente para produc-
tos que han sufrido cambios en las materias primas, reubicacin o cambios en el sitio de fabricacin y dems cambios posterio-
res a la aprobacin conforme a lo detallado en las Pautas para la Industria SUPAC de la FDA (SUPAC-IR, SUPAC-MR y SUPAC-
-SS; disponibles en www.fda.gov/cder/guidance). En este captulo, se debe considerar una prueba de desempeo de la USP
para productos inyectables e implantados a fin de sustentar la liberacin de partidas.

(2) MEDICAMENTOS ORALES-PRUEBAS DE CALIDAD DEL

PRODUCTO

INTRODUCCIN

La administracin oral es la va de administracin ms comn para medicamentos. Todos los medicamentos orales conllevan
a la accin local y/o sistmica en la cavidad oral y/o en el tracto gastrointestinal. Los medicamentos orales se dividen en dos
categoras principales: slidos y lquidos. Los medicamentos orales slidos incluyen, entre otros, cpsulas, tabletas, grnulos y
polvos. De manera similar, los medicamentos orales lquidos incluyen, entre otros, soluciones, suspensiones y emulsiones. Las
definiciones y descripciones de estas formas farmacuticas, as como informacin abreviada sobre su composicin y procesos
de fabricacin se encuentran en el captulo Formas Famacuticas (1151 ). 1
El presente captulo general (2) se centra en las pruebas de calidad de productos que generalmente son necesarias para me-
dicamentos orales para una sola molcula o una combinacin de molculas pequeas de ingredientes activos. Este captulo no
contempla los productos biolgicos en formas farmacuticas slidas. En este captulo, los trminos "frmaco" e "ingrediente
activo" se usan de manera intercambiable. El contenido de este captulo no necesariamente se aplica a medicamentos destina-
dos para un uso distinto a la administracin oral. Por ejemplo, el captulo no trata las formas farmacuticas oromucosas. Algu-
nas de las pruebas indicadas en este captulo se pueden llevar a cabo durante el proceso u omitirse como pruebas de rutina
basndose en la validacin del proceso. Sin embargo, una vez que el producto est en el mercado, ste debe cumplir con los
requisitos farmacopeicos de la USP al momento del muestreo y anlisis.
El captulo (2) provee un marco de sustento para nuevas monografas individuales; stas se consideran documentos de
"avance" y no pretenden apartarse de las monografas individuales (no reemplazan a las monografas individuales). Adems, el
captulo (2) provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes y consolidadas de manera coherente y
concisa. Cuando exista una monografa, sta contendr todas las pruebas requeridas para la forma farmacutica. Cuando no
exista la monografa de un medicamento especfico, el captulo general proveer las pruebas de calidad especficas disponibles
como recurso para los fabricantes hasta que la USP desarrolle las monografas particulares requeridas para la forma farmacuti-
ca. Cuando est disponible un procedimiento de prueba validado para el medicamento especfico, ste se identifica en un ca-
ptulo general con un nmero inferior a (1000). Para aqullos casos en los que no sea posible recomendar un procedimiento

1 [NOTA-Todas las referencias a los captulos a partir del (1000) son nicamente para propsitos informativos y para su uso como recurso til. Estos captulos no
son obligatorios a menos que su aplicacin se indique explcitamente.]
82 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales USP 39

validado pero se cuente con informacin para la prueba de calidad y/o de desempeo del producto, dicha informacin estar
descrita en un captulo informativo con un nmero superior a (1000).

Pruebas de Calidad y de Desempeo de Medicamentos

Las pruebas, los procedimientos analticos y los criterios de aceptacin de una monografa para medicamentos orales se divi-
den en dos categoras: (1) aqullas que evalan los atributos generales de calidad del producto y (2) aqullas que evalan el
desempeo del producto, el cual es un atributo especfico de calidad generalmente vinculado a los estudios de biodisponibili-
dad y de bioequivalencia (ver el captulo Evaluacin de Desempeo del Producto Farmacutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia
y Disolucin (1090)). 1 Las pruebas de calidad del medicamento pretenden evaluar atributos tales como identificacin, conteni-
do (valoracin), impurezas (pruebas universales), uniformidad del contenido de la dosis, pH, llenado mnimo, contenido de
alcohol, contenido voltil y contenido microbiano (pruebas especficas). Las pruebas de desempeo de medicamentos estn
diseadas para evaluar la liberacin de frmacos in vitro a partir de las formas farmacuticas, p.ej., Disolucin (711) y Liberacin
de Frmacos (724). Para medicamentos orales lquidos en solucin, el desempeo se considera ptimo, por lo que no se inclu-
ye una prueba de desempeo en la monografa.
Cada uno de estos atributos es importante para adquirir un entendimiento primario de la calidad y desempeo de un medi-
camento. Por ende, constituyen los cimientos para la monografa. Un producto oficial debe cumplir con todas las pruebas de
calidad de medicamentos y las pruebas de desempeo de medicamentos incluidas en su monografa correspondiente.
[NOTA-Las pruebas de disolucin, especficamente la similitud del perfil de disolucin entre contenidos mayores y conteni-
dos menores de un producto de un fabricante dado y el perfil de similitud entre el producto genrico y el producto de rferen-
cia, se emplean para el otorgamiento de bioexenciones. Ver el captulo (1090). 1]

PRUEBAS DE CALIDAD DE PRODUCTOS PARA MEDICAMENTOS ORALES

Las pruebas de calidad para medicamentos orales se dividen en dos categoras: (1) pruebas universales que se aplican a to-
dos los medicamentos orales y que se deben incluir en la monografa, y (2) pruebas especficas cuya inclusin debe considerar-
se para tipos especficos de productos orales.

PRUEBAS UNIVERSALES

Los atributos de calidad del producto para formas farmacuticas orales son importantes para asegurar que los productos co-
mercializados cumplan con los requisitos mnimos de calidad. Las pruebas universales deben aplicarse a todas las formas far-
macuticas orales y deben incluir Descripcin, Identificacin, Contenido (prueba de valoracin) e Impurezas (orgnicas, inorgni-
cas y disolventes residuales).

DESCRIPCIN

La descripcin tiene un carcter general y no constituye una norma por s misma. sta comunica la aparicin de un artculo
que cumple con los estndares de la monografa.

IDENTIFICACIN

La prueba de identificacin se define en las Advertencias y Requisitos Generales, 5.40 y se incluye en una monografa para
ayudar a confirmar que el artculo contiene el frmaco declarado en la etiqueta mediante una identificacin positiva del frma-
co o de las sustancias en un medicamento.
Un mtodo para confirmar la identidad consiste en comparar el tiempo de retencin de la muestra con el obtenido en in-
yecciones estndar en un procedimiento cromatogrfico de valoracin. Otros mtodos que a menudo se usan para confirmar
ortogonalmente la identidad del ingrediente activo son: Prueba de Identificacin (201 ), Prue-
bas de Identificacin Espectrofotomtrica (197), Espectrosco-
pa en el Infrarrojo Cercano (1119)1 y Espectroscopa Raman (1120), 1 entre otros. El procedimiento ser capaz de
distinguir entre el ingrediente activo y todos los excipientes que estn presentes o de los productos de degradacin potencia-
les que pudieran estar presentes. Se debe tener cuidado de asegurar que el sistema cromatogrfico separa el artculo de otros
frmacos, impurezas y aditivos estrechamente relacionados. La absorcin en el infrarrojo y en el ultravioleta tambin se pueden
usar para la identificacin (ver el captulo (197)), cuando se haya demostrado que el procedimiento es selectivo para el frma-
co mediante un estudio de validacin o verificacin apropiado. Los resultados de la prueba de identificacin deben compararse
con los resultados obtenidos de un estndar de referencia adecuado preparado de manera similar.
USP 39 Requisitos Generales/ (2) Medicamentos Orales 83

VALORACIN

La valoracin es una prueba especfica e indicadora de la estabilidad para determinar la potencia (contenido) del medica-
mento. Cuando se justifica una valoracin no especfica (p.ej., volumetra), se debe asegurar mediante otros procedimientos
analticos de sustento la capacidad de detectar cualquier especie interferente. En general, la aceptacin a priori de una varia-
cin de 10% en los lmites de un atributo de calidad (p.ej., valoracin) a partir de la cantidad declarada esperada (100%) en
la mayora de los casos pretende tomar en cuenta la variabilidad de la fabricacin y la estabilidad durante la vida til, y se basa
principalmente en la nocin de que tal variacin en un atributo de calidad tiene una menor probabilidad de ocasionar un im-
pacto adverso perceptible en el resultado clnico deseado. Los criterios de aceptacin de 95,0%-105,0% se usan con justifica-
cin (p.ej., para medicamentos con un ndice teraputico estrecho). Tambin se aceptan las valoraciones de actividad y las
valoraciones de contenido absoluto siempre que se justifique.

IMPUREZAS

El frmaco y los excipientes usados en la fabricacin del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproduc-
tos sintticos y otras impurezas inorgnicas y orgnicas. Los lmites de dichas impurezas estn indicados en las monografas del
frmaco y de los excipientes. Existe la posibilidad de que ocurra degradacin durante la fabricacin del producto y durante su
vida til, la cual, entre otros factores, puede resultar de la degradacin del frmaco o de interacciones entre el frmaco y los
excipientes. Los procedimientos y criterios de aceptacin deben limitar especficamente los materiales txicos. Ver los requisi-
tos especficos en las Advertencias Generales de la USP, 5.60 Impurezas y Sustancias Extraas. [NOTA-Para informacin adicio-
nal, consultar el captulo Impurezas en Frmacos y Productos Farmacuticos (1086). 1)

PRUEBAS ESPECFICAS PARA TABLETAS

Adems de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para table-
tas, dependiendo de la naturaleza del frmaco y de la formulacin.

CONTENIDO VOLTIL

La prueba y el mtodo especfico dependen de la naturaleza del artculo. Se debe tener consideracin especial a las formas
farmacuticas cuyo contenido de agua pudiera ser un potencial atributo de calidad y a los productos en los que se emplean
disolventes para la fabricacin del medicamento.
Cuando la presencia de humedad u otro material voltil pueda tornarse crtica, los analistas deben determinar la cantidad de
disolventes voltiles no unidos o de materia voltil de cualquier tipo separado mediante Prdida por Secado (731) u otra tcnica
adecuada (p.ej., actividad del agua). Para sustancias que parecen contener agua como el nico componente voltil, el procedi-
miento provisto en el captulo Determinacin de Agua (921) puede ser apropiado. Para los medicamentos, los analistas tambin
deben consultar el captulo Disolventes Residuales (467).

DESINTEGRACIN

La desintegracin es un atributo esencial de los slidos orales, excepto para aqullos destinados a ser masticados antes de
tragarlos y para los productos de liberacin retardada o prolongada. Esta prueba mide el tiempo que tarda en desintegrarse la
unidad de dosificacin en un medio acuoso y se describe en detalle en el captulo (701 ). Para algunas formas farmacuticas,
p.ej., tabletas efervescentes, tabletas de desintegracin, tabletas solubles, entre otros, la Farmacopea Europea describe en gran
detalle la prueba de desintegracin. La prueba de desintegracin para algunas de las formas farmacuticas de este captulo se
incluye para proveer informacin de integridad. Para informacin sobre procedimientos detallados, consultar el captulo (701)
o la Farmacopea Europea. Siempre que se incluye, la prueba de desintegracin se usa nicamente como una prueba de control
de calidad y no como una prueba de desempeo del producto, y debe cumplir con las especificaciones de la monografa. Una
prueba de desintegracin podr usarse como una prueba de desempeo del producto nicamente cuando la desintegracin
se haya correlacionado con la disolucin de una forma farmacutica (Pauta Q6A de la ICH, disponible en www.ich.org). Para
todos los dems casos, se deber considerar una prueba de disolucin como una prueba de desempeo del producto.

fRIABILIDAD DE LAS TABLETAS

El procedimiento de prueba se aplica a la mayora de las tabletas comprimidas sin cubierta. La friabilidad determina la capa-
cidad de las tabletas para soportar las tensiones mecnicas y su resistencia a la formacin de astillas y a la abrasin en la super-
ficie. [NOTA-Para informacin adicional, consultar el captulo Friabilidad de las Tabletas (1216). 1]
84 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales USP 39

FUERZA DE RUPTURA DE LAS TABLETAS

La fuerza de ruptura de las tabletas mide la integridad mecnica de las tabletas, que es la fuerza requerida para provocar que
fallen (es decir, que se rompan) en un plano especfico. [NOTA-Para informacin adicional, ver el captulo Fuerza de Ruptura de
las Tabletas (121 7).1]

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIN

La uniformidad de unidades de dosificacin debe demostrarse mediante uniformidad de contenido o variacin de peso. La
uniformidad de contenido se basa en la valoracin del contenido individual de frmacos en un nmero de unidades de dosifi-
cacin para determinar si los contenidos individuales son lo suficientemente cercanos a la cantidad declarada. La variacin de
peso se puede usar como alternativa para estimar la uniformidad del contenido ante ciertas condiciones (ver el captulo Unifor-
midad de Unidades de Dosificacin (905)).

TABLETAS SIN CUBIERTA

Las tabletas sin cubierta incluyen tabletas de una sola capa que resultan de una sola compresin de partculas y tabletas de
capas mltiples que constan de capas concntricas o paralelas obtenidas mediante compresin sucesiva de partculas de com-
posicin diferente. Los excipientes usados generalmente no tienen el propsito especfico de modificar la liberacin del frma-
co en los fluidos digestivos. Las tabletas sin cubierta incluyen, entre otras, las siguientes: tabletas efervescentes, tabletas buca-
les, tabletas sublinguales, tabletas masticables, tabletas de desintegracin, tabletas de desintegracin oral, bolos, tabletas solu-
bles, tabletas para solucin oral y tabletas para suspensin oral. Los bolos, que son tabletas grandes y alargadas destinadas
para administrarse en animales, deben considerarse tabletas sin cubierta y deben cumplir con los requisitos de calidad del pro-
ducto. Para las tabletas sin cubierta, la desintegracin debe analizarse segn lo indicado en el captulo (701 ).
TABLETAS BUCALES, SUBLINGUALES Y DE DESINTEGRACIN ORAL (DE DISPERSIN ORAL)
Estas formas farmacuticas se estudiarn en el nuevo captulo Medicamentos para Mucosas-Pruebas de Calidad del Producto
(4), el cual se publicar en un futuro. Se citan en este captulo slo para propsitos informativos y para proveer informacin
completa.
TABLETAS MASTICABLES
Las tabletas masticables no requieren cumplir con la prueba de desintegracin. Las tabletas masticables (intactas) deben so-
meterse a la prueba de disolucin, como una prueba de desempeo del producto (cuando se cite en la monografa), debido a
que podran ser tragadas por un paciente sin haberlas masticado apropiadamente. En general, las condiciones de la prueba de
disolucin para tabletas masticables deben ser las mismas que para las tabletas no masticables de la misma fraccin o ingre-
diente activo.
TABLETAS DE DESINTEGRACIN O DE DISPERSIN
Se trata de tabletas destinadas para ser dispersadas en agua antes de su administracin para proporcionar una dispersin
homognea.
Finura de la dispersin: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una
dispersin sin grumos que pasa a travs de un tamiz N 25 (71 O m).
TABLETAS PARA SOLUCIN ORAL Y TABLETAS PARA SUSPENSIN ORAL
Finura de la dispersin: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una
dispersin sin grumos que pasa a travs de un tamiz N 25 (71 O m).

TABLETAS RECUBIERTAS

Las tabletas recubiertas son tabletas cubiertas con una o ms capas de mezclas de varias sustancias tales como resinas sintti-
cas o naturales, gomas, gelatinas, diluyentes inactivos e insolubles, azcares, plastificantes, polioles, ceras, materia colorante
autorizada por la autoridad competente y, en ocasiones, sustancias saborizantes y sustancias activas. Las tabletas recubiertas
con azcar o pelcula incluyen, entre otras: tabletas con cubierta simple, tabletas de liberacin prolongada y tabletas de libera-
cin retardada. Cuando sea aplicable, se debe realizar una prueba de desintegracin segn lo descrito en el captulo (701 ).
No existen pruebas de calidad adicionales especficas para tabletas de liberacin prolongada ni para tabletas de liberacin
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA CPSULAS

Adems de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para cp-
sulas, dependiendo de la naturaleza del frmaco y de la formulacin.
Las pruebas de calidad del producto que se consideran especficas al tipo de cpsula incluyen aqullas para contenido voltil
(captulos (731) y (921)). Las cpsulas de una pieza a menudo se usan para administrar un frmaco como solucin o suspen-
sin. Las cpsulas de dos piezas constan de dos piezas telescpicas de tapa y cuerpo de diversos tamaos estndar y se usan
USP 39 Requisitos Generales / (2) Medicamentos Orales 85

para administrar material slido como polvo, grnulos o tabletas pequeas. Las cpsulas de liberacin modificada incluyen,
entre otras: cpsulas de liberacin retardada y cpsulas de liberacin prolongada.
Desintegracin: Proceder segn se indica en el captulo (701 ), Cpsulas de Gelatina Blanda para cpsulas de una pieza y Cp-
sulas de Gelatina Dura para cpsulas de dos piezas. La desintegracin para cpsulas de liberacin modificada se describe en
sumo detalle en la Farmacopea Europea.
No existen pruebas de calidad adicionales especficas para cpsulas de liberacin prolongada ni para cpsulas de liberacin
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA GRNULOS

Adems de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para gr-
nulos, dependiendo de la naturaleza del frmaco y de la formulacin.
Los grnulos son formas farmacuticas slidas que estn compuestas de aglomeraciones de partculas ms pequeas. Los
grnulos incluyen, entre otros: grnulos efervescentes, grnulos recubiertos, grnulos de liberacin prolongada y grnulos de
liberacin retardada.
Las pruebas que se consideran especficas para el tipo de grnulos incluyen contenido voltil (captulos (731) y (921 )). La
desintegracin para grnulos efervescentes se describe en sumo detalle en la Farmacopea Europea. Basndose en la naturaleza
del artculo y en criterios cientficos, podran ser aplicables pruebas adicionales, incluida la finura de polvos, entre otras.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA POLVOS

Los polvos orales deben indicar lo siguiente: "Slo para Uso Oral". Las pruebas que se consideran especficas para el tipo de
polvo incluyen: Llenado Mnimo (755) y contenido voltil (captulos (731) y (921 )).
El captulo Llenado Mnimo (755) presenta especificaciones aplicables a los polvos orales.
Basndose en la naturaleza del artculo y en criterios cientficos, podran ser aplicables pruebas adicionales, incluidos el pH en
soluciones acuosas, la finura de polvos, los lmites microbanos, entre otros.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA LQUIDOS

Las pruebas de calidad del producto recomendadas para un medicamento lquido incluyen las pruebas universales descritas
anteriormente y las pruebas especficas incluidas ms adelante. La mayora de las pruebas de calidad para lquidos requieren la
evaluacin de productos monodosis para estimar el atributo de calidad. Las instrucciones especficas para realizar las pruebas
de calidad para productos monodosis o multidosis se proveen en la monografa o en el captulo general. Por ejemplo, la varia-
cin de peso se puede usar cuando se controla adecuadamente la aptitud de mezclado para las sustancias activas y los exci-
pientes en la mezcla para asegurar su distribucin uniforme, como en el caso de las soluciones.

VOLUMEN DE ENTREGA

Cuando la formulacin lquida se envasa en un envase multidosis, se debe cumplir con el captulo Volumen de Entrega (698).

DETERMINACIN DE ALCOHOL

Si la formulacin lquida contiene una cantidad de alcohol, se debe incluir el captulo Determinacin de Alcohol (611 ). Los
lmites pueden ser una concentracin absoluta, en porcentaje, o relativos a un contenido declarado.

PH
Los productos orales lquidos generalmente son formulaciones acuosas que son susceptibles a cambios en el pH derivados de
la exposicin al C0 2 atmosfrico. El ingreso de C0 2 atmosfrico y el cambio en el pH de los productos orales lquidos nica-
mente es relevante para los productos acuosos. Aunque es menos crtico que para las preparaciones oftlmicas, el pH de una
formulacin lquida puede afectar el sabor y la estabilidad. El intervalo de pH conforme a lo descrito en el captulo pH (791) se
indica en la monografa.

CONTENIDO MICROBIANO

La presencia de ciertos microorganismos en preparaciones no estriles tiene el potencial de reducir o incluso inactivar la acti-
vidad teraputica del producto, y tiene el potencial de afectar adversamente la salud del paciente. Algunos productos orales
lquidos pueden estar sujetos a un control microbiolgico extremo, mientras que otros no requieren control alguno. La necesi-
dad de especificaciones microbianas para un producto oral lquido dado depende de su formulacin y uso y se indica en la
monografa.
86 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales USP 39

[NOTA-Para informacin adicional, ver el captulo Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Criterios de Aceptacin pa-
ra Preparaciones Farmacuticas y Sustancias de Uso Farmacutico (1111 ). 1]

ANTIOXIDANTE

Se debe realizar una prueba de liberacin. La prueba para vida til podra no ser necesaria cuando los datos de desarrollo y
estabilidad as lo justifiquen (Pauta Q6A de la ICH).

SUSTANCIAS EXTRABLES

Cuando los datos de estabilidad y desarrollo no presentan evidencia significativa de productos extrables, se puede proponer
la eliminacin de esta prueba. Cuando los datos demuestren la necesidad de criterios de aceptacin para soluciones orales-
tapn de goma, recubrimiento interno de la tapa, frasco de plstico-se deben recopilar datos tan pronto como sea posible
durante el proceso de desarrollo (Pauta Q6A de la ICH).

TIPOS DE FORMAS FARMACUTICAS LQUIDAS

Las pruebas de calidad especficas para estas formas farmacuticas se proveen en sus respectivas monografas.
SOLUCIONES ORALES Y POLVOS Y GRNULOS PARA SOLUCIN
Las pruebas para formulaciones "para Solucin" se llevan a cabo en una solucin bien mezclada del medicamento reconsti-
tuido segn se indica en el etiquetado.
EMULSIONES, SUSPENSIONES Y POLVOS Y GRNULOS PARA SUSPENSIN
Las pruebas para formulaciones "para Suspensin" se llevan a cabo en una suspensin bien mezclada del medicamento re-
constituido segn se indica en el etiquetado. Las pruebas de calidad del producto para suspensiones debe incluir al menos una
prueba de capacidad de suspensin.
POLVOS Y GRNULOS PARA JARABES Y POLVOS PARA GOTAS ORALES
Despus de su disolucin o suspensin, cumplen con los requisitos de la monografa para la forma farmacutica final. El con-
tenido voltil (captulos (731) y (921 )) puede ser una prueba de calidad adicional para polvos y grnulos para reconstitucin.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA FORMAS FARMACUTICAS ORALES MISCELNEAS

PRODUCTOS ORALES LIOFILIZADOS

Determinacin de Agua (921 ), Mtodo la: Los productos orales liofilizados cumplen con la prueba. Los lmites se aprueban
segn lo indicado en la monografa especfica.

(3) MEDICAMENTOS TPICOS Y TRANSDRMICOS-PRUEBAS DE

CALIDAD DEL PRODUCTO

INTRODUCCIN

Los medicamentos de aplicacin tpica se dividen en dos categoras generales: medicamentos que se aplican para generar
una accin localizada y los que se aplican para conseguir efectos sistmicos despus de su absorcin a travs de la piel en el
torrente sanguneo. La accin localizada puede presentarse en la superficie del sitio de aplicacin (p.ej., estrato crneo, epitelio
ocular), en los tejidos subyacentes (p.ej., epidermis y/o dermis) y en tejidos subcutneos (p.ej., msculo o articulacin).
Los medicamentos de aplicacin tpica incluyen, entre otros, cremas, geles, ungentos, pastas, suspensiones, lociones, es-
pumas, atomizadores, aerosoles, soluciones y sistemas transdrmicos de liberacin de frmacos (STD, tambin conocidos co-
mo parches). Las definiciones y descripciones de estas formas farmacuticas, as como una breve informacin sobre su compo-
sicin y/o proceso de fabricacin, se encuentran disponibles en el captulo Formas Farmacuticas (1151 ).
Los procedimientos y criterios de aceptacin aceptables para analizar los medicamentos de aplicacin tpica se pueden divi-
dir en dos clases: aqullos que evalan los atributos generales de calidad del producto y aqullos que evalan el desempeo
del producto. Los atributos de calidad del producto incluyen: descripcin, identificacin, valoracin (contenido), impurezas,
propiedades fisicoqumicas, uniformidad de unidades de dosificacin, contenido de agua, pH, viscosidad aparente, lmites mi-
crobianos, contenido de conservantes antimicrobianos, contenido de antioxidantes, esterilidad (cuando corresponda), as co-
mo otras pruebas especficas para cada producto. Las pruebas de desempeo del producto evalan la liberacin de frmacos y
dems atributos que afectan la liberacin de los frmacos de la forma farmacutica terminada.
USP 39 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos 87

Aunque la mayora de los productos de aplicacin tpica son semislidos, lquidos o suspensiones, los STD son dispositivos
que se aplican sobre la piel y varan en su composicin y mtodo de fabricacin. Los STD liberan sus ingredientes activos me-
diante diversos mecanismos, los cuales pueden ser pasivos o activos. Este captulo abarca nicamente las pruebas relacionadas
con STD pasivos.

PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA MEDICAMENTOS DE APLICACIN TPICA

Pruebas Universales
Las pruebas universales (ver Gua Q6A de la ICH-Specifications: Test Procedures and Acceptance Criterio for New Drug Substan-
ces and New Drug Products: Chemical Substances [Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptacin para
Nuevos Frmacos y Nuevos Medicamentos: Sustancias Qumicas], disponible en www.ich.org) se listan a continuacin y se
aplican a todos los medicamentos de aplicacin tpica.
Descripcin: Se debe proporcionar una descripcin cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptacin deben incluir
el aspecto final aceptable de la forma farmacutica terminada y del envase. El examen visual debe identificar los cambios de
color, migracin adhesiva (es decir, flujo fro) para STD, separaciones, cristalizacin, entre otros, que sean especficos del medi-
camento. La descripcin debe especificar el contenido o la cantidad declarada en la etiqueta del artculo. sta ltima no es una
prueba farmacopeica, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el medicamento.
Identificacin: Las pruebas de identificacin se discuten en las Advertencias y Requisitos Generales, 5.40. Las pruebas de
identificacin deben establecer la identidad del o de los frmacos presentes en el artculo y deben distinguir entre compuestos
con estructuras estrechamente relacionadas que pudieran estar presentes. Las pruebas de identidad deben ser especficas para
el o los frmacos (p.ej., espectroscopa en el infrarrojo). Los mtodos de espectrofotometra en el Infrarrojo Cercano (NIR, por
sus siglas en ingls) o Raman tambin podran ser aceptables para la identificacin del producto farmacutico (ver Espectrosco-
pa en el Infrarrojo Cercano (1119) y Espectroscopa Raman (1120)). La identificacin mediante un tiempo de retencin cromato-
grfico nico no es especfica.
Valoracin: Se debe usar una prueba especfica e indicadora de la estabilidad para determinar el contenido del medica-
mento. Para los casos en los que se justifica el uso de una valoracin no especfica, (p.ej., Volumetra (541 )), se deben usar
otros procedimientos analticos de respaldo para conseguir la especificidad general.
Impurezas: El frmaco y los excipientes usados en la fabricacin del medicamento pueden presentar impurezas del proce-
so, subproductos sintticos, impurezas asociadas con el adhesivo (p.ej., monmeros residuales), disolventes residuales (ver Di-
solventes Residuales (467)), metales pesados (ver Metales Pesados (231 )), entre otras impurezas inorgnicas y orgnicas, las cua-
les deben ser evaluadas y controladas. Asimismo, se deben evaluar y controlar las impurezas producidas por la degradacin del
frmaco, as como aqullas producidas durante el proceso de fabricacin del medicamento.

Pruebas Especficas
Adems de las pruebas universales citadas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para cada
caso en particular.
Uniformidad de unidades de dosificacin: Esta prueba se aplica a los STD y a las formas farmacuticas en envases unita-
rios (ver Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905)).
Contenido de agua: Cuando resulte apropiado, se debe incluir una prueba de contenido de agua (ver Determinacin de
Agua (921 )). Esta prueba por lo general depende de la formulacin. Por lo tanto, no se incluye en la monografa oficial del
medicamento, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el mismo.
Lmites microbiolgicos: El examen microbiolgico para medicamentos no estriles se realiza en conformidad con los
mtodos provistos en los captulos generales Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano
(61) y Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos (62), a menos que se haya demos-
trado que la formulacin posee por s misma propiedades antimicrobianas. Los criterios de aceptacin para medicamentos no
estriles basados en el recuento total de microorganismos aerobios (TAMC, por sus siglas en ingls) y en el recuento total com-
binado de hongos filamentosos y levaduras (TYMC, por sus siglas en ingls) se proporcionan en el captulo Examen Microbiol-
gico de Productos No Estriles: Criterios de Aceptacin para Preparaciones Farmacuticas y Sustancias de Uso Farmacutico (1111 ).
Contenido de conservantes antimicrobianos: Se deben establecer criterios de aceptacin para el contenido de conser-
vantes antimicrobianos en productos multidosis. Dichos criterios deben basarse en los niveles de conservante antimicrobiano
necesarios para mantener la calidad microbiolgica del producto durante todas las etapas de su uso y vida til propuestos (ver
Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )).
Contenido de antioxidantes: Si el medicamento contiene antioxidantes, se deben establecer pruebas para determinar su
contenido, a menos que se pueda detectar su degradacin por oxidacin empleando otro mtodo de prueba, como por ejem-
plo, una prueba de impurezas. Se deben establecer criterios de aceptacin para el contenido de antioxidantes. Dichos criterios
deben basarse en los niveles de antioxidante necesarios para mantener la estabilidad del producto durante todas las etapas de
su uso y vida til propuestos.
88 (3) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos / Requisitos Generales USP 39

Esterilidad: Dependiendo del uso de la forma farmacutica (p.ej., preparaciones oftlmicas, productos que se aplicarn a
heridas abiertas o reas con quemaduras), se deber demostrar la esterilidad del producto segn corresponda (ver Pruebas de
Esterilidad (71) ).
pH: Cuando corresponda, el pH de los medicamentos de aplicacin tpica deber analizarse al momento de la liberacin
de la partida y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas. Algunos medicamentos
de aplicacin tpica contienen cantidades muy limitadas de agua o fase acuosa, por lo que no siempre se requiere la medicin
de su pH. Esta prueba por lo general depende de la formulacin. Por lo tanto, no se incluye en la monografa oficial del medi-
camento, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el mismo.
Tamao de partcula: Por lo general, la determinacin y el control del tamao de partcula de los frmacos activos en
medicamentos de aplicacin tpica se llevan a cabo en la etapa de desarrollo de la formulacin. No obstante, los medicamen-
tos de aplicacin tpica deben ser examinados para detectar cualquier alteracin del tamao de partcula (es decir, apariencia
de las partculas, cambios de forma, tamao, hbito o agregacin de las partculas) del frmaco que pudiera ocurrir durante el
procesamiento y almacenamiento del producto. Dichos exmenes se deben realizar al momento de la liberacin de la partida
y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas, debido a que los cambios visible-
mente observables (macro y microscpicamente) podran comprometer la integridad y/o el desempeo del medicamento. Es-
tos tipos de pruebas por lo general dependen de la formulacin, por lo que no se incluyen en las monografas oficiales pero
forman parte de la especificacin del fabricante para el mismo.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA MEDICAMENTOS OFTLMICOS

Las formas farmacuticas oftlmicas deben cumplir con los requisitos del captulo Pruebas de Esterilidad (71 ). Si los ingredien-
tes especficos usados en la formulacin no son susceptibles a las tcnicas de esterilizacin de rutina, se pueden usar ingredien-
tes que cumplan con los requisitos de esterilidad descritos en (71 ), junto con una fabricacin asptica. Cada preparacin oftl-
mica para usos mltiples debe contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para destruir o impedir la proliferacin
de los microorganismos accidentalmente introducidos al usar el producto (ver Sustancias Agregadas en Ungentos Oftlmicos
(771 )), a menos que se indique algo distinto en la monografa individual o a menos que la frmula misma sea bacteriosttica
y/o el sistema de administracin promueva la bacteriostasis. La preparacin oftlmica terminada debe estar exenta de partcu-
las grandes y debe cumplir con los requisitos de Prdida y Partculas Metlicas (771 ). Los envases primarios para preparaciones
oftlmicas deben ser estriles al momento de llenarlos y cerrarlos. Es obligatorio sellar los envases primarios para preparaciones
oftlmicas con un cierre que evidencie la alteracin intencional para asegurar la esterilidad al momento del primer uso.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA MEDICAMENTOS SEMISLIDOS DE APLICACIN TPICA

Viscosidad Aparente

La viscosidad es una medida de la resistencia de la formulacin al flujo, adems de una evaluacin de las propiedades reol-
gicas de la forma farmacutica (p.ej., formas farmacuticas semislidas). Debido a que nicamente los fluidos newtonianos po-
seen una viscosidad medible que no depende de la velocidad de cizallamiento, las formas farmacuticas semislidas que no
son newtonianas presentan una vicosidad aparente.
La viscosidad aparente de los medicamentos semislidos se debe analizar al momento de la liberacin de la partida e, inicial-
mente, en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para establecer las especificaciones para el monitoreo entre par-
tidas y de vida til. Se deben desarrollar procedimientos de medicin de acuerdo a lo indicado en Viscosidad-Mtodos Capila-
res (911 ). Para semislidos tixotrpicos y/o que presentan cambios irreversibles en la viscosidad despus del cizallamiento, se
debe prestar especial atencin a los procedimientos de preparacin de la muestra para minimizar la variabilidad en las medi-
ciones de viscocidad aparente ocasionadas por el historial variable de cizallamiento (p.ej., velocidad y temperatura de mezcla-
do, operacin de llenado, manipulacin de las muestras). Adems, en el caso de algunos productos, puede ser necesario con-
tar con especificaciones de viscosidad aparente para ms de un conjunto de condiciones (p.ej., etapa de proceso a granel, pro-
ducto final envasado, velocidades altas y bajas de cizallamiento, diferentes temperaturas).
Se deben establecer especificaciones de viscosidad aparente basadas en datos obtenidos durante el desarrollo del producto y
el anlisis de la vida til, para la liberacin de la partida y durante toda la vida til propuesta.
La prueba de viscosidad aparente depende de la formulacin y/o del proceso. Por lo tanto, no se incluye en la monografa
oficial del medicamento, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el medicamento. Asimismo, las especificacio-
nes de viscosidad aparente para formas farmacuticas semislidas pueden variar al momento de la liberacin de la partida y
durante la prueba de estabilidad. Aunque la viscosidad aparente del medicamento terminado al momento de la liberacin de
la partida debe cumplir con las especificaciones de desarrollo del mismo, para la prueba de estabilidad, las especificaciones de
viscosidad aparente para el medicamento deben basarse en la evaluacin estadstica del producto durante su vida til.
USP 39 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos 89

Uniformidad en los Envases

Los medicamentos semislidos de aplicacin tpica pueden presentar una separacin fsica durante los procesos de fabrica-
cin y durante la vida til. Para asegurar la integridad del medicamento, es fundamental evaluar la uniformidad del producto
terminado al momento de la liberacin de la partida y durante la vida til.

PRODUCTOS ENVASADOS EN TUBOS

La uniformidad de contenido dentro de los tubos puede evaluarse de la siguiente manera.

Retirar o cortar con cuidado el sello de la parte inferior del tubo y realizar un corte vertical desde la parte inferior hasta la
parte superior del tubo. Cortar con cuidado alrededor del borde superior del tubo, abrir las dos solapas y sujetarlas de modo
que el producto quede expuesto.
Inspeccionar el producto visualmente para determinar si hay separacin de fases, cambios en la apariencia fsica y la textura,
as como otras propiedades descritas en la prueba de Descripcin. Si no se observa separacin de fases o cambios en la aparien-
cia fsica y la textura, y si el producto cumple con los criterios de aceptacin de Descripcin, proceder segn se indica en las
siguientes secciones. Si el producto presenta una separacin de fases y/o cambios en la apariencia fsica o la textura, el produc-
to no cumple con la prueba de uniformidad de contenido del tubo.
Los procedimientos descritos a continuacin se pueden modificar dependiendo de la sensibilidad del procedimiento cuanti-
tativo usado para determinar la cantidad de frmacos presentes en la formulacin.
Para productos multidosis que contienen 5 g o ms
Procedimiento 7
1. Usando un solo tubo, despus de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de
las partes superior, media e inferior del tubo. El tamao de las muestras debe ser tal que permita realizar al menos una
determinacin cuantitativa de los ingredientes activos. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porcin
del producto usando cualquier procedimiento cuantitativo apropiado validado y evaluar los resultados de prueba usando
los Criterios de aceptacin A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptacin A, analizar tres tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptacin B.
Procedimiento 2
1 . Usando dos tubos, despus de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de las
partes superior, media e inferior de cada tubo. El tamao de las muestras debe ser tal que permita realizar al menos una
determinacin cuantitativa de los ingredientes activos. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porcin
del tubo usando cualquier procedimiento cuantitativo apropiado validado y evaluar los resultados de prueba usando los
Criterios de aceptacin A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptacin A, analizar dos tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptacin B.
Para productos multidosis que contienen menos de 5 g de producto
1. Analizar porciones de las partes superior e inferior de dos tubos usando el Procedimiento 7 o el Procedimiento 2 descritos
anteriormente. Evaluar los resultados de prueba usando los Criterios de aceptacin A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptacin A, analizar dos tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los ocho resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptacin B.
Criterios de aceptacin para la prueba de uniformidad de contenido del tubo (envase): Al determinar la desviacin
estndar relativa (RSD, por sus siglas en ingls) de mltiples tubos, determinar primero la varianza a partir de las tres medicio-
nes de cada tubo y promediar todos los tubos. La RSD se calcula usando esta varianza promedio.
Criterios de aceptacin A-Todos los resultados estn dentro del intervalo de valoracin del producto y la RSD es no ms de
6% o la indicada en las especificaciones del producto o en la monografa oficial. Si la RSD es mayor de 6%, usar los Criterios de
aceptacin B.
Criterios de aceptacin 8-Todos los resultados estn dentro del intervalo de valoracin del producto y la RSD de los 12 re-
sultados es no ms de 6% o la indicada en las especificaciones del producto o en la monografa oficial.

PRODUCTOS ENVASADOS EN ENVASES DIFERENTES A LOS TUBOS

Para los productos semislidos que se envasan en envases diferentes a los tubos, para los que no se pueda usar el mtodo de
muestreo anteriormente presentado, se pueden aceptar otros mtodos como el descrito a continuacin para un tarro.
1. Seleccionar una jeringa adecuada cuya longitud sea suficiente para alcanzar el fondo del recipiente.
2. Retirar y colocar aparte el mbolo de la jeringa, y cortar la parte inferior del cuerpo de la jeringa. El muestreo se debe
llevar a cabo desde un punto a la izquierda/derecha de una lnea media en la superficie del tarro a fin de conservar una
regin intacta en el otro lado para cualquier investigacin adicional (Ver la Figura 1).
90 (3) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos /Requisitos Generales USP 39

PARTE SUPERIOR

PARTE MEDIA

PARTE INFERIOR

Figura 1. Muestreo de un tarro.

3. Presionar lentamente el cuerpo de la jeringa hacia el interior del envase hasta alcanzar el fondo. Luego, hacer girar el cuer-
po de la jeringa que contiene el ncleo de la muestra y retirar la jeringa del envase.
4. Insertar el mbolo de la jeringa en el cuerpo y extrudir cuidadosamente el ncleo de la muestra sobre una superficie lim-
pia en tres porciones iguales que representen a las partes superior, media e inferior del envase.
5. Retirar una muestra apropiada, que sea representativa de la porcin media de las partes superior, media e inferior de las
muestras del envase, y analizar de acuerdo con las instrucciones citadas en Productos Envasados en Tubos.

PRUEBAS ESPECFICAS PARA SISTEMAS TRANSDRMICOS DE LIBERACIN DE FRMACOS

Los STD o parches se formulan con una capa de adhesivo para asegurar el contacto ntimo con la piel y para permitir la
administracin de la dosis deseada de frmaco. El adhesivo de los STD debe permitir el fcil desprendimiento de la capa pro-
tectora antes de su uso, se debe adherir adecuadamente a la piel humana durante la aplicacin, debe mantener su adhesin a
la piel durante el periodo de uso prescrito y debe permitir el fcil retiro del STD al final de su uso sin dejar residuo u ocasionar
daos a la piel u otros efectos indeseados. Asimismo, los adhesivos deben ser capaces de mantener el desempeo del STD
durante toda la vida til del medicamento.
Por lo general, se emplean tres tipos de pruebas de desprendimiento para STD: prueba de desprendimiento (a partir de un
sustrato estndar), prueba de desprendimiento de la capa protectora y prueba de adherencia.
Los criterios de aceptacin son especficos para cada producto y se definen para asegurar que las propiedades de adhesin
de cada partida de STD estn dentro del intervalo definido por el diseo del producto y que sean uniformes entre partidas,
basndose en las especificaciones de desarrollo del producto o en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto
durante la vida til del mismo.

Prueba de Desprendimiento

Esta prueba mide la fuerza requerida para retirar (desprender) un STD adherido a una superficie de un sustrato estndar
(p.ej., acero inoxidable pulido). El STD se aplica al sustrato usando las tcnicas especificadas para aplicacin y se acondiciona a
una temperatura y tiempo especficos. Luego, el STD se desprende del sustrato con un instrumento que permite controlar el
ngulo de desprendimiento (p.ej., 90 180 grados) y la velocidad de desprendimiento (p.ej., 300 mm/minuto), mientras se
registra la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras independientes. El
producto no cumple con la prueba si la fuerza promedio de desprendimiento est fuera del intervalo aceptable, determinado
durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto durante la vida
til del mismo.

Prueba de Desprendimiento de la Capa Protectora

Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la capa protectora de la capa de adhesivo del STD. La prueba se lleva a
cabo con una muestra de producto terminado. La muestra de prueba se acondiciona usando procedimientos especficos (tem-
peratura y tiempo). Luego, la capa protectora se desprende del STD con un instrumento que permite controlar el ngulo de
desprendimiento (p.ej., 90 180 grados) y la velocidad de desprendimiento, mientras se registra la fuerza de desprendimien-
to. Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si
la fuerza promedio de desprendimiento est fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o
basado en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto durante la vida til del mismo.
USP 39 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos 91

Prueba de Adherencia

Se han desarrollado diversos mtodos para analizar la adherencia, los cuales incluyen, por ejemplo el Mtodo de Adherencia a
Sonda y el Mtodo de Bola Rodante. Queda a criterio del fabricante de STD decidir qu mtodo es el ms adecuado para cada
medicamento.

MTODO DE ADHERENCIA A SONDA

Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la punta de la sonda de prueba de la capa de adhesivo del STD. Esta prue-
ba emplea un instrumento diseado para crear una unin entre la punta de una sonda de prueba de acero inoxidable (con
una geometra definida) y el STD, usando una fuerza controlada (ligera presin) y condiciones de prueba especficas (es decir,
velocidad, tiempo de contacto, presin de contacto, temperatura). Luego, mientras se controla la velocidad de desprendi-
miento de la sonda, la prueba mide el perfil de la fuerza requerida para separar la punta de la sonda del STD y la fuerza mxi-
ma requerida para romper la unin (adherencia). Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras indepen-
dientes. El producto no cumple con la prueba si el resultado de prueba promedio (perfiles de fuerza y/o adherencia) est fuera
del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluacin estadstica de mltiples
partidas de producto durante la vida til del mismo.

MTODO DE BOLA RODANTE

Esta prueba mide la distancia recorrida por una bola definida sobre la capa de adhesivo del STD usando condiciones defini-
das, como parmetro que depende de las propiedades adherentes de la capa de adhesivo. Esta prueba emplea una configura-
cin diseada para rodar una bola (de material, peso, tamao y superficie definidos) desde una rampa (con un ngulo y longi-
tud definidos) sobre la capa de adhesivo (con orientacin definida) en condiciones de prueba especficas (temperatura) (ver la
ASTM 03 72 7 para ms detalles). La distancia recorrida por la bola sobre la capa de adhesivo se mide usando un dispositivo de
medicin adecuado. Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras independientes. El producto no cum-
ple con la prueba si la distancia promedio recorrida est fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del
producto y/o basado en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto durante la vida til del mismo.

Prueba de Fugas

Esta prueba se aplica nicamente a STD de tipo moldeado-llenado-sellado (en reservorios o bolsas). El STD de tipo moldea-
do-llenado-sellado se debe fabricar manteniendo un enfoque de cero tolerancia para fugas, debido al potencial de prdida de
dosis ante la presencia de las mismas.
Es necesario implementar mtodos de control durante el proceso para examinar los STD en bsqueda de elementos que
pudieran ocasionar fugas, los cuales requieren un desarrollo importante por parte de los fabricantes de STD.

ANLISIS DURANTE EL PROCESO

Durante el proceso de fabricacin, se debe examinar el STD para detectar la presencia de fugas (o el potencial de fugas) por
perforacin, cortadura o sello defectuoso generado por fallas tales como burbujas de aire, salpicaduras del gel o mala alinea-
cin de la capa posterior y de la capa protectora. A menos que se implemente una tecnologa analtica automatizada de proce-
so, se debe llevar a cabo un anlisis durante el proceso para identificar estos defectos usando los siguientes procedimientos de
prueba:
Inspeccin visual
1. Examinar aleatoriamente un nmero especfico de STD, el cual se define basndose en el tamao de la partida.
2. Inspeccionar cada STD muestreado visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas.
3. El producto no cumple con la prueba si alguno de los STD examinados presenta una fuga.
Integridad del sello: Los sellos de los sistemas transdrmicos deben someterse a pruebas de estrs para asegurar que la
presin aplicada no fuerce la apertura del sello, lo cual generara una fuga.
1. Examinar aleatoriamente un nmero especfico de STD, el cual se define basndose en el tamao de la partida.
2. Inspeccionar cada STD muestreado, visualmente y de manera minuciosa, para detectar fugas.
3. Colocar cada STD muestreado sobre una superficie rgida y plana, y colocar encima un peso de 13,6 kg. Dejar que el peso
descanse encima del STD durante 2 minutos. Una vez retirado el peso, inspeccionar visualmente el STD para detectar fu-
gas.
4. El producto no cumple con la prueba si el nmero de STD que presentan fugas es mayor que el lmite aceptable estableci-
do por el fabricante.
Prueba del producto envasado: Los STD pueden presentar fugas despus de haber sido envasados en sus envases prima-
rios debido a la operacin misma de envasado o debido a la apertura del envase por parte del usuario. En consecuencia, los
STD deben ser analizados para detectar fugas despus de su fabricacin y de su envasado en el material de envasado primario.
92 (3) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos / Requisitos Generales USP 39

1. Analizar aleatoriamente un nmero especfico de STD, el cual se define basndose en el tamao de partida, despus de
colocarlos en su material de envasado primario.
2. Retirar los STD muestreados de su envase e inspeccionarlos visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas.
3. Luego, limpiar cada STD muestreado uniformemente con un hisopo humedecido con un disolvente. Es necesario limpiar
tanto el lado posterior como el lado de la capa protectora del STD. Asimismo, se debe limpiar la superficie interna de la
bolsa. Luego, retirar el hisopo y valorar el contenido de frmaco.
4. El producto no cumple con la prueba si la cantidad total de frmaco del STD, y su bolsa correspondiente, excede el lmite
aceptable establecido por el fabricante.

(4) MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS-PRUEBAS DE CALIDAD DEL

PRODUCTO

INTRODUCCIN
Para los propsitos de distincin taxonmica de formas farmacuticas por va de administracin, la va mucosa de adminis-
tracin de medicamentos se subdivide en siete superficies de membrana, las cuales se caracterizan como ticas, oftlmicas,
nasales, orofarngeas, uretrales, vaginales y rectales. Dicha clasificacin no incluye la va mucosa pulmonar, tratada en el cap-
tulo Medicamentos Nasales y para Inhalacin-Informacin General y Pruebas de Calidad del Producto (5). Un medicamento se
administra en cualquiera de estas siete superficies mucosas para producir una accin local o una absorcin sistmica. La accin
local ocurre en el rea prxima a la de aplicacin. Cuando se pretende generar una accin local, por lo regular no se desea la
absorcin sistmica la cual adems es innecesaria para el efecto teraputico. No obstante, en algunos casos se usa la adminis-
tracin de un medicamento por va mucosa para absorcin sistmica debido a que evita el metabolismo de primer paso, pro-
vee una administracin sistmica ms rpida, o representa una alternativa cuando la administracin oral no es posible (en el
tracto gastrointestinal) debido a una enfermedad. Muchas de las formas farmacuticas citadas en el captulo Formas Farmacu-
ticas (1151 )1 pueden administrarse a travs de las diversas superficies de las membranas en la categora de mucosas.
Los procedimientos analticos y criterios de aceptacin para las pruebas de medicamentos se dividen en dos categoras:
aqullas que evalan los atributos generales de calidad del producto y aqullas que evalan el desempeo del producto. Las
pruebas de calidad de los productos evalan atributos tales como identificacin, valoracin (contenido), impurezas y uniformi-
dad de contenido de la dosis, y, por lo general, forman parte de la monografa oficial. Las pruebas de desempeo del producto
incluyen la prueba de disolucin para una forma farmacutica oral slida (ver Disolucin (711 )) y la prueba de liberacin de
frmacos (ver Liberacin de Frmacos (724)). En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeo aseguran la identidad, conte-
nido, calidad y pureza de un medicamento para mucosas.
Asimismo, este captulo provee listas de pruebas comunes y consolidadas de calidad del producto y algunas pruebas espec-
ficas basadas en los requisitos de la va de administracin del medicamento. Las monografas existentes contienen todas las
pruebas requeridas para el artculo. En el caso de monografas nuevas para medicamentos especficos o en los casos en los que
no se cuente con una monografa, el captulo provee pruebas de calidad especficas como un recurso para los fabricantes hasta
que la USP desarrolle las monografas particulares del producto especfico.

Cambio en la redaccin:

PRUEBAS DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS

Este captulo provee pruebas de calidad generalmente necesarias, pruebas aplicables a productos especficos y pruebas apli-
cables a una o ms de las vas mucosas especficas. Se espera que cualquier forma farmacutica que se administre por una va
mucosa especfica se analice mediante las pruebas de calidad que en este captulo se citan bajo el encabezado correspondiente
a dicha va especfica.

Pruebas Generalmente Necesarias

Los atributos de calidad de las formas farmacuticas para mucosas deben reflejar requisitos aceptables para los productos
que se hallan en el mercado. Las siguientes pruebas deben aplicarse de manera general a todas las formas farmacuticas desti-
nadas para administracin por mucosas. Las pruebas que son generalmente necesarias para todos los artculos incluyen: Defini-
cin, Identificacin, Valoracin e Impurezas (orgnicas, inorgnicas y disolventes residuales). Por lo regular, la monografa de un
producto USP incluye la referencia a la prueba del captulo Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905).

1 Todas las referencias a captulos con nmero superiores a 1000 tienen nicamente propsitos informativos como recursos tiles. Dichos captulos no son obliga-
torios a menos que se indique explcitamente su aplicacin.
 USP 39 Requisitos Generales/ (4) Medicamentos para Mucosas 93

DEFINICIN

La seccin Definicin (ver Advertencias y Requisitos Generales 4. 7O) de una monografa USP describe el medicamento y especi-
fica el intervalo aceptable para el contenido de los frmacos presentes en la forma farmacutica segn se obtiene en la valora-
cin. Para ciertos productos, la Definicin incluye toda la informacin adicional pertinente, como por ejemplo, la presencia o
ausencia de otros componentes, excipientes o coadyuvantes y declaraciones precautorias sobre toxicidad y estabilidad. La in-
formacin sobre la apariencia se usa en registros reglamentarios para ayudar a la identificacin del producto. Debido a que los
atributos descriptivos tales como tamao, forma, color, entre otros, son especficos de cada producto individual en el merca-
do, por lo general no se requiere una descripcin cualitativa como parte de una monografa USP (ver el captulo (1151 )).

IDENTIFICACIN

La Identificacin se incluye en una monografa como una ayuda para verificar la identidad del artculo y para proveer una
identificacin positiva del frmaco o frmacos en un medicamento (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.40).

VALORACIN

La valoracin se usa para determinar la concentracin del frmaco (o su contenido) en el medicamento. Por lo regular, la
valoracin es especfica e indicadora de estabilidad. Cuando se justifique una valoracin inespecfica, otros procedimientos
analticos complementarios deberan asegurar la deteccin y limitacin de cualquier especie interferente. Los resultados de la
valoracin a menudo se informan como porcentaje de la cantidad declarada, con criterios de aceptacin que por lo general
estn en el intervalo de 90,0% a 110,0%. Para algunos productos antibiticos, el intervalo puede ser ms amplio. La amplitud
de estos lmites tiene como propsito dejar margen a la variabilidad de la fabricacin, incluyendo cambios en la estabilidad, as
como variacin analtica. El intervalo de aceptacin ms estrecho de 95,0%-105,0% se usa con menos frecuencia y requiere
justificacin.

IMPUREZAS

Las impurezas de proceso incluyen aqullas que surgen de los materiales de partida, subproductos de sntesis, as como otras
impurezas orgnicas e inorgnicas que pueden estar presentes en el frmaco y en los excipientes usados en la fabricacin del
medicamento. Estas impurezas se controlan usando la prueba apropiada, segn se especifica en las monografas del frmaco y
de los excipientes. Las impurezas en el medicamento tambin pueden resultar de la degradacin del frmaco o de los exci-
pientes, de las interacciones entre el frmaco y un excipiente o de las interacciones entre el frmaco y los componentes del
envase. Los procedimientos y criterios de aceptacin deben limitar especficamente los productos de degradacin txicos as
como los productos de degradacin que pongan en peligro la calidad del artculo si estos exceden ciertos niveles. Se deben
proveer lmites para las impurezas del proceso cuya presencia se determine durante la prueba de productos de degradacin. El
captulo Impurezas en Frmacos y Medicamentos (1086) 1 y el documento ICH Q3B lmpurities in New Drug Products (Impurezas
en Nuevos Medicamentos) 2 proveen una discusin ms completa sobre este tema.

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIN

El captulo (905) se usa para asegurar que la uniformidad del contenido del frmaco en las unidades de dosificacin se en-
cuentre dentro de un intervalo estrecho cercano a la cantidad declarada. La prueba se aplica slo a formas farmacuticas que
contienen una sola dosis o una parte de una dosis del frmaco en cada unidad. La uniformidad de unidades de dosificacin se
puede demostrar mediante uno de dos mtodos: uniformidad de contenido o variacin de peso. La uniformidad de contenido
se basa en las valoraciones de un nmero de unidades de dosificacin individuales. La variacin de peso se puede usar para
estimar la uniformidad de contenido en ciertas condiciones.

Formas Farmacuticas por Vas Mucosas Especficas y Pruebas Especficas

Adems de las pruebas de calidad generalmente necesarias previamente discutidas, la forma farmacutica puede requerir
pruebas de calidad especficas que son comunes a diversas vas de administracin. El captulo Medicamentos Inyectables y en
Implantes (1 ;. (AF oi-may-2016 provee requisitos comunes para productos inyectables e implantes. El captulo Medicamentos Ora-
les-Pruebas de Calidad del Producto (2) provee requisitos de anlisis para tabletas y tabletas de disolucin bucal. El captulo
Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) provee requisitos de anlisis comunes para semisli-
dos (cremas, ungentos y geles). El captulo (5) presenta requisitos de anlisis para atomizadores y aerosoles. Para los casos en

2 ICH Q3B (R2) lmpurities in New Drug Products, 2006, http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.htmle ERR(Ol-oct-2015 , Con-
sultado el 6 de mayo de 2014.
94 (4) Medicamentos para Mucosas/ Requisitos Generales USP 39

los que este captulo no presenta una prueba especfica para una forma farmacutica, no se requieren pruebas adicionales a
menos que se incluyan en la especificacin de la monografa individual.

VA TICA

La va tica se caracteriza por la administracin de una preparacin en o a travs del odo. No siempre se requiere demostrar
la esterilidad (ver Pruebas de Esterilidad (71 )) para productos administrados en el odo. Por lo regular, la esterilidad se requiere
cuando el producto se administra en el odo interno o cuando el tmpano se encuentra daado. Para casos en los que no se
requiere la esterilidad, puede ser necesario el recuento cuantitativo de bacterias mesfilas y hongos que crecen en condiciones
anaerbicas, ver el captulo Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ), o la determi-
nacin de la ausencia o presencia limitada de organismos especficos, ver el captulo Examen Microbiolgico de Productos No
Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos (62).
Si se usa un conservante antimicrobiano, puede ser necesario cumplir con los requisitos de los captulos Pruebas de Eficacia
Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ).
Las formas farmacuticas administradas por la va tica incluyen lquidos, soluciones y suspensiones.

VA OFTLMICA

La va oftlmica se refiere a la administracin en el ojo. Adems de las pruebas generalmente necesarias, se deben considerar
las siguientes pruebas especficas para medicamentos oftlmicos (ver la Tabla 7). Para productos que se inyectan o implantan
en el ojo, ver el captulo 1lilfl:illl~llllilil A continuacin se citan algunas de las pruebas importantes de calidad del produc-
to para productos administrados por la va oftlmica. Ver Ungentos Oftlmicos (771) para detalles y dems informacin sobre
calidad de productos.
Materia Extraa y Partculas
Esterilidad
Tamao de Partcula y Distribucin del Tamao de Partcula
Conservantes Antimicrobianos
Tabla 1. Medicamentos Administrados por la Va Oftlmica, Pruebas Especficas
Va Oftlmica
Forma Farmacutica Pruebas Especficas
Llenado Mnimo (755)
Geles Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Osmolalidad y Osmolaridad (785)
pH (791)
Tensin superficial
Viscosidad-Mtodos del Viscosmetro Capilar (911)
Viscosidad-Mtodos del Remetro Rotatorio (912)
Emulsiones Potencial zeta
Insertos Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)
Llenado Mnimo (755)
Ungentos Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Partculas en Soluciones Oftlmicas (789)
pH(791)
Viscosidad-Mtodos del Viscosmetro Capilar (911)
Viscosidad-Mtodos del Remetro Rotatorio (912)
Viscosidad-Mtodos del Viscosmetro de Bola Rodante (913)
Soluciones Osmolalidad y Osmolaridad (785)
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las mo-
Tiras nografas)
pH (791)
Osmolalidad y Osmolaridad (785)
Tamao de partcula y distribucin del tamao de partcula
Viscosidad-Mtodos del Viscosmetro Capilar (911)
Viscosidad-Mtodos del Remetro Rotatorio (912)
Suspensiones Viscosidad-Mtodos del Viscosmetro de Bola Rodante (91 3)
USP 39 Requisitos Generales/ (4) Medicamentos para Mucosas 95

VA NASAL

La va nasal se refiere a la administracin en o a travs de la nariz para efecto local o sistmico (ver la Tabla 2).
Tabla 2. Medicamentos Administrados por la Va Nasal, Pruebas Especficas
Va Nasal
Forma Farmacutica Pruebas Especficas del Producto
Aerosoles Medicamentos Nasales y para Inhalacin-Informacin General y Pruebas de Calidad del Producto (5)
Llenado Mnimo (755)
Geles (Jalea) Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Llenado Mnimo (755)
Ungentos Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Atomizado res Medicamentos Nasales y para Inhalacin-Informacin General y Pruebas de Calidad del Producto (5)
Soluciones Medicamentos Nasales y para Inhalacin-Informacin General y Pruebas de Calidad del Producto (5)

VA OROFARNGEA

La va orofarngea se refiere a la administracin en la cavidad oral y/o la regin farngea. La va orofarngea se subclasifica por
superficies intra-orales especficas, tales como bucal o sublingual. La administracin bucal y sublingual por lo general estn
destinadas a promover la absorcin sistmica mediante la permeacin a travs de la mucosa respectiva. Sin embargo, en este
contexto, la administracin oral puede referirse a la aplicacin tpica para accin local (ver la Tabla 3). Las pruebas de calidad
para productos administrados en superficies orofarngeas a menudo se ajustan a aqullas para administracin oral en el tracto
gastrointestinal (ver el captulo (2)).
Tabla 3. Medicamentos Administrados por la Va Orofarngea, Pruebas Especficas
Va Orofarngea
Forma Farmacutica Pruebas Especficas
Ver el captulo Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) para requisitos
Parches Bucales de prueba comunes para parches.
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
Pelculas monografas)
Llenado Mnimo (755)
Geles Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
Gomas monografas)
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
Tabletas de Disolucin Bucal monografas)
Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Ungentos Llenado Mnimo (755)
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
Soluciones (Enjuagues) monografas)
Atomizadores Medicamentos Nasales y para Inhalacin-Informacin General y Pruebas de Calidad del Producto (5)
Tabletas Medicamentos Ora/es-Pruebas de Calidad del Producto (2)

VA URETRAL

La va uretral se refiere a la administracin dentro de la uretra, por lo regular para accin local, aunque tambin es posible la
distribucin sistmica. El captulo (61) y el captulo (62) pueden ser aplicables. Los medicamentos en esta categora incluyen
insertos uretrales.

VA VAGINAL

La va vaginal se refiere a la administracin dentro de la vagina, por lo regular para accin local, aunque tambin es posible
la distribucin sistmica. El captulo (61) y el captulo (62) pueden ser aplicables (ver la Tabla 4).
Densidad relativa de espumas: Determinar la densidad relativa de espumas pesando una masa de espuma (m) y una masa
del mismo volumen de agua (e) en un recipiente de fondo plano. Densidad relativa de espumas= m/e.
Volumen de expansin de espumas: Estimar el volumen de expansin de espumas a 25 usando una bureta graduada y un
envase generador de espuma equipado con un disparador de dosis integrado a la bureta.
96 (4) Medicamentos para Mucosas/ Requisitos Generales USP 39

Tabla 4. Medicamentos Administrados por la Va Vaginal, Pruebas Especficas del Producto

Va Vaginal
Forma Farmacutica Pruebas Especficas
Llenado Mnimo (755)
Cremas Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Llenado Mnimo (755)
Aspecto fsico (de la espuma y de la espuma colapsada)
Densidad relativa de espumas
Espumas Volumen de expansin de espumas
Llenado Mnimo (755)
Geles Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
Insertos monografas)

VA RECTAL

La va rectal se refiere a la administracin en el recto. Los productos que se administran en el recto pueden producir efectos
locales o liberacin en la circulacin sistmica.
Determinacin de tiempo de ablandamiento de supositorios lipoflicos: La prueba pretende determinar, en las condicio-
nes definidas, el tiempo que transcurre hasta que un supositorio mantenido en agua a 37 0,5 se ablanda hasta el grado en
que ya no ofrece resistencia al aplicarle un peso definido (ver la Tabla 5).
Densidad relativa de espumas: Determinar la densidad relativa de espumas pesando una masa de espuma (m) y una masa
del mismo volumen de agua (e) en un recipiente de fondo plano. Densidad relativa de espumas= m/e.
Volumen de expansin de espumas: Estimar el volumen de expansin de espumas a 25 usando una bureta graduada y un
envase generador de espuma equipado con un disparador de dosis integrado a la bureta.
Tabla 5. Medicamentos Administrados por la Va Rectal, Pruebas Especficas
Va Rectal
Forma Farmacutica Pruebas Especficas
Llenado Mnimo (755)
Apariencia fsica (de la espuma y de la espuma colapsada)
Densidad relativa de espumas
Espumas Volumen de expansin de espumas
Llenado Mnimo (755)
Ungentos Medicamentos Tpicos y Transdrmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3)
Supositorios Tiempo de ablandamiento de supositorios lipoflicos
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
Soluciones monografas)
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
Suspensiones monografas)

(5) MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIN-INFORMACIN

GENERAL Y PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO

l. INTRODUCCIN

Los medicamentos para inhalacin entregan un frmaco a los pulmones mediante inhalacin oral e incluyen las siguientes
formas farmacuticas: aerosoles para inhalacin, polvos para inhalacin, atomizadores para inhalacin, soluciones para inhala-
cin, suspensiones para inhalacin, concentrados para preparar soluciones inhalables y frmacos para preparar solucin inhala-
ble. Los medicamentos nasales entregan frmacos en la cavidad nasal e incluyen las siguientes formas farmacuticas: aerosoles
nasales, atomizadores nasales, soluciones nasales y polvos nasales. En este captulo no se discuten los medicamentos nasales en
forma de geles ni ungentos. La Tabla 7 provee una lista de nombres establecidos y definiciones para estas formas farmacuti-
cas. Asimismo, en el captulo general Formas Farmacuticas (1151) se proveen definiciones, breve informacin acerca de los
mtodos de fabricacin y un glosario de nombres de estas formas farmacuticas.
 USP 39 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 97

Tabla 1. Nombres Establecidos y Definiciones

Nombre
Establecido Definicin
Medicamento para inhalacin oral que se envasa a presin y entrega una cantidad especfica de ingredientes
teraputicamente activos al activar un sistema de vlvula que entrega una dosis exactamente medida. Los
Aerosol para Inhalacin aerosoles para inhalacin se conocen comnmente como inhaladores de dosis fija.
Medicamento en polvo para inhalacin oral que se usa con un dispositivo que lo transforma en aerosol y li-
bera una cantidad exactamente medida de los ingredientes teraputicamente activos. Los Polvos para lnha-
Polvo para Inhalacin lacin se conocen comnmente como inhaladores de polvo seco.
Forma farmacutica lquida de un medicamento para inhalacin oral, en un envase no presurizado, que libe-
Atomizador para Inhalacin ra una cantidad exactamente medida de la formulacin en forma de niebla o roco.
Solucin para Inhalacin Medicamento en solucin para inhalacin oral que se emplea con un sistema de nebulizacin.
Suspensin para Inhalacin Medicamento en suspensin para inhalacin oral que se emplea con un sistema de nebulizacin.
Solucin de un frmaco para inhalacin oral que se debe diluir antes de su administracin con un sistema de
Concentrado para Solucin lnhalable nebulizacin.
Medicamento en polvo que, al agregarle un vehculo adecuado, genera una solucin que cumple con todos
[Frmaco] para Solucin lnhalable los aspectos de una Solucin para Inhalacin.
Medicamento para aplicacin local en las fosas nasales que se envasa a presin y entrega una cantidad espe-
cfica de ingredientes teraputicamente activos al activar un sistema de vlvula de dosis exactamente medi-
Aerosol Nasal da.
Forma farmacutica lquida de un medicamento para aplicacin local en las fosas nasales en un envase no
presurizado que, al activarlo, libera una cantidad exactamente medida de la formulacin en forma de niebla
Atomizador Nasal o roco.
Solucin Nasal Forma farmacutica lquida de un medicamento no presurizado para aplicacin local en las fosas nasales.
Medicamento en polvo para aplicacin local en las fosas nasales que emplea un dispositivo que libera y trans-
Polvo Nasal forma en aerosol una cantidad exactamente medida de los ingredientes teraputicamente activos.

Este captulo general (5) provee los lineamientos generales para sustentar nuevas monografas individuales. ste es un docu-
mento de "avance" y no pretende reemplazar el desarrollo necesario de monografas individuales. Este captulo provee listas
de pruebas de calidad del producto que se requieren tpicamente, consolidadas de manera concisa y coherente. Cuando exista
una monografa, sta deber contener todas las pruebas requeridas para la forma farmacutica en particular. Cuando no se
dispone de una monografa para un medicamento especfico (inexistente), el captulo general provee pruebas de calidad que
se pueden usar hasta que la monografa especfica para la forma farmacutica aparezca en el compendio USP-NF. Cuando se
dispone de un procedimiento de prueba de desempeo validado para el medicamento especfico, ste se identifica en un cap-
tulo general con un nmero menor a (1000). Toda la informacin adicional o la informacin sobre tecnologas venideras que
an no han sido validadas en su totalidad, puede estar disponible en los captulos informativos con nmeros superiores a
(1000).1

Pruebas Generales de Calidad y Pruebas de Calidad de Desempeo para Medicamentos

Una monografa de medicamento de la USP contiene pruebas, procedimientos analticos y criterios de aceptacin. Las prue-
bas de medicamentos se dividen en dos categoras: (1) pruebas que evalan los atributos generales de calidad y (2) pruebas de
calidad que evalan el desempeo del producto, p.ej., uniformidad de dosis liberada y sus caractersticas fsicas tales como
distribucin del tamao aerodinmico de partcula. Las pruebas generales de calidad evalan la integridad de la forma farma-
cutica, mientras que las pruebas de calidad del desempeo evalan la liberacin del frmaco y otros atributos que pueden
relacionarse con el desempeo in vivo del medicamento.
En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeo garantizan la identidad, contenido, calidad y pureza de los medica-
mentos para inhalacin y nasales.
Las dos secciones siguientes de este captulo listan atributos de calidad del producto para medicamentos para inhalacin y
para medicamentos nasales, respectivamente. La seccin final describe en mayor detalle las pruebas de calidad para medica-
mentos para inhalacin y nasales. El captulo general Medicamentos Nasales y para Inhalacin: Pruebas de Calidad de Desempeo
de Aerosoles, Atomizadores y Polvos (601) contiene pruebas de desempeo del producto para medicamentos nasales y para in-
halacin, y se debe usar junto con este captulo (5).

1Todas las referencias a los captulos superiores a 1000 son slo para fines informativos y para su uso como un recurso til. Estos captulos no son obligatorios a
menos que se instruya explcitamente su aplicacin.
98 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Requisitos Generales USP 39

11. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD EN MEDICAMENTOS PARA INHALACIN

Aerosol para Inhalacin

DESCRIPCIN

El trmino aerosol en este contexto es una forma farmacutica que consiste en una preparacin slida o lquida envasada a
presin y destinada para su administracin en forma de niebla fina. El trmino descriptivo aerosol tambin se refiere a la niebla
fina de diminutas gotitas o partculas slidas que se emiten desde el dispositivo que contiene al medicamento. Los aerosoles
para inhalacin, tambin conocidos como inhaladores de dosis fija, son preparaciones que se caracterizan por dispersar el in-
grediente farmacutico activo en las vas respiratorias durante la aspiracin oral para lograr un efecto local o sistmico, mien-
tras que los aerosoles nasales, que tambin se conocen como inhaladores de dosis fija nasales, se caracterizan por depositar los
ingredientes farmacuticos activos en la cavidad nasal para lograr un efecto local o sistmico
Una formulacin en aerosol por lo regular contiene frmacos disueltos o suspendidos en propelentes o una mezcla de pro-
pelentes y codisolventes y posiblemente otros excipientes adecuados. Un medicamento en aerosol para inhalacin, comn-
mente conocido como inhalador de dosis fija, libera una cantidad especfica de ingredientes teraputicamente activos con un
calidad definida al activar un sistema de vlvula que entrega una dosis exactamente medida. Las pruebas generales de calidad
para medicamentos en aerosoles para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante en este captulo
para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Impurezas y Productos de Degradacin
Contenido de Agua
Partculas Extraas
Sustancias Lixiviables
Patrn de Roco
Lmite Microbiano
Contenido de Alcohol (si estuviera presente)
Peso de Llenado Neto
Velocidad de Fuga
Para pruebas de calidad de desempeo, referirse al captulo (601 ).

Solucin para Inhalacin

DESCRIPCIN

Los medicamentos en solucin para inhalacin por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estriles. Estn
diseados para ser transportados a los pulmones mediante nebulizacin con un nebulizador externo especfico. Dichas prepa-
raciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen adems un empaque protec-
tor para minimizar el ingreso de contaminantes extraos voltiles, la prdida de disolvente y la exposicin al oxgeno y la luz.
La nebulizacin implica la generacin mediante energa ultrasnica, efecto de Venturi u otros medios mecnicos/elctricos
apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen el frmaco en solucin, y su contnua administracin al pacien-
te. Las pruebas generales de calidad para soluciones para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante
en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Impurezas y Productos de Degradacin
Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas)
Valoracin de Conservante Antimicrobiano y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)
Esterilidad
Partculas Extraas
pH
Osmolalidad
Sustancias Lixiviables
Peso de Llenado Neto
Prdida de Peso
Para pruebas de calidad de desempeo, referirse al captulo (1601 ).
USP 39 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 99

Suspensin para Inhalacin

DESCRIPCIN

Los medicamentos en suspensin para inhalacin por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estriles. Estn
diseados para ser transportados a los pulmones mediante nebulizacin con un nebulizador externo especfico. Dichas prepa-
raciones de medicamentos por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen adems un empaque
protector para minimizar el ingreso de contaminantes extraos voltiles, la prdida de disolvente y la exposicin al oxgeno y
la luz. La nebulizacin implica la generacin mediante energa ultrasnica, efecto de Venturi u otros medios mecnicos apro-
piados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulacin y su continua administracin al
paciente. Las pruebas generales de calidad para suspensiones para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms
adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Distribucin del tamao de partcula de la formulacin en el envase inmediato.
Para todos los dems atributos generales de calidad, referirse a los atributos de la Solucin para Inhalacin anteriormente
indicados.

Concentrado para Solucin lnhalable

DESCRIPCIN

Los medicamentos concentrados para solucin inhalable por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estriles.
Al diluirlos, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehculo para dilucin,
estn diseados para ser transportados a los pulmones mediante nebulizacin usando un nebulizador externo. Dichas prepara-
ciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen adems un empaque protector
para minimizar el ingreso de contaminantes extraos voltiles, la prdida de disolvente y la exposicin al oxgeno y la luz. La
nebulizacin implica la generacin mediante energa ultrasnica, efecto de Venturi u otros medios mecnicos/elctricos apro-
piados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulacin y su continua administracin al
paciente. Las pruebas generales de calidad para concentrados para solucin inhalable deben incluir lo siguiente (ver la seccin
IV ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Transparencia y color de la solucin luego de la dilucin de acuerdo con las instrucciones del etiquetado.
Para todos los dems atributos generales de calidad, referirse a los atributos anteriormente indicados en Solucin para In-
halacin.

Frmacos para Solucin lnhalable

DESCRIPCIN (POLVO)

Un frmaco para solucin inhalable es un medicamento en polvo (con un colorante especfico) que al agregarle un vehculo
adecuado, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehculo para dilucin,
forma una solucin que cumple con todos los aspectos de los requisitos para la Solucin para Inhalacin. Las pruebas generales
de calidad de frmacos para soluciones inhalables deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante en este captulo
para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Contenido de agua
Transparencia, color y totalidad de la solucin dentro del tiempo especificado, luego de la reconstitucin
Para todos los dems atributos generales de calidad, referirse a los atributos de la Solucin para Inhalacin anteriormente
indicados luego de reconstituir el medicamento.

Atomizador para Inhalacin

DESCRIPCIN

Los medicamentos en atomizadores para inhalacin por lo general son formulaciones lquidas con base acuosa envasadas en
un sistema de envase y cierre compacto que contiene una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla descarga
una cantidad exactamente medida de una niebla fina de gotitas de la formulacin. La niebla puede generarse por diversos
medios tales como accin mecnica, electricidad, o energa derivada de la aspiracin por parte del paciente. Los mecanismos a
travs de los cuales se generan las gotitas difieren entre los varios tipos de atomizadores para inhalacin. Estos medicamentos
pueden proveerse en presentaciones de dosis nica o multidosis. Los medicamentos en atomizadores para inhalacin pueden
presentar un diseo para dosis previamente medida o con dispositivos de dosis fija. Una unidad para dosis previamente medi-
das contiene una cantidad de formulacin lquida previamente medida en un envase individual (p.ej., un blster) que el pacien-
te inserta en el dispositivo antes de usar. Un producto con dispositivo de dosis fija contiene una cantidad de la formulacin
100 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Requisitos Generales USP 39

lquida en un depsito que resulta suficiente para un nmero preestablecido de dosis, y el dispositivo descarga cada dosis co-
mo un roco fijo exacto durante la vida til de la unidad. Las pruebas generales de calidad para atomizadores para inhalacin
deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Geometra de la Nube
Para todos los dems atributos generales de calidad, referirse a los atributos de la Solucin para Inhalacin anteriormente
indicados.
Para pruebas de calidad de desempeo, referirse al captulo (601 ).

Polvo para Inhalacin

DESCRIPCIN

Los medicamentos en polvo para inhalacin, comnmente conocidos como inhaladores de polvo seco, dispensan polvos pa-
ra inhalacin mediante un dispositivo que los transforma en aerosol liberando una dosis exacta del ingrediente activo solo o
con los excipientes adecuados con caractersticas fsicas uniformes. Los diseos actuales incluyen inhaladores de polvo seco
con dosis previamente medidas y con dispositivos de dosis fija, los cuales dependen de diversas fuentes de energa para crear y
dispersar el aerosol durante la aspiracin por parte del paciente.
Los inhaladores de polvo seco con dosis previamente medidas contienen cantidades discretas de formulacin en envases in-
dividuales (p.ej., cpsulas o blsters) que se insertan en el dispositivo antes de usar. Los inhaladores de polvo seco con dosis
previamente medidas tambin pueden contener las unidades de dosificacin ordenadas en forma de cargadores multidosis en
el sistema de liberacin. Los inhaladores de polvo seco con dispositivos de dosis fija tienen un depsito interno que contiene
una cantidad de formulacin suficiente para entregar mltiples dosis mediante el accionamiento del dispositivo por parte del
paciente. Las pruebas generales de calidad para polvos para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelan-
te en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Impurezas y Productos de Degradacin
Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas)
Contenido de Agua
Partculas Extraas
Lmite Microbiano
Contenido Neto (dispositivos de dosis fija)
Disolventes Residuales
Sustancias Lixiviables Voltiles y Semivoltiles
Para pruebas de calidad de desempeo, referirse al captulo (601 ).

111. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD EN MEDICAMENTOS NASALES

Aerosol Nasal

Referirse a los atributos del Aerosol para Inhalacin anteriormente indicados.

Atomizador Nasal

DESCRIPCIN

Los medicamentos en atomizador nasal por lo general son formulaciones lquidas con base acuosa que se aplican a la cavi-
dad nasal para lograr efectos locales y/o sistmicos. Contienen ingredientes teraputicamente activos disueltos o suspendidos
en una solucin o en mezclas de excipientes en un sistema de envase y cierre compacto no presurizado. El sistema de envase y
cierre incluye una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla libera un roco que contiene una cantidad exacta-
mente medida de niebla fina de gotitas de la formulacin. La dispersin de la formulacin en forma de roco por lo general se
logra forzando el paso de la formulacin a travs del accionador del dispositivo nasal y su orificio. A menudo, dichos productos
vienen en presentaciones multidosis con dispositivos de dosis fija (ver Atomizador para Inhalacin) en las que la bomba atomi-
zadora determina la dosis. Los medicamentos en atomizadores nasales tambin se pueden presentar en un diseo de dosis
previamente medidas. Las pruebas generales de calidad para atomizadores nasales deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV
ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Impurezas y Productos de Degradacin
Valoracin de Excipientes Conservantes y Estabilizadores (si estuvieran presentes)
USP 39 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 101

Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas)

Distribucin del Tamao de Partcula (para suspensiones)
Partculas Extraas
Patrn de Roco
Lmite Microbiano
Sustancias Lixiviables
Peso de Llenado Neto
pH
Osmolalidad
Viscosidad
Esterilidad (dosis previamente medidas)
Para pruebas de calidad de desempeo, referirse al captulo (601 ).

Polvo Nasal

Referirse a los atributos de calidad del Polvo para Inhalacin anteriormente indicados.

Solucin Nasal

DESCRIPCIN

Por lo general, las soluciones nasales medicinales son formulaciones lquidas en base acuosa que se aplican a la cavidad nasal
para lograr un efecto local. Pueden contener soluciones de frmacos solos o mezclados con excipientes en un sistema de enva-
se y cierre compacto no presurizado. El sistema de envase y cierre incluye un sistema de descarga que administra cantidades
no medidas de la formulacin en forma de gotitas en una niebla fina. Por lo regular, dichos productos vienen en presentacio-
nes multidosis. Las pruebas generales de calidad para medicamentos en solucin nasal deben incluir lo siguiente (ver la seccin
IV ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Impurezas y Productos de Degradacin
Valoracin de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)
Partculas Extraas
Lmite Microbiano
Sustancias Lixiviables
Peso de Llenado Neto
pH
Osmolalidad
Viscosidad

IV. DESCRIPCIN DE LAS PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO

A continuacin se listan pruebas de calidad del producto que deben aplicarse a los medicamentos nasales y para inhalacin
y a los productos para nebulizacin. Las pruebas de calidad especficas del producto se tratan en las monografas de los pro-
ductos.

Descripcin

Ver las formas farmacuticas previas correspondientes y las etiquetas pertinentes para la monografa de un medicamento.

Contenido de Alcohol (si estuviera presente)

Si se usa alcohol en la formulacin de un medicamento, se debe incluir una valoracin especfica con criterios de aceptacin
apropiados.

Valoracin (contenido y uniformidad de contenido)

Las valoraciones de frmacos en medicamentos de la USP se realizan mediante procedimientos indicadores de estabilidad
validados siguiendo el captulo general Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225). La prueba de Valoracin debe medir
el frmaco disponible y su estabilidad, incluyendo la adherencia del frmaco a los componentes del envase y del cierre. Contar
102 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Requisitos Generales USP 39

con criterios de aceptacin apropiados puede proveer una mayor garanta sobre la reproducibilidad de la fabricacin y puede
asegurar un mejor cumplimiento con otros atributos de desempeo (p.ej., uniformidad de dosis liberada).
Si un medicamento declara contener un solo enantimero de un frmaco quiral, los analistas pueden usar una valoracin
quiral o una combinacin de valoracin no quiral y un procedimiento validado para controlar la presencia del enantimero no
deseado como una impureza.

Valoracin de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)

Por lo general, se debe valorar cualquier conservante (p.ej., un antimicrobiano) o excipiente estabilizador (p.ej., un antioxi-
dante, un agente que se agrega especficamente para minimizar o prevenir la degradacin) en envases multidosis siguiendo un
procedimiento indicador de la estabilidad validado de acuerdo con los lineamientos de la gua ICH Q2 vigente. Los criterios de
aceptacin correspondientes normalmente se basan en la efectividad apropiada del conservante, la cual se demuestra median-
te una prueba de desafo microbiano.

Uniformidad de Contenido para Formas Farmacuticas Previamente Medidas

Ver el captulo (905).

Transparencia y Color de la Solucin Luego de la Dilucin

Las formas farmacuticas de concentrados para solucin inhalable y frmacos para solucin inhalable deben diluirse y re-
constituirse de acuerdo con las instrucciones del etiquetado antes de su administracin por nebulizacin. El tipo y la cantidad
de vehculo usado para la dilucin y la reconstitucin deben especificarse en el etiquetado. Se deben llevar a cabo estudios
apropiados para evaluar la transparencia, el color de la solucin luego de la dilucin o reconstitucin. Los estudios tambin
deben incluir anlisis de estabilidad fsica y qumica apropiados y sobre las caractersticas de desempeo.

Partculas Extraas

Las partculas extraas en estos medicamentos se deben controlar de manera adecuada. Las partculas en medicamentos na-
sales y para inhalacin pueden originarse durante la fabricacin y a partir de los componentes de la formulacin y del envase y
cierre. Para la evaluacin toxicolgica, se debe determinar el tipo, el origen, la cantidad y el tamao de las partculas extraas,
incluyendo partculas finas (p.ej., menos de 1O m) a lo largo del periodo de almacenamiento durante el estudio de estabili-
dad.

Identificacin

Se utiliza una o varias pruebas de identificacin especficas para verificar la identidad del frmaco en el medicamento. Si se
emplea un mtodo no especfico para la identificacin, se lo debe combinar con un segundo mtodo independiente y comple-
mentario. Asimismo, se debe llevar a cabo una prueba de identificacin especfica para formas polimrficas. Adems, si el fr-
maco es una sal, se debe incluir una prueba de identificacin apropiada para el contrain.

Impurezas y Productos de Degradacin

Se deben usar procedimientos analticos indicadores de estabilidad validados de acuerdo con el captulo general vigente
(1225) de la USP para determinar los niveles de impurezas y productos de degradacin en un medicamento. Por lo regular, se
establecen criterios de aceptacin para impurezas y productos de degradacin individuales, totales no especificados, y totales,
siguiendo la gua vigente ICH Q3B. Para umbrales de informe, identificacin y calificacin y dems informacin relevante, se
deben seguir las pautas vigentes de la ICH Q3B.

Sustancias Lixiviables

Los medicamentos nasales y para inhalacin se deben evaluar para determinar la presencia de compuestos que podran lixi-
viarse a partir de los componentes elastomricos, plsticos o del recubrimiento del sistema de envase y cierre que estn en
contacto directo con la formulacin. Adems, el medicamento puede inadvertidamente contener otros contaminantes residua-
les derivados de la fabricacin y el procesamiento. Las sustancias lixiviables pueden incluir sustancias aromticas polinucleares,
nitrosaminas, monmeros, plastificantes, aceleradores, antioxidantes y vulcanizadores. Los contaminantes del procesamiento
pueden incluir agentes de tratamiento de las superficies, o sustancias de procesamiento que se pueden disolver, asociar qumi-
camente o suspender en la formulacin.
Por ende, durante todo el periodo de vida til hasta la fecha de caducidad, el medicamento debe someterse a una evalua-
cin de los compuestos que puedan migrar a la formulacin desde diversas fuentes. El anlisis a realizar depende del tipo de
USP 39 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 103

formulacin, por ejemplo si es un polvo o un lquido y de la composicin del sistema de envase y cierre; p.ej., un medicamen-
to envasado en un envase semipermeable se debe evaluar para determinar el ingreso de sustancias lixiviables voltiles. Se de-
ben aplicar especificaciones apropiadas para identificar, monitorear y cuantificar los lixiviables en el medicamento usando pro-
cedimientos analticos validados con niveles de cuantificacin mnimos apropiados. Se deben establecer y justificar los criterios
de aceptacin correspondientes desde la perspectiva toxicolgica y de seguridad.

Velocidad de Fuga

Los estudios de velocidad de fuga en aerosoles medicinales nasales y para inhalacin se pueden realizar durante la caracteri-
zacin y desarrollo del medicamento para justificar la seleccin de componentes apropiados del sistema de envase y cierre
(p.ej., vlvula y envase) y de parmetros apropiados de fabricacin del medicamento, incluyendo el proceso de precintado de
la vlvula. Las especificaciones para los estudios de la prueba de Velocidad de Fuga de la USP se pueden basar en la determina-
cin de la diferencia en peso con el paso del tiempo a una temperatura especificada sobre mltiples unidades de cada partida.
Ver Velocidad de Fuga (604) para informacin adicional.

Lmites Microbianos

La calidad microbiana de las formas farmacuticas cuando se indica en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para
Inhalacin y Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales por lo regular se controla mediante pruebas y criterios de
aceptacin validados y apropiados para el recuento total de microorganismos aerobios, el recuento total de hongos filamento-
sos y levaduras, y la demostracin de la ausencia de patgenos indicadores especificados. Los criterios de aceptacin se pue-
den expresar en microorganismos por envase. Para mayor informacin, consultar los captulos Examen Microbiolgico de Pro-
ductos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos para Productos Nasa-
les e Inhaladores No Estriles (61 O).

Peso de Llenado Neto

Se deben establecer pruebas y criterios de aceptacin para evaluar y controlar el peso neto total de la formulacin dentro
del envase.

Osmolalidad

Para controlar la tonicidad de la formulacin de formas farmacuticas cuando se indica en Pruebas Generales de Calidad en
Medicamentos para Inhalacin, se debe analizar la osmolalidad del producto con especificaciones apropiadas conforme a lo
descrito en Osmolalidad y Osmolaridad (785).

pH

Se debe establecer una especificacin apropiada para el pH de la formulacin de las formas farmacuticas cuando se indique
en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalacin y Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales con-
forme a los descrito en el captulo pH (791 ).

Distribucin del Tamao de Partcula

Para medicamentos en suspensin para inhalacin y en suspensin para atomizador nasal, se pueden usar mtodos apropia-
dos y criterios de aceptacin correspondientes para la determinacin de la distribucin del tamao de partcula del frmaco en
la formulacin dentro del envase.

Geometra de la Nube

Debido a que diversos factores pueden afectar las caractersticas de la nube de roco en aerosoles para inhalacin, atomiza-
dores para inhalacin, aerosoles nasales, o en atomizadores nasales, su caracterizacin completa es importante para evaluar el
desempeo del sistema de liberacin. La geometra de la nube se puede determinar mediante una variedad de procedimientos
usando mtodos validados apropiadamente. La geometra de la nube tambin se puede controlar mediante criterios de acep-
tacin apropiados que midan las caractersticas del patrn de roco, incluyendo la forma y el tamao de la nube de roco en
condiciones experimentales e instrumentales definidas para la prueba.
104 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Requisitos Generales USP 39

Reconstitucin y Tiempo de Reconstitucin (polvos)

Las formas farmacuticas de frmacos para solucin inhalable deben reconstituirse antes de su administracin. Por consi-
guiente, se deben realizar estudios de compatibilidad apropiados para evaluar el tipo y la cantidad de los disolventes, as como
el tiempo de reconstitucin necesario para la preparacin de la solucin final antes de su administracin al paciente. Los estu-
dios de compatibilidad tambin deben incluir anlisis de estabilidad fsica y qumica apropiados de la solucin reconstituida,
adems de incluir la caracterizacin del desempeo.

Disolventes Residuales

Se deben usar pruebas adecuadas y validadas para determinar los niveles de cualquier disolvente en el medicamento. Ver
Disolventes Residuales (467) para informacin adicional.

Patrn de Roco

Debido a que diversos factores pueden afectar el patrn de roco de medicamentos en aerosol para inhalacin, en aerosol
nasal o en atomizador nasal, la caracterizacin completa del patrn de roco es importante para evaluar el desempeo de la
vlvula especfica y del accionador o la bomba. El patrn de roco se puede determinar usando mtodos validados apropiada-
mente y criterios de aceptacin correspondientes que midan la forma, la densidad y el tamao del mismo. El procedimiento de
prueba para patrones de roco normalmente es especfico para el medicamento y puede incluir, entre otros aspectos, la distan-
cia entre la boquilla y el plano de medicin o la superficie de recoleccin, el nmero mnimo de accionamientos por patrn de
roco para permitir la discriminacin, la orientacin de la superficie de recoleccin con respecto a la boquilla y los procedimien-
tos de visualizacin.

Esterilidad

Todas las formas farmacuticas para inhalacin con base acuosa son preparaciones estriles y deben cumplir con los requisi-
tos en Pruebas de Esterilidad (71 ).

Viscosidad

Se debe incluir una prueba de viscosidad con criterios de aceptacin apropiados para formas farmacuticas cuando as se
indique en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalacin y en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos
Nasales segn corresponda (ver Viscosidad-Mtodos Capilares (911) ).

Contenido de Agua

Se debe establecer una especificacin apropiada para el contenido de agua de las formas farmacuticas cuando as se indi-
que en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalacin y en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasa-
les para asegurar la estabilidad continua del medicamento y el desempeo aceptable del mismo. Se deben usar procedimien-
tos analticos validados conforme a lo descrito en Determinacin de Agua (921 ). Proceder segn se indica en el captulo (921 ),
con las siguientes modificaciones: equipar el vaso de un sistema cerrado para volumetra con una abertura a travs de la cual
pasa un tubo de dispersin de gases de porosidad gruesa conectado a un cilindro para muestras.

Prdida de Peso

Los medicamentos deben evaluarse para determinar la prdida de peso, p.ej., los medicamentos envasados en envases semi-
permeables se deben evaluar para determinar las propiedades de todo el sistema de envase y cierre que protegen contra la
prdida de humedad.

(7) ETIQUETADO

DEFINICIN

El trmino etiquetado se refiere a todas las etiquetas y dems materiales escritos, impresos o grficos que aparezcan directa-
mente sobre el envase primario de un artculo, o sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio secundario, con excepcin
 USP 39 Requisitos Generales / (7) Etiquetado 105

de los embalajes externos destinados para el transporte. El trmino etiqueta designa la parte del etiquetado que se encuentra
sobre el envase primario.
Los embalajes para el transporte que contengan un solo artculo se etiquetan por lo menos con la identificacin del produc-
to (excepto los artculos controlados), el nmero de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento y distri-
bucin, salvo que dicho envase sea tambin el envase primario o la parte exterior del empaque destinado al consumidor.

ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS EXPRESADOS COMO LA PARTE ACTIVA

EN EL NOMBRE Y EL CONTENIDO

Los nombres y contenidos de medicamentos y preparaciones magistrales debern expresarse en trminos de la parte activa
y su contenido correspondiente en la etiqueta (ver Nomenclatura (1121 ), Poltica para la Denominacin de Monografas de Medi-
camentos y Preparaciones Magistrales que Contienen Sales de Frmacos).
Excepciones: Se puede considerar una excepcin a esta Poltica, en aquellos casos raros en los que el uso de la forma salina
especfica de la parte activa en el nombre suministra informacin vital desde una perspectiva clnica. En tales casos, cuando el
ttulo de la monografa contiene la forma salina especfica de la parte activa, el contenido del producto o preparacin tambin
se expresa en trminos de la forma salina especfica.
Etiquetado: Las etiquetas y el etiquetado deben indicar claramente la forma salina especfica de la parte activa que est pre-
sente en el producto o preparacin, debido a que esta informacin puede ser til para profesionales de la salud y pacientes. Se
proveen en el etiquetado los nombres y los contenidos tanto de la parte activa como de la forma salina especfica (cuando
corresponde).

ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS INYECTABLES

Las etiquetas 1 y el etiquetado indican la siguiente informacin:

Nombre de la preparacin
En el caso de una preparacin lquida, la cantidad o proporcin de cada parte activa y/o frmaco en un volumen especifi-
cado
En el caso de una preparacin magistral estril, los nombres y las cantidades o concentraciones de parte activa y/o frma-
co en el envase inmediato (ver Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles (797), Responsabilidad del Personal de Prepara-
cin Magistral)
En el caso de una preparacin seca u otra preparacin a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la canti-
dad o proporcin de cada parte activa y/o frmaco, el volumen final de solucin o suspensin, las instrucciones para el
almacenamiento adecuado de la solucin reconstituida y una fecha de caducidad o fecha lmite de uso (ver la seccin
Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso)
Vas de administracin
Nombre y proporcin de todos los ingredientes inactivos, excepto que los ingredientes agregados para ajustar el pH o
para hacer isotnico el medicamento, se pueden declarar por sus nombres con una indicacin acerca de su efecto
Indicacin de las condiciones de almacenamiento
Nombre y domicilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor
Nmero de lote identificativo y fecha de caducidad
"Venta slo con prescripcin mdica"
La dosis recomendada o comn.
El envase deber etiquetarse de modo que una superficie suficiente de ste quede descubierta en toda su longitud o circun-
ferencia para permitir la inspeccin del contenido.
El nmero de lote debe proporcionar todo el historial de fabricacin del envase especfico, incluyendo todas las operaciones
de fabricacin, llenado, esterilizacin y etiquetado. Cuando la monografa individual permita variar las concentraciones de la
parte activa y/o el frmaco en una inyeccin de gran volumen, se indica la concentracin de cada parte activa y/o frmaco
nombrado en el ttulo oficial como si fuera parte del ttulo oficial (p.ej., Dextrosa 5%, Inyeccin o Dextrosa 5% y Cloruro de Sodio
0,2%, Inyeccin).
Las Inyecciones destinadas para uso veterinario slo deben etiquetarse para ese fin.
El etiquetado de vacunas no se incluye en este captulo general.

Contenido y Volumen Total para Medicamentos Inyectables Monodosis y Multidosis

Para medicamentos inyectables monodosis y multidosis, el contenido por volumen total debe ser la expresin principal y
prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida en proximidad cercana por el contenido/mL entre parntesis. Para
envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido por fraccin de mL debe ser la nica expresin de con-
centracin. El contenido en un mL debe expresarse como mg/mL, y no como mg/l ml. Los siguientes formatos son acepta-
bles para contenidos de ms de 1 mL:

1 Para limitaciones de espacio, ver el CFR 201.1 O(i) y el Ttulo 21 del CFR 610.60.
106 (7) Etiquetado / Requisitos Generales USP 39

Contenido total/volumen total: 500 mg/l O mL

Contenido/mL: 50 mg/mL
o
Contenido total/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL
Contenido/mL: 5000 Unidades/ml.
El siguiente formato es aceptable para medicamentos que contienen menos de 1 mL:
12,5 mg/0,625 mL
Existen algunas excepciones para la expresin del contenido por volumen total. En algunos casos, la expresin principal y
prominente del contenido total de un frmaco por envase puede no ser efectiva en la prevencin de errores en la administra-
cin y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Otro ejemplo de ello es el uso de la lidocana (u otros frmacos similares em-
pleados como anestsicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por porcentaje, (p.ej., 1% o 2%). En tales
casos, se debera expresar el contenido total de la siguiente manera: por ejemplo, 1% se puede expresar como
(100 mg/l O mL) o
(10 mg/mL).
Los slidos secos que deben ser reconstituidos, deben tambin seguir este formato, con la excepcin de que slo se debe indi-
car el contenido total del frmaco y no la concentracin en forma de contenido/volumen total o el contenido/ml.

Expresin de la Relacin de Contenido

Los medicamentos que contienen un solo frmaco que tambin se expresan como una relacin, tal como la epinefrina, de-
bern etiquetarse nicamente en trminos de concentracin, es decir contenido/ml. Un formato de expresin de una relacin
tal como 1:1000 es inaceptable para medicamentos con un solo frmaco.
Ejemplos:
Epinefrina, Inyeccin, USP, 1:1000 deber expresarse como 1 mg/mL
Epinefrina, Inyeccin, USP, 1 :1 O 000 deber expresarse como O, 1 mg/mL
Clorhidrato de lsoproterenol, Inyeccin, USP, 1 :5000 deber expresarse como 0,2 mg/mL
Metilsulfato de Neostigmina, Inyeccin, 1:1000 deber expresarse como 1 mg/mL
Cuando se combina con un anestsico local, la concentracin de epinefrina se expresar en forma de relacin.
Ejemplos:
Clorhidrato de Lidocana 1% y Epinefrina 1:100 000, Inyeccin, USP
Clorhidrato de Bupivacana 0,25% y Epinefrina 1 :200 000, Inyeccin, USP

Envases a Granel para Farmacias

Cuando un envase se ofrece como un Envase a Granel para Farmacias, la etiqueta deber: (a) indicar de manera prominente
"Envase a Granel para Farmacias-No para infusin directa"; (b) contener o referir a informacin sobre tcnicas adecuadas pa-
ra garantizar el uso seguro del producto; y (c) portar una declaracin que limite el intervalo de tiempo en el que el envase
puede usarse una vez que ha sido perforado, siempre que se mantenga en las condiciones de almacenamiento declaradas (ver
Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)).

Casquillos y Tapas de Sobresello

Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fcilmente las indicaciones del eti-
quetado que comunican mensajes de seguridad importantes crticos para evitar situaciones en donde se ponga en riesgo la
vida de forma inminente y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser
simples, concisas y desprovistas de toda informacin no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no
deben incluir ninguna informacin para que aqullos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr
este propsito se requiere un enfoque sistemtico para el etiquetado de los productos inyectables que asegure que los casqui-
llos y tapas de sobresello-un rea de estos productos de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de
estos medicamentos-sean reservados para comunicar mensajes crticos de seguridad. En consecuencia:
1. Slo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (crculo) del casquillo y la tapa de sobresello
de un vial que contenga un producto inyectable. La indicacin precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la
tapa pero puede aparecer solamente en el casquillo, si la tapa de sobresello es transparente y la indicacin precautoria
debajo de la misma es fcilmente legible. Una indicacin precautoria es aqulla destinada a prevenir una situacin que
ponga en riesgo la vida de forma inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si
fuera necesario. Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias incluyen, entre otros: "Advertencia-Agente Parali-
zante" y "Diluir Antes de Usar." El texto de la indicacin precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea
fcilmente visible en condiciones normales de uso.
2. Si no es necesaria una indicacin precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello,
debe quedar en blanco.
USP 39 Requisitos Generales/ (7) Etiquetado 107

3. Otras declaraciones o caractersticas que incluyen, entre otros, nmeros o letras de identificacin, como por ejemplo n-
meros de cdigos, nmeros de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en
la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (crculo) de los casquillos o las tapas de sobresello
de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o caractersticas en la falda del cas-
quillo no deben distraer o interferir con la indicacin precautoria de la superficie superior.

Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin

El uso de un sistema de cierre negro en un vial (p.ej., una tapa de sobresello negra y un casquillo negro para sostener el
cierre elastomrico) o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre el estrechamiento del cuello de una ampolla se
reserva slo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin (ver el captulo (659)).

Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes

Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales
con una declaracin de advertencia impresa en los casquillos y en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la
tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o
la tapa) la declaracin: "Advertencia: Agente Paralizante" o "Agente Paralizante" (dependiendo del tamao del sistema de cie-
rre). Como alternativa, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripcin, de manera que permita la visualizacin
de la indicacin precautoria sobre el casquillo de cierre.

Aluminio en Inyectables de Gran Volumen (IGV), Inyectables de Pequeo Volumen (IPV) y

Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de Nutricin Parenteral Total (NPT)

1. El contenido de aluminio de los IGV usados en terapia de nutricin parenteral total (NPT) no debe exceder de 25 mcg/L.
2. El prospecto del envase de los IGV usados en terapia de NPT debe declarar que el medicamento no contiene ms de 25
mcg de aluminio por L. Esta informacin debe incluirse en la seccin Precauciones del etiquetado de todos los IGV usados
en terapia de NPT.
3. Si la cantidad mxima de aluminio en los IPV y en los EGF es 25 mcg/L o menos, en lugar de declarar la cantidad exacta
de aluminio que contiene cada uno, tal como en el prrafo (4), la etiqueta del envase primario de los IPV y los EGF usados
en la preparacin de mezclas o formulaciones para NPT (con las excepciones que se indican a continuacin) pueden de-
clarar: "No contiene ms de 25 mcg/L de aluminio." Si el IPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del envase pri-
mario puede declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la
concentracin de aluminio no ser ms de 25 mcg/L."
4. El nivel mximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todos los IPV y
los EGF usados en la preparacin de formulaciones y mezclas para NPT. El contenido de aluminio debe declararse de la
siguiente manera: "No contiene ms de_ mcg/L de aluminio." La etiqueta del envase primario de todos los IPV y los
EGF que son polvos liofilizados usados en la preparacin de soluciones para NPT deben declarar lo siguiente: "Cuando se
reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentracin de aluminio no ser ms de _
mcg/L." Este contenido mximo de aluminio debe declararse como el ms alto entre los tres niveles siguientes:
El nivel ms alto de las partidas producidas durante los ltimos tres aos
El nivel ms alto de las ltimas cinco partidas
El nivel mximo con respecto a los niveles histricos, pero slo hasta completar la produccin de las primeras cinco
partidas.
El prospecto adjunto en los envases de todos los IGV, los IPV y los EGF usados en la preparacin de mezclas y formulaciones
para NPT debe contener la siguiente declaracin en la seccin de Advertencias del etiquetado:
ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser txico. El aluminio puede alcanzar niveles txicos con la
administracin parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en particular tienen mayor
riesgo debido a la inmadurez de sus riones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de calcio y fosfato que
contienen aluminio.
Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos prematuros, que reciben niveles de
aluminio por va parenteral mayores de 4-5 mcg/kg/da, acumulan aluminio a niveles asociados con la toxicidad sea y
del sistema nervioso central. La acumulacin en los tejidos puede ocurrir incluso con niveles ms bajos de administracin.

ETIQUETAS V ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS V OTRAS CATEGORAS

Las etiquetas y etiquetados deben incluir la siguiente informacin:

1. En el caso de una preparacin lquida, el contenido porcentual de cada parte activa y/o frmaco o la cantidad de cada
parte activa y/o frmaco en un volumen especificado, excepto que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado
o para hacer isotnica la solucin se puedan declarar por el nombre y una indicacin acerca de su efecto.
108 (7) Etiquetado / Requisitos Generales USP 39

2. En el caso de una preparacin magistral, el etiquetado debe indicar: "Este medicamento es una preparacin magistral"
(ver Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles (795), Proceso de Preparacin Magistral, Criterios para la Elaboracin
de Una Preparacin Magistral para Cada Frmaco).
3. En el caso de una preparacin seca u otra preparacin a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la canti-
dad de cada parte activa y/o frmaco, la composicin de los diluyentes recomendados [slo el o los nombres si la frmula
se especifica en la monografa individual], la cantidad que se usar para lograr una concentracin especfica de la parte
activa o el frmaco, el volumen final de solucin, las instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solucin re-
constituida y una fecha de caducidad o fecha lmite de uso (ver la seccin Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso).

Cantidad de Parte Activa y/o Frmaco por Unidad de Dosificacin

La concentracin de un medicamento se expresa en la etiqueta del envase en trminos de la parte teraputicamente activa o
del frmaco en microgramos, miligramos, gramos o porcentaje, independientemente de la forma que se use en el ttulo, a
menos que se indique de otro modo en una monografa individual. Los nombres de la parte activa y del frmaco, as como sus
cantidades equivalentes se proveen en la etiqueta del envase y en el etiquetado (ver el captulo (1121 ), Poltica para la Denomi-
nacin de Monografas de Medicamentos y Preparaciones Magistrales que Contienen Sales de Frmacos).
Los artculos oficiales en cpsulas, tabletas u otras formas farmacuticas debern etiquetarse indicando la cantidad de cada
parte activa y/o frmaco o el nutriente reconocido que est contenido en cada unidad. Las soluciones o suspensiones orales de
dosis nica (independientemente de si se proveen como preparaciones lquidas o preparaciones lquidas que se reconstitutyen
a partir de slidos con la adicin de un volumen designado de un diluyente especfico) debern etiquetarse expresando la can-
tidad de cada parte activa y/o frmaco o nutriente reconocido administrado en las condiciones descritas en el captulo Volu-
men de Entrega (698). Los medicamentos oficiales que no se envasan como dosis nicas debern etiquetarse indicando la canti-
dad de cada parte activa y/o frmaco en cada mililitro o gramo, o expresando el porcentaje de cada uno de estos ingredientes
(ver Advertencias y Requisitos Generales 8. 740, Concentraciones Porcentuales). Una excepcin son los lquidos o slidos orales
destinados para su reconstitucin para producir lquidos orales que, alternativamente, pueden etiquetarse en trminos de cada
porcin de 5 mL de lquido o del lquido resultante. A menos que se especifique de otro modo en una monografa o un captu-
lo, las concentraciones o cantidades debern declararse solamente en unidades mtricas [ver tambin Advertencias y Requisitos
Generales 5.50. 7O, Unidades de Potencia (Biolgica)].

Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso

La etiqueta de un medicamento o suplemento nutricional o diettico oficial debe llevar una fecha de caducidad. Todos los
productos deben exhibir la fecha de caducidad de manera tal que pueda ser leda por una persona comn en las condiciones
normales de compra y uso. La fecha de caducidad debe aparecer en forma prominente, contrastando claramente con el fon-
do, o grabada en relieve con nitidez, y debe ser fcilmente comprendida (p.ej., "CAD, VENC o EXP 6/13," "Cad, Venc o Exp
13 de junio " o "Caducidad, Vencimiento o Expiracin 6/2013"). [NOTA-Para obtener informacin adicional, consultar los
Voluntary Codes and Guidelines of the Consumer Healthcare Products lndustry de la Consumer Healthcare Products Association.]
Las monografas para ciertas preparaciones especifican cmo se debe determinar la fecha de caducidad que aparece en la
etiqueta. En ausencia de un requisito especfico en la monografa individual de un medicamento o un suplemento nutricional,
la etiqueta debe llevar una fecha de caducidad asignada para dicha formulacin y empaque del artculo, con la siguiente ex-
cepcin: no es necesario exhibir la fecha de caducidad en el caso de medicamentos o suplementos nutricionales envasados en
envases destinados a la venta sin receta mdica, en cuyo etiquetado no se establezcan limitaciones de dosificacin y que se
mantengan estables durante un perodo de no menos de 3 aos, siempre que se almacenen en las condiciones prescritas.
En el caso de artculos oficiales que deban exhibir una fecha de caducidad, tales artculos debern dispensarse nicamente
en un envase, o a partir de un envase, etiquetado con fecha de caducidad, y la fecha de dispensacin del producto deber ser
anterior a la fecha de caducidad declarada. La fecha de caducidad identifica el perodo durante el cual se estima que el artculo
cumple con los requisitos de la monografa oficial, siempre que se conserve en las condiciones de almacenamiento prescritas.
La fecha de caducidad limita el tiempo durante el cual un artculo puede ser dispensado o usado. En los casos en que se indica
slo el mes y el ao de caducidad, se entiende que la fecha se refiere al ltimo da del mes indicado.
La fecha lmite de uso es la fecha despus de la cual no se debe utilizar un producto. Basndose en la informacin provista
por el fabricante o en esta subseccin, el dispensador deber colocar una fecha lmite de uso adecuada en la etiqueta del enva-
se del artculo recetado para limitar el uso del mismo por parte del paciente. La fecha lmite de uso colocada en la etiqueta no
debe ser posterior a la fecha de caducidad del envase del fabricante. Ver tambin la seccin Preparaciones Magistrales ms ade-
lante.
Para los artculos que requieran ser reconstituidos antes de su uso, se debe colocar en el etiquetado una fecha lmite de uso
apropiada para el producto reconstituido.
Para todas las otras formas farmacuticas, al determinar la fecha lmite de uso, el dispensador debe tomar en cuenta, adems
de cualquier otro factor relevante lo siguiente:
La naturaleza del medicamento
El envase en el que fue envasado por el fabricante y su fecha de caducidad
Las caractersticas del envase para el paciente, si el artculo se reenvasa para su dispensacin
USP 39 Requisitos Generales/ (7) Etiquetado 109

Las condiciones de almacenamiento esperadas a las que el artculo puede ser expuesto
Las condiciones de almacenamiento inusuales a las que el artculo puede ser expuesto
El perodo estimado para la duracin del tratamiento.
Despus de tomar en cuenta dichos factores, el dispensador deber colocar una fecha lmite de uso adecuada en la etiqueta
del envase del artculo para limitar el uso del mismo por parte del paciente. A menos que se especifique algo diferente en la
monografa individual, o en ausencia de datos de estabilidad, esa fecha lmite de uso no podr ser posterior a: (a) la fecha de
caducidad indicada en el envase del fabricante, o (b) 1 ao a partir de la fecha en que se dispense el medicamento, lo que
represente un perodo menor. Para formas farmacuticas lquidas y slidas no estriles que estn envasadas en envases unita-
rios y de dosis nica, la fecha lmite de uso debe ser de 1 ao a partir de la fecha de envasado del medicamento en envases
unitarios o de dosis nica, o la fecha de caducidad indicada en el envase del fabricante, lo que represente un perodo menor, a
menos que los datos de estabilidad o el etiquetado del fabricante indiquen algo diferente.

Preparaciones Magistrales

La etiqueta del envase o empaque que contiene una preparacin magistral oficial debe llevar una fecha lmite de uso. La
fecha lmite de uso es la fecha despus de la cual no debe usarse la preparacin magistral. La fecha lmite de uso se determina
basndose en criterios distintos a los utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados en
forma industrial.
La etiqueta en el empaque del envase de una preparacin magistral oficial debe incluir las palabras "preparacin magistral"
despus del nombre del medicamento (p.ej., Baclofeno, Solucin Oral, Preparacin Magistral). Adems, las preparaciones ma-
gistrales oficiales USP para pacientes animales incluirn la palabra "veterinario(a)" despus de la denominacin oficial (p.ej.,
Atenolol, Suspensin, Preparacin Magistral Veterinaria).

Irrigacin, Hemofiltracin y Dilisis

Los envases flexibles para inyecciones destinadas a dilisis, hemofiltracin o soluciones de irrigacin y que contienen un vo-
lumen de ms de 1 L, debern etiquetarse indicando que el contenido no est destinado para infusin intravenosa.

Uso de Ceros al Comienzo y al Final de una Cantidad

Con el fin de minimizar la posibilidad de errores en la dispensacin y administracin de medicamentos, cuando la cantidad
de parte activa y/o frmaco se exprese en nmeros enteros, se debe indicar sin coma decimal seguida de ceros (p. ej., indicar
4 mg, no 4,0 mg). Cuando la cantidad de parte activa y/o frmaco se exprese en un nmero decimal menor a 1, se debe
indicar con un cero antes de la coma decimal (p.ej., indicar 0,2 mg; no ,2 mg).

Alcohol

El contenido de alcohol en una preparacin lquida debe especificarse en la etiqueta como un porcentaje (v/v) de C2 H5 0H.

Productos Botnicos

La etiqueta de una planta u otro producto botnico destinado para uso como suplemento diettico deber incluir la leyenda
"Si est embarazada o en perodo de lactancia, consulte a un profesional de la salud antes de usar este producto."

Electrlitos

La concentracin de electrlitos para terapias de reemplazo (p.ej., sodio, potasio, cloruro), deber especificarse en la etique-
ta en miliequivalentes (mEq)/volumen. [NOTA-El contenido de fsforo en inyectables deber expresarse en miliMoles (p.ej.,
mMol/volumen). Asimismo, la etiqueta del producto deber indicar la cantidad del ingrediente o ingredientes, expresada en
trminos de peso o concentracin porcentual.]

Productos No Orales

Un producto destinado para inyeccin o uso tpico deber indicar los nombres de todas las sustancias agregadas (ver Adver-
tencias y Requisitos Generales 5.20, Sustancias Agregadas).

Sales de Frmacos

Es un principio establecido que los artculos oficiales deben tener un nico ttulo oficial (ver Advertencias y Requisitos Genera-
les 2.20 y los requisitos farmacopeicos de nomenclatura en el captulo (1121 )). Con el objeto de ahorrar espacio en las etique-
11 O (7) Etiquetado / Requisitos Generales USP 39

tas, y dado que los smbolos qumicos de las sales inorgnicas ms comunes son bien conocidos por los profesionales de la
salud, se permiten las siguientes alternativas para el etiquetado de artculos oficiales que son sales: HCI para clorhidrato; HBr
para bromhidrato; Na para sodio; y K para potasio. Los smbolos Na y K se usan para abreviar el nombre de las sales de cidos
orgnicos; sin embargo, estos smbolos no deben usarse cuando se emplea la preposicin de en el ttulo oficial, es decir cuan-
do se denominan oficialmente de sodio o de potasio (con el metal al comienzo de la denominacin oficial en ingls), (p.ej.,
Fenobarbital Sdico, que se denomina Phenobarbital Sodium en ingls, se puede abreviar a Fenobarbital Na, pero no se debe-
r escribir Salicilato de Na para abreviar Salicilato de Sodio, el cual se denomina Sodium Salicylate en ingls).

Cpsulas y Tabletas Especiales

La etiqueta de cualquier Cpsula o Tableta destinada para una administracin que no sea la ingestin oral de la unidad ente-
ra, deber llevar una indicacin bien visible sobre el modo de uso (ver Nomenclatura Farmacopeica, Pautas de Nomenclatura en
el sitio Web de la USP en www.usp.org).

Productos con Vitaminas

La etiqueta de los medicamentos oficiales debe indicar su contenido de vitaminas expresado en unidades mtricas por uni-
dad de dosificacin. Las cantidades de vitamina A, O y E tambin se pueden expresar en Unidades USP. Las cantidades de
vitamina A expresadas en unidades mtricas hacen referencia a las cantidades equivalentes de retinol (alcohol de vitamina A).
La etiqueta de los suplementos nutricionales debe incluir un nmero identificatorio de lote, de control o de partida.

Temperatura Ambiente Controlada

Los artculos pueden etiquetarse indicando su almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o a una temperatura
de "hasta 25", u otra indicacin basada en la misma temperatura cintica media (ver el captulo (659)).

Envase Resistente a la Luz

Cuando se use una cubierta opaca para proveer proteccin de la luz para un producto sensible a la luz envasado en un enva-
se transparente o incoloro o translcido, la etiqueta del envase deber indicar que la cubierta opaca es necesaria hasta el mo-
mento de uso o administracin del contenido (ver Envases-Pruebas de Desempeo (671 ), Prueba de Transmisin de Luz y el
captulo (659)).

Envase Unitario

Todos los envases unitarios debern etiquetarse indicando la identidad, cantidad y/o concentracin, el nombre del fabrican-
te, el nmero de lote y la fecha de caducidad del artculo (ver el captulo (659)).

Envase Monodosis

Un envase monodosis deber etiquetarse como tal y, cuando el espacio lo permita, la etiqueta deber incluir instrucciones
apropiadas para su desecho (ver el captulo (659)).

Envase de Unidad de Uso

Un envase de unidad de uso deber etiquetarse como tal, sin ninguna modificacin adicional excepto la adicin del etique-
tado apropiado (ver el captulo (659)).

Proteccin de la Congelacin

El envase deber incluir una indicacin apropiada para proteger el artculo de la congelacin si estuviera sujeto a la prdida
de contenido o potencia, o a la alteracin destructiva de sus caractersticas (ver el captulo (659)).

Etiquetado de Envases de Venta bajo Receta Mdica

Como mnimo, un envase de venta bajo receta mdica deber etiquetarse tomando en cuenta al paciente. La etiqueta debe-
r contener informacin esencial que sea importante para el uso seguro y efectivo del medicamento por parte del paciente. Las
etiquetas deben tener un diseo y formato que optimice la legibilidad y el entendimiento (ver Etiquetado de Envases de Medica-
mentos de Venta Bajo Receta (1 7)).
USP 39 Requisitos Generales / (11) Estndares de Referencia USP 111

ETIQUETADO GENERAL

Se recuerda a los usuarios referirse siempre a las Advertencias y Requisitos Generales para la evaluacin o aplicacin de cual-
quier norma farmacopeica. Las Advertencias y Requisitos Generales tratan diversos aspectos relacionados con el etiquetado, en-
tre los que se incluyen 3.20, Indicacin de Cumplimiento (cuando un artculo puede etiquetarse con la denominacin USP, NF o
USP-NF, y requisitos relacionados con las diferencias en identidad, denominacin, contenido, calidad o pureza); 5.20. 7O, Sus-
tancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes en Sustancias Oficiales; 6.70, Reactivos; y 8.240, Pesos y Medidas (p.ej., el microgra-
mo puede expresarse como g o mcg. Para propsitos de etiquetado o prescripcin, se prefiere "mcg").

(11) ESTNDARES DE REFERENCIA USP

Los Estndares de Referencia provistos por la Convencin de la Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (Estndares de
Referencia USP o ER) son muestras bien caracterizadas de frmacos y alimentos especficos (frmacos, productos biolgicos,
excipientes, suplementos dietticos, ingredientes alimenticios, impurezas, productos de degradacin, reactivos y estndares de
verificacin de desempeo). Cuando los ER USP se aprueban como aptos para su uso como estndares de comparacin en las
pruebas o valoraciones documentales (es decir, como componentes de las monografas) en la Farmacopea de los Estados Unidos
(USP) o en el Formulario Nacional (NF), tambin adquieren estatus oficial y reconocimiento legal en los Estados Unidos de Am-
rica. Es responsibilidad del usuario evaluar la aptitud de los ER para su uso en otras aplicaciones. Los ER USP oficiales son los
estndares primarios en jurisdicciones que los reconocen como tales y, cuando corresponda, se calibran con respecto a mate-
riales de referencia internacionales tales como los provistos por la Organizacin Mundial de la Salud. Los ER USP no estn desti-
nados para uso teraputico. Los ER USP se ofrecen para propsitos de metrologa legal y pueden ayudar a asegurar la compa-
rabilidad de los resultados y la trazabilidad a las unidades del Sistema Internacional de Unidades (SI) independientemente del
estado de certificacin. Los ER USP son Materiales de Referencia conforme a lo definido en el Vocabulario Internacional de Me-
trologa-Conceptos Bsicos y Generales y Trminos Asociados (VIM): 3ra edicin, 2007.

TIPOS DE ESTNDARES DE REFERENCIA

Estndares de Referencia para Artculos USP o NF

Los Estndares de Referencia para los artculos oficiales en USP o NF se ofrecen como materiales puros o como mezclas de
sustancias qumicas que constituyen un reflejo de los frmacos o excipientes correspondientes. El uso de estos materiales se
especifica en la monografa del artculo. Por lo general, estos materiales son necesarios para la Valoracin y/o las pruebas de
Identificacin. La evaluacin de la aptitud de un ER USP para usos distintos a los especificados en una monografa es responsa-
bilidad del usuario. El valor de propiedad o el valor de clculo del Estndar de Referencia se declara en la etiqueta y se debe
incluir en los clculos usados en la monografa y en los captulos generales aplicables. Para los Estndares de Referencia que no
cuentan con un valor de propiedad o un valor de clculo declarado en la etiqueta o en la documentacin adjunta, se debe
asumir que el Estndar de Referencia es 100,0% puro para las aplicaciones cuantitativas farmacopeicas.

Estndares de Referencia de Impurezas

Los Estndares de Referencia de impurezas pueden incluir lo siguiente:

Impurezas orgnicas que pueden surgir durante los procesos de fabricacin o durante la vida til de un artculo y pueden
incluir materiales iniciales, productos intermedios, subproductos, reactivos, catalizadores y/o productos de degradacin.
Impurezas inorgnicas que normalmente resultan de un proceso de sntesis y que pueden incluir reactivos, catalizadores,
metales pesados o sales inorgnicas
Disolventes residuales que pueden ser lquidos orgnicos o inorgnicos que se usan para preparar soluciones o suspensio-
nes durante la sntesis de un artculo
Los Estndares de Referencia de Impurezas pueden presentarse como materiales purificados de un solo componente o como
mezclas de ms de una impureza. Otras opciones para controlar impurezas pueden incluir la presentacin del artculo oficial
con un contenido de impurezas declarado, el uso de tiempos de retencin y factores de respuesta cromatogrfica relativos, o
la provisin de valores tericos tales como las absortividades UV a longitudes de onda seleccionadas.
En ediciones anteriores de la farmacopea, las impurezas se designaban por sus nombres qumicos. Para facilitar la bsqueda
y el orden en el ndice, los nombres qumicos de las impurezas se han reemplazado gradualmente por la denominacin "ER
Compuesto Relacionado Y de X," donde X es el nombre del artculo oficial e Y es una letra secuencial del alfabeto. La designa-
cin de esta letra no concuerda necesariamente con los esquemas de denominacin usados por otras farmacopeas. Asimismo,
los Estndares de Referencia de mezclas de impurezas se pueden designar segn el uso al que estn destinados, como por
112 (11) Estndares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 39

ejemplo "ER Aptitud del Sistema de X". Los nombres convencionales y los nombres qumicos se reproducen en el catlogo y
en la etiqueta del ER.

Materiales de Referencia Certificados

Los Materiales de Referencia Certificados de USP (MRC) son Estndares de Referencia que proporcionan valores de propieda-
des certificados con incertidumbres asociadas y trazabilidad metrolgica, de conformidad con las Guas 30-35 de la lnternatio-
nal Organization for Standardization (ISO). El uso correcto de estos MRC respalda la trazabilidad de los resultados a las unida-
des del SI y la capacidad de comparabilidad de los procedimientos.

Estndares de Referencia USP para Productos Biolgicos

La USP ofrece ER para productos biolgicos y materiales auxiliares. Por diversas razones, que incluyen razones histricas, y
conforme se indica en la Seccin 5.50.1 O Unidades de Potencia (Biolgica) en las Advertencias y Requisitos Generales, los ER USP
para productos biolgicos pueden diferir en la cantidad de unidades de potencia, por definicin, o en otros aspectos de los
dems estndares reconocidos internacionalmente. A menos que as se indique en la monografa, los estndares de referencia
internacionales generalmente no son intercambiables y se requieren ER USP para las pruebas y valoraciones de USP-NF.

Estndares de Referencia NF

Se pretende designar y etiquetar como "Estndares de Referencia USP" a los Estndares de Referencia actualmente etiqueta-
dos como "Estndares de Referencia NF", conforme a la consolidacin de la USP y el NF dentro de la USP a partir del 2 de
Enero de 1975. Cuando sea necesario un Estndar de Referencia USP, se puede usar la sustancia correspondiente etiquetada
como un "Estndar de Referencia NF".

Transicin de Sustancias Autnticas a Estndares de Referencia USP

En el pasado, la USP desarrollaba a manera de servicio materiales de referencia altamente caracterizados no requeridos para
su uso en monografas o captulos generales de USP-NF, los cuales se distribuan como Sustancias Autnticas (SA). Las SA son
sustancias qumicas altamente caracterizadas que se analizan mediante estudios en colaboracin y se ponen a disposicin co-
mo un servicio primariamente para los laboratorios analticos, clnicos, farmacuticos y de investigacin. Estos materiales pue-
den usarse en la identificacin, el desarrollo de mtodos, la evaluacin del desempeo de mtodos, u otras aplicaciones que
sean adecuadas y estn validadas por el usuario. La USP dejar de lanzar materiales etiquetados como "Sustancias Autnticas".
Todos los materiales de referencia liberados al mercado, independientemente que se requiera o no su uso en una monografa
o captulo general de USP-NF, sern "Estndares de Referencia USP".

Referencias Visuales Autnticas

Las Referencias Visuales Autnticas son Estndares de Referencia USP, pero a diferencia de los materiales de referencia qumi-
cos, las Referencias Visuales Autnticas (RVA) no se usan en anlisis qumicos. Las RVA son imgenes visuales usadas por los
analistas para comparar ciertos artculos de prueba y asegurar que cumplen con los requisitos farmacopeicos. Las RVA se incor-
poran por referencia en la monografa.

Estndares de las Pruebas de Verificacin de Desempeo USP

Estos materiales se proporcionan para analizar y, cuando fuese adecuado, facilitar el ajuste de la operacin de un instrumen-
to para asegurar que los resultados obtenidos son exactos y/o precisos o que proporcionan resultados aceptables. El uso de
estos Estndares de Referencia se describe generalmente en los captulos de pruebas generales asociados y en la informacin
relacionada.

APLICACIONES DE LOS ESTNDARES DE REFERENCIA USP

Las aplicaciones oficiales de los ER USP se especifican en las monografas y captulos generales de USP-NF. Incluyen lo si-
guiente:
usos cuantitativos en valoraciones de frmacos y formulaciones, pruebas de lmite, o blancos y controles
usos cualitativos, (p.ej., pruebas de identificacin, pruebas de aptitud del sistema, o marcadores de picos cromatogrfi-
cos)
usos especficos del mtodo, (p.ej., estndares de verificacin de desempeo, RVA, estndares de punto de fusin y el set
de conteo de partculas)
USP 39 Requisitos Generales/ (11) Estndares de Referencia USP 11 3

Segn se describi con anterioridad, la USP tambin ofrece Sustancias Autnticas que no se especifican para su uso en una
monografa o captulo general de USP, las cuales se usan a criterio del usuario.

ENVASADO

La cantidad de material por envase individual de ER USP depende de la aplicacin farmacopeica del estndar y es, por lo
general, suficiente para varias determinaciones. Algunos estndares (principalmente materiales con requisitos importantes de
manipulacin o materiales que estn disponibles nicamente en pequeas cantidades) se proporcionan en envases de un solo
uso. Dichos productos de un solo uso por lo general son liofilizados y su contenido se declara en unidades de masa o actividad
por envase. Cuando as se declara, el contenido del envase debe reconstituirse en su totalidad sin la necesidad de pesarlo nue-
vamente. Las instrucciones de reconstitucin se proveen en la etiqueta o en las monografas en que se usa el estndar.

ETIQUETADO

El texto de la etiqueta proporciona toda la informacin requerida para el almacenamiento y uso correctos de los ER USP en
las aplicaciones de las monografas. La etiqueta incluye instrucciones de uso, advertencias de seguridad, informacin requerida
para las sustancias controladas y un valor de propiedad o un valor de clculo para los estndares con aplicaciones cuantitativas.
Para los estndares de verificacin de desempeo, se proveen intervalos de aceptacin. Cuando resulta necesario, los ER USP
estn acompaados de documentacin adicional, como por ejemplo Hojas de Datos Tcnicos o Cromatogramas Tpicos.
A menos que se indique algo distinto en el procedimiento de la monografa individual o en un captulo general, los ER USP
se deben usar de acuerdo con las instrucciones en la etiqueta del Estndar de Referencia. Las Hojas de Datos de Seguridad de
los Materiales para todos los materiales de referencia USP estn disponibles en el sitio Web de la USP.
Aunque los ER USP se vuelven a analizar de acuerdo con un programa predefinido para determinar la aptitud continua de
uso, los ER USP no presentan una fecha de caducidad en la etiqueta. Un lote de ER USP puede usarse en sus aplicaciones oficia-
les siempre que se publique como "Current Lot" (Lote Vigente) en la versin vigente del USP Reference Standards Catalog
(Catlogo de Estndares de Referencia USP) o que no haya alcanzado su Fecha de Uso Vlida. Al agotarse, se designa a este
lote en el catlogo como "Previous Lot" (Lote Anterior) y se le asigna una "Valid Use Date" (Fecha de Uso Vlida). La USP
publica bimestralmente el Catlogo de Estndares de Referencia. Se puede encontrar la versin vigente del catlogo en el sitio
Web de la USP: www.usp.org. Es responsabilidad del usuario constatar antes de su uso que el lote del Estndar de Referencia
USP en cuestin tiene un estatus oficial como "Current Lot" (Lote Vigente) o como "Previous Lot" (Lote Anterior) dentro de la
Fecha de Uso Vlida.

Cambio en la redaccin:

USO ADECUADO
Muchas pruebas y valoraciones farmacopeicas estn basadas en la comparacin de una muestra de prueba con un ER USP.
En estos casos, las mediciones se realizan en preparaciones de la muestra de prueba y del Estndar de Referencia. Cuando se
indica que se debe preparar en diluciones sucesivas, o de otro modo, una Solucin estndar o una Preparacin estndar para
realizar una determinacin cuantitativa, est previsto que la sustancia del Estndar de Referencia se pese con exactitud (ver
Balanzas (41 > CAf ol-may-zo 16) y Aparatos Volumtricos (31) ). Tambin se deben tomar en cuenta los errores potenciales asociados
con el pesaje de masas pequeas (ver tambin la Seccin 6.50.20.1 Ajuste de Soluciones en las Advertencias y Requisitos Genera-
les). Segn se indic anteriormente, los Estndares de Referencia que se definen basndose en el contenido por envase son una
excepcin.
Las instrucciones de uso de los ER USP incluyen lo siguiente:
Tal Como se Encuentra (As Is): Usar sin tratamiento previo ni correccin por sustancias voltiles. sta es la opcin de
preferencia y se escoge siempre que los datos validados indiquen que el contenido de sustancias voltiles es constante
con el transcurrir del tiempo.
Secar Antes de Usar (Dry Befare Use): Usar inmediatamente despus de secar en las condiciones indicadas. El secado no
debe realizarse en el envase original. Se debe transferir una porcin del material a un recipiente de secado distinto.
Determinar Volumtricamente el Contenido de Agua al Momento de su Uso (Determine Water Content Titrimetri-
cally At Time of Use): Usar con una correccin por el contenido de agua o la prdida por secado determinada en una
porcin separada del material. Cuando se requiere de una determinacin volumtrica de agua al momento de usar el Es-
tndar de Referencia, proceder segn se indica en el Mtodo/ en Determinacin de Agua (921 ). Para ello se aceptan mto-
dos instrumentales o microanalticos. Cuando se usen cantidades habituales (aproximadamente 50 mg del Estndar de
Referencia), valorar volumtricamente con una solucin del reactivo diluida de 2 a 5 veces. Cuando requiera la determina-
cin de la prdida por secado de una porcin separada del ER USP, proceder segn se indica en la etiqueta. Se pueden
usar tamaos de muestra ms pequeos que los requeridos en el captulo de pruebas generales Prdida por Secado (731)
para un ER USP, siempre que el usuario pueda obtener un resultado suficientemente exacto.
114 (11) Estndares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 39

Siempre que las instrucciones de uso declaradas requieran de secado o de una correccin por sustancias voltiles, se lo debe
realizar al momento del uso. Se deben controlar los detalles experimentales adicionales mediante los Procedimientos Operati-
vos Estndares del usuario y las buenas prcticas de laboratorio.

ALMACENAMIENTO
Los ER USP deben almacenarse en la configuracin de envasado provista por la USP (p.ej., viales que se envasan en bolsas
selladas hermticamente). Cuando se especifiquen condiciones de almacenamiento especiales, se deben seguir las instruccio-
nes de la etiqueta. Los viales sin abrir se deben almacenar segn se indica en la etiqueta. Es responsabilidad del usuario asegu-
rar que el contenido de los viales abiertos contine siendo adecuado para el uso provisto y que se mantenga tanto la asigna-
cin de valores como la informacin de incertidumbre.

Aparatos para Pruebas y Valoraciones

(17) ETIQUETADO DE ENVASES DE MEDICAMENTOS DE VENTA BAJO

RECETA

INTRODUCCIN
El uso errneo de medicamentos ocasiona ms de un milln de eventos adversos por ao en los Estados Unidos. En lo que
respecta a medicamentos recetados, la mejor (y generalmente la nica) fuente de informacin para los pacientes es la etiqueta
del envase del medicamento de venta bajo receta y, aunque en ocasiones el paciente dispone de otra informacin escrita y
asesoramiento verbal, la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta debe satisfacer las obligaciones profesiona-
les del mdico que receta y del farmacutico. Estas obligaciones incluyen proveer al paciente aquella informacin que resulte
esencial y necesaria para entender la forma segura y apropiada de uso del medicamento y el apego al esquema prescrito de
medicacin.
El entendimiento inadecuado de las instrucciones de uso del medicamento recetado y de la informacin auxiliar en los enva-
ses dispensados se ha generalizado. Diversos estudios han descubierto que el 46% de los pacientes no entienden una o ms
instrucciones de posologa, mientras que el 56% malinterpreta una o ms de las advertencias auxiliares. El problema se acen-
ta en pacientes con un bajo nivel de alfabetismo o semi analfabetos, as como en pacientes que reciben varios medicamentos
con esquemas de administracin innecesariamente complejos o no estandarizados. Un estudio demostr que los pacientes con
bajo nivel de alfabetismo son 34 veces ms propensos a malinterpretar las advertencias en las etiquetas de los medicamentos
recetados. Sin embargo, incluso los pacientes con un nivel adecuado de alfabetismo a menudo malinterpretan las instrucciones
y advertencias comunes de los medicamentos recetados. Asimismo, existen grandes discrepancias entre las advertencias auxi-
liares y las instrucciones adicionales indicadas por cada mdico para el mismo medicamento recetado. A menudo, la evidencia
especfica para sustentar una declaracin auxiliar es poco clara y los pacientes en muchas ocasiones ignoran dicha informacin.
Sin embargo, an se requieren mayores estudios con respecto a la necesidad esencial y al beneficio que proporciona la infor-
macin auxiliar en la etiqueta (tanto texto como conos) para mejorar el entendimiento del paciente sobre el uso seguro y
apropiado de sus medicamentos en comparacin con el uso de un lenguaje simplificado y explcito nicamente.
La falta de normas universales para el etiquetado de envases de medicamentos de venta bajo receta que se dispensan es una
causa importante por la que el paciente malinterpreta las instrucciones, no las sigue de manera adecuada y comete errores de
medicacin. El 18 de mayo de 2007, el Comit de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos de la USP estableci un Panel
Asesor con los siguientes objetivos: 1) determinar el contenido y formato ptimos de las etiquetas de los medicamentos de
venta bajo receta para promover el uso seguro de medicamentos mediante la revisin crtica de factores que promueven u
ocasionan que el paciente no entienda las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta y 2) crear normas universa-
les para etiquetas de medicamentos de venta bajo receta con respecto al formato/apariencia y el contenido/lenguaje.
En noviembre de 2009, el Panel Asesor en Alfabetizacin en Salud y Etiquetado de Envases de Medicamentos Recetados pre-
sent sus recomendaciones al Comit de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos, el cual a su vez solicit a la USP desarro-
llar normas para etiquetas centradas en el paciente en lo referente a formato, apariencia, contenido y lenguaje de las instruc-
ciones en los medicamentos de venta bajo receta a fin de promover el entendimiento por parte de los pacientes. Dichas reco-
mendaciones conforman el fundamento de este captulo general.
USP 39 Aparatos / (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos 115

[NOTA-Estas normas no se aplican cuando personal autorizado, que acta dentro del marco de su profesin, administra un
medicamento de venta bajo receta a un paciente.]

NORMAS PARA ETIQUETAR ENVASES DE MEDICAMENTOS RECETADOS QUE PROMUEVAN EL

ENTENDIMIENTO EN LOS PACIENTES

Organizar la Etiqueta del Medicamento de Venta Bajo Receta de una Manera Centrada en el
Paciente

La informacin debe organizarse de la manera que mejor refleje la forma en que la mayora de los pacientes buscan y en-
tienden las instrucciones de uso de los medicamentos. El etiquetado del envase de los medicamentos de venta bajo receta de-
be presentar al paciente nicamente la informacin ms importante requerida para entender el uso seguro y efectivo.

Se Deben Enfatizar las Instrucciones y Dems Informacin Importante para los Pacientes

Presentar de manera prominente la informacin crtica para los pacientes sobre el uso seguro y efectivo del medicamento.
En la parte superior de la etiqueta, se debe especificar el nombre del paciente, el nombre del medicamento (especificar el
nombre genrico y comercial completos) y la dosis, adems de instrucciones de uso explcitas y claras en lenguaje sencillo.
Las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta deben seguir un formato estndar de modo que el paciente
pueda estar seguro de que cada elemento se encontrar en un orden reglamentado cada vez que reciba un medicamento re-
cetado.
Otra informacin menos crtica aunque importante (p.ej., nombre y nmero telefnico de la farmacia, nombre del mdico
que receta, fecha de llenado, fecha de rellenado, fecha de caducidad, nmero de receta mdica, cantidad de medicamento,
descripcin fsica e informacin auxiliar basada en evidencia) no debe predominar sobre la informacin crtica para el paciente.
Esta informacin menos crtica se debe colocar lejos de las instrucciones de dosificacin (p.ej., en la parte inferior de la etiqueta
o en otra ubicacin menos prominente) puesto que distrae a los pacientes e interfiere con su reconocimiento y entendimiento.

Lenguaje Simplificado

El lenguaje de la etiqueta debe ser claro, conciso y familiar, y se debe usar de forma estandarizada. Se deben usar nicamen-
te trminos y clusulas comunes. No se deben usar palabras poco familiares (incluyendo trminos en latn) ni jerga mdica.
No se recomienda el uso de frmulas o software de legibilidad para simplificar extractos de texto como los presentados en
las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta. En su lugar, se deben usar clusulas simplificadas y estandarizadas,
redactadas de tal forma que aseguren el fcil y correcto entendimiento de las instrucciones (mediante retroalimentacin obte-
nida de muestras de diversos consumidores).

Proveer Instrucciones Explcitas

Las instrucciones de uso (es decir, la SIG o signatura) deben separar claramente la dosis misma del esquema de administra-
cin de cada dosis a fin de transmitir explcitamente el nmero de unidades de dosificacin y el momento en que deben admi-
nistrarse (p.ej., periodos (partes) especficos del da, tales como la maana, el medio da, la tarde y antes de acostarse). Las
instrucciones deben incluir detalles especficos sobre los periodos de administracin. No se deben usar caracteres alfabticos en
lugar de nmeros. Por ejemplo, se debe escribir "Tomar 2 tabletas por la maana y 2 tabletas por la tarde" en lugar de "To-
mar dos tabletas dos veces al da").
Siempre que sea posible, se deben usar instrucciones estandarizadas (p.ej., se debe escribir "Tomar 1 tableta por la maana
y 1 tableta por la tarde" si la prescripcin indica b.i.d.). Por lo general, se deben evitar instrucciones ambiguas basadas en
intervalos de dosificacin tales como dos veces al da o 3 veces al da, o en intervalos por horas tales como cada 12 horas,
puesto que dichas instrucciones se consideran implcitas ms que explcitas, pueden requerir destreza con los nmeros y la
interpretacin del paciente puede ser distinta de la intencin del mdico que expidi la receta. Aunque puede parecer que las
instrucciones expresadas en horas especficas (p.ej., 8 a.m. y 1O p.m.) se entienden con ms facilidad que las instrucciones
ambiguas e implcitas, en realidad son menos fciles de entender y pueden presentar mayores problemas de seguimiento debi-
do a los patrones de vida de cada individuo, tales como el horario de trabajo, que los intervalos de tiempo ms generales co-
mo por la maana, por la tarde, despus del desayuno, con el almuerzo, o antes de dormir. El uso uniforme de la misma termi-
nologa ayudar a evitar confusiones en los pacientes.
Se deben evitar instrucciones ambiguas tales como "tomar segn lo indicado" a menos que se proporcionen instrucciones
complementarias claras y asesoramiento (p.ej., instrucciones de uso que no quepan en la etiqueta del envase del medicamento
de venta bajo receta). La etiqueta del envase debe incluir una indicacin clara que refiera al paciente a dichos materiales com-
plementarios.
116 (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos / Aparatos USP 39

Incluir el Propsito de Uso

Si el propsito del medicamento se incluye en la receta mdica, tambin debe incluirse en la etiqueta del envase del medica-
mento de venta bajo receta, a menos que el paciente prefiera la omisin del mismo. Se debe preguntar a los pacientes cules
son sus preferencias al momento de remitir las recetas mdicas para dispensar. Los factores de confidencialidad y el uso apro-
bado por la FDA (p.ej. uso declarado en la etiqueta frente a uso alternativo) pueden restringir la inclusin del propsito en las
etiquetas. La evidencia actual respalda la inclusin del propsito de uso en un lenguaje claro y simple (p.ej., "para la presin
sangunea alta" en lugar de "para la hipertensin").

Limitar la Informacin Auxiliar

La informacin auxiliar que aparezca en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta debe basarse en evi-
dencia cientfica y redactars.e en lenguaje explcito minimizado para evitar distraer a los pacientes con informacin innecesaria.
La mayora de los pacientes, en particular aquellos con un nivel bajo de alfabetismo, prestan poca atencin a la informacin
auxiliar. La informacin debe presentarse de manera estandarizada y debe ser crtica para que el paciente entienda y use el
medicamento de forma segura (p.ej., advertencias y alertas crticas para la administracin). Con frecuencia, los pacientes ma-
linterpretan los conos. Asimismo, los conos que ofrecen imgenes abstractas para transmitir mensajes que sean difciles de
descifrar pueden ser poco efectivos para promover el entendimiento en comparacin con el uso exclusivo de texto simplifica-
do. Deben usarse nicamente aquellos conos que, basndose en estudios con consumidores, mejoren el entendimiento del
paciente sobre su uso correcto. La informacin auxiliar basada en evidencia, tanto texto como conos, debe estandarizarse de
modo que pueda aplicarse de manera uniforme y que no dependa de la preferencia individual del mdico que receta.

Tener en Cuenta el Dominio Limitado del Ingls

Cuando sea posible, las instrucciones de uso en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta deben proveer-
se en el idioma preferido del paciente; de otro modo, existira el riesgo de que los pacientes con un dominio limitado del in-
gls malinterpretaran las instrucciones, lo cual podra llevar a errores de medicacin y resultados adversos para la salud. Ade-
ms, siempre que sea posible, las instrucciones de uso deben proporcionarse tambin en ingls a fin de facilitar el asesoramien-
to; el nombre del medicamento debe estar en ingls para que el personal de emergencia y dems intermediarios tengan rpi-
do acceso a la informacin.
Las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta deben traducirse usando procesos de traduccin de alta calidad. A
continuacin se proporciona un ejemplo de proceso de traduccin de alta calidad:
La traduccin es realizada por un traductor capacitado cuya lengua materna es el idioma de destino
La revisin de la traduccin es realizada por un segundo traductor capacitado quien resuelve cualquier diferencia con el
primer traductor
La revisin de la traduccin es revisada por un farmacutico cuya lengua materna es el idioma de destino quien resuelve
las diferencias con los traductores previos
Se prueba la comprensin con la audiencia a la que est destinada
Cuando no es posible contar con un proceso de traduccin de alta calidad, las etiquetas deben imprimirse en ingls y se de-
ben usar los servicios de un intrprete capacitado siempre que sea posible para asegurar la comprensin del paciente. El uso de
traducciones generadas por computadora debe limitarse a programas de calidad demostrada debido a que las instrucciones de
dosificacin pueden carecer de uniformidad y representar riesgos potenciales. La estandarizacin de las instrucciones traduci-
das y los avances tecnolgicos son necesarios para asegurar la exactitud y seguridad del etiquetado de los envases de medica-
mentos de venta bajo receta para pacientes con un dominio limitado del ingls.

Mejorar la Legibilidad

Las etiquetas deben contar con un diseo y formato que permita su fcil lectura. En la actualidad, no existe evidencia firme
que sustente la superioridad en cuanto a legibilidad de los tipos de letra serif frente a los tipos de letra sans serif, por lo que se
pueden usar tipos de letra no estrecha de cualquier tipo.
Se debe optimizar la tipografa usando las siguientes tcnicas:
Impresin en alto contraste (p.ej., impresin en negro sobre fondo blanco).
Tipos de letra familiares, simples y no estrechas con suficiente espacio dentro y entre caracteres (p.ej., Times Roman o
Aria!).
Uso de maysculas (es decir, siguiendo las reglas del ingls: primera letra en mayscula seguida de palabras en minscu-
las, con excepcin de nombres propios).
Tipo de letra grande (p.ej, Times Roman de mnimo 12 puntos o Arial de 11 puntos) para informacin crtica. Tomar en
cuenta que el tamao de punto no representa el tamao de letra real, por lo que 2 tipos de letra con el mismo tamao
nominal de punto pueden tener en realidad tamaos de letra distintos. La altura x, que es la altura de la x minscula del
tipo de letra, se ha utilizado como un indicador ms exacto del tamao aparente en lugar del tamao de punto. Por
USP 39 Aparatos/ (31) Aparatos Volumtricos 11 7

ejemplo, para un tamao de punto dado, la altura x y el tamao aparente de Arial son en realidad mayores que las de
Times Roman. No usar tipografa menor que Times Roman de 1 O puntos o el tamao de letra equivalente de otra fuente.
Los adultos de mayor edad, particularmente, tienen dificultades para leer impresiones pequeas.
Usar un espacio en blanco adecuado entre lneas de texto (25%-30% del tamao de punto).
Usar espacios en blanco para distinguir entre secciones de la etiqueta, tales como instrucciones de uso frente a informa-
cin de la farmacia.
Usar slo texto orientado horizontalmente.
Existen otras medidas que tambin pueden mejorar la legibilidad:
De ser posible, minimizar la necesidad de girar el envase para leer lneas de texto.
Nunca truncar o abreviar la informacin crtica.
El uso de resaltado, negrillas y otras marcas tipogrficas deben mantener la legibilidad (p.ej., impresin en alto contraste y
color claro para el resaltado) y deben enfatizar la informacin central para el paciente o aquella informacin que facilite el
seguimiento (p.ej., nmero de dispensaciones adicionales).
Limitar el nmero de colores usados para el resaltado (p.ej., no ms de uno o dos).
Usar renglones separados para distinguir los tiempos de dosificacin.
Tener en cuenta los impedimentos visuales:
Ofrecer un acceso alternativo para pacientes con impedimentos visuales (p.ej., sistemas tctiles, auditivos o visuales mejo-
rados que puedan emplear tecnologas de asistencia avanzadas).

Eliminar lo .siguiente:

. . (21). TERMMETROS

Los dispositivos para medir la temperatura adecuados para las pruebas de la Farmacopea deben ser rastreables y cumplir con
las especificaciones de las normas del NIST. Pueden ser de dos tipos: dispositivos de vidrio de columna lquida o dispositivos
con indicador de temperatura digital o analgico, como por ejemplo un dispositivo de resistencia, un termistor.o un termopar.
Los indicadores de temperatura analgicos o digitales constan de una sonda de temperatUra que contiene un sensor.La son-
da est conectada a un medidor que convierte la seal en ohmios o milivoltios en un lectura de temperatura. En este tipo de
indicadores, la parte de la sonda de temperatura que se sumerge en el medio para medr su temperatura est fabrh:;adj'il de un
material inerte. La calibracin de los indicadores de temperatura analgicos y digitales se realiza con un estndar de tempera-
tura rastreable a las normas NIST, con una frecuencia de ensayo predeterminada. Es sumamente importante seleccionar el dis-
positivo de medicin de temperatura segn las condiciones en las que se va a utilizar.
Los termmetros de vidrio de columna lquida pueden calibrarse por inmersin total, parcial o completa y, en la medida de
lo posible, cada termmetro se debera emplear segn las condiciones de inmersin en las que se calibr. L calibracin de los
termmetros se realiza segn una frecuencia predeterminada con un estndar de temperatura rastreable a las norrnas NIST.
Ver la versin vigente de la norma El de la ASTM (Asociacin Estadounidense de Ensayos y Materiales). La calibracin de los
termmetros de vidrio de columna lquida por inmersin total implica la inmersin del termmetro hasta el extremo superior
de la columna lquida dejando el resto de la columna y la cmara de expansin superior expuestas a la temperatura ambi.ente.
La calibracin de los termmetros por inmersin parcial implica la inmersin hasta la lnea de inmersin indicada en el frente
del termmetro dejando el resto de la columna expuesta a la temperatura ambiente. La calibracin por inmersin completa
implica la inmersin de todo el termmetro sin que quede ninguna parte de la columna expuesta a la temperatura ambiente.
Si se utilizan otras condiciones de inmersin, es necesario realizar una correccin por columna emergente a fin de obtener lec-
turas de temperatura correctas .... u5p39

(31) APARATOS VOLUMTRICOS

La mayora de los aparatos volumtricos disponibles en los Estados Unidos estn calibrados a 20, a pesar de que la tempera-
tura que predomina en general en los laboratorios se aproxima ms a los 25. Para minimizar el error volumtrico, la tempera-
tura debera ser la misma para los aparatos volumtricos, el material que se est preparando, los disolventes que se utilizan
para preparar las soluciones volumtricas, el rea en la cual se preparan y el ajuste de volumen final.
 118 (31) Aparatos Volumtricos/ Aparatos USP 39

uso
Para lograr el grado de precisin requerido en muchas valoraciones farmacopeicas que incluyen mediciones volumtricas e
indican que una cantidad sea "medida con exactitud", los aparatos deben elegirse y usarse con cuidado. El tamao de una
bureta debe ser tal que el volumen de la solucin volumtrica no represente menos del 30% del volumen nominal. Cuando se
deben medir menos de 1 O mL de solucin volumtrica, en general se requiere una bureta de 1O mL o una microbureta.

ESTNDARES DE EXACTITUD

Las tolerancias de capacidad para los matraces volumtricos, las pipetas de transferencia y las buretas son las mismas acepta-
das por el Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (National lnstitute of Standards and Technology) (Clase A), 1 segn se
indica en la Tabla 1, la Tabla 2 y la Tabla 3, respectivamente. [NOTA-Las tablas de este captulo listan las tolerancias para los
tamaos de uso ms comn. Para una lista completa de tolerancias y otros criterios aplicables, consultar las normas referidas
de la ASTM.] Usar aparatos volumtricos de Clase A a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.
Cuando se especifica un aparato volumtrico de plstico, las tolerancias de capacidad aceptadas son iguales a las del vidrio
Clase B. 2
Las tolerancias de capacidad para las pipetas de medicin (es decir, graduadas) de hasta 1O mL inclusive, son algo mayores
que las tolerancias para las pipetas de transferencia de los mismos tamaos, es decir, 1O L, 20 L y 30 L para las pipetas de 2
mL, 5 mL y 1O mL, respectivamente.
Las pipetas calibradas "para verter", graduadas y de transferencia, se deben escurrir en posicin vertical y luego apoyar las
puntas contra la pared del recipiente receptor para escurrirlas por completo. Las lecturas de volumen en las buretas deberan
estimarse con una exactitud de 0,01 mL para buretas de 25 mL y 50 mL, y con una exactitud de 0,005 mL para buretas de 5
mL y 1O ml. Las pipetas calibradas "para contener" se utilizan en casos especiales, generalmente para medir lquidos viscosos,
como jarabes; sin embargo, se puede usar un matraz volumtrico en lugar de una pipeta "para contener". En tales casos, la
pipeta o el matraz debera lavarse despus del vaciado y los lavados agregarse a la porcin medida.
Tabla 1. Matraces Volumtricos
Volumen nominal, mL 10 25 50 100 250 500 1000
Lmite de error, mL 0,02 0,03 0,05 0,08 0,12 0,20 0,30
Lmite de error, % 0,20 0,12 0,10 0,08 0,05 0,04 0,03

Tabla 2. Pipetas de Transferencia

Volumen nominal, mL 1 2 5 10 25 50 100
Lmite de error, mL 0,006 0,006 0,01 0,02 0,03 0,05 0,08
Lmite de error, % 0,60 0,30 0,20 0,20 0,12 0,10 0,08

Tabla 3. Buretas
Volumen nominal, mL 1 O (tipo "micro") 25 50
Subdivisiones, mL 0,02 0,1 0,1
Lmite de error, mL 0,02 0,03 0,05

(41 ) BALANZAS

Este captulo establece los requisitos para balanzas que se usan para materiales que deben ser pesados con exactitud (ver
Advertencias y Requisitos Generales, 8.20). A menos que se especifique algo diferente, cuando las sustancias deban ser "pesadas
con exactitud", la pesada se debe realizar usando una balanza que est calibrada dentro de su intervalo operativo y que cum-
pla con los requisitos de repetibilidad y exactitud definidos. Para balanzas que se usan en otras aplicaciones, su repetibilidad y
exactitud deben valorarse junto con los requisitos para su uso.
Con respecto a los principios tericos de estos requisitos, ver Pesada en una Balanza Analtica (1251 ), ya que puede ser una
fuente til, aunque no obligatoria.

REPETIBILIDAD

La repetibilidad se evala pesando una pesa de prueba no menos de 1O veces. [NOTA-La pesa de prueba debe estar dentro
del intervalo operativo de la balanza, pero no es necesario que la pesa est calibrada. Debido a que, dentro de la capacidad de

1 Ver ASTM 288-06, ASTM E287-02, ASTM El 189-00 y ASTM E969-02.

2 Ver ASTM E 288 y Estndar ISO 384.
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 119

la balanza la desviacin estndar es prcticamente independiente de la masa de muestra, no se requiere usar un peso de prue-
ba pequeo, ya que ste podra resultar difcil de manejar.]
La repetibilidad es satisfactoria si el doble de la desviacin estndar del valor pesado dividido por el peso neto ms pequeo
deseado (es decir, el peso neto ms pequeo que Jos usuarios planean usar en esa balanza) no excede de 0, 10%. Si la desvia-
cin estndar obtenida es menos de 0,41 d, donde des el menor intervalo de la escala, reemplazar la desviacin estndar con
0,41 d. En este caso, la repetibilidad es satisfactoria si 2 x 0,41 d, dividido por el peso neto ms pequeo deseado, no excede de
0,10%.

EXACTITUD

La exactitud de una balanza es satisfactoria si su valor de pesada, cuando se prueba con pesas adecuadas, est dentro del
0, 10% del valor del peso de prueba.
Una pesa de prueba es adecuada cuando tiene una masa entre 5% y 100% de la capacidad de la balanza. El error mximo
permisible de la pesa de prueba (emp), o alternativamente, la incertidumbre en la calibracin de la pesa no debe ser ms de
un tercio del lmite de exactitud para Ja prueba. [NOTA-Las siguientes normas son aplicables: ASTM E617 (disponible en
http://www.astm.org) y OIML R 111 (disponible en http://www.oiml.org).]

Pruebas Microbiolgicas

(51) PRUEBAS DE EFICACIAANTIMICROBIANA

INTRODUCCIN

Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a productos farmacuticos acuosos. Las formas farmacuticas no
estriles pueden tener conservantes agregados para protegerlas del desarrollo de microorganismos introducidos inadvertida-
mente durante o despus del proceso de fabricacin. En el caso de artculos estriles envasados en envases multidosis, los con-
servantes antimicrobianos se agregan para inhibir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la extraccin
reiterada de dosis individuales. En todas las unidades multidosis estriles se espera encontrar uno o ms conservantes antimi-
crobianos.
Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas prcticas de fabricacin, solamente para redu-
cir la poblacin microbiana viable de un producto no estril, o para controlar la biocarga antes de la esterilizacin de formula-
ciones multidosis durante la fabricacin. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacuticas farmacopeicas cumplen
con los requisitos en 5.20 Sustancias Agregadas de las Advertencias y Requisitos Generales.
Todos los agentes antimicrobianos tiles son sustancias txicas. Para la mxima proteccin de los pacientes, la concentra-
cin del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar
txico para los seres humanos, basndose en la dosis recomendada del producto medicinal.
La concentracin de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al mnimo si los ingredientes activos de la
formulacin poseen actividad antimicrobiana intrnseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida
por la adicin de un conservante antimicrobiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones envasadas en envases multi-
dosis o para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada
para formas farmacuticas de base acuosa, multidosis tpicas y orales, y para otras formas farmacuticas, como por ejemplo
oftlmicas, ticas, nasales, de irrigacin y lquidos de dilisis (ver Formas Farmacuticas (1151 )). Para los propsitos de la prue-
ba, "acuoso" se define como una actividad de agua de ms de 0,6 (ver Determinacin de Actividad de Agua en Productos Farma-
cuticos No Estriles (1112)).
Los organismos de desafo se basan generalmente en los posibles contaminantes del producto farmacutico, teniendo en
cuenta los atributos fsicos, Ja formulacin y el uso previsto del mismo. La serie de organismos de desafo estndar descrita en
esta prueba no necesita prevenir la inclusin de otras especies, si se considera til para medir la actividad biolgica de los con-
servantes de un producto especfico. Estos organismos de desafo suplementarios no se discuten en este captulo, pero se pue-
den aadir a los organismos de prueba descritos.
 120 (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana /Pruebas Microbiolgicas USP 39

PROCEDIMIENTOS GENERALES

Este captulo proporciona procedimientos para demostrar la eficacia de conservantes antimicrobianos agregados. Estos con-
servantes antimicrobianos deben estar declarados en la etiqueta. Los procedimientos y los criterios de aceptacin para la efica-
cia se aplican a un producto en el envase original sellado en el que fue distribuido por el fabricante (ver la Tabla 7 para catego-
ras de productos). Esta prueba no tiene que realizarse en estos envases, pero se debe evitar el uso de materiales que puedan
interaccionar con el conservante en los envases que se usan para la prueba de eficacia microbiana.

Procedimiento de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuperacin

CONSIDERACIONES GENERALES

Debe establecerse la capacidad del procedimiento para detectar microorganismos de desafo en presencia de un producto a
examinar adecuadamente neutralizado. La aptitud del procedimiento debe volver a confirmarse si se produce algn cambio en
los materiales o mtodos, el producto o los materiales que estn en contacto directo con el producto y que pueda alterar los
resultados de la prueba.
Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este procedimiento.

PREPARACIN DE CEPAS DE PRUEBA

Usar suspensiones estandarizadas de cepas de prueba o preparar segn se indica a continuacin. Las tcnicas de manteni-
miento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar por separado
cada cepa bacteriana y fngica de prueba (ver la Tabla 2).
Usar los cultivos de los siguientes microorganismos: 1 Candida albicans (ATCC N 10231 ), Aspergillus brasiliensis (ATCC N
16404), Escherichia coli (ATCC N 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC N 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC N 6538).
Los microorganismos viables empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p.ej.,
en fase logartmica de crecimiento) a excepcin de las esporas A. brasiliensis. Se describen las condiciones de cultivo para el
inculo (ver la Tabla 2) donde los medios adecuados son el Agar Digerido de Casena y Soja o Medio de Agar Sabouraud Dex-
trosa.
Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solucin salina SR estril, lavar la superficie de crecimiento y
recogerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solucin salina SR estril que contenga
0,05% de polisorbato 80. La suspensin de esporas debe tratarse aspticamente (p.ej., filtracin a travs de lana de vidrio est-
ril) para eliminar hitas. Todas las suspensiones microbianas deben prepararse para garantizar que no se produce un traslado de
medio de crecimiento residual del inculo (p.ej., centrifugacin seguida de resuspensin en un lquido de suspensin estril
apropiado).
Como alternativa, los organismos del cultivo madre pueden crecer en un medio lquido adecuado (es decir, Caldo Digerido
de Casena y Soja o Caldo Sabouraud Dextrosa) y las clulas se pueden cosechar mediante centrifugacin, luego lavar y resus-
pender en lquido de suspensin estril apropiado. Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustar-
se para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 108 ufc/mL. Usar las suspensiones bacterianas y de levaduras
dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas, si se almacenan entre 2 y 8. Se puede preparar una suspensin de esporas
estable y mantenerla a 2-8 hasta 7 das. [NOTE-El clculo estimado de la concentracin del inculo se puede obtener me-
diante procedimientos turbidimtricos para los microorganismos de desafo y luego confirmarse mediante un recuento en pla-
ca.]

PROMOCIN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS

Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento microbiano. Analizar cada partida de
medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes descritos.
Para medios slidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor calculado para un inculo estandarizado.
Para un inculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anterior-
mente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.

Aptitud del Mtodo de Recuento en Presencia del Producto

Preparar una dilucin 10-1 (en volumen) agregando 1 mL del producto a 9 mL de solucin salina u otro diluyente neutrali-
zante. Continuar este patrn de dilucin hasta niveles de dilucin 10-2 y 1 Q-3. Agregar un nmero apropiado de organismos
de desafo a cada tubo de producto diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen adecuado de cada dilucin para obtener

1 Disponible en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 121

menos de 250 ufc/placa para bacterias y levaduras (idealmente entre 25 y 250 ufc) o menos de 80 ufc/placa para A. brasiliensis
(idealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en placa debe realizarse como mnimo por duplicado (aunque un nmero mayor
de repeticiones puede ser til para minimizar la variabilidad en la estimacin del recuento en placa). Se realiza un control posi-
tivo de este procedimiento al introducir los mismos inculos en solucin salina y transferir volmenes similares de solucin sali-
na a placas de agar. Un patrn de recuperacin adecuado es aqul que proporciona al menos 50% del recuento de esta solu-
cin salina de control (promediado).
Si el producto diluido presenta propiedades antimicrobianas, quizs deban incorporarse neutralizadores especficos a los di-
luyentes o a los medios de recuperacin. Para ms informacin, ver Validacin de Recuperacin Microbiana en Artculos Farmaco-
peicos (1227).
La capacidad del procedimiento para medir la eficacia de los conservantes puede verse comprometida si la aptitud del mto-
do requiere una dilucin significativa (10- 2 1Q-3), ya que esto afectar la recuperacin medida (p.ej., puede ser difcil medir
una reduccin logartmica de 3 unidades para un inculo de 1Q5-106 ). Si no se encuentra un agente neutralizador o mtodo
adecuado y la aptitud del mtodo requiere una dilucin significativa, se puede usar un nivel ms alto de inculo (p.ej., 107-
108 ) de manera que se pueda medir una reduccin logartmica de 3 unidades. El promedio de la recuperacin informada no
puede ser menos de 1 ufc/placa (o 100 ufc/mL si se realiza el recuento en placa de 1 mL por duplicado a una dilucin de
1 Q-2).
La filtracin por membrana se puede usar para filtrar volmenes ms grandes de diluciones para contrarrestar esta dificultad
o para asistir en la neutralizacin de las propiedades antimicrobianas.

Anlisis del Producto

CATEGORAS DE PRODUCTOS

Para los fines de anlisis, los artculos farmacopeicos se dividen en cuatro categoras (ver la Tabla 7). Los criterios de eficacia
antimicrobiana para estos productos se establecen en funcin de la ruta de administracin. Es de esperar que las formulaciones
que contienen conservantes cumplan con los estndares mnimos de eficacia, si estn envasados en envases multidosis o en
envases unitarios.
Tabla 1. Categoras de Productos Farmacopeicos
Categora Descripcin del Producto
Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos ticos, productos nasales estriles y productos
1 oftlmicos preparados con bases o vehculos acuosos
Productos empleados de manera tpica preparados con bases o vehculos acuosos, productos nasales no estri-
2 les y emulsiones, incluyendo aqullos que se aplican a membranas mucosas
3 Productos orales a excepcin de anticidos, preparados con bases o vehculos acuosos
4 Anticidos preparados con una base acuosa

PROCEDIMIENTO

El procedimiento puede realizarse ya sea en cinco envases originales, si hay suficiente volumen de producto disponible en
cada envase y si el envase del producto puede ser penetrado aspticamente (es decir, aguja y jeringa a travs de un tapn de
goma elastomrico), o en cinco recipientes bacteriolgicos estriles con tapa [inerte con respecto a los agentes antimicrobia-
nos] de tamao adecuado a los que se ha transferido un volumen suficiente de producto. Inocular cada envase o recipiente,
segn corresponda, con uno de los inculos preparados y normalizados, y mezclar. El volumen de suspensin del inculo em-
pleado est entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. La concentra-
cin de microorganismos de prueba agregados al producto (Categora 7; 2 3) es tal que la concentracin final de la prepara-
cin de prueba despus de la inoculacin est comprendida entre 1 x 105 y 1 x 106 ufc/mL del producto. En los productos de
la Categora 4 (anticidos), la concentracin final de la preparacin de prueba despus de la inoculacin est comprendida en-
tre 1 x 1Q3y1 x 104 ufc/mL del producto.
La concentracin inicial de microorganismos viables en cada preparacin de prueba se calcula a partir de la concentracin
de microorganismos en cada inculo normalizado determinada mediante el mtodo de recuento en placa. Incubar los envases
o recipientes inoculados a 22,5 2,5. Tomar muestras de cada uno de ellos en los intervalos apropiados (especificados en la
Tabla 3). Registrar todos los cambios de apariencia observados en estos intervalos. Determinar mediante el procedimiento de
recuento en placa el nmero de ufc presentes en cada preparacin de prueba en los intervalos correspondientes (ver Procedi-
mientos Generales en Pruebas de Recuento Microbiano (61 )). El recuento en placa se realizar usando un mnimo de placas por
duplicado, con el nmero de ufc promediado antes de la determinacin de ufc/mL deducido. Si se usa filtracin por membra-
na, usar filtros de membrana por duplicado para cada estimacin. Usando las concentraciones calculadas de ufc/mL presentes
al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores log 10 de la concentracin de ufc/mL para cada microorganismo en los in-
tervalos de prueba aplicables, y expresar los cambios en la concentracin en trminos de reducciones logartmicas. La reduc-
cin logartmica se define como la diferencia entre el valor de la concentracin inicial de ufc/mL en la suspensin, en unidades
logw y el valor de ufc/mL, en unidades log 10, de los sobrevivientes al tiempo correspondiente.
122 (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana / Pruebas Microbiolgicas USP 39

Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparacin de lnculos

Tiempo de
Tiempo Incubacin de
Temperatura de Incubacin Recuperacin
Organismo Medio Apropiado de Incubacin del lnculo Microbiana
Caldo Digerido de Casena y
Soja;
Escherichia coli Agar Digerido de Casena y
(ATCC N 8739) Soja 32,5 2,5 18-24 horas 3-5 das
Caldo Digerido de Casena y
Soja;
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Casena y
(ATCC N 9027) Soja 32,5 2,5 18-24 horas 3-5 das
Caldo Digerido de Casena y
Soja;
Staphylococcus aureus Agar Digerido de Casena y
(ATCC N 6538) Soja 32,5 2,5 18-24 horas 3-5 das
Medio de Agar Sabouraud
Candida albicans Dextrosa;
(ATCC N 10231) Caldo Sabouraud Dextrosa 22,5 2,5 44-52 horas 3-5 das
Aspergillus brasiliens Agar Sabouraud Dextrosa;
(ATCC N 16404) Caldo Sabouraud Dextrosa 22,5 2,5 6-10 das 3-7 das

Criterios de Eficacia Antimicrobiana

Los requisitos de eficacia antimicrobiana se alcanzan si se cumplen los criterios especificados en la Tabla 3 (ver Resultados de
Pruebas en Advertencias Generales). La expresin "ningn incremento" en los recuentos se define como no ms de 0,5 unida-
des log 10 por encima del valor con el que se compara.
Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados
En productos de la Categora 1
A los 7 das, una reduccin logartmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial cal-
culada; a los 14 das, una reduccin logartmica de no menos de 3,0 del recuento ini-
Bacterias cial; y a los 28 das ningn incremento con respecto al recuento de los 14 das.
Levaduras y Hongos Ningn incremento a los 7, 14 y 28 das con respecto al recuento inicial
Filamentosos
En productos de la Categora 2
A los 14 das, una reduccin logartmica de no menos de 2,0 desde el recuento inicial; y
Bacterias a los 28 das ningn incremento con respecto al recuento de los 14 das
Levaduras y Hongos Ningn incremento a los 14 y 28 das con respecto al recuento inicial
Filamentosos
En productos de la Categora 3
A los 14 das, una reduccin logartmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial; y
Bacterias a los 28 das ningn incremento con respecto al recuento de los 14 das
Levaduras y Hongos Ningn incremento a los 14 y 28 das con respecto al recuento inicial
Filamentosos
En productos de la Categora 4
Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos Ninqn incremento a los 14 y 28 das con respecto al recuento inicial

(55) INDICADORES BIOLGICOS-PRUEBAS DE RESISTENCIA

RECUENTO TOTAL DE ESPORAS VIABLES

Para indicadores biolgicos en portador de papel, retirar tres muestras del indicador biolgico pertinente de sus envases in-
dividuales originales. Desmenuzar el papel hasta reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba en
un vaso estril de 250 mL de un mezclador adecuado que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada, y mez-
clando durante el tiempo que se considere adecuado para obtener una suspensin homognea. No es inusual que se requie-
ran tiempos de mezclado de 15 minutos o ms para obtener una recuperacin ptima. Transferir a un tubo estril de 16 mm x
125 mm con tapa de rosca una alcuota de 1O mL de la suspensin. Si se trata de un Indicador Biolgico para Esterilizacin por
Vapor, Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la suspensin en un bao de agua de 95 a 100 durante 15 minutos
USP 39 PruebGs Microbiolgicas/ (55) Indicadores Biolgicos 123

(choque trmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza los 95. Si se trata de un Indicador Biolgico
para Esterilizacin por Calor Seco, Portador de Papel y de un Indicador Biolgico para Esterilizacin con xido de Etileno, Portador de
Papel, calentar el tubo que contiene la suspensin en un bao de agua de 80 a 85 durante 1 O minutos, comenzando a medir
el tiempo cuando la temperatura de la suspensin de esporas alcance los 80. Enfriar rpidamente en un bao de hielo-agua
de O a 4. Transferir a tubos adecuados dos alcuotas de 1 mL y hacer diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada estril;
las diluciones se seleccionan por medio de clculos de manera que se obtengan preferentemente entre 30 y 300 colonias, pero
no menos de 6, en cada una de las placas del par cuando se tratan segn se describe a continuacin. Cuando el indicador
biolgico tiene una concentracin baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar ms placas en
cada dilucin. Preparar una serie independiente de placas para cada alcuota. Colocar 1,0 mL de cada dilucin seleccionada en
cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de
Medio Agar con Digerido de Casena y Soja que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45 y 50. Agitar por rota-
cin suave para obtener una suspensin homognea y dejar solidificar. Incubar las placas en posicin invertida a una tempera-
tura entre 55 y 60 para el Indicador Biolgico para Esterilizacin por Vapor, Portador de Papel, y a una temperatura entre 30 y
35 para el Indicador Biolgico para Esterilizacin con xido de Etileno, Portador de Papel y para el Indicador Biolgico para Esterili-
zacin por Calor Seco, Portador de Papel, o a la temperatura de recuperacin ptima especificada por el fabricante. Examinar las
placas despus de transcurridas 24 y 48 horas, registrando el nmero de colonias para cada placa, y usar el nmero de colo-
nias observado despus de 48 horas para calcular los resultados. Calcular el nmero promedio de esporas por muestra a partir
de los resultados, usando el factor de dilucin apropiado. La prueba es vlida si el logaritmo del nmero de esporas por porta-
dor a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del nmero despus de 24 horas en cada caso. Para Indicador Biolgico
para Esterilizacin por Vapor, Autocontenido, extraer aspticamente los tres portadores del envase y proceder segn se indica en
Indicador Biolgico para Esterilizacin por Vapor, Portador de Papel.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, retirar asp-
ticamente los tres portadores de su empaque o envase original. Colocar cada portador en un recipiente estril apropiado que
contenga 100 mL de Agua Purificada enfriada y someter a ultrasonido o agitar en un agitador de vaivn durante un tiempo
apropiado. Para una recuperacin ptima se pueden requerir 15 minutos o ms. Se debe llevar a cabo un estudio previo que
garantice que el mtodo de recuperacin produzca como resultado una recuperacin de por lo menos 50% a 300% del re-
cuento viable de esporas declarado. Transferir a un tubo estril de 16 mm x 125 mm con tapa de rosca una alcuota de 1O mL
de la suspensin. Calentar los tubos que contienen suspensiones de Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis y Bacillus coagulans en-
tre 80 y 85 durante 1 O minutos. Calentar los tubos que contienen una suspensin de Geobacillus stearothermophilus entre 95
y 100 durante 15 minutos. Comenzar a medir el tiempo cuando se alcance la temperatura ms baja de los intervalos indica-
dos. Enfriar rpidamente en un bao de hielo-agua de O a 4. Transferir dos alcuotas de 1 mL a tubos adecuados y hacer
diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada. Las diluciones seleccionadas deben ser aquellas que preferiblemente rindan
entre 30 y 300 colonias, pero no menos de 6, en cada par de placas cuando se traten segn se describe a continuacin. Cuan-
do el indicador biolgico tiene una concentracin baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar
ms placas en cada dilucin. Preparar una serie independiente de placas para cada alcuota. Colocar 1,0 mL de cada dilucin
seleccionada en cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar la alcuota
a cada placa conteniendo 20 mL de agar que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45 y 50. Agitar por rota-
cin suave para obtener una suspensin homognea.
Para G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans, usar Medio de Agar Digerido de Casena y Soja, e incubar
las placas aerbicamente en posicin invertida a las siguientes temperaturas respectivas para cada microorganismo: de 55 a
60, de 30 a 35 y de 48 a 52, o a la temperatura ptima especificada por el fabricante del indicador biolgico. Examinar las
placas despus de transcurridas 24 y 48 horas. Registrar el nmero de colonias observado en cada placa. Calcular el nmero
promedio de esporas por portador a partir de los resultados, usando el factor de dilucin apropiado. La prueba es vlida si el
logaritmo del nmero de esporas por portador a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del nmero despus de 24
horas en cada caso.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Lquidas de Esporas, usando
G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans como indicadores biolgicos, preparar una dilucin seriada apro-
piada de la suspensin original de esporas en Agua Purificada enfriada contenida en un tubo estril de 16 mm x 125 mm con
tapa de rosca y efectuar los procedimientos de recuentos de esporas viables especificados en Indicadores Biolgicos para Esterili-
zacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel.

DETERMINACIN DEL VALOR D

Efectuar todas las pruebas descritas en esta seccin bajo condiciones aspticas, usando equipo estril para microorganismos
no termoflicos. La determinacin del Valor D para G. stearothermophilus y B. coagulans se puede realizar en un ambiente con-
trolado pero no clasificado.

Aparatos
El equipo de prueba para la determinacin de la resistencia microbiana se describe en detalle en la norma ISO 18472, Sterili-
zation of Hea/th Care Products-Biologica/ and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilizacin de Productos para el Cuidado de
124 (55) Indicadores Biolgicos / Pruebas Microbiolgicas USP 39

la Salud-Indicadores Biolgicos y Qumicos-Equipo de Prueba). 1 Los detalles de los Resistmetros para Evaluacin de Indicado-
res Biolgicos (BIER, por sus siglas en ingls) individuales varan segn su diseo y el proceso de esterilizacin particular con el
que se usan conjuntamente. Siempre y cuando el desempeo del BIER cumpla con los requisitos de la norma ISO para exposi-
cin del indicador biolgico, se aceptan diferencias en el diseo.

Procedimiento

Realizar las pruebas del valor D para cada set de condiciones de esterilizacin aplicable segn indique la etiqueta del indica-
dor biolgico envasado en anlisis. Tomar un nmero suficiente de grupos de muestras de indicadores biolgicos en sus enva-
ses individuales originales, constando cada grupo de no menos de 5 muestras. El nmero de grupos proporciona un intervalo
de observaciones desde no menos de un valor D declarado por debajo del tiempo de supervivencia declarado, hasta no menos
de un valor D declarado por encima del tiempo de muerte declarado. Colocar cada grupo en portamuestras separados ade-
cuados que permitan exponer cada muestra a la condicin de esterilizacin indicada en una ubicacin especfica en la cmara
de esterilizacin del BIER. Controlar los parmetros de funcionamiento del aparato BIER, usando portamuestras sin muestras.
Seleccionar una serie de tiempos de esterilizacin en incrementos a partir del menor tiempo para las muestras a analizar. Las
diferencias en los tiempos de esterilizacin a lo largo de las series son tan constantes como sea posible y la diferencia entre los
tiempos adyacentes no es mayor de 75% del valor D declarado.
Los procedimientos de prueba para el uso de resistmetros BIER en la evaluacin de la resistencia microbiana se definen en
una serie de normas ISO bajo la serie 11138.2, 3, 4, s Se debe seguir la norma apropiada para el indicador biolgico. Los mtodos
de prueba y los portadores usados con el BIER se pueden adaptar a las caractersticas especficas del indicador biolgico. El
mtodo y aparatos usados para portadores de papel pueden diferir de los de otros portadores y sern sustancialmente diferen-
tes de los usados para suspensiones de indicadores biolgicos.
Las condiciones de exposicin para el valor D de portadores de materiales alternativos son iguales a las condiciones usadas
para determinar el valor D de portadores de papel. Si la etiqueta del fabricante permite el uso del portador de indicador biol-
gico con mltiples mtodos de esterilizacin, entonces los datos sobre el valor D, tiempo de supervivencia y tiempo de muerte
tendrn que ser proporcionados por el fabricante para cada mtodo de esterilizacin. Es posible que los indicadores biolgicos
inoculados en portadores distintos de los de papel se usen para mtodos de esterilizacin y descontaminacin por gas o vapor
tales como dixido de cloro y perxido de hidrgeno en fase de vapor.
Las condiciones fsicas estndar para la evaluacin de indicadores biolgicos para uso con dixido de cloro o perxido de
hidrgeno en fase de vapor no han sido definidos. En el caso de dixido de cloro, la concentracin del gas, la humedad relati-
va y la temperatura son condiciones crticas del control del proceso que se pueden medir con exactitud. El fabricante de los
indicadores biolgicos comercializados para uso con dixido de cloro debera declarar las condiciones bajo las cuales se llev a
cabo la determinacin del valor D en forma tal que el usuario pueda, cuando menos, discernir la resistencia de un lote de
indicadores biolgicos en comparacin con sus propias condiciones de uso anticipadas. La situacin con el perxido de hidr-
geno en fase de vapor es ms compleja. Diversos fabricantes de equipos han propuesto diferentes condiciones de descontami-
nacin o esterilizacin. Por esa razn, no existe un proceso estndar para efectuar la descontaminacin o esterilizacin de su-
perficie con perxido de hidrgeno en fase de vapor. Como consecuencia, no existen mtodos industriales estndar de evalua-
cin de indicadores biolgicos para perxido de hidrgeno en fase de vapor y se ha informado que podra no haber una corre-
lacin directa entre la concentracin de vapor y la velocidad o incluso la eficacia de inactivacin del indicador biolgico. Adi-
cionalmente, resulta difcil evaluar con exactitud la humedad relativa, que a menudo se define como un parmetro crtico para
el proceso, en presencia de perxido de hidrgeno en forma de vapor. Por estas razones es preferible considerar la resistencia
de los indicadores biolgicos como una medida relativa o comparativa del fabricante, ms que como un verdadero valor D.
Por lo tanto, dependiendo del equipo y de los procesos empleados, podra ser imposible para un usuario final duplicar las
pruebas de resistencia del indicador biolgico efectuadas por el fabricante.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Lquidas de Esporas efectuar
las determinaciones del valor D para cada uno de los microorganismos que se proporcionan como una suspensin lquida de

1 ANSl/AAMl/ISO 18472:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilizacin de Productos para el Cuida-
do de la Salud-Indicadores Biolgicos y Qumicos-Equipo de Prueba). Association far the Advancement of Medica( lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road,
Suite 220, Arlington, VA 22201-4795
2 ANSl/AAMl/ISO 11138-1 :2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 1: General requirements, 2nd ed. (Esterilizacin de Productos de
Salud-Indicadores Biolgicos-Parte 7: Requisitos generales, 2 ED.). Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Sui-
te 220, Arlington, VA.
3 ANSl/AAMl/ISO 11138-2:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 2: Biological lndicators far Ethylene Oxide Sterilization Proces-
ses, 3rd ed. (Esterilizacin de Productos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biolgicos-Parte 2: Indicadores Biolgicos para Procesos de Esterilizacin con xido de
Etileno, 3 Ed.) Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
4 ANSl/AAMl/ISO 11138-3:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 3: Biological lndicators far Moist Heat Sterilization Processes.
(Esterilizacin de Productos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biolgicos-Parte 3: Indicadores Biolgicos para Procesos de Esterilizacin por Calor Hmedo.) Asso-
ciation far the Advancement of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
5 ANSl/AAMl/ISO 11138-4:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 4: Biological lndicators far Dry Heat Sterilization Processes.
(Esterilizacin de Productos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biolgicos-Parte 4: Indicadores Biolgicos para Procesos de Esterilizacin por Calor Seco.) Associa-
tion far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 ON. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
 USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (55) Indicadores Biolgicos 125

esporas. La prueba se efecta usando diluciones seriadas apropiadas basadas en el ttulo declarado de esporas de la suspensin
en Agua Purificada en un tubo estril.
Cuando la suspensin se coloca sobre o en un sustrato como un tapn elastomrico o un producto formulado, su resistencia
puede diferir de la determinada en Agua Purificada. La diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores biolgicos y
las medidas apropiadas hechas antes del uso en actividades de validacin de la esterilizacin.

Recuperacin

Despus de completar el procedimiento de esterilizacin para el Indicador Biolgico para Esterilizacin por Calor Seco, Portador
de Papel, el Indicador Biolgico para Esterilizacin con xido de Etileno, Portador de Papel o el Indicador Biolgico para Esterilizacin
por Vapor, Portador de Papel, segn corresponda y dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas, retirar asptica-
mente cada tira y agregarla a un medio apropiado (ver Medios en Pruebas de Esterilidad (71 >) para sumergir el indicador biol-
gico por completo en un tubo adecuado. Para cada muestra del Indicador Biolgico para Esterilizacin por Vapor, Autocontenido,
se sumerge la tira de papel en el medio autocontenido segn las instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo determina-
do no mayor de 4 horas. Incubar cada tubo a la temperatura ptima de recuperacin especificada por el fabricante. Observar
cada tubo con medio inoculado a intervalos apropiados durante un total de 7 das despus de la inoculacin. (Cuando se ob-
serva crecimiento en cualquier momento de la observacin en particular, se puede suspender la incubacin de dicha muestra.)
Tomar nota del nmero de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en ningn momento.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, la recupera-
cin de esporas de los portadores de indicador biolgico seguir los procedimientos de recuperacin descritos en Recuento To-
tal de Esporas Viables. Los mtodos de determinacin del valor D para indicadores biolgicos en portador de papel se pueden
usar para calcular el valor D de portadores diferentes al papel. Las condiciones de incubacin para los microorganismos que se
pueden usar para indicadores biolgicos en portadores diferentes al papel se describen en la seccin Recuento Total de Esporas
Viables.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Lquidas de Esporas, los mto-
dos de recuperacin despus de la exposicin a las condiciones de esterilizacin son aquellos descritos en la seccin Recuento
Total de Esporas Viables para suspensiones lquidas y cuando se hace una determinacin del valor D por calor seco a partir de
suspensiones de B. atrophaeus, se siguen los mismos procedimientos de recuperacin descritos en Indicador Biolgico para Este-
rilizacin por Vapor, Portador de Papel.
Cuando se usa C. sporogenes como indicador biolgico, los mtodos para la preparacin e inoculacin, as como los mto-
dos y medios de recuperacin, deben adaptarse al uso de este formador de esporas anaerbico.

Clculos

La determinacin de los valores D de los indicadores biolgicos se puede efectuar usando el Mtodo de Spearman-Karber
Limitado, el Mtodo de la Curva de Supervivencia o los procedimientos de Stumbo-Murphy-Cochran. 6, 7, 8 Para determinar los
valores D, es preferible usar el mismo mtodo definido por el fabricante del indicador biolgico. El uso de un mtodo distinto
puede producir diferencias que son ms un artefacto del mtodo que una variacin en el desempeo del indicador biolgico.

Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte

Tomar dos grupos, cada uno integrado por 1O muestras del indicador biolgico pertinente, en sus envases individuales origi-
nales. Colocar las muestras de un grupo en un portamuestras adecuado que permita exponer cada muestra a las condiciones
de esterilizacin en una ubicacin especfica en la cmara BIER.
Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido, ingresar a la cmara y retirar los portamuestras con las
1O muestras. Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcurri un tiempo sustancial, para some-
ter el segundo portamuestras con 1O muestras a condiciones similares a las primeras pero durante el tiempo de muerte reque-
rido.
El Tiempo de supervivencia y el tiempo de muerte para todos los indicadores biolgicos con monografias se describe en la co-
rrespondiente monografa oficial bajo el encabezamiento de cada uno.

6 Pflug, 1.J. Syllabus far an lntroductory Course in the Microbiology and Engineering of Sterilization Processes, 4th ed. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services,
1980.
7 Pflug, 1.J., and G.M. Smith. The Use of Biological lndicators for Monitoring Wet-Heat Sterilization Processes, in Sterilization of Medica/ Products, ed. E.R.L. Gaugh-
ran and K. Kereluk. New Brunswick, NJ: Johnson and Johnson, 1977, 193-230.
8 Holcomb, R.G., and 1.J. Pflug. The Spearman-Karber Method of Analyzing Quantal Assay Microbial Destruction Data, in Microbiology and Engineering Sterilization
Processes, ed. 1.J. Pflug. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services, 1979.
126 (61) Examen Microbiolgico / Pruebas Microbiolgicas USP 39

(61) EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

ESTRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO

INTRODUCCIN
Las pruebas que se describen en este captulo permitirn el recuento cuantitativo de bacterias mesfilas y hongos que pue-
den desarrollarse en condiciones aerbicas.
Las pruebas han sido diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin cumple con una especifica-
cin establecida de calidad microbiolgica. Si se emplean con tales propsitos, seguir las instrucciones que se indican a conti-
nuacin, incluyendo el nmero de muestras a tomar, e interpretar los resultados segn se indica ms abajo.
Los mtodos no son aplicables a productos que contengan microorganismos viables como ingredientes activos.
Pueden utilizarse procedimientos microbiolgicos alternativos, incluidos los mtodos automatizados, siempre que se haya
demostrado su equivalencia con el mtodo Farmacopeico.

PROCEDIMIENTOS GENERALES
Realizar la determinacin en condiciones diseadas para evitar la contaminacin microbiana extrnseca del producto a exa-
minar. Las precauciones a tomar para evitar la contaminacin deben ser tales que no afecten a ningn microorganismo que
deba detectarse en la prueba.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, sta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible. Si
se usan inactivadores para este fin, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos.
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparacin de la muestra, se debe demostrar la ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado.

MTODOS DE RECUENTO
Usar, segn se indica, el mtodo de Filtracin por Membrana o uno de los Mtodos de Recuento en Placa. El Mtodo del Nme-
ro Ms Probable (NMP) es generalmente el mtodo de recuento microbiano menos exacto; sin embargo, para algunos grupos
de productos con biocarga muy baja, puede resultar el mtodo ms apropiado.
La eleccin de un mtodo se basa en factores tales como la naturaleza del producto y el lmite de microorganismos requeri-
do. El mtodo seleccionado debe permitir el anlisis de un tamao de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la
especificacin. Se debe establecer la aptitud del mtodo seleccionado.

PRUEBA DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO, APTITUD DEL MTODO DE RECUENTO Y

CONTROLES NEGATIVOS
Consideraciones Generales

Se debe establecer la aptitud de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar.
Se debe confirmar la aptitud si se introduce un cambio en la realizacin de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados del anlisis.

Preparacin de Cepas de Prueba

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o preparar segn se indica ms abajo. Las tcnicas de mante-
nimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar, por separado,
cada cepa bacteriana y fngica de prueba segn se indica en la Tabla 1.
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (61) Examen Microbiolgico 127

Tabla 1. Preparacin y Uso de Microorganismos de Prueba

Aptitud del Mtodo de Recuento en
Promocin del Crecimiento Presencia del Producto
Recuento Total Recuento To-
Recuento Total de de Hongos Fiia- Recuento Total de tal de Hongos
Preparacin de Ce- Microorganismos Ae- mentosos y Le- Microorganismos Fiiamentosos y
Microorganismo pas de Prueba roblos vaduras Aerobios Levaduras
Staphylococcus aureus por Agar Digerido de Case- Agar Digerido de Casena Agar Digerido de Case-
ejemplo ATCC 6538, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 9518, CIP 4.83 o gerido de Casena y de Casena y Soja $ 100 Digerido de Casena y
NBRC 13276 Soja 30-35 ufc Soja s 100 ufc
18-24 horas 30-35 s 3 das 30-35 s 3 das
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Case- Agar Digerido de Casena Agar Digerido de Case-
por ejemplo ATCC 9027, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 8626, CIP 82.118 gerido de Casena y de Casena y Soja s 100 Digerido de Casena y
o NBRC 13275 Soja 30-35 ufc Soja s 100 ufc
18-24 horas 30-35 s 3 das 30-35 s 3 das
Bacillus subtilis por ejem- Agar Digerido de Case- Agar Digerido de Casena Agar Digerido de Case-
plo ATCC 6633, NCIMB na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
8054, CIP 52.62 o NBRC gerido de Casena y de Casena y Soja s 100 Digerido de Casena y
3134 Soja 30-35 ufc Soja s 100 ufc
18-24 horas 30-35 s 3 das 30-35 s 3 das
Candida a/bicans por ejem- Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Casena Agar Sabouraud Agar Digerido de Case- Agar Sabouraud
ploATCC 10231, NCPF sa o Caldo Sabouraud y Soja S 100 ufc Dextrosa s 100 na y Soja $ 1 00 ufc Dextrosa s 100
3179, IP 48.72 o NBRC Dextrosa 20-25 2-3 30-35 s 5 das ufc 20-25 s 5 30-35 s 5 das NMP: ufc 20-25 s 5
1594 das das no aplica das
Aspergillus brasi/iensis por Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Casena Agar Sabouraud Agar Digerido de Case- Agar Sabouraud
ejemplo ATCC 16404, sa o Agar Papa Dextro- y Sojas 100 ufc Dextrosa $ 100 na y Soja s 100 ufc Dextrosa s 1 00
IMI 149007, IP 1431.83 sa 20-25 30-35 s 5 das ufc 20-25 s 5 30-35 $ 5 das NMP: ufc 20-25s 5
o NBRC 9455 5-7 das o hasta alean- das no aplica das
zar una buena esporu-
lacin

Usar Solucin Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 1,0 o Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para realizar
las suspensiones de prueba; para suspender esporas de A. brasiliensis, se puede aadir 0,05% de polisorbato 80 a la solucin
amortiguadora. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura
entre 2 y 8. Como alternativa para la preparacin y posterior dilucin de una suspensin fresca de las clulas vegetativas de
A. brasiliensis o B. subtilis, preparar una suspensin estable de esporas y luego usar un volumen apropiado de la suspensin de
esporas para la inoculacin de prueba. La suspensin estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2 a 8 du-
rante un perodo validado.

Control Negativo

Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la prepa-
racin de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos segn se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.

Promocin del Crecimiento de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes indicados.
Inocular porciones/placas de Caldo Digerido de Casena y Soja y Agar Digerido de Casena y Soja con un nmero pequeo (no
ms de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 7, empleando una porcin/placa individual de medio para cada
uno. Inocular placas de Agar Sabouraud Dextrosa con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) de los microorganismos indica-
dos en la Tabla 7, empleando una placa individual de medio para cada uno. Incubar de acuerdo con las condiciones descritas
en la Tabla 7.
Para medios slidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de 2 a partir del valor calculado para un
inculo estandarizado. Para un inculo recin preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obte-
nido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Los medios lquidos son adecuados si se pro-
duce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio
analizada y aprobada previamente.
128 (61) Examen Microbiolgico / Pruebas Microbiolgicas USP 39

Aptitud del Mtodo de Recuento en Presencia del Producto

PREPARACIN DE LA MUESTRA

El mtodo para preparar la muestra depende de las caractersticas fsicas del producto a examinar. Si ninguno de los procedi-
mientos que se describen a continuacin resultara satisfactorio, se debe desarrollar un procedimiento alternativo adecuado.
Productos Solubles en Agua-Disolver o diluir (por lo general se prepara una dilucin 1 en 1 O) del producto a examinar
en Solucin Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 1,0, en Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo Di-
gerido de Casena y Soja. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el mismo diluyente, si
fuera necesario.
Productos No Grasos Insolubles en Agua-Suspender el producto a analizar (por lo general se prepara una dilucin 1 en
1O) en Solucin Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7, O, en Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 1,2 o en Caldo
Digerido de Casena y Soja. Se puede aadir un agente tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80, para favorecer la
suspensin de sustancias poco humectables. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el
mismo diluyente, si fuera necesario.
Productos Grasos-Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo esterilizado por filtracin o mezclarlo con la
cantidad mnima necesaria de polisorbato 80 estril u otro reactivo tensoactivo estril no inhibitorio que se calienta, si fuera
necesario, a no ms de 40 o, en casos excepcionales, a no ms de 45. Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mante-
ner la temperatura en un bao de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado precalentado para obtener
una dilucin 1 en 1O del producto original. Mezclar cuidadosamente, manteniendo la temperatura durante el menor tiempo
necesario para la formacin de una emulsin. Se puede preparar una serie de diluciones decimales adicionales empleando el
diluyente seleccionado que contenga una concentracin adecuada de polisorbato 80 estril u otro reactivo tensoactivo estril
no inhibitorio.
Lquidos o Slidos en Forma de Aerosol-Transferir el producto aspticamente a un aparato con filtro de membrana o un
recipiente estril para un muestreo posterior. Usar el contenido completo o una cantidad definida de dosis fijas de cada envase
analizado.
Parches Transdrmicos-Retirar las lminas protectoras ("cubiertas de proteccin") de los parches transdrmicos y colo-
carlas, con el adhesivo hacia arriba, sobre bandejas de vidrio o plstico estriles. Cubrir la superficie adhesiva con un material
poroso estril adecuado (p.ej., gasa estril) para prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferirlos a un volumen
adecuado del diluyente seleccionado que contenga inactivadores tales como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la preparacin
vigorosamente por lo menos durante 30 minutos.

INOCULACIN Y DILUCIN

Agregar a la muestra, preparada segn las instrucciones previas, y a un control (sin incluir material de la prueba) un volumen
suficiente de suspensin microbiana para obtener un inculo de no ms de 100 ufc. El volumen de la suspensin del inculo
no debe exceder del 1% del volumen del producto diluido.
Para demostrar una recuperacin microbiana aceptable del producto, se debe usar el factor de dilucin ms bajo posible de
la muestra preparada para la prueba. Si esto no fuera posible debido a la actividad antimicrobiana o la baja solubilidad, deben
desarrollarse otros protocolos adecuados. Si la inhibicin del crecimiento por la muestra no puede evitarse de cualquier otra
manera, la alcuota de suspensin microbiana puede agregarse despus de la neutralizacin, la dilucin o la filtracin.

NEUTRALIZACIN/ELIMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Comparar el nmero de microorganismos recuperados a partir de la muestra preparada, diluida segn se indica en Inocula-
cin y Dilucin e incubada siguiendo el procedimiento descrito en Recuperacin de Microorganismos en Presencia del Producto,
con el nmero de microorganismos recuperados a partir de la preparacin de control.
Si se inhibe el crecimiento (reduccin en un factor mayor de 2), modificar el procedimiento para la prueba de recuento par-
ticular con el objeto de garantizar la validez de los resultados. La modificacin del procedimiento puede incluir, por ejemplo,
(1) Un aumento en el volumen del diluyente o medio de cultivo;
(2) Incorporacin de agentes neutralizantes generales o especficos en el diluyente;
(3) Filtracin por membrana; o
(4) Una combinacin de todas las medidas anteriores.
Agentes Neutralizantes-Los agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de los agentes antimicro-
bianos (ver la Tabla 2). Pueden aadirse al diluyente seleccionado o al medio, preferentemente antes de la esterilizacin. Si se
usan, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos mediante un blanco con neutralizador
y sin el producto.
USP 39 Pruebas .Microbiolgicas/ (61) Examen Microbiolgico 129

Tabla 2. Agentes Neutralizantes Comunes/Mtodos para

Sustancias de Interferencia
Agentes Neutralizantes
Sustancia de Interferencia Potenciales/Mtodo
Glutaraldehdo, mercuriales Sulfito cido de sodio (Bisulfito de sodio)
Fenlicos, alcohol, aldehdos, sorbato Dilucin
Aldehdos Glicina
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas Lecitina
CAC, yodo, parabenos Polisorbato
Mercuriales Tioglicolato
Mercuriales, halgenos, aldehdos Tiosulfato
EDTA (edetato) Iones de Mg o Ca

Si no se encuentra un mtodo de neutralizacin adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el microorganis-
mo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta informacin permite deducir que no es probable que
el artculo se contamine con esa determinada especie de microorganismo. No obstante, es posible que el producto inhiba sola-
mente algunos microorganismos especificados en este captulo pero que no inhiba otros no incluidos entre las cepas de prue-
ba o aquellos para los cules stas no son representativas. En consecuencia, realizar la prueba con el factor de dilucin ms alto
compatible con el crecimiento microbiano y el criterio de aceptacin especfico.

RECUPERACIN DE MICROORGANISMOS EN PRESENCIA DEL PRODUCTO

Para cada uno de los microorganismos en la lista, realizar pruebas individuales. Contar slo los microorganismos de la cepa
de prueba agregada.
Filtracin por Membrana-Usar filtros de membrana con un tamao nominal de poro no mayor de 0,45 m. Escoger el
tipo de material del filtro de manera que la eficiencia en la retencin de bacterias no se vea afectada por los componentes de
la muestra a investigar. Usar un filtro de membrana para cada uno de los microorganismos mencionados.
Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada segn se indica en Preparacin de la Muestra, Inoculacin y Dilu-
cin y Neutralizacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana (que preferiblemente represente 1 g del producto, o menos si se
espera un gran nmero de ufc) al filtro de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volu-
men adecuado de diluyente.
Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA), transferir el filtro de membrana a la superficie del
Agar Digerido de Casena y Soja. Para determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL),
transferir la membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar las placas segn se indica en la Tabla 7. Realizar el
recuento.
Mtodos de Recuento en Placa-Aplicar los mtodos de recuento en placa al menos por duplicado para cada medio y
usar el recuento medio del resultado.
Mtodo de Vertido en Placa-Para placas de Petri de 9 cm de dimetro, agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada
segn se indica en Preparacin de la Muestra, Inoculacin y Dilucin y Neutralizacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana y
de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Casena y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la temperatura de ambos medios a
no ms de 45. Si se emplean placas de Petri ms grandes, aumentar la cantidad del medio de agar proporcionalmente. Em-
plear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 7.
Incubar las placas segn se indica en la Tabla 7. Tomar la media aritmtica de los recuentos obtenidos en cada medio y
calcular el nmero de ufc en el inculo original.
Mtodo de Extensin en Superficie-Agregar de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Casena y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa a
cada placa de Petri de 9 cm de dimetro, aproximadamente a 45, y dejar solidificar. Si se emplean placas de Petri ms gran-
des, aumentar el volumen del agar proporcionalmente. Secar las placas, por ejemplo, en un gabinete con flujo de aire laminar
o en una incubadora. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 7. Esparcir un
volumen medido de no menos de O, 1 mL de la muestra, preparada segn se indica en Preparacin de Ja Muestra, Inoculacin y
Dilucin y Neutralizacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento
segn se indica en Mtodo de Vertido en Placa.
Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP)-La precisin y exactitud del Mtodo del NMP son menores que las del mto-
do de Filtracin por Membrana o el Mtodo de Recuento en Placa. Los resultados no confiables se obtienen particularmente para
el recuento de hongos filamentosos. Por estas razones, el Mtodo del NMP se reserva para el RTMA en situaciones en las que no
haya otro mtodo disponible. Si se justifica el empleo del mtodo, proceder de la siguiente manera:
Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales en serie del producto segn se indica en Preparacin de la Muestra,
Inoculacin y Dilucin y Neutralizacin/Eliminacin de Actividad Antimicrobiana. A partir de cada nivel de dilucin, usar tres al-
cuotas de 1 g o 1 mL para inocular tres tubos con 9 a 1 O mL de Caldo Digerido de Casena y Soja. Si fuera necesario, se puede
agregar al medio un agente tensoactivo, tal como polisorbato 80, o un inactivador de agentes antimicrobianos. Por lo tanto, si
se preparan tres niveles de dilucin, inocular nueve tubos.
130 (61) Examen Microbiolgico / Pruebas Microbiolgicas USP 39

Incubar todos los tubos a una temperatura de 30 a 35 durante no ms de 3 das. Si la lectura de los resultados resulta
difcil o dudosa dada la naturaleza del producto a examinar, subcultivar en el mismo caldo o en Agar Digerido de Casena y Soja
durante un perodo de 1 a 2 das a la misma temperatura y usar estos resultados. A partir de la Tabla 3, determinar el nmero
ms probable de microorganismos por g o por ml del producto a examinar.
Tabla 3. Valores del Nmero Ms Probable de Microorganismos
Combinaciones Observadas de Nmeros de NMP porgo Lmites
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada por mL de de Confianza
Juego Producto de95%
Nmero de g o mL de Producto por Tubo
0,1 0,01 0,001
o o o <3 0-9,4
o o 1 3 0,1-9,5
o 1 o 3 0,1-10
o 1 1 6,1 1,2-17
o 2 o 6,2 1,2-17
o 3 o 9,4 3,5-35
1 o o 3,6 0,2-17
1 o 1 7,2 1,2-17
1 o 2 11 4-35
1 1 o 7,4 1,3-20
1 1 1 11 4-35
1 2 o 11 4-35
1 2 1 15 5-38
1 3 o 16 5-38
2 o o 9,2 1,5-35
2 o 1 14 4-35
2 o 2 20 5-38
2 1 o 15 4-38
2 1 1 20 5-38
2 1 2 27 9-94
2 2 o 21 5-40
2 2 1 28 9-94
2 2 2 35 9-94
2 3 o 29 9-94
2 3 1 36 9-94
3 o o 23 5-94
3 o 1 38 9-104
3 o 2 64 16-181
3 1 o 43 9-181
3 1 1 75 17-199
3 1 2 120 30-360
3 1 3 160 30-380
3 2 o 93 18-360
3 2 1 150 30-380
3 2 2 210 30-400
3 2 3 290 90-990
3 3 o 240 40-990
3 3 1 460 90-1980
3 3 2 1100 200-4000
3 3 3 >1100

RESULTADOS E INTERPRETACIN

Al verificar la aptitud del mtodo de Filtracin por Membrana o del Mtodo de Recuento en Placa, se debe obtener un recuen-
to medio de cualquier microorganismo de prueba que no difiera en un factor mayor de 2 del valor del control definido en
 USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (61) Examen Microbiolgico 131

Inoculacin y Dilucin en la ausencia del producto. Al verificar la aptitud del Mtodo del NMP, el valor calculado a partir del
inculo debe estar dentro de los lmites de confianza de 95% de los resultados obtenidos con el control.
Si los criterios mencionados anteriormente no pueden cumplirse para uno o ms de los microorganismos analizados con
cualquiera de los mtodos descritos, se debe utilizar para examinar el producto, el mtodo y las condiciones de prueba ms
cercanas a esos criterios.

PRUEBA DE PRODUCTOS

Cantidad Usada para la Prueba

A menos que se indique algo diferente, usar 1Og o 1O mL del producto a examinar, tomados con las precauciones mencio-
nadas anteriormente. Para lquidos o slidos en forma de aerosol, muestrear 1O envases. Para parches transdrmicos, mues-
trear 1O parches.
Se puede reducir la cantidad a analizar de las sustancias activas que se formulan en las siguientes condiciones: la cantidad
por unidad de dosificacin (por ej., tableta, cpsula, inyeccin) es menor o igual a 1 mg o la cantidad por g o mL (para prepa-
raciones que no se presentan en unidades de dosificacin) es menor de 1 mg. En estos casos, la cantidad de la muestra a anali-
zar no es menor que la cantidad presente en 1O unidades de dosificacin o 1Og o 1O mL del producto.
Para materiales que se usan como sustancias activas en los que la cantidad de la muestra es limitada o el tamao de la parti-
da es extremadamente pequeo (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g), la cantidad analizada debe ser 1% de la partida a
menos que se indique, o justifique y autorice una cantidad menor.
Para productos cuyo nmero total de entidades en una partida es menor de 200 (por ej. muestras que se usan en ensayos
clnicos), el tamao de la muestra puede reducirse a dos unidades o a una unidad si el tamao es menor de 1 OO.
Escoger la(s) muestra(s) aleatoriamente a partir del material a granel o de los envases disponibles de la preparacin. Para
obtener la cantidad requerida, mezclar los contenidos de un nmero suficiente de envases para proporcionar la muestra.

Examen del Producto

FILTRACIN POR MEMBRANA

Usar un aparato de filtracin diseado para permitir la transferencia del filtro al medio. Preparar la muestra empleando un
mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn se indica en Prueba de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Re-
cuento, transferir la cantidad adecuada a dos filtros de membrana y filtrar inmediatamente. Lavar cada filtro siguiendo el proce-
dimiento que haya demostrado su aptitud.
Para determinar el RTMA, transferir uno de los dos filtros de membrana a la superficie del Agar Digerido de Casena y Soja.
Para determinar el RTCHL, transferir la otra membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar la placa de Agar
Digerido de Casena y Soja a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 3 a 5 das y la placa de Agar Sabouraud
Dextrosa a una temperatura de 20 a 25 durante un perodo de 5 a 7 das. Calcular el nmero de ufc por g o por mL del
producto.
Al examinar los parches transdrmicos, filtrar por separado 10% del volumen de la preparacin descrita en Preparacin de la
Muestra a travs de cada una de las dos membranas de filtracin estriles. Transferir una membrana al Agar Digerido de Casena
y Soja para el RTMA y la otra membrana al Agar Sabouraud Dextrosa para el RTCHL.

MTODOS DE RECUENTO EN PLACA

Mtodo de Vertido en Placa-Preparar la muestra empleando un mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn se des-
cribe en Prueba de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para cada
medio por cada nivel de dilucin. Incubar las placas de Agar Digerido de Casena y Soja a una temperatura entre 30 y 35
durante un perodo de 3 a 5 das y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa a una temperatura entre 20 y 25 durante un pero-
do de 5 a 7 das. Escoger las placas correspondientes a una dilucin determinada y que muestren el mayor nmero de colo-
nias, menor de 250 para el RTMA y 50 para el RTCHL. Tomar la media aritmtica de los recuentos por medio de cultivo y
calcular el nmero de ufc por g o por mL del producto.
Mtodo de Extensin en Superficie-Preparar la muestra empleando un mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn
se describe en Prueba de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para
cada medio y cada nivel de dilucin. Para la incubacin y clculo del nmero de ufc, proceder segn se indica en el Mtodo de
Vertido en Placa.

MTODO DEL NMERO MS PROBABLE

Preparar y diluir la muestra empleando un mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn se describe en Prueba de Promo-
cin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuento. Incubar todos los tubos durante un perodo de 3 a 5 das a una tempera-
132 (61) Examen Microbiolgico / Pruebas Microbiolgicas USP 39

tura de 30 a 35. Subcultivar, si fuera necesario, empleando el procedimiento cuya aptitud se haya demostrado. Registrar para
cada nivel de dilucin el nmero de tubos que muestran crecimiento microbiano. A partir de la Tabla 3, determinar el nmero
ms probable de microorganismos por g o por mL del producto a examinar.

Interpretacin de los Resultados

El recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) se considera equivalente al nmero de ufc encontrado usando Agar
Digerido de Casena-Soja; si se detectan colonias de hongos en este medio, contarlas como parte del RTMA. El recuento total
combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se considera equivalente al nmero de ufc encontrado empleando
Agar Sabouraud Dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este medio, contarlas como parte del RTCHL. Cuando se espe-
ra que el RTCHL exceda el criterio de aceptacin debido al crecimiento bacteriano, se puede usar Agar Sabouraud Dextrosa que
contenga antibiticos. Si se realiza el recuento mediante el Mtodo del MNP, el valor calculado es RTMA.
Cuando se indica un criterio de aceptacin para la calidad microbiolgica, ste se interpreta de la siguiente manera:
- 101 ufc: recuento mximo aceptable = 20;
- 10 2 ufc: recuento mximo aceptable = 200;
- 10 3 ufc: recuento mximo aceptable = 2000;
y as sucesivamente.
Las soluciones y medios recomendados se indican en Pruebas de Microorganismos Especficos (62).

(62) EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

ESTRILES: PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECFICOS

INTRODUCCIN
Las pruebas que se describen en este captulo permitirn determinar la ausencia, o presencia limitada, de microorganismos
especficos que puedan ser detectados en las condiciones descritas.
Las pruebas han sido diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin cumple con alguna especifi-
cacin establecida de calidad microbiolgica. Si se emplean con tales propsitos, seguir las instrucciones que se indican a con-
tinucin, incluyendo el nmero de muestras a tomar, e interpretar los resultados segn se indica ms abajo.
Pueden utilizarse procedimientos microbiolgicos alternativos, incluyendo mtodos automatizados, siempre que se haya de-
mostrado su equivalencia con el mtodo farmacopeico.

PROCEDIMIENTOS GENERALES
La preparacin de muestras se realiza segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento
Microbiano (61 ).
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, sta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible
segn se describe en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparacin de la muestra, se debe demostrar su ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado, segn se describe en Examen Microbiolgico de Produc-
tos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).

PROPIEDADES DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS,

APTITUD DE LA PRUEBA Y CONTROLES NEGATIVOS
Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar. Se debe
confirmar la aptitud de la prueba si se introduce un cambio en la ejecucin de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados.

Preparacin de Cepas de Prueba

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba segn se indica ms abajo. Las tcnicas de mantenimiento de
cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inocu-
lacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original.
USP 39 PruebasiMicrobiolgicas / (62) Examen Microbiolgico 133

MICROORGANISMOS AEROBIOS

Cultivar por separado cada cepa bacteriana de prueba en recipientes que contengan Caldo Digerido de Casena y Soja o Agar
Digerido de Casena y Soja a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas. Cultivar por separado la cepa
de prueba de Candida albicans en Agar Sabouraud Dextrosa o Caldo Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20 a 25 duran-
te un perodo de 2 a 3 das.

Staphylococcus aureus Por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276
Pseudomonas aeruginosa Por ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC
13275
Escherichia coli Por ejemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 o NBRC
3972
Sa/monella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o, como alternativa, Por ejemplo ATCC 14028
Sa/monella enterica subesp. enterica serovar Abony Por ejemplo NBRC 100797, NCTC 6017 o CIP 80.39
Candida albicans Por ejemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 o NBRC 1594

Usar Solucin Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 o Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 1,2 para preparar
las suspensiones de prueba. Usar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una tempe-
ratura de 2 a 8.

CLOSTRIDIOS

Usar Clostridium sporogenes, como por ejemplo ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) o ATCC 19404
(NCTC 532 o CIP 79.3). Cultivar la cepa clostridial de prueba en condiciones anaerbicas en Medio Reforzado para Clostridios a
una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 24 a 48 horas. Como alternativa para Ja preparacin y posterior dilucin
de una suspensin fresca de las clulas vegetativas de C/. sporogenes, se emplea una suspensin estable de esporas para la ino-
culacin de prueba. La suspensin estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2 a 8 durante un perodo
validado.

Control Negativo

Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en Jugar de Ja prepa-
racin de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar Jos
productos segn se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.

Propiedades de Promocin del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de Jos
ingredientes. Verificar las propiedades adecuadas de Jos medios pertinentes segn se indica en Ja Tabla 7.
Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promocin del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios
Prueba/Medio Propiedad Cepas de Prueba
Prueba eara bacterias Gram-negativas tolerantes a Ja bilis
Caldo Mossel para Enriquecimiento de En- Promocin del crecimiento E. co/i
terobacterias
P. aeruginosa
Inhibitoria S. aureus
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa Promocin del crecimiento + Indicadora E. coli
P. aeruqinosa
Prueba de Escherichia coli
Caldo MacConkey Promocin del crecimiento E. coli
Inhibitoria S. aureus
Agar MacConkey Promocin del crecimiento + Indicadora E. coli
Prueba de Salmonella
Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enrique- Promocin del crecimiento Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
cimiento de Salmonella riumo
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Abony
Inhibitoria S. aureus
134 (62) Examen Microbiolgico/ Pruebas Microbiolgicas USP 39

d a d es In di ca d oras de Promoc1on
Ta bl a 1. Prop1e , )
., d e 1 Cree1m 1ento e In hlbl toras d e 1os Medi os Continuacion
Prueba/Medio Propiedad Cepas de Prueba
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato Promocin del crecimiento + Indicadora Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
riumo
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Abony
Prueba de Pseudomonas aeruginosa
Agar Cetrimida Promocin del crecimiento P. aeruginosa
Inhibitoria E. coli
Prueba de Sta!J_h)'.'_/ococcus aureus
Agar Manitol Salado Promocin del crecimiento + Indicadora S. aureus
Inhibitoria E. coli
Prueba de Clostridios
Medio Reforzado para Clostridios Promocin del crecimiento CI. sporogenes
Agar Columbia Promocin del crecimiento C/. sporogenes
Prueba de Candida albicans
Caldo Sabouraud Dextrosa Promocin del crecimiento C. albicans
Agar Sabouraud Dextrosa Promocin del crecimiento + Indicadora C. albicans

Prueba de las Propiedades de Promocin del Crecimiento, Medios Lquidos-Inocular una porcin del medio apropia-
do con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada duran-
te un tiempo no mayor que el perodo menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de micro-
organismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades de Promocin del Crecimiento, Medios Slidos-Usar el Mtodo de Extensin en Superficie
(ver Mtodos de Recuento en Placa en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), ino-
culando cada una de las placas con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la
temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el perodo menor indicado en la prueba. Se produce un crecimien-
to de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades Inhibitorias, Medios Slidos o Lquidos-Inocular el medio apropiado con al menos 100 ufc
del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no menor del perodo mayor indica-
do en la prueba. No se produce crecimiento del microorganismo de prueba.
Prueba de las Propiedades Indicadoras-Usar el Mtodo de Extensin en Superficie (ver Mtodos de Recuento en Placa en
Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), inoculando cada una de las placas con
un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un
perodo que se encuentre en el intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indi-
cadoras, a aquellas anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente.

Aptitud del Mtodo de Prueba

Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparacin de la muestra segn se indica en el prrafo pertinente en
Pruebas de Productos. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio de crecimiento indicado. Inocular
individualmente las cepas de prueba. Usar un nmero de microorganismos equivalente a no ms de 100 ufc en la preparacin
de prueba inoculada.
Realizar la prueba segn se indica en el prrafo pertinente en Pruebas de Productos empleando el perodo ms corto de incu-
bacin indicado.
Se deben detectar los microorganismos especficos con las reacciones indicadoras segn se describe en Pruebas de Productos.
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificacin del procedimiento de la prueba (ver Neutrali-
zacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Micro-
biano (61 )).
Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con respecto al microorganismo para el cual se indica la prue-
ba no puede neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no estar presente en el producto.

PRUEBAS DE PRODUCTOS

Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis

Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa-Preparar una muestra empleando una dilucin 1 en 1O de no menos de
1 g del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano
(61 ), excepto que se debe usar Caldo Digerido de Casena y Soja como diluyente de eleccin, mezclar e incubar a una tempera-
USP 39 Pruebas.Microbiolgicas/ (62) Examen Microbiolgico 135

tura de 20 a 25 durante un perodo suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicacin de los orga-
nismos (por lo general 2 horas pero no ms de 5 horas).
Prueba de Ausencia-A menos que se indique algo diferente, usar un volumen correspondiente a 1 g del producto, segn
se indica en Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa, para inocular Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias.
Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 24 a 48 horas. Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis
Glucosa. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.
Prueba Cuantitativa-
Se/eccin y Subcultivo-lnocular cantidades adecuadas de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con la prepa-
racin segn se indica en Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa y/o diluciones de la misma que contengan respectiva-
mente O, 1 g; 0,01 g y 0,001 g ( O, 1 ml; 0,01 ml y 0,001 ml) del producto a examinar. Incubar a una temperatura de 30 a
35 durante un perodo de 24 a 48 horas. Subcultivar cada uno de los cultivos en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa.
Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas.
Interpretacin-El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la menor cantidad del producto que pro-
duce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado negativo. Determinar la cantidad probable de bacte-
rias a partir de la Tabla 2.
Tabla 2. Interpretacin de Resultados
Resultados para Cada Cantidad
del Producto Cantidad Probable de Bacterias por
0,1go0,1 mL 0,01 g o 0,01 mL 0,001 g o 0,001 mL g o mL del Producto
+ + + ms de 103
+ + - menos de 10 3 y ms de 1 0 2
+ - - menos de 10 2 y ms de 1 O
- - - menos de 1 O

Escherichia coli
Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa-Preparar una muestra usando una dilucin 1 en 1O de no menos de 1 g
del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se descri-
be en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido de Casena y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35
durante un perodo de 18 a 24 horas.
Seleccin y Subcultivo-Agitar el recipiente, transferir 1 ml de Caldo Digerido de Casena y Soja a 100 ml de Caldo Mac-
Conkey e incubar a una temperatura de 42 a 44 durante un perodo de 24 a 48 horas. Subcultivar en una placa de Agar
MacConkey a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 72 horas.
Interpretacin-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E. coli. Esto se confirma mediante pruebas de
identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificacin son negati-
vos.

Salmonella
Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa-Preparar el producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico
de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar una cantidad correspondiente a no menos de 1 Og 1O
ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se describe en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido
de Casena y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas.
Seleccin y Subcultivo-Transferir O, 1 ml de Caldo Digerido de Casena y Soja a 1O ml de Caldo Rappaport-Vassiliadis para
Enriquecimiento de Salmonella e incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas. Subcultivar en
placas de Agar Xi/osa Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 48 horas.
Interpretacin-El crecimiento de colonias bien desarrolladas de color rojo, con o sin centros negros indica la posible pre-
sencia de Salmonella. Esto se confirma mediante pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificacin confirmatorias son negativos.

Pseudomonas aeruginosa
Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa-Preparar una muestra usando una dilucin 1 en 1 O de no menos de 1 g
del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se descri-
136 (62) Examen Microbiolgico/ Pruebas Microbiolgicas USP 39

be en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido de Casena y Soja y mezclar. Al analizar parches transdrmicos, filtrar el
volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparacin (ver Parches Transdrmicos en Preparacin de la Muestra en
Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a travs de un filtro de membrana estril
y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Casena y Soja. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a
24 horas.
Seleccin y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Cetrimida e incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un
perodo de 18 a 72 horas.
Interpretacin-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de P. aeruginosa. Esto se confirma mediante pruebas
de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificacin confirma-
torias son negativos.

Staphylococcus aureus
Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa-Preparar una muestra usando una dilucin 1 en 1 O de no menos de 1 g
del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se descri-
be en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido de Casena y Soja y homogenizar. Al analizar parches transdrmicos, fil-
trar el volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparacin (ver Parches Transdrmicos en Preparacin de la
Muestra en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a travs de un filtro de mem-
brana estril y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Casena y Soja. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un
perodo de 18 a 24 horas.
Seleccin y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Manito/ Salado e incubar a una temperatura de 30 a 35 duran-
te un perodo de 18 a 72 horas.
Interpretacin-El crecimiento de colonias amarillas o blancas rodeadas de una zona amarilla indica la posible presencia de
S. aureus. Esto se confirma mediante pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificacin confirmatorias son negativos.

Clostridios
Preparacin de la Muestra y Tratamiento Trmico-Preparar una muestra usando una dilucin 1 en 1O (con un volumen
total mnimo de 20 ml) de no menos de 2 g o 2 ml del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Pro-
ductos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ). Dividir la muestra en dos porciones de al menos 1O ml. Calentar una
porcin a 80 durante 1 O minutos y enfriar rpidamente. No calentar la otra porcin.
Seleccin y Subcultivo-Usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml del producto a analizar de ambas porcio-
nes para inocular cantidades adecuadas (determinadas segn se indica en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Medio Reforzado
para Clostridios. Incubar bajo condiciones anaerbicas a una temperatura de 30 a 35 durante 48 horas. Despus de la incuba-
cin, realizar subcultivos a partir de cada recipiente en Agar Columbia e incubar bajo condiciones anaerbicas a una temperatu-
ra de 30 a 35 durante 48 a 72 horas.
Interpretacin-El crecimiento anaerbico de bacilos (con o sin endosporas) que dan una reaccin de catalasa negativa
indica la presencia de Clostridios.
Esto se confirma mediante pruebas de identificacin. Si no se detectan colonias de los tipos descritos o si las pruebas de
identificacin confirmatorias resultan negativas, el producto cumple con la prueba.

Candida albicans
Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa-Preparar el producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico
de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a no menos de 1 g
1 ml, para inocular 100 ml de Caldo Sabouraud Dextrosa y mezclar. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un pero-
do de 3 a 5 das.
Seleccin y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Sabouraud Dextrosa e incubar a una temperatura de 30 a 35
durante un perodo de 24 a 48 horas.
Interpretacin-El crecimiento de colonias blancas puede indicar la presencia de C. albicans. Esto se confirma mediante
pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan tales colonias o si las pruebas de identificacin confirmatorias resultan
negativas.
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (62) Examen Microbiolgico 137

SOLUCIONES RECOMENDADAS V
MEDIOS DE CULTIVO
NOTA-Esta seccin se proporciona como informacin.
Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales
se indican en la prueba de contaminacin microbiana en la Farmacopea. Se pueden usar otros medios siempre que se pueda
demostrar su aptitud.
Solucin Amortiguadora Madre-Transferir 34 g de fosfato monobsico de potasio a un matraz volumtrico de 1000 ml,
disolver en 500 ml de Agua Purificada, ajustar con hidrxido de sodio a un pH de 7,2 0,2, agregar Agua Purificada a volumen
y mezclar. Dispensar en recipientes y esterilizar. Almacenar a una temperatura de 2 a 8.
Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2-Preparar una mezcla de Agua Purificada y Solucin Amortiguadora Madre
(800:1 v/v) y esterilizar.

Solucin Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona

de pH 7,0
Fosfato Monobsico de Potasio 3,6 g
Fosfato Dibsico de Sodio Dihidrato 7,2 g (equivalente a fosfato 0,067 M)
Cloruro de Sodio 4,3 g
Peptona (de carne o casena) 1,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Caldo Digerido de Casena y Soja

Digerido Pancretico de Casena 17,0 g
Digerido Papanico de Soja 3,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Fosfato Dibsico de Potasio 2,5 g
Glucosa Monohidrato 2,5 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,3 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Digerido de Casena y Soja

Digerido Pancretico de Casena 15,0 g
Digerido Papanico de Soja 5,0 g
Cloruro de Sodio 5,0g
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,3 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 40,0 g
Mezcla de Digerido Pptico de Tejido Animal y Digerido Pancretico de Casena (1 :1) 10,0 g
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 5,6 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Papa Dextrosa

Infusin de papas 200g
Dextrosa 20,0 g
Agar 15,0g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 5,6 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.
138 (62) Examen Microbiolgico/ Pruebas Microbiolgicas USP 39

Caldo Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 20,0 g
Mezcla de Digerido Pptico de Tejido Animal y Digerido Pancretico de Casena (1 :1) 10,0 g
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 5,6 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias

Digerido Pancretico de Gelatina 10,0 g
Glucosa Monohidrato 5,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 20,0 g
Fosfato Monobsico de Potasio 2,0 g
Fosfato Dibsico de Sodio Dihidrato 8,0 g
Verde Brillante 15 mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7,2 0,2 a 25. Calentar a 100 durante 30 minutos y enfriar inme-
diatamente.

Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa

Extracto de Levadura 3,0 g
Digerido Pancretico de Gelatina 7,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Glucosa Monohidrato 10,0 g
Agar 15,0 g
Rojo Neutro 30 mg
Cristal Violeta 2 mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7,4 0,2 a 25. Calentar hasta el punto de ebullicin; no calentar
en autoclave.

Caldo MacConkey
Digerido Pancretico de Gelatina 20,0 g
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 5,0 g
Prpura de Bromocresol 10 mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,3 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar MacConkey
Digerido Pancretico de Gelatina 17,0 g
Peptonas (de carne y casena) 3,0 g
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Agar 13,5 g
Rojo Neutro 30,0 mg
Cristal Violeta 1 mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7, 1 0,2 a 25. Calentar a ebullicin durante 1 minuto, agitando
constantemente, y luego esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
USP 39 Pruebas.Microbiolgicas/ (62) Examen Microbiolgico 139

Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enriquecimiento de

Salmonella
Peptona de Soja 4,5 g
Cloruro de Magnesio Hexahidrato 29,0 g
Cloruro de Sodio 8,0 g
Fosfato Dibsico de Potasio 0,4 g
Fosfato Monobsico de Potasio 0,6 g
Verde de Malaquita 0,036 g
Agua Purificada 1000 mL

Disolver, calentando ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado a una temperatura que no exceda
de 115. El pH debe ser de 5,2 0,2 a 25 luego del calentamiento y esterilizacin en autoclave.

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato

Xi losa 3,5 g
L-Lisina 5,0 g
Lactosa Monohidrato 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
Rojo de Fenal 80 mg
Agar 13,5 g
Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Tiosulfato de Sodio 6,8 g
Citrato Frrico Amnico 0,8 g
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7,4 0,2 a 25. Calentar a ebullicin, enfriar a 50 y verter en
placas de Petri. No calentar en un autoclave.

Agar Cetrlmida
Digerido Pancretico de Gelatina 20,0 g
Cloruro de Magnesio 1,4 g
Sulfato de Potasio 10,0 g
Cetrimida 0,3 g
Agar 13,6 g
Agua Purificada 1000 mL
Glicerol 10,0 mL

Calentar a ebullicin durante 1 minuto con agitacin. Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,2 0,2 a
25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Agar Manitol Salado

Digerido Pancretico de Casena 5,0g
Digerido Pptico de Tejido Animal 5,0 g
Extracto de Carne 1,0 g
D-Manitol 10,0 g
Cloruro de Sodio 75,0 g
Agar 15,0 g
Rojo de Fenal 0,025 g
Agua Purificada 1000 mL

Calentar a ebullicin durante 1 minuto con agitacin. Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,4 0,2 a
25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Medio Reforzado para Clostridios

Extracto de Carne 10,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
 140 (62) Examen Microbiolgico/ Pruebas Microbiolgicas USP 39

Medio Reforzado para Clostridios

Almidn Soluble 1,0 g
Glucosa Monohidrato 5,0 g
Clorhidrato de Cistena 0,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Acetato de Sodio 3,0 g
Agar 0,5 g
Agua Purificada 1000 ml

Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullicin y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que despus de la esterilizacin sea de 6,8 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Agar Columbia
Digerido Pancretico de Casena 10,0 g
Digerido Pptico de Carne 5,0 g
Digerido Pancretico de Corazn 3,0 g
Extracto de Levadura 5,0 g
Almidn de Maz 1,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Agar, de acuerdo con la capacidad de gelificacin 10,0-15,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullicin y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que despus de la esterilizacin sea de 7,3 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Dejar enfriar a
una temperatura de 45 a 50, agregar, cuando sea necesario, sulfato de gentamicina correspondiente a 20 mg de gentamici-
na base y verter en placas de Petri.

(63) PRUEBAS PARA MICOPLASMAS

INTRODUCCIN

El gnero micoplasma representa un grupo de bacterias diminutas que no tienen pared celular. Este gnero comprende ms
de 120 especies. Son los organismos procariotas autorreplicantes ms pequeos. Las clulas varan en tamao y morfologa y
no se pueden colorear con Gram, pero las impresiones de las colonias sobre agar slido se pueden colorear con azul de metile-
no o una tincin equivalente. Los micoplasmas son parsitos y comensales, y algunos pueden ser patgenos para una gran
variedad de huspedes animales y vegetales. En humanos, los micoplasmas son por lo general parsitos de superficie que colo-
nizan el epitelio de los tractos respiratorio y urogenital. Los micoplasmas son comunes y pueden ser causa de contaminacin
seria en los cultivos de clulas y/o tejidos usados para producir artculos farmacopeicos. Tambin pueden causar contamina-
cin en el caldo de digestin de casena de soja filtrado y esterilizado. Una infeccin en un cultivo celular puede persistir por
un periodo prolongado sin causar un dao celular aparente. La infeccin de las clulas en un cultivo puede afectar prctica-
mente todas las vas del metabolismo celular, alterando incluso las caractersticas fenotpicas de las clulas y su crecimiento
normal. La presencia de especies de micoplasma no siempre trae como resultado turbidez debido a crecimiento en los cultivos
o una alteracin visible de las clulas.
La prueba para deteccin de micoplasmas es un requisito necesario de control de calidad para garantizar de manera confia-
ble la pureza de los productos biotecnolgicos y de los materiales afines usados para producir dichos productos. Este captulo
de pruebas generales describe dos mtodos requeridos para detectar la contaminacin por micoplasma en los artculos de
prueba y en los cultivos tisulares y/o celulares usados para producir dichos artculos, caldos de digestin o cualquier otro mate-
rial en el que se sospeche contaminacin por micoplasma. Estos son: (A) el procedimiento en medios de agar y caldos y (B) el
procedimiento en cultivo de clulas indicadoras. Estas pruebas requieren una cuidadosa tcnica asptica y condiciones de labo-
ratorio apropiadas. Con el fin de garantizar que las pruebas y la interpretacin de los resultados sean apropiadas, el personal
debe estar adecuadamente capacitado y calificado. Para detectar micoplasmas se puede utilizar una tcnica validada de ampli-
ficacin de cidos nucleicos (NAT, por sus siglas en ingls) o un mtodo basado en la actividad enzimtica, siempre que el
mtodo usado demuestre ser comparable con ambos mtodos (A) y (B). Los mtodos alternativos se deben validar apropiada-
mente. Los requisitos de validacin para los mtodos alternativos no se tratarn en este captulo.
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 141

MTODO DE CULTIVO

Eleccin de los Medios de Cultivo

La prueba se efecta usando un nmero suficiente de medios de cultivo tanto slidos como lquidos para garantizar el creci-
miento en las condiciones de incubacin elegidas de pequeas cantidades de micoplasmas (aproximadamente 100 unidades
formadoras de colonias o ufc; o 100 unidades cambiadoras de color, o ucc) que puedan estar presentes en el artculo o mate-
rial de prueba. Los medios de cultivo lquidos deben contener rojo de fenol. La gama de medios de cultivo escogidos ha de-
mostrado tener propiedades nutritivas satisfactorias al menos para los microorganismos que aparecen en Cepas de Microorga-
nismos de Prueba para Control de Calidad (a continuacin). Las propiedades nutritivas de cada nuevo lote de medio de cultivo
se verifican para los microorganismos apropiados en la lista. Cuando se hagan las pruebas para micoplasmas se deben incluir
en cada una al menos dos especies o cepas conocidas de micoplasmas (listadas en Cepas de Microorganismos de Prueba para
Control de Calidad) como controles positivos, una de las cuales debe ser fermentadora de dextrosa (es decir, M. pneumoniae o
una especie y cepa equivalente) y la otra debe ser hidrolizadora de arginina (es decir, M. ora/e o una especie y cepa equivalen-
te). Solo al examinar lneas celulares de insectos se debe incluir una cepa de control de espiroplasma (p.ej., S. citri ATCC 29747,
S. melliferum ATCC 29416 o una especie y cepa equivalente). Adicionalmente, estas cepas pueden ser un poco ms exigentes
en sus requerimientos nutricionales. Necesitan temperaturas de incubacin ms bajas (al igual que las lneas celulares de insec-
tos).

Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad

Los cultivos de controles positivos no deben tener ms de 15 pases desde el aislamiento. Las especies o cepas de micoplas-
mas aptas para el uso se enumeran a continuacin:
- Acholeplasma laidlawii (vacunas y/o materiales derivados de clulas o cultivos para uso humano y veterinario cuando se ha
usado un antibitico durante la produccin)
- M. gallisepticum (cuando se ha usado material aviar durante la produccin o cuando la vacuna o el cultivo celular estn
destinados al uso en aves de corral)
- M. hyorhinis (vacunas o cultivos celulares veterinarios no aviares)
- M. ora/e (vacunas para uso humano y veterinario)
- M. pneumoniae (vacunas o bancos de clulas para uso humano) u otras especies apropiadas de fermentadores de o-gluco-
sa como M. fermentans
- M. synoviae (cuando se ha usado material aviar durante la produccin o cuando la vacuna o el banco de clulas est desti-
nado al uso en aves de corral)
Las cepas de prueba pueden ser aislados de campo que han sufrido un nmero limitado de subcultivos (no ms de 15), se
almacenan congeladas (-20 o menos) o liofilizadas y se identifican como pertenecientes a las especies requeridas, por compa-
racin con cultivos tipo, por ejemplo, los que aparecen en la Tabla 7.
Tabla 1. Cultivos Tipo para Identificar Aislados de Campo Usados como Cepas de Prueba
Organismo de Prueba Nmero NCTC Nmero CIP Nmero ATCC
A. laidlawii NCTC10116 CIP 75,27 ATCC 23206
M. gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610
M. fermentans NCTC 10117 CIP 105680 ATCC 19989
M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981
M. ora/e NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714
M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531
M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204

Condiciones de Incubacin

Incubar los medios de cultivo lquidos en recipientes hermticamente tapados a 361 . Incubar los medios de cultivo sli-
dos en condiciones microaeroflicas (atmsfera de hidrgeno que contenga< 0,5% de oxgeno y/o nitrgeno que contenga
5% a 10% de dixido de carbono en nitrgeno). Debe aportarse la humedad suficiente para evitar la desecacin de la superfi-
cie del agar a 36 1.

Propiedades Nutritivas

Efectuar la prueba de propiedades nutritivas para cada nueva partida de medio de cultivo. Inocular el medio de cultivo elegi-
do con los microorganismos de prueba apropiados; no usar ms de 100 ufc por placa que contenga al menos 9 mL de medio
de cultivo slido y por recipiente de 100 mL de medio de cultivo lquido; usar una placa y un recipiente aparte para cada espe-
cie de microorganismo. Incubar el medio de cultivo y hacer subcultivos a partir de 0,2 mL de medio lquido en medio slido a
142 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiolgicas USP 39

los intervalos especificados (ver a continuacin en Prueba de Micoplasmas en el Material o Artculo de Prueba). El medio slido
cumple con la prueba si se encuentra un recuento dentro del intervalo de 0,5 unidades logartmicas de la cantidad inoculada
para cada microorganismo de prueba. El medio lquido cumple con la prueba si se encuentra crecimiento en las placas de agar
subcultivadas a partir del caldo, por lo menos en 1 subcultivo para cada microorganismo de prueba. El uso de un microscopio
con un aumento de 1OOx o mayor puede ser til.

Sustancias lnhibidoras

La prueba de sustancias inhibidoras se efecta una vez para un producto determinado y se repite siempre que haya un cam-
bio en el mtodo de produccin que pueda afectar la deteccin de micoplasmas. Para demostrar la ausencia de sustancias
inhibidoras, llevar a cabo la prueba de propiedades nutritivas en presencia y ausencia del artculo o material de prueba. Si el
crecimiento de un microorganismo de prueba en ms de 1 subcultivo ocurre en ausencia del artculo o material de prueba
antes que en su presencia, se encuentran presentes sustancias inhibidoras. Lo mismo es cierto si las placas directamente inocu-
ladas con el artculo o material de prueba no estn dentro del intervalo de 0,5 unidades logartmicas del nmero de colonias
de aquellas inoculadas sin el artculo o material de prueba. En ambos casos, las sustancias inhibidoras se deben neutralizar o
contrarrestar su efecto por un mtodo apropiado; por ejemplo, por pase en sustratos que no contengan inhibidores o por dilu-
cin en un volumen mayor de medio antes de la prueba. Si se usa la dilucin, se pueden usar volmenes mayores de medio o
se puede dividir el volumen del inculo en varios matraces de 100 ml. La eficacia de la neutralizacin o de otros procesos se
controla repitiendo la prueba de sustancias inhibidoras despus de la neutralizacin.

Prueba para Micoplasmas en el Artculo o Material de Prueba

Inocular no menos de 1 O mL del artculo o material de prueba por 100 mL de cada medio lquido. Si ocurre un cambio de
pH significativo despus de la adicin del artculo o material de prueba, se restablece el valor original de pH del medio de
cultivo por medio de la adicin de una solucin estril de hidrxido de sodio o de cido clorhdrico. Inocular 0,2 mL del artcu-
lo o material de prueba en cada placa de medio slido. Incubar el medio lquido durante 20 a 21 das. Incubar el medio slido
durante no menos de 14 das, excepto para aquellas placas correspondientes al subcultivo de 20 a 21 das, las cuales se incu-
ban durante 7 das. Simultneamente, incubar una porcin de 100 mL, sin inculo, de cada medio lquido y placa de agar,
como control negativo. En los das 2 a 4 despus de la inoculacin, subcultivar cada medio lquido por inoculacin de 0,2 mL
al menos en 1 placa de cada medio slido. Repetir el procedimiento entre los das 6 y 8, de nuevo entre los das 1 3 y 15 y una
vez ms entre los das 19 y 21 de la prueba. Observar el medio lquido cada 2 3 das y si se presenta un cambio de color,
subcultivar. Si un medio lquido muestra contaminacin bacteriana o fngica, la prueba es invlida. La prueba es vlida si se
puede leer al menos 1 placa por medio y por da de inoculacin. Incluir en la prueba controles positivos preparados por inocu-
lacin de no ms de 100 ufc de al menos 1 microorganismo de prueba en medio de agar o caldo. Cuando se lleve a cabo la
prueba de deteccin de micoplasmas peridicamente, se recomienda utilizar los microorganismos de prueba en rotacin pe-
ridica. Los microorganismos de prueba usados son los listados en Eleccin de los Medios de Cultivo. Incubar los caldos nutritivos
y las placas en una atmsfera humidificada con condiciones microaeroflicas (5% a 10% de C0 2 ).

Interpretacin de los Resultados

Al finalizar el periodo de incubacin prescrito, examinar todos los medios slidos inoculados en busca de la presencia de
colonias de micoplasmas. El producto cumple con la prueba si no ha ocurrido crecimiento de las colonias tpicas de micoplas-
mas. El producto no cumple con la prueba si ha ocurrido crecimiento de las colonias tpicas de micoplasmas en cualquiera de
los medios slidos. La prueba es invlida si 1 o ms de los controles positivos no muestra crecimiento de micoplasmas al me-
nos en 1 placa de subcultivo. La prueba es invlida si 1 o ms de los controles negativos muestra crecimiento de micoplasmas.
Si se observan colonias sospechosas, usar un mtodo validado apropiado para determinar si se deben a micoplasmas.

Soluciones y Medios Recomendados para el Mtodo de Cultivo

NOTA-Esta seccin se proporciona como informacin.

SOLUCIONES

Caldo de infusin de Corazn Vacuno

Corazn vacuno (para preparar la infusin) 500 g
Peptona 10 g
Cloruro de sodio Sg
Agua destilada hasta 1000 ml
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 143

Vitaminas Esenciales
Biotina 100 mg
Pantotenato de calcio 100 mg
Cloruro de colina 100 mg
cido flico 100 mg
i-lnositol 200 mg
Nicotinamida 100 mg
Clorhidrato de piridoxal 100 mg
Riboflavina 10 mg
Clorhidrato de tiamina 100 mg
Agua destilada hasta 1000 m L

Agar, Purificado
Un agar altamente refinado para usar en microbiologa e inmunologa, preparado por un procedimiento de intercambio inico que da como resultado
un producto con superior pureza, claridad y poder gelificante. Contiene los siguientes ingredientes:
Agua 12,2%
Cenizas 1,5%
Cenizas insolubles en cido 0,2%
Cloro o
Fosfato (calculado como P2 0 5 ) 0,3%
Nitrgeno total 0,3%
Cobre 8 ppm
Hierro 170 ppm
Calcio 0,28%
Magnesio 0,32%

Solucin Salina Balanceada de Hanks (modificada)

Cloruro de sodio 6,4 g
Cloruro de potasio 0,32 g
Sulfato de magnesio heptahidrato 0,08 g
Cloruro de magnesio hexahidrato 0,08 g
Cloruro de calcio anhidro o, 112 g
Fosfato cido disdico dihidrato 0,0596 g
Fosfato dicido de potasio anhidro 0,048 g
Agua destilada hasta 800 ml

Infusin de Cerebro-Corazn
Infusin de cerebro de ternero 200 g
Infusin de corazn vacuno 250 g
Proteosa peptona 1o g
Glucosa monohidrato 2g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato cido disdico anhidro 2,5 g
Agua destilada hasta 1000 ml

Caldo PPLO
Infusin de corazn vacuno 50 g
Peptona 1o g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada hasta 1000 m L

MEDIOS

Se recomiendan los siguientes medios. Se pueden usar otros medios, siempre que cumplan los criterios dados en las seccio-
nes Eleccin de los Medios de Cultivo, Condiciones de Incubacin, Propiedades Nutritivas y Sustancias lnhibidoras.
144 (63) Pruebas para Micoplasmas J Pruebas Microbiolgicas USP 39

Medios de Hayfllck
recomen d ad o para 1a detecc I'on genera Id e m1cop asmas
Medio Lquido
Caldo de infusin de corazn vacuno 90,0 ml
Suero de caballo (sin calentar) 20,0 ml
Extracto de levadura (250 c/L) (se recomienda extracto de levadura fresca) 10,0 ml
Rojo de fenol (solucin de 0,6 g/L) 5,0 mL
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml
cido desoxirribonucleico (solucin de 2 g/L) 1,2 ml
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Slido
Preparar como se describi anteriormente, reemplazando el caldo de infusin de corazn vacuno por agar de infusin de corazn vacuno que canten-
qa 15 g/L de agar.

Medios de Frey
(recomenda do para la deteccI'on de M. synoviae)
Medio Lquido
Caldo de infusin de corazn vacuno 90,0 ml
Vitaminas esenciales 0,025 ml
Glucosa monohidrato (solucin de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (inactivado a 56 durante 30 min) 12,0ml
P -Nicotinamida adenina dinucletido (solucin de 1O g/L) 1,0 ml
Clorhidrato de cistena (solucin de 1O c/L) 1,0 ml
Rojo de fenal (solucin de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml
Mezclar las soluciones de p -nicotinamida adenina dinucletido y clorhidrato de cistena y despus de 1O minutos agregar a los dems ingredientes.
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Slido
Caldo de infusin de corazn vacuno 90,0 ml
Agar, purificado 1,4 q
Ajustar a un pH de 7,8; esterilizar en autoclave y lueqo agregar:
Vitaminas esenciales 0,025 ml
Glucosa monohidrato (solucin de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (sin calentar) 12,0 ml
p -Nicotinamida adenina dinucletido (solucin de 1O g/L) 1,0 ml
Clorhidrato de cistena (solucin de 1O g/L) 1,0 ml
Rojo de fenal (solucin de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml

Medios de Frlls
(recomendado para la deteccin de mlcoplasmas no aviares)
Medio Lquido
Solucin salina balanceada de Hanks (modificada) 800 ml
Agua destilada 67 mL
Infusin de cerebro-corazn 135 ml
Caldo PPLO 248 ml
Extracto de levadura (170 g/L) 60 ml
Bacitracina 250 mg
Meticilina 250 mg
Rojo de fenal (5 g/L) 4,5 ml
Suero de caballo 165 mL
Suero de cerdo 165 ml
Ajustar a un pH de 7,40 a 7,45
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 145

Medios de Frlls
(recomendado para la deteccin de micoplasmas no aviares) (Continuacin)
Medio Slido
Solucin salina balanceada de Hanks (modificada) 200 ml
DEAE-dextrano 200 mg
Agar, purificado 15,65 g
Mezclar bien y esterilizar en autoclave. Enfriar a 100. Agregar a 1740 ml de Medio Lquido como se describi anteriormente.

MTODO DE CULTIVO DE CLULAS INDICADORAS

Los cultivos celulares se tien con un colorante fluorescente que se une al ADN. Los micoplasmas se detectan por su patrn
de fluorescencia filamentoso o particulado caracterstico sobre la superficie celular y, si la contaminacin es abundante, en las
reas vecinas. Las mitocondrias en el citoplasma se pueden teir pero se distinguen fcilmente de los micoplasmas. Para sus-
pensiones virales, si la interpretacin de los resultados se ve afectada por efectos citopticos marcados, neutralizar el virus
usando un antisuero especfico que no tenga efectos inhibidores sobre los micoplasmas o usar un sustrato de cultivo celular
que no permita el crecimiento del virus. Para demostrar la ausencia de efectos inhibidores del suero, efectuar las pruebas con
controles positivos en presencia y ausencia del antisuero.

Verificacin del Sustrato

Usar clulas Vero o un cultivo celular equivalente (por ejemplo, la lnea de clulas de produccin) que tenga una eficacia
equivalente para detectar micoplasmas. Probar la eficacia de las clulas que se van a usar aplicando el procedimiento descripto
a continuacin e inoculando no ms de 100 ufc o ucc de microorganismos de cepas de referencia adecuadas de M. hyorhinis y
M. ora/e. Las clulas son adecuadas si se detectan ambas cepas de referencia. Las clulas indicadoras se deben subcultivar sin
antibiticos antes de usarlas en la prueba.

Mtodo de Prueba
NOTA-Lo siguiente se proporciona como informacin.

SOLUCIONES

Solucin Salina Amortiguada con Fosfato

Fosfato Monobsico de Potasio 2,0 M-Disolver 13,61 g de fosfato monobsico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Fosfato Dibsico de Potasio 2,0 M-Disolver 17,42 g de fosfato dibsico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Solucin Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4)-Combinar 3,6 mL de Fosfato Monobsico de Potasio 2,0 M, 16,4 mL de
Fosfato Dibsico de Potasio 2,0 M, 8 g de cloruro de sodio, y 1 L de agua. Mezclar bien. Ajustar el pH si fuera necesario.
Solucin Madre de Bisbenzimida-Disolver 5 mg de bisbenzimida en agua y diluir con el mismo disolvente hasta 100 ml.
Almacenar en la oscuridad.
Solucin de Trabajo de Bisbenzimida-lnmediatamente antes de usar, diluir 100 L de Solucin Madre de Bisbenzimida
con Solucin Salina Amortiguada con Fosfato (pH 1,4) hasta 100 ml.
Solucin Amortiguadora de Fosfato-Citrato de pH 5,5-Mezclar 56,85 mL de una solucin de 28,4 g/L de fosfato cido
disdico anhidro y 43, 15 mL de una solucin de 21 g/L de cido ctrico.

MTODO

1. Sembrar el cultivo de clulas indicadoras con una densidad apropiada (por ejemplo, 2 x 104 a 2 x 1os clulas/mL, 4 x 1 Q3 a
2,5 x 104 clulas/cm 2 ) que lleven a la confluencia despus de 3 das de crecimiento. Inocular 1 mL del producto a exami-
nar en el recipiente con cultivo celular e incubar a 36 1.
2. Despus de 3 das de incubacin como mnimo, cuando las clulas hayan alcanzado la confluencia, hacer un subcultivo
sobre cubreobjetos en recipientes adecuados o sobre alguna otra superficie (por ejemplo, portaobjetos con cmara para
cultivo) adecuada para el procedimiento de prueba. Sembrar las clulas con baja densidad, de forma que puedan alcanzar
una confluencia del 50% despus de 3 a 5 das de incubacin. La confluencia completa impide la visualizacin de mico-
plasmas despus de la tincin y debe evitarse.
3. Retirar el medio y enjuagar las clulas indicadoras con solucin salina amortiguada con fosfato, pH 7,4; luego agregar una
solucin fijadora adecuada (una mezcla recin preparada de 1 volumen de cido actico glacial SR y 3 volmenes de me-
tano! se considera adecuada cuando se usa bisbenzimida para la tincin).
4. Retirar la solucin fijadora y lavar las clulas con Agua Purificada estril. Secar los portaobjetos completamente si se van a
colorear ms de 1 hora despus (es preciso tener especial cuidado cuando se colorean las lminas despus del secado
debido a los artefactos que se podran producir).
146 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiolgicas USP 39

5. Agregar un colorante apto para ADN y dejar en reposo durante el tiempo adecuado (la solucin de trabajo de bisbenzimi-
da y un tiempo de reposo de 1O minutos se consideran adecuados).
6. Retirar el colorante y enjuagar la monocapa con Agua Purificada.
7. Montar cada cubreobjetos, cuando corresponda (una mezcla de volmenes iguales de glicerol y Solucin Amortiguadora
de Fosfato-Citrato de pH 5,5 es apropiada para el montaje). Examinar por fluorescencia (para la coloracin con bisbenzimi-
da resulta apropiado usar un filtro de excitacin de 330 nm a 380 nm y un filtro de barrera LP de 440 nm) con un au-
mento de 400x o mayor.
8. Comparar la apariencia microscpica de los cultivos de prueba con la de los controles negativos y positivos, buscando
fluorescencia extranuclear. Los micoplasmas producen puntitos o filamentos en el citoplasma de la clula indicadora.
Tambin pueden producir puntitos y filamentos en los espacios intercelulares. Siguiendo el protocolo establecido durante
la validacin, se examinan mltiples campos microscpicos.

Interpretacin de los Resultados

El producto a examinar cumple con la prueba si no est presente la fluorescencia tpica de los micoplasmas. La prueba es
invlida si los controles positivos no presentan la fluorescencia tpica de los micoplasmas. La prueba es invlida si los controles
negativos presentan la fluorescencia tpica de los micoplasmas.

(71) PRUEBAS DE ESTERILIDAD

Algunas partes de este captulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea
y/o la Farmacopea Japonesa. Las partes no armonizadas estn marcadas con los smbolos (+.) para indicar esta situacin .
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseado para garantizar que una partida de un producto es estril o ha sido
esterilizada. Esta garanta se consigue principalmente mediante la validacin del proceso de esterilizacin o de los procedi-
mientos del procesamiento asptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artculos cuya esterilidad es requerida por Ja Farmacopea. Sin embargo, un resul-
tado satisfactorio nicamente indica que no se han encontrado microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las
condiciones de la prueba.

PRECAUCIONES CONTRA LA CONTAMINACIN MICROBIANA

La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones aspticas, por lo que, para lograr tales condiciones, el entorno de la
prueba debe adaptarse a la manera en que sta se realice. Las precauciones para evitar la contaminacin se deben tomar de
modo tal que no se afecte a ningn microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en las
que se efectan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del rea de trabajo y la realizacin
de controles apropiados.

MEDIOS DE CULTIVO Y TEMPERATURAS DE INCUBACIN

Los medios para la prueba se pueden preparar segn se indica a continuacin o se pueden usar medios equivalentes dispo-
nibles comercialmente siempre y cuando cumplan con los requisitos de la Prueba de Promocin del Crecimiento de Organismos
Aerobios, Anaerobios y Hongos.
Se ha hallado que los medios de cultivo siguientes son adecuados para la prueba de esterilidad. El Medio Lquido de Tioglico-
lato sirve principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo, tambin detecta bacterias aerobias. El Medio de
Digerido de Casena y Soja es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias aerobias.
Medio Lquido de Tioglicolato
L-Cistina 0,5 g
Cloruro de Sodio 2,5 g
Dextrosa Monohidrato/ Anhidra 5,5/5,0 g
Agar 0,75 g
Extracto de Levadura (soluble en agua) 5,0 g
Digerido Pancretico de Casena 15,0 g
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 147

Medio Lquido de Tioglicolato (Continuacin)

Tioglicolato de Sodio 0,5 g
o cido Tiogliclico 0,3 mL
Solucin de Resazurina Sdica (1 en 1000), recin preparada 1,0 mL
Agua Purificada 1000 mL

El pH despus de la esterilizacin es de 7, 1 0,2.

Mezclar la L-cistina, el agar, el cloruro de sodio, la dextrosa, el extracto de levadura y el digerido pancretico de casena con
el agua purificada y calentar hasta su disolucin. Disolver el tioglicolato de sodio o el cido tiogliclico en la solucin y, de ser
necesario, agregar hidrxido de sodio 1 N de modo que, despus de la esterilizacin, la solucin tenga un pH de 7, 1 0,2. Si
se requiere filtracin, calentar nuevamente la solucin sin llegar a ebullicin y filtrar mientras est caliente a travs de un papel
de filtro humedecido. Agregar la solucin de resazurina sdica, mezclar y colocar el medio en recipientes adecuados, de forma
que la relacin entre superficie y profundidad sea tal que no ms de la mitad superior del medio haya experimentado un cam-
bio de color indicativo de la captacin de oxgeno al final del perodo de incubacin. Esterilizar usando un proceso validado. Si
el medio se almacena, mantenerlo a una temperatura entre 2 y 25 en un envase estril y hermtico. Si una porcin mayor
que el tercio superior del medio ha adquirido un color rosado, el medio puede recuperarse una vez calentando los recipientes
en un bao de agua o en vapor fluente hasta que desaparezca el color rosado, y enfriar rpidamente tratando de evitar la
entrada de aire no estril en el recipiente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento ms largo que el que ha sido
validado.
El Medio Lquido de Tioglicolato debe incubarse a 30-35. Para productos que contienen un conservante mercurial que no se
pueden analizar mediante el mtodo de filtracin por membrana, se puede utilizar Medio Lquido de Tioglicolato incubado a
20-25 en lugar de Medio de Digerido de Casena y Soja, siempre y cuando haya sido validado segn se indica en Prueba de
Promocin del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Es posible utilizar el siguiente medio de tioglicolato
alternativo para los casos en que se prescriba o justifique y autorice. Preparar una mezcla que tenga la misma composicin que
la del Medio Lquido de Tioglicolato, pero omitiendo el agar y la solucin de resazurina sdica. Esterilizar segn se indica ante-
riormente. El pH despus de la esterilizacin es 7,1 0,2. Calentar en un bao de agua antes de usar e incubar a 30-35 bajo
condiciones anaerbicas.
Medio de Digerido de Casena y Soja
Digerido Pancretico de Casena 17,0 g
Digerido Papanico de Harina de Soja 3,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Fosfato Dibsico de Potasio 2,5 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra 2,5/2,3 g
Agua Purificada 1000 ml

El pH despus de la esterilizacin es de 7,3 0,2.

Disolver los slidos en el Agua Purificada, calentando ligeramente hasta lograr la disolucin. Enfriar la solucin a temperatura
ambiente y ajustar el pH con hidrxido de sodio 1 N de modo que, despus de la esterilizacin, se obtenga un pH de 7,3
0,2. Filtrar el medio si fuera necesario para lograr una solucin transparente, y verter en recipientes adecuados y esterilizar
usando un procedimiento validado. Almacenar a temperatura entre 2 y 25 en un recipiente estril y bien cerrado, a menos
que se use inmediatamente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento ms largo que el que ha sido validado.
El Medio de Digerido de Casena y Soja debe incubarse a 22,5 2,5.

Medios para Penicilinas o Cefalosporinas

Cuando deban usarse medios de prueba de esterilidad en el mtodo de Inoculacin Directa del Medio de Cultivo que se indica
en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar, modificar la preparacin del Medio Lquido de Tioglico/ato y del Medio de Digeri-
do de Casena y Soja segn se indica a continuacin. Transferir aspticamente a los recipientes de cada medio una cantidad de
f3 -lactamasa suficiente para inactivar la cantidad de antibitico presente en la muestra de prueba. Determinar la cantidad de
/3 -lactamasa requerida para inactivar el antibitico empleando una preparacin de f3 -lactamasa cuyo poder inactivante de pe-
nicilinas o cefalosporinas haya sido valorado previamente. [NOTA-Los medios complementados con /J-lactamasa tambin
pueden usarse en la prueba de filtracin por membrana.]
Alternativamente (en un lugar completamente separado del usado para las pruebas de esterilidad), confirmar que se incor-
pora una cantidad adecuada de /3 -lactamasa en el medio, siguiendo cualquiera de los dos mtodos indicados en Prueba de
Aptitud del Mtodo, usando como desafo menos de 100 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococcus aureus (ver
Tabla 7). Debe observarse un crecimiento microbiano tpico del cultivo inoculado como confirmacin de que la concentracin
de f3 -lactamasa es adecuada .
148 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiolgicas USP 39

Tabla 1. Cepas de Microorganismos de Prueba Adecuados para Usar en la Prueba de Promocin del Crecimiento y en la
Prueba de Aptitud del Mtodo
Bacterias Aerobias
Staphylocaccus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa \ ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bacteria anaerobia
Clostridium sporogenes 2 ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC 14293
Hongos
Candida a/bicans ATCC 10231, IP48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis (Aspergillus Nger) ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
1 Un microorganismo alternativo es Kocuria rhizophifo (Micrococcus futeus) ATCC 9341 .
2 Una alternativa para Clostridium sporogenes, cuando se desea usar un microorganismo no formador de esporas, es Bacteroides vufgatus (ATCC 8482) .

Los medios usados cumplen con las pruebas siguientes, realizadas antes o en forma paralela, con la prueba sobre el produc-
to a examinar.

Esterilidad

Incubar porciones del medio durante 14 das. No se produce crecimiento de ningn organismo.

Prueba de Promocin del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos

Evaluar cada lote de medio listo para usar, y cada partida de medio preparado ya sea a partir de medio deshidratado o mez-
clando los ingredientes. Las cepas adecuadas de microorganismos se indican en la Tabla 1.
Inocular porciones de Medio Lquido de Tioglicolato con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) de los microorganismos
siguientes, usando una porcin de medio distinta para cada una de las especies: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aerugino-
sa y Staphylococcus aureus. Inocular porciones de medio de tioglicolato alternativo con un nmero pequeo (no ms de 100
ufc) de Clostridium sporogenes . Inocular porciones de Medio de Digerido de Casena y Soja con un nmero pequeo (no ms de
100 ufc) de los microorganismos siguientes, usando una porcin de medio distinta para cada una de las especies: Aspergillus
brasiliensis, Bacillus subtilis y Candida albicans. Incubar durante no ms de 3 das en el caso de bacterias y durante no ms de 5
das en el caso de hongos. Las tcnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan
para que los microorganismos viables empleados para la inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de
siembra maestro original.
Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos.

LQUIDOS DE DILUCIN V LAVADO PARA FILTRACIN POR MEMBRANA

Lquido A

PREPARACIN

Disolver 1 g de digerido pptico de tejido animal en agua para obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para clarificar, si fuera
necesario, y ajustar a un pH de 7, 1 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado.

PREPARACIN PARA PENICILINAS O CEFALOSPORINAS

Agregar aspticamente a la Preparacin anterior, si fuera necesario, una cantidad de fJ-lactamasa estril suficiente para inac-
tivar cualquier actividad residual de antibiticos en las membranas despus de haber filtrado la solucin de la muestra de prue-
ba (ver Medios para Penicilinas o Cefalosporinas).

Lquido D

Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Lquido A, y ajustar a un pH de 7, 1 0,2. Transferir a envases y esterilizar
empleando un proceso validado. Usar este lquido para artculos que contengan lecitina o aceite, o para dispositivos etiqueta-
dos "para administracin estril".
USP 39 Pruebas Microbiolgicas / (71) Pruebas de Esterilidad 149

Lquido K

Disolver 5,0 g de digerido pptico de tejido animal, 3,0 g de extracto de carne bovina y 10,0 g de polisorbato 80 en agua
para obtener 1 litro. Ajustar el pH para obtener, despus de la esterilizacin, un pH de 6,9 0,2. Transferir a envases y esterili-
zar empleando un proceso validado .

PRUEBA DE APTITUD DEL MTODO

Llevar a cabo una prueba segn se describe ms adelante en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar usando exacta-
mente los mismos mtodos, a excepcin de las modificaciones siguientes.

Filtracin por Membrana

Despus de transferir a la membrana el contenido del envase o envases a analizar, agregar un inculo de un nmero peque-
o de microorganismos viables (no ms de 100 ufc) en la porcin final del diluyente estril usado para enjuagar el filtro.

Inoculacin Directa

Despus de transferir al medio de cultivo el contenido del envase o envases a analizar (para catgut y otros materiales de
sutura quirrgica para uso veterinario: hebras), agregar al medio un inculo de un nmero pequeo de microorganismos via-
bles (no ms de 100 ufc).
En ambos casos, usar los mismos microorganismos que los mencionados anteriormente en Prueba de Promocin del Creci-
miento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Realizar una prueba de promocin del crecimiento como control positivo.
Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no ms de 5 das.
Si despus de la incubacin se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con
el del recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal
actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones.
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, comparable visualmente con el de
los recipientes de control sin producto, el producto posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente
en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la Prueba
de Aptitud del Mtodo.
Esta prueba de aptitud del mtodo se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad tiene que realizarse en un producto
nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del mtodo
podr llevarse a cabo simultneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.

PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL PRODUCTO A EXAMINAR

Nmero de Artculos a Evaluar

A menos que se especifique algo diferente en otra parte de este captulo o en la monografa individual, evaluar el nmero de
artculos especificado en la Tabla 3. Si el contenido de cada artculo est en cantidad suficiente, (ver la Tabla 2) se puede divi-
dir para agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones iguales y apropiadas. [NOTA-Realizar las pruebas de
esterilidad empleando dos o ms de los medios especificados.] Si cada artculo no contiene las cantidades suficientes para cada
medio, usar el doble del nmero de artculos indicado en la Tabla 3.
Tabla 2. Cantidad Mnima a Usar para cada Medio
Cantidad Mnima a Usar
Cantidad por Envase (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Lquidos
Menos de 1 ml El contenido total de cada envase
1-40 ml La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 1 ml
Ms de 40 ml y no ms de 100 ml 20 ml
Ms de 100 ml 10% del contenido del envase, pero no menos de 20 ml
Lquidos antibiticos 1 ml
Preparaciones insolubles, cremas y ungentos que deben suspenderse o emul- Usar el contenido de cada envase para suministrar no menos de 200 mg
sionarse
150 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Mcrobolgcas USP 39

Tabla 2. Cantidad Mnima a Usar para cada Medio (Continuacin)

Cantidad Mnima a Usar
Cantidad por Envase (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Slidos
Menos de 50 mg El contenido total de cada envase
50 mg o ms, pero menos de 300 mg La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg
300 mg-5 g 150 mg
Ms de 5 g 500 mg
Catgut y otros materiales de sutura quirrgica para uso veterinario 3 secciones de una hebra (cada una de 30 cm de longitud)
Apsito quirrgico/algodn/gasa (en envases) 100 mg por envase
Material de sutura y otro material de un solo uso envasado individualmen- El dispositivo completo
te
Otros dispositivos mdicos El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado.

Tabla 3. Nmero Mnimo de Artculos a Evaluar en Relacin con el Nmero de Artculos en la Partida
Nmero Mnimo de Artculos a Analizar para cada Medio
Nmero de Artculos en la Partida* (a menos que se justifique y autorice algo diferente)**
Preparaciones parenterales
No ms de 100 envases 10% o 4 envases, lo que resulte mayor
Ms de 100 pero no ms de 500 envases 1 O envases
Ms de 500 envases 2% o 20 envases, lo que resulte menor
Para preparaciones parenterales de gran volumen 2% o 1O envases, lo que resulte menor
Antibiticos slidos
Envases a granel para farmacias (<5 g) 20 envases
Envases a granel para farmacias (2:5 g) 6 envases
Graneles y mezclas Ver Productos slidos a granel.
Preparaciones oftlmicas y otras preparaciones no inyectables
No ms de 200 envases 5% o 2 envases, lo que resulte mayor
Ms de 200 envases 1O envases
Si el producto se presenta en la forma de envases monodosis, aplicar el
esquema mostrado anteriormente para preparaciones para uso parente-
ral.
Catgut y otros materiales de sutura quirrgica para uso veterinario 2% o 5 envases, lo que resulte mayor, hasta un total mximo de 20 enva-
ses
No ms de 1 00 artculos 10% o 4 artculos, lo que resulte mayor
Ms de 1 00, pero no ms de 500 artculos 1O artculos
Ms de 500 artculos 2% o 20 artculos, lo que resulte menor.
Productos slidos a granel
Hasta 4 envases Cada envase
Ms de 4 envases, pero no ms de 50 envases 20% o 4 envases, lo que resulte mayor
Ms de 50 envases 2% o 1O envases, lo que resulte mayor
* Si no se conoce el tamao de la partida, usar el nmero mximo de artculos prescritos.
** Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna da el nmero de envases necesarios para los dos medios juntos.

La prueba puede llevarse a cabo mediante la tcnica de Filtracin por Membrana o por Inoculacin Directa del Medio de Cultivo
con el producto a examinar. Se incluyen controles negativos adecuados. La tcnica de filtracin por membrana se usa cuando
la naturaleza del producto lo permite, es decir, para preparaciones acuosas filtrables, para preparaciones alcohlicas o aceitosas
y para preparaciones miscibles con, o solubles en, disolventes acuosos o aceitosos, siempre que dichos disolventes no posean
un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.

Filtracin por Membrana

Usar filtros de membrana con un tamao nominal de poro no mayor de 0,45 m, cuya eficacia para retener microorganis-
mos haya sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo con-
tenido alcohlico; y se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones con alto contenido alcohlico. Es posi-
ble que para ciertos productos (p.ej., antibiticos) se necesiten filtros especialmente adaptados.
La tcnica descrita ms adelante supone que se usarn membranas de aproximadamente 50 mm de dimetro. Si se usan
filtros de un dimetro diferente, los volmenes de las diluciones y los lavados deben ajustarse segn corresponda. El aparato de
filtracin y la membrana se esterilizan usando tcnicas adecuadas. El aparato se disea de tal modo que la solucin a examinar
USP 39 Pruebas Microbiolgicas / (71) Pruebas de Esterilidad 151

se pueda introducir y filtrar en condiciones aspticas: permite retirar aspticamente la membrana para transferirla al medio de
cultivo, o es adecuado para llevar a cabo la incubacin dentro del aparato mismo despus de agregarle el medio.

SOLUCIONES ACUOSAS

Si corresponde, transferir una pequea cantidad de un diluyente estril adecuado, como por ejemplo el Lquido A (ver Lqui-
dos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana),. a la membrana en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener
sustancias neutralizantes adecuadas y/o sustancias inactivantes apropiadas, por ejemplo, en el caso de los antibiticos.
Transferir a la membrana o membranas el contenido del envase o envases a analizar, si fuera necesario, despus de diluirlo
hasta el volumen usado en la Prueba de Aptitud del Mtodo con el diluyente estril elegido, pero usando no menos de las canti-
dades del producto a examinar indicadas en las Tablas 2 y 3. Filtrar inmediatamente. Si el producto posee propiedades antimi-
crobianas, lavar la membrana no menos de tres veces, filtrando en cada lavado el volumen del diluyente estril elegido usado
en la Prueba de Aptitud del Mtodo. El ciclo de lavado no debe exceder de cinco lavados con 100 mL por filtro, cada uno, inclu-
so si durante la prueba de aptitud del mtodo se ha demostrado que tal ciclo no elimina por completo la actividad antimicro-
biana. Transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla aspticamente en dos partes iguales y transferir cada
mitad a sendos medios adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio que el empleado en la Prueba de Aptitud del Mto-
do. Alternativamente, transferir el medio a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos de 14 das.

SLIDOS SOLUBLES

Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3 disuelto en un disolvente adecua-
do, como por ejemplo el disolvente suministrado con la preparacin, Agua Estril para Inyeccin, solucin salina estril o una
solucin estril adecuada como por ejemplo Lquido A (Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana),. y proceder
con la prueba segn lo indicado anteriormente para Soluciones Acuosas usando una membrana adecuada para el disolvente
elegido.

ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS

Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3. Los aceites y las soluciones oleosas
de viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilucin a travs de una membrana seca. Los aceites viscosos se pue-
den diluir segn sea necesario con un diluyente estril adecuado, como por ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demos-
trado no tener actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba. Dejar que el aceite penetre la membrana por su pro-
pio peso y, a continuacin, filtrar, aplicando presin o succin gradualmente. Lavar la membrana al menos tres veces filtrando
cada vez aproximadamente 100 mL de una solucin estril adecuada, como por ejemplo el Lquido A (ver Lquidos de Dilucin
y Lavado para Filtracin por Membrana),. que contenga un agente emulsionante adecuado a una concentracin que haya de-
mostrado ser apropiada en la Prueba de Aptitud del Mtodo, como por ejemplo polisorbato 80 a una concentracin de 1Og por
L (Lquido K) . Transferir la membrana o membranas al medio o medios de cultivo, o viceversa, segn lo descrito anteriormen-
te para Soluciones Acuosas e incubar a las mismas temperaturas y durante los mismos tiempos.

UNGENTOS Y CREMAS

Usar para cada medio no menos de las cantidades de producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Los ungentos en base grasa y
las emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1% en miristato de isopropilo segn lo descrito anteriormente, calen-
tando si fuera necesario a no ms de 40. Es probable que en casos excepcionales se requiera calentar hasta no ms de 44.
Filtrar tan rpidamente como sea posible y proceder segn lo descrito anteriormente para Aceites y Soluciones Oleosas.

JERINGAS PRELLENADAS

Para jeringas prellenadas sin agujas estriles acopladas, expulsar el contenido de cada jeringa en uno o dos embudos para
filtracin por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la transferencia. Si se adjunta una aguja estril, ex-
pulsar directamente el contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y proceder segn lo descrito para Solu-
ciones Acuosas. Evaluar la esterilidad de la aguja mediante el procedimiento de Inoculacin Directa que se indica en Prueba de
Aptitud del Mtodo.

SLIDOS PARA INYECCIN DISTINTOS DE ANTIBITICOS

Reconstituir los artculos de prueba segn las instrucciones de la etiqueta y proceder segn lo indicado para Soluciones Acuo-
sas o Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. [NOTA-Si fuera necesario, se puede agregar diluyente en exceso
para facilitar la reconstitucin y filtracin del artculo de prueba reconstituido.]
152 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiolgicas USP 39

ANTIBITICOS SLIDOS PARA INYECCIN

Envases a Granel para Farmacias, <5 g-Tomar una cantidad aproximada a 300 mg de slido de cada uno de 20 envases,
transferir aspticamente a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A (ver
Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana) y mezclar; o bien, reconstituir segn lo indicado en la etiqueta,
cada uno de 20 envases y transferir una cantidad de lquido o suspensin que equivalga aproximadamente a 300 mg de slido
a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y mezclar. Proceder segn lo
indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar.
Envases a Granel para Farmacias, ~5 g-Tomar aproximadamente 1 g de slido de cada uno de 6 envases, transferir asp-
ticamente a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y mezclar; o bien,
reconstituir segn lo indicado en la etiqueta, cada uno de 6 envases y transferir una cantidad de lquido que equivalga aproxi-
madamente a 1 g de slido a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y
mezclar. Proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas.

ANTIBITICOS SLIDOS, GRANELES Y MEZCLAS

Retirar aspticamente una cantidad suficiente de slido de la cantidad adecuada de envases (ver Tabla 2), mezclar hasta ob-
tener una mezcla que equivalga aproximadamente a 6 g de slido y transferir a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL. Disol-
ver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y mezclar. Proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas.

PRODUCTOS ESTRILES EN AEROSOL

Para productos lquidos en forma de aerosol presurizado, congelar los envases en una mezcla de hielo seco y alcohol por lo
menos a -20 durante aproximadamente 1 hora. Si es posible, dejar que el propelente escape antes de abrir aspticamente el
envase y transferir el contenido a un recipiente de combinacin estril. Agregar 100 mL de Lquido D al recipiente de combina-
cin y mezclar suavemente. Proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, segn co-
rresponda.

DISPOSITIVOS CON GUAS QUE DECLARAN SER ESTRILES

Pasar aspticamente un volumen de Lquido D no inferior a 1 O veces el volumen de las guas a travs de cada dispositivo
analizado. Recoger los lquidos en un recipiente estril adecuado y proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites
y Soluciones Oleosas, segn corresponda.
En el caso de jeringas vacas estriles, extraer diluyente estril hacia el mbolo a travs de la aguja estril, si est acoplada, o
a travs de una aguja estril acoplada para el propsito de la prueba y expulsar el contenido en un recipiente de combinacin
estril. Proceder segn lo indicado anteriormente .

Inoculacin Directa del Medio de Cultivo

Transferir directamente en el medio de cultivo la cantidad de la preparacin a examinar que se indica en las Tablas 2 y 3, de
modo que el volumen del producto no sea mayor que el 10% del volumen del medio, a menos que se indique algo diferente.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, realizar la prueba despus de neutralizar esta actividad con una
sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilucin en una cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario
usar un volumen grande del producto, probablemente sea preferible usar un medio de cultivo concentrado preparado de tal
modo que se tenga en cuenta la dilucin subsiguiente. Cuando corresponda, el medio concentrado podr agregarse directa-
mente al producto en su envase.

LQUIDOS OLEOSOS

Usar medios a los que se les haya agregado un agente emulsionante apropiado a una concentracin que haya demostrado
ser adecuada en la Prueba de Aptitud del Mtodo, por ejemplo polisorbato 80 a una concentracin de 1Og por L.

UNGENTOS Y CREMAS

Realizar una dilucin de aproximadamente 1 en 1 O, emulsionando con el agente elegido en un diluyente estril adecuado,
como por ejemplo el Lquido A (ver Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana) . Transferir el producto diluido
a un medio que no contenga agente emulsionante.
Incubar los medios inoculados durante no menos de 14 das. Observar los cultivos varias veces durante el perodo de incuba-
cin. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos todos los das. Sin embargo, cuando se use Medio Lqui-
USP 39 Pruebas Microbiolgicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 153

do de Tioglicolato para detectar microorganismos anaerobios, agitar o mezclar mnimamente con el fin de mantener las condi-
ciones anaerobias.

CATGUT Y OTROS MATERIALES DE SUTURA QUIRRGICA PARA USO VETERINARIO

Usar para cada medio no menos de las cantidades del producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Abrir el envase sellado tenien-
do en cuenta las precauciones de asepsia y retirar tres secciones de la hebra para cada medio de cultivo. Llevar a cabo la prue-
ba sobre las tres secciones, cada una de 30 cm de longitud, que se han cortado al comienzo, medio y final de la hebra. Usar
hebras completas de envases recin abiertos. Transferir cada una de las secciones de la hebra a los medios elegidos. Usar sufi-
ciente medio para cubrir adecuadamente el material a analizar (de 20 mL a 150 mL).

SLIDOS

Transferir una cantidad de producto en forma de slido seco (o preparar una suspensin del producto agregando diluyente
estril al envase primario) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las Tablas 2 y 3. Transferir el material as
obtenido a 200 mL de Medio Lquido de Tioglicolato y mezclar. Del mismo modo, transferir la misma cantidad a 200 mL de
Medio de Digerido de Casena y Soja y mezclar. Proceder segn lo indicado anteriormente.

ALGODN PURIFICADO, GASA, APSITOS QUIRRGICOS Y ARTCULOS RELACIONADOS

De cada envase de algodn, vendas de gasa enrollada o apsitos quirrgicos grandes que se deba evaluar, extraer asptica-
mente dos o ms porciones de 100 a 500 mg cada una de la parte ms interna de la muestra. Para materiales de un solo uso
envasados individualmente, extraer aspticamente todo el artculo. Sumergir las porciones o el artculo en cada medio y proce-
der segn lo indicado anteriormente.

DISPOSITIVOS ESTRILES

Los artculos pueden sumergirse ensamblados o desmontados. Para asegurar que los conductos del dispositivo tambin es-
tn en contacto con los medios, sumergir la cantidad adecuada de unidades en un volumen de medio suficiente para sumergir
completamente el dispositivo y proceder segn lo indicado anteriormente. Para dispositivos extremadamente grandes, sumer-
gir aquellas porciones del dispositivo que han de entrar en contacto con el paciente en un volumen de medio suficiente para
lograr la inmersin completa de esas porciones.
Para catteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte externa, cortarlos en piezas de modo que
el medio entre en contacto con todo el lumen, o llenar el lumen con medio y sumergir la unidad intacta .

OBSERVACIN E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

A intervalos durante el perodo de incubacin, y al momento de su finalizacin, examinar los medios en busca de evidencias
macroscpicas de crecimiento microbiano. Si el material que se est evaluando enturbia el medio de modo que no puede de-
terminarse fcilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano mediante examen visual, transferir porciones de me-
dio (no menores de 1 mL cada una) 14 das despus de comenzada la incubacin, a recipientes nuevos con el mismo medio y,
a continuacin, incubar el recipiente original y el de transferencia durante no menos de 4 das.
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se ha-
llan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda
demostrarse claramente que la prueba result invlida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba pue-
de considerarse invlida slo si se cumplen una o ms de las siguientes condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiolgico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla.
b. Una revisin del procedimiento analtico usado durante la prueba en cuestin revela un error.
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
d. Despus de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o espe-
cies) puede atribuirse de manera inequvoca a errores con respecto al material o a la tcnica usados al realizar el procedi-
miento de la prueba de esterilidad.
Si la prueba se declara invlida, se repetir con el mismo nmero de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas
de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad.
154 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiolgicas USP 39

APLICACIN DE LA PRUEBA A PREPARACIONES PARENTERALES, OFTLMICAS Y OTRAS

PREPARACIONES NO INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

Al usar la tcnica de filtracin por membrana, utilizar, siempre que sea posible, el contenido total del envase, pero no menos
de las cantidades indicadas en las Tablas 2, diluyendo cuando sea necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solucin
estril adecuada, como por ejemplo el Lquido A (ver Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana) .
Al usar la tcnica de inoculacin directa de medios, usar las cantidades que se muestran en la Tabla 2, a menos que se justifi-
que y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad bacteriana y fngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del pro-
ducto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un nico envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usar
el contenido de dos o ms envases para inocular los distintos medios.

NMERO MNIMO DE ARTCULOS A ANALIZAR

En la Tabla 3 se indica el nmero mnimo de artculos a analizar en relacin con el tamao de la partida.

Pruebas y Valoraciones Biolgicas

(81) ANTIBITICOS-VALORACIONES MICROBIOLGICAS

INTRODUCCIN E INFORMACIN GENERAL

En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibiticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
microorganismos. La reduccin en la actividad microbiana puede ser difcil de demostrar por mtodos qumicos. Este captulo
resume los procedimientos para antibiticos reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valora-
cin microbiolgica es el mtodo analtico estndar.
Se utilizan dos tcnicas generales: la valoracin en cilindro-placa (o en placa) y la valoracin turbidimtrica (o en tubo). La
Tabla 7 lista todos los antibiticos que incluyen valoraciones microbiolgicas y especifica el tipo de valoracin (cilindro-placa o
turbidimtrica).
Tabla 1
Antibitico Tipo de Valoracin
Amfotericina B Cilindro-placa
Bacitracina Cilindro-placa
Bleomicina Cilindro-placa
Capreomicina Turbidimtrica
Carbenicilina Cilindro-placa
Cloranfenicol Turbidimtrica
Clortetraciclina Turbidimtrica
Cloxacilina Cilindro-placa
Colistimetato Cilindro-placa
Colistina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Dihidroestreptomicina Turbidimtrica
Eritromicina Cilindro-placa
Gentamicina Cilindro-placa
Gramicidina Turbidimtrica
Nafcilina Cilindro-placa
Natamicina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Neomicina Turbidimtrica
 USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 155

Tabla 1 (Continuacin)
Antibitico Tipo de Valoracin
Novobiocina Cilindro-placa
Nistatina Cilindro-placa
Oxitetraciclina Turbidimtrica
Paromomicina Cilindro-placa
Penicilina G Cilindro-placa
Polimixina B Cilindro-placa
Sisomicina Cilindro-placa
Tetraciclina Turbidimtrica
Tioestreptona Turbidimtrica
Troleandomicina Turbidimtrica
Tilosina Turbidimtrica
Vancomicina Cilindro-placa

[NOTA-Realizar todos los procedimientos descritos en las monografas aspticamente. Tomar las precauciones de seguridad
adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles alergias a los frmacos y a que se usan cultivos vivos de organis-
mos en los procedimientos]
Valoracin en cilindro-placa: La valoracin en cilindro-placa se basa en la difusin del antibitico desde un cilindro vertical a
travs de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El crecimiento del microorganismo especfico inoculado en
el agar resulta inhibido en un rea circular o zona en torno al cilindro que contiene la solucin del antibitico.
Valoracin turbidimtrica: La valoracin turbidimtrica se basa en la inhibicin del crecimiento de un microorganismo en
una solucin uniforme del antibitico en un medio fluido que favorezca el crecimiento del microorganismo en ausencia del
antibitico.
Unidades y Estndares de Referencia: La potencia de los antibiticos se designa en unidades (U) o en g de actividad. En
ambos casos, la unidad o g de actividad del antibitico se establece originalmente contra un Estndar Maestro Federal de los
Estados Unidos para el antibitico en cuestin. El Estndar de Referencia USP correspondiente se calibra en trminos del estn-
dar maestro.
En un principio, se consideraba que un antibitico seleccionado como estndar de referencia constaba en su totalidad de
una sola entidad qumica y, por lo tanto, se le asignaba una potencia de 1000 g/mg. En muchos de estos casos, a medida
que los mtodos de fabricacin y purificacin para ciertos antibiticos avanzaron en su desarrollo, fue posible obtener antibi-
ticos con ms de 1000 g de actividad/mg. Tales antibiticos tenan una actividad equivalente a un nmero determinado de
g del estndar de referencia original. No obstante, la mayora de las veces, los g de actividad son, numricamente, exacta-
mente equivalentes a los g (peso) de la sustancia pura. En ciertas ocasiones, como las citadas a continuacin, los g de activi-
dad definidos en trminos del estndar maestro original equivalen a una unidad:
1. Cuando el antibitico se presenta como la base libre y en forma de sal, y los g de actividad han sido definidos en trmi-
nos de una de estas formas.
2. Cuando la sustancia antibitica consta de un nmero de componentes que son qumicamente similares pero que difieren
en actividad antibitica.
3. Cuando las potencias de una familia de antibiticos se expresan en trminos de un estndar de referencia que consta de
un solo miembro de la familia el cual, no obstante, puede ser por s mismo heterogneo.
No se debe asumir que los g de actividad corresponden a los g (peso) de la sustancia antibitica.
Aparato: El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y diluciones de prueba debe ser est-
ril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoracin (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )). Usar un mto-
do de esterilizacin validado tal como calor seco, vapor o irradiacin; o usar material de laboratorio estril y desechable.
Control de temperatura: Se requiere control termosttico en varias etapas de una valoracin microbiolgica: durante el cul-
tivo de un microorganismo y la preparacin de su inculo, as como durante la incubacin en las valoraciones en placa y tubo.
Referirse a los requisitos especficos de temperatura provistos ms adelante para cada tipo de valoracin.
Organismos de prueba: El organismo de prueba para cada antibitico se lista en la Tabla 3 para la valoracin en cilindro-
placa y en la Tabla 8 para la valoracin turbidimtrica. Los organismos de prueba se especifican mediante su nmero de identi-
ficacin en la American Type Culture Collection (Coleccin de Cultivos Tipo de los EE.UU. o ATCC).
Para asegurar el desempeo aceptable de los organismos de prueba, estos deben ser almacenados y conservados de manera
apropiada. Se deben establecer las condiciones de almacenamiento especficas durante la validacin o verificacin del mtodo.
Desechar los cultivos si se observa un cambio en las caractersticas del organismo.
Almacenamiento prolongado: Para el almacenamiento prolongado, mantener los organismos de prueba en una solucin
de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal de ternero al 50% en caldo, glicerol al 10%-15% en caldo tripticasa de
soja (caldo digerido de casena y soja), sangre de oveja desfribinada o leche descremada. Los cultivos que se van a almacenar
durante periodos prolongados se almacenan mejor en estado liofilizado; se prefieren temperaturas de -60 o inferiores; son
aceptables temperaturas inferiores a -20.
156 (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas/ Pruebas Biolgicas USP 39

Cultivos primarios: Preparar los cultivos primarios transfiriendo organismos de prueba desde los viales de almacenamien-
to prolongado a medios apropiados e incubando en condiciones de crecimiento adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a
la temperatura apropiada, por lo general a 2- 8, y desechar despus de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo prima-
rio para preparar los cultivos de trabajo por un mximo de siete das nicamente.
Cultivos de trabajo: Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo primario a medios slidos apropiados para ob-
tener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento satisfactorio pa-
ra la preparacin de los inculos de prueba. Preparar cultivos de trabajo nuevos para cada da de anlisis.
Crecimiento o desempeo no caractersticos de un organismo de prueba: Usar cultivos madre, cultivos primarios o
cultivos de trabajo nuevos cuando un organismo de prueba presente crecimiento o desempeo no caractersticos.
Diseos de valoracin: Los diseos experimentales adecuados son clave para incrementar la precisin y minimizar el sesgo.
Controlar los parmetros de incubacin, la distribucin de temperaturas y el tiempo es crtico para minimizar el sesgo; esto se
puede lograr acomodando las placas y gradillas, segn se indica en cada valoracin.
Valoracin en cilindro-placa: Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones del dimetro de la zona
dentro de las placas, sin tener en cuenta la variacin entre placas. Las respuestas individuales de las placas se normalizan ba-
sndose en el tamao relativo de la zona del estndar comparado con el tamao medio de la zona del estndar en todas las
placas.
Valoracin turbidimtrica: Para evitar un sesgo sistemtico, colocar aleatoriamente tubos duplicados en gradillas separa-
das de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos. El propsito de esta configuracin es mini-
mizar la influencia de la distribucin de la temperatura sobre las muestras duplicadas. La valoracin turbidimtrica, debido a la
configuracin de las muestras en las gradillas para tubos de ensayo, es sensible a ligeras variaciones de temperatura. Asimismo,
la influencia de la variacin de la temperatura se puede disminuir al asegurar un flujo de aire o la conveccin de calor adecua-
dos durante la incubacin. Se deben colocar por lo menos tres tubos para cada concentracin muestra y estndar (un conjun-
to completo de muestras) en una sola gradilla. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez ob-
servados dentro de las gradillas.
Consideraciones sobre potencia: Dentro de las restricciones citadas anteriormente, el diseo de valoracin recomendado
emplea una curva estndar de cinco concentraciones y una sola concentracin de cada preparacin muestra.
Para la valoracin en cilindro-placa, cada placa incluye nicamente dos tratamientos, el tratamiento de referencia (mediana
de los niveles del estndar, es decir, 53) y una de las otras cuatro concentraciones del estndar (5 7, 52 , 54 y 55) o la muestra (U 3 ).
La concentracin de la muestra es una estimacin basada en la concentracin deseada. La muestra se debe diluir para propor-
cionar una concentracin nominal que se estima es equivalente a la mediana de la concentracin de referencia del estndar
(5 3). El propsito de diluir a la mediana de la concentracin de referencia es asegurar que el resultado de la muestra caer
dentro de la porcin lineal de la curva estndar. La prueba determina la potencia relativa de U3 en funcin de la curva estn-
dar. La muestra ( U3 ) debe tener una potencia relativa de aproximadamente 100%. La potencia final de la muestra se obtiene
multiplicando el resultado de U3 por el factor de dilucin.
Una valoracin debe considerarse preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es inferior al 80% o superior al
125%. En dicho caso, los resultados sugieren que la concentracin de la muestra supuesta durante la preparacin de la solu-
cin madre de la muestra era incorrecta. Si esa fuera la situacin, se puede ajustar la potencia supuesta de la muestra basndo-
se en el valor de potencia preliminar y repetir la valoracin. De otro modo, la potencia se derivar de una porcin de la curva
donde las respuestas del estndar y la muestra probablemente no sern paralelas.
Las determinaciones microbiolgicas de potencia estn sujetas a variables intervaloracin e intravaloracin, de modo tal que
se requieren dos o ms valoraciones independientes para obtener una estimacin confiable de la potencia de una muestra de-
terminada. Partiendo de soluciones madre y diluciones de prueba tanto del estndar como de la muestra, preparadas por se-
pardo, llevar a cabo otro da valoraciones adicionales de una muestra determinada. La potencia media debe incluir los resulta-
dos de todas las valoraciones independientes vlidas. El nmero de valoraciones requerido para lograr una estimacin de po-
tencia confiable depende de la variabilidad de la valoracin y de la incertidumbre mxima requerida para la estimacin de po-
tencia. sta ltima se evala mediante la amplitud del intervalo de confianza (ver Clculos, Lmites de confianza y combinaciones
de clculos de valoracin). El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes ms pequeas a lo largo de
varios das es una estimacin de potencia ms confiable que la obtenida de una sola valoracin grande con el mismo nmero
total de placas o tubos. Se debe tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor variabilidad permite que el
producto cumpla con intervalos de especificacin ms estrechos. Al reducir la variabilidad de las valoraciones se logra el lmite
de confianza requerido con menos valoraciones.

MTODO DE CILINDRO-PLACA

Control de temperatura: Usar equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura
especificados en la Tabla 3.
Aparato
Placas: Placas de Petri de plstico desechables o de vidrio (de aproximadamente 20 x 100 mm) con tapas
Cilindros: Cilindros de acero inoxidable o porcelana; de 8O,1 mm de dimetro externo; de 6O,1 mm de dimetro in-
terno; de 1OO,1 mm de altura. [NOTA-Limpiar los cilindros cuidadosamente para eliminar cualquier residuo; es necesario
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 157

limpiar ocasionalmente en un bao cido, por ejemplo, con cido ntrico aproximadamente 2 N o con cido crmico (ver
Limpieza de Aparatos de Vidrio (1051)).]
Soluciones estndar: Para preparar una solucin madre, disolver una cantidad adecuada del Estndar de Referencia USP de
un determinado antibitico o todo el contenido de un vial de Estndar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolven-
te especificado en la Tabla 2 y diluir a la concentracin especificada. Almacenar a 2-8 y usar dentro del periodo indicado. En
el da de la valoracin, preparar a partir de la solucin madre cinco o ms diluciones de prueba, con un aumento de concen-
tracin entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporcin de 1 :1,25. Usar el diluyente final especificado de tal ma-
nera que la mediana tenga la concentracin sugerida en la Tabla 2.
Soluciones muestra: Asignar a la muestra una potencia supuesta por unidad de peso o volumen. En el da de la valoracin,
preparar una solucin madre de la misma manera que se especifica para el Estndar de Referencia USP (Tabla 2). Diluir la solu-
cin madre de la muestra en el diluyente final especificado hasta obtener una concentracin nominal igual a la mediana de la
concentracin del estndar (5 3).
Tabla 2
Solucin Madre Dilucin de Prueba
Mediana
Concentra- dela
Disolvente cin Diluyente Concentracin Usar Diluyente Concentracin
Antibitico Inicial Inicial Adicional Final dentro de Final (S,),b
Anfotericina sc,ci Dimetil sulfxido - - 1 mg/mL El mismo da B. loe 1 g/mL
cido clorhdrico
- - B.le
Bacitracinat 0,01 N 100 U/mL El mismo da 1 U/mL
Bleomicina B.l 6e - - 2 U/mL 14 das B.l 6e 0,04 U/mL
Carbenicilina B. le - - 1 mg/mL 14 das B.le 20 g/mL
Cloxacilina B.1 e - - 1 mg/mL 7 das B.F 5 g/mL
Colistemetatoc Agua 10 mg/mL B.6e 1 mg/mL El mismo da B.6e 1 g/mL
Colistina Agua 10 mg/mL B.6e 1 mg/mL 14 das B.6e 1 g/ml
Dihidrostreptomicina9 B.3e - - 1 mg/ml 30 das B.3e 1 g/ml
Eritromicina Methanol 10 mg/ml B.3e 1 mg/ml 14 das B.3e 1 g/ml
Gentamicina B.3e - - 1 mg/ml 30 das B.3e 0.1 g/ml
Nafcilina B.le - - 1 mg/ml 2 das B.le 2 g/ml
Natamicina Dimetil sulfxido - - 1 mg/ml El mismo da B.1oe 5 g/ml
Neomicina9 B.3e - - 1 mg/ml 14 das B.3e 1 g/ml
Novobiocina alcohol 10 mg/ml B.3e 1 mg/ml 5 das B.6e 0,5 g/ml
N istati nac,h Dimetilformamida - - 1000 U/ml El mismo da B.6e 20 U/ml
Paromomicina B.3e - - 1 mg/ml 21 das B.3e 1 g/ml
Penicilina G B. le - - 1000 U/ml 4 das B.F 1 U/ml
Polimixina Bi Agua - B.6e 10 000 14 das B.6e 10 U/ml
U/ml
Sisomicina B.3e - - 1 mg/ml 14 das B.3e 0,1 g/ml
Vancomicina Agua - - 1 mg/mL 7 das B.4e 10 g/mL
Se puede ajustar la mediana de la concentracin para optimizar los tamaos de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal.
b g en esta columna se refiere a g de actividad.
e Preparar el Estndar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo.
d Diluir adicionalmente la solucin madre con dimetil sulfxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 g/mL antes de realizar las diluciones
de prueba. La dilucin de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfxido que las diluciones de prueba del Estndar de Referencia
USP.
e La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora lista-
da en esta tabla.
1 Cada una de las diluciones de prueba del estndar debe contener la misma cantidad de cido clorhdrico que la dilucin de prueba de la muestra.
9 Se puede usar la valoracin turbidimtrica como un procedimiento alternativo.
h Diluir adicionalmente la solucin madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 U/mL antes de preparar las dilucio-
nes de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estndar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilucin de prueba de
la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estndar. Usar material de vidrio con proteccin actnica.
i Preparar la solucin madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estndar de Referencia USP.

lnculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solucin
salina SR estril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensin. Esparcir la suspensin salina sobre la superficie de
dos o ms placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del me-
dio especificado (ver la Tabla 3).
Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 3, o hasta que el crecimiento sea evidente.
158 (81 >Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas / Pruebas Biolgicas USP 39

Despus de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solucin salina SR
estril (excepto en el caso de bleomicina para el que debe usarse Medio 34; ver la seccin Medios y Soluciones), usando una
varilla de vidrio doblada en ngulo estril o perlas de vidrio estriles. Pipetear y transferir la suspensin a un frasco de vidrio
estril. sta es la suspensin de recoleccin.
Diluir una cantidad apropiada de la suspensin de recoleccin con solucin salina SR estril. Usando el espectrofotmetro de
UV-visible, medir el % de transmitancia a 580 nm. El valor deseado es aproximadamente 25% de transmitancia a 580 nm. Este
valor se usa para estandarizar el volumen de suspensin de recoleccin agregado a la capa de agar para siembra.
Determinar durante la verificacin del mtodo, comenzando con los volmenes sugeridos en la Tabla 3, las proporciones de
suspensin madre que se habrn de agregar al medio de inculo que resulten en zonas satisfactorias de inhibicin de aproxi-
madamente 14-16 mm de dimetro para la mediana de la concentracin del estndar (5 3 ). [NOTA-Los tamaos de las zonas
fuera del intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que contribuyen a la variabilidad de la valoracin.] Si el por-
centaje de transmitancia de la dilucin est por encima de 25%, se puede usar un cociente para normalizar la adicin de mi-
croorganismos a la capa de siembra. El factor de normalizacin se puede determinar dividiendo por 25 el porcentaje de trans-
mitancia obtenido de la dilucin. Posteriormente, se puede multiplicar este cociente por la cantidad sugerida de inculo para
obtener el volumen (ml) de suspensin de recoleccin que se requiere agregar a la capa de siembra. Ajustar la cantidad de
inculo diariamente, si fuera necesario, para obtener una relacin de concentracin-respuesta ptima.
Alternativamente, determinar durante la verificacin del mtodo la proporcin de suspensin de recoleccin que se habr
de incorporar al inculo, comenzando con los volmenes indicados en la Tabla 3, que resulten en una demarcacin satisfacto-
ria de las zonas de inhibicin de aproximadamente 14-16 mm de dimetro para la mediana de la concentracin del estndar
(5 3) y que produzcan una relacin de concentracin-respuesta reproducible. Preparar el inculo agregando una porcin de
suspensin madre a una cantidad suficiente de medio de agar que se ha fundido y enfriado a 45-50. Agitar la mezcla por
rotacin suave sin crear burbujas hasta obtener una suspensin homognea.
Tabla 3
Composicin
Condiciones de Incubacin Sugerida del lnculo
Temperatu-
Nmero ra Tiem- Cantidad
Antibitico Organismo de Prueba ATCC Mediob () po Mediob (ml/100 ml)
Amfotericina B Saccharomyces cerevisiae 9763 19 29-31 48 h 19 1,0
Bacitracina Micrococcus luteus 10240 1 32-35 24 h 1 0,3
Bleomicina Mycobacterium smegmatis 607 36 36-37,5 48 h 35 1,0
Carbenicilina< Pseudomonas aeruginosa 25619 1 36-37,5 24 h 10 0,5
Cloxacilina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,1
Colistimetato Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Colistina Bordete//a bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Dihidroestreptomi- Segn se re-
cina Bacilfus subtilis 6633 32 32-35 5 das 5 quiera
Eritromicina Micrococcus luteus 9341 1 32-35 24 h 11 1,5
Gentamicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Nafcilina Staphy/ococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,3
Neomicina Staphy/ococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,4
Novobiocina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 1 4,0
Nistatina Saccharomyces cerevisiae 2601 19 29-31 48 h 19 1,0
Paromomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 2,0
Penicilina G Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 1,0
Polimixina B Bordetel/a bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Sisomicina Staphy/ococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Segn se re-
Vancomicina Bacilfus subtilis 6633 32 32-35 5 das 8 quiera
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
e Usar 0,5 ml de una dilucin 1:25 de la suspensin madre/100 ml de Medio 1O.

Anlisis: Preparar la capa base para el nmero requerido de placas de Petri para la valoracin, usando el medio y el volumen
mostrados en la Tabla 4. Dejar que se endurezca formando una capa base lisa de profundidad uniforme. Preparar la cantidad
apropiada de inculo para la capa de siembra (Tabla 5), segn se indica para el antibitico correspondiente (Tabla 3), realizan-
do los ajustes necesarios basndose en el anlisis de ensayo preparatorio. Inclinar la placa hacia atrs y hacia adelante para
esparcir el inculo uniformemente sobre la superficie de la capa base y dejar que se endurezca.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 159

Tabla 4 (capa base)

Volumen
Objetivo
Antibitico Medio (ml)
Amfotericina Bb - -

Bleomicina 35 10
Carbenicilina 9 21
Colistimetato 9 21
Colistina 9 21
Dihidroestreptomicina 5 21
Eritromicina 11 21
Gentamicina 11 21
Neomicina 11 21
Nistatinab - -

Paromomicina 11 21
Polimixina B 9 21
Sisomicina 11 21
Vancomicina 8 10
Todos los dems 2 21
Ver Medios y Soluciones, Medios.
b No se usa capa base.
[NOTA-La capa base se puede entibiar para facilitar la formacin de una capa uniforme.)

Tabla 5 (capa de siembra)

Volumen
Objetivo
Antibitico Medio (ml)
Amfotericina B Referirse a la Tabla 3 8
Bleomicina 6
Nistatina 8
Todos los dems 4
Ver Medios y Soluciones, Medios.

Dejar caer seis cilindros de valoracin sobre la superficie inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una gua mecni-
ca u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de 2,8 cm y tapar las placas para evitar la contamina-
cin. Llenar los seis cilindros en cada placa con diluciones de antibitico que contengan los niveles de prueba (S 1-S5 y U3) espe-
cificados en el prrafo siguiente. Incubar las placas segn se especifica en la Tabla 6 durante 16-18 horas y retirar los cilindros.
Medir y registrar el dimetro de cada zona de inhibicin del crecimiento con una aproximacin de 0, 1 mm.
Tabla 6
Antibitico Temperatura de Incubacin ()
Amfotericina B 29-31
Carbenicilina 36-37,5
Colistimetato 36-37,5
Colistina 36-37,5
Dihidroestreptomicina 36-37,5
Gentamicina 36-37,5
Neomicina 36-37,5
Novobiocina 34-36
Nistatina 29-31
Paromomicina 36-37,5
Polimixina B 36-37,5
Sisomicina 36-37,5
Vancomicina 36-37,5
Todos los dems 32-35

Se usarn durante la valoracin los estndares (S 1-S5 ) y un solo nivel de prueba de la muestra (U3) correspondiente a S3 de la
curva estndar, segn se definen en Soluciones estndar y Soluciones muestra. Para derivar la curva estndar, llenar cilindros
alternos en tres placas con la dilucin correspondiente a la mediana de la dilucin de prueba (S 3) del estndar y cada uno de
160 (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas/ Pruebas Biolgicas USP 39

los nueve cilindros remanentes con una de las otras cuatro diluciones de prueba del estndar. Repetir el proceso para las tres
diluciones de prueba del estndar. Para la muestra, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilucin correspondiente a la
mediana de la dilucin de prueba (5 3) y llenar los nueve cilindros remanentes con la dilucin de prueba correspondiente (U 3)
de la muestra.

MTODO TURBIDIMTRICO
Control de temperatura: Usar un equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatu-
ra especificados en la Tabla 8. [NOTA-El control de la temperatura se puede lograr con circulacin de aire o agua. La mayor
capacidad trmica del agua representa cierta ventaja sobre el aire circulante.]
Espectrofotmetro: La medicin de la absorbancia o transmitancia dentro de una banda de frecuencia muy estrecha requie-
re un espectrofotmetro adecuado en el que se pueda variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm o 530
nm. Como alternativa, se puede usar un espectrofotmetro con longitud de onda variable y ajustar a una longitud de onda de
580 nm o 530 nm.
El instrumento se puede modificar de la siguiente manera:
1. Para que acepte el tubo en el que se lleva a cabo la incubacin (ver Aparato a continuacin).
2. Para que acepte una celda modificada equipada con un drenaje que facilite el cambio rpido del contenido.
3. Para que contenga una celda de flujo para un anlisis de flujo continuo.
Ajustar automticamente el instrumento a cero con un caldo no inoculado transparente, preparado segn las especificacio-
nes de cada antibitico, incluyendo la misma cantidad de dilucin de prueba (incluyendo formaldehdo si se especifica) que se
encuentra en cada muestra.
Durante la preparacin de los inculos se puede medir tanto la absorbancia como la transmitancia.
Aparato: Tubos de ensayo de vidrio o plstico, p.ej., de 16 x 125 mm o de 18 x 150 mm. [NOTA-Usar tubos que tengan
una longitud, dimetro y espesor relativamente uniformes y que estn exentos de defectos y rayaduras en la superficie. En el
espectrofotmetro, usar tubos idnticos exentos de defectos y rayaduras. Limpiar los tubos minuciosamente para eliminar to-
dos los residuos de antibitico y restos de soluciones de limpieza. Esterilizar los tubos antes de usar.]
Soluciones estndar: Para preparar una solucin madre, disolver una cantidad del Estndar de Referencia USP de un antibi-
tico determinado o todo el contenido de un vial de Estndar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especifi-
cado en la Tabla 7 y diluir hasta la concentracin requerida. Almacenar a 2-8 y usar dentro del periodo indicado. En el da de
la valoracin, preparar a partir de la solucin madre cinco o ms diluciones de prueba, con un aumento de concentracin en-
tre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporcin de 1 :1,25. [NOTA-Puede ser necesario usar relaciones ms peque-
as para diluciones sucesivas de la solucin madre para la valoracin turbidimtrica.] Usar el diluyente final especificado de
manera tal que la mediana de los niveles del estndar (5 3) tenga la concentracin sugerida en la Tabla 7.
Soluciones muestra: Asignar una potencia supuesta por unidad de peso o volumen a la muestra desconocida y, en el da de
la valoracin, preparar una solucin madre de la misma manera que se especifica para el Estndar de Referencia USP (Tabla 7).
Diluir la solucin madre de la muestra en el diluyente final especificado a una concentracin nominal igual a la mediana de la
concentracin del estndar (53) segn se especifica en la Tabla 7.
Tabla 7
Solucin Madre Dilucin de Prueba
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente cin Diluyente cin Dentro te Concentracin
Antibitico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S3)
Capreomicina Agua - - 1 mg/ml 7 das Agua 100 g/ml
Cloranfenicol Alcohol 10 mg/ml Agua 1 mg/ml 30 das Agua 2,5 g/ml
Clortetraciclina cido clorhdrico 0,01 N - - 1 mg/ml 4 das Agua 0,06 g/ml
Dihidroestreptomicinab Agua - - 1 mg/ml 30 das Agua 30 g/ml
Gramicidina Alcohol - - 1 mg/ml 30 das Alcohol 0,04 g/ml
Neomicinab,d B.3c - - 100 g/ml 14 das B.3< 1,0 g/ml
Oxitetraciclina cido clorhdrico O, 1 N - - 1 mg/ml 4 das Agua 0,24 g/ml
Tetraciclina cido clorhdrico O, 1 N - - 1 mg/ml 1 da Agua 0,24 g/ml
Tioestreptona El mismo Dimetil
- -
Dimetil sulfxido 1 U/ml da sulfxido 0,80 U/ml
g en esta columna se refiere a g de actividad.
b Se puede usar la valoracin en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
e La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solucin madre de 100 g/ml con Solucin amortiguadora B. 3 para obtener una solucin con una concentracin equivalente a 25 g/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solucin a sendos matraces volumtricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de cido clorhdrico 0,01 N a cada
matraz, diluir con Solucin amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 g/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la lnea de respuesta estndar.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 161

Tabla 7 (Continuacin)
Solucin Madre Dilucin de Prueba
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente cin Diluyente cin Dentro te Concentracin
Antibitico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S3)
Troleandomicina Alcohol isoproplico y agua El mismo
(4:1)
- -
1 mg/ml da Agua 25 g/ml
Ti losina Metanol y
Metanol 10 mg/ml B.16< 1 mg/ml 30 das B.3< (1:1) 4 g/ml
g en esta columna se refiere a g de actividad.
b Se puede usar la valoracin en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
e La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solucin madre de 100 g/ml con Solucin amortiguadora 8.3 para obtener una solucin con una concentracin equivalente a 25 g/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solucin a sendos matraces volumtricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de cido clorhdrico 0,01 Na cada
matraz, diluir con Solucin amortiguadora 8.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 g/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la lnea de respuesta estndar.

lnculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solucin
salina SR estril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensin. Enterococcus hirae (ATCC 10541) y 5taphylococcus
aureus (ATCC 9144) se cultivan en un medio lquido, no en agar. Esparcir la suspensin salina sobre la superficie de dos o ms
placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del medio especifi-
cado (ver la Tabla 8). Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 8, o hasta que el crecimiento sea
evidente.
Despus de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solucin salina SR
estril, usando una varilla de vidrio doblada en ngulo estril o perlas de vidrio estriles. Pipetear y transferir la suspensin a un
frasco de vidrio estril. sta es la suspensin de recoleccin.
Determinar durante la verificacin del mtodo la cantidad de suspensin de recoleccin que se usar como el inculo, co-
menzando con el volumen sugerido en la Tabla 8. Preparar tambin una 53 extra como una prueba de crecimiento. Incubar las
pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la Tabla 7 7. Ajustar la cantidad de inculo a diario, si fuera necesario, para
obtener la relacin de concentracin-respuesta ptima a partir del organismo de prueba en los tubos de valoracin. Una vez
completados los periodos de incubacin especificados, los tubos que contienen la mediana de la concentracin del estndar
deben presentar los valores de absorbancia especificados en la Tabla 9. Determinar la duracin exacta de la incubacin, obser-
vando el crecimiento en la concentracin de referencia (mediana de la concentracin) del estndar (53).
Tabla 8
Composicin
Condiciones de Incubacin Sugerida del lnculo
Tempera-
Nmero Me- tura Tiem- Cantidad
Antibitico Organismo de prueba ATCca diob () po Mediob (ml/100 ml}
Capreomicina K/ebsiel/a pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,05
Cloranfenicol Escherichia coli 10536 1 32-35 24 h 3 0,7
Clortetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Dihidroestreptomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,1
Gramicidina Enterococcus hirae 10541 3 36-37,5 16-18 h 3 1,0
Neomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 39 2
Oxitetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Tetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Tioestreptona Enterococcus hirae 10541 40 36-37,5 18-24 h 41 0,2
Troleandomicina Klebsiel/a pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,1
Tilosina Staphylococcus aureus 9144 3 35-39 16-18 h 39 2-3
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.

Tabla 9
Absorbancia,
Antibitico No menos de (u.a.)
Capreomicina 0,4
Clortetraciclina 0,35
Gramicidina 0,35
Tetraciclina 0,35
162 <81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas/ Pruebas Biolgicas USP 39

Tabla 9 (Continuacin)
Absorbancia,
Antibitico No menos de (u.a.)
Todos los dems 0,3

Anlisis: En el da de la valoracin, preparar la concentracin necesaria de antibitico, diluyendo soluciones madre del estn-
dar y de cada una de las muestras, segn se especifica en Soluciones estndar y Soluciones muestra. Preparar cinco niveles de
prueba, cada uno por triplicado, del estndar (S 7-S5 ) y un solo nivel de prueba ( U3 ), tambin por triplicado, de hasta 20 mues-
tras correspondientes a S3 (mediana de la concentracin) del estndar.
Tabla 10
Volumen de
Dilucin de Volumen de
Prueba lnculo
Antibitico (ml) (ml)
Gramicidina 0,10 9,0
Tioestreptona 0,10 10,0
Tilosina 0,10 9,0
Todos los dems 1,0 9,0

Colocar los tubos en gradillas para tubos de ensayo u otro portador. Incluir en cada gradilla 1-2 tubos de control que con-
tengan 1 mL del diluyente de prueba (ver la Tabla 7) pero sin antibitico. Agregar los volmenes de las diluciones de prueba
del estndar y de la muestra, segn se indica en la Tabla 1O. Distribuir aleatoriamente un set completo, incluyendo los contro-
les, en una gradilla para tubos. Agregar el volumen de inculo especificado en la Tabla 1O a cada tubo en la gradilla, uno por
vez, y colocar la gradilla completada inmediatamente en una incubadora o un bao de agua mantenidos a 36,0-37,5 duran-
te el tiempo especificado en la Tabla 11.
Tabla 11
Tiempo de Incubacin
Antibitico (h)
Capreomicina 3-4
Cloranfenicol 3-4
Cicloserina 3-4
Dihidroestreptomicina 3-4
Estreptomicina 3-4
Troleandomicina 3-4
Ti losina 3-5
Todos los dems 4-5

Despus de la incubacin, inhibir inmediatamente el crecimiento del organismo, agregando 0,5 mL de formaldehdo diluido
a cada tubo, excepto para tilosina. Para tilosina, calentar la gradilla en un bao de agua a 80-90 durante 2-6 minutos o en
un bao de vapor durante 5-1 O minutos y llevar a temperatura ambiente. Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 580
nm, analizando una gradilla cada vez.

MEDIOS V SOLUCIONES
Los medios requeridos para la preparacin de los inculos de los organismos de prueba se preparan con los ingredientes
listados en esta seccin. Se permiten pequeas modificaciones de los ingredientes individuales; asimismo, se pueden usar me-
dios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes tengan propiedades promotoras de crecimiento equiva-
lentes o superiores y que produzcan una curva de respuesta estndar similar.
Medios: Disolver los ingredientes en agua para obtener 1 L y ajustar las soluciones con hidrxido de sodio 1 N o cido clorh-
drico 1 N, segn se requiera, de modo que, despus de la esterilizacin con vapor, el pH sea el especificado.
Medio 1
Peptona 6,0 g
Digerido pancretico de casena 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 6,6 0,1
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 163

Medio2
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 6,6 0,1

Medio 3
Peptona 5,0 g
Extracto de levadura 1,5 q
Extracto de carne 1,5 g
Cloruro de sodio 3,5 g
Dextrosa 1,0 g
Fosfato Dibsico de Potasio 3,68 g
Fosfato monobsico de potasio 1,32 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 7,0 0,05

Medio4
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 6,6 0,1

Medio 5
Peptona 6,0g
Extracto de levadura 3,0g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 7,9 0,1

Medios
Peptona 6,0g
Extracto de levadura 3,0g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 5,9 0,1

Medlo9
Digerido pancretico de casena 17,0 g
Digerido papanico de soja 3,0g
Cloruro de sodio 5,0q
Fosfato dibsico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 20,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 7,2 0,1

Medio 10
Digerido pancretico de casena 17,0 g
Digerido papanico de soja 3,0 q
Cloruro de sodio 5,0 g
164 (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas / Pruebas Biolgicas USP 39

Medio 10 (Continuacin)
Fosfato dibsico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 12,0 g
Aqua 1000 ml
Polisorbato 80 (agregado despus de calentar a ebullicin el medio para disolver el agar) 10 ml
pH despus de la esterilizacin 7,2 0,1

Medio 11
Peptona 6,0 g
Digerido pancretico de casena 4,0 g
Extracto de levadura 3,0g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Aqar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 8,3 0,1

Medio 13
Peptona 10,0 g
Dextrosa 20,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 5,6 0,1

Medio 19
Peptona 9,4 g
Extracto de levadura 4,7 g
Extracto de carne 2,4 g
Cloruro de sodio 10,0 g
Dextrosa 10,0 g
Agar 23,5 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 6,1 0,1

Medio 32
Peptona 6,0 g
Digerido pancretico de casena 4,0 g
Extracto de levadura 3,0g
Extracto de carne 1,5 g
Sulfato de manqaneso 0,3 g
Dextrosa 1,0 g
Aqar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 6,6 0,1

Medio 34
Glicerol 10,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de carne 10,0 g
Cloruro de sodio 3,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 7,0 0,1

Medio 35
Glicerol 10,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de carne 10,0 Q
Cloruro de sodio 3,0q
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 165

Medio 35 (Continuacin)
Agar 17,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 7,0 0,1

Medio 36
Digerido pancretico de casena 15,0 g
Digerido papanico de soja 5,0 q
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 7,3 0,1

Medio 39
Peptona 5,0 g
Extracto de levadura 1,5 g
Extracto de carne 1,5 g
Cloruro de sodio 3,5 q
Dextrosa 1,0 g
Fosfato Dibsico de Potasio 3,68 g
Fosfato monobsico de potasio 1,32 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 7,9 0,1

Medlo40
Extracto de levadura 20,0 g
Poli peptona 5,0 g
Dextrosa 10,0 q
Fosfato monobsico de potasio 2,0q
Polisorbato 80 0,1 g
Agar 10,0 g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 6,7 0,2

Medlo41
Digerido pancretico de cas.ena 9,0 g
Dextrosa 20,0 g
Extracto de levadura 5,0 g
Citrato de sodio 10,0 g
Fosfato monobsico de potasio 1,0 g
Fosfato Dibsico de Potasio 1,0g
Agua 1000 ml
pH despus de la esterilizacin 6,8 0,1

Soluciones
Soluciones amortiguadoras: Preparar segn se indica en la Tabla 72 o por otros medios adecuados. Las soluciones amor-
tiguadoras se esterilizan despus de su preparacin; el pH especificado en cada caso es el pH despus de la esterilizacin.
T a bl a 12 So 1uc i ones amort11guad oras
Concentracin de Concentracin de
Fosfato Fosfato Volumen de
Di bsico Monobsico Hidrxido de
de Potasio de Potasio Potasio 10 N pH despus de la
Solucin amortiguadora (g/L) (g/L) (ml) Esterilizacin
Solucin amortiguadora B.1 (1 %, pH 6,0) 2 8 - 6,0 0,05
Solucin amortiguadora B.3 (O, 1 M, pH 8,0) 16,73 0,523 - 8,0 0,1
Solucin amortiguadora B.4 (O, 1 M, pH 4,5) - 13,61 - 4,5 0,05
Solucin amortiguadora B.6 (10%, pH 6,0) 20 80 - 6,0 0,05
Ajustar el pH con cido fosfrico 18 N o hidrxido de potasio 1O N.
166 (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas / Pruebas Biolgicas USP 39

Tabla 12. Soluciones amortiguadoras (Continuacin)

Concentracin de Concentracin de
Fosfato Fosfato Volumen de
Di bsico Monobsico Hidrxido de
de Potasio de Potasio Potasio 10 N pH despus de la
Solucin amortiguadora (g/L) (g/L) (ml) Esterilizacin
Solucin amortiguadora B.1 O (0,2 M, pH 10,5) 35 - 2 10,5 0,1
Solucin amortiguadora B.16 (O, 1 M, pH 7,0) 13,6 4 - 7,0 0,2
Ajustar el pH con cido fosfrico 18 N o hidrxido de potasio 1O N.
Otras soluciones: Ver Reactivos, Indicadores y Soluciones.
Agua: Usar Agua Purificada.
Solucin salina: Usar Solucin salina SR.
Formaldehdo diluido: Solucin de formaldehdo y agua (1 :3)

CLCULOS

Introduccin: La potencia del antibitico se calcula mediante la interpolacin de una recta estndar o patrn obtenida por
transformacin logartmica y ajustada por cuadrados mnimos (ver los detalles sobre los clculos a continuacin). El analista
debe considerar tres conceptos esenciales al interpretar los resultados de potencia del antibitico:
1. Las relaciones biolgicas de concentracin-respuesta por lo general no son lineales. El mtodo de potencia del antibitico
permite ajustar los datos a una lnea recta, evaluando un intervalo de concentracin estrecho en el que los resultados se
acercan a la linealidad. Los resultados de la valoracin se considerarn vlidos nicamente si la potencia calculada es
80%-125% de la potencia asumida al preparar la solucin madre de la muestra. Cuando la potencia calculada est fuera
del intervalo de 80%-125%, el resultado para la muestra puede quedar fuera del intervalo de concentracin estrecho en
el que se ha establecido la linealidad, en cuyo caso, se debe ajustar la potencia asumida de la muestra segn corresponda
y repetir la valoracin para obtener un resultado vlido.
2. El medio ms efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la media geomtrica de la potencia de todos los
ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del procedimiento de valoracin. El resultado combinado de una
serie de valoraciones independientes ms pequeas realizadas a lo largo de varios das es una estimacin de potencia ms
confiable que la obtenida de una sola valoracin grande con el mismo nmero total placas o tubos. Se requieren tres o
ms valoraciones independientes para determinaciones de potencia de antibiticos.
3. El nmero de valoraciones requeridas para obtener una estimacin confiable de potencia del antibitico depende del in-
tervalo de especificacin requerido y de la variabilidad de la valoracin. El clculo del lmite de confianza descrito a conti-
nuacin se determina a partir de varios logaritmos de las potencias que son aproximadamente iguales en precisin. Si el
valor calculado para la amplitud del intervalo de confianza, W, es demasiado amplio, no ser posible tomar una decisin
til con respecto a si la potencia cumple con su especificacin.
El laboratorio debe determinar de antemano en sus procedimientos operativos estndar un valor mximo aceptable para la
amplitud del intervalo de confianza. El valor mximo se debe determinar durante el desarrollo y confirmarse durante la valida-
cin o la verificacin. Si el intervalo de confianza calculado excede este lmite, el analista debe llevar a cabo determinaciones
de potencia independientes adicionales para cumplir con el requisito del lmite. Se debe tomar en cuenta que la decisin de
realizar determinaciones adicionales no depende de la potencia estimada, sino nicamente de la incertidumbre en dicha esti-
macin, segn lo determina la amplitud del intervalo de confianza. La variabilidad de la valoracin tiene un impacto mayor en
el lmite de confianza calculado que el nmero de determinaciones de potencia independientes. Como resultado, el analista
debe considerar primeramente reducir la variabilidad en la medida de lo posible antes de realizar determinaciones de potencia.
Las siguientes secciones describen los clculos para determinar la potencia de los antibiticos, as como la realizacin del
clculo de lmite de confianza. Asimismo, se presentan mtodos para calcular el error estndar con el propsito de obtener
estimaciones de la varianza de la valoracin. Cuando se usan logaritmos, resulta aceptable cualquier base logartmica. El Apn-
dice 7 proporciona frmulas para clculos manuales cuando las concentraciones estn equitativamente espaciadas en la escala
logartmica. Se pueden usar mtodos estadsticos alternativos siempre que se validen adecuadamente.
Valoracin en cilindro-placa: Esta seccin detalla el anlisis de datos de muestra y la determinacin de la potencia de una
muestra desconocida, usando la valoracin en cilindro-placa.
Datos de muestra: La Tabla 73 presenta los datos de una valoracin que se usarn a manera de ejemplo a lo largo de esta
seccin. Para cada una de las 12 placas, las zonas 1, 3 y 5 corresponden a la concentracin de referencia y las otras tres zonas
son para una de las otras cuatro concentraciones, segn se indican. Las otras columnas son necesarias para los clculos y se
explican ms adelante.
Paso 1: Realizar los clculos iniciales y la verificacin de aptitud de variabilidad.
Para cada conjunto de tres placas, promediar los nueve valores de referencia y promediar los nueve valores estndar.
Ejemplo (ver la Tabla 73)

15,867 =X(l 6, 1; 15,6; ... ; 15,8)

USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81 >Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 167

14, 167 = X(l 4,6; 14, 1; ... ; 14,8)

Para cada conjunto de tres placas, determinar la desviacin estndar de los nueve valores de referencia y de la desviacin es-
tndar de los nueve valores estndar. Para cada desviacin estndar, determinar la desviacin estndar relativa correspondien-
te.
Ejemplo: (ver la Tabla 73)

0,200 = cr(l 6, 1, ... , 15,8)

1,3% = (0,200/15,867) X 100

0,324 = cr(l 4,6, ... , 14, 1)

2,3% = (0,324/14, 167) X 100

Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar un valor mximo aceptable para la desviacin es-
tndar relativa. Si alguna de las ocho desviaciones estndar relativas (cuatro para la referencia y cuatro para el estndar) sobre-
pasan este mximo predeterminado, los datos de la valoracin no sern adecuados y deben desecharse. [NOTA-El lmite suge-
rido para la desviacin estndar relativa es no ms de 10%.]
Paso 2: Realizar una correccin de variacin entre placas.
Esta correccin se aplica para convertir la medicin de zona promedio obtenida para cada concentracin al valor que se ob-
tendra si la medicin de la concentracin de referencia promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la misma
que el valor del punto de correccin:

Xc = media corregida del estndar

X5 = media original del estndar
XR = media de la referencia
P = punto de correccin
Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la Tabla 73 (5 7), la correccin es:

14,022 = 14, 167 - (15,867 - 15,722) = 14, 167 - O, 145

Paso 3: Determinar la lnea de la curva estndar.

Generar la lnea de la curva estndar, graficando las mediciones corregidas de la zona en funcin del logaritmo de los valores
de concentracin estndar. Calcular la ecuacin de la lnea de la curva estndar, realizando una regresin lineal no ponderada
estndar sobre estos valores, usando software adecuado o los clculos manuales del Apndice 7. [NOTA-Usar el logaritmo na-
tural o el logaritmo en base 1O para graficar la curva estndar y determinar la ecuacin de regresin; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mnimo del coeficiente de determinacin (%R2 )
para una regresin aceptable. La regresin es aceptable slo si la %R 2 obtenida excede este valor predeterminado. [NOTA-El
lmite sugerido para el coeficiente porcentual de determinacin es no menos de 95%.]
 Tabla 13. Datos de Muestra (Valoracin en Cilindro-Placa)
O\
Referencia (5,) Media 00
Repeti- Media ,,..._
Estn- cin Zona de la Muestra 00
dar de Pla- Zona 1 Zona 3 Zona 5 Media 2 Zona4 Zona6 Media Corregida
(U/mL) Concentracin ca (mm) (mm) (mm) (mm) SD %RSD (mm) (mm) (mm) (mm) SD %RSD (mm) )>
::::i
51 3,20 1 16,l 15,6 15,8 15,867 0,200 1,3 14,6 14,1 13,5 14,167 0,324 2,3 14,022 !:r.
a-
2 16,0 15,9 16,2 14,5 14, 1 14,4 ~
,....
3 15,7 15,7 15,8 14,0 14,2 14,1
::
o
52 4,00 1
2
15,8
15,7
15,6
15,5
15,5
15,6
15,567 0,158 1,0 14,7
14,7
15,1
14,9
14,8
15,2
14,833 0,265 1,8 14,989
lo
tlJ
3 15,7 15,4 15,3 14,8 15,0 14,3 ...,
tlJ
54 6,25 1 15,6 15,8 16,0 15,789 0,169 1,1 16,6 16,8 16,3 16,578 0,233 1,4 16,511 ("\

2 15,8 15,6 15,7 16,6 16,5 16,2

o
::::i
(!>
3 16,1 15,7 15,8 16,9 16,5 16,8 V>

55 7,8125 1 15,6 15,6 15,5 15,667 0,141 0,9 17,3 17,0 17,0 17,167 0,224 1,3 17,222 ~
::
17,3
...,
2 15,6 15,7 15,5 17,4 17,2 o
3 15,9 15,8 15,8 17,3 17,3 16,7
a-
6

U3 desconocida 1 15,7 15,8 15,7

15,722
15,678 0,179 1, 1 15,3 15,8 15,7 15,478 0,307 2,0 15,522 '
l.C
::
tlJ
V>
2 15,9 15,7 15,7 15,8 15,8 15,5 -....
3 15,5 15,8 15,3 15,2 15,1 15, 1 -o
ste es el valor de la media de referencia general, referida ms adelante como el "punto de correccin".
2
ni
0-
0
V>
O;:J
a
~
8
V>

eVl
v
w
\()
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 169

Ejemplo: La Tabla 14 resume la porcin de la Tabla 13 requerida para esta parte del clculo.
Tabla 14
Mediciones de la
Conjunto de Zona Corregida Concentracin
Estndares (mm) (U/ml)
51 14,022 3,2
52 14,989 4,0
Referencia (5 3) 15,722 5
5, 16,511 6,25
5, 17,222 7,8125

Resultados de la regresin lineal

Lnea de la curva estndar:
Z = [3,551 X ln(C)] + 9,978
Z = medicin de zona corregida
e= concentracin
%R2 = 99,7
Determinacin de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las medicio-
nes de la zona del estndar y las mediciones de la zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por variacin entre
placas, usando el punto de correccin determinado anteriormente para obtener un promedio corregido para la muestra desco-
nocida, V. [NOTA-Un mtodo alternativo aceptable al uso del punto de correccin consiste en corregir usando el valor en la
lnea de regresin estimada correspondiente al logaritmo de la concentracin de 53 .] Usar la medicin de zona promedio co-
rregida en la ecuacin de la lnea de la curva estndar para determinar el logaritmo de la concentracin de la muestra, Lu,
mediante:
Lu =(U - a)/b
a= interseccin de la lnea de regresin
b = pendiente de la lnea de regresin
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilucin aplicable. Este valor tambin se puede expresar como porcentaje del valor de la concentracin de referencia.
Ejemplo: Medicin corregida de la zona de la muestra (Tabla 13) = 15,522
Logaritmo natural de la concentracin de la muestra:
Lu = (15,522 - 9,978)/3,551 = 1,561
Concentracin de la muestra:
Cu= e 1561 = 4,765
Porcentaje de concentracin de referencia:
Resultado= (4,765/5,000) x 100 = 95,3%
Valoracin turbidimtrica: Esta seccin detalla el anlisis de los datos de muestra y la determinacin de la potencia de una
muestra desconocida usando la valoracin turbidimtrica. El mtodo asume que los tubos se distribuyen en forma aleatoria
dentro del bloque de calentamiento u otro dispositivo de control de temperatura. Si el dispositivo tiene un perfil de tempera-
tura que no es uniforme, se prefiere un diseo en bloques aleatorizados. En dicho diseo, la gradilla se divide en reas (blo-
ques) de temperatura relativamente uniforme y en cada rea se coloca al menos un tubo de cada concentracin del Estndar y
de cada muestra desconocida. El anlisis de datos del diseo en bloques aleatorizados es diferente del siguiente.
Datos de muestra: La Tabla 15 presenta los datos de una valoracin que se usarn como ejemplo a lo largo de esta sec-
cin. Se requieren otras columnas para los clculos, las cuales se explican a continuacin.
Tabla 15. Datos de Muestra (Valoracin Turbidimtrica)
Concentracin Absorbancia Promedio Desviacin
Estndar (g/ml) Repeticin (u.a.) (u.a.) Estndar
1 0,8545
2 0,8422
5 64 3 0,8495 0,8487 0,0062
1 0,8142
2 0,8273
5, 80 3 0,8392 0,8269 0,0125
170 (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas/ Pruebas Biolgicas USP 39

Tabla 15. Datos de Muestra (Valoracin Turbidlmtrica) (Continuacin)

Concentracin Absorbancia Promedio Desviacin
Estndar (g/ml) Repeticin (u.a.) (u.a.) Estndar
1 0,6284
2 0,6947
5, 100 3 0,7563 0,6931 0,0640
1 0,6933
2 0,6850
5, 125 3 0,6699 0,6827 0,0119
1 0,5299
2 0,5779
5s 156 3 0,5316 0,5465 0,0272

1 0,7130
2 0,7960
U3 desconocida 3 0,7201 0,7430 0,0460

Paso 1: Realizar los clculos iniciales y la verificacin de aptitud de variabilidad.

Para cada concentracin (incluyendo la muestra), promediar los tres valores de absorbancia.
Ejemplo: Ver 5 7 en la Tabla 15.
o,8487 = X(0,8545; o,8422; o,8495)
Para cada concentracin, determinar la desviacin estndar de las tres lecturas y una desviacin estndar combinada para to-
das las concentraciones.
Ejemplo: Ver 5 7 en la Tabla 15.
0,0125 = 50(0,8545; 0,8422; 0,8495)
El valor combinado se calcula tomando la raz cuadrada del promedio de las cinco varianzas:
0,0325 = {[(0,0062)2 + (0,0125)2 + (0,0640)2 + (0,0119)2 + (0,0272)2]/5}1/2
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar una desviacin estndar combinada mxima acep-
table. Si la desviacin estndar combinada excede este mximo predeterminado, los datos de valoracin no son adecuados y
se deben descartar. [NOTA-El lmite sugerido para la desviacin estndar combinada es no ms de 10% del valor de absor-
bancia promedio a travs de las cinco concentraciones.] Si el nmero de determinaciones repetidas por concentracin es al
menos cinco, entonces se puede calcular una desviacin estndar relativa para cada concentracin despus de verificar valores
atpicos y comparar con una desviacin estndar relativa mxima aceptable. [NOTA-El lmite sugerido para la desviacin es-
tndar relativa es no ms de 10%.]
Paso 2: Determinar la lnea de la curva estndar.
Generar la lnea de la curva estndar, graficando los valores de absorbancia promedio en funcin del logaritmo de los valo-
res de concentracin del estndar. Calcular la ecuacin de la lnea de la curva estndar, realizando una regresin lineal no pon-
derada sobre estos valores usando software apropiado o los clculos manuales del Apndice 1. [NOTA-Usar el logaritmo natu-
ral o el logaritmo en base 1 O para graficar la curva estndar y determinar la ecuacin de regresin; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mnimo del coeficiente porcentual de determina-
cin (%R2) para una regresin aceptable. La regresin es aceptable nicamente si el valor %R2 obtenido excede este valor pre-
determinado. [NOTA-El lmite sugerido para el coeficiente porcentual de determinacin es no menos de 90%.]
Ejemplo: La Tabla 16 resume la porcin de la Tabla 15 requerida para esta parte del clculo.
Tabla 16
Valores Promedio de
Conjunto de Absorbancia Concentracin
Estndares (u.a.) (g/ml)
51 0,8487 64
57 0,8269 80
53 0,6931 100
54 0,6827 125
5, 0,5465 156

Resultados de la regresin lineal

Lnea de la curva estndar:
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas 171

Absorbancia = 2,2665 - [0,7735 x log 10 (concentracin)]

%R2 = 93,0%
Determinacin de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las tres medi-
ciones de absorbancia para obtener un promedio para la muestra desconocida, TJ. Usar esta medicin promedio en la ecuacin
de la lnea de la curva estndar para determinar el logaritmo de la concentracin de la muestra desconocida, Lu, mediante:
Lu =(U - a)/b

a= interseccin de la lnea de regresin

b = pendiente de la lnea de regresin
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilucin aplicable. Este valor tambin se puede expresar como porcentaje del valor de la concentracin de referencia.
Ejemplo: Absorbancia promedio de la muestra (Tabla 75) = 0,7430.

log 10 (Cu) = (0,7430- 2,2665)/(- 0,7735) = 1,9696

Cu= 101,9696 = 93,2

Porcentaje de concentracin de referencia = (93,2/l 00,0) x 100 = 93,2%

Cu= concentracin de la muestra
Lmites de confianza y combinacin de los clculos de las valoraciones: Debido a la variabilidad entre valoraciones, se
requieren tres o ms determinaciones independientes para una estimacin confiable de la potencia de la muestra. Para cada
determinacin independiente, comenzar con soluciones madre y diluciones de prueba tanto del Estndar como de la muestra,
preparadas por separado, y repetir la valoracin de una muestra determinada otro da.
Usando un conjunto de al menos tres determinaciones de la potencia desconocida, usar el mtodo del Apndice 2 para verifi-
car valores atpicos. Esta determinacin debe realizarse en la escala logartmica.
Para obtener una estimacin combinada de la potencia desconocida, calcular el promedio, M, y la desviacin estndar de los
logaritmos de las potencias aceptadas. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1 O.] Determinar el intervalo de
confianza para la potencia, segn se indica a continuacin:
antilog[M - t(0,05, N - 1) x SOJ'l/N], antilog[M + t(0,05, N - 1) x SO /-.JN]
M= promedio
SO = desviacin estndar
N = nmero de valoraciones
t(0,05, N-1) =el punto del 5% de dos colas de una distribucin t de Student con N-1 grados de libertad
NOTA-El valor t est disponible en hojas de clculos, textos estadsticos y software estadstico.
W = antilog{[t(0,05, N - 1) x SO/-.JN]}
W = mitad de la amplitud del intervalo de confianza
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un valor mximo predeterminado aceptable. Si la mitad de
la amplitud es mayor que el lmite de aceptacin, continuar con valoraciones adicionales.
Ejemplo: Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con resultados de potencia en la escala logartmica natural de
1,561; 1,444; 1,517 y 1,535. Entonces:
N=4

M = X(l,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 1,514

SO= cr(l ,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 0,050

t = 3, 182
El intervalo de confianza en la escala logartmica es
1,514(3,182 X 0,050/'l/4) = (1,434, 1,594)
Tomando antilogaritmos, la potencia estimada es
e1,514 = 4,546

con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de e1,434, ei, 594 =(4,197; 4,924)
La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para comparar con un valor de aceptacin es el cociente 4,924/4,546 =
1,083.
 1 72 (81) Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas/ Pruebas Biolgicas USP 39

APNDICE 1. FRMULAS PARA CLCULOS MANUALES DE REGRESIN Y CONCENTRACIN DE

LA MUESTRA
Cuando las concentraciones estn igualmente espaciadas en la escala logartmica, los clculos se pueden realizar usando la
siguiente frmula. Donde:
sk = media de la medicin de zona corregida (valoracin en cilindro-placa) o valor de absorbancia promedio (valoracin
turbidimtrica) para el conjunto estndar k
k = 1, 2, 3, 4, 5
s = media de los cinco valores sk
Lk = logaritmo de la concentracin k correspondiente. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] La
pendiente de la lnea de regresin se calcula mediante:

b = (Yana - Ybaa)!(X'' - Xbaa)

Yalta = lfs(3Ss + 2S4 + S3 - S)

ybaja = 1/s(3S + 2S2 + S3 - Ss)

Xalta = Ls
Xbaja = L
Combinar y simplificar a:

El logaritmo de la concentracin de la muestra se halla usando:

Lu = Lreferencia +[(U - S)/b]

Por ejemplo, usando los datos para la valoracin en cilindro-placa en la Tabla 13 y logaritmos naturales:

b,,..[(4 xJ 7,222).+c(~ ?< 16,.511) .;,. (? <.J4,Q89)f (4.~.J.~.;Q~Q)}/{.5f{p(l:j~l).f !8($,2.)]} =L3551Rll\1.~t-~~1s)

s= (14,020 + 14,989+15,722+16,511+17,222)/5=15,693
Logaritmo natural de la concentracin de la muestra= ln(5) + [(15,522 - 15,693)/3,551] = 1,561

Concentracin de la muestra= e1561 = 4,765

APNDICE 2: PROCEDIMIENTO PARA VERIFICAR VALORES ATPICOS; RECHAZO DE

MEDICIONES ATPICAS O ABERRANTES
Toda medicin que sea claramente cuestionable debido a una falla en el procedimiento de valoracin deber ser rechazada,
sin importar si se descubre durante el procedimiento de medicin o tabulacin. El rechazo o la retencin arbitrarios de una
medicin aparentemente aberrante puede representar una fuente seria de sesgo. Por lo general, el rechazo de mediciones que
se basa nicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia.
Toda medicin de potencia sospechada, o atpica, se puede analizar en funcin del criterio siguiente, el cual se basa en la
variacin dentro de un solo grupo de mediciones supuestamente equivalentes a partir de una distribucin normal. En prome-
dio, el criterio rechazar una observacin vlida una vez cada 25 ensayos o una vez cada 50 ensayos. Designar las mediciones
en orden de magnitud de y1a yN, donde y1es el posible valor atpico, y N es el nmero de mediciones en el grupo. Calcular la
brecha (gap) relativa usando la Tabla A2-1, Prueba para Detectar Mediciones Atpicas y las frmulas siguientes:
Cuando N = 3 a 7:

Cuando N = 8 a 1O:

Cuando N = 11 a 13:

Si G1, G2 , o G3, segn corresponda, excede el valor crtico en la Tabla A2-7, Prueba para Detectar Mediciones Atpicas, para la
N observada, existe una base estadstica para omitir la(s) medicin(es) atpica(s).
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 1 73

Tabla A2-1. Prueba para Detectar Mediciones Atpicas

En las muestras de una poblacin normal, las brechas iguales o mayores que los valores siguientes de G1, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P
= 0,01, cuando las mediciones atpicas pueden ocurrir nicamente en un extremo; o con P = 0,02, cuando stas pueden ocurrir en cualquiera de los
extremos.
N 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7
G 1 0,987 1 0,889 1 0,781 1 0,698 1 0,637

N 1 8 1 9 1 10 1 1

G, 1 0,681 1 0,634 1 0,597 1 1

N 1 11 1 12 1 13 1 1

G3 1 0,674 1 0,643 1 0,617 1 1

Ejemplo: Potencias estimadas de la muestra en escala logartmica= 1,561; 1,444; 1,517; 1,535
Verificar la potencia ms baja para la medicin atpica:
G1 = (1,517 - 1,444)/(1,561 - 1,444) = 0,624 < 0,889

Por lo tanto, 1,444 no es una medicin atpica.

Verificar la potencia ms alta para la medicin atpica:
G1 = (1,561 - 1,535)/(1,561 - 1,444) = 0,222 < 0,889

Por lo tanto, 1,561 no es una medicin atpica.

Las potencias atpicas deben marcarse como valores atpicos y deben excluirse de los clculos de la valoracin. No se puede
excluir ms de una potencia como medicin atpica.

(85) PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Partes de este captulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la
Farmacopea japonesa. Aquellas partes que no han sido armonizadas estn marcadas con los smbolos(+.) para especificar dicha
situacin .
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegati-
vas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus).
Hay tres tcnicas para esta prueba: la tcnica de coagulacin (gel-clot), la cual est basada en la formacin de gel; la tcnica
turbidimtrica, basada en la produccin de turbidez despus de la ruptura de uniones de un sustrato endgeno; y la tcnica
cromognica que se basa en el desarrollo de color despus de la ruptura de un complejo sinttico pptido-cromgeno. Efec-
tuar la prueba con cualquiera de las tres tcnicas. En caso de duda o controversia, la decisin final se toma basndose en la
prueba de lmite de coagulacin, a menos que se indique algo diferente en la monografa del producto en anlisis. La prueba
se efecta de forma tal que se evite la contaminacin por endotoxinas.

APARATOS

Eliminar los pirgenos de todo el material de vidrio y otros materiales termoestables en un horno de aire caliente, mediante
un proceso validado.+\ Habitualmente se usan 30 minutos a 250 como tiempo y temperatura mnimos. Si se emplean mate-
riales de plstico, tales como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automticos, usar los que han demostrado
estar exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba. [NOTA-En este captulo, el trmino "tubo" incluye cual-
quier otro receptculo, como por ejemplo los pocillos de las placas de microtitulacin.]

REACTIVOS V SOLUCIONES DE PRUEBA

Usado de Amebocitos
Un producto liofilizado obtenido a partir de un lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo herradura (Limu/us polyphemus
o Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere slo a un producto fabricado de conformidad con las reglamentaciones de la

l Para una prueba de validez del procedimiento para inactivar endotoxinas, ver Esterilizacin por Calor Seco en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos
Farmacopeicos (1211 ). Usar un Usado SR con una sensibilidad no menor de O, 15 Unidades de Endotoxina por ml.+
 174 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas/ Pruebas Biolgicas USP 39

autoridad competente. [NOTA-El Usado de Amebocitos reacciona con algunos j3 -glucanos adems de reaccionar con las endo-
toxinas. Existen preparaciones de Usado de Amebocitos que no reaccionan con los glucanos: se preparan retirando del Usado de
Amebocitos el factor G que reacciona con los glucanos o inhibiendo el sistema de reaccin del factor G del Usado de Ameboci-
tos. Se pueden usar para pruebas de endotoxinas en presencia de glucanos.]

Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)

Usar Agua para Inyeccin o agua producida por otros procedimientos y que no reaccione con el lisado empleado, en el lmi-
te de deteccin del reactivo.

Usado SR

Disolver con agitacin suave el Usado de Amebocitos en Agua para PEB o en un amortiguador recomendado por el fabricante
del lisado. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o congelado, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES

Solucin Madre del Estndar de Endotoxina

Preparar una Solucin Madre del Estndar de Endotoxina a partir de un Estndar de Referencia de Endotoxina USP que haya
sido calibrado con el Estndar Internacional para Endotoxinas vigente de la OMS. Seguir las especificaciones en el prospecto
del empaque y en la etiqueta para la preparacin y almacenamiento de la Solucin Madre del Estndar de Endotoxina. El conte-
nido de endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NOTA-Una Unidad USP de Endotoxina (UE) es igual a una
Unidad Internacional (UI) de endotoxina.]

Soluciones Estndar de Endotoxina

Despus de mezclar vigorosamente la Solucin Madre del Estndar de Endotoxina, preparar las diluciones seriales apropiadas
de la Solucin Estndar de Endotoxina, usando Agua para PEB. Usar las diluciones tan pronto como sea posible para evitar la
prdida de actividad por adsorcin.

Soluciones Muestra

Preparar las Soluciones Muestra disolviendo o diluyendo los medicamentos, usando Agua para PEB. Algunas sustancias o pre-
paraciones se pueden disolver o diluir adecuadamente en otras soluciones acuosas. Si fuera necesario, ajustar el pH de la solu-
cin (o de la dilucin) a examinar de modo que el pH de la mezcla del lisado y la Solucin Muestra se encuentre dentro del
intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, por lo general entre 6,0-8,0. El pH se puede ajustar con un cido, una
base o una solucin amortiguadora adecuada segn lo recomiende el fabricante del lisado. Los cidos y las bases se pueden
preparar a partir de concentrados o slidos con Agua para PEB en recipientes exentos de endotoxinas detectables. Las solucio-
nes amortiguadoras se deben validar para garantizar que estn exentas de endotoxinas y otros factores de interferencia detec-
tables.

DETERMINACIN DE LA MXIMA DILUCIN VLIDA (MDV)

La mxima dilucin vlida es la dilucin mxima permisible de una muestra a la que se le puede determinar el lmite de
endotoxina. Determinar la MDV a partir de la siguiente ecuacin:

MDV =(lmite de endotoxina x concentracin de la Solucin Muestra)/("-)

Lmite de Endotoxina

El lmite de endotoxina para medicamentos de administracin parenteral, definido segn la dosis, es igual a K/M 2 ., donde K
es la dosis pirognica umbral de endotoxina por kg de peso corporal y Mes igual a la dosis mxima recomendada del produc-
to, en bolo, por kg de peso corporal. Cuando el producto se va a inyectar a intervalos frecuentes o por infusin continua, Mes
la dosis mxima total administrada durante un periodo de una hora. El lmite de endotoxinas para los medicamentos de admi-

2 K es 5 UE-USP/kg de peso corporal para cualquier va de administracin distinta de la intratecal (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de peso corporal). En el caso de
productos radiofarmacuticos que no se administren por va intratecal, el lmite de endotoxina se calcula como 175 UE/V, donde Ves la dosis mxima recomenda-
da en ml. En el caso de radiofrmacos administrados por va intratecal, el lmite de endotoxina se obtiene mediante la frmula 14 UE/V. Para formulaciones (por lo
general productos oncolgicos) que se administran por metro cuadrado de superficie corporal, la frmula es K/ M, donde K= 1 00 UE/m 2 y Mes la dosis
mxima/m 2 .
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 175

nistracin parenteral se especifica en la monografa individual en unidades como UE/mL, UE/mg, UE/Unidad de actividad bio-
lgica, etc.

Concentracin de la Solucin Muestra

mg/mL: en el caso del lmite de endotoxina especificado por peso (UE/mg);

Unidades/mL: en el caso del lmite de endotoxina especificado por unidad de actividad biolgica (UE/Unidad);
mL/mL: cuando el lmite de endotoxina se especifica por volumen (UE/mL).
A-: la sensibilidad declarada en la Tcnica de Coagulacin (UE/mL) o la concentracin ms baja usada en la curva estndar
para la Tcnica Turbidimtrica o la Tcnica Cromognica.

TCNICA DE COAGULACIN

La tcnica de coagulacin se usa para detectar o cuantificar endotoxinas basndose en la coagulacin del lisado empleado
como reactivo en presencia de endotoxina. La concentracin mnima de endotoxina requerida para hacer que el lisado se coa-
gule en las condiciones estndar es la sensibilidad declarada del lisado empleado como reactivo. Para garantizar tanto la preci-
sin como la validez de la prueba, efectuar las pruebas para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y para determinar
factores de interferencia segn se describe en Pruebas Preparatorias.

Pruebas Preparatorias

PRUEBA DE CONFIRMACIN DE LA SENSIBILIDAD DECLARADA DEL LISADO

Confirmar en cuatro determinaciones repetidas la sensibilidad declarada, A, expresada en UE/mL del lisado antes de usarlo
en la prueba. La prueba de confirmacin de sensibilidad del lisado se debe llevar a cabo cuando se usa una partida nueva de
lisado o cuando hay algn cambio en las condiciones de la prueba que pueda afectar el resultado. Preparar soluciones estndar
con al menos cuatro concentraciones equivalentes a 2A-, A, 0,5A y 0,25A-, diluyendo el ER Endotoxina USP con Agua para PEB.
Mezclar un volumen del Lisado SR con un volumen igual (como por ejemplo alcuotas de 0, 1 mL) de una de las Soluciones
Estndar de Endotoxina en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas de prueba individuales que contengan lisa-
do liofilizado, agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. Incubar la mezcla de reaccin durante un perodo
constante segn las instrucciones del fabricante del lisado (habitualmente a 37 1 durante 60 2 minutos), evitando vibracio-
nes. Para analizar la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente de la incubadora y con un nico movimiento
suave, invertirlos aproximadamente a 180. Si se ha formado un gel firme que permanece en su lugar despus de invertir los
tubos, registrar el resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un gel intacto. La prueba se considera vli-
da cuando la concentracin ms baja de las soluciones estndar presenta un resultado negativo en todas las pruebas repetidas.
El punto final es la concentracin ms baja en la serie de concentraciones decrecientes de endotoxina estndar que coagula
el lisado. Determinar la media geomtrica del punto final calculando la media de los logaritmos de las concentraciones en el
punto final de la serie de cuatro determinaciones repetidas y calculando luego el antilogaritmo de la media, segn se indica en
la siguiente frmula:

media geomtrica de la concentracin en el punto final = antilogaritmo ('Le/f)

donde 'Le es la suma de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de diluciones utilizadas, y fes el
nmero de tubos de ensayo repetidos. La media geomtrica de la concentracin en el punto final es la sensibilidad medida del
lisado (en UE/mL). Si no es menor de 0,5A- y no es mayor de 2A, se confirma la sensibilidad declarada y se usa en las pruebas
realizadas con este lisado.

PRUEBA DE FACTORES DE INTERFERENCIA

Por lo general, preparar soluciones (A-D) como se muestra en la Tabla 1, y efectuar la prueba de inhibicin o potenciacin
en las Soluciones Muestra con una dilucin menor que la mxima dilucin vlida (MDV), que no contenga endotoxinas detec-
tables, procediendo segn se describe en Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada del Lisado. La media geomtrica
de las concentraciones en el punto final de las Soluciones By C se determina usando la frmula descrita en la Prueba de Confir-
macin de Ja Sensibilidad Declarada del Usado. La prueba de factores de interferencia deber repetirse siempre que se presenten
cambios en alguna de las condiciones que pudieran influir en el resultado de la prueba.
1 76 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas/ Pruebas Biolgicas USP 39

Tabla 1. Preparacin de Soluciones para la Prueba de Inhibicin/Potenciacin para Tcnicas de Coagulacin

Concentracin de Endotoxina/
Solucin a la que se Agrega Factor de Concentracin Nmero de
Solucin Endotoxlna Diluyente Dilucin de Endotoxlna Repeticiones
A" Ninguna/Solucin Muestra - - - 4
Bb 2A/ Solucin Muestra Solucin Muestra 1 2A 4
2 n 4
4 0,5/c 4
8 0,25/c 4
ce 2A!Agua para PEB Agua para PEB 1 2/c 2
2 n 2
4 0,5/c 2
8 0,25/c 2
Dci Ninguna/Agua para PEB - - - 2
Solucin A: Una Solucin Muestra de la preparacin en anlisis que est exenta de endotoxinas detectables.
b Solucin B: Prueba de interferencia.
e Solucin C: Control para sensibilidad declarada del lisado.
d Solucin D: Control negativo de Agua para PEB

Esta prueba se considera vlida cuando todas las determinaciones repetidas de las Soluciones A y O no muestran ninguna
reaccin y el resultado de la Solucin C confirma la sensibilidad declarada.
Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la Solucin B no es menor de 0,5/c y no es mayor de 2A, la Solucin
Muestra no contiene factores que interfieran en las condiciones experimentales usadas. En caso contrario, la Solucin Muestra a
examinar interfiere con la prueba.
Si la muestra en anlisis no cumple con la prueba a una dilucin menor que la MDV, se debe repetir la prueba empleando
una dilucin mayor que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad permite una dilucin mayor de la mues-
tra a examinar y esto puede contribuir a la eliminacin de la interferencia.
La interferencia se puede resolver mediante un tratamiento adecuado, como filtracin, neutralizacin, dilisis o calentamien-
to. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin prdida de endotoxinas, realizar la valo-
racin descrita anteriormente, utilizando la preparacin a examinar, a la que se ha agregado Estndar de Endotoxina y se ha
sometido al tratamiento seleccionado.

Prueba de Lmite

PROCEDIMIENTO

Preparar las Soluciones A, B, C y O segn se indica en la Tabla 2 y llevar a cabo la prueba en estas soluciones siguiendo el
procedimiento indicado anteriormente en la Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebas Prepara-
torias.
Tabla 2. Preparacin de Soluciones para la Prueba de Lmite de Coagulacin
Concentracin de Endotoxina/
Solucin a la que se Agrega
Solucin* Endotoxina Nmero de Repeticiones
A Ninguna/ Solucin Muestra Diluida 2
B 2A/ Solucin Muestra Diluida 2
e 2A/Agua para PEB 2
D Ninguna/Agua para PEB 2
* Preparar la Solucin A y la Solucin B de control positivo del producto utilizando una dilucin no mayor que la MDV y tratamientos segn se indica en la Prueba
de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias. Las Soluciones By C de control positivo contienen la Solucin Estndar de Endotoxina a una concentracin que
corresponde al doble de la sensibilidad declarada del lisado. La Solucin D de control negativo consiste en Agua para PEB.

INTERPRETACIN

La prueba se considera vlida cuando ambas determinaciones repetidas de las Soluciones By C son positivas y las de la Solu-
cin O son negativas. Cuando se obtiene un resultado negativo para ambas determinaciones repetidas de la Solucin A, la pre-
paracin en anlisis cumple con la prueba. Cuando se obtiene un resultado positivo para ambas determinaciones repetidas de
la Solucin A, la preparacin en anlisis no cumple con la prueba.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 177

Cuando se obtiene un resultado positivo para una de las determinaciones de la Solucin A y un resultado negativo para la
otra, repetir la prueba. En la repeticin, la preparacin en anlisis cumple con la prueba si se obtiene un resultado negativo en
ambas determinaciones repetidas de la Solucin A. La preparacin no cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo
para una o ambas determinaciones repetidas de la Solucin A. Sin embargo, si la preparacin no cumple con la prueba a una
dilucin menor que la MDV, se puede repetir la prueba empleando una dilucin mayor que no exceda la MDV.

Prueba Cuantitativa

PROCEDIMIENTO

La prueba cuantifica endotoxinas bacterianas en las Soluciones Muestra por valoracin volumtrica hasta un punto final. Pre-
parar Soluciones A, B, C y D segn se indica en la Tabla 3 y analizar siguiendo el procedimiento en la Prueba de Confirmacin de
la Sensibilidad Declarada del Usado en Pruebas Preparatorias.
Ta bl a 3 Preparac1on
"' d e So 1uc1ones para 1a Prueba de Coagu 1acI'on
Factor
Concentracin de Endotoxlna/ de
Solucin a la cual se Agrega Dllu- Concentracin Nmero de
Solucin Endotoxlna Diiuyente cln de Endotoxlna Repeticiones
A Ninguna/Solucin Muestra Agua para PEB 1 - 2
2 - 2
4 - 2
8 - 2
Bb 21.,/ Solucin Muestra - 1 21.. 2
ce 21.,/ Agua para PEB Agua para PEB 1 21.. 2
2 lA. 2
4 0,51.. 2
8 0,251.. 2
Dd Ninguna/Aguo para PEB - - - 2
Solucin A: Solucin Muestra en anlisis a la dilucin, que no debe exceder la MDV, con la cual se complet la Prueba de Factores de Interferencia. Las diluciones
subsiguientes de la Solucin Muestra no deben exceder la MDV. Usar Agua para PEB para efectuar una serie de diluciones en cuatro tubos que contengan la
Solucin Muestra en anlisis a concentraciones de 1, 1/2, '/, y 1/s con respecto a la concentracin usada en la Prueba de Factores de Interferencia. Se pueden usar
otras diluciones hasta la MDV, segn sea necesario.
b Solucin 8: Solucin A que contenga endotoxina estndar a una concentracin de 2A- (control positivo del producto).
e Solucin C: Dos series repetidas de cuatro tubos de Agua para PEB que contengan la endotoxina estndar a una concentracin de 2A-, A-, 0,5A-, y 0,25A-, respecti-
vamente.
d Solucin D: Agua para PEB (control negativo).

CLCULO E INTERPRETACIN

La prueba se considera vlida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes: (1) ambas determinaciones repetidas de la
Solucin D de control negativo son negativas; (2) ambas determinaciones repetidas de la Solucin B de control positivo del pro-
ducto son positivas; y (3) la media geomtrica de la concentracin en el punto final de la Solucin C est comprendida en el
intervalo de 0,51.. a n.
Para determinar la concentracin de endotoxinas de la Solucin A, calcular la concentracin en el punto final para cada repe-
ticin multiplicando cada factor de dilucin del punto final por A.. La concentracin de endotoxinas en la Solucin Muestra es la
concentracin en el punto final de las repeticiones. Si la prueba se realiza con una Solucin Muestra diluida, calcular la concen-
tracin de endotoxinas en la Solucin Muestra original multiplicando por el factor de dilucin. Si ninguna de las diluciones de la
Solucin Muestra es positiva en un ensayo vlido, informar la concentracin de endotoxina como menor que 'A (si se analiz la
muestra diluida, informar como menor que 'A multiplicado por el factor de dilucin ms bajo de la muestra). Si todas las dilu-
ciones son positivas, la concentracin de endotoxina se informa como igual o mayor que el factor de dilucin mayor por 'A
(p.ej., el factor de dilucin inicial multiplicado por 8 y por 'A en la Tabla 3).
La preparacin cumple con los requisitos de la prueba si la concentracin de endotoxinas en ambas determinaciones repeti-
das es menor que la especificada en la monografa individual.

TCNICAS FOTOMTRICAS CUANTITATIVAS

Tcnica Turbidimtrica

Esta tcnica es una valoracin fotomtrica que mide los incrementos en turbidez del reactante. Dependiendo del principio
empleado en la valoracin, esta tcnica se puede clasificar como valoracin turbidimtrica de punto final o valoracin turbidi-
178 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas/ Pruebas Biolgicas USP 39

mtrica cintica. La valoracin turbidimtrica de punto final se basa en la relacin cuantitativa entre la concentracin de endo-
toxinas y la turbidez (absorbancia o transmisin) de la mezcla de reaccin al trmino de un perodo de incubacin. La valora-
cin turbidimtrica cintica es un mtodo para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia o transmisin prede-
terminada de la mezcla de reaccin (tiempo de iniciacin) o la velocidad de desarrollo de turbidez. La prueba se efecta a la
temperatura de incubacin recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 1 ).

Tcnica Cromognica

Esta tcnica es una valoracin para medir el cromforo liberado de un pptido cromognico adecuado por la reaccin de las
endotoxinas con el lisado. Dependiendo del principio empleado en la valoracin, esta tcnica se puede clasificar como valora-
cin cromognica de punto final o valoracin cromognica cintica. La valoracin cromognica de punto final se basa en la
relacin cuantitativa entre la concentracin de endotoxinas y la liberacin del cromforo al trmino de un perodo de incuba-
cin. La valoracin cromognica cintica es un mtodo para medir el tiempo (tiempo de iniciacin) necesario para alcanzar
una absorbancia predeterminada de la mezcla de reaccin o la velocidad de desarrollo de color. La prueba se efecta a la tem-
peratura d_e incubacin recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 1 ).

Pruebas Preparatorias

Con el fin de garantizar la precisin o validez de las tcnicas turbidimtricas y cromognicas, se realizan las pruebas prepara-
torias para verificar que los criterios para la curva estndar son vlidos y que la solucin muestra no interfiere con la prueba.
Cuando cambian las condiciones que pueden influir en el resultado de la prueba es necesaria la validacin del mtodo de
prueba.

GARANTA DE LOS CRITERIOS PARA LA CURVA ESTNDAR

La prueba se debe efectuar para cada lote de lisado empleado como reactivo. Utilizando la Solucin Estndar de Endotoxina,
preparar por lo menos tres concentraciones de endotoxina dentro del intervalo indicado por el fabricante del lisado para gene-
rar la curva estndar. Realizar la valoracin usando por lo menos tres determinaciones repetidas de cada concentracin de en-
dotoxina estndar, siguiendo las instrucciones del fabricante del lisado (con respecto a relaciones de volumen, tiempo de incu-
bacin, temperatura, pH, etc.). Si el intervalo deseado en los mtodos cinticos es mayor de dos logaritmos, se deben incluir
estndares adicionales para que cada aumento logartmico est comprendido en el intervalo de la curva estndar. El valor ab-
soluto del coeficiente de correlacin, r, debe ser mayor o igual a 0,980 para el intervalo establecido de concentraciones de
endotoxina.

PRUEBA PARA FACTORES DE INTERFERENCIA

Seleccionar una concentracin de endotoxina en o cerca del centro de la curva estndar de endotoxina. Preparar las Solucio-
nes A, 81 C y D segn se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo la prueba en las Soluciones A, B, C y D al menos por duplicado, de
acuerdo con las instrucciones del lisado empleado, por ejemplo, en lo que respecta al volumen entre la Solucin Muestra y el
Usado SR, la relacin de volumen de la Solucin Muestra y el Usado SR, el tiempo de incubacin, etc.
Tabla 4. Preparacin de Soluclones para la Prueba de Inhibicin/Potenciacin para Tcnicas Fotomtricas
Solucln a la cual se Agrega
Solucln Concentracin de Endotoxlna Endotoxlna Nmero de Repeticiones
N Ninguna Solucin Muestra No menos de 2
Bb Concentracin central de la curva estndar Solucin Muestra No menos de 2
ce Al menos 3 concentraciones (la concentracin ms baja se Agua para PEB No menos de 2 para cada una
denomina A.)
Dd Ninguna Agua para PEB No menos de 2
Solucin A: Solucin Muestra se puede diluir sin que exceda la MDV.
b Solucin 8: La preparacin en anlisis a la misma dilucin que Ja Solucin A, que contenga endotoxina agregada a una concentracin igual o cercana a la
concentracin central de Ja curva estndar.
e Solucin C: La endotoxina estndar a las concentraciones usadas en Ja validacin del mtodo descrito para Garanta de Criterios pora la Curva Estndar en
Pruebas Preparatorias (controles positivos).
d Solucin D: Agua para PEB (control negativo).

La prueba se considera vlida cuando se cumplen las condiciones siguientes.

1. El valor absoluto del coeficiente de correlacin de la curva estndar generada usando la Solucin Ces mayor o igual a
0,980.
2. El resultado de la Solucin D no excede el lmite del valor del blanco requerido en la descripcin del lisado empleado co-
mo reactivo o es menor que el lmite de deteccin de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
 USP 39 Pruebas Biolgicas/ (87) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 179

Calcular la recuperacin media de la endotoxina agregada restando la concentracin media de endotoxina en la solucin, si
la hubiera (Solucin A, Tabla 4), de la que contiene la endotoxina agregada (Solucin B, Tabla 4). Para considerar que no pre-
senta factores que interfieran con la valoracin en las condiciones de la prueba, la concentracin medida de endotoxina agre-
gada a la Solucin Muestra debe estar entre 50%-200% de la concentracin conocida de endotoxina agregada despus de
restar la endotoxina detectada en la solucin sin endotoxina agregada.
Cuando la recuperacin de endotoxina se encuentra fuera de los intervalos especificados, se considera que la Solucin Mues-
tra en anlisis contiene factores de interferencia. Luego, repetir la prueba usando una dilucin mayor que no exceda la MDV.
Adems, la interferencia de la Solucin Muestra o de la Solucin Muestra diluida que no exceda la MDV se puede eliminar me-
diante un tratamiento validado apropiado, como filtracin, neutralizacin, dilisis o calentamiento. Para establecer que el trata-
miento elegido elimina eficazmente la interferencia sin prdida de endotoxinas, realizar la valoracin descrita anteriormente
utilizando la preparacin a examinar, a la que se ha agregado Endotoxina Estndar y se ha sometido posteriormente al trata-
miento seleccionado.

Procedimiento de Prueba

Seguir el procedimiento descrito anteriormente para Prueba de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias.

Clculo
Calcular la concentracin de endotoxina de cada una de las determinaciones repetidas de la Solucin A usando la curva es-
tndar generada con la Solucin C de control positivo. La prueba se considera vlida cuando se cumplen las tres condiciones
siguientes.
1. Los resultados de la Solucin C de control cumplen con los requisitos de validacin definidos en Garanta de Criterios para
la Curva Estndar, en Pruebas Preparatorias.
2. La recuperacin de endotoxina, calculada a partir de la concentracin encontrada en la Solucin B despus de restar la
concentracin de endotoxina encontrada en la Solucin A est dentro del intervalo de 50%-200%.
3. El resultado de la Solucin D de control negativo no excede el lmite del valor del blanco requerido en la descripcin del
lisado empleado o es menor que el lmite de deteccin de endotoxina del lisado empleado como reactivo.

Interpretacin

En las valoraciones fotomtricas, la preparacin en anlisis cumple con la prueba si la concentracin media de endotoxinas
de las determinaciones repetidas de la Solucin A, despus de la correccin por dilucin y concentracin, es menor que el lmi-
te de endotoxina para el producto.

(87) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLGICA, IN VITRO

Las pruebas que se describen a continuacin han sido diseadas para determinar la reactividad biolgica de cultivos de clu-
las de mamferos despus de entrar en contacto con plsticos elastomricos y otros materiales polimricos que, a su vez, estn
en contacto directo o indirecto con el paciente, o de extractos especficos preparados a partir de los materiales en anlisis. Es
esencial que las pruebas se realicen en la superficie especificada. Cuando sta no se puede determinar, utilizar O, 1 g de elast-
mero o 0,2 g de plstico u otro material por cada mL de lquido de extraccin. Tomar precauciones en la preparacin de los
materiales para evitar la contaminacin con microorganismos y otra materia extraa.
Se describen tres pruebas (es decir, la Prueba de Difusin en Agar, la Prueba de Contacto Directo y la Prueba de Elucin). 1 La
decisin acerca del tipo de prueba o el nmero de pruebas a realizar para la evaluacin de la posible respuesta biolgica de
una muestra o extracto especficos depende del material, el producto final y el uso previsto. Otros factores que tambin pue-
den afectar la aptitud de la muestra para un uso especfico son: la composicin polimrica, los procedimientos de procesa-
miento y limpieza, el medio de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorcin, la adsorcin y la permeabilidad de los conser-
vantes, y las condiciones de almacenamiento. La evaluacin de tales factores se debe realizar con pruebas especficas adiciona-
les adecuadas antes de determinar si un producto fabricado a partir de un material especfico es apto para el uso previsto. Los
materiales que no cumplen con las pruebas in vitro son candidatos para las pruebas in vivo descritas en Pruebas de Reactividad
Biolgica, In Vivo (88).
Estndares de Referencia USP (11 )-ER Polietileno de Alta Densidad USP. ER Biorreaccin Positiva USP.

1 Para ms detalles, consulte las siguientes publicaciones de la American Society far Testing and Materials, 1916 Race St., Philadelphia, PA 19103: "Standard Test
Method far Agar Diffusion Cell Culture Screening far Cytotoxicity," designacin de ASTM F 895-84; "Standard Practice far Direct Contact Cell Culture Evaluation
of Materials far Medical Devices," designacin de ASTM F 813-83.
180 (87) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro / Pruebas Biolgicas USP 39

Preparacin del Cultivo de Clulas-Preparar mltiples cultivos de clulas de fibroblastos de mamfero L-929 (ATCC lnea
celular CCL 1, NCTC don 929; pueden usarse lneas celulares alternativas obtenidas de un repositorio de estndares siempre
que se sometan a una validacin adecuada) en un medio de cultivo esencial mnimo suplementado con suero, con una densi-
dad de siembra de aproximadamente 105 clulas por ml. Incubar los cultivos a 37 1 en una incubadora humidificada du-
rante no menos de 24 horas en una atmsfera de 5 1% de dixido de carbono hasta obtener una monocapa con una con-
fluencia superior al 80%. Observar al microscopio los cultivos preparados para asegurar que las monocapas sean uniformes y
tiendan a la confluencia. [NOTA-La reproducibilidad de las Pruebas de Reactividad Biolgica In Vitro depende de la obtencin
de una densidad uniforme del cultivo celular.]
Disolventes de Extraccin-Inyeccin de Cloruro de Sodio (ver monografa-usar una Inyeccin de Cloruro de Sodio que
contenga NaCI al 0,9%). De modo alternativo, se pueden usar medios de cultivo de clulas de mamfero sin suero o medios de
cultivo de clulas de mamfero suplementados con suero. Se usa el suplemento de suero cuando la extraccin se realiza a 37
durante 24 horas.
Aparato-
Autoc/ave-Emplear un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 2 equipado con un termmetro, un ma-
nmetro, una llave de ventilacin, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel del
agua y un sistema de refrigeracin de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente 20, pero no
por debajo de 20, inmediatamente despus del ciclo de calentamiento.
Estufa-Usar una estufa, preferentemente un modelo de conveccin mecnica, que mantenga las temperaturas de funcio-
namiento en un intervalo de 50-70 2.
Incubadora-Usar una incubadora capaz de mantener una temperatura de 37 1 y una atmsfera humidificada de 5 1%
de dixido de carbono en el aire.
Recipientes de Extraccin-Utilizar nicamente recipientes de vidrio Tipo 1, como por ejemplo, ampollas o tubos de ensayo
de cultivo con tapa de rosca, o equivalentes. En caso de utilizar tubos de ensayo para cultivo, o equivalentes, deben cerrarse
con una tapa de rosca que tenga un revestimiento elastomrico adecuado. La superficie expuesta del revestimiento elastomri-
co est completamente protegida con un disco slido inerte con un espesor de 50-75 m. Se puede fabricar un disco adecua-
do de tefln.
Preparacin del Aparato-Limpiar minuciosamente todo el material de vidrio con una mezcla limpiadora de cido crmico y,
si fuera necesario, con cido ntrico caliente y luego enjuagar con Agua Estril para Inyeccin durante un tiempo prolongado.
Esterilizar y secar mediante un proceso adecuado los recipientes y dispositivos usados para la extraccin, transferencia o admi-
nistracin del material de prueba. Si se usa xido de etileno como agente esterilizante, dejar que pasen no menos de 48 horas
para la desgasificacin total.
Procedimiento-
Preparacin de Ja Muestra para Extractos-Preparar segn se indica en Procedimiento, en Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo (88).
Preparacin de Extractos-Preparar segn se indica para la Preparacin de Extractos, en Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo (88) y usar la Inyeccin de Cloruro de Sodio (NaCI al 0,9%) o el medio de cultivo de clulas de mamfero sin suero como
Disolventes de Extraccin. [NOTA-Si la extraccin se realiza a 37 durante 24 horas en una incubadora, usar medio de cultivo
de clulas suplementado con suero. Las condiciones de extraccin no deben causar en ningn caso cambios fsicos como la
fusin o el ablandamiento de los trozos de material, excepto una ligera adherencia.]

Prueba de Difusin en Agar

Esta prueba est diseada para cierres elastomricos de diferentes formas. La capa de agar acta como protector de las clu-
las y evita daos mecnicos mientras permite la difusin de las sustancias qumicas lixiviables de las muestras polimricas. Los
extractos de los materiales que se van a analizar se aplican a una pieza de papel de filtro.
Preparacin de Muestra-Usar extractos preparados segn se indica o usar porciones de las muestras de prueba que tengan
superficies planas con un rea de no menos de 100 mm 2
Preparacin de Control Positivo-Proceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
Preparacin de Control Negativo-Proceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
Procedimiento-Usando 7 mL de suspensin de clulas preparada segn se indica en la Preparacin del Cultivo de Clulas,
preparar las monocapas en placas de 60 mm de dimetro. Despus de la incubacin, aspirar el medio de cultivo de las mono-
capas y reemplazarlo con medio de cultivo suplementado con suero que contenga no ms de 2% de agar. [NOTA-La calidad
del agar debe ser adecuada para mantener el crecimiento celular. La capa de agar debe ser lo suficientemente delgada para
permitir la difusin de las sustancias qumicas lixiviables.] Colocar las superficies planas de la Preparacin de Muestra, Prepara-
cin de Control Negativo y Preparacin de Control Positivo o sus extractos en un medio de extraccin adecuado, en cultivos du-
plicados, en contacto con la superficie de agar solidificado. Usar no ms de tres muestras por placa preparada. Incubar todos
los cultivos durante no menos de 24 horas a 37 1, preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 1%
de dixido de carbono. Observar al microscopio, cada cultivo alrededor de cada Muestra, Control Negativo y Control Positivo
usando una tincin adecuada, si se desea.
Interpretacin de Jos Resultados-La reactividad biolgica (degeneracin y malformacin celular) se describe y clasifica en
una escala de 0-4 (ver la Tabla 1). Determinar las respuestas de los cultivos de clulas de la Preparacin de Muestra, la Prepara-
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (87) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 181

cin de Control Negativo y la Preparacin de Control Positivo. El sistema de prueba de cultivos de clulas es adecuado si la res-
puesta observada de la Preparacin de Control Negativo es grado O (no reactiva) y la de la Preparacin de Control Positivo es al
menos grado 3 (moderada). La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparacin de Muestra no
es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
Tabla 1. Grados de Reactividad en la Prueba de Difusin en Agar y la Prueba de Contacto Directo
Grado Reactividad Descripcin de la Zona de Reactividad
o Ninguna No se detecta zona reactiva alrededor, ni debajo de la muestra
1 Escasa Algunas clulas malformadas o degeneradas debajo de la muestra
2 Leve Zona limitada al rea debajo de la muestra y menos de 0,45 cm alrededor de la muestra
3 Moderada Zona reactiva que se extiende de 0,45 cm a 1,0 cm alrededor de la muestra
4 Grave Zona reactiva que se extiende ms de 1,0 cm alrededor de la muestra

Prueba de Contacto Directo

Esta prueba est diseada para materiales de diferentes formas. Este procedimiento permite la extraccin y el anlisis simul-
tneos de sustancias qumicas lixiviables de la muestra en un medio suplementado con suero. El procedimiento no es adecua-
do para materiales de muy baja o muy alta densidad que puedan causar daos mecnicos a las clulas.
Preparacin de Muestra-Usar porciones de la muestra de prueba que tenga superficies planas con un rea de no menos de
100 mm 2
Preparacin de Control Positivo-Proceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
Preparacin de Control Negativo-Proceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
Procedimiento-Usando 2 mL de suspensin de clulas preparada segn se indica en la Preparacin del Cultivo de Clulas,
preparar las monocapas en placas de 35 mm de dimetro. Despus de la incubacin, aspirar el medio de cultivo de los cultivos
y reemplazarlo con 0,8 mL de medio de cultivo recin preparado. Colocar una nica Preparacin de Muestra, una Preparacin
de Control Negativo y una Preparacin de Control Positivo en cada uno de los cultivos duplicados. Incubar todos los cultivos du-
rante no menos de 24 horas a 37 1en una incubadora humidificada que contenga 51 % de dixido de carbono. Obser-
var al microscopio cada cultivo alrededor de cada Preparacin de Muestra, Preparacin de Control Negativo y Preparacin de Con-
trol Positivo, usando una tincin adecuada, si se desea.
Interpretacin de Jos Resultados-Proceder segn se indica para la Interpretacin de los Resultados en Prueba de Difusin en
Agar. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparacin de Muestra no es mayor que grado 2
(levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.

Prueba de Elucin

Esta prueba est diseada para la evaluacin de extractos de materiales polimricos. El procedimiento permite la extraccin
de muestras a temperaturas fisiolgicas o no fisiolgicas para distintos intervalos de tiempo. Es adecuada para materiales de
alta densidad y para evaluaciones de respuesta a la dosis.
Preparacin de Muestra-Preparar segn se indica en la Preparacin de Extractos, usando una Inyeccin de Cloruro de Sodio
(NaCI al 0,9%) o un medio de cultivo de clulas de mamfero sin suero como Disolventes de Extraccin. Si el tamao de la
Muestra no se puede determinar inmediatamente, usar no menos de O, 1 g de material elastomrico o 0,2 g de material plsti-
co o polimrico por mL de medio de extraccin. De modo alternativo, usar un medio de cultivo de clulas de mamfero suple-
mentado con suero como medio de extraccin para simular mejor las condiciones fisiolgicas. Preparar los extractos calentan-
do la muestra durante 24 horas en una incubadora que contenga 5 1 % de dixido de carbono. Mantener la temperatura de
extraccin a 37 1 ,ya que temperaturas superiores pueden desnaturalizar las protenas sricas.
Preparacin de Control Positivo-Proceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
Preparacin de Control Negativo-Proceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
Procedimiento-Usando 2 mL de suspensin de clulas preparada segn se indica en la Preparacin del Cultivo Celular, prepa-
rar las monocapas en placas de 35 mm de dimetro. Despus de la incubacin, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y
reemplazarlo con extractos de la Preparacin de Muestra, Preparacin de Control Negativo o Preparacin de Control Positivo. Los
extractos de los medios de cultivo de clulas suplementados con suero y sin suero se analizan por duplicado sin dilucin
(100%). El extracto con Inyeccin de Cloruro de Sodio se diluye con el medio de cultivo de clulas suplementado con suero y
se analiza por duplicado a una concentracin del extracto del 25%. Incubar todos los cultivos durante 48 horas a 37 1,
preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 1 % de dixido de carbono. Observar al microscopio cada
cultivo a las 48 horas, usando una tincin adecuada, si se desea.
Interpretacin de Jos Resultados-Proceder segn se indica para la Interpretacin de Jos Resultados en Prueba de Difusin en
Agar, pero usando la Tabla 2. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparacin de Muestra no
es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma. Para realizar eva-
luaciones de la respuesta a la dosis, repetir el procedimiento, usando diluciones cuantitativas del extracto de la muestra.
 182 (87) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro / Pruebas Biolgicas USP 39

Tabla 2. Grados de Reactlvldad en la Prueba de Elucln

Grado Reactlvldad
o Ninguna
1 Escasa
2 Leve
3 Moderada
4 Grave
Condiciones de todos los Cultivos
Grnulos intracitoplasmticos diferenciados sin lisis celular
El 20% o menos de las clulas son redondas, levemente adheridas, sin grnulos intracitoplasmticos; hay al-
gunas clulas lisadas
Ms del 20% pero menos o hasta el 50% de las clulas son redondas y desprovistas de grnulos intracito-
plasmticos; no hay lisis celular extensiva ni reas vacas entre clulas
Ms del 50% pero menos del 70% de las capas celulares contienen clulas redondas o lisadas
Destruccin casi total de las capas celulares

(88) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLGICA, IN VIVO

Las siguientes pruebas estn diseadas para determinar la respuesta biolgica de animales a materiales elastomricos, plsti-
cos y otros materiales polimricos en contacto directo o indirecto con el paciente, o mediante la inyeccin de extractos espec-
ficos preparados a partir del material en anlisis. Es esencial conocer el rea especfica para la extraccin. Cuando sta no se
puede determinar, utilizar O, 1 g de elastmero o 0,2 g de plstico u otro material por cada mL de lquido de extraccin. Tam-
bin es fundamental tomar las precauciones necesarias en la preparacin de los materiales que se van a inyectar o instilar para
evitar la contaminacin con microorganismos y otra materia extraa. Se describen tres pruebas. La Prueba de Inyeccin Sistmi-
ca y la Prueba lntracutnea se utilizan para materiales elastomricos, especialmente para cierres elastomricos para los que las
Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro (87) correspondientes han indicado una reactividad biolgica significativa. Estas dos
pruebas se utilizan para plsticos y otros polmeros adems de una tercera prueba, la Prueba de Implantacin, para probar la
aptitud de estos materiales destinados a la fabricacin de envases y accesorios, para uso en preparaciones parenterales y en
dispositivos mdicos, implantes y otros sistemas.
Estas tres pruebas se aplican a materiales o dispositivos mdicos, cuando existe la necesidad de clasificar los plsticos y otros
polmeros basndose en las pruebas de reactividad biolgica in vivo.
A los efectos de este captulo, se aplicarn las siguientes definiciones: la Muestra es la muestra en anlisis o un extracto pre-
parado a partir de dicha muestra. Un Blanco consiste en la misma cantidad del mismo medio de extraccin usado para extraer
la muestra en anlisis, tratado de la misma manera que el medio de extraccin que contiene dicha muestra. Un Control Negati-
vo1 es una muestra que no produce ninguna reaccin en las condiciones de prueba.

CLASIFICACIN DE PLSTICOS

Se definen seis Clases de Plsticos (ver la Tabla 1). Esta clasificacin se basa en las respuestas a una serie de pruebas in vivo
para las que se especifican extractos, materiales y vas de administracin. Estas pruebas estn directamente relacionadas con el
uso final al que estn destinados los artculos de plstico. La eleccin de extractantes es representativa de los vehculos en pre-
paraciones con las que es probable que los plsticos entren en contacto. La clasificacin de la Tabla 1 facilita la comunicacin
entre proveedores, usuarios y fabricantes de plsticos ya que resume las pruebas a las que deben someterse los envases de
inyectables y dispositivos mdicos cuando es necesaria su clasificacin.
Tabla 1. Clasificacin de Plsticos
Clases de Plstico Pruebas por Realizar
1 11 111 IV V VI Material de Prueba Animal Dosis Procedlmlentob
X X X X X X Ratn 50 ml/kg A(IV)
Extracto de Muestra en Inyeccin de Clo- 0,2 ml/animal en cada
X X X X X X ruro de Sodio Conejo o Cobayo uno de 1O 6 sitios B(IC)
X X X X X Ratn 50 ml/kg A(JP)
Extracto de Muestra en Solucin 7 en 20
de Alcohol en Inyeccin de Cloruro de So- 0,2 ml/animal en cada
X X X X X dio Conejo o Cobayo uno de 1O 6 sitios B (IC)
X X X Ratn 10 g/kg A (JP)
Extracto de Muestra en Poletilenglcol 0,2 ml/animal en cada
X X 400 Conejo o Cobayo uno de 1O 6 sitios B(IC)
Las pruebas requeridas para cada clase de plstico se indican con una "x" en las columnas correspondientes.
b Leyenda: A (IP)-Prueba de Inyeccin Sistmica (intraperitoneal); A (IV)-Prueba de Inyeccin Sistmica (intravenosa); B (IC)-Prueba lntracutnea (intracut-
nea); C-Prueba de Implantacin (implantacin intramuscular o subcutnea).

1 ER Polietileno de Alta Densidad USP.

USP 39 Pruebas Biolgicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 183

Tabla 1. Clasificacin de Plsticos (Continuacin)

Clases de Plstico Pruebas por Realizar
1 11 111 IV V VI Material de Prueba Animal Dosis Procedlmientob
X X X X Ratn 50 mL/kg A (IP) .
0,2 mL/animal en cada
X X X Extracto de Muestra en Aceite Vegetal Conejo o Cobayo uno de 1O 6 sitios B(IC)
X X Tiras de implante de Muestra Conejo 4 tiras/animal c
X X Implante de Muestra Rata 2 Muestras/animal c
Las pruebas requeridas para cada clase de plstico se indican con una "x" en las columnas correspondientes.
b Leyenda: A (IP)-Prueba de Inyeccin Sistmica (intraperitoneal); A (IV)-Prueba de Inyeccin Sistmica (intravenosa); B (IC)-Prueba lntracutnea (intracut-
nea); (-Prueba de Implantacin (implantacin intramuscular o subcutnea).

Con excepcin de la Prueba de Implantacin, los procedimientos se basan en el uso de extractos que, segn la resistencia
trmica del material, se preparan a una de las tres temperaturas estndar: 50, 70 y 121 . Por lo tanto, la designacin del tipo
de plstico debe estar acompaada por una indicacin de la temperatura de extraccin (p.ej., IV-121 , que representa un pls-
tico clase IV extrado a 121 o 1-50, que representa un plstico clase 1 extrado a 50).
Los plsticos pueden clasificarse como Clases de Plstico USP 1-VI nicamente sobre la base de los criterios de respuesta pres-
critos en la Tabla 7
Esta clasificacin no es vlida para plsticos destinados al uso como envases de productos orales o tpicos o que pudieran
utilizarse como una parte integral de la formulacin de un medicamento. La Tabla 7 no es vlida para elastmeros naturales,
los cuales deben analizarse con Inyeccin de Cloruro de Sodio y aceites vegetales nicamente.
La Prueba de Inyeccin Sistmica y la Prueba lntracutnea estn diseadas para determinar las respuestas biolgicas sistmica
y local, respectivamente, de animales a plsticos y otros polmeros mediante la inyeccin monodosis de extractos especficos
preparados a partir de una Muestra. La Prueba de Implantacin est diseada para evaluar la reaccin del tejido vivo al plstico
y a otros polmeros mediante la implantacin de la Muestra propiamente dicha en el tejido animal. Para la realizacin de la
Prueba de Implantacin, son importantes la preparacin y la colocacin adecuadas de las muestras en condiciones aspticas.
Estas pruebas estn diseadas para la aplicacin de plsticos y otros polmeros en la condicin en la que se utilizan. Si el
material va a exponerse a cualquier proceso de limpieza o esterilizacin antes de su uso final, las pruebas deben realizarse con
una Muestra preparada a partir de una muestra preacondicionada mediante el mismo procesamiento.
Ciertos factores, como por ejemplo la composicin del material, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el contac-
to con los medios, tintas, adhesivos, absorcin, adsorcin y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de almacena-
miento tambin pueden afectar la aptitud de un material para un uso especfico. Para determinar la aptitud de un material
para su uso indicado, deben evaluarse estos factores mediante pruebas especficas adicionales.
Estndares de Referencia USP (11 )-fR Polietileno de Alta Densidad USP.
Medios de Extraccin-
INYECCIN DE CLORURO DE sorno (ver la monografa). Usar Inyeccin de Cloruro de Sodio que contenga NaCI al 0,9%.
SOLUCIN 1 EN 20 DE ALCOHOL EN INYECCIN DE CLORURO DE SODIO
POLIETILENGLICOL 400 (ver la monografa).
ACEITE VEGETAL-Usar Aceite de Ssamo recin refinado (ver la monografa) o Aceite de Semilla de Algodn (ver la monogra-
fa) u otros aceites vegetales adecuados.
VEHCULO DEL PRODUCTO FARMACUTICO (donde corresponda).
AGUA PARA INYECCIN (ver la monografa).
NOTA-El Aceite de Ssamo o el Aceite de Semilla de Algodn u otros aceites vegetales cumplen con los siguientes requisitos
adicionales. Obtener, si es posible, aceite recientemente refinado. Usar tres animales debidamente preparados e inyectar el
aceite por va intracutnea en una dosis de 0,2 mL en 1 O sitios por animal y observar los animales a las 24, 48 y 72 horas
despus de la inyeccin. Calificar las observaciones en cada sitio con la escala numrica indicada en la Tabla 2. Para los 3 cone-
jos o cobayos (30 18 sitios de inyeccin), en cualquier momento de observacin, la respuesta promedio para eritema no es
mayor de 0,5 y para edema no es mayor de 1,0; y ningn sitio muestra una reaccin tisular de ms de 1 O mm de dimetro
general. El residuo de aceite en el lugar de la inyeccin no debe confundirse con edema. El tejido edematoso se blanquea al
presionarlo suavemente.
Tabla 2. Evaluacin de las Reacciones Cutneas
Eritema y Formacin de Escaras Puntaje
Ausencia de eritema o
Eritema muy leve (apenas perceptible) 1
Eritema bien definido 2
Eritema de moderado a grave 3
Eritema grave (rojo intenso) a leve formacin de escaras (lesiones profundas) 4
Draize JH, Woodward G, Calvery HO. Methods far the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. I
Pharmaco/ Exp Ther 1944;82:377-390.
b Excluye edemas no inflamatorios (mecnicos) del blanco o lquido de extraccin.
184 (88) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo / Pruebas Biolgicas USP 39

Tabla 2. Evaluacin de las Reacciones Cutneas (Continuacin)

Eritema y Formacin de Escaras Puntaje
Formacin de Edemab Puntaje
Ausencia de edema o
Edema muy leve (apenas perceptible) 1
Edema leve (los bordes estn bien definidos con una elevacin clara) 2
Edema moderado (aproximadamente 1 mm de elevacin) 3
Edema qrave (ms de 1 mm de elevacin y extendido ms all del rea de exposicin) 4
Draize JH, Woodward G, Calvery HO. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. f
Pharmacol Exp Ther 1944;82:377-390.
b Excluye edemas no inflamatorios (mecnicos) del blanco o lquido de extraccin.

Aparatos-Los aparatos requeridos para las pruebas incluyen los siguientes.

AUTOCLAVE-Usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 2,0, equipado con un termmetro, un medi-
dor de presin, una llave de ventilacin, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel
del agua y un sistema enfriador de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente, pero no por
debajo de 20 inmediatamente despus del ciclo de calentamiento.
ESTUFA-Usar una estufa, preferentemente un modelo de circulacin forzada, que mantenga las temperaturas de funciona-
miento de 50 o 70 2.
RECIPIENTES DE EXTRACCIN-Usar nicamente recipientes, como ampollas o tubos de ensayo para cultivo de vidrio Tipo 1 con
tapa de rosca. En caso de usarse, los tubos de ensayo para cultivo deben cerrarse con tapas de rosca que tengan revestimien-
tos elastomricos adecuados. La superficie expuesta del revestimiento elastomrico est completamente protegida con un dis-
co slido inerte con un espesor de 0,05-0,075 mm. Puede fabricarse un disco adecuado a partir de una resina de tefln.
Preparacin del Aparato-Limpiar minuciosamente todos los elementos de vidrio con mezcla limpiadora de cido crmico
o, si fuera necesario, con cido ntrico caliente y luego enjuagar con agua durante un tiempo prolongado. Limpiar los utensi-
lios para cortar con un mtodo adecuado (por ejemplo, limpieza sucesiva con acetona y cloruro de metileno) antes de utilizar-
los para subdividir una muestra. Limpiar todos los dems equipos cepillndolos minuciosamente con un detergente adecuado
y enjuagar con agua durante un tiempo prolongado.
Esterilizar y secar los recipientes y equipos utilizados para la extraccin, transferencia y administracin de material de prueba
con un proceso adecuado. [NOTA-Si se usa xido de etileno como agente esterilizante, dejar transcurrir el tiempo suficiente
para la desgasificacin total.]
Procedimiento-
PREPARACIN DE LA MUESTRA-Tanto la Prueba de Inyeccin Sistmica como la Prueba lntracutnea pueden realizarse utilizando
el mismo extracto, si se desea, o bien pueden utilizarse extractos diferentes para cada prueba. Seleccionar y subdividir en por-
ciones una Muestra del tamao indicado en la Tabla 3. Eliminar las partculas, como pelusas y partculas sueltas, tratando cada
Muestra subdividida o Control Negativo del siguiente modo. Colocar la Muestra en una probeta graduada limpia de 100 mL
con tapn de vidrio Tipo 1y agregar aproximadamente 70 mL de Agua para Inyeccin. Agitar aproximadamente 30 segundos y
escurrir el agua. Repetir este paso y secar las piezas preparadas para la extraccin con Aceite Vegetal en una estufa a una tem-
peratura mxima de 50. [NOTA-No limpiar la Muestra con un pao seco o hmedo ni enjuagando o lavando con un disol-
vente orgnico, agente tensoactivo, etc.]
Tabla 3. Superficie de la Muestra a Utilizar"
Cantidad de Muestra por cada 20 ml de Medio de
Forma del Material Espesor Extraccin Subdividida en
2
Equivalente a 120 cm de superficie total (ambos lados Tiras de aprox. 5 x
Pelcula o lmina <0,5 mm combinados) 0,3 cm
Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (ambos lados
0,5-1 mm combinados)
Longitud (en cm)= 120 cm2 /(suma de las circunferencias Secciones de aprox.
Tubos <0,5 mm (pared) del DI y DE) 5 x 0,3 cm
Longitud (en cm)= 60 cm 2 /(suma de circunferencias del
0,5-1 mm (pared) DI y DE)
Placas, tubos y elementos moldea- Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (todas las superfi- Piezas hasta aprox. 5
dos >1 mm cies expuestas combinadas) x 0,3 cm
Equivalente a 25 cm2 de superficie total (todas las superfi- No subdividirb
Elastmeros >1 mm cies expuestas combinadas)
Cuando la superficie no se puede determinar debido a la configuracin de la muestra, usar O, 1 g de elastmero o 0,2 g de plstico u otros polmeros por cada
ml de lquido de extraccin.
b Los cierres elastomricos moldeados se prueban intactos.

PREPARACIN DE EXTRACTOS-Colocar una Muestra debidamente preparada para su anlisis en un recipiente de extraccin y
agregar 20 mL del medio de extraccin adecuado. Repetir estas indicaciones para cada medio de extraccin requerido para la
USP 39 Pruebas Biolgicas / (88) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 185

prueba. Preparar tambin un blanco de 20 ml de cada medio para inyecciones paralelas y comparaciones. Extraer calentando
en un autoclave a 121 durante 60 minutos, en una estufa a 70 durante 24 horas o a 50 durante 72 horas. Dejar transcurrir
suficiente tiempo para que el lquido que se encuentra dentro del recipiente alcance la temperatura de extraccin. [NOTA-Las
condiciones de extraccin no deberan en ningn caso causar cambios fsicos, como fusin o ablandamiento de los trozos de
Muestra, lo cual provocara una reduccin de la superficie disponible. Puede tolerarse una ligera adherencia de los trozos. Agre-
gar siempre las piezas limpias al medio de extraccin en forma individual. Si se utilizan tubos para cultivo para extracciones en
autoclave con Aceite Vegetal, sellar las tapas de rosca en forma adecuada con cinta sensible a la presin.]
Enfriar hasta una temperatura cercana a la ambiente pero no inferior a 20, agitar vigorosamente durante varios minutos y
decantar cada extracto de inmediato en un recipiente seco estril, tomando las precauciones aspticas pertinentes. Almacenar
los extractos a una temperatura de 20-30 y no utilizar para las pruebas despus de transcurridas 24 horas. Es importante el
contacto del medio de extraccin con la superficie disponible del plstico y el tiempo y la temperatura durante la extraccin, el
enfriamiento adecuado, la agitacin y el proceso de decantacin, as como la manipulacin y almacenamiento asptico de los
extractos despus de la extraccin.

PRUEBA DE INYECCIN SISTMICA

Esta prueba est diseada para evaluar respuestas sistmicas a los extractos de materiales en anlisis despus de su inyeccin
en ratones. Pueden usarse vas alternativas de inyeccin, si se justifican.
Animales de Prueba-Utilizar ratones albinos sanos que pesen de 17-23 g y que no hayan sido utilizados previamente.
Para cada grupo de prueba, utilizar nicamente ratones del mismo origen. Suministrar agua y comida ad lbitum, del tipo nor-
malmente utilizado para animales de laboratorio y de composicin conocida.
Procedimiento-[NOTA-Agitar cada extracto vigorosamente antes de retirar las dosis de inyeccin para asegurar la distri-
bucin uniforme de la materia extrada.] Inyectar a cada uno de los cinco ratones del grupo de prueba la Muestra o el Blanco
segn se indica en la Tabla 4, excepto que se debe diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y
el Blanco correspondiente con 4, 1 volmenes de Inyeccin de Cloruro de Sodio para obtener una solucin con una concentra-
cin de aproximadamente 200 mg de polietilenglicol por ml.
Ta bl a 4. Procedi mento
1 de lnyecc1on-Prue ba de lnyecc1on S1stemlca
Extracto o Blanco Dosis por kg Va
Inyeccin de Cloruro de Sodio 50 ml IV
Solucin 1 en 20 de Alcohol en Inyeccin de Cloruro de Sodio 50 ml IV
Polietilenglicol 400 10 g IP
Vehculo del producto farmacutico (cuando corresponda) 50 ml IV
50ml IP
Aceite Vegetal 50 ml IP
IV= intravenosa (muestra acuosa y blanco); IP = intraperitoneal (muestra oleaginosa y blanco).

Observar a los animales de inmediato despus de la inyeccin, nuevamente 4 horas despus de la inyeccin y luego a las 24,
48 y 72 horas como mnimo. Si durante el perodo de observacin ninguno de los animales tratados con el extracto de la
Muestra evidencia una reactividad biolgica significativamente mayor que los animales tratados con el Blanco, la Muestra cum-
ple con los requisitos de esta prueba. Si dos o ms ratones mueren, o si se produce una conducta anormal, como por ejemplo
convulsiones o postracin, en dos o ms ratones, o si se registra una prdida de peso de ms de 2 g en tres o ms ratones, la
Muestra no cumple con los requisitos de la prueba. Si cualquiera de los animales tratados con la Muestra slo presenta signos
leves de reactividad biolgica y no ms de un (1) animal presenta sntomas de marcada reactividad biolgica o muere, repetir
la prueba utilizando grupos de 1 O ratones. Al repetir la prueba, los 1O animales tratados con la Muestra no presentan reactivi-
dad biolgica significativa superior a la de los animales tratados con el Blanco durante el perodo de observacin.

PRUEBAINTRACUTNEA

Esta prueba est diseada para evaluar las respuestas locales a los extractos de materiales en anlisis despus de su inyeccin
intracutnea en conejos o cobayos.
Animales de Prueba-Seleccionar conejos o cobayos sanos que puedan esquilarse bien y cuya piel est libre de irritacin o
traumatismos mecnicos. Al manipular los animales, evitar tocar los sitios de la inyeccin durante los perodos de observacin,
salvo para discriminar entre edema y residuos de aceite.
Procedirniento-[NOTA-Antes de retirar las dosis de inyeccin, agitar cada extracto vigorosamente para asegurar la distri-
bucin uniforme de la materia extrada.] El da de la prueba, esquilar bien el lomo del animal a ambos lados de la columna
vertebral sobre un rea de prueba suficientemente grande. Evitar la irritacin y los traumatismos mecnicos. Eliminar los pelos
sueltos mediante aspiracin. Si fuera necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo humedecido en alcohol diluido y secar
antes de aplicar la inyeccin. Puede utilizarse ms de un extracto de un determinado material por conejo o cobayo, siempre y
cuando se haya determinado que los resultados de la prueba no se vern afectados. Para cada Muestra utilizar dos animales e
inyectar a cada uno por va intracutnea, utilizando un lado del animal para la Muestra y el otro lado para el Blanco, segn se
186 (88) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo / Pruebas Biolgicas USP 39

indica en la Tabla 5. [NOTA-Diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y el Blanco correspon-
diente, con 7,4 volmenes de Inyeccin de Cloruro de Sodio para obtener una solucin con una concentracin de aproximada-
mente 120 mg de polietilenglicol por ml.]
Tabla 5. Prueba lntracutnea
Nmero de Sitios Dosis
Extracto o Blanco (por animal) (L por sitio)
Muestra 5 200
Blanco 5 200

Examinar los sitios de inyeccin en busca de evidencia de cualquier reaccin del tejido, como por ejemplo eritema, edema y
necrosis. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo con alcohol diluido para facilitar la lectura de los
sitios de inyeccin. Observar a todos los animales 24, 48 y 72 horas despus de la inyeccin. Calificar las observaciones en una
escala numrica para el extracto de la Muestra y para el Blanco, utilizando la Tabla 2. Volver a esquilar el pelaje segn sea nece-
sario durante el perodo de observacin. Se determinan los puntajes promedio de eritema y edema para los sitios de la Muestra
y el Blanco en cada periodo de observacin (24, 48 y 72 horas) para cada conejo o cobayo. Despus del puntaje de las 72
horas, todos los puntajes de eritema ms los puntajes de edema se suman por separado para cada Muestra y Blanco. Dividir
cada uno de los totales por 12 (2 animales x 3 perodos de observacin x 2 categoras de puntaje) para determinar el puntaje
medio de cada Muestra frente al de cada Blanco correspondiente. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre
el puntaje medio de la Muestra y del Blanco es de 1,0 o menos. Si en cualquier perodo de observacin, la reaccin promedio a
la Muestra es cuestionablemente mayor que la reaccin promedio al Blanco, repetir la prueba utilizando tres conejos o cobayos
adicionales. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre el puntaje medio de la Muestra y el Blanco es de 1,0 o
menos.

PRUEBA DE IMPLANTACIN
La prueba de implantacin est diseada para la evaluacin de materiales plsticos y otros materiales polimricos que estn
en contacto directo con tejido vivo. Es importante la preparacin adecuada de las tiras de implante y su adecuada implanta-
cin en condiciones aspticas. Se requieren conejos adultos saludables de Nueva Zelanda para la prueba de implantacin intra-
muscular. Las muestras de prueba se colocan dentro de agujas para ser implantadas. Aunque la mayora de los materiales se
ajustan fcilmente a este mtodo, existen algunos materiales que son inadecuados para la implantacin intramuscular. El mo-
delo de implantacin subcutnea en ratas es una alternativa factible para materiales cuyas caractersticas fsicas son inadecua-
das para la implantacin intramuscular de rutina.

Implantacin Intramuscular en Conejos

Preparar para implantacin 8 tiras de la Muestra y 4 tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP. Cada tira debe medir no
menos de 1 O mm x 1 mm. Los bordes de las tiras deben ser tan lisos como sea posible para evitar traumatismos mecnicos
adicionales durante la implantacin. Las tiras del tamao mnimo especificado se implantan con una aguja hipodrmica (cali-
bre 15-19) con una punta intravenosa y un trocar estril. Utilizar agujas previamente esterilizadas dentro de las cuales se inser-
tan aspticamente las tiras de plstico estriles o insertar cada tira limpia en una aguja cuya cnula y conector hayan sido pro-
tegidos con una cubierta adecuada y sometidos posteriomente al proceso de esterilizacin adecuado. [NOTA-Permitir la des-
gasificacin adecuada si se usan agentes como xido de etileno.]
Animales de Prueba-Seleccionar conejos adultos sanos con un peso de al menos 2,5 kg y cuyos msculos paravertebrales
sean lo suficientemente grandes para permitir la implantacin de las tiras de prueba. No utilizar ningn tejido muscular que no
sea el sitio paravertebral. Los animales deben anestesiarse con un agente anestsico de uso comn hasta un grado suficiente
como para evitar los movimientos musculares, como espasmos. Ver las pautas de la Asociacin Internacional para la Evaluacin
y Acreditacin del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC, por sus siglas en ingls).
Procedimiento-Realizar la prueba en un rea limpia. El da de la prueba, o hasta 20 horas antes del anlisis, esquilar a los
animales a ambos lados de la columna vertebral. Eliminar los pelos sueltos mediante aspiracin. Frotar la piel ligeramente con
un hisopo con alcohol diluido y secar antes de aplicar la inyeccin.
Implantar cuatro tiras de la Muestra en el msculo paravertebral a un lado de la columna de cada uno de dos conejos, 2,5-5
cm respecto a la lnea media y en forma paralela a la columna vertebral, con una separacin de aproximadamente 2,5 cm
entre s. De manera similar, implantar dos tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP en el msculo opuesto de cada animal.
Insertar un estilete estril en la aguja para sostener la tira de implante en el tejido mientras se extrae la aguja. En caso de obser-
var sangrado excesivo despus de implantar una tira, colocar una tira duplicada en otro lugar.
Mantener los animales durante 120 horas como mnimo y luego sacrificarlos al final del perodo de observacin, adminis-
trndoles una sobredosis de un agente anestsico u otros agentes adecuados. Dejar transcurrir suficiente tiempo para cortar el
tejido sin que se presente sangrado. Examinar macroscpicamente el rea del tejido que rodea la porcin central de cada tira
de implante. Utilizar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control para detectar la presencia de hemorragia, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 187

encapsulacin, si la hubiera, registrando el ancho de la cpsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control
o Muestra hasta la periferia de la cpsula) redondeado a la dcima de mm. Calificar la encapsulacin segn se indica en la
Tabla 6.
Tabla 6. Evaluacin de la Encapsulacin en la Prueba de Implantacin
Ancho de la Cpsula Puntaje
Ninguna o
Hasta 0,5 mm 1
0,6-1,0 mm 2
1,1-2,0 mm 3
Ms de 2,0 mm 4

Calcular las diferencias entre puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se cum-
plen si la diferencia no es mayor de 1,0, o si la diferencia entre los puntajes medios de la Muestra y el Control para ms de uno
de los cuatro sitios de implantacin no es mayor de 1 en cualquiera de los animales implantados.

Prueba de Implantacin Subcutnea en Ratas

Preparar para implantacin 1O muestras de prueba y 1O muestras control. El tamao y la forma de las muestras control de-
ben ser lo ms parecido posible a los de las muestras de prueba. Por ejemplo, las muestras preparadas en lminas deben tener
un dimetro de 10-12 mm y un espesor de 0,3-1 mm. Los bordes de las muestras deben ser tan lisos como sea posible para
evitar traumatismos mecnicos adicionales durante la implantacin.
Animales de Prueba-Seleccionar ratas albinas saludables con un peso entre 225-350 g al momento de la implantacin.
Procedimiento-Realizar la prueba en un rea limpia. Anestesiar (ver las pautas de la AAALAC) al animal hasta lograr un
plano quirrgico. Esquilar el pelaje de los animales en ambos lados de la columna vertebral. Retirar los pelos sueltos mediante
aspiracin. Limpiar el rea esquilada con solucin de yodo-povidona. Usando una tcnica asptica, realizar dos incisiones en la
lnea media (de aproximadamente 1,0 cm de largo) a travs de la piel en las regiones craneal y caudal sobre la superficie dor-
sal. Mediante diseccin roma, separar la fascia que conecta la piel con el msculo para formar una bolsa debajo de la piel late-
ral a cada costado de la incisin (la base de la bolsa es de aproximadamente 20 mm a partir de la lnea del implante). Insertar
una muestra estril en cada bolsa y cerrar la incisin mediante sutura o ganchos quirrgicos. Implantar dos muestras de prue-
ba y dos muestras control en cada una de cinco ratas. Mantener a los animales durante un periodo de al menos siete das y
sacrificarlos al final del periodo de observacin mediante hipoxia inducida por C0 2 o administrando una sobredosis de un
agente anestsico. Dejar transcurrir un tiempo suficiente para que el tejido pueda cortarse sin que sangre. Cortar longitudinal-
mente la piel (superficie dorsal) y levantarla. Examinar macroscpicamente y con cuidado el rea del tejido que rodea el im-
plante. Cortar la muestra por la mitad y retirarla para examinar de cerca el tejido que est en contacto directo con la muestra.
Usar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar, si fuera apropiado. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control en busca de hemorragias, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la encapsulacin,
si la hubiera, registrando el ancho de la cpsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control o Muestra hasta
la periferia de la cpsula) redondeando a la dcima de mm. Registrar el puntaje de la encapsulacin de acuerdo con la Tabla 6.
Calcular las diferencias entre los puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se
cumplen si la diferencia no excede de 1,0.

PRUEBAS DE SEGURIDAD-PRODUCTOS BIOLGICOS

La prueba de seguridad aqu descrita est diseada para detectar cualquier reactividad biolgica imprevista e inaceptable en
un artculo. Esta prueba in vivo es para la evaluacin de la seguridad de los productos obtenidos por biotecnologa.

Prueba de Seguridad

Seleccionar cinco ratones sanos que no hayan sido utilizados previamente para pruebas y que pesen de 17-23 g, a menos
que se indique algo diferente en la monografa individual correspondiente o en otra parte de este captulo, mantenidos con
una dieta equilibrada adecuada. Preparar una solucin de prueba segn las indicaciones de la monografa individual corres-
pondiente. A menos que se indique lo contrario en la monografa individual o en otra parte de este captulo, inyectar una dosis
de 0,5 ml de la solucin de prueba a cada uno de los ratones, utilizando una aguja de calibre 26 de la longitud adecuada o de
la longitud especificada a continuacin, segn corresponda. Observar a los animales durante las 48 horas posteriores a la in-
yeccin. Si al cabo de las 48 horas todos los animales sobreviven y no ms de uno de los animales presenta sntomas externos
de una reaccin inesperada debido al nivel de toxicidad relacionado con el artculo, se cumplen los requisitos de esta prueba.
Si uno o ms animales mueren o si ms de uno de los animales presenta signos de toxicidad anormal o indebida del artculo
en anlisis, repetir la prueba utilizando al menos otros 1 O ratones similares a los utilizados para la prueba inicial pero con un
peso de 20 1 g. En cualquiera de los casos, si todos los animales sobreviven durante 48 horas y no presentan sntomas de
una reaccin indicativa de un nivel de toxicidad anormal o indebido del artculo, se cumplen los requisitos de la prueba. De-
188 (88) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo/ Pruebas Biolgicas USP 39

ben obtenerse los pesos corporales de los ratones antes de la prueba y al finalizarse para detectar cualquier efecto inapropiado.
Los animales que presenten signos de toxicidad debern someterse a una necropsia completa y a estudios de histopatologa, si
fuera necesario.
Para los productos biolgicos, realizar la prueba segn los procedimientos que se describen en el Cdigo de Reglamentos Fe-
derales, Seccin 610.11.

(89) ENZIMAS USADAS COMO MATERIALES AUXILIARES EN LA

FABRICACIN DE PRODUCTOS FARMACUTICOS

INTRODUCCIN
El propsito de este captulo es describir los atributos de calidad y las pruebas relacionadas con los criterios de aceptacin para
preparaciones enzimticas usadas en la fabricacin de productos biofarmacuticos. La calidad de los materiales auxiliares,
incluyendo enzimas, usados en la fabricacin de productos biofarmacuticos puede tener un impacto sobre los productos
teraputicos. Se usan diversas enzimas en este tipo de procesamiento celular. Los ejemplos incluyen tripsina, colagenasa,
pepsina y papana. Este captulo no trata las aplicaciones de dichas enzimas, sino que se enfoca en las pruebas para evaluar
su calidad como materiales del proceso.
Tripsina Recombinante
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHFCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL
GEHNID~ NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV
ATVSLPRSCA AAGTECLISG WGNTKSSGSS YPSLLQLKA PVLSDSSCKS
SYPGQITG~ ICVGFLEGGK DSCQGDSGGP VVCNGQLQGI VSWGYGCAQK
NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN

C1020H1s91N2a1321 S14
23 463 (para /3-Tripsina)
[9002-07-7].

DEFINICIN
La tripsina recombinante, una materia prima clave para la fabricacin de productos biofarmacuticos, es una serina proteasa
que rompe cadenas de pptidos principalmente en el extremo carboxlico de los aminocidos arginina y lisina. La secuencia
de aminocidos de la tripsina recombinante es idntica a la de la tripsina de pncreas porcino y la tripsina recombinante se
produce usando mtodos basados en tecnologa de ADN recombinante en la levadura Pichia pastoris. Por lo tanto, las espe-
cificaciones descritas en este captulo aplican nicamente a la tripsina porcina recombinante producida en levadura. Debido
al proceso de produccin recombinante, la tripsina recombinante est exenta de quimotripsina. Se conocen dos formas acti-
vas de tripsina: j]-tripsina (23 463 daltones) y a-tripsina (23 481 daltones). La autlisis de la j]-tripsina en el enlace peptdi-
co entre Arg99 y Va110, Lys1 2s y Ser126 o LysB9 y Ala 14 resulta en tres isoformas posibles de a-tripsina. Todas las isoformas se
mantienen unidas mediante puentes disulfuro y se conservan correctamente dobladas. Como consecuencia de la hidrlisis
de un enlace peptdico, el peso molecular de a-tripsina es mayor que el de f3 -tripsina por 18 daltones. El rea del pico de f3 -
tripsina es no menos de 70% y el rea del pico de a-tripsina es no ms de 20%, segn se determinan en el procedimiento
de HPLC descrito en la prueba de Pureza. La actividad especfica es no menos de 180 Unidades/mg de protena usando ace-
tato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustrato descrito en la Valoracin.
[NOTA-Una Unidad de actividad de tripsina usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustra-
to corresponde a 21 Unidades USP de Tripsina. Una Unidad USP de Tripsina es la actividad que causa un cambio en la absor-
bancia de 0,003 por minuto en las condiciones especificadas en la Valoracin de la monografa de Tripsina Cristalizada usan-
do clorhidrato del ster etlico de N-benzoil-L-arginina como sustrato. Por ende, la actividad especfica de 180 Unidades/mg
de protena usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como sustrato para tripsina recombinante co-
rresponde a 3800 Unidades USP de Tripsina/mg de protena.]

IDENTIFICACIN
A. Cumple con los requisitos de la Valoracin.
B. El tiempo de retencin del pico principal de f3 -tripsina en la Solucin muestra corresponde al de la Solucin estndar, se-
gn se obtienen en la prueba de Pureza.

VALORACIN

PROCEDIMIENTO
Solucin amortiguadora: Disolver 1,21 g de tris(hidroximetil)aminometano y 0,29 g de cloruro de calcio dihidrato en 100
mL de agua, y ajustar con cido clorhdrico 2 N a un pH de 8,0 (a 25 1).
 USP 39 Pruebas Biolgicas/ (89) Enzimas 189

Solucin madre de sustrato: Disolver 20 mg de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida 1 , pesado con

exactitud, en 3,0 mL de agua. [NOTA-Usar nicamente una solucin recientemente preparada.]
Solucin de sustrato: Preparar una solucin mezclando 28 mL de Solucin amortiguadora y 2,8 mL de Solucin madre de
sustrato. [NOTA-Usar nicamente una solucin recientemente preparada.]
Soluciones estndar: Enfriar previamente el ER Tripsina Porcina Recombinante USP y el agua hasta aproximadamente 4.
Comenzar a preparar las Soluciones estndar inmediatamente cuando la temperatura haya alcanzado 4. Preparar cada So-
lucin estndar diluyendo ER Tripsina Porcina Recombinante USP con agua hasta obtener una dilucin 1 :68 921. Preparar al
menos cinco Soluciones estndar en paralelo. Valorar cada Solucin estndar por duplicado. [NOTA-Usar una micropipeta
ajustable para cada medicin y dilucin. Usar tubos de ensayo de poliestireno para preparar las Soluciones estndar y las
Soluciones muestra, y usar puntas de pipeta de poliestireno que contengan filtros de polietileno para transferir las muestras.
La punta de pipeta no debe mojarse antes de la transferencia y cada punta debe usarse slo para transferir una muestra.]
[NOTA-Se puede lograr una dilucin 1 :68 921 mediante tres etapas de dilucin sucesivas en las que cada etapa tiene una
dilucin 1 :41 (1 :41 /l :41 /l :41 ). Por ejemplo, para la dilucin inicial, extraer O, 1 mL de ER Tripsina Porcina Recombinante
USP usando una micropipeta con punta de poliestireno que contenga filtros de polietileno, limpiar la parte externa de la
punta para eliminar cualquier residuo de solucin y agregar el Estndar de Referencia a un tubo de ensayo de poliestireno
que contenga 4,0 mL de agua previamente enfriada, enjuagar la punta pipeteando la solucin hacia arriba y hacia abajo 2-
3 veces, desechar la punta y mezclar la solucin en un mezclador de vrtice durante aproximadamente 2 segundos a mxi-
ma velocidad. Para la segunda y tercera etapa de dilucin, proceder segn se describe para la dilucin inicial, excepto que
se debe transferir O, 1 mL de solucin de la etapa de dilucin previa.]
Soluciones muestra: Preparar al menos cinco Soluciones muestra de tripsina recombinante en paralelo segn se indica en
Soluciones estndar para obtener una concentracin final de al menos O, 16 Unidades/mL usando agua previamente enfria-
da como diluyente. Cada Solucin muestra se valora por duplicado.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopa Ultravioleta-Visible (857) (AF oi-may-io 1w)
Modo: UV
Longitud de onda analtica: 405 nm
Longitud de paso: 1 cm
Temperatura: 25
Anlisis
Muestras: Soluciones estndar y Soluciones muestra
Transferir 1, 1O mL de Solucin de sustrato a una semi-microcubeta de poliestireno, dejar que la temperatura se estabilice,
verificar la temperatura especificada en la cubeta y esperar durante 1O minutos. Comenzar la reaccin agregando 0,020
mL de Solucin estndar o Solucin muestra. Registrar la absorbancia durante al menos 5 minutos y determinar el cambio
en la absorbancia (l'lA/min) a partir del intervalo lineal de la reaccin.
Calcular la actividad de tripsina recombinante en Unidades/mL:

Resultado= [Vr/Ci: x V x B)] x (l'lA/min) x O

Vr =volumen de la mezcla de reaccin, 1, 12 mL

; =coeficiente de extincin para 405 nm, 10,4 (mmol- 1 1 cm- 1)
V =volumen de la Solucin estndar o la Solucin muestra, 0,020 mL
B = longitud de paso de absorcin, 1 cm
O = factor de dilucin
[NOTA-Una unidad liberar el equivalente a 1 mmol de 4-nitril anilina a partir de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-argini-
na-4-nitril-anilida por minuto en las condiciones de la Valoracin.]
Calcular la actividad especfica de tripsina recombinante en Unidades/mg de protena:
Resultado= Actividad/(
C = concentracin de protena en la tripsina recombinante (mg/mL)
Aptitud del sistema
Muestras: Soluciones estndar y Soluciones muestra
Requisitos de aptitud: l'lA/min debe ser 0,03-0,07 para las Soluciones estndar y las Soluciones muestra. La actividad pro-
medio calculada para las Soluciones estndar es de 90%-110% del valor en la etiqueta.
Criterios de aceptacin
Actividad especfica: No menos de 180 Unidades/mg de protena
Desviacin estndar relativa: No ms de 5% para las actividades determinadas a partir de 5 determinaciones repetidas

PUREZA
PROCEDIMIENTO

1 Un acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida adecuado es Chromozym TRY de Roche Applied Science (N de catlogo 10378496103) o equiva-
lente.
190 (89) Enzimas / Pruebas Biolgicas USP 39

Solucin A: Diluir 1 mL de cido fosfrico (85%) con agua hasta 1000 ml.
Solucin B: Diluir 1 mL de cido fosfrico (85%) con acetonitrilo hasta 1000 mL.
Fase mvil: Ver la Tabla 7.
Tabla 1
Tiempo Solucin A Solucin B
(min) (%) (%)
o 75 25
25 55 45
30 10 90
34 10 90
35 75 25
45 75 25

Solucin estndar: Descongelar 100 L de ER Tripsina Porcina Recombinante USP a temperatura ambiente durante apro-
ximadamente 1 hora, mezclar y transferir a un vial para HPLC. La concentracin deseada de la protena debe ser 70 1O
mg/ml.
Solucin muestra: Descongelar 100 L de tripsina recombinante a temperatura ambiente durante 1 hora, mezclar y trans-
ferir a un vial para HPLC. La concentracin deseada de la protena debe ser 70 1O mg/ml.
[NOTA-Mantener la Solucin estndar y la Solucin muestra a 2-8 si no estn listas para ser inyectadas inmediatamente des-
pus de su preparacin.]
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 3 m con un tamao de poro de 200 A
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: 1,0 mL/min
Volumen de inyeccin: 1 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
[NOTA-El tiempo de retencin del pico principal de tripsina recombinante es 12-17 minutos.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1 entre los picos de a-tripsina y j3 -tripsina
Anlisis
Muestra: Solucin muestra
Registrar los cromatogramas y medir las reas de los picos. Evaluar la pureza de la tripsina usando el mtodo de rea-%. El
tiempo de integracin es de 25 minutos. El blanco debe considerarse para la integracin. Los picos que no se separan
completamente y eluyen antes del pico de a-tripsina se integran mediante una lnea perpendicular nicamente si se for-
ma un mnimo. Los picos que no se separan completamente y eluyen luego del pico de j3 -tripsina se integran tangencial-
mente nicamente si se forma un mnimo.
Criterios de aceptacin: No menos de 70% para el rea del pico de j3 -tripsina y no ms de 20% para el rea del pico de
a-tri psi na

PRUEBAS ESPECFICAS

Cambio en la redaccin:

CONTENIDO DE PROTENA
Solucin de cido clorhdrico 4 N: Mezclar 10,4 mL de cido clorhdrico al 25% con 9,6 mL de agua.
Solucin amortiguadora de almacenamiento: Disolver 2,9 g de cloruro de calcio dihidrato en agua, agregar 2,5 mL de
Solucin de cido clorhdrico 4 N y diluir con agua hasta un volumen final de 1000 ml. Ajustar con Solucin de cido clorhdri-
co 4 N a un pH de 2,0 0,2, si fuera necesario.
Soluciones muestra: Agregar 0,025 mL de tripsina recombinante a 3 mL de Solucin amortiguadora de almacenamiento.
Preparar al menos por triplicado.
Solucin blanco: Solucin amortiguadora de almacenamiento, 3 mL
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopa Ultravioleta-Visible (8$7) (AFOl-may.2016i.)
Modo: UV
Longitud de onda analtica: 280 nm
Longitud de paso: 1 cm
Aptitud del sistema
USP 39 Pruebas Biolgicas / (90) Suero Fetal Bovino 191

Muestra: Soluciones muestra

Requisitos de aptitud: AA (segn se define a continuacin) est en el intervalo de O, 13-1,8.
Anlisis
Muestras: Soluciones muestra y Solucin blanco
Calcular la concentracin de protena en mg/mL:

l
Resultado =
(.MxF)
A 1%
2801cm
j
XO

Au = absorbancia de la Solucin muestra

A8 = absorbancia de la Solucin blanco
~ 1% =factor de conversin de 1% a mg/mL, 1O
280 1cm =coeficiente de extincin para tripsina, 13,6
O =factor de dilucin
PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO (61): El recuento total bacteriano no excede de 100 ufc/mL, realizando la prueba en 1
mL de tripsina recombinante por duplicado.
REQUISITOS ADICIONALES
ENVASADO v ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a -15 a -25.
ETIQUETADO: El etiquetado indica que el material es de origen de ADN recombinante, junto con el nmero de producto y el
nmero de lote, las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad.
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Tripsina Porcina Recombinante USP

(90) SUERO FETAL BOVINO-ATRIBUTOS DE CALIDAD Y PRUEBAS DE

FUNCIONALIDAD

PROCESAMIENTO

El Suero Fetal Bovino (FBS, por sus siglas en ingls) es la fraccin lquida de color marrn claro de la sangre bovina fetal
coagulada de la que se ha eliminado clulas, fibrina y factores de coagulacin. Aunque no se ha definido la composicin com-
pleta del FBS, ste contiene altos niveles de factores de crecimiento y bajos niveles de inmunoglobulinas. Adems, contiene
otros ingredientes claves que son esenciales para sustentar la proliferacin de clulas en cultivos. Este producto se usa tanto en
la investigacin bsica de las ciencias biolgicas como en la fabricacin industrial. El FBS es un subproducto de la industria de
la carne y se recolecta a partir de fetos bovinos extrados del ganado que se encuentra preado al momento de su faena. El
FBS se recolecta en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del pas de origen. La recoleccin y el procesa-
miento deben ser llevados a cabo por personal capacitado siguiendo procedimientos escritos y aprobados. La sangre se reco-
lecta en un sistema cerrado en un rea dedicada dentro de la instalacin y se procesa rpidamente para evitar la hemlisis.
Posteriormente, se permite que la sangre coagule y luego, por lo general, se centrifuga en una centrfuga refrigerada para se-
parar el suero de los dems componentes. Por lo regular, el suero se extrae del cogulo, se transfiere a envases etiquetados, y
se congela. Todos los fabricantes emplean filtracin estril antes del envasado final. Adems, la radiacin gamma proporciona
la garanta ms alta de ausencia de actividad viral. Las dosis de radiacin gamma de 25-40 kGy proporcionan una reduccin
logartmica significativa de agentes virales y de otros agentes adventicios, al tiempo que preservan el desempeo para el creci-
miento celular.
La deteccin de contaminacin viral en el FBS se logra usando todas las pruebas aplicables descritas en el Code of Federal
Regulations (Cdigo de Reglamentos Federales) Ttulo 9 CFR 113.53 (conocido como el anlisis completo del Ttulo 9 del
CFR). Los ensayos para micoplasmas se realizan segn se indica en Pruebas para Micoplasmas (63).

ATRIBUTOS DE CALIDAD DEL SUERO FETAL BOVINO

Envasado y Almacenamiento: Almacenar en envases sellados a una temperatura de -1 O o menor.

192 (90) Suero Fetal Bovino / Pruebas Biolgicas USP 39

Etiquetado: Etiquetar indicando que contiene Suero Fetal Bovino e indicar el nmero de lote, la fecha de caducidad y las
condiciones de almacenamiento. Asimismo, indicar el pas de origen en el etiquetado del producto.
Estndares de Referencia USP (11)
ER Endotoxina USP
ER Suero Fetal Bovino USP
pH (791 ): 7,00-8,00 en muestras de suero sin diluir
: 280-360 msmol/kg
Contiene no ms de 1O Unidades USP de Endotoxina/mL de suero.
Contenido de Protenas Totales (1057): 30-45 mg/mL
Pruebas de Esterilidad (71 ): Cumple con los requisitos
ldentificacin-lnmunodifusin Radial
Reactivos
- Muestras de prueba de FBS
- Suero de caballo, muestras de control negativo
- Calibrador de lgG bovina (500 mg/L)
- Diluyente de albmina ovina (albmina ovina al 1%, EDTA al O, 18%, NaCI al 1,75% y Tris/HCI de pH 7,4 al 1,21 %).
Materiales/Aparato: Calibrar el dispositivo de medicin de anillos (halos) en incrementos de O, 1 mm. Las placas de in-
munodifusin radial (IDR) estn disponibles comercialmente y contienen antisuero anti-lgG bovina en un gel de agarosa al
1,5%, solucin amortiguadora de fosfato O, 1 M de pH 7,0, azida de sodio al O, 1% como agente bacteriosttico y 1 g/mL de
anfotericina B como agente antifngico. Almacenar a una temperatura de 2-8. Usar placas de IDR que puedan medir lgG
bovina en el intervalo de 50-500 mg/L.
Curva estndar: Usar los calibradores de lgG bovina para la aptitud del sistema y para generar una curva de calibracin.
Preparar dos diluciones a partir de una solucin madre de lgG bovina de 500mg/ml. Diluir 120 L de la solucin madre de
500 mg/L con 80 L de diluyente (dilucin media) y 25 L de la solucin madre de 500 mg/L con 225 L de diluyente (dilu-
cin baja). Etiquetar cada dilucin respectivamente como calibradores de 300 mg/L y de 50 mg/L. Usar las soluciones de 500
mg/L, 300 mg/L y 50 mg/L para generar la curva estndar. [NOTA-Preparar y analizar las soluciones calibradoras de lgG bovi-
na por duplicado.] Cargar 5 L de cada muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa. A las 72 horas de la incubacin, medir
los dimetros de los anillos con una aproximacin de O, 1 mm usando un dispositivo de medicin de anillos apropiado. Regis-
trar los resultados y generar una curva estndar.
El dimetro del anillo debe desarrollarse completamente a temperatura ambiente durante 72 horas. Usando el resultado de
cada punto de la curva estndar, generar una grfica de linealidad en la que y es el dimetro cuadrado (mm 2) del anillo de
precipitina alrededor del pocillo y x es la concentracin de lgG bovina (mg/L). Calcular la curva de regresin lineal por cuadra-
dos mnimos de la forma y = m(x) + b con ayuda de un software adecuado y determinar los valores para la pendiente (m), la
ordenada al origen y (b) y el coeficiente de determinacin (R2). La curva estndar para el mtodo es lineal si R2 es ~0,98.
Anlisis: Las muestras congeladas sin diluir de FBS se descongelan y analizan dentro de las 24 horas si se almacenan a 4.
El anlisis de las muestras de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP se realiza por triplicado. Preparar placas de IDR que
contengan anti-lgG bovina para el anlisis de varios tipos de suero. Dejar que las placas y los reactivos se equilibren a tempera-
tura ambiente antes de su uso dejando las placas abiertas durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir que se
evapore cualquier condensacin de humedad en los pocillos o en la superficie del gel. Las muestras no se deben aplicar a los
pocillos en los que se observe humedad. Preparar diluciones en serie, si fuera necesario, de las muestras de prueba de FBS y de
ER Suero Fetal Bovino USP en diluyente. Diluir el suero de caballo para control negativo en diluyente. Cargar 5 L de cada
muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 72 horas. [NOTA-Las muestras de
prueba y el control negativo se cargan en la misma placa.]
Clculo: Despus de 72 horas, medir los dimetros de los anillos usando el dispositivo de medicin de anillos y registrar
los resultados. Usando la ecuacin de regresin desarrollada para la desviacin de la curva estndar, calcular la concentracin
de lgG bovina en las muestras de FBS. La concentracin se expresa en mg/L.
Criterios de aceptacin: El suero de caballo es negativo (no debe presentar un anillo de precipitacin). Las muestras de
prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP son positivas y deben contener no ms de 500 mg/L de lgG.
Contenido de hemoglobina:
0Jer11Blflllli. . . . . . . . . . . . ,lllJ.)
Preparacin de la muestra: Las muestras de FBS se descongelan, se almacenan a 4 y se analizan dentro del mismo da.
Anlisis: Determinar la absorbancia de la muestra de suero usando una celda espectrofotomtrica con una longitud de
paso de 1 cm a las longitudes de onda de absorbancia de 576, 623 y 700 nm y usando agua como blanco. Calcular la concen-
tracin de hemoglobina en mg/dL por la frmula:
(Abs 576 x 115) - (Abs 623 x 102) - (Abs 700 x 39, 1)

Criterios de aceptacin: No ms de 30 mg/dL

USP 39 Pruebas Biolgicas/ (90) Suero Fetal Bovino 193

PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD DEL FBS

En caso de no existir un ensayo de funcionalidad definido por el usuario, las siguientes pruebas son adecuadas para determi-
nar la funcionalidad de lotes especficos de FBS y para ayudar en la optimizacin de las condiciones de crecimiento de cultivos
de clulas mamferas en presencia de FBS. Para una confirmacin vlida de la funcionalidad, independiente de las aplicaciones
especficas del usuario, las pruebas se realizan en las lneas celulares especificadas. Para la validacin interna de aplicaciones
especializadas de cultivos celulares, se deben usar y caracterizar lneas celulares especficas para tales aplicaciones. Usar frascos
de cultivo de tejidos apropiados. Las dos pruebas descritas en este captulo son la Curva de Promocin de Crecimiento y el Ensa-
yo Clona/. La decisin sobre el tipo de prueba o el nmero de pruebas que se van a realizar para evaluar la aptitud de un lote
especfico de FBS depende del tipo de lnea celular usada. Para lneas celulares adherentes, el nmero de colonias al final del
periodo de cultivo representa una buena evaluacin de la capacidad de estas clulas, a baja concentracin, para crecer en pre-
sencia de un lote especfico de FBS. Para lneas celulares que crecen en cultivos en suspensin, la cintica ptima de crecimien-
to se mide contando las clulas viables despus de 7 das de cultivo.
Lneas celulares: Se recomiendan cinco lneas celulares:
(1) HFL 1 (ATCC CCL-153) fibroblasto de pulmn normal
(2) Mvl Lu (ATCC CCL-64) epitelio de pulmn de visn
(3) HL-60 (ATCC CCL-240) promieloblasto de sangre perifrica, suspensin
(4) VERO (ATCC CCL-81) fibroblasto de rin de mono
(5) CHO (CCL-61) ovario de hmster chino
Las pruebas de funcionalidad descritas se deben realizar en tres lneas celulares, dos de las cuales corresponden a la lista de las
cinco lneas celulares recomendadas, mientras que la tercera es la lnea celular pertinente a la aplicacin del usuario. Las lneas
celulares se cultivan con medios especficos segn lo recomendado por la ATCC.
Materiales
- Frasco/recipiente de crecimiento adecuado
- Cabina de Seguridad Biolgica Clase 11, Tipo A
- Contador de clulas/hemacitmetro
- Microscopio invertido con accesorio para cmara digital
- Frascos de cultivo de tejidos: T25 cm 2
Preparacin de clulas para ensayos: Descongelar rpidamente un vial en un bao de agua a 37 y determinar el re-
cuento y la viabilidad celular. Preparar mltiples cultivos a partir de cada lnea celular en un medio de crecimiento suplementa-
do con suero. Incubar los cultivos a 37 siguiendo las instrucciones provistas por la ATCC para cada una de las lneas celulares
usadas para la prueba. Examinar los cultivos celulares en un microscopio para asegurarse de la existencia de monocapas unifor-
mes casi confluentes o suspensiones uniformes. Expandir las clulas hasta que se tengan suficientes para el ensayo (aproxima-
damente 1 x 10 7 clulas totales; >90% viabilidad)
Recoleccin de cultivos
1. Retirar y desechar el medio de crecimiento y luego enjuagar cada cultivo con medio sin FBS.
2. Para las clulas adherentes, agregar 1 mL de Tripsina/EDTA durante unos pocos minutos para que las clulas se dispersen.
Incubar a 37, si fuera necesario. Neutralizar con 1 ml de medio de cultivo que contenga por lo menos 10% de FBS.
3. Centrifugar brevemente (spin down) las clulas en una centrfuga. Aspirar el medio de lavado y resuspender las clulas en
un volumen apropiado para siembra.
Siembra de clulas
1. En el da O: Para las tres lneas celulares que se van a analizar, preparar cultivos mltiples usando densidades de siembra
que abarquen el intervalo entre 2 x 103 y 2 x 104 clulas viables/mL. (En un inicio, se seleccionan inculos diferentes para
determinar las condiciones de crecimiento ptimas. Una vez que se ha seleccionado el inculo apropiado, dicha condi-
cin se usa para propagar las clulas). A continuacin se presentan las densidades de siembra recomendadas:
Densidad de siembra baja: 2 x 103 clulas viables/mL
Densidad de siembra media: 6 x 103 clulas viables/mL
Densidad de siembra alta: 2 x 104 clulas viables/mL
2. Preparar cultivos por triplicado para al menos cinco puntos de tiempo (en das u horas de acuerdo con la lnea celular),
para determinar la densidad de siembra que producir condiciones de crecimiento ptimo para cada lnea celular usada.
3. Incubar los cultivos a 37 en una incubadora humidificada saturada con C0 2 al 5%.
4. Para cada punto de tiempo de medicin (das O, 1, 2, 3, 4 y 7), tomar una fotografa de cada cultivo, por triplicado, tanto
para el material de prueba de FBS como del ER Suero Fetal Bovino USP a cada una de las tres concentraciones para cada
lnea celular y registrar el porcentaje de confluencia para cada una de las condiciones. [NOTA-Realizar esta etapa antes de
la tripsinizacin y del conteo celular.]
5. Recolectar las clulas de los tres cultivos de diferente densidad de siembra para cada punto de tiempo especfico. Para
cultivos adherentes, recolectar las clulas segn se describi anteriormente.
6. Realizar y registrar el recuento de clulas totales y la viabilidad para cada uno de los nueve cultivos de la muestra de FBS y
de ER Suero Fetal Bovino USP para cada lnea celular usando un contador de clulas o hemacitmetro apropiado.
[NOTAS-Es posible que tenga que cambiarse el programa de recuento para lneas celulares de crecimiento rpido o clu-
194 (90) Suero Fetal Bovino / Pruebas Biolgicas USP 39

las grandes que confluyan antes del da 7 y/o para lneas celulares de lento crecimiento que requieran estar en cultivo 8-
1O das antes de alcanzar una meseta. Algunas lneas celulares adherentes nunca lograran la confluencia.]

Curva de Promocin de Crecimiento

Las mediciones de las velocidades de proliferacin celular a menudo se usan para determinar la respuesta de las clulas a
estmulos exgenos. La evaluacin cuantitativa de las condiciones de crecimiento celular es un factor importante para monito-
rear la constancia de las condiciones de cultivo. El intervalo de concentracin celular ptimo para subcultivos, el inculo pti-
mo y el tiempo de duplicacin son parmetros que se pueden cuantificar y para los que se pueden establecer tendencias. La
informacin acerca de la cintica del crecimiento de un cultivo es crtica para el diseo de experimentos celulares. Los cultivos
varan significativamente en sus propiedades de crecimiento en la fase de latencia, la fase de crecimiento exponencial o logart-
mica y la fase estacionaria. Documentar las caractersticas de crecimiento del cultivo durante las tres etapas de crecimiento
para determinar el tiempo de duplicacin de la poblacin y el tiempo del ciclo celular. Las clulas que han entrado en la fase
estacionaria pueden demostrar un potencial de crecimiento reducido y cambios en la morfologa. Las clulas se pueden volver
polarizadas y pueden segregar ms matriz extracelular, lo que las vuelve difciles de retirar del sustrato. Al final de la fase de
crecimiento exponencial las clulas presentan su mayor rendimiento y su ms alta reproductibilidad.
Reactivos
- Medios de crecimiento sin FBS
- Muestras de prueba de FBS
- Medio de crecimiento + 10% de FBS
- Solucin de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en Solucin Salina Balanceada de Hank (HBSS)
Anlisis: Una vez que las clulas hayan alcanzado el final de la fase logartmica, subcultivar las clulas para la prueba. Se-
guir el procedimiento descrito en Siembra de Clulas y preparar mltiples cultivos para el ER Suero Fetal Bovino USP y analizar
el FBS para diferentes lneas celulares a tres densidades de siembra para las que al menos una curva de crecimiento presenta
una fase de latencia, una fase logartmica y una fase estacionaria, y para la cual la fase logartmica es lineal en tres o ms pun-
tos de tiempo.
Los recuentos de clulas viables se determinan en los das O, 1, 2, 3, 4 y 7.
Clculo y Anlisis de Datos: Calcular el recuento promedio de clulas viables [clulas/cm 2 (adherentes) o clulas/mL (en
suspensin)] y la viabilidad media porcentual para cada punto. Graficar los datos en una grfica de escala semilogartmica con
el recuento de clulas viables sobre la escala logartmica en el eje y y los das (u horas) en cultivo sobre una escala aritmtica en
el eje x. Estimar el tiempo de duplicacin usando una curva de crecimiento que sea lineal sobre tres o ms puntos.
Criterios de aceptacin: El valor R2 de la curva debe ser igual o mayor que 0,98 a fin de respaldar el clculo de un tiempo
de duplicacin vlido. El tiempo de duplicacin correspondiente a la muestra de prueba debe ser no menos de 90% del tiem-
po de duplicacin correspondiente a ER Suero Fetal Bovino USP.

Ensayo Clonal

Este ensayo est diseado para evaluar el crecimiento ptimo de las lneas celulares adherentes. La eficiencia del plaqueo o
formacin de colonias a baja densidad celular es un mtodo preferido para analizar la capacidad de proliferacin y la supervi-
vencia de clulas individuales en condiciones ptimas de crecimiento. Esta es una prueba muy sensible y a menudo se usa para
evaluar la calidad de los lotes de suero. Esta tcnica revela diferencias en la velocidad de crecimiento dentro de la poblacin
celular y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tamao de colonias) y la supervivencia de las
clulas (nmero de colonias). Debido a la heterogeneidad de la poblacin celular de algunos cultivos celulares, cabe recordar
que las clulas crecen de manera diferente como colonias aisladas a bajas densidades. Por consiguiente, pocas clulas sobrevi-
ven incluso en condiciones ideales debido a la prdida de toda interaccin celular. La clonacin es un ensayo de supervivencia
que se usa tambin para optimizar las condiciones de crecimiento (seleccin de medio y suero). Si es posible confirmar que
una colonia individual surgi de una sola clula, entonces se puede determinar la eficiencia de la clonacin.
Reactivos
- Medio de crecimiento + 10% de FBS (suero de prueba)-Medio esencial mnimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en in-
gls) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustado para que contenga 1,5 g/L de carbonato de sodio, aminocidos no
esenciales O, l mM y piruvato de sodio conteniendo 100 U/mL de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina ms 10% de
FBS.
- Solucin de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en HBSS.
- Solucin Salina Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio.
- Solucin de Carbol Fucsina-Azul de Metileno-Mezclar 20 g de carbol fucsina en 2 L de metanol y mezclar durante 1O
minutos (carbol fucsina al 1%). Mezclar 50 g de azul de metileno en 5 L de metanol y mezclar durante 1O minutos (azul
de metileno al 1%). Preparar una solucin de trabajo de Carbol Fuscina-Azul de Metileno mezclando azul de metileno al
1%, metanol y carbol fucsina al 1% en una proporcin de 3:2:1. Mezclar durante 20 minutos y filtrar a travs de cuatro
pliegues de gasa (cheesecloth) en un embudo. Preparar alcuotas y almacenar en frascos de vidrio marrn a una tempera-
tura de 15 a 25.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (91) Valoracin de Pantotenato de Calcio 195

Muestra: Se usan mltiples lotes de FBS para este ensayo. Por cada lote de suero a analizar, agregar 20 ml de FBS a 180
ml de EMEM y usar la misma muestra para toda la prueba. Esterilizar usando filtros de baja unin a protenas de 0,22 m.
Almacenar el medio de crecimiento a 4 hasta el momento de su uso.
Preparacin de las clulas: Esta prueba es nicamente para cultivos adherentes y se realiza con las lneas celulares adhe-
rentes descritas en Lneas Celulares (HFL 1 y Mv 1 Lu). Una semana antes de analizar el suero, expandir las lneas celulares segn
se indica en Siembra de Clulas, cambiar el medio cada 2-3 das, y subcultivar las clulas cuando presenten una confluencia
aproximada de 90%. Determinar el recuento y la viabilidad celular (la viabilidad debe ser
>90%) antes de realizar el ensayo. Recolectar las clulas segn se indica en Recoleccin de Clulas, lavar dos veces, y resuspen-
der las clulas en EMEM basal.
Anlisis: El procedimiento implica el plaqueo de una suspensin unicelular en densidades bajas (2-50 clulas/cm 2 ) a partir
de la cual se formarn colonias discretas. Al final del ensayo, se debe fijar, teir, y contar el nmero de colonias segn se indica
a continuacin.
1. Para cada lnea celular, etiquetar 1O placas de cultivo de tejidos de 60 mm x 15 mm por cada lote de suero a analizar.
Etiquetar el costado de la mitad inferior de cada plato, incluyendo los controles.
2. Transferir 5 ml de medio que contenga 10% del suero de prueba correspondiente (1 O rplicas). Agregar 400 clulas por
placa de cultivo (se busca una concentracin celular de aproximadamente 800 clulas/ml).
3. Incubar durante 10-14 das a 37 en una incubadora humidificada, saturada con C0 2 al 5%.
4. Retirar el sobrenadante y agregar suficiente Solucin de Carbol Fucsina-Azul de Metileno para cubrir cada una de las pla-
cas de cultivo durante 1 O minutos.
5. Retirar la solucin colorante; enjuagar las placas de cultivo con varios enjuagues de agua destilada; invertir los platos en
toallas de papel; y dejar que se sequen.
6. Contar y registrar (1) el nmero de colonias y (2) la superficie total de colonias teidas (mm 2). Calcular las medias y des-
viaciones estndar.
Criterios de aceptacin: La eficiencia de plaqueo porcentual se expresa contando el nmero de colonias en un rea defi-
nida, dividido por el nmero de clulas sembradas y multiplicado por 1 OO. Comparar los resultados entre los lotes de FBS y
seleccionar un lote de suero que sea apropiado para varios tipos de clulas y ptimo para una aplicacin de cultivo celular
especfica.

(91) VALORACIN DE PANTOTENATO DE CALCIO

Estndares de Referencia USP (11 )-ER Pantotenato de Calcio USP.

Solucin Madre del Estndar de Pantotenato de Calcio-En un matraz volumtrico de 1 000 ml, disolver, en aproxima-
damente 500 ml de agua, 50 mg de ER Pantotenato de Calcio USP, previamente secado y almacenado en un lugar oscuro
sobre pentxido de fsforo, y pesado con exactitud evitando la absorcin de humedad durante la pesada. Agregar 1 O ml de
cido actico 0,2 N y 100 ml de solucin de acetato de sodio (1 en 60) y diluir a volumen con agua. Cada ml contiene 50 g
de ER Pantotenato de Calcio USP. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Preparacin Estndar-Diluir, el mismo da de la valoracin, un volumen medido de Solucin Madre del Estndar de Panto-
tenato de Calcio con una cantidad de agua suficiente para obtener entre 0,01 g y 0,04 g de pantotenato de calcio por ml,
cuya concentracin exacta sea tal que las respuestas obtenidas segn se indica en el Procedimiento, utilizando 2,0 y 4,0 ml de
la Preparacin Estndar, se encuentren en la parte lineal de la curva de respuesta en funcin del logaritmo de la concentracin.
Preparacin de Valoracin-Proceder segn se indica en la monografa individual y preparar una solucin que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentracin de pantotenato de calcio en la Preparacin Estndar.
Solucin Madre de Medio Basal-

Solucin de Hidrolizado cido de Casena 25 ml

Solucin de Cistina-Triptfano 25 ml
Solucin de Polisorbato 80 0,25 ml
Dextrosa, Anhidra 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro 5g
Solucin de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solucin de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina 5 ml
Solucin de cido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina 5 ml
Solucin Salina A 5 ml
Solucin Salina B 5 ml

Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas y ajustar con hidrxido de sodio
1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar.
196 (91 >Valoracin de Pantotenato de Calcio / Pruebas Biolgicas USP 39

Solucin de Hidrolizado cido de Casena-Mezclar 100 g de casena sin vitaminas con 500 ml de cido clorhdrico 6 N
y someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el cido clorhdrico de la mezcla mediante destilacin bajo presin
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en agua, ajustar la solucin con hidrxido de sodio
1 N a un pH de 3,5 O, l y agregar agua para obtener 1000 ml. Agregar 20 g de carbn activado, revolver durante 1 hora y
filtrar. Repetir el tratamiento con carbn activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a
1O. Filtrar la solucin si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solucin de Cistina-Triptfano-Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptfano (o 2,0 g de D,L-triptfano) en un
volumen de agua entre 700 y 800 ml, calentar hasta entre 70 y 80 y agregar, gota a gota y agitando, cido clorhdrico
diluido (1 en 2), hasta que los slidos se disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000 ml. Almacenar bajo tolueno en
un refrigerador a una temperatura no inferior a 1O.
Solucin de Adenina-Guanina-Uracilo-Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200
mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1O ml de cido clorhdrico 4 N, enfriar y agregar agua para obtener 200 ml. Almacenar
bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de Polisorbato 80-Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml.
Solucin de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina-Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en cido
actico 0,02 N para obtener una solucin que contenga 20 g de riboflavina, 1O g de clorhidrato de tiamina y 0,04 g de
biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de cido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina-Preparar una solucin en alcohol al 25 por
ciento neutralizado para obtener las siguientes concentraciones: 1O g de cido paraaminobenzoico, 50 g de niacina y 40 g
de clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solucin Salina A-Disolver 25 g de fosfato monobsico de potasio y 25 g de fosfato dibsico de potasio en agua para ob-
tener 500 ml. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Solucin Salina B-Disolver en agua 1O g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5
g de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Cultivo Madre de Lactobacillus plantarum-Disolver 2,0 g de extracto de levadura hidrosoluble en 100 ml de agua, agre-
gar 500 mg de dextrosa anhidra, 500 mg de acetato de sodio anhidro y 1,5 g de agar y calentar agitando en un bao de
vapor hasta que el agar se disuelva. Verter porciones de aproximadamente 1O ml de la solucin caliente en tubos de ensayo,
tapar o cubrir adecuadamente, esterilizar a 121 y dejar que se enfren en posicin vertical. Preparar cultivos en cua en tres o
ms de los tubos, usando un cultivo puro de Lactobacillus plantarum*, incubar durante 16 a 24 horas a una temperatura selec-
cionada entre 30 y 37 pero mantenerla constante con una aproximacin de 0,5 y luego almacenar en un refrigerador.
Preparar un cultivo madre en cua nuevo una vez por semana y no usar para inoculacin si el cultivo tiene ms de 1 semana.
Medio de Cultivo-Preparar una serie de tubos de ensayo con 5,0 ml de Solucin Madre de Medio Basal y agregar 5,0 ml
de agua con 0,2 g de pantotenato de calcio a cada tubo. Tapar los tubos con algodn, esterilizar en un autoclave a 121 y
enfriar.
lnculo-Transferir clulas del cultivo madre de Lactobacillus plantarum a un tubo estril que contenga 1O ml de medio de
cultivo. Incubar este cultivo durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30 y 37 pero mantenerla constante
con una aproximacin de 0,5. La suspensin de clulas as obtenida es el inculo.
Procedimiento-Agregar a tubos de ensayo similares, por duplicado, 1,0 ml y/o 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml,
respectivamente, de la Preparacin Estndar. A cada tubo y a 4 tubos similares sin Preparacin Estndar agregar 5,0 ml de
Solucin Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 1O ml.
Agregar, por duplicado, a tubos de ensayo similares los volmenes de Preparacin de Valoracin correspondientes a tres o
ms de los niveles especificados anteriormente para la Preparacin Estndar, incluidos los niveles de 2,0 ml, 3,0 ml y 4,0 ml.
Agregar a cada tubo 5,0 ml de Solucin Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 1O ml. Colocar un conjunto
completo de tubos de Estndar y Muestra juntos en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda gradilla o en otra
seccin de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
Cubrir los tubos de ambas series para prevenir la contaminacin y colocar en un autoclave a 121 durante 5 minutos. En-
friar, agregar 1 gota de inculo a cada uno de los tubos, excepto a dos de los cuatro tubos que no contengan Preparacin
Estndar (para que sirvan como blancos no inoculados) y mezclar. Incubar los tubos a una temperatura entre 30 y 37 mante-
nida con variaciones permitidas de 0,5 hasta que, una vez incubados durante un perodo entre 16 y 24 horas, no haya habi-
do un aumento sustancial de la turbidez en los tubos que contienen el nivel ms alto de estndar durante un perodo de 2
horas.
Determinar la transmitancia de los tubos de la siguiente manera: Mezclar el contenido de cada tubo y transferir a un reci-
piente apto para la lectura ptica si fuera necesario. Colocar el recipiente en un espectrofotmetro ajustado a una longitud de
onda especfica entre 540 nm y 660 nm y tomar la lectura de la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este
estado estacionario se observa unos pocos segundos despus de agitar cuando la lectura del galvanmetro permanece cons-
tante durante 30 segundos o ms. Emplear aproximadamente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Con la transmitan-
cia fija en 1,00 para el blanco inoculado, leer la transmitancia para cada uno de los tubos restantes. Si hay evidencia de conta-
minacin con un microorganismo extrao, descartar el resultado de la valoracin.

* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) N 8014 es apropiada. Esta cepa se conoca anteriormente como Lactobaciflus arabinosus 17-5.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (92) Factores de Crecimiento 197

Clculos-Preparar una curva estndar de concentracin-respuesta del siguiente modo. Para cada nivel del estndar, calcu-
lar la respuesta a partir de la suma de los valores duplicados de transmitancia como la diferencia y= 2,00 - I (de transmitan-
cia). Graficar la respuesta en la ordenada de un papel cuadriculado contra el logaritmo del volumen de Preparacin Estndar en
cada tubo, en mL, en la abscisa, usando para la ordenada una escala aritmtica o logartmica (eligiendo entre estas dos la que
ms se aproxime a una recta). Trazar la lnea recta o la curva continua que mejor se ajuste los puntos graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparacin de Valoracin. Leer, a partir de la
curva estndar, el logaritmo del volumen de la Preparacin Estndar correspondiente a cada uno de los valores de y que estn
dentro del intervalo entre los puntos mximos y mnimos graficados para el estndar. Restar de cada logaritmo as obtenido el
logaritmo del volumen, en mL, de la Preparacin de Valoracin para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificacin. Pro-
x
mediar los valores de x para cada uno de tres o ms niveles de dosificacin para obtener = M', el logaritmo de la potencia
relativa de la Preparacin de Valoracin. Determinar la cantidad, en mg, de ER Pantotenato de Calcio USP correspondiente al
pantotenato de calcio en la porcin del material tomada para el ensayo como antilog:

M = antilog (M' + log R)

en donde Res el nmero de mg de pantotenato de calcio que se supuso que estaban presentes por mg (o cpsula o tableta)
del material tomado para valoracin.
Repeticin-Repetir toda la determinacin al menos una vez, usando Preparaciones de Valoracin preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08, su promedio, M, es el logaritmo de la poten-
cia del material de prueba analizado (ver Intervalo de Confianza y Lmites de Potencia (111 )). Si las dos determinaciones difieren
en ms de 0,08, realizar una o ms determinaciones adicionales. Del promedio de dos o ms valores de M que no difieren en
ms de O, 15, calcular la potencia media de la preparacin objeto de la valoracin.

(92) FACTORES DE CRECIMIENTO Y CITOKINAS USADOS EN LA

FABRICACIN DE PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR

INTRODUCCIN
La calificacin de reactivos, de materiales de origen y el control de los procesos de fabricacin son elementos claves que asegu-
ran la calidad y seguridad de las terapias celulares. Los factores de crecimiento y las citokinas son importantes para el mante-
nimiento, crecimiento, seleccin y purificacin de cultivos de productos de terapia celular. Este captulo describe las pruebas,
procedimientos y criterios de aceptacin aceptados para factores de crecimiento y citokinas que pueden estar implicados en
la fabricacin de productos de terapia celular.
INTERLEUKINA RECOMBINANTE HUMANA 4 (rhll-4, por sus siglas en ingls)
MHKCDITLQE llKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT
TEKETFCRAA TVLRQFYSHH EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL
IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC PVKEANQSTL ENFLERLKTI
MREKYSKCSS

15096 Da

La rhlL-4 es un polipptido de cadena simple de 130 residuos de aminocido expresados en Escherichia coli. Se produce como
un polvo liofilizado y contiene no menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg de protena total. Las impurezas de ADN de
la clula anfitriona especficas del proceso en IL-4 con lmites de menos de 1 ng/mg se determinan segn se indica en Tcni-
cas Basadas en cidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de cidos Nucleicos (Anlisis de AON Residual) (1130). La IL-4
que se usa como material auxiliar durante la fabricacin no requiere licencia de fabricacin ni aprobacin comercial. A conti-
nuacin se presentan los atributos de calidad tpicos de la IL-4.

IDENTIFICACIN

Cambio en la red~cln:
A. El anlisis de la secuencia amino-terminal de al menos ocho aminocidos se realiza con un secuenciador automtico.
(AFlrnay-2016 Los feniltiohidanton-aminocidos liberados en etapas se identifican mediante cromatografa lquida de alta re-
solucin en fase reversa en lnea, basndose en sus tiempos de elucin.
B. Usar el mtodo de electroforesis seguido del anlisis por Western blot para visualizar la protena IL-4. El mtodo es electro-
foresis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), descrito en la prueba de Pureza.
Solucin salina amortiguada con fosfatos; Solucin amortiguadora de Laemmli, reductora; y Solucin amortiguadora
de Laemmli, no reductora: Proceder segn se indica en la prueba de Pureza en la Valoracin.
198 (92) Factores de Crecimiento/ Pruebas Biolgicas USP 39

Solucin madre del estndar: 50 g/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP reconstituida en Solucin salina amortiguada
con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Solucin estndar: 20 g/mL de IL-4, a partir de Solucin madre del estndar, en Solucin salina amortiguada con fosfatos
Solucin estndar, reductora: Combinar 20 L de Solucin estndar y 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli, reducto-
ra.
Solucin estndar, no reductora: Combinar 20 L de Solucin estndar y 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin madre de la muestra: 50 g/mL de IL-4 reconstituida en Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No
agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Solucin muestra: 20 g/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la muestra, en Solucin salina amortiguada con fosfatos
Solucin muestra, reductora: Combinar 20 L de Solucin muestra y 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli, reducto-
ra.
Solucin muestra, no reductora: Combinar 20 L de Solucin muestra y 5 L de Solucin amortiguadora de muestra de
Laemmli, no reductora.
Anlisis
Muestras: Solucin estndar, reductora; Solucin estndar, no reductora; Solucin muestra, reductora; y Solucin muestra, no
reductora
Western blot: Despus de la electroforesis, las protenas se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno
(PVDF) usando procedimientos estndares. Incubar la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con Solucin sali-
na amortiguada con fosfatos que contenga O, 1% de polisorbato 20 y 5% de leche en polvo descremada. Posteriormente, la
membrana se incuba con un anticuerpo anti-IL-4 1 (diluido apropiadamente en Solucin salina amortiguada con fosfatos), y
luego con un anticuerpo secundario, a temperatura ambiente y agitacin suave, durante 1 hora para cada uno de los anti-
cuerpos. La banda de la protena IL-4 se identifica desarrollando la membrana usando un sistema de deteccin adecuado. 2
Criterios de aceptacin: El Western blot desarrollado debe proporcionar una seal positiva equivalente al ER rlnterleukina
4 Humana USP.

VALORACIN
PUREZA: [NOTA-La pureza se determina sobre la materia prima.] Se lleva a cabo una SDS-PAGE segn se indica en Artculos
Obtenidos por Biotecnologa-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) en condiciones reductoras y no reductoras.
Marcador de peso molecular: Usar un marcador de peso molecular adecuado que contenga bandas de protenas entre
10 y 200 kDa.
Solucin salina amortiguada con fosfatos: Cloruro de potasio 2,67 mM, fosfato de potasio (KH 2 P0 4 ) 1,47 mM, cloruro
de sodio 137,93 mM y fosfato dibsico de sodio 8,06 mM en agua. Ajustar a un pH de 7,0-7,3.
Solucin amortiguadora de Laemmli, no reductora: TRIS-HCI 100 mM, pH 6,8, 50% de glicerol, 0,25% de indicador de
azul de bromofenol y 10% de lauril sulfato de sodio en agua
Solucin amortiguadora de Laemmli, reductora: Agregar 2,5 L mercaptoetanol a 50 L de Solucin amortiguadora de
Laemmli, no reductora.
Solucin madre de la muestra: 400 g/mL de IL-4 a granel en Solucin salina amortiguada con fosfatos
Solucin muestra 1: Combinar 20 L de Solucin madre de la muestra y 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin muestra 2: Combinar 20 L de Solucin madre de la muestra y 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli, reduc-
tora.
Solucin madre de control A: 4 g/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la muestra en Solucin salina amortiguada con
fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control A se corren por triplicado tanto en condiciones reductoras como en no reducto-
ras.]
Solucin 1 de control A: Combinar 20 L de Solucin madre de control A y 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin 2 de control A: Combinar 20 L de Solucin madre de control A y 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli,
reductora.
Solucin madre de control B: 12 g/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la muestra en Solucin salina amortiguada
con fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control B se corren por duplicado tanto en condiciones reductoras como en no reduc-
toras.]
Solucin 1 de control B: Combinar 20 L de Solucin madre de control By 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin 2 de control B: Combinar 20 L de Solucin madre de control By 5 L de Solucin amortiguadora de Laemmli,
reductora.
Condiciones electroforticas
(Ver Artculos Obtenidos por Biotecnologa-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056).)
Modo: Gel para PAGE discontinuo

1 Un anticuerpo anti-IL-4 adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Dianova lnc.).
2 Un sistema de deteccin adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Pierce/Perbio Science).
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (92) Factores de Crecimiento 199

Gel concentrador: Acrilamida al 4%

Gel de resolucin: Acrilamida al 12%
Condiciones de corrida: 1 O minutos a 100 V; luego 30 minutos a 200 V
Deteccin de protenas: Tincin con plata
Anlisis
Muestras: Solucin muestra 1, Solucin muestra 2, Solucin 1 de control A, Solucin 2 de control A, Solucin 1 de control By
Solucin 2 de control B
Incubar 25 L de Solucin muestra y de Solucin control en condiciones no reductoras durante 5 minutos a 60 y cargar en
el gel. Incubar 20 L de Solucin muestra y de Solucin control en condiciones reductoras durante 5 minutos a 60, y
cargar en el gel. Despus de la tincin con plata y de barrer todo el gel, determinar la intensidad de todas las bandas de
protena detectables por densitometra y calcular el porcentaje de cada banda de protena detectable en la Solucin
muestra dos veces comparando la intensidad de los pixeles de cada banda contaminante con el valor promedio de las
Soluciones de Control A y B, respectivamente, por las frmulas:
Resultado= (A100) x 1/(A 1); y
Resultado = (A100) x 3/(A3)
A100 = intensidad de una banda contaminante de la Solucin muestra
A1 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solucin de control A
A3 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solucin de control B
El anlisis de las soluciones de control de IL-4 debe producir una banda detectable con un peso molecular aparente de
aproximadamente 15 kDa. Si los valores calculados mediante la Solucin de control A son diferentes de los que se obtie-
nen por comparacin con la Solucin de control B, se debe tomar el valor correspondiente a la cantidad ms alta de im-
pureza. Si la intensidad de una de las bandas contaminantes es menor que el valor de la Solucin de control A (correspon-
diente a 1%), el valor de esta contaminacin se ajusta a 1%. La pureza de la solucin muestra se calcula de la siguiente
manera:
Resultado = 100 - Cn
C = porcentaje de cada contaminacin provista en nmeros enteros redondeados
n =nmero de contaminantes de IL-4 de la Solucin muestra
Criterios de aceptacin: La pureza de IL-4 es no menos de 97%, segn se determina mediante SDS-PAGE.

CONTENIDO DE PROTENAS: [NOTA-El contenido de protenas se determina basndose en el producto envasado.]

Solucin salina amortiguada con fosfatos: Proceder segn se indica en la prueba de Pureza.
Solucin muestra: 50 g/mL de IL-4 en Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla;
mezclar suavemente por rotacin.]
Blanco: Solucin salina amortiguada con fosfatos
Condiciones Pc1nP1tronmu>trir::.c
~erllJl!lfllll~ll'~il~lft!l[tllEm~a;i~llllllR~)
Modo: UV
Longitud de paso: 1 cm
Longitud de onda analtica: 280 nm
Anlisis
Muestras: Solucin muestra y Blanco
Calcular la concentracin de protenas:
C = A280 /0,63
C =concentracin de IL-4 de la Solucin muestra (mg/mL)
A280 = absorbancia a 280 nm
PRUEBAS ESPECFICAS
IDENTIDAD BIOLGICA: [NOTA-La medicin de la actividad biolgica se determina basndose en el producto envasado.]
Medio RPMI 1640 con L-glutamina: Preparar una mezcla de los ingredientes en las cantidades que se presentan en la si-
guiente tabla en suficiente agua para obtener 1 L de medio y esterilizar mediante filtracin:
Material Cantidad
Nitrato de calcio (Ca(N0 3)4Hp) 100 mg
Sulfato de magnesio (MgS04 7H 2 0) 100 mg
Cloruro de potasio 400 mg
200 (92) Factores de Crecimiento / Pruebas Biolgicas USP 39

Material Cantidad
Cloruro de sodio 6000 mg
Fosfato dibsico de sodio anhidro 800 mg
Bicarbonato de sodio 2000 mg
Glicina 10 mg
L-Arginina 200 mg
L-Asparagina 50 mg
cido L-asprtico 20 mg
Diclorhidrato de L-cistina 20 mg
cido L-glutmico 20 mg
L-Glutamina 300 mg
L-Histidina 15 mg
L-Hidroxiprolina 20 mg
L-lsoleucina 50 mg
L-Leucina 50 mg
Clorhidrato de L-lisina 40 mg
L-Metionina 15 mg
L-Fenilalanina 15 mg
L-Prolina 20 mg
L-Serina 30 mg
L-Treonina 20 mg
L-Triptfano 5 mg
Sal disdica de L-tirosina dihidrato 20 mg
L-Valina 20 mg
Biotina 0,2 mg
Cloruro de colina 3 mg
D-Pantotenato de calcio 0,25 mg
cido flico 1 mg
-lnositol 35 mg
Niacinamida 1 mg
cido paro-aminobenzoico 1 mg
Clorhidrato de piridoxina 1 mg
Riboflavina 0,2 mg
Clorhidrato de tiamina 1 mg
Vitamina B12 0,005 mg
o-Glucosa (dextrosa) 2000 mg
Glutationa (reducida) 1 mg
Rojo de fenal 5 mg

Medio de crecimiento: Usando procedimientos aspticos, preparar el siguiente medio de cultivo de tejidos:

RPMl-1640 con L-glutamina 500 ml

Piruvato de sodio 100 mM 5 ml
Suero fetal bovino 50 ml
rFEC-GM humano 3 x 1 04 Unidades Internacionales
El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrfagos (FEC-GM) se agrega de manera extempornea.

Esterilizar mediante filtracin y almacenar a una temperatura entre 2 y 8. Usar dentro del periodo de 1 mes. Agregar el
FEC-GM inmediatamente antes de su uso.
Medio de valoracin: Usar Medio de crecimiento que no contenga FEC-GM.
Solucin salina amortiguada con fosfatos: Proceder segn se indica en la prueba de Pureza en la Valoracin.
Solucin de resazurina : 11 mg de resazurina en 100 ml de Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-Esterilizar
mediante filtracin y almacenar la solucin protegida de la luz a 4. La Solucin de resazurina es estable durante al menos 6
meses si se trata en condiciones estriles.]
[NOTA-Para todas las Soluciones estndar y Soluciones muestra, la concentracin de IL-4 se determina mediante fotometra
a 280 nm usando un coeficiente de extincin(;) de 0,63 mg- 1cm- 1 .]
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (111) Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 201

Solucin madre del estndar: 50 g/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP en Solucin salina amortiguada con fosfatos.
[NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Soluciones estndar: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; 0, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solucin madre del estn-
dar en Medio de valoracin
Solucin madre de la muestra: 50 g/mL de IL-4 en Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras
se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Soluciones muestra: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; 0, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la mues-
tra en Medio de valoracin
Solucin control: Usar el Medio de valoracin.
Preparacin del cultivo celular: Preparar cultivos celulares de la lnea celular TF-1 dependiente del factor humano (ATCC
N CRL-2003), siguiendo el protocolo descrito en la hoja de informacin de ATCC. Realizar transferencias de los cultivos
cada 2-3 das, usando subcultivos 1 :3 de las clulas durante un mximo de 1 mes. La densidad de siembra debe ser de 0,5
x 106 clulas/ml y la densidad mxima debe ser de 3 x 106 clulas/ml. La viabilidad de las clulas debe ser >90%. El nme-
ro mximo de pasajes es 24 y el tiempo de cultivo mximo a partir de la descongelacin es 28 das. Despus de 28 das,
iniciar un nuevo cultivo. Las clulas se propagan usando Medio de cultivo a 37, suplementado con aire y dixido de carbo-
no al 5%.
Anlisis
Muestras: Soluciones estndar, Soluciones muestra y Solucin control
La actividad de la Solucin muestra se determina por duplicado. Lavar las clulas tres veces en Solucin salina amortiguada
con fosfatos. Colocar en una placa 2 x 104 clulas TF-1 resuspendidas en 100 L de Medio de valoracin por pocillo en
microplacas de fondo plano de 96 pocillos. Incubar durante 72 horas a 37 y en una atmsfera de C0 2 al 5% en un
incubador humidificado en presencia o ausencia de diversas concentraciones de Solucin estndar, Solucin muestra o
Solucin control agregando 100 L de la solucin correspondiente a cada pocillo. Agregar 30 L de Solucin de resazurina
a cada pocillo e incubar durante 24 horas ms. Determinar la intensidad de la fluorescencia por pocillo leyendo la placa
con un lector de microplaca usando 544 nm (excitacin) y 590 nm (emisin). Convertir la intensidad de fluorescencia
en cada pocillo a un porcentaje de intensidad de fluorescencia mxima. Para la Solucin muestra y la Solucin estndar,
graficar el porcentaje de la intensidad de fluorescencia en funcin de la concentracin de la solucin pertinente. Usando
el mtodo de cuadrados mnimos del anlisis de regresin, calcular el ED50 en ng/mL de la Solucin muestra y la Solucin
estndar. El coeficiente de determinacin para la curva de regresin debe ser?: O, 98. Calcular la potencia en Unidades
USP de lnterleukina 4/mg:
Resultado = A x E5/Eu

A =actividad de ER rlnterleukina 4 Humana USP (unidades USP/mg)

E5 = ED 50 determinado de la Solucin estndar (ng/mL)
Eu = ED 50 determinado de la Solucin muestra (ng/mL)
Criteriosde aceptacin: No menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg
PRUEBAS DE ESTERILIDAD (71 ): Cumple con los requisitos
PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): Contiene no ms de 50 Unidades USP de Endotoxina/mg

REQUISITOS ADICIONALES
ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Conservar en envases impermeables y almacenar a -80.
ETIQUETADO: El material se origina de ADN recombinante.
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP
ER rlnterleukina 4 Humana USP

(111) DISEO Y ANLISIS DE VALORACIONES BIOLGICAS

INTRODUCCIN
La potencia de varios artculos Farmacopeicos debe ser determinada mediante valoraciones biolgicas. El objetivo de este
captulo es presentar un resumen conciso de algunos procedimientos biomtricos esenciales para las valoraciones biolgicas
incluidas en los captulos o monografas de los compendios USP-NF, en particular para la identificacin de valores aberrantes,
la determinacin de los intervalos de confianza para mediciones de potencia relativa y la combinacin de valoraciones inde-
pendientes. Para las valoraciones biolgicas que no forman parte de los compendios USP-NF, pueden ser apropiados otros m-
todos. Se recomienda ver el captulo de informacin general Anlisis de Valoraciones Biolgicas (1034) que puede ser una gua
til, mas no obligatoria.
202 (111) Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas / Pruebas Biolgicas USP 39

RECHAZO DE OBSERVACIONES ABERRANTES

Una respuesta que es dudosa debido a que no cumple con el procedimiento durante el curso de una valoracin es rechaza-
da. Otros valores aberrantes pueden descubrirse slo despus de tabular las respuestas, pero entonces pueden ser relacionadas
con irregularidades en la valoracin que justifiquen su omisin. El rechazo o retencin arbitraria de una respuesta aparente-
mente aberrante puede ser una importante fuente de sesgo. Por lo general, el rechazo de observaciones basado nicamente
en la magnitud relativa, sin investigar la causa, es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia. Si se entendiera
que, ya sea despus investigar la causa o basndose en la experiencia prctica del ensayo, es poco probable que la discrepan-
cia en los valores observados surja de una respuesta esperable del ensayo, entonces la respuesta aberrante o atpica debera ser
analizada contra uno de dos criterios, los cuales asumen que los datos tienen una distribucin aproximadamente normal (la
cual podra ser satisfecha slo despus de una transformacin adecuada de las respuestas originales). Se pueden usar mtodos
alternativos estadsticamente slidos para la deteccin de valores aberrantes. Las condiciones en las que debe llevarse a cabo el
anlisis de valores aberrantes y los criterios que deben usarse, deben estar previamente especificados en los procedimientos del
laboratorio cuando no se especifiquen en la monografa o el captulo.

Criterio 1 (Prueba de Dixon)

El primer criterio se basa en la variacin dentro de un grupo nico de respuestas supuestamente equivalentes, tal como las
obtenidas de un grupo de animales al que se trato con una concentracin habitual de la muestra. A un nivel de confianza de
99%, una observacin vlida ser rechazada en uno de cada 100 ensayos (cuando el valor atpico sospechado pueda presen-
tarse en un solo extremo) o en uno de cada 50 ensayos (cuando el valor atpico pueda presentarse en cualquiera de los dos
extremos), siempre y cuando pocas o ninguna de las respuestas dentro del grupo sean idnticas. Ordenar las respuestas en el
orden de magnitud desde y1 hasta yN, donde N es el nmero de observaciones en el grupo. Calcular el intervalo relativo usan-
do las frmulas de la siguiente Tabla 7.
Tabla 1
El valor aberrante candidato es el ms pe- El valor aberrante candidato es el ms
Tamao de la Muestra (N) queo (y 1} grande (YN)
3-7 G1 = (Y2 - y)l(YN - Y1) G7 = (YN - YN-1)/(yN - Y1)
8-10 G2 = (Y2 - Y1)f(YN-1 - Y1) G2 = (YN - YN-1)/(yN - Y2)
11-13 G3 =(y, - y,)f(YN-1 - Y1) G, = (YN - YN-2)/(yN - Y2)

Si G7, G2 o G3, segn corresponda, exceden el valor crtico de la Tabla 2, para el valor N observado, existe una base estadsti-
ca para identificar la medicin discordante como un valor aberrante y para considerar su eliminacin. Para un valor N mayor
que 13, usar el Criterio 2.
En muestras tomadas de una poblacin normal, a un nivel de confianza de 99%, los intervalos iguales o mayores que los
siguientes valores de G7, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P == 0,01, en donde las mediciones de valores aberrantes
pueden ocurrir slo en un extremo o con una probabilidad de P == 0,02 en donde pueden ocurrir en cualquiera de los dos
extremos.
Tabla 2. Prueba para Mediciones de Valores Aberrantes
N 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7
G1 1 0,988 1 0,889 1 0,780 1 0,698 1 0,637

N 1 8 1 9 1 10 1 - 1 -

G2 1 0,683 1 0,635 1 0,597 1 - 1 -

N 1 11 1 12 1 13 1 - 1 -

G, 1 0,679 1 0,642 1 0,615 1 - 1 -

Criterio 2 (Grubbs, Prueba Estudentizada de Desviacin Extrema)

El segundo criterio se puede usar para detectar la presencia de valores aberrantes en grupos de respuestas supuestamente
equivalentes y tambin se puede usar al examinar el conjunto de residuales a partir de un modelo ajustado (lineal o no lineal)
cuando existe una varianza constante. El modelo final (que produce residuales para la deteccin de valores aberrantes) debe
incluir todas las variables importantes del diseo. (Para mayor informacin sobre las variables del diseo, ver el captulo de
informacin general Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas (1032), que puede ser un recurso til, mas no obligatorio.)
(Se debe tener en cuenta que, para su aplicacin a residuales, la siguiente informacin es una aproximacin. Si el software
estadstico provee residuales estudentizados, dichos valores deben usarse en lugar de los obtenidos con la siguiente ecuacin.)
Para el valor, R, que est ms alejado de la media de la muestra, calcular la desviacin estandarizada Z:
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (111) Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 203

z = (R - R)/S
donde Ry S son la media y la desviacin estndar, respectivamente, del conjunto de valores. Para residuales obtenidos de un
ajuste de cuadrados mnimos, como en el caso de una valoracin por el mtodo de lneas paralelas, R=O y Ses la raz cuadra-
da del cuadrado medio residual del anlisis. Si IZI es mayor que C segn se determina a continuacin, entonces el valor R se
identifica como un valor aberrante estadstico al nivel de 1 %.

donde N es el tamao de la muestra, tes el punto porcentual 1OOp unilateral a partir de la distribucin t con los grados de
libertad df los grados de libertad relacionados con 5:

p==l-...Q.Ql
2N
Se encuentran disponibles mtodos alternativos para valores aberrantes que estn diseados para el anlisis de conjuntos de
datos que pueden contener mltiples valores aberrantes y para la deteccin de valores aberrantes relacionados con el diseo o
modelo de la valoracin biolgica. Para mayor informacin sobre valores aberrantes, ver el captulo de informacin general
Datos Analticos-Interpretacin y Tratamiento (101 O), que puede ser un recurso til, mas no obligatorio.

EL INTERVALO DE CONFIANZA V LOS LMITES DE POTENCIA

El siguiente mtodo (de Fieller) se usa para determinar el intervalo de confianza para una estimacin del logaritmo de poten-
cia relativa a partir de una valoracin por el mtodo de lneas paralelas o valoracin por el mtodo de razn de pendientes. Se
supone que M =a/bes el cociente para el cual se requiere un intervalo de confianza. Para las estimaciones, a y b, se cuenta
con sus respectivos errores estndar, SE0 y SEb, y una covarianza entre estos, denotada Cov. El intervalo de confianza, (M 800 ,
MAita), para el logaritmo de potencia relativa estimado es entonces el siguiente:

donde:
t'SE'
g=--"
b'

y t = td1,012 es el punto porcentual superior a,/2 (o el punto porcentual a bilateral) con los grados de libertad residuales, df,
obtenidos del anlisis estadstico y el nivel de confianza seleccionado, 100*(1-a), (por lo regular 95%). Si g?: 1, significa que el
denominador, b, desde el punto de vista estadstico, no es significativamente distinto de O y el uso del cociente no es prudente
para dichos datos. La longitud, L, de este intervalo de confianza es MAito - M800
Para aquellos casos en los que las estimaciones de a y b no tenga una correlacin estadstica (Cov =O), la frmula del inter-
valo de confianza se simplifica a la siguiente:

Para mayor informacin sobre los intervalos de confianza para potencia, ver el captulo (1034) que puede ser un recurso til,
pero no obligatorio.

COMBINACIN DE VALORACIONES INDEPENDIENTES

Cuando la monografa o el captulo lo permitan, se pueden realizar mltiples valoraciones independientes hasta que los re-
sultados combinados reduzcan el ancho del intervalo de confianza hasta que ste quede comprendido dentro de los lmites
especificados en la monografa o captulo pertinente. Cuando se requieren dos o ms valoraciones independientes y cada una
de ellas conduce a un logaritmo de la potencia M, los valores M se combinan usando uno de los dos mtodos siguientes.
204 (111) Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas / Pruebas Biolgicas USP 39

Mtodo 1

Se define M; como el logaritmo de potencia relativa de la ma valoracin de h resultados de valoracin que se van a combi-
nar. Para combinar los resultados h, la media, la desviacin estndar y el error estndar del valor M; se calculan siguiendo el
procedimento usual :
h
Media M= I.,MJh
; 1

1
/1=-1 f,: (M;
h
Desviacin Estndar S = /) 2

Error Estndar SE = S / .JFi

Entonces, un intervalo de confianza de 100(1 - a)o/o se encuentra como:

M th-1,/2SE
donde th-l,a!l es el punto porcentual superior a/2 (o el punto porcentual a bilateral) de una distribucin t con h - 1 grados de
libertad. El ancho, L, de este intervalo es 2th-l,a/2 SE.

Mtodo 2

Se supone que los resultados de cada una de las h valoraciones han sido analizados para proveer h valores de logaritmo de
potencia con lmites de confianza relacionados. Para cada valoracin, i, se obtiene el intervalo de confianza para el logaritmo
de potencia o el logaritmo de potencia relativa. Posteriormente, se calcula el valor L; restando el imo lmite de confianza infe-
rior del imo lmite de confianza superior. El peso W; para cada valor del logaritmo de la potencia relativa, M;, se calcula segn se
indica a continuacin, donde t; tiene el mismo valor de distribucint que el usado en el clculo de los lmites de confianza en la
ma valoracin y se basa en n; grados de libertad:

4t~
w.=-'-
' e t

Se calculan los productos w;M; para cada valoracin, y la suma de estos se divide por el peso total (w) de todas las valoracio-
nes para obtener la media ponderada del logaritmo de potencia relativa y su error estndar segn se indica a continuacin:
- h
Media, M= L W;M; / w
i=1

Error Estndar Aproximado, SE = 1 I JW (1)

h
donde w = ,Lw;
i=1

A continuacin, calcular un chi cuadrado aproximado:

i=l i=l

Si el valor aproximado de X2 M est bien por debajo del valor de 5% presentado en la Tabla 3, calcular el intervalo de confian-
za usando las ecuaciones de media y error estndar aproximados en (1) anteriores; de otro modo, usar Pesos alternativos segn
se describe a continuacin. Es necesario que los laboratorios especifiquen en sus procedimientos cmo cuantificar los valores
que estn "bien por debajo". En ausencia de dicha especificacin, se sugieren los valores de 20% de la Tabla 3.
Entonces, un intervalo de confianza de 100(1 - a)o/o en la escala logartmica se encuentra como:

M L/2

h-2
d=n.-4x--
, ' h-1
y df = wjj
/ ~w/n;
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (115) Valoracin de Dexpantenol 205

donde tN,a!z es el punto porcentual superior u/2 (o el punto porcentual a bilateral) de una distribucin t con grados de liber-
tad, df. El ancho de este intervalo es L.
Tabla 3. Valores Crticos para la Prueba de Chi Cuadrado Aproximado
Valores Crticos
h 5% 20%
2 3,841 1,642
3 5,991 3,219
4 7,815 4,642
5 9,488 5,989
6 11,070 7,289
7 12,592 8,558
8 14,067 9,803
9 15,507 11,030
10 16,919 12,242

Pesos Alternativos: La variacin observada entre los logaritmos de potencia o de potencias relativas estimados se puede
dividir en dos componentes:
variacin intravaloracin para la valoracin i: V;= 1/w;
componente intervaloracin de variacin:

1 h -2 lh
52
B
= mx{O,-I(M -M) - - v;}
h-1 i=l h i=l
Posteriormente, para cada valoracin se calcula un coeficiente ponderado como:

Entonces, el intervalo de confianza se encuentra como:

MtxSE',
h
donde SE' = 1 / J;/ y w'=L:w;
i=l

y t, el valor de distribucin t, a menudo se aproxima mediante el valor 2.

Para mayor informacin sobre la combinacin de valoraciones, ver el captulo (1034), que puede ser un recurso til, mas no
obligatorio.

APNDICE-BIBLIOGRAFA IMPORTANTE
Bliss, CI. Analysis of the biological assays in USP XV. Drug Standards, 24, 33-67, 1956.
Bohrer A. One-sided and two-sided critica! values far Dixon's outlier test far sample sizes up to n = 30. Economic Quality
Control 23, 5-13, 2008.
Cochran, WG. The combination of estimates from different experiments. Biometrics 1O, 101-129, 1954.
Fieller, EC. Sorne problems in interval estimation. journal of the Royal Statistical Society, B 16, 175-185, 1954.
lglewicz, B and Hoaglin, DC. How to Detect and Handle Outliers. Quality Press, Milwaukee, 1993.

(115) VALORACIN DE DEXPANTENOL

Este procedimiento se utiliza para realizar la valoracin de dexpantenol cuando se presenta como ingrediente de preparacio-
nes multivitamnicas. Se aplica tambin para determinar el componente dextrgiro del pantenol racmico y de otras mezclas
que contengan pantenol dextrgiro.
Pueden usarse medios preparados segn se indica a continuacin o mezclas deshidratadas que proporcionen formulaciones
similares, siempre y cuando, una vez reconstituidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante o del distruidor, posean
propiedades de promocin del crecimiento equivalentes o superiores a las obtenidas con las frmulas incluidas en este captu-
lo.
206 (115) Valoracin de Dexpantenol / Pruebas Biolgicas USP 39

Estndares de Referencia USP (11 )-ER Dexpantenol USP.

Solucin Madre del Estndar de Dexpantenol-Disolver en agua una cantidad pesada con exactitud de ER Dexpantenol
USP, diluir cuantitativamente con agua para obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente 800
g por ml y mezclar. Almacenar en un refrigerador, al resguardo de la luz, y usar dentro de los 30 das de preparada.
Preparacin Estndar-El da de la valoracin, preparar una dilucin de la Solucin Madre del Estndar de Dexpantenol en
agua para obtener una concentracin de 1,2 g de dexpantenol por ml.
Preparacin de Valoracin-Proceder segn se indica en la monografa individual y preparar una solucin que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentracin de dexpantenol en la Preparacin Estndar.
Medio de Pantotenato Modificado-

Solucin de Hidrolizado cido de Casena 25 ml

Solucin de Cistina-Triptfano 25 ml
Solucin de Polisorbato 80 0,25 ml
Dextrosa, Anhidra 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro 5g
Solucin de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solucin de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina 5 ml
Solucin de cido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina 5 ml
Solucin Salina A 5 ml
Solucin Salina B 5 ml
Solucin de Pantotenato de Calcio-Piridoxal 5 ml
Solucin de Polisorbato 40-cido Oleico 5 ml

Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas; ajustar con hidrxido de sodio
1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar.
Medio de Pantotenato Modificado de Doble Concentracin-Preparar segn se indica en Medio de Pantotenato Modifi-
cado, pero hacer que la dilucin final sea de 125 ml en vez de 250 ml. Preparar a diario.
Solucin de Hidrolizado cido de Casena-Mezclar 100 g de casena sin vitaminas con 500 ml de cido clorhdrico 6 N
y someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el cido clorhdrico de la mezcla mediante destilacin bajo presin
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en aproximadamente 500 ml de agua, ajustar la
solucin con hidrxido de sodio 1 N a un pH de 3,5 O, 1 y agregar agua para obtener 1000 ml. Agregar 20 g de carbn
activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbn activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigera-
dor a una temperatura no inferior a 1O. Filtrar la solucin si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solucin de Cistina-Triptfano-Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptfano (o 2,0 g de D,L-triptfano) en un
volumen de agua entre 700 y 800 ml, calentar a 75 5 y agregar, gota a gota y agitando, cido clorhdrico diluido (1 en 2)
hasta que los slidos se disuelvan. Enfriar, agregar agua para obtener 1000 ml y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refri-
gerador a una temperatura no inferior a 1O.
Solucin de Adenina-Guanina-Uracilo-Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200
mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1O ml de cido clorhdrico 4 N, enfriar, agregar agua para obtener 200 ml y mezclar.
Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de Polisorbato 80-Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml y mezclar.
Solucin de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina-Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en cido
actico 0,02 N para obtener una solucin que contenga 20 g de riboflavina, 1O g de clorhidrato de tiamina y 0,04 g de
biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de cido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina-Preparar una solucin con alcohol neutrali-
zado al 25 por ciento para obtener las siguientes concentraciones: 1O g de cido paraaminobenzoico, 50 g de niacina y 40
g clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solucin Salina A-Disolver 25 g de fosfato monobsico de potasio y 25 g de fosfato dibsico de potasio en agua para ob-
tener 500 ml. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Solucin Salina B-Disolver en agua 1O g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5
g de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Solucin de Piridoxal-Pantotenato de Calcio-Disolver 40 mg de clorhidrato de piridoxal y 375 g de pantotenato de
calcio en alcohol al 1O por ciento para obtener 2000 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 das
de preparada.
Solucin de Polisorbato 40-cido Oleico-Disolver 25 g de polisorbato 40 y 0,25 g de cido oleico en alcohol al 20 por
ciento para obtener 500 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 das de preparada.
Cultivo Madre de Pediococcus acidilactici-Disolver con ayuda de calor 6,0 g de peptona, 4,0 g de digerido pancretico
de casena, 3,0 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne, 1,0 g de dextrosa y 15,0 g de agar en aproximadamen-
te 800 ml de agua. Ajustar con hidrxido de sodio O, 1 N o cido clorhdrico O, 1 N a un pH entre 6,5 y 6,6, agregar agua
hasta 1000 ml y mezclar. Agregar porciones de aproximadamente 1O ml de la solucin a tubos de cultivo, tapar y esterilizar a
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (121) Valoracin de Insulina 207

121 durante 15 minutos. Enfriar en pendiente y almacenar en un refrigerador. Preparar un cultivo madre de Pediococcus acidi-
lactici* en un tubo conteniendo una cua de este medio. Incubar a 35 durante 20 a 24 horas y almacenar en un refrigerador.
Mantener el cultivo madre realizando transferencias mensuales en tubos con medio en cua nuevos.
lnculo-lnocular tres porciones de 250 mL de Medio de Pantotenato Modificado de una pendiente de cultivo madre e incu-
bar a 35 durante 20 a 24 horas. Centrifugar la suspensin de las porciones combinadas y lavar las clulas con Medio de Panto-
tenato Modificado. Resuspender las clulas en suficiente Medio modificado de pantotenato de manera que una dilucin 1:50,
cuando se analiza en un tubo de ensayo de 13 mm de dimetro, proporciona una transmisin de luz de 80% a 530 nm. Trans-
ferir porciones de 1,2 mL de esta suspensin madre a ampollas de vidrio, sellar, congelar en nitrgeno lquido y almacenar en
un congelador. El da de la valoracin, dejar que las ampollas alcancen temperatura ambiente, mezclar el contenido y diluir 1
mL del cultivo descongelado con solucin salina estril SR hasta 150 mL. [NOTA-Esta dilucin se puede modificar, cuando sea
necesario, para obtener la respuesta deseada.]
Procedimiento-Preparar por triplicado series de ocho tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los
tubos de una serie: 5,0 mL, 4,5 mL, 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL, 1,0 mL y 0,0 ml. A estos mismos tubos y en ese mismo
orden agregar 0,0 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 3,0 mL, 4,0 mL y 5,0 mL de la Preparacin estndar.
Preparar por duplicado una serie de cinco tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los tubos de una
serie: 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL y 1,0 ml. A estos mismos tubos y en ese mismo orden, agregar 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL,
3,0 mL y 4,0 mL de la Preparacin de Valoracin.
Agregar 5,0 mL de Medio de Pantotenato Modificado de Doble Concentracin a cada tubo y mezclar. Cubrir los tubos con
tapas metlicas y esterilizar en autoclave a 121 durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente en un bao de agua fra e
inocular cada tubo con 0,5 mL del lnculo. Dejar incubando a 37 durante 16 horas. Detener el crecimiento calentando a una
temperatura no inferior a 80, por ejemplo mediante la aplicacin de vapor a presin atmosfrica en un esterilizador adecuado
durante 5 a 1O minutos. Enfriar y determinar concomitantemente el porcentaje de transmitancia de la suspensin, en celdas
de igual paso ptico, en un espectrofotmetro adecuado, a 530 nm.
Clculo-Dibujar una curva de dosis-respuesta en papel para grficos aritmticos trazando la respuesta promedio, en por-
centaje de transmitancia, para cadd conjunto de tubos de la curva estndar en funcin de las concentraciones del estndar. La
curva se traza uniendo cada par adyacente de puntos con una lnea recta. A partir de esta curva estndar, determinar la poten-
cia por interpolacin, en funcin del dexpantenol, de cada tubo que contiene porciones de la Preparacin de Valoracin. Dividir
la potencia de cada tubo por la cantidad de Preparacin de Valoracin agregada para obtener las respuestas individuales. Calcu-
lar la respuesta media realizando el promedio de las respuestas individuales que varan de su media en no ms de un 15%,
utilizando no menos de la mitad del nmero total de tubos. Calcular la potencia de la porcin de material tomada para la
valoracin, en funcin del dexpantenol, multiplicando la respuesta promedio por el factor de dilucin adecuado.

(121) VALORACIN DE INSULINA

INTRODUCCIN
La manifestacin ms importante de la actividad de la insulina, un brusco descenso de la glucosa en sangre, sirvi de base para
valoraciones biolgicas desde sus primeros usos clnicos. El procedimiento, si bien es relativamente complejo, tiene el gran
mrito de reflejar con exactitud el efecto en el paciente diabtico. La aparicin de mtodos fisicoqumicos prcticos pero
sofisticados (por ejemplo la cromatografa lquida) para medir cuantitativamente la potencia de la insulina ha dado lugar a
pruebas farmacopeicas ms precisas y exactas para la insulina y los productos derivados de la insulina. Sin embargo, no se
puede determinar la identidad biolgica de la insulina y de sus productos por estos mtodos. Por esta razn, se incluye en
este captulo una prueba de bioidentidad en conejos y su uso se especifica en las monografas correspondientes.
El Mtodo de Determinacin de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo se usa para determinar la potencia de los Estndares
de Referencia de la Insulina, para la validacin de la estabilidad de nuevas preparaciones de insulina y para determinar las
actividades especficas de los anlogos de la insulina.

VALORACIN
MTODO DE DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE DE CONEJOS-CUANTITATIVO
Diluyente: Preparar una solucin acuosa que contenga de O, 1% a 0,25% (p/v) de cresol o de fenal, de 1,4% a 1,8% (p/v)
de glicerina y suficiente cido clorhdrico para obtener un pH entre 2,5 y 3,5 a menos que se especifique algo diferente en
la monografa individual.
Solucin madre del estndar: Preparar una solucin que contenga 40 Unidades USP de lnsulina/mL a partir de ER Insuli-
na USP de las especies apropiadas en Diluyente y con un pH entre 2,5 y 3,5, a menos que se especifique de otro modo en
la monografa individual. Para la insulina de especies bovina y porcina mezcladas, preparar una solucin que contenga 34,8
Unidades USP de Insulina Bovina/mL y 5,2 Unidades USP de Insulina Porcina/mL en Diluyente con un pH entre 2,5 y 3,5.
Almacenar en un lugar fro, proteger contra la congelacin y usarla dentro de un perodo de 6 meses.

* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) No. 8042 es adecuada.

208 (121) Valoracin de Insulina / Pruebas Biolgicas USP 39

Soluciones estndar: Diluir porciones de la Solucin madre del estndar con Diluyente para obtener dos soluciones, una
que contenga 1,0 Unidad USP de lnsulina/mL (Solucin estndar 7), y otra que contenga 2,0 Unidades USP de lnsulina/mL
(Solucin estndar 2).
Solucin madre de la muestra: Proceder segn se indica en Solucin madre del estndar, excepto que se debe usar una
cantidad adecuada de la preparacin en anlisis en lugar de ER Insulina USP de la especie apropiada. La Solucin madre de
la muestra contiene aproximadamente 40 Unidades USP de lnsulina/mL.
Soluciones muestra: Diluir porciones de la Solucin madre de la muestra con Diluyente para obtener dos diluciones de la
preparacin en anlisis, una de las cuales se puede esperar que contenga 1,0 Unidad USP de lnsulina/mL (Solucin muestra
7), basndose en la potencia supuesta, y la otra que contenga 2,0 Unidades USP de lnsulina/mL (Solucin muestra 2). En el
caso de una inyeccin de insulina neutra, ajustar a un pH entre 2,5 y 3,5 antes de realizar las diluciones.
Dosis de las soluciones a inyectar: Seleccionar la dosis de las diluciones a inyectar, basndose en pruebas o experiencias
anteriores, cuyo volumen generalmente est entre 0,30 mL y 0,50 ml. Para cada animal, el volumen de la Solucin estn-
dar es el mismo que el de la Solucin muestra.
Preparacin de los animales: Seleccionar conejos adecuados y sanos que no pesen menos de 1,8 kg cada uno. Mantener
los conejos en el laboratorio durante no menos de 1 semana antes de utilizarlos en la valoracin y alimentarlos con una
dieta uniforme satisfactoria, con acceso libre al agua en todo momento.
Anlisis: Dividir los conejos en cuatro grupos iguales, preferentemente de no menos de seis conejos cada uno. El da ante-
rior al procedimiento, aproximadamente 20 horas antes de la valoracin, suministrar a cada conejo alimento suficiente pa-
ra que se consuma en 6 horas. Seguir este mismo programa de alimentacin antes de cada da de prueba. Durante la valo-
racin, no suministrar alimentos hasta no haber extrado la ltima muestra de sangre. Manipular los conejos con cuidado
para evitar una excitacin indebida e inyectar subcutneamente las dosis indicadas en el siguiente diseo (ver la Tabla 7), la
segunda inyeccin se debe administrar el da posterior a la primera inyeccin o no ms de 1 semana despus. El tiempo
entre la primera y la segunda inyeccin es el mismo para todos los conejos.
Tabla 1
Grupo Primera Inyeccin Segunda Inyeccin
1 Solucin estndar 2 Solucin muestra 7
2 Solucin estndar 7 Solucin muestra 2
3 Solucin muestra 2 Solucin estndar 7
4 Solucin muestra 7 Solucin estndar 2

Muestras de sangre: A 1 hora 5 minutos y 2 1/2 horas 5 minutos despus de la inyeccin, extraer de cada conejo una
muestra adecuada de sangre de una vena marginal de la oreja. La sangre tambin se puede extraer eficazmente de la arte-
ria auricular central.
Determinacin de dextrosa: Determinar el contenido de dextrosa en las muestras de sangre mediante un procedimiento
adecuado que se adapte a un anlisis automatizado. Se puede utilizar el siguiente procedimiento.
Solucin anticoagulante: Disolver 1 g de edetato sdico y 200 mg de fluoruro de sodio en 1 L de agua y mezclar.
Preparaciones estndar de dextrosa: Transferir concentraciones conocidas de ER Dextrosa USP a recipientes adecuados
y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con Solucin anticoagulante (1 :9) para obtener una serie de Preparacio-
nes estndar de dextrosa que contengan entre 20 mg y 100 mg por 100 mL con concentraciones conocidas similares a las
concentraciones de las muestras de sangre de los conejos.
Preparaciones muestra: Pipetear y transferir a sendos recipientes adecuados 0, 1 mL de cada Muestra de sangre y 0,9 mL
de Solucin anticoagulante.
Anlisis: Someter a dilisis las Preparaciones muestra a travs de una membrana semipermeable durante un tiempo sufi-
ciente de modo que la dextrosa pase a travs de la membrana a una solucin salina SR que contenga oxidasa de glucosa,
peroxidasa de rbano, clorhidrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona SR y N,N-dimetilanilina. Las absorbancias de
las Preparaciones muestra se determinan a 600 nm en un colormetro con registrador. Las absorbancias de las Preparacio-
nes Estndar de Dextrosa se determinan de manera similar al comienzo y al final de cada corrida.
Clculos: Calcular la respuesta de cada conejo a cada inyeccin a partir de la suma de los dos valores de glucemia y restar
su respuesta, sin tomar en cuenta el orden cronolgico en el cual se observaron las respuestas, para obtener las diferencias
individuales, y, segn se indica en la Tabla 2.
Cuando falten datos de uno o ms conejos en una valoracin, no usar las frmulas de intervalo de confianza que se brin-
dan en la presente valoracin, sino usar un procedimiento estadstico. Los datos an pueden analizarse con un anlisis de
varianza apropiado.
Cuando el nmero de conejos, f, usado en la valoracin sea igual en cada grupo, determinar la suma de y para cada grupo
y calcular:

y
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (121) Valoracin de Insulina 209

El logaritmo de la potencia relativa de las diluciones de prueba es M' = 0,301 TufTb. La potencia de la inyeccin en Unidades
USP/mg es igual al antilogaritmo (lag R + M'), donde:

R = Vs/vu
Vs =nmero de Unidades USP/mL de la Solucin estndar
vu = nmero de mg/mL de insulina de la Solucin muestra correspondiente
Determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa con una confianza del 95% usando el Teorema
de Fieller (ver el Apndice y Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas (111 )). Si el intervalo de confianza es mayor de
0,082, que corresponde, a P = 0,95, a lmites de confianza de aproximadamente 10% de la potencia calculada, repetir
la valoracin hasta que los datos combinados de dos o ms valoraciones, redeterminadas segn se describe en Combina-
cin de Valoraciones Independientes en Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas (111 ), cumplan con este lmite aceptable.
Tabla 2
Respuesta Respuesta Desviaciones
Individual Total Estndar
Grupo Diferencias (y) (7) de Diferencias (S)
Solucin estndar 2 - Solucin
1 muestra 1 Y1 T, S
Solucin muestra 2 - Solucin
2 estndar 1 Y2 T2 S2
Solucin muestra 2 - Solucin
3 estndar 1 YJ T3 53
Solucin estndar 2 - Solucin
4 muestra 1 Y1 T4 S4

Apndice:Teorema de Fieller para Determinar el Intervalo de Confianza para un Cociente

Esta versin del Teorema de Fieller es para el caso en el cual el numerador y el denominador no estn correlacionados. La
ecuacin asume que el numerador y el denominador estn normalmente distribuidos y que los grupos de conejos son del
mismo tamao.
Entonces, el intervalo de confianza de 95% para el cociente es:

M' _t_ ~(1- g) S~+ (M')2 s;

(L, U)= _ _T_b_ _ _ _ __
1-g

donde f (grados de libertad en los errores estndar)= 4(k - 1), donde k es la cantidad de conejos en un grupo, tes el per-
centil superior de 97,5 de la distribucin t con f grados de libertad, y

_ t s;2
g-y
b

Si g::: 1, el denominador no es significativamente diferente a O y la frmula no funciona.

sN = 0,301 Jk)s + sg + s; + s:

PRUEBA DE BIOIDENTIDAD
Proceder segn se indica en el Mtodo de Determinacin de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo con las siguientes
modificaciones.
Procedimiento: Dividir los conejos en cuatro grupos iguales de 2 conejos cada uno.
Clculo: Proceder segn se indica para Clculos en Mtodo de Determinacin de Contenido de Glucosa en Sangre de Cone-
jos-Cuantitativo, pero no determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa, M'.
Interpretacin: Si el valor de la potencia obtenido no es menor de 15 Unidades USP/mg, se cumple el requisito de la
Prueba de Bioidentidad. Si el valor de la potencia es menor de 15 Unidades USP/mg, repetir la prueba usando ocho conejos
ms. Si la potencia promedio de los 2 conjuntos de pruebas no es menor de 15 Unidades USP/mg, se cumple el requisito
de la prueba.

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dextrosa USP
ER Insulina Asparta USP
ER Insulina Bovina USP
21 O (121) Valoracin de Insulina/ Pruebas Biolgicas USP 39

ER Insulina Glargina USP

ER Insulina Humana USP
ER Insulina Lispro USP
ER Insulina Porcina USP

(121.1) PROCEDIMIENTOS ANALTICOS FISICOQUMICOS PARA

INSULINAS

INTRODUCCIN
Existen diversos procedimientos fisicoqumicos que se utilizan para la evaluacin de los atributos de calidad de la Insulina Hu-
mana y de diversos anlogos de insulina, en lo sucesivo referidos como insulinas. De stos, el mapeo de pptidos y la deter-
minacin de protenas de alto peso molecular tienen caractersticas similares para el anlisis de los diversos frmacos y medi-
camentos basados en insulina. Este captulo describe las pruebas para mapeo de pptidos y para el anlisis cuantitativo de
protenas de alto peso molecular que se pueden usar para las diversas insulinas.
Las instrucciones especficas que difieran de los procedimientos generales aqu descritos se proporcionan en las monografas
correspondientes de frmacos o medicamentos para las diferentes insulinas.
MAPEO DE PPTIDOS
La digestin de insulina se lleva a cabo usando proteasa de la cepa V8 de Staphylococcus aureus (S. aureus V8), una serin-endo-
proteineasa que escinde desde el lado e-terminal a nivel de los residuos glutamilo y aspartilo en solucin amortiguadora de
fosfato de pH 7,8. Esta proteasa es especfica para la digestin de Glu-C en bicarbonato de amonio y otras soluciones amor-
tiguadoras de pH 7,8 que no contienen fosfato. La presencia de prolina en el lado carboxi de la unin peptdica inhibe la
escicin. El sistema amortiguador usado debe escindir todas las uniones glutamilo de la insulina sin escindir las uniones as-
partilo. En general, usando el sistema amortiguador descrito en la Solucin muestra siguiente, la insulina se digiere en cuatro
pptidos.
A continuacin se muestran las diferencias de aminocidos entre los anlogos de la insulina y la Insulina Humana, y las diferen-
cias in silico en los fragmentos obtenidos luego de la digestin con S. aureus V8.
La Figura 7 presenta los cuatro fragmentos de Insulina Humana despus de la digestin con proteasa V8 de S. aureus.

Fragmento IV Fragmento I Fragmento JI

s s
A1 1 A10 1 A20
Gly-lle-Val-Glu Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu Asn-Tyr-Cys-Asn
1 1
s s
\s s
/ Fragmento III
81 1 810 1 820 830
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
1

Figura 1. Insulina Humana: Fragmentos de digerido con proteasa V8 de 5. aureus.

La Tabla 7 presenta las diferencias de aminocidos entre los anlogos de insulina e Insulina Humana.
Tabla 1. Diferencias de Aminocidos entre los Anlogos de Insulina e Insulina Humana
Anlogo de Insulina Diferencias de Aminocidos con la Insulina Humana
Insulina asparta B28 Asp
Insulina glargina A21 Gly, dos Arg agregadas al (-terminal de la cadena B
Insulina glulisina B3 Lys, B29 Glu
Insulina lispro B28 Lys, B29 Pro
--------------

La Tabla 2 presenta los fragmentos especficos del digerido de proteasa V8 de S. aureus de los anlogos de insulina. Se resaltan
las diferencias de aminocidos en comparacin con la Insulina Humana.
Tabla 2. Diferencias de Aminocidos: Insulina Humana y Anlogos (Las Diferencias con Insulina Humana Se p,-~sentan en Negrilla)
Anlogo de Insulina Diferencias de Aminocidos en Comparacin con la Insulina Humana
Insulina asparta Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr (B3)
Fragmento 11 (A18) Asn-Tyr-Cys-Gly (A21)
Insulina glargina
Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg (B32)
Las letras A y B indican las cadenas A y B de insulina, respectivamente; los nmeros indican la posicin del aminocido en la cadena.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (121.1) Procedimientos para Insulinas 211

Tabla 2. Diferencias de Aminocidos: Insulina Humana y Anlogos (Las Diferencias con Insulina Humana Se Presentan en Negrilla)
(Continuacin)
Anlogo de Insulina Diferencias de Aminocidos en Comparacin con la Insulina Humana
Fragmento 1 (B1) Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu (B11)
Insulina glulisina
Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr (B30)
Insulina lispro Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (B3o)
Las ietras A y B indican las cadenas A y B de insulina, respectivamente; los nmeros inaican ia posicin dei aminocido en 1a cadena.

PROCEDIMIENTO PARA MAPEO DE PPTIDOS

El siguiente procedimiento se aplica a la preparacin de mapas peptdicos de Insulina Humana y anlogos de insulina.
Solucin amortiguadora de HEPES: Disolver 2,38 g de HEPES (cido N-2-hidroxietilpiperazina-W-2-etanosulfnico) en
aproximadamente 90 ml de agua en un mat:az volumtrico de 100 ml. Ajustar con hidrxido de sodio 5 M a un pH de
7,5, dl 1uir co~ agua a volumen y mezclar.
Solucin amortiguadora de sulfato: Sulfato de amonio 2,0 M y cido sulfrico 0,5 M (1 :1). ~/lezc!ar y filtrar.
DIGESTIN DE INSULINA
El siguiente procedimiento provee una escisin eficiente de las uniones a nivel del glutamilo de la insulina. [NOTA-Se pue-
den usar volmenes hasta 20 veces mayores siempre que la proporcin de las soluciones siga siendo la misma. Si al correr
un digerido de la enzima sola se obtienen subproductos de autolisis interferentes en el cromatograma, la relacin enzi-
ma: insulina deber reducirse y se deber aumentar el tiempo de digestin.]
Solucin enzimtica: Preparar una solucin de proteasa V8 de S. aureus (aproximadamente 500 unidades/mg) de 1
mg/ml en agua.
Solucin muestra: Preparar una solucin de la insulina a examinar de 2,0 mg/ml en cido clorhdrico 0,01 N. Agregar a
un vial limpio 25 L de la solucin de insulina de 2,0 mg/ml, 100 L de Solucin amortiguadora de HEPES y 20 L de
Solucin enzimtica (relacin final 25:100:20). Tapar el vial e incubar a 25 durante 6 horas. Detener la reaccin agregan-
do un volumen igual de Solucin amortiguadora de sulfato. Puede ser necesario aumentar los tiempos de incubacin para
los anlogos de baja solubilidad a un pH de 7,5.
Solucin estndar: Preparar al mismo tiempo y de la misma manera una solucin del Estndar de Referencia de Insulina
USP correspondiente, segn se indica en la Solucin muestra.
DETERMINACIN DE FRAGMENTOS PEPTDICOS
Determinar los fragmentos peptdicos usando el siguiente procedimiento de mapeo de pptidos (ver Artculos Obtenidos Por
Biotecnologa-Mapeo de Pptidos (1055)).
Solucin A: Acetonitrilo, agua y Solucin amortiguadora de sulfato (100:700:200). Filtrar y desgasificar.
Solucin B: Acetonitrilo, agua y Solucin amortiguadora de sulfato (400:400:200). Filtrar y desgasificar.
Fase mvil: Ver la Tabla 3.
Tabla 3
Tiempo Solucin A Solucin B
_(min) (%) ~ __ _(%)
~---

o 95 5
3 95 5
30 41 59
35 20 80
40 95 5
50 95 5

Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 214 nm
Columna: 4,6 mm x 1O cm; relleno L1 de 5 m
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyeccin: 50-100 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Comparabilidad de los cromatogramas: En el cromatograma obtenido a partir de la Solucin estndar, identificar los
picos debidos a los fragmentos de digestin 1, 11, 111 y IV. El cromatograma de la Solucin estndar corresponde al cro-
matograma tpico provisto con el Estndar de Referencia de Insulina USP correspondiente.
Factor de asimetra: No ms de 1,5
212 (121.1) Procedimientos para Insulinas/ Pruebas Biolgicas USP 39

Resolucin: Debe existir separacin completa de los picos debidos a los fragmentos 11 y 111. La resolucin se define en la
monografa de la insulina correspondiente.
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Acondicionar el Sistema cromatogrfico mediante una corrida en condiciones iniciales, t = O minutos, durante al menos
15 minutos. Correr un programa de gradientes blanco antes de inyectar los digeridos. Inyectar por separado volme-
nes iguales de la Solucin estndar y la Solucin muestra, y registrar las respuestas de cada pico.
Criterios de aceptacin: El perfil cromatogrfico de la Solucin muestra corresponde al de la Solucin estndar.
LMITE DE PROTENAS DE ALTO PESO MOLECULAR
PROCEDIMIENTO
Solucin A: 1 mg/ml de L-arginina en agua
Fase mvil: Solucin A, acetonitrilo y cido actico glacial (65:20:15). Filtrar y desgasificar.
Solucin de resolucin: Almacenar una cantidad adecuada de frmaco basado en insulina a temperatura ambiente du-
rante un periodo suficiente (5-1 O das, o segn sea necesario) para obtener insulina con ms de 0,4% de protenas de
alto peso molecular. Preparar una solucin de 4 mg/ml en cido clorhdrico 0,01 N. Almacenar la solucin en un refrige-
rador y usar dentro de los 7 das. Como alternativa, disolver aproximadamente 4 mg de ER Insulina Humana de Alto Peso
Molecular USP en 1 ml de cido clorhdrico 0,01 N.
Solucin muestra: En un vial pequeo, preparar una solucin de insulina de 4 mg/ml en cido clorhdrico 0,01 N y mez-
clar hasta disolver. Almacenar en un refrigerador y usar dentro de los 7 das.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 276 nm
Columna: 7,8 mm x 30 cm; relleno L20 de 5 a 1O m
Temperaturas
Columna: Ambiente
Muestreador automtico: Se recomienda usar un muestreador automtico refrigerado.
Velocidad de flujo: 0,5 ml/min
Volumen de inyeccin: 100 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de resolucin
Requisitos de aptitud
Tiempos de retencin: Entre 13 y 17 minutos para los complejos de insulina polimrica, aproximadamente 1 7,5 mi-
nutos para el dmero covalente de insulina, y entre 18 y 22 minutos para el monmero de insulina, con sales que elu-
yen despus del monmero de insulina.
Cociente entre el pico y el valle: El cociente entre la altura del pico del dmero covalente de insulina y la altura del
valle entre el pico del dmero covalente de insulina y el pico del monmero de insulina es no menos de 2,0.
Anlisis
Muestra: Solucin muestra
No tomar en cuenta los picos que tengan tiempos de retencin mayores que el del monmero de insulina.
Calcular el porcentaje de protenas de alto peso molecular en la porcin de Insulina tomada:

Resultado= 100 x 'frH/C'irH + rM)

'frH =suma de las respuestas de todos los picos con tiempos de retencin menores que el del monmero de in-
sulina
rM = respuesta del pico del monmero de insulina
Criterios de aceptacin: Segn se indica en la monografa de insulina correspondiente.
REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Insulina Humana de Alto Peso Molecular USP (uso alternativo u opcional)

(123) PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLGICA DE GLUCAGN

DEFINICIN
El Glucagn es una hormona polipeptdica que posee la propiedad de incrementar la concentracin de glucosa en la sangre
mediante su liberacin a partir de la reserva de glucgeno del hgado y que se usa en la prctica clnica para tratar la hipo-
glucemia. El glucagn humano, porcino y bovino comparten la misma secuencia de 29 aminocidos. Anteriormente, el glu-
cagn disponible comercialmente se purificaba a partir de glndulas pancreticas bovinas y porcinas. En la actualidad, el
glucagn humano es producido recombinantemente (por ADNr) (rGlucagn) con diversos sistemas de fermentacin micro-
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (123) Pruebas de Identidad Biolgica de Glucagn 21 3

biana usando la secuencia de aminocidos humana. La monografa de los compendios USP-NF, Glucagn para Inyeccin, de-
fine las pruebas de identificacin para glucagn. La identidad biolgica del glucagn se debe determinar usando un mtodo
de valoracin biolgica validado, aprobado por una autoridad competente. La valoracin biolgica debe demostrar que el
proceso de fabricacin produce Glucagn con una actividad biolgica de no menos de 0,80 Unidades USP/mg de glucagn.
Este captulo describe una prueba de identidad biolgica validada que mide la glucosa liberada a partir de clulas de hgado
(hepatocitos) de rata preparadas recientemente, estimuladas in vitro con Glucagn.
VALORACIN
VALORACIN CON CLULAS HEPTICAS PRIMARIAS
[NOTA-Todas las soluciones amortiguadoras deben estar oxigenadas, preparadas con Agua Estril para Inyeccin o Agua Est-
ril para Irrigacin, entibiadas a 37 y ajustadas a un pH final de 7,4, a menos que se indique algo distinto. Se deben realizar
por lo menos dos valoraciones independientes (determinaciones repetidas) utilizando dos hgados de rata para cada lote
de Glucagn. La Figura 7 demuestra el proceso usado para generar un valor repetido. Se debe combinar como mnimo dos
determinaciones repetidas de acuerdo con la seccin Clculos. Los intervalos de concentracin de las Preparaciones estndar
y las Preparaciones de valoracin se pueden modificar para que caigan dentro del intervalo lineal de la Valoracin; asimismo,
los clculos se pueden ajustar de manera correspondiente. Como alternativa, se puede emplear un anlisis de curva com-
pleta usando mtodos estadsticos no lineales validados, siempre y cuando se demuestre la similitud cuando los analistas
comparen las respuestas de las Preparaciones estndar y las Preparaciones de valoracin.]

Suspensin de Hepatocitos de
Rata (1 Rata)
Dividida en 2 Suspensiones

/
Suspensin 1 Suspensin 2
1 Vial de ER 1 Vial de ER
5 Viales de Muestra 5 Viales de Muestra

Un Resultado de Un Resultado de
Medicin Medicin

Figura 1. Diagrama de flujo del mtodo de valoracin de hepatocitos de rata (ER = Estndar de Referencia).

Preparacin de Hepatocitos
Solucin amortiguadora para perfusin sin calcio con dextrosa: Preparar una solucin que contenga 7,92 g/L de clo-
ruro de sodio, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 1,80 g/L de dextrosa, O, 19 g/L de cido edtico (EDTA) y 2,38 g/L de cido
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfnico (HEPES). Oxigenar antes de su uso.
Solucin amortiguadora de colagenasa: Preparar una solucin que contenga 3,62 g/L de cloruro de sodio, 23,83
g/L de HEPES, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 0,52 g/L de cloruro de calcio y 1,8 g/L de dextrosa. Ajustar a un pH de 7,6.
Inmediatamente antes de la perfusin, disolver en esta solucin una cantidad de colagenasa para obtener una concentra-
cin de 0,02%-0,05%. La concentracin exacta de colagenasa se determina empricamente para cada lote nuevo de enzi-
ma y es la cantidad que puede disociar el tejido uniformemente dentro de los 1 O minutos del ingreso de la solucin amor-
tiguadora y producir una concentracin celular viable de no menos de 3 x 10 6 clulas/ml.
Solucin amortiguadora para lavado: Preparar una solucin que contenga 7,92 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de
cloruro de potasio, O, 19 g/L de EDTA, 2,38 g/L de HEPES, O, 11 g/L de cloruro de calcio y 0,06 g/L de sulfato de magne-
sio.
214 (123) Pruebas de Identidad Biolgica de Glucagn / Pruebas Biolgicas USP 39

Solucin amortiguadora para incubacin: Preparar una solucin que contenga 6, 19 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L
de cloruro de potasio, 0,22 g/L de cloruro de calcio, 0, 12 g/L de sulfato de magnesio, O, 16 g/L de fosfato monobsico de
potasio, 11,915 g/L de HEPES y 1O g/L de albmina srica bovina (BSA al 1 %). Ajustar a un pH de 7,5.
Animales de prueba: Mantener ratas macho Sprague-Dawley con una dieta estndar de alimento para rata, con agua a
voluntad y permitir que se ajusten a su nuevo ambiente antes del anlisis. En la maana de la prueba, seleccionar una rata
sana con un peso aproximado de 300-400 g y administrar 100 Unidades de Heparina Sdica por va subcutnea.
Procedimiento: [NOTA-Efectuar este procedimiento por la maana para asegurarse de que la rata tenga un nivel ptimo
de glucgeno en el hgado y que el procedimiento pueda completarse en un solo da.] Aneslesiar a la rata con un anest-
sico adecuado. Abrir la cavidad abdominal y aislar la vena porta. Introducir un angiocatter en la vena porta y ligarlo en la
ubicacin general de la rama esplnica. Luego conectarlo a una bomba de perfusin. Comenzar la perfusin (25 mL/min)
in situ con la Solucin amortiguadora para perfusin sin calcio con dextrosa previamente entibiada y oxigenada. Mientras el
hgado aumenta de tamao, cortar la vena cava inferior para permitir que la presin se equilibre. [NOTA-Se requieren
aproximadamente 300 mL del lquido de perfusin para limpiar el hgado de glbulos rojos a una velocidad de flujo de
25-60 mL/min.J Despus, hacer que circule Solucin amortiguadora de colagenasa a una velocidad de flujo apropiada de
manera que el hgado empiece a drenar el lquido de perfusin de los lbulos en aproximadamente 1O minutos (por lo
general 25-60 mL/min). Cuando el hgado aumente significativamente de tamao, cambie de coior y consistencia, y co-
mience a drenar el lquido de perfusin de los lbulos, cambiar el sistema a la Solucin amortiguadora para lavado previa-
mente entibiada y oxigenada. Se requieren aproximadamente 100 mL de Solucin amortiguadora para lavado para lavar el
hgado de colagenasa a una velocidad de flujo de 25 mL/min. Retirar quirrgicamente el hgado del animal y colocarlo en
una cpsula de Petri previamente entibiada que contenga una pequea cantidad de Solucin amortiguadora para lavado
oxigenada (37). Peinar suavemente el hgado con un peine de dientes finos de acero inoxidable para liberar los hepatoci-
tos. Filtrar y lavar los hepatocitos con Solucin amortiguadora para lavado a travs de gasa (con un grosor de 3 capas, o a
travs de una red de polietileno con un tamao de malla de 150 m), previamente humedecida, en un vaso de precipita-
dos. Transferir las clulas a dos tubos de centrfuga y centrifugar durante aproximadamente 1 minuto a 600 rpm. Dese-
char el sobrenadante y volver a suspender los dos pellets en Solucin amortiguadora para incubacin. Combinar los dos
pellets en un recipiente adecuado y agregar suficiente Solucin amortiguadora para incubacin para obtener 150 ml.
Aptitud del sistema de la preparacin de las clulas: La concentracin de las clulas puede variar debido a la actividad
de colagenasa y a la viabilidad de los hepatocitos. Para verificar la viabilidad de las clulas y determinar la concentracin
de clulas viables, diluir una alcuota de 100 L de la suspensin celular con 400 L de Solucin amortiguadora para lavado
y 500 L de solucin isotnica de azul de tripn al 0,4%. Cargar alcuotas de la suspensin celular en las dos cmaras de
un hemocitmetro y contar los ocho cuadrantes. Para cumplir con la aptitud del sistema del mtodo de preparacin de
las clulas, se debe obtener una concentracin de clulas viables de 3 x 10 6 clulas/mL (un intervalo aceptable es de 2,5 x
10 6 a 3,4 x 1 0 6 clulas/mL) a fin de proseguir con la valoracin biolgica. Si la concentracin de clulas viables excede el
lmite superior, se puede agregar a las clulas un volumen adicional de Solucin amortiguadora para incubacin para ajus-
tar la concentracin a 3 x 10 6 clulas/mL. En este caso, se realiza un nuevo recuento de las clulas en un hemocitmetro,
segn se indic anteriormente para verificar la concentracin. [NOTA-Las clulas viables son aqullas que excluyen el azul
de tripn.]
Determinacin de Glucosa
Solucin de control negativo: Preparar una solucin que contenga BSA al 0,5% usando Agua Estril para Inyeccin o
Agua Estril para Irrigacin.
Matraces para incubacin: Usar matraces Erlenmeyer de 25 mL especialmente preparados, cuyos fondos se hayan calen-
tado y empujado hacia adentro para formar un centro elevado cnicamente o matraces similares que permitan un mez-
clado suficiente al agitar por rotacin suave. Colocar los Matraces para incubacin en un bao de agua con agitador orbi-
tal a 35.
Preparaciones estndar: En el da de la valoracin, disolver dos viales de ER rGlucagn USP, medidos con exactitud, en
cido clorhdrico 0,01 N u otro diluyente adecuado (el volumen se basa en la potencia del lote del Estndar de Referencia)
para obtener dos soluciones que contengan 1 Unidad USP de rGlucagn/mL cada una. Todas las diluciones posteriores se
realizan con Solucin de control negativo. Diluir con exactitud volmenes medidos de cada solucin con Solucin de control
negativo para obtener una concentracin intermedia de 400 U/mL y luego diluir la concentracin intermedi;i para pro-
ducir cinco concentraciones: 200; 100; 50; 25 y 12,5 U/mL (Preparaciones estndar). Pipetear y transferir O, 1 mL de cada
una de las Preparaciones estndar a distintos Matraces para incubacin. Pipetear y transferir O, 1 mL de Solucin de control
negativo a cada uno de dos matraces (Soluciones de control negativo 1 y 2).
Preparaciones de valoracin: Usando cantidades pesadas con exactitud de muestras de Glucagn, proceder segn se
indica en Preparaciones estndar o, si se est analizando Glucagn para Inyeccin, reconstituir 1O viales agregando lenta-
mente el contenido de las jeringas prellenadas adjuntas que contienen un diluyente apropiado para glucagr .. Mezc:ar
suavemente cada vial hasta que se disuelva el glucagn. Con las mismas jeringas, extraer el contenido de cinco viales y
colocar las soluciones en un matraz volumtrico de 25 mL. Repetir la operacin para los cinco viales remanentes, transfi-
riendo el contenido a un segundo matraz volumtrico de 25 mL. Diluir cada matraz con cido clorhdr:::o 0,01 N a volu-
men. Diluir una cantidad exacta de cada solucin con BSA al 0,5% hasta obtener una concentracin de 400 U/mL y
diluir la concentracin intermedia hasta producir cinco concentraciones de Preparaon de valoracin: 200; 100; 50; 25 y
12,5 U/ml. Luego, proceder segn se indica en Preparaciones estndar.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (124) Valoraciones Biolgicas de Eritropoyetina 215

Solucin madre de referencia: Secar ER Dextrosa USP y luego transferir 1,0 g, pesados con exactitud, a un matraz volu-
mtrico de 100 ml. Disolver y diluir con solucin saturada de cido benzoico a volumen.
Soluciones de referencia: Transferir cantidades adecuadas de Solucin madre de referencia a cuatro matraces y diluir con
solucin saturada de cido benzoico hasta obtener Soluciones de referencia con concentraciones de 100; 500; 1000 y 1500
mg/L.
Solucin de ferrocianuro de potasio: Disolver 1,25 g de ferrocianuro de potasio trihidrato en 125 mL de Agua Estril
para Inyeccin o usar una fuente comercial apropiada.
Aptitud del sistema: Analizar la Solucin de ferrocianuro de potasio, las Soluciones de referencia y cinco determinaciones
repetidas adicionales de la Solucin de referencia de 500 1000 mg/L en un analizador de glucosa adecuado. [NOTA-Las
Soluciones de ferrocianuro de potasio son estndares apropiados nicamente para analizadores de glucosa que miden acti-
vidad de glucosa oxidasa. El procedimiento tambin se puede realizar usando plataformas alternativas.] Preparar una cur-
va estndar usando las Soluciones de referencia segn se indica en Preparaciones estndar. La raz cuadrada del error cua-
drtico medio residual, a partir de la regresin, dividida por el promedio de la respuesta multiplicada por 100% (desvia-
cin estndar relativa porcentual [o/oRSD] de la lnea) debe ser no ms de 2,0%. Asimismo, la respuesta de la Solucin de
ferrocianuro de potasio debe ser no ms de 30 mg/L y la desviacin estndar relativa debe ser no ms de 2,0% en los
anlisis repetidos de la Solucin de referencia media.
Procedimiento: Dispensar 5 mL de Preparacin de Hepatocitos en los Matraces para incubacin en secuencia desde la con-
centracin ms alta de glucagn hasta la concentracin ms baja de glucagn, alternando las Preparaciones estndar con
las Preparaciones de valoracin. Agitar los matraces por rotacin suave en un bao de agua giratorio a 125 rpm a una tem-
peratura de 30-35 durante aproximadamente 30 minutos. Despus de la incubacin, extraer alcuotas de 1,0 mL de
cada Matraz para incubacin, transferir a tubos de microcentrfuga rotulados y centrifugar a 1 3 000 rpm durante 15 se-
gundos. Colocar cada fraccin sobrenadante en un tubo de muestreo rotulado para analizador de glucosa y determinar la
concentracin de glucosa (mg/L) de cada una de las Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin. Medir la lectura
de fondo de las Soluciones de control negativo 7 y 2, y calcular el promedio de las dos respuestas.
Para cumplir con el intervalo lineal del instrumento que se est usando, puede ser necesario que los analistas ajusten cada
una de las Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin mediante dilucin. Se debe usar un analizador de glucosa
que haya demostrado una especificidad, exactitud, precisin y respuesta lineal apropiadas para el intervalo de las con-
centraciones que se estn determinando. Determinar el incremento en la concentracin de glucosa para cada una de las
Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin en comparacin con el valor promedio de la Solucin de control ne-
gativo.
Clculos
Calcular la potencia relativa de las muestras de Glucagn usando mtodos estadsticos para valoraciones de lneas paralelas,
comparando la curva del Estndar de Referencia (a partir de las Preparaciones estndar) con la curva de la muestra de Glu-
cagn (a partir de las Preparaciones de valoracin). No puede presentarse ninguna inversin de dosis-respuesta dentro de
una corrida para las Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin de 25; 50 100 U/ml. [NOTA-Se puede excluir
el nivel bajo o alto de dosis, pero no ambos, del clculo para cumplir con los requisitos de linealidad.] Debido a que se
requiere un mnimo de dos valoraciones vlidas (ratas), las potencias estimadas se combinan usando los procedimientos
del captulo general Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas (111 ), Combinacin de Valoraciones Independientes; asimis-
mo, se calcula la amplitud, L, de un intervalo de confianza de 95% para el logaritmo estimado de la potencia relativa. Los
resultados son vlidos si Les no ms de O, 1938. Si Les >0, 1938, se pueden realizar valoraciones adicionales y combinarlas
hasta obtener un trmino L vlido, y posteriormente se calcula la potencia relativa a partir de todas las corridas indepen-
dientes vlidas. Calcular la potencia de las muestras de Glucagn en Unidades USP de rGlucagn/mg, multiplicando el
resultado de la potencia relativa por la potencia del ER rGlucagn USP. Cumple con el requisito de identidad biolgica si
la potencia es no menos de 0,80 Unidades USP de rGlucagn/mg.

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dextrosa USP
ER rGlucagn USP

(124) VALORACIONES BIOLGICAS DE ERITROPOYETINA

INTRODUCCIN
Este captulo provee pautas sobre el uso de valoraciones biolgicas para medir la actividad biolgica de eritropoyetina (EPO,
por sus siglas en ingls). Basndose en uno de los enfoques de potencia relativa descritos en el captulo general Diseo y Desa-
rrollo de Valoraciones Biolgicas (1032), la actividad biolgica de una preparacin de EPO desconocida por lo general se deter-
mina mediante comparacin con la actividad biolgica de un Estndar de Referencia (ER). Para este propsito, se ha desarrolla-
216 (124) Valoraciones Biolgicas de Eritropoyetina /Pruebas Biolgicas USP 39

do un ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP. Las valoraciones descritas en el captulo no son aplicables a formas
de EPO modificadas por ingeniera para prolongar su vida media.
El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP se ha calibrado contra el Estndar Internacional para EPO de la Organi-
zacin Mundial de la Salud (OMS) usando el mtodo de valoracin biolgica con ratn normocitmico y el mtodo de valora-
cin biolgica con ratn policitmico exhipxico. Por consiguiente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP tiene
una medida en unidades asignada en trminos de Unidades Internacionales (IU) de EPO conforme a lo definido por la OMS.
De estas dos valoraciones biolgicas in vivo, el mtodo de valoracin biolgica con ratn normocitmico es menos complica-
do y se usa ampliamente para la determinacin de la potencia de EPO. La valoracin se basa en la medicin de la maduracin
de los reticulocitos estimulados por EPO. Debido a que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP se ha calibrado
contra el Estndar Internacional para EPO de la OMS mediante una valoracin biolgica in vivo, se puede usar directamente en
el mtodo de valoracin biolgica con ratn normocitmico para la calibracin de cualquier preparacin de EPO especfica del
proceso.
Sin embargo, si la intencin es usar una valoracin biolgica in vitro validada para transferir la medida en unidades del ER
Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP a una preparacin de EPO especfica del proceso, entonces es necesario de-
mostrar que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP y la preparacin de EPO especfica del proceso presentan
una relacin equivalente entre la potencia in vitro e in vivo. Esto se debe a que la actividad biolgica de la EPO presenta una
relacin compleja entre la estructura y la funcin. En particular, la relacin entre la actividad in vitro e in vivo est inversamente
correlacionada con el tipo y el grado de sialilacin terminal. Los productos que presentan una alta sialilacin tienen un mayor
nivel de actividad in vivo; por ende, tienen una relacin entre actividad in vitro e in vivo relativamente ms baja. Debido a las
diferencias en los procesos de fabricacin usados en la preparacin de EPO, el tipo y el grado de sialilacin terminal puede
variar entre preparaciones de EPO, incluyendo las preparaciones de EPO que se usan como Estndares de Referencia. Como
resultado, el uso de una valoracin in vitro para medir la actividad biolgica de una preparacin de EPO requiere conocer muy
bien la relacin entre la actividad in vivo e in vitro de la EPO. La mejor manera de lograr dicho conocimiento es comparar la
preparacin de prueba de EPO con el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP en la valoracin in vivo y en una valo-
racin in vitro especfica.
El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP tiene asignada una medida en unidades que representa su actividad en
valoraciones in vivo e in vitro. Si las relaciones entre la potencia in vitro e in vivo para el material que se est analizando y el ER
Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP son equivalentes, entonces se puede usar el ER Eritropoyetina para Valoracio-
nes Biolgicas USP directamente en la valoracin in vitro para calibrar el material que se est analizando. No obstante, si las
relaciones no son equivalentes, el material que se est analizando y el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP ten-
drn una relacin de potencia in vitro e in vivo diferente. Por este motivo el estndar no podr usarse con su potencia designa-
da en la valoracin in vitro. En su lugar, se debe usar esta relacin determinada para el material que se est analizando para
asignar al ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP una medida en unidades especfica para el proceso de valoracin
in vitro. Posteriormente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP, con sus unidades ajustadas para valoracin in
vitro, se podr usar en la valoracin in vitro para transferir la medida en unidades del ER Eritropoyetina para Valoraciones Biol-
gicas USP al material que se est analizando.

VALORACIN CON RATN NORMOCITMICO

Soluciones
Solucin A: Disolver 10,75 g de fosfato dibsico de sodio dodecahidrato, 7,6 g de cloruro de sodio y 1Og de albmina bovi-
na en 1000 mL de agua. Inmediatamente antes de su uso, ajustar con solucin de hidrxido de sodio o de cido fosfrico a un
pH de 7,2.
Solucin estndar 1: Disolver ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP en Solucin A hasta una concentracin de
80 Ul/ml.
Solucin estndar 2: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin estndar 7.
Solucin estndar 3: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin estndar 2.
Solucin muestra 1: Preparar la muestra a analizar en Solucin A a una concentracin de 80 Ul/ml.
Solucin muestra 2: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin muestra 7.
Solucin muestra 3: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin muestra 2.
Las concentraciones exactas de cada Solucin estndar y Solucin muestra pueden requerir ajustes basndose en el intervalo
de respuesta en los animales usados.
Preparacin de los animales: Al inicio del procedimiento de valoracin, distribuir de forma aleatoria en seis jaulas ratones de
edad y cepa adecuadas (los ratones B6D2F1 de 8 semanas de vida son adecuados). Se recomienda un mnimo de ocho ratones
por jaula. Inyectar cada animal por va subcutnea con 0,5 mL del tratamiento apropiado (una solucin por jaula) y colocar al
animal en una nueva jaula. Combinar los ratones de tal manera que cada jaula aloje un ratn representativo de cada uno de
los seis tratamientos diferentes (cada una de las Soluciones estndar y de las Soluciones muestras; seis ratones por jaula).
Anlisis: Cuatro das despus de las inyecciones, recolectar muestras de sangre de los animales y determinar el nmero de
reticulocitos usando un procedimiento adecuado. Se puede emplear el siguiente mtodo.
Puede ser necesario modificar el volumen de sangre, el procedimiento de dilucin y el reactivo fluorescente para asegurar el
mximo desarrollo y estabilidad de la fluorescencia.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (126) Pruebas de Identidad 217

Para solucin colorante concentrada, usar una solucin de anaranjado de tiazol adecuada para la determinacin de reticulo-
citos. Preparar a una concentracin que sea el doble de la necesaria para el anlisis.
Proceder con los siguientes pasos de dilucin. Diluir sangre entera 500 veces en la solucin amortiguadora usada para pre-
parar la solucin colorante. Diluir esta solucin a la mitad en la solucin colorante concentrada. Despus de teir durante 3-1 O
minutos, determinar el recuento de reticulocitos por microfluorometra en un citmetro de flujo. El porcentaje de reticulocitos
se determina usando un histograma biparamtrico: nmero de clulas/fluorescencia roja (620 nm).
Calcular la potencia usando mtodos estadsticos convencionales para valoracin de lneas paralelas. Para informacin adi-
cional, consultar el captulo general Anlisis de Valoraciones Biolgicas (1034).
Criterios de aceptacin: La actividad de cada Solucin muestra se compara con la del ER Eritropoyetina para Valoraciones
Biolgicas USP y se expresa en UI. Los lmites de confianza de la potencia estimada (P = 0,95) son no menos de 64% y no ms
de 156% de la potencia, segn se determin mediante el mtodo provisto anteriormente. La potencia estimada es no menos
de 80% y no ms de 125% de la potencia declarada.

REQUISITOS ADICIONALES

Estndares de Referencia USP (11)

ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP

(126) PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLGICA DE SOMATROPINA

La Somatropina es una hormona proteica que contiene la misma secuencia de aminocidos que la hormona de crecimiento
humana producida por la glndula pituitaria. Se usa un procedimiento cromatogrfico fisicoqumico, robusto y preciso en la
Valoracin para asignar potencia en trminos de masa. Ya que la determinacin de la identidad biolgica sigue siendo nece-
saria, se presentan a continuacin dos procedimientos diferentes: un procedimiento de valoracin biolgica in vivo basado
en el aumento de peso corporal en ratas inducido por somatropina y un enfoque ms preciso basado en una lnea celular de
rata que mide la produccin de ATP como un indicador directo del crecimiento celular. [NOTA-La prueba de identidad bio-
lgica de somatropina puede realizarse en el frmaco a granel o en el producto farmacutico.]

PROCEDIMIENTO
PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLGICA IN VIVO
Solucin amortiguadora: Bicarbonato de amonio O, 1 M. Ajustar con hidrxido de sodio a un pH de 8,0.
Soluciones estndar: 10-1 00 g/mL de ER Somatropina USP en Solucin amortiguadora
Soluciones muestra: 10-100 g/mL de Somatropina en Solucin amortiguadora. [NOTA-No agitar mientras se mezcla;
agitar por rotacin suave.]
Control: Solucin amortiguadora
Animales de prueba: Seleccionar un nmero apropiado de ratas Sprague Dawley que sean slo machos o slo hembras y
que hayan sido hipofisectomizadas a los 25-30 das de vida. Despus de la hipofisectoma, alimentar las ratas con alimento
para ratas y solucin de dextrosa al 5% en agua durante al menos 72 horas. Despus de 72 horas, alimentar las ratas con
alimento para ratas y agua filtrada y desionizada ajustada con cido clorhdrico 1 N a un pH de 3,0 0,25. Pesar las ratas
cuando tengan 37-44 das de vida y conservar nicamente las que estn sanas. Volver a pesar las ratas escogidas 7 das
despus y utilizar slo aquellas que estn sanas y cuyo peso no haya aumentado o disminuido ms del 10% durante los 7
das anteriores.
Anlisis: Dividir aleatoriamente las ratas en grupos de control, grupos estndar y grupos de prueba, cada grupo debe con-
tener aproximadamente 1 O ratas. Cada da durante 1O das, inyectar por va subcutnea O, 1 mL de Control, Soluciones es-
tndar y Soluciones muestra a los grupos de control, estndar y de prueba, respectivamente. Registrar el peso corporal de
cada animal al inico de la prueba y aproximadamente 18 horas despus de la 1 O inyeccin.
Clculos: Determinar el cambio en el peso corporal de cada rata durante los 1 O das y calcular la potencia de la Solucin
muestra con respecto a la de la Solucin estndar usando un anlisis estadstico apropiado. Calcular la potencia media en
Unidades USP de Somatropina/mg y, usando mtodos estadsticos apropiados, calcular la amplitud, L, de un intervalo de
confianza de 95% para el logaritmo en base 1O estimado de la potencia relativa. Si Les ms de 0,40, repetir la prueba
hasta que los resultados de dos o ms pruebas, combinados por mtodos estadsticos apropiados, produzcan un valor L de
no ms de 0,40, correspondiente a lmites de confianza del 63%-158% de la potencia calculada.
Criterios de aceptacin: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg, cuando Les no ms de 0,40.
PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLGICA IN VITRO BASADA EN CLULAS
218 (126) Pruebas de Identidad / Pruebas Biolgicas USP 39

Medio A: Medio de Fischer1 que contenga suero fetal bovino al 10% inactivado por calor2 , suero de caballo al 10% inacti-
vado por calor 3, bicarbonato de sodio al 1% y 2-mercaptoetanol 0,05 mM. Esterilizar por filtracin. [NOTA-Almacenar du-
rante un mximo de 2 semanas a 2-8.]
Medio B: Medio de Fischer que contenga suero de caballo al 1%, bicarbonato de sodio al 1% y 2-mercaptoetanol 0,05
mM. Esterilizar por filtracin. [NOTA-Almacenar durante un mximo de 2 semanas a 2-8.]
Solucin salina amortiguada con fosfatos: 4 Solucin salina amortiguada con fosfatos exenta de calcio y magnesio que
contenga fosfato monobsico de potasio 1,5 mM, cloruro de sodio 155 mM y fosfato dibsico de sodio 3 mM, de pH 7,2-
7,4.
Preparacin del cultivo celular: Preparar cultivos de clulas Nb2- l l 5 en suspensin en Medio A en una incubadora humi-
dificada a 37 que contenga dixido de carbono al 5%. Las clulas deben someterse a pasajes dos veces por semana y
volver a sembrarse en Medio A con una densidad de 1 x 105 clulas/mL durante 2 das, 2 x 104 clulas/mL durante 3 das y
1 x 104 clulas/mL durante 4 das. [NOTA-Puede ser necesario adaptar las densidades de siembra cuando los analistas cali-
fiquen lotes nuevos de suero fetal bovino y suero de caballo.] En el da de la valoracin, recolectar las clulas de los matra-
ces y centrifugarlas durante 7 minutos a aproximadamente 218 x g para formar un pellet. Desechar el sobrenadante y lavar
las clulas dos veces con Solucin salina amortiguada con fosfatos, y luego centrifugar. Resuspender las clulas en Medio B,
contarlas y ajustar la concentracin de clulas a 1 x 105 clulas/mL con Medio B. A exepcin de los pocillos de la primera
columna, transferir 50 L de suspensin de clulas a cada pocillo de una placa negra para cultivo de tejidos de 96 pocillos
con fondo transparente. 6 Pipetear y transferir 50 L de Medio Bacada pocillo de la primera columna de la placa. [NOTA-
Cubrir la placa e incubar a 37 durante un mximo de 1 hora mientras se preparan las Soluciones estndar y las Soluciones
de prueba.]
Soluciones estndar: Reconstituir ER Somatropina USP en 1 mL de Solucin salina amortiguada con fosfatos y luego diluir
adicionalmente este material con Medio B hasta una concentracin de 2,0 ng/ml. [NOTA-Usar tubos de ensayo de poli-
propileno para realizar las diluciones. Se requiere aproximadamente 1 mL de esta solucin para cada placa. No usar dilucio-
nes de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volmenes menores de 40 L.]
Soluciones de prueba: Deben obtenerse dos resultados por cada solucin de prueba usando dos preparaciones de soma-
tropina independientes. Reconstitutir dos preparaciones de somatropina independientes en Agua para Inyeccin hasta una
concentracin de 5 mg/ml. Preparar las soluciones de prueba diluyendo adicionalmente este material con Medio B hasta
una concentracin de 2,0 ng/mL. [NOTA-Usar tubos de ensayo de polipropileno para realizar las diluciones. Se requiere
aproximadamente 1 mL de esta solucin para cada placa. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni trans-
ferir volmenes menores de 40 L.] Una preparacin es la Solucin de prueba A y la otra es la Solucin de prueba B.
Solucin de control positivo: Comenzando con una concentracin madre de 5 mg/mL de ER Somatropina USP reconsti-
tuida en Agua para Inyeccin, diluir con Medio B hasta una concentracin de 20 ng/mL. [NOTA-Usar tubos de ensayo de
polipropileno para realizar las diluciones. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volmenes
menores de 40 L.]
Procedimiento: Dispensar 100 L de Medio Ben cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos de fondo redondo/
a exepcin de los pocillos de la columna 12 (pocillos A12-Hl 2 =control positivo) y los pocillos A2-A 1O. [NOTA-Por cada
placa negra de cultivo de tejidos sembrada con clulas segn se describe en Preparacin del cultivo celular, se usa una placa
con pocillos de fondo redondo diferente para preparar las diluciones de la Solucin estndar y la Solucin de prueba.] Luego,
dispensar 200 L de Solucin estndar de 2,0 ng/mL en los pocillos A3, A6 y A9 de la placa de dilucin. Dispensar 200 L
de Solucin de prueba A de 2,0 ng/mL en los pocillos A2, AS y A8 de la placa de dilucin. Dispensar 200 L de Solucin de
prueba B de 2,0 ng/mL en los pocillos A4, Al y A1O de la placa de dilucin. Dispensar 100 L de Solucin de control positivo
de 20 ng/mL en la ltima columna de la placa de dilucin (pocillos A 12-Hl 2). Usando una pipeta de 12 canales, realizar
en la placa diluciones en serie al medio, aspirando 100 L de la primera hilera (A2-A 1O), transferir a la segunda hilera y
mezclar tres veces. Luego, aspirar 100 L de la segunda hilera, transferir a la tercera y mezclar tres veces, etc. Repetir este
procedimineto a lo largo de toda la placa hasta la hilera H. Desechar los 100 L aspirados de la ltima hilera. [NOTA---Los
pocillos de la columna 11 (pocillos A11--Hl 1) son controles negativos que contienen 100 L de Medio B; los pocillos de la
columna 1 (pocillos A1-Hl) son blancos.]
Comenzando con la concentracin ms baja y usando una pipeta de 12 canales, transferir 50 L de cada solucin en la
placa de dilucin al pocillo respectivo de la placa negra de cultivo que contiene las clulas. [NOTA-Durante la transferen-
cia, sumergir las puntas de la pipeta en la suspensin celular. Esta transferencia produce una dilucin adicional 1 :2 de
somatropina, o una concentracin final de 1,O ng/mL para la dosis ms alta agregada a las clulas y 1O ng/mL para la
Solucin de control positivo. La Tabla 1 muestrn el diagrama (layout) de la placa ] Despus de realizar todas las transferen-
cias, agitar suavemente la placa negra durante 30 segundos y luego incubarla en una incubadora humidificada a 37 que
contenga dixido de carbono al 5% durante 30 2 horas. Luego, agregar 100 L de solucin reconstituida de sustrato

1 Quality Biological, N de catlogo 112-032-101 o equivalente.

2 Gibco, N de catlogo 10082-147 o equivalente.
3 Gibco, N de catlogo 26050-088 o equivalente.
4 Amimed, N de catlogo 8-05F291; Gibco, N de catlogo 20012-019 o equivalente.
5 HPA Culture Collections o Sigma-Aldrich HPA Culture Collection N de catlogo #970411 01 o equivalente.
6 Costar, N de catlogo 3904 o equivalente.
7 Placa Greiner N 650 160 o equivalente.
 USP 39 Pruebas Biolgicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos 219

luminiscente8 a todos los pocillos. Incubar las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente mientras se agitan sua-
vemente en un agitador para placas apropiado protegidas de la luz. Incubar las placas sin agitacin durante 15 minutos
adicionales a temperatura ambiente protegidas de la luz. Leer la luminiscencia de los pocillos de las placas en un lector de
placas adecuado con modo de deteccin de luminiscencia.
Tabla 1. Representacon Esquemtica de la Placa de Valoracin Final
!
[ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BL A,#1 St,#1 B,#1 A,# St,#1 B,#1 A,#1 St,#1 B,#1 NEG POS
B BL A,#2 St,#2 B,#2 A,#2 St,#2 B,#2 A,#2 St,#2 B,#2 NEG POS
C BL A,#3 St,#3 B,#3 A,#3 St,#3 B,#3 A,#3 St,#3 B,#3 NEG POS
-;--- --BL.TA~4 __s_t_~,#_4_--;___B~,#_4_+-__,l\~~-~--t,__#4_+--_B,_#_4--<__A~,#-4_-+-_st_,#_4_,___B~,_#4_-+-_N_EG_+--_P_O_s--<
--E- --Bl. r A:#5-- St,#5 B,#5 A,#5 St,#5 B,#5 A,#5 St,#5 B,#5 NEG POS
F BL ! A,#5 St,#6 B,#6 A,#6 St,#6 B,#6 A,#6 St,#6 B,#6 NEG POS
G BL A,#7 St,#7 B,#7 A,#7 St,#7 B,#7 A,#7 St,#7 B,#7 NEG POS
H BL A,#8 St,#8 B,#8 A,#8 St,#8 B,#8 A,#8 St,#8 B,#8 NEG POS
LEYENDA:
BL = Blanco: sin >ornatropina, sin clulas.
A= Serie de diluciones de la Solucin de prueba A (Concentracin inicial de 1,0 ng/ml).
St =Serie de diluciones de la Solucin estndar (Concentracin inicial de 1,0 ng/rnl).
B =Serie de diluciones de la Solucin de prueba B (Concentracin inicial de 1,0 ng/ml).
NEG =Control negativo: sin somatropina, con clulas.
POS = Solucin de control positivo: concentracin mxima de somatropina (1 O ng/ml).

Clculos: Debe usarse un mnimo de dos preparaciones de Solucin de prueba independientes para cada muestra de prue-
ba. Las Soluciones de prueba y las Soluciones estndar se normalizan por el contenido proteico antes de calcular la potencia
relativa. [NOTA-Un mg de somatropina anhidra equivale a 3,0 Unidades USP de Somatropina.] Se omiten los valores abe-
rrantes debidos a la tcnica (pero no ms de 4/curva) y luego se usa el mismo nmero de respuestas a la dosis de la Solu-
cin estndar y la Solucin de prueba, incluyendo la respuesta al 50% (EC 50 ) del estndar y la muestra dentro de este inter-
valo, para calcular la potencia relativa de cada muestra de somatropina usando mtodos estadsticos de anlisis de lneas
paralelas. Para cada Solucin de prueba individual comparada con la Solucin estndar, los resultados de las pruebas estads-
ticas de linealidad, pendiente y paralelismo deben pasar al nivel de 95%. El lmite de confianza de cada potencia relativa
calculada debe estar dentro del 75%-133%. La potencia relativa de una Solucin de prueba debe estar dentro del intervalo
validado para la valoracin (potencia relativa de 50%-200%) de las Soluciones estndar. El logaritmo de la potencia relativa
media no ponderada se calcula a partir de muestras individuales vlidas y posteriormente se calcula la potencia en Unida-
des USP/mg relativas a ER Somatropina USP.
Criterios de aptitud del sistema: La relacin seal-ruido entre la seal de quimioluminiscencia media de la Solucin de
control positivo y la seal de quimioluminiscencia media de los pocillos de control negativo debe ser no menos de 3. No se
pueden omitir ms de 4 valores aberrantes debidos a la tcnica por curva estndar. Debe rechazarse toda placa que no
cumpla con uno o ms de estos criterios y el procedimiento deber repetirse.
Criterios de aceptacin: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Somatropina USP

Agregar lo siguiente:

.. (129) PROCEDIMIENTOS ANALTICOS PARA ANTICUERPOS

MONOCLONALES RECOMBINANTES DE USO TERAPUTICO

INTRODUCCIN
Este captulo provee procedimientos analticos para anticuerpos monoclonales murinos, quimricos y ;1umanizados de isotipo
lgG y subtipos (p.ej., lgGl e lgG2). Las subclases presentan diferencias en la secuencia de aminocidos j en el nmero de
enlaces disulfuro y en algunos casos requieren anlisis especficos para subclases. Este captulo se aplica a anticuerpos mono-
clonales para uso teraputico y profilctico y para uso en diagnsticos in vivo. Este captulo no es aplicable a anticuerpos
monoclonales usados como reactivos en la fabricacin de productos medicinales cuyos requisitos aplicables son determina-
dos por la agencia reglamentara apropiada.
Los anticuerpos polidonales que ocurren naturalmente en suero o plasma pueden unirse a muchas dianas diferentes como par-
te del sistema inmune. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales teraputicos para uso humano son preparaciones de

8 CellTiterGlo Luminescence Kit, p.ej., Promega N G7573 o equivalente.

220 (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos/ Pruebas Biolgicas USP 39
 USP 39 Pruebas Biolgicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos 221

Volumen de inyeccin: 20 L
Tiempo de corrida: 30 min
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de aptitud del sistema
[NOTA-Los tiempos de retencin aproximados para polmero, dmero, monrnero y especies de bajo peso molecular son
12; 15; 18 y 22 minutos, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Cromatograma: El cromatograma de la Solucin de aptitud del sistema es consistente con el cromatograma tpico segn
se ilustra en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP.
Similitud de los cromatogramas: Los perfiles cromatogrficos de las inyecciones de Solucin de aptitud del sistema que
se realizan antes y despus de las inyecciones de las Soluciones muestra en un conjunto de muestra son uniformes entre s
y con el perfil cromatogrfico tpico segn se ilustra en el Certificado USP para el ER Aptitud del sistema de lgG Mono-
clonal USP. Todos los picos nombrados en el cromatograma tpico deben estar presentes, estar bien resueltos y en el
mismo orden de elucin que en los cromatogramas de la Solucin de aptitud del sistema.
Criterios cuantitativos: Las inyecciones de la Solucin de aptitud del sistema que se realizan antes y despus que las de la
muestras, (Bracketing), deben cumplir los siguientes criterios cuantitativos:
El valor porcentual del rea del pico de las especies de alto peso molecular en la Solucin de aptitud del sistema debe ser
0,4%-0,67%.
El valor porcentual del rea del pico principal en la Solucin de aptitud del sistema debe ser 99, 1 %-99,6%.
El valor porcentual del rea del pico de las especies de bajo peso molecular en la Solucin de aptitud del sistema debe ser
no ms de 0,2%.
Anlisis
Muestras: Blanco, Solucin de aptitud del sistema y Solucin muestra
Como mnimo, se deben flanquear (bracket) las inyecciones de la Solucin muestra con inyecciones individuales de la Solu-
cin de aptitud del sistema. Se debe incluir una inyeccin de un Blanco como la inyeccin final antes de la inyeccin de la
Solucin de aptitud del sistema.
Clculos: Usando un integrador electrnico adecuado o un sistema computarizado, analizar las inyecciones de Solucin de
aptitud del sistema que se realizan antes y despus de la inyeccin de la solucin de muestra (Bracketing). Excluir de la
integracin cualquier pico que est presente en el Blanco. Los picos relacionados con protenas que eluyen antes que el
pico principal se clasifican como especies de alto peso molecular; aqullos que eluyen despus del pico principal se clasifi-
can como especies de bajo peso molecular. Informar el valor porcentual de las reas de los picos para las especies de alto
peso molecular, el pico principal, y las especies de bajo peso molecular.
ELECTROFORESIS CAPILAR CON SOS (REDUCTORA Y NO REDUCTORA)
La electroforesis capilar con dodecil sulfato de sodio (CE-SOS) es un mtodo sensible y analtico para la estimacin cuantita-
tiva de impurezas relacionadas con el producto tales como molculas no glicosiladas, medio anticuerpos y fragmentos, y
es, por consiguiente, til tambin como una valoracin indicadora de estabilidad. Despus de la desnaturalizacin con
SDS, el mtodo permite el anlisis del anticuerpo completo en condiciones no reductoras, y el anlisis de las cadenas livia-
nas y de las cadenas pesadas (LC y HC, respectivamente) en condiciones reductoras.
[NOTA-Pueden ser necesarias pequeas variaciones en la preparacin de la muestra dependiendo de la estabilidad del anti-
cuerpo individual. Si la incubacin durante 15 minutos a 70 conlleva a la fragmentacin o escisin de enlaces disulfuro
para una muestra de anticuerpo particular, ajustar el tiempo de incubacin de manera correspondiente.]
Solucin amortiguadora de muestra de SOS: Preparar una solucin que contenga clorhidrato de tris(hidroximetil)amino-
metano (tris-HCI) 100 mM,de pH8,95 0,05 y SDS al 1% (p/p).
Solucin amortiguadora de gel de SOS: Solucin amortiguadora de pH 8,0 que contenga SDS al 0,2% (p/p) y un pol-
mero hidrfilo apropiado que acte como tamiz molecular. 1
Solucin de alquilacin: Yodoacetamida 250 mM en agua, preparada inmediatamente antes de su uso
Solucin de aptitud del sistema: Reconstituir 1 vial de ER Aptitud del sistema de lgG Monoclonal USP con 0,5 ml de
Agua para Inyeccin a una concentracin final de 4 mg/ml.
Solucin de estndar interno: 5 mg/mL de estndar interno de 1 OkDa 2 en agua que contenga SDS al 0,5% (p/p) y azida
sdica al 0,2% (p/v).
Solucin de aptitud det sistema no reducida: Mezclar 25 L de Solucin de aptitud del sistema con 4 L de Solucin de
estndar interno. Mezclar 66 L de Solucn amortiguadora de muestra de SOS con 5 L de Solucin de a/qui/acin. Agregar la
mezcla de Solucin amortiguadora de muestra de SDS y Solucin de a/qui/acin a fa mezcla de Solucin de aptitud del sistema y
Solucin de estndar interno. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70 durante 15 minutos. Dejar que se enfre durante 3
minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 L a viales para muestreador
automtico.
Solucin de aptitud del sistema reducida: Mezclar 25 L de Solucin de aptitud del sistema con 66 L de Solucin amorti-
guadora de muestra de SOS. Agregar 4 L de Solucin de estndar interno y 5 L de (J-mercaptoetanol sin diluir. Mezclar

1 Disponible en Beckman Coulter como un componente del kit de prueba, nmero de catlogo A10663, o un equivalente adecuado.
2 Disponible en Beckman Coulter como un componente del kit de prueba, nmero de catlogo A10663, o un equivalente adecuado.
 222 (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos/ Pruebas Biolgicas USP 39

bien y calentar la mezcla a 70 durante 15 minutos. Dejar que se enfre durante 3 minutos a temperatura ambiehte, centri-
fugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 La viales para muestreador automtico.
Solucin blanco: Mezclar 45 L de agua con 50 L de Solucin amortiguadora de muestra de SOS. Agregar 4 L de Solucin
de estndar interno y 5 L de f3 -mercaptoetanol sin diluir para condiciones reductoras o 5 L.de Solucin de a/qui/acin para
condiciones no reductoras. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70 durante 15 minutos. Dejar que se enfre durante J mi-
nutos a temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 La viales para muestreador auto-
mtico.
Solucin muestra no reducida: Diluir 100 g de la muestra que se va a analizar con 50-95 L de la Solucin amortiguado-
ra de muestra SOS para obtener un volumen final de 95 L. Agregar 4 L de Solucin de estndarinterno y 5 L de Solucin
de alquilacin. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70 durante 15 minutos. Dejar que se enfre durante 3 minutos a tempe-
ratura ambiente, centrifugar a 3QO x g durante 1 minuto y transferir 100 La viales para muestreador automtico.
Sofucin mue$tra reducida: Diluir TOO g de la muestra que se va a analizar con 50-95 L de Solucin amortiguadora de
muestra de SOS para obtener un volumen final de 95 L. Agregar 4 L de Solucin de estndar interno y 5 l de /J-mercap-
toetanol sin diluir. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70 durante 15 minutos. Dejar que se enfre drante 3 minutos a
temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 La viales para muestreador automtico.
Condiciones instrumentales
Modo: CE-SDS
Detector: UV o arreglo de diodos 220 nm
Capilar: Caplar de slice fundida (dimetro interno de 50 m) cortado hasta una longitud total dt: 30 cm con una longi-
tud efectiva de 20 cm. 3 Se requieren los siguientes pasos de preacondicionamiento y prellenado entre cada corrida.
Preacondicionamiento del capilar: Enjuagar durante 3 minutos a 70 psi con hidrxido de sodio 0, 1 N seguido de ci-
do clorhdrico 0, 1 N durante 1 minuto a 70 psi y agua durante 1 minuto a 70 psi.
Prellenado del capilar: Enjuagar durante 1O minutos a 70 psi con Solucin amortguadora de gel de SOS.
Inyeccin de la muestra: Inyeccin electrocintica, polaridad inversa de 5,0 kV durante 20 segundos
Separacin por voltaje
Condiciones no reductoras: Tiempo de corrida de 40 minutos a 15 kV, polaridad inversa
Condiciones reductoras: Tiempo de corrida de 40 minutos a 15 kV, polaridad inversa
Temperaturas
Almacenamiento de la muestra: Aproximadamente 25
Capilar: Aproximadamente 25
Aptitud del sistema
Requisitos de aptitud para condiciones reductoras
Muestra: Solucin de aptitud del sistema reducida
Electroferograma: El electroferograma de la Solucin de aptitud del sistema reducida es consistentecon el electroferogra-
ma tpico ilustrado en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP.
Resolucin: El pico principal de la cadena pesada y el pico de la cadena pesada no glicosilada pueden identificarse cla-
ramente. La resolucin entre la cadena pesada no glicosiladay la cadena pesada intacta es no menos de 1,2.
Cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de la cadena pesada: Usar las reas de los picos corre-
gidos por el tiempo (ver Electroforess Capilar (1053), Cuantificacin, que puede ser un recurso til, mas no obligatorio)
para el clculo. Calcular el cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de: la cadena pesada dividiendo
la cantidad relativa de cadena pesada no glicosilada por la suma de todos los picos de la cadena pesada y multiplicar por
1OO. El cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de la caqena pesada en la Solucin de aptitud del
sistema debe estar dentro de los lmites de 0,75o/o-1,34%.
Requisitos de aptitud para condiciones no reductoras
Muestra: Solucin de aptitud del sistema no reducida
Electroferograma: El electroferograrna de la solucin de aptitud del sistema no reducida es consistente con elelectrofero-
grama tpico ilustrado en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP.
Resolucin: El pico principal de lgG puede identificarse claramente. La resolucin entre el pico principal de lgG y el
Fragmento 1 (Fl) es no menos de 1,3.
Cantidad del pico principal: Calcular 1acantidad relativa del pico principal dividiendo el rea del pico principal de lgG
(corregido por el tiempo) por la suma de todas las reas de los picos (corregidos por el tiempo), excluyendo los picos del
estndar interno y todos los picos del sistema y multiplicar por 100. La cantidad relativa del pico principal de lgG de la
Solucih de apttud del sstema debe estar dentro de los lmites de 61,4%-86,4%.
Desviacin estndar relativa: No ms de 2% para la migracin del estndar interno en la Solucin blanco de los extre-
mos (bracketing). No se detecta ningn otro pico que migre despus del estndar interno.
Anlisis
Muestras: Solucin blanco, Solucin de apttud del :sstema y Solucin muestra
[NOTA~Basndose en los requisitos del instrumento, el campo aplicado a travs del capilar y las condiciones parala inyec-
cin de la muestra pueden ajustarse para lograr la Aptitud del sistema.] Aplicar una potencia de campo de 500 V/cm (polari-

3 Beckman Coulter, nmero de catlogo 338472 o equivalente.

USP 39 Pruebas Biolgicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos 223

dad inversa) durante 40 minutos, usando la Solucin amortiguadora de gel de SOS como electrlito en ambos reservorios de
solucin amortiguadora. Someter las muestras a electroforesis, usando una polaridad inversa de 20 segundos y una inyec-
cin electrocintica a 5,0 kV, en et extremo andico del capilar y registrar los electroferogramas a 220 nm. Enjuagar duran-
te 3 minutos a 70 psi con hidrxido de sodio 0, 1 N seguido de cido clorhdrico O, 1 N durante 1 minuto a 70 psi y agua
durante 1 minuto a 70 psi. Inyectar al menos por duplicado.
Calcular las reas de los picos corregidos por el tiempo de todos los picos que migran despus del pico del estndar inter-
no.

Condiciones reductoras: Calcular la cantidad relativa de los picos que pertenecen al anticuerpo monoclonal, presente en
el producto, dividiendo la suma de las reas de los picos (corregidos por el tiempo) de la cadena pesada, de la cadena
pesada no glicosilada y de la cadena liviana por ta suma de todas las reas de los picos (cori:egidos por el tiempo) para los
picos que aparecen despus del pico del estndar interno y multiplicar por 1OO.
Condiciones no reductoras: Calcular la cantidad relativa del pico del producto dividiendo el rea del pico princ;,ipal de
lgG (corregido por el tiempo) por la suma de todas las reas de los picos (corregidos por el tiempo) que aparecen des-
pus del pico del estndar interno y multiplicar por 1OO.
ANLISIS DE LIGOSACRIDOS-ANLISIS DE LIGOSACRIDOS N-LIGADOS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
La inclusin de anlisis de oligosacridos en una especificacin para un frmaco de anticuerpo monoclonal debe evaluarse
usando enfoques cientficos y basados en riesgos, y deben definirse para cada producto especfico. Si es aplicable, se pue-
de emplear uno o ms de los siguientes enfoques analticos para determinar el perfil de oligosacridos o la cuantif::acin
de estructuras individuales. Se pueden usar otros mtodos validados que son adecuados para la determinacin de glicosi
lacin N- ligada usando diferentes modos de separacin, marcado o deteccin. [NOTA~Para anticuerpos monoclonales
con oligosacridos N-ligados en los dominios Fe y Fab, se pueden usar procedimientos adicionales de preparacin de la
muestra (p.ej., tratamiento con la enzima papana) para separar los dominios antes de los anlisis de modo que se pueda
obtener informacin en los sitios de glicosilacin individuales. Todos los pasos adicionales de preparacin de la muestra
para el mtodo requieren validacin.]
[NOTA-Se pueden definir criterios de aceptacin numricos para estructuras de glicanos individuales. Si es aplicable, los cri-
terios de aceptacin deben derivarse de informacin especfica del producto teniendo en cuenta un rango adecu.ado de
datos histricos de partida.]
Mtodo A: Electroforesis capilar con deteccin de fluorescencia inducida por lser
Solucin amortiguadora de corrida: Preparar trietanolamina (TEA) 100 mM y glicerol al 10% a un pHde 7,5 disolvien-
do 1,492 g de TEA y 1Og de glicerol en 80 mL de agua. Ajustar con cido clorhdrico 1. N a un pH de 7,5, y diluir con
agua hasta un volumen final de 100 ml.
Solucin amortiguadora de muestra: Diluir 1 ml de Solucin amortiguadora de corrida con 9 ml de ag1.a.
Solucin amortiguadora de reaccin enzimtica: Preparar fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5.
Reactivo de marcacin con APTS: Disolver 5 mg de 8-aminopireno-1, 3,6-trisu1fonato (APTS) en 48 l de cido actico
al 15% y mezclar.
Solucin muestra: Agregar 2 L de N-glicosidasa F peptdica (PNGasa F, por sus siglas en ingls) (5 unidades/ml) a 50
g de muestra y ajustar con Solucin amortiguadora de reaccin enzimtica a un volumen de 50 L [NOTA....:..La definicin
de unidad para PNGasa F puede diferir entre fuentes comerciales. Puede ser necesario determinar de forma experimental
la cantidad apropiada de PNGasa F requerida para la liberacin completa de oligosacridos N-ligados en la muestra.] In-
cubar a 37 durante 18 horas. Separar los oligosacridos liberados mediante centrifugacin usando una celda de ultrafil-
tracin centrfuga con membrana con un lmite de corte de peso molecular de 10 000. Secar los oligosacridos librados
en una centrfuga evaporadora con vaco. Agregar 2 L de Reactivo de marcacin con APTS y 2 l de cianoborohidruro de
sodio 1 Malos oligosacridos secos. Incubar a 55 durante 90 minutos. Agregar 46 l de agua para detener la reaccin y
mezclar. Agregar 5 L de muestra marcada con APTS a 95 L de Solucin amortiguadora de muestra.
Solucin de aptitud del sistema: Resuspender cada uno de los estndares de glicano adecuados (1 O g) en 50 L de
agua y mezclar usando un mezclador de vrtice. Agregar 5 L de un estndar de glicano adecuado (1 g) a un tubo de
microcentrfuga. Secar el estndar de glicano usando una centrfuga evaporadora con vaco a temperatura ambiente.
Agregar 2 L de cianoborohidruro de sodio a cada estndar. Agregar 2 l de Reactivo de marcacin con APTS a cada es-
tndar. Mezclar los estndares usando un mezclador de vrtice y centrifugar brevemente para que el lquido repos antes
de la incubacin a 55 durante 90 minutos. Detener la reaccin agregando 46 L de agua a cada estndar. los estndares
pueden almacenarse a -20 hasta 5 semanas.
Condiciones instrumentales
Modo: Electroforesis Capilar
Detector: Detector de fluorescencia inducida por lser (longitud de onda de exeitacin 488 .nm; longitud de ohd.a de
emisin de 520 nm)
Capilar: Capilar de slice fundida sin recubrimiento con un dimetro interno de 50 m y una longitud total de S~ cm. y
una longitud de separacin de 40 cm
Inyeccin de la muestra: Inyeccin hidrodinmica de 1O segundos
Voltaje de separacin: 22kV durante 50 minutos
Muestras: Solucin muestra y Solucin de aptitud del sistema
224 (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos/ Pruebas Biolgicas USP 39

Anlisis: Integrar los picos en el electroferograma resultante e informar los porcentajes relativos de las reas de los picos
(corregidos por el tiempo) de las estructuras de glicano principales pertinentes al producto. Se puede realizar una com-
p~racn con el estndar de referencia adecuado especfico .del producto.
Mtodo 8: Cromatografa de lquidos con deteccin de fluorescencia
Solucin amortiguadora de reaccin enzimtica: Preparar fosfato de sodio 100 mM con un pH de 7,5.
Sofucin amort1guadora de marcacin: Preparar soluciones de acetato de sodio trihidrato al 8% (p/v) y de cido brico
al 4% (p/v) en metano! disolviendo 800 mg de acetato de sodio trihidrato y 400 mg de cido brico en 1O mL de meta-
no!.
Solcin reactivo de marcacin: Preparar una solucin madre de cido antranlico (2-M) de l 00 mg/ml en Solucin
amortiguadora de marcacin. Mezclar con un volumen igual de cianoborohdruro de sodio 1 M en metano! para preparar
un Sofucin reactivo de marcacn final que contenga 50 mg/mL de 2-M y danoborohidruro de sodio 0,5 M. [NOTA-
Mantener el reactivo de marcacin protegido de la luz.]
Sofucin A; Preparar formiato de amonio 50 mM, pH 4,4.
Solucin B: Acetonitrilo
Fase mvil: Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Tiempo Solucin A SolucinB
(rnln) (%) (%)
o,o 32,S 67,5
48,0 42,5 57,5
49,0 10.0 o
53,0 100 o
54,0 32,5 67,5
60,0 32,5 67,5

Preparacin. de la muestra: Transferir 80 g de la muestra de prueba a un tubo de microcentrfuga. Agregar 3 L de

l>NGasa F (2,5 unidades/ml). [NOTA-La definicin de unidad para PNGasa F puede diferir entre fuentes comerciales. Pue-
de ser necesario determinar experimentalmente la cantidad apropiada de PNGasa f requerida para la liberacin completa
de Qligosacridos N-ligadosen .la muestra.] Agregar 14 L de la So/f.!cin amortiguadora de reaccin enzimqtica. Agregar
agua hasta 70 L c;lel.volumen tota!.einq1bar a 37 durante 18 h()ras. Agregar 7.0 L de Solucin reactivo de marcacn
recientemente preparada e incubar a 70 durante 2 horas en una campana de extraccin, Dejar que se enfre y agregar
60 L de metano! al 50% a cada muestra. Mezclar y luego centrifugar.. Retirar 140 l del sobrenadante y transferirlos a un
tubo de microcentrfuga. Agregar 500 Lde acetonttrilo al tubo que contiene el sobrenadante. Cargar la muestra en un
cartucho de extraccin en fase slida para interacci.n hidroflica para eliminar el exceso de reactivo de marcado. Lavar el
cartucho con .acetonitrilo al 95% (aproximadamente 1O ml). Eluir los glicanos marcados del cartucho con 0,5 ml de ace-
tronitrilo al .20%. Diluir el eluato 1:1 con acetonitrilo,
Sistema cromatogrfico
(Ver .Cromatografa {62l), Aptitud del Sistema.)
Moqo: HPLC:
Columnf:l.: 416 mm x 15 cm; relleno L68 de 3 m
Detectc;>r: Fluorescencia (longitud de onda de. excitacin 360 nm; longitud de onda de emisin 420 nm)
Temperatura de la co.lumna: Mantener la columna a 30.
Vel9cidad de flujo; 0,8 mL/min
Volumen de inyeccin: 50 l.,
Anlisis
Muestra: Preparacin de la muestra
Integrar los picos en e.I cromatograma resultante e informar los porcentajes relativos de las reas de los picos de los glica-
11os principales pertinentes al producto. Se puede realizar una comparacin con el estndar de referencia adecuado es-
pec(fko del producto .
ANLISIS QE OLIGOSACR!DOS-J\NLISIS DE ctDO SIAuco
[NOTA-Puede ser necesario modificar el intervalo de la curva estndar o de la masa de la muestra de prueba dependiendo
del contenido de cido silico del anticuerpo monoclonal.)
Solucin A: Preparar hidrxido de sodio 1 00 mM diluyendo 10,4 mL de una solucin de hidrxido de sodio al 50% (p/p)
en 2Jitros de agua. [NOTA-Usar agua de alta cali<::lad y alta resistividad (18 MQ-cm o mejor) que contiene la menor canti-
dad de oxgeno disuelto posible.]
Solucin 6: Preparar una solucin que contenga hidrxido de sodio 100 mM y acetato de sodio 1 M agregando 82,0 g de
acetato de sodio a 800 mL de agua. Agregar 5,2 ml de hidrxido de sodio al 50% (p/p) y diluir con agua hasta un volu-
men final de 1000 ml.
Fase mvit: Ver la Tabla 2.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos 225

Tabla<2
Tiempo S<>lucJo.A $olucinB
(min) (%) (%)
0,0 93 7
10,0 70 30
11,0 i'O 30
12,0 93 7
15,0 93 7

Solucin madre del estndar: Preparar soluciof\es 0;2 mM de ER cido N-Acetilneuramnico USP (NeuAc)y ERdjq N-
Glicolilneuramnico USP (NeuGc) en solucin amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5,2. Oiluir un volumen apro-
piado de esta solucin con solucin amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5,2,hasta obtener una 5oluci6n .madre
del estndar 0,02 mM.
Solucin madre del estndar interno: Preparar una sol11cin 0,1 mM de cido3~desoxi-o-glicero-o-galacto-2-nonulosni~
co (KDN) en solucinamortiguadorde acetatode sodk>20 mM, ajustada a 11npHdeS;2;
Soluciones estndar: Preparar segn se indica en la Tabla 3.
Tabla3
Volumen de
Solucin Amortiguado- Volumen de Solucin
V<!lumen. de Solucin ra de Acetat(! de Sodio Mad.-e de1I E.stJldar
Concentracin MadJ'C! de1I Estndar 20 mM, ptl $,;l. Interno
Estndar (M) {L) (L) (L)
1 .10 250 235 1.5
2 5 125 360 15
3 4 100 385 l.5
4 2 50 435 15
5 1 25 460 15
6 0,4 10 475 15

Solucin de aptitud del. sistema: Preparar soll.1ciones 3 M de NeuAc, NeuGc y KDN en solucin amortiguadora de aceta.;
to de sodio 20 mM, ajustadaa un pH de 5,2. Almacenar la Solucin.de aptitu(./ delsistema a ~70,
Solucin muestra: Pipetear y transferir un volumen de muestra de pnJeba equivalente a .015 llJg a un tubq de rriiq:oq.'ntr:
fuga. Dluir con solucin amortiguadora de acetato de sodio 2Q.mM 1 pH5,21 hasta unvplurrien total de475L. Co1:1firrr!~t
el pH con una tira de prueba y agregar10 Ldeneuraminidasade lOmi.lb.1nidades/L lncubardurante5horas aJ7~.
Agregar 15 L de Solucin madre del estr:Jndar interno. Mezclar el). un mel;clador de .vrticfil ytransferir la muestra ;un vial
para muestreador automtico.[NorA_,.Puede ser necesario unlgero ajuste en la preparacin de.lamu~stra depel1li:liehdo
de la muestra de prueba y la calidad de la enzima. Ajustar el tiempo de incubacin de manera correspondiente.]
Sistema cromatogrfico
(yer Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Detector amperomtrico integrado con electrodo qe oro
Columna: 4 mm x 25 cm; relleno L46 de 1 O m
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyeccin: 50 L
Usar la siguiente forma de onda para el detector electroqumico (ver la Tabla 4).
Tabla4
Tle1mpo Potencial
(s) (V) ll'lte1gracin
0,00 +0,10 -
0,20 +0,10 Inicio
0,40 +O, 1O Flha.I
0,41 -2,00 -
0,42 -2,00 -
0,43 +0,60 -
0,44 -0,10 -
0,50 -0,10 -
Anlisis
Muestras: Soluciones estndar, Solucin de aptitud del sistema y Solucin mL1estra
226 (129) Anticuerpos Monoclonales Teraputicos/ Pruebas Biolgicas USP 39

(130) ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LA PROTENA A

INTRODUCCIN

La Protena A se acopla a un soporte de resina con el fin de crear medios cromatogrficos de afinidad con la protena A,
usados comnmente en la fabricacin de anticuerpos monoclonales teraputicos recombinantes. La protena A natural se ob-
tiene del Staphylococcus aureus y contiene cinco regiones homlogas de unin a anticuerpos y una regin e-terminal de unin
a la pared celular. Adems de la protena A de origen natural, existe en el mercado protena A recombinante producida en
Escherichia coli, as como varias versiones de la protena modificadas por ingeniera, tambin fabricadas en forma recombinan-
te. Cuando se inmoviliza sobre una columna, la protena A proporciona un mtodo altamente eficiente y robusto para purificar
anticuerpos en diversas escalas. Sin embargo, la protena A inmovilizada en la columna (ligando de protena A) puede tambin
coeluir con el anticuerpo durante la purificacin, un efecto conocido a menudo como leaching de la protena A. Esta tendencia
aumenta a medida que envejece el medio cromatogrfico. Las versiones de la protena A modificadas por ingeniera podran
mejorar la tolerancia del medio al pH, pero no eliminan el leaching. La expectativa reglamentaria actual se centra en que la
protena A coeluida se elimine durante la purificacin de los anticuerpos para uso humano y los procesos de fabricacin se
validen de acuerdo con ello. Generalmente, durante el desarrollo y validacin del proceso se utiliza un Enzimoinmunoensayo
(ELISA) para asegurar la eliminacin eficiente de la protena A residual durante las etapas del proceso posteriores a la cromato-
grafa de afinidad con la protena A. Adicionalmente, el fabricante deber poseer un claro conocimiento y documentacin so-
bre la calidad de la resina y el ligando, mediante la calificacin de las materias primas y estudios de vida til de la columna.
El Captulo General (130) describe los atributos de calidad de los ligandos de protena A que se usan en los medios cromato-
grficos para la fabricacin de anticuerpos monoclonales teraputicos: Protena A; rProtena A; rProtena A, C-Cys; rProtena A,
B4, C-Cys.

PROTENA A

C199sH 3163N s97 697S3

46760
Secuencia N-terminal AQHDEA
Secuencia C-terminal IMDNK
La Protena A se obtiene del Staphylococcus aureus. La estructura se compone de una nica cadena de polipptidos que con-
tiene cuatro dominios de unin a lgG. Con excepcin de lgG 3, todas las dems lgG humanas se unen a la protena A. Cada
molcula de Protena A es capaz de unirse a dos molculas de lgG. Se fabrica como una solucin a granel con una concentra-
cin mayor de 20 mg de protena A por mL y una potencia de unin a lgG mayor de 95%. Dado que la Protena A se usa
como un material auxiliar en la fabricacin de frmacos teraputicos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los
de productos farmacuticos teraputicos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20 o menor.
Estndares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER Protena A USP.
Identificacin-
A: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificacin en rProtena A usando ER Protena A USP.
B: Unin a lgG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificacin en rProtena A usando ER Protena A USP.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos especficos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (130) Atributos de Calidad de la Protena A 227

:~ll'!Y~M1~'ilritdati:~iillit;8IM!li~lls~i;fi~il1ilii~lilliirNo contiene ms de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de

protena total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para Protena A se usa para describir la calidad de este material
auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuticas inyec-
tables en las cuales se usa la Protena A.]
Protena total (ver ~1J$P~(~~ii'11l~U!llli'l~lltiiimi~llifall!l)-Preparar muestras por triplicado para anlisis di-
luyendo Protena A hasta 3,0 mg por ml en Agua para Inyeccin. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm despus de
corregirla usando Agua para Inyeccin como blanco. Determinar la concentracin de protena con la siguiente ecuacin:
Concentracin de protena (mg por ml) = (A275/0, 149)
en donde A es la absorbancia de Protena A a la longitud de onda de 275 nm y O, 149 es la absortividad molar. Promediar los
resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es :::;5%.
Lmite de protena contaminante habitual y valoracin correspondiente-
Enterotoxina 8-La enterotoxina B se determina con un kit de enzimoinmunoensayo en microplaca disponible comercial-
mente.1 Los pocillos de las microplacas estn recubiertos con anticuerpos de oveja anti enterotoxina B. Las curvas estndar se
realizan utilizando el kit control de ELISA. Los controles negativos son pocillos recubiertos con suero de oveja no inmunizada. El
nivel de enterotoxina se determina a partir de la curva estndar. La especificacin para el nivel de la enterotoxina B es :::;1 ng
por mg de protena total.
Pureza cromatogrfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la Protena A
de los contaminantes de alto peso molecular.]
Fase mvil-Preparar una solucin de fosfato dicido de sodio 50 mM de pH 6,5 de la siguiente manera. Agregar 6,9O,1
g de fosfato dicido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de
sodio 5 M a un pH de 6,50 0,05. Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir con agua a volumen.
Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,22 m.
Solucin regeneradora de columna-Preparar una solucin de fosfato dicido de sodio O, 1 M de pH 3,0 de la siguiente mane-
ra. Agregar 1 3,8 O, 1 g de fosfato dicido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua hasta obtener 900
ml y ajustar con cido clorhdrico a un pH de 3,0O,1. Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 ml y diluir a
volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,22 m.
Solucin de almacenamiento de la columna-Mezclar 100 mL de metanol con 900 ml de agua.
Solucin de prueba-Diluir Protena A hasta aproximadamente 1 mg por mL con Fase mvil.
Estndares de calibracin-Usando Fase mvil, preparar por separado soluciones de 1 mg por mL de cada una de las siguien-
tes protenas: tiroglobulina (670 kDa), lgG (150 kDa), beta lactoglobulina (36 kDa) y lisozima (14 kDa).
Solucin estndar-Preparar una solucin que contenga 1 mg por mL de ER Protena A USP en Fase mvil.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 280 nm y una
columna de 7,8 mm x 30 cm rellena con material L33. Equilibrar la columna durante aproximadamente 30 minutos a 0,5 mL
de Fase mvil por minuto o hasta que se consiga una lnea base estable.
Procedimiento-Inyectar por separado 100 L de cada muestra y correrlas en la siguiente secuencia: Estndares de calibra-
cin, tiroglobulina, lgG, beta lactoglobulina y lisozima; la Solucin estndar; y la Solucin de prueba. Correr la secuencia tres
veces isocrticamente usando Fase mvil a 0,5 mL por minuto durante 30 minutos. La absorbancia se detecta a 280 nm. Anali-
zar los datos de los picos a 280 nm y seleccionar el tiempo de retencin (TR) con el rea de pico ms grande. Usando los datos
de los Estndares de calibracin, graficar la media del TR en funcin del logaritmo del peso molecular para obtener la curva
estndar. La pureza debe ser ~95% en el pico principal. Utilizar la frmula de la curva estndar para obtener los logaritmos de
los pesos moleculares de las Soluciones de prueba. Convertir los logaritmos de los pesos moleculares de las Soluciones de prueba
y de las Soluciones estndar a pesos moleculares reales. El peso molecular aparente de la protena A a partir de la Solucin estn-
dar est entre 156 y 205 kDa; y el de la Protena A a partir de la Solucin de prueba est dentro del mismo intervalo.
Limpieza y almacenamiento de la columna-Enjuagar la columna con 100 mL de Solucin regeneradora de columna y almace-
nar lavando con 100 mL de Solucin de almacenamiento de la columna.

rPROTENA A, C-CYS

C141gH2320N43zso>S4
34317,5 Da
Secuencia N-terminal AQHDEAQQNA
La rProtena A, C-Cys es una Protena A recombinante que carece de la parte C-terminal de unin a la membrana; en cam-
bio, se le ha introducido una cistena e-terminal para permitir una inmovilizacin dirigida. Tiene cinco dominios homlogos de
unin a lgG idnticos a los de la Protena A nativa y se produce usando Escherichia coli como clula anfitriona, seguido de puri-
ficacin por cromatografa convencional. La rProtena A, C-Cys se fabrica como una solucin a granel con una potencia de

1 Se puede obtener un kit de enzimoinmunoensayo adecuado de TECRA lnternational Pty Ltd., Australia (N SETVIA96).
228 (130) Atributos de Calidad de la Protena A/ Pruebas Biolgicas USP 39

unin a lgG mayor de 95%. Dado que la rProtena A, C-Cys se usa como material auxiliar en la fabricacin de frmacos tera-
puticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacuticos teraputicos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20 o menor.
Estndares de Referencia USP (11 )-fR Endotoxina USP. ER rProtena A, C-Cys USP.
Identificacin-
A: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, C-Cys USP.
B: Unin a /gG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, C-Cys
USP.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos especficos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
lllllllll~,~111111111-No contiene ms de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de
protena total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProtena A, C-Cys se usa para describir la calidad de este
material auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuti-
cas inyectables en las cuales se usa la rProtena A, C-Cys.]
Protena total (ver \llllipj!YJll~llllJD-Preparar muestras por triplicado para anlisis diluyendo rProtena A, C-Cys hasta
3,0 mg por mL en Agua para Inyeccin. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm despus de corregirla usando Agua
para Inyeccin como blanco. Determinar la concentracin de protena con la siguiente ecuacin:
Concentracin de protena (mg por mL) = (A275/0,22)
en donde A es la absorbancia de rProtena A, C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar. Prome-
diar los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es :'>2,5%.
Pureza cromatogrfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la rProtena A,
C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase mvil-Preparar una solucin de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la si-
guiente manera. Agregar 0,96 0,02 g de fosfato monobsico de sodio hidrato, 2,32 0,02 g de fosfato dibsico de sodio
dihidrato y 8,76 g 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con
hidrxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 0,05. Transferir esta solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen
con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 m.
Solucin de fOTA-Preparar una solucin de cido elitendiaminotetraactico (EDTA) 20 mM, disolviendo 0,74 0,02 g de
EDTA en 100 mL de Fase mvil.
Solucin de OTT-Preparar una solucin de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 0,02 g de DTI en 100 mL de
Fase mvil.
Solucin de pretratamiento-Preparar una solucin que contenga una mezcla de Solucin de EDTA y Solucin de DTT (1 :1,
v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de prueba-Diluir rProtena A, C-Cys 1 a 5 en Solucin de pretratamiento, y mezclar suavemente. Incubar la muestra
a 40 durante 60 minutos.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 214 nm y una
columna de 1O mm x 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volmenes de columna de
Fase mvil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto.
Procedimiento-Inyectar 100 L de Solucin de pretratamiento y dejar que la cromatografa contine durante por lo menos
dos volmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 L de la Solucin de prueba. La absorbancia se detecta a
214 nm. Integrar el pico principal de la corrida a partir de la Solucin de prueba y todos los dems picos que no estn presentes
en las corridas de la Solucin de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porcin de la rProtena A, C-Cys to-
mada, por la frmula:
1 OO(r/r,)
en donde r; es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de las respuestas de todos los picos: la suma de todas las
impurezas no es ms de 5%; y la Solucin de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 35 minutos.

rPROTENAA

C1917H3039Ns6s06ssS3
46 618
Secuencia N-terminal FLRPVE
La Protena A es un componente de la pared celular del Staphylococcus aureus. La Protena A recombinante (rProtena A)
consta de cinco dominios homlogos de unin (E, D, A, B, C) a la inmunoglobulina (lgG) seguidos de una secuencia parcial
del dominio X. Se expresa en Escherichia coli y se purifica por medio de un proceso de cromatografa en columna. Las colum-
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (1 30) Atributos de Calidad de la Protena A 229

nas de lgG no se usan en el proceso de purificacin. Se fabrica como una solucin a granel con una potencia de unin a lgG
mayor de 95%. Los mtodos de pruebas para su liberacin y las especificaciones se describen a continuacin. Dado que la
rProtena A se usa como un material auxiliar en la fabricacin de frmacos teraputicos recombinantes, los requisitos regulato-
rios difieren de los de productos farmacuticos teraputicos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-El etiquetado indica que el material proviene de ADN recombinante, as como el nmero de lote, las condicio-
nes de almacenamiento y la leyenda "Formulado en Agua para Inyeccin".
Estndares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER rProtena A USP.
Identificacin-
A: SDS-PAGE-
Marcador de peso molecular-Usar un marcador de peso molecular (MWM, por sus siglas en ingls) apropiado, que conten-
ga bandas de protenas entre 20 y 200 kDa.
Solucin de PBS-Preparar una solucin que contenga 8065,0 mg de cloruro de sodio y 200,0 mg de cloruro de potasio por
L de solucin amortiguadora de fosfato de sodio 0,01 M de pH 7,4.
Solucin amortiguadora de la muestra 4X2 -Disolver 0,666 g de tris-clorhdrico, 0,682 g de tris base, 0,800 g de dodecil
sulfato de litio (LDS, por sus siglas en ingls), 0,006 g de cido etilendinitrilotetractico (EDTA) y 4 g de glicerol en 8 ml de
agua; agregar 0,75 ml de solucin de azul brillante de Coomassie G-250 al 1% (ver Azul de Coomassie G-250 en Reactivos en
Reactivos, Indicadores y Soluciones) y 0,25 ml de solucin de rojo de fenol al 1%. Mezclar bien y ajustar el volumen con agua a
10 ml.
Solucin amortiguadora de la muestra 2X-Preparar una mezcla de Solucin amortiguadora de la muestra 4X y agua (1 :1 ).
Solucin amortiguadora de la muestra 7X-Preparar una mezcla de Solucin amortiguadora de la muestra 2X y agua (1 :1 ).
Solucin de ditiotreitol 7 M-Disolver O, 154 g de DL-ditiotreitol (DTT) en 1 ml de agua.
Solucin amortiguadora reductora de la muestra 2X-Mezclar 180 L de Solucin amortiguadora de la muestra 2X y 20 L de
Solucin de ditiotreitol 7 M.
Solucin amortiguadora de corrida 20X 3-Disolver 104,6 g de cido 3-(N-morfolino)propanosulfnico (MOPS, por sus siglas
en ingls), 60,6 g de tris base, 1Og de dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en ingls) y 3,0 g de EDTA en 400 ml de
agua. Mezclar bien y ajustar con agua hasta 500 ml.
Solucin amortiguadora de corrida 7X-Preparar una solucin de agua y Solucin amortiguadora de corrida 20X (19:1 ).
Solucin de tincin del gel-Preparar una solucin de azul brillante de Coomassie R-250 (ver Azul Brillante de Coomassie
R-250 en Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) que contenga una concentracin de 0,5 g por L en una mezcla de
agua, isopropanol y cido actico (6,5:2,5:1,0). Filtrar y almacenar a temperatura ambiente. No se recomienda la tincin con
plata.
Solucin decolorante-Mezclar 100 ml de cido actico con 900 ml de agua.
Preparacin estndar-Diluir ER rProtena A USP hasta 0,4 mg por ml con Solucin de PBS. Diluir adicionalmente esta solu-
cin 1 :1 con Solucin amortiguadora reductora de la muestra 2X e incubar en un tubo cerrado durante 5 minutos a 90. Mezclar
y centrifugar brevemente (quick spin) antes de cargar.
Preparacin de prueba-Diluir rProtena A con Solucin de PBS hasta 0,4 mg por ml. Proceder segn se indica en Preparacin
estndar, comenzando donde dice "Diluir adicionalmente".
Solucin combinada-Diluir rProtena A y ER rProtena A USP con Solucin de PBS hasta 0,8 mg por ml. Esta solucin contie-
ne 0,4 mg por ml de cada protena. Proceder segn se indica en Preparacin estndar, comenzando donde dice "Diluir adicio-
nalmente".
Montaje del aparato y gel de SDS-PAGE-Montar el aparato para el gel segn las instrucciones del fabricante. Asegurar en su
lugar la cua de presin del gel y llenar la cmara interna con aproximadamente 200 ml de Solucin amortiguadora de corrida
7X. Si no se verifican prdidas de lquido, verter 600 ml de Solucin amortiguadora de corrida 7X en la cmara externa. Sacar
cuidadosamente el peine del gel para sumergir los pocillos (wells) en la Solucin amortiguadora de corrida 7X. Cargar 1O L de
cada preparacin segn se indica a continuacin en Carga del gel en un gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10%.4
Carga del gel-Usar el siguiente esquema de carga del gel al correr una Preparacin de prueba (ver la Tabla 7). Cada Prepara-
cin de prueba se corre sola y como parte de la Solucin combinada que contiene la rProtena A y la ER rProtena A USP.
Tabla 1
Volumen Cantidad
de Carga de Carga
Calle Muestra (L) (g)
1 Solucin amortiquadora de Ja muestra 1X 10 N/D
2 MWM 20 N/D
3 Preparacin de prueba #1 10 2
4 Solucin combinada #1 10 4 (total)
5 Preparacin de prueba #1 10 2

2 La Solucin amortiguadora de la muestra 4X NuPAGE LOS se puede obtener de lnvitogen (N NPOOOl).

3 La Solucin Amortiguadora de Corrida 20X NuPAGE MOPS SDS se puede obtener de lnvitrogen (N NPOOO 1).
4 El gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10% se puede obtener de lnvitrogen (N NP0301 ).
230 (130) Atributos de Calidad de la Protena A/ Pruebas Biolgicas USP 39

Tabla 1 (Continuacin)
Volumen Cantidad
de Carga de Carga
Calle Muestra (L) (g)
--
6 Solucin amortiguadora de la muestra 1X 10 N/D
7 Preparacin estndar 10 2
-
8 MWM 20 N/D
9 - - -

10 - - --

Corrida del gel-Fijar el voltaje en 125 volts y correr a un voltaje constante. Correr los geles hasta que la banda de azul de
bromofenol quede aproximadamente a 5 mm del borde inferior del gel (aproximadamente de 120 a 140 minutos).
Tincin del gel-Verter aproximadamente 100 mL de Solucin de tincin del gel dentro del recipiente de tincin. Colocar el
gel dentro del recipiente de tincin y dejar que la solucin colorante cubra el gel por completo. Calentar en un horno de mi-
croondas durante 30 segundos. Colocar el recipiente de tincin en un agitador orbital y teir el gel durante 1 hora, agitando
suavemente.
Decoloracin-Escurrir la Solucin de tincin del gel y agregar suficiente Solucin decolorante al recipiente hasta cubrir el gel.
Colocar el recipiente en un agitador orbital y agitar a baja velocidad. Cambiar la Solucin decolorante segn sea necesario hasta
obtener un fondo transparente. Despus de decolorar, enjuagar bien el gel con agua y dejarlo en agua durante 1O minutos
antes del escaneo.
Escaneo del gel-Colocar un poco de agua en la placa de vidrio del escner y colocar los geles sobre una placa de vidrio
humedecida. Eliminar las burbujas. Escanear los geles realizando los ajustes apropiados.
Anlisis de los datos-Escoger una banda entre las bandas de 20 kDa y 30 kDa del MWM para calcular el porcentaje del fac-
tor de retencin. Trazar una lnea en una calle (la calle que contiene la Solucin amortiguadora de muestra 7X) desde el pocillo
hasta el pice (regin de mayor intensidad) de la banda escogida.
La longitud de esta lnea se designa como la distancia total (Dr). En las calles que contienen muestras, trazar una lnea desde
el pocillo hasta el pice de cada banda. Para cada banda, la longitud de esta distancia es la distancia de migracin (DM) en
mm. Registrar la Dr y la DM en la hoja de informe para cada pico o banda. La distancia total debe ser la misma para cada calle
en un gel. Calcular el porcentaje del factor de retencin (RF) de cada pico o banda principal y documentar en la hoja de infor-
me, usando la siguiente ecuacin:

%RF = DM/Dr x 100

Tambin para cada gel, registrar el nmero de bandas y el peso molecular aproximado de cada banda en cada muestra.
Aptitud del sistema-Todas las bandas entre 20 kDa y 70 kDa estn presentes. La calle que contiene la Solucin amortiguado-
ra de la muestra 7X no contiene ninguna banda.
Especificidad-La rProtena A tiene una banda principal y un peso molecular similar que corresponden a los de la ER rProte-
na A USP. La Solucin combinada presenta tambin una nica banda principal.
B: Unin a lgG-[NOTA-EI ensayo de unin a lgG es un mtodo funcional para determinar el porcentaje de rProtena A
capaz de unirse a inmunoglobulina policlonal humana inmovilizada. Dado que el porcentaje de rProtena A funcional en cada
lote no es menor de 95%, el ensayo mide la protena no unida en funcin de la protena total inyectada. Esto se realiza me-
diante la comparacin entre la absorbancia del flujo que atraviesa la columna y la absorbancia de una inyeccin desviada de la
misma.]
Pretratamiento de la muestra (desalinizacin)-Con el fin de eliminar cualquier componente de la solucin amortiguadora
que pudiera contribuir a la absorbancia en la fraccin "no unida" a lgG en la columna, las muestras se desalinizan con Solucin
A. La desalinizacin se puede llevar a cabo usando una columna de desalinizacin adecuadas, dependiendo de los volmenes
requeridos.
Columna lgG-Para este ensayo se requiere una columna Sepharose6 de 1 mL con lgG policlonal humana inmovilizada
(hlgG, por sus siglas en ingls). [NOTA-La columna de lgG requiere lavado cuando es nueva, cuando se han efectuado varios
ciclos de anlisis o despus de una falla de la aptitud del sistema. No es necesario efectuar el procedimiento de lavado de la
columna para cada inyeccin de muestra.]
Solucin A para lavado de la columna-Preparar una solucin de cido actico 0,5 M de pH 3,4, agregando 28,6 mL de ci-
do actico a un vaso de precipitados de 1000 mL, diluyendo a 900 mL con agua y ajustando a pH 3,4 con acetato de amonio.
Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro
de membrana de 0,45 m.
Solucin B para lavado de la columna-Preparar una solucin de Tris 50 mM de pH 7,6; cloruro de sodio 150 mM y Tween
20 al 0,05% por el siguiente procedimiento. Agregar 6,06 0,01 g de Tris y 8,77 0,01 g de cloruro de sodio a un vaso de
precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 ml y ajustar con hidrxido de sodio 0,5 M a un pH de 7,60 0,05. Transferir

s Las columnas Zeba se pueden obtener de Pierce; las columnas Nap-1 O se pueden obtener de GE Healthcare.
6 La columna HiTrap lgG Sepharose 6 FF se puede obtener de GE Healthcare (N 90-1003-97).
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (130) Atributos de Calidad de la Protena A 231

la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de mem-
brana de 0,45 m (solucin amortiguadora). Agregar 0,5 mL de Tween 20 a 1 L de la solucin amortiguadora y mezclar bien.
Solucin A-Preparar una solucin de fosfato monobsico de sodio 20 mM y cloruro de sodio 150 mM de pH 7,6 por el
siguiente procedimiento. Agregar 2,76 0,01 g de fosfato monobsico de sodio hidrato y 8,77 0,01 g de cloruro de sodio a
un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de sodio 5 M a un pH de 7,60 0,05.
Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro
de membrana de 0,45 m.
Solucin 8-Preparar una solucin de cido fosfrico 100 mM de pH 2,8 por el siguiente procedimiento. Agregar 6,8 mL de
cido fosfrico a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de potasio 2 M a un
pH de 2,80 0,05. Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua.
Fase mvil-Usar mezclas variables de Solucin A y de Solucin B, segn se indica en el Sistema cromatogrfico. Hacer ajustes
si fuera necesario (ver Aptitud del Sistema en Cromatografa (621 )).
Preparacin estndar-Descongelar el ER rProtena A USP y usarlo directamente.
Preparacin de prueba-Preparar una solucin de 4,0 a 6,0 mg por mL de rProtena A en Solucin A.
Sistema cromatogrfico-Equipar el cromatgrafo de lquidos con un detector a 280 nm y una columna de 1 mL con hlgG
inmovilizada. Equipar un cromatgrafo con una vlvula que permita desviar el flujo de la columna. Cada anlisis consta de una
serie de dos inyecciones, una donde la muestra se inyecta en la columna y otra donde la muestra se desva de la columna y
fluye directamente al detector. Efectuar tres anlisis repetidos. Programar el cromatgrafo (ver la Tabla 2) del siguiente modo.
Tabla 2
Velocidad de flujo Tiempo Solucin A Solucin 8 Posicin de la
(ml por minuto) (minutos) (%) (%) Vlvula Elucln
1,0 0-6 100 o columna reequilibrio
1,0 6-12 100~0 0~100 columna reequilibrio
1,0 12-22 100 o columna equilibrio
0,4 22-25 100 o columna equilibrio
0,4 (muestra
inyectada) 25-35 100 o columna isocrtica
1,0 35-49 100~0 0~100 columna regeneracin
1,0 49-63 0~100 100~0 columna reequilibrio
1 63-65 100 o desvo equilibrio
0,4 65-68 100 o desvo equilibrio
0,4 (muestra
inyectada) 68-75 100 o desvo isocrtica

Inyectar en el cromatgrafo la Preparacin estndar, registrar el cromatograma y calcular el porcentaje de unin a hlgG segn
se indica en el Procedimiento: el porcentaje de unin a hlgG es:?: 95% y la desviacin estndar relativa para el anlisis repetido
no es ms de 1%.
Procedimiento-Inyectar en el cromatgrafo un volumen (aproximadamente 100 L) de la Preparacin de prueba. Registrar
el cromatograma y medir las respuestas de los picos. Calcular el porcentaje de actividad de unin a la hlgG, por la siguiente
frmula:
100 -1 OO(rcfr8)

en donde re es la respuesta del pico del material no unido obtenido a partir de la inyeccin de la columna y r8 es la respuesta
del pico obtenido a partir de la inyeccin desviada de la columna. La unin a hlgG no es menor de 95% en cada anlisis repe-
tido de la Preparacin de prueba. Informar el valor promedio de los tres anlisis repetidos.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos especficos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
Pru~badeEn~ot~7Gfnas 0 $adenaf:~s(8$}ix~it~~~~li~:~>-No contiene ms de 0,5 Unidades USP de Endotoxinas por mg
de protena total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProtena A se usa para describir la calidad de este mate-
rial auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuticas
inyectables en las cuales se usa la rProtena A.]
Protena total (ver (857}. (1, 01,~y,201 )-Preparar muestras por triplicado para anlisis diluyendo rProtena A hasta 3,0 mg
por mL en Agua para Inyeccin. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm despus de corregirla usando Agua para Inyec-
cin como blanco. Determinar la concentracin de protena con la siguiente ecuacin:
Concentracin de protena (mg por mL) = (A275 /0, 165)

en donde A es la absorbancia de rProtena A a la longitud de onda de 275 nm y O, 165 es la absortividad molar. Promediar los
resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es s5%.
 232 (1 30) Atributos de Calidad de la Protena A/ Pruebas Biolgicas USP 39

Anlisis espectral UV-Diluir rProtena A a 1 mg por mL en Agua para Inyeccin. Usar un espectrofotmetro de barrido UV
con Agua para Inyeccin como blanco, obtener los barridos espectrales en el intervalo de 240 a 360 nm. De los datos resultan-
tes, calcular el valor de la absorbancia a 270 nm y el cociente de absorbancias a 270 y a 250 nm (es decir, E270/E250): la
absorbancia a 270 nm de una solucin de 1 mg por mL de rProtena A en Agua para Inyeccin est dentro del intervalo O, 14-
0,20.
Pureza cromatogrfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la rProtena A
de los contaminantes de alto peso molecular.]
Fase mvil-Preparar una solucin de fosfato de sodio 0,3 M de pH 7, mezclando soluciones de fosfato monobsico y dib-
sico de la siguiente manera. Pesar 21,3 O, 1 g de fosfato dibsico de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obte-
ner una solucin de fosfato dibsico de sodio 0,3 M (Solucin 7). En otro recipiente, pesar 18,0O,1 g de fosfato monobsico
de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obtener una solucin de fosfato monobsico de sodio 0,3 M (Solucin 2).
Calibrar un medidor de pH usando calibradores de pH 7 y 1O. Agregar 400 mL de Solucin 7 a un vaso de precipitados de 1 L.
Transferir la sonda de pH al vaso de precipitados. Agregar lentamente la Solucin 2 hasta que el pH sea 7,0 O, 1. Pasar la
solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 m.
Solucin estndar-Diluir ER rProtena A USP hasta 1 mg por mL en Fase mvil.
Solucin de prueba-Diluir rProtena A hasta 1 mg por mL en Fase mvil.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 214 nm y a 280
nm, y una columna de 9,4 mm x 25 cm rellena con material L35. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar
la Solucin estndar segn se indica en el Procedimiento: la rProtena A presenta un nico pico principal aproximadamente a los
9 minutos y el porcentaje de rea es 98% a 214 nm y 95% a 280 nm.
Procedimiento-Inyectar en el cromatgrafo 100 L de la Solucin de prueba, correr isocrticamente durante 15 minutos y
registrar el cromatograma. Los valores para la rProtena A a partir de la Solucin de prueba corresponden a las especificaciones
del ER rProtena A USP a partir de la Solucin estndar.
lsoformas-
Solucin estndar-Descongelar ER rProtena A USP y usarlo directamente.
Solucin de prueba-Diluir rProtena A a 4 mg por mL en Agua para Inyeccin.
Marcadores de pi-Usar un set de marcadores adecuado que contenga marcadores entre 3 y 10.7
Gel de IEF (isoelectroenfoque)-Usar un gel adecuado con intervalo de pH 3-1 O y un tamao de 100 x 125 mm. 8
Procedimiento-Aplicar alcuotas de 5 L de los Marcadores de pi de la Solucin de prueba y de la Solucin estndar al gel de
IEF y correrlas a 1W de potencia durante aproximadamente 1O minutos. Retirar la mscara de aplicacin de la muestra y sumi-
nistrar potencia, con enfriamiento simultneo entre 5 y 1O de la cmara de enfoque, durante 40 minutos a 1OOOV, 20 mA y
25W. Fijar el gel de IEF durante 1 hora en cido tricloroactico al 20%, luego teirlo con una tincin adecuada para geles de
IEF. 9 Por ltimo, lavar y secar el gel: el coeficiente de correlacin para la lnea de mejor ajuste para los Marcadores de pi en
funcin de su migracin en cm es 0,990, y la rProtena A a partir de la Solucin estndar presenta una nica banda principal
dentro del intervalo de pi de 4,6 a 5,2. En la Solucin de prueba se observa una nica banda que corresponde al intervalo de pi
de la Solucin estndar.
Lmite de Triton X-100-
Fase mvil-Preparar una mezcla filtrada y desgasificada de agua y acetonitrilo (60:40).
Solucin de prueba-Diluir rProtena A a 5 mg por mL en Agua para Inyeccin.
Solucin de Triton X- 700 con una cantidad conocida agregada-Combinar 5 mg por mL de ER rProtena A USP y Triton X-100
al O, 15% (9:1) para obtener una solucin con una concentracin conocida de rProtena A y Triton X-100 al 0,015%.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 214 nm y 280
nm y una columna de 4,6 mm x 25 cm rellena con material L11 de 5 m. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cro-
matografiar la Solucin de Triton X-100 con una cantidad conocida agregada segn se indica en el Procedimiento: el Triton X-100
tiene un nico pico principal aproximadamente a los 9 minutos y la rProtena A presenta un pico menor o indetectable con el
mismo tiempo de retencin.
Procedimiento-Inyectar en el cromatgrafo aproximadamente 100 L de la Solucin de prueba, correr isocrticamente du-
rante 35 minutos y registrar el cromatograma. La absorbancia se detecta a 223 nm: el pico de Triton X-1 00 no es mayor de
0,015% (equivalente a la Solucin de Triton X-7 00 con una cantidad conocida agregada).

Cambio en la redaccin:

rPROTENA A, B4 , C-CYS

C1 i nH18s4N3263s4S1
26747,6 Da
Secuencia N-terminal AQGTVDAKFD

7 Los marcadores de pi en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de BioRad (N 161-031 O).

8 Los geles de IEF en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de Cambrex (N 56015).
9 ISS Pro-Blue se puede obtener de lntegrated Separation Systems.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (130) Atributos de Calidad de la Protena A 233

La rProtena A, B4 , C-Cys es una protena recombinante derivada del dominio B de la Protena A. El dominio de la Protena A
ha sido estabilizado al lcali por mutagnesis sitio-especfica y multimerizado en un tetrmero con una cistena (-terminal para
permitir una inmovilizacin dirigida. La rProtena A, B4, C-Cys se produce usando Escherichia coli como clula anfitriona, segui-
do de purificacin por cromatografa convencional. La rProtena A, B4, C-Cys se fabrica como una solucin a granel con una
potencia de unin a lgG mayor de 95%. Dado que la rProtena A, 84 , C-Cys se usa como un material auxiliar en la fabricacin
de frmacos teraputicos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacuticos teraputicos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20 o menor.
Estndares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER rProtena A, 841 C-Cys USP.
Identificacin-
A: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, 84 , C-Cys
USP.
B: Unin a lgG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, 84 , C-Cys
USP.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos especficos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
~~i!'i',!fji!llilll~Mll~Mllllmll~llllJ!llltl-No contiene ms de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de
protena total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProtena A, 84, C-Cys se usa para describir la calidad de este
material auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuti-
cas inyectables en las cuales se usa la rProtena A, B4 , C-Cys.]
Protena total (ver ,,~~J~';li~iiilil)-
Solucin amortiguadora de formulacin-Preparar una solucin de fosfato de potasio 0,02 M de pH 7,0, que contenga cloru-
ro de potasio 0, 15 M y cido elitendiaminotetraactico (EDTA) 2 mM de la siguiente manera. Agregar 2,72 0,01 g de fosfato
monobsico de potasio anhidro, 11, 18 g 0,22 g de cloruro de potasio y 0,744 0,02 g de EDTA en un vaso de precipitados
de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de sodio 1 M a un pH de 7,00 0,05. Transferir la solucin a un
matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 m.
Preparacin de prueba-Diluir la rProtena A, 84 , C-Cys a 3,0 mg por mL con Solucin amortiguadora de formulacin.
Procedimiento-Preparar muestras por triplicado para anlisis. Medir la absorbancia de cada Preparacin de prueba a 275 nm
despus de corregirla usando Solucin amortiguadora de formulacin como blanco. Determinar la concentracin de protena
con la siguiente ecuacin:
Concentracin de protena (mg por mL) = (A275/0,22)
en donde A es la absorbancia de rProtena A, B4 , C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar.
Promediar los resultados triplicados y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es ~2,5%.
Pureza cromatogrfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la rProtena A,
B4 , C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase mvil-Preparar una solucin de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la si-
guiente manera. Agregar 0,96 0,02 g de fosfato monobsico de sodio hidrato, 2,32 0,02 g de fosfato dibsico de sodio
dihidrato, y 8,76 g 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con
hidrxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 0,05. Transferir esta solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen
con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 m.
Solucin de EDTA-Preparar una solucin de EDTA 20 mM, disolviendo 0,74 0,02 g de EDTA en 100 mL de Fase mvil.
Solucin de OH-Preparar una solucin de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 0,02 g de DTI en 100 mL de
Fase mvil.
Solucin de pretratamiento----Preparar una solucin que contenga una mezcla de Solucin de EDTA y Solucin de DTT (1 :1,
v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de prueba-Diluir rProtena A, B4 , C-Cys 1 a 5 en Solucin de pretratamiento y mezclar suavemente. Incubar la mues-
tra a 40 durante 60 minutos.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 214 nm y una
columna de 1O mm x 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volmenes de columnna de
la Fase mvil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto.
Procedimiento-Inyectar 100 L de Solucin de pretratamiento, y dejar que la cromatografa contine durante por lo menos
dos volmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 L de la Solucin de prueba. La absorbancia se detecta a
los 214 nm. Integrar el pico principal a partir de la corrida de la Solucin de prueba y todos los dems picos que no estn pre-
sentes en las corridas de la Solucin de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porcin de rProtena A, 84, C-
-Cys, por la frmula:
1OO(r/r,)
en donde r; es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de todas las respuestas de todos los picos: la suma de
todas las impurezas no es ms de 5%; y la Solucin de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 37 minutos.
234 (151) Prueba de Pirgenos / Pruebas Biolgicas USP 39

(151) PRUEBA DE PIRGENOS

La prueba de pirgenos est diseada para limitar a un nivel aceptable el riesgo de reaccin febril en pacie01tes a los que se
inyecta un determinado producto. La prueba mide el aumento de la temperatura corporal en conejos a los que se iny0cta :..::;a
solucin de prueba por va intravenosa. Este ensayo est diseado para productos que pueden ser tolerados por conejos en
una dosis que no exceda de 1 O mL por kg del peso del conejo, inyectados por va intravenosa durante un perodo de no ms
de 1O minutos. En el caso de productos que requieren una preparacin preliminar o que estn sujetos a condicione:; eseciales
de administracin, se deben seguir las indicaciones adicionales establecidas en la monografa individual o, en el caso de anti-
biticos o de productos biolgicos, seguir las indicaciones adicionales establecidas en las reglamentaciones federales (ver Pro-
ductos Biolgicos (1041) ).

APARATOS Y DILUYENTES

Despirogenar jeringas, agujas y material de vidrio por calentamiento a 250 durante no menos de 30 minutos o utilizando
otro mtodo adecuado. Todos los diluyentes y soluciones para lavado y enjuague de los dispositivos o sistemas de inyeccin
parenteral, se deben tratar de manera que garanticen la esterilidad y la ausencia de pirgenos. Se deben realizar peridica-
mente pruebas de control de pirgenos en porciones representativas de los diluyentes y soluciones que se emplean para lava-
do y enjuague de los aparatos. Cuando se especifique el uso de Inyeccin de Cloruro de Sodio como diluyente, emplear una
Inyeccin que contenga 0,9 por ciento de NaCI.

REGISTRO DE LA TEMPERATURA

Emplear dispositivos sensores de temperatura exactos, tales como termmetros clnicos, sondas termomtricas u otra clase
de sonda calibrada, que aseguren una exactitud de 0, 1y que faciliten la lectura mxima en menos de 5 minutos. Insertar la
sonda sensora de temperatura en el recto del conejo, a una profundidad de no menos de 7,5 cm y, durante un perodo no
menor que el previamente estimado como suficiente, registrar la temperatura corporal del animal de prueba.

ANIMALES DE PRUEBA

Emplear conejos adultos y sanos. Mantenerlos individualmente er.i un lugar sin perturbaciones que los puedan excitar y a
una temperatura uniforme entre 20 y 23, con una variacin mxima de 3 respecto de la temperatura seleccionada. Antes
de emplear por primera vez un conejo en una prueba de pirgenos, se lo debe acondicionar durante un perodo de no ms de
7 das, realizando un ensayo simulado que incluya todos los pasos indicados en el Procedimiento, pero omitiendo la inyeccin.
No utilizar el mismo conejo para pruebas de pirgenos ms de una vez cada 48 horas, ni antes de que hayan transcurrido dos
semanas despus de una elevacin de la temperatura corporal de 0,6 o ms, mientras es sometido a la prueba de pirgenos o
despus de administrarle una sustancia considerada pirognica.

PROCEDIMIENTO

El ensayo se debe llevar a cabo en un rea destinada exclusivamente a la prueba de pirgenos, con condiciones ambientales
similares a las del espacio donde estn alojados los conejos y libres de perturbaciones que puedan excitarlos. Durante el pero-
do de prueba se les suspender todo alimento. El acceso al agua est permitido en todo momento pero podr restringirse du-
rante la prueba. Si el dispositivo empleado para medir la temperatura rectal debe dejarse insertado durante el perodo de prue-
ba, sujetar los conejos mediante sujetadores en el cuello, no muy ajustados, que les permita adoptar una postura natural de
descanso. Determinar la "temperatura control" de cada conejo no ms de 30 minutos antes de la inyeccin de la dosis de
prueba: sta es la temperatura base para determinar si existe aumento provocado por la inyeccin de una solucin de prueba.
En cada uno de los grupos de conejos de prueba, emplear solamente aquellos cuya temperatura control no vare ms de 1
respecto de los dems. Descartar los conejos cuya temperatura corporal exceda de 39,8.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa correspondiente, inyectar a cada uno de tres conejos, en una
vena de la oreja, 1O ml de la solucin de prueba por kg de peso, completndose cada inyeccin dentro de los 1 O minutos
desde el inicio de su administracin. La solucin de prueba es o bien el producto, reconstituido de acuerdo con las especifica-
ciones de la etiqueta, o bien el material en anlisis, tratado segn se indica en la monografa individual e inyectado en la dosis
especificada en la misma. Para la prueba de pirgenos de dispositivos mdicos o sistemas de inyeccin, lavar o enjuagar las
superficies del dispositivo o sistema que entran en contacto con el material administrado en forma parenteral, o con el sitio de
inyeccin, o con los tejidos internos del paciente. Asegurarse de que todas las soluciones de prueba estn protegidas de la
contaminacin. Administrar la inyeccin despus de entibiar la solucin de prueba a una temperatura de 37 2. Registrar la
temperatura a intervalos de 30 minutos durante el perodo de 1 a 3 horas posteriores a la inyeccin.
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (161) Dispositivos Mdicos 235

INTERPRETACIN Y CONTINUACIN DE LA PRUEBA

Considerar cualquier disminucin de la temperatura como elevacin cero. El producto cumple con los requisitos de la prue-
ba para determinar la ausencia de pirgenos si ningn conejo muestra un aumento de 0,5 o ms por encima de su tempera-
tura de control respectiva. Si algn conejo muestra un aumento de 0,5 o ms, continuar la prueba empleando otros cinco
conejos. El material en anlisis cumple con los requisitos para determinar la ausencia de pirgenos cuando no ms de tres de
los ocho conejos tienen un aumento de temperatura de 0,5 o ms y si la suma del aumento mximo de las temperaturas
individuales de los ocho conejos no excede de 3,3.

PRODUCTOS FARMACUTICOS RADIOACTIVOS

Dosis de Prueba para Productos Preformulados, Listos para Usar Marcados con Radioactividad
ALBMINA AGREGADA Y OTROS PRODUCTOS QUE CONTIENEN PARTCULAS

Para la prueba de pirgenos en conejos, diluir el producto con Inyeccin de Cloruro de Sodio a no menos de 100 Ci por
mL e inyectar a cada conejo una dosis de 3 mL por kg de peso corporal.

OTROS PRODUCTOS

Cuando la Vida Media Fsica de los Radionucleidos Es de Ms de Un Da-Calcular el volumen mximo del producto
que puede inyectarse a una persona. Este clculo debe tener en cuenta la dosis radioactiva mxima recomendada del produc-
to, en Ci, y la valoracin de la radioactividad, en Ci por mL, del producto a la hora o fecha de su caducidad. Utilizando esta
informacin, se calcula el volumen de la dosis mxima por kg en una persona de 70 kg.
Para la prueba de pirgenos en conejos, inyectar a cada conejo un mnimo de 1O veces esta dosis por kg de peso corporal.
Si fuera necesario, diluir la dosis con Inyeccin de Cloruro de Sodio. El volumen total inyectado por conejo no debe ser menor
de 1 mL ni mayor de 1O mL de solucin.
Cuando la Vida Media Fsica de los Radionucleidos Es de Menos de Un Da-Para productos cuya etiqueta indica que
contienen radionucleidos con una vida media inferior a 1 da, los clculos de dosificacin son idnticos a los descritos en el
primer prrafo en Otros Productos. Se puede autorizar la distribucin de estos productos antes de terminar la prueba de pirge-
nos en conejos, pero las pruebas se deben comenzar antes de las 36 horas de la autorizacin a ms tardar.

Dosis de Prueba para Componentes de Productos Farmacuticos o Reactivos a Ser Marcados

Se establecen los siguientes requisitos para la dosis de prueba de reactivos a ser marcados o reconstituidos antes del uso por
agregado directo de soluciones radioactivas tales como Inyeccin de Pertecnetato de Sodio Te 99 m, por ejemplo: "equipos
fros".
Se debe suponer que el contenido total del vial de reactivo no radioactivo se inyectar a una persona de 70 kg o que se
inyectar el 1 / 70 del contenido total por kg. Si el contenido es seco, reconstituirlo con un volumen medido de Inyeccin de
Cloruro de Sodio.
Para la prueba de pirgenos en conejos, inyectar ( 1 / 7) del contenido de un vial por kg de peso corporal de cada conejo. La
dosis mxima por conejo ser igual al contenido completo de un solo vial. El volumen total inyectado por conejo no debe ser
de menos de 1 mL ni de ms de 1O mL de solucin.

(161) DISPOSITIVOS MDICOS-PRUEBAS DE ENDOTOXINAS

BACTERIANAS Y PIRGENOS

INTRODUCCIN

Los mtodos y requisitos de este captulo se aplican a dispositivos o equipos que entran en contacto directo o indirecto con
el sistema cardiovascular, el sistema linftico o el lquido cefalorraqudeo y que se etiquetan como estriles y apirgenos. Esto
incluye entre otros a los siguientes dispositivos:
Vas para el paso de lquidos de catteres y de equipos de administracin tales como equipos de administracin de solu-
ciones, conjuntos de extensin, conjuntos de transferencia, conjuntos de administracin de sangre, catteres intraveno-
sos, implantes, tubuladuras y accesorios de oxigenadores extracorpreos, tubuladuras para dilisis, catteres de liberacin
intramuscular de frmacos, y ensamblajes para transfusin e infusin
236 (161) Dispositivos Mdicos/ Pruebas Biolgicas USP 39

Dispositivos mdicos lquidos tales como dializados

Dispositivos mdicos implantables tales como vlvulas cardacas, injertos vasculares, otros dispositivos mdicos que pue-
den entrar en contacto con la sangre o lquido cefalorraqudeo y que llevan una declaracin de apirogenicidad
Geles con una declaracin de apirogenicidad incluyendo matrices seas desmineralizadas y sistemas de liberacin de fr-
macos

ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Proceder segn se indica en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) para los parmetros de valoracin los procedimientos,
estndares y controles de la prueba de endotoxinas bacterianas (PEB) de las pruebas de coagulacin, cinticas y de punto final,
usando el eluato del dispositivo mdico en lugar de la Solucin Muestra.

DEFINICIONES

Lmite de endotoxina
El lmite de endotoxina para el dispositivo terminado es no ms de 20 Unidades USP de Endotoxina por dispositivo y no
ms de 2, 15 Unidades USP de Endotoxina para dispositivos que entran en contacto con lquido cefalorraqudeo.
Para dispositivos que entren en contacto directo o indirecto con el entorno intraocular, se puede aplicar un lmite menos
estricto de endotoxina.
El lmite de endotoxina para el extracto del dispositivo en Unidades de Endotoxina/mL se calcula de la siguiente manera:

(K X N)/V
K = lmite para cada dispositivo
N = nmero de dispositivos analizados
V= volumen total del extracto
Kit: Un kit se define como un conjunto de dispositivos individuales en su envase primario o una variedad de dispositivos rela-
cionados. Cada tipo individual de dispositivo puede tener su propio lmite de endotoxina y debe analizarse y evaluarse indivi-
dualmente [ver la Tabla 7. Seleccin de Unidades de Productos para Anlisis-(Referencia ANSl/AAMI ST72)].
Tabla 1. Seleccin de Unidades de Productos para Anlisis
Producto Artculo para Anlisis
Dispositivo mdico individual en un envase primario en el que cada dispo-
sitivo mdico se usa individualmente en la prctica clnica Dispositivo mdico individual
Conjunto de componentes en un envase primario en el que los compo-
nentes se ensamblan como producto y se usan en conjunto en la prcti-
ca clnica Combinacin de componentes
Nmero de dispositivos mdicos idnticos en un envase primario en el
que cada dispositivo mdico se usa independientemente en la prctica
clnica Dispositivo mdico individual tomado del envase primario
Kit de dispositivos mdicos relacionados con un determinado procedi-
miento, donde cada dispositivo mdico se usa independientemente en la Cada tipo de dispositivo mdico que presenta una declaracin de apiro-
prctica clnica y donde cada dispositivo mdico puede tener un lmite genicidad o
de endotoxina diferente Todos los artculos juntos

Lambda {le): A es la sensibilidad del mtodo de prueba para tcnicas de coagulacin. Para la tcnica turbidimtrica o cromo-
gnica, A es igual a la concentracin ms baja de endotoxina en la curva estndar de referencia.
Familias de productos: Para los propsitos de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas, las familias de productos pueden defi-
nirse con respecto a los materiales de construccin comunes y/o componentes comunes. Se debe justificar y documentar la
seleccin de los miembros de la familia. Si una familia de productos contiene dispositivos de muchos tamaos, se selecciona el
dispositivo con declaracin de apirogenicidad con mayor rea superficial como el miembro representativo de la familia que se
va a usar en la prueba de aptitud.
Solucin de extraccin o de enjuague: Para extraer o enjuagar el dispositivo mdico, se usa Agua para Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas [ver (85), Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)] u otro disolvente adecuado que no interfiera con
la Prueba de Endotoxinas Bacterianas.
Muestreo
1. Muestra-Una muestra para el anlisis de un producto final debe estar en su configuracin y envasado finales, incluyendo
todos los componentes que constituyen el dispositivo mdico final.
2. Muestreo representativo-Un muestreo representativo es un plan de muestreo que se crea y justifica basndose en la supo-
sicin de que el proceso de fabricacin se encuentra validado y controlado.
3. Tamao de Ja Muestra-El nmero de dispositivos seleccionado para el anlisis de rutina depende del tamao del lote,
nivel de control, consideraciones estadsticas y desempeo histrico. En la mayora de los casos, se debe analizar cada lote
de producto usando un nmero de muestras apropiado, no ms de 1O, tomadas de manera aleatoria para representar la
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (161) Dispositivos Mdicos 237

calidad del lote. Los planes de muestreo alternativos que usen muestras de pequeos tamaos o que no analicen cada
lote de producto deben estar claramente definidos y deben estar fundamentados/justificados por una evaluacin de ries-
gos bien establecida.
4. Muestras previas y posteriores a la esterilizacin-Al calificar una valoracin de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas para
muestras previas a la esterilizacin, se debe demostrar la equivalencia con los resultados de las pruebas en las muestras
posteriores a la esterilizacin, para asegurar que la manipulacin durante y luego de la esterilizacin no impacte adversa-
mente sobre la exactitud del resultado de la prueba. El anlisis previo a la esterilizacin es inapropiado para productos que
favorecen el crecimiento microbiano.
Anlisis de aptitud (tambin conocido como prueba de factores de interferencia): Los estudios de aptitud de los extrac-
tos del dispositivo estn diseados para asegurar que el extracto del dispositivo que se est analizando no impacte adversa-
mente sobre la exactitud del resultado de la prueba ya sea por a) ocasionar que la valoracin subestime el nivel de endotoxina
(inhibicin) o b) sobreestime el nivel de endotoxina (potenciacin).

REACTIVOS Y SOLUCIONES DE PRUEBA

Ver el captulo (85).

REQUISITOS PREVIOS PARA EL ANLISIS

Aparato: Todo equipo usado en el proceso de extraccin o anlisis debe calificarse y/o calibrarse apropiadamente. Los equi-
pos incluyen, entre otros, baos de agua, bloques de calentamiento, pipeteadores mecnicos (pipeteadores fijos, ajustables y
de repeticin), termmetros y lectores de placas/tubos/cartuchos.
Despirogenar todo el material de vidrio y dems materiales termoestables en un horno de aire caliente usando un proceso
validado. Si se emplean aparatos de plstico como microplacas y puntas de pipeta para pipeteadores automticos, usar apara-
tos que demuestren estar exentos de endotoxinas detectables y que no interfieran con la prueba.
Los analistas deben estar apropiadamente capacitados para llevar a cabo la valoracin.
La sensibilidad de la valoracin debe confirmarse segn lo descrito en las secciones Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad
Declarada del Usado para reactivos de la tcnica coagulacin y Garanta de los Criterios para la Curva Estndar para mtodos
cuantitativos, del captulo (85). La confirmacin de la sensibilidad de la valoracin debe llevarse a cabo cuando se usa una nue-
va partida de reactivo (lisado o endotoxina) o cuando se presenta algn cambio en las condiciones de la prueba que pudiera
afectar el resultado de la misma.

PREPARACIN DE LOS DISPOSITIVOS: MTODOS ESTNDAR

Lmite de endotoxina: El lmite de endotoxina para la solucin de extraccin o de enjuague es:

(K X N)/V
K = cantidad de endotoxina permitida por dispositivo (20 Unidades de Endotoxina por dispositivo; 2, 15 para dispositivos
intratecales)
N = nmero de dispositivos analizados
V= volumen total del extracto o enjuague
NOTA-El volumen del enjuague o extracto puede ajustarse segn el tamao y la configuracin del dispositivo.
El lquido de extraccin estndar para extraer, enjuagar o empapar dispositivos mdicos es Agua para Prueba de Endotoxinas
Bacterianas (ver el captulo (85)). Si fuera necesario, se pueden usar otros disolventes despus de que se haya demostrado que
no interfieren con el desempeo de la valoracin. El dispositivo completo, cuando indica una declaracin de apirogenicidad, o
todos los componentes del mismo con declaracin de apirogenicidad, incluyendo las vas de paso de lquidos, deben entrar en
contacto con el lquido de extraccin durante todo el transcurso de la extraccin.
El mtodo de extraccin estndar consiste en empapar o sumergir el dispositivo o purgar la va de paso del lquido con lqui-
do de extraccin calentado a 371,0, manteniendo el lquido de extraccin en contacto con las superficies relevantes duran-
te no menos de 1 hora. Se pueden usar mtodos alternativos de extraccin o enjuague, pero debe demostrarse que son equi-
valentes o mejores que el mtodo estndar. Por lo general, los extractos obtenidos a partir de dispositivos mdicos individuales
se combinan para el anlisis.
Aptitud: La aptitud de la valoracin de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas debe demostrarse para cada producto o familia
de productos. El nmero de partidas de producto seleccionado para el estudio de aptitud refleja el nivel de control del proceso
y debe justificarse.
En el caso de la prueba de aptitud, se considera que los extractos de los dispositivos mdicos son las soluciones muestra que
se estn analizando, y se analizan segn lo descrito en el captulo (85) para la tcnica seleccionada en la seccin Prueba de
Factores de Interferencia.
Si fuera necesario, ajustar el pH de la solucin que se va a examinar (o una dilucin de la misma) de modo que el pH de la
mezcla del lisado y la solucin muestra caiga dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, que general-
238 (161) Dispositivos Mdicos/ Pruebas Biolgicas USP 39

mente es un intervalo de pH 6,0-8,0. El pH puede ajustarse usando un cido, base, o una solucin amortiguadora adecuada,
segn lo recomendado por el fabricante del lisado. Se pueden preparar cidos y bases a partir de concentrados o slidos con
Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (ver el captulo (85)) en recipientes exentos de endotoxinas detectables. Se debe
demostrar que las soluciones amortiguadoras estn exentas de endotoxinas detectables y factores de interferencia.
Si se determina que la solucin de enjuague o extraccin sin diluir no es adecuada para realizar la prueba segn el captulo
(85), se puede repetir la prueba de factores de interferencia usando dilucin, o un mtodo que neutralice o elimine la sustancia
i nterferente.
Si se sospecha la presencia de una interferencia de glucano, se permite el uso de un agente bloqueante de glucanos o un
lisado especfico para la endotoxina.
Se permite la dilucin en Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (ver el captulo (85)) u otro disolvente validado por un
factor que no exceda la mxima dilucin vlida (MDV). La mxima dilucin vlida para dispositivos mdicos es la siguiente:

MDV = Lmite de endotoxina (de la solucin de enjuague o extraccin en Unidades de Endotoxina/mL)/A,

A, = sensibilidad del mtodo de prueba en Unidades de Endotoxina/mL

La interferencia se puede resolver mediante el tratamiento adecuado del extracto del dispositivo. Los mtodos para resolver
la interferencia y la calificacin de dichos tratamientos se describen en el captulo (85). Para establecer que el tratamiento se-
leccionado elimina de manera efectiva la interferencia sin prdida de endotoxinas, realizar la valoracin descrita en el captulo
(85) usando la preparacin a examinar a la que se le ha agregado el Estndar de Endotoxina y se ha sometido al tratamiento
seleccionado.

DEMOSTRACIN DE APTITUD CONTINUA

La aptitud continua de la valoracin debe volver a evaluarse cuando se realicen cambios significativos al producto, proceso,
abastecimiento de materias primas, sitio de fabricacin y/o de anlisis, fuente de reactivos para la Prueba de Endotoxinas Bac-
terianas, o cualquier otro cambio que pudiera afectar de manera adversa la exactitud del resultado de la Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas. Los resultados de esta reevaluacin deben documentarse, y los estudios de aptitud deben llevarse a cabo nue-
vamente, segn se requiera.
Los cambios en las tcnicas de extraccin requieren un nuevo estudio de aptitud. Debido a los posibles cambios en los pa-
trones de interferencia entre los mtodos estndar de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas, un cambio en la metodologa de
la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (p.ej., cambiar de una prueba de lmite por coagulacin a una prueba cromognica cin-
tica) requiere la reejecucin del estudio de aptitud.
Anlisis de rutina: El anlisis de rutina de los dispositivos mdicos terminados debe usar las mismas tcnicas de extraccin
que se documentaron en el estudio de aptitud exitoso.
El anlisis de rutina debe llevarse a cabo segn lo descrito en el captulo (85), siguiendo las instrucciones para incubacin y
los controles indicados en la tcnica de valoracin seleccionada.
Interpretacin de los resultados de la prueba: Referirse al captulo (85). La preparacin en anlisis cumple con la prueba si
la concentracin media de endotoxina de determinaciones repetidas de la Solucin A, despus de corregir por dilucin y con-
centracin, es menos de 20 Unidades de Endotoxina por dispositivo mdico (2, 15 Unidades de Endotoxina por dispositivo m-
dico para aquellos dispositivos que entran en contacto con el lquido cefalorraqudeo.)
Si un dispositivo incumple con este requisito, se puede iniciar una investigacin de acuerdo con los procedimientos docu-
mentados. Si una valoracin vlida de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas falla, no se puede reemplazar por la Prueba de
Pirgenos (151) como repeticin.

PIRGENOS

El captulo (151) se aplica para las muestras que no puedan analizarse mediante la Prueba de Endotoxinas Bacterianas debi-
do a una intereferencia por inhibicin o potenciacin de la prueba que no se puede eliminar. Seleccionar un nmero apropia-
do de dispositivos, no ms de 1O, y obtener un extracto combinado, usando mtodos de preparacin adecuados para el dis-
positivo, segn se indica para endotoxinas bacterianas, pero con volmenes de lquido de extraccin o de enjuague que no
excedan de 40 mL de solucin salina SR estril por dispositivo. Se deben cumplir los requisitos del captulo (151 ).

REFERENCIAS

1. ANSl/AAMI ST72: 2011, Bacteria/ endotoxins-Test methods, routine monitoring, and alternatives to batch testing. Associa-
tion for the Advancement of Medica! lnstrumentation, Arlington, VA.
2. United States Food and Drug Administration, Guidance far industry pyrogen and endotoxins testing: questions and answers,
June 2012. http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/ucm314718.htm
 USP 39 Pruebas Biolgicas/ (162) Antitoxina Diftrica 239

AgrgorloslgQlente:

"
(162) PRUEBA DE . POT~NCIA ANTITOXlf';JA DlFTERICA EN
INMUNOGL.OBlJLINAS . HUMANAS

Se provee un m:todo in vitro que es adecuado para determinar la potencia de la antitoxina.diftrica (anticuerpos contra la
toxina diftrica) en preparaciones de nmuhoglobulinas humanas derivadas d plasma. Latokina diftrk es producida por
Corynebacterium diphtheriaeytiene la capddaddeproc;lucr un efecto citopatognco en lneas de clulas epltelials suscep-
tibles. la prueba se basa en. la. capacidad de la antitoxina diftriC:a para neutralizar la toki') diftrica,. red4ciendo su efeC:to
ciftxieo: lapruebadeterniina especficamente lapotenda.dela antitoxinadlftrlcabasndse en su capatidad parainhi-
blf el efe'Ctcitotoxieode .la toxinadiffrk .en.clulasVero cultivadascclulas epiteliales derion de m<>nverdeafricano)
con respecto a un estndar.de referenda. Las deshidrogenass mitocondrlales de clulas Vero vivas pueden.reducir el colo-
rantebrmu.ro de J-{4,S~cjimetilti<!zol~2."'i1)~2,5difeniltetraz01io (MTT; por sus sigla$ en Jngl~s) a un proc;lucto de. color azul/
negro, que sepl:Jedemedirposterirmel1te. deterrninarid 1a absqrbancaa .540 nm; Si . 1aal1tito~lnadiftriC:a se encuent(a
present en una cantidad pequea rilai ento11ce$ la toxina dftric induce l muerte ceJulary fo incapacidad de las clu-
las para reducir el MTT, lb que resulta en la presencia de pocillos blancos o ncolcros. Los crit.erio$de aceptacin son defin~
dos p()r las <1geltas reglamentarias apropiadas.
VAi.ORACiN
~ Pf(C!>CEOJMIETO
Sofdn deDMEM-S: Medio de Ei'\glemodficado por (>ulbecco1, suplementadopar(l contener 5%de suero fetal bovino
(SF~), L-gl.Lltamin~lrnM, 50 g(rnL.de g.entamltnay 2,5 g/mlde Jungl,ana; .[NoTA~A.fternativarnente, sepl}edeusar
una combinacin de 0,1 mg/mLde sulfato de kanamicina., O,l unidades/mL de penicilina yo,1 mg/rnL de estreptomicina
enlugar de.gentamidna.J
Solucin de DMEM~2: Medio. de Eagle modificado .por Dulbecco1 ,,suplementado para contener.2% de suero fetalb()vino
(SFB), l~glutamina 2 mM, 50 g/mLde gentamlcina y 2,5 g/mL de fungzona. [NofAAltema.tivamente, se puede usar
una combinacin de O,l rng/mldesulfatode kanami!=in, O;l.unidade$/mLde.peniclliria. 'f O,{mg/mLde estreptorntina
enluga.r.de.gentamicfoa,J
Sludn.ge Mtr: 5 mglmL de MTT ensolUci(l salina amortiguada con f{)sfatos.z Preparar inmediatamente antes .de su
US y rntnfmzarJa ~posicic)n a. la luz ambiental;
SC>ludrr ele extrac:c:;in; tido clorhfdr!Co 0,4 N enisopropanol
Sofucin depru.eba det(lxina: Obtener una preparacin lquidade toxina. a p:rtirde un cultivo de C. diph.theriae3 , Se
puede esterilizar mediante filtraci.n yla stetilidad puede mantenerse mediante el agregado de un conservante antimicro-
biano ldecuado.Almacenar el .filtrado en la oscuridad a 2-8q durante varias semanas hasta que la actividad se considere
constante $egn$.edetermine mediante an.lisis. Diluirla tox:i.na en Solucin de DMEMShasta obtener una Solucin de
p'l.leba de toxno <!decuada que provea ul"la equivalencia de trabajo .en 1a Soluciqn estndor.. (NoTA-:-Se puede determinar
empric:ament(:! Qna Soludn de prueba de toxina adecuacja segn.se ndica a con ti nuacic)i:t; Val otar Ia tox:ina contra una con-
C:.enttat.r1 fijade anti.foXJna (p.ej., O,l2S unidades/mL) usando volmenes .ymEdios. segn se define a eontinuacin. Deter-
minarl;i concentracin mas bala cfo toxina que ocasiona toxicidad en clulasVero en. presencil dela concentracin de an-
titoxina .sefecdonada,. Esfo pede definirse .comolCD/20 {donde "LCD'1 representa eJ lmite d dosis citotxica y ''120'' se
refiere al/20unidadeslmL~ 0,05 unidades/rnL). Esta es una cohcentracnmnima. que debe usarse.en fa l/aloracfrL]
Solucin de tripsina-EDTA: Disolver' 0,4 g de tripsnaj 0:,2 g de. cido etilendiaminotetraactico (EDTAJ y 0,85 g de dpru-
ro de sodio en 100 mL de aga estril. ~ar ri:lctivos estriles y de grado cultivo celular para. preparar las soluciones descri-
tas anteriormente. Como alternativa,. se puede usar una preparadn estril prefabricada.
Preparad6n del cultivo celular: Prepar~r clulas Vero4 cultivndotas en frascos de cultivo de tejidos de 7:, cm 2 en Solucin
d DMEMS a 36 l, dixido de carbono al 5%(C02) y un ambiente humidifici:ldo.. [NOTA-Se pueden usar tamaos alter-
nativos de frascos de cultivo ajustando los volmenes usados a continuacin.] Despus de 2-3 das de crecimiento, el me-
dio puede reemplazarse por Solucin deDMEM2, dejando que contine el crecimiento. Cuando las clulas hayan aleanza-
d una monotapa confluente, desechar eLmedio de cul~ivo~ Lavar la capa de clulas pipeteando y transfiriendo 5mL de la
Solucin de tripsina...EDTA al frasc:o de cultivo. Luego aplicar. al frasco. de cultivo un movimiento ba$cufar suave hacia adela n-
te y hacia atrs durante aproximadamente 30 segundos, Retirar y desechar la Solucin detripsna...c.EDTA. Agregar 5 ml adi-
cionales de Solucin de tripsna~EDTAy mover suavemente de forma bascular haca adelante y hacia atrs durante 1 minu-
to, Retirar y desechar todo excepto 1 mL Incubar a 36 :!: l, con dixido de carbono al 5% (CQ 2), en un ambiente humidic
ficado durante aproximadamente 1O minutos o hasta que la capa de clulas comience a desprenderse del frasco y golpe-

1 11885-092 Lite Technologes o equivalente.

2.14190-250 Lite Technologies o equivalente.
3 loxina diftrica cdigo 12/282 de NlBSC o una alternativa adecuada.
4 American Type Culture Collection CCL81.
240 (162) Antitoxina Diftrica / Pruebas Biolgicas USP 39

tear suavemente el frasco de cultivo para liberar las clulas. Agregar 1O mL de Solucin de DMEM-5 a las clulas tripsiniza-
das, contar las clulas y ajustar la suspensin celular a 1 x 1os clulas/mL en el mismo medio.
Soluciones estndar: En tubos estriles, preparar cuatro concentraciones del estndar diluyendo el Estndar de los EE.UU.
de Antitoxina Diftrica5 con la Solucin de DMEM-2, hasta una concentracin de 1 unidad/mL, seguido de diluciones en
serie con el mismo medio hasta obtener tres soluciones adicionales de 0,5; 0,25 y O, 1 uni.dades/ml.
Soluciones muestra: Diluir en tubos estriles cada una de las muestras de prueba de inmunoglobulinas humanas con Solu-
cin de DMEM-2 hasta obtener una concentracin de 1,25% de protena. Usando las muestras diluidas, diluir adicionalmen-
te con Solucin de DMEM-2 hasta lograr una concentrqcin de '!ntitoxina diftrica esperada que est dentro del intervalo de
las Soluciones. estndar (es decir, 1 a 0,1 unidades/mL),
Anlisis
Muestras: Solucin de prueba de toxina Soluciones estndar y Soluciones muestra
Analzar cada Solucin estndar o Solucin muestra por duplicado. Rotular placas de .cultivo de 96 pocillos .marcando las co-
lumnas de 8 pocillos en grupos de dos se pueden analizar las cuatro Soluciones estndar y una Solucin muestra por placa.
De acuerdo a lo que se describe seguidamente, las columnas 11 y 12 pueden usarse para el control de clulas sin tratar y
el control de toxina, respectivamente, [NoTA~Se pueden usar diseos de placas alternativos manteniendo las diluciones.]
Agregar 112,5 L de Solucin de DMEM,2 a cada pocillo de la fila A, columnas 1~1 O nicamente (estos son controles de
toxicidad no especficos de estndar o de muestra). Agregar 75 L de Solucin de DMEM2 a cada pocillo de las filas B-H,
columnas 1- 1O nicamente.
Agregar .37,5 L de una dilucin de Solucin estndar o una Solucin muestrq.a los pocillos Al':"A2 y agregar 75 L de la
misma solucin a los pocillos Bl -B2. Agregar 37,5 L de una segunda dilucin de )o/ucin estndar o Solucin muestra a
los pocillos A3-A4 y agregar 75 L de la misma solucin a los pocillos B3-B4. Continuar realizando adiciones similares de
diluciones de Solucin estndar o Soluciones muestra a cada grupo de dos columnas en las columnas 1-1 O,. Realizar dilucio-
nes en serie al medio transfiriendo 75 L de cada pocillo de la fila B a cada pocillo de la fila C de la misma columna.
Mezclar y.luego continuar transfiriendo 75 L de la misma manera hacia abajo en cada col.umna. Desechar.los ltimos 75
L despus de mezclar la fila H. Agregar 75 L de Solucin de prueba de toxina a las filas B-H en las columnas 1-10. Agre-
gar 150 L de Sofucn de DMEM-2 a todos los pocillos de la columna 11 (control de clulas) y agregar 75 L de Solucin
de DMEM~2 ms 75 L de Solucin de prueba de toxina a todos los pocillos de la columna 12 (control de toxina).
Cubrir las placas e incubarlas durante 1 hora a 36 1", en dixido de carbono al 5% (C0 2) en un ambiente humidificado.
Agregar 150 L de suspensin de clulas a todos los pocillos, cubrir las placas e incubarlas .a 36 1 , en dixido de carbo-
no al 5% (C0 2), y en un ambiente humidificado. Incubar durante 4--5 das, verificando peridicamente la contaminacin
microbiana mediante examen microscpico. Una vez que los pocillos de control de toxicidad en la fila A que contienen la
concentracin ms baja de una Solucin estndar sean casi confluentes, agregar 15 L de Solucin de MTT a cada pocillo.
Cubrir las placas e incubarlas en la incubadora de dixido de carbono (C0 2) a 37" durante 3 horas. Dese.char el:medio y
agregar a cada pocillo 150 L de Solucin de extraccin. Cubrir las placas y colocar papel aluminio sobre stas para mini-
mizar la exposicin a la luz. Agitar suavemente para solub!lizar el formazn azl formado por las clulas viables. Usando
un lector de placas adecuado, leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 540 nm.
Clculo; La dilucin de corte es la dilucin ms alta en la que an se presentan clulas viables en el pocillo pero ms all de
ta cual no se encuentra ya ninguna clula viable. La dilucin de corte se define mediante una absorbancia correspondiente
(Abs). [NOTA~EI valor de absorbancia promedio puede calcularse para los pocillos de control de clulas en la columna 11 y
dividirse por 2 para obtener un valor Abs de control del 50%. Este valor puede usarse para determinar las diluciones de
corte. La dilucin de corte para cada Solucin estndar y Solucin muestro puede por ende definirse como la diluein ms
lta en la que el valor Abs es mayor que el valor Abs de control del 50%.] Determinar las diluciones de corte para cada
S.olucin estndar y Solucin muestra. Graficar las diluciones de corte obtenidas para todas las.Soluciones estndar (expresa-
das como la inversa de la dilucirl de corte) en funcin de las unidades de Antitoxina Diftrica Estndar de los EE.UU. Cal-
cular una lrlea de regresin lineal a partir de los datos. Calcular la media geomtrica para las cuatro dUuciones de corte
asociadas con cada Solucin muestra. Comparar la dilucin de corte media cor! la regresin lineal de los datos de la Solucin
estndar para determinar un ttulo, en unidades/mL, para cada Solucin muestra~ Para obtener el valor de potencia final
para la Solucin muestra, multiplicar el ttulo por cualquier dilucin que se haya realizado a la Solucin muestra antes de la
Vd/oracin.
Aptitud del sistema: El coeficiente de correlacin de la curva estndar debe ser >0,995. La pendiente de la curva estndar
debe estar entre 26 y 38. La prueba es vlida si las clulas en los pocillos de la fila A, de las columnas 1-1 O, parecen norma-
les y similares a las clulas de los pocillos de control de la columna 11 . Adems,. los valores de dilucin de corte para los
duplicados de la Solucin estndar y de la Solucin muestra deben estar dentro de una dilucin en serie entre s, y la dilucin
de corte debe estar dentro del intervalo de las diluciones en serie de la Solucin muestra.
Jt.USP39

S Usar el Estndar de los EE.UU. de Antitoxina Diftrica segn lo indicado por el Center for Bologcs Evaluation and Research (Centro para la Evaluacin e Investi-
gacin de Productos Biolgicos) de la Food and Drug Administration (Administracin de Alimentos y Medicamentos).
USP 39 Pruebas Biolgicas/ (171) Valoracin de Actividad de Vitamina Bl 2 241

(171) VALORACIN DE ACTIVIDAD DE VITAMINA B, 2

Estndares de referencia USP (11 )-ER Cianocobalamina USP.

Preparacin de Valoracin-Colocar una cantidad adecuada del material a valorar, previamente reducida a polvo fino si
fuera necesario y medida o pesada con exactitud, en un recipiente apropiado que contenga, por cada g o ml del material
tomado, 25 ml de una solucin acuosa para extraccin preparad a justo antes de usar, en donde, cada 100 ml contienen
1,29 g de fosfato disdico, 1, 1 g de cido ctrico anhidro y 1,0 g de metabisulfito de sodio. Colocar la mezcla en autoclave a
121 durante 1O minutos. Dejar sedimentar las partculas no disueltas del extracto y filtrar o centrifugar si fuera necesario. Di-
luir una alcuota de la solucin transparente con agua, de manera que la solucin de prueba final contenga una actividad de
vitamina B12 que equivalga aproximadamente a la actividad de la Solucin Estndar de Cianocobalamina que se agrega a los
tubos de valoracin.
Solucin Madre del Estndar de Cianocobalamina-A una cantidad adecuada de ER Cianocobalamina USP, pesada con
exactitud, agregar suficiente alcohol al 25 por ciento para obtener una solucin con una concentracin conocida de 1,0 g de
cianocobalamina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solucin de Cianocobalamina Estndar-Diluir un volumen adecuado de Solucin Madre del Estndar de Cianocobalamina
con agua hasta un volumen medido tal que despus del perodo de incubacin segn se indica en el Procedimiento, la diferen-
cia en la transmitancia entre el blanco inoculado y el nivel de 5,0 ml de la Solucin de Cianocobalamna Estndar no sea menor
de aquella correspondiente a la diferencia de 1,25 mg en peso seco de las clulas. Generalmente, esta concentracin est en-
tre 0,01 ng y 0,04 ng por ml de Solucin de Cianocobalamina Estndar. Preparar una solucin estndar nueva para cada valora-
cin.
Solucin Madre de Medio Basal-Preparar el medio de acuerdo con la frmula y las instrucciones que aparecen a conti-
nuacin. Puede usarse una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que, una vez reconstituida se-
gn se indica en la etiqueta, proporcione un medio comparable al obtenido a partir de la frmula que aparece en este procedi-
miento.
Agregar los ingredientes en el orden indicado, disolviendo con cuidado la cistina y el triptfano en el cido clorhdrico antes
de agregar las ocho soluciones siguientes a la solucin resultante. Agregar 100 ml de agua, mezclar y disolver la dextrosa, el
acetato de sodio y el cido ascrbico. Filtrar, si fuera necesario, agregar la solucin de polisorbato 80, ajustar la solucin a un
pH entre 5,5 y 6,0 con hidrxido de sodio 1 N y agregar agua purificada hasta obtener 250 ml.

L-Cistina o, 1 g
L-Triptfano 0,05 g
cido Clorhdrico 1 N 10 ml
Solucin de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solucin de Xantina 5 ml
Solucin Vitamnica 1 10 ml
Solucin Vitamnica 11 10 ml
Solucin Salina A 5 ml
Solucin Salina B 5 ml
Solucin de Asparagina 5 ml
Solucin de Hidrolizado cido de Casena 25 ml
Dextrosa Anhidra 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro 5g
cido Ascrbico 1g
Solucin de Polisorbato 80 5 ml

Solucin de Hidro/izado cido de Casena-Preparar segn se indica en Valoracin de Pantotenato de Calcio (91 ).
Solucin de Aspamgina-Disolver 2,0 g de L-asparagina en agua hasta obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refri-
gerador.
Solucin de Adenna-Guanina-Uracilo-Preparar segn se indica en Valoracin de Pantotenato de Calcio (91 ).
Solucin de Xantina-Suspender 0,20 g de xantina en 30 ml a 40 ml de agua, calentar a una temperatura de aproximada-
mente 70, agregar 6,0 ml de hidrxido de amonio 6 N y mezclar hasta que el slido se disuelva. Enfriar y agregar agua para
obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin Salina A-Disolver 1Og de fosfato monobsico de potasio y 1Og de fosfato dibsico de potasio en agua para obte-
ner 200 ml. Agregar 2 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Solucin Salina 8-Disolver 4,0 g de sulfato de magnesio, 0,20 g de cloruro de sodio, 0,20 g de sulfato ferroso y 0,20 g de
sulfato de manganeso en agua para obtener 200 ml. Agregar 2 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Solucin de Polisorbato 80-Disolver 20 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 200 ml. Almacenar en un refrigerador.
 242 (171) Valoracin de Actividad de Vitamina Bl 2 /Pruebas Biolgicas USP 39

Solucin Vitamnica /-Disolver 1O mg de riboflavina, 1O mg de clorhidrato de tiamina, 100 g de biotina y 20 mg de niaci-

na en cido actico glacial 0,02 N para obtener 400 ml. Almacenar, bajo tolueno protegiendo de la luz, en un refrigerador.
Solucin Vitamnica //-Disolver 20 mg de cido paraaminobenzoico, 1O mg de pantotenato de calcio, 40 mg de clorhidrato
de piridoxina, 40 mg de clorhidrato de piridoxal, 8 mg de diclorhidrato de piridoxamina y 2 mg de cido flico en alcohol
neutralizado diluido (1 en 4) para obtener 400 ml. Almacenar, protegiendo de la luz, en un refrigerador.
Preparacin de Jugo de Tomate-Centrifugar jugo de tomate enlatado comercial para extraer la mayor parte de la pulpa.
Suspender aproximadamente 5 g por L de coadyuvante de filtracin analtico en el sobrenadante y filtrar, con ayuda de pre-
sin reducida, a travs de una capa de coadyuvante de filtracin. Repetir la filtracin, si fuera necesario, hasta obtener un filtra-
do transparente, color amarillo claro. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Medio de Cultivo-[NOTA-Se puede usar una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que,
una vez reconstituida segn las indicaciones del etiquetado, proporcione un medio equivalente al obtenido a partir de la fr-
mula descrita en este procedimiento.] Disolver 0,75 g de extracto de levadura hidrosoluble, 0,75 g de peptona seca, 1,0 g de
dextrosa anhidra y 0,20 g de bifosfato de potasio en 60 ml a 70 ml de agua. Agregar 1O ml de Preparacin de jugo de Tomate
y 1 ml de Solucin de Polisorbato 80. Ajustar la solucin con hidrxido de sodio 1 N hasta un pH de 6,8 y agregar agua para
obtener 100 ml. Colocar porciones de 1O ml de la solucin en tubos de ensayo y tapar con algodn. Esterilizar los tubos y su
contenido en autoclave a 121 durante 15 minutos. Enfriar con la mayor prontitud posible para evitar formacin de colores
que resultan del sobrecalentamiento del medio.
Medio de Suspensin-Diluir un volumen medido de la Solucin Madre de Medio Basal con un volumen igual de agua.
Colocar porciones de 1O ml del medio diluido en tubos de ensayo. Esterilizar y enfriar segn se ha indicado en Medio de Culti-
vo.
Cultivo Madre de Lactobacillus lechmannii-Agregar 1,0 g a 1,5 g de agar a 100 ml de Medio de Cultivo y calentar la
mezcla en un bao de vapor, con agitacin, hasta que el agar se disuelva. Colocar porciones de aproximadamente 1O ml de la
solucin caliente en los tubos de ensayo, tapar bien los tubos, esterilizarlos a 121 durante 15 minutos en autoclave (tempera-
tura de la salida) y dejar que los tubos se enfren en posicin vertical. Inocular tres o ms de los tubos, por transferencias en
cua de un cultivo puro de Lactobacillus leichmannii.* (Antes de usar un cultivo nuevo por primera vez en esta valoracin, hacer
no menos de 1O transferencias sucesivas del cultivo en un perodo de 2 semanas.) Incubar durante 16 a 24 horas, a cualquier
temperatura seleccionada entre 30 y 40, pero mantenida termostticamente dentro de 0,5 y finalmente almacenar en un
refrigerador.
Preparar cultivos nuevos en cua al menos tres veces por semana y no usarlos para preparar el inculo si tienen ms de 4
das. La actividad del microorganismo se puede aumentar mediante transferencias del cultivo en cua realizadas a diario o dos
veces al da, hasta el punto en que se pueda observar una evidente turbidez en el inculo lquido 2 a 4 horas despus de la
inoculacin. Un cultivo de crecimiento lento raramente proporciona una curva de respuesta adecuada y puede conducir a re-
sultados irregulares.
lnculo-[NoTA-Una suspensin congelada de Lactobacillus leichmannii puede usarse como cultivo madre, siempre que
proporcione un inculo comparable a un cultivo nuevo.] Transferir las clulas del Cultivo Madre de Lactobacil/us leichmannii a 2
tubos estriles que contengan 1O ml de Medio de Cultivo cada uno. Incubar estos cultivos durante 16 a 24 horas a cualquier
temperatura seleccionada entre 30 y 40, pero mantenida termostticamente dentro de 0,5. En condiciones aspticas, cen-
trifugar los cultivos y decantar el sobrenadante. Suspender las clulas de cultivo en 5 ml de Medio de Suspensin estril y mez-
clar. Usando Medio de Suspensin estril, ajustar el volumen para que una dilucin 1 en 20 en solucin salina SR produzca
transmitancia de 70% cuando se lee en un espectrofotmetro apropiado a una longitud de onda ajustada a 530 nm, equipado
con una celda de 1O mm y se lee contra solucin salina SR ajustada a una transmitancia de 100%. Preparar una dilucin 1 en
400 de la suspensin ajustada usando Solucin Madre de Medio Basal y usarla para el inculo de prueba. (Esta dilucin puede
alterarse, cuando sea necesario, para obtener la respuesta deseada.)
Calibracin del Espectrofotmetro-Comprobar la longitud de onda del espectrofotmetro peridicamente, usando una
celda de longitud de onda estndar u otro dispositivo apropiado. Previamente a la lectura de las soluciones, calibrar el espec-
trofotmetro con agua para fijar el 0% y el 100% de transmitancia, a la longitud de onda de 530 nm.
Procedimiento-Limpiar meticulosamente, por medios apropiados, los tubos de ensayo de vidrio duro, de 20 mm x 150
mm de tamao aproximado y otro material de vidrio necesario, preferentemente seguido de un calentamiento a 250 durante
2 horas, debido a la alta sensibilidad del organismo de prueba a la actividad de cantidades diminutas de vitamina B12 y a trazas
de muchos agentes de limpieza.
Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado: 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml, respectivamente, de la
Solucin de Cianocobalamina Estndar. A cada uno de estos tubos y a cuatro tubos vacos similares, agregar 5,0 ml de Solucin
Madre de Medio Basal y agua para completar 1O ml.
En tubos de ensayo similares, agregar, por duplicado, respectivamente, 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml y 4,0 ml de la
Preparacin de Valoracin. Agregar a cada tubo 5,0 ml de Solucin Madre de Medio Basal y agua para completar 1O ml. Colocar
juntos un juego completo de tubos del estndar y de la valoracin en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda
gradilla o en otra seccin de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.

* Se pueden obtener cultivos puros de Lactobacillus /eichmannii, Nmero 7830, de la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (181) Identificacin 243

Cubrir los tubos apropiadamente para prevenir la contaminacin bacteriana y esterilizar los tubos y su contenido en un au-
toclave a 121 durante 5 minutos, procurando alcanzar esta temperatura en no ms de 1 O minutos, precalentando el autocla-
ve si fuera necesario. Enfriar tan rpidamente como sea posible para evitar formacin de color como resultado del sobrecalen-
tamiento del medio. Tomar precauciones para mantener la uniformidad de las condiciones de esterilizacin y enfriamiento du-
rante toda la valoracin ya que si los tubos se colocan demasiado juntos o si se sobrecarga el autoclave podra variar la veloci-
dad de calentamiento.
Agregar aspticamente 0,5 ml de lnculo a cada tubo as preparado, excepto a dos de los cuatro que no contengan Solucin
de Cianocobalamina Estndar (los blancos no inoculados). Incubar los tubos a una temperatura entre 30 y 40, mantenida ter-
mostticamente dentro de 0,5, durante 16 a 24 horas.
Terminar el crecimiento calentando a una temperatura no inferior a 80 durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Despus de agitar su contenido, colocar el tubo en un espectrofotmetro que se ha fijado a una longitud de onda de 530 nm
y leer la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se observa unos pocos segundos des-
pus de agitar, cuando la lectura se mantiene constante durante 30 segundos o ms. Emplear aproximadamente el mismo
intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Si la diferencia es
mayor de 5% o si hay evidencia de contaminacin con un microorganismo extrao, descartar los resultados de la valoracin.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia de cada uno de los tubos restantes.
Descartar los resultados de la valoracin si la pendiente de la curva estndar indica un problema de sensibilidad.
Clculos-Preparar una curva estndar de concentracin-respuesta segn el siguiente procedimiento. Examinar los resulta-
dos para detectar y reemplazar cualquier valor de transmitancia aberrante. Para cada nivel del estndar, calcular la respuesta a
partir de la suma de los valores duplicados de las transmitancias O::) como la diferencia, y = 2,00 - L. Graficar esta respuesta en
la ordenada del papel cuadriculado, contra el logaritmo de los ml de Solucin de Cianocobalamina Estndar por tubo en la
abscisa, usando para la ordenada una escala aritmtica o logartmica, la que produzca una mejor aproximacin a una lnea
recta. Trazar la lnea recta o la curva continua que mejor se ajuste a los puntos graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparacin de Valoracin. Leer de la curva
estndar el logaritmo del volumen de la Preparacin Estndar correspondiente a cada uno de esos valores de y que estn com-
prendidos en el intervalo entre el punto ms bajo y ms alto graficados para el estndar. Restar de cada logaritmo as obtenido
el logaritmo del volumen, en ml, de la Preparacin de Valoracin para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificacin.
x
Promediar los valores de x para cada uno de tres o ms niveles de dosis para obtener = M', el logaritmo de la potencia relati-
va de la Preparacin de Valoracin. Determinar la cantidad, en g, de ER Cianocobalamina USP correspondiente a la cianocoba-
lamina en la porcin de material tomada para la valoracin con la ecuacin antilog M = antilog (M' + log R), en donde R es el
nmero de g de cianocobalamina que se supone presente en cada mg (o cpsula o tableta) del material tomado para la valo-
racin.
Repeticin-Repetir toda la determinacin al menos una vez, usando Preparaciones de Valoracin preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08; su promedio, M, es el logaritmo de la poten-
cia resultado de la valoracin del material de prueba (ver Valoracin de la Actividad de la Vitamina 812 en Diseo y Anlisis de
Valoraciones Biolgicas (111 )). Si las dos determinaciones difieren en ms de 0,08 hay que realizar una o ms determinaciones
adicionales. Del promedio de dos o ms valores de M que no difieren en ms de O, 15 calcular la potencia media de la prepara-
cin valorada.

Pruebas y Valoraciones Qumicas

PRUEBAS DE IDENTIFICACIN

(181) IDENTIFICACIN-BASES ORGNICAS NITROGENADAS

INTRODUCCIN
El propsito de esta prueba es identificar los compuestos de aminas terciarias. Esta prueba espectroscpica tiene un grado limi-
tado de especificidad y, por lo tanto, se debe cumplir con todas las pruebas de identificacin adicionales listadas en una
monografa particular para asegurar la identidad de la muestra en anlisis.
VALORACIN
244 (181) Identificacin / Pruebas Qumicas USP 39

Cambio en la redaccin:
PROCEDIMIENTO
Solucin estndar: Disolver en un separador 50 mg del Estndar de Referencia USP correspondiente en 25 mL de cido
clorhdrico 0,01 N.
Solucin muestra: Dependiendo de la naturaleza de la muestra, disolver 50 mg de la sustancia a granel en anlisis en 25
mL de cido clorhdrico 0,01 N, o agitar una cantidad de tabletas reducidas a polvo o el contenido de las cpsulas, equiva-
lente a 50 mg de la sustancia, con 25 mL de cido clorhdrico 0,01 N durante 1O minutos. Transferir el lquido a un separa-
dor, filtrando si fuera necesario y lavando el filtro y el residuo con varias porciones pequeas de agua.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopa en el Infrarrojo Medio <854) (AF oi-may-zo16))
Modo: IR
Intervalo de longitud de onda: 7-15 m (1430 cm- 1 a 650 cm- 1 )
Celda: 1 mm
Blanco: Disulfuro de carbono
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Tratar cada solucin segn se indica a continuacin: Agregar 2 mL de hidrxido de sodio 1 N y 4 mL de disulfuro de carbo-
no, y agitar durante 2 minutos. Si fuera necesario, centrifugar hasta que la fase inferior se torne transparente y pasarla a
travs de un filtro seco, recogiendo el filtrado en un matraz pequeo con tapn de vidrio. Determinar inmediatamente el
espectro de absorcin de la Solucin estndar y la Solucin muestra filtradas.
Criterios de aceptacin: El espectro de la Solucin muestra debe presentar todas las bandas de absorcin significativas pre-
sentes en el espectro de la Solucin estndar.

(191) IDENTIFICACIN-PRUEBAS GENERALES

Bajo este encabezado se describen las pruebas que se mencionan con frecuencia para identificar los artculos oficiales en la
Farmacopea. Antes de usar cualquier cido o base para modificar el pH de la solucin muestra, asegurarse de que la sustancia
agregada no interferir con los resultados de la prueba. [NOTA-Estas pruebas no estn destinadas a mezclas de sustancias, a
menos que se indique especficamente.]
Acetatos-Disolver aproximadamente 30 mg de la sustancia a examinar en 3 mL de agua o usar 3 mL de la solucin pres-
crita. Ajustar el pH de la solucin con hidrxido de sodio hasta alcalinizar levemente. Agregar 0,25 mL de nitrato de lantano
SR. Si se produce un precipitado blanco, filtrar la solucin. Agregar sucesivamente 0, 1 mL de yodo y yoduro de potasio SR 3 y
O, 1 mL de amonaco SR 2 a la solucin. Si no se observa un color azul, calentar cuidadosamente hasta ebullicin. En presencia
de acetatos, se desarrolla un color oscuro o se produce un precipitado azul. Con soluciones neutras de acetatos, el cloruro
frrico SR produce un color rojo que se elimina con la adicin de cidos minerales.
Aluminio-Con hidrxido de amonio 6 N, las soluciones de sales de aluminio producen un precipitado blanco gelatinoso
que es insoluble en un exceso de hidrxido de amonio 6 N. El hidrxido de sodio 1 N o el sulfuro de sodio SR producen el
mismo precipitado, que se disuelve en un exceso de cualquiera de los reactivos mencionados.
Amonio-Agregar 0,2 g de xido de magnesio a la solucin en anlisis. Pasar una corriente de aire a travs de la mezcla y
dirigir el gas que escapa apenas por debajo de la superficie de una solucin indicadora, preparada mezclando 1 mL de cido
clorhdrico O, 1 M y 0,05 mL de rojo de metilo SR 2. En presencia de amonio, el color de la solucin indicadora cambia a amari-
llo. Despus de dirigir el gas hacia el interior de la solucin indicadora durante un periodo suficiente, agregar a la solucin
indicadora 1 mL de cobaltinitrito de sodio SR preparado recientemente. Con la adicin de cobaltinitrito de sodio SR se produ-
ce un precipitado amarillo en presencia de amonio.
Antimonio-Con el sulfuro de hidrgeno, las soluciones de compuestos de antimonio (111) fuertemente acidificadas con ci-
do clorhdrico producen un precipitado de sulfuro de antimonio de color anaranjado que es insoluble en hidrxido de amonio
6 N, pero que es soluble en sulfuro de amonio SR.
Bario-Las soluciones de sales de bario forman un precipitado blanco con cido sulfrico 2 N. Este precipitado es insoluble
en cido clorhdrico y en cido ntrico. Las sales de bario confieren un color verde amarillento a una llama no luminosa, que
parece de color azul cuando se la mira a travs de un vidrio verde.
Benzoato-En soluciones neutras, los benzoatos forman un precipitado de color salmn con cloruro frrico SR. En solucio-
nes moderadamente concentradas, los benzoatos producen un precipitado de cido benzoico al acidificarse con cido sulfri-
co 2 N. Este precipitado es fcilmente soluble en ter etlico.
Bicarbonato-Ver Carbonatos.
Bismutos-Cuando se disuelven en un ligero exceso de cido ntrico o cido clorhdrico, las sales de bismuto proporcionan
un precipitado blanco al diluirse con agua. Este precipitado se torna de color marrn en presencia de sulfuro de hidrgeno y el
compuesto resultante se disuelve en una mezcla tibia de partes iguales de cido ntrico y agua.
USP 39 Pruebas Qumicas / (191) Identificacin-Pruebas Generales 245

Bisulfitos-Ver Sulfitos.
Boratos-Agregar 3 4 gotas de yodo SR y 3 4 gotas de solucin de alcohol polivinlico (1 in 50) a 1 mL de una solucin
de borato, acidificada con cido clorhdrico al tornasol: se produce un color azul intenso. Cuando a un borato se le trata con
cido sulfrico, se le agrega metano! y se incinera la mezcla, arde con una llama de borde verde.
Bromuros-Las soluciones de bromuros, con la adicin gota a gota de cloro SR, liberan bromo que se disuelve en clorofor-
mo por agitacin y colorean el cloroformo de un color rojo a marrn rojizo. El nitrato de plata SR en soluciones de bromuro
produce un precipitado blanco-amarillento que es insoluble en cido ntrico y poco soluble en hidrxido de amonio 6 N.
Calcio-Las soluciones de sales de calcio forman oxalatos insolubles cuando se tratan de la siguiente manera. Agregar
2 gotas de rojo de metilo SR a una solucin de sal de calcio (1 en 20) y neutralizar con hidrxido de amonio 6 N. Agregar,
gota a gota, cido clorhdrico 3 N hasta que la solucin sea cida frente al indicador. Las soluciones de sales de calcio forman
un precipitado blanco al agregar oxalato de amonio SR. Este precipitado es insoluble en cido actico 6 N pero se disuelve en
cido clorhdrico. Las sales de calcio humedecidas con cido clorhdrico proporcionan un color rojo amarillento transitorio a
una llama no luminosa.
Carbonatos-Los carbonatos y bicarbonatos son efervescentes en cidos, y desprenden un gas incoloro que, cuando se ha-
ce pasar por hidrxido de calcio SR, produce inmediatamente un precipitado de color blanco. Una solucin fra (1 en 20) de
un carbonato soluble se colorea de rojo con fenolftalena SR, mientras que una solucin similar de bicarbonato no se modifica
o slo se colorea ligeramente.
Cinc-En presencia de acetato de sodio, las soluciones de sales de cinc forman un precipitado blanco con sulfuro de hidr-
geno. Este precipitado es insoluble en cido actico, pero se disuelve con cido clorhdrico 3 N. El sulfuro de amonio SR produ-
ce un precipitado similar en soluciones neutras y alcalinas. Con ferrocianuro de potasio SR, las sales de cinc en solucin forman
un precipitado blanco que es insoluble en cido clorhdrico 3 N.
Citratos-Agregar algunos mg de sal de citrato disueltos o suspendidos en 1 mL de agua, a 15 mL de piridina, y agitar.
Agregar 5 mL de anhdrido actico a esta mezcla y agitar: se produce un color rojo claro.
Cloratos-Las soluciones de cloratos no producen un precipitado con nitrato de plata SR. La adicin de cido sulfuroso a
esta mezcla produce un precipitado blanco que es insoluble en cido ntrico, pero que es soluble en hidrxido de amonio 6 N.
Al incinerarlos, los cloratos producen cloruros que se identifican mediante las pruebas correspondientes. Cuando se agrega ci-
do sulfrico a un clorato seco, ste crepita y desprende un gas amarillo verdoso. [Precaucin-Emplear slo una pequea canti-
dad de clorato para esta prueba y extremar las precauciones para realizarla.]
Cloruros-Con nitrato de plata SR, las soluciones de cloruros producen un precipitado blanco, grumoso, que es insoluble
en cido ntrico pero soluble en un ligero exceso de hidrxido de amonio 6 N. Cuando se analizan clorhidratos de aminas (in-
cluidos los alcaloides) que no responden a la prueba anterior, agregar una gota de cido ntrico diluido y 0,5 mL de nitrato de
plata SR a una solucin de la sustancia que est siendo examinada que contenga, a menos que se indique algo diferente en la
monografa, aproximadamente 2 mg de in cloruro en 2 mL: se forma un precipitado blanco, grumoso. Centrifugar la mezcla
sin demora y decantar la capa sobrenadante. Lavar el precipitado con tres porciones de 1 mL de solucin de cido ntrico (1 en
100) y desechar los lavados. Agregar amonaco SR gota a gota a este precipitado. Se disuelve rpidamente. Cuando una mo-
nografa especifica que un artculo responde a la prueba para cloruros secos, mezclar el slido que se va a analizar con un peso
igual de dixido de manganeso, humedecer con cido sulfrico y calentar moderadamente la mezcla: se produce cloro, que es
reconocible por la produccin de un color azul con papel de yoduro-almidn humedecido.
Cobalto-Las soluciones de sales de cobalto (1 en 20) en cido clorhdrico 3 N producen un precipitado rojo cuando la
mezcla se calienta en un bao de vapor, con un volumen igual de una solucin caliente, recin preparada, de 1-nitroso-2-
naftol (1 en 1O) en cido actico 9 N. Las soluciones de sales de cobalto, cuando se saturan con cloruro de potasio y se tratan
con nitrito de potasio y cido actico, producen un precipitado amarillo.
Cobre-Las soluciones de compuestos cpricos acidificadas con cido clorhdrico, depositan una pelcula roja de cobre me-
tlico sobre una superficie de hierro brillante y no oxidado. Un exceso de hidrxido de amonio 6 N, agregado a una solucin
de una sal cprica, produce al principio un precipitado azulado y posteriormente una solucin de color azul intenso. Las solu-
ciones de sales cpricas con ferrocianuro de potasio SR producen un precipitado de color marrn rojizo insoluble en cidos
diluidos.
Fosfatos-[NOTA-Cuando la monografa especifica la prueba de identificacin de Fosfatos, utilizar las pruebas para ortofos-
fatos, a menos que las instrucciones especifiquen que se deben emplear las pruebas para pirofosfatos o que se debe incinerar
el producto antes de realizar la prueba.] Con nitrato de plata SR, las soluciones neutras de ortofosfatos producen un precipita-
do amarillo que es soluble en cido ntrico 2 N y en hidrxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR, las soluciones
acidificadas de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en hidrxido de amonio 6 N. Este precipitado
puede tardar en formarse. Con nitrato de plata SR, los pirofosfatos obtenidos por incineracin producen un precipitado blanco
que es soluble en cido ntrico 2 N y en hidrxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR se forma un precipitado ama-
rillo que es soluble en hidrxido de amonio 6 N.
Hierro-Los compuestos frricos y ferrosos en solucin producen un precipitado negro con sulfuro de amonio SR. Este pre-
cipitado se disuelve en presencia de cido clorhdrico 3 N fro con desprendimiento de sulfuro de hidrgeno.
Sales Frricas-Las soluciones cidas de sales frricas producen un precipitado azul oscuro con ferrocianuro de potasio SR.
Con un exceso de hidrxido de sodio 1 N, se forma un precipitado marrn rojizo. Con tiocianato de amonio SR, las soluciones
de sales frricas producen un color rojo intenso que no se elimina con el agregado de cidos minerales diluidos.
246 (191) Identificacin-Pruebas Generales / Pruebas Qumicas USP 39

Sales Ferrosas-Las soluciones de sales ferrosas producen un precipitado azul oscuro con ferricianuro de potasio SR. Este pre-
cipitado es insoluble en cido clorhdrico 3 N pero se descompone con hidrxido de sodio 1 N. Las soluciones de sales ferrosas
con hidrxido de sodio 1 N producen un precipitado blanco-verdoso que cambia de color rpidamente a verde y luego, cuan-
do se agita, se torna marrn.
Hipofosfitos-Cuando se los calienta enrgicamente, los hipofosfitos desprenden fosfina que es espontneamente inflama-
ble. Los hipofosfitos en solucin producen un precipitado blanco con cloruro mercrico SR. Este precipitado se torna gris ante
la presencia de un exceso de hipofosfito. Las soluciones de hipofosfitos, acidificadas con cido sulfrico y calentadas con sulfa-
to cprico SR, producen un precipitado rojo.
Lactatos-Cuando las soluciones de lactatos se acidifican con cido sulfrico, se les agrega permanganato de potasio SR y
se calienta la mezcla, desprenden acetaldehdo. ste se puede detectar al permitir que los vapores entren en contacto con un
papel de filtro humedecido con una mezcla recin preparada de volmenes iguales de solucin acuosa de morfolina al 20% y
de nitroferricianuro de sodio SR: se produce un color azul.
Litio-Con carbonato de sodio SR, las sales de litio en soluciones moderadamente concentradas, alcalinizadas con hidrxi-
do de sodio, producen un precipitado blanco al llevarlas a ebullicin. El precipitado es soluble en cloruro de amonio SR. Las
sales de litio humedecidas con cido clorhdrico proporcionan un color carmes intenso a una llama no luminosa. Las solucio-
nes de sales de litio no precipitan en cido sulfrico 2 N o sulfatos solubles (a diferencia del estroncio).
Magnesio-Las soluciones de sales de magnesio en presencia de cloruro de amonio producen solamente un precipitado
ligeramente turbio cuando se neutralizan con carbonato de amonio SR, pero con la adicin posterior de fosfato dibsico de
sodio SR producen un precipitado blanco cristalino, insoluble en hidrxido de amonio 6 N.
Manganeso-Con sulfuro de amonio SR, las soluciones de sales manganosas producen un precipitado color salmn que se
disuelve en cido actico.
Mercurio-Cuando se aplican sobre una lmina de cobre brillante, las soluciones de sales de mercurio, exentas de un exce-
so de cido ntrico, producen un precipitado que, al frotarlo, adquiere una apariencia plateada y brillante. Con sulfuro de hi-
drgeno, las soluciones de compuestos de mercurio producen un precipitado negro que es insoluble en sulfuro de amonio SR
y en cido ntrico 2 N en ebullicin.
Sales Mercricas-las soluciones de sales mercricas producen un precipitado amarillo con hidrxido de sodio 1 N. En solu-
ciones neutras con yoduro de potasio SR, tambin producen un precipitado escarlata que es muy soluble en un exceso de
reactivo.
Sales Mercuriosos-los compuestos mercuriosos se descomponen en hidrxido de sodio 1 N y producen un color negro.
Con cido clorhdrico, las soluciones de sales mercuriosas producen un precipitado blanco que se ennegrece con hidrxido de
amonio 6 N. Con yoduro de potasio SR producen un precipitado amarillo que, al quedar en reposo, puede tornarse verde.
Nitratos-Cuando una solucin de nitrato se mezcla con un volumen igual de cido sulfrico, se enfra la mezcla y se su-
perpone una solucin de sulfato ferroso, se desarrolla un color marrn en la unin de los dos lquidos. Cuando se calienta un
nitrato con cido sulfrico y cobre metlico, se desprenden humos de color rojo amarronado. Los nitratos no decoloran el per-
manganato de potasio SR acidificado (a diferencia de los nitritos).
Nitritos-Cuando se los trata con cidos minerales diluidos o con cido actico 6 N, los nitritos desprenden humos de color
rojo-amarronado. Las soluciones colorean de azul el papel de almidn-yoduro.
Oxalatos-Las soluciones neutras y alcalinas de oxalatos forman un precipitado blanco con cloruro de calcio SR. Este preci-
pitado es insoluble en cido actico 6 N pero se disuelve con cido clorhdrico. Las soluciones de oxalatos acidificadas y calien-
tes decoloran el permanganato de potasio SR.
Permanganatos-Las soluciones de permanganatos acidificadas con cido sulfrico se decoloran con perxido de hidrge-
no SR y con bisulfito de sodio SR en fro y con cido oxlico SR en solucin caliente.
Perxidos-Las soluciones de perxidos acidificadas ligeramente con cido sulfrico proporcionan un color azul intenso
con la adicin de dicromato de potasio SR. Si la mezcla se agita con un volumen igual de ter etlico y se deja que se separen
los lquidos, el color azul se encuentra en la capa de ter etlico.
Plata-Con cido clorhdrico, las soluciones de sales de plata producen un precipitado grumoso, blanco, que es insoluble
en cido ntrico pero fcilmente soluble en hidrxido de amonio 6 N. Una solucin de una sal de plata a la que se le agrega
hidrxido de amonio 6 N y una pequea cantidad de formaldehdo SR, al entibiarla, deposita un espejo de plata metlica en
las paredes del recipiente.
Plomo-Las soluciones de sales de plomo con cido sulfrico 2 N producen un precipitado blanco que es insoluble en ci-
do clorhdrico 3 N o en cido ntrico 2 N, pero que es soluble en hidrxido de sodio 1 N tibio y en acetato de amonio SR. Con
cromato de potasio SR, las soluciones de sales de plomo, exentas o casi exentas de cidos minerales, producen un precipitado
amarillo que es insoluble en cido actico 6 N pero que es soluble en hidrxido de sodio 1 N.
Potasio-Los compuestos de potasio confieren un color violeta a una llama no luminosa, pero la presencia de pequeas
cantidades de sodio enmascara el color a menos que el color amarillo producido por el sodio se elimine con un filtro azul que
bloquee la emisin a 589 nm (sodio) pero que sea transparente a la emisin a 404 nm (potasio). Tradicionalmente se ha usado
vidrio cobalto, pero tambin hay otros filtros satisfactorios que estn disponibles comercialmente. En soluciones neutras, con-
centradas o moderadamente concentradas, de sales de potasio (dependiendo de la solubilidad y del contenido de potasio), el
bitartrato de sodio SR produce un precipitado blanco cristalino que es soluble en hidrxido de amonio 6 N y en soluciones de
hidrxidos alcalinos y carbonatos alcalinos. La formacin del precipitado, que usualmente es lenta, se acelera al agitar o frotar
USP 39 Pruebas Qumicas/ (193) ldentificacin-Tetraciclinas 247

el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. La adicin de una pequea cantidad de cido actico glacial o alcohol
tambin favorece la precipitacin.
Salicilatos-En soluciones moderadamente diluidas de salicilatos, el cloruro frrico SR produce un color violeta. La adicin
de cidos a soluciones moderadamente concentradas de salicilatos produce un precipitado blanco cristalino de cido saliclico,
que se funde entre 158 y 161 .
Sodio-A menos que se especifique algo diferente en una monografa individual, preparar una solucin que contenga O, 1 g
del compuesto de sodio en 2 mL de agua. Agregar 2 mL de carbonato de potasio al 15% y calentar hasta ebullicin. No se
forma precipitado. Agregar 4 mL de piroantimoniato de potasio SR y calentar hasta ebullicin. Dejar que se enfre en agua
helada y, si fuera necesario, frotar el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Se forma un precipitado denso. Los
compuestos de sodio confieren un intenso color amarillo a una llama no luminosa.
Sulfatos-Las soluciones de sulfatos con cloruro de bario SR producen un precipitado blanco que es insoluble en cido clor-
hdrico y en cido ntrico. Con acetato de plomo SR, las soluciones neutras de sulfatos forman un precipitado blanco que es
soluble en acetato de amonio SR. El cido clorhdrico no produce precipitado cuando se agrega a las soluciones de sulfatos (a
diferencia de los tiosulfatos).
Sulfitos-Cuando se los trata con cido clorhdrico 3 N, los sulfitos y bisulfitos desprenden dixido de azufre que ennegrece
el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR.
Tartratos-Disolver algunos mg de sal de tartrato en 2 gotas de solucin de metaperyodato de sodio (1 en 20). Agregar
1 gota de cido sulfrico 1 N y despus de 5 minutos, agregar algunas gotas de cido sulfuroso seguido de algunas gotas de
cido sulfuroso-fucsina SR: se produce un color rosado rojizo dentro de los 15 minutos.
Tiocianatos-Con cloruro frrico SR, las soluciones de tiocianato producen un color rojo que no se elimina con cidos mi-
nerales moderadamente concentrados.
Tiosulfatos-Con cido clorhdrico, las soluciones de tiosulfatos producen un precipitado de color blanco que se torna
amarillo rpidamente y dixido de azufre, que ennegrece el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR. La adicin
de cloruro frrico SR a las soluciones de tiosulfatos produce un color violeta oscuro que desaparece rpidamente.
Yoduros-Las soluciones de yoduros, con la adicin de cloro SR gota a gota, liberan yodo que colorea la solucin de amari-
llo a rojo. Si esta solucin se agita con cloroformo, ste se torna de color violeta. El yodo as liberado proporciona un color azul
con almidn SR. El nitrato de plata SR, en soluciones de yoduros, produce un precipitado amarillo grumoso, que es insoluble
en cido ntrico y en hidrxido de amonio 6 N.

(193) IDENTIFICACIN-TETRACICLINAS

Los procedimientos cromatogrficos descritos a continuacin se suministran para confirmar la identidad de los frmacos de
la Farmacopea que son del tipo tetraciclina, como por ejemplo la doxiciclina, oxitetraciclina y tetraciclina, y para confirmar la
identidad de dichos compuestos en sus respectivas formas farmacuticas de la Farmacopea. Se describen dos procedimientos,
uno basado en cromatografa en papel (Mtodo/) y otro en cromatografa en capa delgada (Mtodo 11). Utilizar el Mtodo/ a
menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.
Solucin Estndar-A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, disolver el Estndar de Referen-
cia USP del frmaco que se quiere identificar en el mismo disolvente y con la misma concentracin que los utilizados para la
Solucin de Prueba.
Solucin de Prueba-Preparar segn se indica en la monografa individual correspondiente.

MTODO 1

Solucin amortiguadora de pH 3,5 -Disolver 13,4 g de cido ctrico anhidro y 16,3 g de fosfato dibsico de sodio en
1000 mL de agua y mezclar.
Fase Mvil-El da de la prueba, mezclar 1O volmenes de cloroformo, 20 volmenes de nitrometano y 3 volmenes de
piridina.
Solucin de Prueba Mezclada-Mezclar volmenes iguales de la Solucin Estndar y de la Solucin de Prueba.
Hoja Cromatogrfica-Trazar una lnea de aplicacin a 2,5 cm de uno de los bordes de una hoja de papel de filtro, (What-
man No. 1, o equivalente) de 20 cm x 20 cm. Impregnar la hoja pasndola a travs de una cuba con Solucin amortiguadora
de pH 3,5, eliminar el exceso de disolvente presionando con firmeza la hoja entre papeles secantes no fluorescentes.
Procedimiento-En una cmara cromatogrfica adecuada preparada para cromatografa ascendente (ver Cromatografa
(621 )), colocar Fase Mvil hasta una altura de 0,6 cm. Aplicar 2 L de la Solucin Estndar, 2 L de la Solucin de Prueba y 2 L
de la Solucin de Prueba Mezclada a intervalos de 1,5 cm sobre la lnea de aplicacin de la Hoja Cromatogrfica. Dejar que la
hoja se seque parcialmente y, mientras an est hmeda, colocarla en la cmara cromatogrfica con el borde inferior en con-
tacto con la Fase Mvil. Cuando el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente 1O cm, retirar la hoja de la cmara
y exponerla a vapores de amonaco. Examinar el cromatograma bajo luz UV de longitud de onda larga. Registrar las posiciones
248 (193) ldentificacin-Tetraciclinas / Pruebas Qumicas USP 39

de las manchas amarillas fluorescentes principales: el valor Rr de la mancha principal obtenida a partir de la Solucin de Prueba
y de la Solucin de Prueba Mezclada se corresponde con el de la mancha obtenida de la Solucin Estndar.

MTODO 11

Solucin de Resolucin-A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, preparar una solucin en
metanol que contenga 0,5 mg de ER Clorhidrato de Clortetraciclina USP, 0,5 mg de ER Hiclato de Doxiciclina USP, 0,5 mg de
ER Oxitetraciclina USP y 0,5 mg de ER Clorhidrato de Tetraciclina USP por ml.
Fase Mvil-Preparar una mezcla de cido oxlico 0,5 M, previamente ajustado con hidrxido de amonio a un pH de 2,0,
acetonitrilo y metanol (80:20:20).
Placa Cromatogrfica-Utilizar una placa para cromatografa en capa delgada adecuada (ver Cromatografa en Capa Delga-
da en Cromatografa (621 )) recubierta con una capa de 0,25 mm de mezcla de gel de slice octilsilanizada para cromatografa.
Activar la placa calentndola a 130 durante 20 minutos, dejar que se enfre y utilizarla mientras an est tibia.
Procedimiento-Aplicar por separado 1 L de la Solucin Estndar, 1 L de la Solucin de Prueba y 1 L de la Solucin de
Resolucin a la Placa para Cromatografa. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en la Fase Mvil
hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de
la cmara de desarrollo, marcar el frente de la fase mvil y dejar que la placa se seque al aire. Exponer la placa a vapores de
amonaco durante 5 minutos y localizar rpidamente las manchas en la placa observndola bajo luz UV de longitud de onda
larga: el cromatograma de la Solucin de Resolucin presenta manchas bien separadas y el valor Rr, la intensidad y el aspecto de
la mancha principal obtenida de la Solucin de Prueba se corresponden con los de la mancha obtenida de la Solucin Estndar.

(197) PRUEBAS DE IDENTIFICACIN ESPECTROFOTOMTRICA

Las pruebas espectrofotomtricas son las de mayor importancia en la identificacin de muchas de las sustancias qumicas del
compendio. Los procedimientos de se indican a continuacin se a sustancias absorben radiacin infra-
ultravioleta (UV) (ver :11,;MllllM~\'1~~!1'~illi~illil~~-llll!IBllll!irmlllllllll!llll~f~lll!li~~
lll~l~lil~~j)
espectro de absorcin IR de una sustancia, en comparacin con el que se obtuvo concomitantemente para el Estndar de
Referencia USP correspondiente, proporciona quiz la evidencia ms concluyente de la identidad de la sustancia, que puede
obtenerse en una sola prueba. El espectro de absorcin UV, por otro lado, no presenta un alto grado de especificidad. La con-
formidad con las especificaciones de prueba referentes tanto para la absorcin IR como con la absorcin UV, segn se indica
en una gran proporcin de monografas oficiales, deja pocas dudas, si las hubiera, con respecto a la identidad de la muestra
que se est examinando.

ABSORCIN EN EL INFRARROJO

Se indican siete mtodos para la preparacin de muestras de prueba y Estndares de Referencia previamente secados para el
anlisis. La referencia (197K) en una monografa significa que la sustancia que se est examinando se mezcla ntimamente con
bromuro de potasio. La referencia (l 97M) en una monografa significa que la sustancia que se est examinando se muele fina-
mente y se dispersa en aceite mineral. La referencia (197F) en una monografa significa que la sustancia que se est examinan-
do se suspende pura entre placas adecuadas (por ejemplo, de cloruro de sodio o bromuro de potasio). La referencia (1975)
significa que se prepara una solucin de concentracin especificada en el disolvente especificado en la monografa individual, y
que la solucin se examina en celdas de O, 1 mm, a menos que se especifique una longitud de paso diferente para las celdas en
la monografa individual. La referencia (197A) significa que la sustancia que se est examinando est en contacto ntimo con
un elemento de reflexin interna para el anlisis de reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas en ingls). La referencia
(l 97E) significa que la sustancia que se est analizando se presiona como una muestra muy delgada contra una placa adecua-
da para el microanlisis IR. La referencia (l 97D) en una monografa significa que la sustancia que se est examinando se mezc-
la ntimamente con un material transparente para IR y se transfiere a un recipiente de muestra para anlisis por reflexin difusa
(DR, por sus siglas en ingls). Las tcnicas ATR (l 97A) y (197E) pueden usarse como mtodos alternativos para (l 97K),
(l 97M), (l 97F) y (1975) cuando la prueba se realiza cualitativamente y los espectros del Estndar de Referencia se obtienen de
manera similar.
Registrar los espectros de la muestra de prueba y el correspondiente Estndar de Referencia USP en el intervalo de aproxima-
damente 2,6 m a 15 m (3800 cm-1 a 650 cm-1) a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. El
espectro de absorcin IR de la preparacin obtenida a partir de la muestra de prueba, previamente secada bajo las condiciones
USP 39 Pruebas Qumicas/ (201) Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada 249

especificadas para el Estndar de Referencia correspondiente, a menos que se especifique algo diferente, o que el Estndar de
Referencia se emplee sin secar, presenta mximos slo a las mismas longitudes de onda que el de una preparacin similar del
Estndar de Referencia USP correspondiente.
Las diferencias que pueden observarse en los espectros as obtenidos a veces se atribuyen a la presencia de polimorfos, lo
cual no es siempre aceptable (ver Procedimiento en Por lo tanto, a menos que se especifique algo dife-
rente en la monografa individual, continuar del siguiente aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del
estndar, disolver porciones iguales de la muestra de prueba y del Estndar de Referencia en volmenes iguales de un disolven-
te apropiado, evaporar la solucin hasta sequedad en envases similares, bajo condiciones idnticas, y repetir la prueba con los
residuos.

ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA

La referencia (197U) en una monografa significa que una solucin de prueba y una Solucin estndar se examinan espectro-
fotomtricamente, en celdas de 1 cm, sobre el intervalo espectral de 200 nm a 400 nm, a menos que se especifique algo dife-
rente en la monografa individual.
Disolver una porcin de la sustancia que se est examinando en el Medio especificado para obtener una solucin de prueba
que tenga la concentracin especificada en la monografa para Solucin. En forma similar, preparar una Solucin Estndar que
contenga el Estndar de Referencia USP correspondiente.
Registrar y comparar los espectros obtenidos concomitantemente para la solucin de prueba y la Solucin Estndar. Calcular
los cocientes de absortividad y/o absorbancia si estos criterios estn incluidos en una monografa individual. A menos que se
especifique algo diferente, las absorbancias indicadas para estos clculos son aquellas medidas a la absorbancia mxima, apro-
ximadamente a la longitud de onda especificada en la monografa individual. Cuando la absorbancia se deba medir aproxima-
damente a la longitud de onda especificada en lugar de la mxima absorbancia, las abreviaturas (min) y (sh) se utilizan para
indicar un mnimo y un hombro (shoulder), respectivamente, en un espectro de absorcin. Los requisitos se cumplen si los
espectros de absorcin UV de la solucin de prueba y de la Solucin Estndar presentan mximos y mnimos a las mismas
longitudes de onda y los cocientes de absortividad y/o absorbancia estn dentro de los lmites especificados.

(201) PRUEBA DE IDENTIFICACIN POR CROMATOGRAFA EN CAPA

DELGADA

PROCEDIMIENTO GENERAL

El procedimiento descrito a continuacin tiene como fin verificar la identificacin de muchos frmacos farmacopeicos y de
sus formas farmacuticas correspondientes.
Preparar una solucin de prueba segn las indicaciones de la monografa individual correspondiente. En una placa para cro-
matografa en capa delgada adecuada, recubierta con una capa de mezcla de gel de slice para cromatografa de 0,25 mm (ver
Cromatografa (621 )), aplicar, en una lnea paralela al borde y aproximadamente a 2 cm, 1O L de esta solucin y 1O L de una
Solucin estndar; preparada a partir del Estndar de Referencia USP del frmaco que se quiere identificar, en el mismo disol-
vente y a la misma concentracin que para la solucin de prueba, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma con una fase mvil constituida por una mezcla
de cloroformo, metanol y agua (180:15:1 ), a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, hasta que el
frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cmara de
desarrollo, marcar el frente de la fase mvil y dejar que el disolvente se evapore. A menos que se especifique algo diferente en
la monografa individual, localizar las manchas de la placa examinndolas bajo luz UV de longitud de onda corta. El valor RF de
la mancha principal obtenida a partir de la solucin de prueba se corresponde con el obtenido a partir de la Solucin estndar.

PROCEDIMIENTO PARA BACITRACINA, NEOMICINA Y POLIMIXINA B

El procedimiento de cromatografa en capa delgada descrito a continuacin tiene como fin verificar la identificacin de los
ingredientes activos bacitracina, neomicina y polimixina By en sus formas farmacuticas cuando se encuentran presentes de
forma aislada o en mezclas de dos o tres componentes. La referencia (201 BNP) en una monografa indica que ste es el proce-
dimiento a seguir.
Preparar una Solucin de Prueba segn se indica a continuacin, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual.
250 (201) Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada / Pruebas Qumicas USP 39

Solucin de Prueba-
PARA FRMACOS-Disolver una porcin de Bacitracina, Bacitracina Cinc, Sulfato de Neomicina o Sulfato de Polimixina Ben
cido clorhdrico O, 1 N para obtener una solucin que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL, 3,5 mg de neomici-
na (base) por mL, o 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml.
PARA SOLUCIONES-Si la Solucin contiene neomicina y polimixina B, diluir una porcin de solucin con cido clorhdrico O, 1
N para obtener una solucin que contenga, aproximadamente, la cantidad equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por ml.
Si la Solucin contiene polimixina B pero no neomicina, diluir una porcin de solucin con cido clorhdrico O, 1 N para obte-
ner una solucin que contenga aproximadamente 1O000 Unidades USP de Polimixina B por mL.
PARA CREMAS, LOCIONES Y UNGENTOS-Si la Crema, la Locin o el Ungento contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, transferir
una porcin que equivalga aproximadamente a 500 Unidades USP de Bacitracina a un tubo de centrfuga de 15 mL. Si la Cre-
ma, la Locin o el Ungento contiene neomicina pero no contiene Bacitracina ni Bacitracina Cinc, transferir una porcin que
equivalga aproximadamente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL a un tubo de centrfuga de 15 ml. Agregar 4 mL de cloro-
formo al tubo de centrfuga y agitar bien para dispersar la Crema, la Locin o el Ungento. Agregar 1 mL de cido clorhdrico
O, 1 N, mezclar en un mezclador por vrtice durante 4 minutos, centrifugar y usar el sobrenadante transparente.
NOTA-En el Procedimiento Modificado se puede usar la Solucin de Prueba Modificada preparada segn se indica a continua-
cin en lugar de la Solucin de Prueba.
Solucin de Bacitracina Estndar-Disolver una porcin de ER Bacitracina Cinc USP en cido clorhdrico O, 1 N para obte-
ner una solucin que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por ml.
Solucin de Neomicina Estndar-Disolver una porcin de ER Sulfato de Neomicina USP en cido clorhdrico O, 1 N para
obtener una solucin que contenga el equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por ml.
Solucin de Polimixina B Estndar-Disolver una porcin de ER Sulfato de Polimixina B USP en cido clorhdrico O, 1 N
para obtener una solucin que contenga 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml. Si el artculo en anlisis tambin con-
tiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, disolver una porcin de ER Sulfato de Polimixina B USP en cido clorhdrico O, 1 N para
obtener una solucin que contenga 500} Unidades USP de Polimixina B por mL, donde j es el cociente entre las cantidades de
Unidades USP de Polimixina By de Unidades USP de Bacitracina declaradas en la etiqueta por g de Crema, Locin o Ungen-
to.
Fase Mvil-Preparar una mezcla de metano!, alcohol isoproplico, cloruro de metileno, hidrxido de amonio y agua
(4:2:2:2:1,5).
Procedimiento-Aplicar 1O L de Solucin de prueba y 1O L de cada una de las Soluciones Estndar que corresponda a una
placa para cromatografa en capa delgada adecuada (ver Cromatografa (621 )), recubierta con una capa de gel de slice para
cromatografa de 0,25 mm de espesor. Colocar la placa en una cmara cromatogrfica presaturada y desarrollar los cromato-
gramas con la Fase Mvil hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la
placa. Retirar la placa de la cmara y secar a 105 durante 1O minutos. Rociar la placa con una solucin al 0,2% de ninhidrina
en alcohol butlico y calentarla a 105 durante 5 minutos. El valor Rr de cada mancha principal en el cromatograma de la
Solucin de Prueba se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solucin Estn-
dar que corresponda segn el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta. Si el cromatograma de la Solucin de Prueba
presenta demasiadas bandas, proceder segn se indica en el Procedimiento Modificado.
Procedimiento Modificado-Transferir la Solucin de Prueba a un tubo de centrfuga de 15 mL, agregar 1O mL de solucin
acuosa de cido pcrico saturada (1,2%, p/v), mezclar en un mezclador por vrtice durante 1 minuto, centrifugar durante 1 O
minutos y desechar el sobrenadante. Lavar el residuo con porciones de agua de 1 mL hasta que no se observe color amarillo
en el lavado. Desechar los lavados y secar el residuo bajo una corriente de nitrgeno a 50. Disolver el residuo en 1 mL de
acetona, agregar 1 mL de una solucin de cido sulfrico en acetona (1 en 100) recin preparada, agitar, centrifugar durante
5 minutos y desechar el sobrenadante. Enjuagar el residuo con 1 mL de acetona, centrifugar brevemente y desechar el lavado.
Repetir el lavado hasta que no se observe color amarillo. Secar el residuo bajo una corriente de nitrgeno a 50. Disolver el
residuo en 0,5 mL de cido clorhdrico O, 1 N (Solucin de Prueba Modificada). Repetir el Procedimiento utilizando esta Solucin
de Prueba Modificada en lugar de la Solucin de Prueba. El valor Rr de cada mancha principal en el cromatograma de la Solucin
de Prueba Modificada se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solucin
Estndar que corresponda segn el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta.

(202) IDENTIFICACIN DE ACEITES FIJOS POR CROMATOGRAFA EN

CAPA DELGADA

INTRODUCCIN
El siguiente procedimiento para la prueba de Identificacin de la USP se usa para identificar aceites fijos usando cromatografa
en capa delgada de alta resolucin (HPTLC), con un gel de slice octadecilsilanizado adecuado como sustancia de recubri-
miento.
USP 39 Pruebas Qumicas / (202) Identificacin de Aceites Fijos 251

IDENTIFICACIN
MTODO 1
Fase mvil 1: ter etlico
Fase mvil 2: Cloruro de metileno, cido actico glacial y acetona (20:40:50)
Solucin de aptitud del sistema 1: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de ER Aceite de Maz USP en 3 mL de clo-
ruro de metileno.
Solucin de aptitud del sistema 2: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de ER Aceite de Oliva USP en 3 mL de clo-
ruro de metileno.
Solucin estndar: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) del Estndar de Referencia USP apropiado en 3 mL de do-
ruro de metileno.
Solucin muestra: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de una muestra de aceite fijo en 3 mL de cloruro de metile-
no.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Cromatografa en Capa Delgada.)
Modo: HPTLC
Placa: 20 cm x 1 O cm, capa de geJ de slice 60 RP-18 de O, 15-0,2 mm, con un tamao de partcula de 4-8 m 1
Volumen de aplicacin: 1 L, aplicacin manual
Solucin reveladora: 100 mg/mL de cido fosfomolbdico en alcohol al 96%
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema 7 y Solucin de aptitud del sistema 2
Requisitos de aptitud
Resolucin: Las cuatro manchas principales de aceite de maz estn claramente identificadas y separadas, al igual que
las dos manchas principales de aceite de oliva.
[NOTA-Los factores de retardo (Rr) se proveen slo para propsitos informativos para ayudar en la identificacin de las
manchas. Los valores Rr de las cuatro manchas principales de ER Aceite de Maz USP son 0,39; 0,45; 0,51 y 0,56, y los
valores Rr de las dos manchas principales del ER Aceite de Oliva USP son 0,39 y 0,45.]
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Aplicar las Muestras en bandas separadas en el punto de inicio previamente marcado en una placa para HPTLC y desarrollar
la placa en el orden siguiente:
(1) Asegurar que las aplicaciones estn al menos 3 mm por encima de la superficie de la fase mvil. Desarrollar dos veces
a lo largo de un recorrido de 0,5 cm usando la Fase mvil 7. Retirar la placa de la cmara despus de cada corrida y
dejar que la placa se seque al aire.
(2) Desarrollar dos veces a lo largo de un recorrido de 8 cm usando la Fase mvil 2. Dejar que la placa se seque durante
aproximadamente 5 minutos despus de cada desarrollo y antes de rociar con la solucin reveladora.
Rociar la placa con la Solucin reveladora.
Calentar la placa a 120 durante aproximadamente 1 minuto y observar bajo luz diurna.
Criterios de aceptacin: Los valores Rr de las manchas principales de la Solucin muestra corresponden a los de la Solucin
estndar.
MTODO 11
Fase mvil: Cloruro de metileno, cido actico glacial y acetona (20:40:50)
Solucin de aptitud del sistema 1: Disolver 25 L de ER Aceite de Maz USP en 3 mL de cloruro de metileno.
Solucin de aptitud del sistema 2: Disolver 25 L de ER Aceite de Oliva USP en 3 mL de cloruro de metileno.
Solucin estndar: Disolver 25 L del Estndar de Referencia USP apropiado en 3 mL de cloruro de metileno.
Solucin muestra: Disolver 25 L de una muestra de aceite fijo en 3 mL de cloruro de metileno.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Cromatografa en Capa Delgada.)
Modo: HPTLC
Placa: 20 cm x 1 O cm, capa de gel de slice 60 RP 18 (o RP-18 F254 ) de O, 15-0,2 mm, con un tamao de partcula de 4-8
m
Acondicionamiento de la placa: Acondicionar la placa a una humedad relativa de aproximadamente 33%.
Volumen de aplicacin: 2 Len bandas de 8 mm. Se usa un aparato automatizado adecuado.
Solucin reveladora: 25 mg/mL de cido fosfomolbdico en alcohol al 96%
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema 7 y Solucin de aptitud del sistema 2
Requisitos de aptitud
Resolucin: Las cuatro bandas principales de aceite de maz estn claramente identificadas y separadas, al igual que las
dos bandas principales de aceite de oliva.

1 Placa de Gel de Slice para HPTLC 60 RP-18 de Merck EMD o equivalente.

252 (202) Identificacin de Aceites Fijos / Pruebas Qumicas USP 39

[NOTA-Los factores de retardo (RF) se proveen slo para propsitos informativos para ayudar en la identificacin de las
bandas. Los valores RF de las cuatro bandas principales del ER Aceite de Maz USP son 0,20; 0,26; 0,30 y 0,34, y los valo-
res RF para las dos bandas principales del ER Aceite de Oliva USP son 0,20 y 0,26.]
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Desarrollar previamente la placa con cloruro de metileno hasta el borde superior. Secar la placa a 120 durante 1 O minutos.
Aplicar las Muestras en bandas separadas en el punto de inicio previamente marcado en una placa para HPTLC.
Asegurar que las bandas estn al menos 3 mm por encima de la superficie de la fase mvil.
Desarrollar durante un recorrido de 7 cm usando la Fase mvil. Dejar que la placa se seque al aire.
Tratar la placa con la Solucin reveladora.
Calentar la placa a 120 durante 3 minutos y observar bajo luz diurna.
Criterios de aceptacin: Los valores RF de las bandas principales de la Solucin muestra corresponden a los de la Solucin
estndar.

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Aceite de Almendra USP
ER Aceite de Semilla de Borraja USP
ER Aceite de Canola USP
ER Aceite de Maz USP
ER Aceite de Semilla de Algodn USP
ER Aceite de Onagra USP
ER Aceite de Semilla de Lino USP
ER Aceite de Oliva USP
ER Aceite de Palma USP
ER Aceite de Cacahuate USP
ER Aceite de Crtamo USP
ER Aceite de Ssamo USP
ER Aceite de Soja USP
ER Aceite de Girasol USP

(203) PROCEDIMIENTO DE CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA DE

ALTA RESOLUCIN PARA IDENTIFICACIN DE ARTCULOS DE ORIGEN
BOTNICO

INTRODUCCIN

Este captulo describe un procedimiento para uso en una prueba de Identificacin de la USP que se basa en la tcnica de
cromatografa en capa delgada de alta resolucin (HPTLC). Se aplica a la identificacin de artculos de origen botnico en los
compendios USP que sirven como frmaco o medicamento, o como ingrediente diettico o suplemento diettico. Se describe
brevemente como controlar cuidadosamente las variables para la tcnica de HPTLC incluyendo referencias a informacin ms
detallada provista en los manuales de los equipos. La reproducibilidad de los resultados permite comparar materiales botnicos
con ingredientes no oficiales aunque estn estrechamente relacionados. La tcnica analtica emplea placas para cromatografa
de alta resolucin, equipo apropiado para controlar variables y una prueba de aptitud del sistema para propsitos de califica-
cin del desempeo. [NOTA-Para informacin adicional, ver Identificacin de Artculos de Origen Botnico por Cromatografa en
Capa Delgada de Alta Resolucin (1064).]

EQUIPO REQUERIDO

El equipo usado para la tcnica de HPTLC incluye lo siguiente:

Placas: A menos que se especifique de otro modo en la monografa individual, usar placas recubiertas con una capa uni-
forme de 200 m de gel de slice poroso (con un tamao de poro de 60 ) con partculas irregulares de entre 2-1 O m y
un tamao promedio de partcula de 5 m, un aglutinante polimrico y un indicador fluorescente (F 254 ) de 20 x 1 O cm.
[NOTA-Se prefieren los mtodos cromatogrficos que usan placas de vidrio para cromatografa en capa delgada de alta
resolucin a los que usan lminas con soporte de aluminio debido a la mayor rigidez y estabilidad mecnica del vidrio.]
USP 39 Pruebas Qumicas/ (203) Cromatografa en Capa Delgada 253

Un dispositivo adecuado para la aplicacin de los volmenes de muestras especificados, en bandas de las longitudes espe-
cificadas, y en las posiciones especificadas
Una cmara cromatogrfica adecuada (por ejemplo, una cmara de cubetas gemelas) que permita el control de la satura-
cin y de la distancia de desarrollo
Un dispositivo adecuado para controlar la actividad de la fase estacionaria mediante humedad relativa
Un dispositivo adecuado para el secado reproducible de la placa ya desarrollada
Un dispositivo adecuado para el tratamiento de la placa con reactivo de derivatizacin, si fuera necesario
Un dispositivo adecuado para el calentamiento como parte del procedimiento de derivatizacin, si fuera necesario
Un sistema adecuado para la documentacin de cromatogramas bajo UV 254 nm, UV 366 nm y luz blanca
Cada uno de estos dispositivos as como el sistema en su totalidad deben pasar la calificacin de la instalacin, operacin y
desempeo ( IQ, OQ y PQ, por sus siglas en ingls) para asegurar que los instrumentos estn funcionando de acuerdo con sus
especificaciones para controlar variables dentro de los intervalos designados. [NOTA-Para informacin adicional, ver Califica-
cin de Instrumentos Analticos (1058).] Por lo general, los fabricantes del instrumento realizan la calificacin de la instalacin y
de la operacin. El analista lleva a cabo la prueba de aptitud del sistema como prueba de la calificacin del desempeo.

PROCEDIMIENTO

Preparacin de la Solucin de Prueba

A menos que se indique de otro modo en la monografa individual, someter a ultrasonido durante 15 minutos con 1 mL de
metanol, 100 mg de un ingrediente botnico reducido a polvo, 1O mg de un extracto o fraccin secos, o la cantidad de una
forma farmacutica que contenga el equivalente a las cantidades mencionadas anteriormente del correspondiente ingrediente
botnico. Despus de centrifugar o flitrar, usar el filtrado o el sobrenadante como la Solucin muestra. A menos que se indique
de otro modo en la monografa individual, disolver 50 L de un aceite esencial en 1 mL de tolueno y usar como la Solucin
muestra.

Preparacin de las Soluciones Estndar

A menos que se indique de otro modo en la monografa individual, disolver los Estndares de Referencia USP de compuestos
marcadores individuales a una concentracin de 1 mg/mL en metano!. Agitar y someter a ultrasonido los Extractos Estndares
de Referencia USP en metanol a una concentracin de 1O mg/mL o, para aceites esenciales, disolver los Materiales de Referen-
cia USP en tolueno a una concentracin de 50 L/mL.

Aplicacin de la Muestra y Distribucin de la Placa

Aplicar las muestras en bandas estrechas de 8,0 0,5 mm de longitud a una distancia de 8,0 0,5 mm del borde inferior de
la placa. Aplicar los estndares de aptitud del sistema en el carril ms cercana al borde lateral a no menos de 20 mm del borde
lateral de la placa. La distancia entre los carriles (centro a centro) es no menos de 11,0 0,5 mm. Todos los volmenes de
aplicacin se especifican en la monografa individual. Los volmenes de aplicacin por lo regular van de 2,0 a 10,0 L. La dis-
tancia de desarrollo se marca con un lpiz cerca de uno de los bordes laterales de la placa antes del desarrollo, aunque tam-
bin se puede utilizar un dispositivo electrnico de deteccin de frente de fase mvil.

Preacondicionamiento de la Placa

Despus de la aplicacin de la muestra y a menos que se indique de otro modo en la monografa individual, acondicionar la
placa a una humedad relativa de 33% durante un mnimo de 1O minutos (por ejemplo, dejndola en reposo en una cmara
cerrada que contenga una solucin saturada de cloruro de magnesio).

Preparacin de la Cmara de Desarrollo y Desarrollo de la Placa

Cuando se use una cmara de cubetas gemelas, recubrir la pared trasera con papel de filtro inmerso en la cubeta trasera.
Cargar la cmara con un volumen suficiente de fase mvil para humedecer completamente el papel de filtro y lograr un nivel
de fase mvil de exactamente 5 mm en ambas cubetas. Dejar la cmara con la tapa cerrada durante 20 minutos para lograr la
saturacin. Introducir la placa en posicin vertical en la cubeta delantera de la cmara de modo que la capa de recubrimiento
est orientada hacia el papel de filtro. Cuando la fase mvil haya alcanzado una distancia correspondiente a una distancia de
desarrollo de 6 cm, retirar la placa de la cmara y secarla en posicin vertical en una corriente de aire fro que no afecte la
integridad de las zonas separadas. La monografa individual puede especificar otras configuraciones de cmara y distancias de
desarrollo. [NOTA-Se pueden usar otras cmaras de desarrollo si los resultados obtenidos cumplen con todos los requisitos de
aptitud del sistema.]
254 (203) Cromatografa en Capa Delgada / Pruebas Qumicas USP 39

Procedimiento de Derivatizacin
Cuando se usen reactivos de derivatizacin, rociar de manera homognea volmenes definidos de reactivos en solucin (por
lo general 1-2 mL) sobre la placa, o sumergir la placa en la solucin reactivo a una velocidad definida y durante un tiempo de
inmersin definido. [NOTA-Una velocidad de inmersin de 50 mm/segundo y un tiempo de inmersin de 1 segundo funciona
bien para la mayora de los reactivos no acuosos.]

Visualizacin
Los cromatogramas en la placa se visualizan segn se indica en la monografa individual. La observacin y la evaluacin se
pueden realizar bajo luz UV 254 nm, UV 366 nm o luz blanca antes y despus de la derivatizacin.

Aptitud del Sistema

Para verificar la aptitud del sistema en lo que respecta a resolucin, posicin y color de las bandas, a menos que se indique
de otro modo en la monografa individual, seleccionar dos o ms sustancias de referencia que tengan valores RF similares pero
apenas separables en las condiciones cromatogrficas que se van a usar; por ejemplo, cido clorognico (azul) e hipersido
(anaranjado amarillento) en sistemas cromatogrficos usados para flavonoides. Pueden estar disponibles mezclas de Estndares
de Referencia USP para aptitud del sistema, o las sustancias designadas para verificar la aptitud del sistema en lo que respecta a
resolucin, posicin y colores de las bandas pueden estar incluidas en los Extractos Estndares de Referencia USP. La descrip-
cin de la resolucin, posicin y colores para las bandas clave de la identificacin del material de referencia deben correspon-
derse con la descripcin de la monografa dentro de un intervalo de tolerancia especificado. Los requisitos de aptitud del siste-
ma en una monografa individual se cumplen cuando los resultados obtenidos cumplen con los especificados en la monogra-
fa.

Evaluacin y Criterios de Aceptacin

Los cromatogramas de la Solucin muestra y la Solucin estndar se comparan contra la descripcin de la seccin Criterios de
aceptacin de la monografa con respecto a la posicin de las zonas, la separacin de las zonas, el color y la intensidad relativa.

Documentacin
La documentacin es necesaria para registrar los resultados de manera que se puedan auditar, a fin de cumplir con las bue-
nas prcticas de fabricacin vigentes. Se deben usar herramientas apropiadas de documentacin; por ejemplo, una cmara
adecuada para tomar fotos digitales bajo luz UV y blanca, as como software de generacin de imgenes adecuado para archi-
var, recuperar y analizar los resultados lo que facilita el mantenimiento de registros electrnicos.

PRUEBAS DE LMITE

(206) ALUMINIO

El objetivo de este procedimiento es demostrar que el contenido de aluminio (Al) no excede el lmite establecido en la mo-
nografa individual de una sustancia cuya etiqueta indica que est destinada a ser usada en hemodilisis. [NOTA-Las Prepara-
ciones Estndar y la Preparacin de Prueba pueden modificarse, si fuera necesario, para obtener soluciones de concentraciones
adecuadas adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento.]
Diluyente de cido Ntrico-Transferir 40 mL de cido ntrico a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con
agua.
Preparaciones Estndar-Tratar un alambre de aluminio con cido clorhdrico 6 Na 80 durante algunos minutos. Disol-
ver aproximadamente 100 mg del alambre tratado, pesados con exactitud, en una mezcla de 1O mL de cido clorhdrico y 2
mL de cido ntrico calentando aproximadamente a 80 durante aproximadamente 30 minutos. Continuar el calentamiento
hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 4 ml. Enfriar a temperatura ambiente y agregar 4 mL de agua. Evaporar
hasta aproximadamente 2 mL calentando. Enfriar y transferir esta solucin, con ayuda de agua, a un matraz volumtrico de
100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 10,0 mL de esta solucin a un segundo matraz volumtrico de 100
mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un tercer matraz volumtrico de 100 mL, diluir a
volumen con agua y mezclar. La concentracin de aluminio en esta Preparacin Estndar es aproximadamente 1,0 g por ml.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 255

Si se requiere una Preparacin Estndar ms diluida, transferir porciones de 1,0; 2,0 y 4,0 mL de esta solucin a sendos matra-
ces volumtricos de 100 mL, diluir a volumen con Diluyente de cido Ntrico y mezclar. Estas soluciones contienen 0,01 g;
0,02 g y 0,04 g de Al por mL, respectivamente.
Preparacin de Prueba-A menos que se indique algo diferente en la monografa correspondiente, transferir una cantidad
de la sustancia de prueba pesada con exactitud (en g), segn se indica en la monografa, a un matraz volumtrico de plstico
de 100 mL, agregar 50 mL de agua y someter a ultrasonido durante 30 minutos. Agregar 4 mL de cido ntrico, diluir a volu-
men con agua y mezclar.

Procedimiento-Determinar las absorbancias de las Preparaciones Estndar y de la Preparacin de Prueba en la lnea de emi-
sin del aluminio a nm, con un espectrofotmetro de absorcin atmica adecuado (ver lllllrl~lllilllll1Rll
lllllllmllll~iJBlll> equipado con una lmpara de aluminio de ctodo hueco y un horno elctrico sin llama, emplean-
do Diluyente como blanco. Graficar las absorbancias de las Preparaciones Estndar en funcin del contenido de
Al, en g por mL y trazar la lnea recta que mejor se ajuste a los tres puntos graficados. A partir del grfico as obtenido, deter-
minar la cantidad, en g, de Al en cada mL de la Preparacin de Prueba. Calcular la cantidad de Al en la muestra tomada, en g
por g, multiplicando este valor por 100/W, donde W es el peso, en g, de la sustancia tomada para preparar la Preparacin de
Prueba.

(207) PRUEBA PARA EL DERIVADO 1,6-ANHIDRO DE ENOXAPARINA

SDICA

El siguiente procedimiento se usa para determinar los niveles de las formas 1,6-anhidro en la enoxaparina sdica. [NOTA-La
prueba para el derivado 1,6-anhidro slo se realiza cuando se especifica en la monografa individual.]

INTRODUCCIN

Los disacridos especificados en este captulo general se listan por nombre y estructura en el Apndice 7; los oligosacridos se
listan en el Apndice 2.
La despolimerizacin de la heparina hasta enoxaparina sdica produce una conversin parcial pero caracterstica de glucosa-
minas en las terminales reductoras de las cadenas de oligosacridos con glucosamina 6-0 sulfato terminal, produciendo deriva-
dos 1,6-anhidro (ver Figura 1).

itS~[i=~~fa,j=S-"Y"
HO OR1 HO /H
R2
HO OR1 Rp /H
R2 n
HO OR1 HO /H
R2

R,= -H

n=O a 20

Figura 1. Estructura de la enoxaparina sdica que contiene un derivado 1,6-anhidro en el extremo reductor de la cadena.

El porcentaje de cadenas de oligosacridos que se encuentran cclicos en un anillo 1,6-anhidro es una caracterstica de la
enoxaparina sdica.

DESPOLIMERIZACIN DE ENOXAPARINA SDICA POR LAS HEPARINASAS Y

OLIGOSACRIDOS RESULTANTES

La valoracin involucra un anlisis de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls) de una solu-
cin de enoxaparina sdica despolimerizada por una mezcla de heparinasas. Despus de la despolimerizacin enzimtica, los
residuos 1,6-anhidro principales de la enoxaparina sdica observados son el 1,6-anhidro ~llS, el 1,6-anhidro ~llSPi, el 1,6-anhi-
dro ~IS y el 1,6-anhidro ~IS-ISPi (ver Apndice 2).
256 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Qumicas USP 39

Las heparinasas no escinden completamente el tetrasacrido 1,6-anhidro AIS-ISPi (forma de manosamina 2-0-sulfatada). Los
dos disacridos (el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllSPi), que generalmente coeluyen, tienen mala resolucin comparados
con AllA (ver Apndice 7), especialmente porque este ltimo se presenta como dos anmeros: a y fJ. Para poder cuantificar el
1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllSPi, la muestra de enoxaparina sdica ya despolimerizada por las heparinasas se reduce
con borohidruro de sodio (ver Figura 2).

RO~
HO
h oR,

NHR2
OH

OH~ R,O~H
OR
OH
:
'
O

NHR2
NaBH
-'-
OH

R,O~OH
OR
OH
i
'

NHR2

Figura 2. Reduccin de oligosacridos con borohidruro de sodio

La reduccin con borohidruro de sodio elimina el efecto anomrico +-> P al abrir el anillo del oligosacrido terminal. Los
cuatro derivados 1,6-anhidro (ver Apndice 2) no se reducen con el borohidruro de sodio porque el puente 1,6-anhidro blo-
quea la apertura del anillo. La reduccin de los oligosacridos disminuye su tiempo de retencin, mientras que el tiempo de
retencin de los derivados 1,6-anhidro permanece inmutable. Por esa razn, es posible separar los dos compuestos, el 1,6-
-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllSPi, del pico del disacrido AllA reducido. [NOTA-El 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllSPi
eluyen como dos picos sin resolver y se cuantifican juntos como un solo compuesto, el 1,6-anhidro AllS. Por lo tanto, con el
objeto de simplificar, la forma epimrica no se menciona en adelante.]

PROCEDIMIENTO
Estndares de Referencia USP (11 )-ER Enoxaparina Sdica USP.
Soluciones-
Solucin A-Disolver 0,280 g de fosfato monobsico de sodio en 950 mL de agua, ajustar con cido fosfrico a un pH de
3,0 y diluir con agua a 1000 mL.
Solucin 8-Disolver 140 g de perclorato de sodio en 950 mL de Solucin A, ajustar con cido fosfrico a un pH de 3,0 y
diluir con Solucin A a 1000 ml.
Fase Mvil-Usar mezclas variables de Solucin A y Solucin B, filtradas y desgasificadas, segn se indica en el Sistema Croma-
togrfico.
Solucin de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0-Disolver 1O mg de albmina srica bovina y 32 mg de acetato de calcio en
60 mL de agua. Agregar 580 L de cido actico glacial y ajustar con hidrxido de sodio 2 M a un pH de 7,0. Transferir a un
matraz volumtrico de 100 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro con un tamao de poro de
0,45 m o 0,22 m.
Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0-Disolver 68 mg de fosfato monobsico de potasio y 10 mg de alb-
mina srica bovina en 30 mL de agua en un matraz volumtrico de 50 ml. Ajustar con hidrxido de potasio, si fuera necesario,
a un pH de 7,0 y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro con un tamao de poro de 0,45 m o 0,22
m.
Solucin de Borohidruro de Sodio-Disolver 12 mg de borohidruro de sodio en 400 L de agua y mezclar en un mezclador
por vrtice. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de usar.]
Solucin de Heparinasa 7-Disolver heparinasa 1 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [refe-
rencia: heparina liasa 1, EC 4.2.2.7] en Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 1,0 para obtener una solucin con
una actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solucin a -20 hasta el momento de su uso. [NOTA-Las soluciones de heparina-
sa se pueden almacenar durante 3 meses a -20.]
Solucin de Heparinasa 2-Disolver heparinasa 2 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones [sin
nmero EC] en Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solucin con una actividad de 0,4 UI
por ml. Almacenar la solucin a -20 hasta el momento de su uso.
Solucin de Heparinasa 3-Disolver heparinasa 3 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [refe-
rencia: heparitinasa 1, EC 4.2.2.8] en Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 1,0 para obtener una solucin con una
actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solucin a -20 hasta el momento de su uso.
Solucin de Heparinasas 7, 2 y 3-Preparar una mezcla 1 :1 :1 (v:v:v) de Solucin de Heparinasa 1, Solucin de Heparinasa 2 y
Solucin de Heparinasa 3.
Soluciones para Identificacin de los Picos-[NOTA-Las soluciones de prueba y las Soluciones estndar despolimerizadas
se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones de prueba despolimerizadas son estables durante 1 mes a -20. Igualmen-
te, las soluciones de prueba y las Soluciones estndar reducidas se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones reducidas
tambin son estables durante 1 mes a -20.]
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 257

Soluciones de Disacridos-Preparar por separado una solucin con 0,25 mg por mL de cada disacrido 1 L'llA, fl.llA, fl.lllA,
fl.IVA, fl.IS, L'lllS, fl.lllS, fl.IVS (ver Apndice 7). Inyectar en el cromatgrafo cada solucin de disacrido y registrar el cromatogra-
ma.
Soluciones de Disacridos Reducidos-A 60 L de cada Solucin de Disacrido, agregar 1O L de Solucin de Borohidruro de
Sodio recin preparada. Mezclar en un mezclador por vrtice y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4
horas. Inyectar en el cromatgrafo cada solucin y registrar el cromatograma.
Solucin Blanco-Preparar una mezcla de 20 L de agua, 70 L de Solucin de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0 y 100 L
de la Solucin de Heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversin y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un
bao de agua a 25. Preparar una mezcla de 60 L de esta solucin despolimerizada con 1O L de Solucin de Borohidruro de
Sodio recin preparada. Homogeneizar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4 horas. Inyectar en el
cromatgrafo la solucin resultante y registrar el cromatograma.
Solucin de Prueba 7-Preparar dos soluciones, cada una con 20 mg de enoxaparina sdica en 1 mL de agua.
Solucin Estndar 7-Preparar una solucin que contenga 20 mg de ER Enoxaparina Sdica USP en 1 mL de agua.
Solucin de Prueba 2-Para cada solucin, preparar una mezcla de 20 L de Solucin de Prueba 1, 70 L de Solucin de Aceta-
to de Calcio y Sodio de pH 7, Oy 100 L de la Solucin de Heparinasas 1, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversin y dejar en
reposo durante al menos 48 horas en un bao de agua a 25. Despus de 48 horas de despolimerizacin, inyectar en el cro-
matgrafo la solucin y registrar el cromatograma.
Solucin Estndar 2- Preparar una mezcla de 20 L de Solucin Estndar 1, 70 L de Solucin de Acetato de Calcio y Sodio de
pH 7,0 y 100 L de la Solucin de Heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un
bao de agua a 25. Despus de 48 horas de despolimerizacin, inyectar en el cromatgrafo la solucin y registrar el cromato-
grama.
Solucin de Prueba 3-Para cada solucin de prueba despolimerizada, preparar una mezcla de 60 L de Solucin de Prueba 2
y 1O L de Solucin de Borohidruro de Sodio recin preparada. Homogeneizar y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatu-
ra ambiente durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatgrafo. La Solucin de Prueba 3 es estable durante 48
horas a temperatura ambiente.
Solucin Estndar 3-Preparar una mezcla de 60 L de Solucin Estndar 2 y 1O L de Solucin de Borohidruro de Sodio recin
preparada. Homogeneizar, mezclar en un mezclador por vrtice y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatura ambiente
durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatgrafo. La Solucin Estndar 3 es estable durante 48 horas a tempe-
ratura ambiente.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar el cromatgrafo de lquidos con un detector a 234 nm y una
columna de 3 mm x 25 cm rellena con material L14 de 5 m de. Se debe usar tambin una guarda columna rellena con el
mismo material. La velocidad de flujo es de 0,45 mL por minuto, la temperatura de la columna se mantiene a 50 y el volumen
de inyeccin es 1O L. Programar el cromatgrafo del siguiente modo.

Tiempo
(minutos) Solucin A(%) Solucin B (%) Elucin
0-20 97--+65 3--+35 gradiente lineal
20-50 65--+0 35--+ 100 gradiente lineal
50-60 o 100 isocrtica
60-61 0--+97 100--+3 gradiente lineal para reequilibrio
61-79 97 3 isocrtica para reequilibrio

Inyectar en el cromatgrafo la Solucin de Prueba 3 reducida y la Solucin Estndar 3 reducida y registrar el cromatograma se-
gn se indica en el Procedimiento.
Prueba de Aptitud de la Despolimerizacin-EI cociente de rea entre los picos de 1,6-anhidro-fl.IS-IS y 1,6-anhidro fl.IS no es
mayor de 1, 15 para la Solucin Estndar 2 despolimerizada.
Prueba de Aptitud del Desempeo de la Columna-Identificar los picos correspondientes al fl.IA reducido y al 1,6-anhidro-fl.IS
para la Solucin Estndar 3: el tiempo de retencin del fl.IS reducido est entre 27 y 33 minutos para la Solucin Estndar 3
despolimerizada y reducida; y la resolucin, R, entre el fl.1 A reducido y el 1,6-anhidro-fl.IS no es menor de 1,5.
Prueba de Aptitud de la Reduccin-El cociente de rea entre los picos de disacrido fl.IS y fl.IS reducido en la Solucin Estn-
dar 3 despolimerizada y reducida y la Solucin de Prueba 3 no es ms de 0,02%.
Procedimiento y Clculos-Inyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales de la Solucin de Prueba 3 reducida y
de la Solucin Estndar 3 reducida. Usar el mtodo de porcentaje de rea normalizada para el clculo. Los picos se integran
desde el pico de volumen muerto hasta el ltimo pico detectado. Medir el rea del pico de cada analito excluyendo los picos
de los disolventes al comienzo del cromatograma y en la Solucin Blanco. Usando los cromatogramas de las Soluciones de Disa-
cridos Reducidos obtenidos previamente, identificar los picos pertenecientes a los ocho disacridos reducidos en los cromato-
gramas de la Solucin de Prueba 3 y la Solucin Estndar 3. Los picos pertenecientes al 1,6-Anhidro fl.IS, 1,6-Anhidro fl.llS y 1,6-
-Anhidro fl.IS-ISepi se identifican a partir de los tiempos de retencin relativos proporcionados en la Tabla 7 y del Cromatograma
de referencia proporcionado con el ER Enoxaparina Sdica USP. Una vez identificados los picos, utilizar los valores en la Tabla 7

1Se pueden obtener disacridos adecuados de Grampian Enzymes (GE-Hl 001, GE-Gl 002, GE-Hl 003, GE-Hl 004, GE-Hl 005, GE-Hl 006, GE-Hl 007, GE-Hl 008),
Nisthouse, Harray, Orkney, KWl 7 2LQ, Reino Unido, Te/: 01856 771771, Scottish Local Authority: Orkney /slands.
258 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Qumicas USP 39

para calcular el porcentaje (p/p) de los tres principales derivados 1,6-anhidro, obtenidos despus de la despolimerizacin de la
enoxaparina sdica, usando la siguiente frmula:

% 1,6-anhidro i (p/p) = (100 x MW; x A;)/ L(MWx x Ax)

en donde MW; y A; son el peso molecular y el rea del pico i del 1,6-anhidro, respectivamente; y MWx y Ax son el peso molecu-
lar y el rea, respectivamente, del pico X o de la zona X especificados por su tiempo de retencin. [NOTA-Una vez establecido
el mtodo, los picos pertenecientes a los diferentes disacridos y tetrasacridos se pueden identificar fcilmente por medio del
cromatograma del ER Enoxaparina Sdica USP. Por lo tanto, el uso de los Estndares de disacridos slo es necesario durante la
etapa de implementacin del mtodo.]
Calcular el porcentaje molar de los componentes que contienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su
cadena en la muestra de prueba de enoxaparina sdica de acuerdo con la siguiente frmula:
o . MW
'fo1,6anh1dro ~100x l:MW, xreax x

(rea!11s1,6anhidro+ reaL111s1,6anhidro + reaL11s - ls1,6anhidro)

en donde MW es el peso molecular promedio en peso (ver prueba de Identificacin D en Enoxaparina Sdica); MWx y reax son
el peso molecular y el rea, respectivamente, del pico X o del intervalo X, especificados por su tiempo de retencin. El porcen-
taje molar de los componentes que tienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su cadena est entre 15% y
25%. En la Tabla 1 se proporcionan los tiempos de retencin y las masas moleculares tpicos atribuidos a las diferentes estruc-
turas de oligosacridos.
Tabla 1. Tiempos de Retencin Relativos (tRR) y Masas Moleculares Tpicos Atribuidos a los Diferentes Compuestos*
Masa
Molecular
Compuesto tRR (daltones)
- < 0,25 741
AIVA reducido 0,25 401
- 0,25 <tRR < 0,51 741
AIVS reducido 0,51 461
- 0,51 < tRR < 0,55 483
AllA reducido 0,55 503
- 0,55 < tRR < 0,59 503
1,6-Anhidro AllS 0,59 443
- 0,59 < t00 < 0,64 503
AlllA reducido 0,64 503
- 0,64 < tRR < 0,72 533
AllS reducido 0,72 563
- 0,72 < tRR < 0,80 563
AlllS reducido 0,80 563
- 0,80 < tRR < 0,88 583
AIA reducido 0,88 605
- 0,88 < tRR < 0,90 635
1,6-Anhidro i'.IS 0,90 545
- 0,90 < tRR < 0,98 635
AllA-IVSglu reducido 0,98 1066
- 0,98< tRR < 1,00 635
i'.IS reducido 1,00 665
- 1,00< tRR < 1,04 665
AIS 1,04 665
- 1, 04< tRR < 1, 10 1228
AllA-!lliJill reducido 1,10 1168
- 1,10< tRR < 1,27 1228
1,6-Anhidro i'.IS-IS 1,27 1210
- tRR > 1,27 1228
*Los tiempos de retencin relativos se obtuvieron con una partida de enoxaparina sdica despolimerizada y reducida. Se expresan con respecto al tiempo de
retencin del pico principal correspondiente al lilS reducido. Se debe tener en cuenta que los tiempos de retencin relativos pueden variar un poco, dependien-
do de la calidad de la columna.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 259

APNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACRIDOS ESTNDARES

'11VA O- Na+ OH '1UA-(l--->4)a-GlcNAc

1->-oh-oo
HO OH HO

o=\
NH

CH,

'11VS O- Na+ OH i1UA-(l--->4)a-GlcN(NS)

Q-,b-~
HO OH HO NH
~/
o-/ b- N'
i111A O- Na+ '1UA-(l--->4)a-GlcNAc(6S)

O- Na+ ~'o

f-"tob-oo
HO OH HO

o=\
NH

CH,

'1111A O- Na+ OH '1UA-2S-(l--->4)a-GlcNAc

o~oko
"
O
~\/
0- Na+
o =< CH3

'1115 O- Na+ '1UA-(l--->4)u-GlcN (NS,65)

O- Na+
~:s'b

P-b-~
HO OH HO NH
.::::::::-1
~\O-Na+
'11115 O- Na+ OH i1UA-2S-(l--->4)u-GlcN (NS)

f~-ob
HO

?< ?<
"OHO NH

O O-Na+ O O-
N'

'11A O- Na+ i1UA-2S-(l--->4)a-GlcNAc(6S)

~,/
O- Na+ /b

f<b=<
HO

"
O
?-\/
OHO

O- Na+
o
NH

CH3
00
260 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Qumicas USP 39

APNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACRIDOS ESTNDARES (Continuacin)

t.15 O- Na+ UA-25-(1 ~4)a-GlcN (N5,65)
?s\I

i)-:h-00
HO OHO
00-j
~\-o-::::-\_
~ /
NH

O Na+ O Na+

APNDICE 2: ESTRUCTURAS DE OLIGOSACRIDOS

1,6-Anhidro t.15 o
1,6-Anhidro t.15 glucosa

1,6-Anhidro t.115 o
1,6-Anhidro t.115 glucosa

1,6-Anhidro t.115 epi o

1,6-Anhidro t.115 manosa

t.llA-IV5glu

t.l IA-filgill

1,6-Anhidro t.15-15 epi

o
1,6-Anhidro t.15-15 manosa
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (208) Valoracin de Actividad Anti-Factor 261

(208) VALORACIN DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR

lla PARA HEPARINAS NO FRACCIONADAS Y DE BAJO PESO
MOLECULAR

Este captulo provee informacin y procedimientos para determinar la actividad inhibitoria del factor Xa y la actividad inhibi-
toria del factor lla (trombina) de las heparinas no fraccionadas (HNF) y heparinas de bajo peso molecular (HBPM).

INTRODUCCIN

Las heparinas no fraccionadas y las heparinas de bajo peso molecular ejercen su efecto anticoagulante mediante la potencia-
cin de la actividad de los inhibidores de coagulacin del plasma. De todos los glicosaminoglicanos comnmente conocidos,
slo las HNF, las HBPM y el heparn sulfato (referidos en lo sucesivo como heparina) contienen una secuencia de pentasacri-
dos especfica que puede unirse al inhibidor de coagulacin del plasma, la antitrombina (AT). Por lo tanto, se desarrollan valo-
raciones que dependen de la AT para asegurar la especificidad de los mtodos para medir la actividad anticoagulante de la
heparina. La unin de la heparina con la AT provoca un cambio de conformacin en la molcula de AT. Este cambio de confor-
macin incrementa la unin del complejo AT-heparina con los factores activados de coagulacin, principalmente el factor lla
(trombina) y el factor Xa, causando su inhibicin. Una vez que la AT ha sido activada por la secuencia de pentasacridos de la
heparina, sta interacta con los factores Xa y lla mediante su bucle central reactivo. Para conseguir una inhibicin eficiente de
trombina, la molcula de heparina tambin debe unirse a la antritombina y al factor lla. Dicha interaccin requiere un segmen-
to extra de aproximadamente 13 monosacridos, acoplados al extremo no reductor de la secuencia de pentasacridos de la
heparina, que se une a la AT. Este segmento mnimo de la molcula de heparina necesario para inhibir la trombina con AT,
conocido como dominio C, tiene un peso molecular aproximado de 5400 Da. Aunque la potenciacin de la capacidad de la
antitrombina para inactivar el factor Xa tambin depende del peso molecular, las unidades adicionales de sacridos del domi-
nio C no son esenciales, y una heparina con un peso molecular menor de 5400 Da puede potenciar la capacidad de la anti-
trombina para inactivar el factor Xa. Por convencin, el cociente de potencia entre el anti-factor Xa y el anti-factor lla para
HNF es 1. La HNF es heterognea y polidispersa, pero contiene poco o ningn material con un peso molecular menor de 5400
Da. Los pesos moleculares promedio de los productos de HBPM son menores que aqullos de las HNF, y contienen una pro-
porcin mayor de material de peso molecular menor de 5400 Da. El cociente entre las potencias de anti-factor Xa y anti-factor
llapara HBPM es mayor que 1,5. Este captulo describe procedimientos de valoracin para medir la actividad anti-factor Xa y
anti-factor lla de las HBPM en presencia de AT.
En el sistema de prueba, la heparina se une a la AT, y el factor lla o el factor Xa agregado a la mezcla se une al complejo de
heparina-AT. El factor lla o factor Xa residual no inhibido por el complejo de heparina-AT se cuantifica mediante un sustrato
cromognico que es especfico para el factor lla o el factor Xa y se agrega en la etapa final. Los analistas observan una relacin
inversa en la que una mayor cantidad de enzima residual produce ms color, lo cual equivale a una menor actividad de hepari-
na.
Al igual que con cualquier valoracin enzimtica, la temperatura y el tiempo de la reaccin, el manejo adecuado de los reac-
tivos y su orden de adicin representan aspectos crticos para el desempeo ptimo de la valoracin.

VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR XA Y ANTI-FACTOR HA PARA HEPARINAS NO

FRACCIONADAS

Actividad Anti-Factor Xa para HNF

El siguiente procedimiento se usar siempre que se especifique en las monografas individuales. Esta valoracin se puede lle-
var a cabo manualmente en tubos de plstico usando un bloque termosttico o un bao de agua termostatizado. Un equipo
para placa de microtitulacin con un lector y un coagulmetro automtico pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimien-
to.
Solucin amortiguadora de pH 8,4: Disolver cantidades de tris(hidroximetil)aminometano, cido edtico o edetato sdi-
co y cloruro de sodio en agua que contenga O, 1% de polietilenglicol 6000 para obtener soluciones con concentraciones 0,050
M, 0,0075 M y 0, 175 M, respectivamente. Ajustar, si fuera necesario, con cido clorhdrico o solucin de hidrxido de sodio a
un pH de 8,4.
Solucin de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de
Reactivos) segn lo indicado por el fabricante y diluir esta solucin con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una
solucin con una concentracin de 1,0 UI de Antitrombina/ml.
Solucin de factor Xa: Reconstituir factor Xa bovino segn lo indicado por el fabricante (ver Factor Xa en Reactivos, Indi-
cadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) y diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solucin
262 (208) Valoracin de Actividad Anti-Factor / Pruebas Qumicas USP 39

que proporcione un valor de absorbancia de 0,65-1,25 a 405 nm cuando se valora segn se indica a continuacin, pero usan-
do 30 L de Solucin amortiguadora de pH 8,4 en lugar de 30 L de las Soluciones estndar o de las Soluciones muestra. [NOTA-
La Solucin de factor Xa contiene aproximadamente 3 unidades nanocatalticas/mL, pero puede variar dependiendo del fabri-
cante del factor Xa o del sustrato usado.]
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico adecuado para la prueba amidol-
tica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) especfico para factor Xa en agua para obtener una
concentracin 1 mM.
Solucin de detencin: Solucin de cido actico al 20% (v/v)
Soluciones estndar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sdica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos 5 diluciones en el intervalo de concentracin de
0,03-0,375 Unidades USP de Heparina/ml.
Soluciones muestra: Disolver o diluir una cantidad medida con exactitud de Heparina Sdica en Solucin amortiguadora
de pH 8,4 y diluir con la misma solucin amortiguadora hasta obtener soluciones con actividades aproximadamente iguales a
las de las Soluciones estndar.
Anlisis: [NOTA-El procedimiento tambin se puede realizar usando plataformas alternativas. Realizar la prueba con cada
Solucin estndar y Solucin muestra por duplicado.]
Transferir 120 L de Solucin amortiguadora de pH 8,4 a cada una de las series de tubos de plstico adecuados colocados en
un bao de agua ajustado a 37. Luego, transferir por separado 30 L de las diferentes diluciones de las Soluciones estndar o
de las Soluciones muestra a los tubos. Agregar 150 L de Solucin de antitrombina, entibiada previamente a 37 durante 15
minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 L de Solucin de factor Xa, entibiada previamente a
37 durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 L de Solucin de sustrato cromogni-
co, entibiada previamente a 37 durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante exactamente 2 minutos. Agregar
150 L de Solucin de detencin a cada tubo y mezclar. Preparar un blanco para ajustar a cero el espectrofotmetro, agregando
los reactivos en el orden inverso, comenzando con la Solucin de detencin y finalizando con la adicin de 150 L de Solucin
amortiguadora de pH 8,4, y omitiendo las Soluciones estndar o las Soluciones muestra. Registrar la absorbancia a 405 nm contra
el blanco. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoracin, siempre que las
proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Clculos: Graficar el logaritmo de los valores de absorbancia de las Soluciones estndar y de las Soluciones muestra en fun-
cin de las concentraciones de heparina, en Unidades USP. Calcular la actividad de heparina sdica, en Unidades USP/mg,
usando mtodos estadsticos para anlisis de razn de pendientes. Calcular la actividad antifactor Xa de la heparina sdica:

A x (Srf S5)
A = potencia del ER Heparina Sdica para Valoraciones USP
Sr= pendiente de la recta de las Soluciones muestra
S5 = pendiente de la recta de las Soluciones estndar
Expresar la actividad anti-factor Xa de la Solucin muestra como Unidades USP de Heparina/mg, calculada con respecto a la
sustancia seca. Calcular el cociente de la actividad anti-factor Xa en funcin de la potencia anti-factor lla (ver la Valoracin a
continuacin):
actividad anti-factor Xa/potencia anti-factor lla
Criterios de aceptacin: 0,9-1, 1

Actividad Anti-Factor lla para Heparinas No Fraccionadas

Solucin amortiguadora de pH 8,4: Disolver 6, 1 O g de tris(hidroximetil)aminometano, 10,20 g de cloruro de sodio, 2,80

g de edetato sdico y, si fuera adecuado, 0-10,00 g de polietilenglicol 6000 y/o 2,00 g de albmina srica bovina en 800 mL
de agua. [NOTA-Se pueden usar 2,00 g de albmina humana en lugar de 2,00 g albmina srica bovina.] Ajustar con cido
clorhdrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
Solucin de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de
Reactivos) en agua para obtener una solucin de 5 UI de Antitirombina/ml. Diluir esta solucin con Solucin amortiguadora de
pH 8,4 hasta obtener una solucin con una concentracin de O, 125 UI de Antitrombina/ml.
Solucin de trombina humana: Reconstituir trombina humana (factor lla) (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especi-
ficaciones de Reactivos) en agua para obtener una solucin de 20 UI de Trombina/mL y diluir con Solucin amortiguadora de pH
8,4 hasta obtener una solucin con una concentracin de 5 UI de Trombina/ml. [NOTA-La trombina debe tener una activi-
dad especfica de no menos de 750 Ul/mg.]
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico de trombina adecuado para prue-
ba amidoltica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una concentracin
1,25 mM.
Solucin de detencin: Solucin de cido actico al 20% (v/v)
USP 39 Pruebas Qumicas / (208) Valoracin de Actividad Anti-Factor 263

Soluciones estndar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sdica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos cuatro diluciones en el intervalo de concentracin
de 0,005-0,03 Unidades USP de Heparina/ml.
Soluciones muestra: Proceder segn se indica en Soluciones estndar para obtener concentraciones de Heparina Sdica
similares a las obtenidas para las Soluciones estndar.
Anlisis: [NOTA-El procedimiento tambin se puede realizar usando plataformas alternativas.] Para cada una de las dilu-
ciones de las Soluciones estndar y de las Soluciones muestra, se deben analizar al menos muestras por duplicado. Etiquetar un
nmero adecuado de tubos dependiendo del nmero de determinaciones repetidas a analizar. Por ejemplo, si se van a usar
cinco blancos: Bl, B2, B3, B4 y B5 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las
Soluciones muestra; y Sl, S2, S3 y S4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las Soluciones estndar. Distribuir
los blancos sobre las series de manera que representen exactamente el comportamiento de los reactivos durante los experi-
mentos. [NOTA-Tratar los tubos en el siguiente orden: Bl, Sl, S2, S3, S4, B2, Tl, T2, T3, T4, B3, Tl, T2, T3, T4, B4, Sl, S2,
S3, S4, B5.] Cabe destacar que despus de cada adicin de un reactivo, la mezcla de incubacin se debe mezclar evitando la
formacin de burbujas. Agregar el doble del volumen (100-200 L) de Solucin de antitrombina a cada tubo que contenga un
volumen (50-100 L) de Solucin amortiguadora de pH 8,4 o de una dilucin apropiada de las Soluciones muestra o de las
Soluciones estndar. Mezclar evitando la formacin de burbujas. Incubar a 37 durante al menos 1 minuto. Agregar a cada tu-
bo 25-50 L de Solucin de trombina humana e incubar durante al menos 1 minuto. Agregar 50-100 L de Solucin de sustrato
cromognico. Es importante destacar que todos los reactivos, Soluciones estndar y Soluciones muestra deben entibiarse previa-
mente a 37 justo antes de su uso. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la
valoracin, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se manten-
gan iguales.
Se pueden registrar dos tipos de mediciones diferentes:
1. Medicin del Punto Final: Detener la reaccin despus de al menos 1 minuto con 50-100 L de Solucin de detencin.
Medir la absorbancia de cada solucin a 405 nm usando un espectrofotmetro adecuado (ver IJlllllllall!Ul~~lllll
llillffl~l:llll(,;:11~\llil&lii> La desviacin estndar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco.
2. Medicin cambio en la absorbancia para cada solucin durante 1 minuto a 405 nm usando un espec-
trofotmetro adecuado (ver Calcular el cambio en la absorbancia/min (~OD/min). Los blancos para
la medicin cintica tambin se expresan en y deben proporcionar los valores ms altos debido a que se reali-
zan en ausencia de heparina. La desviacin estndar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco.
Clculos: Se pueden usar los modelos estadsticos de Mtodo de razn de pendientes o Mtodo de lneas paralelas depen-
diendo de qu modelo describa mejor la correlacin entre concentracin y respuesta.
Mtodo de razn de pendientes: Para cada una de las series, calcular la regresin del logaritmo de absorbancia o el lo-
garitmo del cambio en la absorbancia/minuto en funcin de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones
estndar, y calcular la potencia de heparina sdica en Unidades USP/mL, usando mtodos estadsticos para los mtodos de
razn de pendientes. Expresar la potencia de heparina sdica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Mtodo de lneas paralelas: Para cada una de las series, calcular la regresin de la absorbancia o el cambio en la absor-
bancia/minuto en funcin del logaritmo de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estndar, y calcular
la potencia de heparina sdica, en Unidades USP/mL, usando mtodos estadsticos para mtodos de lneas paralelas. Expresar
la potencia de heparina sdica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Criterios de aceptacin: La potencia de heparina sdica, calculada con respecto a la sustancia seca, es no menos de 180
Unidades USP de Heparina en cada mg.
Estndares de Referencia USP (11 ): ER Heparina Sdica para Valoraciones USP

VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR XA Y ANTI-FACTOR HA PARA HEPARINAS DE

BAJO PESO MOLECULAR

El siguiente procedimiento se usar siempre que se especifique en las monografas individuales. Esta valoracin se puede lle-
var a cabo manualmente en tubos de plstico usando un bloque termosttico o un bao de agua termostatizado. Un equipo
para placa de microtitulacin con un lector y un coagulmetro automtico pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimien-
to. Se usa solucin de cido actico (solucin de detencin) para la valoracin manual y en placa de microtitulacin. Los coa-
gulmetros automticos miden la velocidad cintica inicial y, por consiguiente, no es necesario detener la reaccin.

Actividad Anti-Factor Xa para Heparinas de Bajo Peso Molecular

Solucin de cido actico: cido actico glacial y agua (42:58)
Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g
de cloruro de sodio en 500 mL de agua. Agregar 1,0 g de polietilenglicol 6000 10,0 g de albmina srica bovina, ajustar con
cido clorhdrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
264 (208) Valoracin de Actividad Anti-Factor/ Pruebas Qumicas USP 39

Solucin amortiguadora de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g de cloruro de sodio en

500 mL de agua. Ajustar con cido clorhdrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 mL.
Solucin amortiguadora de pH 8,4: Disolver 3,03 g de tris(hidroximetil)aminometano, 5, 12 g de cloruro de sodio y 1,40
g de edetato sdico en 250 mL de agua. Ajustar con cido clorhdrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 500 ml.
Solucin de antitrombina humana: Reconstituir un vial de antitrombina humana (ver Reactivos, Indicadores y Solucio-
nes-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solucin que contenga 5 Unidades de Antitrombina por ml. Diluir
esta solucin con Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solucin con una concentracin
de 1,0 Unidad de Antitrombina/mL.
Solucin de factor Xa: Reconstituir una cantidad pesada con exactitud de factor Xa bovino (ver Reactivos, Indicadores y
Soluciones-Especificaciones de Reactivos) segn se indica en las instrucciones del fabricante. Diluir esta solucin madre con So-
lucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solucin que proporcione un incremento en el valor
de absorbancia a 405 nm de no ms de 0,20 unidades de absorbancia/min o 0,8 unidades de absorbancia despus de 4 minu-
tos de incubacin con el sustrato cromognico cuando se valora segn se describe a continuacin, pero usando como un volu-
men apropiado, V, el volumen, en L, de Solucin amortiguadora de pH 7,4 en lugar de V L de la solucin estndar o la solu-
cin muestra.
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico adecuado para prueba amidolti-
ca (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para factor Xa en agua para obtener una concentracin
aproximadamente 3 mM. Diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solucin con una concentracin de
0,5 mM. [NOTA-Calentar previamente los reactivos a 37 1 15 minutos antes de su uso.]
Soluciones estndar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biolgicas U5P con agua destilada y luego diluir con Solucin amortiguadora de pH 1,4 hasta obtener al menos
cuatro diluciones en el intervalo de concentracin de 0,025-0,2 Unidades U5P de anti-factor Xa/ml.
Soluciones muestra: Proceder segn se indica en Soluciones estndar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estndar.
Anlisis
Muestras: Soluciones estndar, Soluciones muestra, Solucin de antitrombina humana, Solucin amortiguadora de pH 7,4, So-
lucin de factor Xa, Solucin de sustrato cromognico y Solucin de cido actico
Etiquetar 18 tubos adecuados: B1 y B2 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno por duplicado para las diluciones de las
Soluciones muestra; y 51, 52, 53 y 54 cada uno por duplicado para las diluciones de las Soluciones estndar. [NOTA-Tratar los
tubos en el orden siguiente: Bl, 51, 52, 53, 54, Tl, T2, T3, T4, Tl, T2, T3, T4, 51, 52, 53, 54, B2.] Agregar a cada tubo 50 L
de Solucin de antitrombina humana y un volumen igual, V, de la Solucin amortiguadora de pH 7,4 (Blanco) o de una dilucin
apropiada de las Soluciones muestra o de las Soluciones estndar. Mezclar evitando la formacin de burbujas. Incubar a 37 du-
rante al menos 1,0 minuto. Agregar a cada tubo 100 L de Solucin de factor Xa e incubar durante 1,0 minuto. Agregar 250 L
de Solucin de sustrato cromognico. Detener la reaccin despus de aproximadamente 4,0 minutos con 250 L de Solucin de
cido actico. Medir la absorbancia de cada solucin a 405 nm usando un espectrofotmetro adecuado (ver (857)
(AFOl-may. 2016)). Usar cubetas de cuarzo o de poliestireno desechables. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactan-
tes para ajustarse al formato de la valoracin, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de
prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Aptitud del sistema: La valoracin es vlida si se cumplen los siguientes requisitos:
1. Una solucin blanco proporciona un incremento en el valor de absorbancia a 405 nm de no ms de 0,20 unidades de
absorbancia/min (o un total de 0,8 unidades de absorbancia) cuando se valora usando un volumen apropiado (50 L) de
Solucin amortiguadora de pH 1,4 en lugar de 50 L de la Solucin estndar o de la Solucin muestra.
2. La lectura del blanco B2 no difiere en ms de 0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco Bl.
Clculos: Para esta valoracin biolgica, se pueden aplicar anlisis de lneas paralelas o de razn de pendientes.
Calcular la potencia de la muestra de prueba, en Unidades U5P de anti-factor Xa/mL, usando un modelo estadstico para
lneas paralelas, graficando la absorbancia en funcin de las concentraciones logartmicas de las Soluciones muestra y de las
Soluciones estndar. En algunos casos, la transformacin logartmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la li-
nealidad para las curvas de dosis-respuesta. La valoracin es vlida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptacin
para regresin, linealidad y paralelismo, conforme a lo requerido para el mtodo de lneas paralelas. Para el anlisis de razn de
pendientes, graficar la absorbancia en funcin de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estndar. En
algunos casos, la transformacin logartmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la linealidad de las curvas de
dosis-respuesta. La valoracin es vlida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptacin para regresin, linealidad y
ordenada al origen comn, conforme a lo requerido para el mtodo de razn de pendientes (ver Diseo y Anlisis de Va/oracio-
nes Biolgicas (111) y Anlisis de Valoraciones Biolgicas (1034)).
Expresar la actividad anti-factor Xa de la muestra/mg, calculada con respecto a la sustancia seca:

Unidades U5P de Anti-factor Xa/mg = [potencia del estndar

(Unidades USP/mL) x cociente de potencia]/[concentracin de la muestra (mg/mL)]
USP 39 Pruebas Qumicas/ (209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas 265

Actividad Anti-Factor lla para Heparinas de Bajo Peso Molecular

Solucin de cido actico, Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4, Solucin amortiguadora de pH
7,4, Solucin amortiguadora de pH 8,4 y Solucin de antitrombina humana: Proceder segn se indica en Actividad Anti-
Factor Xa, excepto que la concentracin de la Solucin de antitrombina humana es 0,5 Unidades de Antitrombina/mL.
Solucin de trombina humana: Reconstituir trombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reacti-
vos) en agua y diluir con Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solucin con una concen-
tracin de 5 Unidades de Trombina/ml. Usar la Solucin de trombina humana inmediatamente despus de su preparacin.
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico adecuado para la prueba amidol-
tica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para trombina en agua para obtener una concentra-
cin aproximadamente 3 mM. Diluir inmediatamente antes de su uso con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta 0,5 mM.
Soluciones estndar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biolgicas USP con agua destilada y diluir con Solucin amortiguadora de pH 7,4 hasta obtener al menos cuatro
diluciones en el intervalo de concentracin de 0,015-0,075 Unidades USP de actividad de anti-factor lla/ml.
Soluciones muestra: Proceder segn se indica en Soluciones estndar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estndar.
Procedimiento: Proceder segn se indica en Actividad Anti-Factor Xa, pero usar Solucin de trombina humana en lugar de
Solucin de factor Xa y usar la Solucin de antitrombina humana segn se describi anteriormente.
Aptitud del sistema: La valoracin es vlida si se cumple el siguiente requisito:
1. La lectura del blanco B2 no difiere en ms de 0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco Bl.
Clculos: Proceder segn se indica en el clculo de Actividad Anti-Factor Xa.
Estndares de Referencia USP (11 ): ER Heparina de Bajo Peso Molecular para Valoraciones Biolgicas USP

(209) DETERMINACIONES DE PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE

BAJO PESO MOLECULAR

Este captulo provee procedimientos usados para determinar la distribucin del peso molecular (PM) y el peso molecular pro-
medio en peso para heparinas de bajo peso molecular (HBPM).
INTRODUCCIN
Las heparinas de bajo peso molecular se preparan a partir de Heparina Sdica USP mediante despolimerizacin parcial. Las
heparinas de bajo peso molecular son polidispersas, es decir, estn compuestas por cadenas de polisacrido con una varie-
dad de pesos moleculares. La distribucin del peso molecular es una caracterstica definitoria para cada producto de hepari-
nas de bajo peso molecular. La USP contiene monografas especficas para productos de heparinas de bajo peso molecular,
incluyendo lmites sobre los parmetros de distribucin del peso molecular.
La mayora de las tcnicas para la determinacin de la distribucin del peso molecular de heparinas de bajo peso molecular
utilizan cromatografa de permeacin en gel (GPC, por sus siglas en ingls), en ocasiones referida como cromatografa de
exclusin por tamao (SEC, por sus siglas en ingls). Para derivar la distribucin del peso molecular de una muestra de hepa-
rina de bajo peso molecular a partir de un cromatograma, es necesario conocer la relacin entre el tiempo de retencin y el
peso molecular. Este captulo describe un mtodo de GPC en el cual la calibracin se llev a cabo usando el Estndar de
Referencia (ER) Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP. Esta preparacin es un Estndar indi-
vidual polidisperso cuya distribucin de pesos moleculares se describe en forma de una Tabla Estndar de Amplio Rango
(Broad Standard Table) (ver el Certificado USP para el ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular
USP) que lista el logaritmo del peso molecular (log PM) de varios puntos de referencia y las fracciones porcentuales corres-
pondientes en peso del calibrador superiores o inferiores a estos puntos de referencia. La Tabla Estndar de Amplio Rango se
usa junto con un cromatograma del calibrador para ajustar una funcin adecuada, en este caso, un polinomio de tercer or-
den, a la relacin entre el log PM y el tiempo de retencin, con lo que se genera una curva de calibracin para el sistema
cromatogrfico. Con esta curva de calibracin, el analista calcula el peso molecular promedio en peso y los parmetros de
distribucin a partir del cromatograma de una muestra de heparina de bajo peso molecular.
Todos los clculos descritos en este captulo se pueden realizar usando un programa de hoja de clculo, aunque dicho mtodo
no se recomienda debido a que es laborioso y est abierto a error humano. El software patentado capaz de automatizar la
calibracin y los clculos de peso molecular se puede obtener de diversos fabricantes de sistemas cromatogrficos.

PROCEDIMIENTO
MEDICIONES DEL PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR MEDIANTE CROMATOGRAFA DE PERMEACIN EN
GEL
El siguiente procedimiento, con cualquier variacin necesaria, se usa cuando as se especifique en las monografas indivi-
duales.
Solucin madre de acetato de amonio: Acetato de amonio 1 M en agua
266 (209) Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas / Pruebas Qumicas USP 39

Solucin de azida sdica: Azida sdica al 1% (p/v) en agua

Fase mvil: Transferir 100 ml de Solucin madre de acetato de amonio a un matraz volumtrico de 1 L, agregar 20 ml de
Solucin de azida sdica y diluir con agua a volumen. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamao de poro de
0,45 m antes de su uso.
Solucin de calibracin: Agregar 2 ml de Fase mvil a un vial que contenga ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina
de Bajo Peso Molecular USP. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamao de poro de 0,45 m antes de su uso.
Solucin muestra: 5 mg/ml de muestra de heparina de bajo peso molecular en Fase mvil. Filtrar usando una membrana
de nailon con un tamao de poro de 0,45 m.
Solucin de aptitud del sistema: 5 mg/ml de ER Dalteparina Sdica USP en Fase mvil. Filtrar usando una membrana de
nailon con un tamao de poro de 0,45 m.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
[NOTA-Se debe ajustar la temperatura del detector de ndice de refraccin a la misma temperatura que la Temperatura de la
columna.]
Modo: HPLC
Detector: ndice de refraccin
Columnas
Guarda columna: 6 mm x 4 cm; relleno L59 de 7 m
Analtica: 7,8 mm x 30 cm; relleno L59 de 5 m en serie con una columna de 7,8 mm x 30 cm; relleno L59 de 5 m 1
Temperatura de la columna: 30
Velocidad de flujo: 0,5 ml/min
Equilibracin de las columnas: 0,5 ml/min durante al menos 2 horas
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolucin: Existe una resolucin en la lnea base entre el ltimo pico del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina
de Bajo Peso Molecular USP y el pico de sal, o picos de intercambio negativos.
Curva de calibracin: El coeficiente de determinacin de la curva de calibracin ajustado a los valores de la Tabla Estn-
dar de Amplio Rango deben ser no menos de 0,990, cuando se usa una ecuacin polinmica de tercer orden.
Peso molecular promedio en peso (Mw): Tomar la media del Mw calculado mediante inyecciones por duplicado de la
Solucin de aptitud del sistema y redondear con una aproximacin de 50 Da. El sistema cromatogrfico es adecuado si el
Mw del ER Dalteparina Sdica USP est dentro de 150 Da del valor declarado segn lo indicado en el Certificado USP del
ER Dalteparina Sdica USP.
Anlisis
Muestras: Inyectar 20 L de la Solucin de calibracin (una sola inyeccin), la Solucin de aptitud del sistema (por duplica-
do) y la Solucin muestra (por duplicado), y registrar los cromatogramas durante el tiempo necesario para asegurar la elu-
cin completa, incluyendo los picos de sal y disolvente (aproximadamente 50 minutos).
[NOTA-El calibrador, el Estndar o la muestra de heparina de bajo peso molecular presentar un pico ancho a un tiempo entre
aproximadamente 25 y 45 minutos, seguido por un pico agudo de sal de elucin tarda, segn se ilustra en el Certificado
USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP.]
Clculos: Calcular el rea total bajo el pico de heparina de bajo peso molecular a partir de la Solucin de calibracin y el
rea acumulativa en cada punto debajo del pico como porcentaje del total. No incluir el pico de sal. Usando la Tabla Es-
tndar de Amplio Rango provista en el Certificado USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso
Molecular USP, identificar aquellos puntos en el cromatograma para los que el rea acumulativa porcentual sea la ms
cercana a las fracciones porcentuales listadas en la Tabla Estndar de Amplio Rango y asignar el peso molecular (MW, por
sus siglas en ingls) en esta Tabla al tiempo de retencin correspondiente (RT, por sus siglas en ingls) en el cromatogra-
ma. Para el conjunto de tiempos de retencin y pesos moleculares identificados, ajustar el log(PM) en funcin del tiempo
de retencin (TR) a una funcin polinmica de tercer orden usando un software adecuado para cromatografa de permea-
cin en gel o encontrar los valores de a, b, c y d de modo que lag PM =a+ (b x TR) + [c x (TR) 2] + [d x (TR) 3].
Usando el mismo software para GPC, para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solucin de aptitud del sistema
y de la Solucin muestra, y con la funcin de calibracin obtenida segn se describi anteriormente, calcular Mw:

Rf; = respuesta del detector en cada punto

M; = PM en cada punto

1 El mtodo fue validado usando una guarda columna TSK SWXL de 6 mm x 4 cm; 7 m en serie con dos columnas analticas: TSK G3000 SWXL de 7,8-mm x 30
cm; 5 m en serie con una columna TSK G2000 SWXL de 7,8 mm x 30 cm; 5 m.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (211) Arsnico 267

Redondear el valor de la media de Mw con una aproximacin de 50 Da. Usando el mismo software para GPC, determinar
para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solucin muestra el porcentaje de producto con peso molecular
segn lo indicado en la monografa del producto.
Criterios de aceptacin: Segn se indican en la monografa.

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dalteparina Sdica USP
ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP

(211) ARSNICO

Este procedimiento est diseado para determinar la presencia de trazas de arsnico (As) convirtiendo el arsnico en las sustan-
cias en anlisis en arsina, la cual se pasa luego a travs de una solucin de dietilditiocarbamato de plata y forma un complejo
de color rojo. El color rojo producido de esta manera se compara, en forma visual o espectrofotomtrica, con el color produ-
cido de manera similar en un control que contiene una cantidad de arsnico que equivale al lmite especificado en la mono-
grafa individual. Los lmites se establecen en trminos de arsnico (As). El contenido de arsnico no debe exceder el lmite
indicado en la monografa individual.
Existen 2 mtodos que slo difieren en el tratamiento preliminar de la sustancia de prueba y del estndar. Por lo general, el
Mtodo I se usa para materiales inorgnicos en tanto que el Mtodo 11 se utiliza para los materiales orgnicos.

PROCEDIMIENTOS
Aparato
El aparato (ver la Ilustracin) consta de un generador de arsina (a) equipado con una unidad depuradora (c) y un tubo de ab-
sorcin (e) con juntas cnicas estndar o juntas de rtula esfrica de vidrio esmerilado (by d) entre las unidades. No obstan-
te, se puede usar cualquier otro aparato adecuado cuyo principio de funcionamiento sea el mismo que el del aparato descri-
to e ilustrado.

e
d

Aparato para la Prueba de Arsnico

Solucin Madre de Trixido de Arsnico: Disolver 1 32,0 mg de trixido de arsnico, previamente secados a 105 duran-
te una hora y pesados con exactitud, en 5 ml de solucin de hidrxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumtrico de
1000 ml. Neutralizar la solucin con cido sulfrico 2 N, agregar 1 O ml ms de cido sulfrico 2 N y luego llevar a volu-
men con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar.
Solucin Estndar de Arsnico: Transferir 10,0 ml de la Solucin Madre de Trixido de Arsnico a un matraz volumtrico de
1000 ml, agregar 1 O ml de cido sulfrico 2 N, llevar a volumen con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar.
Cada ml de la Solucin Estndar de Arsnico contiene el equivalente a 1 g de arsnico (As). Conservar esta solucin en un
recipiente que sea totalmente de vidrio y usarla durante los tres das posteriores a su preparacin.
Mtodo 1
Preparacin Estndar: Pipetear 3,0 ml de la Solucin Estndar de Arsnico y transferir a un matraz generador. Diluir con
agua hasta obtener un volumen de 35 ml.
268 (211) Arsnico / Pruebas Qumicas USP 39

Preparacin de Prueba: Excepto que se indique algo diferente en la monografa individual, transferir al matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada, por la frmula:

3,0/L
L = lmite de arsnico (ppm)
Disolver en agua y diluir con agua hasta obtener un volumen de 35 mL.
Procedimiento: Tratar la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba de la misma manera, tal como se describe a conti-
nuacin. Agregar 20 mL de cido sulfrico 7 N, 2 mL de yoduro de potasio SR y 0,5 mL de solucin cida de cloruro estan-
noso concentrada SR y 1 mL de alcohol isoproplico, y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minu-
tos. Rellenar el tubo depurador (e) con dos trozos de algodn previamente impregnados con solucin saturada de acetato
de plomo, exprimidos para eliminar el exceso de solucin y secados al vaco a temperatura ambiente, dejando un pequeo
espacio de 2 mm entre los dos trozos de algodn. Lubricar las juntas (by d) con una grasa adecuada para llaves de paso,
apropiada para usarse con disolventes orgnicos y conectar la unidad depuradora al tubo de absorcin (e). Transferir 3,0
mL de dietilditiocarbamato de plata SR al tubo de absorcin. Agregar 3,0 g de cinc granulado (malla N 20) a la mezcla del
matraz y conectar inmediatamente la unidad depuradora ensamblada y permitir el desprendimiento de hidrgeno y el de-
sarrollo de color a temperatura ambiente durante 45 minutos, agitando el matraz por rotacin moderada cada 1O minutos.
Desconectar el tubo de absorcin de la unidad depuradora y del matraz generador y transferir la solucin absorbente a
celdas de absorcin de 1 cm. La coloracin roja producida por la Preparacin de Prueba no exceder la producida por la
Preparacin Estndar. Si fuera necesario o conveniente, determinar la absorbancia a la longitud de onda de mxima absor-
cin entre 535 nm y 540 nm con un espectrofotmetro o colormetro adecuado, usando dietilditiocarbamato de plata SR
como blanco.
Sustancias Qumicas lnterferentes: Los metales o las sales de metales, como el cromo, cobalto, cobre, mercurio, molibde-
no, nquel, paladio y plata, pueden interferir con la formacin de arsina. El antimonio, que forma estibina, produce una
interferencia positiva en el desarrollo del color con dietilditiocarbamato de plata SR. Cuando se sospecha la presencia de
antimonio, el color rojo que se produce en las dos soluciones de dietilditiocarbamato de plata, puede compararse a la lon-
gitud de onda de mxima absorcin entre 535 nm y 540 nm con un colormetro apropiado, ya que a esta longitud de
onda la interferencia debida a la estibina es inapreciable.
Mtodo 11
[NOTAS-]
(1) Precaucin-Algunas sustancias pueden reaccionar en forma de explosiones violentas cuando se digieren con perxido de hidr-
geno. Extremar las medidas de seguridad en todo momento.
(2) Si se trabaja con compuestos que contienen halgenos, calentar las muestras con cido sulfrico a una temperatura ms
baja evitando que la mezcla entre en ebullicin y agregar cuidadosamente el perxido de hidrgeno antes de que tenga
lugar la carbonizacin para prevenir la prdida de arsnico trivalente.
(3) Si la sustancia de prueba reacciona con demasiada rapidez y comienza a carbonizarse con 5 mL de cido sulfrico antes de
calentarse, se deber usar en su lugar 1O mL de cido sulfrico diluido fro (1 en 2) y agregar algunas gotas de perxido de
hidrgeno antes de calentar.
Preparacin Estndar: Pipetear 3,0 mL de Solucin Estndar de Arsnico y transferir al matraz generador, agregar 2 mL de
cido sulfrico, mezclar y agregar la cantidad total de perxido de hidrgeno al 30 por ciento empleado en la Preparacin
de Prueba. Calentar la mezcla hasta que se desprenda humo denso. Dejar que se enfre, agregar cuidadosamente 1O mL de
agua y volver a calentar hasta que se produzca humo irritante. Se debe repetir este procedimiento con otros 1O mL de
agua para eliminar cualquier traza de perxido de hidrgeno. Enfriar y diluir con agua hasta obtener 35 ml.
Preparacin de Prueba: Excepto que se indique algo diferente en la monografa individual, transferir un matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada por la frmula:

3,0/L
L = lmite de arsnico (ppm)
Agregar 5 mL de cido sulfrico y algunas perlas de vidrio y digerir en una campana de extraccin, preferentemente en
una placa de calentamiento, y a una temperatura de no ms de 120, hasta que se inicie la carbonizacin. (Agregar ms
cido sulfrico si fuera necesario para humedecer completamente algunas muestras pero teniendo en cuenta que el volu-
men total agregado no puede exceder de 1O ml.) Agregar cuidadosamente, gota a gota, perxido de hidrgeno al 30%, y
dejar que la reaccin disminuya y calentar nuevamente entre una y otra gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente
mezclando lo suficiente para evitar una reaccin rpida. Interrumpir el calentamiento si se produce excesiva espuma. Cuan-
do la reaccin ha terminado, calentar cuidadosamente, rotando el matraz ocasionalmente para evitar que algunas porcio-
nes de la muestra queden adheridas a las paredes del matraz expuestas a la unidad de calentamiento. Mantener las condi-
ciones de oxidacin en todo momento durante Ja digestin agregando pequeas cantidades de la solucin de perxido de hidr-
geno cada vez que la mezcla se torne de color marrn o se oscurezca. Continuar la digestin hasta que la materia orgnica se
destruya, aumentando gradualmente la temperatura de la placa de calentamiento hasta que se desprenda abundante hu-
mo de trixido de azufre y la solucin se vuelva incolora o presente solamente un color ligeramente pajizo. Enfriar, agregar
cuidadosamente 1O mL de agua, mezclar y volver a evaporar hasta que aparezca humo irritante; repetir este procedimiento
USP 39 Pruebas Qumicas/ (212) Anlisis de Oligosacridos 269

para eliminar cualquier traza de perxido de hidrgeno. Enfriar, agregar cuidadosamente 1O mL de agua, lavar las paredes
del matraz con algunos mL de agua y diluir con agua a 35 ml.
Procedimiento: Proceder segn se indica en el Procedimiento en Mtodo l.
Sustancias Qumicas lnterferentes: Ver Sustancias Qumicas lnterferentes en Mtodo l.
, ,
(212) ANALISIS DE OLIGOSACARIDOS

INTRODUCCIN
El anlisis de la composicin de oligosacridos unidos a Asn (tambin conocidos como oligosacridos N-ligados o N-glicanos)
se ha vuelto necesario para la caracterizacin de ciertas protenas teraputicas recombinantes o para establecer sus especifi-
caciones de liberacin. Ver el captulo de informacin general Anlisis de Glicoprotenas y Glicanos-Consideraciones Generales
(1084) para informacin sobre la caracterizacin y evaluacin de la glicosilacin de protenas. El captulo (1084) incluye es-
trategias analticas generales y resalta criterios para seleccionar mtodos apropiados para desafos analticos especficos, ade-
ms de proveer el contexto para este captulo. Por el momento, este captulo se enfoca en el anlisis de oligosacridos uni-
dos a Asn escindidos enzimticamente de protenas teraputicas recombinantes glicosiladas que contienen cadenas biante-
narias relativamente simples, ricas en manosa, con niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, fosforiladas o sulfatadas. Por
lo tanto, se proveen mtodos utilizados en los diferentes pasos del anlisis de protenas teraputicas recombinantes glicosila-
das, incluyendo: un procedimiento genrico para la liberacin enzimtica de N-glicanos usando N-glicosidasa F (PNGasa F)
peptdica, dos mtodos diferentes para el marcado con fluorforos de los N-glicanos liberados, y cuatro procedimientos ana-
lticos de separacin cromatogrfica y electrofortica, as como criterios de desempeo para la separacin. El captulo (1084)
trata estrategias analticas alternativas. Aunque los procedimientos de este captulo estn validados, estos deben ser verifica-
dos para cada producto especfico individual (ver el captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos (1226)). Adems, la
validacin es necesaria cuando se modifica el procedimiento para optimizarlo a un producto especfico (ver el captulo Vali-
dacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225)). Las monografas individuales de los productos proveern el anlisis de datos,
la cuantificacin y las especificaciones de liberacin de lote, las cuales se espera sean especficas para cada producto. Por lo
tanto, dichos aspectos no se tratan en este captulo.
El marcado de los oligosacridos con fluorforo antes del anlisis de mejora la deteccin de los oligosacridos durante la sepa-
racin, debido a que estas molculas tienen baja o nula absortividad de luz UV o visible y tampoco tienen grupos fluorfo-
ros. Este captulo describe dos mtodos diferentes para el marcado con fluorforos. El primero utiliza derivatizacin de oligo-
sacridos con 2-aminobenzamida (2-AB) y se usa cuando la separacin es por cromatografa de lquidos; el segundo utiliza
marcacin con la sal trisdica del cido 8-aminopireno-1,3,6- trisulfnico (APTS, por sus siglas en ingls) y se usa cuando la
separacin es por electroforesis capilar (CE, por sus siglas en ingls). Aunque la deteccin electroqumica (deteccin ampero-
mtrica por pulsos o deteccin electroqumica por pulsos) tambin se usa en el anlisis de los oligosacridos separados por
cromatografa de intercambio aninico de alta resolucin (HPAEC) a alto pH, este mtodo no se trata en este captulo.
Se han desarrollado muchos mtodos de cromatografa y electroforesis diferentes para analizar oligosacridos, y los procedi-
mientos descriptos en este captulo han sido usados con xito para este propsito. La eleccin de los procedimientos aqu
tratados pretende reflejar los enfoques de uso ms comn y amplio para medicamentos biolgicos glicosilados recombinan-
tes que se comercializan en la actualidad. Estos procedimientos analticos incluyen cromatografa lquida en fase normal
(NPLC, por sus siglas en ingls) o cromatografa lquida de interaccin hidroflica {HILIC, por sus siglas en ingls), cromato-
grafa de intercambio aninico de alta resolucin (HPAEC, por sus siglas en ingls) a pH alto y electroforesis capilar. Otros
mtodos cromatogrficos diversos que separan oligosacridos por tamao, forma y polaridad tambin se utilizan rutinaria-
mente, pero no se tratan en este captulo. Los principios generales de cromatografa se tratan en el captulo Cromatografa
(621) y este captulo debe considerarse dentro de dicho contexto.
Se han desarrollado Estndares de Referencia USP (ER) para evaluar la aptitud del sistema para estos procedimientos analticos.
El ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP es un complejo de oligosacridos biantenarios parcialmente
sialilados y parcialmente galactosilados N-enlazados escindidos de inmunoglobulina policlonal humana {lgG) mediante
PNGasa F. El ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP es un complejo de oligosacridos N-enlazados de
alto contenido en manosa con trazas de cadenas hbridas escindidos de ribonucleasa B (RNasa B) bovina mediante PNGasa
F.
ASPECTOS GENERALES DE LOS PROCEDIMIENTOS ANALTICOS
La Tabla 7 describe las aplicaciones y los principios de separacin de procedimientos analticos incluidos en este captulo. La
seleccin del ER apropiado depender del contenido de glicanos esperado del producto que se est analizando.
270 (212) Anlisis de Oligosacridos / Prueb61s Qumicas USP 39

Tabla 1
Tipo de Ollgosacridos N-ligados Que Se
Procedimientos Analticos Van a Separar Estndares de Referencia USP Aplicables
Cromatografa en Fase Normal/HIL/C Cadenas biantenarias relativamente simples con
Procedimiento 1 niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosa-
Columna: 2,0 mm x 15 cm; relleno despus del marcado con 2-AB cridos USP
L68 de 3 m
Produce ms picos de oligosacri-
dos en comparacin con el
Procedimiento 2 en modo HIL/C
Fase mvil en gradientes ms llanos
(menos empinados) y ms prolon-
gados en comparacin con el
Procedimiento 2 en modo HILIC
Mejor sensibilidad que permite me- Cadenas con alto contenido de manosa, des- ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosa-
nor tamao de muestra pus del marcado con 2-AB cridos USP
Cromatografa en Fase Normal/HIL/C Cadenas biantenarias relativamente simples con
Procedimiento 2 niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosa-
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno despus del marcado con 2-AB cridos USP
L68 de 5 m
Produce ms picos de oligosacri-
dos en comparacin con el
Procedimiento 1 en modo HIL/C
Fase mvil en gradientes ms llanos
(menos empinados) y ms prolon-
gados en comparacin con el Pro- Cadenas con alto contenido de manosa, des- ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosa-
cedimiento 1 en modo HIL/C pus del marcado con 2-AB cridos USP
HPAEC Cadenas biantenarias relativamente simples con
Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosa-
relleno L46 de 1O m despus del marcado con 2-AB cridos USP
Columna: 4,0 mm x 25 cm; relleno
L46de10 m
Fase mvil: Acetato de sodio 0-75
mM en hidrxido de sodio O, 150 N
isocrtico
La selectividad es diferente a la de
los Procedimientos 1 y 2 en modo
HILIC con respecto al tamao y la
composicin de los Cadenas con alto contenido de manosa, des- ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosa-
oligosacridos pus del marcado con 2-AB cridos USP
Electroforesis capilar Cadenas biantenarias relativamente simples con
Apropiado para Oligosacridos niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosa-
APTS despus del marcado con APTS cridos USP
Capilar: Dimetro interno de 50 m
con una longitud total de 50 cm y
una longitud de separacin de 40
cm
Tiempos de anlisis ms cortos en
comparacin con el mtodo de ero- Cadenas con contenido alto de manosa, des- ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosa-
matografa de lquidos pus del marcado con APTS cridos USP

PREPARACIN DE MUESTRAS
Las muestras deberan estar idealmente exentas de sales, excipientes y otros materiales portadores que pueden interferir con el
anlisis. Esto se puede lograr mediante: 1) dilisis contra agua o contra una solucin amortiguadora con componentes vol-
tiles usando una membrana apropiada, 2) captura de la muestra en un cartucho de extraccin en fase slida (SPE, por sus
siglas en ingls) seguido por la eliminacin de sales y excipientes mediante lavado y elucin de la muestra requerida o 3)
ultrafiltracin usando una membrana apropiada.
[NOTA-Una muestra control con un perfil de glicanos conocido debe incluirse en el procedimiento general para confirmar el
desempeo correcto del anlisis. Tambin se puede incluir un control o blanco de reaccin que contenga la matriz de la
muestra de glicoprotena usada en el procedimiento general.]
LIBERACIN ENZIMTICA DE N-GLICANOS
[NOTA-El siguiente es un mtodo genrico que debe optimizarse para productos individuales dependiendo de la cantidad de
glicoprotena que se va a digerir y de las estructuras de los glicanos, en particular se debe considerar la relacin protena/
glicano en la molcula y la accesibilidad de la enzima a las uniones de los azcares con las protenas.]
Procedimiento 1 para separacin cromatogrfica
Solucin amortiguadora de reaccin enzimtica: Fosfato de sodio 50 mM de pH 7,5 o tris(hidroximetil)-aminometa-
no 15 mM ajustado con cido clorhdrico a un pH de 7,0
Digestin con PNGasa F: Transferir O, 1-2,25 mg de glicoprotena a un vial, disolver y llevar con Solucin amortiguadora
de reaccin enzimtica a un volumen final de 30-100 L. Agregar PNGasa F a la muestra de glicoprotena en una relacin
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (212) Anlisis de Oligosacridos 271

de 0,5-15 unidades de PNGasa F/0, 1 mg de glicoprotena. Incubar a 37 durante 12-24 horas. Enfriar a temperatura
ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Mezclar suavemente usando un mezclador de vrtice y centrifugar bre-
vemente. [NOTA-Una unidad de PNGasa F se define como la cantidad de enzima requerida para catalizar la liberacin
de oligosacridos N-ligados de 1,0 nmol de ribonucleasa B desnaturalizada por minuto a un pH de 7,5 a 37 y es igual a
1 miliunidad de la Unin de Bioqumica Internacional (IUB, por sus siglas en ingls).] [NOTA-La totalidad de la digestin
mediante PNGasa F se puede evaluar observando un desplazamiento de movilidad de las protenas desglicosiladas en
SDS-PAGE seguida por una tincin con Azul de Coomassie o en SDS-CGE, evidenciada por una reduccin de la masa de
aproximadamente 2 kDa por cadena de glicano escindida.]
A continuacin, se describen dos mtodos para llevar a cabo la separacin de los glicanos liberados de la glicoprotena.
Mtodo 1, usando ultrafiltracin centrfuga por membrana con un lmite de peso molecular de 30 kDa: 1 Eliminar
las trazas de glicerina enjuagando la membrana con 0,5 mi de agua y centrifugando a 11 000 x g. Desechar el permea-
do. Agregar O, 1 mL de agua en el reservorio de la muestra y luego agregar la muestra de glicoprotena digerida al reser-
vorio. Enjuagar el vial de reaccin con O, 1 mL de agua y agregar al reservorio de la muestra. Centrifugar a 11 000 x g y
recoger el permeado. Enjuagar el reservorio de la muestra dos veces con O, 1 mL de agua para cada lavado, centrifugar a
11 000 x g y recoger el permeado. Combinar los permeados (aproximadamente 0,5 mL) y secar completamente las
muestras usando una centrfuga evaporadora sin calor. [NOTA-Se pueden usar membranas de ultrafiltracin centrfuga
con un lmite de peso molecular ms bajo para protenas con un tamao menor a 150 kDa.]
Mtodo 2, usando un cartucho de extraccin en fase slida (SPE) en fase reversa:2 Agregar 2,0 mL de metano! a
una jeringa, acoplar la jeringa al cartucho y usar el mbolo de la jeringa para pasar metanol y desecharlo. Agregar 6,0
mL de cido actico al 5% (v/v) en agua a una jeringa. Acoplar la jeringa al cartucho y usar el mbolo de la jeringa para
pasar la solucin de cido actico y desecharla. Aplicar con cuidado la muestra digerida en un cartucho individual. Agre-
gar 0,5 mL de cido actico al 5% (v/v) a una jeringa de 1 mL, acoplar la jeringa al cartucho y usar el mbolo de la
jeringa para pasar el cido actico y descartar. Agregar 1,5 mL de cido actico al 5% (v/v) a una jeringa de 2 a 3 ml.
Acoplar la jeringa al cartucho y usar el mbolo de la jeringa para pasar el cido actico, y recoger el eluato en un tubo
de 1,5 ml. Secar por completo los eluatos usando una centrfuga evaporadora sin calor.
Procedimiento 2 para separacin por electroforesis capilar
Solucin amortiguadora de reaccin enzimtica: Fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5
Digestin con PNGasa F: Agregar 2 L de PNGasa F (5 unidades/L) a una muestra de 50 g de glicoprotena y ajustar
con Solucin amortiguadora de reaccin enzimtica a un volumen final de 50 L. Incubar a 37 durante 18 horas. Separar
mediante ultrafiltracin centrfuga los oligosacridos escindidos usando un filtro con lmite de peso molecular de 1O kDa.
Secar el permeado conteniendo los oligosacridos usando una centrfuga evaporadora con vacio sin calor.
MARCADO CON 2-AMINOBENZAMIDA (2-A8)3 PARA SEPARACIN POR CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
Solucin A: Mezclar cido actico glacial y dimetil sulfxido (3:7, v/v).
Solucin B: Agregar 1,5 mL de Solucin A a 75 mg de 2-aminobenzamida (2-AB). Mezclar bien y suavemente con un
mezclador de vrtice hasta disolver por completo el 2-AB.
Solucin de marcado: Agregar 1 mL de Solucin B a 63 mg de cianoborohidruro de sodio. Mezclar bien y suavemente
con un mezclador de vrtice. Tapar la muestra hermticamente e incubar a 70 durante 1-2 minutos para disolver por
completo. Enfriar a temperatura ambiente durante 1O minutos. Usar esta Solucin de marcado dentro de la primera hora
de su preparacin. Proteger la solucin de la luz.
Solucin estndar marcada con 2-AB: Agregar 5-15 L de Solucin de marcado a un vial de ER Mezcla A de Aptitud del
Sistema de Oligosacridos USP o de ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP y mezclar bien.
Solucin muestra marcada con 2-AB: Agregar 5-15 L de Solucin de marcado a la muestra de glicano secada y mezclar
bien.
Procedimiento: Incubar inmediatamente la Solucin estndar marcada con 2-AB y la Solucin muestra marcada con 2-AB a
37 durante 16-18 horas o a 65 durante 2 horas. Dejar que se enfre a temperatura ambiente durante 1O minutos. Cen-
trifugar brevemente.
[NOTA-Siguiendo las guas citadas en la Tabla 7, seleccionar el ER USP apropiado y marcar.]
A continuacin se describen dos mtodos para eliminar el 2-AB libre.
Mtodo 1, usando una columna de filtracin en gel para centrifugacin: Preparar columnas de filtracin en gel para
microcentrifugacin G-1 O adecuadas4 golpeteando suavemente la columna para asegurar que la resina seca se sedimente
en el fondo. Retirar las tapas y colocar la columna en un tubo de recoleccin de 2 ml. Agregar 0,5 mL de agua a la resina
y dejar que se rehidrate durante al menos 15 minutos. Un tiempo de rehidratacin ms largo (hasta 24 horas) es acepta-
ble si se mantiene la columna a 2-8. Centrifugar la columna a mxima velocidad por 5-1 O segundos. Retirar el agua del
tubo de recoleccin. Lavar la resina agregando 0,5 mL de agua y centrifugar la columna. Repetir la etapa de lavado una

1 Una dispositivo apropiado de ultrafiltracin centrfuga con membrana con un lmite de peso molecular de 30 kDa. es el Microcn YM-30 disponible en Millipore
(nmeros de catlogo 42422, 42409 y 4241 O) o equivalente.
2 Un cartucho SPE adecuado es Glyko GlycoClean R Cartridge disponible en Prozyme (nmero de catlogo GKl-4756) o equivalente.
3 Un kit de marcado con 2-AB adecuado es el Glycko Signal 2-AB Labeling Kit disponible en Prozyme (nmero de catlogo GKK-404), el kit de marcado LudgerTag
2-AB disponible en QA Bio (nmero de catlogo LT-KAB-A2) o equivalente.
4 Una columna adecuada preempacada con Sephadex G-1 O es la columna Macro Spin G-1 O mini SEC disponible en Harvard Apparatus (nmero de catlogo
743900) o en The Nest Group (nmero de catlogo SMM 501 O) o equivalente.
272 (212) Anlisis de Oligosacridos / Pruebas Qumicas USP 39

vez ms. Despus de eliminar el agua de la etapa de lavado final, centrifugar a la velocidad mxima durante 1O segundos
para retirar el agua residual de la resina. La resina se torna blanca cuando se remueve suficiente agua residual. Colocar la
columna en un nuevo tubo de recoleccin marcado. Agregar 100 L de agua a la Solucin estndar marcada con 2-AB y a
la Solucin muestra marcada con 2-AB, y luego aplicar toda la solucin al centro de cada una de las columnas G-1 O lava-
das, respectivamente. Colocar las columnas G-1 O en la microcentrfuga y centrifugar a aproximadamente 200 x g durante
1 minuto. Aplicar el eluato de la primera columna (aproximadamente 90-120 L) al centro de una segunda columna
G-1 O, que no ha sido previamente usada pero ha sido lavada, y centrifugar a aproximadamente 200 x g durante 1 minu-
to. Colectar este segundo eluato (aproximadamente 60-100 L) y transferirlo a un tubo de microcentrfuga. Secar los
eluatos mediante evaporacin centrfuga sin calor.
Mtodo 2, usando un cartucho para SPE: Preparar cartuchos para SPE adecuados 5 lavndolos con 1,0 mL de agua, se-
guido con 5 x 1,0 mL de cido actico al 30% (v/v) y luego con 1,0 mL de acetonitrilo. Aplicar la Solucin estndar marca-
da con 2-AB y la Solucin muestra marcada con 2-AB a la superficie central de los discos de cartucho y dejar que la solucin
se incube en el disco durante 15-20 minutos. Lavar cada disco con 1 mL de acetonitrilo, seguido por 6 x 1,0 mL de ace-
tronitrilo al 96% (v/v), dejando que escurra cada alcuota antes de aplicar la siguiente. Eluir el estndar marcado con 2-AB
y la muestra marcada con 2-AB con 3 x 0,5 mL de agua, dejando que escurra cada alcuota antes de aplicar la siguiente.
Secar los eluatos usando una evaporacin centrfuga sin calor. [NOTA-Durante este procedimiento, podran perderse los
glicanos hidrfobos muy pequeos.]
MARCADO CON CIDO 8-AMINOPIREN0-1,3,6-TRISULFNICO (APTS) PARA SEPARACIN POR ELECTROFORESIS CAPILAR
Reactivo de marcado con APTS: Disolver 5 mg de 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonato (APTS) trisdico en 48 L de cido
actico al 15% (v/v).
Cianoborohidruro de sodio 1 M: Cianoborohidruro de sodio 1 M en tetrahidrofurano
Solucin amortiguadora de corrida: Disolver 1,492 g de trietanolamina (TEA) y 1Og de glicerol, pesados con exactitud,
en 80 mL de agua. Ajustar a un pH de 7,5 con cido clorhdrico 1 N y diluir con agua a un volumen final de 100 mL.
Solucin amortiguadora de muestra: Diluir 1,0 mL de Solucin amortiguadora de corrida con 9,0 mL de agua.
Solucin estndar marcada con APTS: Agregar 2 L de Reactivo de marcado con APTS y 2 L de Cianoborohidruro de
sodio 1 M a un vial de ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP o de ER Mezcla B de Aptitud del Sistema
de Oligosacridos USP. Incubar a 55 durante 90 minutos. Agregar 46 L de agua para detener la reaccin y mezclar.
Transferir 5 L del ER USP marcado con APTS a 1,995 mL de Solucin amortiguadora de muestra antes de la separacin.
[NOTA-Puede ser necesario ajustar el volumen de la Solucin amortiguadora de muestra para que las seales de fluorescen-
cia de los oligosacridos sean similares a las de la Solucin muestra marcada con APTS.]
Solucin muestra marcada con APTS: Agregar 2 L de Reactivo de marcado con APTS y 2 L de Cianoborohidruro de sodio
1 M a la muestra de glicano seca. Incubar a 55 durante 90 minutos. Agregar 46 L de agua para detener la reaccin y
mezclar. Transferir 5 L de la solucin de glicanos marcada con APTS a 95 L de Solucin amortiguadora de muestra antes
de la separacin.
[NOTA-Siguiendo las guas citadas en la Tabla 1, seleccionar el ER USP apropiado y marcar.]
SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE OLIGOSACRIDOS
CROMATOGRAFA EN FASE NORMAL/HILIC
Procedimiento 1
Solucin de cido frmico 1,4 M: Mezclar 273 mL de agua con 15 mL de cido frmico al 98%-100%.
Solucin de amoniaco 1,4 M: Mezclar 155 mL de agua con 40 mL de solucin de amoniaco al 26%.
Solucin amortiguadora de formiato de amonio: Agregar Solucin de amoniaco 1,4 M a Solucin de cido frmico 1,4
M.
Solucin A: Acetonitrilo, Solucin amortiguadora de formiato de amonio y agua (75: 4,3: 20,7)
Solucin B: Acetonitrilo, Solucin amortiguadora de formiato de amonio y agua (54: 8,3: 37,7)
Fase mvil: Ver la Tabla 2.
Tabla 2
Tiempo Solucin A Solucin B
(mln) (%) (%)
0,0 79 21
80,0 47 53
81,0 o 100
92,0 o 100
93,0 79 21
113,0 79 21

Solucin estndar: Reconstituir el estndar seco marcado con 2-AB con no ms de 500 L de agua. [NOTA-Puede ser
necesario ajustar el volumen de agua para que las seales de fluorescencia de la Solucin estndar sean similares a las de
la Solucin muestra.]

5 Un cartucho adecuado para eliminar el 2-AB libre es Glyko GlycoClean S Cartridge disponible en Prozyme (nmero de catlogo GKl-4726) o equivalente.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (212) Anlisis de Oligosacridos 273

Solucin muestra: Reconstituir la muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar
una relacin de 30 L de agua por cada 100 g de glicoprotena usada en la prueba de Liberacin Enzimtica de N-Glica-
nos como punto de inicio.]
Solucin blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoprotena obtenida mediante el procedimiento de Prepara-
cin de la muestra
Sistema cromatogrfico
0/er Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitacin de 250 nm y longitud de onda de emisin de 428 nm)
Columna: 2,0 mm x 15 cm; relleno L68 de 3 m
Temperaturas
Columna: 45
Muestreador automtico: 20
Velocidad de flujo: 0,2 ml/min
Volumen de inyeccin: 2 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin estndar y Solucin blanco
Requisitos de aptitud
Blanco: No se observan picos en el cromatograma de la Solucin blanco dentro de la ventana del tiempo de retencin
a 5-11 3 minutos
Similitud de los cromatogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, el cromato-
grama obtenido de la Solucin estndar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP
del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de
Oligosacridos USP, el cromatograma obtenido de la Solucin estndar corresponde al cromatograma de referencia
provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP.
Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identifi-
car los picos correspondientes a GO, GOF, Gl Fa, Gl Fb, G2F, A1 F y A2F en el cromatograma obtenido de la Solucin
estndar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del
Sistema de Oligosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identificar los
picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el cromatograma obtenido de la Solucin es-
tndar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del
Sistema de Oligosacridos USP.
Tiempos de retencin relativos: Correspondiente a los tiempos de retencin relativos de N-glicanos listados en la
Tabla 3 o la Tabla 4
Ta bl a 3 So 1ucon san d ar Usan d o e 1 ER Mezc1a Ade Apt1tu d d e 1 SI stema d e 0111gosacar
I' Et' 'Id os USP
N-Glicano Tiempo de Retencin Relativo
GO (NGA2) 0,47
GOF (NGA2F) 0,57
GlFa (NAlF, FA2Gl o NA2GlF) 0,75
GlFb (NAlF, FA2Gl o NA2GlF) 0,78
G2F (NA2F) 1,00
AlF (G2fSl) 1,39
A2F (G2fS2) 1,76

Tabla 4. Solucin Estndar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Ollgosacrldos USP
N-Gllcano Tiempo de Retencin Relativo
MAN-5 0,74
MAN-6 1,00
MAN-7 1,29
MAN-8 1,60
MAN-9 1,85

Anlisis: Equilibrar el Sistema cromatogrfico durante al menos 1 hora con las condiciones iniciales descritas en la Tabla
2. Inyectar la Solucin blanco hasta que la lnea base permanezca estable (1-3 inyecciones).
Muestra: Solucin muestra
Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las reas relativas (con respecto al rea total) de los picos
pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Trazar una lnea base desde el primero hasta el ltimo
pico. Para informacin general sobre la integracin de los picos cromatogrficos, ver Cromatografa (621 ).
Procedimiento 2
274 (212) Anlisis de Oligosacridos / Pruebas Qumicas USP 39

Solucin A: Mezclar 500 ml de agua con 9,8 ml de cido frmico al 96%. Ajustar con hidrxido de amonio al 30% a
un pH de 4,00,1. Diluir con agua hasta un volumen final de 1000 ml. Filtrar la solucin a travs de una membrana de
acetato de celulosa con un tamao de poro de 0,22 m.
Solucin B: Acetonitrilo
Fase mvil: Ver la Tabla 5.
Tabla 5
Tiempo Solucin A Solucin B
(mln) (%) (%)
0,0 20 80
2,0 30 70
67,0 52 48
67,1 80 20
73,0 80 20
73,1 20 80
85,0 20 80

Solucin estndar: Reconstituir el estndar seco marcado con 2-AB con no menos de 500 L de agua. [NOTA-Puede
ser necesario ajustar el volumen de agua para que las seales de fluorescencia de la Solucin estndar sean similares a las
de la Solucin muestra.]
Solucin muestra: Reconstituir la muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar
una relacin de 50 L de agua por cada 100 g de glicoprotena usada en la prueba de Liberacin Enzimtica de N-Glica-
nos como punto de inicio.]
Solucin blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoprotena obtenida mediante el procedimiento de Prepara-
cin de la muestra
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Fluorescencia; ajustar las longitudes de onda de excitacin y emisin segn se listan en la Tabla 6.
Tabla 6
Tiempo Excitacin Emisin
(min) (nm) (nm)
0,00 330 420
1,00 330 420
1,01 400 500
10,00 400 500
10,01 330 420
85,00 330 420

Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L68 de 5 m

Temperaturas
Columna: 35
Muestreador automtico: 2-8
Velocidad de flujo: 0,4 ml/min
Volumen de inyeccin: 1O L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Similitud de los cromatogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, el cromato-
grama obtenido de la Solucin estndar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP
del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de
Oligosacridos USP, el cromatograma obtenido de la Solucin estndar corresponde al cromatograma de referencia
provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP.
Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identifi-
car los picos correspondientes a GO, GOF, Gl Fa, Gl Fb, G2, G2F, Al F y A2F en el cromatograma obtenido de la Solu-
cin estndar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud
del Sistema de Oligosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identificar
los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el cromatograma obtenido de la Solucin
estndar comparando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del
Sistema de Oligosacridos USP.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (212) Anlisis de Oligosacridos 275

Tiempos de retencin relativos: Correspondiente a los tiempos de retencin relativos de N-glicanos listados en la
Tabla 7 o la Tabla 8
, d ar Usan d o e IEM
Ta bl a 7. So1ucI'on Estan R ezcIAdAddlSI
a e pt1tu e 'Id os USP
stema d e 0111gosacar
N-Gllcano Tiempo de Retencin Relativo
GO (NGA2) 0,78
GOF (NGA2F) 0,83
GlFa (NAlF, FA2Gl o NA2G1F) 0,91
Gl Fb (NAl F, FA2Gl o NA2Gl F) 0,92
G2 (NA2) 0,96
G2F (NA2F) 1,00
AlF (G2fS1) 1, 11
A2F (G2f52) 1,20

Tabla 8. Solucin Estndar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Ollgosacrldos USP
N-Gllcano Tiempo de Retencin Relativo
MAN-S 0,77
MAN-6 0,86
MAN-7 0,93
MAN-8 1,00
MAN-9 1,05

Anlisis
Muestra: Solucin muestra
Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las reas relativas (con respecto al rea total) de los picos
pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Para informacin general sobre la integracin de los picos
cromatogrficos, ver Cromatografa (621 ).
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO ANINICO DE PH ALTO CON DETECCIN FLUOROMTRICA
Solucin A: Agua, desgasificar antes de usar.
Solucin B: Disolver 20,5 g de acetato de sodio anhidro en 450 ml de agua y mezclar bien. Diluir con agua hasta un
volumen final de 500 ml. Filtrar la solucin a travs de una membrana con un tamao de poro de no ms de 0,45 m y
desgasificar antes de usar.
Solucin C: Agregar 28 ml de solucin de hidrxido de sodio al 50% (p/p) a 972 ml de agua. Pasar la solucin a travs
de un filtro de membrana resistente a soluciones alcalinas con un tamao de poro de no ms de 0,45 m y desgasificar
antes de usar.
Fase mvil: Ver la Tabla 9.
Tabla 9
Tiempo Solucin A Solucin B Solucin C
(min) (%) (%) (%) Elucin
0,0 70 o 30 Condicin inicial
15,0 70 o 30 Acetato de sodio 0-75 mM,
hidrxido de sodio O, 15 N
65,0 55 15 30 isocrtico
66,0 o 50 50 Acetato de sodio 250 mM,
hidrxido de sodio 0,25 N
74,0 o 50 50 para lavado
75,0 70 o 30
90,0 70 o 30 Re-equilibrio

Solucin estndar: Reconstituir el estndar seco marcado con 2-AB con no ms de 500 L de agua. [NOTA-Puede ser
necesario ajustar el volumen de agua para que las seales de fluorescencia de la Solucin estndar sean similares a las de la
Solucin muestra.]
Solucin muestra: Reconstituir la muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una
relacin de 20 L de agua por cada 100 g de glicoprotena usada en la prueba de Liberacin Enzimtica de N-Glicanos
como punto de inicio.]
Solucin blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoprotena obtenida mediante el procedimiento de Preparacin
de la muestra
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
276 (212) Anlisis de Oligosacridos / Pruebas Qumicas USP 39

Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitacin de 330 nm y longitud de onda de emisin de 420 nm)
Columnas
Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; relleno L46 de 1 O m
Analtica: 4,0 mm x 25 cm; relleno L46 de 1O m
Temperaturas
Columna: 25
Muestreador automtico: 4
Velocidad de flujo: 0,8 ml/min
Volumen de inyeccin: 50 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Similitud de los cromatogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, el cromato-
grama obtenido de la Solucin estndar corresponde al cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del
ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosa-
cridos USP, el cromatograma obtenido de la Solucin estndar corresponde al cromatograma de referencia provisto
con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP.
Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identificar
los picos correspondientes a GOF, Gl F, GO, G2F, A1 F y A2F en el cromatograma obtenido de la Solucin estndar com-
parando el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oli-
gosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identificar los picos correspon-
dientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el cromatograma obtenido de la Solucin estndar comparando
el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacri-
dos USP.
Tiempos de retencin relativos: Correspondientes a los tiempos de retencin relativos de N-glicanos listados en la
Tabla 7O o la Tabla 7 7
Tabla 10. Solucin Estndar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP
N-Glicano Tiempo de Retencin Relativo
GOF (NGA2F) 0,67
GlF (NAlF, FA2Gl o NA2GlF) 0,86
GO (NGA2) 0,92
G2F (NA2F) 1,00
AlF (G2f51) 1,75
A2F (G2f52) 2,22

Tabla 11. Solucin Estndar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP
N-Glicano Tiempo de Retencin Relativo
MAN-5 0,86
MAN-6 1,00
MAN-7 1,09
MAN-8 1, 15
MAN-9 1,24

Anlisis: Equilibrar el Sistema cromatogrfico con las condiciones iniciales de fase mvil descritas en la Tabla 9 durante un
mnimo de 15 minutos. Inyectar 50 L de agua para la primera inyeccin.
Muestra: Solucin muestra
Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las reas relativas (con respecto al rea total) de los picos per-
tinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Para informacin general sobre la integracin de los picos cro-
matogrficos, ver Cromatografa (621 ).
ELECTROFORESIS CAPILAR
Solucin amortiguadora de corrida: Disolver 1,492 g de TEA y 1 Og de glicerol en 80 ml de agua. Ajustar con cido
clorhdrico 1 N a un pH de 7,5 y diluir con agua a un volumen final de 100 ml.
Solucin estndar: Solucin estndar marcada con APTS que se prepara segn se indica en la prueba de Marcado con ci-
do 8-aminopireno- 7,3, 6-trisulfnico (APTS) para Separacin por Electroforesis Capilar
Solucin muestra: Solucin muestra marcada con APTS que se prepara segn se indica en la prueba de Marcado con cido
8-aminopireno- 7, 3, 6-trisulfnico ( APTS) para Separacin por Electroforesis Capilar
Solucin blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoprotena usada en el procedimiento de Preparacin de la
muestra
Condiciones instrumentales
USP 39 Pruebas Qumicas/ (212) Anlisis de Oligosacridos 277

Modo: Electroforesis Capilar

Detector: Fluorescencia inducida por lser (longitud de onda de excitacin de 488 nm y longitud de onda de emisin
de 520 nm)
Capilar: Slice fundida sin recubrimiento, con un dimetro interno de 50 m, una longitud total de 50 cm y una longi-
tud de separacin de 40 cm
Preacondicionamiento del capilar: Entre cada corrida, enjuagar durante 5 minutos a 40 psi con hidrxido de sodio
0,5 N, seguidos de agua durante 1 minuto a 40 psi. [NOTA-Preacondicionamiento del nuevo capilar o segn se re-
quiera: Enjuagar durante 5 minutos a 20 psi con metanol, seguidos de agua durante 1 minuto a 50 psi, de cido clorh-
drico 1 N durante 5 minutos a 20 psi, de agua durante 1 minuto a 50 psi, de hidrxido de sodio 0,5 N durante 25
minutos a 20 psi y de agua durante 5 minutos a 50 psi.]
Prellenado del capilar: Enjuagar durante 5 minutos a 40 psi con Solucin amortiguadora de corrida.
Inyeccin muestra: inyeccin hidrodinmica (presin) de 1O segundos
Voltaje: 22 kV durante 60 minutos
Temperaturas
Cartucho del capilar: 18
Almacenamiento de la muestra: 20
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Similitud de los electroferogramas: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, el electro-
ferograma obtenido de la Solucin estndar corresponde al electroferograma de referencia provisto con el Certificado
USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de
Oligosacridos USP, el electroferograma obtenido de la Solucin estndar corresponde al electroferograma de referencia
provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP.
Presencia de especies de N-glicano: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identificar
los picos correspondientes a G2F, G2, Gl Fa, Gl Fb, GOF, Man-5, GO y Al F en el electroferograma obtenido de la Solu-
cin estndar comparando el electroferograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud
del Sistema de Oligosacridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP, identificar
los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 en el electroferograma obtenido de la Solucin
estndar comparando el electroferograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del
Sistema de Oligosacridos USP.
Tiempos de migracin relativos: Correspondientes a los tiempos de migracin relativos listados en la Tabla 72 o Ta-
bla 73
Tabla 12. Solucin Estndar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP
N-Glicano Tiempo de migracin relativo
G2F (NA2F) 0,79
G2 (NA2) 0,84
GlFa (NAlF, FA2G1 o NA2GlF) 0,87
Gl Fb (NA 1 F, FA2G1 o NA2G1 F) 0,90
GOF (NGA2F) 1,00
MAN-5 1,03
GO (NGA2) 1,12
AlF (G2fS1) 1,18

Tabla 13. Solucin Estndar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP
N-Glicano Tiempo de migracin relativo
MAN-9 0,82
MAN-8 0,85
MAN-7 0,91; 0,92; 0,94
MAN-6 1,00
MAN-5 1, 11

Anlisis
Muestra: Solucin muestra
Integrar los picos en el electroferograma resultante e informar las reas relativas (con respecto al rea total) de los picos
pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto.

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11 >
278 (212) Anlisis de Oligosacridos / Pruebas Qumicas USP 39

ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP

ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacridos USP
APNDICE 1
Tabla 14. Descripcin de Gllcano
Gii cano Descripcin
Oligosacrido biantenario asialo-agalacto

GlcNAc31---+2Mana 1 \

6
Man (31---+4GlcNAc31---+4GlcNAc
3

GlcNAc31---+2Mana 1
/
GO (NGA2)
Oligosacrido biantenario asialo-agalacto-fucosilado

Fuca1
GlcNAc31---+2Mana1 \
1
6 6
Man (31---+4GlcNAc31---+4GlcNAc
3

GlcNAc31---+2Mana 1
/
GOF (NGA2F)
Oligosacrido biantenario asialo-monogalactosilado fucosilado con galac-
tosilacin en el enlace a(l ,6)

Gal p 144GlcNAcp 142Mana 1 Fuca1

\
6 6
Manp 144GlcNAcp 144GlcNAc
3

GlcNAcp 142Mana1
/
GlFa (NAlF, FA2G1 o NA2G1F) con enlace a(l,6)
Oligosacrido biantenario asialo-, monogalactosilado, fucosilado con ga-
lactosilacin en el enlace a(l ,3)

Fuca1
GlcNAcp142Mana1

\6 6
Manp 144GlcNAcp 144GlcNAc
3

Gal p 144GlcNAcp 142Mana1

/
GlFb (NAlF, FA2G1 o NA2G1F) con enlace a(l,3)
Oligosacrido biantenario asialo, galactosilado

Galp144GlcNAcP142Mana1

\6
Manp 144GlcNAcp 144GlcNAc
3

Gal p 144GlcNAcp 142Mana1

/
G2 (NA2)
USP 39 Pruebas Qumicas/ (212) Anlisis de Oligosacridos 279

Tabla 14. Descripcin de Glicano (Continuacin)

Gllcano Descripcin
Oligosacrido biantenario asialo-fucosilado

Fuca1
Gal~1-44GlcNAc~1-42Mana1 \ 1

6 6
Man~ 1-44GlcNAc~ 1-44GlcNAc
3

Gal~ 1-44GlcNAc~ 1-42Mana1

/
G2F (NA2F)
Oligosacrido biantenario monosialo-fucosilado

Fuca1
GalP1->4GlcNAcp1->2Mana1 \ 1

{ 6 6
Neu5Aca2->6 /~anp 1->4GlcNAcp 1->4GlcNAc

Galp 1->4GlcNAcP1->2Mana1
A 1F (G2f51)
Oligosacrido biantenario disialo-fucosilado

Fuca1
Neu5Aca2-->6Galp 1-.4GlcNAcp 1->2Mana 1 \

6 6
Manp 1-.4GlcNAciJ 1-->4GlcNAc
3

Neu5Aca2->6Galp 1->4GlcNAcp 1--;2Mana 1

/
A2F (G2f52)
Oligomanosa 5
Oligomanosa con N-ligada con 5 residuos manosilo

Mana1 \

6
Mana 1---+6Man ~ 1---+4GlcNAc~ 1---+4GlcNAc
3 3

Mana1
/ Mana1
1

MAN-5
Oligomanosa 6
Oligomanosa N-ligada con 6 residuos manosilo

Mana1 \

6
Mana1

/
3
\6
Mana1
Man~ 1---+4GlcNAc~ 1---+4GlcNAc
3

Mana 1---+2Mana 1
/
MAN-6
280 (212) Anlisis de Oligosacridos / Pruebas Qumicas USP 39

Tabla 14. Descripcin de Glicano (Continuacin)

Glicano Descripcin
Oligomanosa 7
Oligomanosa N-ligada con 7 residuos manosilo

r Mancx1 \

6
Mancx1

Mancx1~2
3
\6
Mancx1
/ Man~ 1~4GlcNAc~1 ~4GlcNAc
3

Mancx1~2Mancx1
/
MAN-7
Oligomanosa 8
Oligomanosa N-ligada con 8 residuos manosilo

r Mancx1 \

Mancx1~2
6
Mancx1

/
3
\6
Mana1 Man~1~4GlcNAc~1~4GlcNAc
Mancx1~2
3

Mana1~2Mana1
/
MAN-8
Oligomanosa 9
Oligomanosa N-ligada con 9 residuos manosilo

Mana1~2Mana1 \

6
Mana1

/
3
\ 6
Mano: 1-c>2Mano: 1
Manp 1~4GlcNAcp1 ~4GlcNAc
3

Mano: 1~2Mano:1-c>2Mano:1
/
MAN-9

(221) CLORUROS Y SULFATOS

Ca'1tblo en lo redaccin:
Las siguientes pruebas de lmites se utilizan como procedimientos generales en aquellos casos en que se especifican los lmi-
tes de cloruros y sulfatos en las monografas individuales.
Realizar las pruebas y los controles utilizando tubos de vidrio que tengan el mismo dimetro y sean tan semejantes en las
restantes caractersticas como sea posible (ver Nefelometra, Turbdimetrfa y Comparacin Visual (855);. Comparacin Vis.ual
(Arnl-may.2016)). Emplear las mismas cantidades de los mismos reactivos tanto para la solucin en anlisis como para la solucin
control que contiene el volumen especificado de cloruro o sulfato. Si, despus de la acidificacin, la solucin no queda total-
mente transparente, filtrarla a travs de un papel de filtro exento de cloruro y sulfato. Agregar el precipitante, nitrato de plata
SR o cloruro de bario SR, segn sea necesario, a la solucin de prueba y a la solucin de control en secuencia inmediata.
En aquellos casos en que la monografa individual indique la realizacin de la prueba sobre un volumen especfico de una
solucin de la sustancia y el lmite para cloruro o sulfato corresponda a 0,20 ml o menos de cido clorhdrico 0,020 N o de
cido sulfrico 0,020 N, respectivamente, realizar la prueba a la solucin sin dilucin adicional. En tales casos, mantener las
mismas relaciones de volumen para la solucin de control y para la solucin en anlisis. Cuando se realiza la prueba a sales de
USP 39 Pruebas Qumicas/ (226) 4-Epianhidrotetraciclina 281

metales pesados, que muestran normalmente una reaccin cida, omitir la acidificacin y no neutralizar la solucin. Disolver
las sales de bismuto en unos pocos mL de agua y 2 mL de cido ntrico antes del tratamiento con el agente precipitante.
Cloruros-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en anlisis en 30 mL a 40 mL de agua o, si la sustancia ya est
en solucin, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solucin al
tornasol con cido ntrico. Agregar 1 mL de cido ntrico y 1 mL de nitrato de plata SR y agua suficiente para obtener 50 ml.
Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos protegido de la luz solar directa. A menos que se especifique algo diferente en la
monografa correspondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solucin que contenga el volumen
de cido clorhdrico 0,020 N especificado en la monografa.
Sulfatos-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en anlisis en 30 mL a 40 mL de agua, o, si la sustancia ya est
en solucin, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solucin al
tornasol con cido clorhdrico. Agregar 1 mL de cido clorhdrico 3 N, 3 mL de cloruro de bario SR y agua suficiente para obte-
ner 50 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 1O minutos. A menos que se especifique algo diferente en la monografa corres-
pondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solucin que contenga el volumen de cido sulfrico
0,020 N especificado en la monografa.

(223) DIMETILANILINA

La siguiente prueba de lmite se utiliza como un procedimiento general para la determinacin de trazas de dimetilanilina en
artculos farmacopeicos utilizando cromatografa de gases, cuando esta determinacin se especifica en la monografa individual
correspondiente. La dimetilanilina es un depurador del cido clorhdrico que puede haber sido arrastrado durante el proceso.
Solucin de Estndar Interno-A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, preparar una solu-
cin de naftaleno en ciclohexano que contenga aproximadamente 50 g por ml.
Preparacin Estndar-A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, transferir 50,0 mg de N,N-
dimetilanilina a un matraz volumtrico de 50 mL, agregar 25 mL de cido clorhdrico 1 N, agitar por rotacin suave hasta di-
solver, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 5,0 mL de la solucin resultante a un matraz volumtrico de 250 mL,
diluir a volumen con agua y mezclar. En un tubo de centrfuga adecuado agregar 1,0 mL de esta solucin, 5,0 mL de hidrxi-
do de sodio 1 N y 1,0 mL de Solucin de Estndar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Emplear el
sobrenadante transparente como Preparacin Estndar.
Preparacin de Prueba-A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, transferir 1,0 g de la sus-
tancia a analizar a un tubo de centrfuga adecuado, agregar 5 mL de hidrxido de sodio 1 N, agitar por rotacin suave hasta
disolver la muestra, agregar 1,0 mL de Solucin de Estndar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Em-
plear el sobrenadante transparente como Preparacin de Prueba.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-
Equipar el cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama, mantenido aproximadamente a 250 y una colum-
na capilar de slice fundida, de 0,53 mm x 30 m, unida con una pelcula de fase G42 de 1,0 m. El gas transportador es helio,
con una velocidad lineal de aproximadamente 30 cm por segundo y una relacin de particin de 1O : 1. Mantener la tempera-
tura de la columna a 11 O durante los primeros 4 minutos despus de inyectar, luego aumentar de 11 O a 200 a 8 por minu-
to, y mantener a 200 durante 5 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 250. Inyectar en el cromatgrafo la Prepa-
racin Estndar y registrar las respuestas segn se indica en el Procedimiento: identificar los picos de dimetilanilina y naftaleno
segn sus tiempos de retencin relativos, que son 1,0 y 1,3, respectivamente. La relacin seal-ruido para el pico de dimetila-
nilina es no menor de 1O.
Procedimiento-Inyectar en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 1 L) de la Preparacin Estndar y de la
Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las reas de los picos principales. El cociente entre la respuesta de
cualquier pico de dimetilanilina y la respuesta del pico de naftaleno obtenido a partir de la Preparacin de Prueba no es mayor
que el que se obtiene a partir de la Preparacin Estndar (0,002%).

(226) 4-EPIANHIDROTETRACICLINA

Este procedimiento cromatogrfico se utiliza para demostrar que el contenido de 4-epianhidrotetraciclina, un producto de
degradacin de la tetraciclina, no excede el lmite indicado en la monografa individual.
Solucin Amortiguadora de EDTA-Disolver 37,2 g de edetato disdico en 800 mL de agua, ajustar con hidrxido de
amonio hasta un pH de 7,8, diluir con agua a 1000 mL y mezclar.
Fase de Soporte-Agregar 5 mL de Solucin Amortiguadora de EDTA a 1O g de tierra silcea cromatogrfica lavada con cido
para cromatografa en columna y mezclar hasta que la tierra silcea se humedezca uniformemente.
282 (226) 4-Epianhidrotetraciclina / Pruebas Qumicas USP 39

Solucin de Prueba-Preparar segn se indica en la monografa individual correspondiente.

Procedimiento-Preparar un tubo cromatogrfico de 15 mm x 170 mm con una salida de 4 mm x 50 mm rellenndolo
con Fase de Soporte, en porciones, apisonando firmemente cada porcin, hasta que el tubo se llene hasta una altura de aproxi-
madamente 1O cm. En un vaso de precipitados preparar una mezcla de 1 g de tierra silcea cromatogrfica lavada con cido
para cromatografa en columna y 1 mL de Solucin de Prueba. Transferir la mezcla a la parte superior de la columna. Lavar en
seco el vaso de precipitados con Fase de Soporte y transferir a la columna para proporcionar una capa adicional de 1 cm en la
parte superior de la mezcla que contiene la Solucin de Prueba. Dentro de los 30 minutos, pasar cloroformo a travs de la co-
lumna y recolectar fracciones sucesivas de 5,0 mL, 5,0 mL, 10,0 mL, 10,0 mL y 5,0 ml. Observar la columna durante la elucin
y prestar atencin a la aparicin de dos bandas amarillas separadas. La fraccin o fracciones correspondientes a la primera ban-
da amarilla contienen las anhidrotetraciclinas. Descartar estas fracciones. Las fracciones que aparecen despus de la primera
banda amarilla contienen la 4-epianhidrotetraciclina. Determinar la absorbancia de cada fraccin de 4-epianhidrotetraciclina a
la longitud de onda de mxima absorcin, aproximadamente a 438 nm, con un espectrofotmetro apropiado, diluyendo cada
fraccin, si fuera necesario, con cloroformo y empleando cloroformo como blanco. Calcular la cantidad, en mg, de 4-epianhi-
drotetraciclina en cada fraccin, por la frmula:

AVD/20,08
en donde A es la absorbancia, V es el volumen, en mL, de la fraccin tomada, D es el factor de dilucin, si la fraccin se diluy
y 20,08 es la absortividad de la 4-epianhidrotetraciclina a 438 nm. A partir de la suma de las cantidades de 4-epianhidrotetra-
ciclina encontrada en las diferentes fracciones, calcular el porcentaje de 4-epianhidrotetraciclina en relacin con el equivalente
de clorhidrato de tetraciclina contenido en la Solucin de Prueba.

(227) 4-AMINOFENOL EN MEDICAMENTOS QUE CONTIENEN

ACETAMINOFENO

INTRODUCCIN
Este captulo de pruebas generales provee un procedimiento y un criterio de aceptacin (lmite) para controlar el producto de
degradacin principal de acetaminofeno, el 4-aminofenol, una impureza que se puede formar por la hidrlisis del acetami-
nofeno.
PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES
Todas las soluciones que contienen acetaminofeno o 4-aminofenol deben protegerse de la luz y deben almacenarse slo du-
rante el tiempo que se pueda sustentar mediante datos de estabilidad de las soluciones adquiridos durante la verificacin en
las condiciones reales de uso.
Solucin amortiguadora: 4,0 g/L de citrato de sodio dihidrato y 1,5 g/L de cido ctrico anhidro, en agua.
Diluyente: Solucin amortiguadora y acetonitrilo (9:1)
Solucin A: Solucin amortiguadora de fosfato 1O mM, que se prepara agregando 0,60 g de fosfato monobsico de pota-
sio y 0,82 g de fosfato dibsico de sodio a un matraz volumtrico de 1 L, disolviendo y diluyendo con agua a volumen a un
pH de 7,0.
Solucin B: Agua
Solucin C: Acetonitrilo
Fase mvil: Ver la Tabla 7.
Tabla 1
Tiempo Solucin A Solucin B Solucin C
(mln) (O/o) (O/o) (O/o)
o 90 5 5
5 90 5 5
7 10 10 80
7, 1 90 5 5
10 90 5 5

Solucin madre del estndar: 25 g/mL de ER 4-Aminofenol USP en Diluyente. Preparar en el momento de su uso junto
con las otras soluciones descritas a continuacin. Desechar despus de 4 horas o conforme a los datos de estabilidad de las
soluciones. [NOTA-Ver Ajustes Cromatogrficos, estabilidad de la solucin, a continuacin.]
Solucin de aptitud del sistema: 2,5 g/mL de ER 4-Aminofenol USP, a partir de Solucin madre del estndar en Diluyente
Solucin madre de la muestra: Nominalmente 1O mg/mL de acetaminofeno, a partir de una cantidad adecuada de medi-
camento en Diluyente. [NOTA-Se puede incorporar primero cualquiera de los componentes del Diluyente al medicamento,
seguido por la adicin del otro componente manteniendo las proporciones de Solucin amortiguadora y acetonitrilo, y ob-
teniendo el volumen final apropiado definido para el Diluyente.] [NOTA-Se recomienda preparar de manera simultnea la
USP 39 Pruebas Qumicas/ (227) 4-Aminofenol en Medicamentos 283

Solucin muestra y la Solucin estndar dentro de un lapso de tiempo corto (p.ej., 30 minutos) para cada muestra de medi-
camento.]
Solucin estndar: Agregar 25,0 mL de Solucin madre de la muestra y 15,0 mL de Solucin madre del estndar a un ma-
traz volumtrico de 50 mL y diluir con Diluyente a volumen. Pasar a travs de un filtro adecuado con un tamao de poro de
0,45 m, desechando los primeros 3 mL del filtrado.
Solucin muestra: Agregar 25,0 mL de Solucin madre de la muestra a un matraz volumtrico de 50 mL y diluir con Dilu-
yente a volumen. Pasar a travs de un filtro adecuado con un tamao de poro de 0,45 m, desechando los primeros 3 mL
del filtrado.
MTODO CROMATOGRFICO
Sistema cromatogrfico
(yer Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 300 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L85 de 5 m
Temperatura de la columna: 30
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyeccin: 1O L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar
[NOTA-El tiempo de retencin tpico de 4-aminofenol es aproximadamente 4,2-5,3 minutos.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1,0 entre 4-aminofenol y el pico ms cercano, Solucin estndar
Factor de asimetra: No ms de 1,5 para el pico de 4-aminofenol, Solucin estndar
Desviacin estndar relativa: No ms de 5,0%, Solucin estndar
Relacin seal-ruido: No menos de 20 para el pico de 4-aminofenol, Solucin de aptitud del sistema
ANLISIS
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Inyectar la Solucin muestra y la Solucin estndar para cada muestra de medicamento de manera secuencial, es decir, una tras
otra.
Calcular el porcentaje de 4-aminofenol {C 6 H7NO) con respecto a acetaminofeno en la porcin de medicamento tomada:
Resultado= [ruf(r5 - ru)] x (Wsf Wu) x 100

ru =respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solucin estndar
W5 = cantidad de ER 4-Aminofenol USP agregada a la Solucin estndar (mg)
Wu = cantidad de acetaminofeno en la Solucin muestra (mg)
Criterios de aceptacin: (a menos que se especifique de otro modo en la monografa): No ms de O, 15% de 4-aminofe-
nol con respecto a acetaminofeno
AJUSTES CROMATOGRFICOS
Se puede ajustar el tiempo de retencin de 4-aminofenol para conseguir la especificidad para una matriz de producto determi-
nada. Esta posibilidad de ajuste reemplaza a las disposiciones del captulo Cromatografa (621) para el ajuste de condiciones
cromatogrficas y tiene el propsito de proporcionar una medida de flexibilidad cuando as se requiera. La Tabla 2 propor-
ciona sugerencias para cambiar la retencin del 4-aminofenol. El uso de un sistema ternario de fase mvil permite cambios
fciles en la concentracin inica (agua de la Solucin 8) y en la concentracin orgnica (acetonitrilo de la Solucin C), pero
ste puede simplificarse a un sistema binario de fase mvil.
Tabla 2
Cambio en la Retencin del
Cambio de Condicin 4-Amlnofenol
Aumento en la concentracin orgnica (Solucin C) Reduce la retencin del 4-aminofenol
Reduccin del pH (Solucin A) Aumenta la retencin del 4-aminofenol
Aumento en la concentracin inica (Solucin 8) Reduce la retencin del 4-aminofenol
Aumento en la temperatura
de la columna Aumenta la retencin del 4-aminofenol

Los ajustes al procedimiento cromatogrfico pueden requerir de verificacin o validacin. Ver los captulos Validacin de Proce-
dimientos Farmacopeicos (1225) y Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos (1226) para orientacin. Las condiciones cro-
matogrficas ajustadas deben cumplir con todos los requisitos de aptitud del sistema.
284 (227) 4-Aminofenol en Medicamentos / Pruebas Qumicas USP 39

La estabilidad de la solucin debe verificarse en condiciones reales de uso para asegurar que el 4-aminofenol permanece esta-
ble en la Solucin muestra y en la Solucin estndar segn se demuestra por un cambio de no ms de 10% en las reas de
los picos de 4-aminofenol.

(228) XIDO DE ETILENO Y DIOXANO

El siguiente procedimiento se usa para determinar el contenido de xido de etileno y dioxano residuales en los productos que
se preparan a partir de xido de etileno. A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, usar el
Mtodo l.
Mtodo 1
[PRECAUCIN-El xido de etileno es txico e inflamable. Preparar estas soluciones en una campana bien ventilada con mucho
cuidado. Proteger manos y rostro usando guantes protectores de polietileno y una mscara adecuada. Almacenar todas las
soluciones en recipientes hermticos y refrigerar a una temperatura entre 4 y 8.]
[NOTA-Antes de usar el polietilenglicol 200 en esta prueba, eliminar cualquier componente voltil colocando 500 ml de po-
lietilenglicol 200 en un matraz de fondo redondo de 1000 ml y acoplando el matraz a un evaporador rotatorio mantenido a
60 y bajo un vaco de 10-20 mm Hg durante 6 horas.]
Solucin de acetaldehdo: 1O g/ml de acetaldehdo. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin madre de xido de etileno: 2,5 mg/g de xido de etileno.
Preparar segn se indica a continuacin: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio, agregar 50 ml de polietilenglicol
200, y volver a pesar el matraz. Transferir 5 ml del xido de etileno lquido a un vaso de precipitados de 100 ml enfriado
en una mezcla de cloruro de sodio y hielo (1 :3). Transferir 300 L (correspondientes a 250 mg) de xido de etileno lqui-
do al polietilenglicol 200 y agitar por rotacin suave hasta mezclar. Colocar de nuevo el tapn, volver a pesar el matraz, y
determinar la cantidad de xido de etileno absorbido por diferencia de peso. Ajustar el peso de la mezcla con polietilen-
glicol 200 a 100,0 g, colocar de nuevo el tapn, y agitar por rotacin suave hasta mezclar. [NOTA-Llenar con xido de
etileno lquido un frasco resistente a la presin enfriado y almacenar en un congelador cuando no se use. Usar un trozo
pequeo de pelcula de polietileno para proteger el lquido del contacto con la junta de caucho. Usar un aparato enfriado
adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar esta solucin madre inmediatamente antes de su uso y almacenar en un
refrigerador despus de su preparacin.]
Solucin de xido de etileno: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio y enfriarlo en un refrigerador. Agregar 35
ml de polietilenglicol 200 y volver a pesar el matraz. Transferir 1 g de Solucin madre de xido de etileno enfriada al matraz
Erlenmeyer tarado. Ajustar el peso de la solucin con polietilenglicol 200 a 50,0 g, colocar de nuevo el tapn, y agitar por
rotacin suave hasta mezclar. Transferir 1Og de esta solucin a un matraz volumtrico de 50 ml. Agregar 30 ml de agua y
mezclar. Diluir con agua a volumen y mezclar para obtener una solucin que contenga 1O g/ml de xido de etileno.
[NOTA-Usar un aparato enfriado adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de dioxano: 500 g/ml de dioxano
Solucin estndar A: Transferir O, 1 ml de Solucin de xido de etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml.
[NOTA-Se pueden usar otros tamaos de vial para muestreo de fase gaseosa, como por ejemplo de 22 ml, dependiendo
de las condiciones operativas; sin embargo, se debe usar el mismo tamao para la Solucin estndar A, la Solucin estndar
By la Solucin muestra.] Agregar O, l ml de Solucin de acetaldehdo y 0, 1 ml de Solucin de dioxano, sellar el vial, y mez-
clar.
Solucin estndar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml y agre-
gar O, 1 ml de Solucin de xido de etileno, O, 1 ml de Solucin de dioxano y 1,0 ml de N,N-dimetilacetamida. Sellar el vial y
mezclar.
Solucin muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un a vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml y agregar
1,0 ml de N,N-dimetilacetamida y 0,2 ml de agua. Sellar el vial y mezclar.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografa de Gases con muestreador de cmara gaseosa (Headspace GC)
Detector: Ionizacin a la llama
Columna: Capilar de vidrio o cuarzo, de 0,32 mm x 30 m, con una capa de fase Gl de 1,0 m
Temperatura
Inyector: 150
Detector: 250
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.

Tiempo de Espera (Hold Time)

Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura a la Temperatura
Inicial() (/min) Final() Final (min)
50 - 50 5
 USP 39 Pruebas Qumicas / (228) xido de Etileno y Dioxano 285

Tiempo de Espera (Hold Time)

Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura a la Temperatura
Inicial () (/min) Final () Final (min)
50 5 180 -

180 30 230 5

Gas transportador: Helio

Velocidad lineal: 20 cm/s
Volumen de inyeccin: 1 mL (fase gaseosa)
Tipo de inyeccin: Relacin de particin 20:1
Muestreador de fase gaseosa
Tiempo de equilibrio: 45 min
Temperatura de equilibrio
70 para la Solucin estndar A
90 para la Solucin estndar B
90 para la Solucin muestra
Temperatura de la lnea de transferencia: 150
Tiempo de presurizacin: 1 min
Tiempo de inyeccin: 12 s
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar A
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para acetaldehdo y xido de etileno son 0,94 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 2,0 entre acetaldehdo y xido de etileno
Relacin seal-ruido: No menos de 5, determinado a partir del pico de dioxano
Desviacin estndar relativa: No ms de 15%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar By Solucin muestra
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para xido de etileno y dioxano son 1,0 y 2,5, respectivamente.]
Calcular el contenido de xido de etileno, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:

Resultado= AE x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)]

AE = cantidad de xido de etileno agregado a la Solucin estndar B (g)

ru =respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin muestra
r5 = respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin estndar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin estndar B (g)
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:

Resultado= AD x ru/[(r 5 x Wu) - (ru x W5)]

AD = cantidad de dioxano agregado a la Solucin estndar B (g)

ru = respuesta del pico de dioxano de la Solucin muestra
rs = respuesta del pico de dioxano de la Solucin estndar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin muestra (g)
Ws = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin estndar B (g)
Mtodo 11
Solucin estndar de xido de etileno: Diluir 0,5 mL de xido de etileno en cloruro de metileno (50 mg/mL) 1 con agua
hasta 50,0 mL. [NOTA-La solucin es estable durante 3 meses si se almacena en viales con tapas precintadas de membra-
na de silicona recubiertas con politetrafluoroetileno (polytef) a -20.] Dejar que alcance la temperatura ambiente. Diluir 1,0
mL con agua hasta 250,0 mL para obtener una solucin con una concentracin de 2 g/mL de xido de etileno. [NOTA-
Usar esta solucin inmediatamente despus de su preparacin.]
Solucin estndar de dioxano: 0,05 L/mL de dioxano
Solucin estndar de acetaldehdo: 1O g/mL de acetaldehdo. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de resolucin: Agregar 2,0 mL de Solucin estndar de acetaldehdo y 2,0 mL de Solucin estndar de xido de
etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O mL. Sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona
recubierta con tefln y una tapa de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solucin estndar A: 0,48 g/mL de xido de etileno, a partir de Solucin estndar de xido de etileno y 0,005 L/mL de
dioxano, a partir de Solucin estndar de dioxano, en agua

1 Esta es una solucin disponible comercialmente.

286 (228) xido de Etileno y Dioxano / Pruebas Qumicas USP 39

Solucin estndar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml. Agregar
2,0 mL de Solucin estndar A, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con tefln y una tapa
de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solucin muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1 O ml. Agregar
2,0 mL de agua, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con tefln y una tapa de aluminio,
y mezclar cuidadosamente.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografa de Gases con muestreador de cmara gaseosa (Headspace GC)
Detector: Ionizacin a la llama
Columna: Capilar de slice fundida, de 0,53 mm x 50 m, con una capa de fase G27 de 5,0 m
Temperatura
Inyector: 85
Detector: 250
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.
Tiempo de Espera (Hold Time)
Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura a la Temperatura
Inicial() (/min) Final() Final (mln)
70 10 250 5

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 4 mL/min
Volumen de inyeccin: 1 mL (fase gaseosa)
Tipo de inyeccin: Relacin de particin 3,5 : 1
Muestreador de fase gaseosa
Tiempo de equilibrio: 30 min
Temperatura de equilibrio: 80
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de resolucin
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para acetaldehdo y xido de etileno son 0,9 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 2,0 entre acetaldehdo y xido de etileno
Anlisis
Muestras: Solucin estndar By Solucin muestra
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para xido de etileno y dioxano son 1,0 y 1,9, respectivamente.]
Calcular el contenido de xido de etileno, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= CE x V x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)]
CE = concentracin de xido de etileno en la Solucin estndar A (g/mL)
V = volumen de Solucin estndar A agregada a la Solucin estndar B (2,0 mL)
ru = respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin muestra
r5 = respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin estndar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin estndar B (g)
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= C0 x V x p x F x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)]
C0 =concentracin de dioxano en la Solucin estndar A (L/mL)
V = volumen de la Solucin estndar A agregada a la Solucin estndar B (2,0 mL)
p = densidad de dioxano (1,03 g/mL = 1,03 mg/L)
F = factor de conversin (1000 g/mg)
ru =respuesta del pico de dioxano de la Solucin muestra
r5 =respuesta del pico de dioxano de la Solucin estndar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin estndar B (g)
USP 39 Pruebas Qumicas/ (231) Metales Pesados 287

Eliminar lo siguiente:

(231) METALES PESADOS

Esta prueba se proporciona para demostrar que el contenido de impurezas metlcas coloreadas por el in sulfuro, en las
condiciones de prueba especificadas, no excede el lmite de Metales pesados especificado en la monografa individual corres-
pondiente al porcentaje (en peso} de plomo en la sustancia en anlisis, segn se determina mediante comparacin visual con-
comtante (ver Comparacn Visual en la seccin Procedmie.nto en Espectrofotometra y Dispersin de Luz (851)) con un control
preparado a partir de una Solucin Estndar de Plomo. [NOTA-Las sustancias que generalmente respondern a esta prueba son:
plomo, mercurio, bismuto, arsnico, antimonio, estao, cadmio, plata, cobre y molibdeno.]
Determinar la cantidad de metales pesados por el Mtodo f, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. El Mtodo I se emplea para sustancias que producen preparaciones transparentes e incoloras en las condidones de
prueba especificadas. El Mtodo 11 se emplea para sustancias que no producen preparaciones transparentes e incoloras en las
condiciones de prueba especificadas para el Mtodo 1, o para sustancias que por su naturaleza compleja interfieren con la preci-
pitacin de metales mediante el in sulfuro, o para aceites fijos y voltiles. El Mtodo {lf es un mtodo de digestin hmeda
que se usa slo cuando no se puede usar ni el Mtodo I ni el Mtodo 11.

Reactivos Especiales

Solucin Madre de Nitrat de Plomo-Disolver 159,8 rng de nitrato de plomo en 100 mL de agua a la que se le ha agre-
gado 1 mL de cido ntrico, luego diluir con agua hasta 1000 mL. Preparar y almacenar esta solucin en recipientes de vidrio
libres de sales de plomo solubles.
Solucin Estndar de Plomo-En el da de uso, diluir con agua 10,0 mL de Solucin Madre de Nitrato de Plomo hasta 100,0
mL. Cada ml de la Solucn Estndar de Plomo contiene el equivalente a 1O g de plomo. Una solucin de comparacin prepa-
rada sobre la base de 100 L de Solucin Estndar de Plomo por g de sustancia en anlisis contiene el equivalente a 1 parte de
plomo por milln de partes de la sustancia en anlisis.

MTODO 1

Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5-Disolver 25,0 g de acetato de amonio en 25 ml de agua y agregar 38,0
mL de cido clorhdrico 6 N. Ajustar, si fuera necesario, con hidrxido de amonio 6 N o cido clorhdrico 6 N hasta un pH de
3,5; diluir con agua hasta 100 ml y mezclar.
Preparacin Estndar-Pipetear 2 mL de la Solucin Estndar de Plomo (20 g de Pb), transferir a un tubo de comparacin
de color de 50 ml y diluir con agua hasta 25 mL Usando un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto
como indicador externo, ajustar con cido actico 1 No hidrxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua
hasta 40 ml y mezclar.
Preparacin de Prueba-En un tubo de comparacin de color de 50 ml, colocar 25 mL de la solucin preparada para la
prueba segn se indica en la monografa individual; o usando el volumen de cido indicado, cuando se especifica en la mono-
grafa individual, disolver y diluir con agua hasta 25 ml la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, segn se calcula, por la
frmula:
2,0/(1 OOOL)
en donde Les el lmite de Metales pesados, expresado como porcentaje. Usando un medidor de pH o un papel indicado.r de
pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0
y 4,0, diluir con agua hasta 40 ml y mezclar.
Preparacin Control-En un tercer tubo de comparacin de color de 50 ml, colocar 25 ml de una solucin preparada
segn se indica en la Preparacin de Prueba y agregar 2,0 mL de la Solucin Estndar de Plomo. Usando un medidor de pH o un
papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N
hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua hasta 40 ml y mezclar.
Procedimiento-A cada uno de los tres tubos que contengan la Preparacin Estndar, la Preparacin de Prueba y la Prepara-
cin Control, agregar 2 ml de la Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5; luego agregar 1,2 ml de tioacetamida-glicerina
bsica SR, diluir con agua hasta 50 ml, mezclar, dejar en repso durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie
blanca*: el color de la solucin de la Preparacin de Prueba no es ms oscuro que el de la solucin de la Preparacin Estndar y
el color de la solucin de la Preparacin Control es igual o ms oscuro que el color de la solucin de la Preparacin Estndar.
[NOTA-Si el color de la Preparacin Control es ms claro que el de la Preparacin Estndar, usar el Mtodo 11 en lugar det Mto-
do I para la sustancia en anlisis.]

En aquellos pases o jurisdicciones en los que no se pueda usar tioacetamida, agregar a cada uno de los tubos 1O ml de sulfuro de hidrgeno SR recin prepara-
do, mezclar, dejar en reposo durante 5 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca.
288 (231) Metales Pesados/ Pruebas Qumicas USP 39

-
USP 39 Pruebas Qumicas/ (232) Impurezas Elementales-Lmites 289

ntrico. Entibiar suavemente hasta que.se inicie la reaccin, dejar que la reaccin disminuya)' proceder segn se indica en Si la
sustancia es un slido, comenzando donde: dice "agregar: porciones de la misma mezcla de cidos".
Preparacin Control-Proceder con.1:1 .digestin, usando la misma cantidad de muestra y el mismo procedimiento, segn
se indica en el prrafo Si la sustancia es un slido en la seccin Preparacin de Prueba, hasta el paso ''Enfriar, diluir cuidadosa
mente con unos pocos ml de agua~':;. Agregar2,0 ml de la Solucin Estndar de Plomo(20 g de plomo) y mezclar. Transferir a
un tubo de comparacin de color de 50 mL, enjuagar eLmatraz con agua, agregando los enjuagues altllbo hasta obtener un
volumen de 25 ml y mezclar.
Procedimiento-Tratar la Preparacin de Prueba,. !i! Preparacin Estndar y la Preparacin Control del siguiente modo. Usan-
do un medidor de pH o un papel indkador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar la solucin a un pH entre
3,0 y 410 con hk:lrxido d.e. amonio (se puede 1.sar una solucin de amonaco djluida, si se desea, l medida que se acerca al pH
especificado), diluir con agua hasta. 40 mly mezclar.
Agregar a <:ada tubo 2 mLdela ~olvcinAl:t'lortiguadora de Acetato de pH 3,S, 11.ego agregar 1,2 mL de tioacetamida...gliceri-
na bsca SR, diluir con agua hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo durante 2 minu~os y obsewar hacia abajo sobre una super-
ficie blanca*: el. color de la Preparocin de PruebQ no esms; oscuro que el de fil Preparacin Estndar, y el color de la Prepara~
es
cin Controf igual o ms oscuro que el de la Preparacin Estndar.
Oficial: 01 de enero de 2018 (BR oi-abr-2o15)
{Ofi<:al 01-ene-2018)

(232) IMPUREZAS ELEMENTALES-LMITES

INTRODUCCIN
Este captulo general especifica lmites para la cantidad de impurezas elementales en productos farmacuticos. Las impurezas
elementales incluyen catalizadores y contaminantes ambientales que pueden estar presentes en frmacos, excipientes o medi-
camentos. Estas impurezas pueden presentarse de manera natural, agregarse intencionalmente o introducirse inadvertidamen-
te (p.ej. mediante interacciones con el equipo de procesamiento y el sistema de envase y cierre). Cuando se conoce la presen-
cia de impurezas elementales, cuando se han agregado o cuando se pueden introducir potencialmente, es necesario asegurar
el cumplimiento con los lmites especificados. Una estrategia de control basada en riesgos puede ser adecuada cuando los ana-
listas determinan la forma en que se va a asegurar el cumplimiento de esta norma. La evaluacin de riesgos debe considerar
(como mnimo) al arsnico, cadmio, plomo y mercurio, debido a su naturaleza ubicua. Independientemente de la metodologa
empleada, todos los medicamentos deben cumplir con los lmites especificados a menos que se especifique de otro modo en
una monografa individual o se excluya en el tercer prrafo de esta introduccin.
Los medicamentos que contienen protenas y polipptidos purificados (incluyendo protenas y polipptidos producidos a
partir de fuentes recombinantes o no recombnantes), sus derivados y los productos de los que son componentes (p.ej., conju-
gados) estn dentro del alcance de este captulo, al igual que los medicamentos que contienen polipptidos, polinucletidos y
oligosacridos producidos de manera sinttica.
Este captulo no se aplica a radiofarmacuticos, vacunas, metabolitos celulares, productos de ADN, extractos alergnicos, c-
lulas, sangre entera, componentes celulares o derivados de la sangre, incluido el plasma y los derivados del plasma, soluciones
para dilisis no destinadas para circulacin sistmica y elementos que se incluyen intencionalmente en el medicamento para
beneficio teraputico. Este captulo no se aplica a productos basados en genes (terapia gnica), clulas (terapia celular) y teji-
dos (tejidos modificados por ingeniera).
Los lmites presentados en este captulo no se aplican a excipientes ni frmacos, excepto cuando se especifique en este cap-
tulo o en las monografas individuales. Sin embargo, es necesario conocer, documentar y proporcionar en caso de que sean
solicitados los niveles de impurezas elementales presentes en frmacos y excipientes.
Este captulo no se aplica a los artculos destinados nicamente para uso veterinario. Los requisitos listados en este captulo
tampoco se aplican a los productos de nutricin parenteral total (TPN, por sus siglas en ingls) y soluciones para dilisis. Los
suplementos dietticos y sus ingredientes se tratan en el captulo Contaminantes Elementales en Suplementos Dietticos (2232).

ESPECIACIN
La determinacin del estado de oxidacin, complejo orgnico o combinacin recibe el nombre de especiacin. Cada una de
las impurezas elementales tiene el potencial de estar presente en diferentes estados de oxidacin o de formacin de complejos.
No obstante, el arsnico y el mercurio son de especial cuidado debido a las diferentes toxicidades de sus formas inorgnicas y
orgnicas complejas.
Los lmites de arsnico se basan en la forma inorgnica (la ms txica). El arsnico se puede medir usando un procedimiento
para arsnico total asumiendo que todo el arsnico contenido en el material en anlisis se encuentra en la forma inorgnica.
290 (232) Impurezas Elementales-Lmites / Pruebas Qumicas USP 39

Cuando el lmite se excede usando el procedimiento para arsnico total, puede ser posible demostrarlo mediante un procedi-
miento que cuantifique las diferentes formas en que la forma inorgnica cumple con la especificacin.
Los lmites de mercurio se basan en el estado de oxidacin (2+) inorgnico. El metilmercurio (la forma ms txica de mercu-
rio) no es un problema comn para la industria farmacutica. Por consiguiente, el lmite se estableci asumiendo la forma inor-
gnica ms comn (mercrica). Los lmites para artculos que tienen el potencial de contener metilmercurio (p.ej., productos
obtenidos a partir de peces) se proporcionan en las monografas correspondientes.

VAS DE EXPOSICIN
La toxicidad de una impureza elemental se relaciona con su grado de exposicin (biodisponibilidad). Se ha determinado el
grado de exposicin para cada una de las impurezas elementales de inters para las tres vas de administracin: oral, parenteral
e inhalatoria. Estos lmites se basan en la exposicin crnica. Se deben considerar las exposiciones diarias orales permitidas
(EDP) de la Tabla 7 como punto de partida para el desarrollo de exposiciones diarias orales permitidas especficas para otras
vas de administracin, excepto cuando se indique de otro modo en la monografa individual. [NOTA-Las vas de administra-
cin de medicamentos se definen en el captulo general Formas Farmacuticas (1151 ).]

MEDICAMENTOS
Los lmites descritos en la segunda, tercera y cuarta columnas de la Tabla 7 son las exposiciones diarias permitidas en la dosis
diaria base de las impurezas elementales de inters para un medicamento tomado por un paciente de acuerdo con las vas de
administracin indicadas.

Productos Parenterales

Los medicamentos parenterales con volmenes mximos diarios de hasta 2 litros pueden usar el volumen mximo diario
para calcular las concentraciones permitidas a partir de las exposiciones diarias permitidas. En el caso de los productos cuyos
volmenes diarios, segn se especifican en el etiquetado y/o se establecen mediante la prctica clnica, pueden exceder de 2
litros (p.ej., solucin salina, dextrosa, productos de nutricin parenteral total, soluciones para irrigacin), se puede usar un vo-
lumen de 2 litros para calcular las concentraciones permitidas a partir de las exposiciones diarias permitidas.
Tabla 1. Impurezas Elementales para Medicamentos
EDP EDP EDP
para Dosis para Dosis para Dosis
Diaria Diaria Diaria
Oral" Parenteral de Inhalacin
Elemento (g/da) (g/da) (g/da)
Cadmio 5 2 2
Plomo 5 5 5
Arsnico inorgnico 15 15 2
Mercurio inorgnico 30 3 1
Iridio 100 10 1
Osmio 100 10 1
Paladio 100 10 1
Platino 100 10 1
Rodio 100 10 1
Rutenio 100 10 1
Cromo 11000 1100 3
Molibdeno 3000 1500 10
Nquel 200 20 5
Vanadio 100 10 1
Cobre 3000 300 30
Ver la seccin Especiacin.

Opciones para Demostrar el Cumplimiento

OPCIN DE ANLISIS DEL MEDICAMENTO

Los resultados obtenidos a partir del anlisis de una unidad de dosificacin tpica, multiplicados por la dosis diaria mxima,
se comparan con la EDP por Dosis Diaria.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (232) Impurezas Elementales-Lmites 291

EDP por Dosis Diaria~ valor medido (g/g) x dosis diaria mxima (g/da)

La cantidad medida de cada impureza no es mayor que la EDP por Dosis Diaria, a menos que se indique de otro modo en la
monografa individual.

OPCIN DE SUMATORIA

Sumar por separado las cantidades de cada impureza elemental (en g/g) presente en cada uno de los componentes del
medicamento usando la siguiente ecuacin:

EDP por Dosis Diaria~ [LM 7(CM x WM)] x D0

M = cada ingrediente usado para fabricar una unidad de dosificacin

CM = concentracin de elemento en el componente (frmaco o excipiente) (g/g)
WM =peso del componente en una unidad de dosificacin (g/unidad de dosificacin)
D0 = nmero de unidades en la dosis diaria mxima (unidad/da)
El resultado de la sumatoria de cada impureza no es mayor que la EDP para Dosis Diaria, a menos que se indique algo dife-
rente en la monografa individual. Antes de que se puedan evaluar los productos con esta opcin, el fabricante debe asegurar
que no se hayan agregado impurezas elementales adicionales de manera inadvertida durante el proceso de fabricacin o me-
diante el sistema de envase y cierre durante la vida til del producto.

OPCIN DE COMPONENTE INDIVIDUAL

Para medicamentos con una dosis diaria de no ms de 1Og, si todas los frmacos y excipientes en una formulacin cumplen
con los lmites de concentracin mostrados en la Tabla 2, entonces dichos componentes pueden usarse en cualquier propor-
cin. No es necesario realizar clculos adicionales. Aunque las impurezas elementales derivadas del proceso de fabricacin o
del sistema de envase y cierre no se preveen especficamente en la Opcin de Componente Individual, se espera que el fabrican-
te del medicamento asegure que dichas fuentes no contribuyen de manera significativa con el contenido total de impurezas
elementales.

FRMACOS V EXCIPIENTES
Se debe controlar la concentracin de impurezas elementales en frmacos y excipientes y documentarla cuando estn pre-
sentes. Los niveles aceptables para estas impurezas dependen del uso final previsto del material. Por consiguiente, los fabrican-
tes de medicamentos deben determinar el nivel aceptable de impurezas elementales en los frmacos y excipientes usados para
producir sus productos.
Los valores provistos en la Tabla 2 son ejemplos de lmites de concentracin para componentes (frmacos y excipientes) de
medicamentos dosificados a una dosis diaria mxima de 1 Og/da. Estos valores funcionan como lmites de concentracin pre-
determinados para facilitar las discusiones entre los fabricantes de medicamentos y los proveedores de los componentes para
sus medicamentos. [NOTA-Puede ser necesario limitar los componentes individuales a niveles distintos de los presentados en
la tabla, dependiendo de los factores mitigantes especficos de la monografa.]
Ta bl a 2 . E1emp
. 1os d e L'1m1tes
. d e concentrac I'on para componentes de Me d1camentos con una Dos1s
. D1ar1a Max1ma d e 10 g
Lmites de Concentracin
Lmites de Concentracin Lmites de Concentracin (g/g) para Componentes
(g/g) para Componentes (g/g) para Componentes Usados en
Usados en Medicamentos Ora- Usados en Medicamentos para Inhala-
Elemento les Medicamentos Parenterales cln
Cadmio 0,5 0,2 0,2
Plomo 0,5 0,5 0,5
Arsnico inorgnico 1,5 1,5 0,2
Mercurio inorqnico 3 0,3 0,1
Indio 10 1 0,1
Osmio 10 1 0,1
Paladio 10 1 0,1
Platino 10 1 0,1
Rodio 10 1 0,1
Rutenio 10 1 0,1
Cromo 1100 110 0,3
Molibdeno 300 150 1
Ver la seccin Especiacin.
292 (232) Impurezas Elementales-Lmites / Pruebas Qumicas USP 39

Tabla 2. Ejemplos de Lmites de Concentracin para Componentes de Medicamentos con una Dosis Diaria Mxima de 10 g
(Continuacin)
Lmites de Concentracin
Lmites de Concentracin Lmites de Concentracin (g/g) para Componentes
(g/g) para Componentes (g/g) para Componentes Usados en
Usados en Medicamentos Ora- Usados en Medicamentos para Inhala-
Elemento les Medicamentos Parenterales cin
Nquel 20 2 0,5
Vanadio 10 1 0,1
Cobre 300 30 3
Ver la seccin Especiacin.

PRUEBAS ANALTICAS
Cuando los fabricantes pueden demostrar el cumplimiento, mediante el monitoreo del proceso y control en la cadena de
abastecimiento, entonces puede no ser necesario aplicar pruebas adicionales. Cuando las pruebas se realizan para demostrar el
cumplimiento, se debe proceder segn se indica en el captulo general Impurezas Elementales-Procedimientos (233) y la eva-
luacin de Elementos Diana debe incluir como mnimo arsnico, cadmio, plomo y mercurio.

(233) IMPUREZAS ELEMENTALES-PROCEDIMIENTOS

INTRODUCCIN
Este captulo describe dos procedimientos analticos (Procedimientos 7 y 2) para la evaluacin de los niveles de impurezas
elementales. Asimismo, el captulo describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los analistas confirmarn
mediante estudios de validacin que los procedimientos analticos aqu descritos sean adecuados para su uso en el material
especfico.

Uso de Procedimientos Alternativos

Este captulo tambin describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los procedimientos alternativos que
cumplen con los requisitos de validacin de este captulo pueden usarse de acuerdo con las Advertencias y Requisitos Generales
6.30, Mtodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados. La informacin sobre los Requisitos para la Validacin de Procedimien-
tos Alternativos se provee ms adelante en este captulo.

Especiacin

La determinacin del estado de oxidacin, complejo orgnico o combinacin recibe el nombre de especiacin. Los procedi-
mientos analticos para especiacin no se incluyen en este captulo, pero se pueden encontrar ejemplos en diversas partes de
los compendios USP-NF y en la literatura.

PROCEDIMIENTOS FARMACOPEICOS 1 Y 2
La estandarizacin del sistema y la evaluacin de la aptitud usando materiales de referencia aplicables debe realizarse el da
del anlisis.

Procedimiento y Tcnica de Deteccin

El Procedimiento 7 se puede usar para impurezas elementales que por lo general son fciles de detectar mediante espectros-
copa de emisin (ptica) atmica de plasma inductivamente acoplado (ICP-AES o ICP-OES). El Procedimiento 2 se puede usar
para impurezas elementales que por lo general son fciles de detectar mediante ICP-MS. Antes del uso inicial, el analista debe
verificar que el procedimiento sea apropiado para el instrumento y la muestra usados (verificacin del procedimiento) median-
te el cumplimiento de los requisitos de Validacin de Procedimiento Alternativo siguientes.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 293

Preparacin de la Muestra
Las formas para la preparacin de la muestra incluyen: Sin diluir, Solucin Acuosa Directa, Solucin Orgnica Directa y Solucin
Indirecta. La seleccin de la forma apropiada de preparacin de la muestra depende del material en anlisis y es responsabili-
dad del analista. Cuando no se indica una forma de preparacin de la muestra en la monografa, el analista puede usar cual-
quiera de los siguientes procedimientos de preparacin adecuadamente validados. Para casos en los que sea necesario agregar
cantidades conocidas (spiking) a un material en anlisis a fin de proporcionar una seal de intensidad aceptable, el blanco
tambin debe ser adicionado con los mismos Elementos Diana y, cuando sea posible, con la misma solucin usada para adicio-
nar la muestra. Las soluciones estndar pueden contener mltiples Elementos Diana. [NOTA-Se deben pesar todas las muestras
lquidas.]
Sin diluir: Se usa para lquidos o procedimientos alternativos que permiten examinar muestras sin disolventes.
Solucin acuosa directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente acuoso.
Solucin orgnica directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente orgnico.
Solucin indirecta: Se usa cuando un material no es directamente soluble en disolventes acuosos u orgnicos. La extraccin
total de metales es el mtodo de preparacin de la muestra preferido para obtener una Solucin indirecta. La muestra debe
digerirse usando el procedimiento con vaso de digestin cerrado provisto a continuacin o uno similar a ste. El esquema de
preparacin de la muestra debe proveer una cantidad suficiente de muestra para cuantificar cada elemento en el lmite especi-
ficado en la monografa o captulo correspondiente.
Vaso de digestin cerrado: El procedimiento de preparacin de la muestra se disea para muestras que deben digerirse en
un cido Concentrado usando un aparato de vaso de digestin cerrado. El vaso de digestin cerrado minimiza la prdida de
impurezas voltiles. La seleccin de un cido Concentrado depende de la matriz de la muestra. Puede ser apropiado el uso de
cualquiera de los cidos Concentrados, pero cada uno implica riesgos de seguridad inherentes. Por consiguiente, se deben to-
mar precauciones de seguridad adecuadas en todo momento. [NOTA-Los pesos y volmenes provistos se pueden ajustar para
cumplir con los requisitos del aparato de digestin usado.]
Un procedimiento ilustrativo que ha demostrado una amplia aplicabilidad es el siguiente. Deshidratar y predigerir 0,5 g de
muestra primaria en 5 mL de cido Concentrado recientemente preparado. Dejar en reposo con la tapa sin ajustar durante 30
minutos en una campana de extraccin. Agregar 1 O mL adicionales de cido Concentrado y digerir, usando una tcnica de
vaso cerrado, hasta completar la digestin o la extraccin. Repetir, si fuera necesario, agregando 5 mL adicionales de cido
Concentrado. [NOTA-Cuando se requiera una digestin en vaso cerrado, seguir los procedimientos recomendados por el fabri-
cante para garantizar el uso seguro.]
Como alternativa se pueden realizar lixiviados siempre que se justifique mediante estudios cientficos validados de disponibi-
lidad de los metales, los cuales pueden incluir estudios en animales, de especiacin u otros medios para estudiar la disponibili-
dad del metal especfico desde el producto farmacutico.
Reactivos: Todos los reactivos usados para la preparacin de las soluciones estndar y muestra deben estar exentos de impu-
rezas elementales, de conformidad con el captulo Espectroqumica de Plasma (730).

Procedimiento 1: ICP-OES
Solucin de estandarizacin 1: 1,5] de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solucin de estandarizacin 2: 0,5] de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solucin madre de la muestra: Proceder segn se indica anteriormente en Preparacin de la Muestra. Si fuera necesario, de-
jar que la muestra se enfre. Para la determinacin de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solucin muestra: Diluir la Solucin madre de la muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentracin final
de los Elementos Diana de no ms de 1,5].
Blanco: Matriz Equiparada
Sistema espectromtrico elemental
(Ver Espectroqumica de Plasma (730).)
Modo: ICP
Detector: Sistema de deteccin ptica
Enjuague: El diluyente usado
Estandarizacin: Solucin de estandarizacin 7, Solucin de estandarizacin 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de estandarizacin 7
Requisitos de aptitud
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solucin de estandarizacin 7 antes y despus del anlisis de la Solucin
muestra.
Criterios de aptitud: No ms de 20% para cada Elemento Diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto contenido mine-
ral, enjuagar bien el sistema antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Anlisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y la longitud de onda. Calcular e
informar los resultados basndose en el tamao de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas para co-
rregir por interferencias inducidas por la matriz (p.ej., superposiciones de longitud de onda).]
294 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos / Pruebas Qumicas USP 39

Procedimiento 2: ICP-MS

Solucin de estandarizacin 1: 1,5/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada

Solucin de estandarizacin 2: 0,5/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solucin madre de la muestra: Proceder segn se indica anteriormente en Preparacin de la Muestra. Si fuera necesario, de-
jar que la muestra se enfre. Para la determinacin de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solucin muestra: Diluir la Solucin madre de Ja muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentracin final
de los Elementos Diana de no ms de 1,5/.
Blanco: Matriz Equiparada
Sistema espectromtrico elemental
(Ver Espectroqumica de Plasma (730).)
Modo: ICP. [NOTA-Se recomienda un instrumento con una cmara de roco enfriada. (Una celda de colisin o una celda
de reaccin tambin puede ofrecer beneficios.)]
Detector: Espectrmetro de masas
Enjuague: El diluyente usado
Estandarizacin: Solucin de estandarizacin 7, Solucin de estandarizacin 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de estandarizacin 7
Requisitos de aptitud
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solucin de estandarizacin 7 antes y despus del anlisis de la Solucin
muestra.
Criterios de aptitud: Deriva no ms de 20% para cada Elemento Diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto contenido
mineral, enjuagar bien el sistema antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Anlisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y a m/ z. Calcular e informar los
resultados basndose en el tamao de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas para corregir por in-
terferencias inducidas por la matriz (p.ej., interferencia de cloruro de argn en determinaciones de arsnico).]

REQUISITOS PARA LA VALIDACIN DE PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS

Si los procedimientos farmacopeicos especificados no cumplen con las necesidades de una aplicacin especfica, se puede
desarrollar un procedimiento alternativo (ver Advertencias y Requisitos Generales 6.30, Mtodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados). Los procedimientos alternativos deben ser validados y se debe demostrar que son aceptables de acuerdo con los
requisitos de validacin para procedimientos alternativos descritos a continuacin. El nivel de validacin necesario para asegu-
rar que un procedimiento alternativo es aceptable depende de si se especifica en la monografauna prueba de lmite o una
determinacin cuantitativa. A continuacin se describen los requisitos para la validacin de un procedimiento de impurezas
elementales para cada tipo de determinacin. Cualquier procedimiento alternativo que ha sido validado y que cumple con los
criterios de aceptacin siguientes se considera adecuado para uso.

PROCEDIMIENTOS DE LMITE

La siguiente seccin define los parmetros de validacin que se deben cumplir para que los procedimientos alternativos de
lmite sean aceptables. El cumplimiento con estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedi-
miento de aptitud del sistema y un material de referencia adecuados.
La aptitud del mtodo se debe determinar mediante estudios que empleen los materiales o mezclas en anlisis adicionados
con concentraciones conocidas de cada Elemento Diana de inters a la concentracin del lmite de aceptacin apropiada. Las
cantidades conocidas deben agregarse al material o mezcla en anlisis antes de llevar a cabo las etapas de preparacin de la
muestra.

Capacidad de Deteccin

Solucin estndar: Una preparacin de materiales de referencia para los Elementos Diana a las Concentraciones Diana
Solucin muestra adicionada 1: Preparar una solucin de la muestra en anlisis, a la que se le agregan cantidades conocidas
de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentracin Diana, solubilizada o digerida segn se
indica en Preparacin de la Muestra.
Solucin muestra adicionada 2: Preparar una solucin de la muestra en anlisis, a la que se le agregan cantidades conocidas
de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana al 80% de la Concentracin Diana, solubilizada o digerida
segn se indica en Preparacin de la Muestra.
Solucin muestra no adicionada: Una muestra del material en anlisis, solubilizado o digerido de la misma manera que las
Soluciones muestra
USP 39 Pruebas Qumicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 295

Criterios de aceptacin
Procedimientos no instrumentales: La Solucin muestra adicionada 7 proporciona una seal o intensidad equivalente o
mayor que la de la Solucin estndar. La Solucin muestra adicionada 2 debe proporcionar una seal o intensidad menor que la
de la Solucin muestra adicionada 7. [NOTA-La seal de cada Solucin muestra adicionada no es menor que la determinacin
de la Solucin muestra no adicionada.]
Procedimientos instrumentales: El valor promedio de las tres mediciones repetidas de la Solucin muestra adicionada 7
est dentro de (15%) del valor promedio obtenido para las mediciones repetidas de la Solucin estndar. El valor promedio de
las mediciones repetidas de la Solucin muestra adicionada 2 debe proveer una intensidad o valor de seal menor que los de la
Solucin estndar. [NOTA-Corregir los valores obtenidos para cada una de las soluciones adicionadas usando la Solucin mues-
tra no adicionada.]

Precisin para Mtodos Instrumentales (Repetibilidad)

[NOTA-La precisin no instrumental se demuestra cumpliendo con el requisito de Capacidad de Deteccin anterior.]
Soluciones muestra: Seis muestras independientes del material en anlisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de
materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentracin Diana.
Criterios de aceptacin
Desviacin estndar relativa: No ms de 20% para cada Elemento Diana

Especificidad

El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequvoca (ver Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225))
cada Elemento Diana ante la presencia de los componentes esperados, incluyendo otros Elementos Diana y componentes de la
matriz.

PROCEDIMIENTOS CUANTITATIVOS
La siguiente seccin define los parmetros de validacin que se deben cumplir para que los procedimientos cuantitativos
alternativos sean aceptables. El cumplimiento de estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un proce-
dimiento de aptitud del sistema y materiales de referencia adecuados. El cumplimiento con estos requisitos demuestra que el
procedimiento es equivalente al procedimiento farmacopeico con el propsito de cuantificar los Elementos Diana.

Exactitud

Soluciones estndar: Preparar soluciones que contengan los Elementos Diana a concentraciones en el intervalo de 50% a
150% de j, usando materiales de referencia apropiados.
Muestras de prueba: Preparar muestras del material en anlisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de materiales
de referencia apropiados antes de cualquier etapa de preparacin de la muestra (digestin o solubilizacin), a concentraciones
que caigan dentro del intervalo de 50% a 150% de j para cada Elemento Diana.
Criterios de aceptacin
Recuperacin de cantidades conocidas agregadas: 70%-150% para la media de tres preparaciones repetidas a cada
concentracin

Precisin

REPETIBILIDAD

Muestras de prueba: Seis muestras independientes del material en anlisis (tomadas del mismo lote) con materiales de refe-
rencia apropiados para los Elementos Diana al nivel indicado.
Criterios de aceptacin
Desviacin estndar relativa: No ms de 20% (N = 6) para cada Elemento Diana

PRECISIN INTERMEDIA (TOLERANCIA)

Realizar el anlisis de Repetibilidad nuevamente en un da diferente, usando un instrumento diferente, un analista distinto, o
una combinacin de estos. Combinar los resultados de este anlisis con el anlisis de Repetibilidad de modo que el nmero
total de anlisis sea 12.
Criterios de aceptacin
Desviacin estndar relativa: No ms de 25% (N = 12) para cada Elemento diana
296 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos/ Pruebas Qumicas USP 39

Especificidad
El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequvoca (ver Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225))
cada Elemento Diana en presencia de aquellos componentes que se espera estn presentes, incluyendo otros Elementos Diana y
componentes de la matriz.

Lmite de Cuantificacin, Intervalo y Linealidad

Se demuestra cumpliendo con el requisito de Exactitud.

APNDICE

cido Concentrado: Los cidos ntrico, sulfrico, clorhdrico o fluorhdrico concentrados ultrapuros o el Agua Regia.
Agua Regia: El agua regia es una mezcla de cidos clorhdrico y ntrico concentrados, por lo general en proporciones de 3:1
4:1, respectivamente.
Matriz Equiparada: Son soluciones que tienen la misma composicin de disolvente que la Solucin muestra. En el caso de
una solucin acuosa, la Matriz Equiparada indicara que se estn usando los mismos cidos, concentraciones cidas y estabiliza-
dor de mercurio en ambas preparaciones.
Elementos Diana: Elementos que potencialmente estaran presentes en el material en anlisis. Cuando el anlisis se lleva a
cabo para demostrar el cumplimiento, la evaluacin de elementos diana incluye arsnico (As), cadmio (Cd), plomo (Pb) y mer-
curio (Hg). Los Elementos diana tambin deben incluir cualquier elemento que pudiera agregarse a travs del procesamiento o
almacenamiento del material.
Lmite Diana o Concentracin Diana: Valor de aceptacin para la impureza elemental que se est evaluando. Un exceso en
el lmite diana indica que un material en anlisis excede el valor aceptable. La determinacin del cumplimiento se trata en
otros captulos. [NOTA-Cuando este captulo se aplica a los captulos Impurezas Elementales-Lmites (232) y Contaminantes
Elementales en Suplementos Dietticos (2232), es posible obtener una aproximacin de los Lmites Diana dividiendo las Exposicio-
nes Diarias Permitidas (EDP) para Dosis Diaria por la dosis diaria mxima para la Opcin de Anlisis del Medicamento del captulo
(232) o la EDP por Racin Diaria dividida por el tamao de racin diaria mximo del captulo (2232).]
J: La concentracin (p/p) de los elementos de inters en el Lmite Diana se diluye apropiadamente hasta el intervalo de traba-
jo del instrumento. Por ejemplo, si los elementos diana son Pb y As para un anlisis de un medicamento slido oral, con una
dosis diaria de 1Og/da, usando espectrometra de masas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS), el lmite diana para
estos elementos sera 0,5 g/g y 1,5 g/g (ver la Tabla 2 del captulo (232)). No obstante, en este caso, se sabe que el interva-
lo dinmico lineal de la ICP-MS se extiende desde 0,01 ng/mL hasta O, 1 g/mL para estos elementos. Por consiguiente, se
requiere un factor de dilucin de al menos 1:100 para asegurar que el anlisis se realice en el intervalo dinmico lineal del
instrumento. Jsera, en consecuencia, igual a 5 ng and 15 ng/mL para plomo y arsnico, respectivamente, cuando se suma el
factor de dilucin.
Materiales de Referencia Apropiados: Cuando se especifiquen Materiales de Referencia Apropiados en el captulo, se deben
usar materiales de referencia certificados (CRM) de un instituto nacional de metrologa, o materiales de referencia que sean
rastreables al material de referencia certificado de un instituto nacional de metrologa. Un ejemplo de un instituto nacional de
metrologa en los Estados Unidos es el National lnstitute of Standards and Technology.

(241) HIERRO

Esta prueba de lmite se suministra para demostrar que el contenido de hierro, en forma frrica o ferrosa, no excede el lmite
de hierro especificado en la monografa individual. La determinacin se realiza mediante la comparacin visual concomitante
con un control preparado a partir de una solucin de hierro estndar.
Reactivos Especiales-
SOLUCIN DE HIERRO ESTNDAR-Disolver 863,4 mg de sulfato frrico amnico [FeNHiS0 4 ) 2 12H2 0] en agua, agregar 1O mL
de cido sulfrico 2 N y diluir con agua hasta 100,0 ml. Pipetear 1O mL de esta solucin y transferirlos a un matraz volumtri-
co de 1000 mL, agregar 1O mL de cido sulfrico 2 N, diluir con agua a volumen y mezclar. Esta solucin contiene el equiva-
lente a 0,01 mg (1 O g) de hierro por ml.
SOLUCIN DE TIOCIANATO DE AMONIO-Disolver 30 g de tiocianato de amonio en agua para obtener 100 ml.
Preparacin Estndar-Pipetear 1 mL de Solucin Estndar de Hierro (1 O g de Fe) y transferirlos a un tubo para compara-
cin de color de 50 mL, diluir con agua hasta 45 mL, agregar 2 mL de cido clorhdrico y mezclar.
Preparacin de Prueba-Colocar en un tubo para comparacin de color de 50 mL la solucin preparada para la prueba
segn se indica en la monografa individual y, si fuera necesario, diluir con agua hasta 45 mL; o disolver en agua y diluir con
agua hasta 45 mL la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, segn se calcula por la frmula:
USP 39 Pruebas Qumicas / (251 ) Plomo 29 7

1,0/(l OOOL)
en donde L es el lmite de Hierro expresado como porcentaje. Agregar 2 ml de cido clorhdrico y mezclar.
Procedimiento-A cada uno de los tubos que contienen la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba agregar 50 mg
de cristales de peroxidisulfato de amonio y 3 ml de Solucin de Tiocianato de Amonio y mezclar: el color de la solucin obteni-
da con la Preparacin de Prueba no es ms oscuro que el de la solucin de la Preparacin Estndar.

(251) PLOMO

La imposicin de lmites estrictos para las cantidades de plomo que pueden estar prnsentes en los productos farmacuticos
ha dado como resultado la utilizacin de dos mtodos. El que se presenta en este captulo se basa en la extraccin de plomo
mediante soluciones de ditizona.
Seleccionar todos los reactivos para esta prueba de forma que tengan un contenido de plomo lo ms bajo posible y almace-
nar todas las soluciones reactivo en recipientes de vidrio de borosilicato. Enjuagar minuciosamente todos los materiales de vi-
drio con cido ntrico diluido (1 en 2) tibio y luego con agua.

REACTIVOS ESPECIALES

Solucin de cianuro y amonaco: Disolver 2 g de cianuro de potasio en 15 ml de hidrxido de amonio y diluir con agua
hasta 100 ml.
Solucin de citrato de amonio: Disolver 40 g de cido ctrico en 90 ml de agua. Agregar 2 3 gotas de rojo fenol SR, luego
agregar cuidadosamente hidrxido de amonio hasta que la solucin adquiera un color rojizo. Eliminar todo el plomo que pue-
da estar presente extrayendo la solucin con porciones de 20 ml de Solucin de extraccin de ditizona (ver a continuacin),
hasta que la solucin de ditizona retenga su color verde anaranjado.
Solucin de plomo estndar diluida: Diluir un volumen medido con exactitud de solucin estndar de plomo SR (que con-
tenga 1O g de plomo por ml) con 9 volmenes de cido ntrico diluido (1 en 100) para obtener una solucin que contenga
1 g de plomo por ml.
Solucin de extraccin de ditizona: Disolver 30 mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo y agregar 5 ml de alcohol. Al-
macenar la solucin en un refrigerador.
Antes de usar, agitar un volumen adecuado de la solucin de extraccin de ditizona con aproximadamente la mitad de su
volumen de cido ntrico diluido (1 en 100), desechando el cido ntrico.
Solucin de clorhidrato de hidroxilamina: Disolver 20 g de clorhidrato de hidroxilamina en suficiente agua para obtener
aproximadamente 65 ml. Transferir a un separador, agregar 5 gotas de azul de timol SR, luego agregar hidrxido de amonio
hasta que la solucin adquiera un color amarillo. Agregar 1O ml de solucin de dietilditiocarbamato de sodio (1 en 25), mez-
clar y dejar en reposo durante 5 minutos. Extraer esta solucin con porciones sucesivas de 1O a 15 ml de cloroformo hasta que
una porcin de 5 ml del extracto clorofrmico no presente color amarillo al agitarla con sulfato cprico SR. Agregar cido
clorhdrico 3 N hasta que la solucin adquiera un color rosado (si fuera necesario, agregar 1 2 gotas adicionales de azul de
timol SR), luego diluir con agua hasta 100 ml.
Solucin de cianuro de potasio: Disolver 50 g de cianuro de potasio en suficiente agua para obtener 100 ml. Eliminar el
plomo de esta solucin extrayendo con porciones sucesivas de Solucin de extraccin de ditizona, segn se describe en Solucin
de citrato de amonio, luego extraer cualquier ditizona remanente en la solucin de cianuro agitando con cloroformo. Finalmen-
te diluir la solucin de cianuro con suficiente agua para que cada porcin de 100 ml contenga 1Og de cianuro de potasio.
Solucin de ditizona estndar: Disolver 1O mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo. Mantener la solucin en un frasco
exento de plomo con tapn de vidrio, envuelto adecuadamente para protegerlo de la luz, y almacenar en un refrigerador.

PROCEDIMIENTO

Preparacin de prueba o Solucin muestra

[NOTA-Si en la siguiente preparacin, la sustancia en anlisis reacciona con demasiada rapidez y empieza a carbonizarse
con 5 ml de cido sulfrico antes del calentamiento, usar en su lugar 1O ml de cido sulfrico diluido (1 en 2) enfriado y
agregar unas pocas gotas de perxido de hidrgeno antes del calentamiento.]
Cuando la monografa no especifique la preparacin de una solucin, preparar una Preparacin de prueba o Solucin muestra,
segn se indica a continuacin. [Precaucin-Tomar precauciones de seguridad en este procedimiento, ya que algunas sustancias
pueden reaccionar con violencia explosiva al digerirlas con perxido de hidrgeno.]
Transferir 1,0 g de la sustancia en anlisis a un matraz adecuado, agregar 5 ml de cido sulfrico y algunas perlas de vidrio, y
digerir sobre una placa de calentamiento en una campana hasta que comience la carbonizacin. Se pueden usar otros medios
de calentamiento adecuados. (Agregar cido sulfrico adicional, si fuera necesario, para humedecer la sustancia completamen-
te, pero no agregar ms de un total de 1O ml.) Agregar, gota a gota y con cuidado, perxido de hidrgeno al 30%, permi-
298 (251) Plomo / Pruebas Qumicas USP 39

tiendo que la reaccin disminuya y calentar despus de agregar cada gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente, mez-
clar con cuidado para evitar una reaccin rpida y suspender el calentamiento si se produce espuma en exceso. Agitar por
rotacin suave la solucin en el matraz para evitar que la sustancia sin reaccionar se aglutine a las paredes del matraz. [NOTA-
Agregar perxido cuando la mezcla se torne de color marrn o se oscurezca.] Continuar la digestin hasta que la sustancia se
destruya por completo, se desprendan humos de trixido de azufre abundantes y la solucin se torne incolora. Enfriar y agre-
gar cuidadosamente 1O ml de agua. Evaporar hasta que se genere trixido de azufre nuevamente y enfriar. Repetir este proce-
dimiento con otros 1O ml de agua para eliminar cualquier traza de perxido de hidrgeno. Diluir cuidadosamente con 1O ml
de agua y enfriar.
Anlisis: Transferir a un separador la Preparacin de prueba o la Solucin muestra, enjuagando con 1O ml de agua o con el
volumen de la muestra preparada especificado en la monografa y, a menos que se indique algo diferente en la monografa,
agregar 6 ml de Solucin de citrato de amonio y 2 ml de Solucin de clorhidrato de hidroxilamina. (Para la determinacin de
plomo en sales de hierro, usar 1O ml de Solucin de citrato de amonio.) Agregar 2 gotas de rojo fenal SR y alcalinizar la solucin
(slo hasta color rojo) agregando hidrxido de amonio. Enfriar la solucin, si fuera necesario, y agregar 2 ml de Solucin de
cianuro de potasio. Extraer de inmediato la solucin con porciones de 5 ml de Solucin de extraccin de ditizona, vaciando cada
extracto en otro separador, hasta que la solucin de ditizona retenga su color verde. Agitar las soluciones de ditizona combina-
das durante 30 segundos con 20 ml de cido ntrico diluido (1 en 100) y desechar la capa clorofrmica. Agregar 5,0 ml de
Solucin de ditizona estndar y 4 ml de Solucin de cianuro y amonaco a la solucin cida y agitar durante 30 segundos.
Criterios de aceptacin: El color de la capa clorofrmica no tiene un tono violeta ms intenso que el de un control prepara-
do con un volumen de Solucin de plomo estndar diluida, equivalente a la cantidad de plomo permitida en la muestra en anli-
sis, y usando las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma manera que en la prueba con la muestra.

(261) MERCURIO

Mtodo 1

NOTA-El ditizonato mercrico es fotosensible. Realizar esta prueba en un lugar con luz tenue.
Reactivos-
SOLUCIN MADRE DE DITIZONA-Disolver 40 mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo.
SOLUCIN VOLUMTRICA DE DITIZONA-Diluir 30,0 ml de Solucin Madre de Ditizona con cloroformo hasta 100,0 ml. Esta solu-
cin contiene aproximadamente 12 mg de ditizona por litro.
SOLUCIN MADRE DE MERCURIO-Transferir 135,4 mg de cloruro mercrico a un matraz volumtrico de 100 ml y diluir a volu-
men con cido sulfrico 1 N. Esta solucin contiene la cantidad equivalente a 100 mg de Hg en 100 ml.
SOLUCIN DE MERCURIO PARA ESTANDARIZAR LA SOLUCIN VOLUMTRICA DE DITIZONA-Transferir 2,0 ml de Solucin Madre de Mer-
curio a un matraz volumtrico de 100 ml y diluir a volumen con cido sulfrico 1 N. Cada ml de esta solucin contiene el
equivalente a 20 g de Hg.
Las siguientes soluciones son necesarias en la prueba de lmite para mercurio que se especifica en las monografas de Fuma-
rato Ferroso, Sulfato Ferroso y Sulfato Ferroso Seco.
SOLUCIN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA-Preparar segn se indica en la prueba para Plomo (251 ).
SOLUCIN ESTNDAR DE MERCURIO-En el da de uso, diluir cuantitativamente 1,0 ml de la Solucin Madre de Mercurio con
cido sulfrico 1 N hasta 1000 ml. Cada ml de la solucin resultante contiene el equivalente a 1 g de mercurio.
SOLUCIN DE EXTRACCIN CON DITIZONA-Preparar segn se indica en la prueba para Plomo (251 ).
SOLUCIN DE EXTRACCIN CON DITIZONA DILUIDA-Inmediatamente antes de usar, diluir 5 ml de la Solucin de Extraccin con
Ditizona con 25 ml de cloroformo.
Estandarizacin de la Solucin Volumtrica de Ditizona-Transferir 1,0 ml de la Solucin de Mercurio para Estandarizar la
Solucin Volumtrica de Ditizona a un separador de 250 ml y agregar 100 ml de cido sulfrico 1 N, 90 ml de agua, 1 ml de
cido actico glacial y 1O ml de solucin de clorhidrato de hidroxilamina (1 en 5). Valorar la solucin con la Solucin Volumtri-
ca de Ditizona transferida desde una microbureta de 1O ml, agitando la mezcla 20 veces despus de cada adicin y dejando
que la capa clorofrmica se separe, y luego desechar la capa clorofrmica. Continuar hasta que una ltima adicin de la Solu-
cin Volumtrica de Ditizona haga que la solucin tome una coloracin verde despus de agitarla. Calcular la cantidad, en g,
de Hg equivalente a cada ml de la Solucin Volumtrica de Ditizona, por la frmula:

20/V
en donde V es el volumen, en ml, de la Solucin Volumtrica de Ditizona agregada.
Preparacin de Prueba-Transferir aproximadamente 2 g de la sustancia en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz
Erlenmeyer de 250 ml con tapn de vidrio, agregar 20 ml de una mezcla de volmenes iguales de cido ntrico y cido sulf-
rico, acoplar un condensador adecuado, someter la mezcla a reflujo durante 1 hora, enfriar, diluir cuidadosamente con agua y
USP 39 Pruebas Qumicas/ (261) Mercurio 299

calentar a ebullicin hasta que no se perciban vapores de cido nitroso. Enfriar la solucin, diluir cuidadosamente con agua,
transferir a un matraz volumtrico de 200 ml, diluir a volumen con agua, mezclar y filtrar.
Procedimiento-Transferir 50,0 ml de la Preparacin de Prueba a un separador de 250 ml y extraer con pequeas porcio-
nes sucesivas de cloroformo hasta que el ltimo extracto clorofrmico permanezca incoloro. Desechar el extracto clorofrmico
y agregar 50 ml de cido sulfrico 1 N, 90 ml de agua, 1 ml de cido actico glacial y 1O ml de solucin de clorhidrato de
hidroxilamina (1 en 5) a la Preparacin de Prueba extrada. Proceder segn se indica en Estandarizacin de la Solucin Volumtri-
ca de Ditizona, comenzando donde dice "Valorar la solucin". Calcular la cantidad de mercurio.

Mtodo lla y Mtodo llb

Instrumento de Deteccin de Mercurio-Usar cualquier espectrofotmetro de absorcin atmica adecuado equipado con
un registrador de respuesta rpida y capaz de medir la radiacin absorbida por los vapores de mercurio en la lnea de resonan-
cia del mercurio a 253,6 nm. [NOTA-Lavar todo el material de vidrio asociado a la prueba con cido ntrico y enjuagar bien
con agua antes de usar.]
Aparato de Aireacin-El aparato (ver el diagrama adjunto) consiste en un caudalmetro capaz de medir velocidades de
flujo entre 500 y 1000 ml por minuto, conectado a travs de una llave de paso de tres vas equipada con un tapn de tefln a
un vaso de aireacin (frasco de lavado de gases de 250 ml), seguido de una trampa, un tubo de secado relleno con perclorato
de magnesio, una celda de flujo de 1O cm x 25 mm con ventanas de cuarzo y, por ltimo, un orificio de ventilacin a una
campana de extraccin.

Llave de paso de tres vas

con tapn de tefln
Desvo

Aire o
nitrgeno
Tubo de secado
relleno con
Caudallmetro Mg(CI04'2
flujo 5oo a 1000 Trampa
mi. por minuto 100mL Orificio de

Vaso de Aireacin
(Frasco lavadora de gases) Celda de 10 cm.
con ventanas de cuano

Las conexiones son de vidrio o de PVC

Aparato de Aireacin de Mercurio

Reactivos-
Solucin de Permanganato de Potasio-Disolver 5 g de permanganato de potasio en 100 ml de agua.
Solucin de Clorhidrato de Hidroxilamina-Disolver 1Og de clorhidrato de hidroxilamina en 100 ml de agua.
Solucin de Cloruro Estannoso-Disolver 1Og de SnCl 2 2H 20 en 20 ml de cido clorhdrico tibio y agregar 80 ml de agua.
Preparar soluciones nuevas cada semana.
Solucin Estndar de Mercurio-Preparar a partir de la Solucin Madre de Mercurio segn se indica en Mtodo l. Cada ml de la
Solucin Estndar de Mercurio contiene el equivalente a 1 g de mercurio.
Preparacin de Prueba-A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, usar la cantidad, en g, de la
sustancia de prueba calculada por la frmula:
2,0/L
en donde L es el lmite de mercurio, en ppm.

Mtodo lla

Preparacin Estndar-Pipetear 2,0 ml de la Solucin Estndar de Mercurio, transferir a un vaso de precipitados de 100 ml
y agregar 35 ml de agua, 3 ml de cido sulfrico y 1 ml de solucin de permanganato de potasio. Cubrir el vaso de precipi-
tados con un vidrio de reloj, calentar a ebullicin durante unos segundos y enfriar.
Preparacin de Prueba-Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un vaso de precipitados de 100 ml y
agregar 35 ml de agua. Mezclar y entibiar para disolver, si fuera necesario. Agregar 2 gotas de fenolftalena SR y, segn sea
necesario, neutralizar lentamente revolviendo constantemente, usando hidrxido de sodio 1 N o cido sulfrico 1 N. Agregar 3
ml de cido sulfrico y 1 ml de la Solucin de Permanganato de Potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj,
calentar a ebullicin durante unos segundos y enfriar.
 300 (261) Mercurio/ Pruebas Qumicas USP 39

Procedimiento-Ensamblar el Aparato de Aireacin segn se muestra en el diagrama adjunto, con el vaso de aireacin y la
trampa vacos y la llave de paso en la posicin de desvo. Conectar el aparato a una celda de absorcin y ajustar la velocidad
de flujo del aire o del nitrgeno de modo que, en el procedimiento siguiente, se obtengan una.absorcin y una reproducibili-
dad mximas sin la formacin excesiva de espuma en la solucin de prueba. Obtener una lectura inicial estable a 253,6 nm
segn las instrucciones de funcionamiento del fabricante del instrumento.
Tratar la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba de modo similar, de la siguiente manera. Eliminar el exceso de per-
manganato agregando Solucin de Clorhidrato de Hidroxilamina, gota a gota, hasta que la solucin quede incolora. Lavar inme-
diatamente con agua la solucin en el vaso de aireacin y diluir con agua hasta 100 ml. Agregar 2 ml de la Solucin de Cloruro
Estannoso y reconectar inmediatamente el vaso de aireacin al aparato de aireacin. Girar la llave de paso de la posicin de
desvo a la posicin de aireacin y continuar la aireacin hasta que se haya pasado el pico de absorcin y la pluma registradora
vuelva al valor inicial. Desconectar el vaso de aireacin del aparato y lavar con agua despus de cada uso. Despus de hacer
correcciones por cualquier blanco de reactivo, toda absorbancia producida por la Preparacin de Prueba no excede la produci-
da por la Preparacin Estndar.

Mtodo llb

Precaucin-Algunas sustancias pueden reaccionar con violencia explosiva cuando se digieren con perxido de hidrgeno. Tomar
precauciones de seguridad en todo momento.
Preparacin Estndar-Pipetear 2,0 ml de la Solucin Estndar de Mercurio y transferir a un matraz Erlenmeyer de 125 ml,
agregar 3 ml de cido ntrico y 3 ml de cido sulfrico, mezclar y agregar una cantidad de perxido de hidrgeno al 30 por
ciento igual a la cantidad total usada para preparar la Preparacin de Prueba. Acoplar un condensador enfriado por agua ade-
cuado con una junta ahusada estndar que se ajuste al matraz y someter a reflujo la mezcla en una campana de extraccin
durante 1 hora. Cortar el agua que circula a travs del condensador y calentar hasta que aparezcan humos blancos en el ma-
traz. Enfriar y agregar cuidadosamente 1O ml de agua a travs del condensador mezclando, por rotacin suave. Volver a ca-
lentar hasta que aparezcan humos blancos, enfriar y agregar otros 15 ml de agua. Retirar el condensador y enjuagar las pare-
des del matraz para obtener un volumen de 35 mL. Agregar 1 ml de la Solucin de Permanganato de Potasio, calentar a ebulli-
cin durante unos segundos y enfriar.
Preparacin de Prueba-Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un matraz Erlenmeyer de 125 ml.
Agregar 5 ml de cido ntrico, 5 ml de cido sulfrico y algunas perlas de vidrio. Acoplar un condensador refrigerado por
agua adecuado con una junta ahusada estndar que se ajuste al matraz y digerir en una campana de extraccin, preferente-
mente sobre una placa de calentamiento, y a una temperatura que no exceda los 120 hasta que comience la carbonizacin.
(Si se necesita cido sulfrico adicional para humedecer la muestra por completo, agregarlo cuidadosamente a travs del con-
densador, pero sin permitir que el volumen total agregado exceda de 1O ml.) Despus de que el cido haya descompuesto la
sustancia de prueba, agregar cuidadosamente, gota a gota a travs del condensador, perxido de hidrgeno al 30 por ciento,
permitir que la reaccin disminuya su intensidad, calentar nuevamente entre las gotas (agregar las primeras gotas muy lenta-
mente y mezclando bien para evitar una reaccin rpida; detener el calentamiento si la espuma se torna excesiva). Cuando la
reaccin haya disminuido, calentar cuidadosamente y girar el matraz ocasionalmente para evitar que la muestra se aglutine
sobre el vidrio expuesto a la unidad de calentamiento. Mantener las condiciones de oxidacin en todo momento durante la
digestin agregando pequeas cantidades de solucin de perxido de hidrgeno cuando la mezcla se vuelva de color marrn
o se oscurezca. Continuar la digestin hasta que la materia orgnica se destruya y luego calentar a reflujo la mezcla durante 1
hora. Cortar el agua que circula a travs del condensador y calentar hasta que se desprendan abundantes humos de trixido
de azufre y la solucin se vuelva incolora o presente solamente un color pajizo claro. Enfriar y agregar cuidadosamente 1O ml
de agua a travs del condensador, mezclando por rotacin suave. Calentar nuevamente hasta que aparezcan humos blancos.
Enfriar y agregar cuidadosamente 15 ml de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz con algunos ml de
agua para obtener un volumen de 35 ml. Agregar 1 ml de la Solucin de Permanganato de Potasio, calentar a ebullicin duran-
te unos segundos y enfriar.
Procedimiento-Proceder segn se indica en el Procedimiento en Mtodo /la.

(267) POROSIMETRA POR INTRUSIN DE MERCURIO

En general, los diversos tipos de poros se pueden representar como aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo sli-
do o como espacios (es decir, intersticios o espacios vacos) entre partculas slidas en un lecho, compacto o agregado. Porosi-
dad es un trmino comnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material slido y se define con mayor precisin
como la relacin entre el volumen de poros y espacios vacos accesibles y el volumen total ocupado por una cantidad dada del
slido. Adems de los poros accesibles, un slido puede comprender poros cerrados, que estn aislados de la superficie exter-
na y a los cuales no son capaces de penetrar los fluidos. Este captulo general no abarca la caracterizacin de poros cerrados, es
decir, cavidades sin acceso a una superficie externa.
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (267) Porosimetra por Intrusin de Mercurio 301
~.

Los materiales porosos pueden presentarse en forma de 'polvos finos o gruesos, compactos, extrudidos, lminas o monolitos,
y su caracterizacin a menudo implica la determinacin del volumen total de los poros o porosidad, as como la distribucin
del tamao de los poros.
Se ha establecido debidamente que el desempeo de un slido poroso (p.ej., su resistencia, reactividad, permeabilidad o
poder adsorbente) depende de la estructura de sus poros. Se ha desarrollado un gran nmero de mtodos distintos para carac-
terizar la estructura de los poros. En vista de la complejidad de la mayora de los slidos porosos, no resulta extrao obtener
resultados que no siempre concuerdan y que no exista una tcnica definitiva que pueda garantizar una imagen completa de la
estructura de los poros. La seleccin del mtodo ms adecuado depende de la aplicacin del slido poroso, de su naturaleza
fsica y qumica, y del rango de tamaos de poro.
Este captulo ofrece pautas para medir la porosidad y la distribucin del tamao de los poros mediante porosimetra de mer-
curio, la cual es una prueba comparativa, generalmente destructiva, en la que el volumen de mercurio que penetra en un poro
o espacio vaco se determina como una funcin de la presin hidrosttica aplicada, que se puede relacionar con el dimetro
del poro. Asimismo, se puede inferir otra informacin a partir de las curvas de volumen-presin, por ejemplo, la forma de los
poros y sus interconexiones, el rea de las superficies interna y externa, la granulometra del polvo y la densidad aparente y
despus del asentamiento; sin embargo, el alcance del presente captulo no abarca dichos aspectos de la tcnica.
Las consideraciones prcticas actualmente limitan la presin absoluta mxima aplicada que pueden alcanzar algunos equi-
pos de aproximadamente 400 MPa, que corresponde a un dimetro mnimo de poro equivalente a aproximadamente 0,003
m. El dimetro mximo estar limitado por el tamao de la muestra debido a la diferencia del frente hidrosttico del mercu-
rio entre los extremos superior e inferior de la muestra. Para la mayora de los propsitos, se puede considerar que este lmite
es de aproximadamente 400 m.
Resulta posible determinar la porosidad interparticular e intraparticular, pero el mtodo no distingue entre estas porosidades
cuando coexisten.
El mtodo es apropiado para el estudio de la mayora de los materiales porosos. Sin embargo, puede no ser apropiado para
materiales que se amalgaman con mercurio, como ciertos metales, o puede ser necesaria una pasivacin preliminar. Asimismo,
la presin puede deformar o compactar otros materiales. En algunos casos, se pueden aplicar correcciones a la compresibilidad
de la muestra y an as obtener datos comparativos tiles.
La porosimetra de mercurio debe considerarse una tcnica comparativa, debido a que, para la mayora de los medios poro-
sos, no se encuentra disponible una teora que permita un clculo absoluto de resultados de la distribucin del tamao de los
poros. Por lo tanto, esta tcnica se recomienda principalmente para estudios de desarrollo.
El mercurio es txico. Se deben tomar precauciones adecuadas para salvaguardar la salud del operador y de aqullos que
operen en el rea. El material de desecho se debe eliminar de una manera adecuada, de conformidad con los reglamentos
locales.

PRINCIPIO

La tcnica se basa en la medicin del volumen de mercurio resultante de la intrusin en un slido poroso como una funcin
de la presin aplicada. La medicin incluye nicamente aquellos poros en los que el mercurio puede penetrar a la presin apli-
cada.
Un lquido no humectante penetra en un sistema poroso slo a presin. La presin aplicada es inversamente proporcional al
ancho interno del poro. En poros cilndricos, la correlacin entre el dimetro del poro y la presin se obtiene mediante la ecua-
cin de Washburn:
4. O"
dp =---cose (1)
p
p presin aplicada, en pascales
dP dimetro del poro, en metros
cr tensin superficial del mercurio, en newtons por metro
8 ngulo de contacto entre el mercurio y la muestra, en grados

APARATO

El portamuestras, conocido como penetrmetro o dilatmetro, tiene un tubo capilar calibrado a travs del cual se puede
evacuar la muestra y por el que puede entrar el mercurio. El tubo capilar est unido a un tubo ms ancho en el que se coloca
la muestra. El cambio en el volumen de mercurio resultante de la intrusin por lo general se mide por el cambio de la capaci-
tancia entre la columna de mercurio en el tubo capilar y una funda metlica que rodea la parte externa del tubo capilar. Cuan-
do se requieren mediciones precisas, el volumen interno del tubo capilar debe ser entre 20% y 90% del volumen previsto del
poro y de los espacios vacos de la muestra. Debido a que los distintos materiales presentan un amplio rango de porosidad,
pueden ser necesarios varios penetrmetros equipados con tubos capilares con diferentes dimetros y volmenes de muestra.
La Figura 7 presenta una configuracin tpica para un instrumento de porosimetra de mercurio. El porosmetro puede tener
302 (267) Porosimetra por Intrusin de Mercurio / Pruebas Qumicas USP 39

diferentes puertos para la operacin a alta y baja presin; tambin es posible llevar a cabo la medicin a baja presin en una
unidad distinta.
El intervalo de presin es, por lo general, de 4 kPa a 300 kPa para la operacin a baja presin, y superior a 300 kPa para la
operacin a alta presin, lo cual depende particularmente del diseo del aparato y del uso previsto.

Q 1
1
1
1
1
1
1
1
Mercurio 1
1
Muestra 1

1. Reservorio para fluido hidrulico

de baja presin
2. Bomba hidrulica
3. Multiplicador de presin
4. Transductor de presin
3
-8
5. Reservorio para fluido hidrulico
de alta presin
6. Bomba de vaco con manmetro
7. Reseivorio para mercurio

Figura 1. Ejemplo de la configuracin de un instrumento para porosimetra de mercurio.

MTODO

Preparacin de la Muestra

Tratar la muestra previamente mediante calentamiento y/o evacuacin o con un flujo de gas inerte para eliminar el material
adsorbido que pudiera ocultar su porosidad accesible. La pasivacin de la superficie de slidos humectables o amalgamables se
puede lograr produciendo una capa fina de xido o recubriendo con estearato. Pesar la muestra del slido previamente trata-
do y transferir al penetrmetro. Luego, desgasificar el sistema de poros de la muestra al vaco hasta una presin residual mxi-
ma de 7 Pa.

Llenado del Penetrmetro con Mercurio

Usar mercurio de calidad analtica. Cubrir la muestra con mercurio al vaco. El vaco es necesario para asegurar la transferen-
cia del mercurio desde el reservorio al penetrmetro. En un penetrmetro lleno, la presin de llenado comprende la presin
aplicada ms la contribucin de presin generada por el frente de mercurio que entra en contacto con la muestra. La presin
de llenado tpica es aproximadamente 4 kPa. Se puede minimizar la presin hidrosttica del mercurio sobre la muestra llenan-
do el penetrmetro en las posiciones horizontales.

Medicin a Baja Presin

Aplicar aire o nitrgeno de manera controlada para incrementar la presin en las etapas correspondientes a los tamaos de
los poros de inters o de manera continua a una velocidad baja. Registrar el cambio concomitante en la longitud de la colum-
na de mercurio en el tubo capilar. Una vez alcanzada la presin mxima requerida, reducirla hasta presin ambiental.

Medicin a Alta Presin

Despus de medir en condiciones de baja presin, transferir el penetrmetro cargado con mercurio al puerto o unidad de
alta presin del instrumento y cubrir con fluido hidrulico. El mercurio penetra en el sistema de poros por medio del fluido
hidrulico. Incrementar la presin en el sistema hasta la presin mxima alcanzada en la medicin a baja presin y registrar el
volumen de intrusin a esta presin, debido a que los volmenes de intrusin subsiguientes se calculan a partir de este volu-
men inicial. Incrementar la presin en las etapas correspondientes a los tamaos de poro de inters o de manera continua a
USP 39 Pruebas Qumicas/ (267) Porosimetra por Intrusin de Mercurio 303

una velocidad baja. La cada en la columna de mercurio se mide hasta la presin mxima requerida. En caso necesario, se pue-
de reducir la presin por etapas o de manera continua a una velocidad baja para determinar la curva de extrusin del mercu-
rio. Corregir para considerar los cambios en el volumen del mercurio, el penetrmetro y dems componentes del sistema de-
tector de volumen a presin elevada. El grado de las correcciones requeridas se puede determinar a travs de mediciones blan-
co aplicando las mismas condiciones. La Figura 2 presenta una curva de volumen-presin determinada experimentalmente.
300

JtE 240
.
o
"O 180
.!!!
"
E
o 120
"
lll
e:
"
E 60
:g"
o
10"' 10' 10'
Presin (MPa)

Figura 2. Curva de volumen-presin como grfica semilogartmica.

INFORME DE LOS RESULTADOS

Convertir las lecturas de la presin a dimetro de los poros usando la ecuacin de Washburn u otro modelo.
La tensin superficial de mercurio, cr, no slo depende de la temperatura y del material, sino tambin-en el caso de las
reas superficiales con curvas marcadas-del radio de la curvatura. En general, los valores entre 0,41 N m1 y 0,52 N m1 se
miden a temperatura ambiente. Si no se conoce el valor, se puede usar cr = 0,48 N m- 1
El ngulo de contacto del mercurio, e, es ms de 90 en la mayora de los casos y se puede determinar con un instrumento
para medir el ngulo de contacto. Si no se conoce el valor e, se puede usar 130. Informar los valores de ngulo de contacto,
tensin superficial, as como el modelo usado para el clculo. La visualizacin de los datos se puede realizar mediante varios
tipos de grficas. Frecuentemente, se visualiza la distribucin del tamao de poros representando el dimetro de poro en las
abscisas y el volumen especfico dependiente de la intrusin en las ordenadas. En este caso, resulta apropiado representar las
abscisas en escala logartmica (ver la Figura 3). Los espacios entre las partculas de la muestra slida se incluyen como poros en
el clculo. Si los poros difieren en tamao de los espacios vacos, stos ltimos se pueden separar seleccionando el intervalo de
tamao de poro pertinente.
No se pueden usar las curvas de extrusin para calcular la distribucin del tamao de los poros (para histresis, ver la Figura
2), debido a que una parte del mercurio resultante de la intrusin siempre permanece en el sistema de poros. La relacin de
retencin puede ser de utilidad para la caracterizacin cualitativa de los poros a los que nicamente se puede acceder a travs
de aberturas estrechas ("poros en forma de tintero").
Los valores caractersticos ms comunes, como el volumen especfico total resultante de la intrusin, la media y la mediana
del dimetro de poro se calculan a partir de la distribucin del tamao de los poros. Asimismo, la documentacin del procedi-
miento debe comprender la muestra, su preparacin, las condiciones de evacuacin y el instrumento utilizado.
~~...-~~~~~~~~~~~ ..... ~

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~oL..~.-...i:!llCIIllaIIlLIIIICIIIla:Q]lillJ111Jtb:eJ
10' 10'
Dimetro de poro (nm)

Figura 3. Distribucin del volumen de los poros como grfica semilogartmica.

CONTROL DEL DESEMPEO DEL INSTRUMENTO

Puesto que la tcnica de porosimetra de mercurio es considerada una prueba comparativa, este captulo no proporciona
detalles sobre la misma. Sin embargo, se recomienda analizar un material de comparacin estable de manera rutinaria para
monitorear la calibracin y el desempeo del instrumento.
304 (268) Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de Nitrgeno / Pruebas Qumicas USP 39

(268) POROSIDAD MEDIANTE ADSORCIN-DESORCIN DE

NITRGENO

INTRODUCCIN
La porosidad es un trmino comnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material slido y se define, con ma-
yor precisin, como la relacin entre el volumen de poros y espacios vacos accesibles y el volumen total ocupado por una
cantidad dada del slido. Los poros cerrados o inaccesibles que estn aislados de la superficie externa se excluyen de esta defi-
nicin de volumen de poro. Los poros (o espacios vacos) pueden incluir aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo
slido o espacios entre partculas slidas en un compacto o agregado. Los poros se presentan en una variedad de materiales
slidos ms all de los compactos y los agregados, tales como polvos y tabletas, y su caracterizacin a menudo implica la de-
terminacin del volumen de poro total o porosidad, as como la distribucin del tamao de poro. Por lo general, la clasifica-
cin de los poros se hace por tamao en los siguientes grupos:
Microporos-menores de 2 nm
Mesoporos-2 a 50 nm
Macroporos-mayores de 50 nm
El mtodo del presente captulo, Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de Nitrgeno (268), es complementario al del cap-
tulo general Porosimetra por Intrusin de Mercurio (267). La porosimetra por mercurio puede, en principio (tericamente),
usarse con dimetros de poro de 3 nm a 400 m, aunque se aplica mayormente para el intervalo de 100 nm a 200 m. La
adsorcin-desorcin de nitrgeno se puede usar para caracterizar poros con tamaos menores de aproximadamente 300 nm,
pero es ms apropiado para el anlisis de mesoporos y en el intervalo inferior de macroporos de 2 a 100 nm.

APARATO
Las mediciones generalmente se llevan a cabo usando el procedimiento volumtrico esttico, aunque tambin se pueden
emplear mtodos de flujo dinmico. Los usuarios de equipos comercialmente disponibles deben referirse a los documentos y
manuales del fabricante para obtener una descripcin de su aparato en particular. Por ejemplo, un aparato volumtrico estti-
co debe proveer lo siguiente: sistema de vaco para una presin de menos de 1O Pa, suministro de volmenes conocidos de
nitrgeno y helio de alta pureza, medicin exacta de presin y temperatura, y un medio para enfriar la muestra a la tempera-
tura del nitrgeno lquido.

PRINCIPIO DE MEDICIN
La adsorcin de un gas inerte sobre las superficies slidas a bajas temperaturas es un fenmeno bien conocido y es el funda-
mento para la medicin del rea superficial de los slidos (ver el captulo general rea Superficial Especfica (846)). A medida
que el gas se adsorbe sobre una superficie, se puede condensar en el interior de los poros accesibles. El volumen total de poro
y la distribucin de tamao de poro se pueden derivar de la isoterma de adsorcin de gas, la cual es una medicin de la canti-
dad adsorbida como una funcin de la presin parcial del adsorbato. Las isotermas de adsorcin se dividen en seis categoras
generales, dependiendo de la energtica relativa de la adsorcin y la presencia de poros. La Figura 7 representa las seis catego-
ras generales de isotermas de adsorcin.
Los microporos (poros con tamaos menores de 2 nm) con frecuencia generan isotermas tipo l. Los mesoporos y macropo-
ros normalmente producen isotermas tipo IV, pero la histresis puede ser difcil de observar en poros con tamaos mayores a
aproximadamente 100 nm, lo que produce una isoterma tipo 11. Aunque es posible derivar cierta informacin, tal como la po-
rosidad total, para materiales microporosos, la determinacin de las distribuciones del tamao de poro en dicho intervalo de
tamao est fuera del alcance de este captulo.
El adsorbato preferido es nitrgeno, mientras que la isoterma se determina a la temperatura del nitrgeno lquido (77,4 K).
Se pueden usar otros adsorbatos para propsitos especiales, aunque no se tratan en este captulo.
USP 39 Pruebas Qumicas / (268) Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de Nitrgeno 305

lro
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111

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ro
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ro
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V
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Presin relativa ---~

Figura 1. Tipos de Isotermas. [Reproducido con autorizacin y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et al. Repor-
ting physisorption far gas/salid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (recommenda-
tions 1984)(1nforme de fisisorcin para sistemas de gas/slido con referencia especial a la determinacin del rea superficial y
la porosidad. (Recomendaciones 1984) Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 2.]

PROCEDIMIENTO

Preparacin de la Muestra

Antes del anlisis, los analistas deben desgasificar la muestra para eliminar gases y vapores que se hayan adsorbido fsica-
mente sobre la superficie. Resulta necesario demostrar las condiciones de desgasificacin para obtener una adsorcin-desor-
cin reproducible, un peso constante de la muestra y que no se produzcan cambios fsicos o qumicos detectables en la mues-
tra. La desgasificacin de un gran nmero de sustancias a menudo se consigue mediante vaco, purgando la muestra en una
corriente fluida de gas seco no reactivo o aplicando un procedimiento de adsorcin-desorcin cclica. Si resultara apropiado,
los analistas pueden aplicar temperaturas elevadas para aumentar la velocidad a la que los contaminantes abandonan la super-
ficie. Los analistas deben ser precavidos para evitar que se afecte la naturaleza de la superficie y la integridad de la muestra
cuando se desgasifica a temperaturas elevadas. Si se emplea calentamiento, la temperatura y el tiempo de desgasificacin re-
comendados deben ser los mnimos requeridos para lograr una medicin reproducible de la isoterma de adsorcin-desorcin.
Los analistas deben determinar la masa de la muestra despus de desgasificar o como alternativa, deben determinar la masa
despus de la medicin de adsorcin-desorcin. El rea superficial total de la muestra debe ser mayor que 1 m 2 y de preferen-
cia mayor que 5 mi.

Medicin de las Isotermas

Los detalles especficos del proceso de medicin dependen del procedimiento usado. Los analistas deben seguir las instruc-
ciones del fabricante para el instrumento usado en particular. La siguiente descripcin puede aplicarse de manera general:
- Los analistas deben determinar la presin de vapor saturado del adsorbato, p0 Es preferible determinar p0 de manera ex-
perimental al momento de la medicin, aunque los analistas pueden usar un valor calculado.
- Los analistas deben determinar la isoterma de sordn de nitrgeno y deben medir el volumen adsorbido, V0 , a la presin
relativa ms baja deseada (p/p 0, el cociente entre la presin de adsorbato medida y la presin de su vapor saturado).
306 (268) Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de Nitrgeno / Pruebas Qumicas USP 39

- Los analistas repiten la medicin de V a valores de presin relativa sucesivamente mayores hasta la mxima presin relati-
va deseada (por lo general, 0,99). Posteriormente, los analistas reducen la presin relativa de manera sucesiva para deter-
minar las cantidades sorbidas en la porcin de desorcin de la isoterma. Los analistas deben medir al menos 20 puntos en
los segmentos de adsorcin y desorcin, abarcando un intervalo de presin relativa (p/p 0) de aproximadamente 0,05-
0,99. Los valores p/p 0 se pueden distribuir para lograr la mejor resolucin de la distribucin del tamao de poro. Cuando
se est usando nicamente el segmento de desorcin para calcular la distribucin del tamao de poro, se pueden usar
menos puntos en el segmento de adsorcin.

ANLISIS DE DATOS

Anlisis de la Isoterma

La isoterma se presenta como una grfica de la cantidad de nitrgeno adsorbido (en volumen, V, o moles, n) en funcin de
p/p0 Los datos de la isoterma tambin pueden presentarse en formato de tabla. Los tipos de isoterma e histresis se determi-
nan a partir de la grfica, comparndola con los ejemplos de las Figuras 7 y 2. Una isoterma tipo 1 es comn para materiales
microporosos. Una isoterma tipo IV por lo general se presenta en materiales que contienen mesoporos o macroporos peque-
os.

H1 H2

ro
"O
15
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"O
ro
"O
ro
"O
:;::;
e:
ro

Presin relativa---~

Figura 2. Tipos de Ciclos de Histresis. [Reproducido con autorizacin y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et
al. Reporting physisorption for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (re-
commendations 1984)(1nforme de fisisorcin para sistemas de gas/slido con referencia especial a la determinacin del rea
superficial y la porosidad. (Recomendaciones 1984). Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 3.]

Generar una grfica to a5 para comparar la isoterma de la muestra de prueba con la de una isoterma de referencia tambin
ayuda a ilustrar la presencia de micro y mesoporosidad. La isoterma de referencia se puede calcular usando una expresin ma-
temtica, aunque cuando el adsorbente tiene propiedades qumicas similares a las de la muestra de prueba, se recomienda
usar una isoterma de referencia determinada de manera experimental.
El mtodo de la grfica t se basa en la curva t, que es una grfica de la cantidad de nitrgeno adsorbido en el slido no
poroso como una funcin de t, el espesor estadstico de la capa adsorbida. El valor t se calcula mediante:
USP 39 Pruebas Qumicas/ (268) Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de Nitrgeno 307

nm = cantidad de monocapa
J =espesor de una capa molecular simple, por lo general tomada como 0,354 nm para nitrgeno
En el mtodo de la grfica a 5, la cantidad de nitrgeno adsorbido por el slido no poroso de referencia se normaliza usando
la cantidad adsorbida a alguna presin relativa fija (n' a), a menudo tomada como 0,4. Posteriormente, la adsorcin normaliza-
da a 5 (igual a na! n' x) se grafica contra piPo para obtener una curva a 5
La grfica to la g'rfica a5 se construye graficando la cantidad de nitrgeno adsorbido por la muestra de prueba en funcin
de to a 5 para el material de referencia, en lugar de p/p 0 La conversin de p/p 0 a to a 5 se lleva a cabo tomando como referen-
cia la curva to la curva a 5 La forma de la grfica depende de la naturaleza de la porosidad presente en la muestra de prueba,
conforme a lo siguiente:
(a) si la grfica to a 5 es lineal y pasa a travs del origen, la muestra de prueba es no porosa o macroporosa.
(b) si la muestra de prueba contiene mesoporos, la grfica presenta una desviacin hacia arriba a la presin relativa corres-
pondiente al comienzo de la condensacin capilar en los mesoporos ms pequeos
(c) si la muestra de prueba contiene microporos, la grfica presenta una desviacin hacia abajo debido a que no se pueden
desarrollar mltiples capas dentro del espacio limitado en el interior de los microporos.
Algunos materiales contienen combinaciones de poros, lo que puede resultar en una grfica compleja y difcil de interpretar.
En dichos casos, los analistas deben tener cuidado al analizar la isoterma.

Clculo de la Distribucin del Tamao de Poro

Este anlisis es vlido nicamente para clculos de las distribuciones del tamao de mesoporos.
El clculo de la distribucin del tamao de poro se basa en la ecuacin de Kelvin:

r. - 2xCJ1 xv1 xcos(B)x10

3
--~~------
k - RxTxln(plp0 )

rK =radio del ncleo del poro (o radio de Kelvin) (nm)

a1 =tensin superficial (N/m) del adsorbato lquido (nitrgeno)
v1 =volumen molar del adsorbato condensado (nitrgeno) (cm 3/mol)
R =constante universal de los gases, 8,3144 (J K- 1 mol-1)
T = temperatura (K)
()=ngulo de contacto del adsorbato (O para una superficie humedecida)
Para nitrgeno, la ecuacin 2 se reduce a:

-0.953
r. =----
k ln(p/po)

El radio real del poro, rP' se calcula a partir del radio de Kelvin, corrigiendo por el espesor, t, del adsorbato en las paredes del
poro. Para poros cilndricos, rP = rk + t, y el dimetro del poro, dP, se obtiene mediante dP = 2(rk + t). Debido a la diferente
geometra de los poros en forma de ranura con lados paralelos, el ancho de la ranura se obtiene mediante rk + 2t.
Los analistas pueden calcular la distribucin del tamao de poro por volumen usando el mtodo de Barrett, Joyner y Halen-
da. Este modelo asume que los poros son rgidos y tienen una forma regular (p.ej., cilndrica o en forma de ranura), que no
hay microporos presentes y que la distribucin del tamao de poro no se extiende continuamente sobre los poros ms gran-
des que se pueden medir usando este procedimiento, lo cual implica que todos los poros evaluados se llenan a la presin rela-
tiva ms alta.
Los clculos de porosidad y de distribucin del tamao de poro que emplean la ecuacin de Kelvin deben realizarse usando
la isoterma de desorcin. La ecuacin de Kelvin se deriv para sistemas macroscpicos y no es estrictamente vlida a la escala
molecular. Por ende, la ecuacin de Kelvin se basa en un menisco intacto para describir con exactitud el fenmeno experimen-
tales. Para los sistemas tratados en este captulo, esto se logra nicamente para la isoterma de desorcin. Sin embargo, para la
desorcin, la aplicacin de la ecuacin de Kelvin a tamaos de poro menores se ve limitada por la tensin superficial del adsor-
bato. El lmite se ilustra mediante el punto de cierre del ciclo de histresis en la isoterma. Para nitrgeno, este punto ocurre a
una presin relativa de aproximadamente 0,45, que corresponde a un radio de poro cilndrico limitante de aproximadamente
2 nm. Por consiguiente, la ecuacin de Kelvin no es aplicable a los microporos.

Clculo del Volumen de Microporos

Si la grfica to a5 indica la presencia de microporos, el volumen de los microporos se puede obtener a partir de la intersec-
cin de la porcin lineal extrapolada de la curva.
308 (268) Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de Nitrgeno / Pruebas Qumicas USP 39

Informe de Resultados

Por lo general, los resultados informados pueden incluir el volumen o la porosidad total de los poros, el volumen de los mi-
croporos, la media o la mediana del dimetro de poro, la distribucin del tamao de poro y el rea superficial de los poros.

CALIBRACIN V VERIFICACIN DEL DESEMPEO DEL SISTEMA

Los analistas deben llevar a cabo la calibracin de los componentes individuales de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. La calibracin de transductores de presin y de sensores de temperatura se logra con referencia a dispositivos es-
tndar de medicin de temperatura y presin que cuentan con calibraciones rastreables a estndares nacionales. La calibracin
del volumen del distribuidor mltiple (manifold) se logra a travs de las mediciones apropiadas de presin y temperatura,
usando espacios volumtricos con temperatura constante o slidos con volumen rastreable y conocido.
Un material de referencia certificado o un material de referencia definido localmente que sea rastreable a un material de
referencia certificado debe analizarse de manera regular para monitorear la calibracin y el desempeo del instrumento.

(271 > PRUEBA PARA SUSTANCIAS FCILMENTE CARBONIZABLES

En las pruebas para sustancias fcilmente carbonizables, a menos que se indique algo diferente, agregar la cantidad especifi-
cada de la sustancia, reducida a polvo fino si se encuentra en forma slida, en pequeas porciones al recipiente para compara-
cin que es de vidrio incoloro resistente a la accin del cido sulfrico y contiene el volumen especificado de cido sulfrico
(ver en Especificaciones de Reactivos en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones).
Revolver la mezcla con una varilla de vidrio hasta completar su disolucin, dejar la solucin en reposo durante 15 minutos, a
menos que se indique algo diferente, y comparar el color de la solucin con el del Lquido de Comparacin especificado (ver
Color y Acromatismo (631 )) utilizando un recipiente para comparacin, que tambin es de vidrio incoloro y tiene las mismas
dimensiones internas y cruzadas, observando los lquidos transversalmente contra un fondo de porcelana blanca o de vidrio
blanco.
Cuando se aplica calor para disolver la sustancia en el cido sulfrico, mezclar la muestra y el cido en un tubo de ensayo,
calentar segn se indica y transferir la solucin al recipiente para comparacin para observarla con el Lquido de Comparacin
designado (ver Color y Acromatismo (631 )).

(281 >RESIDUO DE INCINERACIN

Partes de este captulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y de la Far-
macopea japonesa. Las partes que no estn armonizadas se indican con los smbolos (\). Los textos armonizados de estas far-
macopeas son por lo tanto intercambiables y, en lugar de este captulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos, se pue-
den usar los mtodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento con los requisitos.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armonizado.
La prueba de Residuo de Incineracin/Cenizas Sulfatadas emplea un procedimiento para medir la cantidad de sustancia resi-
dual no volatilizada de una muestra cuando sta se incinera en presencia de cido sulfrico conforme al procedimiento que se
describe a continuacin. Generalmente esta prueba se emplea para determinar el contenido de impurezas inorgnicas en una
sustancia orgnica.
Procedimiento-Calcinar un crisol adecuado (por ejemplo de slice, platino, cuarzo o porcelana) a 600 50 durante 30
minutos, enfriar el crisol en un desecador (gel de slice u otro desecante adecuado) y pesarlo con exactitud. Pesar con exacti-
tud 1 a 2 g de la sustancia la cantidad que se especifica en la monografa individual, en el crisol.
Humedecer la muestra con una pequea cantidad (generalmente 1 mL) de cido sulfrico y luego calentar suavemente a
una temperatura tan baja como sea posible hasta que la sustancia se carbonice totalmente. Enfriar; y luego, a menos que se
indique algo diferente en la monografa individual,. humedecer el residuo con una pequea cantidad (generalmente 1 mL) de
cido sulfrico; calentar suavemente hasta que no se generen humos blancos y calcinar a 600 50 , a menos que se especifi-
que otra temperatura en la monografa individual,. hasta que el residuo est completamente incinerado. Asegurarse, durante
todo el procedimiento, de que no se produzcan llamas en ningn momento. Enfriar el crisol en un desecador (gel de slice u
otro desecante adecuado), pesar con exactitud y calcular el porcentaje del residuo.
A menos que se especifique algo diferente, si la cantidad del residuo as obtenido excede el lmite especificado en la mono-
grafa individual, humedecer nuevamente con cido sulfrico, calentar y calcinar como se indic anteriormente, usando un
USP 39 Pruebas Qumicas / (291) Selenio 309

perodo de incineracin de 30 minutos, hasta que dos pesadas consecutivas del residuo no difieran en ms de 0,5 mg o hasta
que el porcentaje del residuo cumpla con el lmite establecido en la monografa individual.
Realizar la incineracin en una campana bien ventilada, pero protegida de las corrientes de aire y a la menor temperatura
posible para lograr la combustin completa del carbn. Puede usarse una mufla, si se desea, cuyo uso para la calcinacin final
se recomienda a 600 50.
La mufla se puede calibrar empleando un termmetro digital adecuado y una sonda termopar de trabajo calibrada contra
un termopar estndar rastreable al Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST, por sus siglas en ingls).
Verificar la exactitud de los circuitos de medicin y control de la mufla mediante la comprobacin de la temperatura fijada
para el uso previsto en distintas posiciones dentro de la mufla. Seleccionar las posiciones que reflejen el mtodo de uso even-
tual con respecto a la ubicacin de la muestra en anlisis. La tolerancia es de 25 en cada posicin medida .

(291) SELENIO

Solucin Madre-Disolver 40,0 mg de selenio metlico en 100 mL de cido ntrico diluido (1 en 2) en un matraz volum-
trico de 1000 mL, calentar moderadamente en un bao de vapor, si fuera necesario para completar la disolucin, agregar
agua a volumen y mezclar. Pipetear 5 mL de esta solucin y transferir a un matraz volumtrico de 200 mL, agregar agua a
volumen y mezclar. Cada mL de la solucin resultante contiene la cantidad equivalente a 1 g de selenio (Se).
Solucin de Diaminonaftaleno-Disolver 100 mg de 2,3-diaminonaftaleno y 500 mg de clorhidrato de hidroxilamina en
cido clorhdrico O, 1 N para obtener 100 mL. Preparar esta solucin el mismo da de su uso.
Solucin Estndar-Pipetear 6 mL de Solucin Estndar y transferir a un vaso de precipitados de 150 mL, y agregar 25 mL
de cido ntrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua.
Solucin de Prueba-La combustin completa del material de prueba es un factor importante para realizar la prueba. Para
los compuestos que se queman mal y producen holln, la adicin de xido de magnesio por lo general da como resultado una
combustin ms minuciosa y reduce la formacin de holln. Cuando se haya detectado la necesidad de agregar xido de mag-
nesio, sta se especificar en la monografa individual. Utilizando un matraz de combustin de 1000 mL y empleando 25 mL
de cido ntrico diluido (1 en 30) como lquido absorbente, proceder segn se indica en Combustin en Matraz con Oxgeno
(471 ), empleando 100 mg a 200 mg de muestra de prueba, a menos que se indique algo diferente en la monografa indivi-
dual. Al finalizar la combustin, colocar algunos mL de agua en el matraz, aflojar el tapn, luego enjuagar el tapn, el porta-
muestras y las paredes del matraz con aproximadamente 1O mL de agua. Transferir la solucin a un vaso de precipitados de
150 mL con la ayuda de aproximadamente 20 mL de agua y calentar moderadamente hasta temperatura de ebullicin. Calen-
tar a ebullicin durante 1O minutos y dejar que se enfre a temperatura ambiente.
Procedimiento-Tratar concomitantemente y en paralelo la Solucin Estndar, la Solucin de Prueba y el blanco de reactivos
constituido por 25 mL de cido ntrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua, segn se indica a continuacin. Agregar solucin de
hidrxido de amonio (1 en 2) para ajustar a un pH de 2,0 0,2. Diluir con agua a 60 mL y transferir a un separador de vidrio
con proteccin actnica con la ayuda de 1O mL de agua, agregando los 1O mL al separador. Agregar 200 mg de clorhidrato de
hidroxilamina, agitar por rotacin moderada para disolver; de inmediato agregar 5,0 mL de Solucin de Diaminonaftaleno, ta-
par y mezclar por rotacin suave. Dejar la solucin en reposo a temperatura ambiente durante 100 minutos. Agregar 5,0 mL
de ciclohexano, agitar vigorosamente durante 2 minutos y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y centrifu-
gar el extracto de ciclohexano para eliminar el agua dispersada. Determinar las absorbancias de los extractos de ciclohexano
de la Solucin de prueba y de la Solucin estndar en una celda de 1 cm, a la longitud de onda de mxima absorcin, aproxima-
damente a 380 nm, con un espectrofotmetro adecuado, usando el extracto de ciclohexano del blanco de reactivos como
blanco, y comparar las absorbancias: la absorbancia de la Solucin de Prueba no es mayor que la de la Solucin Estndar cuando
se ha tomado una muestra de prueba de 200 mg, o no es mayor que la mitad de la absorbancia de la Solucin Estndar cuan-
do se ha tomado una muestra de prueba de 100 mg.
31 O (301) Capacidad Neutralizante de cido / Pruebas Qumicas USP 39

OTRAS PRUEBAS Y VALORACIONES

(301) CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE CIDO

NOTA-Todas las pruebas se deben realizar a una temperatura de 37 3.

Calibracin del Medidor de pH-Calibrar un medidor de pH usando soluciones amortiguadoras de calibracin de biftalato
de potasio 0,05 m y de tetraoxalato de potasio 0,05 m como se describe en pH (791 ).
Mezclador Magntico-Transferir 100 ml de agua a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga una barra mezcla-
dora magntica de 40 mm x 1O mm (u otro tamao adecuado) recubierta con tefln y con un anillo de giro en el centro.
Ajustar la velocidad de la barra mezcladora, de forma que cuando la barra mezcladora se centra en el vaso de precipitados, la
velocidad de mezclado sea de 300 30 rpm, determinada con un tacmetro ptico adecuado.
Preparacin de Prueba-
Polvos-Transferir a un vaso de precipitados de 250 ml, la porcin pesada con exactitud de la sustancia especificada en la
monografa individual, agregar 70 ml de agua y mezclar en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Slidos Efervescentes-Transferir a un vaso de precipitados de 250 ml, una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a
la dosificacin mnima declarada en la etiqueta, agregar 1O ml de agua y mezclar por rotacin moderada el vaso de precipita-
dos mientras se reduce la intensidad de la reaccin. Agregar 1 O ml ms de agua y mezclar por rotacin suave. Lavar las pare-
des del vaso de precipitados con 50 ml de agua, y mezclar en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Suspensiones y Otros Lquidos-Agitar el recipiente hasta que el contenido sea uniforme y determinar la densidad. Transferir
a un vaso de precipitados de 250 ml una cantidad de la mezcla uniforme, pesada con exactitud, que equivalga a la dosifica-
cin mnima declarada en la etiqueta, agregar agua hasta obtener un volumen de aproximadamente 70 ml y mezclar en el
Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Tabletas de Disolucin Bucal-Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas de disolucin bucal y determinar el peso prome-
dio. Seleccionar y pesar 2 tabletas de disolucin bucal y transferirlas a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga 70 ml
de agua.
Tabletas No Masticables-Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas y determinar el peso promedio de las tabletas. Moler
las tabletas hasta un polvo fino, mezclar para obtener una mezcla uniforme y transferir a un vaso de precipitados de 250 ml
una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a la dosificacin mnima declarada en la etiqueta. Si se desea humedecer,
agregar no ms de 5 ml de alcohol (neutralizado a un pH aparente de 3,5) y mezclar para humedecer bien la muestra. Agre-
gar 70 ml de agua y mezclar en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Tabletas Masticables-Preparar segn se indica en Tabletas No Masticables.
Tabletas que Deben Masticarse-Transferir 1 Tableta a un vaso de precipitados de 250 ml, agregar 50 ml de agua y mezclar
en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Cpsulas-Pesar con exactitud no menos de 20 cpsulas. Extraer completamente el contenido de las cpsulas con la ayuda
de un hisopo de algodn si fuera necesario. Pesar con exactitud las cpsulas vacas y determinar el peso promedio del conteni-
do de cada cpsula. Mezclar el contenido combinado de las cpsulas para obtener una mezcla uniforme y proceder segn se
indica en Tabletas No Masticables, comenzando donde dice "transferir una cantidad pesada con exactitud".
Procedimiento para Polvos, Slidos Efervescentes, Suspensiones y Otros Lquidos, Tabletas de Disolucin Bucal,
Tabletas No Masticables, Tabletas Masticables y Cpsulas-Pipetear 30,0 ml de cido clorhdrico 1,0 N SV y transferir a la
Preparacin de Prueba mientras se contina mezclando con el Mezclador Magntico. [NOTA-Cuando la capacidad neutralizante
de cido de la muestra en anlisis es mayor de 25 mEq, usar 60,0 ml de cido clorhdrico 1,0 N SV, y hacer las modificaciones
correspondientes en los clculos.] Mezclar durante 15 minutos, cronometrados exactamente, despus de agregar el cido, co-
menzar a valorar de inmediato y en un perodo que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el cido clorhdrico en exceso
con hidrxido de sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 1 O a 15 segundos). Calcular el nmero de mEq
de cido consumido por la frmula:
mEq totales= (30 x NHc 1) - (VNaoH x NNaoH)
en donde NHci y NNaoH son las normalidades del cido clorhdrico SV y del hidrxido de sodio SV, respectivamente; y VNaoH es el
volumen de hidrxido de sodio SV usado para la valoracin. Expresar el resultado como mEq del cido consumido por g de la
sustancia analizada.
Procedimiento para Tabletas que Deben Masticarse-Pipetear 30,0 ml de cido clorhdrico 1,0 N SV y transferir a la
Preparacin de Prueba mientras se contina mezclando con el Mezclador Magntico durante 1 O minutos, cronometrados con
exactitud, despus de agregar el cido. Interrumpir el mezclado brevemente y retirar sin demora cualquier base gomosa del
vaso de precipitados usando una aguja larga. Enjuagar sin demora la aguja con 20 ml de agua, recogiendo los lavados en el
vaso de precipitados y continuar mezclando durante 5 minutos exactamente cronometrados, despus comenzar a valorar de
inmediato y en un perodo que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el cido clorhdrico en exceso con hidrxido de
USP 39 Pruebas Qumicas / (311) Valoracin de Alginatos 311

sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 1O a 15 segundos). Calcular el nmero de mEq de cido consumi-
do por la Tableta analizada por la frmula:

mEq totales= (30 x NHc1) - CVNaOH x NNaoH)

en donde los trminos son los definidos anteriormente.

(311) VALORACIN DE ALGINATOS

APARATO

El aparato necesario (ver Figura 7) contiene una vlvula dosificadora capilar, A, seguida de un caudalmetro, B, para controlar
y vigilar el flujo de nitrgeno a travs del sistema. Se emplean tubos de plstico vinlico halogenado* y una conexin de cau-
cho, C, para conectar el caudalmetro a un brazo lateral de un matraz de reaccin, D. El matraz Des un matraz de fondo
redondo, de 250 ml, para ebullicin, apoyado en un manto de calefaccin adecuado, E. El matraz D est equipado con un
condensador de reflujo de bobina Hopkins de 225 mm, F. El condensador termina en una trampa en U, G, que contiene dos
bandas de 25 g de cinc de malla 20; estas bandas estn limitadas y separadas por tres tapones de lana de vidrio de 3 pulgadas.
La trampa termina en un adaptador, H, que por medio de un tubo de plstico vinlico halogenado y un conector con llave de
paso por torsin, 1, se conecta con un frasco lavador de gas de 250 ml, J. El tubo de entrada (burbujeo) se extiende casi hasta
el fondo del frasco de lavado de gas y termina en un disco sinterizado con una porosidad gruesa. El tamao de todas las juntas
de vidrio es de 24 / 40 , excepto la junta de 45 / 50 del frasco de lavado de gas.
G

Figura 1 . Aparato para Valoracin de Alginatos.

APTITUD DEL SISTEMA

Empleando D-glucuronolactona como el estndar, proceder como se indica en el Procedimiento, pero no realizar los pasos
previos a la ebullicin. El sistema es adecuado si se cumplen los siguientes criterios: (1) la determinacin con un blanco da
como resultado un valor neto de volumetra, C, de entre 0,02 y 0,06 mEq, calculado de la siguiente manera:

Ab - Bb

en donde Abes el nmero de mEq de hidrxido de sodio 0,25 N en los 25 ml utilizados y Bb es el nmero de mEq de cido
clorhdrico O, 1 N utilizado en la volumetra con un blanco; y (2) el porcentaje de dixido de carbono, C0 2, obtenido a partir
del estndar est entre 24,2% y 25,7%.

*Este tipo de tubos se denominan comnmente tubos Tygon. Esta nota se agrega a los efectos de una mayor claridad y no implica que la USP avale este producto.
312 (311) Valoracin de Alginatos / Pruebas Qumicas USP 39

PROCEDIMIENTO
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, transferir una muestra de aproximadamente 250 mg,
pesados con exactitud, al matraz de reaccin, D, agregar 50 mL de cido clorhdrico O, 1 N, agregar varias perlas de ebullicin
y conectar el matraz al condensador de reflujo, F, empleando cido fosfrico como lubricante. [NOTA-Se puede emplear grasa
para llaves de paso para las otras conexiones.] Conectar la lnea de nitrgeno al brazo lateral del matraz y ajustar el flujo de
agua refrigerante aproximadamente a 2 L por minuto.
[NOTA-Los pasos previos a la ebullicin que se describen en este prrafo son opcionales y nicamente es necesario realizar-
los cuando se sospecha de la presencia de carbonatos inorgnicos.] Mantener el flujo de nitrgeno a travs del aparato a una
velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto. Acercar el manto de calefaccin, E, hasta el matraz, calentar la muestra y llevarla a
ebullicin, y mantener una ebullicin moderada durante 2 minutos. Apagar la fuente de calor, bajar el manto, E, y dejar que la
muestra se enfre durante aproximadamente 1O minutos.
Conectar el frasco lavador de gas vaco, J, y purgar el sistema con nitrgeno a una velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto
durante 5 minutos. Reducir el flujo de nitrgeno hasta 60 mL a 65 mL por minuto, agregar al frasco 1Ogotas de alcohol butli-
co, 25,0 mL de hidrxido de sodio 0,25 N SV y 50 mL de agua destilada, enjuagando hacia el interior del frasco lavador de gas
y volver a colocar la tapa. Desconectar la conexin de caucho, C, del brazo lateral y agregar 46 mL de cido clorhdrico a
travs del brazo lateral del matraz de ebullicin. Volver a unir la lnea de nitrgeno, acercar el manto de calefaccin y calentar
la mezcla de reaccin hasta ebullicin. Despus de 2 horas de ebullicin, aumentar el flujo de nitrgeno hasta 90 mL a 100 mL
por minuto, suspender el calentamiento y bajar el manto. Dejar que se enfre durante 1O minutos. Desconectar y desmontar el
frasco lavador de gas. Empleando un chorro dirigido de agua destilada, enjuagar bien todas las partes del tubo de burbujeo y
tapar, recolectando los lavados en el frasco de lavado de gas. Emplear nitrgeno para forzar suavemente la salida de toda el
agua del tubo de burbujeo. Agregar al frasco inmediatamente 1 O mL de solucin de cloruro de bario al 10% y una barra de
agitacin. Tapar hermticamente y mezclar lentamente durante 1 minuto. Dejar en reposo durante un mnimo de 5 minutos.
Agregar tres gotas de fenolftalena SR y valorar con cido clorhdrico O, 1 N SV. Realizar una determinacin con un blanco (ver
Valoraciones Volumtricas Residuales en Volumetra (541 )). Calcular el porcentaje de dixido de carbono, C0 2 , por la frmula:
2200[(A - B) - C]/(l OOOW)(l - D)
en donde A es el nmero de mEq de hidrxido de sodio 0,25 N en los 25 mL empleados; Bes el nmero de mEq de cido
clorhdrico O, 1 N empleado para la volumetra de la muestra o del estndar; C es el valor neto de volumetra calculado en la
determinacin con un blanco; W es el peso, en g, de la muestra o del estndar tomado; y D es el porcentaje expresado hasta
la dcima de unidad (1 lugar decimal), obtenido en la prueba de Prdida por Secado para la muestra o para el estndar.

(341) AGENTES ANTIMICROBIANOS-CONTENIDO

Un componente esencial de las inyecciones conservadas en envases multidosis es el agente o los agentes que se incorporan
para reducir el riesgo de que, en el momento de retirar parte del contenido, se produzca una contaminacin microbiana acci-
dental del contenido restante. Es un requisito farmacopeico que la presencia y la cantidad agregada de tal( es) agente(s) cons-
ten en la etiqueta del envase. Los mtodos proporcionados aqu para los agentes ms usados deben emplearse para demostrar
que el agente declarado est presente pero no excede la cantidad declarada en la etiqueta en ms de 20%.
La concentracin de un conservante antimicrobiano agregado a una preparacin para uso oftlmico, nasal, tico y parente-
ral, multidosis o monodosis, puede disminuir durante la vida til del producto. Por ello, el fabricante debe determinar el nivel
mnimo en el que el conservante resulta eficaz y debe formular el producto de modo que se garantice que este nivel de efecti-
vidad exceda durante toda la vida til del producto. En el momento de su fabricacin, el producto debe contener la cantidad
declarada del conservante antimicrobiano (dentro de un 20% considerando las variaciones originadas en la fabricacin y el
anlisis). La declaracin de la cantidad de conservante que se indica en la etiqueta, no pretende definir la cantidad de conser-
vante a mantener durante la vida til del producto; sino la cantidad que fue agregada, dentro de las limitaciones del proceso,
y que no se excedi en ms de 20%. Un ejemplo de tal declaracin en la etiqueta es "_(unidad) agregado como conservan-
te." [NOTA-" __(unidad)" es un nmero seguido de la unidad de medida, por ej. 0,015 mg por mL o O, 1%.]
Los agentes ms usados incluyen los dos derivados mercuriales, nitrato fenilmercrico y timerosal, los cuatro steres homlo-
gos del cido p-hidroxibenzoico, fenol, alcohol benclico y clorobutanol. Para los dos primeros mencionados se emplea el m-
todo polarogrfico, mientras que para la determinacin de los otros agentes se emplea la cromatografa de gases cuantitativa.

MTODO GENERAL POR CROMATOGRAFA DE GASES

Los procedimientos generales que se establecen a continuacin son aplicables a la determinacin cuantitativa de alcohol
benclico, clorobutanol, fenol y los steres metlico, etlico, proplico y butlico del cido p-hidroxibenzoico; estos ltimos se
tratan como un grupo pero, si estn presentes en forma individual, se los puede determinar por separado. Preparar la Solucin
USP 39 Pruebas Qumicas/ (341) Agentes Anti microbianos-Contenido 31 3

de Estndar Interno y la Preparacin Estndar para cada agente segn se indica a continuacin. A menos que se indique lo con-
trario, preparar la Preparacin de Prueba a partir de porciones medidas con exactitud de la Solucin de Estndar Interno y la
muestra de la prueba, de tamao tal que la concentracin del agente y la composicin del disolvente se correspondan estre-
chamente con la concentracin y la composicin de la Preparacin Estndar. En la siguiente tabla se proporcionan los parme-
tros operativos recomendados para el cromatgrafo de gases; el gas transportador es helio o nitrgeno y el detector es del tipo
de ionizacin a la llama.
p ara' metros operat1vos Recomend a d os para e IC romatograf o d e Gases
Dimensiones
de la Columna Relleno de la Columna Velocidad de Flujo, Temperatura de
Agente Long. DI Fases y Soporte mL pormin. la Columna
Alcohol Benzlico 1,8 m 3mm 5%G16/S1A 50 140
Clorobutanol 1,8 m 2mm 5%G16/S1A 20 110
Fenol 1,2m 3mm 5%G16/S1A 50 145
Parabenos 1,8m 2mm 5%G2/S1A 20 150

Alcohol Benclico

Solucin de Estndar Interno-Disolver aproximadamente 380 mg de fenol en 1O ml de metanol contenido en un ma-

traz volumtrico de 200 ml. Agregar agua a volumen y mezclar.
Preparacin Estndar-Disolver aproximadamente 180 mg de ER Alcohol Benclico USP, pesados con exactitud, en 20,0
ml de metanol contenidos en un matraz volumtrico de 100 ml. Agregar la Solucin de Estndar Interno a volumen y mezclar.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 5 L) de la Preparacin
Estndar y de la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parmetros establecidos en la
tabla adjunta y medir las reas correspondientes a los picos de alcohol benclico y fenol. Calcular el contenido, en mg por ml,
de alcohol benclico (C 7 H8 0) en la muestra tomada, por la frmula:
1 OO(C/V)(p 1 /p 2 )(Pi/P 1)
en donde C es la concentracin, en mg por ml, de alcohol benclico en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en ml, de la
muestra de la prueba usada para preparar cada 100 ml de la Preparacin de Prueba; p, y p 2 son las reas de los picos del al-
cohol benclico y el fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba; y P1 y P2 son las reas de los picos
del alcohol benclico y el fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin Estndar.

Clorobutanol

Solucin de Estndar Interno-Transferir aproximadamente 140 mg de benzaldehdo a un matraz volumtrico de 100

ml, agregar 1O ml de metanol y agitar por rotacin moderada para disolver. Diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparacin Estndar-Transferir aproximadamente 125 mg de ER Clorobutanol USP, pesados con exactitud, a un matraz
volumtrico de 25 ml. Agregar 2 ml de metanol, agitar por rotacin moderada para disolver, diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 5,0 ml de esta solucin y 5,0 ml de la Solucin de Estndar Interno a un matraz de 25 ml y mezclar para
obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente 2,5 mg de clorobutanol por ml.
Preparacin de Prueba-Diluir cuantitativamente, si fuera necesario, un volumen medido con exactitud de la muestra de
la prueba con metanol para obtener una solucin que no contenga ms de aproximadamente 5,0 mg de clorobutanol por ml.
Combinar 3,0 ml de esta solucin con 3,0 ml de la Solucin de Estndar Interno y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-[NOTA-Ver la tabla adjunta para determinar las dimensiones de la co-
lumna, el relleno de la columna con su fase y soporte, la velocidad de flujo y la temperatura de la columna.] Mantener la tem-
peratura del inyector a 180 y la del detector, a 220. Inyectar en el cromatgrafo la Preparacin Estndar y registrar el croma-
tograma segn se indica en el Procedimiento: los tiempos de retencin relativos son aproximadamente 0,8 para el benzaldeh-
do y 1,0 para el clorobutanol; la resolucin, R, entre el benzaldehdo y el clorobutanol no es menor de 2,0; y la desviacin
estndar relativa para inyecciones repetidas no es ms de 2,0%.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 1 L) de la Preparacin
Estndar y de la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las reas correspondientes a los picos principales.
Calcular la cantidad, en mg, de clorobutanol (C4 H7 CIP) en cada ml de la muestra sometida a la prueba, por la frmula:
C(L/D)(Ru/R5)
I
en donde C es la concentracin, en mg por ml, de clorobutanol, calculada con respecto a la sustancia anhidra, en la Prepara-
cin Estndar; L es la cantidad declarada, en mg, de clorobutanol en cada ml de la muestra de prueba; D es la concentracin,
en mg por ml, de clorobutanol en la Preparacin de Prueba, respecto al volumen de la muestra sometida a la prueba y el grado
de dilucin; y Ru y R5 son los cocientes entre el pico de clorobutanol y el pico de benzaldehdo obtenidos a partir de la Prepara-
cin de Prueba y de la Preparacin Estndar, respectivamente.
314 (341) Agentes Antimicrobianos-Contenido / Pruebas Qumicas USP 39

Fenol

Solucin de Estndar Interno-Pipetear 1 ml de ER Alcohol Benclico USP y transferir a un matraz volumtrico de 500 ml,
agregar metanol a volumen y mezclar.
Preparacin Estndar-Disolver aproximadamente 75 mg de ER Fenal USP, pesados con exactitud, en 7,5 ml de metanol
contenidos en un matraz volumtrico de 100 ml. Agregar 20,0 ml de Solucin de Estndar Interno, luego agregar agua a volu-
men y mezclar.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 3 L) de la Preparacin
Estndar y la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parmetros establecidos en la
tabla adjunta y medir las reas correspondientes a los picos de fenal y alcohol benclico. Calcular el contenido, en mg por ml,
de fenal (C 6 H6 0) en cada ml de la muestra tomada, por la frmula:
1 OO(C/V)(p 1/p 2 )(P 2/P 1)

en donde C es la concentracin, en mg por ml, de fenal en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en ml, de la muestra de
la prueba usada para preparar 100 ml de la Preparacin de Prueba; p1 y p 2 son las reas de los picos de fenal y alcohol bencli-
co, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba; y P1 y P2 son las reas de los picos de fenal y alcohol benc-
lico, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin Estndar.

Metilparabeno y Propilparabeno

Solucin de Estndar Interno-Colocar aproximadamente 200 mg de benzofenona en un matraz volumtrico de 250 ml,
diluir a volumen con ter y mezclar.
Preparacin Estndar-Colocar 100 mg de ER Metilparabeno USP y 1O mg de ER Propilparabeno USP, pesados con exacti-
tud, en un matraz volumtrico de 200 ml, diluir a volumen con Solucin de Estndar Interno y mezclar. Colocar 1O ml de esta
solucin en un matraz Erlenmeyer de 25 ml y proceder segn se indica en la Preparacin de Prueba, comenzando desde donde
dice "Agregar 3 ml de piridina".
Preparacin de Prueba-Pipetear 1 O ml de la muestra sometida a la prueba y 1 O ml de la Solucin de Estndar Interno en
un separador pequeo. Agitar vigorosamente, permitir que las capas se separen, retirar la capa acuosa y ponerla en un segun-
do separador y transferir la capa de ter a un matraz pequeo a travs de un embudo que contenga sulfato de sodio anhidro.
Extraer la capa acuosa con dos porciones de ter de 1O ml y filtrar tambin los extractos a travs del sulfato de sodio anhidro.
Evaporar los extractos combinados en una corriente de aire seco hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 O ml y
luego transferir el residuo a un matraz Erlenmeyer de 25 ml. Agregar 3 ml de piridina, completar la evaporacin del ter y
hervir en una placa de calentamiento hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 ml. Enfriar y agregar 1 ml de un
agente silanizante adecuado, como por ejemplo bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida, bis(trimetilsilil)acetamida o una mezcla de
hexametildisilazano y trimetilclorosilano [2:1 3:1 (v/v)]. Mezclar y dejar en reposo durante no menos de 15 minutos.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (2 L) de la solucin silanizada de la Prepara-
cin Estndar y la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parmetros establecidos en
la tabla adjunta y medir las reas correspondientes a los picos de metilparabeno, propilparabeno y benzofenona. Calcular el
contenido, en g por ml, de metilparabeno (C 8 H8 0 3) en la muestra sometida a la prueba, por la frmula:
1O(CM/V)(pifp3)(P3/P1)

en donde CM es la concentracin, en g por ml, de metilparabeno en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en ml, de la

muestra tomada; p 1 y p 3 son las reas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de
la Preparacin de Prueba; y P1 y P3 son las reas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a
partir de la Preparacin Estndar. De modo similar, calcular el contenido, en g por ml, de propilparabeno (C 10 H1i0 3) en la
muestra sometida a la prueba, por la frmula:

en donde Cp es la concentracin, en g por ml, de propilparabeno en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en ml, de la

muestra tomada; p 2 y p 3 son las reas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir
de la Preparacin de Prueba; y P2 y P3 son las reas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obteni-
dos a partir de la Preparacin Estndar.
El etilparabeno y el butilparabeno pueden determinarse de modo similar.

MTODO POLAROGRFICO

Nitrato Fenilmercrico

Preparacin Estndar-Disolver aproximadamente 100 mg de nitrato fenilmercrico, pesados con exactitud, en una solu-
cin de hidrxido de sodio (1 en 250) contenida en un matraz volumtrico de 1000 ml y entibiar si fuera necesario para lo-
USP 39 Pruebas Qumicas / (345) Valoracin de cido Ctrico/Citrato y Fosfato 315

grar una completa disolucin, agregar la solucin de hidrxido de sodio a volumen y mezclar. Pipetear 1O ml de esta solucin,
transferir a un matraz volumtrico de 25 ml y proceder segn se indica en la Preparacin de Prueba, comenzando desde donde
dice "agregar 2 ml de solucin de nitrato de potasio (1 en 100)."
Preparacin de Prueba-Pipetear 1O ml de la muestra de la prueba, transferir a un matraz volumtrico de 25 ml, agregar
2 ml de solucin de nitrato de potasio (1 en 100) y 1O ml de solucin amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 (ver
Soluciones Amortiguadoras en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones) y, si fuera necesario, ajustar a un pH de 9,2 agregan-
do cido ntrico 2 N. Agregar 1,5 ml de solucin de gelatina recin preparada (1 en 1000), luego agregar la solucin amorti-
guadora alcalina de borato de pH 9,2 a volumen y mezclar.
Procedimiento-Pipetear una porcin de la Preparacin de Prueba y transferir a la celda polarogrfica y desairear burbu-
jeando nitrgeno a travs de la solucin durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polargrafo
adecuado (ver Po/orografa (801 )) y registrar el polarograma desde -0,6 hasta -1,5 voltios en comparacin con el electrodo de
calomel saturado. Determinar la corriente de difusin de la Preparacin de Prueba, (id)u, como la diferencia entre la corriente
residual y la corriente limitante. De forma similar y concomitante, determinar la corriente de difusin, (id) 5, de la Preparacin
Estndar. Calcular la cantidad, en g, de nitrato fenilmercrico {C 6 H5 HgN0 3) en cada ml de la muestra tomada, por la frmu-
la:

en donde C es la concentracin, en g por ml, de nitrato fenilmercrico en la Preparacin Estndar.

Timerosal

Preparacin Estndar-En el da de uso, colocar aproximadamente 25 mg de ER Timerosal USP, pesados con exactitud, en
un matraz volumtrico de 250 ml, agregar agua a volumen y mezclar. Proteger de la luz. Pipetear 15 ml de esta solucin en
un matraz volumtrico de 25 ml, agregar 1,5 ml de solucin de gelatina (1 en 1000), luego agregar solucin de nitrato de
potasio 1 en 100 a volumen y mezclar.
Preparacin de Prueba-Pipetear 15 ml de la muestra en anlisis, transferir a un matraz volumtrico de 25 ml, agregar
1,5 ml de solucin de gelatina (1 en 1000), agregar solucin de nitrato de potasio (1 en 100) a volumen y mezclar.
Procedimiento-Transferir una porcin de la Preparacin de Prueba a la celda polarogrfica y desairear burbujeando nitr-
geno a travs de la solucin durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polargrafo adecuado (ver
Po/orografa (801 )) y registrar el polarograma de -0,2 a -1,4 voltios en comparacin con el electrodo de calomel saturado.
Determinar la corriente de difusin, (id)w como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante. De forma similar
y concomitante, determinar la corriente de difusin, (id) 5, de la Preparacin Estndar. Calcular la cantidad, en g, de timerosal
(C 6 H9 HgNa02 S) en cada ml de la muestra sometida a la prueba, por la frmula:
l ,667C[(id)u/{id)s]

en donde C es la concentracin, en g por ml, de timerosal en la Preparacin Estndar y los otros trminos son los definidos
anteriormente.

(345) VALORACIN DE CIDO CTRICO/CITRATO Y FOSFATO

INTRODUCCIN
El siguiente procedimiento general de cromatografa inica se emplea para determinar el contenido de cido ctrico/citrato y
fosfato en los artculos farmacopeicos, cuando se especifica en las monografas individuales. Con respecto a la teora y los
principios de las mediciones usando cromatografa inica, ver Cromatografa fnica (1065).

VALORACIN
PROCEDIMIENTO
Fase mvil: Hidrxido de sodio o hidrxido de potasio 20 mM, a partir de un volumen apropiado de una solucin de
hidrxido de sodio o hidrxido de potasio, exentos de carbonato, de concentracin conocida y agua (de una resistividad
de no menos de 18 Mohmios-cm). Como alternativa, la Fase mvil se puede generar mediante electrolisis usando un gene-
rador automtico de eluyente. Proteger la Fase mvil del dixido de carbono atmosfrico.
Solucin estndar 1 (slo para la valoracin de cido ctrico/citrato): 20 g/ml de citrato {C 6 H5 0 7) en hidrxido de
sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER cido Ctrico USP
Solucin estndar 2 (para la valoracin concomitante de citrato y fosfato): 20 g/ml de citrato {C 6 H5 0 7) y 12 g/ml
de fosfato (P04 ) en hidrxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER cido Ctrico USP y fosfato monob-
sico de sodio
Solucin muestra (para la valoracin de cido ctrico/citrato): Nominalmente 20 g/ml de citrato en hidrxido de so-
dio 1 mM recientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografa.
316 (345) Valoracin de cido Ctrico/Citrato y Fosfato / Pruebas Qumicas USP 39

Solucin muestra (para la valoracin de fosfato): Nominalmente 12 g/ml de fosfato en hidrxido de sodio 1 mM re-
cientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografa.
Sistema cromatogrfico
0fer Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: De conductividad con supresin
Columnas
Guarda columna: 4 mm x 5 cm; relleno L61 de 13 m
Columna analtica: 4 mm x 25 cm; relleno L61 de 13 m
Temperaturas
Columna: 30
Detector: 35
Supresor: Membrana autosupresora de aniones de 4 mm o un sistema de supresin qumica adecuado
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyeccin: 1O L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin estndar 7 y/o Solucin estndar 2, segn corresponda.
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para fosfato y citrato son 0,57 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Factor de asimetra: No ms de 2,0 para los picos de citrato y/o fosfato, segn corresponda.
Desviacin estndar relativa: No ms de 1,5% para los picos de citrato y/o fosfato, en seis inyecciones repetidas, se-
gn corresponda.
Anlisis
Muestras: Solucin estndar 7 y/o Solucin estndar 2, y Solucin muestra
A menos que se indique algo diferente en la monografa, calcular la concentracin de citrato o fosfato en la porcin de
Solucin muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x C5
ru = respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solucin muestra
r5 = respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solucin estndar 7 o la Solucin estndar 2
C5 = concentracin de citrato o fosfato en la Solucin estndar 7 o la Solucin estndar 2 (g/ml)

(351) VALORACIN DE ESTEROi DES

El siguiente procedimiento se aplica para determinar los esteroides Farmacopeicos que poseen grupos funcionales reductores
tales como a-cetoles.
Preparacin Estndar-Disolver en alcohol una cantidad adecuada del Estndar de Referencia USP especificado en la mo-
nografa individual, previamente secado en las condiciones especificadas en la monografa individual y pesado con exactitud, y
diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con alcohol para obtener una solucin con una concentracin de aproxima-
damente 1O g por ml. Pipetear 20 ml de esta solucin y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 ml con tapn de vidrio.
Preparacin de Valoracin-Preparar segn se indica en la monografa individual.
Procedimiento-A sendos matraces que contienen la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente,
y a un matraz similar que contenga 20,0 ml de alcohol como blanco, agregar 2,0 ml de una solucin preparada por disolu-
cin de 50 mg de azul de tetrazolio en 1O ml de metanol y mezclar. Agregar despus a cada matraz 2,0 ml de una mezcla de
alcohol e hidrxido de tetrametilamonio SR (9:1 ), mezclar y dejar en reposo en la oscuridad durante 90 minutos. Sin demora,
determinar al mismo tiempo las absorbancias de las soluciones de la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar aproxi-
madamente a 525 nm, utilizando un espectrofotmetro adecuado, contra el blanco. Calcular el resultado por la frmula dada
en la monografa individual, en donde Ces la concentracin, en g por ml, del Estndar de Referencia en la Preparacin Estn-
dar; y Au y A5 son las absorbancias de las soluciones de la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente.
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (371) Valoracin de Cobalamina con Marcador Radioactivo 31 7

(371) VALORACIN DE COBALAMINA CON MARCADOR

RADIOACTIVO

Todas las determinaciones de radioactividad requeridas por este mtodo deben hacerse con un equipo de conteo apropia-
do, durante un perodo de tiempo que sea ptimo de acuerdo con el equipo de conteo especfico empleado. Todos los proce-
dimientos deben realizarse varias veces para obtener la mayor exactitud posible.
Estndares de Referencia USP (11 )-fR Cianocobalamina USP.
Reactivo Marcador de Cianocobalamina-Diluir con agua un volumen medido con exactitud de una solucin de cianoco-
balamina radioactiva* para producir una solucin que tenga una radioactividad entre 500 y 5000 conteos por minuto por ml.
Agregar 1 gota de cresol por litro de solucin preparada y almacenar en un refrigerador.
Estandarizacin-Preparar en agua una solucin de una cantidad de ER Cianocobalamina USP, pesada con exactitud, que
contenga 20 g a 50 g por ml. Realizar la valoracin entera de una porcin de 10,0 mL de esta solucin, procediendo segn
se indica en la Preparacin de Valoracin, comenzando donde dice "Agregar agua para obtener un volumen medido".
Solucin de Cresol-Tetracloruro de Carbono-Mezclar volmenes iguales de tetracloruro de carbono y cresol reciente-
mente destilado.
Solucin de Fosfato-Cianuro-Disolver 100 mg de cianuro de potasio en 1000 mL de una solucin saturada de fosfato
dibsico de sodio y mezclar.
Solucin de Butanol-Cloruro de Benzalconio-Diluir una solucin de cloruro de benzalconio (17 en 100) con agua (3:1)
y mezclar con 36 volmenes de alcohol butlico.
Columna de Almina-Resina-Colocar un trozo de lana de vidrio en el fondo de un tubo de vidrio que posea una constric-
cin en uno de sus extremos, como por ejemplo una bu reta de 50 ml. Sosteniendo el tubo en posicin vertical, agregar un
volumen de una suspensin acuosa espesa de resina de intercambio inico (ver en la seccin Reactivos, Indicadores y Solucio-
nes), suficiente para obtener una columna de resina sedimentada de 7 cm de alto. Cuando el slido se haya sedimentado par-
cialmente, dejar que el agua drene, de manera que quede slo 1 cm de lquido encima de la columna de resina y comprimir la
resina suavemente. Luego agregar una suspensin acuosa espesa de almina anhidra (que no est lavada con cido) suficiente
para aumentar la altura de la columna sedimentada a 1O cm; dejar que drene el agua hasta que quede aproximadamente a 1
cm por encima de la almina. Agregar un trozo de lana de vidrio y lavar la columna, empleando un total de 50 mL de agua y
drenar nuevamente hasta un nivel de 1 cm por encima de la columna. Preparar una columna nueva para cada determinacin.
Preparacin de Valoracin-Transferir a un vaso de precipitados una cantidad pesada o un volumen medido de la prepa-
racin a valorar, con una actividad de vitamina B12 equivalente a la de 200 g a 500 g de cianocobalamina. Agregar agua
para obtener un volumen medido de no menos de 25 mL; luego agregar 5,0 mL de Reactivo Marcador de Cianocobalamina.
Trabajando bajo una campana, agregar 5 mg de nitrito de sodio y 2 mg de cianuro de potasio por cada mL de la solucin
resultante. Ajustar la solucin con cido clorhdrico diluido hasta pH 4 aproximadamente y calentar en bao de vapor durante
15 minutos. Enfriar y ajustar la solucin con hidrxido de sodio 1 N hasta un pH entre 7,6 y 8,0. Centrifugar o filtrar para
eliminar cualquier slido no disuelto.
Procedimiento-Transferir la Preparacin de Valoracin a un frasco de centrfuga de 250 mL, agregar 1O mL de Solucin de
Cresol-Tetracloruro de Carbono, cerrar adecuadamente el frasco con un tapn de vidrio, de polietileno o de goma envuelto en
papel de aluminio, agitar vigorosamente durante 2 a 5 minutos y centrifugar. Retirar y guardar la capa de disolvente inferior.
Repetir la extraccin empleando una porcin de 5 mL de Solucin de Cresol-Tetracloruro de Carbono y combinar los extractos
de las capas de disolvente inferiores en un frasco de centrfuga o separador de 50 mL a 100 mL de capacidad.
Lavar los extractos combinados con porciones sucesivas de 1O mL de cido sulfrico 5 N hasta que el ltimo lavado sea prc-
ticamente incoloro (dos lavados bastan generalmente). Durante cada lavado, agitar durante 2 a 5 minutos, dejar que las capas
se separen, centrifugar si fuera necesario y descartar la capa cida. Lavar luego con dos porciones sucesivas de 1O mL de Solu-
cin de Fosfato-Cianuro. Finalmente, lavar con 1O mL de agua. Descartar todos los lavados.
Al extracto lavado agregarle 30 mL de una mezcla de Solucin de Butanol-Cloruro de Benzalconio y tetracloruro de carbono
(2:1). Extraer con dos porciones de agua de 5 mL cada una, agitando vigorosamente cada vez durante 1 minuto, centrifugar,
retirar y guardar la capa superior acuosa.
Pasar los extractos acuosos combinados a travs de la Columna de Almina-Resina a una velocidad de aproximadamente 1
mL por minuto, mantener una capa de 1 cm de lquido sobre la parte superior de la columna, agregando agua segn sea
necesario. Descartar los primeros mL incoloros (generalmente alrededor de 5 mL) y recoger el eluato coloreado (generalmente
alrededor de 1O mL) en un tubo de centrfuga o separador de 50 mL que contenga 500 L de cido actico diluido. Extraer el
eluato agitando durante 2 a 5 minutos con 5 mL de Solucin de Cresol-Tetracloruro de Carbono y desechar la capa acuosa supe-
rior. Agregar al extracto 5,0 mL de agua, 5 mL de tetracloruro de carbono y 1O mL de alcohol butlico. Agitar, dejar que se
separe hasta que la capa superior est transparente y retirar la capa superior acuosa.
Determinar las absorbancias del extracto acuoso en una celda de 1 cm, a 361 nm y 550 nm, con un espectrofotmetro
apropiado, empleando una fuente de iluminacin de tungsteno. Hacer la lectura a 361 nm empleando un filtro capaz de redu-
cir la luz dispersada. Calcular el cociente A361 /A550 : la pureza del extracto acuoso es aceptable si el cociente es entre 3, l O y

* Una solucin de cianocobalamina, transformada en radioactiva mediante la incorporacin de 6Co, est disponible de Merck and Co., lnc., Rahway, NJ 07065.
318 (371) Valoracin de Cobalamina con Marcador Radioactivo/ Pruebas Qumicas USP 39

3,40. Si se observa un cociente fuera de este intervalo, purificar el extracto acuoso repitiendo el ciclo de extraccin, procedien-
do segn se indica en el prrafo anterior.
Si se observa un cociente de absorbancia aceptable en el extracto acuoso, determinar la radioactividad, en conteos por mi-
nuto, empleando un equipo de conteo apropiado durante un perodo de tiempo ptimo de acuerdo al equipo de conteo es-
pecfico empleado. Promediar los resultados y corregir el promedio por la radioactividad de fondo observada durante dos o
ms perodos de 30 minutos.
Clculos-Calcular el contenido de cobalamina, expresado en g de cianocobalamina, de la porcin tomada para la valora-
cin, por la frmula:

en donde Res la cantidad, en g, de cianocobalamina en la porcin de la solucin estndar tomada; C5 y Cu son los valores de
radioactividad promedio corregidos, expresados en conteos por minuto por mL, de la solucin estndar y de la solucin de
valoracin, respectivamente; y Au y A5 son las absorbancias, determinadas a 361 nm, de la solucin de valoracin y de la solu-
cin estndar, respectivamente.

(381) TAPONES ELASTOMRICOS PARA INYECTABLES

Cambio en la redaccin:

INTRODUCCIN

Los tapones elastomricos para los envases usados en los tipos de preparaciones definidas en el captulo de pruebas genera-
les Medicamentos Inyectables y en Implantes \1) (AF<nmay-aQ16), estn hechos de materiales obtenidos por vulcanizacin (entre-
cruzamiento), polimerizacin, poliadicin, o policondensacin de sustancias orgnicas macromoleculares (elastmeros). Las
formulaciones de los tapones contienen elastmeros naturales o sintticos y aditivos orgnicos e inorgnicos para facilitar o
controlar la vulcanizacin, impartir propiedades fsicas y qumicas o color, o estabilizar la formulacin del tapn.
Este captulo se refiere a tapones usados para el almacenamiento a largo plazo de preparaciones definidas en el captulo de
pruebas generales Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659), Envasado de Inyectables (AFQl-my-2019). Dichos tapones se
utilizan generalmente como parte de un vial, frasco o sistema de envase de una jeringa prellenada.
Este captulo se refiere a tapones formulados con sustancias elastomricas naturales o sintticas. No concierne a tapones he-
chos de elastmero de silicona; sin embargo, s se refiere a tapones tratados con silicona (p.ej., Dimeticona, NF). Al efectuar las
pruebas de este captulo, no es necesario tratar los tapones con silicona, aunque ninguna restriccin prohbe el uso de tapones
siliconizados.
Este captulo tambin se refiere a tapones recubiertos con otros materiales lubricantes (p.ej., materiales unidos qumica o
mecnicamente al tapn) no destinados a proporcionar una barrera para el elastmero base, y que de hecho no funcionan
como tal. Al efectuar las pruebas, los tapones con recubrimientos lubricantes sin funcin de barrera deben analizarse en su
estado recubierto.
Los siguientes comentarios se refieren nicamente a los tapones laminados o recubiertos con materiales destinados a propor-
cionar, o que funcionan como, una barrera para el elastmero base (p.ej., recubrimientos de PTFE o laca). No se permite usar
un material de barrera en un tapn que no cumpla con los requisitos farmacopeicos para convertirlo en uno que s los cumpla.
Por lo tanto, todas las Pruebas Fisicoqumicas conciernen a la frmula base de dichos tapones, as como sobre el tapn recubier-
to o laminado. Con el fin de obtener los resultados de las Pruebas Fisicoqumicas, stas deben efectuarse sobre tapones del mis-
mo compuesto elastomrico sin recubrimiento o laminado, as como al tapn recubierto o laminado. Las Pruebas de Funcionali-
dad corresponden y deben efectuarse usando el tapn elastomrico laminado o recubierto. Las Pruebas Biolgicas conciernen
tanto al material de laminacin o recubrimiento como a la frmula base. Las Pruebas Biolgicas pueden efectuarse sobre el ta-
pn laminado o recubierto, o sobre el material de laminacin o recubrimiento y los tapones del mismo compuesto elastomri-
co sin recubrimiento o laminado. En este ltimo caso, los resultados deben informarse por separado. La frmula base usada
para las pruebas fisicoqumicas o biolgicas, destinada a sustentar la conformidad farmacopeica de un tapn recubierto con
material de barrera, debera ser similar al tapn recubierto correspondiente en cuanto a configuracin y tamao.
Para todas las pruebas de este captulo, Nefelometrfa, Turbidrnetra y Comparacin Visual {855) (AF~l-lj'llly,;im 6), efectuadas so-
bre cualquier tipo de tapn, es importante documentar el tapn en anlisis, incluyendo una descripcin completa del elast-
mero y de cualquier lubricante, recubrimiento, laminacin o tratamiento aplicado.
Este captulo establece los lmites de prueba para los tapones elastomricos Tipo 1y Tipo 11. Los tapones Tipo 1son usados
generalmente para preparaciones acuosas. Los tapones Tipo 11 son los destinados generalmente a preparaciones no acuosas,
que si bien tienen propiedades optimizadas para usos especiales, es posible que no cumplan con todos los requisitos listados
para los tapones Tipo 1 debido a su configuracin fsica, al material de construccin o a ambos. Si un tapn no cumple con
uno o ms de los requisitos de prueba para Tipo 1 pero cumple con los requisitos para Tipo 11, se le asigna una clasificacin final
USP 39 Pruebas Qumicas/ (381) Tapones Elastomricos para Inyectables 319

de Tipo 11. Todos los tapones elastomricos adecuados para usar en preparaciones inyectables deben cumplir con los lmites de
prueba para Tipo 1o Tipo 11. Sin embargo, no se pretende que esta especificacin sirva como nico criterio de evaluacin para
la seleccin de dichos tapones.
El uso de este captulo resulta apropiado al identificar tapones elastomricos que pueden ser aceptables para usar en prepa-
raciones inyectables basndose en su reactividad biolgica, las propiedades fisicoqumicas de su extracto acuoso y su funciona-
lidad.
Los siguientes requisitos para la evaluacin de los tapones estn fuera del alcance de este captulo:
- El establecimiento de pruebas y especificaciones para la identificacin de tapones
- La verificacin de la compatibilidad fisicoqumica entre el tapn y el producto
- La identificacin y determinacin de seguridad de los lixiviados de los tapones que se encuentran en el producto envasa-
do
- La verificacin de la funcionalidad del tapn del producto envasado bajo condiciones reales de almacenamiento y uso
El fabricante del producto inyectable (el usuario final) debe obtener del proveedor del tapn la garanta de que la composi-
cin del tapn no vara y que es igual a la del tapn usado durante las pruebas de compatibilidad. Cuando el proveedor infor-
ma al usuario final de cambios en la composicin, se deben repetir las pruebas de compatibilidad, total o parcialmente, depen-
diendo de la naturaleza de los cambios. Los tapones deben almacenarse apropiadamente, limpiarse para remover los contami-
nantes ambientales y las endotoxinas, y para procesos aspticos, esterilizarse antes de usar en el envasado de productos inyec-
tables.

CARACTERSTICAS
Los tapones elastomricos son translcidos u opacos y no tienen un color caracterstico; ste depende de los aditivos usados.
Son homogneos y prcticamente libres de rebabas y materiales adventicios (p.ej., fibras, partculas extraas y residuos de go-
ma).

IDENTIFICACIN
Los tapones se hacen de una gran variedad de materiales elastomricos y recubrimientos polimricos opcionales. Por esta
razn, est ms all del propsito de este captulo especificar pruebas de identificacin que abarquen todas las posibles presen-
taciones de los tapones. Sin embargo, es responsabilidad del proveedor del tapn y del fabricante del producto inyectable (el
usuario final) verificar la formulacin elastomrica del tapn y cualquier recubrimiento o material laminado usado, de acuerdo
con las pruebas de identificacin apropiadas. Ejemplos de algunas de las metodologas analticas de prueba que se pueden
usar incluyen peso especfico, anlisis del porcentaje de cenizas, determinacin del contenido de azufre, prueba FTIR-ATR, cro-
matografa en capa delgada de un extracto, espectrofotometra de absorcin UV de un extracto o espectrofotometra de ab-
sorcin IR de un pirolisado.

PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA
Los tapones elastomricos deben ajustarse a los requisitos biolgicos, fisicoqumicos y de funcionalidad, tanto cuando son
enviados por el proveedor de tapones al fabricante del producto inyectable (el usuario final) como cuando el usuario final los
pone en su estado definitivo, listos para usar.
Para aquellos tapones elastomricos procesados por el proveedor antes de la distribucin al usuario final, el proveedor debe-
r demostrar el cumplimiento con los requisitos farmacopeicos de los tapones expuestos a dichos pasos de procesamiento y/o
esterilizacin. De igual manera, si los tapones elastomricos recibidos por el usuario final son posteriormente procesados o es-
terilizados, el usuario final es responsable de demostrar que los tapones siguen cumpliendo con los requisitos farmacopeicos
despus de dichas condiciones de procesamiento y/o esterilizacin (es decir, en su estado listo para usar). Esto es especialmen-
te importante si los tapones se deben exponer a procesos o condiciones que podran impactar significativamente las caracters-
ticas biolgicas, fisicoqumicas o de funcionalidad del tapn (p.ej., radiacin gamma).
Para tapones que normalmente se lubrican con silicona antes de usar, est permitido efectuar las pruebas fisicoqumicas en
los tapones no lubricados con el fin de evitar una posible interferencia del mtodo y/o dificultades en la interpretacin de los
resultados de la prueba. Para tapones suministrados con otros recubrimientos lubricantes sin funcin de barrera, todas las
pruebas se deben efectuar usando el tapn recubierto.
Para tapones recubiertos o laminados con recubrimientos destinados a proveer una barrera (p.ej., recubrimientos de PTFE o
laca), las pruebas farmacopeicas fisicoqumicas se aplican al elastmero base no recubierto, as como al tapn recubierto. En
este caso, los proveedores son responsables de demostrar el cumplimiento con los requisitos fisicoqumicos farmacopeicos tan-
to del tapn recubierto como del no recubierto, procesado o tratado de forma tal que se simulen las condiciones usadas para
los tapones recubiertos antes del envo al usuario final. El tapn no recubierto sujeto a las pruebas fisicoqumicas debera ser
similar en tamao y configuracin al tapn recubierto correspondiente. Los usuarios finales de los tapones recubiertos son res-
ponsables tambin de demostrar el continuo cumplimiento con los requisitos fisicoqumicos farmacopeicos del tapn recubier-
to, procesado o tratado en una forma que simule las condiciones tpicas empleadas por el usuario final previo al uso.
320 (381) Tapones Elastomricos para Inyectables/ Pruebas Qumicas USP 39

En todos los casos, al informar los resultados de las pruebas es apropiado documentar todas las condiciones del procesa-
miento, pretratamiento, esterilizacin o lubricacin de los tapones.
La Tabla 1 resume los requisitos de prueba de los tapones y las responsabilidades del proveedor y del usuario final.
Tabla 1
Tipos de Tapones (Tal como Requisitos de Prueba
se Suministran o Utlllzan) Pruebas Flslcoqumlcas Pruebas de Funcionalidad Pruebas Biolgicas
Tapn con o sin Estas pruebas son obligatorias. Estas pruebas son obligatorias. Estas pruebas son obligatorias.
Recubrimiento de Silicona El uso de silicona es opcional. El uso de silicona es opcional. El uso de silicona es opcional.
Responsibilidad: proveedor y Responsibilidad: proveedor y usua- Responsibilidad: proveedor y
usuario final. rio final. usuario final.
Tapones con Recubrimiento Estas pruebas se deben Estas pruebas se deben realizar so- Estas pruebas se deben realizar so-
Lubricante (Material realizar sobre el tapn recubier- bre el tapn recubierto. bre el tapn recubierto.
Sin Funcin de Barrera; Diferen- to. Responsibilidad: proveedor y usua- Responsibilidad: proveedor y
te de Silicona) Responsibilidad: proveedor y rio final. usuario final.
usuario final.
Tapones con Recubrimiento Estas pruebas se deben realizar Estas pruebas se deben realizar so- Estas pruebas se deben realizar so-
de Barrera sobre los tapones recubiertos. bre los tapones recubiertos. bre los tapones recubiertos.
Responsibilidad: proveedor y Responsibilidad: proveedor y usua- O:
usuario final. rio final.
Y: Estas pruebas se deben realizar so-
Estas pruebas se deben realizar bre los tapones sin recubrimiento
sobre los tapones sin recubri- (frmula base) y al material de la-
miento (frmula base). minado/recubrimiento (los resulta-
dos se informan por separado).
Responsibilidad: proveedor. Responsibilidad: proveedor y
usuario final.

PRUEBAS BIOLGICAS
Se establecen dos etapas de pruebas. La primera etapa es la realizacin de un procedimiento de prueba in vitro segn se
describe en el captulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro (87). Los materiales que no cumplen con
los requisitos de la prueba in vitro estn sujetos a la segunda etapa de pruebas, que es la realizacin de pruebas in vivo, Prueba
de Inyeccin Sistmica y Prueba lntracutnea, segn los procedimientos presentados en el captulo de pruebas generales Pruebas
de Reactividad Biolgica, In Vivo (88). Los materiales que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no necesitan some-
terse a pruebas in vivo.
Los tapones Tipo 1y Tipo 11 deben cumplir con los requisitos de las pruebas de reactividad biolgica in vitro o in vivo.
[NOTA-Ver tambin el captulo de informacin general Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos,
Dispositivos Mdicos e Implantes (1031 ).]

PRUEBAS FISICOQUMICAS

Preparacin de la Solucin S

Colocar dentro de un recipiente de vidrio adecuado, tapones enteros, sin cortar, que equivalgan a un rea superficial de
100 1O cm 2. Cubrir los tapones con 200 mL de Agua Purificada o Agua para Inyeccin. Si no es posible conseguir el rea
superficial de tapn prescrita (100 1O cm2) usando tapones sin cortar, seleccionar el nmero de tapones que se aproximen
mejor a los 100 cm2, y ajustar el volumen de agua usado al equivalente de 2 mL por cada 1 cm 2 de rea superficial real de
tapn utilizada. Calentar a ebullicin durante 5 minutos y enjuagar cinco veces con Agua Purificada o Agua para Inyeccin.
Colocar los tapones lavados en un matraz Erlenmeyer de vidrio Tipo 1con cuello ancho (ver Envases-Vidrio (660)), agregar
la misma cantidad de Agua Purificada o Agua para Inyeccin agregada inicialmente a los tapones, y pesar. Cubrir la boca del
matraz con un vaso de precipitados de vidrio Tipo l. Calentar en un autoclave hasta alcanzar una temperatura de 121 2 den-
tro de 20 a 30 minutos y mantenerla durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente durante un periodo de aproximada-
mente 30 minutos. Agregar Agua Purificada o Agua para Inyeccin para completar de nuevo la masa original. Agitar e inme-
diatamente decantar y recoger la solucin. [NOTA-Esta solucin se debe agitar antes de usarse en cada una de las pruebas.]

Preparacin del Blanco

Preparar una solucin blanco en forma similar, usando 200 mL de Agua Purificada o de Agua para Inyeccin, pero omitien-
do los tapones.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (381) Tapones Elastomricos para Inyectables 321

APARIENCIA DE LA SOLUCIN (TURBIDEZ/OPALESCENCIA Y COLOR)

Determinacin de Turbidez (Opalescencia)

NOTA-La determinacin de turbidez se puede efectuar por comparacin visual (Procedimiento A), o instrumentalmente, con
un turbidmetro de relacin adecuado (Procedimiento B). Para mayor informacin sobre turbidimetra, ver Nefelometra, Turb-
dmetra y Comparacin Visual <B55)e (AFOl4Tiay-w16l" La evaluacin instrumental de transparencia constituye una prueba ms sen-
sible que no depende de la agudeza visual del analista.
Solucin de Sulfato de Hidrazina-Disolver 1,0 g de sulfato de hidrazina en agua y diluir con agua hasta 100,0 ml. Dejar en
reposo durante 4 a 6 horas.
Solucin de Hexametilentetramina-Disolver 2,5 g de hexametilentetramina en 25,0 mL de agua en un matraz Erlenmeyer
de vidrio tapado de 100 mL.
Suspensin Madre de Opalescencia-Agregar 25,0 mL de Solucin de Sulfato de Hidrazina a la Solucin de Hexametilentetrami-
na en el matraz. Mezclar y dejar en reposo durante 24 horas. Esta suspensin es estable durante un perodo de 2 meses, siem-
pre y cuando se almacene en un envase de vidrio sin defectos en su superficie. La suspensin no debe adherirse al vidrio y
debe mezclarse bien antes de usar.
Suspensin del Estndar de Opalescencia-Preparar una suspensin diluyendo 15,0 mL de la Suspensin Madre de Opalescen-
cia con agua hasta 1000,0 ml. La Suspensin del Estndar de Opalescencia es estable durante aproximadamente 24 horas des-
pus de la preparacin.
Suspensiones de Referencia-Preparar de acuerdo con la Tabla 2. Mezclar y agitar antes de usar. [NOTA-Las suspensiones de
formacina estabilizada que se pueden usar para preparar estndares de turbidez estables y diluidos, estn disponibles comer-
cialmente y se pueden usar despus de la comparacin con los estndares preparados como se ha descrito.]
Tabla 2
Suspensin de Referen- Suspensin de Referen- Suspensin de Referen- Suspensin de Referen-
da A da B cia e da D
Estndar de Opalescencia 5,0 ml 10,0 ml 30,0 ml 50,0 ml
Agua 95,0 ml 90,0 ml 70,0 ml 50,0 ml
Unidades de Turbidez Nefe- 3 NTU 6 NTU 18 NTU 30 NTU
lo mtrica

Procedimiento A: Comparacin Visual-Usar tubos de prueba idnticos, de vidrio neutro, incoloro y transparente con base
plana y un dimetro interno de 15 a 25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de lquido de 40 mm con Solucin S, un tubo
hasta la misma altura con agua, y cuatro tubos ms hasta la misma altura con Suspensiones de Referencia A, B, Cy O. Comparar
las soluciones bajo luz diurna difusa 5 minutos despus de la preparacin de las Suspensiones de Referencia, observndolas verti-
calmente contra un fondo negro. Las condiciones de luz deben ser tales que la Suspensin de Referencia A puede distinguirse
fcilmente del agua y la Suspensin de Referencia B puede distinguirse fcilmente de la Suspensin de Referencia A.
Requisito-La Solucin S no es ms opalescente que la Suspensin de Referencia B para tapones Tipo 1y no ms opalescente
que la Suspensin de Referencia C para tapones Tipo 11. La Solucin S se considera transparente si su transparencia es igual que la
del agua cuando se examina segn se describi anteriormente o si su opalescencia no es ms pronunciada que la de Suspen-
sin de Referencia A (ver la Tabla 3).
Procedimiento B: Comparacin Instrumental-Medir la turbidez de las Suspensiones de Referencia en un turbidmetro calibrado
adecuado (ver (855)e (AF oi-may-2016)). Medir el blanco y corregir los resultados por el blanco. Las Suspensiones de Referencia A, B,
Cy O representan 3, 6, 18 y 30 Unidades de Turbidez Nefelomtrica (NTU, por sus siglas en ingls), respectivamente. Medir la
turbidez de la Solucin S con el turbidmetro calibrado.
Requisito-La turbidez de la Solucin S no es mayor que la de la Suspensin de Referencia B (6 NTU FTU) para tapones Tipo 1y
no es mayor que la de la Suspensin de Referencia C (18 NTU FTU) para tapones Tipo 11 (ver la Tabla 3).
Tabla 3
Mtodo de Comparacin
Requisitos de Procedimiento A Procedimiento B
Opalescencia (Visual) (Instrumental)
Tapones Tipo 1 No ms opalescente que la Suspensin B No ms de 6 NTU
Tapones Tipo 11 No ms opalescente que la Suspensin C No ms de 18 NTU

Determinacin de Color
Estndar de Color-Preparar una solucin diluyendo 3,0 mL de Lquido de Comparacin O (ver Color y Acromatismo (631))
con 97,0 mL de cido clorhdrico diluido.
Procedimiento-Usar tubos idnticos de vidrio neutro, incoloro y transparente con base plana y un dimetro interno de 15 a
25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de lquido de 40 mm con Solucin S y el segundo con Estndar de Color. Comparar los
lquidos bajo luz diurna difusa, observndolos verticalmente contra un fondo blanco.
Requisito-La Solucin S no est ms intensamente coloreada que el Estndar de Color.
322 (381) Tapones Elastomricos para Inyectables/ Pruebas Qumicas USP 39

Acidez o Alcalinidad

Solucin de Azul de Bromotimol-Disolver 50 mg de azul de bromotimol en una mezcla de 4 mL de hidrxido de sodio 0,02
M y 20 mL de alcohol. Diluir con agua hasta 100 ml.
Procedimiento-A 20 mL de Solucin S, agregar O, 1 mL de Solucin de Azul de Bromotimol. Si la solucin es amarilla, valorar
con hidrxido de sodio 0,01 N hasta alcanzar un punto final azul. Si la solucin es azul, valorar con cido clorhdrico 0,01 N
hasta alcanzar un punto final amarillo. Si la solucin es verde, es neutra y no se requiere una valoracin.
Correccin del Blanco-Probar 20 mL de Blanco de manera similar. Corregir los resultados obtenidos para la Solucin S, sus-
trayendo o agregando el volumen de la solucin volumtrica requerida para el Blanco segn sea apropiado. (yer Volumetra
(541 ).)
Requisito-No ms de 0,3 mL de hidrxido de sodio 0,01 N producen un color azul, o no ms de 0,8 mL de cido clorhdri-
co 0,01 N producen un color amarillo o no se requiere una valoracin.

Absorbancia

Procedimiento-[NOTA-Efectuar esta prueba dentro de las 5 horas de la preparacin de la Solucin S.] Pasar la Solucin S a
travs de un filtro con tamao de poro 0,45 m, desechando los primeros mL de filtrado. Medir la absorbancia del filtrado a
una longitud de onda entre 220 y 360 nm en una celda de 1 cm, usando el blanco en una celda pareada en el haz de referen-
cia. Si se requiere diluir el filtrado antes de medir la absorbancia, corregir los resultados de la prueba por la dilucin.
Requisito-Las absorbancias a estas longitudes de onda no exceden de 0,2 para tapones Tipo 1o 4,0 para tapones Tipo 11.

Sustancias Reductoras

Procedimiento-[NoTA-Efectuar esta prueba dentro de las 4 horas de la preparacin de la Solucin S.] A 20,0 mL de Solucin
S, agregar 1 mL de cido sulfrico diluido y 20,0 mL de permanganato de potasio 0,002 M. Calentar a ebullicin durante 3
minutos. Enfriar, agregar 1 g de yoduro de potasio, y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 M, usando 0,25 mL de
solucin de almidn SR como indicador. Efectuar una valoracin usando 20,0 mL de blanco y anotar la diferencia en volumen
de tiosulfato de sodio 0,01 M requerido.
Requisito-La diferencia entre los volmenes de las valoraciones no es mayor de 3,0 mL para tapones Tipo 1 y no es mayor
de 7,0 mL para tapones Tipo 11.

Metales Pesados

Procedimiento-Proceder segn se indica en Mtodo 7 en Metales Pesados (231 ). Preparar la Preparacin de Prueba usando
10,0 mL de Solucin S.
Requisito-La Solucin S contiene no ms de 2 ppm de metales pesados como plomo.

Cinc Extrable

Solucin de Prueba-Preparar una Solucin de Prueba diluyendo 10,0 mL de Solucin S con cido clorhdrico O, 1 N hasta 100
ml. Preparar un blanco de prueba de forma similar, usando el Blanco en lugar de la Solucin S.
Solucin Estndar de Cinc-Preparar una solucin (1 O ppm de Zn) disolviendo sulfato de cinc en cido clorhdrico 0, 1 N.
Soluciones de Referencia-Preparar no menos de tres Soluciones de Referencia, diluyendo la Solucin Estndar de Cinc con ci-
do clorhdrico O, 1 N. Las concentraciones de cinc en estas Soluciones de Referencia deben abarcar el lmite esperado para la
Solucin de Prueba.
Procedimiento-Usar un espectrofotmetro de absorcin atmica apropiado (ver llllllllllllt~fallllBIMllliilB
llllflllllf) equipado con una lmpara de cinc de ctodo hueco y una llama de aire-acetileno. Se puede usar un procedi-
tal como un anlisis de plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en ingls) apropiadamente valida-
do.
Probar cada una de las Soluciones de Referencia en la lnea de emisin de cinc a 213,9 nm por lo menos tres veces. Registrar
las lecturas estables. Enjuagar el aparato con la solucin del blanco de prueba cada vez, para garantizar que la lectura retorna
al valor inicial del blanco. Preparar una curva de calibracin a partir de la media de las lecturas obtenidas para cada Solucin de
Referencia. Registrar la absorbancia de la Solucin de Prueba. Determinar la concentracin de cinc en ppm de la Solucin de
Prueba usando la curva de calibracin.
Requisito-La Solucin S contiene no ms de 5 ppm de cinc extrable.
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (381) Tapones Elastomricos para Inyectables 323

Amonio

Solucin de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina-Preparar una solucin de 100 mL que contenga 11 g de yoduro de po-
tasio y 15 g de yoduro mercrico en agua. Inmediatamente antes de usar, mezclar 1 volumen de esta solucin con un volu-
men igual de una solucin de hidrxido de sodio de 250 g por L.
Solucin de Prueba-Diluir 5 ml de Solucin S con agua hasta 14 ml. Alcalinizarla, si fuera necesario, agregando hidrxido
de sodio 1 N y diluir hasta 15 ml con agua. Agregar 0,3 mL de Solucin de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina y cerrar el
recipiente.
Solucin Estndar de Amonio-Preparar una solucin de cloruro de amonio en agua (1 ppm NH 4 ). Mezclar 1 O ml de la solu-
cin de cloruro de amonio de 1 ppm con 5 ml de agua y 0,3 ml de Solucin de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina. Cerrar
el recipiente.
Requisito-Despus de 5 minutos, cualquier color amarillo en la Solucin de Prueba no es ms oscuro que el de la Solucin
Estndar de Amonio (no ms de 2 ppm de NH 4 en la Solucin S).

Sulfuros Voltiles

Procedimiento--C.olocar tapones, cortados si fuera necesario, con un rea superficial total de 20 2 cm 2 en un matraz de
100 ml y agregar 50 mL de una solucin de cido ctrico de 20 g por L. De la misma manera y en forma simultnea, preparar
una solucin de control en otro matraz de 100 mL, disolviendo O, 154 mg de sulfuro de sodio en 50 mL de una solucin de
cido ctrico de 20 g por L. Colocar un trozo de papel de acetato de plomo sobre la boca de cada matraz y asegurarlo en
posicin, poniendo sobre l un frasco para pesada invertido. Calentar los matraces en un autoclave a 121 2 durante 30 mi-
nutos.
Requisito--C.ualquier mancha negra en el papel, producida por la solucin de prueba, no es ms intensa que la producida
por la solucin de control.

PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD

NOTA-Las muestras tratadas segn se describi para la preparacin de la Solucir; S y secadas al aire, se deben usar para las
Pruebas de Funcionalidad de Penetrabilidad, Fragmentacin y Capacidad de Autoseflado. Las Pruebas de Funcionalidad se efectan
en tapones destinados a ser perforados por una aguja hipodrmica. La prueba de Capacidad de Autoseflado se requiere slo
para tapones destinados a envases multidosis. La aguja especificada para cada prueba es una aguja hipodrmica lubricada de
bisel largo (ngulo de bisel: 12 2) 1

Penetrabilidad

Procedimiento-Llenar con agua 1 O viales adecuados hasta el volumen nominal, colocar los tapones a examinar y asegurar
con una tapa. Usando una aguja hipodrmica nueva, segn se describi anteriormente, para cada tapn, perforar el tapn con
la aguja perpendicular a la superficie.
Requisito-La fuerza de la perforacin no es mayor que 1O N (1 kgf) para cada tapn, determinada con una exactitud de
0,25 N (25 gf).

Fragmentacin

Tapones para Preparaciones Lquidas-Llenar con agua 12 viales limpios hasta 4 ml menos de la capacidad nominal. Colocar
los tapones a examinar, asegurarlos con una tapa y dejar en reposo durante 16 horas.
Tapones para Preparaciones Secas--C.olocar los tapones a examinar en 12 viales limpios y asegurar cada uno con una tapa.
Procedimiento-Usando una aguja hipodrmica segn se describi anteriormente, colocada en una jeringa limpia, inyectar
dentro de cada vial 1 mL de agua mientras se retira 1 mL de aire. Repetir este procedimiento cuatro veces para cada tapn,
perforando cada vez en un sitio diferente. Usar una aguja nueva para cada tapn, verificando que no se vuelva roma durante la
prueba. Filtrar el volumen total de lquido en todos los viales a travs de un nico filtro con un tamao de poro nominal no
mayor que 0,5 m. Contar los fragmentos de caucho que se puedan ver a simple vista en la superficie del filtro.
Requisito-No hay ms de cinco fragmentos visibles. Este lmite se basa en la suposicin de que los fragmentos con un di-
metro >50 m se pueden ver a simple vista. En caso de duda o controversia, examinar las partculas microscpicamente para
verificar su naturaleza y tamao.

1 Consultar ISO 7864, Agujas hipodrmicas estriles para nico uso con un dimetro externo de 0,8 mm (Calibre 21 ).
324 (381) Tapones Elastomricos para Inyectables / Pruebas Qumicas USP 39

Capacidad de Autosellado
Procedimiento-Llenar 1O viales adecuados con agua hasta el volumen nominal. Colocar los tapones a examinar y tapar.
Usando una jeringa hipodrmica nueva para cada tapn, segn se describi anteriormente, perforar cada tapn 1O veces en
un sitio diferente cada vez. Sumergir los 1O viales en una solucin de azul de metileno al O, 1% (1 g por L) y reducir la presin
externa en 27 kPa durante 1O minutos. Restablecer la presin atmosfrica y dejar los viales sumergidos durante 30 minutos.
Enjuagar el exterior de los viales.
Requisito-Ninguno de los viales contiene vestigios de solucin azul.

(391) VALORACIN DE EPINEFRINA

Estndares de Referencia USP (11 )-ER Bitartrato de Epinefrina USP.

Solucin Ferro-Ctrica-El da en que se va a utilizar, disolver 1,5 g de sulfato ferroso en 200 mL de agua, a los que se ha
agregado 1,0 mL de cido clorhdrico diluido (1 en 12) y 1,0 g de bisulfito de sodio. Disolver 500 mg de citrato de sodio en
1O mL de esta solucin y mezclar.
Solucin Amortiguadora-En un matraz volumtrico de 50 mL, mezclar 4,2 g de bicarbonato de sodio, 5,0 g de bicarbo-
nato de potasio y 18 mL de agua (no todos los slidos se disolvern en esta etapa). A otros 18 mL de agua, agregar 3, 75 g de
cido aminoactico y 1,7 mL de hidrxido de amonio 6 N; mezclar para disolver y transferir esta solucin al matraz volumtri-
co de 50 mL que contiene la otra mezcla. Diluir a volumen con agua y mezclar hasta dilucin completa.
Preparacin Estndar-Transferir aproximadamente 18 mg de ER Bitartrato de Epinefrina USP pesados con exactitud, a un
matraz volumtrico de 100 mL con ayuda de 20 mL de solucin de bisulfito de sodio (1 en 50), diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con solucin de bisulfito de
sodio (1 en 500) y mezclar. [NOTA-Hacer la dilucin final en el momento de llevar a cabo la valoracin.] La concentracin de
ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparacin Estndar es aproximadamente 18 g por ml.
Preparacin de Valoracin-Transferir a un matraz volumtrico de 50 mL un volumen medido con exactitud de la Inyec-
cin a valorar, que equivalga aproximadamente a 500 g de epinefrina, diluir a volumen con solucin de bisulfito de sodio (1
en 500), si fuera necesario, y mezclar. [NOTA-La concentracin final de bisulfito de sodio est en el intervalo de 1 a 3 mg por
mL, teniendo en cuenta todo el bisulfito presente en la Inyeccin a valorar.]
Procedimiento-A tres matraces Erlenmeyer de 50 mL con tapones de vidrio, transferir sendas alcuotas de 20,0 mL de la
Preparacin Estndar, de la Preparacin de Valoracin y de la solucin de bisulfito de sodio (1 en 500) para proporcionar el blan-
co. A cada matraz, agregar 200 L de Solucin Ferro-Ctrica y 2,0 mL de Solucin Amortiguadora, mezclar y dejar las soluciones
en reposo durante 30 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones en celdas de 5 cm a la longitud de onda de m-
xima absorcin, aproximadamente a 530 nm, con un espectrofotmetro apropiado, utilizando el blanco para ajustar el instru-
mento. Calcular la cantidad, en mg, de epinefrina (C9 H13 N0 3) en cada mL de Inyeccin, por la frmula:

(183,21 /333,30)(0,05C/V)(Au/As)

en donde 183,21 y 333,30 son los pesos moleculares de epinefrina y bitartrato de epinefrina, respectivamente; Ces la concen-
tracin, en g por mL, de ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparacin Estndar; y V es el volumen tomado, en mL, de
Inyeccin.

(401) GRASAS Y ACEITES FIJOS

Las siguientes definiciones y procedimientos generales se aplican a grasas, aceites fijos, ceras, resinas, blsamos y sustancias
similares.

PREPARACIN DE LA MUESTRA
Si la muestra de aceite se presenta turbia debido a la presencia de estearina, entibiar el recipiente en un bao de agua a 50
hasta que el aceite quede transparente; si el aceite no se clarifica al entibiarlo, filtrarlo a travs de un papel de filtro seco en un
embudo dentro de una camisa de agua caliente. Mezclar minuciosamente y pesar de una vez tantas porciones como sean ne-
cesarias para las distintas determinaciones, empleando preferiblemente una botella que tenga una pipeta gotero o una bureta
de pesaje. Si la muestra se solidifica a temperatura ambiente, mantenerla fundida hasta que se hayan tomado las porciones
necesarias.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 325

PESO ESPECFICO
Determinar el peso especfico de una grasa o aceite segn se indica en Peso Especfico (841 ).

TEMPERATURA DE FUSIN
Determinar la temperatura de fusin segn se indica para las sustancias de Clase 11 (ver Intervalo o Temperatura de Fusin
(741)).

NDICE DE ACIDEZ (CIDOS GRASOS LIBRES)

La acidez de las grasas y los aceites fijos en esta farmacopea pueden expresarse como el nmero de mL de lcali O, 1 N re-
querido para neutralizar los cidos libres en 10,0 g de sustancia. La acidez se expresa frecuentemente como el ndice de Aci-
dez, que es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesario para neutralizar los cidos libres en 1,0 g de la sustancia. A
menos que se indique algo diferente en la monografa individual, usar el Mtodo l.

Mtodo 1

Procedimiento-A menos que se especifique algo diferente, disolver aproximadamente 10,0 g de la sustancia, pesados con
exactitud, en 50 mL de una mezcla de volmenes iguales de alcohol y ter (que se haya neutralizado a la fenolftalena con
hidrxido de potasio O, 1 N o hidrxido de sodio O, 1 N, a menos que se especifique algo diferente) contenidos en un matraz.
Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente fro, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lenta-
mente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agregar 1 mL de fenolftalena SR y valorar con hidrxido de
potasio O, 1 N SV o hidrxido de sodio O, 1 N SV hasta que la solucin permanezca de color ligeramente rosado despus de
agitar durante 30 segundos. Calcular el ndice de Acidez o el volumen de lcali O, 1 N requerido para neutralizar 10,0 g de
muestra (cidos grasos libres), segn corresponda. Calcular el ndice de Acidez:

Resultado= (M, x \/) x (NIW)

M, = peso molecular del hidrxido de potasio, 56, 11

V= volumen (mL)
N = normalidad de la solucin de hidrxido de potasio o la solucin de hidrxido de sodio
W = peso de la muestra tomada (g)
Si el volumen de hidrxido de potasio O, 1 N SV o hidrxido de sodio O, 1 N SV requerido para la volumetra es menos de 2
mL, puede utilizarse una solucin volumtrica ms diluida o ajustar el tamao de la muestra de acuerdo con las necesidades.
Los resultados pueden expresarse en trminos del volumen de solucin volumtrica utilizado o en trminos del volumen equi-
valente de hidrxido de potasio O, 1 N o hidrxido de sodio O, 1 N.
Si se ha saturado el aceite con dixido de carbono para preservarlo, someter la solucin de alcohol-ter a reflujo suavemente
durante 1O minutos antes de la volumetra. Tambin se puede eliminar el dixido de carbono del aceite, exponindolo al vaco
durante 24 horas dentro de una cpsula de poca profundidad en un desecador, antes de pesar las muestras de prueba.

Mtodo 11

Procedimiento-Preparar 125 mL de una mezcla de disolventes que contenga volmenes iguales de alcohol isoproplico y
tolueno. Antes de su uso, agregar 2 mL de una solucin de fenolftalena al 1% en alcohol isoproplico a la mezla de 125 mL y
neutralizar con lcali hasta que se produzca un color rosado leve pero permanente. Pesar con exactitud la cantidad adecuada
de una muestra lquida bien mezclada, indicada en la Tabla 7 y disolverla en la mezcla de disolventes neutralizada. Si la mues-
tra de prueba no se disuelve en el disolvente fro, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lentamente, agi-
tando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agitar vigorosamente mientras se valora con hidrxido de potasio O, 1
N SV o hidrxido de sodio O, 1 N SV hasta que se produzca el primer color rosado permanente, de la misma intensidad que la
del disolvente neutralizado antes de mezclar con la muestra. Calcular el ndice de Acidez segn se indica en el Mtodo l.
Tabla 1
ndice de Acidez Peso de Muestra (g)
0-1 20
1-4 10
4-15 2,5
15-74,9 0,5
d5,0 0,1
326 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qumicas USP 39

NDICE DE ESTERIFICACIN

El ndice de Esterificacin es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesario para saponificar los steres en 1,0 g de la
sustancia. Si se han determinado el ndice de Saponificacin y el ndice de Acidez, la diferencia entre stos dos representa el
ndice de Esterificacin, es decir, ndice de Esterificacin = ndice de Saponificacin - ndice de Acidez.
Procedimiento-Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 ml, agregar 20-30
ml de alcohol neutralizado y agitar. Agregar 1 ml de fenolftalena SR y valorar con hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N SV
hasta que se neutralice el cido libre. Agregar 25,0 ml de hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N SV y proceder segn se indica
en ndice de Saponificacin, comenzando donde dice "Calentar el matraz", pero omitiendo la adicin posterior de fenolftalena
SR. Calcular el ndice de Esterificacin:
Resultado= [M, x (V8 - Vr) x N]!W

M, = peso molecular del hidrxido de potasio, 56, 11

V8 =volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (ml)
Vr =volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba real (ml)
N = normalidad exacta del cido clorhdrico
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)

NDICE DE HIDROXILO

El ndice de Hidroxilo es el nmero de mg de hidrxido de potasio equivalente al contenido de hidroxilo de 1,0 g de la

sustancia.
Reactivo de Piridina-Anhdrido Actico-Antes de usar, mezclar 3 volmenes de piridina recientemente abierta o recin
destilada con 1 volumen de anhdrido actico recin abierto o recin destilado.
Procedimiento-Transferir una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud y ajustada a la Tabla 2, a un matraz Erlenme-
yer de 250 ml con tapn de vidrio y agregar 5,0 ml de Reactivo Piridina-Anhdrido Actico. Transferir 5,0 ml de Reactivo Piridi-
na-Anhdrido Actico a un segundo matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapn de vidrio para proporcionar el blanco del reactivo.
Equipar ambos matraces con condensadores de reflujo con juntas de vidrio adecuadas, calentar en un bao de vapor durante
1 hora, agregar 1O ml de agua a travs de cada condensador y calentar en el bao de vapor durante 1O minutos adicionales.
Enfriar y agregar 25 ml de alcohol butlico previamente neutralizado a la fenolftalena SR con hidrxido de potasio alcohlico
0,5 N a cada matraz, vertiendo 15 ml a travs de cada condensador y lavando las paredes de cada matraz con las porciones
de 1O ml restantes despus de retirar los condensadores. Agregar 1 ml de fenolftalena SR a cada matraz y valorar con hidr-
xido de potasio alcohlico 0,5 N SV, registrando el volumen, en ml, consumido por el cido residual en la solucin de prueba
como Ty el consumido por el blanco como B. En un matraz Erlenmeyer de 125 ml, mezclar aproximadamente 1Og de la
sustancia, pesada con exactitud, con 1O ml de piridina recin destilada y previamente neutralizada a la fenolftalena SR, agre-
gar 1 ml de fenolftalena SR y valorar con hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N SV, registrando el volumen, en ml, consumi-
do por el cido libre en la muestra de prueba como A. Calcular el ndice de Hidroxilo:
Resultado= [(M, x N)!W] x {B + [(W x A)/q - 7}

M, = peso molecular del hidrxido de potasio, 56, 11

N = normalidad exacta del hidrxido de potasio alcohlico
W = peso de la sustancia tomada para la acetilacin (g)
e= peso de la sustancia tomada para la determinacin de cido libre (g)
Si se conoce el ndice de Acidez para la sustancia de prueba, calcular el ndice de Hidroxilo:
Resultado= [(M, x N)!W] x (B - T) + ndice de Acidez

M, = peso molecular del hidrxido de potasio, 56, 11

N = normalidad exacta del hidrxido de potasio alcohlico
W = peso de la sustancia tomada para la acetilacin (g)
Tabla 2
Intervalo del ndice Peso de la Muestra de Prueba
de Hidroxilo (g)
0-20 10
20-50 5
50-100 3
100-150 2
150-200 1,5
200-250 1,25
250-300 1,0
USP 39 Pruebas Qumicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 327

Tabla 2 (Continuacin)
Intervalo del ndice Peso de la Muestra de Prueba
de Hidroxilo (g)
300-350 0,75

NDICE DE YODO
El ndice de Yodo representa el nmero de g de yodo absorbido, en las condiciones prescritas, por 100 g de la sustancia. A
menos que se especifique de otro modo en la monografa individual, determinar el ndice de Yodo mediante el Mtodo l.

Mtodo 1 (Mtodo de Hanus)

Procedimiento-Transferir una cantidad de la muestra pesada con exactitud, segn se determina en la Tabla 3, a un ma-
traz para yodo de 250 mL, disolver en 1O mL de cloroformo, agregar 25,0 mL de yodobromuro SR, tapar el vaso en forma
segura y dejar en reposo durante 30 minutos, protegido de la luz, agitando ocasionalmente. Luego agregar, en este orden, 30
mL de yoduro de potasio SR y 100 mL de agua, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agitando minuciosa-
mente despus de cada adicin de tiosulfato. Cuando el color del yodo se torne muy plido, agregar 3 mL de almidn SR y
continuar la valoracin con tiosulfato de sodio 0, 1 N SV hasta que el color azul desaparezca. Realizar una prueba blanco al
mismo tiempo con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetra (541 ), Valoraciones Resi-
duales). Calcular el ndice de Yodo:

Resultado = [A, x (V8 - V5) x N]/(l O x W)

A,= peso atmico del yodo, 126,90

V8 =volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N SV consumido por la prueba del blanco (mL)
V5 =volumen de tiosulfato de sodio 0, 1 N SV consumido por la prueba real (mL)
N = normalidad exacta del tiosulfato de sodio SV
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
NOTA-Si la porcin de sustancia tomada absorbe ms de la mitad del yodobromuro SR, repetir la determinacin emplean-
do una porcin ms pequea de la sustancia en anlisis.
Tabla 3. Peso de las Muestras
ndice de Peso (g)
Yodo Esperado 0,1
<5 3,0
5-20 1,0
21-50 0,4
51-100 0,2
101-150 o, 13
151-200 0,1

Mtodo 11

Solucin de Yoduro de Potasio-Disolver 10,0 g de yoduro de potasio en agua para obtener 100 mL. Almacenar en reci-
pientes resistentes a la luz.
Solucin Indicadora de Almidn-Mezclar 1 g de almidn soluble con suficiente agua fra para obtener una pasta fina.
Agregar, mezclando, a 100 mL de agua hirviendo. Mezclar y enfriar. Emplear slo la solucin transparente.
Procedimiento-Fundir la muestra si no estuviera lquida todava. [NOTA-La temperatura durante la fusin debe exceder
el punto de fusin de la muestra en no ms de 1O.] Pasar a travs de dos trozos de papel de filtro para eliminar cualquier
impureza slida y los ltimos restos de humedad. El filtrado puede realizarse en un horno de aire a 100 pero debe completar-
se dentro de los 5 minutos 30 segundos. La muestra debe estar absolutamente seca. Todo el material de vidrio debe estar
absolutamente limpio y completamente seco. Despus del filtrado, dejar que la muestra filtrada alcance una temperatura de
68-71 1antes de pesar la muestra. Una vez que la muestra alcance una temperatura de 68-71 1, pesar inmediatamente
la muestra en un matraz para yodo de 500 mL, ajustndose a los pesos y la exactitud de pesada de la tabla adjunta. [NOTA-El
peso de la sustancia debe ser tal que se produzca un exceso de yodocloruro SR de 50-60% de la cantidad agregada, es decir,
del 100-150% de la cantidad absorbida.] Agregar 15 mL de una mezcla recin preparada de ciclohexano y cido actico gla-
cial (1 :1) y agitar por rotacin suave hasta disolver la muestra. Agregar 25,0 mL de yodocloruro SR, tapar el matraz de forma
segura y agitar por rotacin suave para mezclar. Dejar en reposo a 25 5, protegido de la luz, agitando ocasionalmente, du-
rante 1,0 2,0 horas, dependiendo del ndice de Yodo (IV) de la muestra: IV< 150, 1,0 hora; IV 2 150, 2,0 horas. Luego, den-
tro de los 3 minutos despus del tiempo de reaccin indicado, agregar en este orden, 20 mL de Solucin de Yoduro de Potasio y
150 mL de agua recin hervida y enfriada, y mezclar. Dentro de los 30 minutos, valorar el yodo liberado con tiosulfato de
328 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qumicas USP 39

sodio O, 1 N SV mientras se mezcla mecnicamente despus de cada adicin de tiosulfato. Cuando el color amarillo del yodo
haya desparecido casi por completo, agregar 1-2 m L de Solucin Indicadora de Almidn y continuar la valoracin con tiosulfato
de sodio O, 1 N SV hasta que desaparezca el color azul. Realizar una prueba blanco al mismo tiempo, con las mismas cantida-
des de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetra (541) Valoraciones Residuales). Calcular el ndice de Yodo,
segn se indica en Mtodo /.

NDICE DE PERXIDO

El ndice de Perxido es el nmero que expresa, en miliequivalentes de oxgeno activo, la cantidad de perxido contenido
en 1000 g de la sustancia. [NOTA-Esta prueba debe realizarse inmediatamente despus de tomar la muestra para evitar la oxi-
dacin de la muestra de prueba.]
Procedimiento-A menos que se indique algo diferente, colocar aproximadamente 5 g de la sustancia, pesada con exacti-
tud, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapn de vidrio esmerilado. Agregar 30 ml de una mezcla de cido actico
glacial y cloroformo (3:2), agitar hasta disolver y agregar 0,5 ml de solucin de yoduro de potasio saturada. Agitar durante 1
minuto exactamente y agregar 30 ml de agua. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV, agregando lentamente la solucin
volumtrica y agitando continuamente, hasta que el color amarillo desaparezca casi por completo. Agregar 5 ml de almidn
SR y continuar la valoracin, agitando enrgicamente, hasta que desaparezca el color azul. Realizar una determinacin con un
blanco en las mismas condiciones. [NOTA-El volumen de solucin volumtrica empleada en la determinacin con el blanco
no debe exceder O, 1 ml.] Calcular el ndice de Perxido:

Resultado= [1000 (Vr - Va) x N]!W

Vr= volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba real (ml)

Va= volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba del blanco (ml)
N = normalidad exacta de la solucin de tiosulfato de sodio
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)

NDICE DE SAPONIFICACIN

El ndice de Saponificacin es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesario para neutralizar los cidos libres y saponi-
ficar los steres existentes en 1,0 g de la sustancia.
Procedimiento-Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 ml y agregar 25,0
ml de hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N. Calentar el matraz en un bao de vapor, bajo un condensador adecuado para
mantener el reflujo durante 30 minutos, rotando el contenido con frecuencia. [NOTA-El tiempo de reflujo puede ser de hasta
90 minutos para asegurar la saponificacin completa, dependiendo del tipo de ster a analizar.] Agregar a continuacin 1 ml
de fenolftalena SR y valorar el exceso de hidrxido de potasio con cido clorhdrico 0,5 N SV. Realizar una determinacin con
un blanco en las mismas condiciones (ver Volumetra (541 ), Valoraciones Residuales). La valoracin tambin puede realizarse
potenciomtricamente. Calcular el ndice de Saponificacin:
Resultado= [M, x (Va - Vr) x N]/W

M, = peso molecular del hidrxido de potasio, 56, 11

Va= volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (ml)
Vr =volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba real (ml)
N = normalidad exacta del cido clorhdrico
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
Si el aceite se ha saturado con dixido de carbono con el propsito de conservarlo, dejarlo en una cpsula poco profunda en
un desecador de vaco durante 24 horas antes de pesar las muestras de prueba.

MATERIA INSAPONIFICABLE

El trmino "materia insaponificable" en aceites o grasas, se refiere a aquellas sustancias que no son saponificables por medio
de hidrxidos alcalinos, pero que son solubles en disolventes de grasas ordinarios, y a los productos de saponificacin que son
solubles en dichos disolventes.
Procedimiento-Transferir aproximadamente 5,0 g del aceite o grasa, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de
250 ml, agregar 50 ml de una solucin de hidrxido de potasio alcohlico preparada disolviendo 12 g de hidrxido de pota-
sio en 1O ml de agua y diluyendo esta solucin con alcohol hasta 100 ml, y calentar el matraz en un bao de vapor bajo un
condensador adecuado para mantener el reflujo durante 1 hora, agitando frecuentemente por rotacin suave. Enfriar a una
temperatura inferior a 25 y transferir el contenido del matraz a un separador con una llave de paso de tefln, enjuagando el
matraz con dos porciones de 50 ml de agua que se agregan al separador (no usar grasa en la llave de paso). Extraer con tres
porciones de 100 ml de ter, combinando los extractos de ter en otro separador que contenga 40 ml de agua. Rotar o agi-
tar suavemente el separador durante unos minutos. [NOTA-Si se agita con demasiada fuerza, puede formarse una emulsin
USP 39 Pruebas Qumicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 329

difcil de separar.] Dejar que la mezcla se separe y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de ter con dos porciones
adicionales de 40 mL de agua y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de ter sucesivamente con una porcin de 40
mL de solucin de hidrxido de potasio (3 en 100) y una porcin de 40 mL de agua. Repetir tres veces esta secuencia de
lavado con solucin de hidrxido de potasio y agua. Lavar el extracto de ter con porciones de 40 mL de agua hasta que el
ltimo lavado no se torne rojo con la adicin de 2 gotas de fenolftalena SR. Transferir el extracto de ter a un matraz tarado y
enjuagar el separador con 1O mL de ter, agregando los enjuagues al matraz. Evaporar el ter en un bao de vapor y agregar
6 mL de acetona al residuo. Extraer la acetona en una corriente de aire y secar el residuo a 105 hasta que las pesadas sucesi-
vas difieran en no ms de 1 mg. Calcular el porcentaje de materia insaponificable en la porcin de aceite o grasa tomada:

Resultado= 100 x (WR/W5)

WR = peso del residuo (g)

W 5 = peso del aceite o grasa tomado para la prueba (g)
Disolver el residuo en 20 mL de alcohol, neutralizado previamente en el punto final de la fenolftalena, agregar fenolftalena
SR y valorar con hidrxido de sodio alcohlico O, 1 N SV hasta la primera aparicin de un color rosado plido que permanezca
durante no menos de 30 segundos. Si el volumen requerido de hidrxido de sodio alcohlico O, 1 N es superior a 0,2 mL, la
separacin de las capas no fue completa; el residuo pesado no puede considerarse como "materia insaponificable" y debe re-
petirse la prueba.

TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIN DE CIDOS GRASOS

Preparacin de los cidos Grasos-Calentar 75 mL de solucin de glicerina-hidrxido de potasio (preparada disolviendo
25 g de hidrxido de potasio en 100 mL de glicerina) en un vaso de precipitados de 800 mL a 150 y agregar 50 mL de la
grasa clarificada, fundida si fuera necesario. Calentar la mezcla durante 15 minutos mezclando con frecuencia, pero sin permi-
tir que la temperatura sobrepase los 150. La saponificacin se considera completa cuando la mezcla es homognea, sin part-
culas que se adhieran al vaso de precipitados en el menisco. Verter el contenido del vaso de precipitados en 500 mL de agua
prxima a su punto de ebullicin, en una cpsula con mango o un vaso de precipitados de 800 mL, agregar lentamente 50
mL de cido sulfrico diluido [preparado agregando agua y cido sulfrico (3: 1 )] y calentar la solucin, mezclando con fre-
cuencia, hasta que los cidos grasos se separen claramente, formando una capa transparente. Lavar los cidos con agua hir-
viendo hasta que queden libres de cido sulfrico, recogerlos en un vaso de precipitados pequeo, colocar en un bao de
vapor hasta que el agua se haya sedimentado y los cidos grasos se vuelvan transparentes, filtrar en un vaso de precipitados
seco mientras est caliente y secar a 105 durante 20 minutos. Colocar los cidos grasos an calientes en un recipiente adecua-
do y enfriar en un bao de hielo hasta que se solidifiquen.
Prueba de Saponificacin Completa-Colocar 3 mL de los cidos secos en un tubo de ensayo y agregar 15 mL de alcohol.
Calentar la solucin a ebullicin y agregar un volumen igual de hidrxido de amonio 6 N. Se obtiene una solucin transparen-
te.
Procedimiento-Empleando un aparato similar al Aparato de Temperatura de Solidificacin especificado en el captulo Tem-
peratura de Solidificacin (651 ), proceder segn se indica en Procedimiento, leyendo "temperatura de solidificacin" por "punto
de solidificacin" (los trminos son sinnimos). El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas del punto ms alto al
que llega la temperatura es la temperatura de solidificacin de los cidos grasos.

COMPOSICIN DE CIDOS GRASOS

Solucin Estndar-Preparar una mezcla de ster de composicin conocida que contenga los steres requeridos en la mo-
nografa individual. Esta Solucin Estndar puede contener otros componentes. [NOTA-Las mezclas de steres estn disponi-
bles comercialmente en Nu-Chek-Prep, lnc., PO Box 295, Elysian, MN 56028. Las mezclas de steres habituales que son tiles
para esta prueba incluyen Nu-Chek 17A y Nu-Chek 19A.] La mezcla Nu-Chek 17A tiene la siguiente composicin:
Tabla4
Longitud de la Cadena N de
Porcentaje ster de cido Graso de Carbono Enlaces Dobles
1,0 Miristato de metilo 14 o
4,0 Palmitato de metilo 16 o
3,0 Estearato de metilo 18 o
3,0 Araquidato de metilo 20 o
3,0 Behenato de metilo 22 o
3,0 Lignocerato de metilo 24 o
45,0 Oleato de metilo 18 1
15,0 Linoleato de metilo 18 2
3,0 Linolenato de metilo 18 3
20,0 Erucato de metilo 22 1
 330 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qumicas USP 39

La mezcla Nu-Chek 19A tiene la siguiente composicin:

Tabla 5
Longitud de la Cadena N de
Porcentaje ster de cido Graso de Carbono Enlaces Dobles
7,0 Caprilato de metilo 8 o
5,0 Caprato de metilo 10 o
48,0 Laurato de metilo 12 o
15,0 Miristato de metilo 14 o
7,0 Palmitato de metilo 16 o
3,0 Estearato de metilo 18 o
12,0 O/eato de metilo 18 1
3,0 Linoleato de metilo 18 2

Solucin de Hidrxido de Sodio Metanlico 0,5 N-Disolver 2 g de hidrxido de sodio en 100 mL de metano!.
Solucin de Prueba-[NOTA-Si en la muestra de prueba hay cidos grasos que contengan ms de 2 enlaces dobles, ex-
traer el aire del matraz purgndolo con nitrgeno durante unos minutos.] Transferir aproximadamente 100 mg de la muestra
de prueba a un matraz Erlenmeyer de 50 mL equipado con un condensador de reflujo adecuado enfriado con agua y una
barra mezcladora magntica. Agregar 4 mL de Solucin de Hidrxido de Sodio Metanlico 0,5 N y someter a reflujo hasta que
desaparezcan los glbulos de grasa (generalmente 5-1 O minutos). Agregar 5 mL de una solucin preparada disolviendo 14 g
de trifluoruro de boro en metano! para obtener 100 mL, agitar por rotacin suave para mezclar y someter a reflujo durante 2
minutos. Agregar 4 mL de n-heptano cromatogrfico, a travs del condensador y someter a reflujo durante 1 minuto. Enfriar,
retirar el condensador, agregar aproximadamente 15 mL de solucin de cloruro de sodio saturada, agitar y dejar que las capas
se separen. Pasar la capa de n-heptano a travs de O, 1 g de sulfato de sodio anhidro (lavado previamente con n-heptano cro-
matogrfico) a un matraz apropiado. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 10 mL, diluir con n-hepta-
no cromatogrfico a volumen y mezclar.
Solucin de Aptitud del Sistema-Transferir aproximadamente 20 mg de cido esterico, de cido palmtico y de cido
oleico a un matraz Erlenmeyer de 25 mL equipado con un condensador a reflujo enfriado por agua adecuado y una barra mez-
cladora magntica, y proceder segn se indica para la Solucin de Prueba, empezando donde dice "Agregar 5,0 mL de una
solucin preparada disolviendo".
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 >)-Equipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la
llama, mantenido a una temperatura de aproximadamente 260, un sistema de inyeccin no dividido y una columna capilar
de slice fundida de 0,53 mm x 30 m, ligada con una capa de fase Gl 6 de 1,0 m. Programar el cromatgrafo para que man-
tenga una temperatura de columna de 70 durante aproximadamente 2 minutos despus de la inyeccin, luego para que au-
mente la temperatura a una velocidad de 5 /min hasta 240 y finalmente para que mantenga esta temperatura durante 5 mi-
nutos. Mantener la temperatura del inyector aproximadamente a 220. El gas transportador es helio con una velocidad lineal
de aproximadamente 50 cm/s.
Cromatografiar la Solucin de Aptitud del Sistema y registrar las respuestas de los picos segn se indica en Procedimiento: los
tiempos de retencin relativos son aproximadamente 0,87 para el palmitato de metilo, 0,99 para el estearato de metilo y 1,0
para el oleato de metilo; la resolucin, R, entre el estearato de metilo y el oleato de metilo es no menos de 1,5; y la desviacin
estndar relativa de las respuestas de las reas de los picos de palmitato y estearato en inyecciones repetidas es no ms de
6,0%. La desviacin estndar relativa del cociente entre las respuestas de los picos del palmitato y del estearato en inyecciones
repetidas es no ms de 1,0%.
Procedimiento-Inyectar por separado volmenes iguales (aproximadamente 1 L) de la Solucin Estndar y la Solucin de
Prueba en el cromatgrafo, registrar los cromatogramas, identificar los picos de ster de los cidos grasos en el cromatograma
de la Solucin de Prueba, comparando los tiempos de retencin de estos picos con los del cromatograma de la Solucin Estn-
dar y medir las reas de los picos para todos los picos de ster de los cidos grasos en el cromatograma de la Solucin de Prue-
ba. Calcular el porcentaje de cada componente de cido graso en la muestra de prueba:
Resultado= 100 x (AIB)
A = rea de la respuesta de los picos obtenidos para cada componente de ster de cido graso individual
B = suma de las reas de todos los picos, excluido el pico del disolvente, en el cromatograma de la Solucin de Prueba

DETERMINACIN V PERFIL DE CIDOS GRASOS OMEGA-3

El siguiente procedimiento se puede usar para la determinacin de cido eicosapentaenoico (EPA) (C20:5 n-3), cido doco-
sahexaenoico (DHA) (C22:6 n-3) y cidos omega-3 totales que se obtienen de peces, plantas o fuentes microbianas en aceites
a granel y aceite encapsulado, ya sea como triglicridos o como steres etlicos. El trmino "triglicrido" es aplicable a aceites
de algas, aceites de pescado, aceites de hgado de pescado y productos que contienen cidos omega-3 en forma de triglicri-
dos. Los resultados se expresan como cidos grasos libres o steres etlicos. Realizar las pruebas lo ms rpidamente posible.
Proteger las soluciones de la luz actnica, agentes oxidantes, catalizadores de oxidacin y aire.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 331

Contenido de EPA y DHA

Estndares de Referencia USP (11)

ER ster Etlico del cido Docosahexaenoico USP
ER ster Etlico del cido Eicosapentaenoico USP
ER Tricosanoato de Metilo USP
Solucin Antioxidante-Disolver una cantidad, pesada con exactitud, de butil hidroxitolueno en 2,2,4-trimetilpentano pa-
ra obtener una solucin con una concentracin de 0,05 mg por ml.
Solucin de Estndar Interno-Transferir una cantidad de ER Tricosanoato de Metilo USP, pesada con exactitud, a un ma-
traz volumtrico. Disolver en Solucin Antioxidante y diluir con el mismo disolvente hasta obtener una solucin con una con-
centracin de aproximadamente 7,0 mg/ml. [NOTA-Proteger la solucin de la evaporacin durante su uso.]
Tabla6
Cantidad de Muestra
Suma Aproximada a Pesar
EPA+ DHA (g)
30%-50% 0,4-0,5
50%-70% 0,3
>70% 0,25

Solucin de Prueba 1 (para triglicridos)-En un matraz volumtrico de 1O mL, disolver la masa de la muestra a examinar,
de acuerdo con la Tabla 6, en Solucin Antioxidante y diluir con la misma solucin a volumen. Transferir 2,0 mL de esta solu-
cin a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrgeno. Agregar 1,5 mL de una solucin de
hidrxido de sodio en metanol al 2% (p/v), tapar hermticamente con una tapa con recubrimiento interno de politetrafluoroe-
tileno, mezclar y calentar en un bao de agua hirviendo durante 7 minutos. Enfriar, agregar 2 mL de solucin de tricloruro de
boro-metanol (120 g en 1000 mL de metanol), cubrir con nitrgeno, tapar hermticamente, mezclar y calentar en un bao de
agua hirviendo durante 30 minutos. Enfriar a una temperatura de 40-50, agregar 1,0 mL de 2,2,4-trimetilpentano, tapar y
mezclar en un mezclador de vrtice o agitar vigorosamente durante al menos 30 segundos. Agregar inmediatamente 5 mL de
solucin saturada de cloruro de sodio que contenga 1 volumen de cloruro de sodio y 2 volmenes de agua. [NOTA-Agitar de
vez en cuando. Antes de usar, decantar la solucin de cualquier sustancia no disuelta y filtrar si fuera necesario.] Cubrir con
nitrgeno, tapar y mezclar en un mezclador de vrtice o agitar minuciosamente durante al menos 15 segundos. Dejar que la
capa superior se torne transparente y transferir a otro tubo. Agitar la capa de metanol una vez ms con 1,0 mL de 2,2,4-trime-
tilpentano y combinar los extractos de 2,2,4-trimetilpentano. Lavar los extractos combinados dos veces, cada una con 1 mL de
agua, y secar sobre sulfato de sodio anhidro.
Solucin de Prueba 2 (para triglicridos)-Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solucin
de Prueba 7 a un matraz volumtrico de 1O mL, disolver y diluir con Solucin de Estndar Interno a volumen. Puede aplicarse
calor suave (hasta un mximo de 60) para obtener una solucin transparente. Despus, proceder segn se indica en Solucin
de Prueba 7, comenzando donde dice "Transferir 2,0 mL".
Solucin de Prueba 3 (para steres etlicos)-En un matraz volumtrico de 1O mL, disolver la masa de la muestra a exami-
nar, ajustndose a la Tabla 6, en Solucin de Estndar Interno y diluir con la misma solucin a volumen. Puede aplicarse calor
suave (hasta un mximo de 60) para obtener una solucin transparente.
Solucin de Prueba 4 (para steres etlicos)-Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solu-
cin de Prueba 3 a un matraz volumtrico de 1O mL, disolver y diluir con Solucin Antioxidante a volumen.
Solucin Estndar 1a-Transferir 60 mg de ER ster Etlico del cido Docosahexaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumtrico de 1O mL, disolver y diluir con Solucin de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta
un mximo de 60) para obtener una solucin transparente.
Solucin Estndar 1b-Transferir 90 mg de ER ster Etlico del cido Eicosapentaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumtrico de 1O mL, disolver y diluir con Solucin de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta
un mximo de 60) para obtener una solucin transparente.
La Solucin Estndar 7a y la Solucin Estndar 7b estn listas para el anlisis de steres etlicos. Para el anlisis de triglicridos,
continuar con la Solucin Estndar 2a y la Solucin Estndar 2b.
Solucin Estndar 2a-Transferir 2,0 mL de Solucin Estndar 7a a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una co-
rriente suave de nitrgeno. Despus, proceder segn se indica en Solucin de Prueba 7, comenzando donde dice, "Agregar 1,5
mL".
Solucin Estndar 2b-Transferir 2,0 mL de Solucin Estndar 7b a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una co-
rriente suave de nitrgeno. Despus, proceder segn se indica en Solucin de Prueba 7, comenzando donde dice, "Agregar 1,5
mL".
Solucin de Aptitud del Sistema 1-Transferir 0,300 g de palmitato de metilo, 0,300 g de estearato de metilo, 0,300 g de
araquidato de metilo y 0,300 g de behenato de metilo, pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de 1O mL, disolver y
diluir con Solucin Antioxidante a volumen.
Solucin de Aptitud del Sistema 2-[NOTA-Esta solucin debe prepararse slo para triglicridos y slo si el ster metlico
del cido tetracos-15-enoico no se observa claramente en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 2.] Transferir
332 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qumicas USP 39

55,0 mg de ster metlico del cido docosahexaenoico y aproximadamente 5,0 mg de ster metlico del cido tetracos-15-
-enoico (cido nervnico), pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de 1 O ml, disolver y diluir con Solucin Antioxidan-
te a volumen.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografa de gases
Detector: Ionizacin a la llama
Columna: Capilar de slice fundida, de 0,25 mm x 25 m; ligada con una pelcula de fase Gl 6 de 0,20 m
Temperaturas
Inyector
Inyeccin dividida: 250
Inyeccin no dividida: 90-250
Detector: 270
Columna: Ver la Tabla la o la Tabla lb.
Tabla 7a (Inyeccin Dividida)
Tiempo de
Tiempo de Espera
Espera (Hold Time)
(Hold ala
Temperatura Time) Rampa de Temperatura Temperatura
Inicial a 170 Temperatura Final Final
() (min) (/min) () (min)
170 2 3 240 2,5

Tabla 7b (Inyeccin no Dividida)

Tiempo de
Espera
Tiempo de (Hold
Espera Hasta Time)
(Hold Rampa de Hasta Rampa de Temperatu- ala
Temperatura Time) Temperatura Temperatu- Temperatura ra Temperatura
Inicial a 90 Nmero 1 ra Nmero 2 Final Final
() (min) (/min) () (/min) () (min)
90 2 30 170 3 240 2

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 1 ml/min
Relacin de particin del flujo: 200:1. [NOTA-Si fuera necesario, ajustar la relacin de particin y/o la dilucin de la
muestra para obtener un factor de asimetra de 0,8-1,5 para los picos de los steres metlicos de cidos grasos en la Solucin de
Aptitud del Sistema 7, los picos de ster metlico o ster etlico del cido eicosapentaenoico y cido docosahexaenoico en la
Solucin de Prueba 7 y Solucin de Prueba 4, observando al mismo tiempo que para la Solucin de Prueba 7 o Solucin de Prueba
4 los picos debidos a los steres correspondientes de Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3 y C22:5 n-3 son claramente
detectables. Si se utiliza la modalidad de inyeccin no dividida, las soluciones deben diluirse adicionalmente 1 en 200 con
Solucin Antioxidante.]
Volumen de inyeccin: 1 L
Aptitud del sistema (para triglicridos)
Muestras: Solucin de Aptitud del Sistema 7 y Solucin de Prueba 2 o Solucin de Aptitud del Sistema 2 (si es aplicable)
Aptitud del sistema (para steres etlicos)
Muestra: Solucin de Aptitud del Sistema 7
Requisitos de aptitud del sistema
Porcentajes de rea tericos (Solucin de Aptitud del Sistema 7): Los porcentajes de las reas, despus de ajustar por el peso
real, de los picos de palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de metilo, deben estar cada
uno dentro de 1,0% (absoluto) de los valores tericos provistos en la Tabla 8.
Tabla 8
rea Terica(%) en una Solucin de Pesos Iguales de Palmitato de
ster Metlico del Metilo, Estearato de Metilo, Araquidato de Metilo y Behenato de Me-
cido Graso tilo
Palmitato de metilo 24,37
Estearato de metilo 24,84
Araquidato de metilo 25,23
Behenato de metilo 25,56
USP 39 Pruebas Qumicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 333

[NOTA-El rea terica (%)en una solucin de pesos iguales (Tabla 8) se deriva de los factores de respuesta terica calculados,
que son 1,049; 1,029; 1,013 y 1,000 para palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de meti-
lo, respectivamente.]
Resolucin: Para triglicridos (Solucin de Prueba 2 o Solucin de Aptitud del Sistema 2): No menos de 1,2 entre los picos de
ster metlico del cido docosahexaenoico y ster metlico del cido tetracos-15-enoico
Analisis (para triglicridos)
Muestras: Solucin Estndar 2a, Solucin Estndar 2b, Solucin de Prueba 1 y Solucin de Prueba 2
Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatogrfico de la Solucin de
Prueba 2 con el de la Solucin de Prueba 1 e identificar el pico del estndar interno presente en la Solucin de Prueba 2. Calcular
el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de triglicridos tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (W5/Wu) x F x 100
Ru = cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estndar interno en el croma-
tograma de la Solucin de Prueba 2, calculado:
Resultado= 1J[(rU2/rri) - (ru 11rn)]
[NOTA-Si ru 1 = O debido a que no se observan picos en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de
Prueba 1, entonces Ru = rr21rU2.]
ru2 = respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 2
rr2 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solucin de Prueba 2
ru 1 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 7
rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solucin de Prueba 1
R5 = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de
la Solucin Estndar 2a o la Solucin Estndar 2b
W5 = peso del DHA tomado para preparar la Solucin Estndar 1a o peso del EPA tomado para preparar la Solucin Estn-
dar 7b (mg)
Wu = peso de la muestra tomada para preparar la Solucin de Prueba 2 (mg)
F =factor para expresar el contenido de DHA como cidos grasos libres, 0,921; y factor para expresar el contenido de EPA
como cidos grasos libres, O, 915
Anlisis (para steres etlicos)
Muestras: Solucin Estndar 7a, Solucin Estndar 1b, Solucin de Prueba 3 y Solucin de Prueba 4
Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatogrfico de la Solucin de
Prueba 3 con el de la Solucin de Prueba 4 e identificar el pico del estndar interno presente en la Solucin de Prueba 3. Calcular
el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de steres etlicos tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (W5/Wu) x 100
Ru = cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estndar interno en el croma-
tograma de la Solucin de Prueba 3, calculada segn se indica a continuacin:
Resultado= 1 /[(rU3/rn) - (ru 4 f rr4)]
[NOTA-Si ru4 = O debido a que no se observan picos en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de
Prueba 4, entonces Ru = rnf ru 3 .]
ru 3 = respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 3
rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solucin de Prueba 3
ru4 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 4
rr4 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solucin de Prueba 4
R5 = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de
la Solucin Estndar 7a o Solucin Estndar 7b
W5 = peso del DHA tomado para preparar la Solucin Estndar 7a o peso del EPA tomado para preparar la Solucin Estn-
dar 7b (mg)
Wu =peso de la muestra tomada para preparar la Solucin de Prueba 3 (mg)

Contenido de cidos Omega-3 Totales (para triglicridos)

Calcular el porcentaje de los cidos omega-3 totales en la porcin de muestra de triglicridos tomada:
Resultado= EPA+ DHA + [(An_ 3 x (EPA+ DHA)/(AEPA + A0HJ]
EPA = contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
DHA =contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
334 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qumicas USP 39

An- 3 =suma de las reas de los picos correspondientes a los steres metlicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3
y C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 1
AEPA = rea del pico correspondiente al ster metlico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 1
AoHA = rea del pico correspondiente al ster metlico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 1

Contenido de cidos Omega-3 Totales (para steres etlicos)

Calcular el porcentaje de los cidos omega-3 totales en la porcin de muestra de steres etlicos tomada:

Resultado= EPA+ DHA + [(An- 3 x (EPA+ DHA)/(AEPA + AoHA)]

EPA= contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)

DHA = contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
An _3 =suma de las reas de los picos correspondientes a los steres etlicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3 y
C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 4
AEPA =rea del pico correspondiente al ster etlico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 4
AoHA = rea del pico correspondiente al ster etlico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 4

AGUA Y SEDIMENTOS EN ACEITES FIJOS

Aparato-La centrfuga preferida tiene un dimetro de giro (d = distancia entre los extremos de los tubos cuando stos
estn girando) de 38-43 cm y opera a una velocidad aproximada de 1500 rpm. Si se emplea una centrfuga de dimensiones
diferentes, calcular la velocidad deseada de las revoluciones:

rpm = 1500.J40,6/d

Los tubos de la centrfuga tienen forma de pera y se les puede colocar tapones. La capacidad total de cada tubo es de apro-
ximadamente 125 ml. Las graduaciones son claras y diferenciadas, y se leen hacia arriba desde el fondo del tubo, segn la
escala mostrada en la Tabla 9.
Tabla 9
Volumen Divisin de la Escala
(mL) (mL)
0-3 0,1
3-5 0,5
5-10 1,0
10-25 5,0
25-50 25,0
50-100 50,0

Procedimiento-Colocar 50,0 mL de benceno en cada uno de dos tubos de centrfuga y agregar a cada tubo 50,0 mL de
aceite, entibiado, si fuera necesario, para reincorporar la estearina separada y mezclar minuciosamente a 25. Tapar con firme-
za los tubos y agitarlos enrgicamente hasta que el contenido se mezcle minuciosamente y sumergir los tubos en un bao de
agua a 50 durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos. Leer el volumen combinado de agua y sedimento en el fon-
do de cada tubo. Centrifugar repetidamente en perodos de 1O minutos hasta que el volumen combinado de agua y sedimen-
to permanezca constante en 3 lecturas consecutivas. La suma de los volmenes de agua y sedimento combinados en los dos
tubos representa el porcentaje, en volumen, de agua y sedimento en el aceite.

NDICE DE ANISIDINA
El ndice de Anisidina se define como 100 veces la densidad ptica medida en una celda de 1 cm de una solucin que con-
tiene 1 g de la sustancia a examinar en 100 mL de una mezcla de disolventes y reactivos, segn el mtodo que se describe a
continuacin. [NOTA-Realizar las operaciones lo ms rpidamente posible, evitando la exposicin a la luz actnica.]
Solucin de Prueba A-Disolver 0,500 g de la sustancia a examinar en isooctano y diluir con el mismo disolvente hasta
25,0 ml.
Solucin de Prueba B-Agregar 1,0 mL de una solucin de 2,5 g/L de p-anisidina en cido actico glacial a 5,0 mL de la
Solucin de Prueba A, agitar y almacenar protegida de la luz.
Solucin Estndar-Agregar 1,0 mL de una solucin de 2,5 g/L de p-anisidina en cido actico glacial a 5,0 mL de isoocta-
no, agitar y almacenar protegida de la luz.
Procedimiento-Medir la absorbancia de la Solucin de Prueba A a 350 nm usando isooctano como blanco. Medir la absor-
bancia de la Solucin de Prueba B a 350 nm, exactamente 1O minutos despus de su preparacin, usando la Solucin Estndar
como el lquido de compensacin. Calcular el ndice de Anisidina a partir de la expresin:
USP 39 Pruebas Qumicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 335

Resultado= [25 x (1,2A 5 - A8)]/m

A5 = absorbancia de la Solucin de Prueba B a 350 nm

A8 = absorbancia de la Solucin de Prueba A a 350 nm
m = peso de la sustancia a analizar en la Solucin de Prueba A (g)

NDICE DE OXIDACIN TOTAL (TOTOX)

El ndice de Oxidacin Total se define:
Resultado = 2PV + AV
PV = ndice de Perxido
AV= ndice de Anisidina

TRAZAS DE METALES

Aparato

El aparato generalmente consiste en lo siguiente:

Matraces de Digestin-Usar un matraz de politetrafluoroetileno con un volumen de aproximadamente 120 ml, equipa-
do con un tapn impermeable, una vlvula para ajustar la presin en el interior del recipiente y un tubo de politetrafluoroetile-
no para permitir la liberacin de gas.
Sistema-Cerrar los matraces de forma impermeable usando la misma fuerza de torsin para cada uno de ellos.
Horno de Microondas-Tiene una frecuencia de magnetrn de 2450 MHz, con una potencia de salida seleccionable de O a
630 70 vatios en incrementos de 1%, una computadora digital programable, una cmara de microondas recubierta con poli-
tetrafluoroetileno con un ventilador para extraccin con velocidad variable, un sistema de transmisin con plato giratorio y
tubos de escape para permitir la salida de humos.
Espectrmetro de Absorcin Atmica-Equipado con una lmpara de ctodo hueco como fuente de radiacin y una lm-
para de deuterio como corrector de fondo. El sistema se equipa con lo siguiente:
1. Un horno de grafito como el dispositivo de atomizacin para cadmio, cobre, hierro, plomo, nquel y cinc.
2. Un sistema automatizado de generacin de vapores de hidruros de flujo continuo para arsnico y mercurio.

Procedimiento General

Precaucin-Cuando se usan vasos de digestin de alta presin cerrados y equipo de laboratorio de microondas, se deben seguir
las precauciones e intrucciones de operacin y seguridad suministradas por el fabricante.
[NOTA-Si se utiliza un aparato alternativo, es posible que se requiera ajustarle los parmetros.]
Limpieza-Limpiar todo el material de vidrio y el equipo de laboratorio con una solucin de 1O mg/ml de cido ntrico
antes de usarlo.
cido Ntrico Libre de Trazas de Metal-El cido ntrico cumple con los requisitos cuando los valores mximos para ars-
nico (As), cadmio (Cd), cobre (Cu), hierro (Fe), mercurio (Hg), plomo (Pb), nquel (Ni) y cinc (Zn) son iguales a 0,005; 0,005;
0,001; 0,02; 0,002; 0,001; 0,005 y 0,01 ppm, respectivamente.
cido Clorhdrico Libre de Trazas de Metal-El cido clorhdrico cumple con los requisitos cuando los valores mximos
para As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,003; 0,003; 0,05; 0,005; 0,001; 0,004 y 0,005 ppm, respectiva-
mente.
cido Sulfrico Libre de Trazas de Metal-El cido sulfrico cumple con los requisitos cuando los valores mximos para
As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,002; 0,001; 0,05; 0,005; 0,001; 0,002 y 0,005 ppm, respectivamente.
Solucin Madre de Prueba-Colocar en un matraz de digestin aproximadamente 0,5 g de aceite graso, pesados con
exactitud, segn se indica en cada monografa individual. Agregar 6 ml de cido Ntrico Libre de Trazas de Metal y 4 ml de
cido Clorhdrico Libre de Trazas de Metal. Cerrar el matraz.
Solucin Madre del Blanco-Mezclar 6 ml de cido Ntrico Libre de Trazas de Metal y 4 ml de cido Clorhdrico Libre de
Trazas de Metal en un matraz de digestin.
Solucin de Prueba 1-Colocar el matraz de digestin que contiene la Solucin Madre de Prueba en el horno de microon-
das. Llevar a cabo la digestin en tres etapas, segn el siguiente programa: 80% de potencia durante 15 minutos, 100% de
potencia durante 5 minutos y 80% de potencia durante 20 minutos.
Al final del ciclo, dejar que el matraz se enfre. Agregar 4 ml de cido Sulfrico Libre de Trazas de Metal al matraz. Repetir el
programa de digestin. Despus de completar la digestin, dejar que el matraz se enfre a temperatura ambiente. Abrir el ma-
traz de digestin y transferir la solucin transparente e incolora obtenida a un matraz volumtrico de 50 ml. Enjuagar el ma-
traz de digestin dos veces, cada una con 15 ml de agua, y recoger los enjuagues en el matraz volumtrico. Agregar 1,0 ml
de una solucin de 1O mg/ml de nitrato de magnesio y 1,0 ml de una solucin de 100 mg/ml de fosfato dicido de amonio
al matraz volumtrico. Diluir con agua a volumen y mezclar. La solucin resultante es la Solucin de Prueba 7.
336 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qumicas USP 39

Solucin Blanco 1-Colocar el matraz de digestin que contiene la Solucin Madre del Blanco en el horno de microondas.
Proceder segn se indica en Solucin de Prueba 7, comenzando donde dice "llevar a cabo la digestin en tres etapas, segn el
siguiente programa".
Calibracin Directa- [NOTA-Las concentraciones de las soluciones estndar dependern de los contenidos de metal de la
sustancia de prueba.] Para mediciones de rutina, se preparan y examinan tres soluciones estndar, la Solucin Blanco 7 y la
Solucin de Prueba 7.
Emplear la Solucin de Prueba 7 y la Solucin Blanco 7 preparadas segn se indica anteriormente o segn se indica en la mo-
nografa. Preparar no menos de 3 soluciones estndar que contengan todos los metales a analizar. El valor de absorbancia es-
perado en la Solucin de Prueba 7 para cada metal deber estar comprendido dentro del intervalo de absorbancia calibrado
correspondiente, de preferencia en la parte media de dicho intervalo. Cualquier reactivo usado en la preparacin de la Solucin
de Prueba 7 se agrega en la misma concentracin en las soluciones estndar.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento usando el mismo nmero de repeticiones para cada una de las solu-
ciones para obtener una lectura estable.
Preparar una curva de calibracin a partir de la media de las lecturas obtenidas con las soluciones estndar, graficando las
medias en funcin de la concentracin. Determinar la concentracin del elemento en la Solucin de Prueba 7 a partir de la
curva obtenida.
Estndar Agregado-Agregar volmenes iguales de la Solucin de Prueba 7, preparada segn se indica anteriormente o se-
gn se indica en la monografa, a por lo menos cuatro matraces volumtricos idnticos. Agregar a todos los matraces menos a
uno volmenes progresivamente mayores de una solucin estndar que contenga una concentracin conocida del elemento
de prueba para obtener una serie de soluciones con concentraciones crecientes de manera estable del elemento que se sabe
produce respuestas en la parte lineal de la curva. Diluir el contenido de cada matraz con el disolvente especificado en la mono-
grafa a volumen y mezclar. Etiquetar el matraz sin el estndar adicionado como la solucin de prueba.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento, usando el mismo nmero de repeticiones para cada una de las solu-
ciones, para obtener una lectura estable.
Graficar las absorbancias de las soluciones estndar y de la solucin de prueba en funcin de la cantidad agregada del ele-
mento de prueba. [NOTA-La solucin de prueba debe graficarse como si tuviera un contenido del elemento de prueba agre-
gado equivalente a O mg o g]. Extrapolar la lnea uniendo los puntos en la grfica hasta que se encuentre con el eje de con-
centracin. La distancia entre este punto y la interseccin de los ejes representa la concentracin del elemento de prueba en la
solucin de prueba.

Pruebas Especficas
CADMIO (CD), COBRE (cu), HIERRO (FE), PLOMO (PB), NQUEL (NI) y CINC (ZN)

Solucin Madre del Estndar-Preparar una solucin con concentraciones conocidas de 5 g/mL de cada elemento de
prueba.
Soluciones Estndar-En tres matraces volumtricos idnticos de 1O mL, introducir 1O, 20 y 40 L, respectivamente, de
Solucin Madre del Estndar. Agregar a cada matraz 5,0 ml de la Solucin de Prueba 1, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solucin de Prueba 2-En un matraz volumtrico de 1 O mL, agregar 5,0 mL de la Solucin de Prueba 1, diluir con agua a
volumen y mezclar.
Solucin Blanco 2-En un matraz volumtrico de 1O mL, agregar 5,0 ml de Solucin Blanco 1, diluir con agua a volumen y
mezclar.
Procedimiento-Medir el contenido de Cd, Cu, Fe, Pb, Ni y Zn usando un espectrofotmetro de absorcin atmica equi-
pado con un horno de grafito adecuado. Determinar concomitantemente las absorbancias de la Solucin Blanco 2, las Solucio-
nes Estndar y Solucin de Prueba 2 por lo menos tres veces cada una. El valor de absorbancia de la Solucin Blanco 2 se resta
del valor obtenido usando las Soluciones Estndar y la Solucin de Prueba 2. Proceder segn se indica en el mtodo de Estndar
Agregado en el Procedimiento General anterior. La Tabla 7O indica los parmetros instrumentales que pueden usarse.
Tabla 10
Cd Cu Fe Pb NI Zn
Longitud de onda (nm) 228,8 324,8 248,3 283,5 232 213,9
Ranura (nm) 0,5 0,5 0,2 0,5 0,2 0,5
Corriente de la lmpara (mA) 6 7 5 5 10 7
Temperatura de incineracin () 800 800 800 800 800 800
Temperatura de atomizacin () 1800 2300 2300 2200 2500 2000
Corrector de fondo Encendido Apagado Apagado Apagado Apagado Apagado
Flujo de nitrgeno (L/min) 3 3 3 3 3 3
USP 39 Pruebas Qumicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 337

ARSNICO Y MERCURIO

Medir el contenido de arsnico y mercurio contra sus soluciones estndar de arsnico o mercurio a una concentracin cono-
cida empleando el mtodo de Calibracin Directa de la seccin Procedimiento General anterior, con un sistema automatizado de
generacin de vapores de hidruros de flujo continuo.
Para el lmite de especificacin de 1 ppm para arsnico y el lmite de especificacin de 1 ppm para mercurio, preparar tres
soluciones de calibracin de trabajo con concentraciones conocidas de aproximadamente 5, 1 O y 20 ng/ml, respectivamente,
para cada elemento de prueba.
El valor de absorbancia de Ja solucin blanco se resta automticamente del valor obtenido usando la solucin de prueba.
Arsnico-
Solucin Blanco 3-Agregar 1,0 ml de una solucin de 200 mg/ml de yoduro de potasio a 19,0 ml de la Solucin Blanco 7
preparada segn se indica anteriormente. Dejar esta solucin en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente
50 minutos o a 70 durante aproximadamente 4 minutos.
Solucin de Prueba 3-Agregar 1,0 ml de una solucin de 200 mg/ml de yoduro de potasio a 19,0 ml de la Solucin de
Prueba 7 preparada segn se indica anteriormente. Dejar esta solucin en reposo a temperatura ambiente durante aproxima-
damente 50 minutos o a 70 durante aproximadamente 4 minutos.
Reactivo cido 7: cido Clorhdrico Libre de Trazas de Metal
Reactivo Reductor 7: Una solucin de 6 mg/ml de tetrahidroborato de sodio en una solucin de 5 mg/ml de hidrxido de
sodio
Se pueden utilizar los parmetros instrumentales de la Tabla 7 7.
Mercurio-
Solucin Blanco 4-Proceder segn se indica en Solucin Blanco 3.
Solucin de Prueba 4-Proceder segn se indica en Solucin de Prueba 3.
Reactivo cido 2: Una solucin de 515 mg/ml de cido Clorhdrico Libre de Trazas de Metal
Reactivo Reductor 2: Una solucin de 1 O mg/ml de cloruro estannoso en una solucin de 200 mg/ml de cido Clorhdrico
Libre de Trazas de Metal
Se pueden utilizar los parmetros instrumentales de la Tabla 7 7.
Tabla 11
As Hg
Longitud de onda (nm) 193,7 253,7
Ancho de ranura (nm) 0,2 0,5
Corriente de la lmpara (mA) 10 4
Velocidad de flujo del reactivo cido (ml/min) 1,0 1,0
Velocidad de flujo del reactivo reductor (ml/min) 1,0 1,0
Velocidad de flujo para las soluciones blanco, estndar y de prueba (ml/min) 7,0 7,0
Celda de absorcin Cuarzo (calentado) Cuarzo (sin calentar)
Corrector de fondo Apagado Apagado
Velocidad de flujo de nitrgeno (L/min) 0,1 0,1

COMPOSICIN DE ESTEROLES

Separacin de la Fraccin de Esteroles

Solucin de Referencia A-Disolver una cantidad de colesterol, pesada con exactitud, en cloroformo para obtener una so-
lucin al 5% (p/v).
Fase Mvil: Una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y ter (65:35)
Solucin de Prueba A-Pesar con exactitud 5 g de la sustancia de prueba en un matraz de 250 ml. Agregar 50 ml de
hidrxido de potasio alcohlico SR 2 (hidrxido de potasio alcohlico 2 N) y calentar hasta ebullicin suave, agitando vigoro-
samente y de manera continua, hasta que ocurra la saponificacin (la solucin se torna transparente). Continuar calentando
durante 20 minutos adicionales y agregar 50 ml de agua desde la parte superior del condensador. Enfriar el matraz hasta
aproximadamente 30. Transferir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 500 ml con varios enjuagues de
agua, hasta un volumen total de aproximadamente 50 ml. Agregar aproximadamente 80 ml de ter, agitar vigorosamente
durante aproximadamente 30 segundos y dejar que sedimente. [NOTA-Cualquier emulsin puede destruirse mediante el ro-
ciado de pequeas cantidades de alcohol etlico o alcohol metlico.] Separar la fase acuosa inferior y recogerla en un segundo
embudo de separacin. Realizar de la misma forma dos extracciones adicionales en la fase de agua-alcohol, usando 60-70 ml
de ter en cada ocasin. Combinar los extractos etreos en un solo embudo de separacin y realizar lavados con agua, de 50
ml cada uno, hasta que el agua de lavado no presente reaccin alcalina frente a la fenolftalena. Secar la fase etrea con sulfa-
to de sodio anhidro y filtrar a travs de sulfato de sodio anhidro recolectando en un matraz de 250 ml previamente pesado,
lavando el embudo y filtrando con pequeas cantidades de ter. Destilar el ter hasta que el contenido del matraz se reduzca a
 338 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qumicas USP 39

unos pocos mL y llevar a sequedad aplicando un ligero vaco o una corriente de nitrgeno. Completar el secado a 100 duran-
te aproximadamente 15 minutos, luego pesar despus de enfriar en un desecador. Disolver la materia insaponificable as obte-
nida en cloroformo para obtener una solucin con una concentracin de aproximadamente 5%.
Solucin de Prueba 8-Tratar 5 g de aceite de canola de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solucin de Prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidrxido de potasio alcohlico SR 2 (hidrxido de potasio
alcohlico 2 N)".
Solucin de Prueba (-Tratar 5 g de aceite de girasol de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solucin de Prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidrxido de potasio alcohlico SR 2 (hidrxido de potasio
alcohlico 2 N)".
Procedimiento-Sumergir por completo en hidrxido de potasio alcohlico 0,2 N durante 1O segundos una placa de gel
de slice para cromatografa en capa delgada (ver Cromatografa (621 )), de 20 cm x 20 cm con un espesor de capa de 200 m
y un tamao de partcula de 5-17 m 1 sobre polister, luego dejar que se seque en una campana de extraccin durante 2
horas y finalmente colocar a 100 durante 1 hora. [NOTA-Retirar del dispositivo de calentamiento validado y mantener la pla-
ca en un desecador hasta que se requiera su uso. Las placas deben usarse dentro de los 15 das. Tambin se encuentran dispo-
nibles comercialmente placas para cromatografa en capa delgada que no requieren de preacondicionamiento]. Usar una placa
individual para cada solucin de prueba.
Colocar en la cmara una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y ter (65:35) hasta una profundidad
de aproximadamente 1 cm. Cerrar la cmara con la cubierta apropiada y dejar en reposo durante al menos 30 minutos. Se
pueden colocar tiras de papel de filtro sumergidas en el eluyente sobre las superficies internas de la cmara. [NOTA-La fase
mvil debera reemplazarse para cada prueba para asegurar condiciones de elucin reproducibles.] Aplicar 0,3 mL de Solucin
de Prueba A aproximadamente a 2 cm a partir del borde inferior formando una franja que sea lo ms delgada y uniforme posi-
ble. Colocar 2-3 L de Solucin de Referencia A en un extremo de la placa, alineados con la franja. Desarrollar los cromatogra-
mas en una cmara equilibrada con la Fase Mvil hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente 1 cm
desde el borde superior de la placa. Retirar la placa de la cmara de desarrollo y evaporar la fase mvil empleando una corrien-
te de aire caliente [NOTA-Evitar el calor excesivo.] o dejando la placa bajo una campana durante un periodo corto. Rociar la
placa con una solucion alcohlica de 2,7-diclorofluorescena al 0,2% y examinar bajo luz UV a 254 nm. [NOTA-Tambin se
encuentran disponibles comercialmente placas previamente tratadas con indicador de UV y se usan en forma equivalente]. En
cada una de las placas, marcar los lmites de la banda de esteroles, identificada mediante su alineacin con la mancha obteni-
da a partir de la Solucin de Referencia A a lo largo de los bordes de la fluorescencia e incluir adems el rea de las zonas que se
encuentran a 2-3 mm por encima y por debajo de las zonas visibles que corresponden a la Solucin de Referencia A. Retirar el
gel de slice de las reas marcadas y colocarlo en un embudo de filtracin provisto de un septo poroso G3.2 Agregar 1O mL de
cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la esptula de metal, filtrar empleando vaco y recoger el filtrado en el ma-
traz Erlenmeyer acoplado al embudo de filtracin. Lavar el residuo en el embudo tres veces con ter, aproximadamente 1O mL
cada vez, y recoger el filtrado en el mismo matraz acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta un volumen de 4-5 mL,
transferir la solucin residual a un tubo de ensayo de 1O mL, previamente pesado, con fondo cnico y tapn de cierre hermti-
co, y evaporar hasta sequedad mediante calentamiento moderado en una corriente suave de nitrgeno. Disolver el residuo en
unas pocas gotas de acetona y evaporar de nuevo hasta sequedad. Colocar a 105 durante aproximadamente 1O minutos,
dejar que se enfre en un desecador y pesar.
Tratar la Solucin de Prueba By la Solucin de Prueba C de la misma forma que se indica para la Solucin de Prueba A.

Determinacin de Esteroles

Solucin de Prueba O-Agregar al tubo de ensayo que contiene la fraccin de esteroles separada de la sustancia de prueba
mediante cromatografia en capa delgada, una mezcla preparada recientemente de piridina anhidra, hexametildisilazano y clo-
rotrimetilsilano (9:3:1) [NOTA-Este reactivo tambin se encuentra comercialmente disponible y se utiliza de manera equivalen-
te.], en una relacin de 50 L por cada mg de esteroles, evitando cualquier absorcin de humedad. Tapar el tubo de ensayo y
agitar cuidadosamente hasta disolver completamente los esteroles. Dejar en reposo durante al menos 15 minutos a temperatu-
ra ambiente y centrifugar durante unos pocos minutos si fuera necesario. Usar el sobrenadante. [NOTA-Es normal que se pro-
duzca una leve opalescencia y no causa anomala. Sin embargo, la formacin de un flculo blanco o la aparicin de un color
rosado indica la presencia de humedad o el deterioro del reactivo. Si algo de esto ocurre, se debe repetir la prueba].
Solucin de Referencia E-Agregar a 9 partes de los esteroles separados del aceite de canola mediante cromatografa en
capa delgada, 1 parte de colesterol. Tratar la mezcla de la misma forma que se indica para la Solucin de Prueba D.
Solucin de Referencia F-Tratar los esteroles separados del aceite de girasol mediante cromatografia en capa delgada de
la misma forma que se indica para la Solucin de Prueba D.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar el cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la
llama y una columna capilar de vidrio o de slice fundida de 20-30 m de largo, con un dimetro interno de 0,25-0,32 mm,
totalmente recubierta con una capa de fase estacionaria G27 o G36 de 0, 1O a 0,30 m. Mantener la temperatura del inyector
a 280, la temperatura del detector a 290 y la temperatura de la columna a 260 5. El gas transportador es helio con una

1 Se puede obtener una placa para TLC de grado comercial en Sigma-Aldrich, N de catlogo zl 22785.
2 Se puede obtener un producto comercial en Kimble/Kontes como un filtro buchner con disco sinterizado, Kimax 28400-1 52.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (411) Valoracin de cido Flico 339

velocidad lineal de 20-35 cm/s o hidrgeno con una velocidad lineal de 30-50 cm/s. Se usa una relacin de particin de 1 :50
a 1 :100. Inyectar en el cromatgrafo Solucin de Referencia Ey Solucin de Referencia Fy registrar el cromatograma segn se
indica en Procedimiento: el tiempo de retencin debera ser de 20 5 minutos para fJ -sitosterol y todos los esteroles presentes
deben estar separados. El cromatograma obtenido con la Solucin de Referencia E presenta cuatro picos principales correspon-
dientes a colesterol, brasicasterol, campesterol y fJ -sitosterol; y el cromatograma obtenido con la Solucin de Referencia F pre-
senta cuatro picos principales correspondientes a campesterol, estigmasterol, /J-sitosterol y L'l7-estigmastenol. Los tiempos de
retencin de los esteroles con referencia a fJ -sitosterol se indican en la Tabla 72.
Tabla 12. Tiempos de Retencin Relativos de Esteroles
para Dos Columnas Diferentes
Identificacin Columna G36 Columna G27
Colesterol 0,67 0,63
Brasicasterol 0,73 0,71
24-Metileno-colesterol 0,82 0,80
Campesterol 0,83 0,81
Campestanol 0,85 0,82
Estigmasterol 0,88 0,87
t...7-Campesterol 0,93 0,92
tJ.5,23-Estigmastadienol 0,95 0,95
Clerosterol 0,96 0,96
f3 -5itosterol 1,00 1,00
Sitostanol 1,02 1,02
!J.5-Avenasterol 1,03 1,03
!J.5,24-Estigmastadienol 1,08 1,08
t...7-Estigmastenol 1,12 1, 12
t...7-Avenasterol 1,16 1,16

Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 1 L) de Solucin de Prue-

ba O, Solucin de Referencia E y Solucin de Referencia F, registrar los cromatogramas y medir las reas de los picos de esteroles.
Calcular el porcentaje de cada esterol individual en la fraccin de esteroles de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= 100 x (AIS)
A= rea del pico debido al componente de esteroles a determinar
S = suma de las reas de los picos debidos a los componentes indicados en la Tabla 12

Cambio en la redaccin:
" ,,. ,,.
.. (411) VALORACION DE ACIDO FOLICO

INTRODUCCIN
Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se usan para la determinacin de cido flico como un ingrediente
farmacutico activo, un ingrediente de suplemento diettico o un componente de suplementos dietticos o de formas far-
macuticas.
Durante estos procedimientos, proteger de la atmsfera y la luz las soluciones que contengan y se deriven de la muestra de
prueba y los Estndares de Referencia, de preferencia usando material de vidrio con proteccin actnica.
VALORACIN
PROCEDIMIENTO 1
Este procedimiento se puede usar para determinar cido flico en los siguientes artculos:
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Tabletas de Vitaminas Hdrosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles
Cpsulas de Vitaminas Hidrosolubles
340 (411 > Valoracin de cido Flico / Pruebas Qumicas USP 39

Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin usando una Solucin de estndar interno que conten-
ga metilparabeno, hidrxido de tetrabutilamonio y cido penttico en solucin amortiguadora de fosfato alcohlica y me-
diante agitacin mecnica para liberar los analitos de las matrices.
A menos que se especifique de otro modo en las monografas individuales, las soluciones reactivo, la Solucin de estndar
interno, lo Solucin estndar y las Soluciones muestra se preparan segn se indica a continuacin.
Reactivo A: Solucin de hidrxido de tetrabutilamono al 25% en metano!
Reactivo B: Transferir 5,0 g de cido penttico a un matraz volumtrico de 50 mL. Usando ultrasonido si fuera necesario,
disolver y diluir con hidrxido de sodio 1 Na volumen.
Fase mvil: 2 g de fosfato monobsico de potasio en 650 ml de agua. Agregar 12,0 ml de Reactivo A, 7,0 ml de cido
fosfrico 3 N y 240 ml de metano!. Enfriar a temperatura ambiente, ajustar con cido fosfrico o amoniaco SR a un pH de
7,0, diluir con agua hasta 1000 mL y filtrar. Volver a verificar el pH antes de usar agregando agua o metano! a fa Fase mvil
preparada para obtener la separacin de cido flico y el estndar interno a la altura de la lnea de base. El pH puede au-
mentarse hasta 7, 15 para obtener una mejor separacin. [NOTA-El contenido de metano! y de agua puede modificarse
(1 o/o-3%).J
Solucin de estndar interno: Transferir 40 mg de metilparabeno a un matraz volumtrico de 1000 mL y agregar 220 mL
de metano! para disolver. Disolver 2,0 g de fosfato monobsico de potasio en 300 mL de agua en un vaso de precipitados
separado, transferir cuantitativamente esta solucin al matraz que contenga la solucin de metlparabeno y agregar 300
ml adicionales de agua. Agregar 19 ml de Reactivo A, 7 ml de cido fosfrico 3 N y 30 ml de Reactivo B. Ajustar con amo-
niaco SR a un pH de 9,8, burbujear nitrgeno a travs de la solucin durante 30 minutos, dlur con agua a volumen y
mezclar.
Solucin estndar: 0,016 mg/ml de ER cido Flico USP en la Solucin de estndar interno
Solucin muestra para Tabletas: Triturar no menos de 30 Tabletas hasta reducirlas a polvo fino. Transferir una porcn de
polvo, equivalente a 0,4 mg de cido flico, a un tubo de centrfuga de color mbar de 50 mL. Agregar 25,0 ml de So/U-
cin de estndar interno, agitar mecnicamente durante 1O minutos y centrifugar. Filtrar una porcin del sobrenadante
transparente y usar el filtrado.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cpsulas vacas lavando, si fuera necesario, con varias porciones de ter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire hasta que deje de percibirse el olor a ter. Pesar
las cubiertas de las cpsulas vacas en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cpsula. Transferir
una cantidad del contenido de las Cpsulas a un tubo de centrfuga adecuado y agregar un volumen de Solucin de estn-
dar interno para obtener una concentracin de 0,016 mg/ml de cido flico. Agitar mecnicamente durante 1O minutos y
centrifugar. Filtrar una porcin del sobrenadante transparente y usar el filtrado.
Sistema cromatogrflco
(l/er Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de Inyeccin: 15 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para cido flico y metilparabeno son aproximadamente 0,8 y 1,0, respectiva-
mente.]
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndary Solucin muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de cido flico (C 19 H19 N70 6) en la porcin de Muestra tomada:
Resultado= (Ruf Rs) x (C5/Cu) x 100
Ru =cociente de estndar interno {respuesta del pico de cido flico/respuesta del pico del estndar interno) de la
Solucin muestra correspondiente
R5 = cociente de estndar interno (respuesta del pico de cido flico/respuesta del pico del estndar .interno) de la
Solucin estndar
C5 = concentracin de ER cido Flico USP en la Solucin estndar (g/mL)
Cu =concentracin nominal de cido flico en la Solucin muestra correspondiente (g/mL)
PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento se puede usar para determinar el cido flico en los siguientes artculos:
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolub!es con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubtes e Hidrosolubles con Minerales
USP 39 Pruebas Qumicas / (411 ) Valoracin de cido Flico 341

Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles

Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles
Cpsulas de Vitaminas Hidrosolubles
Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin usando una solucin de extraccin que contenga
una mezcla de edetato disdico e hidrxido de amonio o una mezcla de metanol, cido actico glacial y etilenglicol, y
mediante agitacin mecnica para liberar los analitos de las matrices.
A menos que se especifique de otro modo en las monografas individuales, la solucin reactivo, el Diluyente, la Solucin ma-
dre del estndar, las Soluciones estndar y las Soluciones muestra se preparan segn se indica a continuacin.
Reactivo: Disolver 7,5 g de edetato disdico, mezclando, en 500 ml de agua que contenga lO ml de hidrxido de amo-
nio.
Diluyente: 60 g/ml.de hidrxido de amonio
Fase mvil: Transferir 0,4 ml de trietilamina, 15 ml de cido actico glacial y 350 ml de metano! a .un matraz volumtrico
de 2000 mL, y diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M a volumen.
Solucin madre del estndar: 60 g/ml de ER cido Flico USP en Diluyente. Preparar esta solucin a diario.
Solucin estndar para Tabletas: Mezclar 5,0 ml de Solucin madre del estndar con 10,0 ml de metano! y 35,0 ml de
Reactivo. Agitar durante 15 minutos en un bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del
filtrado.
Solucin estndar para Cpsulas: Mezclar 5,0 ml de Solucin madre del estndar con 10,0 mL de una mezcla de metano!
y cido actico glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1). Agitar durante 15 minutos en un
bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros mL del filtrado.
Solucin muestra para Tabletas: Transferir una porcin de Tabletas reducidas a polvo fino, equivalente a 0,3 mgde cido
flico, a un matraz de 125 ml con tapn. Agregar 10,0 ml de metano! y 35,0 ml de Reactivo. Agitar durante 15 minutos
en un bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros mL del filtrado.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, Sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cpsulas vacas lavando, si fuera necesario, con varias porciones de teL Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire hasta que deje de percibirse el olor a ter. Pesar
las cubiertas de las cpsulas vacas en el frasco de pesada tarado y ca!Cular el peso neto promedio por Cpsula. Transferir
una cantidad del contenido de las Cpsulas, equivalente a 0,3 mg de cido flico, a un matraz de 125 ml con tapn. Agre-
gar 10,0 ml de una mezcla de metano! y cido actico glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etlenglicol
(1 :1 ). Agitar durante 15 minutos en un bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del
filtrado.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 }, Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 270 nm
Columna: 4,6 mm x 25.cm; relleno L7
Temperatura de la columna: 50
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de Inyeccin: 5 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar correspondiente y Solucin muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de cidoflico (C19 H19 N,0 6 ) en la porcin de Muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (Cs!Cu) x 100
ru = respuesta del pico de cido flico de la Solucin muestra correspondiente
r5 = respuesta del pico de cido flico de la Solucin estndar correspondiente
C5 = concentracin de ER cido Flico USP en la Solucin estndar corresp0ndiente (g/ml)
Cu = concentracin nominal de cido flico en la Solucin muestra correspondiente (g/ml)
PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento se puede usar para determinar el cido flico en los siguientes artculos:
Ingrediente farmacutico activo
Ingrediente diettico
Este procedimiento implica la disolucin de analitos y estndar interno en Fase mvil.
342 (411) Valoracin de cido Flico/ Pruebas Qumicas USP 39

A menos que se especifique de otro modo en las monografas individu(!les, las soluciones reactivo, la Solucin de estndar
interno, la Slucin mar:Jre del e$tndar, la Solucin estndar, la Solucin mdre de la muestra y la Solucin muestra se prepa-
ran segn se indica a continuacin.
cido fosfrico 3 N: 98 g/L de cido fosfrico en agua
Hidrxido de amonio 6 N: Diluir 40 ml de hidrxido de amonio con agua hasta 100 mL.
Fa$e.mvU: Transferir2,0g de fosfato monobsico de potasio a un matraz volumtrico del OOOmL y disolver en 650 ml
de agua, Agregar 15,0 mt de una soluqinde hidrxido de tetrabutilamonio 0,5 M en metano!, 7,0 ml de c(do fosfrico
J N y270 ml de metano!: Enfriar atemperatura ambiente, aju$tar con cido fosfrico JN o Hidrxid de amnio 6N a un
pH de 5,0 y diluir con agua a volumen. Volver a verificar el pH antes de usar.
Solucin de estndar interno: 2 mg/mL de metilparaben enFase mvil. Disolver el metHparabeno primero con metanol
(aproximadarnente4% del volumen final)ydih,iir con Fase mvil a volumen.
Soli:in madre del estndar: 1 mg/rnl de ER dd Flic USP en Fase mvil. Disolver el cido flico con ayuda de hidr-
xido de amonio al 10% (aproximadamente lo/o del volumen final) y diluir con Fase mvil a volumen.
Solucin estndar: Transferir 4,0 ml de Solucin madre del estndar y 4,0 rnlde Solucin de estndar interno a un matraz
volumtrico de 50 ml y diluir con Fase mvl a volumen.
Solucin madre de la muestra: Transferir 100 mg de cido flko a un matraz volumtrico de 100 mL y dsolver en 40 ml
de Fase mvl y1 ml de hidrxido de amonio al 10%.. Diluir con Fase mvl a volumen.
Soludn muestra: Transferir 4,0 ml de Solucin madre de la muestra y 4,0 ml de Solucin de estndar interno a un matraz
volumtrico deSOmLy dilllir con Fase mvil a volumen.
Sistema cromatogrfico
<Yer Cromatografa (621), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6mm ><25 cmrelleno L1
Velocidad de flujo: l,2ml/min
Volumen de Inyeccin: 1O L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos deaptitud
Resolucin: No menos de 3,6 entre metilparabenoycido flico
Desviadn estndar relativa: No ms de 2,0% para los cocientes de respuesta entre los picos de cido flico y estn"
dar interno
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin .muestra
Calcular el porcentaje de cido flico (C19 H19 N70 6) en la porcin de Muestra tomada:
Resultado= (Ruf Rs) x (CsfCu)x 100
Ru =cociente de estndar interno (respuesta del pico de cido flico/respuesta del pico deLestndar interno) dela
Solucin muestra
R5 = cociente de estndar interno (respuesta del pico de cido flico/respuesta del pico del estndar interno) de. la
Solucin estndar
C5 = concentracin de ER cido Flico USP en la Solucin madre del estndar (mg/rnl)
Cu =concentracin de cido flico en la Solucn madre de la muestra(mg/ml)
PROCEDIMIENTO 4
Este procedimiento se puede usar para determinar el cido flico en los siguientes artculos:
Tabletas de cidoJlico
Inyeccin de cido Flico
E~te procedimiento implica la disoludn de analitos en un Diluyente que contenga 2 ml de hidrxido de amonio y lg de
perclorato de sodio porcada 100 mL de agua.
A menos que se especifique de. otro modo en las monog raas individuales, preparar el Diluyente, la Soludn de aptitud del
sstemCI, la Solucin estndaryla$ Soluciones .muestra segn seihdica a continuacin.
Fase mvil: Transferir 35,l g de perdorato de sodio y lAO g de fosfat monobsko de potasio a un matraz \lol\,lmtrico
de 1 litro. Agregar 7,0 mL de hidrxido de potasio l Ny40 ml de metanl, diluir con agua a volumen y mezclar. Ajustar
a
con hidrxido de potasio 1 N o cido fosfrico .uh pH de 7,2.
Diluyente: SolUcin acuosa que contenga 2mlde. hidrxido de>arnonioy 1 g de perclotto de sodio por cada 1oo mL
Solucin de aptitud del sistema: 0,.2 mg/mLdeERcido.FlicoUSPy de ERCompuesto ReladonadoA de cido Flico
\,.JSP en Diluyente, [NotA.,._Antes de usar, pasar a travs de un filtro con un tamao de poro del m o menor.]
Solucin estndar: 0,20 mg/mL de ERcido .F<)li<;o USP enDfuynte
SolUcin muestra .para Tabletas: Equivalente a 0,2 mg/ml de cido flko, a partk de no menos de 20 Tabletas reducidas
a polvo en Diluyente. Agitar suavemente parafacilitlr la disolucin y filtrar, desechando ls primeros mL del filtrado.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (413) Anlisis de Impurezas en Gases Medicinales 343

Solucin muestra para Inyeccin: Diluir con Diluyente un volumen de Inyeccin medido con exactitud, cuantitativamente
y en diluciones sucesivas, hasta obtener una solucin con una concentracin cercana a la de la Solucin estndar y entre
0,20 y 0,80 mg/ml.
Sistema cromatogrfico
0fer Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de Inyeccin: 25 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 3,6 entre compuesto relacionado A de cido flico y cido flico, Solucin de aptitud del ss
tema
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0%, Solucin estndar
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de cido flico (C 19 H19 NP6) en la porcin de Tabletas tomada:
Resultado= (ruf r5) x (Csf Cu) x 100

ru = respuesta del pico de cido flico de la Solucin muestra para Tabletas

r5 = respuesta del pico de cido flico de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER cido Flico USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Cu =concentracin nominal de cido flico en la Solucin muestra para Tabletas (mg/ml)
Calcular la cantidad, en mg, de cido flico (C 19H19 NP 6) en cada mL de Inyeccin tornado:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Vu) x V

ru = respuesta del pico de cido flico de la Solucin muestra para Inyeccin

r5 = respuesta del pico de cido flico de la Solucin estndar
( 5 = concentracin de ER cido Flico USP en la Solucin estndar (mg/mL)
Vu = volumen de Inyeccin tomado para preparar la Solucin muestra para Inyeccin (rnl)
V "" volumen total usado para diluir la Inyeccin (mL)

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER cido Flico USP
ER Compuesto Relacionado A de cido Flico USP
Formiltetrahidrofolato de calcio.
>.USP39

(413) ANLISIS DE IMPUREZAS EN GASES MEDICINALES

INTRODUCCIN
El presente captulo de prueba general define los medios seguros y apropiados para el muestreo de envases de gases a alta
presin conteniendo distintas composiciones de gases medicinales usando tubos detectores de acuerdo con las monografas
USP, y utilizando el volumen total de gas recomendado por el fabricante del tubo detector. Ver Reactivos en la seccin Reacti-
vos, Indicadores y Soluciones para informacin sobre cada tubo detector referido.
En la actualidad se fabrican dos tipos de tubos detectores: aquellos que se utilizan con una bomba manual de volumen fijo
(p.ej., 100 ml/bombeo) y aquellos que se usan en un sistema de flujo continuo que se puede ajustar para pasar un volumen
de gas a travs del tubo detector a aproximadamente 1 atmsfera. Es importante usar un tipo de tubo detector que corres-
ponda con el modo de intercambio de volumen de gas.
Para asegurar el paso del volumen de gas requerido a travs del tubo detector, medir el volumen de gas al momento del
anlisis usando una bomba manual o un caudalrnetro calibrado para el gas que se analiza o corregido mediante un grfico de
calibracin. Los fabricantes de caudalmetros por lo general proveen grficos de volumen de flujo para gases comunes con ca-
344 (413) Anlisis de Impurezas en Gases Medicinales/ Pruebas Qumicas USP 39

da uno de los tubos identificados en este captulo general. [NOTA-Ver el captulo general Valoracin de Gases Medicinales
(415) para el muestreo.]

SISTEMA DE FLUJO CONTINUO

Identificar el gas contenido en el envase y seleccionar el regulador de gas apropiado. Conectar el regulador al envase del
gas. No aplicar lubricante o cinta de Tefln a las conexiones entre el envase y el regulador. Purgar el regulador con el gas en
anlisis. Ajustar el nivel del flotador para obtener Ja velocidad de flujo adecuada a fin de lograr el volumen total de gas reco-
mendado por el fabricante. Acoplar el tubo detector, Juego ajustar la velocidad de flujo al nivel requerido, segn se indica en
los grficos que acompaan al caudalmetro y al tubo detector. Cronometrar para alcanzar el volumen total de gas requerido
1 O segundos al flujo fijado. En el tiempo establecido, cerrar Ja vlvula del regulador y luego Ja vlvula principal del envase.
Observar el tubo mientras contine conectado para determinar el grado de cambio de color y registrar el resultado. Retirar el
tubo y desconectar el aparato, equilibrar la presin de gas en el regulador permitiendo que el gas se libere a Ja atmsfera y
desconectar el regulador del envase. Desechar el tubo despus de su uso.

BOMBA MANUAL DE VOLUMEN FIJO

El mtodo alternativo consiste en aplicar Ja bomba manual detectora de gases. El sistema extrae un volumen constante con
cada bombeo. Para asegurar Ja exactitud del volumen total de gas, el usuario debe seguir las recomendaciones de bombeo
sugeridas por el fabricante de Ja bomba.

(415) VALORACIN DE GASES MEDICINALES

Cambio en 1aredaccJ6n:

INTRODUCCIN
Las monografas de gases medicinales USP tienen como propsito evaluar la pureza de un gas usado para tratamiento mdi-
co o como componente de un proceso farmacutico. En general, la pureza se evala mediante una valoracin del contenido
del artculo y mediante anlisis de trazas de impurezas. La aplicacin de cromatografa de gases, anlisis paramagntico y tu-
bos detectores para gases medicinales vara con respecto a los procedimientos tradicionales usados para analitos en fase lqui-
da y, por lo tanto, requiere de una descripcin separada. Este captulo de pruebas generales se centra en Ja valoracin para
pruebas de contenido. El muestreo de impurezas se trata en el captulo general Anlisis de Impurezas en Gases Medicinales
(41 3).
Este captulo incluye los aspectos relacionados con el muestreo y la calificacin para el anlisis por cromatografa de gases y
anlisis paramagntico de gases medicinales. Asimismo, este captulo incluye una descripcin de Ja configuracin, validacin y
calibracin iniciales de estos instrumentos. Los procedimientos especficos de valoracin se definen en la monografa especfica
para cada gas.
Las definiciones bsicas sobre calificacin y validacin instrumental se incluyen en los captulos de informacin general Califi-
cacin de Instrumentos Analticos (1058) y .Vafdacin de Procedimieilros Farmacopeicos (1225), {AFOJ-may-tm 6 respectivamente,
por lo que no se repiten en este captulo. No obstante, cuando debido a la naturaleza del analito se requieran variaciones de
los materiales presentados en los captulos mencionados, tales variaciones sern definidas en este captulo.

MTODOS

Cromatografa de Gases (GC)

Ver Cromatografa (621 ).

Detectores para Valoracin de Gases Medicinales

Los dos detectores ms comunes usados en Jos anlisis de gases medicinales son el detector de conductividad trmica (TCD,
por sus siglas en ingls) y el detector de ionizacin a la llama (FID, por sus siglas en ingls).
El TCD detectar cualquier gas o vapor que tenga una conductividad trmica que difiera significativamente de la alta con-
ductividad trmica del gas de referencia, por lo regular helio, y por lo tanto, es prcticamente universal. Sin embargo, el lmite
de deteccin ms bajo generalmente aceptado para el TCD es 50 ppm v/v. Esto representa una limitacin para Ja evaluacin
de trazas de impurezas en gases medicinales.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (415) Valoracin de Gases Medicinales 345

El FID tambin se usa para la evaluacin de trazas de impurezas en gases medicinales, debido a que es ms sensible a com-
puestos orgnicos pero no produce seales para los gases medicinales ms comunes.

CALIFICACIN

Calificacin de la Instalacin (IQ, por sus siglas en ingls)

Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del cromatgrafo de gases se instale
de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del Cromatgrafo de Gases.
Se debe tener en cuenta lo siguiente segn sea aplicable:
Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
Fugas (debe estar exento de fugas);
Muestreo representativo;
Velocidad de flujo de la muestra;
Tiempo de respuesta;
Seales de encendido correcto;
Suministro de energa (incluyendo regulacin de voltaje); y
Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presin).

Calificacin Operativa (OQ, por sus siglas en ingls)

La OQ verifica que el desempeo del Cromatgrafo de Gases sea el previsto dentro de su intervalo de operacin esperado.
Para el anlisis de producto final del gas medicinal, el Cromatgrafo de Gases se prueba para asegurar la repetibilidad (verifica-
cin de que la desviacin estndar relativa se corresponde con lo declarado) para cada analito de inters. Debido a la naturale-
za especfica del anlisis de gases medicinales y al nmero limitado de analitos, en lugar de la OQ inicial o peridica, se pueden
usar la calibracin de rutina y la verificacin de calibracin peridica del Cromatgrafo de Gases, as como el procedimiento de
anlisis. Cuando un instrumento se usa para un rango ms amplio de analitos, resulta inapropiado realizar la calibracin y la
verificacin de calibracin peridica en lugar de la OQ.

Calificacin de Desempeo (PQ, por sus siglas en ingls)

Para el anlisis de producto final de los gases medicinales, el Cromatgrafo de Gases se verifica de manera peridica en in-
tervalos apropiados durante los anlisis con un gas de calibracin (es decir, verificando que los resultados se correspondan con
una determinada concentracin en un intervalo de exactitud y precisin aceptables despus de un nmero especfico de inyec-
ciones de la muestra).

Medicin Paramagntica de Oxgeno

TEORA

El analizador paramagntico mide el desplazamiento de un gas diamagntico (nitrgeno) ocasionado por un gas paramag-
ntico (oxgeno), en un campo magntico fuerte. Una celda de medicin por lo general emplea dos esferas de vidrio conecta-
das por un tubo rellenas de nitrgeno, que se suspenden sobre una cinta de torsin entre imanes que concentran el flujo alre-
dedor de las esferas de vidrio. Cuando las molculas de oxgeno ingresan a la celda de medicin, las esferas de vidrio se mue-
ven por la fuerza ejercida por las molculas de oxgeno, que son atradas a la parte ms fuerte del campo magntico. Mediante
el uso de sensores pticos, una bobina de retroalimentacin y aparatos electrnicos adecuados, los analistas miden una res-
puesta que es directamente proporcional a la presin parcial de oxgeno.
El oxgeno es el nico gas paramagntico de la atmsfera que se encuentra por encima de los niveles de trazas. No obstante,
los analizadores paramagnticos se pueden ver afectados por la susceptibilidad magntica del gas acompaante. Por lo tanto,
se debe evitar hacer cambios a los gases acompaantes en las monografas USP.

Consideraciones del Diseo

Las consideraciones del diseo para la adquisicin de nuevos instrumentos pueden incluir los siguientes parmetros:

DERIVA

Cambio de la respuesta del instrumento para una concentracin determinada durante un tiempo establecido en condiciones
constantes y sin ajustes del instrumento por medios externos. La deriva es la suma de dos componentes, deriva del cero y deri-
va de medicin. La deriva determina la frecuencia con que se debe calibrar el instrumento.
346 (415) Valoracin de Gases Medicinales/ Pruebas Qumicas USP 39

DERIVA DEL CERO

Cambio en la respuesta cuando se mide gas cero.

DERIVA DE MEDICIN

Cambio en la respuesta con respecto a la concentracin de oxgeno durante la medicin del gas.

TEMPERATURA DE OPERACIN

El intervalo de temperatura ambiente en el que continuar siendo vlida la especificacin de desempeo declarada del ins-
trumento. Un coeficiente de temperatura mayor indicar que se permite un cambio ms pequeo en la temperatura ambiente
antes de que se requiera la recalibracin.

PRESIN OPERATIVA

El instrumento debe operar a las presiones de entrada de las muestras a analizar.

Aspectos de la Calificacin

CALIFICACIN DE LA INSTALACIN (IQ)

Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del analizador de oxgeno se instale
de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno.
Se debe tener en cuenta lo siguiente segn sea aplicable:
Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
Fugas (debe estar exento de fugas);
Muestreo representativo;
Velocidad de flujo de la muestra;
Tiempo de respuesta;
Seales de encendido correcto;
Suministro de energa (incluyendo regulacin de voltaje); y
Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presin).

CALIFICACIN OPERATIVA (OQ)

Los requisitos de la OQ verifican que el desempeo del analizador paramagntico sea el previsto dentro de su intervalo de
operacin esperado y que sea adecuado para las condiciones reales de uso. Los instrumentos y aparatos se deben calibrar y
usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno. Debido a la naturaleza especfica del instrumen-
to, en lugar de la OQ inicial y peridica, se puede usar la calibracin de rutina.

CALIFICACIN DEL DESEMPEO (PQ)

Los requisitos de la PQ verifican que el desempeo del analizador paramagntico sea el esperado en su ambiente normal
operativo. Para el anlisis de producto final de los gases medicinales, el analizador paramagntico se calibra inicialmente [ajus-
tando a cero y calibrando (spanning) mediante un estndar certificado] de acuerdo con las instrucciones del fabricante del
analizador de oxgeno y se recalibra peridicamente para asegurar un desempeo continuo aceptable.

AJUSTE A CERO DEL INSTRUMENTO (ESTABLECIMIENTO DEL LMITE INFERIOR)

Usando el estndar certificado definido en la monografa, ajustar a cero el analizador pasando el gas cero en el analizador a
la velocidad de flujo recomendada por el fabricante del analizador de oxgeno. Mantener el flujo hasta que se observe una
lectura estable en el instrumento. Conforme se requiera, ajustar la configuracin de la posicin del cero a un valor de 0,0% de
acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno. Confirmar que la lectura sea estable. [NOTA-Depen-
diendo del uso previsto del instrumento, una alternativa aceptable a este procedimiento es cambiar la configuracin de la posi-
cin del cero a un valor diferente de 0,0%, siempre que proporcione una mayor precisin en la medicin.]
USP 39 Pruebas Qumicas/ (415) Valoracin de Gases Medicinales 347

CALIBRACIN (SPANNING) DEL INTERVALO DE USO

Establecer el lmite superior (span) con un gas de calibracin (span gas) definido en la monografa y apropiado para el inter-
valo de uso. Pasar el gas de calibracin a travs del instrumento a la velocidad de flujo sugerida por el fabricante. Confirmar
que la lectura sea estable. Ajustar la configuracin de la calibracin al valor certificado del estndar de referencia de acuerdo
con las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno. Confirmar que la lectura sea estable.

VALIDACIN
La validacin de este instrumento por lo general se completa durante el proceso (IQ/OQ). La verificacin de rutina se lleva a
cabo segn se describe en las secciones OQ/PQ de este captulo y, por lo tanto, no se requiere de informacin especfica sobre
la validacin del instrumento.

PROCEDIMIENTO

Para Instrumentos Fuera de Lnea

Antes del anlisis, ajustar el cero del instrumento y calibrar (span) segn se describe en la seccin PQ. [NOTA-La calibracin
no debe correrse concomitantemente con las muestras de prueba.] Conectar el gas muestra al instrumento y establecer un
flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante del analizador. Mantener el flujo hasta
que se observe una lectura constante en el instrumento. La definicin de lectura constante se incluye en las instrucciones del
fabricante del analizador o en la documentacin para calificacin del instrumento del usuario.

Para Instrumentos en Lnea

Los intervalos de calibracin son definidos por el fabricante del analizador, por el historial o por medios estadsticos. Estable-
cer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante.

MUESTREO

Muestreo de Fase Lquida

Los cilindros que contienen un tubo de inmersin permiten obtener una muestra lquida a partir de la salida de la vlvula
con el cilindro en posicin vertical. Si no se cuenta con un tubo de inmersin, el cilindro debe colocarse en posicin invertida
con el cilindro y la vlvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase lquida est en contacto con la vlvula).
El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido. Los reguladores deben purgarse
con el gas que se va a muestrear. Cuando sea necesario, se debe medir el flujo hacia el analizador usando un caudalmetro
calibrado.

Muestreo de Fase Gaseosa

Los cilindros que no cuentan con un tubo de inmersin permiten obtener una muestra gaseosa de la salida de la vlvula con
el cilindro en posicin vertical. Si se cuenta con un tubo de inmersin, el cilindro debe colocarse en posicin invertida con el
cilindro y la vlvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase gaseosa est en contacto con el tubo de in-
mersin). El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido.

ESTNDARES CERTIFICADOS PARA EL ANLISIS DE GASES MEDICINALES

Las monografas USP para gases medicinales requieren de pruebas que usan estndares certificados para la calibracin del
instrumento y determinaciones analticas. Tales anlisis farmacopeicos se pueden llevar a cabo usando materiales de referencia
rastreables al U.S. National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa de EE.UU.,
[NIST]) u otras organizaciones de estndares nacionales, p.ej., el lnstitute for National Measurement Standards (Instituto Na-
cional de Estndares de Medicin, Canad). Las monografas individuales, as como la seccin de reactivos, indicadores y solu-
ciones hacen referencia al porcentaje nominal de diversos estndares certificados requeridos para llevar a cabo los anlisis de
gases medicinales. Los requisitos para las concentraciones certificadas reales en trminos de varianza del valor nominal se indi-
can en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones para cada estndar certificado pertinente.
348 (425) Antibiticos-Valoracin Yodomtrica / Pruebas Qumicas USP 39

(425) ANTIBITICOS-VALORACIN YODOMTRICA

El siguiente mtodo se utiliza para la valoracin de la mayora de los medicamentos antibiticos farmacopeicos derivados de
la penicilina y sus formas farmacuticas, cuando la valoracin yodomtrica resulta particularmente apropiada.
Preparacin Estndar-Disolver en el disolvente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una canti-
dad adecuada del Estndar de Referencia USP especificado en la monografa individual, previamente secado bajo las condicio-
nes citadas en la monografa individual y pesado con exactitud, y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas, con el
mismo disolvente hasta obtener una solucin con una concentracin conocida aproximada a la que se especifica en la tabla.
Pipetear 2,0 ml de esta solucin y transferir a cada uno de dos matraces Erlenmeyer de 125 ml con tapn de vidrio.
Disolventes y Concentraciones Finales
Concentracin
Antibitico DI solvente* Final
Amoxicilina Agua 1,0 mg por ml
Ampicilina Agua 1,25 mg por ml
Ampicilina Sdica Solucin Amortiguadora N 7 1,25 mg por ml
Cloxacilina Sdica Agua 1,25 mg por ml
Ciclacilina Agua 1,0 mg por ml
Dicloxacilina Sdica Solucin Amortiguadora N 7 1,25 mg por ml
Meticilina Sdica Solucin Amortiguadora N 7 1,25 mg por ml
Nafcilina Sdica Solucin Amortiguadora N 7 1,25 mq por ml
Oxacilina Sdica Solucin Amortiguadora N 7 1,25 mg por ml
Penicilina G Potsica Solucin Amortiguadora N 7 2000 unidades por ml
Penicilina G Sdica Solucin Amortiguadora N 7 2000 unidades por ml
Penicilina V Potsica Solucin Amortiguadora N 7 2000 unidades por ml
Feneticilina Potsica Solucin Amortiguadora N 7 2000 unidades por ml
* A menos que se indique algo diferente, las Soluciones Amortiguadoras son las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en la seccin Medios y
Diluyentes en Antibiticos-Valoraciones Microbiolgicas (81 ), excepto que no se requiere su esterilizacin antes de usarlas.

Preparacin de Valoracin-A menos que se especifique de otro modo en la monografa individual, disolver en el disol-
vente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una cantidad adecuada, pesada con exactitud, de la
muestra en anlisis y diluir cuantitativamente con el mismo disolvente hasta obtener una solucin con una concentracin final
conocida aproximada a la que se especifica en la tabla. Pipetear 2 ml de esta solucin y transferir a cada uno de dos matraces
Erlenmeyer de 125 ml con tapn de vidrio.
Procedimiento-
/nactivacin y Volumetra-Agregar 2,0 ml de hidrxido de sodio 1,0 Na 2,0 ml de la Preparacin Estndar y de la Prepara-
cin de Valoracin, en sus respectivos matraces, mezclar por rotacin moderada y dejar en reposo durante 15 minutos. Agregar
a cada matraz 2,0 ml de cido clorhdrico 1,2 N y 10,0 ml de yodo 0,01 N SV. Tapar de inmediato y dejar en reposo durante
15 minutos. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidn yoduro SR al acercarse al punto
final y continuar la volumetra hasta que el color azul desaparezca.
Determinacin con un Blanco-En un matraz que contenga 2,0 ml de la Preparacin Estndar, agregar 10,0 ml de yodo 0,01
N SV. Si la Preparacin Estndar contiene amoxicilina o ampicilina, agregar de inmediato O, 1 ml de cido clorhdrico 1,2 N.
Valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidn yoduro SR cerca del punto final y
continuar la volumetra hasta que el color azul desaparezca. Tratar en forma similar un matraz que contenga 2,0 ml de la
Preparacin de Valoracin.
Clculos-Calcular los microgramos (o unidades) equivalentes (F) a cada ml de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido por la
Preparacin Estndar, por la frmula:
(2CP)/(B - 1)
en donde C es la concentracin, en mg por ml, de Estndar de Referencia en la Preparacin Estndar; P es la potencia, en g
(o unidades) por mg, del Estndar de Referencia; B es el volumen, en ml, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la
Determinacin con un Blanco; e 1es el volumen, en ml, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la lnactivacin y Volumetra.
Calcular la potencia de la muestra en anlisis por la frmula especificada en la monografa individual.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (429) Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz 349

(429) MEDICIN DEL TAMAO DE PARTCULA POR DIFRACCIN DE

LUZ

INTRODUCCIN

El mtodo se basa en las normas ISO 13320-7(7999) y 9276-1(7998).

Este captulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japo-
nesa.
La tcnica de difraccin de luz lser usada para la determinacin de la distribucin del tamao de las partculas se basa en el
anlisis del patrn de difraccin producido cuando las partculas se exponen a un haz de luz monocromtica. Histricamente,
los primeros instrumentos de difraccin lser usaban slo dispersin en ngulos pequeos. No obstante, desde entonces la
tcnica se ha ampliado para incluir dispersin de la luz lser en un intervalo angular ms amplio y la aplicacin de la teora de
Mie, adems de la aproximacin de Fraunhofer y de la difraccin anmala.
La tcnica no puede distinguir entre dispersin por partculas individuales y dispersin por grupos de partculas primarias, es
decir por aglomerados o agregados. Dado que la mayora de las muestras de partculas contienen aglomerados o agregados y
como el foco de inters generalmente se centra en la distribucin del tamao de las partculas primarias, los grupos por lo
general se dispersan en partculas primarias antes de la medicin.
Para partculas no esfricas, se obtiene una distribucin de tamao de esferas equivalentes, debido a que la tcnica supone
en su modelo ptico que las partculas son esfricas. La distribucin de tamao de partcula resultante puede diferir de la obte-
nida por mtodos que se basan en otros principios fsicos (p.ej., sedimentacin, tamizado).
Este captulo proporciona una gua para la medicin de las distribuciones de tamao de las partculas en diferentes sistemas
dispersos (p.ej., polvos, atomizaciones, aerosoles, suspensiones, emulsiones y burbujas de gas en lquidos) por medio del anli-
sis de sus patrones angulares de dispersin de luz. No se consideran en este captulo los requisitos particulares de la medicin
del tamao de las partculas de productos especficos.

PRINCIPIO

Una muestra representativa, dispersada a una concentracin adecuada en un lquido o gas apropiado, se pasa a travs de un
haz de luz monocromtica, generalmente un lser. La luz dispersada por las partculas a diversos ngulos se mide con un de-
tector de multielementos. Se registran los valores numricos que representan el patrn de dispersin para su posterior anlisis.
Estos valores del patrn de dispersin se transforman luego, por medio de un modelo ptico y un procedimiento matemtico
adecuados, para obtener la proporcin entre el volumen total y un nmero discreto de clases de tamao, formando una distri-
bucin volumtrica del tamao de partculas.

INSTRUMENTO

El instrumento se ubica en un entorno donde no se vea afectado por el ruido elctrico, las vibraciones mecnicas, las fluctua-
ciones de temperatura, la humedad o la luz brillante directa.
En la Figura 7 se muestra un ejemplo de configuracin de un instrumento de difraccin de luz lser. Se puede usar otro equi-
po.
9 11
8 10
7

(/)

5
1. Detector de 5. Luz dispersa no captada 9. Distancia de trabajo de la lente (4)
oscurecimiento por la lente (4) 1O. Detector de mullielementos
2. Haz dispersado 6. Conjunto de partculas
3. Haz directo 7. Fuente de luz lser 11. Distancia focal de la lente (4)
4. Lente de Fourier a. Unidad de procesamiento del haz

Figura 1 . Ejemplo de configuracin de un instrumento de difraccin de luz lser.

El instrumento est compuesto por una fuente de luz lser, un sistema ptico para procesar el haz de luz, una regin de
medicin de la muestra (o celda), una lente de Fourier y un detector de multielementos para medir el patrn de la luz disper-
350 (429) Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz / Pruebas Qumicas USP 39

sada. Tambin se requiere un sistema de datos para la deconvolucin de los datos de dispersin en una distribucin volumtri-
ca de tamaos, as como el anlisis e informe de los datos asociados.
Las partculas pueden entrar al haz lser en dos posiciones. En el caso convencional, las partculas entran al haz paralelo an-
tes de la lente colectora y dentro de su distancia de trabajo. En la llamada ptica de Fourier inversa, las partculas entran por
detrs de la lente colectora y por lo tanto, en un haz convergente. La ventaja de la configuracin convencional es que queda
un paso de longitud razonable para la muestra dentro de la distancia de trabajo de la lente. La segunda configuracin admite
slo longitudes de paso pequeas, pero permite la medicin de luz dispersa en ngulos ms grandes, lo cual es til cuando
hay presencia de partculas submicromtricas.
La interaccin del haz de luz incidente con el conjunto de las partculas dispersas da como resultado un patrn de dispersin
con distintas intensidades de luz en diversos ngulos. La distribucin de intensidad angular total, constituida por la luz directa
y la dispersa, se enfoca entonces sobre un detector de multielementos por medio de una lente o una serie de lentes. Estas
lentes crean un patrn de dispersin que, dentro de ciertos lmites, no depende de la ubicacin de las partculas en el haz de
luz. Por consiguiente, la distribucin de intensidad angular continua se convierte en una distribucin de intensidad espacial
discreta en un set de elementos detectores.
Se supone que el patrn de dispersin medido del conjunto de partculas es idntico a la suma de los patrones de todas las
partculas dispersivas individuales presentadas en posiciones relativas aleatorias. Se debe tener en cuenta que las lentes y por lo
tanto, el detector, slo captan un intervalo angular limitado de luz dispersa.

DESARROLLO DEL MTODO

La medicin del tamao de las partculas por difraccin lser puede arrojar datos reproducibles, incluso en la regin submi-
cromtrica, siempre que el instrumento usado y la muestra analizada sean cuidadosamente controlados para limitar la variabili-
dad de las condiciones de la prueba (p.ej., medio de dispersin, mtodo de preparacin de la dispersin de la muestra).
Tradicionalmente, la medicin del tamao de partcula utilizando difraccin lser se ha limitado a partculas comprendidas
en un intervalo de aproximadamente O, 1 m a 3 mm. Debido a los recientes avances en el diseo de lentes y equipos, los
instrumentos modernos son habitualmente capaces de exceder este intervalo. Con el informe de validacin, el usuario de-
muestra la aplicabilidad del mtodo para el uso previsto.

Muestreo

La tcnica de muestreo debe ser adecuada para obtener una muestra representativa de un volumen apropiado para la medi-
cin del tamao de partculas. Se pueden aplicar tcnicas de divisin de muestras tales como la del separador rotatorio de
muestras o el mtodo de cono y divisin por cuarteo.

Evaluacin del Procedimiento de Dispersin

La muestra a analizar se inspecciona, visualmente o con la ayuda de un microscopio, para estimar su intervalo de tamao y
forma de partculas. El procedimiento de dispersin debe ajustarse al propsito de la medicin. El propsito puede ser tal, que
se prefiera desaglomerar los grupos en partculas primarias tanto como sea posible o, por el contrario, conservar los grupos tan
intactos como sea posible. En este sentido, las partculas de inters pueden ser partculas primarias o grupos de partculas.
Para el desarrollo de un mtodo, es aconsejable verificar que no ocurra la conminucin de las partculas y, a la inversa, que la
dispersin de las partculas o grupos sea satisfactoria. Por lo general, esto puede hacerse cambiando la energa de dispersin y
monitoreando el cambio de la distribucin del tamao de las partculas. La distribucin de tamao medida no debe cambiar
de manera significativa si la muestra est bien dispersada y las partculas no son frgiles ni solubles. Por otra parte, si el proceso
de fabricacin (p.ej., cristalizacin, molienda) del material ha cambiado, se debe verificar la aplicabilidad del mtodo (p.ej., por
comparacin microscpica).
Las atomizaciones, aerosoles y burbujas de gas en un lquido se deben medir directamente, siempre que su concentracin
sea adecuada, puesto que el muestreo o la dilucin generalmente alteran la distribucin del tamao de las partculas.
En otros casos (como por ejemplo emulsiones, pastas y polvos), se pueden dispersar muestras representativas en los lquidos
adecuados. A menudo se usan aditivos dispersantes (humectantes, estabilizadores) y/o fuerzas mecnicas (p.ej., agitacin, ul-
trasonido) para la desaglomeracin o desagregacin de grupos de partculas y la estabilizacin de la dispersin. Para estas dis-
persiones lquidas, lo que se usa ms comnmente es un sistema de recirculacin, que consiste en una celda de medicin pti-
ca, un bao de dispersin por lo general equipado con un mezclador y un generador de ultrasonido, una bomba y tuberas.
Las celdas de agitacin sin sistema recirculante son tiles cuando se dispone slo de pequeas cantidades de muestra o cuan-
do se utilizan lquidos especiales en la dispersin.
Los polvos secos tambin pueden convertirse en aerosoles por medio del uso de dispersadores de polvo seco adecuados, los
cuales aplican fuerzas mecnicas para la desaglomeracin o desagregacin. Por lo general, los dispersadores usan la energa
del gas comprimido o la presin diferencial de un sistema de vaco para dispersar las partculas hasta convertirlas en un aerosol
que es soplado a travs de la zona de medicin, habitualmente hacia la entrada de una unidad de vaco que recolecta las part-
USP 39 Pruebas Qumicas/ (429) Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz 351

culas. Sin embargo, en el caso de partculas o grnulos ms gruesos y de libre fluidez, el efecto de la gravedad puede ser sufi-
ciente para dispersar las partculas adecuadamente.
Si el tamao mximo de las partculas de la muestra excede el intervalo de medicin del instrumento, el material que es
demasiado grueso se puede retirar por tamizado, informndose la masa y el porcentaje del material retirado. Sin embargo,
cabe sealar que despus del pretamizado la muestra deja de ser representativa, a menos que se compruebe lo contrario.

Optimizacin de la Dispersin Lquida

Los lquidos, surfactantes y dispersantes usados para dispersar polvos deben:

- ser transparentes a la longitud de onda del lser y estar prcticamente exentos de burbujas de aire o partculas;
- tener un ndice de refraccin que difiera del correspondiente al material de prueba;
- no ser disolventes del material de prueba (lquido puro o solucin saturada, prefiltrada);
- no alterar el tamao de los materiales de prueba (p.ej., por efecto de la solubilidad, aumento de la solubilidad o recristali-
zacin);
- favorecer la fcil formacin y estabilidad de la dispersin;
- ser compatibles con los materiales usados en el instrumento (como juntas tricas, juntas de estanqueidad, tuberas, etc.);
y
- poseer una viscosidad apropiada para facilitar la recirculacin, agitacin y filtracin.
Para humedecer las partculas y estabilizar la dispersin a menudo se usan agentes tensoactivos y/o dispersantes. Para el caso
de cidos y bases dbiles, la amortiguacin del medio dispersante a un pH bajo o alto, respectivamente, puede ayudar a la
identificacin de un dispersante adecuado.
Se puede hacer una verificacin preliminar de la calidad de la dispersin por medio de una inspeccin visual o microscpica.
Tambin es posible tomar muestras fraccionadas de una dispersin madre bien mezclada. Dichas dispersiones madre se for-
man agregando un lquido a la muestra mientras se mezcla, por ejemplo, con una varilla de vidrio, una esptula o un mezcla-
dor por vrtice. Se debe tener cuidado de asegurar la transferencia de una muestra representativa y de que no se sedimenten
las partculas ms grandes. Por lo tanto, se prepara una pasta de la muestra o se lleva a cabo un muestreo rpido de una sus-
pensin que se mantiene bajo agitacin.

Optimizacin de la Dispersin con Gas

Para atomizaciones y dispersiones de polvo seco se puede utilizar un gas comprimido exento de aceite, agua y partculas.
Para retirar dichos materiales del gas comprimido se puede usar una secadora provista de filtro. Toda unidad de vaco debe
estar localizada lejos de la zona de medicin, de forma que no altere la medicin.

Determinacin del Intervalo de Concentracin

Con el fin de producir una relacin seal-ruido aceptable en el detector, la concentracin de partculas en la dispersin debe
exceder un nivel mnimo. De igual manera, debe estar por debajo de un nivel mximo con el fin de evitar la dispersin mlti-
ple. El intervalo de concentracin est influenciado por el ancho del haz lser, la longitud de paso de la zona de medicin, las
propiedades pticas de las partculas y la sensibilidad de los elementos detectores.
En vista de lo anterior, se deben efectuar las mediciones con diferentes concentraciones de partculas para determinar el in-
tervalo apropiado de la concentracin para cualquier muestra tpica de material. [NOTA-En diferentes instrumentos, las con-
centraciones de partculas se representan habitualmente mediante magnitudes y escalas diferentes, p.ej., oscurecimiento, con-
centracin ptica, nmero proporcional de la masa total.]

Determinacin del Tiempo de Medicin

El tiempo de medicin, el tiempo de lectura del detector y la frecuencia de adquisicin se determinan experimentalmente,
de acuerdo con la precisin requerida. Por lo general, el tiempo de medicin permite un gran nmero de barridos o escaneos
en intervalos de tiempo cortos.

Seleccin de un Modelo ptico Apropiado

La mayora de los instrumentos usan la aproximacin de Fraunhofer o la teora de Mie, aunque a veces se aplican otras apro-
ximaciones para el clculo de la matriz de dispersin. La eleccin del modelo terico depende de la aplicacin prevista y las
diferentes suposiciones (tamao, absorbancia, ndice de refraccin, rugosidad, orientacin cristalina, mezcla, etc.) hechas para
el material de prueba. Si los valores del ndice de refraccin (partes real e imaginaria para la longitud de onda usada) no se
conocen exactamente, entonces se puede usar la aproximacin de Frauenhofer o la teora de Mie con una estimacin realista
del ndice de refraccin. La primera tiene la ventaja de que es simple y no necesita valores del ndice de refraccin; la segunda
por lo general arroja distribuciones menos sesgadas del tamao de las partculas, en el caso de partculas pequeas. Por ejem-
352 (429) Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz/ Pruebas Qumicas USP 39

plo, si se usa el modelo Fraunhofer para muestras que contienen una cantidad apreciable de partculas pequeas, transparen-
tes, la cantidad de partculas pequeas calculada puede resultar significativamente sobreestimada. Con el fin de obtener resul-
tados rastreables, es esencial documentar los valores del ndice de refraccin usados, porque pequeas diferencias en los valo-
res supuestos para la parte real e imaginaria del ndice de refraccin complejo pueden ocasionar diferencias significativas en las
distribuciones de tamao de las partculas resultantes. A menudo se aplican valores bajos de la parte imaginaria del ndice de
refraccin (aproximadamente 0,01 a O, 1 i) para permitir la correccin de la absorbancia en funcin de la rugosidad de superfi-
cie de las partculas. En general, cabe anotar que las propiedades pticas de la sustancia a analizar, as como la estructura
(p.ej., forma, rugosidad de superficie y porosidad) influyen en el resultado final.

Validacin

Tpicamente, la validacin de un procedimiento se puede determinar por la evaluacin de su especificidad, linealidad, inter-
valo, exactitud, precisin y robustez. En el anlisis del tamao de partculas por difraccin de luz lser no aplica la especifici-
dad, segn la definicin de la ICH, y no es posible discriminar los diferentes componentes en una muestra, ni discriminar entre
aglomerados y partculas dispersas a menos que se complemente adecuadamente con tcnicas microscpicas. No se puede
aplicar a este procedimiento la exploracin de una relacin lineal entre concentracin y respuesta o un modelo matemtico de
interpolacin. Ms que evaluar la linealidad, este mtodo requiere la definicin de un intervalo de concentracin dentro del
cual el resultado de las mediciones no vare significativamente. Las concentraciones por debajo de ese intervalo producen un
error debido a la deficiente relacin seal-ruido, mientras que las concentraciones por encima de ese intervalo producen un
error debido a la dispersin mltiple. El intervalo depende principalmente del hardware del instrumento. La exactitud se debe
confirmar a travs de una apropiada calificacin del instrumento y de una comparacin con un anlisis microscpico, mientras
que la precisin se puede evaluar por medio de una determinacin de repetibilidad.
La repetibilidad que se consiga con el mtodo depende principalmente de las caractersticas del material (molido o sin mo-
ler, robusto o frgil, ancho de la distribucin de su tamao, etc.) mientras que la repetibilidad requerida depende del propsi-
to de la medicin. Los lmites obligatorios no se pueden especificar en este captulo puesto que la repetibilidad (diferentes pre-
paraciones de la muestra) puede variar apreciablemente de una sustancia a otra. Sin embargo, una buena prctica consiste en
aspirar a criterios de aceptacin para repetibilidad, tales como % RSD <::: 10% [n = 6] para cualquier valor central de la distribu-
cin (p.ej., para x 50 ). Los valores a los lados de la distribucin (p.ej., x 10 y x 90 ) sern sometidos a criterios de aceptacin menos
estrictos, como % RSD <::: 15% [n = 6]. Por debajo de 1O m, estos valores deben duplicarse. La robustez se puede analizar du-
rante la seleccin y optimizacin de los medios y fuerzas de dispersin. El cambio de la energa dispersante se puede monito-
rear por el cambio en la distribucin del tamao de las partculas.

MEDICIN

Precauciones

Seguir las instrucciones en el manual del instrumento:

- no mirar nunca de frente el haz lser directo o sus reflexiones;
- conectar a tierra todos los componentes del instrumento para prevenir la ignicin de los disolventes o explosiones del
polvo;
- verificar la configuracin del instrumento (p.ej., calentamiento, intervalo de medicin y lentes requeridos, distancia de tra-
bajo apropiada, posicin del detector, ausencia de luz diurna brillante directa); y
- en el caso de dispersiones hmedas, evitar burbujas de aire, evaporacin de lquidos, efecto schlieren u otras inhomoge-
neidades en la dispersin; de igual manera, evitar una relacin masa-flujo inapropiada del dispersador o un flujo de aire
turbulento en el caso de dispersiones secas; dichos efectos pueden ocasionar distribuciones errneas del tamao de part-
culas.

Medicin de la Dispersin de la Luz de las Muestras Dispersadas

Despus de la alineacin adecuada de la parte ptica del instrumento se debe efectuar una medicin blanco del medio de
dispersin exento de partculas, usando el mismo mtodo utilizado para la medicin de la muestra. La seal de ruido de fondo
debe estar por debajo del umbral apropiado. Los datos suministrados por el detector se guardan con el fin de restarlos poste-
riormente de los datos obtenidos con la muestra. La dispersin de la muestra se mide de acuerdo con el mtodo desarrollado.
Para cada elemento del detector se calcula una seal promedio, a veces junto con su desviacin estndar. La magnitud de la
seal de cada elemento del detector depende del rea de deteccin, de la intensidad de la luz y de la eficiencia cuntica. Las
coordenadas (tamao y posicin) de los elementos del detector junto con la distancia focal de la lente determinan el intervalo
de los ngulos de dispersin para cada elemento. La mayora de los instrumentos miden tambin la intensidad del haz lser
central (sin dispersar). La relacin entre la intensidad de una muestra dispersada y la obtenida en su ausencia (la medicin
blanco) indica la proporcin de luz dispersada y por lo tanto la concentracin de partculas.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (429) Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz 353

Conversin del Patrn de Dispersin en Distribucin del Tamao de Partcula

Este paso de deconvolucin es la inversa del clculo de un patrn de dispersin para una distribucin dada del tamao de
partcula. La suposicin de la forma esfrica de las partculas es especialmente importante por cuanto la mayora de los algorit-
mos usan la solucin matemtica para la dispersin por partculas esfricas. Adems, los datos medidos siempre contienen
errores aleatorios y sistemticos que podran viciar las distribuciones de tamao. Se han desarrollado varios procedimientos
matemticos para usar en los instrumentos disponibles. Estos permiten cierta ponderacin de las desviaciones entre los patro-
nes de dispersin medidos y calculados (p.ej., cuadrados mnimos), algunas restricciones (p.ej., no negatividad para cantidades
de partculas), y/o cierta suavizacin de la curva de distribucin de tamao.
Los algoritmos utilizados son especficos para cada marca y modelo de equipo y estn amparados por una licencia. Las dife-
rencias en los algoritmos entre distintos instrumentos pueden dar lugar a diferencias en las distribuciones de tamaos de las
partculas calculadas.

Repeticiones

El nmero de mediciones repetidas (con preparaciones de muestras individuales) a efectuar depende de la precisin requeri-
da en la medicin. Se recomienda fijar este nmero en el mtodo especfico de una sustancia.

INFORME DE RESULTADOS

Los datos de distribucin del tamao de las partculas por lo general se informan como una distribucin acumulada de los
tamaos inferiores y/o como distribucin de la densidad por volumen. El smbolo x se usa para indicar el tamao de la partcu-
la, que a su vez se define como el dimetro de una esfera de volumen equivalente. Q3(x) indica la fraccin en volumen de las
partculas de tamao menor a x. En una representacin grfica, x se representa sobre la abscisa y la variable dependiente Q3
sobre la ordenada. Los valores caractersticos ms comunes se calculan por interpolacin de la curva de distribucin del tama-
o de partculas. Con frecuencia se usan tamaos de partculas de las fracciones acumuladas del 10%, 50%, y 90% (x 10, x50, y
x90, respectivamente); x50 se conoce tambin como la mediana del tamao de partcula. Se reconoce que el smbolo d se usa
tambin ampliamente para designar el tamao de partcula, por lo cual el smbolo x podra reemplazarse por d.
Por otra parte, se debe documentar suficiente informacin sobre la muestra, la preparacin de la muestra, las condiciones de
dispersin y el tipo de celda. Dado que los resultados dependen del instrumento particular, el programa de anlisis de datos y
el modelo ptico usado, estos detalles tambin se deben documentar.

CONTROL DEL DESEMPEO DEL INSTRUMENTO

Usar el instrumento segn las instrucciones del fabricante y llevar a cabo las calificaciones prescritas con la frecuencia ade-
cuada, de acuerdo con el uso del instrumento y las sustancias a examinar.

Calibracin

Los sistemas de difraccin lser, aunque suponen propiedades idealizadas de las partculas, se basan en los principios funda-
mentales de la dispersin de la luz lser. Por eso, no se requiere una calibracin en el sentido estricto. Sin embargo, es necesa-
rio confirmar que el instrumento funciona correctamente. Esto puede efectuarse usando cualquier material de referencia certifi-
cado que sea aceptable en la prctica industrial. Se examina el procedimiento de medicin completo, incluidos la recoleccin
de la muestra, la dispersin de la muestra, el transporte de la muestra a travs de la zona de medicin, la medicin y el proce-
dimiento de deconvolucin. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
Los materiales de referencia certificados preferidos constan de partculas esfricas de una distribucin conocida. Deben estar
certificados en lo que respecta a la distribucin del tamao en porcentaje de masa por medio de una tcnica absoluta, si estu-
viese disponible, y usarse junto con un procedimiento operativo acordado y detallado. Si se aplica la teora de Mie en el anlisis
de datos, es fundamental que se indiquen las partes real e imaginaria del ndice de refraccin complejo del material. La repre-
sentacin de la distribucin del tamao de partculas por volumen igualar a la de la distribucin por masa, siempre que la
densidad de las partculas sea la misma para todas las fracciones de tamaos.
La respuesta de un instrumento de difraccin lser cumple con los requisitos si el valor medio de x50 de por lo menos tres
mediciones independientes no se desva en ms de 3% del intervalo de valores certificado del material de referencia certifica-
do. Los valores medios para x10 y x90 no se deben desviar del intervalo de valores certificado en ms del 5%. Por debajo de 1 O
m, estos valores deben duplicarse.
Pese a que se prefiere el uso de materiales compuestos por partculas esfricas, tambin pueden usarse partculas no esfri-
cas. Preferentemente, stas deben tener valores certificados o tpicos provenientes de anlisis de difraccin lser efectuados se-
gn un procedimiento operativo acordado y detallado. El uso de valores de referencia obtenidos por mtodos distintos de la
difraccin lser puede ocasionar una desviacin significativa. El motivo de esta desviacin es que los distintos principios inhe-
354 (429) Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz/ Pruebas Qumicas USP 39

rentes a los diversos mtodos pueden conducir a diferentes dimetros de esferas equivalentes para la misma partcula no esfri-
ca.
Aunque se prefiere el uso de de materiales de referencia certificados, se pueden emplear tambin otros materiales de refe-
rencia bien definidos. Estos consisten en sustancias de composicin y distribucin de tamao de partculas tpicas para una
clase especificada de sustancias. La distribucin del tamao de partculas de los mismos ha demostrado ser estable con el tiem-
po. Los resultados deben cumplir con los datos previamente determinados, con la misma precisin y desviacin que el material
de referencia certificado.

Calificacin del Sistema

Adems de la calibracin, el desempeo del instrumento debe calificarse a intervalos regulares o tan frecuentemente como
sea apropiado. Esto se puede llevar a cabo usando un material de referencia apropiado, como se mencion en el prrafo ante-
rior.
La calificacin del sistema se basa en el concepto de que el equipo, la electrnica, el software y las operaciones analticas
constituyen un sistema integral que se puede evaluar como una entidad. Se examina el procedimiento de medicin completo,
incluidos la recoleccin de la muestra, la dispersin de la muestra, el transporte de la muestra a travs de la zona de medicin,
la medicin y el procedimiento de deconvolucin. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
En general, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se considera que la respuesta de un ins-
trumento de difraccin lser cumple con los requisitos si el valor x50 no se desva en ms de 10% del intervalo de valores del
material de referencia. Si se evalan opcionalmente los valores a los lados de la distribucin (p.ej., x10 y x90 ), estos valores no se
deben desviar en ms de 15% del intervalo de valores certificado. Por debajo de 1O m, estos valores deben duplicarse.
NOTA-Para la calibracin del instrumento, en el prrafo sobre Calibracin se especifican requisitos ms estrictos.

(431) DETERMINACIN DE GRUPOS METOXILO

APARATO

El aparato para la determinacin de grupos metoxilos se muestra esquemticamente en la figura adjunta. El matraz de ebulli-
cin, A, cuenta con un brazo lateral capilar para la introduccin de dixido de carbono o nitrgeno y est conectado a una
columna, 8, que sirve para separar el cido yodhdrico acuoso del yoduro de metilo que es ms voltil. El yoduro de metilo
pasa a travs de agua en una trampa depuradora, C, y finalmente es absorbido en la solucin de bromo-cido actico en el
tubo de absorcin O. El dixido de carbono o nitrgeno se introduce a travs de un dispositivo que regula la presin y se
conecta al aparato por medio de un capilar pequeo que contiene un pequeo trozo de algodn. [NOTA-Evitar el uso de
disolventes orgnicos al limpiar este aparato, ya que las trazas remanentes pueden afectar la determinacin. Esta prueba se
emplea tambin para la determinacin de grupos etoxilo con un tiempo de reaccin de 80 minutos y un equivalente de solu-
cin volumtrica de 0,751 mg de (OC 2 H5).]
Para mayor comodidad en el uso y la limpieza, una junta esfrica de vidrio esmerilado conecta las dos columnas verticales
del aparato. La parte superior del depurador C consta de una junta esfrica 35/20, cuya mitad superior est conectada por
medio del brazo lateral al tubo O. Esto permite separar el aparato en partes y facilita el agregado de agua a la trampa. Adems,
permite el acceso al tubo de ensayo (de 1 O mm) suelto e invertido que sirve como trampa sobre el tubo interno del depurador
c.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (431) Determinacin de Grupos Metoxilo 355

11 mm DE

Robinete 2 mm
de paso

Aparato para la Determinacin de Grupos Metoxilos

REACTIVOS

Solucin de Bromo-cido Actico

Disolver 100 g de acetato de potasio en 1000 ml de una solucin constituida por 900 ml de cido actico glacial y 100 ml
de anhdrido actico. En el da de su utilizacin, agregar 5 ml de bromo a 145 ml de esta solucin.

cido Yodhdrico

Est disponible comercialmente una solucin reactivo incolora o casi incolora de punto de ebullicin constante preparada
para este fin. Si no se obtiene comercialmente, puede prepararse destilando cido yodhdrico sobre fsforo rojo, pasando di-
xido de carbono o nitrgeno a travs del aparato durante la destilacin. Usar la mezcla de punto de ebullicin constante (entre
55% y 58% de HI) que destila entre 126 y 127, que es incolora o casi incolora. [Precaucin-Se deben tomar medidas de segu-
ridad al destilar cido Yodhdrico.] Colocar el cido en frascos pequeos de color mbar con tapn de vidrio purgados con di-
xido de carbono o nitrgeno, sellarlos con parafina y almacenar en un sitio fresco y oscuro.

PROCEDIMIENTO

Preparar el aparato desconectando la junta esfrica y vertiendo agua en la trampa C hasta la mitad. Conectar las dos partes,
empleando una cantidad mnima de una grasa de silicona apropiada para sellar la junta esfrica. Agregar 7 ml de Solucin de
Bromo-cido Actico en el tubo de absorcin D. Pesar la muestra en una cpsula de gelatina tarada y colocarla en el matraz de
ebullicin junto con unas pocas perlas de ebullicin o pedazos de plato poroso. Finalmente agregar 6 ml de cido Yodhdrico y
juntar el matraz a la columna, empleando una cantidad mnima de grasa de silicona apropiada para sellar la unin. Burbujear
dixido de carbono o nitrgeno a travs del aparato a una velocidad de 2 burbujas por segundo; colocar el matraz de ebulli-
cin en un bao de aceite o manto de calentamiento a 150 y continuar la reaccin durante 40 minutos para la determinacin
356 (431) Determinacin de Grupos Metoxilo /Pruebas Qumicas USP 39

de grupos metoxilo, u 80 minutos para la determinacin de grupos etoxilo. Drenar el contenido del tubo de absorcin en un
matraz Erlenmeyer de 500 mL que contenga 1 O mL de solucin de acetato de sodio (1 en 4). Lavar el tubo con agua, agregar
los lquidos de lavado al matraz y finalmente, diluir con agua hasta aproximadamente 125 ml. Agregar cido frmico, gota a
gota, agitando por rotacin moderada hasta que el color marrn rojizo del bromo desaparezca; luego agregar 3 gotas adicio-
nales. Por lo general, se requiere un total de 12 a 15 gotas. Dejar en reposo durante 3 minutos y agregar 15 mL de cido
sulfrico diluido y 3 g de yoduro de potasio y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio O, 1 N SV usando 3 mL de almidn
SR como indicador. Realizar una determinacin con un blanco, incluyendo tambin una cpsula de gelatina y hacer las correc-
ciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 0,517 mg de (OCH 3).

,,
(441) VALORACION DE NIACINA O NIACINAMIDA

Estndares de Referencia USP (11)

ER cido 6-Hidroxinicotnico USP (ver el Procedimiento 4)
ER Niacina USP
ER Niacinamida USP
NOTA-Los Estndares de Referencia secados previamente se pueden almacenar en un desecador sobre gel de slice. Prote-
ger de la luz.

MTODO QUMICO

El siguiente procedimiento fotomtrico implica la reaccin colorimtrica de niacina o niacinamida con bromuro de ciange-
no en presencia de cido sulfanlico. Se puede usar para la determinacin de niacina o niacinamida en las monografas como
Niacina, Inyeccin; Niacinamida, Inyeccin y Niacinamida, Tabletas.
[NOTA-Determinar a partir de la informacin del etiquetado si la vitamina presente en la muestra de valoracin es niacina o
niacinamida y emplear la preparacin estndar correspondiente (ya sea Preparacin estndar de niacina o Preparacin estndar
de niacinamida) segn se indica en el Procedimiento.]
Solucin de bromuro de ciangeno: Disolver 5 g de bromuro de ciangeno en agua para obtener 50 ml.
[PRECAUCIN-Preparar esta solucin bajo una campana, ya que el bromuro de ciangeno se volatiliza a temperatura ambiente y el
vapor es sumamente irritante y venenoso.]
Solucin de cido sulfanlico: Agregar 15 mL de agua y 3 mL de hidrxido de amonio 6 N a 2,5 g de cido sulfanlico.
Mezclar y, si fuera necesario, agregar mezclando ms hidrxido de amonio 6 N hasta que el cido se disuelva. Ajustar el pH de
la solucin con cido clorhdrico 3 N a aproximadamente 4,5 empleando verde de bromocresol SR como indicador externo, y
diluir con agua hasta 25 ml.
Solucin madre de niacina estndar: Transferir 25,0 mg de ER Niacina USP a un matraz volumtrico de 500 mL, disolver
en solucin de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con solucin de alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un refrigerador.
Cada mL de esta solucin contiene 50 g de ER Niacina USP.
Preparacin estndar de niacina: Transferir 10,0 mL de Solucin madre de niacina estndar a un matraz volumtrico de
100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solucin contiene 5 g de ER Niacina USP.
Solucin madre de niacinamida estndar: Transferir 50,0 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumtrico de 500
mL, disolver en solucin de alcohol (1 en 4), diluir con solucin de alcohol (1 en 4) a volumen y mezclar. Almacenar en un
refrigerador. Cada mL de esta solucin contiene 100 g de ER Niacinamida USP.
Preparacin estndar de niacinamida: Transferir 10,0 mL de Solucin madre de niacinamida estndar a un matraz volu-
mtrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solucin contiene 1 O g de ER Niacinamida USP.
Preparacin de valoracin: Preparar segn se indica en la monografa individual.
Procedimiento: Pipetear y transferir a cuatro tubos marcados las cantidades de la Preparacin estndar correspondiente, de
la Preparacin de valoracin, de la Dilucin de amonaco y de Agua segn se indican en la Tabla 1. Luego agregar los dems
componentes, respectivamente, segn se indican en la tabla, conforme a las instrucciones que se proporcionan en este captu-
lo.
Tabla 1. Mezclas de Reaccin para la Valoracln de Niacina o
Nlaclnamlda-Mtodo Qumico
Tubo 1 Tubo2 Tubo 3 Tubo4
Componente (ml) (ml) (ml) (ml)
Preparacin estndar 1,0 1,0 - -
Preparacin de valoracin - - 1,0 1,0
Dilucin de amonaco (hidrxido de amonio, diluido a 1
en 50) 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua 6,5 1,5 6,5 1,5
USP 39 Pruebas Qumicas/ (441) Valoracin de Niacina o Niacinamida 357

Tabla 1. Mezclas de Reaccin para la Valoracln de Nlaclna o

Nlaclnamlda-Mtodo Qumico (Continuacin)
Tubo 1 Tubo2 Tubo 3 Tubo4
Componente (ml) (ml) (ml) (ml)
Solucin de bromuro
de ciangeno - 5,0 - 5,0
Solucin de cido sulfanlico 2,0 2,0 2,0 2,0
cido clorhdrico 1 gota - 1 qota -
Agregar al Tubo 7 la Solucin de cido sulfanlico, agitar bien, agregar el cido clorhdrico, mezclar, colocar en un espectrofot-
metro adecuado y ajustar a absorbancia cero a 450 nm. Agregar al Tubo 2 la Solucin de bromuro de ciangeno, mezclar y a los
30 segundos, cronometrados con exactitud, despus de completar la adicin del bromuro de ciangeno, agregar la Solucin
de cido su/fanlico, agitando por rotacin suave. Cerrar el tubo, colocarlo en el espectrofotmetro y despus de 2 minutos me-
dir su absorbancia a 450 nm contra el Tubo 7 utilizado como blanco, designando la absorbancia como A5 Repetir el procedi-
miento con el Tubo 3 (como blanco) y el Tubo 4, designando la absorbancia del Tubo 4 como Au. Calcular la cantidad de niaci-
na o niacinamida en la muestra segn se indica en la monografa individual.

MTODOS CROMATOGRFICOS

Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se proveen para la determinacin de niacina o niacinamida co-
mo un ingrediente farmacutico activo, como un ingrediente de suplemento diettico o como un componente de suplemen-
tos dietticos o de formas farmacuticas.
Usar el Estndar de Referencia USP apropiado para la niacina o niacinamida presente en la formulacin.
A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmsfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan
de la muestra de prueba y de los Estndares de Referencia, usando preferiblemente material de vidrio con proteccin actnica.
Procedimiento 1
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacina o niacinamida en:
- Vitaminas olesolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin usando agua caliente o agitacin mecnica
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y las soluciones
reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Diluyente: Acetonitrilo, cido actico glacial y agua (5:1 :94)
Fase mvil: Una mezcla de metanol, cido actico glacial y agua (27:1 :73) que contenga 140 mg de 1-hexanosulfonato de
sodio por cada 100 ml
Solucin estndar: Transferir 80 mg de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP a un matraz volumtrico de 200 ml y agregar
180 ml de Diluyente. Sumergir el matraz en un bao de agua caliente mantenido a 65-70 durante 1O minutos agitando
regularmente o usando un mezclador de vrtice, hasta que se disuelvan todos los materiales slidos. Enfriar rpidamente en un
bao de agua fra durante 1O minutos a temperatura ambiente y diluir con Diluyente a volumen.
Solucin muestra: Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 30 tabletas. Transferir una porcin del polvo, equivalente
a 1O mg de niacinamida y 2,5 mg de clorhidrato de piridoxina, de riboflavina y de clorhidrato de tiamina a un tubo de centr-
fuga de 50 ml. Agregar 25,0 ml de Diluyente y mezclar usando un mezclador de vrtice durante 30 segundos para suspender
el polvo completamente. Sumergir el tubo de centrfuga en un bao de agua caliente mantenido a 65-70, calentar durante
5 minutos y mezclar en un mezclador de vrtice durante 30 segundos. Volver a sumergir el tubo en el bao de agua caliente,
calentar durante otros 5 minutos y mezclar en un mezclador de vrtice durante 30 segundos. Filtrar una porcin de la solu-
cin, enfriar a temperatura ambiente y usar el filtrado transparente. [NOTA-Usar el filtrado dentro de las 3 horas de la filtra-
cin.]
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyeccin: 1O L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Medir las reas de los picos de niacina o niacinamida.
358 (441) Valoracin de Niacina o Niacinamida / Pruebas Qumicas USP 39

Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N02 ) o niacinamida (C 6 H6 Nz) en la porcin de la Muestra
tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Cu= concentracin nominal de niacina o niacinamida en la Solucin muestra (mg/ml)
Procedimiento 2
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacina o niacinamida en:
- Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin mediante el Disolvente de extraccin, calor y agita-
cin mecnica.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y las soluciones
reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Solucin A: Transferir 1 ml de cido actico glacial y 2,5 g de edetato disdico a un matraz volumtrico de 100 ml. Disolver
y diluir con agua a volumen.
Disolvente de extraccin: Solucin A y metanol (3:1)
Fase mvil: Solucin de acetato de sodio O, 1 M (13,6 mg/ml de acetato de sodio en agua). Ajustar con cido actico a un
pH de 5,4. [NOTA-Se puede agregar una pequea cantidad de metanol (hasta 1%) a la Fase mvil para mejorar la resolucin.]
Solucin madre del estndar: 1 mg/ml de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Disolvente de extraccin
Solucin estndar: Transferir 5,0 ml de Solucin madre del estndar a un matraz volumtrico de 25 ml y diluir con Disolven-
te de extraccin a volumen.
Solucin muestra: [NOTA-Esta preparacin es adecuada para la determinacin de niacina o niacinamida, piridoxina y ribo-
flavina, cuando se encuentran presentes en la formulacin.] Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Trans-
ferir una porcin del polvo, equivalente a 2 mg de riboflavina, a un matraz volumtrico de 200 ml. Si la riboflavina no se
encuentra presente en la formulacin, transferir una porcin del polvo, equivalente a 2 mg de piridoxina. Si la piridoxina no se
encuentra presente en la formulacin, transferir una porcin del polvo, equivalente a 20 mg de niacina o niacinamida. Agregar
100,0 ml de Disolvente de extraccin y mezclar durante 20 minutos, usando un agitador de movimiento tipo mueca (wrist
action). Sumergir el matraz en un bao de agua mantenido a 70-75 y calentar durante 20 minutos. Mezclar en un mezcla-
dor de vrtice durante 30 segundos, enfriar a temperatura ambiente y filtrar. Usar el filtrado transparente.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0% [NOTA-Si fuera necesario, purgar la columna con metano! entre inyec-
ciones.]
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2) o niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porcin de la Muestra
tomada:

Resultado= (ruf r5) x (CsfCu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin estndar
C5 =concentracin de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Cu= concentracin nominal de niacina o niacinamida en la Solucin muestra (mg/ml)
Procedimiento 3
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacina o niacinamida en:
- Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin mediante mezclas de disolventes orgnicos, calor y
agitacin mecnica.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y las soluciones
reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Reactivo: 25 mg/ml de edetato disdico en agua
USP 39 Pruebas Qumicas/ (441) Valoracin de Niacina o Niacinamida 359

Fase mvil: Transferir 0,4 ml de trietilamina, 15,0 ml de cido actico glacial y 350 ml de metanol a un matraz volumtrico
de 2000 ml. Diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M a volumen.
Solucin madre del estndar: 1,5 mg/ml de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Reactivo, calentando si fuera necesa-
rio.
Solucin estndar: Transferir 5,0 ml de Solucin madre del estndar a un matraz de 125 ml con tapn. Agregar 10,0 ml de
un a mezcla de metanol y cido actico glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1 ). Tapar, agitar
durante 15 minutos en un bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado.
Solucin muestra: Para tabletas, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Transferir una porcin del polvo,
equivalente a 7,5 mg de niacina o niacinamida, a un matraz de 125 ml con tapn. Agregar 10,0 ml de una mezcla de meta-
no! y cido actico glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1 ). Tapar, agitar durante 15 minutos en
un bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 270 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L7
Temperatura de la columna: 50
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyeccin: 5 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2) o niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porcin de la Muestra
tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Cu= concentracin nominal de niacina o niacinamida en la Solucin muestra (mg/ml)
Procedimiento 4
Este procedimiento se puede usar para describir niacina como:
- Un ingrediente farmacutico activo
- Un ingrediente de suplemento diettico
- Un ingrediente en las tabletas de liberacin prolongada de niacina
Este procedimiento implica disolver el analito en Diluyente, una mezcla de metanol y agua (82:18), o extraer el analito de
la formulacin con Diluyente y agitacin mecnica
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar A, la
Solucin estndar B, la Solucin muestra A, la Solucin muestra By las soluciones reactivo se preparan segn se indica a
continuacin.
Diluyente: Metanol y agua (82:18)
Fase mvil: Metanol y agua (82:18), ajustada con cido actico glacial a un pH de 3, 15 0,05
Solucin de aptitud del sistema: 0,25 mg/ml de ER Niacina USP, 0,050 mg/ml de ER cido 6-Hidroxinicotnico USP y 0, 1O
mg/ml de piridina en Diluyente
Solucin estndar A: Para un ingrediente farmacutico activo o ingrediente de suplemento diettico, usar 0,25 mg/ml de
ER Niacina USP en Diluyente.
Solucin estndar B: Para tabletas de liberacin prolongada, usar 0,25 mg/ml de ER Niacina USP, 0,050 mg/ml de ER ci-
do 6-Hidroxinicotnico USP y 0,0978 mg/ml de piridina en Diluyente.
Solucin muestra A: Para un ingrediente farmacutico activo o ingrediente de suplemento diettico, usar 0,25 mg/ml de
Niacina en Diluyente.
Solucin muestra B: Para tabletas de liberacin prolongada, transferir una cantidad del polvo, equivalente a 50 mg de niaci-
na, a partir de no menos de 20 tabletas reducidas a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar Diluyente y mezclar durante 2
horas. Diluir con Diluyente hasta una concentracin final de 0,25 mg/ml de niacina.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 260 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 5 m
360 (441) Valoracin de Niacina o Niacinamida / Pruebas Qumicas USP 39

Velocidad de flujo: 1 ml/min

Volumen de inyeccin: 25 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar A o Solucin estndar B [NOTA-Los tiempos de retencin rela-
tivos para piridina, cido 6-hidroxinicotnico y niacina son O, 14; 0,64 y 1,0, respectivamente, Solucin de aptitud del sistema.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1,5 entre piridina y cido 6-hidroxinicotnico y no menos de 1,5 entre cido 6-hidroxinicotnico
y niacina, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solucin estndar A o
Solucin estndar B
Anlisis
Muestras: Solucin estndar A y Solucin muestra A o Solucin estndar By Solucin muestra B
Calcular el porcentaje de niacina (C 6 H5 N0 2 ) en la porcin de la Muestra tomada:

Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina de la Solucin muestra A o Solucin muestra B

r5 = respuesta del pico de niacina de la Solucin estndar A o Solucin estndar B
C5 =concentracin de ER Niacina USP en la Solucin estndar A o Solucin estndar B (mg/ml)
Cu= concentracin de Niacina en la Solucin muestra A o concentracin nominal de niacina en la Solucin muestra B
(mg/ml)
Procedimiento 5
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacinamida como:
- Un ingrediente farmacutico activo
- Un ingrediente de suplemento diettico
Este procedimiento implica disolver niacinamida como el ingrediente farmacutico activo o ingrediente de suplemento
diettico en Fase mvil
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar, la
Solucin de niacina, la Solucin muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Metanol y 1-heptanosulfonato de sodio 0,005 M (30:70)
Solucin estndar: Transferir 50 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumtrico de 100 ml. Agregar 3 ml de agua
para disolver y diluir con Fase mvil a volumen. Diluir con Fase mvil hasta 0,04 mg/ml.
Solucin de niacina: Preparar segn se indica en Solucin estndar, usando ER Niacina USP en lugar de ER Niacinamida USP.
Solucin de aptitud del sistema: Mezclar volmenes iguales de Solucin estndar y Solucin de niacina.
Solucin muestra: Preparar segn se indica en Solucin estndar, usando Niacinamida en lugar de ER Niacinamida USP.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 3,0 entre niacina y niacinamida, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de niacinamida en inyecciones repetidas, Solucin estndar
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porcin de la Muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacinamida de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de niacinamida de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Niacinamida USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Cu= concentracin de Niacinamida en la Solucin muestra (mg/ml)
Procedimiento 6
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacina como:
- Un ingrediente activo en las tabletas de niacina
Este procedimiento implica la extraccin de la niacina de la formulacin usando agua, calor y agitacin mecnica.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y las soluciones
reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (451) Volumetra con Nitrito 361

Solucin A: Solucin 5 mM de 1-hexanosulfonato de sodio en agua

Fase mvil: Metanol, acetonitrilo, cido actico glacial y Solucin A (14:7:1 :78)
Solucin estndar: 0,050 mg/mL de ER Niacina USP en agua. Disolver con ayuda de calor en un bao de vapor.
Solucin muestra: Para tabletas, transferir el equivalente a 500 mg de niacina, a partir de no menos de 20 tabletas reducidas
a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar 50 mL de agua y calentar en un bao de vapor durante 30 minutos. Someter a
ultrasonido durante 2 minutos, agitar mecnicamente durante 15 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Diluir con agua
hasta 0,050 mg/mL y filtrar.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 262 nm
Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno Ll
Velocidad de flujo: 1,3 mL/min
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Eficiencia de la columna: No menos de 1000 platos tericos para el pico de niacina
Factor de asimetra: No menos de 2,0 para el pico de niacina
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solucin estndar
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N02) en la porcin de la Muestra tomada:
Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de niacina de la Solucin estndar
C5 =concentracin de ER Niacina USP en la Solucin estndar (mg/mL)
Cu= concentracin nominal de niacina en la Solucin muestra (mg/mL)

(451) VOLUMETRA CON NITRITO

El siguiente mtodo general se utiliza para la determinacin de la mayora de los medicamentos farmacopeicos con sulfona-
midas y sus formas farmacuticas, as como de otros medicamentos farmacopeicos para los cuales la volumetra con nitrito
resulta particularmente apropiada.
Estndares de referencia USP (11 )-fR Sulfanilamida USP.
Procedimiento-Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg en el caso de una sulfonamida, o la cantidad especificada
en la monografa individual y transferir a un recipiente apropiado abierto. Agregar 20 mL de cido clorhdrico y 50 mL de
agua, mezclar hasta disolver, enfriar hasta aproximadamente 15, lentamente valorar con nitrito de sodio O, 1 M SV, previa-
mente normalizado frente a ER Sulfanilamida USP.
Determinar electromtricamente el punto final empleando electrodos apropiados (de platino-calomel o platino-platino). Co-
locar la punta de la bureta debajo de la superficie de la solucin para evitar la oxidacin del nitrito de sodio por efecto del aire
y agitar la solucin suavemente, usando un agitador magntico, evitando la formacin de un vrtice de aire bajo la superficie y
manteniendo la temperatura aproximadamente a 15. La volumetra puede llevarse a cabo manualmente, o con un titulador
automtico. En la volumetra manual, agregar la solucin volumtrica hasta que la volumetra est cerca de 1 mL del punto
final y luego, agregar porciones de O, 1 mL, dejando que transcurra no menos de 1 minuto entre cada adicin. (La aguja del
instrumento se desva y luego regresa aproximadamente a su posicin original hasta que se alcanza el punto final).
El peso, en mg, de la sustancia al que equivale cada mL de nitrito de sodio O, 1 M SV es el indicado en la monografa indivi-
dual.
Para la valoracin de Tabletas de sulfonamidas u otros frmacos, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas, pesar con
exactitud una porcin del polvo, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de frmaco
especificada en la monografa individual y proceder segn se indica previamente, desde donde dice "transferir a un recipiente
apropiado abierto".
Para la valoracin de Inyectables y otras formas lquidas para las que se especifica la volumetra con nitrito, pipetear una
porcin, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de frmaco especificada en la mo-
nografa individual, y transferir a un recipiente abierto apropiado y proceder segn se indica previamente, desde donde dice
"Agregar 20 mL de cido clorhdrico".
 362 (461) Determinacin de Nitrgeno/ Pruebas Qumicas USP 39

(461) DETERMINACIN DE NITRGENO

Algunos alcaloides y otros compuestos orgnicos que contienen nitrgeno no proporcionan todo el nitrgeno que contie-
nen al someterlos a digestin con cido sulfrico; en consecuencia, estos mtodos no pueden emplearse para la determinacin
de nitrgeno en todos los compuestos orgnicos.

MTODO 1

Nitratos y Nitritos Ausentes-Colocar aproximadamente 1 g de la sustancia, pesado con exactitud, en un matraz de Kjel-
dahl de 500 ml de vidrio de borosilicato duro. El material a analizar, si es slido o semislido, puede envolverse en una hoja de
papel de filtro exento de nitrgeno para transferirlo mas cmodamente al matraz. Agregar 1O g de sulfato de potasio en polvo
o sulfato de sodio anhidro, 500 mg de sulfato cprico en polvo y 20 ml de cido sulfrico. Inclinar el matraz en un ngulo de
aproximadamente 45 y calentar moderadamente la mezcla, manteniendo la temperatura debajo del punto de ebullicin has-
ta que deje de producir espuma. Aumentar el calor hasta que el cido llegue a una ebullicin intensa y continuar el calenta-
miento hasta que la solucin se torne casi incolora o adquiera un color verde transparente durante 30 minutos. Dejar que se
enfre, agregar 150 ml de agua, mezclar el contenido del matraz y volver a enfriar. Agregar cuidadosamente 100 ml de solu-
cin de hidrxido de sodio (2 en 5), de tal manera que la solucin fluya hacia abajo por la pared interna del matraz y forme
una capa bajo la solucin cida. Agregar inmediatamente unos pedazos de cinc granulado y, sin demorarse, conectar el ma-
traz a un bulbo de conexin (trampa) Kjeldahl, previamente unido a un condensador, cuyo tubo de salida est sumergido de-
bajo de la superficie de 100 ml de solucin de cido brico (1 en 25) contenidos en un matraz Erlenmeyer o en un frasco de
boca ancha de aproximadamente 500 ml de capacidad. Mezclar el contenido del matraz de Kjeldahl mediante rotacin mo-
derada y destilar hasta que se hayan destilado aproximadamente cuatro quintas partes del contenido del matraz. Valorar con
cido sulfrico 0,5 N SV, determinando el punto final potenciomtricamente. Realizar una determinacin con un blanco y ha-
cer las correcciones necesarias. Cada ml de cido sulfrico 0,5 N SV equivale a 7,003 mg de nitrgeno.
Cuando se sabe que el contenido de nitrgeno de la sustancia es bajo, el cido sulfrico 0,5 N SV puede reemplazarse por
cido sulfrico O, 1 N SV. Cada ml de cido sulfrico O, 1 N SV equivale a 1,401 mg de nitrgeno.
Nitratos y Nitritos Presentes-Colocar una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud, que corresponda aproximada-
mente a 150 mg de nitrgeno, en un matraz de Kjeldahl de 500 ml de vidrio de borosilicato duro y agregar 25 ml de cido
sulfrico en el cual se ha disuelto previamente 1 g de cido saliclico. Mezclar el contenido del matraz y dejar reposar la mezcla
durante 30 minutos agitando frecuentemente. Agregar a la mezcla 5 g de tiosulfato de sodio en polvo y volver a mezclar; lue-
go, agregar 500 mg de sulfato cprico en polvo y proceder segn se indica en Nitratos y Nitritos Ausentes, desde donde dice
"Inclinar el matraz a un ngulo de aproximadamente 45".
Cuando se sabe que el contenido de nitrgeno de la sustancia excede de 10%, pueden agregarse entre 500 mg y 1 g de
cido benzoico, antes de la digestin, para facilitar la descomposicin de la sustancia.

MTODO 11
Aparato-Seleccionar un matraz de Kjeldahl de 300 ml adecuado, del cual se libera el nitrgeno por digestin cida en
primer lugar y luego se transfiere cuantitativamente al recipiente de volumetra mediante destilacin con vapor.
Procedimiento-Colocar en el matraz de digestin del aparato una cantidad del material pesada o medida con exactitud,
equivalente a 2 a 3 mg de nitrgeno. Agregar 1 g de una mezcla pulverizada de sulfato de potasio y sulfato cprico (10:1) y
lavar el cuello del matraz con un chorro fino de agua para desprender cualquier material adherido a l. Agregar 7 ml de cido
sulfrico, dejando que se escurra por las paredes del matraz; luego, girando el matraz con rotacin suave, agregar cuidadosa-
mente 1 ml de perxido de hidrgeno al 30 por ciento de manera tal que resbale por la pared del matraz. (No agregar per-
xido de hidrgeno durante la digestin).
Calentar el matraz sobre una llama libre o sobre un calentador elctrico hasta que la solucin tome un color azul transparen-
te y las paredes del matraz estn exentas de material carbonoso. Agregar cuidadosamente 70 ml de agua a la mezcla de di-
gestin, enfriar la solucin y preparar para destilacin con vapor. Agregar 30 ml de solucin de hidrxido de sodio (2 en 5) a
travs de un embudo, de manera tal que la solucin fluya hacia abajo por la pared interna del matraz para formar una capa
bajo la solucin cida; enjuagar el embudo con 1O ml de agua, cerrar hermticamente el aparato y comenzar la destilacin
con vapor inmediatamente. Recibir el destilado en 15 ml de solucin de cido brico (1 en 25), a la cual se le han agregado
3 gotas de rojo de metilo-azul de metileno SR y agua suficiente para cubrir el extremo del tubo condensador. Continuar la
destilacin hasta que el destilado mida de 80 a 100 ml. Retirar el matraz de absorcin, enjuagar el extremo del tubo conden-
sador con una cantidad pequea de agua y valorar volumtricamente el destilado con cido sulfrico 0,01 N SV. Realizar una
determinacin con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de cido sulfrico 0,01 N SV equivale a 140, 1 g
de nitrgeno.
Cuando se toma una cantidad de material que contiene ms de 2 mg a 3 mg de nitrgeno, puede emplearse cido sulfrico
0,02 N o O, 1 N, siempre y cuando se requieran al menos 15 ml para la volumetra. Si el peso seco total de material tomado es
mayor de 100 mg, aumentar proporcionalmente las cantidades de cido sulfrico y de hidrxido de sodio.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (466) Impurezas Comunes 363

(466) IMPUREZAS COMUNES

Esta prueba tiene como fin evaluar la presencia de impurezas comunes en artculos oficiales y se utiliza cuando una mono-
grafa individual as lo indica. Las impurezas comunes se definen como aquellas especies en frmacos y/o productos farmacu-
ticos que no poseen una actividad biolgica indeseable significativa en las cantidades presentes. Estas impurezas pueden surgir
de la sntesis, preparacin o degradacin de los artculos farmacopeicos. En algunos casos, se pueden detectar impurezas que
representan un riesgo potencial para la salud. Dado que dichas impurezas no seran identificadas individualmente por el uso
estricto de este Captulo General, puede ser necesario realizar otra evaluacin diferente para garantizar que las impurezas de-
tectadas cumplen con los requisitos establecidos en la definicin de Impurezas Comunes. La seleccin de pruebas y valoracio-
nes admite cantidades previstas de impurezas que no son objetables para el uso habitual del artculo.
Informe y Especificaciones-A menos que la monografa individual indique algo diferente, se seleccion el valor 2,0% co-
mo lmite general para la cantidad total de impurezas comunes en monografas en las que la documentacin no respaldaba la
adopcin de otros valores.
Cuando una monografa establece lmites para componentes concomitantes y/o impurezas/productos de degradacin espe-
cificados, estas especies no deben incluirse en la estimacin de impurezas comunes a menos que as lo especifique la monogra-
fa individual. Los componentes concomitantes se definen como especies caractersticas de muchos frmacos que no se consi-
deran impurezas en el sentido Farmacopeico. Son ejemplos de componentes concomitantes los ismeros geomtricos y pti-
cos (o racematos) y los antibiticos que son mezclas. Cualquier componente que pueda considerarse una impureza txica de-
bido a su efecto biolgico indeseable significativo no se considera un componente concomitante.
Metodologa-A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, la estimacin de la cantidad y nmero
de impurezas comunes se hace mediante mtodos relativos en lugar de la comparacin estricta con Estndares de Referencia
individuales. La deteccin no especfica de impurezas comunes tambin es consecuente con esta clasificacin.
Los mtodos de evaluacin tpicos empleados para las impurezas comunes son las tcnicas por cromatografa en capa delga-
da (TLC, por sus siglas en ingls). Ver en Cromatografa (621) una explicacin general de la tcnica por cromatografa en capa
delgada. Las pruebas para sustancias relacionadas o pureza cromatogrfica tambin pueden usarse para evaluar la presencia de
impurezas comunes. Tambin pueden emplearse, con la debida justificacin, otros mtodos alternativos (p.ej., HPLC, HPTLC,
etc.). A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, usar el siguiente mtodo.
Solucin de Prueba-Preparar una solucin de la sustancia en anlisis en el disolvente especificado en la monografa para
obtener una concentracin final conocida con exactitud de aproximadamente 1O mg por ml. [NOTA-Para disolver el frmaco
se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten negativamente el compuesto.]
Soluciones Estndar-Preparar soluciones del Estndar de Referencia USP o de la sustancia indicada en el disolvente especi-
ficado en la monografa, para obtener concentraciones conocidas con exactitud de 0,01 mg por mL, 0,05 mg por mL, 0, 1 mg
por mL y 0,2 mg por ml. [NOTA-Para disolver el frmaco se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos pro-
cedimientos no afecten negativamente el compuesto.]
Procedimiento-Utilizar una placa para cromatografa en capa delgada recubierta de una capa de mezcla de gel de slice
para cromatografa de 0,25 mm de espesor y la Fase mvil especificada en la monografa. Aplicar a la placa volmenes iguales
(de 20 L) de la Solucin de Prueba y de las Soluciones Estndar, empleando una corriente de nitrgeno para secar las manchas.
Desarrollar el cromatograma en una cmara preequilibrada hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximada-
mente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cmara y secar al aire. Examinar la placa utilizando las tcni-
cas de visualizacin especificadas. Localizar en el cromatograma de la Solucin de Prueba cualquier mancha diferente de la
mancha principal y determinar las intensidades relativas por comparacin con las manchas obtenidas en los cromatogramas de
las Soluciones Estndar correspondientes. Ver la discusin anterior en cuanto al informe y especificacin de impurezas comunes
totales.

CLAVE DE LAS TCNICAS DE VISUALIZACIN

(1) Utilizar luz UV a 254 nm y aproximadamente a 366 nm.

(2) Utilizar Yodoplatinato SR.
(3) Solucin A-Mezclar 850 mg de subnitrato de bismuto con 40 mL de agua y 1O mL de cido actico glacial.
Solucin 8-Disolver 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua. Mezclar A y B para obtener una Solucin Madre, la cual se
puede almacenar durante varios meses en un frasco oscuro. Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 1O mL de la Solu-
cin Madre con 20 mL de cido actico glacial y diluir con agua hasta 100 ml.
(4) Solucin de Ninhidrina para Rociado-Disolver 200 mg de ninhidrina en 100 mL de alcohol. Calentar la placa despus de
rociarla.
(5) Solucin de cido para Rociado-En un bao de hielo, agregar lenta y cuidadosamente, y mezclando, 1O mL de cido
sulfrico a 90 mL de alcohol. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice.
(6) Solucin de cido-Dicromato para Rociado-Agregar suficiente dicromato de potasio a 100 mL de cido sulfrico para ob-
tener una solucin saturada. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice.
(7) Vainillina-Disolver 1 g de vainillina en 100 mL de cido sulfrico.
364 (466) Impurezas Comunes/ Pruebas Qumicas USP 39

(8) Cloramina T-cido Tricloroacticcr-Mezclar 1O mL de una solucin acuosa de cloramina Tal 3% con 40 mL de una solu-
cin alcohlica de cido tricloroactico al 25%. Preparar inmediatamente antes de usar.
(9) Fo/in-C-Agregar 1O g de tungstato de sodio y 2,5 g de molibdato de sodio a 70 mL de agua, agregar 5 mL de cido
fosfrico al 85% y 1O mL de cido clorhdrico al 36% y someter esta solucin a reflujo durante 1 O horas.
(1 O) KMn0 4-Disolver 100 mg de Permanganato de Potasio en 100 mL de agua.
(11) DAB-Mezclar 1 g de p-dimetilaminobenzaldehdo en 100 mL de cido clorhdrico 0,6 N.
(12) OAC-Mezclar 100 mg de p-dimetilaminocinamaldehdo en 100 mL de cido clorhdrico 1 N.
(13) Ferricianurcr-Mezclar volmenes iguales de una solucin de cloruro frrico al 1% y de una solucin de ferricianuro de
potasio al 1%. Usar inmediatamente.
(14) Fast Blue 8-Reactivo A-Disolver 500 mg de Sal de Fast Blue B en 100 mL de agua.
Reactivo B-Hidrxido de sodio O, 1 N.
Rociar primero con el Reactivo A y luego con el Reactivo B.
(15) Cianuro Frrico A/ca/incr-Diluir 1,5 mL de una solucin de ferricianuro de potasio al 1 % con agua hasta 20 mL y agregar
1O mL de una solucin de hidrxido de sodio al 15%.
(16) Solucin de Yodo para Rociadcr-Preparar una solucin de yodo al 0,5% en cloroformo.
(17) Exponer la placa durante 1O minutos a los vapores de yodo en una cmara cerrada preequilibrada que tenga cristales
de yodo en el fondo.
(18) Solucin A-Disolver 0,5 g de yoduro de potasio en 50 mL de agua.
Solucin 8-Preparar una solucin de 0,5 g de almidn soluble en 50 mL de agua caliente.
Mezclar volmenes iguales de la Solucin A y de la Solucin B inmediatamente antes de usar.
(19) PTSS-Disolver 20 g de cido p-toluensulfnico en 100 mL de alcohol, rociar la placa, secarla durante 15 minutos a
11 O y examinarla bajo luz UV a 366 nm.
(20) Solucin de o-Tolidina para Rociadcr-Disolver 160 mg de o-tolidina en 30 mL de cido actico glacial, diluir con agua
hasta 500 mL, agregar 1 g de yoduro de potasio y mezclar hasta que el yoduro de potasio se haya disuelto.
(21) Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 3 mL de solucin de cido cloroplatnico (1 en 1 O) con 97 mL de agua,
seguido del agregado de 100 mL de una solucin de yoduro de potasio (6 en 100).
(22) Solucin de Yodo-Metano/ para Rociadcr-Preparar una mezcla de yodo SR y metano! (1: 1).

(467) DISOLVENTES RESIDUALES

INTRODUCCIN

Este captulo general se aplica a frmacos, excipientes y productos existentes. Toda sustancia o producto se encuentra sujeto
al control pertinente de disolventes que pudieran estar presentes en una sustancia o producto.
Generalmente no se mencionan las pruebas de disolventes residuales en las monografas especficas cuando los lmites a apli-
car cumplen con los que se especifican ms adelante, ya que los disolventes empleados pueden variar de un fabricante a otro.
El objetivo de este captulo general es proporcionar las cantidades aceptables de disolventes residuales en productos farma-
cuticos para la seguridad del paciente. El captulo recomienda el uso de disolventes menos txicos y describe niveles conside-
rados toxicolgicamente aceptables para algunos disolventes residuales.
Para propsitos farmacopeicos, los disolventes residuales en productos farmacuticos se definen como las sustancias qumi-
cas orgnicas voltiles que se emplean o producen durante la fabricacin de frmacos o excipientes, o en la preparacin de
productos farmacuticos. Los disolventes residuales no se eliminan por completo mediante las tcnicas prcticas de fabrica-
cin. La seleccin adecuada del disolvente para la sntesis de un frmaco o un excipiente puede mejorar el rendimiento o de-
terminar caractersticas tales como la forma cristalina, la pureza y la solubilidad. Por lo tanto, a veces el disolvente puede ser un
elemento crtico en el proceso de sntesis. Este captulo general no trata los disolventes que se emplean deliberadamente como
excipientes ni los solvatos. No obstante, se debe evaluar y justificar el contenido de disolventes en tales productos.
Dado que los disolventes residuales no proporcionan ningn beneficio teraputico, deben eliminarse en lo posible, para
cumplir con las especificaciones del producto y de sus ingredientes, las buenas prcticas de fabricacin u otros requisitos basa-
dos en la calidad. Los productos farmacuticos no deben contener niveles de disolventes residuales superiores a los que permi-
tan los datos de seguridad. Evitar el uso de disolventes que ocasionen una toxicidad inaceptable (Clase 1, Tabla 7) en la pro-
duccin de frmacos, excipientes o productos farmacuticos, a menos que su uso pueda justificarse fehacientemente mediante
una evaluacin de riesgo-beneficio. Se deber limitar el uso de disolventes asociados a una toxicidad menos grave (Clase 2,
Tabla 2) para proteger a los pacientes de posibles efectos adversos. En una situacin ideal, se deberan emplear los disolventes
menos txicos (Clase 3, Tabla 3). En el Apndice 7 se proporciona la lista de todos los disolventes incluidos en este captulo
general. Estas tablas y el listado no son exhaustivos. Para los fines de esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aproba-
cin por parte de una autoridad reglamentaria competente para usar un disolvente nuevo que no se indica actualmente en
este captulo, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente, el lmite de disolvente residual
aprobado en el artculo y el procedimiento de prueba adecuado para dicho disolvente residual en el artculo. La USP considera-
USP 39 Pruebas Qumicas/ (467) Disolventes Residuales 365

r entonces este tema en la monografa individual. Cuando se aprueba un disolvente nuevo a travs del proceso de ICH, este
disolvente nuevo se agregar a la lista correspondiente en este captulo general. En ese momento, se considerar la eliminacin
del requisito de la prueba para el disolvente especfico en la monografa individual.
Se debern analizar los frmacos, excipientes y productos farmacuticos para detectar la presencia de disolventes residuales
cuando se sepa que los procesos de purificacin o produccin dan como resultado la presencia de tales disolventes residuales.
Solamente es necesario realizar pruebas para los disolventes residuales que se emplean o producen en la purificacin o fabrica-
cin de frmacos, excipientes o productos.
Aunque los fabricantes pueden optar por realizar una prueba al producto farmacutico, se puede emplear un procedimiento
acumulativo para calcular los niveles de disolventes residuales en el producto farmacutico a partir de los niveles en los ingre-
dientes usados para producir el producto farmacutico. Si los clculos dan como resultado un nivel igual o inferior al propor-
cionado en este captulo general, no es necesario considerar la realizacin de la prueba de disolventes residuales al producto
farmacutico. Sin embargo, si el nivel calculado est por encima del nivel recomendado, se debe analizar el producto farma-
cutico para determinar si el proceso de formulacin redujo el nivel del disolvente correspondiente hasta la cantidad acepta-
ble. Tambin se debe analizar un producto farmacutico si durante su fabricacin se utiliza un disolvente residual.
Para los fines de esta Farmacopea, cuando el fabricante recibe la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria com-
petente de un nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del
disolvente y el lmite de disolvente residual aprobado en el artculo. La USP considerar entonces este tema en la monografa
individual.
Ver el Apndice 2 para obtener informacin de referencia adicional sobre disolventes residuales.

CLASIFICACIN DE DISOLVENTES RESIDUALES POR EVALUACIN DE RIESGO

El Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Qumicas (lnternational Program on Chemical Safety, IPCS, por sus
siglas en ingls) emplea la expresin ingesta diaria tolerable (IDT) para describir los lmites de exposicin a sustancias qumicas
txicas, y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) y otros institutos y autoridades sanitarias nacionales e internacionales
emplean la expresin ingesta diaria admisible (IDA). La expresin exposicin diaria permitida (EDP) se define como la ingesta
farmacuticamente admisible de disolventes residuales para evitar crear confusiones con valores diferentes de IDA de una mis-
ma sustancia.
Los disolventes residuales que se evalan en este captulo general se listan en el Apndice 1 segn su estructura y nombre
comn. Los mismos han sido evaluados en funcin del riesgo que pueden suponer para la salud humana y colocados en una
de las tres clases que figuran a continuacin:
Clase de
Disolvente
Residual Evaluacin
Disolventes que deben evitarse.
Sustancias conocidas como carcingenas para los seres humanos.
Clase 1
Sustancias seriamente sospechosas de ser carcingenas para los seres humanos.
Sustancias que representan riesgos ambientales.
Disolventes que deben limitarse.
Sustancias carcingenas y no genotxicas, o posibles agentes causantes de otras toxicidades irreversibles
Clase 2
tales como neurotoxicidad o teratogenicidad, en animales.
Disolventes sospechosos de causar otras toxicidades importantes pero reversibles.
Disolventes con bajo potencial txico
Clase 3 Disolventes con bajo potencial txico para los seres humanos; no es necesario un lmite de exposicin
basado en el riesgo para la salud.
[NOTA-Los disolventes residuales de Clase 3 tienen EDP de 50 mg o ms por da.]*
Para disolventes residuales con EDP superior a 50 mg por da, ver las consideraciones presentadas en la seccin Clase 3 en Lmites de Disolventes Residuales.

MTODOS PARA ESTABLECER LMITES DE EXPOSICIN

El mtodo empleado para establecer la EDP respecto a disolventes residuales se presenta en el Apndice 3.
Para los artculos designados como "slo para uso veterinario", se pueden justificar niveles ms elevados de EDP y de lmite
de concentracin en casos excepcionales, basados en la dosis diaria real, la especie para la cual estn destinados y los datos
toxicolgicos pertinentes, considerando el impacto sobre la seguridad del consumidor. Para los fines de esta Farmacopea,
cuando un fabricante recibe la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria competente de un lmite superior, es res-
ponsabilidad del fabricante notificar a la USP el lmite de disolvente residual aprobado en el artculo y la justificacin. La USP
considerar entonces este tema en la monografa individual.
366 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Qumicas USP 39

OPCIONES PARA DESCRIBIR LOS LMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES DE CLASE 2

Existen dos opciones para establecer los lmites de disolventes residuales de Clase 2.

Opcin 1

Se emplean los lmites de concentracin en ppm indicados en la Tabla 2. stos se calcularon empleando la ecuacin que
figura a continuacin, suponiendo un peso de producto de 1O g administrado diariamente.

Concentracin (ppm) = (1000 g/mg x EDP)/dosis

En este caso, la EDP se expresa en mg por da y la dosis se expresa en g por da.

Estos lmites se consideran aceptables para todos los frmacos, excipientes y productos farmacuticos. Por lo tanto, esta op-
cin se puede aplicar si la dosis diaria no se conoce o no ha sido fijada. Si todos los frmacos y excipientes de una formulacin
cumplen con los lmites que se proporcionan en la Opcin 1, estos componentes se pueden usar en cualquier proporcin. No
es necesario realizar clculos adicionales siempre que la dosis diaria no exceda de 1O g. Los productos que se administran en
dosis superiores a 1O g por da se contemplan en la Opcin 2.

Opcin 2

No se requiere que cada componente del producto farmacutico cumpla con los lmites proporcionados en la Opcin 1. Se
puede emplear la EDP expresada en mg por da segn se indica en la Tabla 2 con la dosis diaria mxima conocida y la ecua-
cin anteriormente mencionada, para determinar la concentracin de disolvente residual permitida en un producto farmacu-
tico. Tales lmites se consideran aceptables, si se demuestra que el disolvente residual se ha reducido al mnimo factible. Los
lmites deben ser realistas en cuanto a la precisin analtica, la capacidad de fabricacin y la variacin razonable en el proceso
de fabricacin. Los lmites tambin deben reflejar las normas de fabricacin actuales.
La Opcin 2 se puede aplicar sumando las cantidades de disolventes residuales presentes en cada uno de los componentes
del producto farmacutico. La suma de las cantidades de disolvente por da debe ser menor que la indicada por la EDP.
A continuacin, se ofrece un ejemplo de la aplicacin de la Opcin 7 y la Opcin 2 para la concentracin de acetonitrilo en
un producto farmacutico. La exposicin diaria permitida al acetonitrilo es 4, 1 mg por da; por lo tanto, el lmite de la Opcin
1 es 41 O ppm. El peso diario mximo administrado de un producto farmacutico es 5,0 g y el producto farmacutico contiene
dos excipientes. La composicin del producto farmacutico y el contenido mximo calculado de acetonitrilo residual se mues-
tran en la siguiente tabla.

Cantidad en la Contenido de Exposicin

Formulacin Acetonitrilo Diaria
Componente (g) (ppm) (mg)
Frmaco 0,3 800 0,24
Excipiente 1 0,9 400 0,36
Excipiente 2 3,8 800 3,04
Producto farmacutico 5,0 728 3,64

El Excipiente 1 cumple con el lmite de la Opcin 1, pero el frmaco, el excipiente 2 y el producto farmacutico no cumplen
con el lmite de la Opcin 1. No obstante, el producto farmacutico cumple con el lmite de la Opcin 2 de 4, l mg por da y de
ese modo se ajusta a los criterios de aceptacin de este captulo general.
A continuacin, se ofrece otro ejemplo que emplea acetonitrilo como disolvente residual. El peso diario mximo administra-
do de un producto farmacutico es 5,0 g y el producto farmacutico contiene dos excipientes. La composicin del producto
farmacutico y el contenido mximo calculado de acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla.

Contenido de Exposicin
Cantidad en la Acetonitrilo Diaria
Componente Formulacin (g) (ppm} (mg}
Frmaco 0,3 800 0,24
Excipiente 1 0,9 2000 1,80
Excipiente 2 3,8 800 3,04
Producto farmacutico 5,0 1016 5,08

En este ejemplo, el producto farmacutico no cumple con el lmite de la Opcin 1 ni con el de la Opcin 2 segn esta suma. El
fabricante podra analizar el producto farmacutico para determinar si el proceso de formulacin redujo el nivel de acetonitrilo.
Si, durante la formulacin, el nivel de acetonitrilo no se redujo a los lmites permitidos, el producto no cumple con los lmites
de disolventes segn se describen en este captulo y el fabricante del producto farmacutico debe tomar otras medidas para
reducir la cantidad de acetonitrilo en el producto farmacutico. En algunos casos, el fabricante puede haber recibido la apro-
bacin por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre dicho nivel ms elevado de disolvente residual. Si ste fue-
USP 39 Pruebas Qumicas/ (467) Disolventes Residuales 367

ra el caso, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el lmite de disolvente residual apro-
bado en el artculo. La USP considerar entonces este tema en la monografa individual.

PROCEDIMIENTOS ANALTICOS

Normalmente, los disolventes residuales se determinan empleando tcnicas cromatogrficas tales como la cromatografa de
gases. Los mtodos oficiales para analizar el contenido de disolventes residuales se describen en la seccin Identificacin, Con-
trol y Cuantificacin de Disolventes Residuales de este captulo general. Las Advertencias Generales tratan el uso de otros mtodos
en circunstancias especiales (ver 6.30. Mtodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados). Si estn presentes disolventes de
Clase 3, se puede usar un mtodo no especfico como por ejemplo prdida por secado.

INFORME DE NIVELES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Los fabricantes de productos farmacuticos necesitan cierta informacin acerca del contenido de disolventes residuales en
frmacos o excipientes para cumplir con los criterios de este captulo general. Las siguientes declaraciones se proporcionan
como ejemplos aceptables de la informacin que podra ofrecer un proveedor de frmacos o excipientes a un fabricante de
productos farmacuticos. El proveedor podra escoger alguna de las que se presentan a continuacin, segn corresponda:
Es probable que estn presentes slo disolventes de Clase 3. La prdida por secado es menos de 0,5%.
Es probable que estn presentes slo los disolventes X, Y, ... de Clase 2. Todos se encuentran por debajo del lmite de la
Opcin 7. (Aqu el fabricante mencionara los disolventes de Clase 2 representados por X, Y, ... )
Es probable que estn presentes slo los disolventes X, Y, ... de Clase 2 y disolventes de Clase 3. Los disolventes residuales
de Clase 2 se encuentran por debajo del lmite de la Opcin 7 y los disolventes residuales de Clase 3 se encuentran por
debajo de 0,5%.
La frase "es probable que estn presentes", segn se usa en los ejemplos anteriores, hace referencia al disolvente usado o
producido en la etapa final de fabricacin y a los disolventes usados o producidos en las etapas iniciales de fabricacin y que
no son eliminados uniformemente mediante un proceso validado.
Si es probable que estn presentes los disolventes de Clase 1, stos se deberan identificar y cuantificar. Si los disolventes de
Clase 2 3 estn presentes en cantidades superiores a los lmites de la Opcin 7 0,5%, respectivamente, stos se deben iden-
tificar y cuantificar.

LMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Clase 1 (Disolventes que deben evitarse)

Los disolventes residuales de Clase 1 (Tabla 7) no deben emplearse en la fabricacin de frmacos, excipientes o productos
farmacuticos debido a su inaceptable toxicidad o sus efectos ambientales perjudiciales. No obstante, si es inevitable su uso en
la fabricacin de un medicamento con una ventaja teraputica significativa, sus niveles deben estar restringidos tal como se
muestra en la Tabla 7, a menos que se indique algo diferente en la monografa individual. El disolvente 1, 1, 1-tricloroetano se
ha incluido en la Tabla 7 debido a que representa un riesgo ambiental. El lmite indicado de 1500 ppm est basado en la revi-
sin de datos de seguridad.
Cuando se emplean o producen disolventes residuales de Clase 1 en la fabricacin o purificacin de frmacos, excipientes o
productos farmacuticos y no son eliminados durante el proceso, estos disolventes se deben identificar y cuantificar. Los proce-
dimientos que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes Residuales de este captulo gene-
ral se deben aplicar siempre que sea posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
Tabla 1. Disolventes Residuales de Clase 1
(Disolventes que deben evitarse)
Lmite de
DI solvente Concentracin (ppm) Motivo
Benceno 2 Carcingeno
Tetracloruro de carbono 4 Txico y presenta riesgos para el medio ambiente
1,2-Dicloroetano 5 Txico
1, 1-Dicloroeteno 8 Txico
1, 1, 1-Tricloroetano 1500 Presenta riesgos para el medio ambiente

Clase 2

Los disolventes residuales de Clase 2 (Tabla 2) deben estar limitados en los frmacos, excipientes y productos farmacuticos
debido a su toxicidad inherente. Las EDP se proporcionan con una aproximacin de O, 1 mg por da y las concentraciones con
368 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Qumicas USP 39

una aproximacin de 1O ppm. Los valores indicados no reflejan la precisin analtica necesaria del proceso de determinacin.
La precisin se debe determinar como parte de la validacin del procedimiento.
Si los disolventes residuales de Clase 2 estn presentes en cantidades superiores a los lmites de la Opcin 7, stos se deben
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes
Residuales de este captulo general se deben aplicar siempre que sea posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un pro-
cedimiento validado apropiado. [NOTA-Los siguientes disolventes residuales de Clase 2 no se detectan con facilidad mediante
las condiciones de inyeccin de fase gaseosa que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes
Residuales de este captulo general: formamida, 2-etoxietanol, 2-metoxietanol, etilenglicol, N-metilpirrolidona y sulfolano. Es
necesario emplear otros procedimientos validados apropiados para la cuantificacin de estos disolventes residuales. Tales pro-
cedimientos se debern remitir a la USP para su revisin y posible inclusin en la monografa individual correspondiente. Ade-
ms, puede usarse ER Mezcla C-Disolventes Residuales de Clase 2 USP para desarrollar un procedimiento alternativo.]
Tabla 2. Disolventes Residuales de Clase 2
Lmite de
EDP Concentracin
Disolvente (mg/da) (ppm)
Acetonitrilo 4,1 410
Ciclohexano 38,8 3880
Clorobenceno 3,6 360
Cloroformo 0,6 60
Cloruro de metileno 6,0 600
Cu meno 0,7 70
1,2-Dicloroeteno 18,7 1870
N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090
N,N-Dimetilformamida 8,8 880
1,2-Dimetoxietano 1,0 100
1,4-Dioxano 3,8 380
Etilenglicol 6,2 620
2-Etoxietanol 1,6 160
Forma mida 2,2 220
Hexano 2,9 290
Metanol 30,0 3000
Metilbutilcetona 0,5 50
Metilciclohexano 11,8 1180
N-Metilpirrolidona 5,3 530
2-Metoxietanol 0,5 50
Nitro metano 0,5 50
Piridina 2,0 200
Sulfolano 1,6 160
Tetrahidrofurano 7,2 720
Tetralina 1,0 100
Tolueno 8,9 890
Tricloroetileno 0,8 80
Xi le no* 21,7 2170
* Generalmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etilbenceno

Clase 3

Se considera que los disolventes residuales de Clase 3 (Tabla 3) son menos txicos y representan un riesgo menor para la
salud humana que los disolventes residuales de Clase 1 y Clase 2. La Clase 3 no incluye disolventes que representen un riesgo
para la salud humana a los niveles normalmente aceptados en productos farmacuticos. Sin embargo, no hay estudios de car-
cinogenicidad o toxicidad a largo plazo para muchos de los disolventes residuales de Clase 3. Los datos disponibles indican
que son menos txicos en estudios de toxicidad a corto plazo o agudos y que son negativos en estudios de genotoxicidad.
Se considera que aquellas cantidades de disolventes residuales de 50 mg por da o menos (correspondientes a 5000 ppm o
0,5% en la Opcin 7) seran aceptables sin necesidad de justificacin. Cantidades superiores pueden tambin ser aceptables
siempre que sean realistas en relacin con la capacidad de fabricacin y las buenas prcticas de fabricacin. Para los fines de
esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre un
nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el
USP 39 Pruebas Qumicas/ (467) Disolventes Residuales 369

lmite de disolvente residual aprobado para el artculo. La USP considerar entonces este tema en la monografa individual. Si
el lmite de disolvente de Clase 3 en una monografa individual es superior a 50 mg por da, ese disolvente residual se debe
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes
Residuales de este captulo general, con las debidas modificaciones a las soluciones estndar, se deben aplicar siempre que sea
posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
Tabla 3. Disolventes Residuales de Clase 3
(L"1m1ta
. d os por 1as b uenas practicas d e f ab ncac1on
. u otros requ1s1 . . t es y pro d uct os f armaceu
. "tos b asa d osen 1aca1l"d ad en f'armacos, exc1p1en , f 1cos

Acetato de butilo Etanol

Acetato de etilo ter terc-butilmetlico
Acetato de isobutilo ter etlico
Acetato de isopropilo Formiato de etilo
Acetato de metilo Heptano
Acetato de propilo 3-Metil-1-butanol
Acetona Metiletilcetona
cido actico Metilisobutilcetona
cido frmico 2-Metil-1-propanol
Anisol Pentano
1-Butanol 1-Pentanol
2-Butanol 1-Propanol
Dimetil sulfxido 2-Propanol

Otros Disolventes Residuales

Los disolventes residuales que figuran en la Tabla 4 tambin podran interesar a los fabricantes de frmacos, excipientes o
productos farmacuticos. No obstante, no se han encontrado datos toxicolgicos adecuados para fundamentar una EDP.
Tabla 4. Otros Disolventes Residuales
(Para los cuales no se han encontrado datos toxicolgicos adecuados)
cido tricloroactico ter isoproplico
cido trifluoroactico ter de petrleo
1, 1-Dietoxipropano lsooctano
1, 1-Dimetoximetano Metil isopropil cetona
2,2-Dimetoxipropano Metiltetrahidrofurano

IDENTIFICACIN, CONTROL V CUANTIFICACIN DE DISOLVENTES RESIDUALES

Siempre que sea posible, la sustancia en anlisis debe disolverse para liberar el disolvente residual. Dado que la USP se ocupa
de productos farmacuticos, as como de ingredientes activos y excipientes, a veces puede ser aceptable que algunos de los
componentes de la formulacin no se disuelvan por completo. En tales casos, puede ser necesario reducir el producto farma-
cutico primero a polvo fino, de manera que se pueda liberar cualquier disolvente residual que pudiera estar presente. Esta
operacin debe realizarse lo ms rpido posible para evitar la prdida de disolventes voltiles durante el procedimiento.
[NOTA-El agua exenta de sustancias orgnicas que se especifica en los siguientes procedimientos no produce picos que in-
terfieran significativamente cuando se lleva a cabo una cromatografa.]

Disolventes Residuales de Clase 1 y Clase 2

Los siguientes procedimientos son tiles para identificar y cuantificar disolventes residuales cuando no est disponible la in-
formacin acerca de los disolventes residuales que pudieran estar presentes en el material. Cuando la informacin acerca de la
presencia de disolventes residuales especficos est disponible, slo es necesario llevar a cabo el Procedimiento C para cuantificar
la cantidad de disolventes residuales presentes. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo para la aplicacin de las pruebas de
lmite de disolventes residuales.
370 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Qumicas USP 39

Los picos
correspondientes a los disolventes si
residuales tienen reas menores que
las de los estndares?

Los picos S
correspondientes a los disolventes > - - - - - - l l CUMPLE CON LA PRUEBA, NO
residuales tienen reas menores que REQUIERE ACCIN POSTERIOR
las de los estndares?

tlquetar tn 1can o
la cantidad del disolvente
residual encontrado

Fig. 1. Diagrama relativo a la identificacin de disolventes residuales y la aplicacin de pruebas de lmite.

ARTCULOS SOLUBLES EN AGUA

Procedimiento A
Solucin Madre del Estndar de Clase 7-[NOTA-AI transferir las soluciones, colocar la punta de la pipeta justo por debajo de
la superficie del lquido y mezclar.] Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz volu-
mtrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 9 mL de dimetil sulfxido, diluir con agua a volu-
men y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado
aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 1O mL de esta solucin a un matraz volu-
mtrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y
mezclar.
Solucin Estndar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar de Clase 7 a un vial para muestreo de fase
gaseosa apropiado que contenga 5,0 mL de agua (colocar la punta de la pipeta justo por debajo de la superficie del lquido
para dispensar), tapar y mezclar.
Soluciones Madre del Estndar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumtrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. sta es la Solucin Madre A del Estndar de Clase 2. Trans-
ferir 1,0 mL de ER Mezcla B-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumtrico de 100 mL, diluir con agua a
volumen y mezclar. sta es la Solucin Madre B del Estndar de Clase 2.
Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solucin Madre A del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (467) Disolventes Residuales 371

Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2-Transferir 5,0 mL de Solucin Madre B del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 250 mg del artculo en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumtrico de 25 mL, disolver y diluir con agua a volumen, y mezclar.
Solucin de Prueba-Transferir 5,0 mL de Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agre-
gar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar de Clase 7 a un vial para mues-
treo de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de la Solucin Madre de Prueba, tapar y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la lla-
ma y una columna de slice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 1,8 m o una columna
macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 m. El gas transportador es nitrgeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de particin de 1:5. [NOTA-La relacin de particin
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40 durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 1O por minuto hasta 240 y mantenerla a 240 durante 20 minutos. Mantener las temperaturas
del inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar de Clase 7, la
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 7 y la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma segn se indica
en Procedimiento: la relacin seal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solucin Estndar de Clase 7 no es menor de 5; la relacin
seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 7 no es menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la lnea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (siguiendo alguno de los sets
de parmetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volmenes iguales de la fase gaseosa (aproxi-
madamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 7, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase
2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si la respuesta de cualquier
pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano en la Solucin de Prueba es mayor o igual a la del pico correspondiente en la
Solucin Estndar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, o si la respuesta del pico de 1, 1, 1-
-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-tricloroetano en la Solucin Estndar
de Clase 7, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no sucediera, el artculo cumple con los
requisitos de esta prueba.
Tabla 5. Parmetros Operativos para el Inyector de Fase Gaseosa
Sets de Parmetros Operativos
para el Inyector de Fase Gaseosa
1 2 3
Temperatura de equilibrio() 80 105 80
Tiempo de equilibrio (min) 60 45 45
Temperatura de lnea de transferencia() (si corresponde) 85 11 o 105
Temperatura de la jeringa() (si corresponde) 80-90 105-115 80-90
Gas transportador: nitrgeno o helio a una presin adecuada
Tiempo de presurizacin (s) (si corresponde) 2:60 2:60 2:60
Volumen de inyeccin (ml)* 1 1 1
* O seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento, siempre y cuando se cumplan los criterios del mtodo. Se permite inyectar una cantidad menor
a la citada siempre y cuando se logre la sensibilidad adecuada.

Procedimiento B
Solucin Madre del Estndar de Clase 7, Solucin Estndar de Clase 7, Soluciones Madre del Estndar de Clase 2, Solucin
Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2, Solucin Madre de Prueba, Solucin de Prueba y Solucin de
Aptitud del Sistema de Clase 7-Preparar segn se indica en Procedimiento A.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la lla-
ma y una columna de slice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl 6 de 0,25 m o una columna
macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl 6 de 0,25 m. El gas transportador es nitrgeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de particin de 1 :5. [NOTA-La relacin de particin
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 50 durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 6 por minuto hasta 165 y mantenerla a 165 durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del
inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar de Clase 7 y la Solucin
de Aptitud del Sistema de Clase 7, y registrar el cromatograma segn se indica en Procedimiento: la relacin seal-ruido del ben-
ceno en la Solucin Estndar de Clase 7 no es menor de 5; la relacin seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del
Sistema de Clase 7 no es menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo y cis-dicloroeteno en la Solucin Estndar Mezcla A de
Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la lnea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (siguiendo alguno de los sets
372 (467) Disolventes Residuales / Pruebas Q1.,1micas USP 39

de parmetros operativos para el inyector de fase gaseosa, descritos en la Tabla 5) volmenes iguales de la fase gaseosa (apro-
ximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de
Clase 2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si las respuestas de los
picos en la Solucin de Prueba de los picos identificados en el Procedimiento A son iguales o mayores que los picos correspon-
dientes en la Solucin Estndar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el
Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artculo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento C
Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Madre A del Estndar de Clase 2, Solucin
Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Madre de Prueba, Solucin de Prueba y Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 7-Prepa-
rar segn se indica en Procedimiento A.
Solucin Madre del Estndar-[NOTA-Preparar por separado una Solucin Madre del Estndar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para los disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la pri-
mera dilucin segn se indica para la primera dilucin en Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estndar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente resi-
dual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solucin con una concentracin final de 1/20 del valor indicado
en la Tabla 1 2 (en Lmite de Concentracin).
Solucin Estndar-Transferir 1,0 mL de esta solucin a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 5,0 mL de
agua, tapar y mezclar.
Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada--{NOTA-Preparar por separado una Solucin de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL de
Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar,
tapar y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-[NOTA-Si se verifica que los resultados de la cromatografa del Procedi-
miento A son inferiores a los del Procedimiento 81 se puede sustituir el Sistema Cromatogrfico del Procedimiento B.] Equipar un
cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama y una columna de slice fundida de 0,32 mm x 30 m recubier-
ta con una capa de fase G43 de 1,8 m o una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43
de 3,0 m. El gas transportador es nitrgeno o helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de
particin de 1 :5. [NOTA-La relacin de particin puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura
de la columna a 40 durante 20 minutos, luego elevarla a una velocidad de 1O por minuto hasta 240 y mantenerla a 240
durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cro-
matgrafo la Solucin Estndar de Clase 1, la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2,
y registrar el cromatograma segn se indica en Procedimiento: la relacin seal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solucin Es-
tndar de Clase 1 no es menor de 5; la relacin seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es
menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo y cloruro de metileno en la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2 no es menor
de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la lnea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (siguiendo alguno de los sets
de parmetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volmenes iguales de fase gaseosa (aproxi-
madamente 1,0 mL) de Solucin Estndar, Solucin de Prueba y Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, regis-
trar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente resi-
dual encontrado en el artculo en anlisis, por la frmula:

5(C/W)[ru /(r5r - fu)]

en donde Ces la concentracin, en g por mL, del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin Madre del Estn-
dar; W es el peso, en g, del artculo en anlisis tomado para preparar la Solucin Madre de Prueba; y ru y r5r son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solucin de Prueba y la Solucin de Prueba con una Cantidad Conoci-
da Agregada, respectivamente.

ARTCULOS INSOLUBLES EN AGUA

Procedimiento A-[NOTA-Se puede usar dimetil sulfxido como disolvente alternativo en lugar de dimetilformamida.]
Solucin Madre del Estndar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un ma-
traz volumtrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 100 mL, al que previa-
mente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar (re-
servar una porcin de esta solucin para la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1). Transferir 1,0 mL de esta solucin a un
matraz volumtrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
Solucin Estndar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar de Clase 1 a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (467) Disolventes Residuales 373

Soluciones Madre del Estndar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. sta es la Solucin Madre A del Estndar de Clase 2. Transferir 0,5 mL de ER Mezcla B-
Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumtrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
sta es la Solucin Madre B del Estndar de Clase 2.
Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solucin Madre A del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solucin Madre B del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 500 mg del artculo en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumtrico de 1O mL, disolver y diluir con dimetilformamida a volumen, y mezclar.
Solucin de Prueba-Transferir 1,0 mL de Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 7-Mezclar 5 mL de la Solucin Madre de Prueba con 0,5 mL de la dilucin interme-
dia reservada de la Solucin Madre del Estndar de Clase 1. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa (621 ))-Equipar el cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la lla-
ma y una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 m. El gas transportador es
helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de particin de 1 :3. [NOTA-La relacin de parti-
cin puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40 durante 20 minutos, lue-
go aumentarla a una velocidad de 1O por minuto hasta 240 y mantenerla a 240 durante 20 minutos. Mantener las tempera-
turas del inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar de Clase 1, la
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma segn se indica
en Procedimiento: la relacin seal-ruido de 1, 1, 1-tricloroetano en la Solucin Estndar de Clase 1 no es menor de 5; la relacin
seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la lnea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (usar los sets de parmetros
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presin del vial de 1O psi) volme-
nes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Estndar Mezcla A de Clase
2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos
principales. Si la respuesta de cualquier pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano, en la Solucin de Prueba es mayor o igual
al pico correspondiente en la Solucin Estndar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, o si
la respuesta del pico de 1, 1, 1-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-triclo-
roetano en la Solucin Estndar de Clase 1, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no suce-
diera, el artculo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento B
Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Solucin Estndar de Clase 1, Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1, Soluciones
Madre del Estndar de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2, Solucin Madre de
Prueba y Solucin de Prueba-Preparar segn se indica en Procedimiento A.
Sistema Cromatogrfico-Proceder segn se indica en Procedimiento Ben Artculos Solubles en Agua con una relacin de parti-
cin de 1:3. [NOTA-La relacin de particin puede modificarse para optimizar la sensibilidad.]
Procedimiento-{NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la lnea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (usar los sets de parmetros
operativos para inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presin del vial de 1O psi) volmenes
iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2,
Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos prin-
cipales. Si la respuesta de los picos identificados en la Solucin de Prueba en el Procedimiento A son mayores o iguales a los picos
correspondientes en la Solucin Estndar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, llevar a
cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artculo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento C
Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Solucin Estndar de Clase 1, Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solucin Madre
A del Estndar de Clase 2 y Solucin Estndar Mezclo A de Clase 2-Proceder segn se indica en Procedimiento A.
Solucin Madre del Estndar-[NOTA-Preparar por separado una Solucin Madre del Estndar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la primera
dilucin segn se indica para la primera dilucin en Solucin Madre del Estndar de Clase 1 en el Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estndar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente resi-
dual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solucin con una concentracin final de 1/20 del valor especifica-
do en la Tabla 1 o Tabla 2 (en Lmite de Concentracin).
374 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Qumicas USP 39

Solucin Estndar-Transferir 1,0 mL de la Solucin Madre del Estndar a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado,
que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Madre de Prueba-Proceder segn se indica en Procedimiento A.
Solucin de Prueba-Transferir 1,0 mL de la Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada-[NOTA-Preparar por separado una Solucin de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 1,0 mL de
Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1 mL de Solucin Madre del Estndar y 4,0
mL de agua, tapar y mezclar.
Sistema Cromatogrfico-Proceder segn se indica en Procedimiento C en Artculos Solubles en Agua.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la lnea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (usar los sets de parmetros
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presin del vial de 1O psi) volme-
nes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar, Solucin de Prueba y Solucin de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad,
en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el artculo en anlisis, por la frmula:

en donde Ces la concentracin, en g por mL, del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin Madre del Estn-
dar; W es el peso, en g, del artculo en anlisis tomado para preparar la Solucin Madre de Prueba; y ru y r5r son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solucin de Prueba y la Solucin de Prueba con una Cantidad Conoci-
da Agregada, respectivamente.

Disolventes Residuales de Clase 3

Si estn presentes los disolventes de Clase 3, el nivel de disolventes residuales se puede determinar segn se indica en Prdi-
da por Secado (731) cuando la monografa del artculo en anlisis incluye un procedimiento de prdida por secado que especi-
fique un lmite superior de no ms de 0,5% (de acuerdo con la Opcin 7 en este capitulo general), o se puede realizar una
determinacin especfica del disolvente. Si la monografa del artculo en anlisis no incluye un procedimiento de prdida por
secado o si el lmite de disolvente de Clase 3 en una monografa individual es superior a 50 mg por da (lo que corresponde a
5000 ppm 0,5% en la Opcin 1), el disolvente residual de Clase 3 individual o los disolventes presentes en el artculo en
anlisis se deben identificar y cuantificar, aplicando los procedimientos descritos anteriormente, con las debidas modificaciones
a las soluciones estndar, siempre que sea posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apro-
piado. En estos procedimientos se deben usar Estndares de Referencia USP, siempre que estn disponibles.

GLOSARIO

Carcingenos genotxicos: Son carcingenos que producen cncer al afectar los genes o cromosomas.
Exposicin diaria permitida (EDP): La mxima ingesta diaria admisible de un disolvente residual en productos farmacuti-
cos.
Factor de modificacin: Un factor determinado segn el criterio profesional de un toxiclogo y que se aplica a datos de
valoraciones biolgicas de manera que los datos se puedan relacionar con seres humanos de manera segura.
lngesta diaria admisible (IDA): La mxima ingesta diaria admisible de sustancias qumicas txicas. Este trmino es emplea-
do por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS).
lngesta diaria tolerable (IDT): La exposicin diaria tolerable a sustancias qumicas txicas. Este trmino es empleado por el
Programa Internacional para la Seguridad de las Sustancias Qumicas (IPCS).
Neurotoxicidad: La capacidad de una sustancia de ocasionar efectos adversos en el sistema nervioso.
Nivel mnimo de efecto observable (LOEL, por sus siglas en ingls): La dosis mnima de una sustancia en un estudio o
grupo de estudios que produce un incremento biolgicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causa-
dos a los seres humanos o animales expuestos a esta sustancia.
Nivel sin efecto observable (NOEL, por sus siglas en ingls): La dosis mxima de una sustancia que no produce un incre-
mento biolgicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos o animales ex-
puestos a esta sustancia.
Sustancias seriamente sospechosas de carcinogenidad para los seres humanos: Una sustancia para la cual no hay eviden-
cia epidemiolgica de carcinognesis pero de la que existen datos de genotoxicidad positivos y clara evidencia de carcinog-
nesis en roedores.
Teratogenicidad: La presencia de malformaciones estructurales en un feto en desarrollo ocasionadas cuando se administra
una sustancia durante el embarazo.
Toxicidad reversible: La presencia de efectos nocivos ocasionados por una sustancia que desaparecen cuando termina la ex-
posicin.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (467) Disolventes Residuales 375

APNDICES
Apndice 1: Lista

Ver la tabla Apndice 7. Lista de Disolventes Residuales Incluidos en Este Captulo General.
APNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPTULO GENERAL
Disolvente Otros nombres Estructura Clase
Acetato de butilo ster butlico del cido actico CH,COO(CH,),CH, Clase 3
Acetato de etilo ster etlico del cido actico CH 3 COOCH,CH, Clase 3
Acetato de isobutilo ster isobutlico del cido actico CH 3 COOCH 2 CH(CH 3)i Clase 3
ster isoproplico del cido
Acetato de isopropilo actico CH,COOCH(CH,), Clase 3
Acetato de metilo ster metlico del cido actico CH,COOCH, Clase 3
Acetato de propilo ster proplico del cido actico CH,COOCH,CH 2 CH, Clase 3
2-Propanona
Acetona Propan-2-ona CH,COCH, Clase 3
Acetonitrilo CH,CN Clase 2
cido actico cido etanoico CH 3 COOH Clase 3
cido frmico HCOOH Clase 3
UOCH,
"'
Anisol h
Metoxibenceno Clase 3

Benceno Benzol
Alcohol n-butlico
o Clase 1

1-Butanol Butan-1-ol CH,(CH,hOH Clase 3

Alcohol sec-butlico
2-Butanol Butan-2-ol CH 3 CH 2CH(OH)CH 3 Clase 3

Ciclohexano Hexametileno o
UCI
Clase 2

Clorobenceno h
Clase 2
Cloroformo Triclorometano CHCI, Clase 2
Cloruro de metileno Diclorometano
CH,
CH 7 Cl 7 Clase 2

Cu meno
lsopropilbenceno
(1-Metiletil)benceno
d'CH, Clase 2
sim-Dicloroetano
Dicloruro de etileno
1,2-Dicloroetano Cloruro de etileno CH 2 CICH 2 CI Clase 1
1, 1-Dicloroetileno
1, 1-Dicloroeteno Cloruro de vinilideno H7 C=CCl 7 Clase 1
1,2-Dicloroetileno
1,2-Dicloroeteno Dicloruro de acetileno CIHC=CHCI Clase 2
N,N-Dimetilacetamida DMA CH,CON(CH,), Clase 2
N,N-Dimetilformamida DMF HCON(CH,), Clase 2
Metilsulfinilmetano
Metil sulfxido
Dimetil sulfxido DMSO (CH,),SO Clase 3
ter dimetlico de etilenglicol
Monoglima
1,2-Dimetoxietano Dimetil celosolve H,COCH 7 CH 7 0CH, Clase 2

1,4-Dioxano
p-Dioxano
[1,4]Dioxano
() o Clase 2
Etanol Alcohol etlico CH,CH,OH Clase 3
ter terc-butilmetlico 2-Metoxi-2-metilpropano (CH,),COCH, Clase 3
Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% de etil benceno.
376 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Qumicas USP 39

APNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPTULO GENERAL (Continuacin)

Disolvente Otros nombres Estructura Clase
ter dietlico
Etoxietano
ter etlico 1, l '-Oxibisetano CH,CH,OCH,CH, Clase 3
1,2-Dihidroxietano
Etilenglicol 1,2-Etanodiol HOCH,CH,OH Clase 2
2-Etoxietanol Celosolve CH,CH,OCH,CH 2 0H Clase 2
Formamida Metanamida HCONH, Clase 2
Formiato de etilo ster etlico del cido frmico HCOOCH,CH, Clase 3
Heptano n-Heptano CH,(CH,)<CH, Clase 3
Hexano n-Hexano CH,(CH,)ACH, Clase 2
Metanol Alcohol metlico CH,OH Clase 2
Alcohol isoamlico
Alcohol isopentlico
3-Metil-1-butanol 3-Metilbutan-1-ol (CH,),CHCH,CH,OH Clase 3
2-Hexanona
Metilbutilcetona Hexan-2-ona CH 3 (CH 2 ),COCH, Clase 2
()CH,
Metilciclohexano Ciclohexilmetano Clase 2
2-Butanona
MEK
Metiletilcetona Butan-2-ona CH 3 CH 2 COCH 3 Clase 3
4-Metilpentan-2-ona
4-Metil-2-pentanona
Metil isobutil cetona MIBK CH,COCH,CH(CH.), Clase 3
?H3

N-Metilpirrolidona
1-Metilpirrolidin-2-ona
1-Metil-2-pirrolidinona
Lr Clase 2
Alcohol isobutlico
2-Metil-1-propanol 2-Metilpropan-1-ol (CH,),CHCH,OH Clase 3
2-Metoxietanol Metil celosolve CH,OCH,CH,OH Clase 2
Nitrometano CH,N0 2 Clase 2
Pentano n-Pentano CH,(CH,) 3 CH 3 Clase 3
Alcohol amlico
Pentan-1-ol
1-Pentanol Alcohol pentlico CH,(CH,).CH,OH Clase 3

Piridina
Propan-1-ol
o Clase 2

1-Propanol Alcohol proplico CH,CH,CH,OH Clase 3

Propan-2-ol
2-Propanol Alcohol isoproplico (CH.),CHOH Clase 3
,;,
\'/
Sulfolano
1, 1-Dixido de
tetrahidrotiofeno o Clase 2
Tetracloruro de carbono Tetraclorometano CCIA Clase 1

Tetrahidrofurano
xido de tetrametileno
Oxaciclopentano Clase 2

Tetralina 1,2, 3,4-Tetrahidronaftaleno co

VCH,
Clase 2

"'
Tolueno Metilbenceno "" Clase 2
1, 1, 1-Tricloroetano Metilcloroformo CH,CCI, Clase 1
Tricloroetileno 1, 1,2-Tricloroeteno HCIC=CCI, Clase 2
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (467) Disolventes Residuales 377

APNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPTULO GENERAL (Continuacin)

Disolvente Otros nombres Estructura Clase
CH,

Dimetilbenceno

"'
Xileno* Xilol Clase 2
Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.

Apndice 2: Referencia Adicional

REGLAMENTACIN AMBIENTAL DE DISOLVENTES ORGNICOS VOLTILES

Varios de los disolventes residuales empleados con frecuencia en la elaboracin de productos farmacuticos figuran como
productos qumicos txicos en las monografas de los Criterios Sanitarios Ambientales (EHC, por sus siglas en ingls) y en el
Sistema Integrado de Informacin de Riesgo (IRIS, por sus siglas en ingls). Entre los objetivos de grupos tales como el Progra-
ma Internacional para la Seguridad de las Sustancias Qumicas (IPCS, por sus siglas en ingls), la Agencia de Proteccin Am-
biental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en ingls) y la Administracin de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA, por sus siglas en ingls) se incluye la determinacin de niveles de exposicin admisibles. Su propsito es mante-
ner la integridad medioambiental y proteger la salud de los seres humanos frente a los posibles efectos nocivos de las sustan-
cias qumicas ocasionados por una exposicin medioambiental a largo plazo. Los procedimientos relativos a la estimacin de
los lmites de exposicin mxima segura estn basados generalmente en estudios a largo plazo. Cuando no hay disponibles
datos de estudios a largo plazo, se pueden emplear datos de estudios a plazos ms cortos modificando el mtodo, por ejemplo
empleando factores de seguridad mayores. El enfoque descrito en esos documentos se refiere en primer lugar a la exposicin a
largo plazo o durante toda la vida de la poblacin general al medio ambiente (es decir, el aire ambiental, la comida, el agua
potable y otros medios).

DISOLVENTES RESIDUALES EN PRODUCTOS FARMACUTICOS

Los lmites de exposicin que figuran en este captulo general estn establecidos con respecto a metodologas y datos de
toxicidad descritos en monografas del EHC e IRIS. Sin embargo, se deben tener en cuenta al establecer los lmites de exposi-
cin las siguientes suposiciones especficas sobre los disolventes residuales que se emplearn en la sntesis y formulacin de
productos farmacuticos.
1. Los pacientes (no la poblacin en general) emplean los productos farmacuticos para tratar sus enfermedades o como
profilaxis para prevenir infecciones o enfermedades.
2. La suposicin de una exposicin del paciente durante toda su vida no es necesaria para la mayora de los productos far-
macuticos, pero puede ser adecuada como hiptesis de trabajo para reducir el riesgo para la salud de los seres humanos.
3. Los disolventes residuales son componentes inevitables en la produccin de productos farmacuticos y a menudo son par-
te de los productos medicinales.
4. No se debe exceder el nivel recomendado de disolventes residuales salvo en circunstancias excepcionales.
5. Los datos de los estudios toxicolgicos que se emplean para determinar los niveles admisibles de disolventes residuales
deben provenir de protocolos apropiados, como por ejemplo los que describen la Organizacin para la Cooperacin y el
Desarrollo Econmico (OECD, por sus siglas en ingls), la EPA y el Libro Rojo de la FDA.

Apndice 3: Procedimientos para Establecer Lmites de Exposicin

El mtodo Gaylor-Kodell para la evaluacin del riesgo (Gaylor, D. W. y Kodell, R. L., Linear lnterpolation Algorithm for Low
Dose Assessment of Toxic Substance. journal of Environmental Pathology and Toxicology, 4:305, 1980) es apropiado para los
disolventes carcinognicos de Clase 1. Solamente cuando se dispone de datos fiables sobre carcinogenicidad puede hacerse
una extrapolacin mediante modelos matemticos para fijar lmites de exposicin. Los lmites de exposicin para los disolven-
tes residuales de Clase 1 podran determinarse empleando un factor de seguridad mayor (es decir, de 1O000 a 100 000) con
respecto al nivel sin efecto observable (NOEL). La deteccin y la cuantificacin de estos disolventes residuales se efectan me-
diante tcnicas analticas de ltima generacin.
Los niveles de exposicin admisibles que figuran en este captulo general para los disolventes residuales de Clase 2 se esta-
blecieron mediante el clculo de los valores de EDP conforme a los procedimientos para fijar lmites de exposicin en produc-
tos farmacuticos (pgina 5748 del PF 15(6) [nov.-dic. 1989]) y el mtodo adoptado por la IPCS para la Evaluacin del Riesgo
para la Salud Humana de los Productos Qumicos [Assessing Human Health Risk of Chemicals (Environmental Health Criterio
770, OMS, 1994)]. Estos procedimientos son similares a los que emplea la EPA de los Estados Unidos (IRIS), la FDA de los Esta-
dos Unidos (Libro Rojo) y otros organismos. El mtodo se describe en este documento para facilitar la comprensin del origen
de los valores de EDP. No es necesario realizar estos clculos para emplear los valores de EDP que figuran en la Tabla 2 de este
documento.
378 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Qumicas USP 39

La EDP proviene del nivel sin efecto observable (NOEL) o del nivel mnimo de efecto observable (LOEL), en los estudios ms
importantes en animales, de la siguiente manera:
EDP = (NOEL x Ajuste por Peso)/(Fl x F2 x F3 x F4 x F5) (1)

La EDP se calcula preferentemente a partir de un NOEL. Si no se obtiene un NOEL, se puede emplear el LOEL. Los factores de
modificacin que se proponen en este documento para relacionar datos con seres humanos son del mismo tipo que los "facto-
res de incertidumbre" empleados en los Criterios Sanitarios Ambientales (Environmental Health Criteria 170, OMS, Ginebra,
1994) y los "factores de modificacin" o los "factores de seguridad" en el Pharmacopeial Forum. La suposicin de una exposi-
cin sistmica del 100% se emplea en todos los clculos sin tener en cuenta la va de administracin.
Los factores de modificacin son los siguientes:

Fl = Un factor que representa la extrapolacin entre especies

Fl = 2 para extrapolacin de perros a seres humanos
Fl = 2,5 para extrapolacin de conejos a seres humanos
Fl = 3 para extrapolacin de monos a seres humanos
Fl = 5 para extrapolacin de ratas a seres humanos
Fl = 1O para extrapolacin de otros animales a seres humanos
Fl = 12 para extrapolacin de ratones a seres humanos

El factor Fl tiene en cuenta la relacin comparativa entre el rea de superficie y el peso corporal de las especies involucradas y
de los seres humanos. El rea de superficie (5) se calcula como:
S = kMo,61 (2)

en donde M = peso corporal; y la constante k se ha tomado con valor 1O. Los pesos corporales empleados en la ecuacin
figuran a continuacin en la Tabla A3.1.

F2 = Un factor de 1 O representa la variabilidad entre individuos. Por lo general, se proporciona un factor de 1O para todos los disolventes orgni-
cos y 1 O se usa en todo este captulo general.

F3 = Un factor de variabilidad que representa los estudios de toxicidad por exposicin a corto plazo.
F3 = 1 para estudios con una duracin de al menos la mitad del ciclo vital (1 ao para roedores o conejos; 7 aos para gatos, perros
y monos).
F3 = 1 para estudios reproductivos que cubren el periodo completo de organognesis.
F3 = 2 para un estudio de 6 meses en roedores o de 3,5 aos en no roedores.
F3 = 5 para un estudio de 3 meses en roedores o de 2 aos en no roedores.
F3 = 1O para estudios de ms corta duracin.

En todos los casos, se ha empleado el factor ms alto para los estudios con una duracin intermedia (p.ej., un factor de 2 para
un estudio de 9 meses en roedores).

F4 = Un factor que se puede aplicar en casos de toxicidad grave, p.ej., carcinogenicidad no genotxica, neurotoxicidad o teratogenicidad. En
estudios de toxicidad reproductiva, se emplean los siguientes factores:
F4 = 1 para toxicidad fetal asociada a toxicidad materna
F4 = 5 para toxicidad fetal sin toxicidad materna
F4 = 5 para un efecto teratognico con toxicidad materna
F4 = 1O para un efecto teratognico sin toxicidad materna

F5 = Un factor variable que se puede aplicar si no se ha establecido un nivel sin efecto.

Cuando slo est disponible un LOEL, se puede emplear un factor de hasta 1 O dependiendo de la gravedad de la toxicidad.
Para el ajuste por peso, se supone un peso corporal arbitrario para humanos adultos para ambos sexos de 50 kilogramos (kg).
Este peso relativamente bajo proporciona un factor de seguridad adicional con respecto a los pesos estndar de 60 70 kg
que se usan a menudo en este tipo de clculos. Se reconoce que algunos pacientes adultos pesan menos de 50 kg; se conside-
ra que estos pacientes se incluyen mediante los factores de seguridad empleados para determinar una EDP. Si el disolvente
estaba presente en una formulacin especficamente destinada para uso peditrico, sera apropiado realizar un ajuste para un
peso corporal inferior.
Como ejemplo de la aplicacin de esta ecuacin, se considera un estudio de toxicidad de acetonitrilo en ratones que est
resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, N 1, Suplemento, abril 1997, pgina S24. Se calcula que el NOEL es de 50,7 mg kg-1 da-1
La EDP para el acetonitrilo en este estudio se calcula de la siguiente manera:

EDP = (50,7 mg kg-1 da-1 x 50 kg)/(12 x 1O x 5 x 1 x 1) = 4,22 mg da-1

USP 39 Pruebas Qumicas/ (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol 379

En este ejemplo,

Fl = 12 representa la extrapolacin de ratones a seres humanos

F2 = 1O representa las diferencias entre seres humanos individuales
F3 = 5 porque la duracin del estudio fue de slo 13 semanas
F4 = 1 porque no se encontr toxicidad grave
FS = 1 porque se determin el nivel sin efecto

Valores Empleados en los Clculos en este Documento

Peso corporal de ratas 425 g
Peso corporal de ratas preadas 330 g
Peso corporal de ratones 28 g
Peso corporal de ratonas preadas 30 g
Peso corporal de cobayos 500 g
Peso corporal de monos Rhesus 2,5 kg
Peso corporal de conejas (preadas o no) 4 kg
Peso corporal de perros Beagle 11,5 kg
Volumen respiratorio de ratas 290 L/da
Volumen respiratorio de ratones 43 L/da
Volumen respiratorio de conejos 1440 L/da
Volumen respiratorio de cobayos 430 L/da
Volumen respiratorio de humanos 28 800 L/da
Volumen respiratorio de perros 9000 L/da
Volumen respiratorio de monos 1150 L/da
Consumo de agua de ratones 5 ml/da
Consumo de agua de ratas 30 ml/da
Consumo de alimentos de ratas 30 g/da

Se emplea la ecuacin de gases ideales, PV = nRT, para convertir las concentraciones de gases empleados en estudios de
inhalacin de unidades en ppm a unidades en mg/L o mg/m 3. Se propone como ejemplo un estudio de toxicidad reproducti-
va en ratas por inhalacin de tetracloruro de carbono (peso molecular 153,84) resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, N 1, Suple-
mento, abril 1997, pgina S9.
n P 300 x 10-6 atm x 153 840 mg mo1- 1 46.15mg =1.89m /L
V RT 0.082 L a mK- 1 mo1- 1 x 298K 24,45 L g

La relacin 1000 L = 1 m 3 se emplea para convertir los valores a mg/m3.

(469) ETILENGLICOL, DIETILENGLICOL Y TRIETILENGLICOL EN

SUSTANCIAS ETOXILADAS

El siguiente procedimiento se usa para determinar la concentracin de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales en
productos etoxilados. Los productos etoxilados pueden contener etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales como
resultado del proceso de fabricacin. El procedimiento es adecuado para las siguientes sustancias:
1 . Polietilenglicol 200
2. Polietilenglicol 300
3. Polietilenglicol 400
4. Polietilenglicol 600
5. Polietilenglicol 1000
6. Polisorbato 20
7. Polisorbato 40
8. Polisorbato 60
9. Polisorbato 80
1O. Polietilenglicol monometil ter 350
11 . Polietilenglicol monometil ter 550
12. Aceite de ricino polioxilado 35
13. Hidroxiestearato de polioxilo 15
380 (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol / Pruebas Qumicas USP 39

14. Polioxil 20 cetoestearil ter

15. Estearato de polioxilo 8
16. Octoxinol 9
17. Nonoxinol 9

IMPUREZAS
PROCEDIMIENTO
Diluyente: Acetona
Solucin estndar: 25 g/ml de ER Etilenglicol USP, 40 g/ml de ER Dietilenglicol USP, 40 g/ml de ER Trietilenglicol
USP y 40 g/ml de ER 1,3-Butanodiol USP (estndar interno) en Diluyente
Solucin muestra: 40 mg/ml de la sustancia de prueba y 40 g/ml de ER 1,3-Butanodiol USP (estndar interno) en Dilu-
yente
Sistema cromatogrfico
0/er Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografa de Gases
Detector: Ionizacin a la llama
Columna: Capilar, de 0,53 mm x 30 m; ligada con una capa de fase G3 de 1,0 m
Temperaturas
Detector: 290
Inyector: 270
Columna: Ver la Tabla 7.
Tabla 1
Tiempo de Espera (Hold Time)
Temperatura Rampa de Temperatura a la Temperatura
Inicial Temperatura Final Final
() (/mln) () (mln)
40 10 60 5
60 10 170 o
170 15 280 O; 60
El tiempo de espera fue de O minutos para la Solucin estndar y 60 minutos para la Solucin muestra y el Diluyente.

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 5,0 ml/min
Volumen de inyeccin: 1,0 L
Tipo de inyeccin: Dividida; relacin de particin, 2:1
Camisa del inyector (liner): Dispositivo comn desactivado, para sistemas de inyeccin con o sin divisin, ahusado (ta-
per) y con lana de vidrio, para propsitos generales
Tiempo de corrida: 26 minutos para la Solucin estndar; 86 minutos para la Solucin muestra y el Diluyente
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
[NOTA-Ver la Tabla 2 para los tiempos de retencin relativos.]
Tabla 2
Tiempo de
Retencin
Nombre Relativo
Etilenglicol 0,45
1,3-Butanodiol (estndar interno) 1,00
Dietilenglicol 1,25
Trietilenglicol 1,70

Requisitos de aptitud del sistema

Resolucin: No menos de 20 entre etilenglicol y 1,3-butanodiol; no menos de 20 entre 1,3-butanodiol y dietilenglicol;
no menos de 20 entre dietilenglicol y trietilenglicol
Factor de asimetra: 0,8-1,8 para cada uno de los cuatro picos asignados a etilenglicol, 1, 3-butanodiol, dietilenglicol y
trietilenglicol
Desviacin estndar relativa: No ms de 5,0% para el cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente (eti-
lenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) y el estndar interno
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Identificar los picos de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol en la Solucin muestra por comparacin con los de la Solu-
cin estndar.
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (471) Combustin en Matraz con Oxgeno 381

Calcular el contenido de etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol, en g/g, en la porcin de la sustancia de prueba toma-
da:
Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x F

Ru =cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estndar interno (respuesta del pico del glicol
pertinente/respuesta del pico del estndar interno) de la Solucin muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estndar interno (respuesta del pico del glicol
pertinente/respuesta del pico del estndar interno) de la Solucin estndar
C5 =concentracin del glicol pertinente (etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) en la Solucin estndar (g/mL)
Cu =concentracin de la sustancia de prueba en la Solucin muestra (mg/mL)
F =factor de conversin (1000 mg/g)

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER 1,3-Butanodiol USP
ER Dietilenglicol USP
ER Etilenglicol USP
ER Trietilenglicol USP

(471) COMBUSTIN EN MATRAZ CON OXGENO

El procedimiento de combustin en matraz con oxgeno constituye el paso preparatorio en la determinacin de bromo, clo-
ro, yodo, selenio y azufre en algunos artculos farmacopeicos. La combustin del material en anlisis (generalmente orgnico)
produce compuestos inorgnicos hidrosolubles, los cuales se analizan para determinar los elementos especficos, segn se indi-
ca en la monografa individual o en el captulo general.
La advertencia que figura en el Procedimiento slo indica las precauciones de seguridad mnimas y subraya la necesidad de
proceder con extremo cuidado en todas las etapas.
Aparato-El aparato, consta de un matraz Erlenmeyer de paredes gruesas, con boca de bordes elevados o en forma de
copa, de 500 mL de capacidad (salvo que se indique un matraz de mayor capacidad), equipado con un tapn de vidrio esme-
rilado al que se ha soldado un dispositivo para colocar la muestra de prueba, formado por un alambre de platino grueso y un
pieza de malla de platino soldada de aproximadamente 1,5 x 2 cm.

Punto de
ignicin
Muestra en
envoltorio de papel

Lquido absorbente

Tapn esmerilado estandardizado

Aparato para la Combustin en Matraz con Oxgeno

Procedimiento-[Precaucin-Usar lentes de seguridad y colocar una proteccin de seguridad adecuada entre el aparato y us-
ted. Tomar las precauciones necesarias para asegurar que el matraz est perfectamente limpio y no contenga ni siquiera trazas de
disolventes orgnicos.] Si se trata de un slido, pesar la sustancia colocndola sobre un trozo de papel de filtro exento de halu-
ros de aproximadamente 4 cm cuadrados y plegar el papel de forma tal que el slido quede envuelto por aquel. Si se trata de
sustancias lquidas, pesarlas en cpsulas taradas; las cpsulas de policarbonato 1 se utilizan para lquidos cuyos volmenes no
excedan de 200 L, mientras que las cpsulas de gelatina resultan adecuadas para volmenes mayores. [NOTA-Es posible que
las cpsulas de gelatina contengan cantidades significativas de azufre o haluros combinados. Si se utiliza este tipo de cpsulas,
efectuar una determinacin con un blanco y realizar las correcciones necesarias.] Colocar la muestra y una tira de papel de
filtro, a modo de mecha, en el soporte de malla de platino. Colocar en el matraz el lquido absorbente especificado en la mo-
nografa individual o en el captulo general, humedecer la junta del tapn con agua y desplazar el aire del matraz con una
corriente rpida de oxgeno, agitando el lquido por rotacin moderada para favorecer la absorcin de oxgeno. [NOTA-La
saturacin del lquido con oxgeno es clave para el xito del procedimiento de combustin.] Encender la tira de papel de filtro
por medios adecuados. Si se enciende la tira fuera del matraz, introducir inmediatamente el soporte de la muestra en el ma-

1 Thomas Scientific, localizado en 99 High Hill Road, Swedesboro, N) 08085 provee un aparato [Nmeros de Catlogo 6513-C20 (de 500 ml de capacidad) y
6513-C30 (de 1000 ml de capacidad)] y cpsulas [Nmero de Catlogo 6513-84 (1000 cpsulas)) adecuados.
382 (471) Combustin en Matraz con Oxgeno/ Pruebas Qumicas USP 39

traz, invertir el matraz para que la solucin de absorcin selle el tapn y sostener el tapn en su lugar con firmeza. Se puede
omitir la inversin del matraz si se enciende en un sistema cerrado. Una vez finalizada la combustin, agitar el matraz vigorosa-
mente y dejarlo en reposo durante no menos de 1O minutos agitando intermitentemente. Luego proceder segn se indica en
la monografa individual o en el captulo general.

(481) VALORACIN DE RIBOFLAVINA

El siguiente procedimiento es apropiado para las preparaciones donde la riboflavina es un elemento constitutivo de una
mezcla de varios ingredientes. Al emplearlo, se debe mantener el pH de las soluciones por debajo de 7,0 y proteger las solucio-
nes de la luz solar directa en todo momento.
Estndares de Referencia USP (11 )-ER Riboflavina USP.
Solucin Madre del Estndar de Riboflavina-A 50,0 mg de ER Riboflavina USP, previamente secados y protegidos de la
luz en un desecador sobre pentxido de fsforo, agregar aproximadamente 300 mL de cido actico 0,02 N y calentar la
mezcla en un bao de vapor agitando frecuentemente hasta que la riboflavina se haya disuelto. Luego enfriar, agregar cido
actico 0,02 N para obtener 500 mL y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Diluir una porcin medida con exactitud de esta solucin, usando cido actico 0,02 N, hasta una concentracin de 10,0 g
de ER Riboflavina USP seca por mL para obtener la Solucin Madre del Estndar de Riboflavina. Almacenar bajo tolueno en un
refrigerador.
Preparacin Estndar-Diluir a volumen con agua 10,0 mL de la Solucin Madre del Estndar de Riboflavina en un matraz
volumtrico de 100 mL y mezclar. Cada mL representa 1,0 g de ER Riboflavina USP. Preparar una Preparacin Estndar nueva
para cada valoracin.
Preparacin de Valoracin-Colocar una cantidad del material a valorar en un matraz de tamao adecuado y agregar un
volumen de cido clorhdrico O, 1 N igual en mL a no menos de 1O veces el peso seco del material en g, aunque la solucin
resultante no debe contener ms de 100 g de riboflavina por ml. Si el material no es fcilmente soluble, pulverizarlo para que
pueda dispersarse uniformemente en el lquido. Luego agitar vigorosamente y lavar las paredes del matraz con cido clorhdri-
co O, 1 N.
Calentar la mezcla en un autoclave entre 121 y 123 durante 30 minutos y enfriar. Si el material se aglutina, agitar la mezc-
la hasta que las partculas se dispersen uniformemente. Ajustar la mezcla, agitando vigorosamente, a un pH de 6,0 a 6,5 con
solucin de hidrxido de sodio* y, de inmediato, agregar solucin de cido clorhdrico* hasta que no haya ms precipitacin
(por lo general a un pH de aproximadamente 4,5, el punto isoelctrico de muchas de las protenas presentes). Diluir la mezcla
con agua para obtener un volumen medido que contenga aproximadamente O, 11 g de riboflavina en cada mL y filtrar a tra-
vs de papel que se sepa que no adsorbe riboflavina. A una alcuota del filtrado, agregar, agitando vigorosamente, una solu-
cin de hidrxido de sodio* para producir un pH de 6,6 a 6,8, diluir la solucin con agua para obtener un volumen final medi-
do que contenga aproximadamente O, 1 g de riboflavina en cada mL y, si la solucin se enturbia, filtrar nuevamente.
Procedimiento-Agregar a cada uno de cuatro o ms tubos (o recipientes de reaccin) 10,0 mL de la Preparacin de Valo-
racin. Agregar a cada uno de dos o ms de estos tubos 1,0 mL de la Preparacin Estndar y mezclar y luego agregar a cada
uno de los dos o ms tubos restantes 1,0 mL de agua y mezclar. Agregar a cada tubo 1,0 mL de cido actico glacial y mez-
clar; luego agregar, mezclando, 0,50 mL de solucin de permanganato de potasio (1 en 25) y dejar en reposo durante 2 minu-
tos. Agregar a cada tubo, mezclando, 0,50 mL de solucin de perxido de hidrgeno, con lo cual el color del permanganato
desaparecer en 1O segundos. Agitar vigorosamente los tubos hasta expulsar todo el exceso de oxgeno. Cuando haya cesado
la produccin de espuma, eliminar las burbujas de gas que queden en las paredes de los tubos por inclinacin de los tubos
para que la solucin fluya lentamente de un extremo a otro.
En un fluorofotmetro adecuado que tenga un filtro de entrada con un estrecho intervalo de transmitancia y un mximo
aproximadamente a 440 nm y un filtro de salida con un estrecho intervalo de transmitancia y un mximo aproximadamente a
530 nm, medir la fluorescencia de todos los tubos y designar la lectura promedio de los tubos que contienen solamente la
Preparacin de Valoracin como lu y el promedio de los tubos que contienen la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estn-
dar como Is. Luego, a uno o ms tubos de cada tipo, agregar, mezclando, 20 mg de hidrosulfito de sodio y medir nuevamente
la fluorescencia a los 5 segundos; designar la lectura promedio como 18
Clculo-Calcular la cantidad, en mg, de C17 H20 N4 0 6 en cada mL de la Preparacin de Valoracin tomado, por la frmula:

0,0001 (lu- 18)/(ls - lu).

Calcular la cantidad, en mg, de C17 H20 N 4 0 6 en cada cpsula o tableta.

* Las concentraciones de las soluciones de cido clorhdrico e hidrxido de sodio empleadas no se indican en cada caso porque estas concentraciones pueden
variar segn la cantidad de material tomado para la valoracin, el volumen de la solucin de prueba y el efecto amortiguador del material.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (503) cido Actico en Pptidos 383

(501) SALES DE BASES ORGNICAS NITROGENADAS

Preparacin Estndar-A menos que se indique algo diferente, preparar una solucin en cido sulfrico diluido (1 en 70)
que contenga, en cada mL, aproximadamente 500 g del Estndar de Referencia USP especificado, calculados con respecto a
la sustancia anhidra y pesados con exactitud.
Preparacin de Valoracin-Si la forma farmacutica es una tableta, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas,
pesar con exactitud una porcin del polvo, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente activo y transferir a un
separador de 125 mL; o, si la forma farmacutica es un lquido, transferir un volumen de ste, que equivalga aproximadamen-
te a 25 mg del ingrediente activo y medido con exactitud, a un separador de 125 mL. Luego agregar al separador 20 mL de
cido sulfrico diluido (1 en 350) y agitar vigorosamente durante 5 minutos. Agregar 20 mL de ter, agitar cuidadosamente y
filtrar la fase cida, recogindola en un segundo separador de 125 ml. Agitar la fase etrea con dos porciones de 1 O mL de
cido sulfrico diluido (1 en 350), filtrar cada porcin del cido y recolectarla en el segundo separador y desechar el ter.
Agregar 1O mL de hidrxido de sodio SR y 50 mL de ter al extracto cido, agitar cuidadosamente y transferir la fase acuosa a
un tercer separador de 125 mL que contenga 50 mL de ter. Agitar cuidadosamente el tercer separador y desechar la fase
acuosa. Lavar sucesivamente las dos soluciones etreas con una nica porcin de 20 mL de agua y desechar el agua. Extraer
cada una de las dos soluciones etreas con porciones de 20 mL, 20 mL y 5 mL de cido sulfrico diluido (1 en 70), en el orden
indicado, pero siempre extrayendo primero la solucin etrea del tercer separador y despus la del segundo separador. Com-
binar los extractos cidos en un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con el cido y mezclar.
NOTA-El ter puede sustituirse por hexano o heptano si el coeficiente de particin de la base nitrogenada entre el agua y el
hexano, o entre el agua y el heptano, favorece una extraccin completa hacia la fase orgnica.
Procedimiento-A menos que se indique algo diferente, diluir 5,0 mL de la Preparacin Estndar y 5,0 mL de la Preparacin
de Valoracin con cido sulfrico diluido (1 en 70) hasta 100,0 mL y determinar la absorbancia de cada solucin a la longitud
de onda especificada, usando cido sulfrico diluido (1 en 70) como blanco. Designar la absorbancia de la solucin de la Pre-
paracin Estndar como A5 y la de la Preparacin de Valoracin como Au y calcular el resultado de la valoracin segn se indique
en la monografa individual.

(503) CIDO ACTICO EN PPTIDOS

INTRODUCCIN
Este captulo provee procedimientos que se deben usar para determinar la cantidad de cido actico en pptidos. El cido ac-
tico/acetato es un contrain comn en las preparaciones de pptidos .
MTODO 1
Solucin de hidrxido de sodio concentrado: Disolver 42 g de hidrxido de sodio en agua y diluir con agua hasta 100
ml.
Solucin A: Agregar 0,7 mL de cido fosfrico a 1000 mL de agua y ajustar con Solucin de hidrxido de sodio concentrado
a un pH de 3,0.
Solucin B: Metanol
Fase mvil: Ver la Tabla 7.
Tabla 1
Tiempo Solucin A Solucin B
(min) (%) (%)
o 9S s
s 9S s
10 so so
20 so so
22 9S s
Diluyente: Preparar una mezcla de Solucin A y Solucin B (95:5).
Solucin estndar: Disolver en Diluyente una cantidad, pesada con exactitud, de ER cido Actico Glacial USP para obte-
ner una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente O, 1 mg/ml. [NOTA-La concentracin puede ajus-
tarse dependiendo de la cantidad de acetato o cido actico que se espera est presente en el material de prueba.]
Solucin muestra: Preparar segn se indica en la monografa individual. La cantidad de material usado puede adaptarse
dependiendo de la cantidad de cido actico esperada.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 21 O nm
384 (503) cido Actico en Pptidos / Pruebas Qumicas USP 39

Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 m

Velocidad de flujo: 1,2 ml/min
Volumen de inyeccin: 1 O L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 5%
Tiempo de retencin de cido actico: 3-4 min
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de cido actico en la porcin de material de prueba tomada:
Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de la Solucin muestra
r5 = respuesta del pico de la Solucin estndar
C5 =concentracin de ER cido Actico Glacial USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Cu = concentracin de la Solucin muestra (mg/ml)
Agregar lo siguiente:
MTODO 2
Solucin A, Solucin B, Fase mvil, Diluyente y Sistema cromatogrfico: Ver. cido Trifluoroactco en Pptidos (503.1 ).
Solucin estndar: 0,7 mg/ml de ER Acetato de Sodio Trihidrato USP en Diluyente
Calcular la concentracin, en mg/ml, d cido actico en la Solucn estndar ( C5) tomada:
C5 =0,441.xc
0,441 =factor de conversin de peso molecular (60,05/136,08)
C == concentracin de ER Acetato de Sodio Trihidrato USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Solucin muestra: Aproximadamente 4 mg/ml de muestra de prueba en Oiluyente. [NOTA-La concentracin de la mues-
tra puede adaptarse dependiendo de la cantidad de cido actico esperada.]
[NOTA-Como alternativa, se puede preparar fa Solucin estndar y la Solucin muestra segn se describe en Mtodo 1.]
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 5%
Anlisis: Proceder segn se indica en Mtodo 1.usm
REQUISITOS ADICIONALES

Cambio en la redaccin:
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11>
ER cido Actico Glacial USP
ER Acetato de Sodio Trihidrato USP &usp39

Agregar lo siguiente:
/ / /

(503.1) ACIDO TRIFLUOROACETICO EN PEPTIDOS

INTRODUCCIN
Los siguientes procedimientos se deben usar para determinar la cantidad de cido trfluoroactico (TFA, por sus siglas.en in-
gls) en pptidos. El TFA/Trifluoroacetato es una impureza residual comn del proce~o de preparacin de pptidos o un
contrain en ingredientes farmacuticos activos (API, por sus siglas en ingls).
PROCEDIMIENTO
Solucin A: Agregar 7,0 mL de cido fosfrico y 5,0 mL de hidrxido de amonio a 900 mt de agua. Mezclar y diluir con
agua hasta 1000 ml. [NOTA-El pH de la solucin es aproximadamente 2,5.] Pasar a travs de un filtro on un tamao de
poro de 0,45 m y desgasificar. Agregar 20 ml de metanol, mezclar y desgasificar durante 2 minutos adicionales.
Solucin B: Acetonitrilo y agua (50:50). Mezclar y desgasificar.
Fase mvil: Ver la TabJa 1.
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (503.1) cido Trifluoroactico 385

Tabla 1
Tiempo SoludnA Soluc:ln B
(min) (%) (%)
o 100 o
5 100 o
6 o 100
14 o 100
15 100 o
25 100 o
Diluyente: cido fosfrico al 0,5% en agua (v/v)
Solucin madre de TFA (opcin 1): 12 mg/ml de ER Trirluoroacetato de SOdio USP en agua
Calcul.ar la cqncentracin (C5), en mg/mL1 . de TFA en la Solucin ma.dre de TPA tomada:
t 5 =o,838 ><.e
0,838 ::: factor de conversin de peso molecular (114,02/136,01)
C == concentracin de ER Trifh,ioroacetato qe S!:>dio USP en. la Solucin madre.de TFA(mg/ml)
Solu~.in madre de TFA (opcin 2): 1Omg/mLQe TfA en agua, preparada segr).se inclica a. c:.ontinuai;:in. Agregar apro-
ximadamente 50. rnL de aga a 4n matraz volumtrico de loo mL con t~pn..Tarar el matraz tapado en lna .balanza anal-
tica hasta que no haya cambios significativos en Ja lectura.Transferir 670 LdeTM al matraz, taparde in.mediato y pesar.
Diluir i;:on agua a volumen,
Solucin de aptitt,id deJ sis~ema: 0,()25 mg/mLde TFA en Diluyente, preparada a partir de la Solucin madre de TFA
Solucin estndar (cuando el contenido de TFA se analiza como una impureza.del procesq): 0,01 mg/ml de TFA en DHu-
yente, preparada a partir de la Soluci.n madre de TFA
Solucin estndar (cuando el contenido de JFA se analiza como un co.11train en. un ingrediente farmacutico ~ctivo):
0,25 mg/ml,, de TFA en Diluyente, preparada a partir de la Solucin madre d.e TEA. [NOTA-:La concen.tracin puede ser ajus-
tada dependiendo de la cantidad deTFA que se .espera est presente en el materied de prueba.]
Solucin muestra: No menos de 4mg/ml de. la muestra de pr4eb<!.e11 Diluyente. [NQTA-La concentracin muestra puede
ser adaptada dependiendo de la cantidad de TFA esperacfa.]
Sistema cromatogrfico
{Ver Cromatografa< 621 ), lptitud del. Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 21 O nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 m. [NOTA-Se puede usar una guarda columna de 4 mm x 2 cm; relleno Ll
de 5 m.]
Velocidad de Flujo: 1,5 mL/min
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de aptitud del sistema
[NOTA-Eftiempo deretencin es aproximadamente 3 minutos para TFA.]
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 5%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de TFA en la porcin de muestra tomada:
Resultaqo = (ruf r5) x (CsfCu) x 100
ru =respuestas de los picos deTfA de la Sofucinmuestra
r5 = respuestas de tos picos de TFA de la Solucin estndar
( 5 = concentracin de TFA en la Solucin estndar (mg/rnl)
Cu =concentracin de la Solucin muestra (mg/mL)
REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Trifluoroacetato de Sodio USP
1>.USP39
386 (511) Valoracin de un Esteroide Aislado/ Pruebas Qumicas USP 39

(511) VALORACIN DE UN ESTEROIDE AISLADO

En el siguiente procedimiento, el esteroide a valorar se separa de los esteroides extraos relacionados y excipientes mediante
cromatografa en capa delgada y se determina despus de la recuperacin a partir del cromatograma.
Preparacin de la Placa-Preparar una suspensin espesa con 30 g de gel de slice para cromatografa y una sustancia fluo-
rescente adecuada agregando gradualmente aproximadamente 65 mL de una mezcla de agua y alcohol (5:2), y mezclando.
Transferir la suspensin espesa a una placa limpia de 20 cm x 20 cm, extender hasta obtener una capa uniforme de 250 m
de espesor y dejar que se seque a temperatura ambiente durante 15 minutos. Calentar la placa a 105 durante 1 hora y alma-
cenar en un desecador.
Disolvente A-Mezclar cloruro de metileno con metanol (180:16).
Disolvente B-Mezclar cloroformo con acetona (4: 1).
Preparacin Estndar-Disolver en una mezcla de volmenes iguales de cloroformo y alcohol una cantidad adecuada del
Estndar de Referencia USP especificado en la monografa individual, previamente secada segn se indic (ver Estndares de
Referencia USP (11 )) y pesada con exactitud, para obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente
2 mg por ml.
Preparacin de Valoracin-Preparar segn se indica en la monografa individual.
Procedimiento-Dividir el rea de la placa cromatogrfica en tres secciones iguales y usar las secciones izquierda y derecha
para la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente, y la seccin central para el blanco. Aplicar 200 L
de la Preparacin de Valoracin y 200 L de la Preparacin Estndar en franjas alejadas en 2,5 cm del borde inferior de la seccin
correspondiente de la placa. Secar la solucin a medida que se aplica, con ayuda de una corriente de aire. Usando el Disolvente
especificado en la monografa individual, desarrollar el cromatograma en una cmara adecuada, previamente equilibrada y
con recubrimiento interno de papel absorbente, hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido 15 cm por encima de las
franjas iniciales.
Retirar la placa, evaporar el disolvente y localizar la banda principal ocupada por la Preparacin Estndar observndola bajo
luz UV. Marcar esta banda, adems de las bandas correspondientes en la Preparacin de Valoracin y en las secciones del blan-
co de la placa. Quitar el gel de slice de cada banda por separado, ya sea raspando sobre papel satinado o usando un dispositi-
vo adecuado recolector por vaco y transferirlo a un tubo de centrfuga de 50 mL con tapn de vidrio. Agregar 25,0 mL de
alcohol a cada tubo y agitar durante no menos de 2 minutos. Centrifugar los tubos durante 5 minutos, pipetear 20 mL del
sobrenadante de cada tubo y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 mL con tapn de vidrio, agregar 2,0 mL de una solucin
preparada por disolucin de 50 mg de azul de tetrazolio en 1O mL de metano! y mezclar. Proceder segn se indica en el
Procedimiento en Valoracin de Esteroides (351 ), comenzando donde dice "Luego a cada matraz".

(525) DIXIDO DE AZUFRE

Los siguientes mtodos se proporcionan a efectos de la determinacin de dixido de azufre en excipientes farmacuticos.

MTODO 1

Procedimiento

Mezclar 20 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, con 200 mL de un disolvente adecuado, segn se indica en la
monografa individual, y mezclar hasta obtener una suspensin homognea. Dejar en reposo la mezcla de prueba hasta que la
mayor parte de la muestra se haya sedimentado y filtrar la porcin acuosa a travs de papel (Whatman N 1 o equivalente). A
100 mL del filtrado transparente, agregar un disolvente adicional segn se indica en la monografa individual, agregar 3 mL de
almidn SR y valorar con solucin de yodo 0,01 N SV hasta el primer color azul o prpura permanente. Cada mL de solucin
de yodo 0,01 N SV consumido corresponde a 0,003% de dixido de azufre encontrado.

MTODO 11

Procedimiento

Transferir aproximadamente 50 a 100 g de la sustancia en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250
mL, agregar 100 a 150 mL de agua y mezclar. Enfriar entre 5 y 1O. Mientras se mezcla con un mezclador magntico, agregar
1O mL de hidrxido de sodio 1,5 N fro (a una temperatura entre 5 y 1O). Mezclar durante 20 segundos adicionales y agre-
gar 1O mL de solucin indicadora de almidn, preparada de la siguiente manera: mezclar 1O g de almidn soluble con 50 mL
USP 39 Pruebas Qumicas/ (525) Dixido de Azufre 387

de agua fra, transferir a 1000 ml de agua en ebullicin, mezclar hasta que se disuelva por completo, enfriar y agregar 1 g de
cido saliclico como conservante. [NOTA-Desechar la solucin despus de 1 mes.] Agregar 1O ml de cido sulfrico 2,0 N (a
una temperatura entre 5 y 1O) y valorar inmediatamente con yodo 0,005 N SV hasta que persista un color azul claro durante
1 minuto (ver Volumetra (541 )). Realizar una determinacin con un blanco, usando 200 ml de agua tratada de manera similar
que la solucin en anlisis y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de yodo 0,005 N equivale a O, 16 mg de S0 2

MTODO 111

Procedimiento

Disolver 20,0 g de la muestra de prueba en 150 ml de agua caliente en un matraz de fondo redondo y cuello largo, agregar
5 ml de cido fosfrico y 1 g de bicarbonato de sodio, e inmediatamente conectar el matraz a un condensador. [NOTA-Se
puede reducir la produccin excesiva de espuma mediante el agregado de unas pocas gotas de un agente antiespumante ade-
cuado.] Destilar 50 ml, recibiendo el destilado bajo la superficie de 50 ml de yodo 0, 1 N. Acidificar el destilado con unas
pocas gotas de cido clorhdrico, agregar 2 ml de cloruro de bario SR y calentar en un bao de vapor hasta que el lquido sea
casi incoloro. El precipitado de sulfato de bario, si lo hubiera, una vez filtrado, lavado e incinerado, pesa no ms de 3 mg, que
corresponde a no ms de 0,004% de dixido de azufre, haciendo las correcciones para cualquier sulfato que pudiera estar
presente en 50 ml del yodo 0, 1 N.

MTODO IV

En esta prueba, el dixido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio cido en ebullicin y se extrae
con una corriente de dixido de carbono. El gas separado se recoje en una solucin de perxido de hidrgeno diluida, en la
que el dixido de azufre se oxida a cido sulfrico y se valora con lcali estndar, usando un medidor de pH para controlar el
valor de pH y la valoracin. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la
prueba de aptitud del sistema.

Reactivos Especiales

DIXIDO DE CARBONO

Usar dixido de carbono con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 100 1 O ml por minuto.

SOLUCIN DE PERXIDO DE HIDRGENO

Diluir perxido de hidrgeno al 30% con agua para obtener una solucin al 3%. Neutralizar la solucin de perxido de hi-
drgeno al 3% con hidrxido de sodio 0,01 N a un pH de 4, 1 determinado potenciomtricamente.

SOLUCIN DE METABISULFITO DE POTASIO

Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K2 S2 0 5 ) y 0,2 g de edetato disdico a un matraz volumtrico de 1000 ml.
Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disdico para proteger al in sulfito de la oxidacin.]

Aparato

El diagrama adjunto muestra un aparato adecuado para la determinacin de dixido de azufre (Figura 1). El aparato consiste
en un matraz de ebullicin de 500 ml de fondo redondo con tres cuellos, A; un embudo de separacin, 8, con una capacidad
de 100 ml o mayor; un tubo de entrada de gas de longitud sificiente para permitir la introduccin de dixido de carbono a
2,5 cm del fondo del matraz de ebullicin; un condensador de reflujo, C, con una longitud de la camisa de 200 mm; y un tubo
de salida, E, que conecta el extremo superior del condensador de reflujo con el fondo de un tubo de ensayo receptor, O.
Aplicar una pelcula fina de grasa para llaves de paso a las superificies de sellado de todas las juntas, excepto la junta que est
entre el embudo de separacin y el matraz de ebullicin, y sujetar las juntas con abrazaderas para garantizar la hermeticidad.
388 (525) Dixido de Azufre / Pruebas Qumicas USP 39

Figura 1. Aparato para el Mtodo IV.

Prueba de Aptitud del Sistema

PRUEBA A

Usando la Solucin de Metabisulfito de Potasio como el estndar, proceder segn se indica en Procedimiento, excepto que se
deben reemplazar 25,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solucin de Metabisulfito de Potasio. Calcular el contenido, en
g por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada por la frmula:

1000(32,03)VN/Vp

en donde 1000 es el factor de conversin de mg a g; 32,03 es el peso miliequivalente de dixido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y Vp es el volumen, en mL, de la
Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.

PRUEBA B

En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solucin de yodo 0,02 N y 5 mL de cido clorhdrico 2 N. Agregar 1
mL de almidn SR y valorar con la Solucin de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloracin. Calcular el
contenido, en g por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio por la frmula:

1000(32,03)VN/Vp

en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V1 es el volumen, en mL, de solucin de yodo usado en la prueba; N 1 es la
normalidad de la solucin de yodo; y Vp es el volumen, en mL, de la Solucin de Metabisulfito de Potasio consumida.
La diferencia entre los contenidos de dixido de azufre obtenidos a partir de la Prueba A y la Prueba Bes no ms de 5% de su
valor promedio. La Prueba B se debe realizar dentro de los 15 minutos posteriores a la finalizacin de la Prueba A. [NOTA-Esto
evita una variacin potencial del contenido de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena
a temperatura ambiente.]

Procedimiento

Agregar 150 mL de agua al matraz de ebullicin (A). Cerrar la llave de paso del embudo de separacin y comenzar el flujo
de dixido de carbono a una velocidad de 100 5 mL por minuto a travs del aparato. Iniciar el flujo refrigerante del conden-
sador. Colocar 1 O mL de Solucin de Perxido de Hidrgeno en el tubo de ensayo receptor (O). Despus de 15 minutos, sin
haber interrumpido el flujo de dixido de carbono, retirar el embudo de separacin (8) del matraz de ebullicin y transferir
25,0 g de la muestra de prueba al matraz de ebullicin con ayuda de 100 mL de agua. Aplicar grasa para llaves de paso a la
junta externa del embudo de separacin y volver a colocar el embudo de separacin en el matraz de ebullicin. Cerrar la llave
de paso del embudo de separacin y agregar 80 mL de cido clorhdrico 2 N al embudo de separacin. Abrir la llave de paso
USP 39 Pruebas Qumicas/ (525) Dixido de Azufre 389

del embudo de separacin para permitir que la solucin de cido clorhdrico fluya en el matraz de ebullicin, cerrando la llave
de paso antes de que escurran los ltimos ml de cido clorhdrico para evitar que el dixido de azufre escape hacia el embudo
de separacin. Calentar la mezcla a ebullicin durante 1 hora. Abrir la llave de paso del embudo, detener el flujo de dixido de
carbono, discontinuar el calentamiento del matraz, y detener el flujo de agua refrigerante en el condensador. Retirar el tubo de
ensayo receptor y transferir su contenido a un matraz Erlenmeyer de 200 ml de cuello ancho. Enjuagar el tubo de ensayo
receptor con una pequea porcin de agua, agregar el enjuague al matraz Erlenmeyer de 200 ml, y mezclar. Calentar en un
bao de agua durante 15 minutos y dejar que se enfre. Agregar O, 1 ml de azul de bromofenol SR y valorar el contenido con
hidrxido de sodio O, 1 N SV hasta que el color cambie de amarillo a azul violceo y el cambio de color persista durante al
menos 20 segundos. Realizar una determinacin con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetra (541 )). Cal-
cular el contenido, en g por g, de dixido de azufre en la muestra de prueba tomada por la frmula:
1000(32,03)VN/W
en donde 1000 es el factor de conversin de mg a g; 32,03 es el peso miliequivalente de dixido de azufre; V es el volumen,
en ml, de solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y W es el peso, en g, de la muestra
de prueba tomada.

MTODO V
En este mtodo, de manera similar al Mtodo IV, el dixido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio
cido en ebullicin y se extrae con una corriente de nitrgeno. El gas separado se recoje en una solucin de perxido de hidr-
geno diluida, en la que el dixido de azufre se oxida a cido sulfrico y se valora con lcali estndar, usando rojo de metilo
como indicador. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la prueba de
aptitud del sistema.

Reactivos Especiales

SOLUCIN DE PERXIDO DE HIDRGENO

Diluir una porcin de perxido de hidrgeno al 30 por ciento con agua para obtener una solucin al 3%. Justo antes de su
uso, agregar 3 gotas de rojo de metilo SR y neutralizar hasta un punto final amarillo con hidrxido de sodio 0,01 N. No exce-
der el punto final.

NITRGENO

Usar nitrgeno de alta pureza con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 200 1O ml por minuto. Evitar la presen-
cia de oxgeno pasando el nitrgeno a travs de un depurador, tal como pirogalol alcalino, que se prepara segn se indica a
continuacin: agregar 4,5 g de pirogalol a un frasco de lavado de gases, purgar el frasco con nitrgeno durante 3 minutos, y
agregar una solucin que contenga 85 ml de agua y 65 g de hidrxido de potasio mientras se mantiene una atmsfera de
nitrgeno en el frasco.

SOLUCIN DE METABISULFITO DE POTASIO

Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K 2 SP5 ) y 0,2 g de edetato disdico a un matraz volumtrico de 1000 ml.
Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disdico para proteger al in sulfito de la oxidacin.]

Aparato

El aparato (ver la Figura 2) est diseado para realizar la transferencia selectiva de dixido de azufre de la muestra en cido
clorhdrico acuoso en ebullicin a la Solucin de Perxido de Hidrgeno en el vaso G. La contrapresin se limita a la presin inevi-
table debida a la altura de la Solucin de Perxido de Hidrgeno por encima del extremo del burbujeador, F. Mantener la contra-
presin lo ms baja posible reduce la probabilidad de prdida de dixido de azufre por fugas. Calentar a ebullicin previamen-
te los tubos de vinilo y silicona. Aplicar una pelcula fina de grasa para llaves de paso a las superficies de sellado de todas las
juntas, excepto la junta entre el embudo de separacin y el matraz, y sujetar las juntas para garantizar la hermeticidad. El em-
budo de separacin, 8, tiene una capacidad de 100 ml o mayor. El adaptador de entrada, A, con una manguera conectora,
permite aplicar presin de carga a la solucin. [NOTA-No se recomienda el uso de un embudo de goteo que equilibre la pre-
sin debido a que el condensado, que puede contener dixido de azufre, se deposita en el embudo y en el brazo lateral.]
390 (525) Dixido de Azufre / Pruebas Qumicas USP 39

A___..

E---+

s-

,
'
'
''
''
'
''
'
''

Figura 2. Aparato para el Mtodo V.

El matraz de fondo redondo, C, es un matraz de 1000 ml con tres juntas cnicas tipo 24/40. El tubo de entrada de gas, D,
tiene una longitud suficiente para permitir la introduccin del nitrgeno a 2,5 cm del fondo del matraz. El condensador Allihn,
E, tiene una longitud de camisa de 300 mm. El burbujeador, F (ver la Figura 3), est fabricado con vidrio segn las dimensiones
proporcionadas en la Figura 3. La Solucin de Perxido de Hidrgeno est contenida en el vaso, G, con un dimetro interno de
aproximadamente 2,5 cm y una profundidad de aproximadamente 18 cm. Hacer que circule un refrigerante, como por ejem-
plo una mezcla de agua y metanol (4:1) mantenida a 5, para enfriar el condensador.

T24/40

1
185 mm

l
Figura 3. Burbujeador (F) para el aparato del Mtodo V.
USP 39 Pruebas Qumicas / (525) Dixido de Azufre 391

Prueba de Aptitud del Sistema

PRUEBA A

Usando la Solucin de Metabisulfito de Potasio como el estndar, proceder segn se indica en Procedimiento, excepto qe se
deben reemplazar los 50,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solucin de Metabisulfito de Potasio. Calcular el contenido,
en g por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada por la frmula:
1000(32,03)VN/Vp

en donde 1000 es el factor de conversin de mg a g; 32,03 es el peso miliequivalente de dixido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y Vp es el volumen, en mL, de
Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.

PRUEBA B

En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solucin de yodo 0,02 N y 5 mL de cido clorhdrico 2 N. Agregar 1
mL de almidn SR y valorar con la Solucin de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloracin. Calcular el
contenido, en g por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio por la frmula:

1000(32,03)VN/Vp

en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V1 es el volumen, en mL, de solucin de yodo usado en la prueba; N 1 es la
normalidad de solucin de yodo; y Vp es el volumen, en mL, de Solucin de Metabisulfito de Potasio consumida.
La diferencia entre el contenido de dixido de azufre obtenido a partir de la Prueba A y la Prueba Bes no ms de 5% de su
valor promedio. La Prueba B deber realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la finalizacin de la Prueba A. [NOTA-Esto
evita la variacin potencial del contenido de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena a
temperatura ambiente.]

Procedimiento

Colocar el aparato en un manto de calentamiento controlado por un dispositivo regulador de energa. Agregar 400 mL de
agua al matraz. Cerrar la llave de paso del embudo de separacin y agregar 90 mL de cido clorhdrico 4 N al embudo de
separacin. Comenzar el flujo de nitrgeno a una velocidad de 200 1O mL por minuto. Iniciar el flujo refrigerante del con-
densador. Agregar 30 mL de Solucin de Perxido de Hidrgeno al vaso (G). Despus de 15 minutos, retirar el embudo de sepa-
racin y transferir al matraz una mezcla de 50,0 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, y 100 mL de solucin
alcohlica (5 en 100). Aplicar grasa para llaves de paso a la junta externa del embudo de separacin, volver a colocar el embu-
do de separacin al matraz de junta cnica, y reanudar concomitantemente el flujo de nitrgeno. Aplicar presin de carga
sobre la solucin de cido clorhdrico en el embudo de separacin con una pera de goma provista de una vlvula. Abrir la llave
de paso del embudo de separacin para permitir que la solucin de cido clorhdrico fluya en el matraz. Continuar mantenien-
do por encima de la solucin de cido clorhdrico una presin suficiente para forzarla hacia el interior del matraz. [NOTA-Si
fuera necesario, se puede cerrar la llave de paso temporalmente para incrementar la presin.] Para evitar fugas de dixido de
azufre hacia el embudo de separacin, cerrar la llave de paso antes de que escurran los ltimos mL de cido clorhdrico. Aplicar
suficiente energa al manto de calentamiento para generar aproximadamente 85 gotas de reflujo por minuto. Despus de so-
meter a reflujo durante 1,75 horas, retirar el vaso (G), agregar 3 gotas de rojo de metilo SR, y valorar el contenido con hidrxi-
do de sodio 0,01 N SV, usando una bureta de 1O mL con un tubo de desborde y una manguera que conecte a un tubo de
absorcin de dixido de carbono, hasta un punto final amarillo que persista durante al menos 20 segundos. Realizar una deter-
minacin con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetra (541 )). Calcular la cantidad, en g, de S0 2 en cada
g de la muestra de prueba tomada por la frmula:

1000(32,03)VN/W
en donde el factor 1000 convierte mg a g; 32,03 es el peso miliequivalente de dixido de azufre; V es el volumen, en mL, de
solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y W es el peso, en g, de la muestra de prueba
tomada.
392 (531) Valoracin de Tiamina /Pruebas Qumicas USP 39

(531) VALORACIN DE TIAMINA

Estndares de Referencia USP (11 )-ER Clorhidrato de Tiamina USP.

El siguiente procedimiento se proporciona para la determinacin de tiamina como ingrediente de Preparaciones farmacopei-
cas que contengan otros componentes activos.
Soluciones y Disolventes Especiales-
SOLUCIN DE FERRICIANURO DE POTASIO-Disolver 1,0 g de ferricianuro de potasio en agua para obtener 100 ml. Preparar la
solucin el mismo da de su uso.
REACTIVO DE OXIDACIN-Mezclar 4,0 ml de la Solucin de Ferricianuro de Potasio con suficiente hidrxido de sodio 3,5 N para
obtener 100 ml. Usar esta solucin dentro de las 4 horas posteriores.
SOLUCIN MADRE DE SULFATO DE QUININA-Disolver 1 O mg de sulfato de quinina en cido sulfrico O, 1 N para obtener 1000
ml. Conservar esta solucin, protegida de la luz, en un refrigerador.
SOLUCIN ESTNDAR DE SULFATO DE QUININA-Diluir cido sulfrico 0, 1 N con Solucin Madre de Sulfato de Quinina (39:1 ). Esta
solucin emite fluorescencia aproximadamente en el mismo grado que el tiocromo obtenido de 1 g de clorhidrato de tiami-
na y se usa para corregir el fluormetro a intervalos frecuentes debido a la variacin en la sensibilidad entre una lectura y otra
dentro de una valoracin. Preparar esta solucin el mismo da de su uso.
Solucin Madre de Clorhidrato de Tiamina Estndar-Transferir aproximadamente 25 mg de ER Clorhidrato de Tiamina
USP, pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de 1000 ml. Disolver el Estndar pesado en aproximadamente 300 ml
de solucin de alcohol diluido (1 en 5) ajustada con cido clorhdrico 3 N hasta un pH de 4,0 y llevar a volumen con el alcohol
diluido acidificado. Almacenar en un envase resistente a la luz, en un refrigerador. Preparar esta solucin madre nueva cada
mes.
Preparacin Estndar-Diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas una porcin de la Solucin Madre de Clorhidrato
de Tiamina Estndar con cido clorhdrico 0,2 N para obtener la Preparacin Estndar, cada ml de la cual representa 0,2 g del
ER Clorhidrato de Tiamina USP.
Preparacin de Valoracin-Colocar en un matraz volumtrico adecuado una cantidad suficiente del material a valorar,
pesada con exactitud o medida por volumen segn se indique, de modo que al diluir a volumen con cido clorhdrico 0,2 N,
la solucin resultante contenga aproximadamente 100 g de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml. Si la muestra es
difcil de disolver, se puede calentar la solucin en un bao de vapor y luego enfriar y diluir a volumen con el cido. Diluir
cuantitativamente y en diluciones sucesivas 5 ml de esta solucin usando cido clorhdrico 0,2 N hasta una concentracin esti-
mada de 0,2 g de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml.
Procedimiento-Pipetear 5 ml de la Preparacin Estndar y transferir a cada uno de tres o ms tubos (u otros recipientes
adecuados) de aproximadamente 40 ml de capacidad. A cada uno de dos de estos tubos agregar rpidamente (en 1 2 se-
gundos) mezclando, 3,0 ml del Reactivo de Oxidacin y dentro de 30 segundos agregar 20,0 ml de alcohol isobutlico, luego
mezclar vigorosamente durante 90 segundos por agitacin manual de los tubos tapados, o haciendo burbujear una corriente
de aire en la mezcla. Preparar un blanco en el tubo restante del estndar sustituyendo el Reactivo de Oxidacin por un volumen
equivalente de hidrxido de sodio 3,5 N y procediendo de la misma manera.
Pipetear 5 ml de la Preparacin de Valoracin y transferir a cada uno de tres o ms tubos similares. Tratar estos tubos de
manera similar a como se indica para los tubos que contienen la Preparacin Estndar.
Pipetear 2 ml de alcohol deshidratado y transferir a cada uno de seis tubos, agitar por rotacin suave durante algunos se-
gundos, permitir que las fases se separen y decantar o extraer aproximadamente 1 O ml de solucin de alcohol isobutlico so-
brenadante transparente a celdas estandarizadas, luego medir la fluorescencia en un fluormetro adecuado que tenga un filtro
de entrada de intervalo de transmitancia estrecho con un mximo aproximadamente a 365 nm y un filtro de salida con un
intervalo de transmitancia estrecho con un mximo aproximadamente a 435 nm.
Clculos-La cantidad de g de C12 H17 CIN 4 0S HCI en cada 5 ml de la Preparacin de Valoracin est dada, por la frmula:

(A - b)/(S - d)
en donde A y S son las lecturas promedio del fluormetro de las porciones de la Preparacin de Valoracin y la Preparacin
Estndar tratadas con el Reactivo de Oxidacin, respectivamente, y b y d son las lecturas de los blancos de la Preparacin de
Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente.
Calcular la cantidad, en mg, de clorhidrato de tiamina (C 12 H17 CIN 4 0S HCI) en el material de valoracin sobre la base de las
alcuotas tomadas. Cuando se indique, la cantidad, en mg, de mononitrato de tiamina (C 12 H17 N 5 0 4 S) se puede calcular por
multiplicacin de la cantidad encontrada de C12 H 17 CINPS HCI por 0,9706.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (541) Volumetra 393

(541) VOLUMETRA

Valoraciones Volumtricas Directas-La volumetra directa es el tratamiento de una sustancia soluble en solucin, y con-
tenida en un recipiente adecuado, con una solucin estandarizada apropiada (la solucin volumtrica), donde el punto final se
determina en forma instrumental, o visualmente con ayuda de un indicador adecuado.
La solucin volumtrica se agrega desde una bureta de capacidad adecuada que se elige de acuerdo con la concentracin
(normalidad), de modo tal que el volumen consumido sea de entre 30% y 100% de la capacidad nominal de la bureta.
[NOTA-En los casos en que se requiera menos de 1 O mL de solucin volumtrica, se debe utilizar una microbureta adecuada.]
La aproximacin al punto final se hace directamente pero con cuidado, y finalmente la solucin volumtrica se agrega gota a
gota desde la bureta para que la ltima gota no sobrepase el punto final. La cantidad de sustancia valorada se puede calcular a
partir del volumen, el factor de normalidad o molaridad de la solucin volumtrica, y el factor de equivalencia de la sustancia
que se especifica en la monografa correspondiente.
Valoraciones Volumtricas Residuales-Algunas valoraciones farmacopeicas requieren la adicin de un volumen determi-
nado de una solucin volumtrica, en exceso del necesario para reaccionar con la sustancia a valorar. Despus, el excedente
de esta solucin se valora con una segunda solucin volumtrica. Esto constituye una volumetra residual y tambin se conoce
como "retrovaloracin" o "valoracin por retorno". La cantidad de la sustancia valorada se puede calcular a partir de la dife-
rencia entre el volumen de la solucin volumtrica que se agreg originalmente corregida por medio de una valoracin con un
blanco y el consumido por la solucin volumtrica en la retrovaloracin, teniendo en cuenta los respectivos factores de molari-
dad o normalidad de las dos soluciones y el factor de equivalencia para la sustancia indicado en la monografa correspondien-
te.
Valoraciones Complejomtricas-EI xito de las valoraciones complejomtricas depende de varios factores. La constante
de equilibrio de formacin del complejo del reactivo en la solucin volumtrica-analito debe ser lo suficientemente grande co-
mo para que, en el punto final, casi el 100% del analito haya formado el complejo. El complejo final se debe formar lo suficien-
temente rpido para que el tiempo de anlisis sea prctico. Cuando la reaccin analtica no es rpida, algunas veces puede
resultar til realizar una volumetra residual.
En general, los indicadores para valoraciones complejomtricas son en s mismos agentes formadores de complejos. La reac-
cin entre el in metlico y el indicador debe ser rpida y reversible. La constante de equilibrio de formacin del complejo
metal-indicador debe ser lo suficientemente grande como para producir un cambio de color marcado pero debe ser menor
que la correspondiente al complejo metal-valorante. La eleccin del indicador tambin est limitada por el intervalo de pH en
el que se debe efectuar la reaccin de formacin del complejo y por la interferencia de otros iones presentes en la muestra o
de la solucin amortiguadora. Los iones que interfieren, a menudo se pueden enmascarar o "secuestrar" mediante la adicin
de otro agente formador de complejos. (La tcnica de enmascaramiento tambin se usa en las valoraciones redox).
Valoraciones por xido-Reduccin (Redox)-Con frecuencia, se pueden llevar a cabo determinaciones de manera conve-
niente mediante el uso de un reactivo que provoque la oxidacin o la reduccin del analito. Muchas curvas de valoracin re-
dox no son simtricas respecto al punto de equivalencia y, de ese modo, no es posible la determinacin grfica del punto final;
pero se dispone de indicadores para muchas determinaciones y adems, frecuentemente los reactivos redox pueden servir co-
mo sus propios indicadores. Igual que en cualquier tipo de volumetra, el indicador ideal cambia de color en un punto final
que est lo ms prximo posible al punto de equivalencia. En consecuencia, cuando la solucin volumtrica sirve como su pro-
pio indicador, la diferencia entre el punto final y el punto de equivalencia slo est determinada por la habilidad del analista
para detectar el cambio de color. Un ejemplo comn es el uso del in permanganato como componente de una solucin volu-
mtrica de oxidacin ya que un leve exceso se puede detectar por su color rosado. Otras soluciones volumtricas que pueden
servir como sus propios indicadores son el yodo, las sales de cerio (IV} y el dicromato de potasio. En la mayora de los casos, sin
embargo, el uso de un indicador redox producir un punto final mucho ms marcado.
Puede ser necesario ajustar el estado de oxidacin del analito antes de la volumetra mediante el uso de un agente oxidante
o reductor adecuado; despus, el exceso de reactivo se debe eliminar, por ejemplo, mediante precipitacin. Esta es casi siem-
pre la prctica habitual en la determinacin de agentes oxidantes, ya que la mayora de soluciones volumtricas de agentes
reductores son oxidadas lentamente por el oxgeno atmosfrico.
Valoraciones Volumtricas en Disolventes No Acuosos-Los cidos y las bases han sido definidas durante mucho tiempo
como sustancias que cuando se disuelven en agua, proporcionan iones de hidrgeno e hidroxilo, respectivamente. Esta defini-
cin, introducida por Arrhenius, no reconoce el hecho de que propiedades caractersticas de los cidos o las bases tambin se
pueden desarrollar en otros disolventes. Una definicin ms generalizada es la de Bronsted, quien defini un cido como una
sustancia que proporciona protones y una base como una sustancia que se combina con protones. Una definicin an ms
amplia es la de Lewis, quien defini un cido como cualquier sustancia que acepta un par de electrones, una base como cual-
quier sustancia que dona un par de electrones y la neutralizacin como la formacin de una unin de coordinacin entre un
cido y una base.
La fuerza aparente de un cido o una base se determina por su grado de reaccin con un disolvente. En solucin acuosa
todos los cidos fuertes parecen ser igualmente fuertes porque reaccionan con el disolvente para sufrir una conversin casi
completa en el in oxonio y el anin del cido (efecto nivelador). En un disolvente dbilmente protfilo como el cido actico,
394 (541) Volumetra / Pruebas Qumicas USP 39

el grado de formacin del in acidonio del acetato, indica que el orden decreciente de la fuerza para cidos es perclrico,
brornhdrico, sulfrico, clorhdrico y ntrico (efecto diferenciador).
El cido actico reacciona de forma incompleta con el agua para formar in oxonio y por lo tanto es un cido dbil. En
contraste, se disuelve en una base corno etilendiarnina y reacciona en forma tan completa con el disolvente que se comporta
corno un cido fuerte. Lo mismo es vlido para el cido perclrico.
Este efecto nivelador tambin se observa en el caso de las bases. En cido sulfrico, casi todas las bases parecen tener la
misma fuerza. A medida que las propiedades del disolvente disminuyen en la serie constituida por cido sulfrico, cido acti-
co, fenol, agua, piridina y butilarnina, las bases se vuelven progresivamente ms dbiles hasta que todas, excepto las ms fuer-
tes, pierden sus propiedades bsicas. En orden de fuerza decreciente, las bases ms fuertes son 2-arninoetxido de sodio, rne-
txido de potasio, rnetxido de sodio y rnetxido de litio.
Muchos compuestos insolubles en agua adquieren mejores propiedades cidas o bsicas cuando se disuelven en disolventes
orgnicos. De esta manera, la eleccin del disolvente adecuado permite la determinacin de una variedad de tales sustancias
mediante valoracin en medios no acuosos. Adems, dependiendo de cual sea la parte fisiolgicamente activa del compuesto,
con frecuencia es posible valorarla selectivamente, eligiendo el disolvente y el valorante adecuados. Los compuestos puros se
pueden valorar directamente, pero en preparaciones farmacuticas a menudo es necesario aislar el ingrediente activo de los
excipientes y vehculos que interfieran.
Entre los tipos de compuestos que se pueden valorar corno cidos estn los cidos de haluros, anhdridos de cidos, cidos
carboxlicos, aminocidos, enoles corno barbituratos y xantinas, irnidas, fenoles, pirroles y sulfonamidas. Entre los tipos de
compuestos que se pueden valorar corno bases estn las aminas, compuestos heterocclicos que contienen nitrgeno, oxazoli-
nas, compuestos de amonio cuaternario, sales alcalinas de cidos orgnicos, sales alcalinas de cidos inorgnicos dbiles y al-
gunas sales de aminas. Muchas sales de cidos halogenados se pueden valorar en cido actico o anhdrido actico despus de
agregar acetato de mercurio, que elimina iones haluros formando un complejo de halgeno-mercurio sin ionizar e introduce el
acetato ionizado.
Para la volurnetra de un compuesto bsico se prefiere una solucin volumtrica de cido perclrico en cido actico glacial,
aunque en casos especiales se usa cido perclrico en dioxano. El sistema de electrodos de vidrio-calomel resulta til en este
caso. En cido actico corno disolvente, este sistema de electrodos funciona de acuerdo con la teora.
Para la volurnetra de un compuesto cido, se dispone de dos clases de soluciones volumtricas: los alcxidos de metales
alcalinos y los hidrxidos de tetraalquilarnonio. Con frecuencia se usa una solucin volumtrica de rnetxido de sodio en una
mezcla de metano! y tolueno, aunque en algunos casos, cuando se produce un precipitado gelatinoso con el rnetxido de
sodio, se emplea rnetxido de litio en un disolvente de rnetanol-benceno.
Cuando se emplean soluciones volumtricas de alcxidos de metales alcalinos se produce un error alcalino que limita el em-
pleo de un electrodo de vidrio, en particular en disolventes bsicos. El electrodo indicador de antimonio, aunque algo errtico,
resulta til en estos casos. El uso de hidrxidos de amonio cuaternario, por ej., el hidrxido de tetra-n-butilarnonio y el hidrxi-
do de trirnetilhexadecilarnonio (en benceno-metano! o alcohol isoproplico), presenta dos ventajas sobre las otras dos solucio-
nes volumtricas: (a) la sal de tetraalquilarnonio del cido valorado es soluble en el medio de valoracin y (b) se puede em-
plear un par de electrodos de vidrio calomel, de uso corriente en la mayora de los laboratorios analticos, para llevar a cabo
valoraciones volumtricas potenciorntricas.
Debido a la interferencia producida por el dixido de carbono, los disolventes empleados en la valoracin de sustancias ci-
das se deben proteger de la exposicin excesiva al aire atmosfrico durante la valoracin mediante una proteccin adecuada o
una atmsfera inerte. La absorcin de dixido de carbono se puede determinar mediante la volurnetra con un blanco. El blan-
co no debe exceder ms de 0,01 rnL de rnetxido de sodio SV O, 1 N por rnL de disolvente.
El punto final se puede determinar visualmente por el cambio de color de un indicador, o potenciorntricarnente, segn se
especifique en la monografa correspondiente. Si se usa un electrodo de calomel corno referencia, es recomendable sustituir la
solucin acuosa de cloruro de potasio del puente salino con perclorato de litio O, 1 N en cido actico glacial para valoraciones
en disolventes cidos o cloruro de potasio en metano! para valoraciones en disolventes bsicos.
Cuando en la monografa correspondiente se indica el uso de estas u otras mezclas, el electrodo de calomel de referencia se
modifica retirando en primer lugar la solucin acuosa de cloruro de potasio y el cloruro de potasio residual, si lo hubiera, en-
juagando con agua y luego eliminando el agua residual enjuagando con el disolvente no acuoso indicado y finalmente, llenan-
do el electrodo con la mezcla no acuosa indicada.
En casi todos los casos, excepto en aquellos en los que el in de plata podra interferir, el electrodo de calomel se puede
sustituir por un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. El electrodo de plata-cloruro de plata es ms resistente y su
uso ayuda a eliminar sales de mercurio txicas del laboratorio. En general se puede utilizar un puente salino para evitar la inter-
ferencia del in plata.
Los sistemas ms tiles para volurnetra en disolventes no acuosos se indican en la Tabla 1.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (541) Volumetra 395

Tabla 1. Sistemas para Valoraciones Volumtricas No Acuosas

Relativamente Neutro Relativamente Neutro
Tipo de cido (para valoracin (para valoracin Bsico (para valoracin (para valoracin
DI solvente de bases y sus sales) diferencial de bases) de cidos) diferencial de cidos)
Disolvente 1 cido actico glacial Acetonitrilo Dimetilformamida Acetona
Anhdrido actico Alcoholes n-Butilamina Aceton itrilo
cido frmico Cloroformo Piridina Metil etil cetona
cido propinico Benceno Etilendiamina Metil isobutil cetona
Cloruro de sulfurilo Tolueno Morfolina Alcohol terc-butlico
Clorobenceno
Acetato de etilo
Dioxano
Indicador Cristal violeta Rojo de metilo Azul de timol Azo violeta
Rojo de quinaldina Naranja de metilo Timolftalena Azul de bromotimol
p-Naftolbencena p-Naftolbencena Azo violeta p-Hidroxiazobenceno
Alfazurina 2-G o-Nitroanilina Azul de timol
Verde de malaquita p-Hidroxiazobenceno
Electrodos Vidrio-calomel Vidrio-calomel Antimonio-calomel Antimonio-calomel
Vidrio-plata-cloruro de pla- Calomel-plata-cloruro de Antimonio-vidrio Vidrio-calomel
ta plata
Mercurio-acetato mercrico Antimonio-antimonio2 Vidrio-platino2
Platino-calomel
Vidrio-calomel
1 Los disolventes relativamente neutros de baja constante dielctrica como benceno, tolueno, cloroformo o dioxano se pueden emplear junto con cualquier
disolvente cido o bsico para aumentar la sensibilidad del punto final de la valoracin.
2 En solucin volumtrica.

Indicadores y Deteccin Potenciomtrica del Punto Final-El mtodo ms simple y conveniente para determinar el pun-
to de equivalencia, es decir, el punto en el que la reaccin analtica estequiomtrica est terminada, es mediante el uso de
indicadores. Estas sustancias qumicas, generalmente coloreadas, responden a cambios en la solucin antes y despus del pun-
to de equivalencia presentando cambios de color que se pueden detectar visualmente como el punto final de la reaccin, lo
que constituye una estimacin confiable del punto de equivalencia.
Un mtodo til de determinacin del punto final es mediante mediciones electroqumicas. Si un electrodo indicador, sensi-
ble a la concentracin de la especie sometida a la reaccin volumtrica y un electrodo de referencia cuyo potencial no es sensi-
ble a ninguna especie disuelta, se sumergen en la solucin a valorar para formar una celda galvnica, la diferencia de potencial
entre los electrodos se puede medir con un medidor de pH que permite seguir el curso de la reaccin. Cuando es posible grafi-
car correctamente dichas series de cambios (por ejemplo, para el caso de una valoracin cido-base, el pH en funcin de los
ml de solucin volumtrica agregada; para valoraciones de precipitacin, complejomtricas o de xido-reduccin, los mV en
funcin de los ml de solucin volumtrica agregada), se obtiene una curva sigmoidea con una porcin que cambia rpida-
mente (punto de "ruptura") cerca del punto de equivalencia. El punto medio de esta porcin vertical o punto de inflexin se
puede considerar como punto final. El punto de equivalencia tambin se puede determinar matemticamente sin trazar una
curva de valoracin. Sin embargo, se debe tener en cuenta que en reacciones asimtricas en las que el nmero de aniones que
reaccionan no es igual al nmero de cationes que reaccionan, el punto final definido por la inflexin de la curva de volumetra
no ocurre exactamente en el punto de equivalencia estequiomtrico. En consecuencia, la deteccin potenciomtrica del punto
final mediante este mtodo no es adecuada para reacciones asimtricas, como por ejemplo la reaccin de precipitacin,
2Ag+ + Cr0 4 - 2

y la reaccin de xido-reduccin,
5Fe 2 + Mn04-.

Todas las reacciones cido-base, sin embargo, son simtricas. De este modo, la deteccin potenciomtrica del punto final se
puede emplear en valoraciones volumtricas cido-base y en otras valoraciones volumtricas que comprendan reacciones si-
mtricas reversibles donde se especifique un indicador, a menos que se indique lo contrario en la monografa correspondiente.
Existen dos tipos de tituladores electromtricos. El primero agrega la solucin volumtrica automticamente y registra las
diferencias de potencial del electrodo durante el curso de la titulacin dando la curva sigmoidea esperada. En el segundo tipo,
el agregado de solucin volumtrica se lleva a cabo automticamente hasta que se alcanza un potencial o pH preseleccionado,
que representa el punto final y en ese momento cesa el agregado de solucin volumtrica.
Varios sistemas de electrodos, apropiados para valoraciones volumtricas potenciomtricas, se resumen en la Tabla 2.
396 (541) Volumetra / Pruebas Qumicas USP 39

Tabla 2. Sistemas de Electrodos para Valoraciones Volumtricas Potenciomtrlcas

Valoracin
volumtrica Electrodo indicador Ecuacin 1 Electrodo de referencia Aplicaciones 2
cido-base Vidrio E= k + 0,0591 pH Calomel o plata-cloruro de Valoracin volumtrica de
plata cidos y bases
Precipitimetra (plata) Plata E= E+ 0,0591 log [Ag +] Calomel (con puente salino Valoracin volumtrica con
de nitrato de potasio) plata o de plata que com-
prende haluros o tiocianatos
Complejometra Mercurio-mercurio (11) E= E+ 0,0296(1og k'- pM) Calomel Valoracin volumtrica de di-
versos metales (M), p.ej.,
Mg+ 2, Ca+ 2, Al+ 3, Bi+ 3, con
EDTA
xido-reduccin Platino E= E+ (0,0591 /n) x log Calomel o plata-cloruro de Valoraciones volumtricas
[ox]/[red] plata con arsenito, bromo, cerato,
dicromato, hexacianoferrato
(111), yodato, nitrito, perman-
ganato, tiosulfato
1 Forma apropiada de la ecuacin de Nernst que describe el sistema de electrodos indicado: k = constante del electrodo de vidrio; k' = constante derivada del
equilibrio Hg-Hg(ll)-EDTA; M =cualquier metal que se pueda valorar con EDTA; [ox] y [red] de la ecuacin, ox +ne:> red.
2 La lista es representativa pero no est completa.

Correcciones con un Blanco-Como se hizo notar anteriormente, el punto final determinado en una volumetra es una
estimacin del punto de equivalencia de la reaccin. La validez de esta estimacin depende, entre otros factores, de la natura-
leza de las sustancias a valorar y de la concentracin de la solucin volumtrica. Para aumentar la confiabilidad de la determi-
nacin del punto final en valoraciones volumtricas, se realiza una correccin con un blanco adecuado. Dicha correccin con un
blanco se obtiene habitualmente mediante una valoracin residual del blanco, en la que el procedimiento indicado se repite en
todos los detalles excepto que la muestra en anlisis se omite. En tales casos, el volumen real de solucin volumtrica, equiva-
lente a la sustancia analizada, es la diferencia entre el volumen consumido en la valoracin residual del blanco y el consumido
en la valoracin de la muestra. El volumen corregido que se obtiene de esta manera se utiliza para calcular la cantidad de sus-
tancia valorada, de la misma manera que se indica en Valoraciones volumtricas residuales. Cuando el punto final se determina
potenciomtricamente, la correccin del blanco en general es inapreciable.

(551) VALORACIN DE VITAMINA E

INTRODUCCIN
Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se usan para la determinacin de vitamina E como ingrediente far-
macutico activo, como ingrediente de suplemento diettico o como componente de formas farmacuticas farmacopeicas
en las formas alfa tocoferol (C 29 Hs 00 2), acetato de alfa tocoferilo (C 31 H52 0 3), o succinato cido de alfa tocoferilo (C 33 H54 0 5).
Durante toda esta valoracin, proteger de la atmsfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
Estndar de Referencia y las que deriven de stos, usando preferentemente una atmsfera de gas inerte y material de vidrio
con proteccin actnica.
Cuando se especifique vitamina E (alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato cido de alfa tocoferilo) en el siguiente
procedimiento, usar la forma qumica presente en la formulacin y el Estndar de Referencia USP pertinente.

VALORACIN
PROCEDIMIENTO 1
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de vitamina E en:
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
ste es un procedimiento neutro que implica el uso de dimetil sulfxido para disolver los excipientes en la muestra,
seguido de una extraccin lquido-lquido de la vitamina E con hexano. Luego, el extracto de hexano se evapora al
vaco hasta sequedad, y el residuo se reconstituye con metano! antes de inyectarlo en el cromatgrafo.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar,
las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Solucin A: Solucin de cido fosfrico (1 en 100) en agua
USP 39 Pruebas Qumicas/ (551) Valoracin de Vitamina E 397

Fase mvil: Metanol y Solucin A (19: 1)

Solucin de aptitud del sistema: Preparar una solucin de 0,65 mg/ml de ER Ergocalciferol USP en metano!. Transferir
1,0 ml de esta solucin a un matraz volumtrico de 100 ml que contenga 100 mg de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP.
Disolver en 30 ml de metano!, con ayuda de ultrasonido, si fuera necesario, y diluir con metanol a volumen. Almacenar
esta solucin en un refrigerador.
Solucin estndar: 2 mg/ml de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP o ER Succinato cido de Alfa
Tocoferilo USP en metanol
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, tpica-
mente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en anlisis, pero que no exceda de 7,5 g del polvo, a un tubo de
centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfxido y
aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador
en un bao de agua mantenido a 60. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle
de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipe-
ta a un matraz volumtrico. [NOTA-Capacidad del matraz volumtrico: no menos de 20 mL.] Agregar 3 ml de n-hexano
por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y trans-
ferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adicionales
de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 ml de esta
solucin a un recipiente adecuado y evaporar al vaco a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo con
ayuda de metano! a un matraz volumtrico adecuado y diluir con metano! a volumen hasta obtener una concentracin de
2 mg/ml de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo.
Solucin muestra para Cpsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cpsulas a un recipiente adecuado, mezclar
y pesar. Transferir una porcin de la mezcla, tpicamente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en anlisis, pero
que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.
[NOTA-Para Cpsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cpsulas cortan-
do las cubiertas de las Cpsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y trituran-
do hasta formar una masa homognea. Transferir una porcin de la masa, tpicamente equivalente a 20 mg de la forma de
vitamina E en anlisis, pero que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubri-
miento interno de tefln.] Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfxido por cada g del contenido de las Cpsulas y
aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g del contenido de las Cpsulas, y agitar durante 45 minutos en un agita-
dor en un bao de agua mantenido a 60. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se
mezcle de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con
una pipeta a un matraz volumtrico. [NOTA-Capacidad del matraz volumtrico: no menos de 20 ml.] Agregar 3 ml de n-
hexano por cada g del contenido de las Cpsulas a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos
y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adi-
cionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 ml
de esta solucin a un recipiente adecuado y evaporar al vaco a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo
con ayuda de metanol a un matraz volumtrico adecuado y diluir con metanol a volumen hasta obtener una concentracin
de 2 mg/ml de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 8 mm x 1O cm; relleno L1 de 5 m
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyeccin: 100 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo son aproximadamente 0,5 y 1,0, res-
pectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 12 entre ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo, Solucin de aptitud del sistema
Factor de asimetra: 0,8-1,2, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%, Solucin estndar
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato cido de alfa tocofe-
rilo en la porcin de la muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin estndar
398 (551) Valoracin de Vitamina E / Pruebas Qumicas USP 39

C5 =concentracin de la forma de vitamina E pertinente del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solu-
cin estndar (mg/mL)
Cu =concentracin nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solucin muestra (mg/mL)
PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento se puede usar para las formulaciones que contienen vitaminas A, D y E. La aplicacin incluye:
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con cido sulfrico metanlico, seguido de una extraccin
con 2,2,4-trimetilpentano.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar,
las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Mezclar 240 mL de metanol con 1O mL de agua, seguido de 0,5 mL de cido fosfrico al 50%, y diluir con
acetonitrilo hasta 1000 ml.
Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de cido sulfrico a 80 mL de metanol en un
matraz volumtrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metanol a volumen.
Solucin de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volum-
trico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de cido sulfrico y diluir con agua a volumen.
Solucin de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin de aptitud del sistema: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP y de ER Succi-
nato cido de Alfa Tocoferilo USP en metanol
Solucin estndar: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP, o ER Succinato cido de Alfa
Tocoferilo USP en metanol
Solucin muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D y
vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porcin del
polvo, nominalmente equivalente a una cantidad de 90 mg de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido
de alfa tocoferilo. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solucin de Jecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpenta-
no, y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y
dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisin de gases y luego agitar durante
12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspen-
sin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico metan/ico 3 N, mezclar en un mezclador de
vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para rom-
per la emulsin y hasta que el sobrenadante se torne transparente. Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpenta-
no sobrenadante a un matraz volumtrico adecuado; el volumen de la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano
y la capacidad del matraz volumtrico son tales que la concentracin final de la Solucin muestra es equivalente a la de la
Solucin estndar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios mL de metanol y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano rema-
nente. Diluir con metano! a volumen.
Solucin muestra para Cpsulas: [NOTA-Esta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de
la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Usan-
do una cuchilla afilada, si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir
el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cpsulas va-
cas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una co-
rriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del
contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 55 mg de vitamina E, a un
recipiente con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solu-
cin de /ecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de
ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya
cesado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en
un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulf-
rico metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar
12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 1O
minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsin y hasta que el sobrenadante se torne transparente.
Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpentano sobrenadante a un matraz volumtrico adecuado, el volumen de
USP 39 Pruebas Qumicas/ (551) Valoracin de Vitamina E 399

la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano y el tamao del matraz volumtrico son tales que la concentracin
final de la Solucin muestra es equivalente a la de la Solucin estndar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios ml de
metano! y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano remanente. Diluir con metano! a volumen.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 m
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Volumen de inyeccin: 25 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para succinato cido de alfa tocoferilo, alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo son
aproximadamente 0,6; 0,8 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 4,0 entre succinato cido de alfa tocoferilo y alfa tocoferol; no menos de 3,0 entre alfa toco-
ferol y acetato de alfa tocoferilo, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%, Solucin estndar
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocofe-
rilo en la porcin de la muestra tomada:

Resultado= Crulr5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin estndar
C5 = concentracin de la forma de vitamina E pertinente del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solu-
cin estndar (mg/ml)
Cu =concentracin nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solucin muestra (mg/ml)
[NOTA-Para calcular la concentracin nominal, tomar en cuenta el volumen de extraccin inicial de 26,5 ml de 2,2,4-trimetil-
pentano y el factor de dilucin al cambiar el disolvente de 2,2,4-trimetilpentano a metano!.]
PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de vitamina E en:
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Solucin Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Solucin Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Este procedimiento emplea la saponificacin de la muestra, seguida de una extraccin lquido-lquido de vitamina E a
partir de la muestra con n-hexano. Evaporar el extracto de hexano hasta sequedad y reconstituir el residuo en una
mezcla de acetonitrilo y acetato de etilo (1: 1).
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, las Soluciones muestra y las solucio-
nes reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Metano!, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Acetonitrilo y acetato de etilo (1: 1)
Solucin de hidrxido de potasio: [NOTA-Usada en la muestra para Solucin Oral.] Transferir 90 g de pellets de hidrxi-
do de potasio a un matraz volumtrico de 100 ml que contenga 60 ml de agua. Mezclar hasta disolver, enfriar y diluir con
agua a volumen.
Solucin estndar: 0,3 mg/ml de ER Alfa Tocoferol USP en Diluyente
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, equiva-
lente a 8 mg de alfa tocoferol, a un matraz de 125 ml equipado con una junta de vidrio esmerilado. Agregar 25,0 ml de
agua, 25,0 ml de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidrxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un bao de
agua mantenido a 55. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mnimo de agua a un embudo de separacin de 125
ml. Enjuagar el matraz con 50 ml de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosa-
mente durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separacin
de 250 ml y repetir la extraccin con 50 ml de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano.
400 (551) Valoracin de Vitamina E/ Pruebas Qumicas USP 39

Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar
3 gotas de cido actico glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces ms. Filtrar la capa de hexano lavada a tra-
vs de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con
unos pocos mL de n-hexano, y agregar el enjuague a la solucin de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un bao de
agua mantenido a 50 y evaporar la solucin de hexano con ayuda de un evaporador rotatorio hasta sequedad. Inmediata-
mente, agregar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotacin suave hasta disolver el residuo.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido
adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubier-
tas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesa-
da tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equi-
valente a una cantidad de 8,0 mg de alfa tocoferol, a un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio. Agregar 25,0 mL de agua,
25,0 mL de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidrxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un bao de agua
mantenido a 55. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mnimo de agua a un embudo de separacin de 125 mL.
Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente
durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separacin de 250
mL y repetir la extraccin con 50 mL de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los
extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de
cido actico glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces ms. Filtrar la capa de hexano lavada a travs de sulfato
de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos mL
de n-hexano, y agregar el enjuague a la solucin de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un bao de agua manteni-
do a 50 y evaporar la solucin de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio. Inmediatamente, agre-
gar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotacin suave hasta disolver el residuo.
Solucin muestra para Solucin Oral: Transferir una cantidad de Solucin Oral, equivalente a 1,5 mg de alfa tocoferol, a
un matraz Erlenmeyer de 125 mL equipado con una junta de vidrio esmerilado y agregar 25,0 mL de alcohol deshidratado.
Conectar un condensador de reflujo y someter a reflujo en un bao de agua en ebullicin durante 1 minuto. Agregar con
cuidado 3 mL de Solucin de hidrxido de potasio a travs del condensador y continuar sometiendo a reflujo durante 30
minutos. Retirar el matraz del bao y enjuagar el condensador con aproximadamente 15 mL de agua. Enfriar y transferir
con un volumen mnimo de agua a un embudo de separacin de 250 ml. Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y
agregar los enjuagues al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 1 minuto y dejar que las capas se
separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separacin de 250 mL y repetir la extraccin con 50 mL de n-
hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua,
dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de cido actico glacial y repetir el procedimien-
to de lavado dos veces ms. Filtrar la capa de hexano lavada a travs de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo
redondo de 250 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con n-hexano, y agregar el enjuague a la solucin de hexano
en el matraz. Evaporar la solucin de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un bao de
agua mantenido a aproximadamente 50. Inmediatamente, agregar 5,0 ml de Diluyente y agitar por rotacin suave hasta
disolver el residuo.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 291 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: 3 mL/min
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 0,5%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina E, como alfa tocoferol, en la porcin de la muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Alfa Tocoferol USP en la Solucin estndar (mg/mL)
Cu = concentracin nominal de vitamina E, como alfa tocoferol, en la Solucin muestra (mg/mL)
[NOTA-Calcular el alfa tocoferol equivalente a acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo, multiplicando sus
contenidos por los factores 0,91 0,81, respectivamente.]
USP 39 Pruebas Qumicas/ (551) Valoracin de Vitamina E 401

PROCEDIMIENTO 4
Este procedimiento de cromatografa de gases se usa para la determinacin de vitamina E como ingrediente farma-
cutico activo, como ingrediente de suplemento diettico o como componente de formas farmacuticas farmacopei-
cas. Puede usarse para:
Vitamina E
Cpsulas de Vitamina E
Preparacin de Vitamina E
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra y las solu-
ciones reactivo se preparan y se usan apropiadamente segn se indica a continuacin.
Solucin de estndar interno: 1O mg/mL de escualano en ciclohexano
Solucin de aptitud del sistema: O, 1 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP y de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP en ciclohe-
xano
Solucin estndar 1: 1O mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP en Solucin de estndar interno
Solucin estndar 2: 1O mg/mL de ER Acetato de Alfa To~oferilo USP en Solucin de estndar interno
Solucin estndar 3: Transferir 30,0 mg de ER Succinato Acido de Alfa Tocoferilo USP a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 mL
de metano!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a ultra-
sonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo has-
ta sequedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 mL de Solucin de estndar interno
y mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Soluciones muestra para Ingredientes Activos Farmacuticos
Solucin muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): 1O mg/mL de Vitamina E (d- o di-alfa
tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) en Solucin de estndar interno
Solucin muestra 2 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo): Transferir 30,0 mg de Vitamina E (succinato
cido de d- o di-alfa tocoferilo) a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 mL de metano!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y 0, 1 mL
de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1
hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de
una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 mL de Solucin de estndar interno y mezclar en un mezclador de vrtice hasta
disolver.
Soluciones muestra para Preparaciones de Vitamina E
Solucin muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma lquida): Disolver una porcin
de Preparacin en Solucin de estndar interno para preparar una solucin de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato
de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentracin nominal de 1O mg/ml.
Solucin muestra 2 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo en forma lquida): Transferir una porcin de Pre-
paracin, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato cido de d- o di-alfa tocoferilo), a un vial de 20 ml. Agregar 2,0
mL de metano!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a
ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar
justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 mL de Solucin de es-
tndar interno y mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Solucin muestra 3 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma slida): Transferir una porcin
de Preparacin, equivalente a 50 mg de alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo, a un matraz adecuado para reflujo.
Agregar 5 mL de agua y calentar en un bao de agua a 60 durante 1O minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter a
reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de ter. Agitar vigo-
rosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos
porciones de 25 mL de ter, combinando los extractos con la capa etrea original. Lavar los extractos combinados con
una porcin de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etreas a travs de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de
una corriente de nitrgeno, evaporar la solucin etrea en un bao de agua controlado a una temperatura que no cause
que la solucin etrea se derrame por ebullicin. Retirar el recipiente del bao de agua cuando queden 5 mL y completar
la evaporacin sin aplicar calor. Disolver el residuo en Solucin de estndar interno para preparar una solucin de Vitamina
E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentracin nominal de 1O mg/ml.
Solucin muestra 4 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo en forma slida): Transferir una porcin de Pre-
paracin, equivalente a 30 mg de Vitamina E (succinato cido de d- o di-alfa tocoferilo), a un matraz adecuado para reflu-
jo. Agregar 5 mL de agua y calentar en un bao de agua a 60 durante 1O minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter
a reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de ter. Agitar
vigorosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos
porciones de 25 mL de ter, combinando los extractos con la capa etrea original. Lavar los extractos combinados con
una porcin de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etreas a travs de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de
una corriente de nitrgeno, evaporar la solucin etrea en un bao de agua controlado a una temperatura que no cause
que la solucin etrea se derrame por ebullicin. Retirar el recipiente del bao de agua cuando queden 5 ml. Transferir
cuantitativamente el remanente a un vial de 20 mL y completar la evaporacin sin aplicar calor. Agregar 2,0 mL de meta-
no!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a ultrasonido.
Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta se-
402 (551) Valoracin de Vitamina E / Pruebas Qumicas USP 39

quedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 ml de Solucin de estndar interno y
mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Soluciones muestra para Cpsulas de Vitamina E
Solucin muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 1 O Cpsulas en un
frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin per-
der material de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cpsulas a un vaso de precipitados de 100 ml.
Retirar cualquier sustancia adherida a las Cpsulas vacas lavando con varias porciones pequeas de n-hexano. Desechar
los lavados y dejar que las Cpsulas vacas se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a n-
hexano. Pesar las Cpsulas vacas en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cpsula.
Disolver una porcin del contenido combinado de las Cpsulas en Solucin de estndar interno para preparar una solucin
de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentracin nominal de 1 O mg/ml.
Solucin muestra 2 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 1O Cpsulas en un frasco de
pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder mate-
rial de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cpsulas a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cual-
quier sustancia adherida a las Cpsulas vacas lavando con varias porciones pequeas de n-hexano. Desechar los lavados y
dejar que las Cpsulas vacas se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a n-hexano. Pesar las
Cpsulas vacas en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cpsula. Transferir una por-
cin del contenido combinado de las Cpsulas, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato cido de d- o di-alfa toco-
ferilo), a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 ml de metano!, 1,0 ml de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 ml de cido clorhdrico al
vial. Tapar hermticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar
de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno.
Agregar 3,0 ml de Solucin de estndar interno y mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 >, Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografa de Gases
Detector: Ionizacin a la llama
Columna: Capilar de slice fundida, de 0,25 mm x 30 m; ligada con una pelcula de fase G2 de 0,25 m
Temperaturas
Columna: 280
Inyector: 290
Detector: 290
Gas transportador: Helio
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Relacin de particin: 100:1
Volumen de inyeccin: 1 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar apropiada
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 3,5 entre alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para los cocientes entre las respuestas de los picos de la forma de vita-
mina E pertinente y el estndar interno en inyecciones repetidas, Solucin estndar apropriada
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra apropiadas
Calcular el porcentaje de vitamina E en trminos de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa toco-
ferilo en la porcin de la muestra tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x 100
Ru =cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estndar interno de la Solucin
muestra apropiada
R5 = cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estndar interno de la Solucin es-
tndar apropiada
C5 =concentracin del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin estndar apropiada (mg/ml)
Cu =concentracin nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solucin muestra apropiada (mg/ml)
PROCEDIMIENTO 5
Este procedimiento de cromatografa de gases se usa para la determinacin de Vitamina E (como d- o di-alfa tocofe-
rol) en:
Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol (Succinato de vitamina E y polietilenglicol es una mezcla que se forma
mediante la esterificacin de succinato cido de d-alfa tocoferilo y polietilenglicol).
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra y las solu-
ciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Disolvente: 0,25 ml de fenolftalena SR en 1 L de alcohol
USP 39 Pruebas Qumicas/ (551) Valoracin de Vitamina E 403

Solucin de estndar interno: 12 mg/ml de araquidato de etilo en isooctano

Solucin estndar: Transferir 32,5 mg de ER Alfa Tocoferol USP a un matraz de reaccin adecuado. Agregar 2 ml de piri-
dina y 0,5 ml de N,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%, y calentar el matraz a 100 durante
1O minutos. Enfriar el matraz, agregar 5,0 ml de Solucin de estndar interno seguido de 20 ml de isooctano y agitar.
Solucin muestra: Transferir una cantidad equivalente a O, 100-0, 160 g de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol fun-
dido a 60 a un tubo de cultivo (de aproximadamente 20 cm de longitud y 2,5 cm de dimetro) equipado con un tapn
de rosca. Agregar 40-50 mg de cido ascrbico y unas pocas perlas de ebullicin, seguido de 20 ml de Disolvente.
[NOTA-Someter la solucin a reflujo suavemente sin que se produzca emisin del contenido. Colocar el tubo en un bloque
de calentamiento ajustado a 100-150.] Cuando la muestra se disuelva por completo, agregar 0,25 g de hidrxido de
potasio y continuar sometiendo a reflujo durante 30 minutos. Retirar el tubo del calor y, mientras el contenido est calien-
te, agregar 1-2 ml de cido clorhdrico, gota a gota, hasta que la coloracin rosada desaparezca. [PRECAUCIN-Reaccin
exotrmica. Dejar que el cido se deslice poco a poco dentro del tubo para evitar salpicaduras.] Enfriar el tubo, luego lavar
las paredes del tubo con 20 ml de agua. Agregar 5,0 ml de Solucin de estndar interno, tapar y agitar para asegurar un
mezclado minucioso. Dejar el tubo en reposo hasta que se formen dos capas diferenciadas. Transferir 2,5-3,5 ml de la
capa superior a un matraz de reaccin adecuado y agregar 2,0 ml de piridina seguida de 2,5 ml de N,0-bis(trimetilsilil)tri-
fluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%. Calentar el matraz a 100 durante 1O minutos. Enfriar y luego agregar 12
ml de isooctano.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografa de Gases
Detector: Ionizacin a la llama
Columna: Capilar de slice fundida, de 0,25 mm x 15 m; ligada con una pelcula de fase G27 de 0,25 m
Temperaturas
Inyector: 280
Detector: 345
Columna: Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Tiempo de Espera
(Hold Time)
a la
Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura
Inicial Temperatura Fin al Final
() (/mln) () (mln)
260 20 340 1

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Relacin de particin: 200:1
Volumen de inyeccin: 1 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Factor de asimetra: No ms de 2,0 para el pico de alfa tocoferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el cociente entre las respuestas de los picos de alfa tocoferol y el
estndar interno en inyecciones repetidas
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de vitamina E como d-alfa tocoferol en la porcin de la muestra tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (W5/Wu) x 100

Ru = cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estndar interno de la Solucin muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estndar interno de la Solucin estndar
W5 = peso de ER Alfa Tocoferol USP usado para preparar la Solucin estndar (mg)
Wu = peso de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol tomado para preparar la Solucin muestra (mg)

REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Alfa Tocoferol USP
ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP
ER Succinato cido de Alfa Tocoferilo USP
ER Ergocalciferol USP
404 (561) Artculos de Origen Botnico/ Pruebas Qumicas USP 39

(561) ARTCULOS DE ORIGEN BOTNICO

MUESTREO
Con el fin de reducir el efecto de la desviacin sistemtica de muestreo en los resultados cualitativos y cuantitativos, es nece-
sario asegurar que la composicin de la muestra usada sea representativa de la partida de material que est siendo examinada.
Los procedimientos de muestreo siguientes son el mnimo que se considera aplicable a artculos de origen vegetal. Algunos
artculos o algunas pruebas pueden requerir procedimientos ms rigurosos que involucren el muestreo de ms envases o de
ms muestras por envase.

Muestra Bruta

Cuando el examen externo de envases, marcas y etiquetas indica que la partida se puede considerar homognea, tomar
muestras individuales del nmero de envases seleccionados de forma aleatoria que se indica a continuacin. Cuando la partida
no se puede considerar homognea, dividirla en subpartidas que sean tan homogneas como sea posible y, a continuacin,
muestrear cada una como una partida homognea. Cuando el nmero de envases en la partida (N) es 11 o ms y cada envase
de la partida est marcado en orden con un nmero o una letra, se recomienda incluir muestras de los envases primero, inter-
medio y ltimo.
N de Envases N de Envases
en la Partida (N) que Deben Ser Muestreados (n)
1-1 o Todos
11-19 11
>19 n = 1 O + (N/1 O)

(Redondear "n" al siguiente nmero entero ms alto.)

Las muestras se toman de las secciones superior, media e inferior de cada envase. Si el material sin procesar est formado
por partes componentes que tienen 1 cm o menos en cualquier dimensin, y en el caso de todos los materiales molidos o en
polvo, retirar la muestra por medio de un dispositivo de muestreo que quite un centro de la parte superior a la inferior del
envase, tomando no menos de dos centros desde ngulos diferentes. Para materiales con partes componentes de ms de 1 cm
en cualquier dimensin, retirar las muestras manualmente. En el caso de fardos o paquetes grandes, las muestras se deben
tomar a una profundidad de 1O cm porque el contenido de humedad de la capa superficial puede ser diferente del de las
capas interiores.
Preparar la muestra bruta combinando y mezclando las muestras individuales tomadas de cada envase abierto, teniendo cui-
dado de no aumentar el grado de fragmentacin ni de afectar significativamente el contenido de humedad.
Para artculos en envases que contienen menos de 1 kg, mezclar el contenido y retirar una cantidad suficiente para las prue-
bas. Para artculos en envases que contienen entre 1 y 5 kg, retirar porciones iguales de la parte superior, media e inferior del
envase, de modo que cada una de las muestras sea suficiente para realizar las pruebas. Mezclar meticulosamente las muestras
y retirar una cantidad suficiente para realizar las pruebas. Para envases que contienen ms de 5 kg, retirar tres muestras, de
modo que cada una pese no menos de 250 g, de la parte superior, media e inferior del envase. Mezclar minuciosamente las
muestras y retirar una porcin suficiente para realizar las pruebas.

Muestra de Laboratorio

Preparar la Muestra de Laboratorio por cuarteo repetido de la muestra bruta.

NOTA-La reduccin de muestra por cuarteo consiste en la distribucin pareja de la muestra, adecuadamente mezclada, en
la forma de un cuadrado, y la posterior divisin por las diagonales en cuatro partes iguales. Luego se toman las dos partes
opuestas y se mezclan cuidadosamente. El proceso se repite segn sea necesario hasta obtener la cantidad requerida.
La Muestra de Laboratorio debe ser de un tamao suficiente como para realizar todas las pruebas necesarias.

Muestra de Prueba

A menos que se indique algo diferente en la monografa individual o en el procedimiento de prueba siguiente, preparar la
Muestra de Prueba segn se indica a continuacin.
Reducir por cuarteo el tamao de la Muestra de Laboratorio, teniendo cuidado de que cada una de las porciones retiradas
contine siendo representativa. En el caso de artculos sin moler o que no se presentan en polvo, moler la muestra tomada de
modo que pase a travs de un tamiz de malla estndar N 20 y mezclar bien el polvo resultante. Si el material no se puede
moler, reducirlo a un estado tan fino como sea posible, mezclarlo hacindolo rodar sobre un papel o pao de muestreo, exten-
derlo hasta formar una capa delgada y retirar la porcin para analizar.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (561) Artculos de Origen Botnico 405

MTODOS DE ANLISIS

Materia Orgnica Extraa

MUESTRA DE PRUEBA

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, pesar las cantidades siguientes de la Muestra de Labo-
ratorio, teniendo cuidado de que la porcin tomada sea representativa (reducir la muestra por cuarteo si fuera necesario).
Races, rizomas, corteza y hierbas 500 g
Hojas, flores, semillas y frutos 250 g
Cortar los frmacos vegetales (el peso promedio de las piezas es menos de 0,5 g) 50 g

Extender la muestra hasta formar una capa delgada y separar a mano la materia orgnica extraa tanto como sea posible.
Pesar y determinar el porcentaje de materia orgnica extraa en el peso del artculo tomado.

Cenizas Totales

Pesar con exactitud, en un crisol tarado, una cantidad de la Muestra de Prueba, que represente 2-4 g del material secado al
aire e incinerar, suavemente al principio, y aumentar gradualmente la temperatura a 675 25, hasta que no quede carbn y
determinar el peso de la ceniza. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbn, extraer la masa carbonizada con agua
caliente, recoger el residuo insoluble en un papel de filtro exento de ceniza, incinerar el residuo y el papel de filtro hasta que la
ceniza quede blanca o casi blanca, luego agregar el filtrado, evaporar hasta sequedad y calentar todo a una temperatura de
675 25. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbn, enfriar el crisol, agregar 15 ml de alcohol, deshacer la
ceniza con una varilla de vidrio, quemar el alcohol y volver a calentar todo a una temperatura de 675 25. Enfriar en un dese-
cador, pesar la ceniza y calcular el porcentaje de ceniza total con referencia al peso del artculo tomado.

Cenizas Insolubles en cido

Calentar a ebullicin la ceniza obtenida segn se indica anteriormente en Cenizas Totales con 25 ml de cido clorhdrico 3 N
durante 5 minutos, recoger la materia insoluble en un crisol de filtrado tarado o un filtro exento de ceniza, lavar con agua
caliente, incinerar y pesar. Determinar el porcentaje de ceniza insoluble en cido calculada con referencia al peso del artculo
tomado.

Cenizas Solubles en Agua

Calentar a ebullicin la ceniza obtenida segn se indica en Cenizas Totales con 25 ml de agua durante 5 minutos. Recoger la
materia insoluble en un crisol de vidrio sinterizado o sobre un papel de filtro exento de ceniza. Lavar con agua caliente e inci-
nerar durante 15 minutos a una temperatura que no exceda de 450. Restar el peso de este residuo, en mg, obtenido en
Cenizas Totales, y calcular el porcentaje de ceniza soluble en agua con referencia al peso de la muestra segn se determin en
Cenizas Totales.

Extractos Solubles en Alcohol

MTODO 1 (MTODO DE EXTRACCIN EN CALIENTE)

Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer
con tapn de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol y pesar el matraz. Agitar y dejar en reposo durante 1 hora. Acoplar un con-
densador de reflujo al matraz y calentar a ebullicin suave durante 1 hora, enfriar y pesar. Volver a ajustar al peso original con
alcohol. Agitar y filtrar rpidamente a travs de un filtro seco. Transferir 25 ml del filtrado a una cpsula tarada de fondo plano
y evaporar en un bao de agua hasta sequedad. Secar a 105 durante 6 horas, enfriar en un desecador durante 30 minutos y
pesar sin demora. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extrable en alcohol en la muestra de prueba.

MTODO 2 (MTODO DE EXTRACCIN EN FRO))

Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer
con tapn de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol, tapar el matraz y macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente duran-
te las primeras 8 horas y, a continuacin, dejar en reposo. Filtrar rpidamente, procurando no perder alcohol. Evaporar 25 ml
del filtrado hasta sequedad en una cpsula tarada, poco profunda y de fondo plano, y secar a 105 hasta peso constante. Cal-
cular el contenido, en mg/g, de materia extrable en alcohol en la muestra de prueba.
406 (561) Artculos de Origen Botnico/ Pruebas Qumicas USP 39

Extractos Solubles en Agua

MTODO 1 (MTODO DE EXTRACCIN EN CALIENTE)

Proceder segn se indica en el Mtodo 7 (Mtodo de Extraccin en Caliente) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se
debe usar agua en lugar de alcohol.

MTODO 2 (MTODO DE EXTRACCIN EN FRO)

Proceder segn se indica en el Mtodo 2 (mtodo de extraccin en fro) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe
usar agua en lugar de alcohol.

Fibra Cruda

Agotar una cantidad pesada de la Muestra de Prueba, que represente aproximadamente 2 g del artculo, con ter. Agregar
200 mL de cido sulfrico diluido en ebullicin (1 en 78) al residuo agotado con ter, en un matraz de 500 mL, y conectar el
matraz a un condensador de reflujo. Calentar a reflujo la mezcla durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, luego pa-
sar a travs de un filtro de tela o papel endurecido y lavar el residuo en el filtro con agua hirviendo hasta que el lavado efluente
ya no sea cido. Volver a colocar el residuo en el matraz enjuagando con 200 mL de solucin de hidrxido de sodio en ebulli-
cin, ajustada a 1,25% por valoracin volumtrica y sin carbonato de sodio. Someter a reflujo nuevamente la mezcla durante
30 minutos, cronometrados con exactitud, y luego, pasar rpidamente a travs de un filtro tarado, lavar el residuo con agua
hirviendo hasta que el ltimo lavado sea neutro y secar a 11 O hasta peso constante. Incinerar el residuo seco hasta peso cons-
tante, enfriar en un desecador y pesar la ceniza: la diferencia entre el peso obtenido mediante el secado a 11 O y el de la ceni-
za representa el peso de fibra cruda.
NOTA-La ebullicin con cido y lcali debe continuar durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, desde el momen-
to en que el lquido (que se enfra por debajo del punto de ebullicin al agregarlo al matraz fro) vuelve a alcanzar su punto de
ebullicin. Despus de llevar la solucin al punto de ebullicin, se debe disminuir el calor lo suficiente como para mantener la
ebullicin. Durante la ebullicin, el matraz se debe rotar suavemente a intervalos regulares para reincorporar a la solucin toda
partcula que pueda adherirse a las paredes del matraz. Una corriente de aire suave introducida en el matraz durante la opera-
cin de ebullicin ayuda a evitar la formacin excesiva de espuma.

Contenido de Almidn

MTODO 1

El siguiente es un procedimiento general para todos los azcares reductores y se puede utilizar para determinar el contenido
de almidn en artculos botnicos.
Extracto de Malta: Usar malta de cebada nueva, limpia y de eficacia conocida y moler inmediatamente antes de usar.
Preparar el extracto de malta inmediatamente antes de usar. Por cada 80 mL de extracto de malta que se necesiten, digerir 5 g
de malta molida con 100 mL de agua a temperatura ambiente durante 2 horas. [NOTA-Si se usa un mezclador elctrico, mez-
clar durante 20 minutos.] Filtrar para obtener un extracto transparente, volver a filtrar, si fuera necesario, y mezclar bien la
infusin.
Solucin de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de la muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 1O
mL de ter, usando un filtro que retenga completamente el grnulo de almidn ms pequeo. Dejar evaporar el ter del resi-
duo y lavar con 250 mL de solucin de alcohol acuosa (1 O en 100). Lavar cuidadosamente el residuo del papel y verterlo en un
vaso de precipitados de 500 mL con aproximadamente 100 mL de agua. Calentar aproximadamente a 60 (evitando, si es
posible, gelatinizar el almidn) y dejar en reposo durante aproximadamente 1 hora, mezclando frecuentemente para lograr
una disolucin completa de los azcares. Transferir a un frasco de boca ancha, enjuagar el vaso de precipitados con un poco
de agua tibia y enfriar. Agregar un volumen equivalente de alcohol, mezclar y dejar en reposo durante no menos de 1 hora.
Centrifugar hasta que el precipitado quede bien compacto en el fondo del frasco y decantar el sobrenadante. Lavar el preci-
pitado con porciones sucesivas de 50 mL de solucin de alcohol (50 en 100) centrifugando y decantando a travs de un filtro
adecuado hasta que los lavados estn exentos de azcar. [NOTA-Para comprobar la presencia de azcar, transferir unas gotas
de los lavados a un tubo de ensayo y agregar 3 4 gotas de una solucin de 1-naftol en alcohol al 20%, preparada por disolu-
cin de 200 mg de 1-naftol en 1 mL de alcohol y 2 mL de agua. Agitar bien el tubo de ensayo para que la mezcla quede
uniforme, dejar fluir entre 2-4 mL de cido sulfrico por las paredes del tubo de ensayo y sostener el tubo de ensayo en posi-
cin vertical. Si hay presencia de azcar, la interfase de los dos lquidos pasa de color violeta claro a violeta oscuro, y al agitar
toda la solucin se torna violeta azulado.]
Transferir el residuo del frasco y del filtro endurecido a un vaso de precipitados con aproximadamente 50 mL de agua. Su-
mergir el vaso de precipitados en agua hirviendo y mezclar constantemente durante 15 minutos o hasta que se gelatinice todo
el almidn. Enfriar el vaso de precipitados a 55, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a esta temperatura durante 1
USP 39 Pruebas Qumicas/ (561) Artculos de Origen Botnico 407

hora. Volver a calentar a ebullicin durante algunos minutos, enfriar a 55, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a
esta temperatura durante 1 hora o hasta que el residuo, cuando se trata con yodo SR, no muestre un matiz azulado en el exa-
men microscpico. Enfriar, diluir con agua hasta 250 mL y filtrar.
Procedimiento general: Transferir 200 mL de la Solucin de prueba a un matraz equipado con un condensador de reflujo,
agregar 20 mL de cido clorhdrico y calentar en un bao de agua hirviendo durante 2 1/2 horas. Enfriar, llevar a pH casi neutro
con hidrxido de sodio SR, completar la neutralizacin con carbonato de sodio SR, diluir con agua hasta 500 mL, mezclar y
filtrar. El volumen de la alcuota tomada depende del contenido de almidn de la muestra en anlisis (ver la Tabla 1). La alcuo-
ta debera contener entre 100 y 200 mg de dextrosa. Transferir 50 mL del filtrado a un vaso de precipitados de vidrio de 400
mL resistente a los lcalis, agregar 50 mL de tartrato cprico alcalino SR, cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj y
calentar. Ajustar la llama del quemador para que el contenido del matraz comience a hervir en 4 minutos y continuar la ebulli-
cin durante 2 minutos exactos. Filtrar la solucin caliente de inmediato a travs de un filtro de vidrio sinterizado. Lavar minu-
ciosamente el precipitado de xido cuproso con agua aproximadamente a 60, luego con 1O mL de alcohol y finalmente con
1O mL de ter.
Tabla 1. Determinacin de la Alcuota ptima
Contenido de Almidn Esperado Alcuota
(%) (mL}
60 25
50 35
40 50
30 50
20 50

Para soluciones de azcares reductores de relativamente alta pureza, proceder segn se indica en el Mtodo 1A para determi-
nar la cantidad de cobre reducido obtenido pesando el xido cuproso seco. Para soluciones de azcares reductores que contie-
nen grandes cantidades de impurezas orgnicas, incluida sacarosa, proceder segn se indica en el Mtodo 1B para determinar
la cantidad de cobre reducido obtenido por valoracin volumtrica con tiosulfato de sodio.
Mtodo 1A-Secar el precipitado obtenido en el Procedimiento General en un horno durante 30 minutos a 11 O 2, enfriar a
temperatura ambiente en un desecador y pesar. Consultar la Tabla 2 para obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspon-
diente al peso del xido cuproso hallado. Determinar el porcentaje de dextrosa y, luego, el contenido de almidn por la si-
guiente frmula:
Porcentaje de dextrosa = (peso de dextrosa en mg x O, 1 x 500)/(peso de la muestra en g x alcuota en mL)
Contenido de almidn=% de dextrosa x 0,9

Tabla 2. Clculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu 2 0) (Expresado en mg)

xido Dextro- xido Dextro- xido xido xido Dextro- xido Dextro-
Cu pro- sa Cu pro- sa Cu pro- Dextrosa Cu pro- Dextrosa Cu pro- sa Cu pro- sa
so (D-Glu- so (D-Glu- so (o-Gluco- so (D-Gluco- so (o-Glu- so (D-Glu-
(Cu 2 0) cosa) (Cu 2 0) cosa) (Cu 2 0) sa) (Cu 2 0) sa) (Cu 2 0) cosa) (Cu 2 0) cosa)
10 4,0 90 38,9 170 75,l 250 112,8 330 152,2 410 193,7
12 4,9 92 39,8 172 76,0 252 113,7 332 153,2 412 194,7
14 5,7 94 40,6 174 76,9 254 114,7 334 154,2 414 195,8
16 6,6 96 41,5 176 77,8 256 115,7 336 155,2 416 196,8
18 7,5 98 42,4 178 78,8 258 116,6 338 156,3 418 197,9

20 8,3 100 43,3 180 79,7 260 117,6 340 157,3 420 199,0
22 9,2 102 44,2 182 80,6 262 118,6 342 158,3 422 200,1
24 10,0 104 45,1 184 81,5 264 119,5 344 159,3 424 201,l
26 10,9 106 46,0 186 82,5 266 120,5 346 160,3 426 202,2
28 11,8 108 46,9 188 83,4 268 121,5 348 161,4 428 203,3

30 12,6 110 47,8 190 84,3 270 122,5 350 162,4 430 204,4
32 13,5 112 48,7 192 85,3 272 123,4 352 163,4 432 205,5
34 14,3 114 49,6 194 86,2 274 124,4 354 164,4 434 206,5
36 15,2 116 50,5 196 87,1 276 125,4 356 165,4 436 207,6
38 16,1 118 51,4 198 88,1 278 126,4 358 166,5 438 208,7

40 16,9 120 52,3 200 89,0 280 127,3 360 167,5 440 209,8
408 (561) Artculos de Origen Botnico/ Pruebas Qumicas USP 39

,,.
Tabla 2 Clculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu O) (Expresado en mg) (Continuacin)
xido Dextro- xido Dextro- xido xido xido Dextro- xido Dextro-
Cu pro- sa Cu pro- sa Cu pro- Dextrosa Cu pro- Dextrosa Cu pro- sa Cu pro- sa
so (o-Glu- so (o-Glu- so (o-Gluco- so (o-Gluco- so (o-Glu- so (o-Glu-
(Cu 2 0) cosa) (Cu 2 0) cosa) (Cu,O) sa) (Cu,O) sa) (Cu,O) cosa) (Cu 7 0) cosa)
42 17,8 122 53,2 202 89,9 282 128,3 362 168,5 442 210,9
44 18,7 124 54,1 204 90,9 284 129,3 364 169,6 444 212,0
46 19,6 126 55,0 206 91,8 286 130,3 366 170,6 446 213,1
48 20,4 128 55,9 208 92,8 288 131,3 368 171,6 448 214,1

50 21,3 130 56,8 210 93,7 290 132,3 370 172,7 450 215,2
52 22,2 132 57,7 212 94,6 292 133,2 372 173,7 452 216,3
54 23,0 134 58,6 214 95,6 294 134,2 374 174,7 454 217,4
56 23,9 136 59,5 216 96,5 296 135,2 376 175,8 456 218,5
58 24,8 138 60,4 218 97,5 298 136,2 378 176,8 458 219,6

60 25,6 140 61,3 220 98,4 300 137,2 380 177,9 460 220,7
62 26,5 142 62,2 222 99,4 302 138,2 382 178,9 462 221,8
64 27,4 144 63,1 224 100,3 304 139,2 384 180,0 464 222,9
66 28,3 146 64,0 226 101,3 306 140,2 386 181,0 466 224,0
68 29,2 148 65,0 228 102,2 308 141,2 388 182,0 468 225,1

70 30,0 150 65,9 230 103,2 310 142,2 390 183,1 470 226,2
72 30,9 152 66,8 232 104,1 312 143,2 392 184,1 472 227,4
74 31,8 154 67,7 234 105,1 314 144,2 394 185,2 474 228,3
76 32,7 156 68,6 236 106,0 316 145,2 396 186,2 476 229,6
78 33,6 158 69,5 238 107,0 318 146,2 398 187,3 478 230,7

80 34,4 160 70,4 240 108,0 320 147,2 400 188,4 480 231,8
82 35,3 162 71,4 242 108,9 322 148,2 402 189,4 482 232,9
84 36,2 164 72,3 244 109,9 324 149,2 404 190,5 484 234,1
86 37, 1 166 73,2 246 110,8 326 150,2 406 191,5 486 235,2
88 38,0 168 74,1 248 111,8 328 151,2 408 192,6 488 236,3

Mtodo 78
SOLUCIN DE TIOSULFATO DE sorno: Transferir 3,9 g de tiosulfato de sodio, pesados con exactitud, a un matraz volumtrico
de 100 ml, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar.
SOLUCIN DE YODURO DE POTASIO: Disolver 42 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua.
SOLUCIN DE ACETATO DE SODIO: Disolver 5,74 g de acetato de sodio en 1O ml de agua.
SOLUCIN DE COBRE: Transferir aproximadamente 0,3 g de cobre electroltico puro, pesados con exactitud, a un matraz de
250 ml, agregar 5 ml de cido ntrico para disolver el cobre, agregar aproximadamente 25 ml de agua y calentar a ebullicin
para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 ml de bromo SR y calentar a ebullicin hasta eliminar completamen-
te el bromo. Enfriar, agregar 1O ml de Solucin de acetato de sodio seguidos de 1O ml de Solucin de yoduro de potasio y valo-
rar con la Solucin de tiosulfato de sodio hasta obtener un color amarillo claro. Agregar suficiente almidn SR para producir un
marcado color azul y continuar con la valoracin. A medida que se aproxima el punto final, agregar 2 g de tiocianato de pota-
sio y mezclar hasta disolver completamente. Continuar la valoracin hasta que el precipitado quede totalmente blanco. Un ml
de Solucin de tiosulfato de sodio equivale aproximadamente a 1 O mg de cobre. [NOTA-Es esencial que la concentracin de la
Solucin de yoduro de potasio se regule cuidadosamente. Si la solucin contiene menos de 320 mg de cobre al finalizar la volu-
metra, agregar 4,2-5 g de yoduro de potasio para obtener una solucin total de 100 ml. Si hay presentes cantidades mayores
de cobre, agregar lentamente Solucin de yoduro de potasio desde una bureta con agitacin constante en cantidades propor-
cionalmente mayores.]
PROCEDIMIENTO: Lavar con agua el precipitado de xido cuproso obtenido en el Procedimiento general, cubrir este filtro con
un vidrio de reloj y disolver el xido cuproso con 5 ml de cido ntrico vertidos con una pipeta por debajo del vidrio de reloj.
Recoger el filtrado en un matraz de 250 ml, lavar el vidrio de reloj y el filtro con agua. Recoger todos los lavados en el matraz.
Calentar a ebullicin el contenido del matraz para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 ml de bromo SR y ca-
lentar a ebullicin hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar y proceder segn se indica en Solucin de cobre comenzan-
do donde dice "agregar 1O ml de Solucin de acetato de sodio". A partir del volumen de Solucin de tiosulfato de sodio consu-
mido, obtener el peso de cobre, en mg, multiplicndolo por 1, 1259 para obtener el peso, en mg, de xido cuproso. Basndo-
USP 39 Pruebas Qumicas/ (561) Artculos de Origen Botnico 409

se en la Tabla 2, obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso de xido cuproso. El contenido de almidn
equivale al peso, en mg, de dextrosa obtenida multiplicado por 0,9. Realizar una determinacin con un blanco usando 50 ml
de tartrato cprico alcalino SR y 50 ml de Extracto de malta. Si el peso del xido cuproso as obtenido excede 0,5 mg, corregir
el resultado de la determinacin de forma adecuada. [NOTA-El tartrato cprico alcalino SR se deteriora en reposo y la canti-
dad de xido cuproso obtenida en la determinacin con un blanco aumenta.]

MTODO 2

El mtodo siguiente es especfico para la dextrosa (glucosa) y, dado que es extremadamente sensible, puede explicar las di-
ferencias detectadas entre valores obtenidos a partir de una misma muestra. Las determinaciones duplicadas no varan en ms
de 2%.
Solucin de glucoamilasa: Preparar una solucin de glucoamilasa en agua que contenga 30 Unidades Internacionales
(Ul)/ml. Usar glucoamilasa obtenida preferentemente de Rhizopus delemar. El total de actividad de glucoamilasa en la muestra
de prueba utilizada debe ser no menos de 150 UI.
Solucin amortiguadora de acetato: Disolver 16,4 g de acetato de sodio en 100 ml de agua, agregar 12,0 ml de cido
actico glacial y mezclar. El pH de esta solucin es 4,8.
Solucin amortiguadora de fosfato: Disolver 3,63 g de tris (hidroximetil) aminometano y 5,0 g de fosfato monobsico
de sodio en 50,0 ml de agua. Ajustar con cido fosfrico a un pH de 7,0 a una temperatura de 37, diluir con agua hasta
100,0 ml y mezclar. [NOTA-El pH del medio de la solucin amortiguadora es sensible a la temperatura y se debe ajustar al pH
deseado a la temperatura que se utilizar durante la incubacin.]
Solucin enzimtica: Disolver 30 mg de glucosa oxidasa (Tipo 11 de Aspergillus niger), 3 mg de peroxidasa (Tipo 1 de rba-
no picante) y 1 O mg de ferrocianuro de potasio en 100 ml de Solucin amortiguadora de fosfato. [NOTA-Esta mezcla se puede
almacenar en un refrigerador durante un perodo de hasta 1 O das.]
cido sulfrico 18 N: Agregar lentamente, mezclando, 54 ml de cido sulfrico a 102 ml de agua, dejar que se enfre a
25 y mezclar.
Soluciones estndar: Disolver una cantidad pesada con exactitud de ER Dextrosa USP en agua para obtener una solucin
que contenga 1,0 mg de ER Dextrosa USP por ml. Diluir cuantitativamente un volumen conocido de esta solucin en agua
para obtener las Soluciones Estndares A, B, C, D y E, con concentraciones conocidas de 1 O, 20, 25, 40 y 50 g/ml de ER Dex-
trosa USP, respectivamente. [NOTA-Esperar 4 horas para que termine la mutarrotacin antes de usar.]
Soluciones de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 25
ml de alcohol al 80% y filtrar. Eliminar todo el alcohol del residuo mediante secado en un horno de aire a 105 durante apro-
ximadamente 8 horas. [NOTA 1-Cualquier traza de alcohol que quede en el residuo inhibir la glucoamilasa.] Enfriar y transfe-
rir el matraz que contiene la muestra de prueba seca a un desecador. Transferir aproximadamente 1 g de la muestra de prue-
ba, pesado con exactitud, a un matraz previamente tarado, agregar 25 ml de agua y ajustar con cido fosfrico a un pH entre
5,0-7,0; si fuera necesario. Calentar a ebullicin la suspensin durante aproximadamente 3 minutos, transferir el matraz a un
autoclave y calentar a 135 durante 2 horas. Retirar el matraz del autoclave, mantener la temperatura prxima a 55 y agregar
2,5 ml de Solucin amortiguadora de acetato y agua suficiente para ajustar el peso total de la solucin a 45 1 g. Sumergir el
matraz en un bao de agua mantenido a 55 1 y agregar 5 ml de Solucin de glucoamilasa. Agitar el matraz por rotacin
suave y de forma continua durante 2 horas para lograr la hidrlisis, pasar a travs de un papel de filtro a un matraz volumtri-
co de 250 ml, lavar cuantitativamente con agua y recoger todos los lavados en el matraz. Diluir el contenido del matraz con
agua a volumen y mezclar. Transferir 1 ml de una alcuota que contenga entre 20-60 g de o-glucosa a cada uno de cinco
tubos de ensayo. [NOTA 2-Para obtener el intervalo de concentracin de glucosa en el hidrolizado, diluir cuantitativamente
con agua a volumen, si fuera necesario.] Agregar 2 ml de Solucin Enzimtica a cada uno de los cinco tubos de ensayo y colo-
carlos en la oscuridad a 37 1 durante exactamente 30 minutos para que se forme el color. Una vez transcurridos los 30 mi-
nutos, agregar 2 ml de cido sulfrico 78 Na cada uno de los tubos de ensayo para detener la reaccin y mezclar.
Solucin control: Transferir una cantidad pesada con exactitud de aproximadamente 0,4 g de almidn a un matraz tara-
do previamente y proceder segn se indica en Soluciones de prueba, comenzando donde dice "agregar 25 ml de agua y ajus-
tar el pH con cido fosfrico".
Procedimiento: Determinar concomitantemente las absorbancias de las Soluciones estndar y las Soluciones de prueba a la
longitud de onda de absorbancia mxima aproximadamente a 540 nm, con un espectrofotmetro apropiado, utilizando la
Solucin control como blanco para ajustar el instrumento. Graficar los valores de absorbancia de las Soluciones estndar en fun-
cin de la concentracin, en g/ml, de dextrosa, y trazar la lnea recta que mejor se ajuste a los cinco puntos graficados. A
partir de la grfica as obtenida, determinar la concentracin, C, en g/ml, de dextrosa en cada una de las Soluciones de Prueba
y calcular la concentracin promedio, en g/ml, de la solucin en anlisis. El porcentaje del contenido de almidn en el peso
de la muestra de prueba tomada se calcula por la frmula:
(0,9C/l 0 6 )(V7)(250/Va)(l 00/E)(l 00/W) = 2,25CV7/VaEW

en donde E es el peso, en g, de la muestra de prueba tomada; Va es el volumen, en ml, de la alcuota tomada del matraz
volumtrico de 250 ml; W es el porcentaje de peso en seco de la muestra de prueba; y V7 es el volumen, en ml, si se realiza
una dilucin adicional (ver Nota 2 en Soluciones de prueba). [NOTA-Va es 1,0 cuando no se realiza ninguna dilucin adicional.]
410 (561) Artculos de Origen Botnico/ Pruebas Qumicas USP 39

Determinacin de Aceite Voltil

Colocar un matraz de 1 L de fondo redondo y cuello corto en un manto de calentamiento sobre un mezclador magntico.
Introducir en el matraz una barra de agitacin magntica de forma ovoide y acoplar un condensador de camisa fra por agua y
una trampa para aceite voltil apropiada del tipo que se ilustra (ver la Figura 7).

Graduado: Graduado -
0,1 mL - 0,1 ml

Para aceites ms Para aceites ms

livianos que el agua pesados que el agua

Figura 1. Trampas para Aceite Voltil

Triturar en granos gruesos una cantidad suficiente del artculo para producir entre 1 y 3 mL de aceite voltil. Normalmente
no es necesario triturar semillas, frutos pequeos u hojas quebradas de hierbas. Se deben evitar los polvos muy finos. Si esto no
fuera posible, puede que sea necesario mezclarlos con serrn purificado o arena purificada. Colocar una cantidad adecuada del
artculo, pesada con exactitud, en un matraz y llenarlo con agua hasta la mitad. Acoplar el condensador y el separador adecua-
do. Calentar a ebullicin el contenido del matraz, con una cantidad adecuada de calor para mantener una ebullicin suave
durante 2 horas, o hasta que el aceite voltil se haya separado completamente del artculo y ya no se recoja en el tubo gradua-
do del separador.
Si se ha obtenido una cantidad adecuada de aceite voltil en el tubo graduado del separador, se puede leer en dcimos de 1
mL, y se puede calcular el volumen de aceite voltil por cada 100 g del artculo usando el peso del artculo tomado para el
anlisis. Las graduaciones en el separador "para aceites ms pesados que el agua" se colocan de manera que el aceite perma-
nezca por debajo del condensado acuoso que fluye automticamente de regreso al matraz.

Contenido de Agua

Para artculos sin moler o que no se presentan en polvo, preparar aproximadamente 1Og de la Muestra de Laboratorio cor-
tando, granulando o desmenuzando de modo que las partes tengan aproximadamente 3 mm de grosor. Las semillas o los
frutos ms pequeos de 3 mm deben partirse. Evitar el uso de molinos de alta velocidad para preparar la muestra. Procurar
que no se pierda una cantidad apreciable de humedad durante la preparacin y que la porcin tomada sea representativa de
la Muestra de Laboratorio. Determinar el contenido de agua segn se indica en Procedimiento para Artculos de Origen Botnico
en Determinacin de Agua (921 ), Mtodo 111 (Gravimtrico).

PRUEBA DE AFLATOXINAS

PRECAUCIN-Las aflatoxinas son muy peligrosas, por lo que se debe tener sumo cuidado cuando se manipulan materiales que
contienen aflatoxinas.
Cuando la monografa individual requiere el cumplimiento con los lmites de aflatoxinas, los lmites son no ms de 5 ng/g
para aflatoxina B1 (AFB 1 ) y no ms de 20 ng/g para la suma de aflatoxinas B1 (AFB 1 ), B2 (AFB 2), G1 (AFG 1 ) y G2 (AFG 2 ). Se puede
usar un enfoque basado en el riesgo de contaminacin para determinar el alcance de la prueba. Al determinar el cumplimien-
to, se considera la presencia inesperada de aflatoxinas. Se proporcionan los siguientes procedimientos analticos para determi-
nar el cumplimiento. A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, usar el Mtodo l. Si la aptitud del
sistema no cumple con los requisitos, usar el Mtodo 11 o el Mtodo 111.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (561) Artculos de Origen Botnico 411

Mtodo 1

La prueba de TLC se suministra para detectar la posible presencia de AFB 1, AFB 2, AFG, y AFG 2 en cualquier material de origen
vegetal.

REACTIVO DE ACETATO DE CINC-CLORURO DE ALUMINIO

Disolver 20 g de acetato de cinc y 5 g de cloruro de aluminio en agua suficiente para obtener 100 ml.

SOLUCIN DE CLORURO DE SODIO

Disolver 5 g de cloruro de sodio en 50 mL de agua.

SOLUCIN DE PRUEBA 1

Moler aproximadamente 200 g de material vegetal para formar un polvo fino. Transferir aproximadamente 50 g pesados
con exactitud de material en polvo a un matraz con tapn de vidrio. Agregar 200 mL de una mezcla de metanol y agua
(17:3). Agitar mecnicamente en forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. [NOTA-Si la solucin contiene
pigmentos vegetales que interfieren, proceder segn se indica para la Solucin de Prueba 2.] Desechar los primeros 50 mL del
filtrado y recoger la porcin siguiente de 40 ml. Transferir el filtrado a un embudo de separacin. Agregar 40 mL de Solucin
de Cloruro de Sodio y 25 mL de ter de petrleo y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa
acuosa inferior a un segundo embudo de separacin. Extraer dos veces la capa acuosa en el embudo de separacin, cada vez
con 25 mL de cloruro de metileno, agitando durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa org-
nica inferior y recoger las capas orgnicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Evaporar el disolvente orgnico en
un bao de agua. Transferir el extracto remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un bao de
agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias con el residuo, proceder segn se indica para Procedimiento de limpieza en
Solucin de Prueba 2; de lo contrario, disolver el residuo obtenido anteriormente en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y
acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecnicamente si fuera necesario.

SOLUCIN DE PRUEBA 2

Recoger 100 mL de filtrado del inicio del flujo y transferir a un vaso de precipitados de 250 ml. Agregar 20 mL de Reactivo
de Acetato de Cinc-Cloruro de Aluminio y 80 mL de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Agregar 5 g de un coad-
yuvante de filtracin adecuado, como por ejemplo tierra de diatomeas, mezclar y filtrar. Desechar los primeros 50 mL del filtra-
do y recoger la porcin siguiente de 80 ml. Proceder segn se indica para la Solucin de Prueba 7, comenzando donde dice
"Transferir el filtrado a un embudo de separacin".
Procedimiento de limpieza: Colocar un disco de vidrio sinterizado de porosidad media o un tapn de lana de vidrio en el
fondo de un tubo cromatogrfico de 1 O mm x 300 mm. Preparar una suspensin espesa de 2 g de gel de slice con una mezc-
la de ter etlico y ter de petrleo (3:1 ), verter la suspensin espesa en la columna y lavar con 5 mL de la misma mezcla de
disolventes. Dejar que el absorbente sedimente y agregar a la parte superior de la columna una capa de 1,5 g de sulfato de
sodio anhidro. Disolver el residuo obtenido anteriormente en 3 mL de cloruro de metileno y transferir a la columna. Enjuagar
el matraz dos veces con porciones de 1 mL de cloruro de metileno, transferir los enjuagues a la columna y eluir a una veloci-
dad de no ms de 1 mL/min. Agregar sucesivamente a la columna 3 mL de ter de petrleo, 3 mL de ter etlico y 3 mL de
cloruro de metileno, eluir a una velocidad de no ms de 3 mL/min y desechar los eluatos. Agregar a la columna 6 mL de una
mezcla de cloruro de metileno y acetona (9:1) y eluir a una velocidad de no ms de 1 mL/min, preferentemente sin la ayuda
de vaco. Recoger este eluato en un vial pequeo, agregar una perla de ebullicin si fuera necesario y evaporar hasta sequedad
en un bao de agua. Disolver el residuo en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecnicamen-
te si fuera necesario.

SOLUCIN DE PRUEBA 3

Si existen interferencias con el residuo, proceder segn se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC en Solucin de Prueba
en Mtodo 11.

SOLUCIN DE AFLATOXINAS

PRECAUCIN-Las aflatoxinas son muy txicas. Manipular con cuidado.

Diluir el ER Aflatoxinas USP 1 :5 con acetonitrilo para obtener una solucin con una concentracin de 0,4 g/mL de AFB 1 y
de AFG 1, y O, 1 g/mL de AFB 2 y de AFG 2
412 (561) Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

PROCEDIMIENTO

Aplicar por separado 2,5; 5; 7,5 y 1O L de la Solucin de Af/atoxinas y tres aplicaciones de 1O L de la Solucin de Prueba 1,
Solucin de Prueba 2, o Solucin de Prueba 3 a una placa adecuada para cromatografa en capa delgada (ver Cromatografa
(621)) recubierta con una capa de mezcla de gel de slice para cromatografa de 0,25 mm. Superponer 5 L de la Solucin de
Aflatoxinas a una de las tres aplicaciones de 1O L de la Solucin de Prueba. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el
cromatograma en una cmara no saturada que contenga una fase mvil constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y
alcohol isoproplico (85:10:5) hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido no menos de 15 cm desde el origen. Retirar la
placa de la cmara de desarrollo, marcar el frente de la fase mvil y dejar que la placa se seque al aire. Localizar las manchas en
la placa bajo luz UV a 365 nm.

APTITUD DEL SISTEMA

Las cuatro aplicaciones de la Solucin de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas clara-
mente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba que concide en tono y ubicacin con aqullas de la
Solucin de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba con la Solucin de Aflatoxinas superpuesta no es de
menor intensidad que la de la Solucin de Aflatoxinas correspondiente.

CRITERIOS DE ACEPTACIN

Ninguna mancha de las aplicaciones de la Solucin de Prueba corresponde a las manchas obtenidas con las aplicaciones de la
Solucin de Aflatoxinas. Si se obtiene alguna mancha de aflatoxinas en la Solucin de Prueba, comparar la ubicacin de cada
mancha fluorescente de la Solucin de Prueba con las de la Solucin de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxina presente.
La intensidad de la mancha de aflatoxina, si estuviera presente en la Solucin de Prueba, cuando se compara con la de la aflato-
xina correspondiente en la Solucin de Aflatoxinas representa la concentracin aproximada de aflatoxina en la Solucin de Prue-
ba. Cuando la monografa individual requiere el cumplimiento con los lmites de aflatoxinas, los lmites son no ms de 5 ng/g
para AFB 1 y no ms de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2, a menos que se especifique algo diferente.

Mtodo 11

SOLUCIN DE CLORURO DE SODIO

Ver el Mtodo l.

SOLUCIN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

Preparar una solucin amortiguadora de fosfato 1 O mM que contenga cloruro de sodio O, 1 38 M y cloruro de potasio 0,0027
M en agua, y ajustar con hidrxido de sodio 2 M a un pH de 7,4. 1

COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD (IAC, POR SUS SIGLAS EN INGLS)

Antes de acondicionar, ajustar la IAC a temperatura ambiente. Para acondicionar, aplicar 1O mL de Solucin Salina Amorti-
guada con Fosfato sobre la columna y dejar que fluya a travs de la columna por gravedad a una velocidad de 2-3 mL/min.
Dejar 0,5 mL de la Solucin Salina Amortiguada con Fosfato sobre la parte superior de la columna hasta que se aplique la Solu-
cin de Prueba.

SOLUCIN DE PRUEBA

Extraccin de la muestra: Transferir aproximadamente 5 g de una muestra representativa en polvo, pesada con exacti-
tud, a un matraz con tapn de vidrio. Agregar 20 mL de una mezcla de metanol y agua (17:3). Agitar mecnicamente en
forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. Desechar los primeros 5 mL del filtrado y recoger la porcin siguien-
te de 4 ml. Transferir el filtrado a un embudo de separacin. Agregar 4 mL de Solucin de Cloruro de Sodio y 2,5 mL de hexano
y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separa-
cin. Extraer la capa acuosa en el embudo de separacin dos veces, cada vez con 2,5 mL de cloruro de metileno, agitando
durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgnica inferior, y recoger las capas orgnicas
combinadas en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Evaporar el disolvente orgnico en un bao de agua. Transferir el extracto
remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un bao de agua. Enfriar el residuo. Si existen inter-

1 Se puede obtener una mezcla de polvo adecuada en Sigma como PBS P-381 3.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (561) Artculos de Origen Botnico 413

ferencias en el residuo, proceder segn se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC. De otra manera, disolver el residuo ob-
tenido anteriormente en 200 L de acetonitrilo y agitar mecnicamente, si fuera necesario.
Procedimiento de limpieza con IAC: Disolver el residuo en 5 mL de una mezcla de metanol y agua (60:40) y luego diluir
con 5 mL de agua. Aplicar este extracto sobre una IAC acondicionada. Enjuagar la IAC dos veces con 1O mL de Solucin Salina
Amortiguada con Fosfato y eluir lentamente con 2 mL de metanol. Evaporar el eluato con nitrgeno y disolver el residuo en 200
L de acetonitrilo.

SOLUCIN DE AFLATOXINAS

PRECAUCIN-Las aflatoxinas son muy txicas. Manipular con cuidado.

Diluir cuantitativamente el ER Aflatoxinas USP 1 :50 con acetonitrilo para obtener una solucin que contenga 0,04 g/mL de
AFB 1 y de AFG 1, y 0,01 g/mL de AFB 2 y de AFG 2

ANLISIS

Aplicar por separado 5; 7,5 y 1O L de Solucin de Af/atoxinas y tres aplicaciones de 1O L de la Solucin de Prueba a un placa
para HPTLC adecuada (ver Cromatografa (621)) recubierta con una capa de mezcla de gel de slice para cromatografa de 200
m. Superponer 5 L de Solucin de Aflatoxinas sobre una de las tres aplicaciones de 1O L de la Solucin de Prueba. Dejar que
las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en una cmara saturada que contenga una fase mvil constituida por
una mezcla de cloroformo, acetona y agua (140:20:0,3) hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido no menos de 72
mm desde el origen (80 mm del borde inferior de la placa). Retirar la placa de la cmara de desarrollo, marcar el frente de la
fase mvil y dejar que la placa se seque al aire durante 5 minutos. Localizar las manchas en la placa mediante el barrido de la
densidad de fluorescencia (> 400 nm) bajo luz UV a 366 nm. Comparar la ubicacin de cada mancha fluorescente de la Solu-
cin de Prueba con las de la Solucin de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxinas presente. La concentracin de aflatoxi-
nas en la Solucin de Prueba se puede calcular a partir de la curva de calibracin obtenida de los datos de barrido con Solucin
de Aflatoxinas.

APTITUD DEL SISTEMA

Las cuatro aplicaciones de Solucin de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas claramente.
Observar cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba que coincida en tono y ubicacin con las de Solucin de Aflatoxi-
nas. Cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba con la Solucin de Aflatoxinas superpuesta no es de menor intensidad
que la de la Solucin de Aflatoxinas correspondiente. La recuperacin media de la cantidad agregada conocida de AFB 1 y AFG 1
es no menos de 70%.

CRITERIOS DE ACEPTACIN

Cuando la monografa individual requiere el cumplimiento con los lmites de aflatoxinas, los lmites son no ms de 5 ng/g
para AFB 1 y no ms de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2, a menos que especifique algo diferente.

Mtodo 111

Se proporciona este mtodo de prueba como un ejemplo para la deteccin de la presencia posible de AFB 1 y de aflatoxinas
totales (AF: suma de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2). Se ha demostrado que este mtodo es adecuado para ginseng y jengibre en
polvo. Se debe demostrar su aptitud para otros artculos de origen botnico.

SOLUCIN AMORTIGUADORA DE FOSFATO O, 1 M

Disolver 8,69 g de fosfato disdico anhidro y 4,66 g de fosfato monosdico anhidro o 5,36 g de fosfato monosdico mo-
nohidrato en 800 mL de agua, ajustar con hidrxido de sodio 2 M a un pH de 7,4, agregar 1O mL de polisorbato 20, y diluir
hasta 1 L.

SOLUCIN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

Preparar segn se indica en el Mtodo JI.

414 (561) Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

SOLUCIONES ESTNDAR DE TRABAJO DE AFLATOXINAS

Preparar seis soluciones en sendos matraces volumtricos de 1O mL segn la Tabla 3. Diluir con una mezcla de metanol y
agua (1 :1, v/v) a volumen. Almacenar en un refrigerador y equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar las
soluciones en el da de su uso.
Tabla 3. Preparacin de Soluciones Estndar de Trabajo de Aflatoxlnas
Concentracin Final de Aflatoxinas
de la Solucin Estndar de Trabajo de Aflatoxlnas
Soluciones Estndar de Trabajo de ER Aflatoxinas USP (ng/mL)
Aflatoxlnas (L) AFB 1 AFB, AFG 1 AFG 2 LAF
1 o o o o o o
2 12,5 0,25 0,0625 0,25 0,0625 0,625
3 25 0,5 0,125 0,5 0,125 1,25
4 50 1 0,25 1 0,25 2,5
5 100 2 0,5 2 0,5 5
6 200 4 1 4 1 10

COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD {IAC) 2

Usar una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpos monoclonales de reactividad cruzada con AFB 1, AFB 2, AFG,
y AFG 2 Las columnas de inmunoafinidad tienen una capacidad mnima de no menos de 100 ng de aflatoxinas totales y pro-
porcionan una recuperacin de no menos de 80% para AFB 1, AFB 2, AFG, y AFG 2 cuando se aplican 5 ng de AFB,, de AFB 2, de
AFG, y de AFG 2 en 1 O mL de metano! al 10% en Solucin Salina Amortiguada con Fosfato {v/v).

SOLUCIN DE PRUEBA

Extraccin: Pesar 5 g de una muestra de prueba representativa en un tubo de centrfuga de 50 ml. Agregar 1 g de cloru-
ro de sodio y 25 mL de una mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300). Mezclar en un mezclador de vrtice
hasta que las partculas de muestra y el disolvente de extraccin se mezclen bien. Agitar a 400 rpm durante 1O minutos. Cen-
trifugar durante 1 O minutos a 7000 rpm (valor g = 5323 mm/s 2) o a una velocidad que pueda producir un pellet de residuos
firme. Pipetear y transferir de inmediato 7 mL a un tubo de centrfuga de 50 mL, agregar 28 mL de Solucin Amortiguadora de
Fosfato O, 7 M, mezclar y filtrar a travs de papel de microfibra de vidrio. Recoger 25 mL del filtrado (equivalente a 1 g de la
muestra de prueba) en una probeta graduada de 25 mL y proceder inmediatamente con la cromatografa de IAC.
Limpieza de IAC: [NOTA-Para la limpieza de IAC, las columnas deben mantenerse a temperatura ambiente durante al
menos 15 minutos antes de su uso.] Retirar la tapa superior de la columna y conectarla con el reservorio de solvente. Retirar la
tapa inferior de la columna y acoplarla al colector de la columna (el ajuste debe ser hermtico). Dejar que el lquido pase a
travs de la columna hasta dejar aproximadamente 2-3 mm de lquido por encima del lecho de la columna. Transferir los 25
mL del filtrado, obtenido en Extraccin, al reservorio de solvente. Dejar que el filtrado fluya a travs de la columna por grave-
dad. Dejar que la columna se seque. Retirar la columna del colector para comenzar el flujo de nuevo con facilidad, agregar
aproximadamente 2 mL de Solucin Salina Amortiguada con Fosfato a la columna, volver a acoplar la columna al reservorio de
solvente, lavar la columna con 3 mL adicionales de Solucin Salina Amortiguada con Fosfato y luego con 5 mL de agua (se pue-
de agregar 5 mL de Solucin Salina Amortiguada con Fosfato directamente al reservorio de solvente de la columna si se usan
otras tcnicas para desprender las burbujas de aire en el extremo de la columna y para comenzar el flujo de nuevo con facili-
dad). Dejar que la columna se seque, luego forzar 3 mL de aire a travs de la columna con una jeringa. Eluir con 1 mL de
metanol y recoger los analitos en un matraz volumtrico de 3 mL, dejando que el eluato gotee libremente. Dejar que la colum-
na se seque. Dejar en reposo durante 1 minuto, luego eluir con 1 mL adicional de metanol, y recoger en el mismo matraz
volumtrico. Dejar que la columna se seque y forzar 1O mL de aire a travs de la columna. Diluir el eluato con agua a volumen.
Usar esta dilucin como la Solucin de Prueba y realizar el anlisis de aflatoxinas de inmediato.

SOLUCIN DE APTITUD DEL SISTEMA

Preparar una muestra adicionada, agregando 5 mL de Solucin Estndar de Trabajo de Aflatoxinas 5 a una muestra de 5 g,
repitiendo el procedimiento para la Solucin de Prueba, usando 20 mL en lugar de 25 mL de la mezcla de metanol y bicarbona-
to de sodio al 0,5% (700:300).

2 Columna de AflaOchraTest (G1017; Vicam, Watertown, MA, USA) o equivalente. Las columnas de inmunoafinidad de Aflatoxina/OTA son adecuadas.
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (561) Artculos de Origen Botnico 415

SISTEMA CROMATOGRFICO

Velocidad de flujo: 0,8 mL/minuto

Deteccin: Detector de fluorescencia; ajustar la longitud de onda de excitacin (Ex) a 362 nm y la longitud de onda de
emisin (Em) a 440 nm.
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 3 m
Fase mvil: !socrtica
Para derivatizacin post-columna con celda fotoqumica 3-Agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150)
Para derivatizacin post-columna con celda electroqumica4 -Una solucin preparada mezclando 1 L de una mezcla de agua,
metanol y acetonitrilo (600:250:150); 350 L de cido ntrico 4 M; y 120 mg de bromuro de potasio
Sistemas de derivatizacin post-columna (PCD, por sus siglas en ingls)
Celda PHRED--Celda fotoqumica para derivatizacin post-columna
Celda Kobra--Celda electroqumica, celda de bromacin para derivatizacin post-columna.

ANLISIS

Derivatizacin post-columna para aflatoxinas: Usar una celda fotoqumica o electroqumica. Inyectar 50 L de blanco
de reactivo (Solucin Estndar de Trabajo de Aflatoxinas 7), las Soluciones Estndares de Trabajo de Aflatoxinas 2-6 o la Solucin
de Prueba en la columna de HPLC. Identificar los picos de aflatoxinas en la Solucin de Prueba comparando los tiempos de re-
tencin con los de los estndares de trabajo. Las aflatoxinas eluyen en el orden AFG 2, AFG 1, AFB 2 y AFB 1 Despus de pasar a
travs de la celda fotoqumica o electroqumica, AFG 1 y AFB 1 han derivatizado para formar AFG 2 (derivado de AFG 1) y AFB 2
(derivado de AFB 1). [NOTA-Las estructuras qumicas de los derivados que resultan de bromacin electroqumica y fotlisis no
son iguales. Las estructuras de los productos de fotlisis de AFB 1 y AFG 1 no se han definido.] Los tiempos de retencin de AFG 2 ,
AFG 2., AFB 2 y AFB 2 estn entre aproximadamente 14 y 27 minutos usando la celda fotoqumica; los tiempos de retencin
usando la celda electroqumica resultan en perodos de tiempo ms breves. Los picos se deben resolver hasta la lnea base.
Construir una curva estndar para cada aflatoxina. Determinar la concentracin de cada aflatoxina en la Solucin de Prueba a
partir de la curva de calibracin.
Curvas de calibracin de aflatoxinas: Se preparan las curvas de calibracin para cada una de las aflatoxinas usando las
Soluciones Estndar de Trabajo de Aflatoxinas que contengan las cuatro aflatoxinas descritas. Estas soluciones abarcan el interva-
lo de 0,25-4 ng/mL para AFB 1 y AFG 1, y el intervalo de 0,0625-1 ng/mL para AFB 2 y AFG 2 Construir las curvas de calibracin
antes de su anlisis segn la Tabla 3 y verificar la linealidad de la grfica. Si el rea de respuesta de la porcin de prueba se
encuentra fuera (ms alto) del intervalo de la calibracin, entonces la Solucin de Prueba debe diluirse con una mezcla de meta-
no! y agua (1 :1; v/v) y volver a inyectarse en la columna de HPLC.
Cuantificacin de Aflatoxinas: Se realiza la cuantificacin de aflatoxinas midiendo las reas de los picos a cada tiempo de
retencin de aflatoxina y comparndolos con la curva de calibracin correspondiente.

APTITUD DEL SISTEMA

La recuperacin media de la cantidad agregada conocida de AFB 1 (2 g/kg) y de aflatoxinas totales (5 g/kg) es no menos
de 68% y 70%, respectivamente. La desviacin estndar relativa (RSD, por sus siglas en ingls) es no ms de 10% para AFB 1 y
para aflatoxinas totales.

CLCULOS

Graficar el rea del pico (respuesta, eje y) de cada estndar de toxina en funcin de la concentracin (ng/mL, eje x) y deter-
minar la pendiente (5) y la interseccin con el eje y (a). Calcular el nivel de toxina en la muestra por la siguiente frmula:

Toxina (g/kg) = {[(R - a)/ S] x V/W} x F

en donde Res el rea del pico de la Solucin de Prueba; V es el volumen final de la Solucin de Prueba inyectada (mL); y Fes el
factor de dilucin. F = 1 cuando V= 3 ml. W es 1 g de la muestra de prueba pasada a travs de la columna de inmunoafini-
dad. Las aflatoxinas totales son la suma de AFG 2 , AFG 1, AFB 2 y AFB 1

CRITERIOS DE ACEPTACIN

Cuando la monografa individual requiera cumplimiento con los lmites para aflatoxinas, los lmites son no ms de 5 ng/g
para AFB 1 y no ms de 20 ng/g para la suma de AFB 1 , AFB 2, AFG 1 y AFG 2 , excepto cuando se indique algo diferente.

3 Celda fotoqumica para derivatizacin post-columna, tipo PHRED'" Reactor Fotoqumico (AURA Industries, New York, NY, USA) o equivalente. Procurar no mirar
directamente la lmpara UV.
4 Celda electroqumica para derivatizacin post-columna, tipo Kobra'" (R-Biopharm lnc., Marshall, MI, USA) o equivalente. Ajustado a 100 mA. No prender la co-
rriente hasta que el bombeo de HPLC funcione para evitar el sobrecalentamiento de la membrana celular.
416 (561) Artculos de Origen Botnico/ Pruebas Qumicas USP 39

ANLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS

Definicin

Siempre que se emplee en esta Farmacopea, la denominacin de plaguicida se aplica a cualquier sustancia o mezcla de sus-
tancias destinadas a evitar, destruir o controlar plagas, especies de plantas no deseadas, hongos, o animales que provocan da-
os durante la produccin, el procesamiento, el almacenamiento, el transporte o la comercializacin de artculos puros, o que
interfieren de algn otro modo con estos procesos. La denominacin incluye sustancias elaboradas para ser usadas como regu-
ladores de crecimiento, defoliantes o desecantes, y cualquier sustancia que se aplica a los cultivos antes o despus de la cose-
cha para proteger el producto del deterioro durante el almacenamiento y el transporte.

Lmites

Dentro de los Estados Unidos, muchos productos botnicos se tratan como suplementos dietticos y por eso estn sujetos a
las disposiciones reglamentarias que rigen sobre los alimentos pero no rigen sobre los medicamentos en la Ley Federal sobre
Alimentos, Medicamentos y Productos Cosmticos (Federal Food, Drug and Cosmetic Act). Los lmites de plaguicidas en ali-
mentos estn determinados por la Agencia de Proteccin Ambiental del los Estados Unidos (EPA - Environmental Protection
Agency) segn se indica en el Reglamento sobre Alimentos y Medicamentos [Code of Federal Regulations (40 CFR Part 180)) o
el Diario Oficial (FR - Federal Register). Adems, la Administracin de Alimentos y Medicamentos (FDA - Food and Drug Admi-
nistration) establece niveles de accin para residuos inevitables de plaguicidas (21 CFR Part 109 y 21 CFR Part 509). Para pla-
guicidas qumicos sin niveles de tolerancia establecidos por la EPA o niveles de accin de la FDA, los residuos deben estar por
debajo del lmite de deteccin del mtodo especificado. Los resultados con valores menores a los lmites de deteccin de la
EPA se consideran cero. Por lo tanto, los lmites aqu detallados no son vlidos en los Estados Unidos cuando los artculos de
origen botnico estn etiquetados para fines alimentarios. Sin embargo, los lmites se pueden aplicar en otros pases. A menos
que se especifique algo diferente en la monografa individual, el artculo a examinar debe cumplir con los lmites provistos en
la Tabla 4. Los lmites de plaguicidas, de los que se sospecha su presencia, que no se indican en la Tabla 4 deben cumplir las
reglamentaciones de la EPA. En casos en donde un plaguicida no se indica en la Tabla 4 ni en las reglamentaciones de la EPA,
calcular el lmite por la frmula:
Lmite (mg/kg) = AM/l 008
en donde A es la ingesta diaria admisible (IDA), publicada por FAO-OMS, en mg/kg de peso corporal; Mes el peso corporal,
en kg (60 kg); y 8 es la dosis diaria del artculo, en kg.
Si el artculo est destinado para la preparacin de extractos, tinturas o otras formas farmacuticas de la cual el mtodo de
preparacin modifica el contenido de plaguicidas en el producto final, calcular los lmites por la frmula:
Lmite (mg/kg) = AME/l 008

donde E es el factor de extraccin de pesticida en el mtodo de preparacin, determinado experimentalmente como la rela-
cin entre el contenido original de plaguicida en el material botnico y el contenido final de plaguicida en la preparacin; 8 es
la dosis diaria de la preparacin en kg; y A y M se definen anteriormente.
Puede concederse una exencin total o parcial de la prueba cuando se conoce toda la historia (naturaleza y cantidad de los
plaguicidas usados, la fecha de cada tratamiento durante el cultivo y despus de cosechar) del tratamiento de la partida y se
puede verificar precisamente de acuerdo con las buenas prcticas agrcolas y de recoleccin (GACP, por sus siglas en ingls).
Tabla4
Lmite
Sustancia (mg/kg)
Acefato 0,1
Alaciar 0,05
Aldrina y dieldrina (suma de) 0,05
Azi nfos-etl ico 0,1
Azinfos-metlico 1
Bromuro inorgnico (calculado como in bromuro) 125
Bromofos-etlico 0,05
Bromofos-metlico 0,05
Bromopropilato 3
Clordano (suma de cis-, trans- y oxiclordano) 0,05
Clorfenvinfos 0,5
Clorpirifos-etlico 0,2
Clorpirifos-metlico 0,1
USP 39 Pruebas Qumicas/ (561) Artculos de Origen Botnico 41 7

Tabla 4 (Continuacin)
Lmite
Sustancia (mg/kg)
Clortal-dimetlico 0,01
Ciflutrina (suma de) o, 1
?c-Cihalotrina 1
Cipermetrina e ismeros (suma de) 1
DDT (suma de o,p'-DDE, p,p'-DDE, o,p'-DDT, p,p'-DDT, o,p'-TDE y p,p'-TDE) 1
Deltametrina 0,5
Diazinn 0,5
Diclofluanida 0,1
Diclorvos 1
Dicotal 0,5
Dimetoato y ometoato (suma de) 0,1
Ditiocarbamatos (expresado como CS2) 2
Endosulfn (suma de ismeros y sulfato de endosulfano) 3
Endrina 0,05
Etin 2
Etrimtas 0,05
Fenclorotas (suma de fenclorotas y fenclorotas-oxn) o, 1
Fenitrotin 0,5
Fenpropatrina 0,03
Fensultatin (suma de fensultatin, fensultatin-oxn, fensultatin-oxn-sultana y fensultatin sultana) 0,05
Fentin (suma de fentin, fentin-oxn, fentin-oxn-sultana, fentin-oxn-sulfxido, fentin sultana y
fentin-sulfxido) 0,05
Fenvalerato 1,5
Flucitrinato 0,05
T-Fluvalinato 0,05
Fo notas 0,05
Heptaclor (suma de heptaclor, cis-heptaclorepxido y tmns-heptaclorepxido) 0,05
Hexaclorbenceno o, 1
Hexaclorociclohexano (suma de ismeros a-, fJ -, B- y E-) 0,3
Lindano (y-hexaclorociclohexano) 0,6
Malatin y malaoxn (suma de) 1
Mecarbam 0,05
Metacritas 0,05
Metamidotas 0,05
Metidatin 0,2
Metoxiclor 0,05
Mirex 0,01
Monocrototas O, 1
Paratin-etlico y Paraoxn-etlico (suma de) 0,5
Paratin-metlico y Paraoxn-metlico (suma de) 0,2
Pendimetalina o, 1
Pentacloranisol 0,01
Permetrina e ismeros (suma de) 1
Fosa lona O, 1
Fosmeto 0,05
Butxido de piperonilo 3
Pirimitas-etlico 0,05
Pirimitas-metlico (suma de pirimitas-metlico y N-desetil-pirimitas-metlico) 4
Procimidona o, 1
Profenotas o, 1
Protiotas 0,05
418 (561) Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

Tabla 4 (Continuacin)
Lmite
Sustancia (mg/kg)
Piretro (suma de cinerina 1, cinerina 11, jasmolina 1, jasmolina 11, piretrina 1y piretrina 11) 3
Quinalfos 0,05
Quintoceno (suma de quintoceno, pentacloroanilina y metil pentaclorofenil sulfuro) 1
S-421 0,02
Tecnaceno 0,05
Tetradifona 0,3
Vinclozolina 0,4

Anlisis cualitativo y cuantitativo de residuos de plaguicidas: Emplear procedimientos analticos validados, p.ej. de
acuerdo con la versin ms actualizada de la gua de la UE sobre procedimientos analticos de control de calidad y de valida-
cin para el anlisis de residuos de plaguicidas [NOTA-La versin vigente del Documento Nm. SANC0/12571 /2013, http://
ec.europa.eu/food/plant/resources/qualcontrol_en.pdf] o los principios de validacin del mtodo de la EPA (OPPTS 860.1340)
que cumplan con los siguientes criterios. El mtodo, especialmente con respecto a los pasos de purificacin, es adecuado para
la combinacin de residuos de plaguicidas y la sustancia en anlisis, y no es susceptible a interferencias de sustancias coextra-
bles. El lmite de cuantificacin para cada combinacin de matriz de plaguicidas que se va a analizar no debe exceder el lmite
de tolerancia correspondiente: el mtodo demuestra una recuperacin de entre 70% y 120% de cada plaguicida con una re-
petibilidad de no menos de 20% de desviacin estndar relativa [NOTA-en algunos casos, se pueden aceptar recuperaciones
ms bajas conforme a lo tratado en el documento SANC0/12571 /2013]; y las concentraciones de las soluciones de prueba y
de referencia, y la calibracin del aparato son tales que se obtiene una respuesta lineal del detector analtico.

LMITES DE IMPUREZAS ELEMENTALES

Los niveles de impurezas elementales deben restringirse conforme a lo indicado en la Tabla 5 a menos que se indique de
otro modo en la monografa individual. Ciertas monografas especficas pueden proveer diferentes lmites para artculos que
por lo regular se usan en grandes cantidades.
Tabla 5. Lmites de Impurezas Elementales
Lmites
Elemento (g/g)
Arsnico (inorgnico) 2
Cadmio 0,5
Plomo 5
Mercurio (total) 1
Metilmercurio (como Hg)b 0,2
El arsnico puede medirse usando un procedimiento sin especiacin suponiendo que todo el arsnico contenido en el suplemento se encuentra en forma
inorgnica. Cuando se excede el lmite al usar un procedimiento sin especiacin, se deber demostrar el cumplimiento con el lmite para arsnico inorgnico
teniendo como fundamento un procedimiento con especiacin.
b La determinacin de metilmercurio no es necesaria cuando el contenido de mercurio total es menor que el lmite para metilmercurio.

Los artculos se analizan de acuerdo con los procedimentos establecidos en Impurezas Elementales-Procedimientos (233).
Cuando se requiera especiacin, se usan para el anlisis los procedimientos del captulo Contaminantes Elementales en Suple-
mentos Dietticos (2232).

(563) IDENTIFICACIN DE ARTCULOS DE ORIGEN BOTNICO

INTRODUCCIN
La identificacin de materias primas vegetales que se utilizan en la fabricacin de medicamentos, excipientes, o suplementos
dietticos se lleva a cabo examinando las caractersticas morfolgicas e histolgicas del artculo en anlisis y realizando pruebas
de diagnstico qumicas. Las caractersticas botnicas y qumicas obtenidas del examen del artculo de prueba se comparan
luego con las caractersticas botnicas y qumicas conocidas de la especie vegetal. Se pueden especificar artculos de referencia
para ayudar a la adecuada identificacin botnica y qumica de la planta y de las partes de la planta. Un artculo de referencia
puede ser un Material de Referencia Autenticado USP, que se puede utilizar tanto para la identificacin qumica como botni-
ca, o un Estndar de Referencia USP, que se usa slo para la identificacin qumica.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico 419

MATERIALES DE REFERENCIA AUTENTICADOS USP

Los Materiales de Referencia Autenticados USP son rganos o tejidos vegetales certificados por provenir de una planta identi-
ficada adecuadamente como perteneciente a la especie declarada en la etiqueta. La autenticacin es realizada por especialistas
en taxonoma botnica, anatoma vegetal, fitoqumica u otros cientficos especialistas en plantas contratados por la USP. Un
Material de Referencia Autenticado USP es habitualmente un rgano o tejido vegetal seco y pulverizado que se puede obtener
de la USP. Se archivan muestras de herbario de las plantas autenticadas, que pueden incluir races, tallos, hojas, flores, frutos y
semillas. Las muestras del archivo se pueden solicitar para su examen. Generalmente, una muestra de herbario estndar consis-
te en la planta adulta entera. Los Materiales de Referencia Autenticados USP se someten a las mismas pruebas de diagnstico
botnico y qumico que se aplican en el anlisis de materias primas. Un artculo de prueba debe tener todas las caractersticas
botnicas y qumicas especificadas que se encuentran en el Material de Referencia Autenticado USP. Para que sirva al propsito
al que est destinado, cada Material de Referencia Autenticado USP se debe almacenar, manipular y usar de manera apropia-
da. Por lo general, los Materiales de Referencia Autenticados USP se almacenan en sus envases originales en un ambiente fres-
co, seco y protegidos de la luz y de la infestacin de insectos. Cuando se requieren condiciones de almacenamiento especiales,
las instrucciones se indican en la etiqueta. Por lo general, los principios activos y los compuestos marcadores se degradan con
el tiempo; por lo tanto, se asignan fechas de caducidad a los Materiales de Referencia Autenticados USP para su uso en identifi-
cacin qumica. Los Materiales de Referencia Autenticados USP no estn destinados para emplearse en la fabricacin de pro-
ductos farmacuticos, excipientes ni suplementos dietticos.

IDENTIFICACIN BOTNICA

La identificacin botnica de las materias primas vegetales que se emplean en la fabricacin de productos farmacuticos,
excipientes, o suplementos dietticos consiste en determinar las caractersticas macroscpicas e histolgicas (microscpicas) de
la parte de la planta, como por ejemplo, raz, tallo, hoja, flor, fruto o semilla, que se utiliza en la fabricacin del artculo. La
identificacin puede incluir tambin la inspeccin de las caractersticas organolpticas del tejido vegetal, como la presencia o
ausencia de un olor caracterstico. Las monografas oficiales individuales pueden incluir informacin botnica de posibles espe-
cies adulterantes para asegurar su ausencia en la materia prima. Para identificar adecuadamente la planta, el rgano o el tejido
vegetal, es necesario tener un conocimiento bsico de anatoma vegetal.

Morfologa y Anatoma Vegetal Diagnstica

Esta seccin trata exclusivamente las caractersticas morfolgicas y anatmicas diagnsticas de plantas vasculares y de las
diversas partes de las plantas, tales como races, tallos, hojas, flores, frutos y semillas, a partir de las que se obtienen productos
farmacuticos, excipientes o suplementos dietticos. Las plantas vasculares comprenden las Pteridofitas (helechos y plantas re-
lacionadas con los helechos; por ejemplo, los gneros Aspidium, Equisetum y Lycopodium), las Gimnospermas (plantas de semi-
lla, en las que la semilla no est encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los gneros Ephedra, Gingko y Pinus) y las Angiosper-
mas (plantas de semilla, donde la semilla est encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los gneros Allium, Dgito/is, Panax,
Matricaria y Rauwolfia). Algunas de las caractersticas anatmicas diagnsticas que se especifican en una monografa individual
(ver Caractersticas botnicas en monografas individuales) pueden incluir, entre otras, la presencia de un tejido particular en un
rgano; la disposicin y el tipo de clulas de un tejido; la presencia y el tipo de canal secretor, la presencia de aceite, resina o
conductos laticferos dentro de un rgano; el nmero de clulas epiteliales que rodea un canal secretor; y la presencia y tipo
de sustancias ergsticas como por ejemplo almidn, inulina, glbulos de grasa, aceites esenciales, cristales de oxalato de cal-
cio, cistolitos, polifenoles, lquidos u otros materiales que se producen en el citoplasma, organelos, vacuolas, cavidades o pared
celular.

RACES

Los tejidos presentes en races jvenes, comenzando desde el tejido ms externo, comprenden una epidermis con pelos radi-
culares, corteza, endodermis, periciclo, floema, xilema y, en algunas especies, mdula. En algunas especies, la capa o capas
ms externas de la corteza son diferentes de las capas internas, en cuyo caso se denominan hipodermis. En especies que pre-
sentan crecimiento secundario de la raz, es habitual que se desprendan todos los tejidos externos al periciclo. Las races que
presentan crecimiento secundario tienen un peridermo o corteza, compuesto de sber (tejido suberoso), felgeno (cmbium
suberoso) y felodermo como el tejido ms externo. Debajo del peridermo se pueden encontrar restos de floema primario, floe-
ma secundario, cmbium vascular, xilema primario y xilema secundario. Los tejidos vasculares secundarios tienen radios medu-
lares que separan en grupos a las principales clulas conductoras del floema (elementos cribosos o clulas cribosas) y a las prin-
cipales clulas conductoras del xilema (vasos y traqueidas). La mayora de las especies de plantas que presentan crecimiento
secundario carecen de mdula en la raz. El tipo y la disposicin de las clulas conductoras principales de los tejidos vasculares
puede permitir el diagnstico de la especie. Las races de muchas especies se desarrollan como rganos de almacenamiento
alimenticio. Este tipo de races se caracteriza por la presencia de abundante parnquima y grandes cantidades de almidn u
otros polisacridos. La presencia, el tipo y la disposicin de fibras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicacin de ma-
420 (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

terial ergstico tambin pueden ser caractersticas diagnsticas. Desde el punto de vista morfolgico, las races se pueden dis-
tinguir de los rizomas (los tallos subterrneos) principalmente por la ausencia de nodos e internodos, que estn presentes en
los rizomas.

TALLOS

Varias caractersticas macroscpicas externas de los tallos que pueden permitir el diagnstico de la especie comprenden los
atributos de los nodos, internodos, cicatrices de las hojas, cicatrices de los haces vasculares, lenticelas y yemas; el patrn de
crecimiento de las yemas; la posicin y disposicin de las hojas a lo largo del tallo y la presencia de zarcillos, aguijones, pas o
espinas. Comenzando con el tejido ms externo, la disposicin interna de tejidos en los tallos jvenes de la mayora de las
especies es epidermis, corteza, un anillo concntrico de haces vasculares separados entre s por haces medulares parenquima-
tosos y mdula. Segn la especie, en la epidermis puede haber estomas o tricomas, o ambas estructuras. La corteza de algunas
especies puede incluir una hipodermis o una endodermis, o ambas. En muchas monocotiledneas, la disposicin de los haces
vasculares no es concntrica, sino que los haces estn esparcidos a travs de toda una masa de tejido parenquimatoso en la
parte interior de la epidermis. Debido a esta disposicin, no se puede distinguir la corteza, los haces medulares, ni la mdula.
En los tallos de plantas leosas que presentan crecimiento secundario, es habitual que la epidermis se desprenda y se reempla-
ce con un peridermo que consta de sber, felgeno y felodermo. Algunas especies se caracterizan por presentar mltiples peri-
dermos (ritidoma). En el peridermo puede haber lenticelas y sus atributos pueden servir como caractersticas diagnsticas. Por
debajo del peridermo estn los restos de la corteza, el floema primario, el floema secundario, el cmbium vascular, el xilema
secundario, el xilema primario y la mdula. Tambin hay haces medulares. Igual que en la raz, el tipo y la disposicin de las
clulas conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposicin de fibras, esclereidas y otros teji-
dos, y la presencia y ubicacin de material ergstico, tambin pueden ser caractersticas diagnsticas. Los rizomas pueden te-
ner algunas caractersticas morfolgicas similares a las de las races y por lo tanto se pueden confundir con races. Sin embargo,
los rizomas se pueden identificar correctamente como tallos porque tienen nodos e internodos evidentes.

HOJAS

Algunas caractersticas macroscpicas de las hojas que pueden permitir el diagnstico de la especie comprenden los atribu-
tos de las lminas foliares, el pecolo, las estpulas y la filotaxia. El tejido ms externo de la lmina foliar es la epidermis, seguida
por los tejidos mesfilo y vascular. Entre las caractersticas diagnsticas microscpicas de las clulas epidrmicas estn el grosor
y las marcas de la cutcula, la forma y disposicin de los estomas y las clulas guardianas, la disposicin y tamao de clulas
subsidiarias, el nmero de estomas (nmero de estomas por unidad de superficie) y el ndice estomtico (nmero de estomas
por nmero de unidades de clulas epidrmicas). Otras caractersticas tiles en la identificacin de material foliar consisten en
los tipos y la disposicin de los tricomas (pelos de los vegetales) presentes; el tipo y la disposicin de los tejidos mesfilo y
vascular; la relacin de mesfilo en empalizada; la presencia y el aspecto de tejidos accesorios tales como vainas de haces pa-
renquimatosos o esclerenquimatosos, mesfilo paraveinal, endodermis y tejido de transfusin; el tipo y la disposicin de las
clulas conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposicin de fibras, esclereidas y otros teji-
dos; y la presencia, la ubicacin y el aspecto fsico del material ergstico.

FLORES

Las flores son las mejores caractersticas morfolgicas diagnsticas de cualquier planta floral y la estructura floral es el criterio
principal que se usa en taxonoma vegetal. Las caractersticas diagnsticas de las flores comprenden el tipo de inflorescencia; la
presencia, el nmero y el aspecto de las partes florales principales (spalos, ptalos, estambres y carpelos); el tipo de simetra
que presentan las partes florales; la posicin relativa de los ovarios con respecto a las dems partes de la flor; el nmero de
vulos por ovario; el tipo de placentacin del ovario; el aspecto fsico de los granos de polen; la presencia de nectarios, la pre-
sencia de recubrimientos o tricomas glandulares; y caractersticas fsicas de estructuras accesorias, como el receptculo y las
brcteas. Las caractersticas histolgicas y la presencia de materiales ergsticos en los tejidos de las partes florales permiten
tambin el diagnstico de la especie.

FRUTOS

La identificacin de la especie vegetal a partir de la que se obtiene un fruto se puede determinar mediante la observacin de
varios criterios macroscpicos. Estos criterios comprenden el nmero de pistilos que tiene el fruto; el nmero de carpelos den-
tro de cada pistilo; el nmero de semillas dentro de cada carpelo, la placentacin del fruto; y si el fruto es dehiscente, indehis-
cente o carnoso. Algunas otras caractersticas diagnsticas son las referentes al nmero de suturas en un fruto dehiscente, la
determinacin de si las semillas estn unidas o no a la pared del pericarpio, las caractersticas fsicas de las tres capas del peri-
carpio de los frutos carnosos (epicarpio, mesocarpio y endocarpio) y la presencia y el aspecto fsico de tejidos accesorios como
el receptculo y las brcteas. Las caractersticas histolgicas de los tejidos del fruto pueden ayudar a la identificacin. Las carac-
tersticas de las semillas dentro del fruto tambin son caracteres distintivos que permiten diagnosticar la especie.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico 421

SEMILLAS

Las caractersticas macroscpicas de las semillas que se utilizan en la identificacin comprenden la forma y el tamao de la
semilla; el aspecto de la superficie del recubrimiento de la semilla; la posicin del hilio y del micrpilo; y la presencia de estruc-
turas accesorias del recubrimiento de la semilla, tales como los arilos, carncula, o cuerpos oleosos. Las caractersticas fsicas del
embrin, tales como su tamao, forma, posicin y el nmero y aspecto de los cotiledones, al igual que la presencia y el aspec-
to de tejidos nutritivos accesorios como los restos de un megagametofito (en Gimnospermas), perisperma (nucela) o endos-
perma, permiten tambin diagnosticar la especie. Las caractersticas histolgicas del recubrimiento de la semilla y otras estruc-
turas y tejidos de la semilla tambin se pueden utilizar para identificar la especie.

Microtcnica

El anlisis histolgico de muestras botnicas se puede realizar en material vegetal entero o pulverizado. Puede ser necesario
el empleo de tinciones citolgicas u otros reactivos para visualizar determinadas caractersticas histolgicas. Se pueden emplear
polarizadores cruzados para detectar estructuras que rotan la luz polarizada plana. Estas estructuras comprenden granos de
almidn, cristales de oxalato de calcio, algunas fibras y granos de arena (presentes como un contaminante) que se pueden
observar como objetos brillantes contra un fondo oscuro. Generalmente se coloca un polarizador en el condensador o la fuen-
te de iluminacin y el segundo polarizador se coloca en el ocular. La luz que entra al portaobjetos desde abajo es polarizada
plana, lo que permite que pasen solamente algunas ondas luminosas en un plano especfico. El campo se torna brillante cuan-
do los dos polarizadores se alinean y cuando los dos polarizadores estn cruzados, el campo se oscurece.

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES TEMPORALES Y MATERIAL PULVERIZADO

Procedimiento general: Las muestras vegetales se observan bajo el microscopio mediante el empleo de diferentes me-
dios de montaje, tinciones u otras soluciones que ayudan a la correcta identificacin del artculo de prueba. Si se dispone de
un Material de Referencia Autenticado USP, se debe preparar con los mismos medios de montaje o soluciones reactivo utiliza-
dos para el artculo de prueba. Colocar 1 2 gotas de agua, Solucin de alcohol-glicerina, Solucin de hidrato de cloral, u otra
solucin reactivo en el centro de un portaobjetos limpio (ver Preparacin y uso de soluciones reactivo, dispositivos pticos y me-
dios de montaje). Transferir una pequea seccin de tejido vegetal o una porcin de polvo de la planta al medio de montaje o
solucin reactivo y cubrirla con un cubreobjetos limpio. (Para obtener ms informacin sobre tcnicas de preparacin especfi-
cas, ver Preparacin de montajes temporales y cortes manuales, Maceracin o Preparacin de material pulverizado, segn corres-
ponda). Para evitar la formacin de burbujas de aire, el cubreobjetos se debe colocar cuidadosamente en un ngulo adecuado,
de tal manera que su borde entre primero en contacto con el portaobjetos y luego presionar hasta que cubra la muestra. Elimi-
nar el exceso de lquido del extremo del cubreobjetos con un trozo de papel de filtro. Las burbujas de aire se pueden eliminar
colocando el portaobjetos en un desecador de vaco. Cuando se emplea hidrato de cloral, las burbujas de aire se pueden elimi-
nar calentando la muestra a ebullicin suave sobre una llama pequea, como la de una lmpara de alcohol. Para reemplazar el
medio de montaje o solucin reactivo, colocar gotas del nuevo medio de montaje o solucin reactivo en un borde del cu-
breobjetos. Colocar una tira de papel de filtro en el extremo opuesto del cubreobjetos para eliminar el medio de montaje o
solucin reactivo anterior y hacer que el nuevo medio de montaje o solucin reactivo corra sobre el tejido o material pulveriza-
do. Los aceites vegetales tambin pueden ser arrastrados del tejido de esta manera, lavando el portaobjetos con ter de petr-
leo o acetona seguido luego por agua, y si fuera necesario, por Solucin de hidrato de cloral. No usar Solucin de hidrato de
cloral inmediatamente despus de tratar el tejido vegetal con disolventes inflamables sin haber lavado minuciosamente el teji-
do con agua. De este modo se evita que el disolvente residual se inflame cuando el portaobjetos se coloque sobre una llama
pequea para calentar el tejido a ebullicin. Se debe tener cuidado al usar soluciones reactivo que sean voltiles o corrosivas
para el microscopio. Para evitar que las soluciones acuosas o de hidrato de cloral se sequen durante la observacin, agregar al
portaobjetos una pequea gota de glicerina. Observar la muestra montada bajo un microscopio ptico (ver Microscopa ptica
(776)) y examinar las caractersticas histolgicas.
Preparacin y uso de soluciones reactivo, dispositivos pticos y medios de montaje: Los siguientes reactivos, dispositi-
vos pticos y medios de montaje se emplean en la identificacin de clulas, tejidos, caractersticas estructurales y sustancias
ergsticas en el tejido o material pulverizado (ver la Tabla 1 y la Tabla 2).
Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos pticos
Soluciones Reactivo y
Deteccin Dispositivos pticos
Concrecin de Carbonato de calcio cido actico diluido
Cristales de oxalato de calcio Polarizadores cruzados
Solucin de carmn-alumbre-verde de metilo
cido yodhdrico
Celulosa Solucin de yodcrcloruro de cinc
Citoplasma Solucin de cido pcrico alcohlico
1,8-Dihidroxiantraquinonas Solucin de hidrxido de potasio 7 M
422 (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos pticos (Continuacin)

Soluciones Reactivo y
Deteccin Dispositivos pticos
Solucin de tetrxido de osmio
Aceites esenciales Solucin de sudn 111
lnulina Solucin de naftol--Ocido sulfrico
Solucin de carmn-alumbre-verde de metilo
Solucin de floroglucinol--Ocido clorhdrico
Lignina Reactivo universal
Solucin de carmn-alumbre-verde de metilo
Solucin de tetrxido de osmio
Solucin de sudn 111
Lpidos (cutina, ceras y suberina incluidas) Reactivo universal
Solucin de rojo de rutenio
Solucin de tionina
Pectina y muclago Solucin de azul de toluidina
Fitoglicgeno Solucin de rojo de rutenio
Solucin de cido pcrico alcohlico
Cuerpos proteicos Solucin de tetrxido de osmio
Mezcla de sangre-gelatina
Solucin de yodo-glicerina
Saponina (confirmar mediante prueba con Mezcla de sangre-gelatina)
Polarizadores cruzados
Solucin de yodo
Almidn Reactivo universal
Solucin de cloruro frrico
Taninos y otros polifenoles Solucin de tetrxido de osmio

Tabla 2. Agentes Blanqueadores y Clariflcantes y Medios de Montale

Usar Medios de Montaje y Agentes
Agentes Blanqueadores Solucin de hipoclorito de sodio
Solucin de hidrato de cloral
Solucin de lactocloral
Agentes Clarificantes Solucin de lactofenol
Glicerina
Solucin de glicerina-alcohol
Mezcla de glicerina-gelatina
Medios de Montaje Agua

Solucin de cido pcrico alcohlico-Preparar una solucin de cido pcrico al 1% en alcohol. El cido pcrico es til para
teir clulas que tienen un citoplasma denso, como las clulas de aleurona en semillas. Colocar una pequea cantidad del ma-
terial vegetal pulverizado en un tubo de ensayo y agitarla con aproximadamente 1 mL de ter de petrleo para eliminar acei-
tes vegetales que interferiran con la reaccin. Centrifugar y desechar el ter de petrleo. Empapar el polvo vegetal en Solucin
de cido pcrico alcohlico durante aproximadamente 30 minutos. Transferir una porcin del polvo a un portaobjetos y observar
al microscopio. El citoplasma y los cuerpos proteicos se tornan de un color amarillo brillante. [PRECAUCIN-El cido pcrico es
explosivo cuando se seca. Manipular de manera adecuada.]
Mezcla de sangre-gelatina-Agregar 4,5 g de gelatina en polvo a 100 mL de una solucin de cloruro de sodio al 0,9% y
dejar hinchar durante 30 minutos. Calentar el gel mezclndolo hasta aproximadamente 80, en un bao de agua. Enfriar a 40
y agregar 6 mL de sangre bovina desfibrinada. Calentar a 45-50 y verter sobre un portaobjetos para microscopio en una
capa delgada de aproximadamente 1 mm manteniendo el portaobjetos en posicin horizontal. Para evitar prdidas de la
mezcla de sangre-gelatina por los lados del portaobjetos, sellar los bordes con cinta adhesiva de 1 cm de ancho para formar
una bandeja. Despus de enfriarse y solidificarse, la mezcla est lista para usar. [NOTA-Almacenar en una cmara hmeda du-
rante no ms de 1-2 das, a 3-4.] Para realizar la prueba de saponinas, colocar grupos pequeos del material vegetal en pol-
vo sobre la capa de sangre-gelatina, dejando una separacin de algunos mm entre ellos, transferir a un humidificador durante
algunas horas y observar. Las partculas que contengan saponinas originarn zonas claras transparentes en la sangre-gelatina.
Solucin de carmn-alumbre-verde de met/o-Calentar a ebullicin 1,5 g de carmn durante 30 minutos en una solucin de
sulfato de potasio y aluminio al 15%. Enfriar, filtrar y agregar mezclando 1 O mL de una solucin de verde de metilo al 0,75%.
Agregar de 1-2 gotas al material vegetal. La lignina y la suberina se tornan de color verde y la celulosa se torna de color violeta
rojizo.
Solucin de hidrato de cloral-Usar hidrato de cloral SR. Cuando se use la solucin como agente clarificante, agregar algunas
gotas al material vegetal y calentar a ebullicin brevemente sobre una llama pequea. El hidrato de cloral disuelve el contenido
celular y las sustancias intercelulares, y permite observar fcilmente las paredes y las formas celulares. Se puede utilizar para
USP 39 Pruebas Qumicas/ (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico 423

ayudar a la identificacin de sber, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio (con ayuda de polarizadores cruzados), tricomas,
estomas y polen.
Polarizadores cruzados-Este dispositivo ptico se emplea para detectar cristales de oxalato de calcio y granos de almidn
(amiloplastos). Bajo la luz polarizada, los cristales de oxalato de calcio y los granos de almidn aparecen como objetos brillan-
tes, birrefringentes, sobre un fondo oscuro. Los granos de almidn observados bajo la luz polarizada tambin presentan el
efecto de la cruz de Malta, cuyos brazos se cruzan en el hilio. En general, los cristales de oxalato de calcio se ven mejor des-
pus de clarificar la muestra con Solucin de hidrato de cloral u otro agente clarificante.
cido actico diluido-Agregar de 1-2 gotas al material vegetal y observar inmediatamente al microscopio. Los depsitos de
carbonato de calcio se disuelven con efervescencia.
Solucin de cloruro frrico-Diluir 1 mL de cloruro frrico SR con 9 mL de agua. Para la deteccin de grupos hidroxilo fenli-
cos, como taninos y flavonoides, agregar la solucin a la muestra acuosa desde la parte lateral del cubreobjetos. Los taninos y
otros polifenoles se tornan de color de negro azulado a verde.
Glicerina-Usar como medio de montaje para evitar que las soluciones acuosas y de hidrato de cloral se sequen.
Solucin de glicerina-alcohol-Mezclar volmenes iguales de glicerina y alcohol. Usar como medio de montaje.
Mezcla de glicerina-gelatina-Agregar 10,0 g de gelatina en polvo a 60 mL de agua. Dejar en reposo durante 2 horas y
agregar 70 mL de glicerina que contenga 1,5 g de fenol disuelto. Calentar en un bao de agua y filtrar a travs de un embudo
precalentado que contenga lana de vidrio. La mezcla filtrada se lica antes de usar y sirve como medio de montaje. Agregar
algunas gotas al material vegetal pulverizado o cortado y cubrir con un cubreobjetos calentado. Esta preparacin se utiliza para
el almacenamiento a largo plazo de montajes de muestras. Los extremos del cubreobjetos se pueden sellar con blsamo de
Canad despus de algunos meses de secado.
cido yodhdrico-Agregar de 1-2 gotas al material vegetal. Las paredes celulares de celulosa se tornan de color azul a viole-
ta azulado.
Solucin de yodo-Agregar de 1-2 gotas de yodo O, 1 N SV al material vegetal. Las partculas de almidn se tornan de color
azul oscuro a violeta azulado; esta reaccin es reversible si se calienta. [NOTA-Las protenas, los lpidos y la celulosa se tornan
de amarillo a marrn. Las partculas de polvo de guayaco se tornan de verde a azul, pero este reactivo no se usa para la identi-
ficacin diagnstica de estas caractersticas.]
Solucin de yodo-glicerina-Disolver 0,3 g de yodo y 1,0 g de yoduro de potasio en una pequea cantidad de agua y agre-
gar 1O mL de una mezcla de glicerina y agua (1 :1 ). Agregar 1-2 gotas al material vegetal en polvo. Las muestras que contie-
nen saponinas forman grumos o agregados de color amarillo. Si la prueba de una muestra diera un resultado positivo para
saponina, el resultado se debe confirmar realizando tambin una prueba a la muestra con la Mezcla de sangre-gelatina.
Solucin de lactocloral-Disolver 50,0 g de hidrato de cloral en 50 mL de cido lctico, calentando suavemente. Agregar
algunas gotas al material vegetal. Si fuera necesario, colocar el portaobjetos del microscopio en un pequeo desecador al vaco
para eliminar las burbujas de aire. La Solucin de hidrato de cloral y la Solucin de lactocloral se usan para el mismo tipo de iden-
tificacin, excepto que la Solucin de lactocloral es un agente clarificante ms fuerte y se usa para el material vegetal que es
ms difcil de clarificar.
Solucin de lactofenol-Mezclar 20 g de cido lctico, 40 g de glicerina y 20 mL de agua. Agregar 20 g de fenol y mezclar.
ste es un agente clarificante fuerte adecuado para el examen de granos de polen.
Solucin de naftol-cido sulfrico-Preparar una solucin al 20% de 1-naftol en alcohol. Agregar al material vegetal 1 gota de
solucin de 1-naftol y 1 gota de cido sulfrico. Los cristales de inulina se tornan de color rojo amarronado y luego se disuel-
ven.
Solucin de tetrxido de osmio-Disolver O, 1 g de tetrxido de osmio en 5 mL de agua destilada. Agregar 1-2 gotas de la
solucin as obtenida al material vegetal. Los aceites esenciales, los aceites grasos y otros lpidos, los taninos y los cuerpos pro-
teicos se tornan de color marrn a negro.
Solucin de floroglucinol-cido clorhdrico-Esta solucin se utiliza para la identificacin de la lignina y otros derivados de hi-
droxifenilpropano; tejidos lignificados como esclereidas, vasos, fibras y clulas ptreas; y parnquima lignificado. Humedecer el
polvo o la muestra cortada con floroglucinol SR y dejar que se seque durante 2-3 minutos antes de colocar el cubreobjetos.
Agregar algunas gotas de solucin de cido clorhdrico al 25% y cubrir con el cubreobjetos. Las paredes de las clulas lignifica-
das se tornan de color rojo carmn. [NOTA-Este colorante no es estable.] Las clulas que presentan derivados de hidroxifenil-
propano, como vainillina y cido ferlico, tambin se tornan de color rojo. Alternativamente, los derivados del hidroxifenilpro-
pano se pueden extraer del material vegetal y luego ste puede ser examinado. Para extraer los derivados del hidroxifenilpro-
pano, sumergir repetidamente en alcohol el material sin tratar, mezclar en un mezclador de vrtice, centrifugar y desechar el
alcohol entre los lavados. A continuacin tratar el material vegetal segn la especificacin provista anteriormente, comenzando
con el agregado de floroglucinol SR.
Solucin de hidrxido de potasio 1 M-Agregar 1 gota al material vegetal. Las clulas que contienen 1,8-dihidroxiantraquino-
nas se tien de rojo.
Solucin de rojo de rutenio-Agregar algunas gotas de hidrxido de amonio a rojo de rutenio SR. [NOTA-Almacenar esta
solucin protegindola de la luz.] Agregar 1-2 gotas al material vegetal. Las membranas celulares que contienen pectina, el
muclago cido y el fitoglicgeno se tornan de color rojo.
Solucin de hipoclorito de sodio-Esta solucin se usa para blanquear cortes con una coloracin intensa. Sumergir el material
vegetal en la solucin durante algunos minutos hasta que est suficientemente blanqueado. Lavar el tejido con agua y montar
424 (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

con un agente de montaje adecuado. [NOTA-El hipoclorito de sodio extraer la lignina; el tejido vegetal tratado de esta ma-
nera dar un resultado negativo para lignina.]
Solucin de sudn /1/-Disolver 0,5 g de sudn 111 en 50 mL de alcohol o alcohol isoproplico con ebullicin a reflujo. Enfriar,
filtrar y agregar 50 mL de glicerina. Agregar de 1-2 gotas de esta solucin al polvo vegetal. Los aceites esenciales, las ceras, la
cutina, la suberina, los aceites grasos y otros lpidos se combinan con este colorante lipoflico y se tornan de un color rojo ana-
ranjado a un color rojo despus de un perodo corto.
Solucin de tionina-Preparar una solucin de acetato de tionina al 0,2% en alcohol al 25%. Sumergir la muestra seca en
esta solucin. Despus de aproximadamente 15 minutos, lavar el exceso de colorante con alcohol al 25%. El muclago se ha-
br hinchado formando glbulos esfricos y se habr tornado de color violeta rojizo, mientras que la celulosa, la pectina y los
tabiques lignificados se tornarn de color azul o violeta azulado.
Solucin de azul de toluidina-Utilizando azul de toluidina, proceder segn se indica en Solucin de tionina.
Reactivo universa/
SOLUCIN A: Diluir 20 mL de una solucin de sudn 111 saturada con cido lctico con 30 mL de cido lctico.
SOLUCIN B: Disolver 0,55 g de sulfato de anilina en 35 mL de agua.
SOLUCIN C: Disolver 0,55 g de yoduro de potasio y 0,05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de alcohol.
PROCEDIMIENTO: Combinar la Solucin A, la Solucin 8 y la Solucin C y agregar mezclando 2,5 mL de cido clorhdrico.
[NOTA-La solucin se usa sin filtrar.] Para identificacin, agregar 2-3 gotas a la muestra y calentar a ebullicin suave sobre una
llama pequea. Si fuera necesario, se pueden agregar cantidades pequeas de Reactivo universal durante la ebullicin. Cubrir
con el cubreobjetos. Los elementos lignificados se tornan de color amarillo, la suberina de color marrn rojizo, los lpidos de
color rojo y el almidn de color violeta azulado.
Agua-Usar como medio de montaje. [NOTA-Todos los grados de agua son aceptables para este propsito.]
Solucin de cloruro de cinc-yodo-Disolver 20,0 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua.
Agregar 0,5 g de yodo O, 1 N SV y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Almacenar en recipientes de vidrio con
proteccin actnica. Agregar 1-2 gotas al material vegetal y dejar en reposo durante algunos minutos. Las paredes celulares de
celulosa se tien de color azul a violeta azulado.
Preparacin de montajes temporales y cortes manuales: Cuando se use tejido vegetal seco, empapar o calentar a ebu-
llicin suave en agua hasta que se ablande. No dejar que se ablande demasiado. El material se puede tratar entonces como
material vegetal fresco. Cuando corresponda, usar los medios de montaje o soluciones reactivo indicadas para usar con plantas
en polvo para ayudar a visualizar las caractersticas del tejido (ver Preparacin y uso de soluciones reactivo, dispositivos pticos y
medios de montaje).
Para sacar una pelcula epidrmica de la hoja, ptalo, spalo, brctea u otro apndice similar a la hoja, enrollar el tejido for-
mando un cilindro y hacer una muesca con una cuchilla afilada, revestida de tefln, que haya sido humedecida con agua. Con
una pinza tomar el trozo de tejido cortado y tirando hacia atrs, remover un corte transparente de la epidermis. Montar en
agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio
Si resulta difcil obtener una pelcula epidrmica mediante el procedimiento anterior, proceder del siguiente modo. Empapar
el tejido en una solucin de cido ntrico al 40%- 60%, a 60 durante 3-4 minutos, o hasta que la epidermis se pueda pelar
con facilidad. La pelcula epidrmica despus se lava en agua de 3-5 veces para eliminar el exceso de cido ntrico. Neutralizar
el tejido en una solucin de hidrxido de potasio al 1 % o una solucin de hidrxido de sodio al 1 %. Lavar nuevamente el
tejido con agua, montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio.
Un mtodo alternativo para preparar tejido foliar para el examen de la epidermis es calentar un fragmento de la hoja (apro-
ximadamente 5 mm x 5 mm) durante 15 minutos en Solucin de hidrato de cloral en un bao de agua. Transferir el tejido a un
portaobjetos, agregar una gota de agua y cubrirlo con un cubreobjetos. Se pueden emplear estos procedimientos para deter-
minar el tipo, la distribucin y el nmero de estomas, al igual que el ndice estomtico.
El nmero de estomas se determina contando el nmero de estomas por unidad de superficie de un campo microscpico.
Determinar el nmero de estomas en al menos 1O sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Registrar la superfi-
cie foliar que se est observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia el nmero de estomas de las distintas superfi-
cies es muy diferente.
Para calcular el ndice estomtico, la muestra se observa al microscopio con poco aumento. El tamao de la superficie se
define con un micrmetro ocular calibrado y se determina el nmero de estomas y el nmero de clulas epidrmicas para esa
superficie. El ndice estomtico se calcula:

Resultado = (100 x S)/(E + S)

S = nmero de estomas para una superficie determinada

E= nmero de clulas epidrmicas de la misma superficie
Determinar el ndice estomtico en al menos 1 O sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Nuevamente regis-
trar la superficie foliar que se est observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia los ndices estomticos de las dis-
tintas superficies son muy diferentes
Para hacer un corte transversal de una hoja o races delgadas, tallos u otros apndices delgados, poner el apndice que se va
a cortar sobre un portaobjetos. Colocar otro portaobjetos sobre el apndice con una porcin del tejido expuesto. Con una
cuchilla afilada, revestida de tefln, humedecida, cortar derecho hacia abajo a lo largo del borde del portaobjetos superior. Sin
mover el portaobjetos superior, cortar de nuevo hacia abajo colocando la cuchilla en ngulo. Se puede necesitar cierta prctica
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para poder obtener cortes lo suficientemente delgados, de modo que cuando se monten y se cubran con un cubreobjetos,
estos cortes se puedan utilizar para determinar la organizacin del tejido (por ejemplo, el nmero de capas en empalizada en
la hoja, el grosor de la cutcula, los tipos de tricomas, los tipos de haces vasculares y otros similares). Debido a que las cuchillas
se desafilan rpidamente, se deben reemplazar con frecuencia.
Usar el corte transversal del tejido foliar as obtenido para determinar la relacin de mesfilo en empalizada. Alternativamen-
te, calentar a ebullicin fragmentos de hoja de aproximadamente 2 mm 2 en Solucin de hidrato de cloral, montar, cubrir con un
cubreobjetos y observar al microscopio. Identificar grupos de cuatro clulas epidrmicas adaxiales y contar las clulas de mes-
filo en empalizada que se extiendan por debajo y estn cubiertas al menos en el 50% por las clulas epidrmicas. Este valor
dividido entre 4 es la relacin de mesfilo en empalizada. Determinar la relacin de mesfilo en empalizada de al menos
1Ogrupos de clulas epidrmicas y calcular el valor medio. La relacin de mesfilo en empalizada tambin se puede determi-
nar en material foliar en polvo.
Para hacer un corte transversal de tallos o races gruesas, u otras partes de la planta, incluidos los tejidos leosos, sostener el
tejido con una mano y utilizando una cuchilla afilada revestida de tefln, previamente humedecida con agua, rebanar un corte
transversal del apndice. Montar en agua, otro medio o solucin reactivo, colocar un cubreobjetos sobre el material y exami-
nar al microscopio. En general, con un poco de prctica se pueden hacer cortes que sean lo suficientemente delgados como
para determinar la organizacin del tejido vascular, el tipo de rayos, la distribucin del parnquima, la presencia de cristales y
similares.
Maceracin: Para la adecuada identificacin del material vegetal, algunas veces es necesario macerar el tejido en sus clu-
las individuales antes del examen microscpico. Esta tcnica puede ser particularmente til para tejidos leosos u otros tejidos
duros. El material se corta en pequeos trozos de aproximadamente 2 mm de grosor y 5 mm de largo o se rebana en trozos
de aproximadamente 1 mm de grosor. Segn la naturaleza de la pared celular, se emplea uno de los mtodos siguientes. Para
tejidos duros o muy lignificados, usar el Mtodo l. Para tejidos que no estn muy lignificados, usar el Mtodo //.
Mtodo I
SOLUCIN A: Usar solucin de cido ntrico 4 N.
SOLUCIN B: Preparar una mezcla de solucin de trixido de cromo 1,2 M y cido sulfrico (7:4).
PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una mezcla de
la Solucin A y de la Solucin B (1 :1 ). Calentar en un bao de agua durante 20 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y
transferir a un portaobjetos. Desmenuzar el tejido con una aguja de diseccin, agregar 1-2 gotas de medio de montaje, cubrir
con un cubreobjetos y examinar al microscopio. Si fuera necesario, las clulas se pueden separar ms entre s al presionar el
cubreobjetos con un movimiento suave y deslizante. El tejido macerado dar un resultado negativo en la prueba para lignina.
Mtodo 11
PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una solucin
de hidrxido de potasio 2 M. Calentar en un bao de agua durante 30 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transfe-
rir a un portaobjetos. Agregar 1-2 gotas de medio de montaje. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido, presionar hacia abajo,
aplastando el tejido y examinar al microscopio. El tejido macerado dar un resultado negativo en la prueba para lignina.
Preparacin de materiales en polvo: Colocar 1 2 gotas de agua, otro medio de montaje o una solucin reactivo en el
centro de un portaobjetos limpio. Humedecer la punta de una aguja de diseccin con agua y sumergir en el polvo en anlisis.
Transferir una pequea cantidad de material que se adhiera a la aguja al lquido en el portaobjetos y mezclar minuciosamente
y con cuidado. Cubrir con un cubreobjetos limpio. Debido a que se ha destruido la organizacin de las estructuras del tejido
dentro del tejido vegetal, las caractersticas importantes a observar del material vegetal en polvo son las caractersticas fsicas y
qumicas de los tejidos y los tipos celulares, al igual que la presencia y las caractersticas qumicas y fsicas de sustancias ergsti-
cas. Los tejidos, clulas y sustancias ergsticas especficas que se van a examinar se especifican en la monografa individual.

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES PERMANENTES DELGADOS

Cuando sea necesario revelar caractersticas histolgicas detalladas de una muestra vegetal, se deben obtener cortes delga-
dos del tejido. Los cortes deben ser lo suficientemente delgados para transmitir luz y se deben cortar en un plano que permita
exponer las caractersticas deseadas. El material vegetal se mata, fija y deshidrata en forma adecuada y se incluye en parafina u
otro medio de inclusin. El medio de inclusin se usa como una matriz de soporte slido durante el corte del tejido. Despus
de efectuar el corte y el montaje, frecuentemente se realiza la tincin de la muestra para ayudar a la diferenciacin de determi-
nadas estructuras.[NoTA-EI proceso de fijacin, deshidratacin, inclusin y tincin se puede acelerar significativamente si se
utiliza un horno de microondas diseado especficamente para trabajo histolgico.]
Muerte y fijacin: El primer paso en la preparacin de material vegetal para corte es matar las clulas vivas y conservar el
tejido. Con mucha frecuencia, esto se hace mediante el empleo de un fijador qumico. Un buen fijador de uso general para
material vegetal es una mezcla de formaldehdo, cido actico y alcohol (FAA).
Solucin FAA-Mezclar 50 mL de alcohol, 5 mL de cido actico glacial, 1 O mL de solucin de formaldehdo y 35 mL de
agua. [NOTA-Preparar peridicamente una solucin nueva, ya que con el almacenamiento pierde su eficacia.]
Procedimiento-Sumergir completamente el material vegetal en la Solucin FAA. Dejar el material sumergido durante 18-24
horas a temperatura ambiente. El material vegetal se puede conservar indefinidamente en Solucin FAA, siempre que el mismo
permanezca completamente sumergido y no se deje secar. Determinados tejidos pueden requerir infiltracin al vaco para faci-
litar la penetracin del fijador. La infiltracin al vaco es necesaria si el tejido tuviera abundantes espacios de aire o pelos epidr-
426 (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

micos, o si flotara en la superficie de la solucin de fijacin. Colocar el tejido en un vial pequeo que contenga el fijador. Colo-
car el vial sin tapar en una campana de cristal o desecador que est conectado a una fuente de vaco, preferentemente una
bomba de vaco con sello de aceite. Conectar la salida del sistema de vaco a una campana de extraccin para evitar que los
vapores de fijacin llenen la habitacin. Encender lentamente el vaco. No usar un vaco fuerte porque el fijador puede comen-
zar a hervir y daar el tejido. A medida que el aire residual es extrado del tejido, ste subir a la superficie. Encender y apagar
durante varios ciclos de vaco hasta que el tejido quede en el fondo del recipiente durante un ciclo "encendido".
Deshidratacin del tejido: La parafina y otros medios de inclusin son hidrfobos. Por lo tanto, se debe eliminar el agua
del tejido vegetal despus de la fijacin. Esto se lleva a cabo sumergiendo el tejido fijado en soluciones de deshidratacin, sien-
do estas soluciones una serie de mezclas de alcohol y agua con concentraciones de alcohol en aumento. La solucin final de la
serie es alcohol deshidratado. Comenzar lavando el tejido fijado una o dos veces con alcohol nuevo al 50% para eliminar trazas
de FAA. Eliminar esta solucin y eliminar a continuacin cualquier otra solucin de deshidratacin decantando la solucin o
eliminndola con ayuda de una pipeta de vidrio. Agregar la primera solucin de deshidratacin (alcohol al 70%) al vial, sumer-
giendo el tejido completamente. La serie graduada alcohol-agua y los tiempos sugeridos para la inmersin del tejido se listan
en la Tabla 3.
Tabla 3
Solucin de Deshidratacin Tiempo (h)
Alcohol al 50% 1-2
Alcohol al 70% 1-2
Alcohol al 90% 1-2
Alcohol al 95% 1-2
Alcohol deshidratado con O, 1% de safranina O 2-4
Alcohol deshidratado 1

Se agrega safranina O a la penltima solucin de deshidratacin de la serie para visualizar el tejido cuando ha quedado in-
cluido en parafina. Si el tejido que se va a cortar es duro o leoso, es posible que el tiempo de cada uno de los pasos de la serie
se deba aumentar hasta 24 horas. Si fuera necesario, el tejido se puede almacenar durante varios das en alcohol al 70% o en
soluciones con concentraciones de alcohol an ms altas.
Inclusin
Preparacin para inclusin
REMOCIN DE ALCOHOL: La parafina es el medio de inclusin ms comn, aunque se dispone de otros medios de inclusin.
Despus de la deshidratacin, el alcohol se elimina del tejido por medio de una serie graduada de soluciones de alcohol deshi-
dratado-xileno, debido a que la parafina no es soluble en alcohol. La serie graduada de alcohol deshidratado-xileno y los tiem-
pos sugeridos para la inmersin del tejido se listan en la Tabla 4.
Tabla 4
Solucin de Remocin de Alcohol Tiempo (h)
Una mezcla de alcohol deshidratado y xi le no (3: 1) 1
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1) 1
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :3) 1
Xileno 1
Xileno 1

REMOCIN DE XJLENO: Una vez que el xileno haya reemplazado completamente al alcohol, agregar lentamente parafina pa-
ra infiltrar el tejido y eliminar el xileno. Proceder del siguiente modo:
1. Por cada mL de xileno, agregar aproximadamente 1 perla de parafina al vial del tejido, tapar y dejar en reposo a tempera-
tura ambiente durante 4 horas. Agregar ms perlas de parafina hasta que no se disuelvan ms perlas.
2. Colocar el tejido en un horno mantenido a 42-45. Agregar 2-3 perlas de parafina cada hora hasta que a esa temperatu-
ra no se disuelvan ms perlas.
3. Verter un tercio del volumen y reemplazar con un volumen igual de parafina fundida. No tapar y transferir el vial a un
horno mantenido a 58-60.
4. Despus que la parafina se vuelva a fundir (aproximadamente 4 horas ms tarde), verter la mitad del volumen y reempla-
zar con un volumen igual de parafina fundida. Transferir el vial al horno mantenido a 58-60 si la parafina comienza a
solidificarse.
5. Repetir el cuarto paso dos veces ms, despus verter todo el volumen de parafina-xileno. Reemplazar con parafina pura
fundida. Aproximadamente 4 horas ms tarde, verter la parafina y reemplazarla con parafina pura fundida nueva. Volver a
verter y reemplazar 4 horas ms tarde, y dejar en reposo durante toda la noche. [NOTA-Transferir el vial al horno mante-
nido a 58-60 si la parafina comienza a solidificarse en algn momento.]
Procedimiento de inclusin-Verter el tejido con la parafina en un molde de inclusin. La parafina debe cubrir el tejido por
completo aproximadamente 3-5 mm. Colocar el molde de inclusin en una plataforma de calentamiento precalentada, dise-
ada para trabajo histolgico. Ajustar el tejido en el molde con la orientacin adecuada para realizar el corte. Lentamente, en-
USP 39 Pruebas Qumicas/ (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico 427

friar la parafina deslizando el molde hacia abajo, hacia el lado fro de la plataforma, hasta que la parafina se solidifique. Sumer-
gir el bloque de parafina en agua helada para enfriarlo rpidamente y evitar que se formen cristales de parafina. Almacenar el
bloque de parafina a 4.
Corte y montaje: Cortar el bloque de parafina en trozos, cada uno de los cuales debe contener una muestra de tejido.
Recortar el bloque de parafina lo ms cerca posible de la masa de tejido, para formar un rectngulo o una forma casi trapezoi-
dal. Este recorte evitar problemas de corte debidos al exceso de parafina alrededor del tejido. Para hacer cortes transversales,
orientar el tejido en un ngulo recto respecto a un bloque de tejido de madera cuya superficie se haya empapado en parafina
fundida. Fijar el bloque de parafina a la superficie del bloque de tejido. Agregar una pequea cantidad de parafina fundida a la
base del bloque de parafina para facilitar la formacin de un sello ms impermeable. Enfriar el bloque a 4.
Montar y ajustar en forma apropiada el tejido y el bloque de parafina en un micrtomo. Usar una cuchilla de micrtomo de
acero inoxidable adecuadamente afilada. Ajustar el micrtomo para hacer cortes de 8-15 m de grosor (1 O m es el grosor
ptimo para la mayora de los tejidos). Hacer cortes individuales o en serie. Preparar un portaobjetos para microscopio del si-
guiente modo. Se puede preparar un adhesivo en forma de solucin con 1 % de gelatina y 0,5% de benzoato de sodio que se
calienta a 30-35 para disolver la gelatina. Hacer un frotis de una pelcula delgada del adhesivo as obtenido sobre el portaob-
jetos, dejar que se seque, enjuagar con una solucin de formaldehdo SR al 4% y agregar una pequea cantidad de agua. Co-
locar al revs las secciones cortadas sobre el portaobjetos, de modo que floten en agua e inundar con una solucin de formal-
dehdo SR al 4%. Los cortes se extienden inmediatamente y desaparecen las arrugas.
Colocar el portaobjetos sobre una plataforma de calentamiento, mantenida a 42, para que los cortes se expandan. Pipetear
y secar el exceso de agua y solucin de formaldehdo. Secar durante toda la noche en un horno a 42 para asegurar la adhe-
rencia del corte de tejido al portaobjetos.
Tincin
Preparacin para tincin-Sumergir dos veces en xileno el portaobjetos con el tejido fijado, durante 10-15 minutos cada vez
para eliminar la parafina. Luego sumergir el portaobjetos en la siguiente secuencia de soluciones, dejndolo durante 5 minutos
en cada solucin y teniendo cuidado de no sacar el tejido: una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1 ), alcohol deshi-
dratado, alcohol y una solucin de alcohol al 70%. El tejido se blanquea antes de la tincin si est opaco debido a la presencia
de taninos u otros materiales ergsticos. Para blanquear, sumergir el portaobjetos en una solucin de permanganato de pota-
sio al 1% durante 1 minuto, enjuagar con agua, sumergir en una solucin de cido oxlico al 5% durante 1 minuto y enjuagar
minuciosamente con agua. El material est ya listo para la tincin. Para la mayora de los trabajos de identificacin botnica se
recomienda usar uno de los dos procedimientos de tincin siguientes. El primer procedimiento de tincin emplea safranina O
contrastada con fast green. Un procedimiento alternativo emplea safranina O contrastada con anaranjado G.
Tincin de safranina 0-fast green
SOLUCIN DE TINCIN DE SAFRANINA O: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado, agua y solucin de for-
maldehdo (50:25:25:2). Agregar una cantidad suficiente de acetato de sodio para obtener una solucin que contenga 1% de
acetato de sodio y mezclar. Agregar una cantidad suficiente de safranina O para obtener una solucin que contenga 1% de
safranina O y mezclar.
SOLUCIN DE TINCIN DE FAST GREEN: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado y salicilato de metilo
(1 :1 :1) que contenga 0,05% de fast green FCF.
PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70% segn se describe en Preparacin para tin-
cin, sumergir durante 2-24 horas, dependiendo del tejido, en Solucin de tincin de safranina O. Eliminar el exceso de coloran-
te sumergiendo varias veces el portaobjetos en agua. Transferir el portaobjetos a una solucin de alcohol que contenga 0,5%
de cido pcrico durante 2-1 O segundos para eliminar an ms el exceso de colorante del corte y ayudar a la diferenciacin de
las estructuras del tejido. Para detener la accin del cido pcrico, transferir el portaobjetos durante 1O segundos a 1 minuto a
una solucin de alcohol que contenga 4 gotas de hidrxido de amonio por cada 100 mL de alcohol. Transferir el portaobjetos
al alcohol deshidratado durante 1O segundos. Inspeccionar visualmente al microscopio el tejido teido para comprobar si es
necesaria una mayor decoloracin con cido pcrico. Contrastar durante 10-15 segundos en Solucin de tincin de fast green.
Pasar el portaobjetos por dos cambios de una mezcla de salicilato de metilo, alcohol deshidratado y xileno (2:1 :1 ); cada cam-
bio dura 5-1 O segundos. Luego transferir el portaobjetos a una mezcla de xileno y alcohol deshidratado (95:5) durante 1 mi-
nuto. Pasar por dos cambios de xileno. Almacenar en xileno hasta que est listo para montar el cubreobjetos. Los cromosomas,
los ncleos y las paredes celulares lignificadas, cutinizadas o suberizadas, se teirn de color rojo. El citoplasma y las paredes
celulares de celulosa se teirn de color verde a azul, dependiendo del pH del tejido.
Tincin de anaranjado G-safranina O
SOLUCIN DE TINCIN DE SAFRANINA O: Preparar una solucin de safranina o al 0,004%.
SOLUCIN DE TINCIN DE ANARANJADO G: Disolver 2 g de anaranjado G, 5 g de cido tnico y 4 gotas de cido clorhdrico en
agua y diluir con agua hasta 1 00 ml.
PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70%, segn se describe en Preparacin para
Tincin, transferir en forma secuencial el portaobjetos por la serie de soluciones en la Tabla 5.
Tabla 5
Solucin Tiempo
Alcohol al 35% 5 min
Una solucin filtrada de cloruro de cinc al 2% 1 min
428 (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico/ Pruebas Qumicas USP 39

Tabla 5 (Continuacin)
Solucin Tiempo
Agua 5s
Solucin de tincin de safranina O 5 min
Agua 5 s
Solucin de tincin de anaranjado G 1 min
Agua 5 s
Una solucin filtrada de cido tnico al 5% 5 min
Agua 3s
Una solucin de sulfato frrico amnico al 1% 2 min
Agua 15 s
Alcohol al 45% 10 s
Alcohol al 90% 10 s
Alcohol deshidratado 10 s
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1) 1-2 min

Finalmente, almacenar en xileno hasta que est listo para colocar el cubreobjetos. Las paredes celulares de celulosa se tei-
rn de negro azulado, los ncleos de color amarillo, los granos de almidn de color negro y las paredes celulares lignificadas
de color rojo.
Montaje del cubreobjetos: El montaje del cubreobjetos sobre el tejido completa la preparacin del portaobjetos. Como
adhesivo se puede usar blsamo de Canad, diluido con una pequea porcin de xileno. En el mercado existen otros medios
de montaje disponibles. Cuando se seca el medio de montaje, el portaobjetos puede examinarse al microscopio. Todo el pro-
ceso de preparacin de extensiones permanentes sobre portaobjetos puede llevar 5 das o ms.
Microscopa electrnica de barrido: Los productos botnicos comercializados por lo general se encuentran en forma de
polvo o en trozos, lo que dificulta y generalmente imposibilita la autenticacin mediante un mtodo rutinario de corte trans-
versal del artculo. Las estructuras tales como los vasos del xilema y las traqueidas se pueden partir en trozos ms pequeos, lo
que dificulta y en ocasiones imposibilita la deteccin de puntuaciones y lignificaciones en las paredes usando un microscopio
ptico. Las estructuras que son resistentes a estos procesos son ms tiles en la identificacin. La microscopa electrnica de
barrido (SEM, por sus siglas en ingls) es til para caracterizar el tamao y la morfologa de muestras microscpicas. Mediante
la SEM es posible observar e identificar las caractersticas diferenciales ms detalladas en la estructura de los tricomas, elemen-
tos peculiares en la epidermis, junto con material granular superficial que contenga compuestos especficos, lo cual ayuda en la
identificacin de especies particulares. La SEM se ha usado ampliamente para investigar la topologa superficial de una extensa
variedad de materiales vegetales y puede desempear un papel vital en la autenticacin de un producto botnico completo,
aqullos en forma de polvo, distinguiendo entre especies estrechamente relacionadas, y se puede usar para examinar una
mezcla de polvos.
El captulo general de USP Microscopa Electrnica de Barrido (1181) proporciona una introduccin e informacin general
acerca de la SEM con respecto a su aplicacin a artculos farmacopeicos.
La SEM produce una resolucin ms alta en comparacin con la resolucin obtenible usando un microscopio ptico y las
imgenes obtenidas son tridimensionales. La SEM tiene la ventaja de proporcionar imgenes con una gran profundidad de
campo, lo cual premite enfocar un espesor importante de la muestra de una sola vez. Asimismo, permite el anlisis de mues-
tras de tamaos tan grandes como 50 mm, lo que permite producir micrografas electrnicas con los detalles topogrficos de
un objeto claramente visibles para el ojo humano. La resolucin mxima para la SEM (la distancia mnima por la cual se pue-
den separar y observar los dos objetos como objetos distintos) es de 10-20 nm en comparacin con 200-300 nm para la mi-
croscopa ptica. El aumento tpico de la SEM vara de xl O a x300 000. Los instrumentos comerciales SEM tambin estn dis-
ponibles con aumentos tan bajos como x5 y tan altos como x2 000 000. En comparacin, los microscopios pticos modernos
tpicos tienen un intervalo de aumento de xl O a x2000. A un aumento bajo, las imgenes obtenidas con la SEM proporcionan
ms informacin que aqullas obtenidas mediante microscopa ptica. La SEM puede producir imgenes cuyos constrastes se
basan en variaciones composicionales de las muestras.

IDENTIFICACIN QUMICA

Para tener la certeza de que se logra la autenticidad del artculo, se realiza la identificacin qumica junto con la identifica-
cin botnica descrita anteriormente. La identificacin qumica generalmente emplea procedimientos cromatogrficos para
detectar la presencia de compuestos indicadores o marcadores especificados en la monografa individual. Se pueden emplear
perfiles espectroscpicos o cromatogrficos para obtener la identificacin qumica mediante la comparacin de huellas dactila-
res o caracterizaciones con un estndar o muestra de referencia. Algunos ejemplos de mtodos espectroscpicos son ultraviole-
ta (UV, por sus siglas en ingls), infrarrojo (IR) e IR por transformada de Fourier (ver Pruebas de Identificacin Espectrofotomtrica
(197)). Algunos ejemplos de mtodos cromatogrficos son cromatografa lquida de alta presin (HPLC, por sus siglas en in-
gls), cromatografa en capa delgada (TLC, por sus siglas en ingls), TLC bidimensional y cromatografa de gases (GC, por sus
USP 39 Pruebas Qumicas/ (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico 429

siglas en ingls) (ver Cromatografa (621 )). Los mtodos analticos utilizados para producir huellas dactilares deben ser capaces
de detectar tantos componentes qumicos como sea posible. Puede resultar til emplear huellas dactilares mltiples, tales co-
mo una combinacin de mtodos analticos con principios de separacin y condiciones de prueba diferentes. Adems de los
mtodos cromatogrficos espectroscpicos, en la monografa individual tambin se pueden especificar mtodos cualitativos de
qumica hmeda.

Quimiotaxonoma

La quimiotaxonoma es la clasificacin de las plantas, basada en sus componentes qumicos, y la misma puede resultar til
para la identificacin de artculos botnicos. Los compuestos metablicos que se encuentran en los tejidos vegetales se pueden
dividir en dos amplias categoras, en base a sus funciones. La primera categora comprende los metabolitos primarios-meta-
bolitos que participan en los procesos fisiolgicos vegetales, que son absolutamente necesarios para la vida y estn presentes
en todo el reino vegetal. Estos procesos comprenden la fotosntesis, la respiracin y el metabolismo de los cidos nucleicos, las
protenas, los carbohidratos y los lpidos. La segunda categora comprende metabolitos secundarios-compuestos que no se
consideran absolutamente necesarios para los procesos vegetales, aunque pueden tener funciones importantes en las interac-
ciones de las plantas con otros organismos, como interacciones alelopticas; en la defensa qumica contra herbvoros y patge-
nos vegetales, y en las seales para atraer animales que polinizan y propagan las semillas. Se sabe que muchos metabolitos
secundarios tienen actividad farmacolgica. Tambin representan la base de la quimiotaxonoma vegetal. Los metabolitos se-
cundarios pertenecen a varias clases qumicas diferentes, tales como aminocidos no proteicos, flavonoides, xantonas, cumari-
nas, poliacetilenos, polictidos cclicos, monoterpenos, sesquiterpenos, iridoides, triterpenos, esteroles, terpenos que contienen
nitrgeno y alcaloides. Estas clases qumicas no se encuentran en todo el reino vegetal, sino que tienden a ser especficas para
determinadas clases, rdenes y familias botnicas. Por otra parte, muchas subclases qumicas y compuestos secundarios parti-
culares son especficos para determinadas subfamilias, gneros o especies. Estas subclases qumicas y compuestos particulares
son los que se pueden usar como compuestos marcadores para ayudar a la identificacin adecuada del material vegetal.

Principios Activos y Compuestos Marcadores

Para la identificacin qumica de artculos botnicos se preparan extractos. Dichos extractos son generalmente mezclas com-
plejas de varios componentes qumicos. En la gran mayora de los extractos botnicos no se conoce con certeza cul de los
diferentes componentes es responsable del efecto farmacolgico informado. En general, se cree que los distintos componentes
actan en forma sinrgica para proporcionar el efecto informado. En el caso de artculos para los que existen monografas ofi-
ciales, se eligen determinados componentes qumicos del artculo y se proporcionan procedimientos de pruebas cuantitativas
para determinar su contenido. La eleccin de dichos componentes, generalmente conocidos como compuestos marcadores,
se basa en ciertas consideraciones. Actualmente, en las monografas oficiales se especifican los siguientes tipos de compuestos
marcadores y pueden ser identificados en materias primas:

PRINCIPIOS ACTIVOS

Estos son componentes que han demostrado ser los responsables de la actividad clnica. Generalmente, en la monografa
individual se especifica un intervalo o contenido mnimo de los principios activos. Una determinacin cuantitativa de los princi-
pios activos durante estudios de estabilidad de formas farmacuticas botnicas provee la informacin necesaria para determi-
nar fechas de caducidad apropiadas.

MARCADORES ACTIVOS

Estos componentes tienen actividad farmacolgica conocida que contribuye en cierto grado a la eficacia. Sin embargo, la
eficacia clnica de estos componentes puede no estar demostrada. Generalmente, en las monografas individuales se especifica
un contenido o intervalo mnimo de los marcadores activos. Una determinacin cuantitativa de los marcadores activos durante
estudios de estabilidad de formas farmacuticas botnicas provee la informacin necesaria para determinar fechas de caduci-
dad apropiadas.

MARCADORES ANALTICOS

Cuando no se conocen ni los principios activos ni los marcadores activos, se eligen otros componentes del extracto botnico
a los que se les puedan realizar determinaciones cuantitativas. Estos marcadores ayudan a la identificacin positiva del artculo
en anlisis. Adems, mantener un contenido mnimo o un intervalo especfico de los marcadores analticos ayuda a lograr la
normalizacin del extracto vegetal y a determinar una fecha de caducidad apropiada durante los estudios de estabilidad.
430 (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas USP 39

MARCADORES NEGATIVOS

Estos componentes pueden tener propiedades alergnicas o txicas. La presencia de estos componentes resulta indeseable
en el extracto botnico. Por ejemplo, los cidos ginkglicos del ginkgo pertenecen a esta categora. Las monografas individua-
les pueden tener especificado un lmite estricto para estos marcadores negativos.

Uso de Artculos de Referencia USP

Se usan artculos de referencia para ayudar a la identificacin de compuestos marcadores dentro del artculo de prueba. Los
artculos de referencia son Materiales de Referencia Autenticados USP o Estndares de Referencia USP (ver Estndares de Refe-
rencia USP (11 )), segn lo que especifique en la monografa individual. Los Estndares de Referencia USP utilizados para identi-
ficar compuestos indicadores o marcadores en los artculos de prueba pueden ser una entidad qumica purificada nica, una
mezcla de entidades qumicas purificadas o un extracto estandarizado preparado a partir del artculo vegetal autenticado. Ade-
ms se pueden utilizar Estndares de Referencia USP para cuantificar compuestos marcadores, segn se especifique en la mo-
nografa individual.
Se somete un artculo de prueba pulverizado a un procedimiento de extraccin especificado (ver Mtodos de Extraccin en
Extractos Botnicos (565)) y se prepara para el anlisis cromatogrfico o de qumica hmeda. Cuando se dispone de un Mate-
rial de Referencia Autenticado USP, se somete al mismo procedimiento de extraccin que al artculo de prueba. Luego se so-
meten la preparacin de prueba y los artculos de referencia al mismo procedimiento cromatogrfico o de qumica hmeda
especificado en la monografa individual. Se compara la respuesta de la preparacin de prueba con la respuesta de los artculos
de referencia para determinar la presencia de los compuestos indicadores o marcadores en el artculo de prueba.

MTODOS BASADOS EN ADN PARA LA AUTENTIFICACIN DE ARTCULOS DE ORIGEN

BOTNICO
Debido a que a menudo resulta imposible la identificacin morfolgica cuando el material vegetal original consta de partes
de la planta secas, cortadas y modificadas o procesadas, o cuando el material consiste nicamente en una sola parte entera de
la planta sin caracteres taxonmicos, estos tipos de muestras por lo regular requieren mtodos de identificacin adicionales,
tales como identificacin basada en ADN. Los mtodos basados en ADN han demostrado ser eficientes para distinguir materia-
les vegetales genuinos de materiales adulterantes en matrices botnicas complejas y pueden complementar a los mtodos de
identificacin botnica tradicionales que se basan en caractersticas morfolgicas o qumicas. Adems, los mtodos basados en
ADN a menudo son ms confiables que los mtodos tradicionales, en especial cuando se aplican a muestras de un slo rgano
que carecen de caracteres taxonmicos de diagnstico, a materiales en polvo en los que ya no son apreciables las caractersti-
cas que los distinguen o cuando es difcil distinguir entre especies estrechamente relacionadas o morfolgicamente similares.

Cdigo de Barras de ADN (DNA Barcoding)

El cdigo de barras de ADN es un mtodo de identificacin particular basado en secuenciacin de ADN que emplea secuen-
cias especficas cortas de loci de ADN nuclear o de plstidos para la identificacin de especies de plantas. Las pruebas se basan
en la comparacin de las secuencias de nucletidos de un tramo especfico de ADN (secuencias de ADN o cdigo de barras de
ADN) para realizar una identificacin basada en secuencias del ADN. Asimismo, los mtodos basados en ADN, tales como las
tecnologas de secuenciacin de nueva generacin (NGS, por sus siglas en ingls), son capaces de identificar mltiples especies
en una mezcla, incluyendo especies esperadas e inesperadas.

Identificacin de Productos Botnicos Usando Secuenciacin del ADN (Sanger)

El proceso de identificacin de productos botnicos que usa secuenciacin del ADN (Sanger) incluye seleccin de marcado-
res, extraccin del ADN, cebadores y amplificacin por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciacin del ADN y
comparacin con materiales de referencia, tal como se describe en las secciones siguientes. Ver Tcnicas Basadas en cidos Nu-
cleicos-Extraccin, Deteccin y Secuenciacin (1126), Tcnicas Basadas en cidos Nucleicos-Amplificacin (1127) y Tcnicas Basa-
das en cidos Nucleicos-Genotipificacin (1129) para informacin adicional.

SELECCIN DE MARCADORES

La secuencia seleccionada debe ser lo suficientemente especfica para capturar cualquier especie primaria adulterante y po-
tencial en la muestra, pero tambin lo suficientemente universal para evitar reacciones de falsos negativos para especies estre-
chamente relacionadas. Por ejemplo, un cebador especfico para una especie no es apropiado para la mayora de los procedi-
mientos de identificacin, debido a que no pueden detectarse los adulterantes y porque una falla en la amplificacin puede ser
el resultado tanto de la ausencia de las especies o de la degradacin del ADN. En muchos casos, un solo marcador puede ser
suficiente para la identificacin, pero mltiples marcadores de diversas partes del genoma (p.ej. material nuclear o de los pls-
USP 39 Pruebas Qumicas/ (563) Identificacin de Artculos de Origen Botnico 431

tidos) aseguran la deteccin de los hbridos. Por lo regular, las regiones usadas para la identificacin de secuencias de ADN
tienen una longitud de 100 a 1500 pares de bases. Los fragmentos de ADN ms pequeos pueden ser menos susceptibles a la
degradacin del ADN.

EXTRACCIN DEL ADN

Antes de que se pueda llevar a cabo la amplificacin del marcador deseado, se debe extraer el ADN genmico en su totali-
dad. La aptitud de un procedimiento de extraccin genmica depende del material inicial y de la pureza del ADN requerido
para las aplicaciones posteriores. Los procedimientos principales se describen a continuacin, adems de que se encuentran
disponibles diversos kits comerciales para ajustarse a diferentes tipos de muestras y aplicaciones.
Se debe extraer del material vegetal molido todo el ADN genmico. Los materiales vegetales pueden homogeneizarse ma-
nualmente usando un mortero y una mano de mortero, una moledora mecnica u otro aparato, dependiendo de la naturaleza
del material. La extraccin y purificacin de la totalidad del ADN genmico puede ser complicada debido a la abundancia de
metabolitos secundarios (polisacridos, taninos, aceites esenciales, fenoles, alcaloides y ceras) en muchas especies de plantas
medicinales. Algunos metabolitos secundarios pueden coprecipitar con el ADN durante la extraccin y pueden inhibir otras
reacciones enzimticas, incluyendo la digestin por restriccin y la PCR. En particular, grandes cantidades de polisacridos
complejos pueden imposibilitar la extraccin de ADN utilizable, volviendo la porcin acuosa del extracto demasiado viscosa
como para permitir que el ADN se separe eficientemente de los polisacridos contaminantes. Este tipo de contaminacin pue-
de llevar a una escasa extraccin de ADN y puede evitar el acceso de enzimas modificadoras.
Resultan apropiados numerosos mtodos de extraccin de ADN usados comnmente para una amplia variedad de materia-
les vegetales frescos y secos, incluyendo bromuro de cetiltrimetilamonio, mtodos basados en slice y una variedad de kits dis-
ponibles comercialmente que emplean columnas de slice o perlas magnticas recubiertas con vidrio. Aunque muchos de estos
mtodos funcionan bien en materiales frescos y secos y en cualquier parte de la planta, aqullos que se degradan o que contie-
nen niveles significativos de compuestos secundarios u otros inhibidores de la PCR pueden requerir ajustes menores en los pro-
tocolos estndar de extraccin.

CEBADORES Y AMPLIFICACIN POR PCR

Por lo regular, los cebadores para PCR tienen una longitud de 18 a 30 bases y amplifican una regin con una longitud de
100 a 1500 pares de bases. Como se indic anteriormente, los cebadores para PCR pueden ser universales, es decir, capaces
de amplificar cualquier organismo potencial presente en una muestra de prueba (incluyendo hongos, plantas y animales o un
subconjunto importante y predecible) o pueden ser especficos de taxn, lo que significa que han sido diseados para amplifi-
car slo organismos de un conjunto determinado (es decir, familia, gneros, especies o subespecies). Para la amplificacin uni-
versal, se utilizan diversas regiones gnicas nucleares, mitocondriales y de plstidos, incluyendo nrlTS, nrlTSl, nrlTS2, matK,
rbcL, espaciador intergnico psbA-trnH, cox3, COI (tambin conocido como coxl), espaciador externo transcrito, 18S, 5S, espa-
ciador intergnico trnL-trnF e intrn trnL. Los cebadores especficos de taxn pueden estar diseados basndose en las prote-
nas encontradas en grupos vegetales especficos (p.ej., el gen de lecitina de soja encontrado en la soja) u obteniendo secuen-
cias de cualquier regin variable de ADN para el taxn determinado y cebadores diseados para unirse nica y especficamen-
te a las secuencias del taxn de inters.

SECUENCIACIN DEL ADN

Resulta ms comn llevar a cabo la secuenciacin del ADN usando el protocolo de Sanger, que se ha modificado para usar
terminadores colorantes fluorescentes en un aparato de electroforesis capilar, aunque en este momento, se estn abriendo pa-
so diversas tecnologas emergentes de secuenciacin [p.ej., secuenciacin de nueva generacin (NGS)]. Una vez que el colo-
rante fluorescente se ha incorporado en el ADN amplificado, se identifican las bases mediante su emisin de luz a diferentes
longitudes de onda. Los datos resultantes son un cromatograma que se puede visualizar y analizar usando diversos programas
computarizados de anlisis de secuencias.

COMPARACIN CON MATERIALES DE REFERENCIA

Las secuencias de ADN de los artculos de prueba se comparan con secuencias obtenidas de diversos materiales de referencia
en una matriz alineada (proceso comnmente referido como alineacin), lo cual permite examinar visualmente las secuencias
para identificar posiciones de nucletidos diagnsticas. Aunque una buena cantidad de programas computarizados son capa-
ces de automatizar las comparaciones entre secuencias derivadas de artculos de prueba y secuencias de referencia, el desem-
peo vara considerablemente. Se recomienda que los investigadores verifiquen siempre de forma manual los resultados suge-
ridos por los programas computarizados para confirmar la identidad. Las identificaciones positivas no son posibles cuando las
secuencias de los artculos de prueba caen fuera del intervalo de variacin conocido representado en las secuencias de referen-
cia. Si se ha utilizado un nmero suficientemente grande de materiales de referencia para desarrollar la prueba, la mayora de
los materiales de prueba deberan identificarse sin ambigedad basndose en los datos de secuencias de ADN.
432 (565) Extractos Botnicos / Pruebas Qumicas USP 39

(565) EXTRACTOS BOTNICOS

En la prctica de extraccin para artculos de origen botnico, los componentes de inters se separan total o parcialmente
de los otros componentes con ayuda de agua, alcohol, mezclas de alcohol y agua u otros disolventes adecuados. El proceso de
extraccin implica la extraccin de los componentes deseados de la materia de origen vegetal con disolventes adecuados, la
evaporacin de todo o casi todo el disolvente y el ajuste de los lquidos, masas o polvos residuales a los estndares prescritos.
Se pueden agregar sustancias inertes adecuadas como vehculos o diluyentes para mejorar las caractersticas fsicas. Se pueden
agregar agentes antimicrobianos y otros conservantes adecuados para preservar la integridad. Los extractos pueden estar suje-
tos a procesos que aumentan el contenido de los componentes caracterizados, que disminuyan el contenido de componentes
no deseados, o ambos. Los extractos que no tienen sustancias inertes agregadas ni procesamientos ms all de la extraccin se
llaman extractos naturales. En algunas preparaciones, la materia de origen vegetal puede tener un tratamiento previo median-
te la inactivacin de enzimas y contaminantes microbianos, molienda, desengrasado o un procedimiento similar.
Los extractos se pueden definir como preparaciones con consistencia lquida, slida o semislida. Los productos obtenidos
mediante extraccin son extractos lquidos, extractos en polvo, extractos semislidos y tinturas.

MTODOS DE EXTRACCIN

Percolacin

En la fabricacin de extractos, la percolacin es un mtodo comnmente usado. El material sin refinar a extraer se reduce a
trozos de un tamao adecuado, si fuera necesario, luego se mezcla bien con una porcin del disolvente especificado y se deja
en reposo durante aproximadamente 15 minutos. La mezcla se transfiere a un percolador, se agrega una cantidad suficiente
del disolvente especificado para cubrir toda la masa slida y se deja percolar la mezcla lentamente (a una velocidad no mayor
de 1 mL por minuto por 1000 g de material), manteniendo la materia a extraer siempre recubierta con una capa de disolvente.
El residuo se puede prensar y el lquido obtenido se combina con el percolado. Los percolados totales se concentran, general-
mente por destilacin a presin reducida, a fin de someter los contenidos de inters en el artculo bajo extraccin al menor
calor posible.

Maceracin

A menos que se especifique algo diferente, el material crudo a extraer se reduce a trozos del tamao adecuado, se mezcla
bien con el disolvente de extraccin especificado y se deja en reposo a temperatura ambiente en un recipiente cerrado durante
un tiempo adecuado, agitando frecuentemente hasta que la materia soluble se disuelva. La mezcla se filtra, la materia insoluble
se lava con el mismo disolvente usado para la maceracin y los filtrados se combinan y concentran, por lo general a presin
reducida, hasta lograr la consistencia deseada.

Cambio en la redaccin:

PREPARACIONES

Extractos Lquidos

Los EXTRACTOS LQUIDOS son preparaciones de materia de origen vegetal que contienen alcohol como disolvente o como con-
servante, o ambos, y estn hechos de forma que cada mL contiene los componentes extrados de 1 g del material crudo que
representa, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. Se pueden preparar a partir de extractos
adecuados y pueden contener conservantes antimicrobianos o de otro tipo que sean adecuados.
Los extractos lquidos farmacopeicos se producen por percolacin, a menudo despus de un perodo de maceracin. El di-
solvente requerido se especifica en la monografa individual. El procedimiento de fabricacin comn incluye la concentracin
de las porciones ms diluidas de percolado por evaporacin o destilacin al vaco a temperaturas por debajo de 60. El tiempo
de maceracin y la velocidad de flujo durante la percolacin se pueden modificar para ajustarlos a la cantidad y naturaleza del
material sin refinar que se extrae, siempre que la composicin de los componentes de inters extrados no se altere negativa-
mente.
La velocidad de flujo del percolado puede ser lenta, moderada o rpida. Con referencia a la extraccin de 1000 g del mate-
rial inicial, a una velocidad lenta, no se produce ms de 1 mL de percolado por minuto; a una velocidad moderada, se produ-
cen entre 1 y 3 mL por minuto; y a una velocidad rpida, se producen entre 3 y 5 mL por minuto. Los extractos lquidos que
tienden a depositar sedimentos se pueden dejar en reposo por un tiempo y luego filtrar, o se puede decantar la porcin trans-
parente, siempre que el lquido transparente resultante cumpla con las normas de la Farmacopea.
USP 39 Pruebas Qumicas/ (565) Extractos Botnicos 433

Extractos en Polvo

Los EXTRACTOS EN POLVO son preparaciones slidas que tienen una consistencia polvorienta obtenida por evaporacin del di-
solvente usado para la extraccin. Pueden contener sustancias adecuadas agregadas, como por ejemplo excipientes, estabili-
zantes y conservantes. Los extractos en polvo estandarizados se ajustan al contenido definido de componentes, usando mate-
riales inertes adecuados o un extracto en polvo de la materia de origen vegetal usada para la preparacin. Cuando correspon-
da, se especifica un lmite para el disolvente en la monografa individual.

Extractos Semislidos

Los EXTRACTOS SEMISLIDOS, tambin conocidos como extractos blandos o extractos pilulares, son preparaciones que tienen
una consistencia entre la de los extractos lquidos y la de los extractos en polvo y se obtienen por evaporacin parcial del disol-
vente, agua, alcohol o mezclas hidroalcohlicas usadas como disolventes de extraccin. Pueden contener conservantes antimi-
crobianos o de otro tipo que sean adecuados. Un extracto semislido y un extracto en polvo obtenidos del mismo material son
intercambiables como frmacos o complementos, pero cada uno tiene sus propias ventajas.

Requisitos Farmacopeicos Generales

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, los requisitos Farmacopeicos para los extractos lqui-
dos, extractos en polvo y extractos semislidos son los siguientes.
Envasado y Almacenamiento-Almacenar en envases impermeables resistentes a la luz. [NOTA-Ver Conservacin, Envasa-
do, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.]
Etiquetado-Etiquetar indicando el nombre de la parte de la planta usada, el nombre de los disolventes, con excepcin de
los disolventes hidroalcohlicos, usados en la preparacin, el contenido, en porcentaje, de los principios activos o compuestos
marcadores identificados en la monografa individual, y el nombre y la concentracin de cualquier conservante antimicrobiano
o de otro tipo. Cuando se desconocen los principios activos, se declara la relacin entre el material inicial y el producto final.
Para los extractos semislidos y extractos en polvo, se indica la identidad y la cantidad de todos los excipientes agregados. En
tales casos, se puede declarar el porcentaje de extracto natural.
Residuo de Evaporacin-Transferir rpidamente aproximadamente 2 mL, determinados con exactitud, de Extracto Lqui-
do, aproximadamente 0,5 g de Extracto en Polvo, o aproximadamente 2 g de Extracto Semislido a un matraz de fondo re-
dondo tarado adecuado. Evaporar hasta sequedad en un bao de agua y secar el residuo entre 100 y 105 durante 3 horas.
Dejar que se enfre en un desecador sobre pentxido de fsforo y determinar el peso del residuo obtenido: no menos del 95%
de la muestra de Extracto en Polvo permanece como residuo; o no menos del 70% de la muestra de Extracto Semislido per-
manece como residuo. [NOTA-Los lmites para los Extractos Lquidos se especifican en las monografas individuales.]
Disolventes Residuales-Si se prepara con disolventes que no sean alcohol, agua o mezclas de alcohol y agua, cumplen
con los requisitos para Disolventes Residuales (467). [NOTA-Ver en el documento de la ICH Impurezas: Disolventes Residuales
para obtener informacin relacionada.]
Residuos de Plaguicidas-Los extractos botnicos, tinturas u otras formas farmacuticas pueden contener residuos de pla-
guicidas a niveles elevados o bajos en comparacin con su forma nativa como material botnico. A menos que se indique de
otro modo en la monografa individual, los lmites para plaguicidas en extractos de artculos botnicos se calculan mediante la
siguiente frmula:
Si ES: 1O: Lmite (mg/kg) = L x E
Si E> 1O: Lmite (mg/kg) = AM/1008
donde L es el lmite en el artculo original segn se lista en la Tabla 4 (ver Anlisis de Residuos de Plaguicidas en Artculos de
Origen Botnico (561 )), o la tolerancia admitida por la EPA o el nivel de accin aprobado por la FDA; E es la relacin entre
material botnico y extracto (es decir, la relacin entre la cantidad de artculo botnico usado en la fabricacin del extracto y la
cantidad del extracto obtenido); A es la ingesta diaria admisible (IDA), conforme a lo publicado por la FAO-OMS, en mg/kg de
peso corporal; Mes el peso corporal, en kg (60 kg); y Bes la dosis diaria del extracto, en kg.
NOTA-Se pueden justificar lmites ms altos de pesticidas para extractos usados como ingredientes botnicos si la ingesta o
dosis sugerida de extracto se reduce por un factor que sea mayor que E.
Se puede otorgar una exencin parcial o total de la prueba cuando se conoce el historial completo (naturaleza y cantidad de
pesticidas usados, fecha de cada tratamiento durante el cultivo y despus de la cosecha) del tratamiento de la partida y ste
puede verificarse con precisin de acuerdo con las buenas prcticas agrcolas y de recoleccin (GACP, por sus siglas en ingls).
'1Bgflill:illlill!l1Mlllll\Rl.l!lmlilmllllrl (si estuviera presente): Entre 90% y 110% de la cantidad de-
clarada en la etiqueta de C2 H50H se encuentra en Extracto Lquido y Extracto Semislido.
434 (565) Extractos Botnicos/ Pruebas Qumicas USP 39

Tinturas
Las TINTURAS son preparaciones lquidas, por lo general preparadas por extraccin de materia vegetal con alcohol o mezclas
hidroalcohlicas. Tradicionalmente, las tinturas de artculos potentes de origen botnico representan la actividad de 1Og del
frmaco en 100 mL de tintura, ajustndose la concentracin despus de la prueba para ajustar el contenido de principios acti-
vos o compuestos marcadores. La mayora de las dems tinturas vegetales representan 20 g de la respectiva materia vegetal en
100 mL de tintura.
Las diferentes tinturas no siempre se diluyen para obtener la misma relacin de materia vegetal inicial con la tintura final.
Esta relacin depende de los requisitos indicados en las pruebas especficas para contenido de principios activos o de compues-
tos marcadores incluidos en las monografas individuales. A medida que se preparan las tinturas, se valoran de acuerdo con
estas pruebas de contenido. Utilizando los valores obtenidos a partir de tales valoraciones, la concentracin final de una tintura
se ajusta agregando ms disolvente o evaporndolo parcialmente.
A menos que se especifique algo diferente, las tinturas generalmente se preparan a partir de polvo grueso o cortes finos de
materia vegetal, ya sea mediante un proceso de percolado o un proceso de maceracin.

PROCESO DE PERCOLACIN

Mezclar cuidadosamente la mezcla de ingredientes molidos con una cantidad suficiente del disolvente de extraccin indica-
do para humedecerlo de forma completa y uniforme, dejar en reposo durante 15 minutos, trasladar la mezcla a un percolador
adecuado y compactar la masa con firmeza. Verter una cantidad suficiente del disolvente de extraccin indicado para saturar el
material a extraer y cubrir la parte superior del percolador. Cuando el lquido est a punto de gotear, cerrar el orificio inferior y
dejar macerar durante 24 horas o durante el tiempo especificado en la monografa. Si la monografa individual no requiere
prueba de contenido de principios activos o compuestos marcadores, dejar que la percolacin proceda lentamente o a la velo-
cidad indicada (ver definiciones de velocidad de flujo en Extractos Lquidos), agregar gradualmente una cantidad suficiente de
disolvente para producir 1000 mL de tintura y mezclar. Si se requiere una prueba de principios activos o compuestos marcado-
res, recolectar slo 950 mL del percolado, mezclar y analizar una porcin segn se indica en la monografa individual. Diluir el
resto del percolado con la cantidad de disolvente de extraccin que indique la prueba de contenido que es necesaria para
producir una tintura que cumple con los requisitos y mezclar.

PROCESO DE MACERACIN

Macerar el material a extraer con 750 mL del disolvente de extraccin indicado en un recipiente cerrado y colocar en un
lugar tibio. Agitarlo con frecuencia durante 3 das o hasta que el material soluble se disuelva. Transferir la mezcla a un filtro.
Cuando se haya filtrado la mayor parte del lquido, lavar el residuo sobre el filtro con una cantidad suficiente del disolvente de
extraccin indicado, combinar los filtrados para producir 1000 mL de tintura y mezclar.

REQUISITOS FARMACOPEICOS GENERALES

A menos que se especifique algo diferente en las monografas individuales, los requisitos Farmacopeicos para las tinturas son
los siguientes.
Envasado y Almacen.amiento-Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz y protegerlos de la exposicin a
la luz solar directa y al calor excesivo. [NOTA-Ver Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requi-
sitos Generales.]
Etiquetado-Declarar en la etiqueta el nombre de la parte de la planta usada para la preparacin, el nombre del disolvente
o de la mezcla disolvente usada para la extraccin, el contenido de los componentes de inters y la relacin entre el material
inicial y el producto final.

(571) VALORACIN DE VITAMINA A

Cambio en la redaccin:

MTODOS QUMICOS
Procedimiento 1
El siguiente procedimiento se utiliza para la determinacin de vitamina A en ingredientes dietticos o ingredientes farmacu-
ticos. Cumple con el procedimiento adoptado en 1956 para uso internacional por la lnternational Union of Pure and Applied
Chemistry (Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada).
USP 39 Pruebas Qumicas/ (571) Valoracin de Vitamina A 435

Realizar la valoracin sin demora y tomar precauciones a lo largo del procedimiento para reducir al mnimo la exposicin a la
luz actnica y al oxgeno atmosfrico y otros agentes oxidantes, usando preferentemente material de vidrio con proteccin ac-
tnica y una atmsfera de gas inerte.
Para los artculos de prueba que contienen tocoferol, se debe usar un mtodo cromatogrfico apropiado.
Solucin muestra: Pesar, contar o medir con exactitud una porcin de la muestra de prueba, que se espera contenga el
equivalente a no menos de O, 15 mg de retinol, pero que no contenga ms de 1 g de grasa. Si se presenta en forma de cpsu-
las, tabletas u otro slido, de modo que no se puede saponificar de manera eficiente segn las instrucciones descritas a conti-
nuacin, someter a reflujo la porcin tomada en 1 O ml de agua en un bao de vapor durante aproximadamente 1 O minutos,
triturar el slido remanente con una varilla de vidrio de punta roma y entibiar durante aproximadamente 5 minutos ms.
Transferir a un matraz de vidrio de borosilicato adecuado y agregar 30 ml de alcohol, seguidos por 3 ml de solucin de
hidrxido de potasio (9 en 1O). Someter a reflujo en un aparato que sea completamente de vidrio de borosilicato durante 30
minutos. Enfriar la solucin, agregar 30 ml de agua y transferir a un separador cnico. Agregar 4 g de sulfato de sodio decahi-
drato reducido a polvo fino. Extraer agitando con una porcin de 150 ml de ter durante 2 minutos y luego, si se forma una
emulsin, con tres porciones de 25 ml de ter. Combinar los extractos etreos, si fuera necesario, y lavar agitando por rota-
cin suave con 50 ml de agua. Repetir el lavado de manera ms vigorosa con tres porciones adicionales de 50 ml de agua.
Transferir el extracto etreo lavado a un matraz volumtrico de 250 ml, agregar ter a volumen y mezclar.
Evaporar una porcin de 25,0 ml del extracto etreo hasta aproximadamente 5 ml. Sin aplicar calor y con ayuda de una
corriente de gas inerte o vaco,continuar la evaporacin hasta aproximadamente 3 ml. Disolver el residuo en un volumen de
alcohol isoproplico suficiente para obtener una concentracin esperada equivalente a 3 g-5 g de vitamina A por ml o para
obtener una absorbancia en el intervalo de 0,5-0,8 a 325 nm.
Condiciones instrumentales
~er!Jlllmlll~r~""~411r~lllrilri!til~lll~l~lll~I.)
Modo: UV
Longitudes de onda analticas: 31 O; 325 y 334 nm
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isoproplico
Anlisis
Muestra: Solucin muestra
Determinar las absorbancias de la Solucin muestra a 31 O; 325 y 334 nm. Calcular la vitamina A, como contenido de retino!
(C 20 H300), en mg, en la porcin de muestra tomada, usando una de las siguientes frmulas:
Resultado = (0,549 x A325 )/(L x C)
o
Resultado = (0,549 x [A 325 ])/(L x C)
L = longitud de la celda de absorcin (cm)
C = concentracin en la solucin final de alcohol isoproplico de la muestra de prueba (g/l 00 ml) o cpsulas o tabletas
(unidades/l 00 ml)
[A 325 ] = absorbancia corregida a 325 nm, calculada:
Resultado= (6,815 x A325 ) - (2,555 x A310 ) - (4,260 x A334 )
Cada mg de vitamina A, como retino! (C 20 H3o0), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.
Usar la primera frmula cuando A325, la absorbancia observada a 325 nm, est entre [A 325 ]/l ,030 y [A 325 ]/0,970. Usar la se-
gunda frmula cuando [A 325 ] tenga un valor menor que A325 /l ,030.
[NOTA-El intervalo de los lmites de error para este procedimiento analtico, en el que se indica el grado de discrepancia
que se puede esperar en los resultados de diferentes laboratorios a P = 0,05, es aproximadamente 8%.]
Procedimiento 2
Este procedimiento se usa para ingredientes dietticos o ingredientes farmacuticos en forma de steres de retinilo puro o
preparados a partir de steres de retinilo puro en un vehculo excipiente.
Solucin muestra: Disolver 25-100 mg, pesados con exactitud, en 5 ml de pentano y diluir con alcohol isoproplico has-
ta obtener una concentracin esperada equivalente a 3-4,5 g/ml de retinol.
Condiciones instrumentales
(Ver ,!fi~f~.~@lii';:1{,j~fl:~:~t?Jl~fl~11?'MJ~~it(~1~i1:\i1~~~~mf~.)
Modo: UV
Longitud de onda analtica: 326 nm
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isoproplico
Anlisis
Muestra: Solucin muestra
Calcular la vitamina A, como contenido de retino! (C 20 H300), en mg, en la porcin de muestra tomada:
436 (571) Valoracin de Vitamina A/ Pruebas Qumicas USP 39

Resultado= (0,570 x A326 )/(L x C)

A326 = absorbancia a 326 nm

L =longitud de la celda de absorcin (cm)
C = concentracin de la Solucin muestra (gil 00 ml)
Cada mg de vitamina A, como retinol (C 20 H300), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.

MTODOS CROMATOGRFICOS
Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se usan para la determinacin de vitamina A como un ingredien-
te farmacutico activo, como un ingrediente de suplemento diettico o como un componente de suplementos dietticos o de
medicamentos terminados.
A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmsfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan
de la muestra de prueba y de los Estndares de Referencia, usando preferiblemente una atmsfera de gas inerte y material de
vidrio con proteccin actnica.
Cuando se especifique una forma de ster de vitamina A (acetato de retinilo o palmitato de retinilo) en el siguiente procedi-
miento, usar la forma qumica presente en la formulacin y el Estndar de Referencia USP correspondiente.
Estndares de Referencia USP (11)
ER Acetato de Retinilo USP
ER Palmitato de Retinilo USP
Procedimiento 1
ste es un procedimiento neutro que implica simplemente la disolucin de la muestra directamente en hexano y su inyec-
cin en el cromatgrafo de lquidos o la extraccin de la muestra disolvindola primero en dimetil sulfxido, seguida por una
extraccin lquido-lquido de la vitamina A con hexano. Aunque su sistema cromatogrfico puede separar los ismeros 13-cis y
todo trans de vitamina A, nicamente se usa el pico del ismero todo trans para la cuantificacin de vitamina A. El procedi-
miento se puede usar para determinar la vitamina A en una materia prima, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, en Cpsulas
de Vitaminas Oleosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, en Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e
Hidrosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y en Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e
Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra y la Solucin de
aptitud del sistema se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano
Solucin estndar 1: 15 g/ml de retinol, 1 a partir de ER Acetato de Retinilo USP en n-hexano
Solucin estndar 2: 15 g/ml de retinol,2 a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en n-hexano
Solucin de aptitud del sistema: Mezclar volmenes iguales de Solucin estndar 1 y de Solucin estndar 2.
Solucin muestra para materias primas: Transferir acetato de retinilo o palmitato de retinilo, pesados con exactitud,
equivalente a 15 mg de retinol, a un matraz volumtrico de 100 ml, disolver y diluir con n-hexano a volumen y mezclar. Pipe-
tear y transferir 5,0 ml de esta solucin a un matraz volumtrico de 50 ml, diluir con n-hexano a volumen y mezclar.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, que no
exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), a un tubo de centrfuga con tapa de
rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfxido y aproximadamente 3 ml de
n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un bao de agua manteni-
do a 60. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa.]
Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumtrico. Agregar 3
ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5
minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones
adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta
solucin con n-hexano hasta obtener una solucin con una concentracin nominal de 15 g/ml de vitamina A, como retinol
(C 20 H30 0). [NOTA-Podra no ser necesaria la dilucin.]
Solucin muestra para Cpsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cpsulas a un recipiente adecuado, mezclar
y pesar. Transferir una porcin de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como
retinol (C 20 H300), a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.[NOTA-Para Cpsulas de
gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cpsulas, cortando las cubiertas de las Cpsu-
las para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado, y triturando hasta formar una masa ho-
mognea. Transferir una porcin de la masa, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retino! (C 20 H300), a un
tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.] Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfxi-
do y aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g de contenido de las Cpsulas y agitar durante 45 minutos en un agita-
dor en un bao de agua mantenido a 60. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle

1 Usar el valor de 0,872 para convertir acetato de retinilo en su equivalente de retinol.

2 Usar el valor de 0,546 para convertir palmitato de retinilo en su equivalente de retinol.
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (571) Valoracin de Vitamina A 437

de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a
un matraz volumtrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cpsulas a la capa de dimetil sulfxido,
agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir
esta extraccin con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volu-
men. Diluir un volumen de esta solucin con n-hexano hasta obtener una solucin con una concentracin nominal de 15
g/mL de vitamina A, como retino! (C20 H300). [NOTA-Podra no ser necesaria la dilucin.]
Sistema cromatogrfico
(yer Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 m
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyeccin: 40 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar 7 o Solucin estndar 2
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1O entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retini-
lo, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%, Solucin estndar 7 o Solucin estndar 2
Anlisis
Muestras: Solucin estndar 7 o Solucin estndar 2 y la Solucin muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retino! (C 20 H300), en la porcin de muestra tomada:
Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin muestra correspondiente
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin estndar 7 o la Solucin estndar 2
C5 = concentracin de retino! (C 20 H3o0) en la Solucin estndar 7 o la Solucin estndar 2 (g/mL)
Cu= concentracin de vitamina A, como retino! (C 20 H300), en la Solucin muestra (g/mL)
Procedimiento 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con cido sulfrico metanlico, seguido por extraccin con 2,2,4-
-trimetilpentano. La preparacin muestra se puede usar para la formulacin que contiene vitaminas A, D y E. La aplicacin in-
cluye Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolu-
bles, Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra, la Solucin de
aptitud del sistema y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano y acetato de etilo (99,7: 0,3)
Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de cido sulfrico a 80 mL de metanol en
un matraz volumtrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metano! a volumen.
Solucin de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volum-
trico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de cido sulfrico y diluir con agua a volumen.
Solucin de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin estndar 1: 15 g/mL de retinoP, a partir de ER Acetato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin estndar 2: 15 g/mL de retinol 2, a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin de aptitud del sistema: Mezclar volmenes iguales de Solucin estndar 7 y de Solucin estndar 2.
Solucin muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porcin del polvo
nominalmente equivalente a una cantidad entre 0,4 mg y 2,5 mg retino!. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de
Solucin de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de
ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya ce-
sado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico
metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5
mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 1O minutos.
Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsin y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario,
diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la
de la Solucin estndar.
Solucin muestra para Cpsulas: [NOTA-Esta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una
438 (571) Valoracin de Vitamina A/ Pruebas Qumicas USP 39

cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el conteni-
do a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando
con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire
seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cp-
sulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 2,5 mg de la cantidad declarada de vitamina A, co-
mo retinol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 ml de Solucin de lecitina y 12,5 ml de 2,2,4-trimetilpentano y disper-
sar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 ml de Solucin de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solu-
cin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicio-
nales. Agregar 6 ml de dimetil sulfxido, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12
minutos. Agregar 6 ml de Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una sus-
pensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 ml de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta
formar una suspensin y agitar durante 1 O minutos. Centrifugar durante 1 O minutos para romper la emulsin y para que el
sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trime-
tilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la de la Solucin estndar.
Sistema cromatogrfico
(yer Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 m
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Volumen de inyeccin: 40 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 8,0 entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retini-
lo
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar 7 o Solucin estndar 2 y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la porcin de muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru =respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin muestra
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin estndar 7 o la Solucin estndar 2
C5 = concentracin de retinol (C20 H300) en la Solucin estndar 7 o la Solucin estndar 2 (g/ml)
Cu= concentracin nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solucin muestra (g/ml). [NOTA-Usar 26,5 ml
como el volumen final de la Solucin muestra para calcular la concentracin nominal.]
Procedimiento 3
Este procedimiento emplea la saponificacin del estndar y de la muestra, seguida por una extraccin lquido-lquido de
vitamina A a partir de la muestra con una mezcla de n-hexano y cloruro de metileno (3: 1). Se pueden caracterizar y cuantificar
los ismeros 13-cis y todo trans de vitamina A. El procedimiento se puede usar para Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cp-
sulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hi-
drosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidro-
solubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, las Soluciones muestra y las soluciones
reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano y alcohol isoproplico (92:8)
Disolvente de extraccin: n-Hexano y cloruro de metileno (3:1)
Solucin de hidrxido de potasio: 800 mg/ml de hidrxido de potasio en agua. [NOTA-Agregar cuidadosamente el hi-
drxido de potasio al agua. Mezclar y enfriar.]
Diluyente: 1O mg/ml de pirogalol en alcohol
Solucin estndar: Diluir ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo USP con Diluyente hasta obtener una con-
centracin de 8,5 g/ml de retino11,2 (C 20 H3p). Transferir 10,0 ml de esta solucin a un matraz de 125 ml con tapn y agre-
gar 5 ml de agua, 5 ml de Diluyente y 3 ml de Solucin de hidrxido de potasio. Ajustar bien el tapn, agitar durante 15 minu-
tos sobre un bao de agua mantenido a 60 5 y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disol-
vente de extraccin. Ajustar bien el tapn y agitar vigorosamente durante 60 segundos. Enjuagar las paredes del matraz con 60
ml de agua y dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen. Retirar una porcin de la capa orgnica para
inyectarla en el cromatgrafo. Esta Solucin estndar contiene 3,4 g/ml de retinol.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adhe-
rido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las
USP 39 Pruebas Qumicas/ (571) Valoracin de Vitamina A 439

Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y
calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 1,3 mg
de retinol, a un matraz de 125 ml con tapn. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de Solucin de hidrxido de
potasio. Ajustar bien el tapn, agitar durante 15 minutos sobre un bao de agua mantenido a 60 5 y enfriar a temperatura
ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extraccin. Ajustar bien el tapn y agitar vigorosamente durante
60 segundos, o ms si fuera necesario, para completar la extraccin. Enjuagar las paredes del matraz con 60 ml de agua y
dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No agitar porque podra formarse una emulsin.]
Retirar una porcin de la capa orgnica y diluir cuantitativamente, y en diluciones sucesivas si fuera necesario, con Disolvente
de extraccin para obtener una concentracin de 3,4 g/ml de retinol.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino un nmero contado de Tabletas. Transferir una porcin del polvo,
equivalente a 1,3 mg de retinol, a un matraz de 125 ml con tapn. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de
Solucin de hidrxido de potasio. Tapar hermticamente, agitar durante 15 minutos sobre un bao de agua mantenido a 60 5
y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extraccin. Ajustar bien el tapn y agitar
vigorosamente durante 60 segundos, o ms si fuera necesario, para completar la extraccin. Enjuagar las paredes del matraz
con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No agitar porque podra
formarse una emulsin.] Retirar una porcin de la capa orgnica y diluir con Disolvente de extraccin para obtener una concen-
tracin de 3,4 g/ml de retinol.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 335 nm
Columna: 6,2 mm x 8 cm; relleno L3
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: 4 ml/min
Volumen de inyeccin: 50 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C20 H30 0), en la porcin de muestra tomada:
Resultado= (rnlrr2 ) x (C5/Cu) x 100
rn = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de ster de retinilo y 13-cis de ster de retinilo de la
Solucin muestra
rr2 = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de ster de retinilo y 13-cis de ster de retinilo de la
Solucin estndar
C5 = concentracin de retinol (C 20 H300) en la Solucin estndar (g/ml)
Cu= concentracin nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solucin muestra (g/ml)
Procedimiento 4
Este procedimiento emplea una extraccin lquido-lquido de vitamina A a partir de la muestra con hexano, seguida por la
evaporacin de hexano y la reconstitucin del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1 ). Se puede usar
para la determinacin de vitamina A en la Solucin Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles y la Solucin Oral de Vita-
minas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y el Diluyente se prepa-
ran segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1)
Solucin estndar: 0,33 mg/ml de retinoP, 2 (C 20 H30 0), a partir de ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo
USP en Diluyente
Solucin muestra para formas farmacuticas lquidas: Transferir un volumen medido con exactitud de Solucin Oral,
equivalente a 3,3 mg de retinol, a un embudo de separacin de 500 ml que contenga 1 O ml de agua y 20 ml de alcohol
deshidratado. Agregar 150 ml de ter de petrleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 ml de ter de petrleo,
tapar, agitar y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y filtrar el extracto de ter de petrleo en un matraz de
fondo redondo de 500 ml a travs de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solucin hasta sequedad con ayuda de un evapora-
dor rotatorio sobre un bao de agua mantenido a aproximadamente 65. Agregar inmediatamente 10,0 ml de Diluyente, agi-
tar por rotacin suave hasta disolver el residuo y filtrar.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
440 (571) Valoracin de Vitamina A/ Pruebas Qumicas USP 39

Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 50 cm (dos columnas concatenadas de 4,6 mm x 25 cm cada una); relleno L1
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 5,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la porcin de muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin muestra
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin estndar
C5 = concentracin de retinol (C 20 H300) en la Solucin estndar (g/ml)
Cu= concentracin nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la Solucin muestra (g/ml)

Agregar lo siguiente:

1.(580) VALORACIN DEVITAMINA C

INTRODUCCIN
Los siguientes procedimientos se proveen para llevar a cabo el anlisis de d.iferentes formas de vitamina C como cido ascrbi-
co (C 6H80 6), ascorbato de sodio (C 6 H7 Na0 6) y ascorbato de calcio dihidrato (C 12H14Ca012 2H 2 0) o sus mezclas en formas
farmacuticas terminadas, tales como Cpsulas, Tabletas o Soluciones Orales.
MTODO 1-MTODO VOLUMTRICO
PROCEDIMIENTO
A menos que se especifique de otro modo en la mnograf iridvidual, proceder segn se indica a continuacin.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cps4las en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de. precipitados de 100 mL. Retirar todo el contenido
adherido a las cumertas de las Cpsulas vacas lavando, si fL:ieta. necesario; con v.arlas poriones de ter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una ~orriente de aire .seco .hasta que deje de percibirse el olor a
ter. Pesar las cubertas de las cpsulas vacas en elfrasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cpsula.
Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a. l.00 mg de cido. ascrbko, a un matraz volumtrico
de .200 ml y agregar 75 ml de cido metafosfrico.:-cido actico SR. Tapar el matraz y agitar mecnicamente dt1rantce 30
minutos. Diluir con agua a volumen.
Solucin muestra para Soluciones Orales: Transferir un volumen de Solucin Oral equivalente a 50 mg de cido ascr-
bico, previamente diluido con agua si fuera necesarid, a un matraz volumtrico de i 00 ml. Agregar 20 ml ae cido me-
tafo:Sfric~cido actico SR, diluir con agua a volmen y mezclar,
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino rlo menos de :lo Tabletas. Transferir una porcin del polvo equi-
valente a 100 mg de cido ascrbico, a un matraz volumtrico de 200 mL y agregar 75 ml de cido metafosfrico-cido
actico SR. Tapar ef matraz y agitar mecnicamente durante 30 minutos. Diluir con agua a volumen.
Blanco: Una mezcla ae 5,5 ml de cido metafosfri.co-ddo actico SR y 15ml de agua
Sistema volumtrico
(Ver Volumetra (541 ).)
Modo: Valoracin directa
Solucin volumtrica: Solucin estndar de diclorofenol-indofenol SV
Deteccin del punto final: Visual
Anlisis: Transferir una porcin de ta Solucin muestra a un tubt;i de centrfuga y entrifugar hasta obtener un sobrena-
dante transparente. Transferir un v.C>Jutnehde la Solucin muestra, equivalente a 2 mg de cido ascrbico a un matraz Er
tenmeyer de 50 mLyagregar 5mLde cido metafsfrico-cido actio SR. Valorar con SolU<;n volumtrica hasta un
color rosceo que persista dur<1nte al menos 5 segundos. C:orregir por el volumim ae ~oM;in volumtrica tonsumido por
el Blanco.
Calcular el porcentaje de ddo ascrbico (C 6H80 6)en la porcin de muestra tomada:
Resultado = {[(V5 - V8) x F)/W} x 100
USP 39 Pruebas Qumicas/ (580) Valoracin de Vitamina C 441

V5 = volumen. de Solucin volumtrica consumido por I(} Solucin muestra (ml)

V8 =volumen de Solucin vofumtrica consumidoporel8/anco
F = concentracin. de. Solucin volumtrica en trrninosde su equivalente de. cido ascrl:i.ito (mglml)
W = cantidad nominal de cido ascrbico tomada para el Anlsis(mg)
MTODO 11-MTODO CROM.ATOGRflCO
PllCEDIMU:NTO 1
A menos que se especifique de otro modo en las monografas individuales, preparar el Diluyente, la So/fJcin estndar y ls
Soluciones muestra segn se indita a continuacin.
[NOTA:.:....Proteger las muestras del aire, de fa luz y del calor.]
Solucinarnortiguadora: 2,04g/L de fosfato monobsico de potasio en.agua.Ajustar concidofosfrko.a Un pH de
3,o.
Fase mvil: Solucin amortiguadora
Diluyente: Oi59 g de edetato di sdico dihidrato y 2,04.g defosfato monotisito de potaS[ prlOOO mi:. d agua. jjjs-
tar con cidofosfricoun pHde3,0.
SoluciQn ~stnciar: 0,25 mg/mL de ER cido Ascrli:>ico U$P eri. Dluyent~
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no rnenos de 20 Cpsulas en n frasco de pesada tarado, Abrirl<!s Cpsul(ls, sin
perder el material de l cubierta, y transferir et contenido a un vaso de preC::ipit<ldos de 100 m~. 8etitar todo. e! C::ontenidc>
<!dherido a las cubiertas de las ('.psulas vacas lavando, sifu.E!ra 11eces<:1tio con varias rx;>rciories de.ter; Qesechar los.1<:1va-
dosy secar las q.1biertas de.la$ Cpsulas con ayuda de una C:::or:rientede. aire se.e;<> hasta que deje depercibirse el olor a
ter.Pesarlas .cubiertas.delas cpsulas vacas enel frasco de pesada tar;,tcio y calcular. el peso neto promedioporCpsula.
Transferir una porcin del conten1dodelas.Cpslllas, .equivalente a aprxirndame.nfo 25m9 de ()idt) ascrbico, a up
matraz volumtrico de TOO mL Agregar .60IT\L de Diluyente, agitar mecni<:amente dl!rantel$JT!Inufos, di.l1;1ir cpn [)ilu-
yentea vot!imen, mezclar bien y pa~at a travs de un fttode membrana con un Jama fo de pqro de 0,45 !il, desechan-
do lo~ primeros 4mL.
Sludnmuestra para Solucines Orales: Diluir un volumen medido con exactitud .de Solud()n Oral con Diluyentehas-
ta obtener ura solucin con una concentracin de 0,25 mg/ml de cido ascprbico. Mezclar:con <;.:uidado.
Solucin muestr para Tablet;s: Transferir a Un.matraz Y<:>lumtrico de.loo .r'tll una pordn.de no mnosde 20 Table-
tas . reducidas a. polvo fino, que equivalga norninalmnte a aproxirnadafl1etite 2Smg de>cic!o ascrqiCO; Agregar 60 m L
de. Diluyente, agitar. mecnicamente durante 15 minutos, .diluir con Diluyente a volumen, rnez:dart>en y pasar a trav~s de
un filtro de membrana con 1;1n tamao de poro de 0,45 m, desec::hando>ls prlmems4 rnt.
Sl$tema cromatogrfico
(Ver (;romatografa \621 ),. Aptitud del Sistema.}
Modo: HPLC
Detector: UV 245 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno Ll de 5 m
Velocidad de Flujo: l,0 ml/min
Vt>frnen de inyeccin: 5 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de vitamina C, como cido ascrbico (C6 H80 6)en la porcin de rnue$tra tom<ida:
Resultado;::: (ruf r5) x (CsfCv} x 100
ru = rea del pico d cido .ascrbico de la Solucin..muestra
r5 "" rea del pico de cido ascrbieo de la Solucf6n estndar
C5 = concentracin de ER cido Ascrbico USP en ta Solucn estndar (mg/mL)
Cu =concentracin nominal de cido ascrbico en la Solucin muestra (mg/ml)
PROCEDIMIENTO 2
A menos que se especifique de otro rnodo en las monografas individuales, preparar efDifuyente, la Sll.lclonestndary las
Soluciones muestra segn se indicaacontinuacin.
[NOTA-Proteger las muestras del aire, de la luz y del calor. Todas las muestras preparadas deben anali?arse c!en.tro deJas4
horas.]
Solucin amortiguadora: 7,8 g/Lde fosfato dicido de sodio dhidrato en agua. Ajustar con ddofosfricO a>unpHde
2,5.
Fase mvil: Solucin amortiguadora y metano!. Ver la Tabla 7 para gradiente.
442 (580) Valoracin de Vitamina C / Pruebas Qumicas USP 39

Tabla 1
Tiempo Solucin amortiguadora Metano!
(mln) ("lo) (O/o)
o 100 o
3 100 o
s o 100
6 so so
7 100 o
10 100 o
Diluyente: Disolver 73 g de cido metafosfrico en 800 ml de agua, agregar 84 ml de cido actico glacial y diluir con
agua hasta 1000 ml.
Solucin madre del estndar: 1 mg/ml de ER cido Ascrbico USP en Dluyente. [NOTA-Si fuera necesario, someter a
ultrasonido con agitacin intermitente para facilitar la disolucin. Preparar en el momento de su uso.]
Solucin estndar: Diluir Solucin madre del estndar con Diluyente hasta obtener una solucin que contenga 0,05
mg/mL de ER cido Ascrbico USP.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cpsulas vacas lavando, si fuera necesario, con varias porciones de ter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a
ter. Pesar las cubiertas de las cpsulas vacas en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cpsula.
Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a aproximadamente 25 mg de cido ascrbico, a un
tubo de centrfuga de 50 ml. Agregar 25,0 ml de Diluyente, someter a ultrasonido durante 15 minutos y centrifugar a
aproximadamente 2000 rpm durante 5 minutos. Diluir cuantitativamente el sobrenadante transparente con Diluyente has-
ta obtener una solucin que contenga 0,05 mg/ml de cido ascrbico. Mezclar y pasar la solucin a travs de un filtro de
membrana con un tamao de poro de 0,45 m.
Solucin muestra para Soluciones Orales: Diluir un volumen medido con exactitud de Solucin Oral con Diluyente has-
ta obtener una solucin con una concentracin de 0,05 mg/ml de cido ascrbico. Mezclar con cuidado.
Solucin muestra para Tabletas: Transferir una porcin a partir de no menos de 20 Tabletas molidas, que equivalga no-
minalmente a aproximadamente 25 mg de cido ascrbico, a un tubo de centrfuga de 50 ml. Agregar 25,0 rnL de Dilu-
yente, someter a ultrasonido durante 15 minutos y centrifugar a aproximadamente 2000 rpm durante 5 minutos. Diluir
cuantitativamente el sobrenadante transparente con Diluyente hasta obtener una solucin que contenga 0,05 mg/ml de
cido ascrbico. Mezclar y pasar la solucin a travs de un filtro de membrana con un tamao de poro de 0,45 m.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 )1 Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 245 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L7 de 3,5 m
Velocidad de Flujo: 0,8 ml/min
Volumen de inyeccin: 1O L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de vitamina C, como cido ascrbico {C6 H8 0 6) en la porcin de muestra tomada:
Resultado= (rulrs) x (C5/Cu) x 100
ru == rea del pico de cido ascrbico de la Solucin muestra
r5 = rea del pico de cido ascrbico de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER cido Ascrbico USP en la Solucin estndar (mg/ml)
Cu =concentracin nominal de cido ascrbico en la Solucin muestra (mg/ml)
REQUISITOS ADICIONALES
ESTNDARES DE REFERENCIA USP {11)
ER cido Ascrbico USP
AUSP39
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (581) Valoracin de Vitamina D 443

(581) VALORACIN DE VITAMINA D

MTODOS CROMATOGRFICOS

Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se usan para la determinacin de vitamina D como ingrediente
farmacutico activo, como ingrediente de suplemento diettico o como componente de formas farmacuticas farmacopeicas.
Durante toda esta valoracin, proteger de la atmsfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
Estndar de Referencia y las que deriven de stos, usando preferentemente una atmsfera de gas inerte y material de vidrio
con proteccin actnica.
Cuando se especifique vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) en el siguiente procedimiento, usar la forma qumica pre-
sente en la formulacin y el Estndar de Referencia USP pertinente.
Estndares de Referencia USP (11)
ER Colecalciferol USP
ER Ergocalciferol USP
ER Aptitud del Sistema de Valoracin de Vitamina O USP
Procedimiento 1
Este procedimiento usa una preparacin de la muestra sin ajuste de pH y conlleva el uso de dimetil sulfxido para disolver
los excipientes en la muestra, seguido por una extraccin lquido-lquido de la vitamina D con hexano. La separacin cromato-
grfica se logra usando modo de fase normal sobre una columna L8. Se puede usar para determinar vitamina D sola o en com-
binacin con otras vitaminas y minerales en formas farmacuticas farmacopeicas.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y la Solucin de aptitud
del sistema se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano y alcohol isoproplico (99:1)
Solucin estndar: 2 g/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en n-hexano
Solucin de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solucin estndar a 60 durante 1 hora para isomerizar parcial-
mente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, que no
exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrfu-
ga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfxido y aproximada-
mente 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un bao de
agua mantenido a 60. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa
y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1 O minutos y transferir la capa de hexano
con una pipeta a un matraz volumtrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de
dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz
volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico
con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solucin con n-hexano hasta obtener una solucin con una concentracin
de 2 g/mL de colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podra no ser necesaria la dilucin.]
Solucin muestra para Cpsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cpsulas a un recipiente adecuado, mezclar y
pesar. Transferir una porcin de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D, como
colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. [NOTA-Para
Cpsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cpsulas cortando las cubiertas de
las Cpsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y triturando hasta formar una
masa homognea. Transferir una porcin de la masa, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D, como colecalciferol o
ergocalciferol, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.] Agregar aproximadamente 2
mL de dimetil sulfxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cpsulas y agitar durante 45
minutos en un agitador en un bao de agua mantenido a 60. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del
recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1 O
minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumtrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de
contenido de las Cpsulas a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de he-
xano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir
los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solucin con n-hexano hasta obte-
ner una solucin con una concentracin de 2 g/mL de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podra no ser
necesaria la dilucin.]
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 m
Velocidad de flujo: 1 mL/min
444 (581) Valoracin de Vitamina D /Pruebas Qumicas USP 39

Volumen de inyeccin: 100 L

Aptitud del sistema
Muestras: Solucin estndar y Solucin de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1O entre la forma presente de vitamina D y su precursor correspondiente, Solucin de aptitud del
sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%, Solucin estndar
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porcin de mues-
tra tomada:

Resultado= Crufr5) x (C5/Cu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar (g/mL)
Cu= concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (g/mL)
F= factor de correccin que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solucin
muestra, 1,09
Procedimiento 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con bicarbonato de sodio, una solucin cida antioxidante que ge-
nera la emisin de gas; lecitina como surfactante; y dimetil sulfxido, seguido por cido sulfrico metanlico para crear una
dispersin y extraer de manera eficiente la vitamina D de los componentes de la matriz en la fase de 2,2,4-trimetilpentano. La
separacin se logra en un modo de fase normal sobre una columna L24. La preparacin muestra y el Sistema cromatogrfico
usados en este procedimiento tambin son adecuados para determinar vitamina A y E cuando se encuentran presentes en la
formulacin; los analistas deben realizar los ajustes correspondientes en el tamao de la muestra y longitud de onda de detec-
cin.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra, la Solucin de aptitud
del sistema y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano y alcohol butlico terciario (98,75: 1,25)
Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de cido sulfrico a 80 mL de metanol en un
matraz volumtrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metanol a volumen.
Solucin de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1 Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumtrico
de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de cido sulfrico y diluir con agua a volumen.
Solucin de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin estndar: 1 g/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solucin estndar a 60 durante 1 hora para isomerizar parcial-
mente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solucin muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D y
vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porcin del polvo
nominalmente equivalente a una cantidad de no menos de O, 1 mg de vitamina D. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5
mL de Solucin de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin
de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya
cesado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico
metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5
mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 1O minutos.
Centrifugar durante 1 O minutos para romper la emulsin y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario,
diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la
de la Solucin estndar.
Solucin muestra para Cpsulas: [NOTA-Esta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D y
vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una
cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el conteni-
do a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando
con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire
seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cp-
sulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a no menos de O, 1 mg de la cantidad declarada de
vitamina D, como colecalciferol o ergocalciferol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solucin de lecitina y 12,5
mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de ascorbato de sodio-pirogalol,
USP 39 Pruebas Qumicas/ (581) Valoracin de Vitamina D 445

agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisin de gases y
luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un mezclador de vrtice hasta
formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N, mezclar en un
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano,
mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos
para romper la emulsin y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volu-
men del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la de la Solucin estndar.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 m
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyeccin: 40 L
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin estndar y Solucin de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 4,0 entre la forma de vitamina D presente y su precursor correspondiente, Solucin de aptitud del
sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%, Solucin estndar
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porcin de mues-
tra tomada:
Resultado== (ru/r5) x (C5/Cu) x 100

ru == respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra

r5 == respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar
C5 == concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar (g/mL)
Cu== concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (g/mL)
Procedimiento 3
Este procedimiento es adecuado para matrices con excipientes que son solubles o degradables en condiciones alcalinas. Em-
plea la saponificacin de la solucin muestra, seguida por una extraccin lquido-lquido con hexano y una limpieza por ex-
traccin en fase slida (EFS) usando una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isoproplico (99,8: 0,2) como eluyente. La
Solucin estndar se somete a un tratamiento similar para compensar prdidas en la recuperacin debidas a la isomerizacin.
Posteriormente, el eluato se evapora y el residuo se reconstituye en acetonitrilo antes de inyectarlo en el cromatgrafo. La se-
paracin se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y las soluciones reacti-
vo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Acetonitrilo y metanol (91 :9)
cido actico diluido: Solucin de cido actico glacial (1 en 1O) en agua
Solucin de fenolftalena: 1O mg/mL de fenolftalena en alcohol
Solucin de hidrxido de potasio: Disolver lentamente 14 g de hidrxido de potasio en una mezcla de 31 mL de alcohol
deshidratado y 5 mL de agua. Preparar en el da de su uso.
Disolvente de extraccin: Cloruro de metileno y alcohol isoproplico (99,8:0,2)
Columna de extraccin: Relleno de slice con una relacin entre la masa del sorbente y el volumen de la columna de 500
mg a 2,8 mL o equivalente. [NOTA-Acondicionar la columna lavndola inicialmente con 4,0 mL de una mezcla de cloruro de
metileno y alcohol isoproplico (4:1 ), seguida de 5,0 mL de Disolvente de extraccin. No dejar que la columna se seque.]
Solucin madre del estndar: 0,2 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en alcohol deshidratado.
[NOTA-Preparar cada 4 semanas. Almacenar en un congelador.]
Solucin estndar: Diluir un volumen de Solucin madre del estndar con alcohol deshidratado hasta obtener una concentra-
cin de 5 g/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP. Preparar esta solucin en el da de su uso. Transferir 2,0 mL
de esta solucin a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 15,0 mL de agua y 15,0 mL de Solucin de hidrxido de potasio,
tapar y agitar durante 30 minutos en un bao de agua mantenido a 60. Dejar que se enfre a temperatura ambiente y transfe-
rir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 250 mL. Agregar 15,0 mL de agua al matraz, tapar, agitar vigorosa-
mente y transferir esta solucin al embudo de separacin. Enjuagar el matraz con 60 mL de n-hexano y transferir el enjuague
al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que
las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 mL de agua a la capa de hexano en el embudo de sepa-
racin, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa
acuosa. Agregar 1 gota de Solucin de fenolftalena y 15,0 mL de agua al embudo de separacin. Agregar cido actico diluido,
gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen.
446 (581) Valoracin de Vitamina D / Pruebas Qumicas USP 39

Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a travs de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeo
trozo de algodn, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml
de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50
hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extraccin para disolver el residuo. Transferir esta solucin a
una Columna de extraccin en fase slida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de
Disolvente de extraccin y transferir a la columna. Eluir la Columna de extraccin con 2,0 ml de Disolvente de extraccin y dese-
char esta fraccin. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extraccin y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar
el matraz en un bao de agua tibia mantenido a 42 y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agre-
gar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solucin para inyectarla en el cromatgrafo.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, equivalen-
te a 1O g de colecalciferol o ergocalciferol, a un matraz de 125 ml con tapn. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0 ml de Solu-
cin de hidrxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un bao de agua mantenido a 60. Dejar que se enfre a
temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 250 ml. Agregar 15,0 ml de agua
al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solucin al embudo de separacin. Enjuagar el matraz con 60 ml de n-
hexano y transferir el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo
durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a la capa de
hexano en el embudo de separacin, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se
separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solucin de fenolftalena y 15,0 ml de agua al embudo de separacin.
Agregar cido actico diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta
que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a travs de sulfato de sodio anhidro,
colocado sobre un pequeo trozo de algodn, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de
sodio con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un
evaporador rotatorio a 50 hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extraccin para disolver el resi-
duo. Transferir esta solucin a una Columna de extraccin en fase slida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de
fondo redondo con 1,0 ml de Disolvente de extraccin y transferir a la columna. Eluir la Columna de extraccin con 2,0 ml de
Disolvente de extraccin y desechar esta fraccin. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extraccin y recoger el eluato en
un matraz adecuado. Colocar el matraz en un bao de agua tibia mantenido a 42 y evaporar el disolvente con ayuda de una
corriente de nitrgeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solucin para inyectarla en el cro-
matgrafo.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin per-
der material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido
a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las
Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y
calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 1O g
de ergocalciferol o colecalciferol, a un matraz de 125 ml con tapn. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0 ml de Solucin de hidr-
xido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un bao de agua mantenido a 60. Dejar que se enfre a temperatura
ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 250 ml. Agregar 15,0 ml de agua al matraz,
tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solucin al embudo de separacin. Enjuagar el matraz con 60 ml de n-hexano y
transferir el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante
15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a la capa de hexano
en el embudo de separacin, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen
y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solucin de fenolftalena y 15,0 ml de agua al embudo de separacin. Agregar
cido actico diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las
capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a travs de sulfato de sodio anhidro, colocado
sobre un pequeo trozo de algodn, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio
con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evapora-
dor rotatorio a 50 hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extraccin para disolver el residuo. Trans-
ferir esta solucin a una Columna de extraccin en fase slida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo re-
dondo con 1,0 ml de Disolvente de extraccin y transferir a la columna. Eluir la Columna de extraccin con 2,0 ml de Disolvente
de extraccin y desechar esta fraccin. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extraccin y recoger el eluato en un matraz
adecuado. Colocar el matraz en un bao de agua tibia mantenido a 42 y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente
de nitrgeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solucin para inyectarla en el cromatgrafo.
Sistema cromatogrfico
0/er Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 m
Temperatura de la columna: 27
Velocidad de flujo: 0,7 ml/min
Volumen de inyeccin: 15 L
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (581) Valoracin de Vitamina D 447

Aptitud del sistema

Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 4,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porcin de mues-
tra tomada:

Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar (g/mL)
Cu= concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (g/mL)
F = factor de correccin que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solucin
muestra, 1,09
Procedimiento 4
Este procedimiento se aplica a formas farmacuticas lquidas. Emplea una extraccin lquido-lquido de la muestra con hexa-
no, seguida por la evaporacin del hexano y la reconstitucin del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo
(1: 1). La separacin se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y el Diluyente se prepa-
ran segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1)
Solucin estndar: 5 g/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Diluyente
Solucin muestra: Transferir un volumen medido con exactitud de la muestra, equivalente a 50 g de colecalciferol o ergo-
calciferol, a un embudo de separacin de 500 mL que contenga 1O mL de agua y 20 mL de alcohol deshidratado. Agregar 150
mL de ter de petrleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 mL de ter de petrleo, tapar, agitar y dejar que
las capas se separen. Desechar la capa acuosa. Escurrir el extracto de ter de petrleo en un matraz de fondo redondo de 500
mL a travs de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solucin hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un
bao de agua mantenido a aproximadamente 65. Agregar inmediatamente 10,0 mL de Diluyente, agitar por rotacin suave
hasta disolver el residuo y filtrar.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: Dos columnas, 4,6 mm x 25 cm, conectadas en serie; ambas con relleno L1
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Volumen de inyeccin: 20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
Requisitos de aptitud
Desviacin estndar relativa: No ms de 5,0%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H4P) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porcin de mues-
tra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar (g/mL)
Cu= concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (g/mL)
F =factor de correccin que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solucin
muestra, 1,09
Procedimiento 5
Este procedimiento emplea la disolucin de vitamina D en tolueno y la solucin se inyecta en el cromatgrafo de lquidos.
Se puede aplicar a matrices simples tales como vitaminas puras e ingredientes que no requieren saponificacin y que son solu-
bles en tolueno. La separacin se logra en modo de fase normal.
448 (581) Valoracin de Vitamina D / Pruebas Qumicas USP 39

A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y la Solucin de aptitud
del sistema se preparan segn se indica a continuacin.
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatogrfica rellenando un tubo cromatogrfico, de 8 cm x 60 cm, con
500 g de tierra silcea para cromatografa de 50 a 250 m, activada mediante secado a 150 durante 4 horas. 0/er Cromatogra-
fa (621 ), Cromatografa en Columna.) Pasar 500 mL de hexano a travs de la columna y recoger el eluato en un matraz con
tapn de vidrio.
Fase mvil: Alcohol n-amlico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solucin de aptitud del sistema: 250 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoracin de Vitamina D USP en 1O mL de una
mezcla de tolueno y Fase mvil (1 :1 ). Calentar esta solucin a reflujo a 90 durante 45 minutos y enfriar. [NOTA-Esta solucin
contiene colecalciferol, precolecalciferol y trans-colecalciferol. Para las soluciones madre, seguir estos procedimientos: usar ma-
terial de vidrio con proteccin actnica, disolver las muestras sin calentar y preparar las soluciones en el da de su uso.]
Solucin madre del estndar: 0,6 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno
Solucin estndar: 120 g/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Fase mvil, preparada a partir de Solucin
madre del estndar
Solucin madre de la muestra: 0,6 mg/mL of colecalciferol o ergocalciferol en tolueno
Solucin muestra: 120 g/mL de colecalciferol o ergocalciferol en Fase mvil, preparada a partir de Solucin madre de Ja
muestra
Sistema cromatogrfico
0/er Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: Se puede variar para cumplir con los Requisitos de aptitud del sistema
Volumen de inyeccin: 5-1 O L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de aptitud del sistema
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, res-
pectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1,O entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porcin de mues-
tra tomada:
Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar
C5 = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar (g/mL)
Cu= concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (g/mL)
Procedimiento 6
El procedimiento emplea la disolucin de la muestra en Fase mvil y la solucin se inyecta en el cromatgrafo de lquidos. La
aplicacin incluye colecalciferol y ergocalciferol disueltos en aceite vegetal comestible, polisorbato 80 o propilenglicol, ningu-
no de los cuales interferir con el precursor correspondiente de modo que ste pueda cuantificarse. La separacin se logra en
modo de fase normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separacin de las formas trans de los precurso-
res de vitamina D.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar y la Solucin muestra se preparan segn
se indica a continuacin.
Fase mvil: Hexano y pentanol (997:3)
Solucin madre del estndar: Disolver ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno y diluir con Fase mvil hasta
50 g/ml. [NOTA-Preparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin estndar A: 5 g/mL, a partir de Solucin madre del estndar en Fase mvil. [NOTA-Almacenar a una temperatura
que no exceda de O.]
Solucin estndar B: Transferir 5,0 mL de Solucin madre del estndar a un matraz de fondo redondo equipado con un con-
densador de reflujo. Desplazar el aire con nitrgeno y someter a reflujo durante 1 hora en un bao de agua bajo una atmsfe-
ra de nitrgeno para obtener una solucin que contenga colecalciferol y precolecalciferol. Enfriar, transferir la solucin con
ayuda de varias porciones de Fase mvil a un matraz volumtrico de 50 mL y diluir con Fase mvil a volumen.
Solucin muestra: Equivalente a 5 g/mL de colecalciferol o ergocalciferol en Fase mvil, a partir de un volumen de muestra
medido con exactitud
USP 39 Pruebas Qumicas/ (581) Valoracin de Vitamina D 449

Sistema cromatogrfico
0/er Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Velocidad de flujo: 1-2 mL/min
Volumen de inyeccin: 10-20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar B (ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP)
[NOTA-Los tiempos de retencin relativos para precolecalciferol y colecalciferol son aproximadamente 0,4 y 1,0, respectiva-
mente, y aproximadamente 0,8 y 1,0 para pre-ergocalciferol y ergocalciferol, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1,0 entre los picos de precolecalciferol y colecalciferol. No menos de 1,0 entre los picos de pre-
ergocalciferol y ergocalciferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol
Anlisis
Muestras: Solucin estndar A, Solucin estndar By Solucin muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, Fe:

Fe= C5/r5

C5 = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (g/mL)

r5 = rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentracin, C 5, en g/ml, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B:

Cs =Fe x r's
Fe = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
r' s = rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar B
Calcular la concentracin, CP'" en g/mL, de precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

Cpre= Cs- Cs
C5 = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (g/mL)
C' s = concentracin de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B (g/mL)
Calcular el factor de respuesta, FP,., para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

Fpre = C'pr.f rP
C'pre =concentracin de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (g/mL)
rP = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin estndar B
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como colecalciferol (C 27 H4P) o como ergocalciferol (C 28 H44 0)
en la porcin de muestra tomada:

Resultado= {[(Fe X fe)+ (Fpre X rpre)]/Cu} X 100

Fe= factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol

re= rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra
Fpre =factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
rpre = rea del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin muestra
Cu= concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (g/mL)
Procedimiento 7
Este procedimiento emplea la saponificacin de la muestra, seguida por una extraccin lquido-lquido con ter-ter de pe-
trleo y por la evaporacin del ter-ter de petrleo y la reconstitucin del residuo en una mezcla de tolueno y Fase mvil
(1 :4). Se aplica a soluciones en aceite y cpsulas que contengan soluciones de vitamina D en aceite, en las que el aceite no
interfiera con el precursor correspondiente de modo que ste pueda cuantificarse. La separacin se logra en modo de fase nor-
mal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separacin de las formas trans de los precursores de vitamina D.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, la Solucin muestra y las soluciones
reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatogrfica rellenando un tubo cromatogrfico, de 8 cm x 60 cm, con
500 g de tierra silcea para cromatografa de 50 a 250 m, activada mediante secado a 150 durante 4 horas. 0/er Cromatogra-
450 (581) Valoracin de Vitamina D / Pruebas Qumicas USP 39

fa (621 ), Cromatografa en Columna.) Pasar 500 ml de hexano a travs de la columna y recoger el eluato en un matraz con
tapn de vidrio.
Fase mvil: Alcohol n-amlico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solucin de butil hidroxitolueno: 1O mg/ml de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografa
Solucin acuosa de hidrxido de potasio: 1 g/ml de hidrxido de potasio en agua recientemente calentada a ebullicin.
[NOTA-Preparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin alcohlica de hidrxido de potasio: 3 g de hidrxido de potasio en 50 ml de agua recientemente calentada a
ebullicin. Agregar 1O ml de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullicin hasta 100 ml. [NOTA-Preparar
esta solucin en el da de su uso.]
Solucin de ascorbato de sodio: Disolver 175 mg/ml de cido ascrbico en hidrxido de sodio 1 N. [NOTA-Preparar en el
da de su uso.]
Solucin de sulfuro de sodio: 12 g de sulfuro de sodio en 20 ml de agua. Diluir con glicerina hasta 100 ml.
Solucin madre del estndar: 0,5 mg/ml de ER Ergocalciferol USP o ER Colecalciferol USP en tolueno. [NOTA-Preparar esta
solucin en el da de su uso.]
Solucin estndar A: 20 g/ml, a partir de Solucin madre del estndar en Fase mvil. [NOTA-Almacenar esta solucin a una
temperatura que no exceda de O.]
Solucin estndar B: Pipetear y transferir 4 ml de Solucin madre del estndar a un matraz de fondo redondo equipado con
un condensador de reflujo y agregar 2 3 cristales de butil hidroxitolueno. Desplazar el aire con nitrgeno y calentar en un
bao de agua mantenido a una temperatura de 90 con luz tenue bajo una atmsfera de nitrgeno durante 45 minutos para
obtener una solucin que contenga vitamina D y pre-vitamina D. Enfriar, transferir con ayuda de varias porciones de Fase mvil
a un matraz volumtrico de 100 ml y diluir con Fase mvil a volumen.
Solucin de aptitud del sistema: Agregar 100 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoracin de Vitamina D USP a un matraz
volumtrico de 1O ml. Agregar una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase mvil a volumen y mezclar. Calentar una porcin de esta
solucin a reflujo a 90 durante 45 minutos y enfriar.
Solucin muestra: Someter a reflujo no menos de 1O Cpsulas con una mezcla de 1O ml de Solucin de ascorbato de sodio y
2 gotas de Solucin de sulfuro de sodio en un bao de vapor durante 1O minutos, triturar los slidos remanentes con una varilla
de vidrio de punta roma y continuar el calentamiento durante 5 minutos. Enfriar y agregar 25 ml de alcohol y 3 ml de Solu-
cin acuosa de hidrxido de potasio. Someter la mezcla a reflujo en un bao de vapor durante 30 minutos. Enfriar rpidamente
bajo una corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador cnico, enjuagando el matraz de saponificacin
con dos porciones de 15 ml de agua, 1O ml de alcohol y dos porciones de 50 ml de ter. [NOTA-Usar el ter dentro de las
24 horas despus de abrir el envase.] Agitar vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30
segundos y dejar en reposo hasta que ambas capas se tornen transparentes. Transferir la fase acuosa a un segundo separador
cnico, agregar una mezcla de 1O ml de alcohol y 50 ml de ter de petrleo y agitar vigorosamente. Dejar que se separen,
transferir la fase acuosa a un tercer separador cnico y transferir la fase de ter de petrleo al primer separador, enjuagando el
segundo separador con dos porciones de 1O ml de ter de petrleo y agregando los enjuagues al primer separador. Agitar la
fase acuosa en el tercer separador con 50 ml de ter de petrleo y agregar la fase de ter de petrleo al primer separador.
Lavar los extractos combinados de ter-ter de petrleo agitando vigorosamente con tres porciones de 50 ml de Solucin al-
cohlica de hidrxido de potasio y lavar vigorosamente con porciones de 50 ml de agua hasta que el ltimo lavado sea neutro
frente a la fenolftalena. Escurrir las gotas de agua remanentes de los extractos combinados de ter-ter de petrleo, agregar 2
lminas de papel de filtro de 9 cm en tiras al separador y agitar. Transferir los extractos lavados de ter-ter de petrleo a un
matraz de fondo redondo, enjuagando el separador y el papel con ter de petrleo. Combinar los enjuagues de ter de petr-
leo con los extractos de ter-ter de petrleo, agregar 100 L de Solucin de butil hidroxitolueno y mezclar. Evaporar hasta se-
quedad al vaco agitando por rotacin suave en un bao de agua mantenido a una temperatura no superior a 40. Enfriar bajo
una corriente de agua e introducir nitrgeno suficiente para restaurar la presin atmosfrica. Disolver y diluir el residuo sin de-
mora en un volumen medido con exactitud de una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase mvil, hasta que la concentracin de
vitamina D sea aproximadamente 25 g/ml.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Velocidad de flujo: 1-2 ml/min
Volumen de inyeccin: 10-20 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de aptitud del sistema
NOTA-Los tiempos de retencin relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, res-
pectivamente.
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
 USP 39 Pruebas Qumicas/ (581 >Valoracin de Vitamina D 451

Anlisis
Muestras: Solucin estndar A, Solucin estndar By Solucin muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, F0 :

F0 = C5/r5

C5 =concentracin de ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (g/ml)

r5 =rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentracin, C' 5, en g/ml, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B:

C's=Foxr's
F0 = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
r' 5 = rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar B
Calcular la concentracin, C'pre' en g/ml, para pre-ergocalciferol:

C5 = concentracin de ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (g/ml)

C' 5 = concentracin de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B (g/ml)
Calcular el factor de respuesta, Fpre1 para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

Fpre = C' pref rP

C'pre =concentracin de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (g/ml)
rP = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin estndar B
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como ergocalciferol (C 28 H44 0) o como colecalciferol (C 27 H44 0)
en la porcin de muestra tomada:

Resultado= {[(F0 x re) + (Fpre x r' pre)l/Cu} x 100

F0 = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol

re= rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra
Fpre = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
r' pre= rea del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin muestra
Cu= concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (g/ml)
Procedimiento 8
Este procedimiento es adecuado para la determinacin de colecalciferol en aceites y matrices grasas. Emplea dos sistemas
cromatogrficos, uno para la limpieza de la muestra y el otro para la determinacin de vitamina D. El estndar, estndar inter-
no y las soluciones muestra se someten a saponificacin, seguida por una extraccin lquido-lquido con una mezcla de ter y
hexano (1 :1 ). El extracto se evapora y reconstituye en la Solucin de butil hidroxitolueno.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, las Soluciones muestra, la Solucin de es-
tndar interno y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Solucin A: Alcohol n-amlico y hexano deshidratado (3:997)
Solucin B: Acetonitrilo, agua y cido fosfrico (96: 3,8: 0,2)
Solucin de butil hidroxitolueno: 1O mg/ml de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografa
Solucin acuosa de hidrxido de potasio: Disolver 800 mg de hidrxido de potasio en 1000 ml de agua recientemente
calentada a ebullicin, mezclar y enfriar. [NOTA-Preparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin alcohlica de hidrxido de potasio: Disolver 3 g de hidrxido de potasio en 50 ml de agua recientemente calen-
tada a ebullicin, agregar 1O ml de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullicin hasta 100 ml. [NOTA-
Preparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin de cido ascrbico: 100 mg/ml de cido ascrbico en agua. [NOTA-Preparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin de estndar interno: 5 g/ml de ER Ergocalciferol USP en alcohol
Solucin madre del estndar: 5 g/ml de ER Colecalciferol USP en alcohol
Solucin estndar: Transferir 2,0 ml de Solucin madre del estndar y 2,0 ml de Solucin de estndar interno a un matraz de
fondo redondo. Proceder segn se indica en Solucin muestra 1 comenzando donde dice "Agregar 5 ml de ... ".
Solucin muestra 1: Transferir 4,00 g de aceite a un matraz de fondo redondo. Agregar 5 ml de Solucin de cido ascrbico,
100 ml de alcohol y 1O ml de Solucin acuosa de hidrxido de potasio y mezclar. Someter la mezcla a reflujo en un bao de
vapor durante 30 minutos. Agregar 100 ml de una solucin de cloruro de sodio de 1O mg/ml. Enfriar rpidamente bajo una
corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador de 500 ml, enjuagando el matraz de saponificacin con
75 ml de una solucin de cloruro de sodio de 1O mg/ml y luego con 150 ml de una mezcla de ter y hexano (1 :1 ). Agitar
vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30 segundos y dejar en reposo hasta que ambas
452 (581) Valoracin de Vitamina D / Pruebas Qumicas USP 39

capas se tornen transparentes. Desechar la capa inferior. Lavar los extractos de ter y hexano agitando vigorosamente con 50
mL de Solucin alcohlica de hidrxido de potasio y luego lavando con tres porciones de 50 mL de una solucin de cloruro de
sodio de 1O mg/ml. Filtrar la capa superior a travs de 5 g de sulfato de sodio anhidro sobre un papel de filtracin rpida en
un matraz de 250 mL adecuado para un evaporador rotatorio. Lavar el filtro con 1O mL de una mezcla de ter y hexano (1 :1 ),
y combinar con el extracto. Evaporar el disolvente a presin reducida a una temperatura que no exceda de 30 y llenar con
nitrgeno cuando la evaporacin se haya completado. Alternativamente, evaporar el disolvente bajo una corriente suave de
nitrgeno a una temperatura que no exceda de 30. Disolver el residuo en 1,5 mL de Solucin de butil hidroxitolueno. [NOTA-
Puede ser necesario calentar suavemente en un bao ultrasnico. Una fraccin grande del residuo blanco es colesterol.]
Solucin muestra 2: Agregar 2,0 mL de Solucin de estndar interno a 4,00 g de aceite y proceder segn se indica en Solu-
cin muestra 1 comenzando donde dice "Agregar 5 mL de ... ".
Sistema cromatogrfico de limpieza
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase mvil: Solucin A
Columna de limpieza: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 25 cm; relleno L1O
Volumen de inyeccin: 350 L
Anlisis (limpieza)
Muestras: Solucin estndar, Solucin muestra 1 y Solucin muestra 2
Recoger por separado los eluatos desde 2 minutos antes hasta 2 minutos despus del tiempo de retencin de colecalciferol
en un tubo de vidrio que contenga 1 mL de Solucin de butil hidroxitolueno y equipado con un cierre hermtico. Evaporar cada
tubo bajo una corriente de nitrgeno a una temperatura que no exceda de 30. Disolver cada residuo en 1,5 mL de acetonitri-
lo e inyectar en el sistema cromatogrfico analtico siguiente.
Sistema cromatogrfico analtico
(Ver Cromatografa (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase mvil: Solucin B
Columna analtica: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 5 m
Volumen de inyeccin: 200 L
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar (despus de la limpieza)
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1,4 entre colecalciferol y ergocalciferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de colecalciferol, en inyecciones repetidas
Anlisis
Muestras: Solucin estndar, Solucin muestra 1 y Solucin muestra 2 (despus de la limpieza)
Calcular el contenido de vitamina D, en g/g, en la porcin de muestra tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu)

R5 = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estndar interno de la Solucin estndar
C5= concentracin de ER Colecalciferol USP en la Solucin estndar (g/mL)
Cu= concentracin de aceite en la Solucin muestra 2 (g/mL)
Ru = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estndar interno de la Solucin estndar 2, segn se calcula a con-
tinuacin:

Ru = ruif[r1s2 - (r1s1 x fu2f fu1)]

[NOTA-Si r,57 = O debido a que no se observa ningn pico en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin
muestra 1, entonces Ru = ru2f r1s2l
ru2 = respuesta del pico de colecalciferol de la Solucin muestra 2
r152 = respuesta del pico del estndar interno de la Solucin muestra 2
r151 = respuesta del pico del estndar interno de la Solucin muestra 1
ru 1 = respuesta del pico de colecalciferol de la. Solucin muestra 1
USP 39 Pruebas Qumicas/ (591) Determinacin de Cinc 453

(591) DETERMINACIN DE CINC

La necesidad de establecer una determinacin cuantitativa de cinc en las Preparaciones farmacopeicas de insulina refleja el
hecho de que este elemento es un componente esencial de los cristales de insulina-cinc. De la misma manera que el plomo, se
puede determinar el contenido de cinc por el mtodo de la ditizona o mediante absorcin atmica.

Mtodo de Ditizona

Para esta prueba, seleccionar todos los reactivos que contengan el menor contenido posible de metales pesados. Si fuera
necesario, destilar el agua y otros disolventes en aparatos de vidrio duro o vidrio de borosilicato. Enjuagar bien todos los mate-
riales de vidrio con cido ntrico diluido tibio (1 en 2) y luego con agua. Evitar el uso en el separador de cualquier lubricante
que se disuelva en cloroformo.
Soluciones y Disolventes Especiales-
SOLUCIN ALCALINA DE CITRATO DE AMONIO-Disolver 50 g de citrato dibsico de amonio en agua para obtener 100 ml. Agre-
gar 100 ml de hidrxido de amonio. Eliminar los metales pesados que podran estar presentes, por extraccin de la solucin
con porciones de 20 ml de Solucin de Extraccin de Ditizona (ver Plomo (251)) hasta que la solucin de ditizona retenga un
color verde transparente, luego extraer la ditizona remanente en la solucin de citrato por agitacin con cloroformo.
CLOROFORMO-Destilar el cloroformo en un aparato de vidrio duro o vidrio de borosilicato, recibiendo el destilado en sufi-
ciente alcohol deshidratado para obtener una concentracin final de 1 ml de alcohol por cada 100 ml de destilado.
SOLUCIN DE DITIZONA-Emplear Solucin Estndar de Oitizona (ver Plomo (251 )), preparada con el Cloroformo destilado.
SOLUCIN ESTNDAR DE CINC-Disolver 625 mg de xido de cinc, pesados con exactitud y previamente incinerados suavemen-
te hasta peso constante, en 1 O ml de cido ntrico y agregar agua hasta obtener 500,0 ml. Esta solucin contiene 1,0 mg de
cinc por ml.
SOLUCIN ESTNDAR DE CINC DILUIDA-Diluir 1 ml de Solucin Estndar de Cinc, medido con exactitud, con 2 gotas de cido
ntrico y suficiente agua para obtener 100,0 ml. Esta solucin contiene 1 O g de cinc por ml. Usar esta solucin dentro del
periodo de 2 semanas.
SOLUCIN DE CIDO TRICLOROACTICO-Disolver 100 g de cido tricloroactico en agua hasta obtener 1000 ml.
Procedimiento-Transferir de 1 a 5 ml de la preparacin a analizar, medidos con exactitud, a un tubo de centrfuga gra-
duado de 40 ml. Si fuera necesario, agregar cido clorhdrico 0,25 N, gota a gota, hasta obtener una solucin transparente.
Agregar 5 ml de Solucin de cido Tricloroactico y suficiente agua para obtener 40,0 ml. Mezclar y centrifugar.
Transferir a un separador de vidrio duro un volumen exactamente medido del sobrenadante que, se supone, contiene de 5
g a 20 g de cinc y agregar agua hasta obtener aproximadamente 20 ml. Agregar 1,5 ml de Solucin Alcalina de Citrato de
Amonio y 35 ml de Solucin de Ditizona. Agitar vigorosamente 100 veces. Permitir que la fase clorofrmica se separe. Insertar
un trozo cilndrico de algodn en el vstago del separador para extraer el agua que est emulsionada en el cloroformo. Reco-
ger en un tubo de ensayo el extracto clorofrmico (descartando la primera porcin que pase) y determinar la absorbancia a
530 nm, con un espectrofotmetro apropiado.
Calcular la cantidad de cinc contenida por referencia a una curva estndar de absorbancia-concentracin obtenida utilizan-
do 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml y, si el contenido de cinc de la muestra extrada excede 15 g, tambin 2,0 ml de la Solucin
Estndar de Cinc Diluida. Corregir la curva estndar mediante una determinacin concomitante de un blanco segn se indica,
donde se usan todos los reactivos pero no se agrega cinc.
454 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

Pruebas y Determinaciones Fsicas

(601) MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIN: PRUEBAS DE

CALIDAD DE DESEMPEO DE AEROSOLES, ATOMIZADORES Y
POLVOS

TABLA DE CONTENIDO

Introduccin
A. Uniformidad de Dosis Liberada
A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales
A.1.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.1.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Atomizadores Nasales
A.1.1.2 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles Nasales

A.2 Aerosoles para Inhalacin y Atomizadores para Inhalacin

A.2.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.2.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles para Inhalacin y Atomizadores para Inhalacin

A.3 Polvos Nasales

A.3.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.3.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos Nasales

A.4 Polvos para Inhalacin

A.4.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.4.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos para Inhalacin

B. Distribucin del Tamao de Gotitas/Partculas-Aerosoles, Atomizadores y Polvos Nasales

B. l Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Lser

C. Distribucin del Tamao Aerodinmico-Aerosoles, Atomizadores y Polvos para Inhalacin

C.1 Principios Generales de la Medicin del Tamao Aerodinmico de Partculas
C.1.1 Medicin de Estacin
C.1.2 Prdida de Frmaco entre Estaciones (Prdidas en las Paredes)
C.1.3 Reingreso por Arrastre
C.1.4 Balance de Masa

C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalacin-lmpactador Andersen (sin preseparador)
C.2.1 Diseo-Aparato 1
C.2.2 Procedimiento-Aparato 1

C.3 Aparato 2 para Polvos para lnhalacin-lmpactador Marple-Miller

C.3.1 Diseo-Aparato 2
C.3.2 Procedimiento-Aparato 2

C.4 Aparato 3 para Polvos para lnhalacin-lmpactador Andersen (con preseparador)

C.4.1 Diseo-Aparato 3
C.4.2 Procedimiento-Aparato 3

C.5 Aparato 4 para Polvos para lnhalacin-lmpactador (lmpinger) Multiestacin en Fase Lquida
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 455

C.5.1 Diseo-Aparato 4
C.5.2 Procedimiento-Aparato 4

C.6 Aparato 5 para Polvos para lnhalacin-lmpactador de Nueva Generacin (con preseparador)
C.6.1 Diseo-Aparato 5
C.6.2 Procedimiento-Aparato 5

C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalacin-lmpactador de Nueva Generacin (con preseparador)
C.7.1 Diseo-Aparato 6
C.7.2 Procedimiento-Aparato 6

INTRODUCCIN

Las principales mediciones de desempeo para aerosoles, atomizadores y polvos nasales y para inhalacin se relacionan con
la dosis liberada al paciente, incluyendo la uniformidad de la dosis liberada y las mediciones pertinentes de tamao de partcu-
la (ptico o aerodinmico) dependiendo de la forma farmacutica. Las secciones siguientes presentan descripciones de cada
una de stas. El captulo Medicamentos Nasales y para Inhalacin-Informacin General y Pruebas de Calidad del Producto (5),
provee una tabla de nomenclatura de la que se pueden obtener los trminos descriptivos para varias formas farmacuticas.

A. UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA

A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales

La siguiente prueba se aplica a aerosoles y atomizadores nasales, formulados como suspensiones no acuosas o acuosas o
soluciones de frmacos que generalmente se presentan en envases multidosis y provistos de vlvulas o bombas dosificadoras.
En todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el atomizador segn se indica en el etiquetado y en las instruc-
ciones de uso.

A.1 .1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de la dosis mnima liberada
recolectada al inicio de la vida de la unidad y al final de la vida de la misma, se determinar en 1 O envases distintos. Esto repre-
senta un total de 20 determinaciones. Estas mediciones deben realizarse despus de cebar el sistema segn se describe en el
etiquetado o en las instrucciones de uso. El nmero de dosis no debe exceder de 2 atomizaciones (es decir, un total de 20
determinaciones).
A.1.1.1 Muestreo de la dosis liberada de atomizadores nasales
Procedimiento-Para garantizar una recoleccin de dosis in vitro reproducible, se recomienda emplear un medio mecnico de
accionamiento del sistema dosificador o bomba para liberar las dosis que se van a recolectar. El procedimiento de acciona-
miento mecnico debe tener controles adecuados para los parmetros crticos de accionamiento mecnico (p.ej., fuerza de
accionamiento, velocidad de accionamiento, longitud del desplazamiento y periodos de descanso). La prueba debe realizarse
en unidades que hayan sido minuciosamente agitadas y cebadas de acuerdo con las instrucciones de uso para el paciente. La
unidad de prueba debe accionarse en una posicin vertical o casi vertical con la vlvula hacia arriba. La dosis recolectada al
inicio de cada uno de los 1 O envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado, y la dosis recolectada al
final de la vida de cada envase debe corresponder al ltimo nmero de dosis declarado en la etiqueta del envase. Las dosis
entre las dos muestras de prueba secuenciales deben desecharse apropiadamente.
Para productos en suspensin, la dosis debe ser liberada en un envase adecuado (por ejemplo, un vial de centelleo) en el
cual se pueda lograr la transferencia cuantitativa desde el envase en anlisis. Se utiliza un mtodo analtico validado para deter-
minar la cantidad de frmaco en cada dosis liberada y los datos se informan como porcentaje de la cantidad declarada. Para
productos en solucin, la dosis liberada se puede determinar gravimtricamente a partir del peso de la dosis liberada y de la
concentracin y la densidad de la solucin de llenado del producto en anlisis.
A.1.1.2 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles nasales: Ver A.2. 7. 7 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inha-
lacin y atomizadores para inhalacin.
456 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

A.2 Aerosoles para Inhalacin y Atomizadores para Inhalacin

Las siguientes pruebas se aplican a aerosoles para inhalacin (comnmente conocidos como inhaladores de dosis fija) y ato-
mizadores para inhalacin. Los aerosoles para inhalacin se formulan como suspensiones o soluciones de un frmaco en pro-
pelentes y posiblemente en otros excipientes adecuados, y se presentan como unidades multidosis. Los atomizadores para in-
halacin son, por lo regular, formulaciones lquidas acuosas envasadas en un sistema compacto de envase-cierre que contiene
una bomba atomizadora integral. Consultar el captulo (5) para informacin adicional. Los siguientes mtodos de prueba son
especficos para estos productos y pueden requerir modificaciones cuando los analistas analizan tecnologas de inhalacin al-
ternativas (por ejemplo, aerosoles para inhalacin o atomizadores para inhalacin activados por la respiracin). No obstante,
los requisitos farmacopeicos para todas las formas farmacuticas de dosis fija para inhalcin requieren determinar la dosis libe-
rada y la distribucin del tamao aerodinmico. En todos los casos y para todas las pruebas, el producto debe ser preparado y
probado de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta y las instrucciones de uso. Cuando el fabricante del producto no pro-
vea dichas instrucciones, se deben seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen en las pruebas siguien-
tes.

A.2.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles para inhalacin y atomizadores para inhalacin que
contienen formulaciones de frmacos (p.ej., solucin o suspensin) en presentaciones con dosis medidas por el dispositivo o
con dosis premedidas o prefijadas. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la
vida de la unidad. (Para productos envasados en unidades de dosificacin prefijadas/premedidas, consultar tambin el captulo
Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905).) En esta prueba, una dosis se define como el nmero mnimo recomendado de
atomizaciones especificado en el etiquetado o en las instrucciones de uso del producto, pero no ms de dos atomizaciones.
Para aerosoles para inhalacin y atomizadores para inhalacin, la dosis liberada esperada se especifica en la etiqueta, a menos
que se especifique algo distinto en la monografa individual. Su valor refleja el contenido medio de frmaco esperado para un
gran nmero de dosis liberadas recolectadas de muchas unidades del producto, empleando el mtodo especificado en la mo-
nografa.
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de las dosis liberadas recolecta-
das al comienzo de la vida de la unidad (despus de realizar el cebado segn se describe en la etiqueta o en las instrucciones
de uso) y al final de la vida de la unidad declarada en la etiqueta, se determinar a partir de 1O envases distintos (es decir, un
total de 20 determinaciones).
A.2.1.1 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inhalacin y atomizadores para inhalacin
Procedimiento-Para determinar el contenido de ingrediente activo en la nube descargada de un aerosol para inhalacin y de
un atomizador para inhalacin, usar el Aparato A de muestreo (ver la Figura 7) descrito a continuacin. Preparar el producto
para su uso de acuerdo con las instrucciones del etiquetado para agitar, cebar y disparar. A menos que se indique algo diferen-
te en la monografa individual, con la bomba de vaco en funcionamiento y asegurando una velocidad de flujo de aire a travs
del dispositivo del producto de 28,3 L de aire por minuto (5%), descargar en el aparato los accionamientos mnimos reco-
mendados a travs del adaptador de boquilla, accionando el sistema de medicin durante un tiempo suficiente para garantizar
que la dosis se haya descargado por completo. El volumen de aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. La dosis recolectada
de cada uno de los 1O envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado y la dosis recolectada al final
de la vida de cada envase debe ser la ltima dosis de acuerdo con lo declarado en la etiqueta. A menos que se indique algo
diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y recolectar el primer acciona-
miento posterior al cebado. Esperar 5 segundos y recolectar el siguiente accionamiento, cuando se justifique. Las dosis entre
las dos muestras de prueba secuenciales (es decir, el comienzo y el final de la vida del envase) deben desecharse de manera
apropiada. Se debe tener en cuenta que, para los aerosoles para inhalacin, la velocidad de las descargas (nmero de descar-
gas por unidad de tiempo) que se van a desechar no debe ocasionar un enfriamiento excesivo del envase. Despus de las reco-
lecciones individuales del nmero mnimo de accionamientos de cada unidad en cada muestra de prueba secuencial, retirar el
producto del Aparato A (ver la Figura 7) y desconectar el vaco. Valorar por separado el contenido de frmaco en el aparato al
comienzo y al final de las muestras de prueba secuenciales despus de enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disol-
vente adecuado.
Aparato A-El aparato de muestreo (ver la Figura 7) consta de una base para soporte de filtro con un soporte de filtro de malla
abierta, como una criba de acero inoxidable, un tubo de recoleccin fijado o atornillado a la base para soporte de filtro y un
adaptador de boquilla para garantizar un sellado hermtico entre el tubo de recoleccin y la boquilla. Usar un adaptador de
boquilla que garantice que la abertura de la boquilla del producto est nivelada con la cara frontal o con el borde indentado
de 2,5 mm que est en el tubo de recoleccin de muestra, segn sea apropiado. El conector de vaco est conectado a un
sistema compuesto por una fuente de vaco, un regulador de flujo y un caudalmetro. La fuente debe ser capaz de arrastrar aire
a travs de todo el dispositivo, incluyendo el filtro y el producto a analizar, a la velocidad de flujo deseada. Durante las pruebas
de aerosoles para inhalacin, el aire debe extraerse de forma continua a travs del sistema de manera que se evite la prdida
del medicamento por fuga al medio ambiente que lo rodea. La base para soporte de filtro est diseada para soportar discos
de filtro de 25 mm de dimetro. Con el flujo de aire empleado, el tubo de recoleccin de muestra y el disco de filtro deben ser
capaces de recolectar cuantitativamente la dosis liberada. El disco de filtro y los restantes materiales utilizados en la construc-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 457

cin del aparato deben ser compatibles con el frmaco y los disolventes empleados para extraer el frmaco del filtro. Un extre-
mo del tubo de recoleccin est diseado para sostener firmemente el filtro contra la base para soporte de filtro. Una vez mon-
tado, las uniones entre los componentes del aparato son hermticas, de forma que cuando se aplica vaco a la base del filtro,
todo el aire extrado a travs del aparato de recoleccin pasa a travs del dispositivo del producto.
Rosca Interna

~26,7

~ 31,8

Tubo

Cotas de 103 89 5
Rosca Externa

~~
ffi
rnmoooOo Rosca Interna ~apa
4 20
J_ 16,6
:::__J_ 8,5

:-n
Descanso de Rosca 1 1 t
Conector de Vaco

Tapa
Adaptadores de Boquilla

~
Tubo de recoleccin de Muestra

Tapa

Las dimensiones son en mm,

salvo que se especifique lo contrario. ~ lohalad0<de
Dosis Fija

Figura 1. Aparato de muestreo para aerosoles y atomizadores para inhalacin

A.3 Polvos Nasales

La siguiente prueba se aplica a polvos nasales presentados en unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. En
todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el polvo segn se indica en el etiquetado y en las instrucciones de
uso.

A.3.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de las dosis mnimas liberadas
de 1O envases individuales se determinar al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al nmero correspondiente de dosis
medidas declarado en la etiqueta. Esto representa un total de 20 determinaciones. Para polvos nasales envasados en unidades
monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 1O unidades de dosificacin.
A.3.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos nasales: Para garantizar una recoleccin de dosis in vitro reproducible, se
recomienda emplear un medio adecuado de accionamiento del dispositivo para liberar las dosis a recolectar. Las unidades de
458 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

prueba se deben accionar en posicin vertical o casi vertical. Las dos dosis separadas recolectadas incluyen la primera dosis y la
dosis correspondiente a la ltima dosis declarada de cada una de 1O unidades. Las dosis entre las dos muestras de prueba se-
cuenciales para cada unidad se deben desechar apropiadamente. Se emplea un mtodo analtico validado para determinar la
cantidad de frmaco en cada dosis liberada y los datos se registran como porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta.
Para polvos nasales, se recomienda el aparato B (Figura 2).

A.4 Polvos para Inhalacin

Las siguientes pruebas se aplican a polvos para inhalacin (comnmente conocidos como inhaladores de polvo seco) pre-
sentados como unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. Los requisitos farmacopeicos para todos estos me-
dicamentos requieren la determinacin de la dosis liberada y de la distribucin de tamao aerodinmico. En todos los casos y
para todas las pruebas, preparar y probar el producto segn se indica en el etiquetado y en las instrucciones de uso. Cuando el
fabricante del producto no provea dichas instrucciones, seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen
en las pruebas siguientes.

A.4.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para polvos para inhalacin en presentaciones con dosis medida por
el dispositivo y premedidas (incluyendo multidosis ordenadas) cuyo etiquetado indica que se deben usar con el sistema de li-
beracin especificado. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la vida de la
unidad. (Para formulaciones envasadas en unidades de dosis premedidas, consultar tambin el captulo (905).) Se debe tener
en cuenta que la dosis liberada esperada es el contenido medio de frmaco de un gran nmero de dosis liberadas recolectadas
de muchas unidades en condiciones experimentales definidas. En muchos casos, el valor esperado puede depender de la for-
ma en que se realice la prueba para la dosis liberada. Para polvos para inhalacin, en los que la cantidad que se declara en la
etiqueta es usualmente la dosis premedida o medida del frmaco, la dosis liberada esperada se especifica en la monografa
individual y generalmente es menor que la cantidad que se declara en la etiqueta. Su valor refleja el contenido medio de fr-
maco esperado para un gran nmero de dosis liberadas recolectadas del producto, empleando el mtodo especificado en la
monografa.
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de la dosis mnima liberada de
1 O envases individuales se determina de acuerdo con el procedimiento descrito a continuacin.
La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada durante toda la vida de la unidad se requiere para medicamentos envasados en
unidades de dosis medida por el dispositivo o unidades de dosis premedidas con dosis mltiples ordenadas que tienen una
secuencia de dosis predeterminada.
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de las dosis liberadas se recolec-
tar al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al nmero de dosis declarado en la etiqueta. Se obtendrn dos determina-
ciones de 1 O unidades individuales de medicamento. Esto representa un total de 20 determinaciones.
Para polvos para inhalacin envasados en unidades monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 1 O unida-
des de dosificacin.
A.4.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos para inhalacin: Emplear el Aparato B (ver la Figura 2) para determinar el
contenido del ingrediente activo emitido de la boquilla de un polvo para inhalacin. Este aparato puede muestrear las dosis
emitidas a distintas velocidades de flujo de aire.
H
G Vlvula de Control de Flujo

g \ PI"'-. Adaptador de Boquilla

Temp_---- " " ' "..

Bomba
de Vac
F
B Filtro
E Tubo de Recoleccin de Muestra
e D
A

Figura 2. Aparato B: Aparato de muestreo para polvos para inhalacin. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componen-
tes.)
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 459

Tabla 1. Especificaciones de Componentes para el Aparato B (ver la Figura 2)

Cdigo Artculo Descripcin Dimensiones
Tubo de recoleccin de
A muestra Ver la Figura 2 34,85 mm de dimetro interno x 12 cm de longitud
B Filtrob Ver la Figura 2 Filtro de fibra de vidrio de 47 mm
(p.ej., acoplamiento corto
de metal con ramificacin
c Conector a P3 de dimetro menor) 28 mm de dimetro interno
(p.ej., tubera de silicona
con un dimetro externo
de 14 mm y un dimetro Un tubo de longitud adecuada de dimetro interno 28 mm con un volu-
D Tubera de vaco interno de 8 mm) men interno de 25 mL 5 ml.
Vlvula solenoide de dos Vlvula solenoide de 2 vas, 2 puertos, con un dimetro interno 28 mm y
E vas< Ver la Figura 2 un tiempo de respuesta de apertura de $100 milisegundos.
La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo requerida a
travs del aparato ensamblado con el polvo para inhalacin en el adap-
tador de boquilla. Conectar la bomba a la vlvula solenoide empleando
una tubera de vaco corta y ancha (2 1O mm de dimetro interno) y ca-
F Bomba de vacod Ver la Figura 2 nectores para minimizar los requisitos de capacidad de la bomba.
El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente a la vlvula so-
G Temporizador" Ver la Figura 2 lenoide durante el lapso de tiempo requerido.
2,2 mm de dimetro interno, 3, 1 mm de dimetro externo, a nivel con la
superficie interna del tubo de recoleccin de muestra, centrado y sin re-
babas, a 59 mm de su entrada. Las llaves de presin Pl, P2 y P3 no se
Pl Llave de paso de presin Ver la Figura 2 deben abrir al exterior durante la recoleccin de la dosis.
Pl, P2, P3 Mediciones de presin1 - -

H Vlvula de control de flujo9 Ver la Figura 2 Vlvula reguladora ajustable con mximo Cv 2 1h.
A modo de ejemplo, un producto Millipore nmero XX4004700 (Millipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, MA 01 732), modificado de forma que el
tubo de salida tenga un dimetro interno de 28 mm, equipado con un producto Gelman nmero 61631.
b A/E (Gelman Sciences lnc., 600 South Wagner Road, Ann Arbor, MI 48106) o equivalente.
e Producto ASCO nmero 8030G13, Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932.
d Producto Gast tipo 1023, 1423 2565 (Gast Manufacturing lnc., PO Box 97, Benton Harbar, MI 49022) o equivalente.
e Producto Eaton nmero 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094) o equivalente.
f A modo de ejemplo, un manmetro PDM 21 O (Air-Neotronics Ltd., Neotronics Technology ple, Parsonage Road, Takeley, Bishop's Stortford, CM226PU, Gran
Bretaa) o equivalente.
g Un producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS (Parker Hannifin ple., Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1 NP, Gran Bretaa) o equivalente.
h Coeficiente de Flujo, segn lo define la norma ISA S75.02 Control valve capacity test procedure en Standards and Recommended Practices far lnstrumentation
and Control, 1Orna. edicin, Vol. 2; 1989. Publicada por lnstrument Society of America, 67 Alexander Orive, PO Box 1227, Research Triangle Park, NC 27709,
EE.UU.

Aparato 8-EI aparato es similar al que se describe en la Figura 1 para analizar los aerosoles para inhalacin. Sin embargo, en
este caso el filtro y el tubo de recoleccin tienen un dimetro interno mayor para poder alojar discos de filtro de 47 mm de
dimetro. Esta caracterstica permite la recoleccin de las dosis a mayores velocidades de flujo de aire-hasta 100 L de aire/
minuto-cuando resulta necesario. Un adaptador de boquilla garantiza un sellado hermtico entre el tubo de recoleccin y la
boquilla del polvo para inhalacin en anlisis. El adaptador de boquilla debe garantizar que el extremo de la boquilla del pro-
ducto est a nivel con el extremo abierto del tubo de recoleccin de la muestra. Los conectores de tubera, si se emplean,
deben tener un dimetro interno :?:8 mm para evitar que sus propios dimetros internos creen una resistencia significativa al
flujo de aire. Se debe seleccionar una bomba de vaco con un exceso de capacidad para extraer aire a la velocidad de flujo
volumtrico especificada a travs del aparato de muestreo y del producto simultneamente. Una vlvula de dos vas, operada
mediante solenoide, de baja resistencia y controlada por un temporizador est interpuesta entre la bomba de vaco y la vlvula
de control de flujo para controlar la duracin del flujo. Este tipo de vlvula permite que se extraigan 4,0 L de aire (5%) desde
la boquilla del producto a la velocidad de flujo especificada. El control del flujo se logra asegurando que se produzca un flujo
crtico (snico) en la vlvula de control de flujo (la relacin de presin absoluta P3/P2 es:.,:; 0,5 en condiciones de flujo estacio-
nario).
Procedimiento-Operar el aparato a un flujo de aire que produzca una cada de presin de 4 kPa (40,8 cm de H20) en el pro-
ducto a analizar y durante un lapso de tiempo que sea congruente con la extraccin de 2,0 L de aire desde la boquilla del
producto. [NOTA-Si la velocidad de flujo y la duracin se definieran de forma diferente en la monografa, ajustar el sistema
con una aproximacin de 5% con respecto a esos valores.] El volumen del aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. Deter-
minar la velocidad de flujo de prueba usando el Aparato B de la siguiente manera. Insertar el producto en el adaptador de
boquilla para asegurar un sellado hermtico. En los casos en que el envase del medicamento modifique la resistencia del pro-
ducto al flujo de aire, usar un dispositivo con el envase cargado, sin el medicamento (con el envase previamente vaciado). En
los otros casos, usar un dispositivo sin carga (sin el medicamento). Conectar un puerto de un transductor de presin diferencial
a la llave de presin, Pl, y dejar el otro abierto a la atmsfera exterior. Encender la bomba y abrir la vlvula solenoide de dos
vas. Ajustar la vlvula de control de flujo hasta que la cada de presin a travs del producto sea de 4,0 kPa (40,8 cm de H2 0).
460 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

Asegurarse de que se produzca un flujo crtico (snico) en la vlvula de control de flujo determinando los valores individuales
de presin absoluta P2 y P3 de manera que la relacin P3/P2 sea ::>0,5. Si no se logra la relacin P3/P2, cambiar la bomba por
una ms potente y medir nuevamente la velocidad de flujo. Las condiciones de flujo crtico (snico) en la vlvula de control de
flujo son necesarias para asegurar que el flujo volumtrico de aire extrado de la boquilla no se vea afectado por fluctuaciones
de la bomba y modificaciones de la resistencia al flujo de aire en el producto. Retirar el producto del adaptador de boquilla sin
alterar la vlvula de control de flujo, medir la velocidad del flujo de aire extrado desde la boquilla, Q0 u11 conectando hermtica-
mente un caudalmetro al adaptador de boquilla. Emplear un caudalmetro calibrado para medir el flujo volumtrico que sale
del medidor de manera hermtica para determinar directamente Oout o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo
volumtrico que sale del medidor (Oout) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el
flujo volumtrico de entrada (Q;n) calcular:

P0 = presin atmosfrica
!lP = cada de la presin en el medidor
Si la velocidad de flujo es >100 L de aire/minuto, ajustar la vlvula de control de flujo hasta que Oout sea igual a 100 L/minuto;
de lo contrario, registrar el valor de Ooutt sin modificar la vlvula de control de flujo. Definir la duracin del flujo de prueba,
p.ej., a 60 L/minuto T = 120/Q0 u11 en segundos, de manera que un volumen de 2,0 L de aire (5%) se extraiga del producto a
la velocidad de flujo de prueba Oout y ajustar de manera correspondiente el temporizador que controla la operacin de la vlvu-
la solenoide de dos vas. Cebar o cargar el dispositivo con polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la
etiqueta. Con la bomba de vaco en funcionamiento y la vlvula solenoide cerrada, insertar la boquilla del producto horizontal-
mente en el adaptador de boquilla. Descargar el polvo en el aparato de muestreo activando el temporizador que controla la
vlvula solenoide y extrayendo 2,0 L de aire desde el producto a la velocidad de flujo previamente definida. Repetir la opera-
cin completan - 1 veces, comenzando donde dice "Cebar o cargar el dispositivo con polvo", en donde n es el nmero de
veces definido en el etiquetado como la dosis mnima recomendada. Desmontar el envase del dispositivo de polvo para inhala-
cin del aparato de muestreo y desconectar la tubera de vaco D. Valorar el contenido de frmaco en el aparato despus de
enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado. Cuando se especifique en la monografa individual, reali-
zar esta prueba en condiciones de temperatura y humedad controladas.

B. DISTRIBUCIN DEL TAMAO DE GOTITAS/PARTCULAS-AEROSOLES, ATOMIZADORES Y

POLVOS NASALES
En el caso de aerosoles, atomizadores y polvos nasales en suspensin y en solucin, la distribucin del tamao de las gotitas/
partculas se debe determinar para la nube liberada subsiguiente a la descarga en condiciones experimentales especificadas. Si
se usa un mtodo de difraccin de lser (para ms detalles, consultar la descripcin de este mtodo en la seccin siguiente), la
distribucin del tamao de las gotitas se puede controlar en trminos de intervalos para el 1O (0 10 ), 50 (050 ) y 90 (0 90 ) per-
centil de la distribucin de tamao acumulativa ponderada por volumen (masa), as como el alcance de la distribucin, expre-
sado como [(0 90 - 0 10 )/050 ], y el porcentaje de gotitas de menos de 1O m. Se debe tomar en cuenta que 0 50 es idntico al
dimetro medio del volumen (masa) cuando la distribucin es unimodal. Los procedimientos analticos apropiados y validados
o calibrados para la determinacin del tamao de las gotitas/partculas emitidas deben describirse a detalle suficiente para per-
mitir una evaluacin exacta y reproducible que incluya lo siguiente:
informacin completa sobre el aparato y los accesorios
modo terico (aproximacin de Lorenz-Mie o de Fraunhofer)
la aplicacin de la opcin de desactivacin para uno o ms de los detectores ms internos para mitigar los efectos del
direccionamiento del haz (slo se aplica a aerosoles nasales)
versin del software
colocacin de la muestra con respecto al banco ptico del difractmetro del lser
intervalo de medicin
ancho del haz
condicin de accionamiento del lser con respecto al inicio y el trmino de la secuencia de medicin
lmite inferior de deteccin (si no se usa el accionamiento del lser)
y lmite de obstruccin de luz (lmite superior del intervalo de deteccin en trminos de la concentracin de partculas).

B.1 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Lser

Los medicamentos nasales destinados para aplicacin tpica en la cavidad nasal producen gotitas lquidas que a menudo
son mucho ms grandes que el intervalo de operacin de los impactadores inerciales multiestacin. Por ende, la difraccin de
lser (en ocasiones llamada dispersin de luz lser en ngulo bajo) es una alternativa aceptable para determinar la distribucin
del tamao debido a que no hay necesidad de relacionar la escala del tamao con el dimetro aerodinmico.
La teora y los principios operativos para la difraccin de lser se encuentran adecuadamente descritos en la norma ISO
13320:2009. Estos sistemas usan el patrn de dispersin de luz producido por el paso de una nube de gotitas a travs de la
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 461

zona de medicin para desarrollar la distribucin de tamao ponderada por volumen en un proceso iterativo en el que se usa
un modelo terico (ya sea de Fraunhofer o de Lorenz-Mie) para interpretar los datos. El proceso se resume esquemticamente
en la figura Figura 3. [NOTA-Si se selecciona la opcin del modelo de Lorenz-Mie, ser necesario ingresar valores para los
componentes reales (refraccin) e imaginarios (absorcin) del ndice de refraccin para el lquido que se est estudiando. Los
fabricantes de equipos de difraccin de lser proveen esta informacin para medios lquidos comnmente encontrados, a tra-
vs de su sitio Web o a solicitud.]

fabricante de instrumento.

Figura 3. Conversin de los datos de dispersin de luz en una distribucin del tamao de las gotitas por difractometra de
lser.

Se requiere un aparato que sea capaz de evaluar aerosoles o atomizadores. [NOTA-no todos los equipos de difraccin de
lser disponibles comercialmente tienen dicha capacidad.] Configurar el sistema de medicin de acuerdo con el procedimiento
descrito esquemticamente en la Figura 4.

Figura 4. Configuracin para difractometra de lser con un medicamento nasal.

Los atomizadores para medicamentos nasales por lo general se miden usando un arreglo de banco abierto con una configu-
racin de estacin de accionamiento automtico de manera que se pueda optimizar la reproducibilidad de la operacin del
inhalador de un accionamiento al siguiente. Esta precaucin es particularmente importante para mediciones ms exactas con
bombas para atomizadores nasales. Verificar la alineacin del inhalador con la configuracin ptica del difractmetro de lser
usando las herramientas provistas por el fabricante para optimizar el banco ptico. Verificar que la obstruccin del haz de luz
est dentro de los lmites superior e inferior especificados por el fabricante, consultando el manual del operador para el sistema
de difraccin de lser que se est usando. Es necesaria la extraccin de vaco para eliminar las gotitas de manera eficiente des-
pus de que pasan a travs del lser. Se podra presentar un resultado no representativo si el ajuste de este valor es demasiado
bajo (por lo general <5%). Asimismo, ocurrir un error no cuantificable debido a la dispersin mltiple si la obstruccin de la
luz est por encima del lmite superior recomendado. [NOTA-Este lmite vara entre fabricantes y adems puede variar entre
los sistemas de difraccin de lser del mismo fabricante.]
Realizar tantas determinaciones repetidas como sea necesario para lograr un conjunto de datos representativo. Inspeccionar
cada distribucin de tamao presentada, idealmente en formato diferencial ponderado por volumen o equivalente para eva-
462 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

luar si es o no unimodal y simtrica. [NOTA-El siguiente anlisis de datos asume el cumplimiento con estos criterios. En caso
contrario, puede ser necesario un anlisis adicional que tome en cuenta la presencia de ms de un modo en la distribucin o
sesgo.]
Asumiendo que la densidad del lquido que se investiga es constante independientemente del tamao de las gotitas, las dis-
tribuciones de tamao ponderadas por volumen se pueden tratar como distribuciones de tamao ponderadas por masa con el
propsito de interpretar los datos. A partir de los datos acumulativos de distribucin del tamao-volumen, calcular la media y
una desviacin estndar para los tamaos que correspondan a fracciones de masa de menos del 10%, 50% y 90% de la distri-
bucin (0 10, 0 50 Y 090).

C. DISTRIBUCIN DEL TAMAO AERODINMICO-AEROSOLES, ATOMIZADORES Y POLVOS

PARA INHALACIN

C.1 Principios Generales de la Medicin del Tamao Aerodinmico de Partculas

La distribucin del tamao de partculas o gotitas en la nube descargada por los aerosoles y atomizadores para inhalacin y
la distribucin del tamao de partculas en la nube descargada de los polvos para inhalacin son parmetros importantes para
evaluar el desempeo del producto. Aunque se puede usar la medicin del tamao de partcula por microscopa para evaluar
el nmero de partculas grandes, de aglomerados y de partculas extraas en las emisiones de los aerosoles y atomizadores
para inhalacin, cuando sea posible, esta prueba debe reemplazarse con un mtodo para determinar la distribucin del tama-
o aerodinmico del aerosol del frmaco que abandona el producto. El dimetro aerodinmico de una partcula de aerosol es
igual al dimetro de una esfera de densidad unitaria con la misma velocidad gravimtrica de asentamiento. La distribucin de
tamao aerodinmico define la forma en que un aerosol se deposita durante la inhalacin. En la prctica, muchos inhaladores
descargan frmaco en forma de partculas o gotitas de gran tamao (la fraccin balstica) que salen del inhalador a gran velo-
cidad e impactan quedando capturadas en las superficies hmedas de la boca y garganta. El remanente de la descarga del
inhalador es aerosol til, una "fraccin no balstica" que se inhala en el resto del tracto respiratorio.
Los dispositivos de impacto en cascada clasifican las partculas y las gotas de los aerosoles de acuerdo con los dimetros ae-
rodinmicos. El principio de operacin de estos dispositivos, mediante el cual las partculas y gotitas de aerosol se separan de la
corriente de aire en movimiento por su inercia, se muestra en la Figura 5. Debido a que las dimensiones del tubo de admisin
utilizado para conectar los productos a impactadores en cascada y a impactadores en fase lquida (que se muestran en los
Aparatos 7; 2; 3; 4; 5 y 6) tambin definen la masa del frmaco que ingresa en el dispositivo para clasificar el tamao aerodin-
mico, estas dimensiones se definen cuidadosamente y, cuando es posible, se mantienen constantes entre aparatos (ver las
Figuras 6; 7; 8; 9; 7Oy 7 7).
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 463

Partculas en aerosol

Estacin inicial
de la descarga

Sello-----~

Placa colectora

ltima estacin
de la descarga - - - - /
Placa colectora

Vaco

Figura 5. Representacin esquemtica del principio de operacin de los impactadores en cascada. (Se muestra un solo cho-
rro por estacin del impactador. Los impactadores con chorros mltiples en cada estacin funcionan de la misma manera.)

C.1.1 MEDICIN DE ESTACIN

Los fabricantes de dispositivos de impacto en cascada proporcionan una calibracin definitiva para las caractersticas de se-
paracin de cada estacin de impacto en trminos de la relacin entre la eficiencia de recoleccin a dicha estacin y el dime-
tro aerodinmico de las partculas y gotitas que la atraviesan en forma de aerosol. La calibracin es una propiedad que depen-
de de la dimensin y la disposicin espacial del chorro, de la superficie sobre la que se recoge, y de la velocidad del flujo de
aire que atraviesa. Debido a que los chorros pueden causar corrosin y desgaste a lo largo del tiempo, las dimensiones crticas
de cada estacin, que definen la calibracin de la estacin de impacto, deben medirse peridicamente. Este proceso conocido
como medicin de estacin evita la necesidad de la calibracin repetida usando aerosoles estndar y asegura que, en el anlisis
de las emisiones de los productos, slo se utilicen aquellos dispositivos que cumplen con las especificaciones. El proceso inclu-
ye la medicin y el ajuste de las dimensiones crticas del instrumento.

C.1.2 PRDIDA DE FRMACO ENTRE ESTACIONES (PRDIDAS EN LAS PAREDES)

Cuando sean posibles variaciones en la metodologa y no se especifique un aparato en la monografa, el procedimiento se-
leccionado debe asegurar que se pierda no ms del 5% de la masa de frmaco total descargada del producto (dentro del im-
pactador) entre las superficies de recoleccin de muestra del dispositivo de impacto. En el caso de que se sepa que las prdidas
de frmaco entre estaciones son >5%, se debe usar otro aparato alternativo o bien el procedimiento debe realizarse de tal for-
ma que las prdidas en las paredes se incluyan junto con la recoleccin de la placa asociada. A modo de ejemplo, los siguien-
tes procedimientos descritos para los Aparatos 7 y 3 han sido redactados incluyendo las prdidas en las paredes junto con la
placa de recoleccin asociada. No obstante, siempre que se sepa que tales prdidas son :"0:5% de la masa total de frmaco des-
cargada dentro del impactador y que no haya instrucciones contrarias en una monografa individual, el procedimiento puede
simplificarse valorando slo el frmaco que est sobre las placas de recoleccin.
464 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin /Pruebas Fsicas USP 39

C.1.3 REINGRESO POR ARRASTRE

Cuando sea posible variar la metodologa, el mtodo seleccionado debe apuntar a minimizar el reingreso de partculas por
arrastre (desde una estacin de impacto superior a una inferior) en las estaciones que contribuyan a fracciones del tamao
definido en la monografa individual, especialmente cuando esto pueda alterar las cantidades recolectadas de frmaco. Mini-
mizar el nmero de dosis muestreadas, usar superficies de recoleccin de partculas recubiertas y probar que los procedimien-
tos para dosis mltiples producen resultados estadsticamente similares a los obtenidos a partir de un nmero de dosis menor
son mtodos que se pueden emplear para este propsito. En el caso de que no se pueda evitar el reingreso por arrastre, se
deben normalizar el nmero de dosis recolectadas, el intervalo de tiempo entre dosis y la duracin total del flujo de aire a
travs del dispositivo de impacto en cascada. En estas circunstancias, la presentacin de los datos de impacto no debe asumir
la validez de la calibracin del impactador (es decir, los rangos de dimetros aerodinmicos no deben ser asignados a masas de
frmacos recolectadas en estaciones especficas).
Usando mtodos de valoracin apropiados y un dispositivo de impacto medido adecuado, los analistas pueden determinar
la distribucin de tamao aerodinmico de partculas de los frmacos que salen de las boquillas de los aerosoles y atomizado-
res para inhalacin o polvos para inhalacin. Si los lmites de temperatura o humedad para el uso del producto estn indicados
en la etiqueta, puede ser necesario controlar la temperatura y la humedad del aire del entorno del dispositivo y del aire que lo
atraviesa para que se ajusten a esos lmites. Se presumen las condiciones ambientales, salvo que se especifique algo diferente
en las monografas individuales.

C. 1 .4 BALANCE DE MASA

Adems de la distribucin de tamao, las buenas prcticas analticas dictan que se debe lograr un balance de masa comple-
to para confirmar que toda la cantidad de frmaco descargada desde el producto y que se captura y se mide en el tubo de
admisin a travs del filtro terminal del mpactador en cascada, est comprendida en el intervalo aceptable con respecto a la
dosis liberada medida. El resultado para la masa recuperada se puede expresar en trminos de cada accionamiento como por-
centaje de la dosis liberada declarada, la cual representa la dosis liberada desde la boquilla.
La masa total de frmaco recolectada en todos los componentes (balance de material) dividida por el nmero total de dosis
mnimas recomendadas descargadas es por lo regular no menos de 85% y no ms de 115% de la cantidad declarada que se
espera liberar. sta no es una prueba del producto pero sirve para asegurar que los resultados de la prueba son vlidos.
Procedimiento
Usar uno de los siguientes dispositivos de impacto multiestacin, o uno equivalente, para determinar la distribucin de ta-
mao aerodinmico de partculas de los frmacos que salen de las boquillas de aerosoles y atomizadores para inhalacin o
polvos para inhalacin. Los Aparatos 1 y 6 [Figuras 6 y 11 (sin preseparador), respectivamente] estn destinados para su uso
con aerosoles y atomizadores para inhalacin a una sola velocidad de flujo de aire. Los Aparatos 2, 3, 4 y 5 (Figuras 8, 9, 1Oy
11, respectivamente) estn destinados para uso con polvos para inhalacin a la velocidad de flujo de aire apropiada, Q0 w de-
terminada anteriormente, siempre que el valor Oout est comprendido en el intervalo de 30-100 L/minuto. [NOTA-Si Oout es
>100 L/minuto, la prueba debe ser realizada ajustando Oout a 100 L/minuto; si Oout es menor que 30 L/minuto, la prueba se
realiza con Oout a 30 L/minuto.]
La Tabla 2 indica el aparato usado para determinar el tamao aerodinmico de partculas y los productos que se pueden
evaluar.
Tabla 2. Aparato para Tamao Aerodinmico de Partcula:
Su Descripcin y los Productos que se Pueden Evaluar
Aparato Descripcin Producto
1 lmpactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (sin preseparador) Aerosoles y atomizadores para inhalacin
2 lmpactador Marple-Miller Polvos para inhalacin
3 lmpactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (con preseparador) Polvos para inhalacin
4 lmpactador Multiestacin en Fase Lquida Polvos para inhalacin
5 lmpactador de Nueva Generacin (con preseparador) Polvos para inhalacin
6 lmpactador de Nueva Generacin (sin preseparador) Aerosoles y atomizadores para inhalacin

Tabla 3. Valores Lmite para Todos los lmpactadores a Velocidades de Flujo Especificadas
a. Puntos de Corte para los Aparatos 1 y 3 con Configuracin Estndar para Operacin a 28,3 L/mlnuto en Comparacin con
Configuraciones Especializadas para Uso a 60 L/ minuto
y 90 L/m 1nulo
Estacin 28,3 mL/minuto 60 L/mlnuto 90 L/mlnuto
-2 - - 8,0
-1 - 8,6 6,5

9,0 6,5 5,2

La versin de la estacin O usada a 60 y 90 L/minuto presenta modificacin externa que permite otra estacin en lugar de equiparla con el cono adaptador de
admisin. Sus caractersticas y desempeo internos se mantienen sin cambios.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 465

Tabla 3. Valores Lmite para Todos los lmpactadores a Velocidades de Flujo Especificadas
a. Puntos de Corte para los Aparatos 1 y 3 con Configuracin Estndar para Operacin a 28,3 L/minuto en Comparacin con
Configuraciones Especializadas para Uso a 60 L/mlnuto y 90 L/mlnuto (Continuacion)
Estacin 28,3 mL/mlnuto 60 L/minuto 90 L/mlnuto
1 5,8 4,4 3,5
2 4,7 3,2 2,6
3 3,3 1,9 1,7
4 2,1 1,2 1,0
5 l, 1 0,55 0,22
6 0,7 0,26 -
7 0,4 - -

La versin de la estacin O usada a 60 y 90 L/minuto presenta modificacin externa que permite otra estacin en lugar de equiparla con el cono adaptador de
admisin. Sus caractersticas y desempeo internos se mantienen sin cambios.

b . Puntos d e corte m ) para e Aparato 2a6 0y9 0L/m

1 nuto
Velocidad de Flujo Velocidad de Flujo
Estacin 60 L/mlnuto 90 L/mlnuto
1 10,0 8,1
2 5,0 4,0
3 2,5 2,0
4 1,25 1,0
5 0,63 0,5

c. Puntos de Corte (m) para el Aparato 4 a 60 L/mlnuto

Velocidad de Flujo
Estacin (60 L/mlnuto)
1 13,0
2 6,8
3 3,1
4 1,7

d puntos d e corte ( m para e IA.parato 5 y 6 a 30I 60 y 100 L/ mnu

1 to
Velocidad de Flujo Velocidad de Flujo Velocidad de Flujo
Estacin (30 L/mlnuto) (60 L/mlnuto) (100 L/mlnuto)
1 11,76 8,06 6,12
2 6,40 4,46 3,42
3 3,97 2,82 2,18
4 2,30 1,66 1,31
5 1,36 0,94 0,72
6 0,83 0,55 0,40
7 0,54 0,34 0,24
Moca 0,36 0,14 0,07
MOC =colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls). Los tamaos corresponden a una eficiencia de recoleccin del 80% para esta estacin de
respaldo.

C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalacin-lmpactador Andersen (sin

preseparador)

Usar el Aparato 7 o un equivalente, a una velocidad de flujo de 28,3 L/minuto (5%) conforme a lo especificado por el fabri-
cante del impactador en cascada.
466 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

C.2.1 DISEO-APARATO 1

El diseo y montaje de este aparato y del tubo de admisin para conectar el impactador a un producto se muestran en las
Figuras 6, 6a y 6b.1

Boquilla del
-Inhalador

Figura 6. Aparato 1: Montaje del tubo de admisin y del cono de ingreso sobre el impactador en cascada.

f>erfor!runorifkbyoclulr
<XlllUntomilkldacabezaM-4 10 1 30 1
o#S-32(2)
Nota: Usar la mnima luz para
atornillarlaparteinferiory
permitir una alineacin precisa. /
/
/
/
/
14,3 / La junta DEBE ser a prueba de fugas
/
/
/

/~ 45't1' tomillo de cabeza roscada

Nmero 8-32 6 M-4~--""

Nota
1) El material puede ser aluminio, acero 38
inoxidable u otro material adecuado
2) Tornear a partir de una barra estndar de 38 mm (1,5*)
3) Hacer un orificio de 19 mm en la barra '
4) Cortar el tubo en un ngulode45 exactos como se muestra :.. -10 1
5) La parte interna de los orfficios y de los estrechamientos debe estar pulida
La rugosidad de la superficie (Ra) es de aproximadamente
0,40 micrones (16 micropulgadas)
6) Pulir las juntas en la barra para generar un sello sin fugas Vista isomtrica del
para los liquidos
7) Montar un soporte para alinear el interior del orificio de 19 mm y
tubo de admisin
para taladrar las roscas M-4 x 0,7 8-32 y obturarlas.
Prcticamente no debe haber defectos de alineacin entre el
interior de los orificios en la junta

Figura 6a. Aparato 1: Vista expandida del tubo de admisin para uso con aerosoles y atomizadores para inhalacin y polvos
para inhalacin.

1 Se puede obtener un impactador en cascada adecuado como Modelo Mk 11 de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador se usa sin
el preseparador. El producto se conecta al impactador a travs del tubo de admisin, por encima del cono de ingreso que se muestra en la Figura 6. Si se emplea
un impactador equivalente, se debe utilizar el tubo de admisin de la Figura 6a, aunque el cono de ingreso (Figura 6b) debe ser reemplazado por otro que se ajuste
al impactador en cuestin. Se debe tener en cuenta que las superficies internas del tubo de admisin (Figura 6a) estn diseadas para ajustarse a nivel con sus
contrapartes en el cono de ingreso (Figura 6b). Este diseo evita la captura del aerosol en la junta entre los dos tubos.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 467

6,4
Romper todos los bordes
EXCEPTO este borde interno

+25,4 ,1

Puerto de entrada del muestreador de Andersen

12,3 30.2

R 9,5 l !

Profundidad: 2,5 hasta el _ _ _~

fondo del estrechamiento
del agujero

Las medidas estn en mm a menos que se indique algo diferente

Figura 6b. Aparato 1: Vista expandida del cono de ingreso para montar el tubo de admisin en el impactador en cascada
Andersen sin preseparador. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado. La rugosidad de la su-
perficie (R0 ) debe ser aproximadamente de 0,4 m.

Las dimensiones crticas de ingeniera de los fabricantes para las estaciones del Aparato 7 figuran en la Tabla 4. Durante el
uso, puede producirse la oclusin y bloqueo de las toberas de chorros y, por lo tanto, es necesario justificar las tolerancias de
medicin durante el uso.
Tabla 4. Dimensiones Crticas para las Toberas de Chorro del Aparato 1
Nmero Dimetro de
Nmero de Estacin de Chorros Tobera (mm)
o 96 2,55 0,025
1 96 1,89 0,025
2 400 0,914 0,013
3 400 0,711 0,013
4 400 0,533 0,013
5 400 0,343 0,013
6 400 0,254 0,013
7 201 0,254 0,013

C.2.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 1

Ajustar el impactador en cascada de mltiples estaciones segn se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro
terminal debajo de la ltima estacin para capturar todas las partculas finas que de otra manera escaparan del dispositivo.
Para asegurar una captura eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glice-
rol, aceite siliconado u otro lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya
demostrado que esto es innecesario. Unir el tubo de admisin y el adaptador de boquilla de manera que se produzca un sella-
do hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin segn se muestra en la Figura 6. Emplear un adaptador de
boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo abierto del tubo de admisin.
Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada estn conectadas y selladas hermticamente para evitar
fugas. Encender la bomba de vaco para extraer el aire a travs del impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a travs del
sistema con un caudalmetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisin. Ajustar la vlvula de control de flujo en
la bomba de vaco para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velocidad requerida y asegurarse de que el flujo de
468 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

aire a travs del sistema quede comprendido en un intervalo de 5% con respecto a la velocidad de flujo especificada por el
fabricante. A menos que se indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5
segundos y accionar el disparador para desechar una descarga. Con la bomba de vaco en funcionamiento, insertar la boquilla
en su adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la dosis mnima recomendada en el impactador en cascada. Mante-
ner la vlvula presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se re-
quieren atomizaciones adicionales para recolectar la muestra, esperar 5 segundos antes de desmontar el producto del adapta-
dor de boquilla, agitar el producto, colocarlo nuevamente en el adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la siguien-
te dosis mnima recomendada. Repetir hasta que se haya descargado el nmero de dosis requerido. El nmero de dosis mni-
mas recomendadas debe ser tal que permita una determinacin exacta y precisa de la distribucin de tamao aerodinmico.
[NOTA-Usualmente, el nmero de dosis mnimas recomendadas no es >1 O.] Despus de descargar la ltima dosis, retirar el
producto del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisin con un disolvente adecuado, y
diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada, colocar cada esta-
cin y su respectiva placa de recoleccin o filtro asociado en sendos recipientes y enjuagar para extraer el frmaco de cada uno
de stos. [NOTA-Si se ha determinado que las prdidas en las paredes del impactador son ~5%, entonces se necesita analizar
solamente el material recolectado en las placas.] Diluir cada uno cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Empleando el
mtodo de anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada uno de los
componentes. Para analizar los datos, proceder segn se indica en Anlisis de Datos.

C.3 Aparato 2 para Polvos para lnhalacin-lmpactador Marple-Miller

C.3.1 DISEO-APARATO 2

El diseo y el montaje del Aparato 2 y del tubo de admisin para conectar el impactador al producto se muestran en la
Figura 8. 2 [NOTA-El tubo de admisin se muestra en detalle en la Figura 6a.] El impactador tiene cinco estaciones de impacta-
cin y un filtro terminal. A una velocidad de flujo volumtrico de aire de 60 L/minuto (la velocidad del flujo nominal, Q"), los
dimetros aerodinmicos lmite D5 o,Qn de las Estaciones 1-5 son 1O; 5; 2,5; 1,25 y 0,625 m, respectivamente. El filtro terminal
retiene eficazmente el frmaco suspendido en el aerosol en el rango de tamao de partcula de hasta 0,625 m. Colocar el
impactador en cascada multiestacin con el sistema de control segn se especifica en la Figura 7. Para asegurar una captura
eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol, aceite siliconado u otro
lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya demostrado que esto es in-
necesario. Ensamblar el impactador, segn se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de
la estacin final para capturar todas las partculas finas que de otra manera escaparan del dispositivo. Unir el tubo de admisin
y el adaptador de boquilla, de manera que se produzca un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admi-
sin. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo
abierto del tubo de admisin. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada estn conectadas y sella-
das hermticamente para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vaco, abrir la vlvula solenoide y calibrar el flujo de aire a travs del sistema segn se indica a
continuacin. Conectar un caudalmetro al tubo de admisin. Emplear un caudalmetro calibrado para medir el flujo volumtri-
co que sale del medidor para determinar directamente Oaut o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo volumtri-
co que sale del medidor (Qout) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo volu-
mtrico de entrada (Q;n), calcular:

P0 = presin atmosfrica
!J.P = cada de la presin en el medidor
Ajustar la vlvula de control de flujo para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velocidad requerida, Oaut' de mane-
ra que el valor de Oout est dentro del 5% del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Asegurar
que se produzca el flujo crtico en la vlvula de control de flujo a la velocidad de flujo que se va a emplear durante la prueba,
empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulacin, medir
la presin absoluta a ambos lados de la vlvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relacin de P3/P2 ~0,5 indica
flujo crtico. Si no se alcanza esta relacin de P3/P2, cambiar la bomba por una ms potente y medir nuevamente la velocidad
de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas, de manera que abra
esta vlvula durante un lapso de T segundos, segn se determin durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o
cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vaco en funciona-
miento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de
boquilla del tubo de admisin. Descargar el polvo dentro del aparato, abriendo la vlvula solenoide de dos vas durante un
lapso de T segundos. Despus de que la vlvula solenoide de dos vas se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de
boquilla. Si se requieren dosis adicionales para recolectar la muestra, recargar el producto segn las instrucciones que figuran

2 Se puede obtener el impactador en cascada como Modelo 160 Marple-Miller lmpactor en MSP Corporation, Minneapolis, MN. El producto debe conectarse al
impactador mediante el tubo de admisin que se muestra en la Figura 6a.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 469

en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operacin hasta que el nmero de dosis requerido
haya sido descargado. Despus de la descarga de la ultima dosis, apagar la bomba de vaco. Enjuagar el adaptador de boquilla
y el tubo de admisin con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Des-
montar el impactador en cascada y colocar el filtro terminal en un recipiente aparte. Enjuagar para extraer el frmaco de cada
una de las estaciones y del filtro y diluir cuantitativamente cada uno hasta un volumen apropiado. Empleando el mtodo de
anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada uno de los componentes.

F Adaptador
Vlvula de control de flujo de boquilla
E

Aparatos
2, 34

Bomba
de vaco
solenoide
P3 P2
D
de dos vas
e
A B

Figura 7. Aparatos 2; 3, 4 5: Equipos de control general. 0Jer la Tabla 6 para especificaciones de los componentes.)

Recipiente de cubeta
recolectora de la

Figura 8. Aparato 2: Montaje del tubo de admisin, colector de estaciones y portafiltro. (lmpactador Marple-Miller, Modelo
160 con tubo de admisin USP.)

Tabla 5. Dimensiones Crticas para las Toberas de Chorro del Aparato 2

Nmero de Nmero de Dimetro de
Estacin Chorros Tobera (mm)
1 1 16,8 0,05
2 20 3,40 0,03
3 40 1,70 0,01
4 80 0,84 0,01
5 160 0,410,01
 470 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

C.3.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 2

Realizar la prueba utilizando el Aparato 2 a la velocidad de flujo de aire, Oout determinada anteriormente, durante la prueba
de Uniformidad de Dosis Liberada, siempre que Oout sea :s;l 00 L/minuto. [NOTA-Si Oout es> 100 L/minuto, utilizar una velocidad
de flujo de aire de 100 L/minuto.] Conectar el aparato al sistema de control de flujo basado en el flujo crtico (snico) segn se
especifica en la Figura 7 (ver tambin la Tabla 6).
Tabl a 6. Especlf"1cac ones d e 1os Componentes para a Figura 7
Cdigo Artculo Descripcin Dimensiones
p.ej., acoplamiento corto de metal con ra-
A Conector mificacin a P3 de dimetro menor 2:8 mm de dimetro interno
p.ej., tubera de silicona con un dimetro
externo de 14 mm y un dimetro interno Un tubo de longitud adecuada de dimetro interno 2:8 mm
B Tubera de vaco de8mm con un volumen interno de 25 ml 5 ml
Vlvula solenoide de 2 vas, 2 puertos, con un dimetro in-
Vlvula solenoide de dos terno 2:8 mm y un tiempo de respuesta de apertura de
c vas Ver la Figura 7 ~100 milisegundos.

La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo

requerida a travs del aparato ensamblado con el inhala-
dor de polvo seco en el adaptador de boquilla. Conectar
la bomba a la vlvula solenoide empleando una tubera de
vaco corta y ancha (2:1 O mm de dimetro interno) y co-
nectores para minimizar los requisitos de capacidad de la
D Bomba de vacob Ver la Figura 7 bomba.
El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente
a la vlvula solenoide durante el lapso de tiempo requeri-
E Temporizador<= Ver la Figura 7 do.
Determinadas en condiciones de flujo estacionario con un
P2, P3 Mediciones de Presin transductor de presin absoluta.
F Vlvula de control de flujod Ver la Fiqura 7 Vlvula reguladora ajustable con Cv 2:1 mximo.
Amodo de ejemplo, el producto ASCO nmero 8030Gl 3 (Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932) o equivalente. Ver tam-
bin la nota al pie h en la Tabla 1.
b Producto Gast tipo 1023, 1423 2565 (Gast Manufacturing lnc., PO Box 97, Benton Harbor, MI 49022) o equivalente.
e Amodo de ejemplo, el producto Eaton nmero 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094)
o equivalente.
d Producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS o equivalente (Parker Hannifin ple, Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaa). Ver tambin la nota
al pie h en la Tabla 1.
En condiciones de flujo constante, a la velocidad de flujo de aire volumtrico apropiada a travs de todo el aparato, asegu-
rarse de que se ocasione un flujo crtico (snico) en la vlvula de control de flujo determinando los valores de presin absoluta,
P2 y P3, de manera que la relacin P3/P2 sea :s;0,5. Si no se alcanza esta relacin de P3/P2, cambiar la bomba por una ms
potente y medir nuevamente la velocidad de flujo de prueba. Recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada una de
las estaciones del impactador en cascada para asegurar que las partculas que hayan impactado en una estacin dada no se
reintroduzcan por arrastre en la corriente de aire que fluye a menos que se haya demostrado que esto no es necesario. Analizar
los datos segn se indica en Anlisis de Datos.

C.4 Aparato 3 para Polvos para lnhalacin-lmpactador Andersen (con preseparador)

C.4.1 DISEO-APARATO 3

El Aparato 3 es idntico al Aparato 1 (Figura 6), excepto que el preseparador del fabricante se instala encima de la Estacin O
para recolectar masas grandes de polvo no inhalable antes de que ingresen al impactador; y la conexin de salida, que se utili-
za para conexin al tubo de vaco B (Figura 7), se reemplaza por otra que tenga un dimetro interno ~8 mm. Para conectar el
preseparador del impactador al tubo de admisin (Figura 6a), usar una pieza superior especialmente diseada para el presepa-
rador. Esto se muestra en la Figura 93 Por lo tanto, el impactador tiene ocho estaciones, un preseparador (para recoleccin de
partculas grandes) y un filtro terminal. Puede no requerirse un preseparador para ciertos polvos modificados por ingeniera, en
especial aqullos con baja densidad aparente. Conectar el impactador en cascada al sistema de control especificado en la Figu-
ra 7. Omitir la Estacin 6 y la Estacin 7 del impactador si la velocidad de flujo de prueba, Oout usada durante el anlisis de
Uniformidad de Dosis Liberada fue ~60 L/minuto. Para asegurar una captura eficiente de partculas, recubrir la superficie de re-
coleccin de partculas de cada estacin con glicerol, aceite siliconado u otro lquido adecuado generalmente depositado a
partir de un disolvente voltil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Ensamblar el impactador, segn se

3 El impactador en cascada est disponible como el producto Andersen 1ACFM Non-Viable Cascade Impactar (Mark 11) de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway,
Franklin, MA 02038. El impactador se usa con el preseparador.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 471

describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de la estacin final para capturar todas las part-
culas finas que de otra manera escaparan del dispositivo. Colocar un volumen adecuado (hasta 1 O ml) de un disolvente apro-
piado en el preseparador o recubrir las superficies de recoleccin de partculas del preseparador para prevenir el reingreso de
las partculas impactadas por arrastre. [Precaucin-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-vapor inflamables que se
pueden incendiar durante su pasaje a travs de la bomba de vaco. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alternati-
vos, uso de trampas de vapor, tiempos de operacin de la bomba mnimos, etc.) para garantizar la proteccin del operador durante
la prueba.] Conectar un adaptador de boquilla moldeado al extremo del tubo de admisin de manera que se produzca un
sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el
extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo abierto del tubo de admisin. Asegurarse de que las diferentes
estaciones del impactador en cascada estn conectadas y selladas hermticamente para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vaco, abrir la vlvula solenoide de dos vas y calibrar el flujo de aire a travs del sistema segn
se indica a continuacin. Cebar o cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con
la bomba de vaco en funcionamiento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma
horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisin. Una vez que el inhalador est en posicin, descargar el polvo
dentro del aparato activando el temporizador y abriendo la vlvula solenoide de dos vas durante el lapso de tiempo requerido,
T 5%, segn se determin durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Despus de que la vlvula solenoide de dos
vas se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el
polvo para inhalacin segn las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y
repetir la operacin hasta que el nmero de dosis requerido haya sido descargado. Despus de la descarga de la ltima dosis,
retirar el inhalador del adaptador de boquilla y apagar la bomba de vaco.
Desmontar cuidadosamente el aparato. Usando un disolvente adecuado, enjuagar para extraer el frmaco del adaptador de
boquilla, el tubo de admisin y el preseparador, y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Enjua-
gar para extraer el frmaco de cada estacin y de la placa de impacto situada inmediatamente debajo y recoger los enjuagues
en matraces de tamao apropiado. Diluir cuantitativamente cada matraz hasta un volumen apropiado. Empleando el mtodo
de anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada una de las muestras.
472 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

44_1
38,s+~-1
Los radios se muestran en vista superior y en seccin
transversal para mayor claridad

19-1
15-
Seccin transversal
R 12,7

13-1
14,4-

a-
R 15
-R15,87~~
ll!2l+-- R 14,4
r;r_, 1--....__Ranura para la
R 12,7
-R19 junta trica

R38,3~.~
-Re
R6,70 ,03 -R6,70,03
453'

Excepto cuando se indique lo contrario,

todos los bordes se deben romper y eliminar los
rebordes
Las superficies deben estar bien pulidas a mquina,
Junta trica: Dimensiones nominales: DI= 29 mm,
= ~ DE= 32 mm, Ancho= 1,8 mm

Las medidas estn en mm a menos que se indique

algo diferente

Figura 9. Aparato 3: Vista expandida de la parte superior del preseparador Andersen adaptado al tubo de admisin USP. El
material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado; el interior debe estar pulido hasta una rugosidad de
superficie (R0 ) de aproximadamente 0,4 m.

C.4.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 3

Proceder segn se indica en el Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 3.

C.5 Aparato 4 para Polvos para lnhalacin-lmpactador (lmpinger) Multiestacin en Fase Lquida
NOTA-El Aparato 4, un impactador multiestacin en fase liquida, tiene un nmero reducido de estaciones y su uso est am-
pliamente difundido fuera de los Estados Unidos. Se proporciona en este documento para beneficio de los usuarios de otros
pases.

C.5. 1 DISEO-APARATO 4

El diseo y el montaje del Aparato 4 se muestran en las Figuras 1O, 1Oa y 1Ob. 4 El tubo de admisin, empleado para conectar
el impactador (impinger) multiestacin en fase lquida a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impacta-
dor multiestacin en fase lquida que consiste en las Estaciones de impacto 1; 2; 3 y 4 y un filtro terminal integrado (Estacin
5). Las estaciones de recoleccin del impactador multiestacin en fase lquida (ver la Figura 1Oy la Tabla 1) se mantienen h
medas, a diferencia de los impactadores tradicionales, como por ejemplo los Aparatos 1; 2; 3; 5 y 6. Este humedecimiento pue-
de producir un efecto similar al recubrimiento de las estaciones de los Aparatos 2; 3; 5 y 6 a determinadas velocidades de flujo,
aunque esto debe confirmarse demostrando el control del reingreso por arrastre segn se ha descrito previamente. Una esta-

4 El impactador en fase lquida de cinco estaciones est disponible en Copley lnstruments, ple, Nottingham, Gran Bretaa. El producto debe conectarse al impac-
tador mediante el tubo de admisin que se muestra en la Figura 8 y la Figura 6a.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 473

cin de impacto comprende una pared divisoria metlica horizontal y superior (B) a travs de la cual sobresale un tubo metli-
co de entrada de chorro (A) con su placa de impacto (D); un cilindro de vidrio (E) con una abertura de muestreo (F), que
forma la pared vertical de la estacin; y una pared divisoria metlica horizontal inferior (G) a travs de la cual un tubo (H) se
conecta a la estacin inferior. El tubo que entra en la estacin 4 (U) termina en una disposicin de chorros mltiples. La placa
de impacto (D) se asegura en un marco metlico (J), el cual se ajusta mediante dos alambres (K) a un manguito (L) asegurada
sobre el tubo de chorro (C). Para ms detalles sobre el tubo de chorro y la placa de impacto, ver la Figura 7Oa. El plano hori-
zontal de la placa de recoleccin es perpendicular al eje del tubo de chorro y se alinea centralmente. La superficie superior de
la placa de impacto se eleva levemente por encima del borde del marco metlico. Un surco alrededor del permetro de la pa-
red divisoria horizontal gua la posicin del cilindro de vidrio. Los cilindros de vidrio se sellan con juntas (M) contra las paredes
divisorias horizontales y se sujetan mediante seis pernos (N). Las aberturas de muestreo se sellan con tapones. El fondo de la
pared divisoria inferior de la Estacin 4, tiene una protuberancia concntrica fijada con una junta trica de goma (P) que la
sella contra el borde de un filtro colocado en el portafiltro. El portafiltro (R), es una cubeta con un hueco concntrico en el que
se calza un soporte de filtro perforado (S). El portafiltro est diseado para filtros de 76 mm de dimetro. El montaje completo
de la estacin de impacto se ajusta al portafiltro mediante dos cierres de funcionamiento ultrarrpido (T). El impactador mul-
tiestacin en fase lquida est equipado con un tubo de admisin (Figura 6a) que se ajusta al tubo de entrada de chorro de la
Estacin 1. Una junta trica de goma en el tubo de chorro proporciona un sellado hermtico al tubo de admisin. Un adapta-
dor de boquilla elastomrico para insertar el producto en anlisis proporciona un sellado hermtico entre la boquilla del pro-
ducto y el tubo de admisin.
Asegurarse de que el Aparato 4 est limpio y exento de solucin del frmaco proveniente de pruebas anteriores. Colocar un
filtro de 76 mm de dimetro en la estacin de filtro y montar el aparato. Usar un filtro de baja presin capaz de recolectar
cuantitativamente el aerosol del frmaco que lo atraviesa, que tambin permita una recuperacin cuantitativa del frmaco re-
colectado. Armar el Aparato 4 empleando el sistema de control especificado en la Figura 7. Unir el tubo de admisin (Figura 6a)
y el adaptador de boquilla para que se produzca un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin.
Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo abierto
del tubo de admisin. Asegurarse de que las diferentes estaciones del aparato estn conectadas hermticamente para evitar
fugas. Poner en marcha la bomba de vaco, abrir la vlvula solenoide de dos vas y calibrar el flujo de aire a travs del sistema
segn se indica a continuacin. Conectar al tubo de admisin un caudalmetro calibrado para medir la velocidad del flujo volu-
mtrico que sale del medidor. Ajustar la vlvula de control de flujo para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velo-
cidad requerida, "" de manera que el valor de Q00 , est dentro del 5% del valor determinado durante la prueba de Uniformi-
dad de Dosis Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crtico en la vlvula de control de flujo al valor Q00 , que se va a emplear
durante la prueba, empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en
circulacin, medir la presin absoluta a ambos lados de la vlvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relacin de
P3/P2 :S:0,5 indica flujo crtico. Si no se alcanza esta relacin de P3/P2, cambiar la bomba por una ms potente y medir nueva-
mente la velocidad de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas,
de manera que abra esta vlvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se emple durante la prueba de Uniformidad
de Dosis Liberada. Dispensar 20 mL de un disolvente capaz de disolver el frmaco dentro de cada una de las cuatro estaciones
superiores del Aparato 4 y colocar nuevamente los tapones. [Precaucin-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-
vapor inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a travs de la bomba de vaco. Tomar las precauciones correspondien-
tes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operacin de la bomba mnimos, etc.) para garantizar la protec-
cin del operador durante la prueba.] Inclinar el aparato para humedecer los tapones y de esa forma neutralizar sus cargas elec-
troestticas. Ajustar el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas, de manera que abra la vl-
vula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se emple durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o
cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vaco en funciona-
miento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de
boquilla del tubo de admisin. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la vlvula solenoi-
de de dos vas durante el lapso requerido, T 5%. Despus de que la vlvula solenoide de dos vas se haya cerrado, retirar el
producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhalacin segn
las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operacin hasta que el
nmero de dosis requerido haya sido descargado. Despus de descargar la ultima dosis, apagar la bomba de vaco.
Desarmar la estacin de filtro del Aparato 4. Cuidadosamente retirar el filtro (Figura 7Ob) y extraer el frmaco con disolvente.
Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisin con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente
hasta un volumen apropiado. Enjuagar el interior del tubo de chorro de entrada que va a la Estacin 1 (Figura 7O), permitiendo
que el disolvente fluya dentro de la estacin. Enjuagar para extraer el frmaco de las paredes internas y de la placa de recolec-
cin de cada una de las cuatro estaciones superiores del aparato y transferir a la solucin de la estacin respectiva, inclinando y
rotando el aparato, asegurndose de que no haya transferencia de lquido entre las estaciones. Empleando el mtodo de anli-
sis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada uno de los seis volmenes de
disolvente. Asegurarse de que el mtodo corrija la posible evaporacin de disolvente durante la prueba. Esto puede involucrar
el uso de un estndar interno (de concentracin original conocida en el disolvente y valorado al mismo tiempo que el frmaco)
o la transferencia cuantitativa del contenido lquido de cada una de las estaciones, seguida por una dilucin hasta un volumen
conocido. Empleando el mtodo de anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolec-
tada en cada una de las muestras.
474 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

Q~~A
ti_____1__j ,,,r- e
Estacin 1

Estacin 2

Estacin 3
- :- -(
1 1

Estacin 4

Estacin 5 (filtro)

V--+--_.,

Figura 1O. Aparato 4: Esquema del impactador multiestacin en fase lquida. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los
componentes.)
Tabla 7. Unidades Componentes del lmpactador (lmplnger) Multlestacln en Fase Lquida
(ver la Figura 1O, la Figura 1Oa y la Figura 1Ob)
Dimensiones
(en mm a menos que se
Cdigo Artculo Descripcin Indique algo diferente)
Tubo de metal atornillado a una pared divisora se-
A,H Tubo de chorro liada por una junta (C), superficie interna pulida Ver la Figura 1Oa
B, G Pared divisoria Placa circular de metal, dimetro 120
Grosor Ver la Figura 1Oa
e junta p.ej., de PTFE Para adaptarse al tubo del chorro
D Placa de impacto Disco de vidrio sinterizado de porosidad O
Dimetro Ver la Figura 1Oa
E Cilindro de vidrio Tubo de vidrio cortado pulido plano
Altura, incluyendo juntas 46
Dimetro externo 100
Espesor de pared 3,5
Dimetro (F) de la abertura de muestreo 18
Tapn de la abertura de muestreo ISO 24/25
J Marco de metal Marco circular con perfil en L con ranura
Dimetro interno Para adaptarse a la placa de impacto
Altura 4
Grosor de la seccin horizontal 0,5
Grosor de la seccin vertical 2
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 475

Tabla 7. Unidades Componentes del lmpactador (lmpinger) Multiestacln en Fase Lquida

(ver la Figura 1O, la Figura 1Oa y la Figura 1Ob) (Continuacin)
Dimensiones
(en mm a menos que se
Cdigo Artculo Descripcin Indique algo diferente)
Alambre de acero que interconecta el marco de
K Alambre metal y el manguito (dos por cada marco)
Dimetro 1
Manguito metlico fijado al tubo de chorro me-
L Manguito diante tornillos
Dimetro interno Para adaptarse al tubo del chorro
Altura 6
Grosor 5
M junta p.ej., de silicona Para adaptarse al cilindro de vidrio
N Perno Perno con tuerca de metal (seis pares), longitud 205
Dimetro 4
p junta trica junta trica de goma, dimetro x grosor 66,34 X 2,62
Q junta trica junta trica de goma, dimetro x grosor 29,1 X 1,6
R Portafiltro Bastidor de metal con pie y salida Ver la Figura 1Ob
s Soporte de filtro Lmina de metal perforada, dimetro 65
Dimetro de orificio 3
Distancia entre orificios (puntos centrales) 4
Cierres de funciona-
T miento ultrarrpido
Tubo de chorros Tubo de chorro (H) que termina en disposicin de
u mltiples chorros mltiples Ver insertos en Figura 1Oa
V Salida Salida y tobera para conexin a vaco Dimetro interno 2'.l O (Figura 1Ob)

Centro de la estacin

Figura 1Oa. Aparato 4: Detalles del tubo de chorro y la placa de impacto. Los insertos muestran el extremo del tubo de cho-
rros mltiples (U) que lleva a la Estacin 4. 0fer la Tabla 8 para especificaciones de dimensiones.)

Tabla 8. Aparato 4--Dimensiones del lmpactador Multiestacin en Fase Lquida.

Nmero de Tobe- Dimetro
Estacin ras (mm)
Valor
Nominal Tolerancia ()
1 1 25,0 o, a
2 1 14,0 o,ia
3 1 8,0 o,ia
Cortesa de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaa.
476 (601 > Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 8. Aparato 4-Dimensiones del lmpactador Multiestacin en Fase Lquida. (Continuacin)

Nmero de Tobe- Dimetro
Estacin ras (mm)
1 Entrada 6,3 1 o,,.
4 1 Salida 7 2,7 1 0,05
Cortesa de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaa.

10mm
Smm

Figura 1Ob. Aparato 4: Vista expandida de la Estacin 5. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componentes.)

C.5.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 4

Proceder segn se indica en Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 4.

C.6 Aparato 5 para Polvos para lnhalacin-lmpactador de Nueva Generacin (con preseparador)

C.6.1 DISEO-APARATO 5

El diseo y montaje del Aparato 5 5 se muestran en las Figuras 7 1, 7 7a, 7 7b, 7 7e y 7 7d. El tubo de admisin, empleado para
conectar el impactador a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impactador en cascada con siete estacio-
nes y un colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls). Las curvas de eficiencia de recoleccin para cada estacin
son marcadas y minimizan la superposicin entre estaciones. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material
adecuado.
El diseo del impactador presenta cubetas de impacto extrables con todas las cubetas en un mismo plano (Figuras 7 7- 7 7e).
El impactador tiene tres secciones principales: el marco inferior que aloja las cubetas de impacto, el cuerpo sellador que man-
tiene en su lugar los chorros y la tapa que contiene los pasajes entre estaciones (que se muestran en las Figuras 7 7- 7 7b). Se
emplean mltiples toberas en todas las estaciones salvo en la primera ( 7 7e). El flujo pasa a travs del impactador siguiendo un
patrn en forma de dientes de sierra.
La medicin de la estacin se realiza peridicamente junto con la confirmacin de otras dimensiones crticas para el eficaz
funcionamiento del impactador. Las dimensiones crticas se proporcionan en la Tabla 9.
Ta bl a 9 o1mens1ones e
rit 1cas para os A paratos 5 y 6
Dimensiones
Descripcin (mm)
Preseparador (ver la Dimensin a en la Figura 7 7d) 12,80 0,05
Estacin 1 -Dimetro de tobera 14,30 0,05
Estacin 2" -Dimetro de tobera 4,88 0,04
Estacin 3 -Dimetro de tobera 2,185 0,02
Estacin 4 -Dimetro de tobera 1,207 0,01
Estacin 5 -Dimetro de tobera 0,608 0,01
Estacin 6-Dimetro de tobera 0,323 0,01
Estacin 7-Dimetro de tobera 0,206 0,01
MOC Aproximadamente 0,070
Profundidad de cubeta opcional (ver la Dimensin ben la Figura 77b) 14,6250,10
Ver la Figura 77c. MOC = colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls).
b Ver la Figura 77b.

5 El impactador en cascada puede obtenerse como Next Generation Pharmaceutical lmpactor en MSP Corporation, Minneapolis, MN.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 477

Tabla 9. Dimensiones Crticas para los Aparatos 5 y 6 (Continuacin)

Rugosidad de la superficie de la cubeta recolectora 0,5-2 m
Estacin 1-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b o 1,18
Estacin 2-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b 5,236 0,736
Estacin 3-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b 8,445 0,41 o
Estacin 4-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b 11,379 0,237
Estacin 5-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b 13,176 0,341
Estacin 6-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b 13,999 0,071
Estacin 7-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b 14,000 0,071
Opcional: MOC-Distancia de la tobera al cuerpo selladorb 14,429 - 14,571
Ver Ja Figura 77c. MOC = colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls).
b Ver la Figura 1 7b.

En las operaciones de rutina, el cuerpo sellador y la tapa se mantienen juntos entre s como un solo dispositivo. Se tiene
acceso a las cubetas de impacto cuando se abre este equipo al final de una prueba de un producto. Las cubetas se mantienen
en una bandeja que hace de soporte, de manera que todas las cubetas se pueden sacar simultneamente del impactador le-
vantando la bandeja.
Un tubo de admisin con dimensiones internas idnticas a las que se definen en la Figura 6a se conecta a la entrada del
impactador. Cuando sea necesario, con los polvos para inhalacin, se puede agregar un preseparador para evitar sobrecargar
la primera estacin. El preseparador se conecta entre el tubo de admisin y el impactador. Se emplea un adaptador de boqui-
lla adecuado para proporcionar un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin.
El aparato contiene un colector con microorificios (MOC) terminal que, para la mayora de las formulaciones, puede eliminar
la necesidad de un filtro final, segn se determine mediante la validacin del mtodo. El MOC es la placa de toberas y cubeta
de recoleccin del impactador. La placa de toberas contiene, nominalmente, 4032 orificios, cada uno con un dimetro de
aproximadamente 70 m. La mayora de las partculas que no fueron capturadas en la Estacin 7 del impactador sern captu-
radas en la superficie de la cubeta que est debajo del MOC. Para formulaciones con una fraccin significativa de partculas no
capturadas por el MOC, hay un portafiltro opcional que puede reemplazar al MOC. Como alternativa se puede colocar un
filtro terminal (a menudo, la fibra de vidrio es adecuada) en un portafiltro externo al Aparato 5 y 6, que se ubica a continua-
cin del MOC.

Tubo de admisin

Preseparador

/ Cuerpo del impactador

Figura 11. Aparato 5 (se muestra con el preseparador colocado en su lugar).

478 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

Boquilla de estacin 1 Conexin entre estaciones

Colector de micro-
orificios (MOC)

Tapa con sello

unida al cuerpo

Encaje para la saliente de

colocacin

Marro inferior oon la bandeja

para las cubetas montada

Figura 11 a. Componentes del Aparato 5.

Conexin a la siguiente Conexin a la estacin

estacin previa

Tapa

Sello del cuerpo

Bandeja de
cubetas
Marco inferior

Cubeta de recoleccin
Estacin multi tobera

Figura 11 b. Disposicin de los pasajes entre estaciones del Aparato 5.

estacin 2 estacin 4 estacin 6 MOC

6 orificios 52 orificios 396 orificios 4032 orificios

estacin 1 estacin 3 estacin 5 estacin 7

1 orificio 24 orificios 152 orificios 630 orificios

Figura 11 c. Configuracin de toberas del Aparato 5.

USP 39 Pruebas Fsicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin 479

Cuerpo del preseparador

__....._____..____ / Dimetro de tobera

(dimensin a)

ubeta central
t
=
t
n
~-~u-~,-~ Inserto del preseparador
" ' Base del preseparador

Figura 11 d. Disposicin del preseparador para el Aparato 5.

C.6.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 5

Ensamblar el aparato con el preseparador (Figura 77d), a menos que se haya demostrado experimentalmente que su omisin
no da como resultado un incremento en la prdida de frmaco entre estaciones (>5%) o en el reingreso de partculas por
arrastre, en cuyo caso se puede omitir el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para
asegurar una captura eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol,
aceite siliconado u otro lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya de-
mostrado que esto es innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Ce-
rrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido a sta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de
forma que el sistema sea hermtico.
El preseparador puede prepararse del siguiente modo. Montar el inserto del preseparador en la base del preseparador; co-
nectar la base del preseparador a la entrada del impactador; agregar hasta aproximadamente 15 ml del disolvente empleado
para la recuperacin de la muestra a la cubeta central del inserto del preseparador; colocar el cuerpo del preseparador encima
de este montaje; y cerrar las dos grampas sujetadoras. [Precaucin-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-vapor
inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a travs de la bomba de vaco. Tomar las precauciones correspondientes
(p.ej., disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos mnimos de operacin de la bomba, etc.) para garantizar la protec-
cin del operador durante la prueba.]
Conectar un tubo de admisin con dimensiones internas segn se definen en la Figura 6a a la entrada del impactador o a la
entrada del preseparador ubicado encima del impactador en cascada (Figura 7 7d). Colocar en posicin un adaptador de bo-
quilla adecuado al final del tubo de admisin de manera que el extremo final de la boquilla del producto, cuando se inserta,
est alineado a lo largo del eje horizontal del tubo de admisin. La cara frontal de la boquilla del producto est a nivel con la
cara frontal del tubo de admisin, produciendo un sellado hermtico. Cuando se une al adaptador de boquilla, el producto
debe colocarse en la misma orientacin en la que est previsto que se use. Conectar el aparato al sistema de flujo conforme al
esquema especificado en la Figura 7.
A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba a la velocidad de flujo empleada en la prueba para Uniformidad de
Dosis Liberada, extrayendo 4,0 L de aire desde la boquilla del producto a travs del aparato. Conectar un caudalmetro al tubo
de admisin. Emplear un caudalmetro calibrado para medir el flujo volumtrico que sale del medidor o calcular el flujo volu-
mtrico que sale del medidor (Qout) utilizando la ley de los gases ideales. Para un medidor calibrado para el flujo volumtrico
de entrada (Q;n), calcular:

P0 =presin atmosfrica
f:i.P = cada de la presin en el medidor
Ajustar la vlvula de control de flujo para lograr un flujo estable a travs del sistema a la velocidad requerida, Oout (5%). Ase-
gurar que se produzca flujo crtico en la vlvula de control de flujo mediante el Procedimiento descrito para el Aparato 2. Ajustar
el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas, de manera que abra la vlvula durante el mismo
lapso de tiempo, T, que el que se emple durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada.
Cebar o cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vaco en
funcionamiento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adapta-
dor de boquilla del tubo de admisin. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la vlvula
solenoide de dos vas durante el lapso requerido, T (5%). Despus de que la vlvula solenoide de dos vas se haya cerrado,
retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhala-
cin segn las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operacin
hasta que el nmero de dosis requerido haya sido descargado. Despus de descargar la ltima dosis, apagar la bomba de va-
co.
480 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas USP 39

Desarmar el aparato y recuperar el frmaco a analizar de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisin y el adaptador de
boquilla del preseparador y extraer el frmaco en una alcuota de disolvente; si se hubiera empleado el preseparador, retirarlo
del impactador sin derramar el disolvente dentro de ste ltimo; y recuperar el ingrediente activo de todas las superficies inter-
nas. Abrir el impactador liberando el mecanismo de enganche y levantando la tapa. Retirar la bandeja de cubetas con las cube-
tas de recoleccin y recuperar el ingrediente activo de cada cubeta con una alcuota de disolvente. Empleando el mtodo de
anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco contenida en cada alcuota de disolvente.

C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalacin-lmpactador de Nueva Generacin

(sin preseparador)

C.7.1 DISEO-APARATO 6

El Aparato 6 es idntico al Aparato 5 (Figuras 11-11 d) excepto que no se utiliza el preseparador. Emplear este aparato a una
velocidad de flujo de 30 L/minuto (5%), a menos que se indique algo diferente en la monografa individual.

C.7.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 6

Montar el aparato sin el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para asegurar una cap-
tura eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol, aceite siliconado u
otro lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya demostrado que esto es
innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impacta-
dor con el cuerpo sellador unido a sta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de forma que el sistema sea
hermtico. Conectar a la entrada del impactador un tubo de admisin con las dimensiones internas que se definen en la Figura
6a. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo
abierto del tubo de admisin. Encender la bomba de vaco para extraer el aire a travs del impactador en cascada y calibrar el
flujo de aire a travs del sistema con un caudalmetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisin. Ajustar la
vlvula de control de flujo de la bomba de vaco para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velocidad requerida, y
asegurarse de que el flujo de aire que recorre el sistema est dentro del 5% de esa velocidad de flujo. A menos que se indique
algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y accionar el disparador para
desechar una descarga. Con la bomba de vaco en funcionamiento, insertar la boquilla en su adaptador de boquilla e inmedia-
tamente disparar para descargar la dosis mnima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la vlvula presionada
durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se requieren atomizaciones adi-
cionales para recolectar la muestra, agitar el producto, reinsertarlo en el adaptador de boquilla e inmediatamente pulsar para
descargar la siguiente dosis mnima recomendada.
Repetir hasta que se haya descargado el nmero de dosis requerido. El nmero de dosis mnimas recomendadas debe ser tal
que permita una determinacin exacta y precisa de la Distribucin de Tamao Aerodinmico. [NOTA-Usualmente, el nmero de
dosis mnimas recomendadas no es >1 O.] Despus de que la ltima dosis haya sido descargada, retirar el producto del adapta-
dor de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisin con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues
cuantitativamente hasta un volumen apropiado.
Desarmar el aparato y recuperar el frmaco para su anlisis de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisin y el adapta-
dor de boquilla del aparato y recuperar el frmaco depositado en una alcuota de disolvente; abrir el impactador liberando el
mecanismo de enganche y levantando la tapa; retirar la bandeja de cubetas con las cubetas de recoleccin; y extraer el ingre-
diente activo de cada cubeta con una alcuota de disolvente. Empleando el mtodo de anlisis especificado en la monografa
individual, determinar la cantidad de ingrediente activo contenida en cada alcuota de disolvente.

<602) PROPELENTES

Precaucin-Los propelentes que son hidrocarburos son extremadamente inflamables y explosivos. Tomar las precauciones necesa-
rias y realizar el muestreo y las operaciones analticas bajo una campana de extraccin bien ventilada.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE MUESTREO

Este procedimiento se utiliza para obtener muestras de prueba de propelentes que son gases a aproximadamente 25 y que
se almacenan en cilindros presurizados. Emplear un cilindro para muestras de acero inoxidable equipado con una vlvula de
acero inoxidable con una capacidad de no menos de 200 ml que soporte 240 psi o una presin mayor. Secar el cilindro con la
vlvula abierta a 11 O durante 2 horas y vaciar el cilindro caliente hasta menos de 1 mm de mercurio. Cerrar la vlvula, enfriar
y pesar. Conectar un extremo de una tubera de carga al envase del propelente ajustando bien y conectar sin ajustar el otro
USP 39 Pruebas Fsicas/ (602) Propelentes 481

extremo al cilindro para muestras. Abrir con cuidado el envase del propelente y dejar que el propelente purgue la tubera de
carga y salga a travs de la conexin sin ajustar. Evitar una purga excesiva, ya que esto provoca la congelacin de humedad en
la tubera de carga y las conexiones. Ajustar la conexin del cilindro para muestras, abrir la vlvula del cilindro para muestras y
dejar que el propelente fluya hacia el interior del cilindro vaco. Continuar el muestreo hasta que se obtenga la cantidad desea-
da de muestra, luego cerrar la vlvula del envase del propelente y, finalmente, cerrar la vlvula del cilindro para muestras.
[Precaucin-No sobrecargar el cilindro para muestras. La expansin hidrulica ocasionada por los cambios de temperatura puede
causar la explosin de un cilindro sobrecargado.] Pesar nuevamente el cilindro para muestras cargado y calcular el peso de la
muestra.

TEMPERATURA DE EBULLICIN APROXIMADA

Transferir una muestra de 100 ml a un tubo de centrfuga tarado en forma de pera de 100 ml que contenga algunas pie-
dras de ebullicin y pesar. Suspender un termmetro en el lquido y colocar el tubo en un medio mantenido a una temperatu-
ra de 32 por encima de la temperatura de ebullicin esperada. Cuando la lectura del termmetro permanezca constante, re-
gistrar como temperatura de ebullicin la lectura del termmetro despus de que se haya destilado como mnimo el 5% de la
muestra. Conservar el resto de la muestra para la determinacin de residuos de alto punto de ebullicin.

RESIDUOS DE ALTO PUNTO DE EBULLICIN, MTODO 1

Dejar que destilen 85 ml de la muestra segn se indica en la prueba para Temperatura de Ebullicin Aproximada y transferir el
tubo de centrfuga que contiene los 15 ml remanentes de la muestra a un medio mantenido a una temperatura de 1O por
encima de la temperatura de ebullicin. Despus de 30 minutos, retirar el tubo del bao de agua, secarlo con material absor-
bente y pesar. Calcular el peso del residuo.

RESIDUOS DE ALTO PUNTO DE EBULLICIN, MTODO 11

Preparar una serpentina de enfriamiento con una tubera de cobre (de aproximadamente 6 mm de dimetro exterior x apro-
ximadamente 6, l m de largo) para que entre en un matraz con camisa al vaco. Sumergir la serpentina de enfriamiento en una
mezcla de hielo seco y acetona en el matraz con camisa al vaco y conectar un extremo de la tubera al cilindro para muestras
con propelente. Abrir cuidadosamente la vlvula del cilindro para muestras, purgar la serpentina de enfriamiento con aproxi-
madamente 50 ml de propelente y desechar esta porcin de propelente licuado. Continuar descargando el propelente licuado
desde la serpentina de enfriamiento y recogerlo en un cono de sedimentacin de 1000 ml previamente enfriado hasta que el
cono se llene hasta la marca de 1000 ml. Dejar que el propelente se evapore, usando un bao de agua tibia mantenido a
aproximadamente 40 para reducir el tiempo de evaporacin. Cuando todo el lquido se haya evaporado, enjuagar el cono de
sedimentacin con dos porciones de 50 ml de pentano y combinar los enjuagues en una cpsula de evaporacin tarada de
150 ml. Transferir 100 ml de pentano a una segunda cpsula de evaporacin tarada de 150 ml, colocar ambas cpsulas de
evaporacin en un bao de agua; evaporar hasta sequedad y calentar las cpsulas en una estufa a 100 durante 60 minutos.
Enfriar las cpsulas en un desecador y pesar. Repetir el calentamiento durante periodos de 15 minutos hasta que la variacin
de peso entre pesadas sucesivas no sea ms de O, 1 mg y calcular el peso del residuo obtenido a partir del propelente como la
diferencia entre los pesos de los residuos en las dos cpsulas de evaporacin.

CONTENIDO DE AGUA

Proceder segn se indica en el captulo Determinacin de Agua (921 ), con las siguientes modificaciones: (a) Utilizar un reci-
piente de sistema cerrado para volumetra con una abertura a travs de la cual pasa un tubo de dispersin de gases de porosi-
dad gruesa conectado a un cilindro para muestreo. (b) Diluir el Reactivo con metano! anhidro hasta obtener un factor de equi-
valencia de agua de entre 0,2 y 1,0 mg/ml, y dejar reposar esta solucin diluida durante no menos de 16 horas antes de la
estandarizacin. (c) Obtener una muestra de 100 g segn se indica en Procedimiento General de Muestreo e introducir la mues-
tra en el vaso de valoracin a travs del tubo de dispersin de gases a una velocidad de aproximadamente 100 ml de gas por
minuto. Si fuera necesario, calentar suavemente el cilindro para muestras para mantener esta velocidad de flujo.

OTRAS DETERMINACIONES

Para los aerosoles que utilizan propelentes, realizar las pruebas que se especifican en las monografas individuales de prope-
lentes del NF.
482 (603) Aerosoles Tpicos/ Pruebas Fsicas USP 39

(603) AEROSOLES TPICOS

INTRODUCCIN

Los aerosoles tpicos contienen frmacos en solucin o en suspensin, envasados a presin, que se liberan al activar un siste-
ma de vlvulas apropiado. Los aerosoles tpicos deben seguir los requisitos de las pruebas de calidad descritos en los captulos
de pruebas generales Medicamentos Nasales y para Inhalacin-Informacin General y Pruebas de Calidad del Producto (5), Prue-
bas de Recuento Microbiano (61 ), Pruebas de Microorganismos Especficos (62), Llenado Mnimo (755) y Velocidad de Fuga (604).
Los aerosoles tpicos incluyen espumas y atomizadores dermatolgicos. Las espumas de los aerosoles tpicos deben incluir la
apariencia fsica de la espuma y de la espuma colapsada.

VELOCIDAD DE DESCARGA Y CANTIDAD DESCARGADA

Realizar estas pruebas exclusivamente en envases equipados con vlvulas de descarga continua.
Velocidad de Descarga: Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, agitar si la etiqueta incluye esta instruccin,
retirar las tapas y las cubiertas, y accionar cada vlvula durante 2-3 segundos. Pesar cada envase con exactitud y sumergir en
un bao de temperatura constante hasta que la presin interna se equilibre a una temperatura de 25, determinada por la
constancia de la presin interna, segn se indica ms adelante en Prueba de Presin. Retirar los envases del bao, eliminar el
exceso de humedad secando con una toalla de papel, agitar, si la etiqueta incluye esta instruccin, accionar cada vlvula du-
rante 5,0 segundos (medidos con exactitud, empleando un cronmetro) y pesar nuevamente cada envase. Devolver los enva-
ses al bao de temperatura constante y repetir el procedimiento previo tres veces ms para cada envase. Calcular el promedio
de Velocidad de Descarga, en g/s, para cada envase.
Cantidad Descargada: Devolver los envases al bao de temperatura constante, continuar descargando en accionamien-
tos de 5 segundos hasta vaciar los envases. [NOTA-Asegurar que pase suficiente tiempo entre los accionamientos para evitar
un enfriamiento significativo del envase.] Calcular la prdida total de peso de cada envase. sta es la Cantidad Descargada.

PRUEBA DE PRESIN

Realizar esta prueba slo en aerosoles tpicos equipados con vlvulas de descarga continua.
Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, retirar las tapas y las cubiertas, y sumergir en un bao de temperatura
constante hasta que la presin interna sea constante a una temperatura de 25. Retirar los envases del bao, agitar y retirar el
disparador y el agua, si la hubiera, del vstago de la vlvula. Colocar cada envase en posicin vertical y determinar la presin
en cada envase colocando un manmetro calibrado sobre el vstago de la vlvula, sostenindolo con firmeza y accionando la
vlvula de manera que quede completamente abierta. El manmetro se calibra para presiones aproximadas a las esperadas y
est equipado con un adaptador apropiado para las dimensiones particulares del vstago de la vlvula. Leer la presin directa-
mente del manmetro.

LLENADO MNIMO

Los aerosoles tpicos cumplen con los requisitos para aerosoles que figuran en Llenado Mnimo (755).

PRUEBA DE FUGA

Proceder segn se indica en Velocidad de Fuga (604).

NMERO TOTAL DE DESCARGAS POR ENVASE

Realizar esta prueba slo en aerosoles tpicos equipados con vlvulas dosificadoras, simultneamente con la prueba de Uni-
formidad de Dosis Liberada y en los mismos envases utilizados en dicha prueba. Determinar el nmero total de descargas o
entregas contando el nmero de descargas para cebado ms las usadas para determinar el contenido del roco y continuar
accionando el disparador hasta completar el nmero de descargas declarado en la etiqueta. Los requisitos se cumplen si todos
los envases o inhaladores analizados contienen un nmero de descargas que no sea menor al declarado en la etiqueta.

UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles tpicos equipados con vlvulas dosificadoras. Para re-
coger la dosis mnima, proceder segn se indica en la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Inhaladores de Dosis Fija e
Inhaladores de Polvo Seco, segn se describe en el captulo (601 ), excepto que se debe modificar el aparato de muestreo de
USP 39 Pruebas Fsicas/ (61 O) Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos 483

dosis de manera que sea capaz de capturar cuantitativamente la dosis descargada de la preparacin que se est analizando. A
menos que se indique algo diferente en la monografa individual, aplicar los criterios de aceptacin para Inhaladores de Dosis
Fija e Inhaladores de Polvo Seco segn se describe en el captulo (601 ).

(604) VELOCIDAD DE FUGA

Seleccionar 12 envases de aerosol y registrar la fecha y la hora con una aproximacin de media hora. Pesar cada envase con
una aproximacin de 1 mg y registrar el peso de cada uno, en mg, como W 1 Dejar en reposo los envases en posicin vertical
a una temperatura de 25,0 2,0 durante no menos de 3 das, y pesar nuevamente cada envase, registrar el peso de cada
uno, en mg, como W2 y registrar la fecha y la hora con una aproximacin de media hora. Determinar el tiempo, T, en horas,
durante el que se analizaron los envases. Calcular la velocidad de fuga, en mg por ao, de cada envase tomado, por la frmu-
la: (365)(24/7)(W7 - W2).
Cuando se analizan envases de aerosol de vidrio recubiertos de plstico, secar los envases en un desecador durante 12-18
horas y dejarlos en reposo en una atmsfera de humedad constante durante 24 horas antes de determinar el peso inicial segn
se indic anteriormente. Realizar la prueba bajo las mismas condiciones de humedad constante. Vaciar el contenido de cada
envase analizado empleando una tcnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la presin interna, retirar la vlvula y verter).
Retirar el contenido residual enjuagando con disolventes adecuados y luego enjuagar con algunas porciones de metano!. Man-
tener el envase, la vlvula y todas las partes relacionadas como una unidad, y calentar todo junto a 100 durante 5 minutos.
Enfriar, pesar, registrar el peso como W3 y determinar el peso neto de llenado (W 1 - W3) para cada envase analizado. [NOTA-Si
el peso neto de llenado promedio se ha determinado previamente, dicho valor puede emplearse en lugar del valor (W, - W3)
mencionado anteriormente.] Los requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio por ao para los 12 envases no es
ms de 3,5% del peso neto de llenado, y ninguno de los envases tiene fugas de ms de 5,0% del peso neto de llenado por
ao. Si 1 envase tiene fugas de ms de 5,0% por ao y si ninguno de los envases tiene fugas de ms de 7,0% por ao, deter-
minar la velocidad de fuga para 24 envases adicionales, segn se indica en esta prueba. No ms de 2 de los 36 envases tienen
fugas de ms de 5,0% del peso neto de llenado por ao y ninguno de los 36 envases tiene fugas de ms de 7,0% del peso
neto de llenado por ao. Cuando el peso neto de llenado es menos de 15 g y la etiqueta contiene una fecha de caducidad, los
requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio de los 12 envases no es mayor de 525 mg por ao y ninguno de los
envases tiene fugas mayores de 750 mg por ao. Si 1 envase tiene fugas de ms de 750 mg por ao pero de no ms de l, 1 g
por ao, determinar la velocidad de fuga sobre 24 envases adicionales, segn se indica en esta prueba. No ms de 2 de los 36
envases tiene fugas mayores de 750 mg por ao y ninguno de los 36 envases tiene fugas mayores de l, l g por ao. Esta
prueba es adicional a la prueba de fuga habitual que se realiza en lnea a cada envase.

/ /

(61 O) METODOS DE MUESTREO MICROBIOLOGICO ALTERNATIVOS

PARA PRODUCTOS NASALES E INHALADORES NO ESTRILES

INTRODUCCIN
El muestreo apropiado de productos no estriles susceptibles a la contaminacin microbiana puede ser complicado, debido
a que estos productos a menudo se llenan en envases primarios especiales, diseados para proteger al producto de la contami-
nacin inadvertida durante su almacenamiento y uso. Estos diseos especiales pueden hacer ms difcil la toma de muestras
aspticas de tamao o volumen suficientes para el anlisis microbiolgico. A menos que se utilicen metodologas especiales,
puede resultar difcil realizar el muestreo de productos tales como formas farmacuticas en polvo, lquidos nasales o para inha-
lacin, sin exponerlos potencialmente a contaminacin microbiana extraa. El presente captulo de pruebas generales propor-
ciona tales metodologas especiales para el muestreo de formas farmacuticas para inhalacin o nasales de alto y bajo conteni-
do. Las metodologas de muestreo alternativas pueden ofrecer mejores maneras para muestrear envases de forma asptica. To-
da metodologa alternativa debe utilizar tcnicas aspticas y se debe llevar a cabo en condiciones ambientales y de otro tipo,
apropiadas para el muestreo asptico.

FORMAS FARMACUTICAS PARA INHALACIN V NASALES

Los productos farmacuticos nasales e inhaladores de bajo contenido (en lo sucesivo, PFNI de bajo contenido) son produc-
tos que presentan un llenado esperado de menos de 100 mg de polvo o 1 mL de formulacin lquida por unidad (envase
484 (61 O) Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos/ Pruebas Fsicas USP 39

primario). Ejemplos de estos productos incluyen polvos para inhalacin previamente medidos, ms comnmente conocidos
como inhaladores de polvo seco, y atomizadores nasales monodosis.
Los PFNI de alto contenido son productos farmacuticos multidosis que presentan un llenado esperado de ms de 100 mg
de polvo o ms de 1 mL de formulacin liquida por unidad. Ejemplos de estos productos incluyen aerosoles para administra-
cin por inhalacin y va nasal, conocidos como inhaladores de dosis fija; polvos para inhalacin con dosis medidas para dispo-
sitivos; y aerosoles nasales multidosis.
La cantidad o volumen apropiado de muestra debe basarse en la metodologa de prueba, incluido cualquier captulo de
pruebas generales pertinente, como los captulos (61) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Mi-
crobiano y (62) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos. El anlisis se puede llevar
a cabo en el polvo seco a granel sin envasar, en la formulacin lquida o en el producto terminado. Si el anlisis se realiza slo
en el material a granel, entonces se debe validar la capacidad del proceso para prevenir la contaminacin microbiana desde el
lote a granel hasta el producto terminado. El anlisis se debe llevar a cabo en el producto terminado cuando el proceso no est
validado.

DETERMINACIN DEL TAMAO DE LA MUESTRA

Para cada prueba microbiolgica, muestrear 1O envases o unidades del producto farmacutico o un nmero de unidades
que sea representativo de la partida y que pueda proporcionar como mnimo 1 gramo de producto. Para tamaos de partida
menores de 200 unidades (p.ej., partidas usadas en ensayos clnicos), el tamao de la muestra se puede reducir al 1% de las
unidades o a 1 unidad, lo que resulte mayor. Se puede combinar el contenido de envases individuales para el anlisis.

ANLISIS DEL GRANEL PARA PFNI DE BAJO CONTENIDO

Es preferible el anlisis de lote a granel para PFNI de bajo contenido en lugar del anlisis del producto terminado, debido a
que permite tomar muestras de mayores tamaos que son representativas de la partida, sin incrementar indebidamente el ries-
go de contaminacin microbiana inadvertida. El anlisis del granel se puede llevar a cabo en polvos o en preparaciones lqui-
das justo antes del llenado. Cuando se realiza el anlisis del granel en lugar del anlisis del producto terminado, se debe validar
la capacidad de los procesos de fabricacin posteriores al muestreo (p.ej., llenado y envasado) para prevenir contaminacin
microbiana de conformidad con las buenas prcticas de fabricacin vigentes (CGMP). Para pruebas de recuento microbiano,
se pueden muestrear al menos 1 Og o 1O mL de material a granel o, para las pruebas de microorganismos especficos, se pue-
de muestrear 1 g o 1 mL de material de prueba. Para tamaos pequeos de partida (es decir, menos de 1000 g o 1000 mL), el
tamao de muestra recomendado es 1o/o de la partida para las pruebas de recuento microbiano y de microorganismos especfi-
cos.

MTODOS DE MUESTREO PARA PFNI DE AL TO CONTENIDO

Inhaladores de Polvo Seco

Los inhaladores de polvo seco tienen un reservorio interno que contiene una cantidad suficiente de formulacin para dosis
mltiples que son dosificadas por el dispositivo durante la activacin por parte del paciente. En estos casos, se deben emplear
procedimientos validados apropiados para muestrear un envase de producto farmacutico no estril.

Aerosoles para Inhalacin

Tomar en cuenta las cuestiones de seguridad relacionadas con la inhalacin del producto farmacutico y el posible peligro
de inflamacin. Evitar la contaminacin de las muestras usando tcnicas aspticas siempre que sea necesario.

MTODO DE ACCIONAMIENTO AUTOMTICO

El contenido de los envases de los aerosoles para inhalacin se puede recolectar accionando automticamente cada envase
de aerosol y recolectando la formulacin liberada en un filtro estril adecuado.

MTODO A TEMPERATURA AMBIENTE

Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los envases se sequen en
un ambiente controlado. Vaciar el contenido del envase de aerosol en un vaso estril usando un dispositivo con aguja u otro
dispositivo similar (p.ej., el conducto de ingreso de agua de una mquina para hacer hielo). Si se ha demostrado que el prope-
lente no inhibe el crecimiento de microorganismos, se puede agregar el contenido del vaso estril directamente a los medios
lquidos o a las soluciones amortiguadoras para la prueba. De otro modo, esperar a que el propelente se evapore del vaso,
dejando el vaso a temperatura ambiente durante varios minutos. Eliminar el propelente gaseoso residual inclinando ligeramen-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (611) Determinacin de Alcohol 485

te el vaso o permitiendo el paso de una corriente lenta de gas estril microbiolgicamente inerte sobre la superficie del mismo.
En el caso de algunos propelentes menos voltiles, por ejemplo, combinaciones de clorofluorocarbono (CFC) 11 /12, se puede
calentar el vaso suavemente (a temperatura~ 45) para ayudar a la evaporacin. Una vez evaporado el propelente, agregar los
medios lquidos o las soluciones amortiguadoras y mezclar el contenido para preparar para el anlisis.
La expulsin directa en los caldos de cultivo o las soluciones amortiguadoras puede ser factible siempre que se cuente con
un dispositivo con aguja que sea lo suficientemente fino y fuerte como para perforar el envase y permitir que el contenido
salga lentamente. En este caso, el contenido puede ser expulsado y mezclado en el medio acuoso. Existe la posibilidad de que
se formen capas de propelente y de medio acuoso, lo cual puede requerir un mayor periodo de espera y calentamiento suave
(que no exceda de 45) para evaporar el propelente.

MTODO CON ENFRIAMIENTO

Colocar los envases de aerosol desinfectados en hielo seco o en una suspensin espesa de hielo seco (garantizar la calidad
microbiana del hielo seco y del lquido para formar la suspensin espesa), o en un criocongelador durante el periodo necesario
para licuar el contenido. Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los
envases se sequen en un ambiente asptico. Abrir aspticamente los envases de aerosol usando una herramienta apropiada. Se
debe tener en cuenta que la congelacin puede afectar la viabilidad de los microorganismos. Para productos basados en CFC,
verter el contenido de los envases en vasos estriles. Dejar que escape el propelente y combinar el residuo con un diluyente
adecuado para el producto farmacutico. Tambin se pueden emplear otros procedimientos especficos para el frmaco. Para
productos basados en hidrofluoroalcanos, verter el contenido de los envases en vasos estriles parcialmente sumergidos en va-
sos ms grandes que contengan hielo seco. Expulsar el propelente, por ejemplo, evaporando el material hasta sequedad con
una corriente lenta de aire comprimido estril, filtrado y libre de aceite. Combinar el residuo con un diluyente apropiado para
el producto farmacutico. Un mtodo alternativo para analizar todo el contenido de un envase previamente enfriado consiste
en verter el contenido del envase abierto en una unidad de filtracin por membrana estril, dejar que escape el propelente y
luego enjuagar con una cantidad adecuada de diluyente estril.

Atomizadores Nasales Multidosis

Los envases de atomizadores nasales multidosis a menudo tienen una tapa de rosca, precintada, o de anclaje hermtico. El
envase se puede abrir desenroscando la tapa, cortando el sello o usando una herramienta para retirar el precinto, con cuidado
de evitar la contaminacin microbiana durante el proceso. Despus de retirar la tapa, por lo general resulta apropiado el uso
de los mtodos de muestreo tradicionales, como los descritos en los captulos de pruebas generales (61) Examen Microbiolgico
de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Mi-
croorganismos Especficos.

(611) DETERMINACIN DE ALCOHOL

MTODO 1-MTODO DE DESTILACIN

El mtodo 1 se utiliza para la determinacin de alcohol a menos que se especifique algo diferente en la monografa indivi-
dual. Es adecuado para examinar la mayora de los extractos lquidos y las tinturas, siempre que la capacidad del matraz de
destilacin sea suficiente (normalmente de dos a cuatro veces el volumen del lquido a calentar) y la velocidad de destilacin
sea la necesaria para producir destilados transparentes. Los destilados turbios pueden clarificarse mediante agitacin con talco
o con carbonato de calcio y filtracin, despus de lo cual la temperatura del filtrado se ajusta y el contenido de alcohol se
determina a partir del peso especfico. Durante todas las manipulaciones, tomar precauciones para minimizar la prdida de
alcohol por evaporacin.
Tratar los lquidos que forman una cantidad inconveniente de espuma durante la destilacin acidificndolos fuertemente con
cidos fosfrico, sulfrico o tnico, o tratarlos con un leve exceso de solucin de cloruro de calcio o con una pequea cantidad
de parafina o aceite de silicona antes de comenzar la destilacin.
Evitar las proyecciones durante la destilacin agregando trozos de material poroso insoluble, como carburo de silicio, o per-
las.
Para Lquidos que se Supone que Contienen 30% de Alcohol o Menos-Con una pipeta, transferir a un aparato de des-
tilacin adecuado no menos de 25 mL del lquido en el que se debe determinar el contenido de alcohol y observar la tempera-
tura a la que se midi el volumen. Agregar un volumen igual de agua, destilar y recoger un volumen de destilado que sea
aproximadamente 2 mL menor que el volumen tomado de lquido de prueba original, ajustar a la temperatura a la cual se
midi el lquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el volumen original del lquido de prue-
ba y mezclar. El destilado es transparente o no ms que levemente turbio y no contiene ms que trazas de sustancias voltiles,
486 (611) Determinacin de Alcohol / Pruebas Fsicas USP 39

adems de alcohol y agua. Determinar el peso especfico del lquido a 25, segn se indica en Peso Especfico (841 ), y usar este
resultado para establecer el porcentaje, en volumen, de C2 H5 0H contenido en el lquido examinado por referencia a la Tabla
Alcoholimtrica en la seccin Tablas de Referencia.
Para Lquidos que se Supone que Contienen Ms de 30% de Alcohol-Proceder segn se indica en el prrafo anterior,
excepto que se debe hacer lo siguiente: diluir la muestra con aproximadamente el doble de su volumen en agua, recoger un
volumen de destilado que sea aproximadamente 2 mL menor que el doble del volumen del lquido de prueba original, ajustar
a la temperatura a la cual se midi el lquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el doble del
volumen original del lquido de prueba, mezclar y determinar el peso especfico. La proporcin de C2H50H, en volumen, en
este destilado, segn se determina a partir de su peso especfico, equivale a la mitad del C2 H50H contenido en el lquido exa-
minado.
Tratamiento Especial-
CIDOS Y BASES VOLTILES-Acidificar levemente las preparaciones que contengan bases voltiles con cido sulfrico diluido
antes de destilar. Si hay cidos voltiles presentes, alcalinizar levemente la preparacin con hidrxido de sodio SR.
GLICERINA-A los lquidos que contengan glicerina, agregar suficiente agua para que el residuo, despus de la destilacin,
contenga no menos de 50% de agua.
YODO-Antes de la destilacin, tratar todas las soluciones que contengan yodo libre con cinc en polvo o decolorar con una
cantidad apenas suficiente de solucin de tiosulfato de sodio (1 en 1O), seguida de algunas gotas de hidrxido de sodio SR.
OTRAS SUSTANCIAS VOLTILES-Los alcoholados, elxires, tinturas y preparaciones similares que contienen proporciones aprecia-
bles de sustancias voltiles, adems de alcohol y agua, tales como aceites voltiles, cloroformo, ter, alcanfor, etc., requieren
tratamiento especial, como se describe a continuacin:
Para Lquidos que se Supone que Contienen 50% de Alcohol o Menos-Mezclar en un separador 25 mL de la muestra en anli-
sis, medidos con exactitud, con aproximadamente el mismo volumen de agua. Saturar esta mezcla con cloruro de sodio, luego
agregar 25 mL de ter de petrleo y agitar la mezcla para extraer los ingredientes voltiles que interfieran. Transferir la capa
separada inferior a un segundo separador y repetir la extraccin dos veces con dos porciones ms de 25 mL de ter de petr-
leo. Extraer las soluciones combinadas de ter de petrleo con tres porciones de 1O mL de una solucin saturada de cloruro de
sodio. Combinar las soluciones salinas y destilar de la manera habitual, recogiendo un volumen de destilado que presente un
cociente simple en relacin al volumen de la muestra original.
Para Lquidos que se Supone que Contienen Ms de 50% de Alcohol-Ajustar la muestra en anlisis a una concentracin de
aproximadamente 25% de alcohol diluyendo con agua y luego proceder segn se indica en Para Lquidos que se Supone que
Contienen 50% de Alcohol o Menos, comenzando donde dice "Saturar esta mezcla con cloruro de sodio".
En la preparacin de Colodin o Colodin Flexible para destilacin, usar agua en lugar de la solucin saturada de cloruro de
sodio que se indica anteriormente.
Si hay aceites voltiles presentes slo en pequeas proporciones y se obtiene un destilado turbio, y no se ha empleado el
tratamiento con ter de petrleo, se puede clarificar el destilado y adecuarlo para la determinacin de peso especfico agitn-
dolo con aproximadamente un quinto de su volumen de ter de petrleo o filtrndolo a travs de una capa fina de talco.

MTODO 11-MTODO DE CROMATOGRAFA DE GASES

Usar el Mtodo /la cuando el Mtodo 11 se especifica en la monografa individual. Para obtener un anlisis de los principios en
los que se basa, ver Cromatografa de Gases en Cromatografa (621 ).
Estndares de referencia USP-ER Determinacin de Alcohol-Acetonitrilo USP. ER Determinacin de Alcohol-Alcohol USP.

Mtodo lla

Aparato-En condiciones tpicas, usar un cromatgrafo de gases equipado con un detector de ionizacin a la llama y una
columna cromatogrfica de vidrio de 4 mm x 1,8 m rellena con soporte 53 de malla 100 a 120, usando nitrgeno o helio
como gas transportador. Antes de usar, acondicionar la columna durante la noche a 235 con un flujo lento de gas transporta-
dor. Mantener la temperatura de la columna a 120 y la temperatura del inyector y el detector a 21 O. Ajustar el flujo del gas
transportador y la temperatura de modo que el acetonitrilo, el estndar interno, eluya entre 5 y 1O minutos.
Soluciones-
Preparacin Madre de Prueba-Diluir la muestra en anlisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solucin que
contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparacin de Prueba-Pipetear 5 mL de la Preparacin Madre de Prueba y de ER Determinacin de Alcohol-Acetonitrilo
USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solucin de
estndar interno], transferir a un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparacin Estndar-Pipetear 5 mL de ER Determinacin de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinacin de Alcohol-
Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solucin de estndar interno], transferir a un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Procedimiento-Inyectar por duplicado en el cromatgrafo de gases aproximadamente 5 L de la Preparacin de Prueba y
de la Preparacin estndar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes entre las respuestas de los picos. Calcular el
porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en anlisis, por la frmula:
USP 39 Pruebas Fsicas/ (616) Densidad Aparente y por Asentamiento 487

en donde Ces la concentracin declarada de ER Determinacin de Alcohol-Alcohol USP; Des el factor de dilucin (cociente
entre el volumen de la Preparacin Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y Ru y R5 son los cocientes de respuesta
entre los picos obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba y de la Preparacin Estndar, respectivamente.
Prueba de Aptitud del Sistema-En un cromatograma adecuado, el factor de resolucin, R, no es menor de 2; el factor de
asimetra del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la Preparacin Estndar presentan una desvia-
cin estndar relativa de no ms de 2,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del estndar interno.

Mtodo llb

Aparato-Equipar un cromatgrafo de gases con un inyector partido con una relacin de particin de 5 : 1, un detector de
ionizacin a la llama y una columna capilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una pelcula de 3,0 m de fase G43. Usar helio
como gas transportador a una velocidad de flujo de 34,0 cm por segundo. Programar el cromatgrafo para mantener la tem-
peratura de la columna a 50 durante 5 minutos, luego aumentar la temperatura a una velocidad de 1 O por minuto hasta
200, y mantener a esa temperatura durante 4 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 21 O y la del detector a 280.
Soluciones-
Preparacin Madre de Prueba-Diluir la muestra en anlisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solucin que
contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparacin de Prueba-Pipetear 5 mL de la Preparacin Madre de Prueba y de ER Determinacin de Alcohol-Acetonitrilo
USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solucin de
estndar interno], y transferir a un matraz volumtrico de 25 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparacin Estndar-Pipetear 5 mL de ER Determinacin de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinacin de Alcohol-
Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solucin de estndar interno], y transferir a un matraz volumtrico de 25 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Procedimiento-Inyectar por duplicado en el cromatgrafo de gases aproximadamente de 0,2 a 0,5 L de la Preparacin
de Prueba y de la Preparacin Estndar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes de respuesta de los picos. Calcu-
lar el porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en anlisis, por la frmula:

CD(Ru/R 5)

en donde Ces la concentracin declarada de ER Determinacin de Alcohol-Alcohol USP; Des el factor de dilucin (cociente
entre el volumen de la Preparacin Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y Ru y R5 son los cocientes de respuesta
entre los picos obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba y de la Preparacin Estndar, respectivamente.
Prueba de Aptitud del Sistema-En un cromatograma adecuado, el factor de resolucin, R, entre alcohol y el estndar
interno no es menor de 4; el factor de asimetra del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la
Preparacin Estndar presentan una desviacin estndar de no ms de 4,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del
estndar interno.

(616) DENSIDAD APARENTE Y DENSIDAD POR ASENTAMIENTO DE

LOS POLVOS

DENSIDAD APARENTE

Este captulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japo-
nesa. La porcin que no est armonizada se marca con los smbolos (.) para especificar este hecho .
La densidad aparente de un polvo es la relacin de la masa de una muestra de polvo sin asentar y su volumen, incluida la
contribucin del volumen del espacio vaco entre las partculas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la
densidad de las partculas de polvo como de la distribucin espacial de las partculas en el lecho de polvo. La densidad aparen-
te se expresa en gramos por mL (g/mL) aunque la unidad internacional es el kilogramo por metro cbico (1 g/mL =
1000 kg/m 3) porque las mediciones se hacen usando probetas. Tambin se puede expresar en gramos por centmetro cbico
(g/cm 3). Las propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo dependen de la preparacin, el tratamiento y el
almacenamiento de la muestra, es decir la forma en que se manipul. Las partculas se pueden compactar para que tengan un
intervalo variable de densidades aparentes; sin embargo, la ms ligera perturbacin del lecho de polvo puede producir un
cambio en la densidad aparente. Por lo tanto, a menudo es muy difcil medir la densidad aparente de un polvo con buena
reproducibilidad y, al informar los resultados, es fundamental especificar cmo se hizo la determinacin. La densidad aparente
de un polvo se determina midiendo el volumen de una muestra de polvo de peso conocido, que puede haber sido pasada a
488 (616) Densidad Aparente y por Asentamiento/ Pruebas Fsicas USP 39

travs de un tamiz, en una probeta graduada (Mtodo /) o midiendo la masa de un volumen conocido de polvo que haya sido
pasado a travs de un volmetro a un vaso (Mtodo //) o un recipiente de medidas (Mtodo 111).
Se prefieren el Mtodo I y el Mtodo 111.

Mtodo 1-Medicin en una Probeta Graduada

PROCEDIMIENTO

Pasar una cantidad de material suficiente para completar la prueba a travs de un tamiz con aperturas mayores o iguales a
1,0 mm, de ser necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento; esto se
debe hacer cuidadosamente para evitar cambios en la naturaleza del material. Introducir sin compactar aproximadamente
100 g de la muestra de prueba, M, pesada con una exactitud de O, 1%, en una probeta graduada, seca, de 250 ml (legible
hasta 2 ml). Si fuera necesario, nivelar cuidadosamente el polvo, sin compactarlo, y tomar la lectura del volumen aparente sin
asentar (V0 ) con una aproximacin a la unidad ms cercana de la escala. Calcular la densidad aparente en g/ml por la frmula
M/V0 En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repetidas. Si la densidad del polvo es de-
masiado baja o demasiado alta, de tal forma que la muestra de prueba tenga un volumen aparente sin asentamiento de ms
de 250 ml o menos de 150 ml, no es posible usar una muestra de polvo de 100 g. Por lo tanto, se debe seleccionar una
cantidad diferente de polvo como muestra de prueba, de manera que su volumen aparente sin asentamiento sea de 150 a 250
ml (volumen aparente mayor o igual a 60% del volumen total de la probeta); el peso de la muestra de prueba se especifica en
la expresin de los resultados. Para muestras de prueba que tengan un volumen aparente entre 50 y 100 ml, se puede usar
una probeta de 100 ml, legible hasta 1 ml; el volumen de la probeta se especifica en la expresin de los resultados.

Mtodo 11-Medicin en un Volmetro

APARATO

El aparato (Figura 7) consta de un embudo superior provisto de un tamiz de 1,0 mm. 1 El embudo est montado sobre una
caja deflectora que contiene cuatro placas deflectoras de vidrio sobre las que se desliza el polvo y rebota a medida que pasa. El
embudo que se encuentra en el fondo de la caja deflectora recoge el polvo y lo vierte en un vaso de capacidad especificada
colocado directamente debajo del embudo. El vaso puede ser cilndrico (con una capacidad de 25,00 0,05 ml y con un
dimetro interno de 30,00 2,00 mm) o cbico (con una capacidad de 16,39 0,20 ml cuyas dimensiones internas son de
25,400 0,076 mm).

Tamiz de 1,0 mm _ _ _ ___,_,

Embudo para polvos ___.

Caja deflectora

Vaso colector
de muestra

Figura 1.

PROCEDIMIENTO

Dejar que un exceso de polvo fluya a travs del aparato y recogerlo en el vaso colector de la muestra hasta que ste se des-
borde, usando al menos 25 cm3 de polvo con el vaso cbico y 35 cm3 de polvo con el vaso cilndrico. Quitar cuidadosamente
el exceso de polvo de la parte superior del vaso pasando suavemente el filo de la hoja de una esptula ubicada en direccin
perpendicular a la superficie y apoyada en el borde superior del vaso, tomando las precauciones necesarias para que la esptu-
la est siempre perpendicular y as evitar la compactacin o la remocin del polvo del vaso. Limpiar el material que hubiera

1 El aparato (Volmetro de Scott) se ajusta a las dimensiones que aparecen en ASTM B329-06(2012).
USP 39 Pruebas Fsicas/ (616) Densidad Aparente y por Asentamiento 489

podido quedar adherido a las paredes laterales del vaso y determinar el peso del polvo, M, con una aproximacin de O, 1%.
Calcular la densidad aparente, en g/mL, por la frmula:

en donde V0 es el volumen del vaso, en mL. Registrar el promedio de tres determinaciones usando tres muestras de polvo dife-
rentes.

Mtodo 111-Medicin en un Recipiente

APARATO

El aparato consta de un recipiente cilndrico de acero inoxidable de 100 mL, con las dimensiones que se especifican en la
Figura 2.

D
2~0
+
--54.o-.
1
52,0

l 10f
[~:;~]__.

54,0
1
50,0

l
Figura 2.

PROCEDIMIENTO

Pasar una cantidad de polvo suficiente para completar la prueba a travs de un tamiz de 1,0 mm, si fuera necesario, para
deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento y permitir que la muestra obtenida fluya
libremente hacia el recipiente de medicin hasta que se desborde. Quitar cuidadosamente el exceso de polvo de la parte supe-
rior del recipiente como se describi para el Mtodo JI. Determinar el peso (M0 ) del polvo con una aproximacin de O, 1%,
restando la masa, previamente determinada, del recipiente de medicin vaco. Calcular la densidad aparente (g/mL) por la fr-
mula M 0/l 00 y registrar el promedio de tres determinaciones, usando tres muestras de polvo diferentes.

DENSIDAD POR ASENTAMIENTO

La densidad por asentamiento es una densidad aparente aumentada, obtenida despus de golpetear mecnicamente un re-
cipiente que contiene la muestra de polvo. La densidad por asentamiento se obtiene golpeteando mecnicamente una probe-
ta o un recipiente de medicin graduado que contenga una muestra de polvo. Despus de determinar el volumen o peso ini-
cial del polvo, se golpetea mecnicamente la probeta o recipiente de medicin y se toman las lecturas de volumen o peso
hasta que sean prcticamente constantes. El asentamiento mecnico se obtiene levantando la probeta o recipiente y dejndolo
caer por su propio peso desde una altura especificada, por alguno de los tres mtodos que se describen a continuacin. Puede
ser preferible emplear dispositivos que rotan la probeta o recipiente durante el golpeteo a fin de reducir al mnimo la posibili-
dad de que la masa se separe durante el asentamiento.

Mtodo 1

APARATO

El aparato (Figura 3) consta de lo siguiente:

Una probeta graduada de 250 mL (legible hasta 2 mL, con una masa de 220 44 g)
Un aparato de asentamiento capaz de producir, en 1 minuto, nominalmente, 250 15 golpes desde una altura de 3 0,2
mm o, nominalmente, 300 15 golpes desde una altura de 14 2 mm. El soporte de la probeta graduada, con su disposi-
tivo de fijacin, tiene una masa de 450 1O g.
490 (616) Densidad Aparente y por Asentamiento/ Pruebas Fsicas USP 39

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Yunque
Esta dimensin es tal que la
cada G) cumple con las
especificaciones y que, en el punto

ms bajo de la leva, el soporte de
la probeta se apoya libremente
sobre la parte superior del yunque.

Leva

Figura 3.

PROCEDIMIENTO

Proceder segn se describi anteriormente para la determinacin del volumen aparente (V0 ). Fijar la probeta en el soporte.
Realizar 1O, 500 y 1250 golpes en la misma muestra de polvo y leer los volmenes correspondientes V10, V500 y V1250 con una
aproximacin a la unidad ms cercana de la escala. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a 2 ml, V1250 es el volu-
men por asentamiento. Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 2 ml, repetir en incrementos, por ejemplo, de 1250 golpes,
hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 2 mL Para algunos polvos, puede ser apropiado un
nmero menor de golpes, si se ha validado. Calcular la densidad por asentamiento (g/ml), usando la frmula m/VF en donde
VF es el volumen final por asentamiento. En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repeti-
das. Especificar la altura de cada con los resultados. Si no es posible utilizar una muestra de prueba de 100 g, usar una canti-
dad reducida y una probeta graduada apropiada de 100 ml (legible hasta 1 ml) que pese 130 16 g y est montada en un
soporte que pese 240 12 g. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a 1 ml, V1250 es el volumen por asentamiento.
Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 1 ml, repetir en incrementos, por ejemplo, de 1250 golpes, hasta que la diferencia
entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 1 mL Las condiciones de la prueba modificada se especifican en la expre-
sin de los resultados.

Mtodo 11

APARATO Y PROCEDIMIENTO

Proceder segn se indic en Mtodo /, excepto que el analizador mecnico proporciona una cada fija de 3 0,2 mm a una
velocidad nominal de 250 golpes por minuto.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (621) Cromatografa 491

Mtodo 111

APARATO Y PROCEDIMIENTO

Proceder segn se indic en el Mtodo 111-Medicin en un Recipiente para medir la densidad aparente en un recipiente de
medicin equipado con la tapa que se muestra en la Figura 2. El recipiente de medicin con la tapa se levanta 50-60 veces por
minuto mediante un aparato medidor de densidad por asentamiento adecuado. Efectuar 200 golpes, retirar la tapa y quitar
cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del recipiente de medicin segn se describe en el Mtodo 111-Medi-
cin en un Recipiente para medir la densidad aparente. Repetir el procedimiento con 400 golpes. Si la diferencia entre las dos
masas obtenidas despus de 200 y 400 golpes excede el 2%, realizar una prueba efectuando 200 golpes adicionales hasta que
la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menos de 2%. Calcular la densidad por asentamiento (g/mL) usando la frmula
M/100, donde MF es la masa del polvo en el recipiente de medicin. Registrar el promedio de tres determinaciones usando
tres muestras de polvo diferentes. Especificar las condiciones de la prueba en los resultados, incluyendo la altura de la cada.

MEDIDAS DE LA COMPRESIBILIDAD DE UN POLVO

Dado que las interacciones entre las partculas que afectan las propiedades que determinan la densidad aparente de un pol-
vo tambin afectan el flujo del polvo, una comparacin entre la densidad aparente y la densidad por asentamiento puede pro-
porcionar una medida de la importancia relativa de estas interacciones en un polvo determinado. A menudo, este tipo de
comparacin se usa como un ndice de la capacidad de flujo del polvo, por ejemplo, el ndice de Compresibilidad o el ndice de
Hausner, segn se describe a continuacin.
El ndice de Compresibilidad y el ndice de Hausner son medidas que expresan la propensin de un polvo a la compresin,
segn se describi antes. Como tales, son medidas de la capacidad de asentamiento de un polvo y permiten evaluar la impor-
tancia relativa de las interacciones entre partculas. En un polvo que fluye libremente, dichas interacciones son menos relevan-
tes, y la densidad aparente y la densidad por asentamiento tendrn valores ms cercanos. En el caso de materiales de menor
fluidez, generalmente existen interacciones mayores entre las partculas y se observa una diferencia mayor entre la densidad
aparente y la densidad por asentamiento. El ndice de Compresibilidad y el ndice de Hausner reflejan estas diferencias.

NDICE DE COMPRESIBILIDAD

Calcular por la frmula:

V0 = volumen aparente sin asentar

VF =volumen final asentado

NDICE DE HAUSNER

Vo/VF

Dependiendo del material, el ndice de compresibilidad se puede determinar usando V10 en vez de V0 [NOTA-Si se usa Vw
debe especificarse claramente en los resultados.]

(621) CROMATOGRAFA

INTRODUCCIN

Las tcnicas de separacin cromatogrfica son mtodos de separacin de mltiples etapas en los que los componentes de
una muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra mvil. La fase estacionaria puede ser un
slido, un lquido absorbido sobre un slido o un gel. La fase estacionaria puede estar empacada en una columna, extendida
como una capa, distribuida como pelcula o aplicada mediante otras tcnicas. La fase mvil puede ser gaseosa o lquida o un
fluido supercrtico. La separacin puede basarse en adsorcin, distribucin de masa (particin) o intercambio inico; o puede
basarse en diferencias entre las propiedades fisicoqumicas de las molculas, tales como tamao, masa o volumen. Este captu-
lo contiene procedimientos generales, definiciones y clculos de parmetros comunes y describe requisitos generales para apti-
tud del sistema. Los tipos de cromatografa tiles en el anlisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos
cromatogrficos de la USP son: cromatografa en columna, de gases, en papel, en capa delgada (incluyendo la cromatografa
492 (621) Cromatografa/ Pruebas Fsicas USP 39

en capa delgada de alta resolucin) y de lquidos presurizados (comnmente llamada cromatografa lquida de alta presin o
alta resolucin).

PROCEDIMIENTOS GENERALES
Esta seccin describe los procedimientos bsicos usados cuando se describe un mtodo cromatogrfico en una monografa.
Se deben seguir los siguientes procedimientos a menos que se indique algo distinto en la monografa individual.

Cromatografa en Papel

FASE ESTACIONARIA

La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en cuyo caso
el disolvente se desplaza hacia arriba por el papel mediante fuerzas de capilaridad, o descendente, en cuyo caso el flujo del
disolvente se ve ayudado por la fuerza de gravedad. La orientacin de las fibras del papel con respecto al flujo del disolvente se
debe mantener constante en una serie de cromatogramas. (Por lo general, el fabricante indica la direccin de mquina).

APARATO

El equipo esencial para cromatografa en papel comprende una cmara hermtica al vapor provista de entradas para agregar
el disolvente y una gradilla de material resistente a la corrosin aproximadamente 5 cm ms corta que la altura interior de la
cmara. La gradilla sirve como soporte para la cubeta de disolvente y para las varillas antisifn que, a su vez, sostienen las hojas
cromatogrficas. El fondo de la cmara est cubierto con la mezcla de disolventes o fase mvil indicada. La saturacin de la
cmara con el vapor del disolvente se facilita revistiendo las paredes del interior con un papel humedecido con la fase mvil
indicada.

SIEMBRA

La sustancia o sustancias a ser analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se aplican volmenes convenientes, medi-
dos con micropipetas adecuadas, de la solucin resultante que contengan normalmente de 1-20 g del compuesto, en zonas
de 6 a 1 O mm de dimetro y con una separacin de no menos de 3 cm.

PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFA DESCENDENTE EN PAPEL

1. Suspender la hoja cromatogrfica sembrada en el aparato, usando la varilla antisifn para sostener el extremo superior de
la hoja en la cubeta de disolvente. [NOTA-Asegurar que la porcin de la hoja que cuelga por debajo de las varillas est
suspendida libremente en la cmara sin tocar la gradilla o las paredes de la cmara o el lquido que est en el interior de la
cmara.]
2. La cmara se sella para permitir su equilibrio (saturacin) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exce-
so de presin, si fuera necesario.
3. Despus de equilibrar la cmara, la fase mvil previamente preparada se introduce en la cubeta a travs de la entrada.
4. Cerrar la entrada y dejar que la fase mvil se desplace hacia abajo la distancia deseada sobre el papel.
5. Retirar la hoja de la cmara.
6. Marcar rpidamente la ubicacin de la fase mvil y secar la hoja.
7. Observar el cromatograma y medir directamente o despus del revelado adecuado para localizar las manchas del frmaco
o de los frmacos aislados.

PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFA ASCENDENTE EN PAPEL

1. Agregar la fase mvil al fondo de la cmara.

2. La cmara se sella para permitir su equilibrio (saturacin) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exce-
so de presin, si fuera necesario.
3. Sumergir el borde inferior de la fase estacionaria en la fase mvil para permitir que la fase mvil ascienda en la hoja cro-
matogrfica por capilaridad.
4. Cuando la fase mvil haya alcanzado la altura deseada, abrir la cmara, retirar la hoja, marcar rpidamente la ubicacin
del frente de la fase mvil, y secar la hoja.
5. Observar el cromatograma y medir directamente o despus del revelado adecuado para localizar las manchas del frmaco
o de los frmacos aislados.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (621) Cromatografa 493

Cromatografa en Capa Delgada

FASE ESTACIONARIA

La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco y reducido a polvo fino que se aplica
sobre una lmina o placa de vidrio, plstico o metal (generalmente conocida como la placa). La fase estacionaria para TLC
tiene un tamao de partcula promedio de 10-15 m, y la de TLC de alta resolucin (HPTLC) tiene un tamao de partcula
promedio de 5 m. Se pueden usar placas disponibles comercialmente con una zona preadsorbente si se especifican en una
monografa. La muestra aplicada a la regin preadsorbente se desarrolla en forma de bandas estrechas y definidas en la interfa-
se entre el preadsorbente y el sorbente. Las separaciones logradas pueden basarse en la adsorcin, la particin o una combina-
cin de ambos efectos, segn el tipo especfico de fase estacionaria.

APARATO

Usar una cmara cromatogrfica de material inerte y transparente con las siguientes especificaciones: una cubeta de fondo
plano o cubetas gemelas, una tapa que cierre hermticamente y un tamao adecuado para las placas. Revestir como mnimo
una pared de la cmara cromatogrfica con papel de filtro. Agregar una cantidad suficiente de fase mvil a la cmara cromato-
grfica de modo que proporcione, despus de impregnar el papel de filtro, un nivel de profundidad apropiado a la dimensin
de la placa utilizada. Cerrar la cmara cromatogrfica y dejar que se equilibre. [NOTA-A menos que se indique algo diferente,
las separaciones se realizan en una cmara saturada.]

DETECCIN/VISUALIZACIN

A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta
(254 nm) y larga (365 nm), as como una variedad de soluciones reveladoras para visualizar las manchas.

SIEMBRA

Aplicar las soluciones en forma de zonas sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porcio-
nes lo suficientemente pequeas para obtener manchas circulares de 2-5 mm de dimetro (1-2 mm sobre placas de HPTLC) o
bandas de 10-20 mm x 1-2 mm (5-1 O mm x 0,5-1 mm sobre placas de HPTLC) a una distancia adecuada del borde inferior y
de los bordes laterales de la placa. [NOTA-Durante el desarrollo, la posicin de la aplicacin debe estar por lo menos 5 mm
(TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase mvil.] Aplicar las soluciones sobre una lnea paralela al borde inferior
de la placa con una separacin mnima de 1O mm (5 mm en placas de HPTLC) entre los centros de las manchas o 4 mm (2
mm en placas de HPTLC) entre los bordes de las bandas y dejar que se sequen.

PROCEDI M 1ENTO

1. Colocar la placa en la cmara, asegurando que las manchas o bandas estn por encima de la superficie de la fase mvil.
2. Cerrar la cmara.
3. Dejar que la fase mvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido tres cuartos de la longitud
de la placa o la distancia indicada en la monografa.
4. Retirar la placa, marcar el frente de la fase mvil con un lpiz, y dejar que se seque.
5. Visualizar los cromatogramas segn se indica.
6. Determinar los valores del factor de retardo cromatogrfico (RF) para las manchas o zonas principales.
7. Se puede realizar una identificacin presuntiva mediante la observacin de las manchas o zonas con valores RF idnticos y
de magnitud similar, obtenidas respectivamente cromatografiando una muestra desconocida y un estndar en la misma
placa. Una comparacin visual del tamao o intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimacin semi-
cuantitativa. La mediciones cuantitativas se pueden efectuar mediante densitometra (mediciones de absorbancia o fluo-
rescencia).

Cromatografa en Columna

SOPORTE SLIDO

Usar tierra silcea purificada para separacin de fase normal. Usar tierra silcea cromatogrfica silanizada para cromatografa
de particin en fase reversa.
 494 (621) Cromatografa/ Pruebas Fsicas USP 39

FASE ESTACIONARIA

Modificar el soporte slido agregando la fase estacionaria especificada en la monografa individual. Si se emplea una mezcla
de lquidos como fase estacionaria, mezclarlos antes de la introduccin del soporte slido.

FASE MVIL

La fase mvil se especifica en la monografa individual. Si la fase estacionaria es una solucin acuosa, equilibrar con agua. Si
la fase estacionaria es un lquido orgnico polar, equilibrar con ese lquido.

APARATO

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, el tubo cromatogrfico tiene un dimetro interno de
aproximadamente 22 mm y una longitud de 200-300 mm. Acoplado al tubo cromatogrfico se encuentra un tubo de salida
sin llave de paso con un dimetro interno de aproximadamente 4 mm y una longitud de aproximadamente 50 mm.
Preparacin del aparato: Apisonar un trozo de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combinar el volumen especificado
de fase estacionaria y la cantidad especificada de soporte slido para producir una mezcla homognea y liviana. Transferir esta
mezcla al tubo cromatogrfico y apisonar empleando presin suave, hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad especifi-
cada de soporte slido es ms de 3 g, transferir la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisonar cada
porcin. Si la valoracin o la prueba requieren una columna multisegmentada, con una fase estacionaria diferente especificada
para cada segmento, apisonar despus de la adicin de cada segmento y agregar cada segmento directamente sobre el ante-
rior. Apisonar un trozo de lana de vidrio fina por encima del relleno de la columna. [NOTA-La fase mvil debe fluir a travs de
una columna rellena adecuadamente como una corriente moderada o, si se lleva a cabo una cromatografa en fase reversa,
como un goteo lento.]
Si se incorpora la solucin del analito en la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatogrfico
raspando el vaso de precipitados usado para la preparacin de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g
de Soporte Slido y varias gotas del disolvente usado para preparar la solucin muestra antes de agregar el trozo final de lana
de vidrio por encima del relleno.

PROCEDIMIENTO

1. Transferir la fase mvil al espacio de la columna por encima del relleno y dejar que fluya a travs de la columna por accin
de la gravedad.
2. Enjuagar la punta de la columna cromatogrfica con aproximadamente 1 mL de fase mvil antes de cada cambio en la
composicin de la fase mvil y despus de completar la elucin.
3. Si se introduce el analito en la columna como una solucin en la fase mvil, dejar que pase completamente al relleno de
la columna, luego agregar fase mvil en varias porciones pequeas, dejando que cada porcin drene completamente, an-
tes de agregar el grueso de la fase mvil.
4. Cuando el procedimiento indique el uso de mltiples columnas cromatogrficas montadas en serie y se especifique la adi-
cin de fase mvil en porciones divididas, dejar que cada porcin drene por completo a travs de cada columna, y enjua-
gar la punta de la columna con fase mvil antes de la adicin de cada porcin sucesiva.

Cromatografa de Gases (GC)

FASE ESTACIONARIA LQUIDA

Este tipo de fase est disponible en columnas rellenas o capilares.

CROMATOGRAFA DE GASES EN COLUMNA RELLENA

La fase estacionaria lquida se deposita sobre un soporte slido inerte finamente dividido, como por ejemplo tierra de diato-
meas, polmeros porosos, o carbono grafito, con el que se rellena la columna que por lo regular tiene un dimetro interno de
2-4 mm y una longitud de 1-3 m.

CROMATOGRAFA DE GASES EN COLUMNA CAPILAR

En las columnas capilares, las cuales no estn rellenas con soporte slido, la fase estacionaria lquida se deposita sobre la
superficie interna de la columna y puede unirse qumicamente a ella.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (621) Cromatografa 495

FASE ESTACIONARIA SLIDA

Este tipo de fase est disponible nicamente en columnas rellenas. En estas columnas, la fase slida es un adsorbente activo,
como por ejemplo almina, slice o carbono, con el que se rellena una columna. Las resinas poliaromticas porosas, que a ve-
ces se emplean en las columnas rellenas, no se recubren con una fase lquida. [NOTA-Las columnas capilares y rellenas deben
acondicionarse antes del uso, hasta que la lnea base y otras caractersticas sean estables. Los distribuidores de columnas y ma-
teriales de relleno proveen instrucciones relativas al acondicionamiento recomendado.]

APARATO

Un cromatgrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector, una columna, un detector y un dispositi-
vo registrador. El inyector, la columna y el detector tienen temperaturas controladas y se puede variar como parte del anlisis.
Los gases transportadores tpicos son helio, nitrgeno o hidrgeno, dependiendo de la columna y el detector en uso. El tipo de
detector que se usa depende de la naturaleza de los compuestos que se analizan y se especifica en la monografa individual. La
seal de salida de los detectores se registra como la respuesta del instrumento en funcin del tiempo y la medida del rea o
altura del pico, es una funcin de la cantidad presente.

PROGRAMA DE TEMPERATURA

La longitud y la calidad de una separacin por GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna cromatogr-
fica. Cuando sea necesario un programa de temperatura, la monografa individual indica las condiciones en formato de tabla.
La tabla indica la temperatura inicial, la velocidad de cambio de temperatura (rampa), la temperatura final y el tiempo de espe-
ra (hold time) a la temperatura final.

PROCEDIMIENTO

1. Equilibrar la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas transportador hasta obtener una seal constante.
2. Inyectar una muestra a travs del septo del inyector, o usar un muestreador automtico.
3. Comenzar el programa de temperatura.
4. Registrar el cromatograma.
5. Analizar segn se indica en la monografa.

Cromatografa de Lquidos (HPLC)

El trmino cromatografa de lquidos, segn se usa en los compendios, es sinnimo de cromatografa lquida de alta presin y
de cromatografa lquida de alta resolucin. La cromatografa de lquidos es una tcnica de separacin basada en una fase esta-
cionaria slida y una fase mvil lquida.

FASE ESTACIONARIA

Las separaciones se logran por procesos de particin, adsorcin o intercambio inico, segn el tipo de fase estacionaria em-
pleada. Las fases estacionarias ms comnmente usadas son la slice modificada o las microperlas de polmero. Las microperlas
se modifican agregando hidrocarburos de cadena larga. El tipo de relleno especfico necesario para completar un anlisis se
indica mediante la designacin "L" en la monografa individual (ver tambin la seccin Columnas Cromatogrficas ms adelan-
te). A menudo, el tamao de las microperlas tambin se describe en la monografa. Los cambios en el tipo y tamao de relleno
se analizan en la seccin Aptitud del Sistema de este captulo.

COLUMNA CROMATOGRFICA

El trmino columna incluye columnas de acero inoxidable, de acero inoxidable con recubrimiento interno y polimricas, re-
llenas con una fase estacionaria. La longitud y el dimetro interno de la columna afectan la separacin y, por lo tanto, las di-
mensiones tpicas de la columna se incluyen en la monografa individual. Los cambios en las dimensiones de la columna se
analizan en la seccin Aptitud del Sistema de este captulo. Las monografas farmacopeicas no incluyen el nombre comercial de
las columnas apropiadas; esta omisin evita la interpretacin de cualquier tipo de respaldo para un producto de un proveedor
y permite la adaptacin a cambios normales en el mercado. Ver la seccin Columnas Cromatogrficas para ms informacin.
En los procedimientos de HPLC, se puede usar una guarda columna siempre que se cumplan los siguientes requisitos, a me-
nos que se indique algo diferente en la monografa individual: (a) la longitud de la guarda columna debe ser no mayor de
15% de la longitud de la columna analtica, (b) el dimetro interno debe ser igual o menor que el de la columna analtica y (c)
el material de relleno debe ser el mismo que en la columna analtica (p.ej., slice) y contener la misma fase ligada (p.ej., Cl 8).
496 (621) Cromatografa / Pruebas Fsicas USP 39

En todo caso, se deben cumplir todos los requisitos de aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial con la
guarda columna instalada.

FASE MVIL

La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes, segn se define en la monografa individual.

APARATO

Un cromatgrafo de lquidos consta de un recipiente que contiene la fase mvil, una bomba para forzar el paso de la fase
mvil a travs del sistema a alta presin, un inyector para introducir la muestra en la fase mvil, una columna cromatogrfica,
un detector y un dispositivo de recoleccin de datos.

ELUCIN EN GRADIENTE

Se denomina elucin en gradiente o programacin del disolvente a la tcnica de cambiar continuamente la composicin del
disolvente durante la cromatografa. El perfil de elucin en gradiente se presenta en la monografa individual como una tabla
de gradientes, que indica el tiempo y la composicin proporcional de la fase mvil en el tiempo indicado.

PROCEDI M1ENTO

1. Equilibrar la columna y el detector con fase mvil a la velocidad de flujo especificada hasta obtener una seal constante.
2. Inyectar una muestra a travs del inyector o usar un muestreador automtico.
3. Comenzar el programa de gradientes.
4. Registrar el cromatograma.
5. Analizar segn se indica en la monografa.

COLUMNAS CROMATOGRFICAS
Una lista completa de rellenos (L), fases (G) y soportes (S) usados en las pruebas y valoraciones de USP-NF se encuentra en la
seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones-Columnas Cromatogrficas de USP-NF y PF. Esta lista pretende ser una referencia til
para el tcnico en cromatografa en la identificacin de la columna cromatogrfica correspondiente especificada en la mono-
grafa individual.

DEFINICIONES E INTERPRETACIN DE CROMATOGRAMAS

Cromatograma: Un cromatograma es una representacin grfica de la respuesta del detector, concentracin de analito
en el efluente u otra cantidad usada como una medida de concentracin del efluente en funcin del volumen de efluente o del
tiempo. En la cromatografa planar se puede usar el trmino, cromatograma para referirse al papel o capa con las zonas separa-
das.
La Figura 7 representa una separacin cromatogrfica tpica de dos sustancias, 1 y 2. tR 7 y tR 2 son los tiempos de retencin
respectivos; h es la altura, h/ 2 es la mitad de la altura y Wh 12 es el ancho a la mitad de la altura, para el pico 1. W1 y W2 son los
anchos de los picos 1 y 2, respectivamente, en la lnea base. Los picos de aire son una caracterstica de los cromatogramas de
gases y corresponden al frente de la fase mvil en la cromatografa de lquidos. El tiempo de retencin de estos picos de aire o
componentes no retenidos se denomina tM.

ll:'.
Pico del disolvente
~

w
f-
w
o
--' Cola del disolvente
w
o
~
(/)
w
::J
Q_
(/)
w
ll:'.

TIEMPO - - - - -

Figura 1. Separacin cromatogrfica de las dos sustancias.

 USP 39 Pruebas Fsicas/ (621) Cromatografa 497

Volumen de Residencia (D): El volumen de residencia (tambin conocido como volumen de demora en elucin a gra-
diente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna.
Tiempo Muerto (tM): El tiempo muerto es el tiempo requerido para la elucin de un componente no retenido (ver la
Figura 1, mostrado como un pico de aire o de componente no retenido, con la escala de la lnea base en minutos).
Volumen Muerto (VM): El volumen muerto es el volumen de fase mvil requerido para eluir un componente no retenido.
Se puede calcular a partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo F, en mL/min:

VM = tM X F
En la cromatografa de exclusin por tamao, se usa el smbolo V0
Nmero de Platos Tericos (N) 1: N es una medida de eficiencia de la columna. Para los picos gaussianos, se calcula por
la ecuacin:

en donde tR es el tiempo de retencin de la sustancia y W es el ancho del pico en su base, que se obtiene extrapolando los
lados relativamente rectos del pico hasta la lnea base. El valor de N depende de la sustancia cromatografiada as como de las
condiciones operativas, tales como la velocidad de flujo y la temperatura de la fase mvil o gas transportador, la calidad del
relleno, la uniformidad del relleno dentro de la columna, y, para columnas capilares, el espesor de la pelcula de fase estaciona-
ria, el dimetro interno y la longitud de la columna.
Cuando se usan integradores electrnicos, puede ser conveniente determinar el nmero de platos tericos por la ecuacin:

donde Wh12 es el ancho del pico a la mitad de la altura. Sin embargo, en caso de discrepancias, slo se deben usar las ecuacio-
nes basadas en el ancho del pico en la lnea base.
Pico: El pico es la porcin del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un componente individual elu-
ye de la columna. Si la separacin es incompleta, se puede registrar la elucin de dos o ms componentes como un pico no
resuelto.
Relacin Pico/Valle (p/v): La p/v se pueden emplear como un criterio de aptitud del sistema en una prueba de sustancias
relacionadas cuando no se logra la separacin entre dos picos en la lnea base. La Figura 2 representa una separacin incomple-
ta de dos sustancias, donde HP es la altura del pico menor por encima de la lnea base extrapolada y Hv es la altura en el punto
ms bajo de la curva que separa los picos menor y mayor por encima de la lnea base extrapolada:

p/v= H/Hv

Figura 2. Determinacin de la relacin pico/valle.

Retardo Relativo (R,.t): El retardo relativo es el cociente entre la distancia recorrida por el analito y la distancia recorrida
simultneamente por un compuesto de referencia (ver la Figura 3) y se usa en una cromatografa planar.

1 Los parmetros k, N, r y rG se desarrollaron para separaciones por GC isotrmicas y separaciones por HPLC isocrticas. Debido a que estos trminos son
parmetros termodinmicos, son vlidos nicamente para separaciones realizadas a temperatura, composicin de la fase mvil y velocidad de flujo constantes. No
obstante, para separaciones realizadas con un programa de temperatura o gradiente de disolventes, estos parmetros se pueden usar simplemente como medio de
comparacin para asegurar que existen las condiciones cromatogrficas adecuadas para llevar a cabo los mtodos segn se indican en las monografas.
498 (621) Cromatografa/ Pruebas Fsicas USP 39

Rret = b/c

-~----- Frente de Fase Mvil

Muestra

Referencia

Figura 3. Cromatografa planar tpica.

Retencin Relativa (r) 1 : Es el cociente entre el tiempo de retencin ajustado de un componente y el de otro usado como
referencia obtenido en condiciones idnticas:

r= tR2 - tM/tR1 - tM

donde tR2 es el tiempo de retencin medido desde el punto de inyeccin del compuesto de inters; tR 1 es el tiempo de reten-
cin medido a partir del punto de inyeccin del compuesto usado como referencia; y tM es el tiempo de retencin de un mar-
cador no retenido definido en el procedimiento, todos determinados en condiciones experimentales idnticas en la misma co-
lumna.
Tiempo de Retencin Relativo (RR1): Tambin conocido como tiempo relativo no ajustado. Las comparaciones en la
USP normalmente se realizan en trminos de retencin relativa no ajustada, a menos que se indique de otro modo.

RRT = tR)tR1
El smbolo re tambin se usa para designar los valores de retencin relativa no ajustados.
Desviacin Estndar Relativa Porcentual

%RSD
I( x-xf ]
= 1~0 [~i~1 -
112

X N-1

Factor de Retardo (RF): El factor de retardo es el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la
distancia recorrida simultneamente por la fase mvil y se usa en cromatografa planar. Usando los smbolos de la Figura 3:

RF = b/a
Factor de Retencin (k) 1 : El factor de retencin tambin se conoce como el factor de capacidad (k'). Se define como:

k cantidad de sustancia en la fase estacionaria

cantidad de sustancia en la fase mvil

o
k = tiempo de la sustancia en la fase estacionaria
tiempo de la sustancia en la fase mvil

El factor de retencin de un componente se puede determinar a partir del cromatograma:

k = (tR - tM)/tM
Tiempo de Retencin (tR): En cromatografa lquida y cromatografa de gases, el tiempo de retencin, tR, se define como
el tiempo transcurrido entre la inyeccin de la muestra y la aparicin de la respuesta mxima. Se puede usar tR como un par-
metro para identificacin. Los tiempos de retencin cromatogrficos son caractersticos de los compuestos que representan,
pero no son nicos. La coincidencia de los tiempos de retencin de una muestra y de una sustancia de referencia puede usarse
como un criterio parcial en la construccin de un perfil de identidad, pero es insuficiente por s misma para establecer la identi-
dad. Los tiempos de retencin absolutos de un compuesto dado varan de un cromatograma al siguiente.
Volumen de Retencin (VR): El volumen de retencin es el volumen de fase mvil requerido para la elucin de un com-
ponente. Se puede calcular a partir del tiempo de retencin y de la velocidad de flujo en mL/min:
USP 39 Pruebas Fsicas/ (621) Cromatografa 499

VR = tR X F
Resolucin (R5): La resolucin es la separacin de dos componentes en una mezcla, calculada por:
R5 = 2 x (tR 2 - tR 1)/(W1 + W2)
donde tR2 y tR 1 son los tiempos de retencin de los dos componentes; y W2 y W 7 son los anchos correspondientes en las bases
de los picos obtenidos extrapolando los lados relativamente rectos de los picos hasta la lnea base.
Cuando se usan integradores electrnicos, puede ser conveniente determinar la resolucin, mediante la ecuacin:
Rs = 1, 18 x (tR2 - tR)/(W1,h12 + W2,h;2)
Factor de Separacin (a): El factor de separacin es la retencin relativa calculada para dos picos adyacentes (por con-
vencin, el valor del factor de separacin siempre es >1 ):
a= kifk 1

Factor de Simetra (A 5) 2 : El factor de simetra (tambin conocido como factor de asimetra) de un pico (ver la Figura 4) se
calcula por:
As= Wo,os/2f
donde W0 ,05 es el ancho del pico al 5% de la altura y fes la distancia del mximo del pico hasta el borde inicial del pico, mi-
diendo la distancia en un punto ubicado al 5% de la altura desde de la lnea base.

Th

0,05h

Figura 4. Pico cromatogrfico asimtrico.

Factor de Asimetra (7): Ver Factor de Simetra.

APTITUD DEL SISTEMA

Las pruebas de aptitud del sistema son una parte integral de los mtodos de cromatografa de lquidos y de gases. Estas
pruebas se usan para verificar que el sistema cromatogrfico sea adecuado para el anlisis que se pretende efectuar.
Las pruebas se basan en el concepto de que el equipo, los sistemas electrnicos, las operaciones analticas y las muestras
analizadas constituyen un sistema integral que se puede evaluar como tal.
Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatogrfico incluyen lo siguiente:
Composicin, fuerza inica, temperatura y pH aparente de la fase mvil
Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presin
Las caractersticas de la fase estacionaria, incluyendo el tipo de soporte cromatogrfico (basado en partculas o monolti-
co), tamao de partcula, tamao de poro y rea superficial especfica
En fase reversa y otras modificaciones superficiales de las fases estacionarias, el grado de modificacin qumica (segn se
expresa mediante recubrimiento exhaustivo (end-capping), carga de carbono, etc.)
La resolucin, R5, es una funcin del nmero de platos tericos, N (tambin referido como eficiencia), el factor de separa-
cin, a, y el factor de capacidad, k. [NOTA-Todos los trminos y smbolos se definen en la seccin anterior Definiciones e Inter-
pretacin de Cromatogramas.] Para una fase mvil y una fase estacionaria determinadas, se puede especificar N para asegurar
que los compuestos que eluyen muy cerca entre s se resuelvan unos de otros, para establecer el poder de resolucin general
del sistema y para asegurar que el estndar interno se resuelva del frmaco. Este es un medio menos confiable para asegurar la
resolucin que la medicin directa de la misma. La eficiencia de la columna es, en parte, un reflejo de la agudeza del pico, que
es tambin importante para la deteccin de trazas de componentes.
Las inyecciones repetidas de una preparacin estndar u otras soluciones estndar se comparan entre s para determinar si se
cumplen los requisitos de precisin. A menos que se especifique de otro modo en la monografa individual, se usan los datos

2 Una prctica comn consiste en medir el Factor de Asimetra como el cociente entre la distancia entre la lnea vertical que conecta el pice del pico con la lnea
base interpolada y el frente del pico, y la distancia entre dicha lnea y el pico medido a la inversa al 10% de la altura del pico (ver la Figura 4) sera (W0 10 - f010 )/
f0 ,10 . No obstante, para los propsitos de la USP, nicamente es vlida la frmula (A 5) segn se presenta en este captulo. ' '
500 (621) Cromatografa / Pruebas Fsicas USP 39

de cinco inyecciones repetidas del analito para calcular la desviacin estndar relativa, %RSD, si el requisito es 2,0% o menos;
se usan los datos de seis inyecciones repetidas si el requisito de desviacin estndar relativa es ms de 2,0%.
Para la Valoracin en una monografa de un frmaco, donde el valor es 100% para la sustancia pura, y no se especifica una
desviacin estndar relativa mxima, se calcula la %RSD mxima permitida para una serie de inyecciones de la solucin de
referencia como:

%RSD = KB'ilt90%,n-i
donde K es una constante (0,349), obtenida a partir de la expresin K = (0,61-12.) x (t90 % 15 l'6), en la que 0,61-12. representa la
desviacin estndar relativa porcentual requerida despus de seis inyecciones para B = 1,0; Bes el lmite superior provisto en la
definicin de la monografa individual menos 100%; n es el nmero de inyecciones repetidas de la solucin de referencia (3
sn s 6); y t90 %,n-i es el valor t de Student al 90% del nivel de probabilidad (dos colas) con n - 7 grados de libertad.
A menos que se indique de otro modo, la desviacin estndar relativa mxima permitida no excede del valor apropiado pro-
visto en la tabla de requisitos de repetibilidad. Este requisito no se aplica a las pruebas para sustancias relacionadas.
Requisitos para Desviacin Estndar Relativa
Nmero de Inyecciones Individuales
3 4 5 6
B (%) RSD Mxima Permitida
2,0 0,41 0,59 0,73 0,85
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06
3,0 0,62 0,89 1,10 1,27

El factor de simetra, A5, una medicin de la simetra del pico, la unidad es el valor que adquiere para picos perfectamente
simtricos; y su valor se incrementa conforme la asimetra se vuelve ms pronunciada (ver la Figura 4). En algunos casos, pue-
den observarse valores menores a la unidad. A medida que la simetra del pico se aleja de valores de 1, la integracin y por lo
tanto la precisin se tornan menos confiables.
La relacin seal-ruido (SIN) es un parmetro til de aptitud del sistema. La SIN se calcula segn se indica a continuacin:
SIN= 2Hlh
donde Hes la altura del pico medido a partir del pice del pico hasta la lnea base extrapolada sobre una distancia ?:5 veces el
ancho del pico a su altura media; y hes la diferencia entre el valor de ruido ms grande y ms pequeo observados sobre una
distancia ?:5 veces el ancho del pico a su altura media y, si fuera posible, igualmente distribuida a ambos lados del pico de
inters (ver la Figura 5).

Figura 5. Ruido y pico cromatogrfico, componentes de la relacin SIN.

Estas pruebas de aptitud del sistema se realizan recolectando datos a partir de inyecciones repetidas del estndar u otras
soluciones segn se especifica en la monografa individual.
La especificacin de parmetros definidos en una monografa no excluye el uso de otras condiciones de operacin aptas.
Puede ser necesario realizar ajustes al sistema cromatogrfico especificado para cumplir con los requisitos de aptitud del sis-
tema. Los ajustes realizados a los sistemas cromatogrficos para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema no deben
hacerse para compensar fallas en la columna o malfuncionamiento del sistema. Se permiten ajustes nicamente cuando se en-
cuentran disponibles estndares adecuados (incluyendo Estndares de Referencia) para todos los compuestos usados en la
prueba de aptitud; y los ajustes o el cambio de columna generan un cromatograma que cumple con todos los requisitos de
aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial.
Si es necesario realizar ajustes a las condiciones operativas para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema, cada uno
de los parmetros en la lista siguiente es la variacin mxima que se puede considerar, a menos que se indique algo distinto en
la monografa; estos cambios pueden requerir datos de verificacin adicionales. Para verificar la aptitud del mtodo en estas
nuevas condiciones, evaluar las caractersticas de desempeo analtico pertinentes que sean potencialmente afectadas por el
cambio. Mltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el desempeo del sistema y deben considerarse cuidadosa-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (621) Cromatografa 501

mente antes de implementarlos. En algunas circunstancias, puede ser deseable usar una columna para HPLC con dimensiones
distintas a las prescritas en el procedimiento oficial (longitud, dimetro interno y/o tamao de partcula diferentes). En todo
caso, los cambios en las caractersticas qumicas (designacin "L") de la fase estacionaria debern considerarse como una mo-
dificacin del mtodo y requerirn validacin completa. No se recomienda realizar ajustes a la composicin de la fase mvil en
la elucin en gradiente puesto que puede ocasionar cambios en la selectividad. Si se requieren ajustes, se permiten cambios en
el relleno de la columna (manteniendo las mismas propiedades qumicas), en la duracin del tiempo de espera isocrtico inicial
(cuando se indique) y/o ajustes en el volumen de residencia. Las concesiones adicionales para el ajuste de gradientes se tratan
a continuacin.
pH de la Fase Mvil (HPLC): El pH de la solucin amortiguadora acuosa usada en la preparacin de la fase mvil se pue-
de ajustar dentro de 0,2 unidades del valor o intervalo especificado. Se aplica a las separaciones en gradiente e isocrticas.
Concentracin de Sales en la Solucin Amortiguadora (HPLC): La concentracin de las sales usadas en la preparacin
de la solucin amortiguadora acuosa empleada en la fase mvil se puede ajustar dentro de 10% siempre que se cumpla con
la variacin del pH permitida (ver arriba). Se aplica a las separaciones en gradiente e isocrticas.
Relacin de los Componentes en la Fase Mvil (HPLC): Los siguientes lmites de ajuste aplican a componentes minori-
tarios de la fase mvil (especificados a 50% o menos). La cantidad de estos componentes se puede ajustar en un 30% relati-
vo. Sin embargo, el cambio en cualquier componente no puede exceder de 10% absoluto (es decir, en relacin a la fase
mvil total). Se puede ajustar un componente minoritario en una mezcla ternaria. A continuacin se presentan ejemplos de
ajustes para mezclas binarias y ternarias.
Mezclas Binarias
RELACIN ESPECIFICADA DE 50:50: 30% de 50 es 15% absoluto, pero esto excede el cambio mximo permitido de 10% ab-
soluto en cada componente. Por lo tanto, slo se puede ajustar la relacin de la fase mvil dentro del intervalo de 40:60-
60:40.
RELACIN ESPECIFICADA DE 2:98: 30% de 2 es 0,6% absoluto. Por lo tanto, el ajuste mximo permitido se encuentra dentro
del intervalo de 1,4: 98,6-2,6: 97,4.
Mezclas Ternarias
RELACIN ESPECIFICADA DE 60:35:5: Para el segundo componente, 30% de 35 es 10,5% absoluto, que excede el cambio m-
ximo permitido de 10% absoluto en cualquier componente. Por lo tanto, el segundo componente slo puede ajustarse den-
tro del intervalo de 25%--45% absoluto. Para el tercer componente, 30% de 5 es 1,5% absoluto. En todos los casos, usar una
cantidad suficiente del primer componente para obtener un total de 100%. Como consecuencia, los intervalos de mezclas de
50:45:5-70:25:5 58,5: 35: 6,5-61,5: 35: 3,5 cumplirn con el requisito.
Longitud de Onda del Detector UV-Visible (HPLC): No estn permitidas las desviaciones de las longitudes de onda es-
pecificadas en el procedimiento. Se usa el procedimiento especificado por el fabricante del detector, u otro procedimiento vali-
dado, para verificar que el error en la longitud de onda del detector sea, como mximo, 3 nm.
Fase Estacionaria
LONGITUD DE LA COLUMNA (Ge): Se puede ajustar tanto como 70%.
LONGITUD DE LA COLUMNA (HPLC): Ver Tamao de Partcula (HPLC) ms adelante.
DIMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (HPLC): Se puede ajustar siempre que la velocidad lineal se mantenga constante. Ver Velo-
cidad de Flujo (HPLC) ms adelante.
DIMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (GC)-Se puede ajustar tanto como 50%.
ESPESOR DE LA PELCULA (GC CAPILAR)-Se puede ajustar tanto como -50% a 100%.
Tamao de Partcula (HPLC): Para separaciones isocrticas, se puede modificar el tamao de partcula y/o la longitud de
la columna siempre que la relacin entre la longitud de la columna (L) y el tamao de partcula (dp) permanezca constante o
dentro del intervalo entre -25% y +50% de la relacin L/dp prescrita. Como alternativa (igual que para la aplicacin del ajuste
de tamao de partcula para partculas con superficies porosas), se pueden usar otras combinaciones de L y dp siempre que el
nmero de platos tericos (N) est dentro del intervalo -25% a +50%, con respecto a la columna prescrita. Se debe tener
cuidado cuando el ajuste resulte en un nmero mayor de platos tericos pues esto genera volmenes de pico menores y pue-
de requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la banda extra columna originado por factores tales como la tubula-
dura del instrumento, el volumen de celda del detector y la velocidad de muestreo, y el volumen de inyeccin. Cuando no se
mencione el tamao de partcula en la monografa, la relacin se debe calcular usando el tamao de partcula ms grande
designado en la definicin USP de la columna. Para separaciones en gradiente, no se permiten cambios en la longitud de la
columna, en el dimetro interno de la columna ni en el tamao de partcula.
Tamao de la Partcula (GC): Es aceptable cambiar la malla de un soporte para GC de un tamao de partcula mayor a
uno menor o de uno menor a uno mayor siempre que la cromatografa cumpla con los requisitos de aptitud del sistema y se
mantenga la misma relacin del intervalo de tamao de partcula. La relacin del intervalo del tamao de partcula se define
como el dimetro de la partcula ms grande dividida por el dimetro de la partcula ms pequea.
Velocidad de Flujo (GC): La velocidad de flujo se puede ajustar tanto como 50%.
Velocidad de Flujo (HPLC): Cuando se modifica el tamao de partcula, puede ser necesario ajustar la velocidad de flujo
debido a que las columnas con un tamao de partcula menor requerirn de velocidades lineales ms altas para el mismo de-
sempeo (medido por una reduccin de la altura del plato). Los cambios en la velocidad de flujo para un cambio en el dime-
tro de la columna y en el tamao de partcula se pueden realizar mediante:
502 (621) Cromatografa / Pruebas Fsicas USP 39

F2 = F1 x [(de/ x dp 1)/(de 12 x dp2 )]

donde F1 y F2 son las velocidades de flujo para las condiciones originales y modificadas, respectivamente; de, y de2 son los di-
metros de columna respectivos; y dp 1 y dp2 son los tamaos de partcula.
Cuando se realiza un cambio de partculas de :?:3 m a <3 m en separaciones isocrticas, se puede justificar un aumento
adicional en la velocidad lineal (ajustando la velocidad de flujo), siempre que la eficiencia de la columna no caiga en ms del
20%. De manera similar, un cambio de partculas de <3 m a :?:3 m puede requerir la reduccin adicional de la velocidad
lineal (velocidad de flujo) para evitar una reduccin en la eficiencia de la columna de ms del 20%. No se permiten cambios
en F, de y dp para separaciones en gradiente.
Adems, la velocidad de flujo se puede ajustar en 50% (slo en separacin isocrtica).
EJEMPLOS: Los ajustes en la longitud de la columna, el dimetro interno, el tamao de partcula y la velocidad de flujo se
pueden usar de manera combinada para proveer condiciones equivalentes (mismo N), pero con diferencias en la presin y el
tiempo de corrida. La tabla siguiente lista algunas de las configuraciones de columna ms populares para proveer una eficien-
cia equivalente (N) mediante el ajuste de estas variables.

Tamao de Valores Relativos

Longitud Dimetro de la Partcula Tiempo de
(l, mm) Columna (de, mm) (dp, m) l/dp F N Presin Corrida
250 4,6 10 25000 0,5 0,8 0,2 3,3
150 4,6 5 30000 1,0 1,0 1,0 1,0
150 2,1 5 30000 0,2 1,0 1,0 1,0
100 4,6 3,5 28600 1,4 1,0 1,9 0,5
100 2,1 3,5 28600 0,3 1,0 1,9 0,5
75 4,6 2,5 30000 2,0 1,0 4,0 0,3
75 2,1 2,5 30000 0,4 1,0 4,0 0,3
50 4,6 1,7 29400 2,9 1,0 8,5 0,1
50 2,1 1,7 29400 0,6 1,0 8,5 0,1

Por ejemplo, si una monografa especifica una columna de 150 mm x 4,6 mm, de 5 m, operada a 1,5 mL/minuto, se pue-
de esperar la misma separacin con una columna de 75 mm x 2, 1 mm, de 2,5 m operada a 1,5 mL/minuto x 0,4 = 0,6 mL/
minuto, junto con un aumento en la presin de aproximadamente cuatro veces y una reduccin en el tiempo de corrida hasta
aproximadamente 30% del original.
Volumen de Inyeccin (HPLC): El volumen de inyeccin se puede ajustar siempre que sea congruente con la precisin, la
linealidad y los lmites de deteccin aceptados. Se debe tomar en cuenta que un volumen excesivo de inyeccin puede llevar a
un ensanchamiento inaceptable de la banda, ocasionando una reduccin en N y en la resolucin. Aplica a las separaciones en
gradiente e isocrticas.
Volumen de Inyeccin y Volumen de Divisin (Split Volume) (GC): El volumen de inyeccin y el volumen de divisin
se pueden ajustar si la deteccin y la repetibilidad son satisfactorias.
Temperatura de la Columna (HPLC): La temperatura de la columna se puede ajustar tanto como 1 O. Se recomienda la
termostatizacin de la columna para mejorar el control y la reproducibilidad del tiempo de retencin. Se aplica a las separacio-
nes en gradiente e isocrticas.
Temperatura del Horno (GC): La temperatura del horno se puede ajustar tanto como 10%.
Programa de Temperatura del Horno (GC): Se permiten ajustes de la temperatura segn se especific anteriormente.
Cuando la temperatura especificada se debe mantener o cuando la temperatura debe cambiarse de un valor a otro, se permite
un ajuste de hasta 20%.
A menos de se indique algo distinto en la monografa, los parmetros de aptitud del sistema se determinan a partir del pico
del analito.
Los valores medidos de R, o RF o tR para la muestra no se desvan de los valores obtenidos para el compuesto o la mezcla de
referencia en ms que los estimados de confiabilidad estadsticamente determinados en valoraciones repetidas del compuesto
de referencia. Los tiempos de retencin relativos, si se proporcionan en las monografas, son con fines informativos nicamente
para facilitar la identificacin de los picos. No existen criterios de aceptacin pertinentes a los tiempos de retencin relativos.
El sistema operativo final debe someterse a una prueba de aptitud para determinar su eficiencia. Realizar inyecciones de las
preparaciones apropiadas segn se requiera para demostrar una adecuada Aptitud del sistema en toda la corrida (segn se des-
cribe en la seccin Sistema cromatogrfieo del procedimiento en una monografa).
La preparacin puede ser una preparacin estndar o una solucin que contenga una cantidad conocida de analito y cual-
quier material adicional (por ejemplo, excipientes o impurezas) tiles para el control del sistema analtico. Siempre que haya
un cambio significativo en el sistema cromatogrfico (equipo, componentes de la fase mvil, u otros componentes) o en un
reactivo crtico, debera restablecerse la Aptitud del sistema. Ningn anlisis de muestras es aceptable a menos que se haya de-
mostrado la aptitud del sistema.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (631) Color y Acromatismo 503

CUANTIFICACIN

Durante la cuantificacin, no tomar en cuenta los picos producidos por disolventes y reactivos o generados por la fase mvil
o la matriz de la muestra.
En el intervalo lineal, el rea del pico y la altura del pico son generalmente proporcionales a la cantidad de compuesto elui-
do. Las reas y las alturas de los picos se miden comnmente mediante integradores electrnicos, pero se pueden determinar
de modos ms clsicos. En general, se emplean las reas de los picos pero pueden ser menos exactas si se producen interferen-
cias. Los componentes medidos se separan de cualquier componente interferente. Se deben minimizar las asimetras tanto en
la parte anterior como en la posterior del pico y se debe evitar la medicin de picos dentro de las colas de otros picos.
Aunque se prefiere la comparacin de los picos de impurezas con los del cromatograma de un estndar de la impureza a
una concentracin similar, las pruebas de impurezas pueden basarse en la medicin de las respuestas de los pico debidos a
impurezas y expresarse como un porcentaje del rea del pico del frmaco. El estndar puede ser el mismo frmaco a un nivel
correspondiente de impurezas, por ejemplo, a 0,5%, asumiendo respuestas idnticas de los picos. Cuando las impurezas de-
ben determinarse con una mayor certeza, usar un estndar de la misma impureza o aplicar un factor de correccin basado en
la respuesta de la impureza relativa a la del componente principal.

MTODO DE ESTNDAR EXTERNO

La concentracin del componente cuantificado se determina comparando las respuestas obtenidas a partir de la solucin
muestra con las respuestas obtenidas a partir de una solucin estndar.

MTODO DEL ESTNDAR INTERNO

Se introducen cantidades iguales del estndar interno en la solucin muestra y en una solucin estndar. El estndar interno
se selecciona de modo que no reaccione con el material de prueba, se resuelva de los componentes cuantificados (analitos), y
no contenga impurezas con el mismo tiempo de retencin que los analitos. Las concentraciones de los analitos se determinan
comparando los cocientes entre las reas de sus picos o las alturas de sus picos y el estndar interno en la solucin muestra,
con los cocientes entre las reas o alturas de sus picos y el estndar interno en la solucin estndar.

PROCEDIMIENTO DE NORMALIZACIN

El contenido porcentual de un componente del material de prueba se calcula determinando el rea del pico correspondiente
como un porcentaje del rea total de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a disolventes o reactivos o que surgen de la
fase mvil o de la matriz de la muestra y aquellos por debajo del lmite en el que pueden descartarse.

PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIN

Se determina la relacin entre la seal medida o evaluada y y la cantidad de la sustancia x (por ejemplo, concentracin, ma-
sa) y se calcula la funcin de calibracin. Los resultados analticos se calculan a partir de la seal del analito medida o evaluada
y su posicin en la curva de calibracin.
En las pruebas para impurezas tanto para el Mtodo del Estndar Externo, cuando se usa una dilucin de la solucin muestra
para comparacin, como para el Procedimiento de Normalizacin, se aplica cualquier factor de correccin indicado en la mono-
grafa (por ejemplo, cuando el factor de respuesta relativa est fuera del intervalo de 0,8-1,2).
Cuando la prueba de impurezas indica el total de impurezas o cuando existe una determinacin cuantitativa de una impure-
za, es importante seleccionar un ajuste de umbral apropiado y condiciones apropiadas para la integracin de las reas de los
picos. En tales pruebas, el lmite en el cual, o por debajo del cual se descarta un pico, es generalmente 0,05%. De esta forma,
el ajuste de umbral del sistema de recoleccin de datos corresponde al menos a la mitad de este lmite. Integrar el rea del
pico de cualquier impureza que no se separe por completo del pico principal, preferiblemente mediante extrapolacin valle a
valle de la lnea base (extrapolacin tangencial).

(631) COLOR Y ACROMATISMO

Definicin-A los efectos de este captulo, el color se puede definir como la percepcin o la respuesta subjetiva de un ob-
servador al estmulo objetivo de energa radiante en el espectro visible que se extiende en el intervalo de longitudes de onda
de 400 nm a 700 nm. El color percibido es una funcin de tres variables: las propiedades espectrales del objeto, tanto absor-
bentes como reflectantes; las propiedades espectrales de la fuente de iluminacin; y las caractersticas visuales del observador.
504 (631) Color y Acromatismo/ Pruebas Fsicas USP 39

Se dice que dos objetos poseen colores iguales para una fuente especfica de iluminacin cuando un observador no puede
detectar una diferencia de color. Cuando un par de objetos presenta colores iguales, con una fuente de iluminacin y no con
otra, constituyen un par metamrico. El color de dos objetos es igual para todas las fuentes de iluminacin si los espectros de
absorcin y de reflectancia de los dos objetos son idnticos.
El acromatismo o falta de color es un extremo de cualquier escala de color para la transmisin de luz. Esto implica la ausen-
cia completa de color y, en consecuencia, el espectro visible del objeto carece de absorbancias. A efectos prcticos, el observa-
dor en este caso percibe poca o ninguna absorcin en el espectro visible.
Atributos del Color-Como la sensacin de color tiene un componente subjetivo y otro objetivo, el color no puede descri-
birse exclusivamente en trminos espectrofotomtricos. Por lo tanto, los atributos comunes del color no pueden corresponder
uno a uno con la terminologa espectral.
Por lo general se utilizan tres atributos para identificar un color. (1) el matiz, o la cualidad segn la cual una familia de colo-
res se distingue de otra, como por ejemplo rojo, amarillo, azul, verde y trminos intermedios; (2) el valor, o la cualidad que
distingue un color claro de uno oscuro; y (3) la cromaticidad, o la cualidad que distingue un color fuerte de uno dbil, o el
grado en el cual un color difiere de un gris del mismo valor.
Los tres atributos del color se pueden utilizar para definir un espacio de color tridimensional, en el cual se ubica cualquier
color por sus coordenadas. El espacio de color elegido es visualmente uniforme si la distancia geomtrica entre dos colores en
el espacio de color es directamente una medida de la distancia del color entre ellos. A menudo se eligen coordenadas cilndri-
cas por conveniencia. Los puntos a lo largo del eje longitudinal representan valores del oscuro al claro o del negro al blanco y
poseen un matiz indeterminado y ninguna cromaticidad. Centrndose en una seccin transversal perpendicular al eje del va-
lor, el matiz se determina por el ngulo con respecto al eje longitudinal y la cromaticidad se determina por la distancia desde
el eje longitudinal. Los matices rojos, amarillos, verdes, azules, morados e intermedios estn dados por diferentes ngulos. Los
colores a lo largo de un radio de una seccin transversal tienen el mismo matiz, que se convierte en un matiz ms intenso a
medida que se aleja. Por ejemplo, el agua incolora o acromtica tiene un matiz intermedio, valor alto y ninguna cromaticidad.
Si se agrega un soluto de color, el agua adopta un matiz especfico. A medida que se agrega ms soluto, el color se torna ms
oscuro, ms intenso, o ms profundo; es decir, generalmente la cromaticidad aumenta y el valor disminuye. Sin embargo si el
soluto es de color neutro, es decir, gris, el valor disminuye, no se observa un aumento en la cromaticidad y el matiz permanece
indeterminado.
Las mediciones espectroscpicas de laboratorio pueden convertirse en mediciones de los tres atributos de color. Los resulta-
dos espectroscpicos para tres luces o estmulos elegidos se ponderan mediante tres funciones de distribucin para producir
los valores tricromticos, X, Y, Z (ver Color-Medicin Instrumenta/ (1061 )). Las funciones de distribucin se determinaron en
experimentos de comparacin de color con sujetos humanos.
Los valores tricromticos no son coordenadas en un espacio de color visualmente uniforme; sin embargo, se han propuesto
varias transformaciones que son cercanas a la uniformidad, una de las cuales se describe en el captulo citado (1061) Color-
Medicin Instrumental. El valor es a menudo una funcin solamente del valor de Y. La obtencin de uniformidad en el subespa-
cio de matiz y cromatismo ha sido menos satisfactoria. En un sentido prctico, esto significa que en una comparacin visual de
colores, cuando dos objetos difieren significativamente en matiz, resulta difcil decidir cul tiene mayor cromaticidad. Esto se-
ala la importancia de elegir un estndar de comparacin lo ms parecido posible al color de la muestra, especialmente para
los atributos de matiz y cromaticidad.
Determinacin de Color y Estndares-La percepcin del color y de la igualdad de colores depende de las condiciones de
observacin e iluminacin. Las determinaciones deben hacerse usando iluminacin difusa y uniforme bajo condiciones que re-
duzcan al mnimo las sombras y la reflectancia no espectral. La superficie de los polvos debe alisarse con presin suave para
que puedan presentar una superficie plana sin irregularidades. Los lquidos deben compararse en tubos para comparacin de
color iguales, contra un fondo blanco. Si se descubre que los resultados varan con la iluminacin, se considerarn correctos los
valores obtenidos con luz de da natural o artificial. En lugar de la determinacin visual debe emplearse un mtodo instrumen-
tal apropiado.
Los colores de los estndares deben ser lo ms parecidos posibles a los de las muestras de prueba para cuantificar las diferen-
cias de color. Los estndares para materiales opacos estn disponibles como conjuntos de muestras indicadoras de color que se
disponen en un espacio visualmente uniforme.* Estndares para comparaciones de color de lquidos, identificados mediante
una letra, se pueden preparar segn la tabla adjunta. Para preparar el lquido de comparacin requerido, pipetear y transferir
los volmenes prescritos de las soluciones de prueba calorimtricas [ver en Soluciones Colorimtricas (SC) en la seccin Reacti-
vos, Indicadores, y Soluciones] y agua en uno de los recipientes para comparacin y mezclar la solucin en el recipiente. Hacer
la comparacin segn se indica en la monografa individual, bajo las condiciones de observacin previamente descritas. Los
lquidos de comparacin u otras combinaciones de las soluciones calorimtricas pueden emplearse en concentraciones muy
bajas para medir desviaciones del acromatismo.

* Las colecciones de muestras de color, ordenadas segn matiz, valor y cromatismo en un espacio visualmente uniforme y apropiado para su uso en la designacin
de colores de muestras por comparacin visual estn disponibles en GretagMacbeth LLC, 617 Little Britain Road, New Windsor, NY 12553-6148.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (643) Carbono Orgnico Total 505

Lquidos de Comparacin
Partes de Partes de
Lquido de Compara- Partes de Cloruro Sulfato
cin Cloruro Cobaltoso SC Frrico SC Cprico SC Partes de Agua
A 0,1 0,4 0,1 4,4
B 0,3 0,9 0,3 3,5
e 0,1 0,6 0,1 4,2
D 0,3 0,6 0,4 3,7
E 0,4 1,2 0,3 3,1
F 0,3 1,2 0,0 3,5
G 0,5 1,2 0,2 3, 1
H 0,2 1,5 0,0 3,3
1 0,4 2,2 0,1 2,3
J 0,4 3,5 0,1 1,0
K 0,5 4,5 0,0 0,0
L 0,8 3,8 0,1 0,3
M 0,1 2,0 0,1 2,8
N 0,0 4,9 0,1 0,0
o 0,1 4,8 0,1 0,0
p 0,2 0,4 0,1 4,3
Q 0,2 0,3 0,1 4,4
R 0,3 0,4 0,2 4,1
s 0,2 0,1 0,0 4,7
T 0,5 0,5 0,4 3,6

(641) TOTALIDAD DE LA DISOLUCIN

Colocar la cantidad de la sustancia especificada en la monografa individual en una probeta de vidrio de 1O mL, de aproxi-
madamente 13 mm x 125 mm de tamao, con tapn de vidrio, meticulosamente limpia. Utilizando el disolvente especificado
en la monografa o en la etiqueta del producto, llenar la probeta casi hasta el estrechamiento del cuello. Agitar suavemente
para disolver: La solucin no es menos transparente que un volumen igual del mismo disolvente contenido en un recipiente
similar y examinado de modo similar.

(643) CARBONO ORGNICO TOTAL

El carbono orgnico total (COT) es una medida indirecta de las molculas orgnicas presentes en las aguas para uso farma-
cutico, determinadas como carbono. Las molculas orgnicas se introducen en el agua junto con el agua original, desde los
materiales del sistema de purificacin y distribucin, desde biopelculas que se desarrollan en el sistema y desde los envases de
agua estril y de agua no estril. El COT tambin puede emplearse como un atributo de control del proceso, para monitorear
el funcionamiento de las operaciones unitarias que conforman el sistema de purificacin y distribucin. Una medicin de COT
no es un reemplazo de la prueba de control microbiolgico o de endotoxinas. Aunque puede haber una relacin cualitativa
entre el COT y la actividad microbiolgica, no existe una correlacin numrica directa.
Existen varios mtodos aceptables para analizar el COT. Este captulo no respalda, limita ni impide el empleo de tecnologas
alternativas, sino que ofrece una orientacin para calificar estas tecnologas analticas para su uso, as como tambin una gua
para interpretar los resultados de los instrumentos para emplearlos como una prueba de lmite.
Los aparatos que se usan comnmente para determinar el COT en aguas para uso farmacutico comparten el objetivo de
oxidar las molculas orgnicas del agua para producir dixido de carbono, seguido de la medicin de la cantidad de dixido
de carbono producido. Posteriormente, la cantidad determinada de C0 2 producido se usa para calcular la concentracin de
carbono orgnico en el agua.
Todas las tecnologas deben distinguir entre el carbono inorgnico, que puede estar presente en el agua proveniente de
fuentes como C0 2 y bicarbonato disueltos, y el C0 2 generado por la oxidacin de molculas orgnicas en la muestra. La distin-
cin se puede lograr determinando el carbono inorgnico y restndolo del carbono total (que es la suma de carbono orgnico
506 (643) Carbono Orgnico Total / Pruebas Fsicas USP 39

y carbono inorgnico), o eliminando el carbono inorgnico de la muestra antes de oxidarla. Aunque el paso de eliminacin
tambin puede eliminar molculas orgnicas, este carbono orgnico eliminable se encuentra presente en cantidades inaprecia-
bles en las aguas para uso farmacutico.

AGUA A GRANEL

Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Purificada, Agua para Inyeccin, Agua para Hemodilisis y el con-
densado de Vapor Puro a granel.
Requisitos del Aparato: Este mtodo de prueba se lleva a cabo como una prueba en lnea (on-line test) o como una
prueba de laboratorio fuera de la lnea de produccin (off-line test), empleando un instrumento calibrado. La aptitud del apa-
rato debe demostrarse peridicamente, segn se describe a continuacin. Adems, debe tener especificado un lmite de detec-
cin, establecido por el fabricante, de 0,05 mg/L (0,05 ppm) de carbono o menor.
Cuando se analiza agua para propsitos de control de calidad, se debe asegurar que el instrumento y sus datos estn bajo
un control apropiado y que los mtodos y lugares de muestreo tanto de las mediciones en lnea como de las mediciones fuera
de lnea sean representativos de la calidad del agua usada. Se debe tomar en cuenta el carcter de la produccin, distribucin
y uso del agua al momento de seleccionar una medicin en lnea o fuera de lnea.
Estndares de Referencia USP (11 ): ER 1,4-Benzoquinona USP. ER Sacarosa USP.
Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no ms de O, 1O mg/L. [NOTA-Puede ser necesario establecer un
requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del mtodo.]
Preparacin de Envases: La contaminacin orgnica de los envases da lugar a valores de COT ms altos. Por lo tanto, se
deben usar materiales de laboratorio y envases que hayan sido meticulosamente limpiados para eliminar los residuos orgni-
cos. Se puede emplear cualquier mtodo eficaz para eliminar la materia orgnica (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )).
Utilizar Agua Reactivo para el enjuague final.
Solucin Estndar: A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solucin con una concentracin de 1, 19 mg/L de saca-
rosa (0,50 mg/L de carbono).
Solucin de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad pesada con exactitud de ER 1,4-Benzoquinona
USP para obtener una solucin con una concentracin de 0,75 mg/L (0,50 mg/L de carbono).
Control de Agua Reactivo: Usar una cantidad adecuada de Agua Reactivo obtenida al mismo tiempo que la utilizada en la
preparacin de la Solucin Estndar y de la Solucin de Aptitud del Sistema.
Muestra de Agua: Obtener una muestra en lnea o fuera de lnea que refleje de manera apta la calidad del agua usada.
Otras Soluciones de Control: Preparar soluciones apropiadas de blanco de reactivos u otras soluciones especificadas ne-
cesarias para establecer la lnea de base del aparato o para realizar ajustes en la calibracin siguiendo las instrucciones del fabri-
cante, y correr los blancos apropiados para ajustar a cero el instrumento, si fuera necesario.
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utili-
zando la Solucin Estndar y registrar la respuesta, r5 Calcular la respuesta corregida de la Solucin Estndar, que es tambin la
respuesta lmite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin Estndar. El lmite terico de
0,50 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solucin Estndar, r5 - rw. Analizar la Solucin de Aptitud del Siste-
ma en el aparato y registrar la respuesta, r55 Calcular la respuesta corregida de la Solucin de Aptitud del Sistema, restando la
respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin de Aptitud del Sistema, r55 - rw. Calcular la eficiencia de la
respuesta porcentual de la Solucin de Aptitud del Sistema:
eficiencia de la respuesta%= 1OO[(r55 - rw)f(r5 - rw)]
en donde r55 es la respuesta del instrumento para la Solucin de Aptitud del Sistema; rw es la respuesta del instrumento para el
Control de Agua Reactivo y r5 es la respuesta del instrumento para la Solucin Estndar. El sistema es apto si la eficiencia de la
respuesta porcentual no es menos de 85% ni ms de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, ru. La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si runo es mayor que la respuesta lmite, r5 - rw. Este mtodo se puede realizar usando instrumental en lnea o
fuera de lnea que cumpla con los Requisitos del Aparato.

AGUA ESTRIL

Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Estril para Inyeccin, Agua Estril Purificada, Agua Estril para Irri-
gacin y Agua Estril para Inhalacin.
Seguir los requisitos en Agua a Granel, con las siguientes excepciones.
Requisitos del Aparato: Adems de cumplir con los Requisitos del Aparato en Agua a Granel, el aparato debe tener un
lmite de deteccin especificado por el fabricante de O, 1 O mg/L (O, 1O ppm) de carbono o menor.
Control de Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no ms de 0,50 mg/L. [NOTA-Puede ser necesario
establecer un requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del mtodo.]
USP 39 Pruebas Fsicas/ (645) Conductividad del Agua 507

Solucin Estndar: A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solucin con una concentracin de 19,0 mg/L de saca-
rosa (8,0 mg/L de carbono).
Solucin de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad, pesada con exactitud, de ER 1,4-Benzoquino-
na USP para obtener una solucin con una concentracin de 12,0 mg/L (8,0 mg/L de carbono).
Muestra de Agua: Obtener una muestra que refleje de manera apta la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigo-
rosamente el envase para homogeneizar la muestra de agua. Puede que se requieran varios envases para contar con suficiente
agua para analizar.
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utili-
zando la Solucin Estndar y registrar la respuesta, r5 Calcular la respuesta corregida de la Solucin Estndar, que es tambin la
respuesta lmite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin Estndar. El lmite terico de
8,0 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solucin Estndar, r5 - rw. Analizar la Solucin de Aptitud del Sistema
en el aparato y registrar la respuesta, r55 Calcular la respuesta corregida de la Solucin de Aptitud del Sistema, restando la res-
puesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin de Aptitud del Sistema, r55 - rw. Calcular la eficiencia de la
respuesta porcentual de la Solucin de Aptitud del Sistema:

eficiencia de la respuesta%= 1OO[(r55 - rw)l(r5 - rw)]

en donde r55 es la respuesta del instrumento para la Solucin de Aptitud del Sistema; rw es la respuesta del instrumento para el
Control de Agua Reactivo; y r5 es la respuesta del instrumento para la Solucin Estndar. El sistema es apto si la eficiencia de la
respuesta porcentual es no menos de 85% ni ms de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, ru. La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si runo es mayor que la respuesta lmite, r5 - rw, determinada en los requisitos de Aptitud del Sistema, en Agua
Estril

(645) CONDUCTIVIDAD DEL AGUA

INTRODUCCIN
La conductividad elctrica del agua es una medida del flujo de electrones facilitado con iones. Las molculas de agua se diso-
cian en iones en funcin del pH y la temperatura, producindose una conductividad fcil de predecir. Algunos gases, especial-
mente el dixido de carbono, se disuelven fcilmente en el agua e interactan para formar iones, lo que tambin afecta la
conductividad en forma predecible. Para los fines de este captulo, estos iones y la conductividad resultante se pueden conside-
rar como intrnsecos al agua.
La presencia de iones extraos tambin afecta la conductividad del agua. Los iones extraos usados para determinar las es-
pecificaciones de conductividad que se describen a continuacin son los iones cloruro y amonio. En cuanto al nivel de impure-
zas inicas permitidas en el agua, la mayor proporcin corresponde a la conductividad del in cloruro ubicuo (en una concen-
tracin terica final de 0,47 ppm cuando el cloruro constitua una prueba de calidad requerida en la USP 22 y en versiones
anteriores) y al in amonio (con un lmite de 0,3 ppm). Para mantener la electroneutralidad el nivel de impurezas permitido
incluye una cantidad balanceada de aniones (tales como cloruro, para contrarrestar el in amonio) y cationes (tales como so-
dio, para contrarrestar el in cloruro). Los iones extraos como los mencionados, pueden tener un efecto significativo en la
pureza qumica del agua y en la aptitud para su uso en aplicaciones farmacuticas.
El procedimiento en la seccin Agua a Granel est especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purifica-
da, el Agua para Inyeccin, el Agua para Hemodilisis y el condensado de Vapor Puro. El procedimiento en la seccin Agua Estril
est especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purificada Estril, Agua Estril para Inyeccin, Agua Estril
para Inhalacin y Agua Estril para Irrigacin.
Los procedimientos siguientes se deben realizar usando instrumental que haya sido calibrado, cuyas constantes de celda del
sensor de conductividad hayan sido determinadas con exactitud y cuya funcin de compensacin de temperatura haya sido
desactivada para la Etapa 1 del anlisis de Agua a Granel. Para las mediciones en lnea y fuera de lnea, la aptitud del instrumen-
to para las pruebas de control de calidad depende tambin de los sitios de muestreo en el sistema del agua. Los sitios seleccio-
nados para el instrumento de muestreo deben reflejar la calidad del agua empleada.

ESPECIFICACIONES DEL INSTRUMENTO V PARMETROS DE FUNCIONAMIENTO

La conductividad del agua debe medirse con exactitud usando instrumentos calibrados. Una medicin de la conductividad
elctrica consiste en la determinacin de la conductancia, G (o su inversa, la resistencia, R), del fluido entre y alrededor de los
electrodos. La conductancia (1 / R) se ve directamente afectada por las propiedades geomtricas de los electrodos; es decir, la
conductancia es inversamente proporcional a la distancia (d) entre los electrodos y proporcional al rea (A) de los mismos. Esta
508 (645) Conductividad del Agua / Pruebas Fsicas USP 39

relacin geomtrica (d/A) se conoce como constante de celda, 0. Por consiguiente, la conductancia medida se normaliza para
la constante de celda a fin de determinar la conductividad, K, de acuerdo con la siguiente ecuacin:
conductividad, K (S/cm) =e (cm-1)/R (n)
Si fuera necesario, se deben ajustar y verificar la constante de celda y la medida de resistencia.
Constante de celda: La constante de celda debe conocerse con una aproximacin de 2%. La constante de celda puede ser
verificada directamente, usando una solucin de conductividad conocida o rastreable, o indirectamente, comparando la lectu-
ra del instrumento obtenida con el sensor de conductividad en cuestin con las lecturas obtenidas con un sensor de conducti-
vidad con constante de celda conocida o rastreable. Si fuera necesario, ajustar la constante de celda siguiendo el protocolo del
instrumento provisto por el fabricante del mismo. La frecuencia de la verificacin/calibracin se determina en funcin del dise-
o del sensor.
Medicin de resistencia: La calibracin (o verificacin) de la medicin de resistencia se logra reemplazando los electrodos
del sensor de conductividad con resistores de precisin que tengan estndares rastreables al NIST o a autoridades nacionales
equivalentes en otros pases (con una exactitud que no se aleje en ms de 0, 1% del valor declarado) para obtener una res-
puesta de conductividad prevista del instrumento. La exactitud de la medicin de resistencia es aceptable si la conductividad
medida con el resistor rastreable se encuentra dentro de 0, 1 S/cm del valor calculado, de acuerdo con la ecuacin anterior.
Por ejemplo, el resistor rastreable es 50 kn y la constante de celda, e, es 0, 1 O cm-1. El valor calculado es 2,0 x 10-6 S/cm 2,0
S/cm. El valor medido debe ser 2,0 O, 1 S/cm. El instrumento debe tener una resolucin mnima de O, 1 S/cm en el inter-
valo ms bajo.
Los valores de conductividad deseados deben basarse en el tipo de agua que se va a analizar y deben ser iguales o menores
que el lmite de conductividad del agua para dicho tipo de agua. Se pueden incluir mltiples circuitos de medicin en el medi-
dor o el sensor y cada circuito puede requerir de verificacin o calibracin independiente antes del uso. La frecuencia de la
recalibracin se determina en funcin del diseo del instrumento.
Verificacin del sistema: La constante de celda del sensor del usuario se puede determinar con el sistema de medicin de
resistencia del usuario, o la constante de celda se puede determinar con un sistema de medicin de resistencia independiente.
Si la constante de celda se determina con un sistema de medicin de resistencia independiente, se recomienda que el usuario
verifique que el sensor ha sido apropiadamente conectado al sistema de medicin de resistencia para asegurar un funciona-
miento adecuado. La verificacin puede hacerse comparando los valores de conductividad (o resistividad) presentados en la
pantalla del equipo de medicin, con los de un dispositivo externo calibrado medidor de conductividad. Los dos valores de
conductividad (o resistividad) no compensados por temperatura deben ser equivalentes entre s o tener una aproximacin de
5%, o bien deben tener una diferencia que sea aceptable con respecto a la criticidad del agua producida y/o a los intervalos
de conductividad del agua en los que se realizaron las mediciones. Los dos sensores de conductividad se deben posicionar lo
suficientemente juntos para medir la misma muestra de agua a la misma temperatura y calidad del agua.
Compensacin de temperatura y mediciones de temperatura: Debido a que la temperatura tiene un efecto sustancial so-
bre las lecturas de conductividad de las muestras a temperaturas altas y bajas, muchos instrumentos corrigen automticamente
la lectura real para mostrar el valor que tericamente se observara a la temperatura nominal de 25. Normalmente, la correc-
cin se efecta mediante un sensor de temperatura incluido junto con el sensor de conductividad y un algoritmo informtico
incluido en el instrumento. Este algoritmo de compensacin de temperatura puede no ser exacto para los distintos tipos de
agua e impurezas. Por esta razn, los valores de conductividad usados en la prueba de la Etapa 1 para Agua a Granel son medi-
ciones no compensadas por temperatura. Otras pruebas de conductividad que se especifican para la medicin a 25 pueden
usar mediciones compensadas por temperatura o mediciones no compensadas por temperatura.
Se requiere una medicin de temperatura para la prueba de la Etapa 1 o para las otras pruebas a 25. sta puede realizarse
usando el sensor de temperatura incluido en el sensor de la celda de conductividad. Tambin es aceptable un sensor de tem-
peratura externo colocado cerca del sensor de conductividad. La exactitud de las mediciones de temperatura debe ser de 2.

AGUA A GRANEL

El procedimiento y los lmites de prueba en esta seccin estn destinados para Agua Purificada, Agua para Inyeccin, Agua
para Hemodilisis, el condensado de Vapor Puro y cualquier otra monografa que especifique esta seccin.
Se trata de un mtodo de prueba de tres etapas para realizar el anlisis en lnea o fuera de lnea. La prueba de conductividad
en lnea proporciona mediciones en tiempo real y oportunidades para controlar, tomar decisiones e intervenir en el proceso en
tiempo real. Se deben tomar las precauciones necesarias en la recoleccin de muestras de agua para las mediciones de con-
ductividad fuera de lnea. El mtodo de muestreo, el envase de muestreo y los factores ambientales, tales como la concentra-
cin ambiental de dixido de carbono y los vapores orgnicos pueden afectar la muestra. El procedimiento se puede iniciar en
la Etapa 2 si se prefiere el anlisis fuera de lnea.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (645) Conductividad del Agua 509

Procedimiento

ETAPA 1

La Etapa 7 est destinada para la medicin en lnea o puede realizarse fuera de lnea en un recipiente apropiado.
1 . Determinar la temperatura y la conductividad del agua usando una lectura de conductividad que no haya sido compensa-
da por temperatura.
2. Mediante la Tabla 7, determinar el valor de temperatura que no sea mayor que la temperatura medida, es decir, la tem-
peratura inmediatamente inferior. El valor de conductividad correspondiente en esta tabla es el lmite. [NOTA-No interpolar.]
3. Si la conductividad medida no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en la etapa 2, el agua cumple
con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad es mayor que el valor especificado en la tabla, pasar a la
Etapa 2.
Tabla 1. Etapa 1-Requisitos de Temperatura y Conductividad
(slo para mediciones de conductividad no compensadas por temperatura)
Temperatura Requisito de Conductividad (S/cm)
o 0,6
5 0,8
10 0,9
15 1,0
20 1,1
25 1,3
30 1,4
35 1,5
40 1,7
45 1,8
50 1,9
55 2,1
60 2,2
65 2,4
70 2,5
75 2,7
80 2,7
85 2,7
90 2,7
95 2,9
100 3, 1

ETAPA 2

4. Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatu-
ra, si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 1 , comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se
observa la conductividad de manera peridica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorcin de
dixido de carbono atmosfrico) es menos de O, 1 S/cm por 5 minutos, registrar la conductividad. [NOTA-Las mediciones de
conductividad en esta etapa pueden ser compensadas por temperatura a 25 o no compensadas por temperatura.]
5. Si la conductividad no es mayor de 2, 1 S/cm, el agua cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la
conductividad es mayor de 2, 1 S/cm, pasar a la Etapa 3.

ETAPA 3

6. Efectuar esta prueba dentro de los 5 minutos aproximadamente de haber efectuado la determinacin de conductividad
en el paso 5, manteniendo la temperatura de la muestra a 25 1 . Agregar una solucin saturada de cloruro de potasio a la
misma muestra de agua (0,3 ml por cada 100 ml de la muestra de prueba) y determinar el pH con una aproximacin de O, 1
unidades de pH segn se indica en pH (791 ).
7. Empleando la Tabla 2, determinar el lmite de conductividad en el valor de pH medido. Si la conductividad medida en el
paso 4 no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en el paso 6, el agua cumple con los requisitos de la
prueba de conductividad. Si la conductividad medida es mayor que este valor o si el pH est fuera del intervalo de 5,0-7,0, el
agua no cumple con los requisitos de la prueba de conductividad.
51 O (645) Conductividad del Agua/ Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 2. Etapa 3-Requisitos de pH y Conductividad

(slo para muestras equilibradas con la temperatura y la atmsfera)
pH Requisito de Conductividad (S/cm)
5,0 4,7
5, 1 4,1
5,2 3,6
5,3 3,3
5,4 3,0
5,5 2,8
5,6 2,6
5,7 2,5
5,8 2,4
5,9 2,4
6,0 2,4
6, 1 2,4
6,2 2,5
6,3 2,4
6,4 2,3
6,5 2,2
6,6 2, 1
6,7 2,6
6,8 3, 1
6,9 3,8
7,0 4,6

AGUA ESTRIL

El procedimiento y los lmites de prueba estn destinados para Agua Purificada Estril, Agua Estril para Inyeccin, Agua Estril
para Inhalacin y Agua Estril para Irrigacin y cualquier otra monografa que especifique esta seccin. Las aguas estriles proce-
den de Agua Purificada o Agua para Inyeccin y por lo tanto se ha determinado que cumplen con los requisitos para Agua a
Granel antes de ser envasadas. La especificacin proporcionada representa el valor mximo de conductividad permitido, to-
mando en cuenta la limitacin del mtodo de medicin y una razonable lixiviacin (leaching) del envase. La eleccin de la
especificacin y del volumen de muestreo se debe definir y validar de acuerdo con el propsito previsto del agua.

Procedimiento

Obtener una muestra que refleje de manera adecuada la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigorosamente el
envase para homogeneizar la muestra de agua. Se pueden requerir varios envases para recolectar suficiente agua para el anli-
sis.
Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatura,
si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 1, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se obser-
va la conductividad de manera peridica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorcin de dixido
de carbono atmosfrico) es menos de O, 1 S/cm por 5 minutos, registrar la conductividad.
Para envases con un volumen nominal de 1O mL o menos, si la conductividad no es mayor que 25 S/cm, el agua cumple
con los requisitos. En envases con un volumen nominal mayor que 1O mL, si la conductividad no es mayor que 5 S/cm, el
agua cumple con los requisitos.

(651) TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIN

La temperatura a la cual una sustancia pasa del estado lquido al slido cuando se enfra es un ndice til de su pureza si se
libera calor al producirse la solidificacin, siempre que toda impureza presente se disuelva slo en el lquido y no en el slido.
Las sustancias puras tienen un punto de congelacin bien definido, pero generalmente las mezclas se congelan a diferentes
temperaturas. Para muchas mezclas, la temperatura de solidificacin, determinada siguiendo estrictamente los siguientes m-
todos empricos, es un ndice til de su pureza. El mtodo para determinar las temperaturas de solidificacin que se describe
en este documento se aplica a sustancias que funden entre -20 y 150, que es el intervalo del termmetro usado en el bao.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (651) Temperatura de Solidificacin 511

La temperatura de solidificacin es el punto mximo (o en caso de no existir un mximo, el punto de inflexin) en la curva de
temperatura-tiempo.

Cambio en la redaccin:

APARATO

Ensamblar un aparato similar al ilustrado,

--- ----T
Nivel de llenado

5cm

-- -'~~ j
15cm

_______ _j _____ _

-3.75cm 1,25cm 3,75 cm

3,75 cm

Aparato de Temperatura de Solidificacin

donde el recipiente para la sustancia es un tubo de ensayo de 25 x 100 mm en el que se coloca un termmetro adecuado de
intervalo corto, suspendido en el centro y un mezclador de alambre, aproximadamente de 30 cm de largo, que se dobla en su
extremo inferior en un anillo horizontal que rodea el termmetro. Emplear un termmetro con un intervalo que no exceda de
30, graduado en divisiones de O, 1y calibrado para una inmersin a 76 mm pero no usado a esa profundidad. La serie ASTM
El 89C a 96C es una serie disponible y adecuada de termmetros, que abarcan un intervalo desde -20 hasta+ 150. Se pue-
den usar otros aparatos para medir temperaturas siempre y cuando estn validados para este procedimiento (ver Advertencias
y Requstos Generales, 6.80.30, Dispostivos de Medicin e Temperatura (AFoi-may-2016,). Las dimensiones deben estar comprendi-
das entre 20% con respecto a las que se muestran en la figura.
El recipiente para la muestra se encuentra sostenido, mediante un corcho, dentro de un cilindro adecuado, impermeable al
agua, con un dimetro interno de aproximadamente 50 mm y 11 cm de longitud. A su vez, el cilindro se apoya en un bao
con una altura suficiente como para proporcionar una capa de no menos de 37 mm alrededor de los lados y del fondo del
cilindro. El bao externo tiene un termmetro apropiado.

PROCEDIMIENTO

Fundir la sustancia, si es un slido, a una temperatura que no exceda de 20 por encima del punto de solidificacin esperado
y verterla en el tubo de ensayo hasta una altura de 50 mm a 57 mm. Armar el aparato con el bulbo del termmetro del tubo
512 (651) Temperatura de Solidificacin/ Pruebas Fsicas USP 39

de ensayo inmerso en un punto medio entre la parte superior e inferior de la muestra en el tubo de ensayo. Llenar el bao
hasta aproximadamente 12 mm desde la parte superior del tubo con un lquido apropiado a una temperatura de 4 a 5 por
debajo del punto de solidificacin esperado.
En caso de que la sustancia sea un lquido a temperatura ambiente, llevar a cabo la determinacin empleando un bao a
una temperatura de aproximadamente 15 por debajo del punto de solidificacin esperado.
Cuando la muestra de prueba est enfriada aproximadamente a 5 por encima del punto de solidificacin esperado, ajustar
el bao a una temperatura de 7 a 8 por debajo del punto de congelacin esperado. Revolver continuamente la muestra has-
ta terminar la prueba moviendo el agitador de alambre hacia arriba y hacia abajo entre la parte superior e inferior de la mues-
tra, a una velocidad constante de 20 ciclos completos por minuto.
Frecuentemente, la congelacin puede inducirse frotando las paredes internas del tubo de ensayo con el termmetro, o in-
troduciendo un fragmento pequeo de la sustancia previamente solidificada. Un sobreenfriarniento pronunciado puede causar
una desviacin respecto del patrn normal de cambios de temperatura. Si esto ltimo ocurre, repetir la prueba, introduciendo
partculas pequeas del material en anlisis en forma slida a intervalos de 1 a medida que la temperatura se acerca al punto
de solidificacin esperado.
Registrar la lectura del termmetro del tubo de ensayo cada 30 segundos. Continuar revolviendo slo mientras baje gradual-
mente la temperatura; dejar de revolver cuando la temperatura se vuelva constante o comience a subir levemente. Continuar
registrando la temperatura en el tubo de ensayo cada 30 segundos, al menos durante 3 minutos, despus de que la tempera-
tura comience a caer nuevamente despus de haber permanecido constante.
El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas comprendidas dentro de un intervalo de 0,2 constituye la tempe-
ratura de solidificacin. Estas lecturas se encuentran cerca de un punto de inflexin o un mximo, en la curva de ternperatura-
tiernpo, que se produce despus de que la temperatura se vuelva constante o comience a subir y antes de que empiece a bajar
nuevamente. El promedio de las lecturas con una aproximacin de O, 1 constituye la temperatura de solidificacin.

(659) REQUISITOS DE ENVASADO Y ALMACENAMIENTO

(Este captulo ser oficial el 1 de mayo de 2016)

ENVASADONT

Los envases no deben interactuar fsica o qumicamente con los artculos oficiales de modo que se ocasione el incumplimien-
to de sus requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza.
En este captulo se proporcionan opciones de los distintos tipos de envase. Para medicamentos e ingredientes farmacuticos
activos, las opciones de envases son impermeable, bien cerrado, o si fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes,
dado que generalmente se manejan en grandes volmenes (cuyos envases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el
envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado. Para artculos que no sean frmacos ni medicamentos, para los que
no se proporcionan instrucciones o limitaciones especficas, los artculos deben protegerse de la humedad, la congelacin y el
calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribucin.
Los requisitos farrnacopeicos para el uso de envases especificados tambin se aplican a artculos envasados por el farmacuti-
co u otro dispensador, a menos que la monografa individual indique algo diferente.

DEFINICIONES GENERALES

Sistema de envasado (tambin referido corno sistema de envase-cierre): Se refiere al conjunto de los componentes de los
envases que contienen y protegen el artculo, e incluye los componentes de los envases primarios y los componentes de los
envases secundarios, si stos ltimos se utilizaran para ofrecer proteccin adicional.
Envases: Receptculo que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacutico activo, excipiente o forma farma-
cutica, y que est o puede estar en contacto directo con el artculo. El envase inmediato o primario es aqul que est en con-
tacto directo con el artculo constantemente. El cierre es una parte del envase. El envase debe estar limpio antes de llenarse.
Puede ser necesario tomar precauciones y emplear procedimientos de limpieza especiales para asegurar que cada envase est
limpio y que no se introduzca materia extraa en el artculo o sobre el mismo.
Componentes del envase: Cualquier parte del envase o del sistema de envase-cierre, incluyendo el envase primario (p.ej.,
ampollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); el recubrimiento interno del envase primario (p.ej., recubrimiento interno en
cartucho tubular); el cierre (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos
internos; puertos de administracin; envolturas; accesorios de administracin; y etiquetas.

NT ES IMPORTANTE DESTACAR QUE LAS OPERACIONES REFERIDAS AL "ENVASADO" INCLUYEN EL ENVASADO PRIMARIO PROPIAMENTE DICHO, AS COMO LAS
OPERACIONES DE EMPACADO (ENVASADO SECUNDARIO) Y EMBALAJE (ENVASADO TERCIARIO PARA EL TRANSPORTE).
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 513

Componentes de los envases primarios: Componentes de los envases que estn en contacto directo o que pueden entrar
en contacto directo con el artculo.
Componentes de los envases secundarios (empaque): Componentes de los empaques que no estn y que no entrarn en
contacto directo con el artculo.
Envase terciario (embalaje): Componentes de los envases que no estn en contacto directo con el artculo pero que facili-
tan su manipulacin y transporte para evitar daos derivados de la manipulacin fsica y de las condiciones de almacenamien-
to a las que se somete el artculo.
Materiales de construccin: Se refiere a los materiales (p.ej., vidrio, plstico, elastrneros, metal) usados para fabricar com-
ponentes de los envases (envases primarios, empaques y embalajes).
Envases multidosis (o de dosis mltiple): Sistemas de envasado que permiten retirar porciones sucesivas de un artculo para
administracin parenteral sin alterar la seguridad, el contenido, la calidad o la pureza de la porcin remanente. Ver Envases
Multidosis en Contenido en Envases para Inyectables (697).
Envases de unidades mltiples: Sistemas de envasado que permiten retirar porciones sucesivas de un artculo sin alterar la
seguridad, la concentracin o potencia, la calidad o la pureza de la porcin remanente.
Envases unitarios: Sistemas de envasado que contienen una cantidad de un artculo destinado para administracin como
dosis nica o corno un dispositivo terminado individual destinado para ser utilizado inmediatamente luego de la apertura del
envase. Preferiblemente, el envase primario o el secundario, o el empaque protector utilizado debe estar diseado de forma tal
que se evidencie cualquier alteracin en el contenido.
Envases monodosis: Envases monodosis son envases de medicacin estril para administracin parenteral (inyeccin o infu-
sin) que no estn sujetos a cumplir con los requisitos de los criterios de eficacia antirnicrobiana. [NOTA-nicamente para esta
definicin, el envase es sinnimo de sistema de envase y sistema de envase-cierre.] Un envase monodosis est diseado para
su uso en un paciente individual como una inyeccin/infusin individual. 1 Un envase monodosis se etiqueta como tal y debe
incluir instrucciones de desecho apropiadas en la etiqueta, si hubiera espacio disponible. Los viales, ampollas y jeringas prelle-
nadas son ejemplos de envases rnonodosis.
Envases de dosis nica: Sistemas de envasado unitarios para un artculo destinado a su administracin como dosis nica por
una va que no sea la parenteral.
Envases de unidad de uso: Sistemas de envasado que contienen una cantidad especfica de un artculo que est destinado a
dispensarse como tal, sin ninguna modificacin posterior, excepto la adicin de un etiquetado adecuado. El envase de unidad
de uso no se puede reenvasar para su venta.
Envases a granel para farmacias: Sistemas de envase de una preparacin estril para uso parenteral que contienen muchas
monodosis. El contenido est destinado para su uso en programas de preparacin de mezclas en farmacias y est restringido a
la preparacin de mezclas para infusin o al llenado de jeringas estriles vacas con un dispositivo de transferencia estril.
El cierre debe ser penetrado slo una vez despus de la reconstitucin, si fuera necesario, usando un dispositivo de transfe-
rencia estril adecuado o equipo dispensador que permita la dosificacin medida del contenido. El Envase a granel para farma-
cias slo se emplear en un rea de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar (o un rea equivalente de
aire limpio para preparacin magistral).
La nomenclatura Envase a granel para farmacias se limita a las formas farmacuticas denominadas Inyeccin, para Inyeccin
o Emulsin Inyectable, segn se establece en el captulo Nomenclatura (1121 ), Estructuras Generales de Nomenclatura.
El envase a granel para farmacias, aunque contenga ms de una monodosis, est exento del lmite de volumen de 30 mL
para envases multidosis y del requisito de contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento
de microorganismos. Para requisitos de etiquetado, ver el captulo Etiquetado (7).
Inyecciones de pequeo volumen: Una inyeccin que se envasa en envases que declaran contener 100 mL o menos.
Inyecciones de gran volumen: Una inyeccin destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que declaran con-
tener ms de 100 ml.
Envases seguros para nios: Sistemas de envase diseados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Pro-
duct Safety Commission (Comisin de Seguridad del Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de nios
(16 CFR 1700.20).
Envases adecuados para la tercera edad: Sistemas de envase diseados o construidos para cumplir con las normas de la
Consurner Product Safety Commission (Comisin de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases
por parte de personas de edad avanzada (16 CFR 1700.20).
Envases que evidencian su alteracin intencional: Sistemas de envase que no pueden ser abiertos sin la destruccin evi-
dente del sello o de alguna parte del sistema de envase. El envase que evidencia su alteracin intencional debe usarse para un
artculo estril destinado para uso oftlmico u tico, excepto cuando se trata de una preparacin magistral extempornea para
su dispensacin inmediata segn receta mdica. Los artculos destinados a la venta sin prescripcin mdica tambin deben
cumplir, cuando corresponda, con los requisitos de la FDA relativos al etiquetado y envasado que evidencie la alteracin inten-
cional. El envase primario y/o el empaque o envase secundario, o el embalaje protector utilizado por fabricantes o distribuido-
res para todas las formas farmacuticas, salvo excepciones especficas, se disea, preferentemente para evidenciar cualquier
alteracin en el contenido.

1 Pueden aceptarse excepciones, slo en las condiciones descritas en el captulo Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles (797).
514 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Fsicas USP 39

Envases hermticos: Sistemas de envase que impiden la penetracin del aire o cualquier otro gas en las condiciones usuales
o habituales de manejo, transporte, almacenamiento o distribucin.
Envases impermeables: Sistemas de envase que protegen el contenido de la contaminacin por lquidos, slidos o vapores
extraos; de la prdida del artculo; y de eflorescencia, delicuescencia o evaporacin en condiciones habituales o usuales de
manejo, transporte, almacenamiento y distribucin, pudindose volver a cerrar de forma impermeable una vez abierto. Cuan-
do se especifique un envase impermeable, ste puede sustituirse con un envase hermtico para una sola dosis de un artculo.
[NOTA-Cuando en una monografa individual se especifique el envasado y almacenamiento en un envase impermeable o bien
cerrado, el envase usado para dispensar el artculo prescrito cumple con los requisitos en el captulo Envases-Pruebas de De-
sempeo (671 ).]
Envases bien cerrados: Sistemas de envase que protegen el contenido de la contaminacin por slidos extraos y de la pr-
dida del artculo en condiciones habituales o usuales de manejo, transporte, almacenamiento y distribucin. Ver Envases-Prue-
bas de Desempeo (671 ).
Envases resistentes a la luz: Sistemas de envase que protegen el contenido de los efectos de la luz por medio de las propie-
dades especficas del material que los compone, incluyendo los recubrimientos aplicados sobre los mismos. Un envase transpa-
rent e incoloro o translcido puede ser convertido en un envase resistente a la luz mediante una cubierta exterior opaca o
mediante el uso de un envase secundario, en cuyo caso la etiqueta del envase debe indicar que es imprescindible el uso de la
cubierta opaca o que se requiere el envase secundario hasta que el artculo se haya usado o administrado. Cuando en una
monografa individual se indique "proteger de la luz", se entiende que el artculo se debe conservar en un envase resisitente a
la luz. Ver el captulo Envases-Pruebas de Desempeo (671 ), Prueba de Transmisin de Luz.
Sistema de cierre negro o bandas negras: El uso de un sistema de cierre negro en un vial (es decir, una tapa de sobresello
negra y un casquillo negro para sostener el cierre elastomrico) o el uso de una banda o serie de bandas negras sobre el estre-
chamiento del cuello de una ampolla se reserva slo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin y est prohibido
su uso en cualquier otra inyeccin. Ver el captulo Etiquetado (7).

ENVASADO DE INYECTABLES

La validacin de la integridad del envase-cierre debe demostrar la ausencia de la introduccin de contaminacin microbiana
y de impurezas fsicas o qumicas. Adems, se deben mantener las cantidades o concentraciones totales y relativas especifica-
das de solutos y vehculos frente a la exposicin a las condiciones extremas previstas en la fabricacin y procesamiento, alma-
cenamiento, transporte y distribucin. Los cierres para envases multidosis deben permitir la extraccin del contenido sin retirar
o destruir el cierre. El cierre debe permitir la penetracin de una aguja y el cierre inmediato tras retirarla, protegiendo el envase
de la contaminacin. La validacin de la integridad del envase-cierre del envase multidosis debe incluir una verificacin de que
un envase de ese tipo impide la contaminacin microbiana o la prdida del contenido del producto en las condiciones previs-
tas de mltiples entradas y usos.
Los sistemas de envase para venoclisis en tndem (piggyback containers) son por lo general sistemas de envase-cierre de
infusin intravenosa empleados para administrar una segunda infusin a travs de algn tipo de conector o a travs de un
puerto inyector en el equipo de administracin del primer lquido, evitndose as la necesidad de inyectar en otro sitio al pa-
ciente. Los envases para venoclisis en tndem son tambin conocidos como envases de infusin secundaria.
El volumen de inyeccin en un sistema de envase monodosis proporciona la cantidad especificada para administracin pa-
renteral nica y no debe ser superior a 1 L.
Las preparaciones destinadas para administracin intrarraqudea, intracisternal o peridural se envasan slo en sistemas de en-
vase monodosis.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, un sistema de envase multidosis contiene un volu-
men de inyeccin suficiente para permitir la extraccin de no ms de 30 ml.
Las siguientes inyecciones estn exentas de la restriccin de 1 L de los requisitos anteriores relacionados con el envasado:
1. Inyecciones envasadas para uso extravascular como soluciones de irrigacin o dilisis peritoneal.
2. Inyecciones envasadas para uso intravascular como nutricin parenteral o como lquido de reemplazo o sustitucin para
ser administrado en forma continua durante una hemofiltracin.
Las inyecciones envasadas para uso intravascular que pudieran usarse como lquido durante una hemodilisis u otros proce-
dimientos de reemplazo mediante administracin intermitente, continua o en bolo, deben cumplir con la restriccin de 1 L a
menos que se trate de una excepcin mencionada anteriormente. Cuando se declara que las inyecciones estn destinadas para
uso veterinario, stas estn exentas de los requisitos de envasado y almacenamiento en lo referente a las limitaciones para sis-
temas de envase monodosis y de las limitaciones de volumen para los envases multidosis.
Envases para slidos estriles: Los envases, incluyendo los cierres, para slidos secos destinados para inyeccin no deben
presentar ninguna interaccin fsica o qumica con la preparacin que altere de alguna manera la concentracin o potencia, la
calidad o la pureza ms all de los requisitos oficiales, en condiciones habituales de manejo, transporte, almacenamiento, ven-
ta y uso. Un sistema de envase para un slido estril debe permitir la adicin de un disolvente adecuado y la extraccin de
porciones de la solucin o suspensin resultante de tal modo que se mantenga la esterilidad del producto. Cuando la Valora-
cin en una monografa indica un procedimiento para la Solucin muestra, donde se deba tomar el contenido total extrable de
un sistema de envase monodosis con una jeringa y aguja hipodrmicas, se extraer ese contenido en la forma ms completa
posible con una jeringa hipodrmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a extraer, y
USP 39 Pruebas Fsicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 515

equipada con una aguja nmero 21 de una longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la precaucin de expeler
cualquier burbuja de aire, y se descargar en un recipiente para dilucin y valoracin.

ENVASADO DE GASES MEDICINALES

Cilindro de gas: Un cilindro de gas es un sistema de envase metlico construido de acero o aluminio diseado para contener
gases medicinales a presin. Los gases medicinales incluyen Dixido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, xido
ntrico, xido Nitroso USP, Nitrgeno NF y Oxgeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Seguridad
de encaje pareado "Pin-lndex" para dixido de carbono, ciclopropano, helio, aire medicinal, xido nitroso y oxgeno en cilin-
dros de Tamao E o menor.

COMPONENTES RELACIONADOS

Muchos componentes relacionados se gradan para administracin en dosis determinadas. Es responsabilidad del fabricante
garantizar que se provea el componente de dosificacin apropiado o que se especifique un componente para propsitos gene-
rales, como los descritos en esta seccin, para la administracin de la dosis apropiada con la exactitud prevista. Las graduacio-
nes deben ser legibles e indelebles.
Los componentes relacionados graduados que se decriben en esta seccin son de uso general. Las marcas de graduacin
deben ser legibles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga contacto con la boca o producto. En condicio-
nes ideales de uso, el error de volumen en el que se incurre al medir lquidos para la administracin de dosis individuales por
medio de dichos componentes graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparacin lquida con la
que se usar el componente graduado. Pocas preparaciones lquidas comparten las mismas caractersticas superficiales y de
flujo. Por tanto, el volumen administrado vara considerablemente de una preparacin a otra.
Los polmeros e ingredientes agregados a los polmeros que se usan en la fabricacin de componentes relacionados deben
cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Code of Federal Regulations (Cdigo de Reglamentos Federales), Ttu-
lo 21, lndirect Food Additives (Aditivos Alimentarios Indirectos).
Dosificador: Dispositivo de medicin que consiste en un vaso pequeo que se incluye en el envase de los artculos lquidos
orales o que se puede vender y comprar por separado.
Cuchara dosificadora: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava con un mango que se incluye en el enva-
se de los artculos lquidos orales o que se puede vender y comprar por separado. El mango puede ser un tubo graduado.
Gotero para medicamentos: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translcido que ge-
neralmente est equipado con un bulbo depresible. Se incluye en el envase de artculos lquidos orales o se puede vender y
comprar por separado.
Aunque la capacidad de los goteros generalmente vara, el extremo de descarga debe ser una abertura redonda con un di-
metro externo de aproximadamente 3 mm. El cuerpo puede estar graduado. [NOTA-Pocos lquidos medicinales comparten
las mismas caractersticas superficiales y de flujo con el agua, por lo que el tamao de las gotas vara considerablemente de
una preparacin a otra.]
Jeringa para administracin oral: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo y un mbolo fabricados con material
de plstico rgido y transparente o translcido adecuado y que tiene un sello en el extremo. Se incluye en el envase de artcu-
los lquidos orales o se puede vender y comprar por separado. La jeringa debe expulsar una cantidad medida del artculo lqui-
do directamente en la boca del paciente. Las alas para los dedos ubicadas en el extremo abierto del cuerpo deben tener un
tamao, forma y resistencia apropiados y deben permitir que la jeringa se pueda sostener de manera segura durante el uso. El
cuerpo puede estar graduado.
Cucharita de t: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava poco profunda, de forma ovalada o redonda,
que se encuentra al final de un mango. Se ha establecido que una cucharadita de t contiene 4,93 0,24 ml. Para la adminis-
tracin de artculos, se puede considerar que la cucharadita de t representa un volumen de 5 ml.
Los artculos destinados para administracin mediante cucharita de t se deben formular tomando en cuenta una dosifica-
cin en unidades de 5 mL, por lo que, siempre que se indique una calibracin basada en una cucharadita de t, el componen-
te usado para administrar artculos lquidos deber liberar 5 ml. Una cuchara disponible en el hogar no es una alternativa
aceptable a la cucharita de t graduada descrita en este captulo.

LEY DE ENVASADO PARA LA PREVENCIN DE ENVENENAMIENTO O PPPA (POISON

PREVENTION PACKAGING ACT)

Esta ley exige el uso de envases especiales para la mayora de los medicamentos de administracin por va oral para huma-
nos de venta bajo receta, medicamentos de administracin por va oral controlados, algunos medicamentos de administracin
por va oral de venta sin receta mdica, algunos suplementos dietticos y para muchas preparaciones farmacuticas de venta
libre para proteger al pblico de lesiones o enfermedades causadas por el uso incorrecto de estas preparaciones (16 CFR
1700.14).
516 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Fsicas USP 39

El envase primario para sustancias reglamentadas por la PPPA debe cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR
1700.15 y 16 CFR 1700.16) las cuales rigen para todos los tipos de envases, incluidos los que pueden volver a cerrarse, los
que no se cierran y los de dosis nica.
No se requieren envases especiales para los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Los
fabricantes o envasadores de medicamentos a granel de venta bajo receta no necesitan usar envases especiales si el medica-
mento ha de ser reenvasado por el farmacutico. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la PPPA se pue-
den dispensar en envases que no sean seguros para nios si el comprador lo solicita o si una receta vlida as lo indica (15
u.s.c. 1473).
Los fabricantes o envasadores de preparaciones farmacuticas de venta libre reglamentados por la PPPA estn autorizados a
envasar un tamao de producto en envases que no sean seguros para nios siempre que tambin provean envases especiales
de tamao habitual. Los envases que no sean seguros para nios requieren un etiquetado especial (16 CFR 1700.5).

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO
En algunas monografas se establecen instrucciones especficas con respecto a las condiciones de almacenamiento, p.ej., la
temperatura o humedad a las que se debe almacenar y transportar el artculo. Estas condiciones se aplican excepto cuando la
etiqueta del artculo indica condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estabilidad. Cuando no se
proporcionan condiciones de almacenamiento especficas en la monografa individual, pero la etiqueta de un artculo establece
condiciones de almacenamiento basadas en estudios de estabilidad, tales instrucciones de almacenamiento son las que se de-
ben aplicar.
Congelador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre -25 y -1 O (-13 y 14 F).
Refrigerador: Es un lugar fro con una temperatura mantenida entre 2 y 8 (36 y 46 F).
Fro: Toda temperatura que no exceda de 8 (46 F).
Fresco: Toda temperatura entre 8 y 15 (46 y 59 F). [NOTA-Cuando se indique que un artculo debe almacenarse en un
lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la
monografa individual.]
Temperatura ambiente: La temperatura predominante en un rea de trabajo.
Temperatura ambiente controlada: La temperatura mantenida termostticamente que abarca la prevalente en el ambiente
usual de trabajo de 20-25 (68-77 F). Tambin se deben cumplir las siguientes condiciones.
La temperatura cintica media no debe exceder de 25. Se permiten desviaciones entre 15 y 30 (59 y 86 F) experimenta-
das en farmacias, hospitales y depsitos, y durante el transporte. Siempre que la temperatura cintica media no exceda de 25,
se permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a 40 siempre que no duren ms de 24 horas. Slo se permi-
ten elevaciones superiores a 40 cuando el fabricante as lo instruye.
Los artculos pueden etiquetarse para almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o "hasta 25", u otra referencia
escrita con base en la misma temperatura cintica media.
Un artculo para el que se indique almacenamiento a Temperatura ambiente controlada puede almacenarse o distribuirse al-
ternativamente en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual o en la
etiqueta.
Clido (tibio): Toda temperatura entre 30 y 40 (86 y 104 F)
Calor excesivo: Toda temperatura por encima de 40 (104 F)
Lugar seco: El trmino "lugar seco" se refiere a un sitio con una humedad relativa promedio que no exceda de 40% a 20
(68 F) o de la presin de vapor de agua equivalente a otras temperaturas. La determinacin puede hacerse por medicin di-
recta en el lugar o basndose en informacin de las condiciones climticas. La determinacin se basa en no menos de 12 me-
diciones espaciadas equitativamente y realizadas ya sea durante una estacin del ao, durante un ao, o si los registros los
demostrasen, durante el periodo de almacenamiento del artculo. Puede haber valores de hasta 45% de humedad relativa
siempre que el promedio no exceda de 40%. Se considera almacenamiento en un lugar seco al almacenamiento de un envase
que haya sido validado para proteger al artculo del vapor de agua, incluyendo el almacenamiento a granel.
Proteccin de la congelacin: Cuando adems del riesgo de rotura del envase, la congelacin de un artculo pueda ocasio-
nar la prdida de contenido o potencia, o la alteracin destructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las ins-
trucciones apropiadas para proteger al artculo de la congelacin.
Proteccin de la luz: Cuando la luz pueda ocasionar la prdida de contenido o potencia de un artculo, o la alteracin des-
tructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artculo de la luz.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 517

(659) REQUISITOS DE ENVASADO Y ALMACENAMIENTO

(Este captulo ser oficial hasta el 30 de abril de 2016)

Todas las monografas USP y NF deben contar con requisitos de envasado y almacenamiento. Las opciones de los distintos
tipos de envase, para la porcin de la leyenda referida a envasado, se consignan en este captulo. Asimismo, se proporcionan
definiciones como pautas para la seleccin y adaptacin de los requisitos de envasado de productos farmacuticos. Para los
ingredientes farmacuticos activos (API, por sus siglas en ingls), el envase de eleccin sera impermeable, bien cerrado o, si
fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volmenes (cuyos en-
vases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado.
Cuando no se proporcionen instrucciones o limitaciones especficas en el etiquetado del artculo, los artculos deben prote-
gerse de la humedad, congelacin y calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribucin. Los
frmacos estn exentos de dicha norma.

ENVASES
El envase no debe interaccionar fsica o qumicamente con los artculos oficiales de modo que se ocasionen fallas en el cum-
plimiento de los requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza de dichos artculos. Este captulo provee defi-
niciones para envases y almacenamiento.

DEFINICIONES GENERALES
Sistema de Envase (tambin referido como sistema de envase-cierre): Se refiere al conjunto de los componentes del envase
que contienen y protegen al artculo, e incluye los componentes del envase primario y los componentes del envase secundario,
si ste ltimo se utilizara para ofrecer proteccin adicional.
Envase Primario: Receptculo que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacutico activo, excipiente o forma
farmacutica, y que est en contacto directo con el artculo.
Componentes del Envase: Cualquier parte del envase o del sistema de envase-cierre, incluido el envase primario (p.ej., am-
pollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); el recubrimiento interno del envase primario (p.ej., recubrimiento interno en cartu-
cho tubular); el cierre (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos inter-
nos; puertos de administracin; envolturas; accesorios de administracin; y etiquetas.
Componentes Primarios de los Envases: Componentes de envases que estn en contacto directo o que pueden entrar en
contacto directo con el artculo.
Componentes Secundarios de los Envases: Componentes de envases que no estn y que no entrarn en contacto directo
con el artculo, pero que pueden proveer proteccin adicional.
Envase Terciario (embalaje): Componentes de envases que no estn en contacto directo con el artculo pero que facilitan
su manipulacin y transporte para evitar daos derivados de la manipulacin fsica y de las condiciones de almacenamiento a
las que se somete el artculo.
Materiales de Construccin: Se refiere a los materiales (p.ej., vidrio, plstico, elastmeros, metal) usados para fabricar com-
ponentes de envases.
Envases Multidosis (o de dosis mltiple): Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artculo para
administracin parenteral sin alterar la seguridad, contenido, calidad o pureza de la porcin remanente. Ver !~Bl,~(!!r;i!!'lD
/41:~;,$~~1~!fr~ra~1~ft~~:'tilll~l1~~~:1.
Envases de Unidades Mltiples: Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artculo sin alterar la
seguridad, contenido, calidad o pureza de la porcin remanente.
Envases Unitarios: Sistemas de envases que contienen una cantidad de un artculo destinado para administracin como do-
sis nica o un dispositivo terminado individual destinado un solo uso.
Envases Monodosis (ver tambin ~~lm~ll~[l~!!tlill~Hi~:~gBftllll~U~~~"J~~ifi~~~';'~i~ff~~1~fi'~~~
-~~;fl;:,~~-?~t~i): Envases unitarios para un artculo destinado a su administracin parenteral. Deben ser etiquetados como en-
vases monodosis. Entre los ejemplos de envases monodosis se incluyen jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por
fusin y envases con cierres sellados cuando se los etiqueta como tales.
Envases de Dosis nica: Sistemas de envases unitarios para un artculo destinado a su administracin como dosis nica por
una va que no sea parenteral.
Envases de Unidad de Uso: Sistemas de envases que contienen una cantidad especfica de un artculo que est destinado a
dispensarse como tal, sin ninguna modificacin posterior excepto por la adicin de un etiquetado adecuado. El envase de Uni-
dad de Uso no se puede reenvasar para su venta.
518 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Fsicas USP 39

Envases a Granel Para Farmacias: Envases de una preparacin estril para uso parenteral que contienen muchas monodosis.
El contenido est destinado para su uso en programas de preparacin de mezclas en farmacias y est restringido a Ja prepara-
cin de mezclas para infusin o al llenado de jeringas estriles vacas con un dispositivo de transferencia estril.
Luego de Ja reconstitucin, su cierre debe ser perforado slo una vez usando un dispositivo de transferencia estril o equipo
dispensador que permita Ja dosificacin medida del contenido. El Envase a Granel Para Farmacias slo se emplear en un rea
de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar (o un rea equivalente de aire limpio para preparacin ma-
gistral).
La nomenclatura Envase a Granel Para Farmacias se limita a Inyecciones, artculos para Inyeccin o Emulsiones Inyectables se-
gn se define en ~~(~~!1i~llqi~~~a:!1~.1!i)'~;1:~&;;o:~,;~~~~~.
Los Envases a Granel Para Farmacias, aunque ms de una monodosis, estn exentos del lmite de volumen de 30
mL para envases multidosis, y del requisito de contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para prevenir el creci-
miento de microorganismos. Cuando un envase se ofrece como Envase a Granel Para Farmacias, la etiqueta debe (a) indicar
explcitamente "Envase a Granel para Farmacias-No usar para infusin directa", (b) contener o hacer referencia a informacin
sobre tcnicas apropiadas para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una declaracin que limite el tiempo
en el que el envase se puede usar una vez perforado el cierre, siempre que su contenido se haya mantenido en las condiciones
de almacenamiento declaradas.
Inyecciones de Pequeo Volumen: Inyeccin monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que
declaran contener 100 mL o menos.
Inyecciones de Gran Volumen: Inyeccin monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que decla-
ran contener ms de 100 ml.
Envases Seguros para Nios: Sistemas de envases diseados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Pro-
duct Safety Commission (Comisin de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de
nios (16 CFR 1700.20).
Envases Adecuados para la Tercera Edad: Sistemas de envases diseados o construidos para cumplir con las normas de la
Consumer Product Safety Commission (Comisin de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases
por parte de personas de edad avanzada (16 CFR 1 700.20).
Envases Que Evidencian su Alteracin Intencional: Sistemas de envases que no pueden ser abiertos sin la destruccin evi-
dente del sello o de alguna otra parte del sistema de envase.
Envases Impermeables: Sistemas de envases que protegen a los artculos de la contaminacin por lquidos, slidos o vapores
extraos; de la prdida del artculo; y de eflorescencia, delicuescencia o evaporacin en condiciones habituales o acostumbra-
das de manejo, transporte, almacenamiento y distribucin. Ver Envases-Pruebas de Desempeo (671 ).
Envases Bien Cerrados: Sistemas de envases que protegen a los artculos de la contaminacin por slidos y lquidos extraos
y de la prdida del artculo en condiciones habituales o acostumbradas de manejo, transporte, almacenamiento y distribucin.
Ver (671 ).
Envases Resistentes a la Luz: Sistemas de envases que protegen el contenido de los efectos de la luz por medio de las pro-
piedades especficas del material que los compone, incluyendo los recubrimientos aplicados sobre los mismos. Un envase
translcido o incoloro y transparente puede convertirse en un envase resistente a la luz mediante una cubierta exterior opaca o
mediante un envase secundario, en cuyo caso la etiqueta del envase debe indicar que es imprescindible el uso de la cubierta
opaca o que se requiere el envase secundario hasta que el artculo se haya usado o administrado. Ver (671 ), Prueba de Transmi-
sin de Luz.

ENVASES PARA GASES MEDICINALES

Cilindro de Gas: Un cilindro de gas es un sistema de envase metlico construido de acero o aluminio diseado para conte-
ner gases medicinales a presin. Los gases medicinales incluyen Dixido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, xi-
do ntrico, xido Nitroso USP, Nitrgeno NF y Oxgeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Seguri-
dad de encaje pareado "Pin-lndex" para dixido de carbono, ciclopropano, helio, aire medicinal, xido nitroso y oxgeno en
cilindros de Tamao E o menor.

COMPONENTES RELACIONADOS
Muchos componentes relacionados se gradan para administracin en dosis determinadas. Es responsabilidad del fabricante
garantizar que se provea el componente de dosificacin apropiado o que se especifique un componente para propsitos gene-
rales, como los descritos en esta seccin, para la administracin de la dosis apropiada con la exactitud prevista. Las graduacio-
nes deben ser visibles e indelebles.
Los componentes graduados que se decriben en esta seccin son de uso general. Las marcas de graduacin deben ser legi-
bles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga contacto con la boca o producto. En condiciones ideales de
uso, el error de volumen en el que se incurre al medir lquidos para la administracin de dosis individuales por medio de dichos
componentes graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparacin lquida con la que se usar el
componente graduado. Pocas preparaciones lquidas comparten las mismas caractersticas superficiales y de flujo. Por tanto, el
volumen administrado vara considerablemente de una preparacin a otra.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 519

Los polmeros e ingredientes agregados a los polmeros que se usan en la fabricacin de componentes relacionados deben
cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Code of Federal Regulations (Cdigo de Reglamentos Federales), Ttu-
lo 21, lndirect Food Additives (Aditivos Alimentarios Indirectos).
Dosificador: Dispositivo de medicin que consiste en un pequeo vaso que se incluye en el envase de los artculos lquidos
orales o que se puede vender o comprar por separado.
Cuchara dosificadora: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava con un mango que se incluye en el enva-
se de los artculos lquidos orales o que se puede vender o comprar por separado. El mango puede ser un tubo graduado.
Gotero para Medicamentos: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translcido que ge-
neralmente est equipado con un bulbo depresible. Se incluye en el envase de artculos lquidos orales o se puede vender o
comprar por separado.
Aunque la capacidad de los goteros generalmente vara, el extremo de descarga debe ser una abertura redonda con un di-
metro externo de aproximadamente 3 mm. El cuerpo puede estar graduado. [NOTA-Pocos lquidos medicinales comparten
las mismas caractersticas superficiales y de flujo que el agua, por lo que el tamao de las gotas vara considerablemente de
una preparacin a otra.]
Jeringa para Administracin Oral: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo y un mbolo fabricados con material
de plstico rgido y transparente o translcido y que tiene un sello en el extremo. Se incluye en el envase de artculos lquidos
orales o se puede vender o comprar por separado. La jeringa debe expulsar una cantidad medida del artculo lquido directa-
mente en la boca del paciente. Las alas para los dedos ubicadas en el extremo abierto del cuerpo deben tener un tamao,
forma y resistencia apropiados y deben permitir que la jeringa se pueda sostener de manera segura durante el uso. El cuerpo
puede estar graduado.
Cucharita de T: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava poco profunda, de forma ovalada o redonda,
que se encuentra al final de un mango. Se ha establecido que una cucharadita de t contiene 4,93 0,24 mL. Para la adminis-
tracin de artculos, se puede considerar que la cucharadita de t representa 5 mL.
Los artculos destinados para administracin mediante cucharita de t se deben formular tomando en cuenta una dosifica-
cin en unidades de 5 mL, por lo que, siempre que se indique una calibracin basada en una cucharadita de t, el componen-
te usado para administrar artculos lquidos deber liberar 5 ml. Una cuchara disponible en el hogar no es una alternativa
aceptable a la cucharita de t graduada descrita en este captulo.

POISON PREVENTION PACKAGING ACT (LEY DE ENVASES PARA PREVENIR

ENVENENAMIENTOS O PPPA)

Esta ley exige el uso de envases especiales para la mayora de los medicamentos de administracin por va oral para huma-
nos de venta bajo receta, medicamentos de administracin por va oral controlados, algunos medicamentos de administracin
por va oral de venta sin receta mdica, algunos suplementos dietticos y para muchas preparaciones farmacuticas de venta
libre para proteger al pblico de lesiones o enfermedades causadas por el uso incorrecto de estas preparaciones (16 CFR
1700.14).
El envase primario para sustancias reglamentadas por la PPPA debe cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR
1700.15 y 16 CFR 1700.16, las cuales rigen para todos los tipos de envases, incluidos los que pueden volver a cerrarse, los
que no se cierran y los de dosis nica.
No se requieren envases especiales para los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Los
fabricantes o envasadores de medicamentos a granel de venta bajo receta no necesitan usar envases especiales si el medica-
mento ha de ser reenvasado por el farmacutico. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la PPPA se pue-
den dispensar en envases inseguros para nios si el comprador lo solicita o si la receta original as lo indica (15 U.S.C. 1473).
Los fabricantes o envasadores de medicamentos de venta libre reglamentados por la PPPA estn autorizados a envasar un
tamao de producto en envases inseguros para nios siempre que provean el tamao de venta habitual en envases especiales.
Los envases inseguros para nios requieren un etiquetado especial (16 CFR 1 700.5).

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO

En algunas monografas se establecen instrucciones especficas con respecto a las condiciones de almacenamiento, p.ej., la
temperatura o humedad, a las que se debe almacenar y transportar el artculo. Estas condiciones aplican excepto cuando la
etiqueta del artculo indique condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estabilidad. Cuando no se
proporcionan condiciones de almacenamiento especficas en la monografa individual, pero la etiqueta de un artculo establece
condiciones de almacenamiento basadas en estudios de estabilidad, tales instrucciones de almacenamiento son las que se de-
ben aplicar. Las condiciones de almacenamiento vigentes para artculos se definen de acuerdo con los siguientes trminos.
Congelador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre -25 y -1 O (-13 y 14 F).
Refrigerador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre 2 y 8 (36 y 46 F).
Fro: Toda temperatura que no exceda de 8 (46 F).
Fresco: Toda temperatura entre 8 y 15 (46 y 59 F). [NOTA-Cuando se indique que un artculo debe almacenarse en un
lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, en un refrigerador, a menos que se especifique algo dife-
rente en la monografa individual.]
520 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Fsicas USP 39

Temperatura Ambiente: La temperatura predominante en un rea de trabajo.

Temperatura Ambiente Controlada: La temperatura mantenida entre 20 y 25 (68 y 77 F) prevalente en el ambiente
usual de trabajo. Tambin se deben cumplir las siguientes condiciones:
La temperatura cintica media no debe exceder de 25. La temperatura cintica media es un valor calculado que correspon-
de a la temperatura isotrmica que simula los efectos no isotrmicos de las variaciones de temperatura de almacenamiento.
Se permiten desviaciones entre 15 y 30 (59 y 86 F) experimentadas en farmacias, hospitales y depsitos y durante el
transporte, siempre que la temperatura cintica media no exceda de 25.
Se permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a 40 siempre que no duren ms de 24 horas. Slo se per-
miten elevaciones superiores a 40 cuando el fabricante as lo instruye.
Los artculos pueden etiquetar para almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o "hasta 25", u otra referencia
escrita con base en la misma temperatura cintica media.
Un artculo para el que se indique almacenamiento a Temperatura Ambiente Controlada alternativamente puede almacenarse
o distribuirse en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual o en la
etiqueta.
Clido: Toda temperatura entre 30 y 40 (86 y 1 04 F).
Calor Excesivo: Toda temperatura por encima de 40
(1 04 F).
Lugar Seco: El trmino "lugar seco" se refiere a un sitio con una humedad relativa promedio que no exceda de 40% a 20
(68 F) o de la presin de vapor de agua equivalente a otras temperaturas. La determinacin puede hacerse por medicin di-
recta en el lugar o basndose en informacin de las condiciones climticas. La determinacin se basa en por lo menos 12 me-
diciones espaciadas equitativamente y realizadas ya sea durante una estacin del ao, durante un ao, o si los registros los
demostrasen, durante el periodo de almacenamiento del artculo. Puede haber valores de hasta 45% de humedad relativa
siempre que el promedio no exceda de 40%. Se considera almacenamiento en un lugar seco al almacenamiento de un envase
que haya sido validado para proteger al artculo del vapor de agua, incluyendo el almacenamiento a granel.
Proteccin contra la congelacin: Cuando adems del riesgo de rotura del envase, la congelacin de un artculo pueda
ocasionar la prdida de contenido o potencia, o la alteracin destructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las
instrucciones apropiadas para proteger al artculo contra la congelacin.
Proteccin contra la Luz: Cuando la luz pueda ocasionar la prdida de contenido o potencia de un artculo, o la alteracin
destructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artculo de la luz.

(660) ENVASES-VIDRIO

DESCRIPCIN

Los envases de vidrio para uso farmacutico estn destinados a entrar en contacto directo con los productos farmacuticos.
El vidrio usado para los envases farmacuticos es de borosilicato (neutro) o de soda, cal y slice. El vidrio de borosilicato contie-
ne cantidades significativas de xido brico, xido de aluminio y xidos alcalinos y/o alcalino trreos en el entramado vtreo.
Debido a su composicin qumica, el vidrio de borosilicato presenta una alta resistencia hidroltica y una alta resistencia al im-
pacto trmico; est clasificado como vidrio Tipo l. El vidrio de soda, cal y slice es un vidrio de slice que contiene xidos de
metales alcalinos, principalmente xido de sodio y xidos alcalino trreos, principalmente xido de calcio en el entramado v-
treo. Debido a su composicin qumica, el vidrio de soda, cal y slice presenta una resistencia hidroltica moderada; est clasifi-
cado como vidrio Tipo 111. El tratamiento adecuado de la superficie interna de los envases de vidrio de soda, cal y slice Tipo 111
aumentar su resistencia hidroltica de un grado moderado a alto, cambiando as la clasificacin del vidrio a Tipo 11.
A continuacin, se presentan recomendaciones con respecto a la aptitud del tipo de vidrio para envases de productos farma-
cuticos, basadas en las pruebas de resistencia hidroltica. Los envases de vidrio Tipo 1 son adecuados para la mayora de los
productos para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 son adecuados para la mayora de los productos
acuosos cidos y neutros para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 se pueden usar para productos pa-
renterales alcalinos siempre que se demuestre su aptitud mediante datos de estabilidad. Los envases de vidrio Tipo 111 por lo
general no se usan para productos parenterales ni para polvos para uso parenteral, excepto cuando se cuenta con datos de
pruebas de estabilidad adecuados que indican que el vidrio Tipo 111 es satisfactorio.
Se puede tratar la superficie interna de los envases de vidrio para mejorar su resistencia hidroltica. Asimismo, se puede tratar
la superficie externa de los envases de vidrio para reducir la friccin o para proteger de la abrasin o rotura. El tratamiento de
la superficie externa se realiza de manera que no contamine la superficie interna del envase.
El captulo Envases de Vidrio-Evaluacin de la Durabilidad de la Superficie Interna (1660) proporciona informacin sobre la
composicin qumica de los tipos de vidrio, la formacin de los envases de vidrio y los factores que afectan la durabilidad de la
superficie interna de los envases de vidrio. Este captulo tambin contiene metodologa recomendada para evaluar el potencial
que tiene un medicamento para ocasionar la formacin de partculas de vidrio y descamacin.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (660) Envases-Vidrio 521

El vidrio se puede colorear para que ofrezca proteccin de la luz mediante la adicin de pequeas cantidades de xidos de
metales y se analiza segn se indica en Transmisin Espectral para Envases de Vidrio Coloreado. Un envase transparente e incolo-
ro que se convierte en un envase resistente a la luz mediante una envoltura opaca (ver el captulo Requisitos de Envasado y
Almacenamiento (659), Envases Resistentes a la Luz) est exento de los requisitos de transmisin espectral.

PRUEBAS ESPECFICAS

La Prueba de Vidrio Granulado en combinacin con la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidroltica determina el tipo
de vidrio. La resistencia hidroltica se determina por la cantidad de lcali que libera el vidrio en las condiciones especificadas.
Dicha cantidad de lcali es extremadamente pequea en el caso de los vidrios ms resistentes, por lo que es muy importante
prestar la debida atencin a todos los detalles de las pruebas y utilizar aparatos de alta calidad y precisin. La utilizacin de
material de referencia estndar (SRM, por sus siglas en ingls) de vidrio en forma rutinaria al realizar estas pruebas, ayuda a
asegurar la exactitud del mtodo. Los materiales de referencia para vidrio de borosilicato (SRM 623) y vidrio de soda, cal y
slice (SRM 622) estn disponibles en el Instituto Nacional de Normas y Tecnologa del gobierno de EE.UU. (National lnstitute
of Standards and Technology, NIST). Estas pruebas deben realizarse en un rea relativamente exenta de humos y polvo excesi-
vo. La seleccin de la prueba se presenta en la Tabla 7 y la Tabla 2.
Tabla 1. Determinacin de Tipos de Vidrio
Tipo de Envase Prueba Propsito
Prueba de Vidrio Distingue el vidrio de borosilicato Tipo 1del vi-
1, 11, 111 Granulado drio de soda, cal y slice Tipos 11 y 111

La superficie interna de los envases de vidrio es la superficie de contacto para las preparaciones farmacuticas, y la calidad de
esta superficie se determina mediante la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidroltica. La Prueba de Atacado de Superfi-
cie se puede usar para determinar si la alta resistencia hidroltica se debe a la composicin qumica o al tratamiento de la super-
ficie. Como alternativa, la comparacin de los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial se puede
usar en la Tabla 2.
Tabla 2. Determinacin de la Resistencia Hldroltica
de la Superficie Interna
Tipo de Envase Prueba Propsito
Determina la resistencia hidroltica de la superfi-
cie interna; distingue entre envases Tipo /y Ti-
Prueba de Vidrio po 11 con alta resistencia hidroltica, y envases
1, 11, 111 Superficial Tipo 111 con resistencia hidroltica moderada
Cuando resulta necesario, determina si la alta
Prueba de Atacado de Superficie o comparacin de resistencia hidroltica se debe al tratamiento de
los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la la superficie interna o a la composicin qumi-
1, 11 Prueba de Vidrio Superficial ca de los envases de vidrio

Los envases de vidrio deben cumplir con sus especificaciones respectivas de identidad y resistencia hidroltica superficial para
ser clasificados como vidrio Tipo 1, 11 o 111. Los envases Tipo 1o Tipo 11 para productos parenterales acuosos se analizan para
determinar la presencia de arsnico extrable.

Resistencia Hidroltica

APARATO

Autoclave: Para estas pruebas, usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 1, equipado con un term-
metro, o un termopar calibrado que permita una medicin de la temperatura independente del sistema de autoclave; un regis-
trador adecuado; un manmetro, una vlvula de ventilacin y una bandeja con suficiente capacidad para acomodar el nmero
de envases requeridos para llevar a cabo la prueba por encima del nivel del agua. Limpiar el autoclave y dems aparatos minu-
ciosamente con Agua Purificada antes de usar.
Mortero y mano de mortero: Usar un mortero y una mano de mortero de acero endurecido, construidos de acuerdo con
las especificaciones de la Figura 7.
522 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Fsicas USP 39

40

1{>48
1{>50

60

1{>75

Figura 1. Mortero y mano de mortero para pulverizar vidrio.

Otros aparatos: Tambin se requiere un juego de tres tamices enmarcados, de malla cuadrangular de acero inoxidable N
25, 40 y 50, segn la numeracin de EE.UU. (ver Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por Tamizado Analtico
(786), Tabla 7. Tamaos de las Series de Tamices Estndar segn el Intervalo de Inters); un agitador mecnico para tamices o
una mquina de tamizado que pueda usarse para tamizar los granos; un martillo magntico de acero templado; un imn per-
manente; frascos de pesada; tapones; lmina metlica (p.ej. aluminio, acero inoxidable); un horno de aire caliente con capaci-
dad de mantener una temperatura de 140 5; una balanza capaz de pesar hasta 500 g con una exactitud de 0,005 g; un
desecador y un bao ultrasnico.

REACTIVOS

Agua exenta de dixido de carbono: Se trata de Agua Purificada que se ha calentado a ebullicin vigorosa durante 5 minu-
tos o ms y se ha dejado enfriar protegindola de la absorcin de dixido de carbono de la atmsfera, o Agua Purificada con
una resistividad no menor de 18 Mohm-cm.
Solucin de rojo de metilo: Disolver 50 mg de rojo de metilo en 1,86 mL de hidrxido de sodio O, l M y 50 mL de etanol
(96%), y diluir con Agua Purificada hasta 100 mL. Para analizar la sensibilidad, agregar 100 mL de agua exenta de dixido de
carbono y 0,05 mL de cido clorhdrico 0,02 M a O, 1 mL de la solucin de rojo de metilo. La solucin resultante debe ser roja.
No se requieren ms de 0, 1 mL de hidrxido de sodio 0,02 M para cambiar el color a amarillo. El cambio de color de rojo a
amarillo corresponde a un cambio en el pH de 4,4 (rojo) a 6,0 (amarillo).

Prueba de Vidrio Granulado

La Prueba de Vidrio Granulado se puede realizar sobre los envases o sobre las caas que se usan para fabricar envases tubula-
res de vidrio.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

Enjuagar los envases a analizar con Agua Purificada y secar en el horno. Envolver al menos tres de los artculos de vidrio en
papel limpio y triturar hasta obtener dos muestras de aproximadamente 100 g cada una en trozos con un tamao de no ms
de 30 mm. Colocar en el mortero 30-40 g de las piezas con un tamao de entre 1 O y 30 mm tomadas de una de las muestras,
insertar la mano del mortero y golpearla firmemente con el martillo una sola vez. Como alternativa, transferir las muestras a un
molino de bolas, agregar las bolas y triturar el vidrio. Transferir el contenido del mortero o del molino de bolas al tamiz ms
grueso (N 25) de los tamices. Repetir la operacin hasta que todos los fragmentos hayan sido transferidos al tamiz. Agitar
manualmente los tamices durante un periodo breve y retirar el vidrio remanente en los tamices N 25 y N 40. Triturar de
nuevo estas porciones, repitiendo la operacin hasta que queden aproximadamente 1Og de vidrio en el tamiz N 25. Dese-
char esta porcin y la porcin que pase a travs del tamiz N 50. Volver a montar los tamices y agitar durante 5 minutos.
Transferir a un frasco de pesada los granos de vidrio que pasaron a travs del tamiz N 40 y que quedaron retenidos en el
tamiz N 50. Repetir el procedimiento de triturado y tamizado con la segunda muestra de vidrio hasta obtener dos muestras
de granos, cada una con un peso mayor de 1Og.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (660) Envases-Vidrio 523

Extender cada muestra sobre una pieza de papel satinado limpio y extraer las partculas de hierro pasndo el imn sobre
ellas. Transferir cada muestra a un vaso de precipitados para limpiarlas. Agregar 30 ml de acetona a los granos en cada vaso
de precipitados y frotar los granos usando medios adecuados, como por ejemplo, una varilla de vidrio con punta de goma o
recubierta de plstico. Despus de frotar los granos, dejar que sedimenten y decantar la mayor cantidad de acetona posible.
Agregar 30 ml adicionales de acetona, agitar por rotacin suave, decantar y agregar una nueva porcin de acetona. Llenar el
vaso del bao ultrasnico con agua a temperatura ambiente, luego colocar el vaso de precipitados en la gradilla y sumergirlo
hasta que el nivel de acetona est al mismo nivel que el agua; aplicar ultrasonido durante 1 minuto. Agitar por rotacin suave
el vaso de precipitados, dejar que sedimente y decantar la mayor cantidad de acetona posible; luego repetir la operacin de
limpieza ultrasnica. Si persiste una leve turbidez, repetir la limpieza ultrasnica y el lavado con acetona hasta que la solucin
permanezca transparente. Agitar por rotacin suave y decantar la acetona. Secar los granos colocando el vaso de precipitados
primero sobre una placa tibia y luego calentando a 140 durante 20 minutos en un horno de secado. Transferir los granos
secos de cada vaso de precipitados a sendos frascos de pesada, tapar y enfriar en un desecador.

MTODO

Llenado y calentamiento: Pesar 10,00 g de los granos limpios y secos en dos matraces Erlenmeyer diferentes. Pipetear y
transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dixido de carbono a cada uno de los matraces Erlenmeyer (soluciones de prue-
ba). Pipetear y transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dixido de carbono a un tercer matraz Erlenmeyer que servir
como blanco. Distribuir los granos de manera uniforme sobre las bases planas de los matraces agitando suavemente. Cubrir los
matraces con placas de vidrio neutro o papel aluminio enjuagados con Agua Purificada o con vasos de precipitados invertidos
de modo tal que las superficies internas de los vasos de precipitados se ajusten fcilmente a los bordes superiores de los matra-
ces. Colocar los tres matraces en el autoclave que contiene el agua a temperatura ambiente y asegurar que se mantengan suje-
tos por encima del nivel del agua en el vaso. Realizar las siguientes operaciones:
1. Insertar el extremo de un dispositivo termomtrico calibrado en un envase lleno a travs de un agujero de aproximada-
mente el dimetro del termopar y conectarlo a un dispositivo de medicin externo. Si el envase es demasiado pequeo
para insertar un termopar, aplicar un termopar en un envase similar adecuado. Como alternativa, usar el termmetro in-
terno del autoclave.
2. Cerrar firmemente la puerta o la tapa del autoclave, dejando la vlvula de venteo abierta.
3. Iniciar el registro automtico de la temperatura en funcin del tiempo y calentar el autoclave a una velocidad regular tal
que se libere vapor vigorosamente por la vlvula de venteo despus de 20-30 minutos, y se mantenga la liberacin vigo-
rosa de vapor durante 1O minutos adicionales. Para los autoclaves que usan un generador de vapor, no es necesario man-
tener la temperatura durante 1O minutos a 100.
4. Cerrar la vlvula de venteo y aumentar la temperatura de 100 a 121 a una velocidad de 1 /min durante 20-22 minutos.
5. Mantener la temperatura a 121 1 durante 30 1 minutos, desde el momento en que se alcanza la temperatura de es-
pera.
6. Enfriar hasta 100 a una velocidad de 0,5 /min, ventilando para evitar la formacin de vaco, durante 40-44 minutos.
7. No abrir el autoclave hasta que se haya enfriado hasta 95.
8. Retirar las muestras calientes del autoclave tomando las precauciones de seguridad apropiadas y enfriar las muestras con
cuidado a temperatura ambiente durante 30 minutos, evitando el impacto trmico.
Valoracin: Agregar 0,05 ml de Solucin de rojo de metilo a cada uno de los tres matraces. Valorar la solucin blanco inme-
diatamente con cido clorhdrico 0,02 M, luego valorar las soluciones de prueba hasta que el color sea idntico al obtenido
con la solucin blanco. Restar el volumen de valoracin para la solucin blanco del volumen de valoracin de las soluciones de
prueba. Calcular el valor medio de los resultados, en ml, de cido clorhdrico 0,02 M por gramo de la muestra. Repetir la
prueba si los valores ms altos y ms bajos observados difieren en ms del intervalo permisible provisto en la Tabla 3.
Tabla 3. Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos
Media de los Valores Obtenidos para el Consumo de Solucin de cido
Clorhdrico por gramo de Granos de Vidrio (ml/g) Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos
No ms de 0,10 25% de la media
0,10-0,20 20% de la media
No menos de 0,20 10% de la media

NOTA-Cuando se necesite obtener un punto final bien definido, decantar la solucin transparente en un matraz diferente
de 250 ml. Enjuagar los granos agitando por rotacin suave con tres porciones de 15 ml de agua exenta de dixido de carbo-
no y agregar los lavados a la solucin principal. Agregar 0,05 ml de la Solucin de rojo de metilo. Valorar y calcular segn se
indic anteriormente. En este caso, agregar tambin 45 ml de Agua Purificada exenta de dixido de carbono y 0,05 ml de
Solucin de rojo de metilo a la solucin blanco.

LMITES

El volumen no excede los valores indicados en la Tabla 4.

524 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 4. Lmites de Prueba para la Prueba de Vidrio Granulado

Volumen Mximo de HCI 0,02 M por g de Vidrio de Prueba (ml)
Volumen de Llenado (ml) Tipol 1 Tipos 11 y 111
Todos 0,1 1 0,85

Prueba de Vidrio Superficial

DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE LLENADO

El volumen de llenado es el volumen de Agua Purificada que se debe agregar al envase para los fines de la prueba. Para
viales, frascos, cartuchos y jeringas, el volumen de llenado es 90% de la capacidad de desbordamiento. Para ampollas, se refie-
re al volumen hasta la altura del hombro.
Viales y frascos: Seleccionar seis viales o frascos secos del lote de muestra, o tres si su capacidad excede de 100 mL, y elimi-
nar toda suciedad o residuo. Pesar los envases vacos con una exactitud de O, 1 g. Colocar los envases sobre una superficie
horizontal y llenarlos con Agua Purificada hasta aproximadamente el borde superior, evitando el desbordamiento y la introduc-
cin de burbujas de aire. Ajustar los niveles de lquido hasta la lnea de desbordamiento. Pesar los envases llenos para obtener
la masa de agua expresada con dos decimales para envases con un volumen nominal menor o igual a 30 mL, y expresada con
un decimal para envases con un volumen nominal mayor de 30 mL. Calcular el valor medio de la capacidad de desbordamien-
to en mL y multiplicarlo por 0,9. Este volumen, expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de envases
particular.
Cartuchos y jeringas: Seleccionar seis jeringas o cartuchos secos y sellar la pequea abertura (la boca de los cartuchos; el
cierre Luer o la aguja insertada de las jeringas), usando un material inerte. Determinar la capacidad de desbordamiento media
y el volumen de llenado de acuerdo con Viales y frascos.
Ampollas: Colocar al menos seis ampollas secas sobre una superficie horizontal plana y llenarlas con Agua Purificada usando
una bureta hasta que el agua alcance el punto A, donde el cuerpo de la ampolla comienza a estrecharse para formar el hom-
bro de la ampolla (ver la Figura 2). Leer las capacidades, expresadas con dos decimales y calcular el valor medio. Este volumen,
expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de ampollas particular. El volumen de llenado se puede deter-
minar tambin por peso.

Figura 2. Volmenes de llenado de ampollas hasta el punto A.

PRUEBA

La determinacin se lleva a cabo en envases sin usar. Los volmenes de la solucin de prueba requeridos para la determina-
cin final se presentan en la Tabla 5.
Tabla 5. Volumen de Solucin de Prueba y
Nmero de Valoraciones
Volumen de Solucin de Prueba
Volumen de Llenado para Una Valoracin
(ml) (ml) Nmero de Valoraciones
No ms de 3 25,0 1
3-30 50,0 2
30-100 100,0 2
No menos de 100 100,0 3
USP 39 Pruebas Fsicas/ (660) Envases-Vidrio 525

MTODO

Limpieza: Eliminar cualquier residuo o polvo. Poco antes de la prueba, enjuagar cada envase cuidadosamente al menos dos
veces con Agua Purificada, llenar con Agua Purificada y dejar en reposo hasta su anlisis. Inmediatamente antes del anlisis,
vaciar los envases; enjuagarlos una vez con Agua Purificada, luego con agua exenta de dixido de carbono y dejar que escu-
rran. Completar el procedimiento de limpieza dentro de los 20-30 minutos desde el momento del primer enjuage. Las ampo-
llas cerradas se pueden entibiar en un bao de agua o en una estufa de aire a no ms de 40 durante aproximadamente 2
minutos antes de abrirlas para evitar el aumento de presin en el envase. No enjuagar antes de analizar.
Llenado y calentamiento: Llenar los envases con agua exenta de dixido de carbono hasta el volumen de llenado. Cerrar los
envases en forma de cartucho o jeringas prellenables de manera adecuada con material que no interfiera con la prueba. Se
debe cerrar holgadamente cada envase, incluidas las ampollas, con un material inerte, como por ejemplo, una tapa de vidrio
neutro o papel aluminio previamente enjuagados con Agua Purificada. Colocar los envases en la bandeja del autoclave, el cual
contiene una cantidad de agua tal que la bandeja permanece por encima del agua. Cerrar el autoclave y realizar los pasos 1-8
del procedimiento de autoclavado segn se indica en la Prueba de Vidrio Granulado, excepto que la temperatura debe mante-
nerse a 121 1 durante 60 1 minutos. Si se usa un bao de agua para enfriar las muestras, procurar que el agua no entre en
contacto con las cubiertas de papel aluminio que las cubren sin ajustar, para evitar la contaminacin de la solucin de extrac-
cin. Las soluciones de extraccin se analizan valorando de acuerdo con el mtodo descrito a continuacin.
Valoracin: Llevar a cabo la valoracin dentro de la primera hora despus de retirar los envases del autoclave. Combinar los
lquidos obtenidos de los envases y mezclar. Introducir el volumen prescrito (ver la Tabla 5) en un matraz Erlenmeyer. Transfe-
rir el mismo volumen de agua exenta de dixido de carbono a un segundo matraz similar para usarlo como blanco. Agregar a
cada matraz 0,05 mL de Solucin de rojo de metilo por cada 25 mL de lquido. Valorar el blanco con cido clorhdrico 0,01 M.
Valorar la solucin de prueba con el mismo cido hasta que el color de la solucin resultante sea igual que el obtenido para el
blanco. Restar el valor encontrado para la valoracin con el blanco, del encontrado para la solucin de prueba y expresar los
resultados en mL de cido clorhdrico 0,01 M por 100 mL de solucin de prueba. Expresar los valores de la valoracin menores
de 1,0 mL con dos decimales; expresar los valores de la valoracin mayores o iguales a 1,0 mL con un decimal.

LMITES

Los resultados, o el promedio de los resultados si se realiza ms de una valoracin, no exceden los valores declarados en la
Tabla 6.
Tabla 6. Valores Lmite para la Prueba de Vidrio Superficial
Volumen Mximo de HCI 0,01Mpor100 mL de Solucin de Prueba
(mL}
Volumen de Llenado
(mL} Tipos I y 11 Tipo 111
No ms de 1 2,0 20,0
1-2 1,8 17,6
2-3 1,6 16,1
3-5 1,3 13,2
5-10 1,0 10,2
10-20 0,80 8,1
20-50 0,60 6,1
50-100 0,50 4,8
100-200 0,40 3,8
200-500 0,30 2,9
No menos de 500 0,20 2,2

Prueba de Atacado de Superficie

La Prueba de Atacado de Superficie se usa de manera adicional a la Prueba de Vidrio Superficial cuando es necesario determinar
si se ha tratado la superficie de un envase y/o para distinguir entre envases de vidrio Tipo 1y Tipo 11. Como alternativa, se
puede usar la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial. La Prueba de Atacado de Superficie puede realizarse con
muestras sin usar o con muestras usadas en la Prueba de Vidrio Superficial.

MTODO

Viales y frascos: Los volmenes de solucin de prueba requeridos se presentan en la Tabla 5. Enjuagar los envases dos veces
con Agua Purificada, llenar hasta el punto de desbordamiento con una mezcla de un volumen de cido fluorhdrico y nueve
volmenes de cido clorhdrico, y dejar en reposo durante 1O minutos. Vaciar los envases y enjuagar cuidadosamente cinco
526 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Fsicas USP 39

veces con Agua Purificada. Inmediatamente antes de la prueba, enjuagar una vez ms con Agua Purificada. Someter estos en-
vases al mismo procedimiento de esterilizacin en autoclave y determinacin segn se indica en la Prueba de Vidrio Superficial.
Si los resultados son considerablemente ms altos que los obtenidos de las superficies originales (por un factor de aproximada-
mente 5-1 O), significa que la superficie de las muestras ha sido tratada. [Precaucin-El cido fluorhdrico es extremadamente
agresivo. Incluso en cantidades pequeas puede ocasionar lesiones que ponen en riesgo la vida.]
Ampollas, cartuchos y jeringas: Aplicar el mtodo de prueba segn se indica en Viales y frascos. Si la superficie de las ampo-
llas, cartuchos y jeringas no ha sido tratada, entonces los valores obtenidos sern ligeramente ms bajos que los obtenidos en
las pruebas previas. [NOTA-La superficie interna de las ampollas, cartuchos y jeringas fabricadas con tubos de vidrio Tipo 1
normalmente no se somete a tratamiento.]

DISTINCIN ENTRE ENVASES DE VIDRIO TIPO 1 Y TIPO 11

Los resultados obtenidos de la Prueba de Atacado de Superficie se comparan con los obtenidos de la Prueba de Vidrio Superfi-
cial. Para envases de vidrio Tipo 1, los valores obtenidos son cercanos a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial. Para
envases de vidrio Tipo 11, los valores obtenidos exceden en gran medida a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial; y son
similares pero no mayores que los obtenidos para envases de vidrio Tipo 111 con el mismo volumen de llenado.

IMPUREZAS

Arsnico (211)
Usar como Preparacin de Prueba 35 mL de agua de un envase de vidrio Tipo 1o Tipo 11, o para envases ms pequeos, 35
mL del contenido combinado de varios envases de vidrio Tipo 1o Tipo 11, preparados segn se indica en la Prueba de Vidrio
Superficial. El lmite no excede de O, 1 g/g.

FUNCIONALIDAD

Transmisin Espectral para Envases de Vidrio Coloreado

APARATO

Un espectrofotmetro UV-Vis, equipado con un detector de fotodiodos o un tubo fotomultiplicador acoplado con una esfera
de integracin.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

Romper el envase de vidrio o cortarlo con una sierra circular equipada con un disco abrasivo en hmedo, como por ejemplo,
un disco de carborundo o diamante. Seleccionar las secciones representativas del espesor de la pared y cortarlas de un tamao
adecuado para montarlas en un espectrofotmetro. Despus de cortar, lavar y secar cada muestra, procurando no rayar las
superficies. Si la muestra es demasiado pequea para cubrir la abertura del portamuestras, cubrir la porcin descubierta de la
abertura con cinta o papel opaco, siempre que la longitud de la muestra sea mayor que la de la abertura. Antes de colocar en
el portamuestras, lavar, secar y limpiar la muestra con un pao para lentes. Montar la muestra con ayuda de cera u otros me-
dios adecuados, procurando no dejar huellas dactilares u otras marcas.

MTODO

Colocar la muestra en el espectrofotmetro con su eje cilndrico paralelo a la abertura y de tal manera que el haz de luz sea
perpendicular a la superficie de la seccin y que las prdidas por reflexin sean mnimas. Medir la transmisin de la muestra
con respecto al aire en la regin espectral 290-450 nm, de manera continua o en intervalos de 20 nm.

LMITES

La transmisin espectral observada para envases de vidrio coloreado para productos no parenterales no excede del 10% a
cualquier longitud de onda en el intervalo 290-450 nm, independientemente del tipo y capacidad del envase de vidrio. La
transmisin espectral observada en los envases de vidrio coloreado para productos parenterales no excede los lmites provistos
en la Tabla 7.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (661) Sistemas de Envases Plsticos 527

Tabla 7. Lmites de Transmisin Espectral para Envases de Vidrio Coloreado para Productos Parenterales
Percentaje Mximo de Transmisin Espectral a Cualquier Longitud de Onda entre
Volumen Nominal 290 nm y 450 nm
(mL) Envases Sellados a la Llama Envases con Cierres
No ms de 1 50 25
1-2 45 20
2-5 40 15
5-10 35 13
10-20 30 12
No menos de 20 25 10

Cambio en la redaccin:

(661) ~SISTEMAS DE ENVASES PLSTICOS Y SUS MATERIALES DE

CONSTRUCCIN

INTRODUCCIN
El captulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento <659/ considera y define los sistemas, y sus materiales y componentes de
construccin asociados, que se usan para envasar productos teraputicos (farmacuticos, productos biolgicos, suplementos
dietticos y dispositivos). Dichos sistemas pueden construirse con materiales y componentes plsticos. Los plsticos usados en
los sistemas de envases estn compuestos por polmeros homlogos con una variedad de pesos moleculares y contienen aditi-
vos tales como antioxidantes, estabilizantes, lubricantes, plastificantes, colorantes, entre otros. La naturaleza y la cantidad de
aditivos en los plsticos usados para los sistemas de envases son dictadas por el tipo de polmero, el uso del polmero y el pro-
ceso usado para convertir el polmero en componentes, envases o sistemas de envase.
Los productos teraputicos entran en contacto directo con los sistemas de envases y sus materiales plsticos de construccin
a medida que el producto es fabricado, almacenado y administrado. Dicho contacto puede resultar en una interaccin entre
los productos teraputicos y los sistemas de envase y sus materiales o componentes de construccin. Estas interacciones deben
ser de tal manera que la aptitud de uso (incluyendo su seguridad y eficacia) del producto teraputico y de los sistemas de
envases no se vea afectada de manera adversa por la interaccin. Aunque la aptitud de uso incluye varios aspectos relaciona-
dos con la calidad del medicamento envasado y su desempeo, la aptitud de uso tratada en este captulo es la seguridad del
paciente. La obtencin de un resultado necesario y deseable se facilita mediante el uso de materiales plsticos de construccin
bien caracterizados en componentes, envases y sistemas de envases, y mediante el anlisis apropiado de los sistemas de enva-
se.

ALCANCE
El establecimiento de la aptitud de sistemas de envases plsticos para productos teraputicos implica mltiples pruebas y
procedimientos de anlisis, tal como se describe brevemente a continuacin:
Evaluacin del material: Caracterizacin de los materiales de construccin de un sistema de envase para evaluar los ingre-
dientes como posibles sustancias extrables y potenciales sustancias lixiviables. Dicha caracterizacin facilita la identifica-
cin de materiales que son adecuados para su uso en sistemas de envases.
Estudio de extraccin controlada (simulacin): Estudio de extraccin controlada (simulacin) en las condiciones ms exi-
gentes para determinar el grado en el que las sustancias extrables pueden convertirse en probables sustancias lixiviables
(para informacin adicional, ver el captulo Evaluacin de Sustancias Extrables Relacionadas con Envases Farmacuticos y Sis-
temas de Administracin (1663)).
Evaluacin del producto: Medicin en circunstancias reales de las sustancias lixiviables confirmadas en el producto tera-
putico en el envase farmacutico y el sistema de administracin destinado para la comercializacin (para informacin
adicional, ver el captulo Evaluacin de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacuticos y Sis-
temas de Administracin (1664)).
Adems, la informacin provista por el proveedor de los sistemas de envase plsticos y sus materiales relacionados o compo-
nentes de construccin pueden facilitar las evaluaciones de aptitud, puesto que dicha informacin puede representar adiciones
apropiadas o sustitutos de los resultados obtenidos al realizar las pruebas citadas anteriormente.
El proceso de fabricacin de un producto teraputico envasado es complejo. Considerando especficamente el sistema de
envase, los sistemas de envases por lo regular constan de componentes que se fabrican de manera individual a partir de mate-
riales plsticos de construccin. Estos materiales plsticos de construccin individuales inicialmente se generan a partir de reac-
528 (661) Sistemas de Envases Plsticos/ Pruebas Fsicas USP 39

tivos que se hacen reaccionar para producir un polmero base, que posteriormente se mezcla con diversos aditivos para produ-
cir una resina base. Las resinas base individuales son por s mismos materiales de construccin o pueden combinarse con aditi-
vos adicionales y coadyuvantes de procesamiento para formar un material plstico de construccin. El anlisis de estos materia-
les plsticos de construccin para establecer que han sido bien caracterizados y que son adecuados para su uso, especfica-
mente considerando la seguridad, en sistemas de envases est dentro del alcance de esta serie de captulos y se trata en el
captulo Materiales Plsticos de Construccin (661.1 ).
Los materiales plsticos de construccin individuales se combinan para formar componentes del sistema de envase. El siste-
ma de envase se completa ensamblando sus diversos componentes para obtener la forma final. El anlisis de los sistemas de
envase para establecer que son adecuados para sus usos pretendidos, especficamente en lo que concierne a la seguridad, est
dentro del alcance de esta serie de captulos y se trata en el captulo Sistemas de Envases Plsticos para Uso Farmacutico
(661.2).
Los sistemas de envases ensamblados se llenan con el producto teraputico mediante diversos mtodos y en varios puntos
en el proceso de fabricacin del sistema de envase, con lo que se genera el producto teraputico envasado. El anlisis de los
productos teraputicos envasados para establecer que son adecuados para su uso pretendido se trata en las monografas far-
macopeicas pertinentes al producto teraputico especfico y est fuera del alcance de esta serie de captulos.
Para mayor inforrnqcin sobre el alcance, la aplicabilidad y otros temas relu;:ionados con el conjunto de captulos generales
(661), ver el captulo Evaluacin de Sistemas de Envases Pfsticos y sus Materiales de Construccin con Respecto a su Impacto sobre
la Seguridad del Usuario (1661 >usr39

Agregar lo siguiente:

(661.1) MATERtALES PLSTICOS DE CONSTRUCCIN

INTRODUCCIN
El uso de materiales bien caracterizados para construir sistemas de envases es una de las principales formas para asegurar
que el sistema de envase sea apto para su uso previsto. Los materiales se ca.racterizan de modo tal que sus propiedades y ca-
ractersticas puedan coi.ncidir con los requisitos del sistema de envase, con lo que se facilita la seleccin ntencional de materia-
les apropiados. Para los propsitos de este captlo, se considera que un material plstico de construccin est bien caracteri-
zado para su uso previsto si se han establcido de manera adecuada las siguientes caractersticas: su identidad, biocompatibili-
dad (reactvidd biolgica), propiedades f.isicoqumicas generales y composicin (es decir, aditivos y metales e:xtrables que pu-
dieran estar presentes).
Establecer el efecto potencial quetiene un material de construccin sobre la seguridad no puede basarse en una sola estrate-
gia de anlisis individual, debido a que una sola estrategia de anlisis no puede abarcar todos los atributos dl material que
pueden tener un impacto potencial sobre la seguridad. El anlisis qumico prescrito en el captulo es ortogonal en el sentido de
que las secciones de Pruebas Fiscoqumcas proveen una perspectiva general de las sustancias extradas, las secciones Metales
Extrafbles tratan tas fuentes potenciales de impurezas elementales; y la informacin provista por las pruebas de Aditivos Plsticos
tratan las potenciales sustancias extrables orgnicas. Debido a que el anlisis qumico por s solo puede no ser adecuado para
establecer.la aptitud de uso de un material, el anlisis qumico se complementa con el enfoque ortogonal de establecer la reac-
tividad biolgica.

ALCANCE
El propsito de este captulo es proveer mtodos y especificaciones de prueba para materiales plsticos de construccin usa-
dos en .sistemas d envases. Este captulo se aplica nicamente a matra:les plsticos individuales y no debe aplicarse a sistemas
d envases o componentes que consten de. mltiples materiales plsti.cos individuales. El anlisis y la calificacin de los sistemas
de envases plsticos y sus componentes para uso farmacutico se tratan en el captulo Sistemas de Envases Plsticos para Uso
Farma.cutico {661.2}.
Este cptulo contiene pruebas, mtodos y especificaciones para los siguientes materiales: olefinas cclicas, polletileno, poli-
prop.ileno, tereftalato de plietileno, tereftalato C d.e polietilno y loru.to de polivinilo plastificado. Se pueden usar otros mate-
rales plsticos en los sistemas de envases si se establece su aptitud de uso mediante anlisis consistentes con los procedimien-
tos y especificaciones generales provistos en este captulo para los materiales mencionados previamente. Como alternativa, los
materiales plsf;:os individuales de cnstrccin se consider<')n bien caracterizados y apropiados para su uso siempre que se
utilicen en uri sistema de envase que cumpla con los requisitos del captulo (661.2) o si el sistema de envase ha sido considera-
do apropiado para uso farmacutico por la .autoridad reglamentaria apropiada. Dicha conclusin slo es vlida para el sistema
de envas.e especfico que cumple con .los requisitos del captulo {661.2) y no puede extenderse a otros sistemas de envases
USP 39 Pruebas Fsicas / (661 .1) Materiales Plsticos de Construccin 529

llllllllallllll
P:lllltlill
530 (661.1) Materiales Plsticos de Construccin/ Pruebas Fsicas USP 39

Calorimetra de barrido diferencial-El termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Baja Densidad
USP y la temperatura de transicin (T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estndar de
Referencia en ms de 8,0.
Polietileno de alta densidad
Espectrofotometrfa en el Infrarrojo-Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm-1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 m). La muestra
presenta un espectro de absorcin que es sustancialmente equivalente al del ER Polietileno de Alta Densidad USP. La equiva-
lencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variacin natural de la
composicin y/o variacin fsica entre polmeros de esta clase. La equivalencia sustancial se logra cuando todas las diferencias
entre los espectros de la muestra y del Estndar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variaciones natu-
rales de la composicin y/o variaciones fsicas.
Calorimetra de barrido diferencial-El termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Alta Densidad
USP y la temperatura de transicin (T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estndar de
Referencia en ms de 6,0.

PRUEBAS FISICOQUMICAS

Absorbanda: La absorbancia mxima es 0,2.

Acidez o alcalinidad: Se requieren no ms de 1,5 mL de hidrxido de sodio 0,01 N para cambiar el color del indicador a
azul. Se requiere no ms de 1,O mL de cido clorhdrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de
amarillo a anaranjado.
Carbono orgnico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgnico total de la muestra y el blanco es no
ms de 5 mg/L.

METALES EXTRABLES

Aluminio: La Solucin S3 (ver la Tabla 3) contiene no ms de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 g/g.
Arsnico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto y nquel: Informar el valor medido en la Solucin S3 de valores por encima de
0,01 mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 g/g. Si los valores medidos estn por debajo de estos valores, informar el resulta-
do como menos de 0,01 mg/L (ppm}, correspondientes a menos de 0,025 g/g.
Cromo: La Solucin S3 contiene no ms de 0,02 mg/L (ppm), correspondientes a 0,05 g/g.
Titanio: La Solucin S3 contiene no ms de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 g/g.
Vanadio: La Solucin S3 contiene no ms de 0,04 mg/L (ppm), correspondientes a O, 1 g/g.
Cinc: La Solucin S3 contiene no ms de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 g/g.
Circonio: La Solucin S3 contiene no ms de 0,04 mg/L (ppm), correspondientes a O, 1 g/g.
Los resultados de prueba para metales extrables relevantes adicionales se informan de manera similar.

ADITIVOS PLSTICOS. ANTIOXIDANTES FENLICOS. ANTIOXIDANTES NO FENLICOS. COPOLMERO DE SUCCINATO DE

DIMETILO Y (4-HIDROXl-2,2,6,6-TETRAMETILPIPERIDIN-1-IL)ETANOL, AMIDAS Y ESTEARATOS

Se deben informar los resultados de prueba de estos anlisis.

Olefinas Cclicas
IDENTIFICACIN

Espectrofotometra en el infrarrojo: Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm-1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 m). La
muestra presenta un espectro de absorcin que es sustancialmente equivalente al del ER Polmero de Olefina Cclica USP o al
ER Copolmero de Olefina Cclica USP. La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales me-
nores que surgen de la variacin natural de la composicin y/o variacin fsica entre polmeros de esta clase. La equivalencia
sustancial se logra cuando todas las diferencias entre los espectros de la muestra y del Estndar de Referencia pueden ser expli-
cadas en el contexto de dichas variaciones naturales de la composicin y/o variaciones fsicas.
Calorimetra de barrido diferencial: Debido a la naturaleza amorfa de estos polmeros y a su variedad en su composicin,
se pueden anticipar variaciones entre materiales en la temperatura de transicin (T9). Por ende, no se recomienda ni se requie-
re realizar una calorimetra de barrido diferencial.

PRUEBAS FISICOQUMJCAS

Absorbancia: La absorbancia mxima es 0,2.

USP 39 Pruebas Fsicas/ (661.1) Materiales Plsticos de Construccin 531
532 (661.1) Materiales Plsticos de Construccin/ Pruebas Fsicas USP 39

Tereftalato de Polietileno y Tereftalato G de Polietileno

IDENTIFICACIN

Espectrofotometra en el infrarrojo: Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm-1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 m). La
muestra presenta un espectro de absorcin que es sustancialmente equivalente al del ER Tereftalato de Polietileno USP o del ER
Tereftalato G de Polietileno USP. La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores
que surgen de la variacin natural de la composicin y/o variacin fsica entre polmeros de esta dase. La equivalencia sustan-
cial se logra cuandotodaslas diferencias entre los espectros de la muestra y del Estndar de Referencia pueden ser explicadas
en el contexto de dichasvariaeiones naturales de la.composicin y/o variaciones fsicas.
Calorhnetra de barrido diferendal
Tereftalato de polietlleno-EI termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Polietileno USP. La tem-
a
peratura de transicin vtrea (T9 ) obtenida partir deltermograma de la muestra no difiere de aquella del Estndar de Ref.eren
da en ms de 4,0 9
Tereftalato G de polietileno~EI term()grama de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato G de Polietileno. USP. La
temperatura de transicin vtrea (T9 ) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estndar de Re-
ferencia en ms de 6,0.,

PRUEBAS FISICOQUMICAS

Absorbancia: Las absorbancia mxima es 0,2 para Ja Solucin S1y0,05 para la Solucn SS. Para el tereftalato de polietileno
con color, la absorbancia mxima entre 400y 800 nm es 0105 parda Solucin S1.
Acidez. o alcalinidad: Se requieren n ms de 0,5 ml de hidrxiclo de sdio 0,01 N para cambiar el color del indicador a
azul. Se requieren no ms de0,5 ml de cido clorhdricoO,Ol.N para alcanzar el.inicio del cambio de colordel indicador de
amarillo a>anaranjado,
Carbono orgnico total: La diferencia entre las con<;entracione.s de q:1rbono orgnico total de la muestra y el blanco es no
msde5mg/k;

METALES EXTAABLES

Aluminio: La Solucin SJ(ver la Tabla 3) contiene no ms de 0,4 mg/l (ppm), cQrrespQndientes a T g/g.
Antlmonio;kaSo/up;nS4.c0 ntil;!neno.msdeQ,4mg/L{pprn),correspondientesa lg/g.
ArsniCo, cadmio, plom, 111erc1Jrio, fobalto, nquel y vanadio:.. Informar el valor medido. en la Solucin .53 de valores por
encima de o,OT rng/L (ppm), correspondientes a 0,025 g/g. Si los valores medidos estn por debajo de estos valores, infor.
mar el resultado C:Omo menos de O,Ol. mg/L(ppm), i:;orrespondientes .a menos de 0,025. g/g,
Bario: La SolucinS3contiene nomsde 0;4mg/L{ppm), correspondientes a 1 g/g,
Germanio: La Solucin S4 contiene no ms de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a l g/g.
M<tf'lgaqeso: La So[iu;i<)o 53 contiene no .ms de 0,4 mg/L{ppm), corre~pqndi(;'!ntes a l g/g.
Titanio: ta solu~il?S3 <:;ontiene no ms c;!(;'! 0,4 mg/L(ppm), cgrrespondientes a 1 g/g.
Cinc: ta Sollldn 53 contiene no mas de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 .g/g.
Los resultado~ de prueba para. metales extrables relevantes adicionales se .informan de manera similar,

Cloruro de PolivinUo Plastificado

IDtNTI FICtXCJN

Espec;trofoto01etr<1 ep eUnfral"r~jo: Oeterrnnar .el espectro infrarroj.o desde 3800 cm~ 1 . hasta 600 cm- 1. (2,6-16 m). La
muestra presenta 1;10 e~pec~ro .de bsorcin que es sustancialmente eql!ivalente al del. tR Cloruro de Po!ivinilo Plastificado USP.
La. equivalencia smtancial, .a1 contrario de la>exacta, PE:rtnite dlfereocias espectrales menores que ~urgen. de la variacin n~tural
de la composicin y/o variacin fl~ica entre polmeros de esta clase. La eq1Jivale9ciasustancial se l()gra cuando todas tas dife
rencias entre los espectros de la muestra y del ~tndar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variado
nes naturales de la composiciny/ovaracioriesfsics.
Calorimetra de barrido d~erenc,al: . ti termograrna de la muestra. es similar al terrnograma del ER Cloruro de Polivinilo Plas-
tificado USP y. la temperatura de transicin(T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella .del Estn-
dar de Referencia en 1)1.sde 8;0. Teoer en cuenta .ql!e los resultados del anlisis porcalorimetra de barrido diferencial depen-
den en grar\ medida de la cantidad de plastfcante en el artculo de prueba.

PRUEBAS FISICOQUMICAS

Absorbancia: No ms de 0,25 para la Solucin 51

 USP 39 Pruebas Fsicas/ (661 .1) Materiales Plsticos de Construccin 533

Acidez o alcalinidad: Se requieren no ms de 1,5 ml de hidrxido de sodio 0,01 N para cambia(el color del indicador a
azul. Se requiere no ms de l,O mL de cido clorhdrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de
amarillo a anaranjado.
Carbono orgnico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgnico total de la muestra y el blanco es no
ms de 5 mg/L.

METALES EXTRABLES

Arsnico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto, nquel y vanadio: Informar el valor medido en la Solucin 53 de valores por
encima. de O,Ol. mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 g/g. Si los valores medidos estn por debajo de estos valores, infor
mar el resultado como menos de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a menos de 0,025 g/g.
Bario: La Solucin S3 (ver la Tabla 3)cor\tiene no ms de 0,25 mg/L (ppm}, correspondientes as g/g.
Calcio: La So/ucinS3 contiene no ms de 35 mg/L (ppm), correspondientes a 0;07 % en peso.
Estao: La Solucin S3 contiene no ms de 1 mg/L (ppm), correspondientes a 20 g/g:
Cinc;:: La Solucin 53 contiene no ms de 100 mg/L (ppm), correspondientes a 0,2 % en peso.
Los resultados de prueba para metales extrables relevantes adicionales se informan de manera similar.

ADITIVOS PLSTICOS

Di(2cetilhexil)ftalato: El residuo erno ms de 40 mg.

NIN''-Diaciletilenediaminas: El residuo erno ms de 20 mg,
Aceite de soja epoxidldo: la diferencia entre las l'nasas de ambos residu:Os es no ms de 1O. mg.
Aceite de linaza epoxidado: La difereneia entre las rnass de arnbos residuos es no ms d 1O mg:
Clorur devinllo: No ms del ppm; Tener en cuenta que el Cloruro de vinilo no es f1.aditvo, pero s mrlitore como
monmero residual.

MTODOS DE PRUEBA
Identificacin

La prueba de .identific::acin descrita. en .este captulo es requerida para todos los materiales d constr'cdri usados en ros
sistemas de envases. La prueba de identificacion debe realizarse usando los procedimientos indicados en este captufo (spec-
trofotometra en el infrarrojo y anlisis trmico). S estos procedimientos no son aplicables pr unmaterial particlar, ehtbhces
se.puede usar un procedimiento alternativo. El procedimiento alternativo debe establecer la identidad en base ala obtencin
de resultados sustancialmente equivalentes para el artculo de prueba y su Estndar de Referencia USP apropiado.
Se deb.en establecer especificaciones para materiales que no estn indicados en e~e captulo, las cuales deben.ser consisten-
tes en las especificaciones estableddas para los materiales especificados ri este capftulo. Prejemplo,na speclfii:cinde
ca!orimefrde brrido diferencial para url material que no se encuentre listado en este cpffulo debe ser C:onsiste1te, ef)J tj
respecta a for\gaje y rigor, con u na especificadn de calorimetra de barrido diferencial paran rhateriJ que est li$t.dd ~n
este captulo [por ejemplo, el ndice de concordancia de la temperatura de trasiein ( T9) entre la muestra y e/rhateril de
referencia].
lasidentdades de Jos materiales de construccin slo necesitan ser establecidas mediante uh procedimiehto de prueba.

Espectrofotometra. en el 1nfrarrojo

Aparato: Usar l1nespectrofotmetro infrarrojo capaz de corregir por el espectro del blanco y capaz de medir en modo de
transmisin o equipado con un accesorio de reflectancia interno y una placa de reflectancia interna apropiada.
Preparacin de la muestra
Modo de transmisin-Preparar una muestra con un espesor apropiado (aproximadamente 250 m para polietileno; aproxima-
damente 100 m para polipropileno) sin defectos visibles (grietas u orificios). Las muestras pueden compactarse para formar
una pelcula delgada y uniforme mediante exposicin a temperaturas y presiones elevadas (2000 psi o ms). Las temperaturas
a las que se generan las pelculas delgadas representan un cOmpromiso entre producir un fundido (lo cual lo dicta la tempera-
tura necesaria ms baja) y degradar la muestra (lo cual lo dicta la temperatura ms alta permitida). En ltimo caso, las tempe-
raturas que se usan son apropiadas si la pelcula producida es conductiva para el anlisis IR.
Modo de reflectancia interna-Preparar una seccin plana y cortarla segn sea necesario para obtener un segmento que sea
conveniente para el montaje en el accesorio de reflectancia interna. limpiar la muestra con papel seco o, si fuera necesario,
con un trapo suave empapado con metano!, teniendo cuidado de no rayar las superficies, y dejar que stas se sequen. Antes
de montar la muestra en la placa, compactarla para formar una pelcula uniforme exponindola a temperaturas elevadas bajo
alta presin (2000 psi o ms). Posteriormente, asegurar la muestra sobre la placa de reflexin interna asegurando el contacto
adecuado con la superficie.
534 (661.1) Materiales Plsticos de Construccin / Pruebas Fsicas USP 39

Procedimiento~ Colocar los cortes de muestra montados en el compartimiento de la muestra del espectrofotmetro infrarro-
jo o en el accesorio de reflectancia interna, y colocar el montaje en el haz de la muestra del espectrofotmetro infrarrojo. Para
reflectancia interna, ajustar la posicin de la muestra y los espejos dentro del accesorio para permitir la mxima transmisin de
luz del haz de referencia sin atenuar. (Para un instrumento de doble haz, atenuar el haz de referencia despus de completar el
ajuste en el accesorio para permitir la deflexin a escala completa durante el barrido de la muestra.)

Anlisis Trmico

Referirse al captulo Anlisis Trmico {891 ).

Preparacin de la muestra: Colocar aproximadamente 12 mg de muestra en la bandeja colectora de muestra. [NOTA-El
contacto ntimo entre la bandeja colectora y el termopar es esencial para obtener resultados reproducibles.] Determinar el ter-
mograma bajo nitrgeno, usando condiciones de calentamiento/enfriamiento especificadas para el tipo de polmero y usando
equipo capaz de realizar determinaciones segn lo descrito en el captulo (891 ). Los termogramas se obtienen para los mate-
riales de prueba y sus Estndares de Referencia USP asociados.
Procedimiento
Poletileno-Determinar el termograma bajo nitrgeno a temperaturas de entre 40 y 200 a un intervalo de calentamiento de
entre 2 y 1 O/minuto, seguido por enfriamiento, a una velocidad de entre 2 y 10/minuto, hasta 40.
Tereftafato de pofieti/eno-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 280 a una velocidad de calentamiento de
aproximadamente 20 /minuto. Mantener la muestra a 280 durante 1 minuto. Enfriar rpidamente la muestra hasta tempera-
tura ambiente y volver a calentarla a 280 a una velocidad de calentamiento de S /minuto.
Tereftalato G de po/ietileno-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 120 a una velocidad de calentamiento de
aproximadamente 20 /minuto. Mantener la muestra a 120 durante 1 minuto. Enfriar rpidamente la muestra hasta tempera-
tura ambiente y volver a calentarla a 120 a una velocidad de calentamiento de 1O /minuto.
Olefina cfclica-Determinar el termograma bajo nitrgeno a temperaturas que vayan desde temperatura ambiente hasta 30
por arriba del punto de fusin. Mantener la temperatura durante 1O minutos, fuego enfriar a 50 por debajo del pico de. la
temperatura de cristalizacin a una velocidad de 1 O a 20/minuto.
Polipropileno-Determinar el termograma bajo nitrgeno a temperaturas que vayan desde temperatura ambiente hasta 30 por
arriba del punto de fusin. Mantener la temperatura durante 1O minutos, luego enfriar a 50 por debajo del pico de la tempe-
ratura de cristalizacin a una velocidad de 1O a 20 /minuto.
Cloruro de polivinilo plastificado-Calentar la muestra desde -20 hasta 120 a una velocidad de calentamiento de aproximada-
mente l O/minuto. Enfriar rpidamente la muestra .a temperatura ambiente.
Otros materiales-Las muestras deben calentarse y enl'rarse de una manera apropiada para el material de prueba y que facilite
la generacin un termograll1a utilizable.

Extracciones

El anlisis ficoqumico del material plstico requiere la extraccin o disolucin del mismo. Se proveen diversas pruebas ba-
sadas en varios mtodos de extraccin. La Tabla 3 describe los extractos que se generan y las pruebas que se realizan a dichos
extractos. Las secciones subsiguientes tratan sobre mtodos para producir los extractos. Se debe tener en cuenta que estos
extractos pueden usarse para otras pruebas distintas a las pruebas fisicoqumicas.
Tabla 3. Extracciones Realizadas para Varias Pruebas Qumicas
Pruebas Realizadas en Plsticos Usando la Solucin de Extraccin Especificada
Tereftalato de
Polietileno, Polietlleno y
Olefina Cclica y Tereftalato G de Cloruro de Polivinllo
Extraccin Solucin de Extraccin Pollpropileno Polletileno Plastificado
Absorban ca Absorbancia Absorbancia
Acidez/alcalinidad Acidez/alcalinidad Acidez/alcalinidad
51 Agua Carbono orgnico total Carbono orgnico total Carbono orgnico total
Antioxidantes fenlicos, anti-
oxidantes no fenlicos,
52 Tolueno amidas y estearatos N/A N/A
Metales extrables: Al, As, Metales extrables: Al, Sb, Metales extrables: As, Ba, Ca,
Cd, Co, Crb, Hg, Ni, Pb, Ti, As, Ba, Cd, Co, Ge, Hg, Cd, Co, Hg, Ni, Pb, Sn, V y
53 cido V, Zn y Zr' Mn, Ni, Pb, T, V y Zn Zn
54 lcali N/A Metales extrables: Sb y Ge N/A
55 Alcohol N/A Absorbancia N/A
Aunque este extracto es adecuado para su uso con estos mtodos para ingredientes especficos, dicho extracto puede ser til para otras pruebas diseadas a
establecer la composicin de un material.
0 Para poletileno no plastificado nicamcinte.
e No aplicable para olefinas cclicas.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (661.1) Materiales Plsticos de Construccin 535

EXTRACCIN CON AGUA, SOL{.JCJN S1

Polietileno, olefinas cclicas y polipropileno: Colocar 25 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato
con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 500 mL de Agua Purificada y calentar a ebullicin en condidones de rflujo durante 5
horas. Dejar que se enfre y filtrar la solucin de extraccin a travs de un filtro devidrio sinterizad<:); Recolectar el filtrado en
un matraz volumtrico de 500 mL ydiluir con Agua Purificada a volumen; la solucin diluida se de/lamina Solucin 51. Usar la
Solucin S1 dentro de las 4 horas de su preparacin.
TereftJato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 1Og del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 200 mL de Agua Purificada y calentar a 50 durante 5 horas. Dejar que se
enfre, decantar la solucin en un matraz volumtrico de 200 mly diluir con Agua Purificada a volumen; la muestra diluida se
denomina Solucin S1. Usar la Solucin Sl dentro de las 4 horas de su preparacin.
Cloruro de po/vnilo plastificado-Colocar 25 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato. Agregar 500 ml
de Agua Purificada, tapar el cuello del matraz con papel aluminio o un vaso de precipitados de borosilicato y calentaren un
autoclave a 121 2 durante 20 minutos. Dejar que la solucin se enfre y que los slidos sedimenten, de<;antar.Ja. soluc:;in en
un matraz volumtrico de 500 ml y diluifcon Agua Purificada a volumen; la solucin diluida se denomina Solucin .S 1.

EXTRACCIN CON TOLUENO, .SOLUCIN S2

Polietileno, olefinas cclicas y polipropileno: Colocar 2,0 g del material de prueba en un matraz de vidr.io de borosilicato de
250 mL con cueUo de vidrio esmerilado. Agregar 80ml de tolueno y calentar a ebullicin en un condensador de reflujo duran
te 1,5 horas, mezclando constantemente. Dejar que se enfre a 60 y agregar, mezclando cbntinuamente, l 20 mL de metano!.
Pasar la solucin resultante a travs de un filtro de vidrio sinterizado. Enjuagar el matraz y el filtro con 25 ml de una mezcla de
40 mLde toli.Jeno y 60mL de metano!, agregar los enjuagues alfiltrady diluir hasta 250 mi... con la mismame.;zc:;la de disol~
ventes para producir la Solucin S2. Preparar una solucin blanco.

EXTRACCIN CON CIDO, SOLUCINS.3

Polietileno, olefinas cclicas y polipropileno: Colocar 100 g del material de prueba en un matraz de vidrio de botosilicato
con un cuello de vidrio esmerilado. Agregar 250 mi... de cido clorhdrico O, l N y calentar a ebullicin en un condensador de
reflujo durante 1 hora mezclando constantemente. Dejar que se enfre, decantar la solucin en un matraz volumtrico de 250
mL y diluir con cido clorhdrico O, 1 N a volumen; la solucin diluida se denomina Solucin S3.
Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 20 g del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 50 ml de cido clorhdrico O, 1 N y calentar a 50 durante 5 horas. Dejar
que se enfre, decantar la solucin en un matraz volumtrico de 50 ml y diluir con cido clorhdricoO,l Na volumen; la solu~
cin diluida se denomina Solucin S3. Usar la Solucin S3 dentro de las 4 horas de su preparacin.
Cloruro de polivinilo plastificado: Colocar 5 g en un matraz de vidrio de borosilicato con un cuello de vidrio esmerilad().
Agregar 100 mi... de cido clorhdrico O, 1 N y calentar a ebullicin en un condensdor de reflujo durante 1 hr mezclando
constantemente. Dejar que se enfre y que los slidos sedimenten, decantar la solucin en un matraz volumtrico de 100 mL y
diluir con cido clorhdrico O, 1 N a volumen; la solucin diluida se denomina Solucin S3.

EXTRACCIN CON LCAU, SOLUCIN S4

Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 20 g del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 50 mL de hidrxido de sodio 0,01 N y calentar a 50 durante 5 horas.
Dejar que se enfre y que los slidos sedimenten, decantar la solucin en un matrazvolumtrio de 50 ml ydiluircon hidrxi-
do de sodio 0,01 Na volumen; ta solucin diluida se denomina Solucin S4. Usar la Solucin S4 dentro de las 4 horas de su
preparacin.

EXTRACCIN CON ALCOHOi..., SOLUCIN SS

Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 1Og del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 100 mL de alcohol absoluto, y calentar a 50 durante 5 horas. Dejar que
se enfre y que los slidos sedimenten, luego decantar la solucin para producir la Solucin SS. Usar la Solucin SS dentro de las
4 horas de su preparacin.

Pruebas Fisicoqumicas
ABSORBANCIA

Referirse al captulo Espectroscopa Ultravioleta-Visible <857).

536 (661.1) Materiales Plsticos de Construccin/ Pruebas Fsicas USP 39

Polietileno, olefinas cclicas y polipropileno: Determinar el espectro entre 220 y 340 nm en la Solucin S1.
Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Determinar el espectro entre 220 y 340 nm en la Solucin S1.
Para tereftalato de polietileno de color, determinar el espectro entre 400 y 800 nm en la Solucin S1. Para tereftalato de polieti-
leno de color y sin color, determinar el espectro entre 400 y 800 nm en la Solucin 55.
Cloruro de polivinilo plastificado: Evaporar 100 mL de Solucin S1 hasta sequedad. Disolver el residuo resultante en 5 mL
de hexano para producir la muestra de hexano. Pasar la muestra de hexano, si fuera necesario, a travs de un filtro previamen-
te enjuagado con hexano. Determinar el espectro entre 250 y 31 O nm en la muestra de hexano. Adicionalmente, slo para
materiales de cloruro de polivinilo no plastificado, determinar el espectro entre 250 y 330 nm en la muestra de alcohol asocia-
da con la Solucin S3.

ACIDEZ O ALCALINIDAD

Solucin indicadora de BRP: 1,0 mg/mL de azul de bromofenol, 0,2 mg/ml de rojo de metilo y 0,2 mg/ml de fenolftalefna
en alcohol. Filtrar la solucin resultante.
Solucin de anaranjado de metilo: Disolver 100 mg de anaranjado de metilo en 80 mL de Agua Purificada y diluir con al-
cohol R hasta 100 mL. Prueba de sensibilidad: Agregar O, 1 mL de Solucin de anaranjado de metilo a l 00 mL de Agua Purifica-
da exenta de dixido de carbono. Se requiere no ms de O, 1 ml de cido clorhdrico 1 N para cambiar el color de amarillo a
rojo.
PoHetiJeno, olefinas cclicas y polipropileno: Agregar O, 15 ml de Solucin indicadora de BRP a 100 ml de Solucin S1. De-
terminar el volumen consumido de hidrxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul. Agregar
0,2 mL de Solucin de anaranjado de metilo a u na porcin separada de 100 m L de Solucin 51. Determinar el volumen consu-
mido de cido clorhdrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado.
Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Agregar O, 15 mL de Solucin indicadora de BRP a 50 mL de Solu-
cin S7. Determinar el volumen consumido de hidrxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul.
Agregar 0,2 mL de Solucin de anaranjado de metilo a una porcin separada de 50 rnL de Solucin s7. Determinar el volumen
consumido de cido clorhdrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado.
Cloruro de polivinilo plastificado: Agregar O, 15 mL de Solucin indicadora de BRP a 100 mL de Solucin 51. Determinar el
volumen consumido de hidrxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul. Agregar 0,2 ml de
Solucin de anaranjado de metilo a 100 mL de Solucin S1 ..Determinar el volumen consumido de cido clorhdrico 0,01 N para
alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado.

CARBONO ORGNICO TOTAL

El contenido de carbono orgnico total de la Solucin S1 se. mide de acuerdo con las metodologas generales descritas en el
captulo Carbono Orgnico Total {643). Sin embargo, aunque el captulo {643) est diseado .para el anlisis de agua de alta
pureza con valores bajos de carbono orgnico total, los extractos de materiales pueden tener valores de carbono orgnico to
tal que son superiores a los del agua purificada debido a las sustancias orgnicas extradas. Por consiguiente, el mtodo usado
para realizar los anlisis de carbono orgnico total debe tener un lmite de deteccin de 02 mg/L (ppm) y debe tener un nter
valo dinmico lineal demostrado de 0,2 a 20 mg/L (ef cuaf abarque ef lmite de carba.no orgnico total). Se puede usar un
intervalo lineal con una concentracin superior siempre que se establezca la linealidad. Si los extractos de la muestra exceden
este intervalo lineal superior, deben ser diluidos apropiadamente para el anlisis.

Metales Extrables
El anlisis de Metales Extrables descrito en este captulo es requerido para todos los materiales plsticos de construcc.i.n usa-
dos en sistemas de envases, independientemente de si el. material est especificado en este captulo. Especficamente, todos los
materiales deben ser analizados para detectar aquellos metales listados en la Tabla 3 y cualquier otro metal que sea relevante
en el sentido de que se conoce o se puede anticipar razonablemente su presencia en el material de prueba.

PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIN

Los materiales plsticos usados en sistemas de envases para artculos mdicos no se disuelven en condiciones de uso, sino
que las sustancias derivadas de los sistemas de envase se acumulan en los artculos envasados a travs del proceso de lixivia-
cin (extraccin). Por consiguiente, el proceso de preparacin de muestras apropiado y pertinente para evaluar metales en los
materiales de construccin de un sistema de envase es la extraccin del material de plstico, al contrario de la digestin com-
pleta. La Solucin S3 (extraccin con cido) y la Solucin S4 {extraccin con lcali) preparadas para las Pruebas Fisicoqumicas
(Tabla 2) son los extractos de material que se analizan para determinar la presencia de metales extrables.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (661.1) Materiales Plsticos de Construccin 537
538 (661.1) Materiales Plsticos de Construccin/ Pruebas Fsicas USP 39
USP 39 Pruebas Fsicas/ (661.1) Materiales Plsticos de Construccin 539
540 (661.1) Materiales Plsticos de Construccin/ Pruebas Fsicas USP 39

Sistema cromatogrfico
{Ver Cromatografa (621), Cromatografa en Capa Delgada.)
Placa: Gel de slice para cromatografa en capa delgac;la GF254 (1 mm de espesor)
Mtodo: Aplicar 0,5 ml de Solucin A 1 a la placa como una banda de 30 mm x 3 mm. Aplicar 5 L de cada So/ucn de
referencia a la placa. Desarrollar ta placa con un recorrido .de 15 cm usando tolueno. Secar la placa con cuidado.
Aditivo Ftalato de di(2-etilhexilo): UV 254 nm; localizar la zona correspondiente al aditivo ftalato de di(2-etilhexilo) (R1
aproximadamente 0,4). Retirar el rea del gel de slice correspondiente a esta zona, mezclar con 40 ml de ter etlico y agitar
durante l minuto. Filtrar, enjuagar con dos cantidades de ter etlico, cada un;'l c;le 1O mL, agregar los enjuagues al filtrado y
evaporar hasta sequedad. El residuo pesa no ms de 40 mg.
Aditivo Aceite de soja epoxidado y aditivo aceite de linaza epoxidado: Exponer la placa a vapor de yodo durante 5 mi
nutos. Observar elcromatograma y localizar la banda correspondiente al aditivo aceite de soj!'l epoxidado y al aditivo ;'lceite de
linaza epoxidado (R1 "" O). Retirar el rea del gel de slice correspondiente a esta banda. De manera similar, retirar l.m rea co-
rrespondiente del gel de slice como blanco de referencia. Mezclar por separado ambas muestras con porciones separac;las de
40 ml de metano!, agitando durante 15 minutos. Filtrar, enjuagar el filtr() con dos volmenes de 10 mL de metano!, agregar
los. enjuagues al filtrado y evaporar hasta sequedad. La diferencia entre las masas de ambos resduos es no ms de 1 O mg.
Aditivo N,N'-diaciletilendiaminas: Lavar el precipitado B2 con alcohol absoluto. Secar hasta peso constante sobre pentxi-
do de difsforo y pesar el filtro. El precipitado pesa no ms de 20 mg.
CLORURO DE VINILO
Solucin de estndar interno: Usando una microjeringa,inyectar 10 Lde teretlicoen20,0 ml deN1 N"dimetilacetami~
da, sumergiendo la punta de la aguja en el disolvente, Inmediatamente antes de su uso, diluir la solucin hasta 1000 veces su
volumen con N,N-dimetilacetamda.
Solucin muestra: Colocarl ,O g del material de prueba en un vial de 50 ml vial, y agregar 10,0 ml de Solucinde estn-
dar interno. Cerrar el vial y asegurar con un tapn. Agitar, evitando el contacto entre el tapn y el lquido, Colocar el vial en un
bao de agua a 60 1 durante 2 horas.
Solucin primaria de cloruro de vinilo: [NOTA-Preparar en una campana ventilada.] Colocar 50,0 ml de N,N-dimetilace
tamida en un vial de 50 ml, tapar el vial, asegurar el tapn y pesar con una aproximacin de 0,1 mg. Llenar urjeringa de
polietileno o polipropileno de 50 ml con cloruro de vinilo gaseoso, dejar que el gas permanezca en contacto con la jeringa
durante aproximadamente 3 minutos, vaciar la jeringa y llenar nuevamente con 50 ml de cloruro de vinilo gaseoso. Equipar la
jeringa con una aguja hipodrmica y reducir el volumen de gas en la jeringa de 50 a. 25 mL Inyectar los 25 mL remanentes de
cloruro de vinilo lentamente en el vial, agitando suavemente y evitando el contacto entre eUqudo y la aguja. Pesar el vial
nuevamente; el aumento en el peso es de aproximadamente 60 mg (1 L de la solucin obtenida contiene aproximadamente
1,2 g de cloruro de vinilo). Dejar en reposo durante 2 horas; Almacenar la solucin primara en un refrigerador.
Solucin estndar de cloruro de vinilo: Agregar 3 volmenes de N,N-dimetlacetamida a 1 volumen de Solucin primaria
de cloruro de vinilo.
Soluciones de referencia: Colocar 10,0 mL de Solucin de estndar interno en C;'lda uno de seisviale~ de 50ml. Cerrarlos
viales y asegurar los tapones. Inyectar 1; 2; 3; 5 y 1O L, respectivamente, de So/ucin:estndar de Cloruro devinlo en cinco de
los viales. Por consiguente, las seis soluciones obtenidas contenen1respectivamente, 0;.0,3; 0,6; 0,9; 1,5 y 3 g de cloruro de
vinilo.Agitar, evitando el contacto entre el tapn y el lquido. Colocarlos viales en un baodeagua a.601.durante2horas.
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa (621 ), Cromatografa de Gases.)
<:otmna: .Acero inoxidable de 3. m x3. mm rellena con tierra diatomcea silanizada para cromatgrafo de gases.impreg-
nadac:on 5%m/m de dimetilestearilamida y5%m/m depolietilenglicol 400
Gas transportador: Nitrgeno para cromatografa
Velocidad de flujo: 30 ml/min
Temperaturas
Columna: 45
Inyector: 100
C>etector: 150
Anlisis
Muestra: Inyectar 1 mt de la fase gaseosa de cada vial que contiene la Solucin muestra y las Soluciones de.referencia.
Calcular la cantidad de cloruro de vinilo en la ~olucin muestrQ comparando el. resultado de prueba de la Solucin muestra con
los resultados de las Soluciones d refrencia. Calcular la cantidad de cloruro de vinilo en el materia[de prueba dividiendo la
cantidad de cloruro de vinilo eh la Sofucinmuestraporl,0 g, produciendo un resltado en g/g o ppm.
Estndares de Referencia USP (1 l)
ER Butil Hidroxitolueno USP
ER. Polfmerode Olefina Cclica lJSP
ER Copolrnero de OJefna Cclica USP
ERPoHetileno. de Alta Densidad USP
ER Homopolmero de Polipropileno USP
ERPolietileno de Baja Densidad USP
ER Aditivo Plstico 01 USP
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (661.2) Sistemas de Envases Plsticos 541

~:.sist~fflas:Qeei:l.va~$ .~l$:tit;as'.P'~~oS9. ~arffla(;euffolocl~~n; '~~~t:e''atrl;)si 'qQls~s;;tl'~$c~s,'vlatt''am~~JJi:mlllBl!lii

tal~d;es de polvo sec y d dosis;fja, Jeringas preUenadas; bifSteres, oo1s11s. (po1.11:hes)~ as coi:ro s~~, <:;ter~si~~i'ij~i~~
542 (661.2) Sistemas de Envases Plsticos/ Pruebas Fsicas USP 39

o 0000

00 &

mllllllli!ll!lllllll
llll1l,liloll~llJll1llqit
USP 39 Pruebas Fsicas/ (661.2) Sistemas de Envases Plsticos 543

Acidez o alcalinidad: Realizar la prueba de Acidez o alcalinidad nicamente cuando los sistemas de envases estn destinados a
contener un producto lquido o un producto que se disuelva en su envase antes de su uso.
Agregar O, 1 mL de fenolftalena SR a 20 mL de Solucin C1 obtenida ya sea como una porcin de la solucin de llenado o
combinando la solucin de llenado de distintos envases; tener en cuenta el color de la solucin. Agregar 0,4 ml de hidrxido
de sodio 0,01 N; tener en cuenta el color de la solucin. Agregar 0,8 mL de cido clorhdrico 0,01 N y 0, 1 mL de rojo de
metilo SR 2; tener en cuenta el color de la solucin.
Rojo de Metfo SR 2: Prueba de sensibilidad: Agregar 0, 1 mL de solucin de rojo de metilo a 100 mL de Agua Purificada exenta
de dixido de carbono y 0,05 mL de cido clorhdrico 0,02 N. Se requiere no ms de 0, 1 ml de cido clorhdrico 0,02 N para
cambiar el color de rojo a amarillo.

CARBONO ORGNICO TOTAL

Referirse al captulo Carbono Orgnico Total (643).

El contenido de carbono orgnico total (TOC, por sus siglas en ingls) de la Solucin C1 se mide de acuerdo al captulo
(643). Sin embargo, el captulo (643) est diseado para analizar agua de alta pureza con valores bajos de carbono orgnico
total. Debido a las sustancias orgnicas extradas, los extractos de materiales pueden tener valores de carbono orgnico total
mucho ms altos que los del Agua Purificada. Por ende, los anlisis de carbono orgnico total realizados tienen un lmite de
deteccin de 0,2 mg/L (ppm) y tienen un intervalo dinmico lineal demostrado de 0,2-20 mg/L (que abarca el lmite de car-
bono orgnico total). Se puede usar un inteNalo lineal con una concentracin superior ms alta siempre que se establezca la
linealidad. Si los extractos de la muestra exceden este intervalo lineal superior, entonces deben diluirse apropladamente para
su anlisis.

SUBUNIDADES TEREHALOLO TOTALES EN SISTEMAS DE ENVASES DE TEREFTALATO DE POLIETILENO Y DE TEREFTALATO G

DE POUHILENO

Preparaciones
Medios de extraccin de tereftafato de polietileno: Alcohol al 50% (diluir 125 ml de alcohol R deshidratado con Agua Purificada
hasta 238 ml y mezclar), n-heptano y Agua Purificada. Para cada medio de extraccin, llenar un nmero suficiente de sistemas
de envases de prueba hasta el 90% de su capacidad nominal para obtener no menos de 30 ml. Llenar un nmero correspon-
diente de frascos de vidrio con cada medio de extraccin para usarlos como blancos. Equipar los frascos con sellos impermea-
bles tales como papel de aluminio y colocar los cierres. Incubar los sistemas de envases de prueba y los frascos de vidrio a 49
durante 1O das. Retrar los sistemas de prueba y los frascos de vidrio y almacenar a temperatura ambiente. No transferir las
muestras de medio de extraccin a vasos de almacenamiento alternativos.
Medios de extraccin de tereftalato G de polietileno: Alcohol al 25% (diluir 125 ml de alcohol al 50% con Agua Purificada hasta
250 ml y mezclar), n-heptano y Agua Purificada. Proceder segn se indica en Medios de extraccin de tereftalato de polietileno.
Procedimiento: Determinar la absorbancia de los extractos de alcohol al 50% o alcohol al 25% en una celda de 1 cm a la
longitud de onda de absorbancia mxima a aproximadamente 244 nm (ver Espectroscopa Ultravioleta-Visible (857)). Para el
blanco, usar el blanco de medio de extraccin correspondiente.
Determinar la absorbancia del extracto de n-heptano en una celda de 1 cm a la longitud de onda de absorbancia mxima a
aproximadamente 240 nm (ver el captulo (857>). Para el blanco, usar el medio de extraccin de n-heptano.

ETILENGLICOL EN SISTEMAS DE ENVASES DE TEREFTALATO DE POLIETILENO Y DE TEREFTALATO G DE POLIETILENO

Preparaciones
Solucin de cido perydico: Disolver 125 mg de cido perydico en 1 O ml de Agua Purificada.
cido sulfrico diluido: Agregar lentamente y mezclando constantemente 50 ml de cido sulfrico a 50 ml de Agua Purifica-
da y dejar que se enfre a temperatura ambiente.
Solucin de bisulfito de sodio: Disolver O, 1 g de bisulfito de sodio en 1O ml de agua. Usar esta solucin dentro de los 7 das.
Solucin de cromotropato disdico: Disolver l 00 mg la sal disdica del cido cromotrpico R en 100 ml de cido sulfrico.
Proteger esta solucin de la luz y usar dentro de los 7 das.
Solucin estndar: Disolver una cantidad pesada con exactitud de etilengJicol en Agua Purificada y diluir cuantitativamente y
en diluciones sucesivas si fuera necesario hasta obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente 1
g/mL.
Solucin muestra: Usar el extracto de Agua Purificada de Subunidades Tereftafoflo Totales en Sistemas de Envases de Tereftalato
de Poletileno y de Tereftalato G de Polietleno.
Procedimiento: Transferir 1,0 mL de Sofucin estndar a un matraz volumtrico de 10 ml. Transferir 1,0 ml de Solucin mues-
tra a un segundo matraz volumtrico de 1O mL. Transferir 1,O ml de medio de extraccin de Agua Purificada a un tercer ma-
traz volumtrico de 1O ml que siNa como blanco del mtodo. Agregar 100 L de Solucin de cido perydico a cada uno de los
tres matraces, agitar por rotacin suave hasta mezclar y dejar en reposo durante 60 minutos. Agregar 1,0 ml de Solucin de
bsu/fto de sodio a cada matraz y mezclar. Agregar 100 L de Solucin de cromotropato dsdico a cada matraz y mezclar.
544 (661.2) Sistemas de Envases Plsticos/ Pruebas Fsicas USP 39

[NOTA-Todas las soluciones deben analizarse dentro de la primera hora posterior a la adicin de la Solucin de cramotropato
dsdico.] Agregar cuidadosamente 6 mL de cido sulfrico a cada matraz, mezclar y dejar que las soluciones se enfren a tem-
peratura ambiente.
PRECAUCIN-La dilucin del cido sulfrico produce calor significativo y puede ocasionar que Ja solucin hierva. Realizar dicha
adicin con cuidado. Se emitirn gases de dixido de azufre. Se recomienda usar una campana de extraccin.
Diluir cada solucin con cido sulfrico diluido a volumen y mezclar. Determinar concomitantemente las absorbancias de las
soluciones a partir de fa Solucin estndar y de la Solucin muestra en celdas de 1 cm a la longitud de onda de absorbancia
mxima a aproximadamente 5 75 nm (ver el captulo {85 7}), usando como blanco del mtodo el medio la solucin de extrac-
cin de Agua Purificada.

Evaluacin de Seguridad Qumica

Se debe establecer la seguridad del sistema de envase con fundamento en el anlisis qumico relevante y apropiado 1) del
sistema de envase, 2) de sus materiales de construccin, 3) de sus componentes de construccin, segn corresponda, o 4) del
medicamento envasado. El anlisis qumico apropiado de materiales de construccin se especifica en el captulo (661.1} y pue-
de incluir la demostracin de cumplimiento con las secciones apropiadas de las reglamentaciones del Ttulo 21 del CFRsobre
Aditivos Alimentarios Indirectos (lndirect Food Additives). Con respecto al anlsis del sistema de envase (y/o sus componentes
de construccin segn corresponda) y al medicamento envasado, una evaluacin de seguridad qumica rigurosa incluira el
anlisis de sustancias extrables del sistema de envase y el anlsis de Jixiviab1es del medicamento envasado. Se espera que el
diseo del estudio de sustancias exttables y lixiviables se base en principios cientficos rigurosos y justificables, y que los estu-
dios mismos sean uniformes con respecto a 1) la naturaleza del sistema de envase y del medicamento envasado, 2) al uso clni-
co del medicamento envasado y 3) al riesgo de seguridad percibido, asociado con el sistema de envase y la forma farmacuti-
ca. Aunque ninguna forma farmacutica est exenta de este requisito de anlisis, se anticipa que el carcter y el grado .del
anlisis dependeran de la forma farmacutica y sera congruente con un enfoque basado en riesgos. En vista de la considera-
ble diversidad de los sistemas de envases, de las formas farmacuticas y de los medicamentos envasados, no es posible proveer
condiciones de prueba especficas para realizar los estudios de sustancias extrables y lixiviables. Sin embargo, se pueden en-
contrar principios bsicos generales y recomendaciones sobre las mejores prcticas demostradas para estudios de sustancias
extrables y lixiviables en los captulos Evaluacin de Sustancias Extralbles Relacionadas con Envases Farmacuticos y Sistemas de
Administracin (1663) y Evaluacin de Sustancias Lixiviables en Medir:;amentos Relpcionadas con Envases farmar:;uticos y Sistemas
de Administracin {1664), respectivamente. Estos captulos pueden servir como recursos tiles para el diseo y la justificacin
de estudios rigurosos y apropiados.
Pueden ser apropiadas estrategias alternativas de anlisis para la evaluacin cie seguridac:f. qumica en circu.nstancias justifica-
das, las cuales estn sujetas a un convenio con la autoridad reglamentaria .apropiada.

ESPECIFICACIONES
Reactividad Biolgica
Los resultados de la prueba son consistentes con los captulos pertinentes ((87) u (88)).

Pn.1ebas Fisicoqumicas
Apariencia de la solucin: La Solucin C1 es transparente e incolora.
Absorbancia: No ms de 0,20
Acidez o alcalinidad: La solucin es incolora despus de la adicin de solucin de fenolftalena, rosada despus de la adicin
de hidrxido de sodio 0,01 N y roja anaranjada o roja despus de la adicin de cido clorhdrico 0,01 N y de O, 1 mL de solu-
cin de rojo de metilo.
Contenido orgnico total: La diferencia en las concentraciones de carbono orgnico total entre la Solucin C1 y el blanco
adecuado es no ms de 8 mg/L
Etilenglicol en sistemas de envases de tereftalato de polietileno y de tereftalato G de polietileno: La absorbancia de la
solucin a partir de la Solucin muestra no excede la de la solucin a partir de la Solucin estndar, correspondiente a n ms
de 1 ppm de etilenglicol.
Subunidades tereftalolo totales en sistemas de envases de tereftalato de polietileno y de tereftalato G de polietileno:
La absorbancia de los extractos de alcohol al 50%, del alcohol al 25% y de n,heptano no exceden de O, 150, correspondiente a
no ms de 1 ppm de subunidades tereftalolo totales.

Evaluacin de Seguridad Qumica

Los datos y la informacin obtenida en la Evaluacin de Seguridad Qumica deben interpretarse en el contexto de establecer
los riesgos para la seguridad del paciente relacionados con el uso del sistema de envase y la administracin del medicamento
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 545

(670) ENVASES-COMPONENTES AUXILIARES

Los componentes auxiliares de los envases son artculos que se usan para respaldar o mejorar los sistemas de envase-cierre.
Estos artculos incluyen, entre otros, torunda farmacutica (pharmaceutical coil) lli&lliEM''.1111 para envases. Los compo-
nentes que se describen en este captulo deben cumplir con los requisitos aplicables aqu provistos y los requisitos aplicables
adicionales provistos en otros captulos especificados.

TORUNDA FARMACUTICA

La torunda farmacutica se usa como material de relleno en envases de unidades mltiples para formas farmacuticas slidas
orales a fin de evitar la ruptura de tabletas o cpsulas durante el transporte. El material de relleno se debe desechar una vez
que se ha abierto el frasco.

Soluciones

Solucin yodada de cloruro de cinc: Disolver 20 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua
purificada. Agregar 0,5 g de yodo y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Proteger de la luz.
Solucin de cloruro de cinc-cido frmico: Disolver 20 g de cloruro de cinc en 80 g de una solucin de 850 g/L de cido
frmico anhidro.
Solucin al 1% de colorante N 4 para identificacin de fibras DuPont 1: Disolver 3,8 g de colorante en polvo en 378,5
mL de agua desionizada.

Torunda Farmacutica de Algodn

El algodn purificado es el pelo de la semilla de las variedades cultivadas de Gossypium hirsutum L. u otras especies de Gossy-
pium (Fam. Malvaceae). Se elimina la materia grasa y se blanquea, y no contiene ms que trazas de residuo de hojas, pericar-
pio, recubrimiento de la semilla u otras impurezas. La torunda farmacutica de algodn se usa en frascos de formas farmacu-
ticas slidas orales para evitar la ruptura.

1 El Colorante N 4 para Identificacin de Fibras DuPont est disponible en Pylam Products Co., 2175 East Cedar Street, Tempe, AZ. 85281: www.pylamdyes.com.
546 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Fsicas USP 39

IDENTIFICACIN

A: Cuando se examinan al microscopio, se observa que cada fibra consiste en una clula individual, de hasta aproximada-
mente 4 cm de longitud y 40 m de ancho, en forma de un tubo aplanado con paredes gruesas y redondeadas que estn a
menudo retorcidas.
B: Cuando se tratan con Solucin yodada de cloruro de cinc, las fibras se tornan de color violeta.
C: Agregar 1 O mL de Solucin de cloruro de cinc-cido frmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40 y dejar en reposo durante 2
horas, agitando ocasionalmente: las fibras no se disuelven.
D: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar las fibras a 100 mL de Solucin
al 7% de colorante N 4 para identificacin de fibras DuPont en ebullicin y calentar a ebullicin suave durante al menos 1 minu-
to. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fra y exprimir el exceso de lquido: las fibras se tornan de color verde.

ACIDEZ O ALCALINIDAD

Sumergir aproximadamente 1 Og de fibras en 100 mL de agua purificada recientemente calentada a ebullicin y enfriada, y
dejar que se macere durante 2 horas. Decantar en dos cpsulas sendas porciones de 25 mL del agua con ayuda de una varilla
de vidrio. Agregar a una porcin 3 gotas de fenolftalena SR y agregar a la otra porcin 1 gota de anaranjado de metilo SR.
Ninguna porcin se presenta de color rosa cuando se observa contra un fondo blanco.

FLUORESCENCIA

Examinar una capa de aproximadamente 5 mm de espesor bajo luz UV a 365 nm. Presenta solamente una ligera fluorescen-
cia de color violeta amarronado y unas pocas partculas de color amarillo. No presenta una fluorescencia de color azul intenso,
excepto por la que pueden presentar unas pocas fibras aisladas.

CONCENTRACIN DE PERXIDO DE HIDRGENO RESIDUAL

Colocar 1 g de fibras en un vaso de precipitados que contenga 30 mL de agua purificada y mezclar durante 3 minutos con
una varilla de vidrio. Verter el contenido en otro recipiente limpio (no exprimir la muestra), o como alternativa, retirar las fibras
de la solucin con tenacillas limpias. Retirar una tira de prueba analtica de perxido 2 de su envase y sumergir el extremo de
prueba en el lquido de muestra durante 2 segundos. Agitar para eliminar el exceso de lquido, insertar inmediatamente la tira
de prueba en un instrumento de reflectometra adecuado y registrar la lectura en mg/kg (ppm), y calcular la concentracin de
perxido de hidrgeno residual en ppm.
Como mtodo alternativo, colocar 20 g en un vaso de precipitados, agregar 400 mL de agua purificada, mezclar, agregar 20
mL de cido sulfrico al 20% y mezclar el contenido. Valorar con solucin de permanganato de potasio O, 100 N hasta un
color rosado plido que permanezca durante 30 segundos. Registrar la cantidad de contenido y calcular la concentracin en
ppm.
Se encuentra no ms de 50 ppm usando cualquiera de los mtodos.
Prdida por Secado (731)
Anlisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105 hasta peso constante.
Criterios de aceptacin: No ms de 8,0%
Residuo de Incineracin (281)
Anlisis: Colocar 5 g de fibras en una cpsula de porcelana o platino y humedecer con cido sulfrico 2 N. Calentar suave-
mente el algodn hasta que se carbonice, luego incinerar con mayor intensidad hasta que el carbono se haya consumido com-
pletamente.
Criterios de aceptacin: No ms de 0,20%

SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA

Colocar 1 Og de fibras en un vaso de precipitados que contenga 1000 mL de agua purificada y calentar a ebullicin suave
durante 30 minutos, agregando agua segn se requiera para mantener el volumen. Verter el agua a travs de un embudo en
otro vaso y exprimir el exceso de agua del algodn con una varilla de vidrio. Lavar el algodn en el embudo con dos porciones
de 250 mL de agua en ebullicin, presionando el algodn despus de cada lavado. Filtrar el extracto y los lavados combinados
y lavar el filtro minuciosamente con agua caliente. Evaporar el extracto y los lavados combinados hasta un volumen pequeo,
transferir a una cpsula de porcelana o platino tarada, evaporar hasta sequedad, y secar el residuo a 105 hasta peso constan-
te. El residuo pesa no ms de 0,35%.

2Un sistema de anlisis adecuado que consiste en tiras de prueba de perxido Reflectoquant y un instrumento de reflectometra RQflex se puede obtener de
EMD Chemicals lnc., 480 S. Democrat Road, Gibbstown, NJ 08027: www.emdchemicals.com.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 547

MATERIA GRASA

Compactar 1 Og de fibras en un extractor Soxhlet equipado con un receptor tarado y extraer con ter etlico durante 4 horas
a una velocidad tal que permita que el ter se descargue por sifn no menos de 4 veces por hora. La solucin de ter etlico en
el matraz no presenta trazas de color azul, verde o marrn. Evaporar el extracto hasta sequedad y secar a 105 durante 1 hora.
El peso del residuo no excede de 0,7%.

COLORANTES

Compactar aproximadamente 1 Og de fibras en un percolador estrecho y extraer lentamente con alcohol hasta que el perco-
lado alcance 50 mL. Cuando se observa hacia abajo a travs de una columna de 20 cm de profundidad, el percolado puede
presentar un color amarillento, pero no una coloracin azul o verde.

OTRA MATERIA EXTRAA

Al inspeccionar visualmente los pequeos trozos de algodn no contienen manchas de aceite o partculas metlicas.

Torunda Farmacutica de Rayn

La torunda farmacutica de rayn es una forma fibrosa de celulosa regenerada blanqueada que se usa como relleno en fras-
cos de formas farmacuticas slidas orales para evitar la ruptura. Consiste exclusivamente en fibras de rayn excepto por unas
pocas fibras extraas aisladas que pueden estar presentes.
[NOTA-Se ha demostrado que la torunda farmacutica de rayn es una fuente potencial de problemas de disolucin para
cpsulas de gelatina o tabletas recubiertas de gelatina que resultan del entrecruzamiento de la gelatina.]

IDENTIFICACIN

A: Cuando se tratan con Solucin yodada de cloruro de cinc, las fibras se tornan de color violeta.
B: Agregar 1 O mL de Solucin de cloruro de cinc-cido frmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40 y dejar en reposo durante 2
horas, agitando ocasionalmente: las fibras se disuelven por completo, excepto por las fibras de rayn mate en las que perma-
necen partculas de titanio.
C: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solucin al
7% de colorante N 4 para identificacin de fibras DuPont en ebullicin y calentar a ebullicin suave durante al menos 1 minuto.
Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fra y exprimir el exceso de lquido: las fibras se tornan de color verde azulado.
Acidez o Alcalinidad, Fluorescencia, Materia Grasa, Colorantes y Otra Materia Extraa: Proceder segn se indica en To-
runda Farmacutica de Algodn, excepto que se debe usar torunda farmacutica de rayn. El peso de la muestra para materia
grasa es 5 g y el peso del residuo no excede de 0,5%.
Prdida por Secado (731)
Anlisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105 hasta peso constante.
Criterios de aceptacin: No ms de 11,0%
Residuo de Incineracin (281 ): No ms de 1,50%, determinado en una muestra de prueba de 5 g
Cenizas Insolubles en cido: Agregar 25 mL de cido clorhdrico 3 N al residuo obtenido en la prueba de Residuo de Incine-
racin y calentar a ebullicin durante 5 minutos. Recoger la materia insoluble en un crisol de filtracin tarado, lavar con agua
caliente, incinerar, y pesar: el residuo pesa no ms de 1,25%.
Sustancias Solubles en Agua: Proceder segn se indica en Torunda Farmacutica de Algodn, excepto que se debe usar to-
runda farmacutica de rayn. El residuo pesa no ms de 1,0%.

Torunda Farmacutica de Polister

La torunda farmacutica de polister es un material blanco e inodoro que se usa como relleno en frascos de formas farma-
cuticas slidas orales para evitar la ruptura.

IDENTIFICACIN

A: Proceder segn se indica en Espectroscopa Infrarroja en la seccin de Mtodos de Prueba. Determinar el espectro IR de
4000 a 650 cm- 1 (2,5-15 m). El espectro obtenido de la muestra presenta bandas de absorcin principales solo a las mismas
longitudes de onda que el espectro de ER Tereftalato de Polietileno USP.
B: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solucin al
7% de colorante N 4 para identificacin de fibras DuPont en ebullicin y calentar a ebullicin suave durante al menos 1 minuto.
Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fra, y exprimir el exceso de lquido: las fibras se tornan de color anaranjado plido.
548 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Fsicas USP 39

Acidez o Alcalinidad: Proceder segn se indica en Torunda Farmacutica de Algodn, excepto que se debe usar torunda far-
macutica de polister.
Prdida por Secado (731)
Anlisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105 hasta peso constante.
Criterios de aceptacin: No ms de 1,0%
Residuo de Incineracin (281 ): No ms de 0,5%, determinado en una muestra de prueba de 5 g
Acabado sobre Fibras: El acabado sobre las fibras usado para el procesamiento debe cumplir con los reglamentos de la FDA
para el contacto con alimentos.

Mtodos de Prueba
ESPECTROSCOPA INFRARROJA3

Aparato: FTIR o un espectrofotmetro de doble haz capaz de barrer de 4000 a 650 cm- 1 (2,5-15 m).
Preparacin de la Muestra
Mtodo 1 (disco de bromuro de potasio): Usar tijeras para cortar las fibras de polister (1-3 mg) en longitudes cortas
(menos de 1 mm de longitud), mezclar con 200 mg de bromuro de potasio en polvo y moler en un molino de bolas durante
1-2 minutos. Transferir a una matriz para discos de bromuro de potasio y formar un disco.
Mtodo 2 (pelcula fundida): Generar una pelcula presionando fibras de polister entre lminas de TFE-fluorocarbono y
colocar entre placas calientes.

3 Se puede encontrar informacin adicional sobre mtodos de identificacin para fibras en "Standard Test Methods for ldentification of Fibers in Textiles" (Mto-
dos de Prueba Estndar para Identificacin de Fibras en Textiles). Versin actual del Mtodo 0276 de ASTM, publicada por ASTM lnternational, 100 Barr Harbor
Orive, P.O. Box C700, West Conchohocken, PA 19428-2959. www.astm.org.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 549

MTODOS DE PRUEBA

Identificacin-Difraccin de Rayos X
Preparacin muestra A: Agregar 2 g en pequeas porciones a 100 ml de agua, agitando intensamente. Dejar en reposo
durante 12 horas para asegurar una hidratacin completa. Colocar 2 ml de la muestra as obtenida en un portaobjetos de
vidrio adecuado y dejar que se seque al aire a temperatura ambiente para producir una pelcula orientada. Colocar el portaob-
jetos en un desecador de vaco sobre una superficie libre de etilenglicol. Aplicar vaco al desecador y cerrar la llave de paso de
modo que el etilenglicoJ sature la cmara del desecador. Dejar el portaobjetos en reposo durante 12 horas.
Preparacin muestra B: Preparar una muestra aleatoria de polvo.
Anlisis: Preparacin muestra A y Preparacin muestra B. Registrar el patrn de difraccin de rayos X de las muestras y de-
terminar los valores d.
Identificacin-Precipitacin
Muestra: 5 g
Anlisis: Agregar 1 g de nitrato de potasio y 3 g de carbonato de sodio anhidro a la Muestra contenida en un crisol de
metal, calentar hasta que la mezcla funda y dejar que se enfre. Agregar al residuo 20 mL de agua en ebullicin, mezclar, .filtrar
y lavar el residuo con 50 ml de agua. Agregar al residuo l ml de cido clorhdrico y 5 ml de agua, y filtrar. Agregar al filtrado
1 ml de hidrxido de sodio 1O N, filtrar y agregar 3 ml de cloruro de amonio 2 M.
Arsnico
Solucin muestra: Transferir 8,0 g de muestra seca a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga 100 ml de cido
clorhdrico diluido (1 en 25), mezclar y cubrir con un vidrio de reloj. Calentar a ebullicin suave, mezclando ocasionalmente,
durante 15 minutos evitando la formacin excesiva de espuma. Pasr el sobrenadante lquido caliente a travs de un papel de
filtro de flujo rpido a un matraz volumtrico de 200 rnl y lavar el filtro con cuatro porciones de 25 mL de cido clorhdrico
diluido (1 en 25) caliente, recogiendo los lavados en el matraz volumtrico. Enfriar los filtrados combinados a temperatura am~
biente, agregar cido clorhdrico diluido (1 en 25) a volumen y mezclar.
Solucin madre de trixido de arsnico: Pesar con exactitud 132,0 mg de trixido de arsnico, previamente secados a
105 durante 1 hora, y disolver en 5 mL de solucin de hidrxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumtrico de 1000 ml.
Neutralizar la solucin con cido sulfrico 2 N, agregar 10 ml adicionales de cido sulfrico 2 N y llevar a volumen con agua
recientemente calentada a ebullicin y enfriada, y mezclar.
Solucin estndar de arsnico: Diluir Solucin madre de trixido de arsnico hasta obtener soluciones con concentraciones
adecuadas, adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento. Mantener en un recipiente que sea totalmente de vd:rio
y usar dentro de los 3 das.
Anlisis: Proceder segn se indica en Impurezas Elementales-Procedimientos (233).
Plomo
Solucin muestra: Transferir 3,75 g de muestra a un vaso de precipitados de 250 mL que contenga 100 .mL de cido
clorhdrico diluido (1 en 25), mezclar y cubrir con un vidrio de reloj. Calentar a ebullicin durante 15 minutos, luego enfriaJ a
temperatura ambiente y pasar a travs de un papel de filtro de flujo rpido a un vaso de precipitados de 400 ml. Lava.r el filtro
con cuatro porciones de 25 ml de agua caliente, recogiendo los lavados .en el vaso de precipitados de 400 ml. Concentrar los
extractos combinados, calentando a ebullicin suave, hasta aproximadamente 20 ml. Si .se forma precipitado, agregar 2-
3 gotas de cido ntrico, calentar a ebullicin y enfriar a temperatura ambiente. Pasar los extractos concentrados a trav~s de (ln
papel de filtro de flujo rpido a un matraz volumtrico de 50 mL. Transferir el contenido remanente del vaso de precipitadQs
de 400 mL a travs del papel de filtro al matraz con agua. Diluir con agua a volumen.
Solucin madre de nitrato de plomo: Disolver 159,8 mg de nitrato de plomo en 100 ml de agua, a la que se ha i}grega-
do 1 ml de cido ntrico, luego diluir con agua hasta 1000 ml. Preparar y alm.acenar esta solucin en recipientes dev.idrio
libres de sales de plomo solubles.
Solucin estndar de plomo: En el da de su uso, diluir Solucin mac/re de nitrato de plomo hasta obtener soluciones .con
concentraciones adecuadas, adaptables al .intervalo lineal o de trabajo del instrumento.
Anlisis: Proceder segn se indica en Impurezas Elementales-Procedimientos (233).
Capacidad de Adsorcin de Humedad
Equipo: Cmaras de humedad y temperatura capaces de mantener una humedad controlada de 40% 5% HR y 80%
5% HR a 25 2 o un desecador que contenga sales saturadas con agua que provea un %HR al nivel requerido y un horno
capaz de mantener una temperatura de 25 2.
Mtodo: 5~1Og. Retirar la muestra del material de envasado. Cuando los adsorbentes se incorporan directamente en la
pared o tapa de los envases usar un desecante no incorporado. Agregar la muestra a la cmara de humedad o al desecador y
medir la ganancia de peso hasta que se alcance el equilibrio cuando dos pesadas sucesivas consecutivas no difieran en ms de
3 mg/g de sustancia tomada y la segunda pesada se realiza despus de un periodo adicional de 31 horas de almacenamien-
to en las condiciones requeridas de temperatura y humedad. Calcular la capacidad de adsorcin como% de la ganancia de
peso en relacin con el peso inicial de la muestra. Cuando se empaca una combinacin de dos adsorbentes, fa especificacin
de capacidad de adsorcin de humedad debe calcularse en proporcin a la mezcla. Por ejemplo, para una mezcla de 60% de
tamiz molecular y 40% de gel de slice, la capacidad de adsorcin de humedad sera no menos de 16,6% (9,0% + 7,6%) cuan-
do las condiciones de prueba son 40% 5% HR y 25 2 y las capacidades de adsorcin de humedad se toman con respecto
a las especificaciones mnimas.
550 (670) Envases-Componentes Auxiliares / Pruebas Fsicas USP 39
USP 39 Pruebas Fsicas/ <670) Envases-Componentes Auxiliares 551

agua helada. Agregar 15 mL de citrato de sodio 1 M y 1 O rr\L de EDTA disdico 0,2 M1 y mezclar. Ajustar el pH a 5,5 01 lcon
cido clorhdrico 1 N o hidrxido de sodio 1 N, si fuera necesario. Transferir a un matraz vqlumtrico de 100 mL, diluir con
agua a volumen y mezclar. Transferir una porcin de 50 mL de esta solucin a .unv.aso de precipitados de plstico de 125 mL
y medir el potencial de la solucin usando el aparato descrito en Curva de calibradon. Determinare! contenido de floruro, en
g, en la muestra, a partir de la Curva de calibracin. Determinar el porcentaje de fluoruro en la muestra tomada:
Resultado = (C/WS) x 0,000001 x l 00%
en la que Ces el contenidodefluoruro, en g, en la muestra1 determinado a partir de .la Curva de calibraciqn; W.S es el peso de
la muestra, en g;y 0,000001es el factor de conversin de g a gramos.
Plomo
Solucin muestra: 1 gen 20 mL
Soluciones Madre y Estndar: Proceder segn se indica en Bentonita.
Anlisis: Proceder segn se indica en Bentonita.
Magnesio y Sales Alcalinas
Muestra: 1 g
Anlisis: Disolver la Muestra en 50 mL de agua, agregar 500 mg de cloruro qe.amonio, mezclar y calentar a ebullicin
durante l minuto. Agregar rpidamente 40 mL cido oxlico SR y mezclar.vigorosamente hasta completar' la preeipitadn.
Agregar de inmediato 2 gotas de rojo de metilo SR. Luego agregar hidrxido de amonio 6 N, gota a gota, hasta que la metda
se torne alcalina y enfriar. Transferir la mezcla a una probeta graduada de 100 mL, diluir con agua hastalOO mLYdejar.en
reposo durante A horas o durante toda la noche....Decantar el lquido sobrenadante transparente a travs de un papeldefltro
seco y transferir 50 mL del filtrado transparente a una cpsula de platino; Agrega.r 0,5mL de cido sulfrieo a.Ja. cpsula y
evaporar la mezcla en un bao de vapor hasta un volumen pequeo. Evaporar cuidadosamente elliquidoretnanente hasti;i
sequedad sobre una llama directa y :ontinuar calentando hasta completar la descotnposici<Sn yvQ~atUlzacin de.las sales de
amonio. Finalmente, incinerar el residuo hasta peso constante.
Capacidad de Adsorcin de Humedad
Anlisis: Proceder segn se ndica en Bentonita.

xido.deCalcio

Identificacin-Calcio: Cumple con las pruebas.

Valoracin: No menos de 95,0% y no ms de 100,5% de CaO, con respecto a la sustam:ia incinerada
Impurezas Inorgnicas
Sustancias insolubles en cido: No ms de 1%
Arsnico: No ms de 3 ppm
Fluoruro: No ms de 0,015%
Plomo: No ms d 2 mg/kg
Magnesioy sales alcalinas; No ms de 3,6%
Pruebas Especficas
Prdida por incineracin: No ms de 10,0%
Capacidad de Adsorcin de Humedad: No menos de 28% a 80% 5% HR y 25 :1:2

MTODOS DE PRUEBA

Identificacin-Calcio
Solucin muestra: Agitar 1 g de muestra con 20 mL de agua y agregar cido actico glacial hasta que la muestra se
disuelva.
Anlisis: Proceder segn se indica en.Cloruro de CalcioAnhdro.
Valoracin
Muestra: 1 g de muestra incinerada hasta peso constante (ver :>erdida por Incineracin a continuacin.)
Anlisis: Disolver la Muestra en 20 mL de cido clorhdrico 2,7 N. Enfriar la solucin, diluir con agua hasta 500,0 mLy
mezclar. Pipetear y transferir 50,0 mL de esta solucin a un recipiente adecuado y agregar 50 m[ de agua. Mientras se mezcla,
preferiblemente con un agitador magntico, agregar aproximadamente 30 mL de EDTA disdco 0,05 M desde una bureta de
50 ml. Luego, agregar 15 mL de hidrxido de sodio 1N y 300 mg de indicador azul de hidroxinaftol. Continuar la valoracin
volumtrica conEDTA disdico hasta un punto final azul. Cada mL de EDTA disdico 0,05 M equivale a 2,804 mg de CaO.
Arsnico
Solucin muestra: 1 g en 15 mL de cido dorhd rico 2, 7 N
Soluciones Madre y Estndar: Proceder segn se indica en Bentonta.
Anlisis: Proceder segn se indica en Bentonita.
Fluoruro
Muestra: 1,0 g
Anlisis: Proceder segn se indica en Cloruro de Calcio Anhidro.
552 (670) Envases-Componentes Auxiliares / Pruebas Fsicas USP 39

lllllllil1Jlllilllll
USP 39 Pruebas Fsicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 553
554 (670) Envases-Componentes Auxiliares / Pruebas Fsicas USP 39

(671) ENVASES-PRUEBAS DE DESEMPEO

INTRODUCCIN

El propsito de este captulo es proporcionar normas para las propiedades funcionales de los sistemas de envases que se
usan para formas farmacuticas orales slidas y lquidas para medicamentos y suplementos dietticos. Las definiciones aplica-
bles a este captulo se encuentran en el captulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659). Las siguientes pruebas sirven
para determinar la velocidad de transmisin de vapor de agua (velocidad de permeabilidad al vapor de agua) y la transmisin
espectral de los envases de plstico.
Los mtodos de prueba para medir las velocidades de transmisin de vapor de agua que se detallan en este captulo pueden
ser tiles para los fabricantes de medicamentos y de suplementos dietticos para determinar el nivel de proteccin provisto por
los sistemas de envases de formas farmacuticas orales slidas. Adems, se proveen mtodos adicionales para determinar la
clasificacin de sistemas de envases para formas farmacuticas orales slidas y lquidas que se reenvasan en envases unitarios y
envases de unidades mltiples (Tabla 7), ya sea por organizaciones o por farmacuticos al momento de la dispensacin de
acuerdo con lo indicado en la receta mdica. Pueden existir otros sistemas de envases a los que podran aplicarse los mtodos
de prueba de esta seccin; sin embargo, se debe describir cualquier tipo de desviacin. Si se usan otros mtodos para medir la
velocidad de transmisin de vapor de agua, deben describirse con suficiente detalle para justificar su uso.
Tabla 1. Mtodos de Prueba de Transmisin de Vapor de Agua en Sistemas de Envases
Formas Farmacuticas Formas Farmacuticas
Orales Slidas Orales Lquidas
Clasificacin para En- Clasificacin para Envases de Uni-
Determinacin del Nivel de Clasificacin para Envases vases Unitarios y En- ~ades Mltiples y Envase de Dosis
Ttulo de la Seccin Barrera de Proteccin de Unidades Mltiples vase de Dosis nica Unica
Envases de unidades mlti- Envases de unidades mlti-
ples con sello intacto o da- ples con cierre aplicado y Envases unitarios y de
ado y envases unitarios y sello en estado intacto o dosis nica en esta- Envases de unidades mltiples y
Aplicacin de dosis nica daado do sellado unitarios
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (671 >Envases-Pruebas de Desempeo 555

Tabla 1. Mtodos de Prueba de Transmisin de Vapor de Agua en Sistemas de Envases (Continuacin)

Formas Farmacuticas Formas Farmacuticas
Orales Slidas Orales Lquidas
Fabricantes Fabricantes Fabricantes
Envasadores Envasadores Envasadores
Reenvasadores Reenvasadores Reenvasadores
Usuarios Fabricantes Farmacias Farmacias Farmacias

Definiciones
Blster-Domo de plstico o laminado, moldeado, tapado y sellado que contiene la cpsula o la tableta (por lo general,
en un envase unitario o de dosis nica).
Blster de barrera baja-Blsteres hechos con materiales de baja proteccin (a la humedad), moldeados y sellados de tal
manera que la velocidad de transmisin de vapor de agua al analizarla a 40/75% de humedad relativa (HR) sea mayor de
1,0 mg/cavidad-da.
Blster de barrera alta-Blsteres hechos con materiales de alta proteccin (a la humedad), moldeados y sellados de tal
manera que la velocidad de transmisin de vapor de agua al analizarla a 40/75% de humedad relativa sea menor de 1,0
mg/cavidad-da.
Blster de barrera ultra alta-Blsteres hechos con materiales de ultra alta proteccin (a la humedad), moldeados y sella-
dos de tal manera que la velocidad de transmisin de vapor de agua al analizarla a 40/75% de humedad relativa sea
menor de 0,01 mg/cavidad-da.
Tira de blsteres-Grupo contiguo de blsteres moldeados y sellados con una tapa. El nmero de blsteres por tira por lo
regular va de uno a diez, pero puede tener un nmero mayor. En ocasiones, se puede hacer referencia a la tira de blsteres
como un sistema de envase.
Cavidad o burbuja-Domo de plstico o laminado, moldeado, tapado y sellado (ver Blster).
Velocidad de transmisin de vapor de agua-Es la transmisin de vapor de agua por unidad de tiempo a travs de un
sistema de envase, en estado estacionario y en condiciones especficas de temperatura y humedad. Estos mtodos de
prueba emplean medicin gravimtrica para determinar la velocidad de ganancia en peso como resultado de la transmi-
sin de vapor de agua hacia el interior del sistema de envase y la captacin subsiguiente mediante un desecante dentro
del sistema de envase.
Muestra de prueba (o muestra)-Para envases de unidades mltiples, el frasco es la muestra de prueba; mientras que
para envases unitarios o de dosis nica, la tira de blster que contiene mltiples cavidades es la muestra de prueba. Cuan-
do se prueban blsteres, se pueden agrupar varias tiras (es decir, varias muestras) en una unidad de prueba para realizar la
prueba.
Unidad de prueba-Para envases de unidades mltiples, el frasco es tanto la unidad de prueba como la muestra de prue-
ba, y para envases unitarios o monodosis, la unidad de prueba es un grupo de muestras de prueba (tiras de blsteres) que
se procesan juntas para medir su exposicin a la temperatura y humedad y para pesarlas en cada tiempo de muestreo. El
propsito de la unidad de prueba para envases unitarios o monodosis es sacar ventaja de la ganancia de peso aditiva que
resulta de una mayor cantidad de cavidades que las presentes en una sola tira. Cuando se habla de la unidad de prueba,
en el caso de los frascos, se hace para mantener la congruencia en la denominacin de los tres mtodos de prueba.

TRANSMISIN DE VAPOR DE AGUA

Determinacin de la Barrera de Proteccin para Sistemas de Envases para Formas Farmacuticas

Orales Slidas
Esta seccin describe los mtodos de prueba de transmisin de vapor de agua para envases de unidades mltiples (Mtodo
7), envase unitarios y de dosis nica de alta barrera (Mtodo 2) y envases unitarios y de dosis nica de baja barrera (Mtodo 3)
usados por los fabricantes de formas farmacuticas orales slidas. El propsito de este mtodo es obtener velocidades de trans-
misin de vapor de agua confiables y especficas que se puedan usar para diferenciar entre el desempeo de la barrera de los
sistemas de envases usados para artculos reglamentados; el mtodo se basa en el mtodo ASTM 07709.1
Este mtodo presenta las siguientes caractersticas:
a. Informa un valor de transmisin de vapor de agua especfico para un envase en lugar de una clasificacin
b. Provee sensibilidad y precisin suficientes para permitir diferenciar el desempeo de la barrera entre los envases
c. Las condiciones de uso para analizar estos sistemas de envases son las mismas que las usadas para el anlisis de estabilidad
acelerado del envase primario de artculos reglamentados (por lo regular, humedad relativa de 75% a 40).

1 ASTM D7709. Standard Test Methods for Measuring Water Vapor Transmission Rate (WVTR) of Pharmaceutical Bottles and Blisters published by ASTM lnterna-
tional, 100 Barr Harbar Drive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.
556 (671) Envases-Pruebas de Desempeo/ Pruebas Fsicas USP 39

EQUIPO

Se debe contar con los siguientes elementos:

Una balanza de capacidad suficiente para pesar las muestras de prueba durante todo el periodo de la prueba (ver Pesada
en una Balanza Analtica (1251 )). La balanza debe tener una sensibilidad adecuada para detectar las pequeas diferencias
de peso que se producen entre tiempos de anlisis consecutivos. La incertidumbre de la pesada deber ser menor que el
5% de la ganancia en peso de un tiempo de muestreo al siguiente. La incertidumbre de la pesada es por lo regular tres
veces la resolucin/sensibilidad de la balanza. Por ejemplo, una balanza con una resolucin de O, 1 mg es aceptable para
sistemas de envases cuya ganancia en peso por intervalo de tiempo sea mayor o igual a 6 mg [(O, l x 3)/5%], que es 60
veces la sensibilidad de la balanza.
Una cmara capaz de mantener una temperatura de 40 2 y una humedad relativa de 75 5%.

DESECANTE

Mtodo 1: El desecante es cloruro de calcio anhidro en forma de grnulos. Pueden resultar adecuados otros desecantes, tales
como el tamiz molecular o el gel de slice. Si se usa cloruro de calcio anhidro, presecar a 215 5 durante 71/4 1/4 horas para
asegurar que todo hexahidrato presente se convierta completamente a la forma anhidra. Enfriar el desecante en un desecador
durante al menos 2 horas antes de su uso.
Mtodos 2 y 3: El desecante es gel de slice moldeado de tal forma que se ajuste al tamao y forma de la cavidad de blster
usada. Pueden resultar adecuados otros desecantes, por ejemplo, un tamiz molecular. Si se usa gel de slice, presecarlo en una
estufa con circulacin de aire forzado usando una de las siguientes condiciones: 155 5 durante 31/4 1/4 horas 150 5
durante 4 1/4 1/4 horas. Si se usa un tamiz molecular, presecarlo en una mufla a 595 25. Secar los tamices 4y 3 durante
31/4 1/4 horas; secar el tamiz 13X durante 51/4 1/4 horas. Enfriar el desecante en un desecador durante al menos 2 horas antes
de su uso. [NOTA-Se ha demostrado2 que el cloruro de calcio anhidro puede contener calcio hexahidrato, que pierde agua
slo cuando la temperatura alcanza los 200.]

PROCEDIMIENTO

Mtodo 1: Usar 15 envases de unidades mltiples y 15 cierres que sean representativos del sistema a analizar. Preparar las
muestras de prueba llenando cada envase de unidades mltiples hasta dos tercios de su capacidad con desecante y luego, para
cierres de rosca, cerrar usando el torque especificado en la Tabla 2. Para otros tipos de cierre, aplicar de acuerdo con el mto-
do de incumbencia. Asegurar que se haya aplicado la membrana correcta en el rea de colocacin del acabado del frasco,
logrando el sellado apropiado. Identificar cada envase de unidades mltiples con tinta indeleble. No usar etiquetas. Si hay ne-
cesidad de incrementar la precisin del mtodo, el usuario puede probar el sistema sin el cierre siempre que un sello imper-
meable permanezca en el envase.
Si se desea, pesar cada envase de unidades mltiples a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para
el tiempo cero, pero no usarlo en el clculo de la permeacin. Colocar todos los envases en la cmara de prueba (humedad
relativa de 75% a 40) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar todos los envases de unidades mltiples en intervalos de
tiempo de 7 das 1 hora. Pesar los envases de unidades mltiples en los das 7; 14; 21; 28 y 35 para obtener los datos en
estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo O hasta el da 7 es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes
de pesar los envases en cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante aproximadamente 30 minutos a la temperatu-
ra y humedad relativa de pesada. Limitar el tiempo fuera de la cmara a menos de 2 horas. Registrar los pesos de manera
apropiada para luego calcular la lnea de regresin.
Tabla 2. Torque aplicable al Envase con Tapa de Rosca
Intervalo de Afuste Intervalo de Ajuste
Sugerido con Sugerido con
Dimetro del Torque Aplicado Torque Aplicado
Cierre Manualmenteb Manualmenteb
(mm) (pulqada-libras) (Newton-metros)
8 5 0,56
10 6 0,68
13 8 0,90
Para probrar envases con dimetros de cierre intermedios, usar el torque asignado al dimetro de cierre de mayor tamao siguiente.
b Un aparato adecuado se encuentra disponible en SecurePak, PO Box 905, Maumee, Ohio 43552-0905; www.secure-pak.com. El Modelo MRA con indicadores
en ambos lados de retiro y aplicacin est disponible con los siguientes intervalos: 1) 0-25 pulgada por libras, lectura en incrementos de 1 pulgada por libra, 2)
0-50 pulgada por libras, lectura en incrementos de 2 pulgadas por libra y 3) 0-1 00 pulgada por libra, lectura en incrementos de 5 pulgadas por libra. Para ms
detalles sobre las instrucciones, se puede consultar el documento "Standard Test Method for Application and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closu-
res" ASTM Method 03198, publicado por la ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.

2Oetermination of water vapor transmission rate (WVTR) of HOPE bottles for pharmaceutical products. Chen, Yisheng and Yanxia Li, lnternational journal of Phar-
maceutics, 358 (2008) 137-143.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeo 557

Tabla 2. Torque aplicable al Envase con Tapa de Rosca (Continuacin)

Intervalo de Ajuste Intervalo de Ajuste
Sugerido con Sugerido con
Dimetro del Torque Aplicado Torque Aplicado
Cierre Manualmenteb Manualmenteb
(mm) (pulgada-libras) (Newton-metros)
15 5-9 0,56-1,02
18 7-10 0,79-1, 13
20 8-12 0,90-1,36
22 9-14 1,02-1,58
24 10-18 1,13-2,03
28 12-21 1,36-2,37
30 13-23 1,47-2,60
33 15-25 1,69-2,82
38 17-26 1,92-2,94
43 17-27 1,92-3,05
48 19-30 2,15-3,39
53 21-36 2,37-4,07
58 23-40 2,60-4,52
63 25-43 2,82-4,86
66 26-45 2,94-5,08
70 28-50 3,16-5,65
83 32-65 3,62-7,35
86 40-65 4,52-7,35
89 40-70 4,52-7,91
100 45-70 5,09-7,91
110 45-70 5,09-7,91
120 55-95 6,22-10,74
132 60-95 6,78-10,74
Para probrar envases con dimetros de cierre intermedios, usar el torque asignado al dimetro de cierre de mayor tamao siguiente.
b Un aparato adecuado se encuentra disponible en SecurePak, PO Box 905, Maumee, Ohio 43552-0905; www.secure-pak.com. El Modelo MRA con indicadores
en ambos lados de retiro y aplicacin est disponible con los siguientes intervalos: 1) 0-25 pulgada por libras, lectura en incrementos de 1 pulgada por libra, 2)
0-50 pulgada por libras, lectura en incrementos de 2 pulgadas por libra y 3) 0-100 pulgada por libra, lectura en incrementos de 5 pulgadas por libra. Para ms
detalles sobre las instrucciones, se puede consultar el documento "Standard Test Method for Application and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closu-
res" ASTM Method 03198, publicado por la ASTM lnternational, 100 Barr Harbar Drive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.

Mtodo 2: Usar 1O unidades de prueba para este mtodo. Proveer un mnimo de 1O cavidades de blster por cada unidad de
prueba. Si la tira contiene menos de 1O cavidades, agrupar suficientes tiras para formar una unidad de prueba que contenga al
menos 1O cavidades. Esto es necesario para proveer una ganancia en peso suficiente en cada intervalo de tiempo. Llenar con
un desecante previamente secado y sellar los blsteres en un equipo capaz de llenar y sellar correctamente el blster. El dese-
cante debe llenar la cavidad. El peso total del desecante debe ser la cantidad suficiente para cumplir con el requisito de evitar
la saturacin parcial del desecante antes de completar la prueba. Llenar los blsteres en una atmsfera de humedad baja (lo
ms baja posible, pero con una humedad relativa de no ms de 50%). No exponer los desecantes a la humedad ambiental por
ms de 30 minutos antes de sellar. Identificar cada muestra de prueba con tinta indeleble; no usar etiquetas. Una unidad de
prueba constar de una o ms muestras de prueba. Agrupar las muestras de prueba en unidades de prueba.
Pesar cada unidad de prueba a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para el tiempo cero. Colo-
car todas las unidades de prueba en la cmara de prueba (humedad relativa de 75% a 40) dentro de la primera hora de la
pesada. Pesar todas las unidades de prueba en intervalos de tiempo de 7 das 1 hora. Pesar las unidades de prueba en los das
7; 14; 21; 28 y 35 para obtener 5 datos en estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo O hasta el da 7
es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes de pesar a cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante 30 5 minu-
tos a la temperatura y humedad relativa de pesada controladas. Limitar el tiempo fuera de la cmara a menos de 2 horas.
Registrar los pesos de manera apropiada para luego calcular la lnea de regresin.
Puede ser que no se consiga alcanzar toda la precisin y sensibilidad que este mtodo puede proveer al medir los blsteres
de barrera ultra alta. Para blsteres de barrera ultra alta, las unidades de prueba deben tener no menos de 1 O cavidades, pero
no ms de 30. Los ejemplos incluyen blsteres de aluminio-aluminio o blsteres muy pequeos hechos de otros materiales. Al-
ternativamente, se puede duplicar o triplicar el tiempo de los intervalos de pesada para lograr una ganancia en peso de la
muestra de prueba de al menos 6 mg por intervalo.
Mtodo 3: Preparar las unidades de prueba segn se indica en el Mtodo 2. Colocar todas las unidades de prueba en la c-
mara de prueba (humedad relativa de 75% a 40) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar las unidades de prueba luego
de 2 das (48 1 hora). En ese momento, la diferencia en peso (la ganancia en peso) se divide por el nmero de blsteres y das
558 (671) Envases-Pruebas de Desempeo/ Pruebas Fsicas USP 39

(2) en cada unidad de prueba y esto se toma como la velocidad de transmisin de vapor de agua en mg/blster/da. El nmero
de blsteres analizados depende de las caractersticas del material de barrera, del tamao del blster y de la sensibilidad de la
balanza usada en la prueba. Para este mtodo, se puede obviar el requisito de cinco pesadas consecutivas debido a que el
desecante se satura rpidamente cuando se envasa en un envase de barrera baja y se almacena a una humedad relativa de
75% a 40. [NOTA-Para envases unitarios y de dosis nica de barrera baja, la ganancia en peso despus del segundo da
muestra un perfil curvilneo tpico de la cercana a la saturacin del desecante. Obtener cinco pesadas dentro de los 2 das no
es viable y podra aumentar la variabilidad. Los Mtodos 2 y 3 pueden requerir el uso de mltiples tiras de blsteres agrupadas
para obtener ganancias en peso con una magnitud suficiente para usar la sensibilidad de la balanza que se usa. Al agruparlas,
estas tiras o muestras de prueba se denominan unidades de prueba. La ganancia en peso en cada periodo de pesada deber
ser 20 veces la sensibilidad de la balanza y la sensibilidad de la balanza es 3 veces la precisin de la balanza. En otras palabras,
la ganancia en peso mnima por intervalo de tiempo debe ser al menos 60 veces la precisin de la balanza.]

CLCULOS

Para los Mtodos 1 y 2, realizar el anlisis de regresin para cada unidad de prueba. Por lo regular, el punto de datos inicial
(en el da O) no se incluye en el ajuste de la lnea de regresin. La pendiente de la lnea de regresin es la velocidad de transmi-
sin de vapor de agua de cada unidad de prueba. Para el Mtodo 1, la pendiente es la velocidad de transmisin de vapor de
agua para el envase de unidades mltiples correspondiente. Para el Mtodo 2, la velocidad de transmisin de vapor de agua de
cada cavidad de blster se calcula dividiendo la pendiente por el nmero de cavidades en cada unidad de prueba.

Para el Mtodo 3, calcular la ganancia en peso en mg/da desde el da O hasta el da 2 usando las 1 O unidades de prueba. La
velocidad de transmisin de vapor de agua de cada blster se calcula dividiendo la ganancia en peso por 2 (para 2 das) y el
nmero de blsteres en cada unidad de prueba.
Ecuacin de Regresin:
W= I+ MT

Clculos:
N _ _ N _

Pendiente(M)= L[(w;-W)(T-T)]/L(T-T) 2
i=1 i=1

Interseccin (/) = W - MT
donde
M = pendiente de la lnea de regresin
N =nmero de datos (cada dato consta de un peso y un tiempo)
W = peso medido
W = media del peso total
T = tiempo de muestreo
T = media del tiempo de muestreo total
I =ordenada al origen de la lnea de regresin (punto en el que la lnea de regresin se intersecta con el eje vertical)
N - -
L[(W-W)(T-T)]
i=1

igual a la suma de productos cruzados (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar la media del peso total del
valor en peso y la media del tiempo total del valor de tiempo y multiplicar las dos diferencias para obtener un producto cruza-
do. Posteriormente, sumar todos los productos cruzados N).
N
I<T-T)2
i=1

igual a la suma de las desviaciones al cuadradro (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar el tiempo medio
total del valor de tiempo y elevar al cuadrado la diferencia. Posteriormente, sumar todas las N diferencias al cuadrado).

RESULTADOS

Mtodo 1: Informar la velocidad de transmisin de vapor de agua como el valor promedio, en mg/da por envase, y la des-
viacin estndar de las 15 pendientes. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
Mtodo 2: Informar la velocidad de transmisin de vapor de agua como el valor promedio, en mg/da por cavidad, y la des-
viacin estndar de las 1 O pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeo 559

Mtodo 3: Informar la velocidad de transmisin de vapor de agua como el valor promedio desde el da O hasta el da 2, en
mg/da por blster, y la desviacin estndar de las 1 O pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de
envase cierre analizado.

Clasificacin para Sistemas de Envases para Envases de Unidades Mltiples para Formas
Farmacuticas Orales Slidas

El procedimiento y esquema de clasificacin siguientes se proveen para evaluar las caractersticas de transmisin de vapor de
agua de envases de unidades mltiples. La informacin recopilada debe usarse para tomar una decisin informada con respec-
to a la aptitud del sistema de envase para formas farmacuticas orales slidas.

DESECANTE

Colocar una cantidad de cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 8 3 en un recipiente poco profundo, procurando excluir el
polvo fino, secar a 11 O durante 1 hora y enfriar en un desecador.

PROCEDIMIENTO

Seleccionar 12 envases de tamao y tipo uniformes, limpiar las superficies de sellado con un pao libre de pelusa y cerrar y
abrir cada envase 30 veces. Cerrar el envase firme y uniformemente cada vez. Cerrar los envases con tapa de rosca con un
torque dentro del intervalo especificado en la Tabla 2. Agregar Desecante a 1 O de los envases, designados como envases de
prueba, llenando cada uno hasta 1 3 mm por debajo del cierre si el volumen del envase es 20 mL o ms, o llenando cada uno
hasta dos tercios de su capacidad si el volumen del envase es menos de 20 ml. Si el interior del envase tiene ms de 63 mm
de profundidad, puede colocarse un relleno inerte o un espaciador en el fondo para minimizar el peso total del envase y Dese-
cante; la capa de Desecante en dicho envase no debe ser de menos de 5 cm de profundidad. Cerrar cada envase inmediata-
mente despus de agregar el Desecante, aplicando el torque especificado en la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de
rosca. A cada uno de los 2 envases restantes, designados como controles, agregar un nmero suficiente de perlas de vidrio para
lograr un peso aproximadamente igual al de cada uno de los envases de prueba y cerrarlos, aplicando el torque especificado en
la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de rosca. Registrar el peso de los envases individuales as preparados con una
aproximacin de O, 1 mg si el volumen del envase es menos de 20 mL, con una aproximacin de 1 mg si el volumen del enva-
se es mayor o igual a 20 mL pero menos de 200 mL, o con una aproximacin de 1 centigramo (1 O mg) si el volumen del
envase es mayor o igual a 200 mL y almacenar a una humedad relativa de 75 3% y a una temperatura de 23 2. [NOTA-
Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 ml de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la
humedad especificada. Se pueden emplear otros mtodos para mantener estas condiciones.] Despus de 336 1 hora (14
das), registrar el peso de los envases individuales de la misma manera. Llenar completamente cinco envases vacos del mismo
tipo y tamao que los envases en anlisis con agua o con un slido no compresible y de libre fluidez, como perlas de vidrio
pequeas bien apisonadas, hasta el nivel indicado por la superficie del cierre cuando est colocado en su lugar. Transferir el
contenido de cada envase a una probeta graduada y determinar el volumen promedio de los envases, en mL. Calcular la velo-
cidad de transmisin de vapor de agua, en mg/da/L:
(1000/14\l)[(TF- T,) - (CF- C)]
V= volumen del envase (mL)
TF = peso final de cada envase de prueba (mg)
T; = peso inicial de cada envase de prueba (mg)
CF = peso promedio final de los dos controles (mg)
C; = peso promedio inicial de los dos controles (mg)
Clasificacin: Los sistemas de envases son impermeables si no ms de 1 de los 1O envases de prueba excede 100 mg/da/L en
la transmisin de vapor de agua, y ninguno excede 200 mg/da/L. Los sistemas de envases son bien cerrados si no ms de 1 de
los 1 O envases de prueba excede 2000 mg/da/L en la transmisin de vapor de agua, y ninguno excede 3000 mg/da/L.

ENVASES DE POLIETILENO Y POLIPROPILENO

Sellar los envases con sellos impermeables mediante sellado trmico de un laminado de aluminio-polietileno, u otro sello
apropiado. 4 Analizar segn se indica en la seccin Procedimiento.

3 Cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 8 adecuado est disponible comercialmente como el Artculo JT1313-1 en VWR lnternational (www.vwr.com; telfono
1-800-952-5000).
4 Un laminado adecuado para sellado tiene una capa de polietileno como capa de contacto con el envase de no menos de 0,025 mm (0,001 pulgadas) y una
segunda capa de papel de aluminio de no menos de 0,018 mm (0,0007 pulgadas), con capas adicionales de materiales de refuerzo adecuados. Se puede obtener
tambin un sellado apropiado mediante el empleo de placas de vidrio y una cera para sellado constituida por 60% de cera amorfa refinada y 40% de cera de
parafina cristalina refinada.
 560 (671) Envases-Pruebas de Desempeo/ Pruebas Fsicas USP 39

Clasificacin: Los envases de polietileno de alta densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisin de vapor de
agua excede de 1 O mg/da/L en no ms de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/da/L. Los envases de
polietileno de baja densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisin de vapor de agua excede de 20 mg/da/L
en no ms de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 30 mg/da/L.
Los envases de polipropileno analizados cumplen con los requisitos si la transmisin de vapor de agua no excede de 15
mg/da/L en ms de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/da/L.

Clasificacin para Sistemas de Envases para Envases de Unitarios y Envases de Dosis nica para
Formas Farmacuticas Orales Slidas

El procedimiento y esquema de clasificacin siguientes se proveen para evaluar las caractersticas de transmisin de vapor de
agua de envases unitarios y envases de dosis nica. La informacin obtenida debe usarse para tomar una decisin informada
con respecto a la aptitud del sistema de envase para formas farmacuticas orales slidas.

DESECANTE

Secar pellets de desecante adecuados a 11 O durante 1 hora antes de su uso y enfriar en un desecador. Usar pellets que
pesen aproximadamente 400 mg cada uno y con un dimetro de aproximadamente 8 mm. [NOTA-Si fuera necesario, debido
al tamao limitado de los envases de dosis nica, se pueden usar pellets que pesen menos de 400 mg cada uno y que tengan
un dimetro menor de 8 mm.]

PROCEDIMIENTO

Mtodo 1: Sellar no menos de 1 O envases de dosis nica con un pellet en cada uno y sellar 1 O envases de dosis nica vacos
adicionales que servirn de control, usando dedales o pinzas con extremos acolchados para manipular los envases sellados.
Enumerar los envases y registrar los pesos individuales 6 con una aproximacin de 1 mg. Pesar los controles de la misma unidad
y dividir el peso total por el nmero de controles para obtener el promedio. Almacenar todos los envases a una humedad rela-
tiva de 75 3% y a una temperatura de 23 2. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de
agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros mtodos para man-
tener estas condiciones.] Despus de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo mltiplo de ste (ver Clasificacin), retirar los
envases de la cmara y permitir que se equilibren durante 15 a 60 minutos en el rea de pesada. Registrar nuevamente el peso
de los envases individuales y de los controles combinados de la misma manera. [NOTA-Si algn pellet indicador se torna de
color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso del grnulo excede de 10%, terminar la prueba y considerar
vlidas slo las determinaciones anteriores.] Devolver los envases a la cmara de humedad. Calcular, con dos cifras significati-
vas, la velocidad de transmisin de vapor de agua, en mg/da, de cada envase tomado:
(l/N)[(WF- W1) - (CF- C1)]

N =nmero de das transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas)
WF = peso final de cada envase de prueba (mg)
W1 = peso inicial de cada envase de prueba (mg)
CF = peso promedio final de los controles (mg)
C1 = peso promedio inicial de los controles (mg)
[NOTA-Cuando las velocidades de transmisin de vapor de agua son menores de 5 mg/da y cuando se observa que los con-
troles llegan a un estado de equilibrio dentro de los 7 das, las velocidades individuales de transmisin de vapor de agua pue-
den determinarse con mayor exactitud empleando en el clculo los valores obtenidos a los 7 das para los pesos del envase de
prueba y del envase de control como W1 y C1, respectivamente. En tal caso, un intervalo de prueba adecuado para la Clase A
(ver Clasificacin) sera no menos de 28 das despus del periodo de equilibrio inicial de 7 das (un total de 35 das).]
Mtodo 2: Usar este procedimiento para empaques (por ejemplo, tarjetas de blsteres) que incorporen varios envases de do-
sis nica o blsteres sellados por separado. Sellar un nmero suficiente de empaques, de modo que se sometan a la prueba no
menos de cuatro empaques y un total de no menos de 1 O envases de dosis nica o blsteres llenados con un pellet en cada
unidad. Sellar el mismo nmero de empaques vacos, de los que cada uno contenga el mismo nmero de envases de dosis
nica o blsteres que los usados en los empaques de prueba, para utilizarlos como control. Almacenar todos los envases a una
humedad relativa de 75 3% y a una temperatura de 23 2. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por
cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros

5 Los pellets de desecante indicadores de humedad adecuados se encuentran disponibles comercialmente en fuentes tales como Unit Dose Supply, P.O. Box 104,
Ringoes, NJ 08551-01 04 (www.unitdose.net; telephone 609-31 0-1456), como lndicating Desiccant Pellets (Pellets de Desecante Indicadores), Artculo N
TK-1002.
6 Las comparaciones exactas de envases Clase A pueden requerir periodos de prueba de ms de 28 das si las pesadas se realizan en una balanza para preparar
medicamentos recetados Clase A (ver Balanzas y Aparatos Volumtricos para Prescripciones (11 76)). El uso de una balanza analtica que permita registrar los pesos
con una sensibilidad de dcima o centsima de miligramo lleva a una caracterizacin ms precisa entre envases y/o perodos de prueba ms cortos.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeo 561

mtodos para mantener estas condiciones.] Despus de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo mltiplo de ste (ver
Clasificacin), retirar los empaques de la cmara y dejar que se equilibren durante aproximadamente 45 minutos. Registrar los
pesos de los empaques individuales y devolverlos a la cmara. Pesar los empaques control como una sola unidad y dividir el
peso total por el nmero de empaques control para obtener el peso promedio del empaque vaco. [NOTA-Si algn pellet indi-
cador se torna de color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso promedio del pellet en cualquiera de los
empaques excede de 10%, terminar la prueba y considerar vlidas slo las determinaciones anteriores.] Calcular, con dos cifras
significativas, la velocidad promedio de transmisin de vapor de agua, en mg/da, para cada envase de dosis nica o blster en
cada empaque tomado:
[1 /{N X X)][(WF- W,) - (CF - C,)]

N =nmero de das transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas)
X= nmero de unidades por empaque selladas por separado
WF = peso final de cada empaque de prueba (mg)
W; = peso inicial de cada empaque de prueba (mg)
CF = peso final de los empaques de control (mg)
C; = peso inicial de los empaques de control (mg)
Usando el Desecante indicado para el Mtodo 1 y el Mtodo 2, pesar los envases o empaques de prueba y de control despus
de cada 24 horas y despus de los intervalos de prueba adecuados para las pesadas finales. WF y CF son segn se indica a conti-
nuacin: 24 horas para la Clase D; 48 horas para la Clase C; 7 das para la Clase B; y no menos de 28 das para la Clase A.
Clasificacin: Los envases de dosis nica individuales analizados segn el Mtodo 1 se designan de la siguiente manera: Clase
A si no ms de 1 de 1 O envases analizados excede de 0,5 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor de agua y ninguno
excede de 1 mg/da; Clase B si no ms de 1 de 1O envases analizados excede de 5 mg/da y ninguno excede de 1 O mg/da;
Clase C si no ms de 1 de 1 O envases analizados excede de 20 mg/da y ninguno excede de 40 mg/da; y Clase D si los envases
analizados no cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisin de vapor de agua.
Los envases analizados segn el Mtodo 2 se designan de la siguiente manera: Clase A si ningn envase analizado excede de
0,5 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor de agua promedio para blster; Clase B si ningn envase analizado excede
de 5 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor de agua promedio para blster; Clase C si ningn envase analizado excede
de 20 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor de agua promedio para blster; y Clase D si los envases analizados no
cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisin de vapor de agua promedio para blster.

Clasificacin para Siste~as de Envases para Envases de Unidades Mltiples y Envases de Dosis
Unica para Formas Farmacuticas Orales Lquidas

El procedimiento y esquema de clasificacin siguientes se proveen para evaluar las caractersticas de transmisin de vapor de
agua de envases de unidades mltiples. La informacin recopilada debe usarse para tomar una decisin informada con respec-
to a la aptitud del sistema de envase para formas farmacuticas lquidas orales. [NOTA-Determinar los pesos de los sistemas de
envase-cierre individuales (frasco, sello interno, si se usa, y cierre), tanto el peso de tara como el peso de llenado, con una
aproximacin de O, 1 mg si la capacidad del frasco es menos de 200 mL; con una aproximacin de 1 mg si la capacidad del
frasco es 200 mL o ms, pero menos de 1000 mL; o al centigramo ms cercano (1 O mg) si la capacidad del frasco es 1000 mL
o ms.]

PROCEDIMIENTO

Seleccionar 12 frascos de tamao y tipo uniformes y limpiar las superficies de sellado con un pao libre de pelusa. Acondi-
cionar cada frasco con un cierre, recubrimiento interno del cierre (si corresponde) y un sello. Numerar cada sistema de envase-
cierre y registrar el peso de tara.
Retirar los cierres y, usando una pipeta, llenar 1 O frascos con agua hasta la capacidad de llenado. Llenar dos envases con
perlas de vidrio hasta el mismo peso de los envases de prueba llenos. Si se emplean cierres de rosca, aplicar una fuerza de
torsin que est dentro del intervalo especificado en la Tabla 2 y almacenar los envases sellados a una temperatura de 25 2 y
una humedad relativa de 40 2%. Despus de 3361 horas (14 das), registrar el peso de los envases individuales y calcular la
velocidad de prdida de peso en agua, en porcentaje por ao, para cada frasco tomado:
[(W 1; - Wr) - (W 14 ; - Wr) - (Wc 1 - Wm)] x 365 x {[100/(W1; - Wr)] x 14}

W = peso inicial de cada frasco individual (1)

Wr = peso de tara
W 14 ; = peso de cada frasco individual (1) a los 14 das
Wc 1 = peso inicial del envase de control en el da 1
Wm = peso del envase de control a los 14 das
Clasificacin: El sistema de envase cumple con los requisitos para ser impermeable si el porcentaje de prdida de peso en
agua no excede de 2,5% por ao en no ms de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 5,0% por ao.
562 (671) Envases-Pruebas de Desempeo/ Pruebas Fsicas USP 39

TRANSMISIN ESPECTRAL

Aparato 7

Utilizar un espectrofotmetro de sensibilidad y exactitud adecuadas, adaptado para medir la cantidad de luz transmitida a
travs de los materiales plsticos usados en los envases farmacuticos. Adems, el espectrofotmetro tiene la capacidad de me-
dir y registrar la luz transmitida tanto en rayos difusos como en paralelos.

Procedimiento

Seleccionar trozos que representen el promedio del espesor de la pared. Cortar secciones circulares de dos o ms reas del
envase y recortarlas, segn sea necesario, para obtener segmentos de un tamao adecuado para montarlos en el espectrofot-
metro. Despus de cortarlas, lavar y secar cada muestra, procurando no rayar las superficies. Si la muestra fuera demasiado
pequea para abarcar la abertura del portamuestras, tapar el espacio sobrante de la abertura con un papel opaco o una cinta
adhesiva, siempre y cuando la longitud de la muestra exceda la de la ranura del espectrofotmetro. Limpiar la muestra inme-
diatamente antes de montarla en el portamuestras con papel para limpiar objetivos. Montar la muestra con ayuda de una cera
adherente, o empleando otro medio adecuado, y tomar las precauciones necesarias para evitar dejar huellas digitales u otras
marcas en las superficies a travs de las cuales debe pasar la luz. Colocar la seccin en el espectrofotmetro con su eje cilndri-
co paralelo al plano de la ranura y aproximadamente centrado en relacin a la ranura. Cuando est correctamente colocada, el
haz de luz es normal en relacin a la superficie de la seccin y las prdidas por reflexin son mnimas.
Medir continuamente la transmitancia de la seccin en relacin al aire en la regin espectral de inters con un instrumento
de registro o en intervalos de aproximadamente 20 nm con un instrumento manual, en la regin de 290-450 nm.

Lmites

La transmisin espectral observada no excede los lmites que se proporcionan en la Tabla 3 para envases destinados para uso
parenteral. La transmisin espectral observada para envases de plstico para productos destinados a la administracin oral o
tpica no excede de 10% a cualquier longitud de onda en el intervalo de 290-450 nm.
Tabla 3. Lmites para Plsticos de Clases 1 a VI
Porcentaje Mximo de Transmisin Espectral
a Cualquier Longitud
Tamao Nominal de Onda
(en mL) entre 290 y 450 nm
1 50
2 45
5 40
10 35
20 30
50 15

[NOTA-Ningn envase con un tamao intermedio a los listados anteriormente presenta una transmisin espectral mayor que
la del envase de tamao inmediatamente superior listado en la Tabla 3. Para envases con tamaos superiores a 50 mL, se apli-
can los lmites establecidos para envases de 50 mL.]

7 Para ms detalles sobre el aparato y los procedimientos, se pueden consultar las siguientes publicaciones de la ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, West
Conshohocken, PA 19428-2959: "Standard Test Method of Test for Haze and Luminous Transmittance of Transparent Plastics", ASTM Method D1003-11 el;
"Standard Practice for Computing the Colors of Objects by Using the CIE System", ASTM Method E308-08.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (691) Algodn 563

(691) ALGODN

Antes de determinar la absorbencia y la longitud de la fibra, extraer el Algodn de su envoltorio y acondicionarlo durante no
menos de 4 horas en una atmsfera estndar a una humedad relativa de 65 2% a 21 1, 1 (70 2F).

PRUEBA DE ABSORBENCIA

Procedimiento

Preparar una canastilla de prueba usando alambre de cobre de aproximadamente 0,4 mm de dimetro (N 26 B. & S.) que
no pese ms de 3 g, con forma de cilindro de aproximadamente 5 cm de dimetro y 8 cm de profundidad y con espacios de
aproximadamente 2 cm entre cada alambre. Tomar porciones de algodn purificado que pesen 1 0,05 g de cinco partes di-
ferentes del paquete, tirando pero sin cortar. Colocar las porciones combinadas en la canastilla y pesar. Sostener la canastilla
por uno de los lados aproximadamente a 12 mm por encima de la superficie del agua a 25 1 y, luego, dejarla caer en el
agua. Determinar, preferentemente mediante el uso de un cronmetro, el tiempo requerido en segundos hasta que la canasti-
lla se sumerja completamente.
Retirar la canastilla del agua, dejar que se escurra durante 1 O segundos en la misma posicin horizontal; luego colocarla de
inmediato en un recipiente tarado cubierto y pesarla. Restar el peso de la canastilla de prueba y del algodn purificado para
determinar el peso del agua absorbida.

LONGITUD DE FIBRA

Para determinar la longitud y la distribucin de la longitud de las fibras de algodn en el algodn purificado emplear el si-
guiente mtodo:
Llevar a cabo todas las operaciones asociadas con la determinacin de la longitud de fibra del algodn purificado en una
atmsfera estable de humedad relativa de 65 2% a 21 1, 1 (70 2F).
Estas instrucciones describen la modalidad de procedimiento que se adeca bien al clasificador* de mayor uso en la actuali-
dad en los Estados Unidos.

Aparato

El clasificador (ver ilustracin)

Clasificador Doble de Fibra de Algodn

consta de dos bancos de peines rgidamente montados uno al lado del otro sobre una base comn. Cada banco de peines
consta de por lo menos 12 peines individuales, separados 3,2 mm uno detrs de otro y montados en ranuras para que a medi-
da que se acercan durante el proceso de fraccionamiento y cuando ya no sean necesarios, puedan descender debajo del plano
de trabajo. Cada peine individual tiene una sola fila de dientes puntiagudos de 12 mm de largo exactamente alineados, que
son agujas de 0,38 mm de dimetro. Los dientes estn espaciados a una distancia de 62 a 25 mm entre s a lo largo de una
extensin de aproximadamente 50 mm.
El equipo accesorio consta de pinzas para clasificar las fibras, una rejilla para comprimir la fibra, una placa lisa para compri-
mir la fibra y placas recubiertas de terciopelo. Las pinzas clasificadoras constan de dos piezas de latn de aproximadamente 75
mm de largo unidas en uno de sus extremos y ligeramente curvadas en forma de pico en el otro para agarrar las fibras que
sobresalgan cerca de la superficie de los peines. Por lo general, uno de los bordes sujetadores posee un almohadillado de cuero
o de otro material fibroso. El borde por el que se toman las fibras tiene un ancho de aproximadamente 19 mm.

[NOTA-El mtodo aqu descrito se adapta especialmente al aparato clasificador Suter-Webb Duplex Cotton Fiber, pero introduciendo alteraciones ms o menos
obvias en el procedimiento, tambin se puede llevar a cabo con dos clasificadores Baer dispuestos en serie, o con un aparato Johannsen u otro aparato similar.]
564 (691) Algodn / Pruebas Fsicas USP 39

La rejilla que comprime las fibras consta de una serie de varillas de latn separadas a una distancia de 3,2 mm entre s para
que puedan colocarse entre los peines a fin de apretar las fibras entre los dientes. La placa lisa para comprimir las fibras consta
de una placa pulida de latn de aproximadamente 25 x 50 mm con una perilla o mango en la superficie superior, mediante el
cual la placa puede pasarse sobre las fibras cuando stas se colocan en la superficie de las placas recubiertas de terciopelo. Las
placas recubiertas de terciopelo, sobre las cuales se pueden distribuir las fibras, son lminas de aluminio de aproximadamente
100 mm x 225 mm x 2,4 mm de espesor, recubiertas sobre ambos lados con terciopelo de alta calidad, preferentemente de
color negro.

Seleccin del Algodn

Despus de desenrollar el algodn, preparar una muestra de prueba representativa tomando, de un paquete que contenga
de 8 a 16 onzas, 32 trozos pequeos (de aproximadamente 75 mg cada uno) bien distribuidos en todo el volumen del rollo,
tomando 16 trozos representativos de cada mitad longitudinal del rollo. Evitar los extremos cortados del rollo y tener la pre-
caucin de tomar porciones de todo el espesor del rollo. Para evitar que se seleccionen slo las fibras largas o las cortas, extraer
todas las fibras tomadas del grupo cuidando que no se resbalen entre los dedos.
De los paquetes de no ms de 4 onzas de peso, tomar 8 trozos y de los envases de ms de 4 onzas pero no ms de 8 onzas,
tomar 16 trozos, en forma bien distribuida.
Mezclar muy bien los trozos en pares y combinar cada par tirando y enrollando suavemente entre los dedos. Luego fraccio-
nar cada par combinado dividindolos longitudinalmente en dos partes aproximadamente iguales y utilizar una parte en el
mezclado adicional. (La otra parte puede descartarse o reservarse para cualquier prueba o control adicional.)
Repetir el proceso descrito en el prrafo anterior con las sucesivas mitades de la serie bifurcada hasta que slo se obtenga un
trozo: la porcin de prueba final integrada. Enderezar suavemente y colocar en forma paralela las fibras de la porcin de prue-
ba final integrada extrayndolas y enrollndolas entre los dedos. Tomar la precaucin de retener todas las fibras, en lo posible
incluyendo aquellas que forman botones (partculas de fibras enmaraadas) y lanillas (masas apelmazadas de fibras), desechan-
do slo las motas (fragmentos de semillas inmaduras con fibras) y todo material extrao que no sea fibra, como por ejemplo
tallos, hojas y fragmentos de las cscaras de las semillas.
De la porcin final integrada descrita en el prrafo anterior, separar longitudinalmente una porcin de prueba de 75 2 mg,
pesada con exactitud. Retener el residuo para cualquier prueba de control que pudiera ser necesaria.

Procedimiento

Con la rejilla para comprimir las fibras, insertar cuidadosamente la porcin de prueba pesada en un banco de peines del
clasificador de algodn de modo tal de que se extienda a travs de los peines en ngulos aproximadamente rectos.
Con las pinzas clasificadoras, tomar por los extremos libres una porcin pequea de las fibras extendindolas a travs de los
dientes del peine ms cercano al operador. En forma suave y pareja, halar las fibras para que emerjan de los peines hacia ade-
lante y transferirlas a las puntas de los dientes en el segundo banco de peines; colocarlas en forma paralela entre s y en un
ngulo aproximadamente recto con respecto a las caras de los peines, liberando los extremos sujetos tan cerca de la cara del
peine frontal como sea posible. Con la rejilla para comprimir las fibras, apretar cuidadosamente las fibras transferidas a los
dientes de los peines. Continuar la operacin hasta que se hayan transferido todas las fibras al segundo banco de peines. Du-
rante esta transferencia de las fibras, soltar en forma sucesiva los peines del primer banco una vez que todas las fibras sobresa-
lientes hayan sido retiradas.
Girar la mquina a 180 y transferir las fibras de algodn nuevamente al primer banco de peines de la manera descrita en el
prrafo anterior.
Asegurarse bien de emparejar los extremos de las fibras durante las dos transferencias anteriores, acomodndolas lo ms cer-
ca posible a la superficie frontal del peine prximo. Este emparejamiento de las puntas de las fibras sobresalientes tambin
puede incluir la extraccin de fibras desparejas del frente o de la parte de atrs de los bancos de peines, para volver a colocar-
las dentro o sobre el manojo principal de algodn en los peines.
Girar nuevamente la mquina a 180. Soltar en forma sucesiva los peines, si fuera necesario, para exponer los extremos de
las fibras ms largas. Puede ser necesario volver a depositar algunas fibras desparejas. Con las pinzas extraer las pocas fibras
que ms sobresalgan. Continuar extrayendo de esta manera las fibras sobresalientes que queden en la parte opuesta a la cara
frontal del peine ms prximo. Soltar este peine y repetir la serie de operaciones de la misma manera hasta que se hayan ex-
trado todas las fibras. Para no alterar excesivamente la porcin de prueba y de ese modo viciar el fraccionamiento de longitu-
des en grupos, hacer varias tracciones (8 a 1O) entre cada par de peines.
Colocar las tracciones sobre las placas recubiertas con terciopelo una al lado de la otra, tan derechas como sea posible, con
los extremos lo mejor definidos que sea posible y con los extremos distales colocados en una lnea recta. Presionar luego hacia
abajo suavemente y en forma homognea con la placa para comprimir fibras antes de liberar la traccin de las pinzas. Emplear
no menos de 50 y no ms de 100 tracciones para fraccionar la porcin de prueba.
Agrupar todas las fibras que midan 12,5 mm (aproximadamente media pulgada) o ms de longitud y pesar el grupo con
una aproximacin de 0,3 mg. De la misma manera, agrupar todas las fibras de 6,25 mm (aproximadamente 1/4 de pulgada) o
menos de longitud y pesar de la misma manera. Finalmente, agrupar las fibras restantes de longitudes intermedias y pesarlas.
La suma de los tres pesos no difiere del peso inicial de la porcin de prueba en ms de 3 mg. Dividir el peso de cada uno de
USP 39 Pruebas Fsicas/ (696) Slidos Cristalinos 565

los dos primeros grupos por el peso de la porcin de prueba para obtener el porcentaje, en peso, de fibra en los dos intervalos
de longitud.

(695) CRISTALINIDAD

Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento con los requisitos de cristalinidad establecidos en la monografa indi-
vidual de un frmaco.

PROCEDIMIENTO

En Microscopa ptica (776) se describe un detallado procedimiento de la prueba.

(696) CARACTERIZACIN DE SLIDOS CRISTALINOS POR

MICROCALORIMETRA Y CALORIMETRA DE DISOLUCIN

Para Jos propsitos de este captulo, Jos materiales cristalinos, parcialmente cristalinos y amorfos se consideran slidos.

INTRODUCCIN-EL CONCEPTO DE CRISTALINIDAD

Una retcula cristalina perfectamente ordenada, donde cada molcula ocupa su lugar esperado en la retcula es un ideal que
casi nunca se logra. El otro extremo es el estado amorfo, en el que un slido contiene la mayor densidad posible de imperfec-
ciones (defectos de diversas dimensionalidades), donde se pierde todo el orden de largo alcance y donde slo permanece el
orden de corto alcance, impuesto por las molculas adyacentes ms cercanas. Los cristales reales estn en algn punto entre
estos dos extremos. La posicin de un cristal en una escala delimitada por estos dos extremos se denomina cristalinidad.
Todos los cristales reales, incluso los que estn en estado puro, poseen algunas imperfecciones o defectos en su retcula, que
incrementan tanto la energa (entalpa en condiciones de presin atmosfrica constante) como el desorden (expresado como
la entropa) de su retcula cristalina. Se dice que un cristal es altamente cristalino cuando posee una densidad relativamente
baja de imperfecciones y una cristalinidad alta. Por el contrario, una partcula con una densidad de imperfecciones relativa-
mente alta se dice que es parcialmente amorfa y que posee una baja cristalinidad. En trminos ideales, a una partcula total-
mente amorfa le corresponde una cristalinidad de cero. Las partculas amorfas pueden contener dominios ordenados de algu-
na manera que pueden actuar como ncleos para la cristalizacin; de tales partculas denominadas amorfas se dice que poseen
una cristalinidad de bajo nivel pero finita.
La capacidad de detectar y cuantificar la cantidad de material amorfo dentro de una sustancia altamente cristalina es de
gran importancia durante el desarrollo y la fabricacin subsiguiente de una preparacin farmacutica.
En realidad, un polvo probablemente contiene partculas con diferentes grados de cristalinidad, as como puede contener
partculas con formas y tamaos variados. Cuanto ms baja es la cristalinidad de un slido, mayor es su entalpa y su entropa.
El aumento de la entalpa nunca se compensa totalmente con el incremento en la entropa; por lo tanto, la energa libre de
Gibbs, que refleja el equilibrio entre ambas, tiene un aumento neto. As, cuanto ms baja es la cristalinidad de un material
(polvo), y consecuentemente, cuanto mayor es su carcter amorfo, mayor es su solubilidad intrnseca aparente y su velocidad
de disolucin, pero menor es su estabilidad termodinmica. Debido a la gran relevancia de estas propiedades, la cristalinidad
es asimismo una propiedad importante y es necesario medirla mediante un mtodo adecuado.
En este captulo, la cristalinidad o el contenido de partes amorfas de un polvo se miden mediante mtodos de calorimetra,
tales como microcalorimetra o calorimetra de disolucin, aunque se pueden emplear otros mtodos (p.ej., ver el captulo ge-
neral Caracterizacin de Slidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difraccin de Rayos X Sobre Polvo (DRXP) (941 )).
Muchas sustancias son capaces de cristalizar en ms de un tipo de retcula cristalina, lo que se conoce como polimorfismo.
Cuando se incorpora agua o un disolvente en la retcula cristalina, a los cristales se les denomina hidratos o solvatos. Debido al
diferente orden cristalino y/o conformacin molecular y energa de la retcula, las distintas formas cristalinas a menudo presen-
tan distintas propiedades fsicas. Por cuestiones de simplicidad, las mediciones de calorimetra para determinar el grado de cris-
talinidad discutida en este captulo asumen una forma cristalina slida que se halla presente slo en el material de inters. La
teora y tcnica experimental se pueden expandir fcilmente a sistemas polimrficos tomando las consideraciones adecuadas
de las diferencias de entalpa entre los polimorfos.
566 (696) Slidos Cristalinos / Pruebas Fsicas USP 39

MTODO 1-MICROCALORIMETRA (DETERMINACIN DE CONTENIDO AMORFO)

La mayora de los procesos qumicos, fsicos y biolgicos tienen un intercambio de calor asociado. La microcalorimetra es
una tcnica altamente sensible para monitorear y cuantificar los cambios exotrmicos (que producen de calor) y endotrmicos
(que absorben calor) asociados con tales procesos. La tcnica permite determinar la velocidad y extensin de las reacciones
qumicas, los cambios de fase o los cambios de estructura.
Se pueden observar eventos trmicos que producen nicamente una fraccin de un microvatio usando microcalorimetra.
Esto significa que se deben detectar diferencias de temperatura menores de 106 K. La microcalorimetra por lo regular emplea
el principio de flujo de calor {prdida de calor), donde, en un vaso definido trmicamente, el calor producido (o absorbido)
fluye desde (o hacia dentro del) vaso en un esfuerzo por restablecer el equilibrio trmico con su entorno. La estabilidad trmica
excepcional con sus alrededores debe obtenerse mediante un aislador de calor (heat sink) o un entorno regulado electrnica-
mente.
La energa trmica de una muestra activa en el vaso de reaccin se canaliza generalmente a travs de elementos Peltier; di-
chos elementos actan como generadores termoelctricos usando el efecto Seebeck. La energa trmica se convierte en una
seal de voltaje proporcional al flujo de calor.
Por lo general, los resultados se presentan como una medicin de la energa trmica producida por unidad de tiempo (Va-
tio) en funcin del tiempo.

Aparato

Los microcalormetros a menudo se disean como sistemas gemelos con un vaso de medicin y un vaso de referencia. Los
vasos generalmente estn hechos de vidrio o acero inoxidable. Para ciertas aplicaciones, se pueden usar vasos especialmente
diseados que permiten la adicin de un material gaseoso, lquido o slido.

Calibracin

El microcalormetro se calibra para el flujo de calor (energa por unidad de tiempo) usando fuentes de calor elctrico exter-
nas o internas o una reaccin estndar adecuada.

Sensibilidad

La sensibilidad del mtodo micocalorimtrico se puede evaluar con respecto a una muestra estndar apropiada, que se anali-
za de acuerdo con el mtodo correspondiente en conjunto con la determinacin del ruido de la lnea base del instrumento.

Procedimiento

Pesar una cantidad apropiada del material en un vaso adecuado. Cerrar el vaso cuidadosamente para evitar cualquier evapo-
racin de disolventes y colocar los vasos en el portamuestras. Si resulta apropiado, permitir que el vaso se equilibre a la tempe-
ratura de la medicin antes de colocarlo en la posicin de medicin.
Comenzar el anlisis y registrar el flujo de calor con el tiempo sobre la abscisa y el flujo de calor sobre la ordenada (especifi-
car la direccin del flujo de calor exotrmico o endotrmico).

Deteccin y Cuantificacin de Contenido Amorfo en Polvos

El estado amorfo es metaestable con respecto al estado cristalino; por consiguiente, puede producirse recristalizacin. La
medicin del calor de recristalizacin permite determinar el contenido amorfo mediante el rea del pico de recristalizacin.
Resulta posible cuantificar el contenido amorfo de la muestra relacionando el resultado del microcalormetro para una muestra
con el obtenido a partir de un estndar amorfo. El intervalo de contenido amorfo abarcado por este mtodo depende de la
sustancia individual que se va a analizar. En casos favorables, se pueden alcanzar lmites de deteccin por debajo de 1%.
Es posible iniciar la recristalizacin sometiendo la muestra a una humedad relativa ms alta o a una atmsfera que contenga
vapor orgnico. La muestra generalmente se coloca en una ampolla que tambin contiene un pequeo tubo de ensayo que a
su vez contiene una solucin salina acuosa saturada, un disolvente orgnico o una mezcla de disolventes.
El calor de recristalizacin por lo regular se mide usando una masa de muestra fija colocada en un vaso de vidrio o acero. Al
seleccionar el tubo de ensayo que contiene la solucin salina saturada o el disolvente orgnico se debe optar por un tubo lo
suficientemente largo para permitir una saturacin total de la atmsfera sobre la muestra. La masa de la muestra y la naturale-
za de la atmsfera de vapor sobre la muestra deben permitir que la recristalizacin ocurra de tal forma que se observe un pico
definido, claramente separado de los eventos trmicos iniciales ocasionados por la introduccin de la muestra.
Las condiciones en las que ocurra la transicin de la fase amorfa a un estado cristalino termodinmicamente ms estable
tendrn un impacto significativo sobre el tiempo de recristalizacin. En particular, las mezclas fsicas de material puramente
USP 39 Pruebas Fsicas/ (696) Slidos Cristalinos 567

amorfo y cristalino se comportarn de forma diferente a un material parcialmente cristalino. Estos efectos se deben tomar en
cuenta al desarrollar un mtodo.
La Figura 1 muestra una respuesta tpica para la recristalizacin de un material mayoritariamente amorfo. La primera parte de
la curva representa diversos procesos concurrentes que ocurren de manera simultnea, tales como la absorcin de vapor de
agua en las partes amorfas del polvo y por la generacin de vapor de agua a partir del tubo de ensayo. Despus de esta res-
puesta inicial, se presenta una gran respuesta exotrmica ocasionada por la recristalizacin del material amorfo. Tambin in-
cluida, aunque inobservable, est la expulsin del exceso de agua de las partes recristalizadas y su condensacin. Por consi-
guiente, el rea bajo esta respuesta de recristalizacin exotrmica es proporcional al calor de recristalizacin.
2,5
11
2

ia 1,5
111
ei
Cll
e 1
w

0,5

o
o 1 2 3
Tiempo (Horas)

Figura 1. Resultado microcalorimtrico tpico de energa (en W) en funcin del tiempo (en horas): pico de colapso amorfo
(1) y pico de recristalizacin (11) para lactosa mayoritariamente amorfa a 25 y a una humedad relativa de 75%.

MTODO 2-CALORIMETRA DE DISOLUCIN (DETERMINACIN DE CRISTALINIDAD)

La calorimetra de disolucin proporciona un medio para determinar la entalpa de disolucin (es decir, el calor de disolucin
a presin atmosfrica constante) de una sustancia. La entalpa de disolucin se define como la entalpa de la sustancia disuelta
en la solucin a una concentracin definida, menos la entalpa de la sustancia original. El disolvente para el proceso de disolu-
cin debe ser tal que la masa del slido se disuelva dentro de un intervalo de tiempo que corresponda con el tiempo de res-
puesta del calormetro, segn se analiza a continuacin. La entalpa de una disolucin es proporcional a la cantidad de slido
que se disuelve. Esta cantidad se puede definir como un mol para la entalpa molar o un gramo para la entalpa especfica. Si la
sustancia posee una pureza adecuada (segn se determina mediante el grado de exactitud requerida) y se conoce su masa
molecular, se prefiere la entalpa molar; en caso contrario, se emplea la entalpa especfica. La entalpa de disolucin depende
levemente tanto de la temperatura, que generalmente es de 25,0, como de la concentracin final del soluto disuelto.
Por lo general, se prefiere expresar la cristalinidad, P0 de una sustancia en una escala porcentual. Este procedimiento requie-
re de dos estndares de referencia, a saber, una muestra altamente cristalina para la que se asume una cristalinidad de 100% y
que posea una entalpa de disolucin medida de t-..Hs0 y una muestra amorfa para la que se asume una cristalinidad de 0% y
que posea una entalpa de disolucin medida de b..H'0 A partir de estos valores y de la entalpa, AH',, la disolucin medida del
slido en anlisis, se puede calcular la cristalinidad porcentual del slido, P0 segn se indica a continuacin:
pe(%)= 1 OO(t-...Hs, - t-..H'a)f(b..H'c- b..H'a)
Resulta claro que la cristalinidad expresada en una escala porcentual depende de tres valores medidos y que las entalpas de
disolucin se pueden reemplazar por otras cantidades fsicas correspondientes que dependan de la cristalinidad. Sin embargo,
el valor de la cristalinidad porcentual de una muestra depende no slo de la naturaleza y del mtodo de preparacin de los dos
estndares de referencia, sino tambin de la eleccin de la cantidad fsica que se mide.
La entalpa de la disolucin se mide ya sea mediante un calormetro de disolucin isoperiblico (con permetro constante, es
decir, camisa) o mediante un calormetro de disolucin isotrmico (con temperatura constante). Por lo general, se realizan co-
mo mnimo tres mediciones con cada muestra. Posteriormente, se calcula la media aritmtica de estos tres valores. Los requisi-
tos exactos dependern de la capacidad del equipo y del grado de exactitud requerido.

Calorimetra de Disolucin lsoperiblica

En el calormetro de disolucin isoperiblico, el cambio de temperatura durante el proceso de disolucin ocasiona un cam-
bio correspondiente en la temperatura del sistema disolvente-soluto (es decir, en la solucin). Este cambio de temperatura se
mide con un sensor de temperatura, que est conectado a un circuito elctrico que registra una seal elctrica que correspon-
568 (696) Slidos Cristalinos/ Pruebas Fsicas USP 39

de al cambio de temperatura. Por lo regular, este cambio de temperatura en forma electrnica se mide a intervalos de tiempo
definidos con precisin para proporcionar datos de temperatura-tiempo que una computadora recoge, analiza y posterior-
mente grafica. Una corrida con un blanco sin la adicin del soluto slido al disolvente normalmente no muestra un cambio
discernible en la pendiente de la grfica de temperatura-tiempo.
Para los calormetros de disolucin isoperiblicos, la respuesta es lo suficientemente rpida, pero se deben hacer correccio-
nes por cualquier prdida o ganancia de calor originada a partir del bao. Por lo tanto los calormetros de disolucin isoperib-
licos tienen ms ventajas que los calormetros de disolucin isotrmica cuando el proceso de disolucin es relativamente rpi-
do. Para todas las mediciones de la entalpa de la disolucin empleando calormetros de disolucin isoperiblicos, la eleccin
del disolvente es un paso crtico. La naturaleza y la masa del disolvente y la masa de la muestra se eligen de forma que el
cambio de calor total correspondiente a la disolucin total del slido se complete en el plazo de cinco minutos agitando vigo-
rosamente a una velocidad de rotacin constante dentro del intervalo de 400-600 revoluciones/minuto.
Se determina la capacidad de calor efectiva de la celda del calormetro y su contenido para cada corrida del calormetro. Esta
determinacin se logra mediante el calentamiento elctrico del contenido de la celda del calormetro. La capacidad trmica
efectiva se determina de acuerdo con uno de dos protocolos-realizando una determinacin despus del rompimiento de la
ampolla o realizando una determinacin antes y una segunda determinacin despus del rompimiento de la ampolla, y poste-
riormente promediando los dos resultados. La exactitud y confiabilidad del calentamiento elctrico se establecen mediante la
exactitud y confiabilidad de las calibraciones qumicas anteriormente mencionadas.

Calorimetra de Disolucin Isotrmica

En el calormetro de disolucin isotrmico (temperatura constante), el cambio de temperatura durante el proceso de disolu-
cin se compensa mediante un cambio de energa igual pero opuesto, de tal manera que la temperatura del sistema disolven-
te-soluto (es decir, en la solucin) se mantenga esencialmente constante. Este cambio igual pero opuesto de energa se mide
y, cuando se invierte su signo, proporciona la entalpa de disolucin. Para calormetros isotrmicos, la respuesta es relativamen-
te lenta, pero el proceso de compensacin elimina el efecto de prdidas o ganancias de calor causadas por el bao. Por lo
tanto, los calormetros de disolucin isotrmicos son ms ventajosos que los calormetros de disolucin isoperiblicos cuando
el proceso de disolucin es relativamente lento.

Solucin de Calibracin del Calormetro

Para asegurar la exactitud del calormetro, se deben realizar calibraciones qumicas regularmente. Para una disolucin endo-
trmica, la calibracin del calormetro se verifica midiendo el calor absorbido durante la disolucin de cloruro de potasio en
agua destilada a 298, 15 K (25,0). El cambio de entalpa establecido en este proceso endotrmico es 235,5 J/g (17,56 kj/mol).
Para una disolucin exotrmica, el calormetro se verifica midiendo el calor producido durante la disolucin de 5 g/L de trome-
tamina [tris(hidroximetil)aminometano, THAM] en una solucin acuosa de cido clorhdrico O, 1 M a 298, l 5 K (25,0). El calor
establecido para el proceso mencionado anteriormente es de -246,0 J/g (-29,80 kJ/mol).

Manejo de la Muestra

La estabilidad qumica y fsica de los slidos puede verse reducida al disminuir la cristalinidad. En particular, los slidos de
baja cristalinidad, especialmente los slidos amorfos, tienden a absorber vapor de agua de la atmsfera, lo que provoca cristali-
zacin y un aumento correspondiente en la cristalinidad. Por estos motivos, las muestras anhidras cuya cristalinidad se va a
determinar, deben almacenarse en condiciones de cero humedad o a niveles inferiores a la humedad crtica en cmaras sella-
das que contengan un desecante que preferentemente contenga un indicador de eficacia. Cuando se van a llevar a cabo estu-
dios de cristalinidad-humedad, la muestra se almacena en una cmara sellada que contenga una solucin salina saturada para
proporcionar una humedad relativa definida.

(697) CONTENIDO EN ENVASES PARA INYECTABLES

Cada envase de inyeccin debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de fr-
maco (ver Formas Farmacuticas (1151 ), Exceso de Volumen en Inyectables). Dicha extraccin se debe realizar de acuerdo a las
instrucciones del etiquetado, cuando se provean.

DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE INYECCIN EN LOS ENVASES

Esta seccin est armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas
farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a esta seccin armonizada. Una porcin del presen-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (698) Volumen de Entrega 569

te texto (ver ms adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; est marcada con
smbolos (.) para especificar este hecho.
Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las prepara-
ciones viscosas y oleosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosa-
mente justo antes de extraer el contenido. Luego, el contenido se enfra a una temperatura de 20-25 antes de medir el volu-
men. Las formulaciones de slidos estriles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de retirar
su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o soluciones, se-
gn sea apropiado .
Envases Monodosis-Seleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 1O mL o ms, 3 envases si el volumen nominal es
ms de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Tomar individualmente el contenido
total de cada envase seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y
provista con una aguja de calibre 21 con una longitud de no menos de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire
de la jeringa y la aguja, y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (cali-
brada para contener ms que para verter los volmenes marcados) de un tamao tal que el volumen que se va a medir ocupe
al menos el 40% de su volumen graduado. Como alternativa, el volumen del contenido, en mL, puede calcularse como la
masa, en g, dividida por la densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de una cantidad
suficiente de envases puede combinarse para obtener el volumen requerido para la medicin, siempre que, para cada envase,
se emplee un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 1O mL o ms se puede determinar
abrindolos y vaciando el contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado.
El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de enva-
ses con un volumen nominal de 2 mL o menos, no es menor que la suma de los volmenes nominales de los envases tomados
colectivamente.
Envases Multidosis-Para Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un nmero especfico de dosis de un volu-
men determinado, seleccionar 1 envase y proceder segn se indica para los envases monodosis, empleando el mismo nmero
de conjuntos diferentes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos
de la dosis indicada.
Inyecciones en Cartuchos o Jeringas Prellenadas-Seleccionar 1 envase si el volumen es 1O mL o ms, 3 envases si el
volumen nominal es ms de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Si fuera necesario,
equipar los envases con los accesorios requeridos para su uso (aguja, mbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados
tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la aguja, empujando el mbolo en forma lenta y continua. Determi-
nar el volumen, en mL, calculado como la masa, en g, divida por la densidad.
El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal.
Soluciones Intravenosas de Gran Volumen-Para soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a
una probeta graduada seca, de una capacidad tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen
nominal de la probeta. Medir el volumen transferido.
El volumen no es menor que el volumen nominal.

(698) VOLUMEN DE ENTREGA

PROPSITO
Las siguientes pruebas estn diseadas para garantizar que las preparaciones lquidas orales, cuando se transfieren desde su
envase original, entreguen el volumen de la forma farmacutica que se declara en la etiqueta del artculo.

ALCANCE
Estas pruebas se aplican a productos que se dispensan vertiendo desde el envase. Estas pruebas se aplican a productos que
se suministran como preparaciones lquidas o como preparaciones lquidas reconstituidas a partir de slidos mediante el agre-
gado del volumen determinado del diluyente especificado. Estas pruebas no son obligatorias para los artculos envasados en
envases unitarios cuando la monografa incluye la prueba de Uniformidad de Unidades de Dosificacin (905).

DETERMINACIN DE DENSIDAD
Debido a la tendencia de las preparaciones lquidas orales a atrapar aire al ser agitadas o transferidas, determinar primero la
masa entregada resulta un mtodo ms exacto de determinacin del volumen entregado, usando luego la densidad del mate-
rial para convertir la masa en volumen entregado. Para usar este mtodo, se requiere una determinacin de la densidad del
material. A continuacin se indica un mtodo para determinar la densidad:
570 (698) Volumen de Entrega/ Pruebas Fsicas USP 39

1. Tarar un matraz volumtrico de 100 ml que contenga 50,0 ml de agua.

2. Agregar aproximadamente 25 g de producto bien agitado, agitando el contenido por rotacin suave hasta mezclar.
3. Volver a pesar el matraz.
4. Agregar desde una bureta, una cantidad de agua medida con exactitud hasta llevar el contenido del matraz a volumen,
mientras se agita por rotacin suave. Registrar el volumen agregado desde la bureta.
5. Calcular la densidad de la muestra:
W/V
en donde W es el peso, en g, del material tomado; y V es 50,0 ml menos el volumen de agua necesario para ajustar el conte-
nido del matraz a volumen, en ml. Se pueden usar otros mtodos para determinar la densidad, dependiendo de la formula-
cin (p.ej., formulaciones sustancialmente no acuosas).

PREPARACIONES DE PRUEBA

Para determinar el volumen de entrega, seleccionar no menos de 30 envases y proceder del siguiente modo para la forma
farmacutica correspondiente.
Soluciones Orales y Suspensiones Orales-Agitar individualmente el contenido de 1 O envases.
Polvos Cuyas Etiquetas Declaran el Volumen de la Preparacin Lquida Oral que Resulta cuando el Polvo se
Reconstituye con el Volumen de Diluyente Declarado en el Etiquetado-Reconstituir 1 O envases con el volumen de dilu-
yente declarado en el etiquetado, medido con exactitud, y agitar individualmente.

PROCEDIMIENTO

El volumen de entrega se puede determinar por peso, segn se indica a continuacin:

1. Vaciar el contenido del envase en un recipiente tarado adecuado (dejando que escurra durante no ms de 5 segundos
para envases unitarios, y no ms de 1 O minutos para envases de unidades mltiples).
2. Determinar la masa del contenido.
3. Calcular el volumen usando la densidad .
Como alternativa, se puede usar el siguiente procedimiento por volumen:
1 . De acuerdo con las condiciones de uso, o segn se indique en el etiquetado, vaciar cuidadosamente el contenido de cada
envase en sendas probetas individuales, graduadas y secas, con una capacidad marcada que no exceda de dos veces y
media el volumen a medir, y calibradas "para contener" (ver Aparatos Volumtricos (31 )). Se debe tener cuidado de evitar
que se formen burbujas de aire durante el proceso. Si el etiquetado carece de instrucciones, sujetar los envases en un n-
gulo de aproximadamente 30 con respecto a la horizontal y vaciar, cuidadosamente, el contenido en la probeta gradua-
da.
2. Dejar escurrir cada envase durante un periodo que no exceda de 1 O minutos para envases de unidades mltiples y 5 se-
gundos para envases unitarios, a menos que se especifique de otra manera en la monografa.
3. Cuando no haya burbujas, medir el volumen de cada mezcla.

CRITERIOS DE ACEPTACIN

Usar los siguientes criterios para determinar el cumplimiento de esta prueba.

Para Envases de Unidades Mltiples (ver la Figura 7)-EI volumen promedio de lquido obtenido a partir de los 1 O envases
es no menos de 100% y el volumen de ningn envase es menos de 95% del volumen declarado en el etiquetado. Realizar la
prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en el etiquetado pero el volu-
men de ningn envase es menos de 95% de la cantidad declarada, o si B, el volumen promedio es no menos de 100% y el
volumen de no ms de 1 envase es menos de 95%, pero es no menos del 90% del volumen declarado. El volumen promedio
de lquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado; y el volumen de lquido
obtenido de no ms de 1 de los 30 envases es menos de 95%, pero no menos de 90% del volumen declarado en el etiqueta-
do.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (698) Volumen de Entrega 571

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

El volumen de 1 envase El volumen de ningn El volumen de 1 o ms El volumen de ningn

es menos de envase es menos de envases es menos de envase es menos de
95% del V decl. 95% del V decl. 95% del V decl. 95% del V decl.

No cumple Cumple
con la prueba El volumen de no ms El volumen de con la prueba
de 1 envase es menos ms de 1 envase
de 95% del V decl. es menos de
pero no menos de 95% del V decl.
90% del V decl.

A B
No cumple
con la prueba
Analizar 20 envases ms

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

No cumple
con la prueba
El volumen de El volumen de no ms
ms de 1 envase e 1 envase es meno
es menos de de 95% del V decl.
v
95 % del decl. pero no menos de
90% del V decl.

No cumple Cumple
con la prueba con la prueba

Figura 1. Esquema de decisin para envases de unidades mltiples. ,Y= Volumen promedio. V decl. =Volumen declarado)
Para Envases Unitarios (ver la Figura 2)-EI volumen promedio de lquido obtenido a partir de los 1O envases es no menos
de 100% y el volumen de cada uno de los 1O envases se encuentra dentro del intervalo de 95%-110% del volumen declarado
en el etiquetado. Realizar la prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en
el etiquetado, pero el volumen de ningn envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, o si B, el volumen promedio
es no menos de 100% y el volumen de no ms de 1 envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, pero dentro del
intervalo de 90o/o-115%. El volumen promedio de lquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen de-
clarado en el etiquetado y el volumen obtenido de no ms de 1 de los 30 envases se encuentra fuera del intervalo de 95%-
110% pero dentro del intervalo de 90%-115% del volumen declarado en el etiquetado.
572 (698) Volumen de Entrega/ Pruebas Fsicas USP 39

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

El volumen de 1 o ms El volumen de ningn El volumen de 1 o ms El volumen de cada uno de

envases cae afuera del envase cae afuera del envases cae afuera del los envases cae afuera del
intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110%
del Vdecl. del V decl. del Vdecl. del Vdecl.

No cumple Cumple
El volumen de no ms El volumen de
con la prueba de 1 envase cae afuera con la prueba
ms de 1 envase
del intervalo de 95% a cae afuera del
110% del V decl. pero intervalo de 95% a
dentro del intervalo 110% del V decl.
de 90% a 115%

A B
No cumple
con la prueba
Analizar 20 envases ms

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

No cumple
con la prueba El volumen de no ms
El volumen de ms
de 1 envase cae afuera
de 1 envase
del intervalo de 95% a
cae afuera del
110% del V decl. pero
intervalo de 95% a
dentro del intervalo
110% del V decl.
de 90% a 115%

No cumple Cumple
con la prueba con la prueba

Figura 2. Esquema de decisin para envases unitarios. <Y= Volumen promedio. V decl. =Volumen declarado)

(699) DENSIDAD DE SLIDOS

TRMINOS Y DEFINICIONES
El trmino densidad se refiere a la distribucin espacial promedio de la masa en un material. La densidad de los slidos tpi-
camente se expresa en g por cm 3, mientras que en los lquidos la densidad se expresa generalmente en g por mL a una tempe-
ratura de referencia establecida.
La densidad de una partcula slida puede tomar diferentes valores segn el mtodo empleado para medir el volumen de la
partcula. Es importante distinguir entre tres posibilidades diferentes.
La densidad verdadera de una sustancia es la masa promedio por unidad de volumen, excluyendo todos los espacios vacos
que no son parte fundamental de la disposicin tridimensional molecular. Es una propiedad de cada material particular y, por
lo tanto, debe ser independiente del mtodo de determinacin. La densidad verdadera de un cristal perfecto puede determi-
narse a partir del tamao y la composicin de la unidad celular.
La densidad picnomtrica, medida por picnometra de gases, es una medicin de la densidad conveniente para polvos farma-
cuticos. En un picnmetro de gases, el volumen ocupado por una masa conocida de polvo se determina mediante la medi-
cin del volumen de gas desplazado por el polvo. El cociente entre la masa y el volumen de gas desplazado es la densidad
picnomtrica. La densidad picnomtrica equivale a la densidad verdadera a menos que el material contenga espacios vacos
impenetrables, o poros cerrados que sean inaccesibles al gas empleado en el picnmetro.
La densidad granular incluye las contribuciones al volumen de la partcula de poros abiertos que son ms pequeos que un
tamao lmite, que depende del mtodo de medicin. Una tcnica comn de medicin es la porosimetra de mercurio, donde
USP 39 Pruebas Fsicas/ (699) Densidad de Slidos 573

el tamao lmite del poro depende de la presin mxima de penetracin. Debido a la contribucin adicional del volumen de
poro, la densidad granular nunca ser mayor que la densidad verdadera. Un concepto relacionado es la densidad aerodinmica,
que es la densidad de la partcula con un volumen definido por la envoltura aerodinmica de la partcula en una corriente de
flujo. Tanto los poros cerrados como los abiertos contribuyen a este volumen, pero los poros abiertos se llenan con el lquido
impregnante. Por lo tanto, si la partcula es porosa, la densidad aerodinmica depende de la densidad del lquido utilizado en
la prueba.
En sntesis, tanto la densidad picnomtrica como la densidad verdadera se denominan "densidad". Si es necesario, se pue-
den distinguir estas cantidades segn el mtodo de medicin.
La densidad de un material depende de la cohesin molecular. En el caso de los gases y los lquidos, la densidad depende de
la temperatura y la presin. En el caso de los slidos, la densidad tambin variara segn la estructura del cristal y el grado de
cristalinidad. Si los slidos son amorfos, la densidad tambin puede depender de los antecedentes de preparacin y tratamien-
to de esta sustancia. En consecuencia, a diferencia de los lquidos, las densidades de dos slidos qumicamente equivalentes
pueden ser diferentes debido a una diferencia en la estructura del estado slido. La densidad de las partculas constitutivas es
una caracterstica fsica importante de los polvos farmacuticos.
Ms all de estas definiciones sobre densidad de la partcula, la densidad aparente de un polvo incluye la contribucin al vo-
lumen del espacio vaco entre las partculas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la densidad como de la
compactacin de las partculas de polvo.

PICNOMETRA DE GASES PARA LA MEDICIN DE DENSIDAD

La picnometra de gases es un mtodo conveniente y apropiado para la medicin de la densidad de partculas de polvo. En
la Figura 1 se muestra un diagrama sencillo de un tipo de picnmetro de gases.

Vr =Volumen de referencia
Ye= Volumen de celda
V8 = Volumen de muestra
M =Manmetro

Fig. 1. Esquema de Picnmetro de Gases.

La muestra, con una masa w y un volumen V51 se coloca dentro de una celda de prueba sellada que tiene un volumen de
celda sin contenido de Ve La presin de referencia del sistema, P, se determina en el manmetro mientras la vlvula que co-
necta el volumen de referencia con la celda de prueba est abierta. Se cierra la vlvula para separar el volumen de referencia,
V,, de la celda de prueba. La celda de la prueba se presuriza con el gas de medicin a una presin inicial, P;. Luego, se abre la
vlvula para conectar el volumen de referencia, V,, con la celda de la prueba y la presin desciende a la presin final, P1 Si el
gas de medicin se comporta idealmente en las condiciones de medicin, el volumen de la muestra, V51 se calcula mediante la
siguiente expresin:

(1)

La densidad, p, se calcula por la ecuacin:

w
p=-(2)
v,
Los detalles del diseo instrumental pueden diferir, pero todos los picnmetros de gases dependen de la medicin de los cam-
bios de presin a medida que se agrega o se elimina un volumen de referencia de la celda de prueba.
La densidad medida es una media ponderada por volumen de las densidades de las partculas individuales que constituyen
el polvo. La densidad ser errnea si el gas de la prueba se adsorbe o se absorbe en el polvo o si se producen contaminantes
voltiles a partir del polvo durante la medicin. La adsorcin o absorcin se evitan mediante una eleccin apropiada del gas de
prueba. Normalmente se elige helio. Los contaminantes voltiles del polvo se eliminan mediante la desgasificacin del polvo a
travs de una purga constante con helio antes de la medicin. Ocasionalmente, los polvos pueden desgasificarse al vaco. Si los
574 (699) Densidad de Slidos/ Pruebas Fsicas USP 39

contaminantes voltiles no interfieren con la medicin, los volmenes de muestra proporcionados por dos lecturas consecuti-
vas no difieren en ms del 0,2%. Debido a que se pueden producir contaminantes voltiles durante la medicin, el peso de la
muestra debe tomarse despus de la medicin picnomtrica del volumen.

Mtodo

Asegurarse de que el volumen de referencia y el volumen de calibracin se hayan determinado para el picnmetro de gases
mediante un procedimiento apropiado de calibracin. El gas a utilizar en la prueba debe ser helio, a menos que se especifique
otro gas en la monografa individual correspondiente. La temperatura del picnmetro de gases debe estar entre 15 y 30 y no
debe variar en ms de 2 durante el curso de la medicin. Cargar la celda de prueba con la sustancia en anlisis que se ha
preparado segn la monografa individual correspondiente. Secar la sustancia en anlisis, cuando se indica (699D), segn se
describe en Prdida por secado en la monografa correspondiente, a menos que se especifiquen otras condiciones de secado en
la prueba de Densidad de slidos de la monografa. Cuando se indica (699U), la sustancia en anlisis se emplea sin secar. Em-
plear una cantidad de polvo recomendada en el manual operativo para el picnmetro. Sellar la celda de prueba del picnme-
tro y purgar el sistema del picnmetro con el gas de prueba segn el procedimiento indicado en las instrucciones de funciona-
miento del fabricante. Si la muestra debe desgasificarse al vaco, seguir las recomendaciones de las monografas individuales
correspondientes y las instrucciones del manual operativo del picnmetro.
La secuencia de medicin anterior describe el procedimiento para el picnmetro de gases que aparece en la Figura 1. Si el
picnmetro tiene una operacin o construccin diferentes, del que se muestra en la Figura 1, seguir el procedimiento operativo
indicado en el manual de uso del picnmetro.
Repetir la secuencia de medicin para la misma muestra de polvo hasta que las mediciones consecutivas del volumen de
muestra, V,, no difieran en ms del 0,2%. Descargar la celda de la prueba y medir el peso final de polvo, w. Calcular la densi-
dad picnomtrica, p, de la muestra segn la Ecuacin 2.

(701) DESINTEGRACIN

Este captulo general est armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa.
Los textos de estas farmacopeas son por lo tanto intercambiables y en lugar de este captulo general, se pueden usar los mto-
dos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento de los requisitos. Estas farmacopeas
se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armonizado.
Las partes del texto de este captulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armoniza-
do, estn indicadas con smbolos (..) para especificar este hecho.
Esta prueba sirve para determinar si las tabletas o cpsulas se desintegran dentro del tiempo establecido cuando se las colo-
ca en un medio lquido en las condiciones experimentales que se presentan a continuacin. Se requiere el cumplimiento con
los lmites de Desintegracin establecidos en las monografas individuales excepto cuando la etiqueta indica que las tabletas o
cpsulas estn destinadas para su uso como trociscos (troches) o para ser masticadas o estn diseadas como formas farma-
cuticas de liberacin prolongada o formas farmacuticas de liberacin retardada. Determinar el tipo de unidades en anlisis
segn lo que indique el etiquetado o por observacin y aplicar el procedimiento correspondiente a 6 o ms unidades de dosifi-
cacin .
A los efectos de esta prueba, la desintegracin no implica la disolucin completa de la unidad ni de su ingrediente activo. Se
define como desintegracin completa al estado en el cual los residuos de la unidad, excepto la cubierta insoluble de una cp-
sula o los fragmentos del recubrimiento insoluble, que permanezcan en el tamiz del aparato de prueba o se adhieran a la su-
perficie inferior del disco, constituyen una masa blanda sin un ncleo firme y palpable.

APARATO
El aparato consta de un montaje de canastilla-gradilla, un vaso de precipitados bajo de 1000 mL, con una altura entre 138
mm y 160 mm y con un dimetro interno de 97 mm a 115 mm para el lquido de inmersin, una disposicin termosttica
para calentar el lquido entre 35 y 39 y un dispositivo para elevar y sumergir la canastilla en el lquido de inmersin a una
frecuencia constante entre 29 y 32 ciclos por minuto recorriendo una distancia de no menos de 53 mm y no ms de 57 mm.
El volumen del lquido en el recipiente es tal que en el punto ms alto del recorrido ascendente, la malla de alambre permane-
ce al menos 15 mm por debajo de la superficie del lquido y desciende a no menos de 25 mm desde el fondo del recipiente en
el recorrido descendente. En ningn momento debe quedar sumergida la parte superior del montaje de canastilla-gradilla. El
tiempo requerido para el recorrido ascendente es igual al tiempo del recorrido descendente y el cambio de sentido se produce
en una transicin suave y no con un movimiento abrupto. El montaje de canastilla-gradilla se mueve verticalmente a lo largo
de su eje. No hay un movimiento horizontal significativo ni un movimiento del eje que no sea vertical.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (701) Desintegracin 575

Montaje de Canastilla-Gradilla-El montaje de canastilla-gradilla consiste en seis tubos transparentes abiertos en sus extre-
mos, de 77,5 2,5 mm de longitud cada uno, con un dimetro interno de aproximadamente 20,7 mm a 23 mm y una pared
de 1,0 mm a 2,8 mm de espesor; los tubos estn sostenidos en posicin vertical por dos placas, de 88 mm a 92 mm de dime-
tro y de 5 mm a 8,5 mm de espesor cada una, con seis orificios de 22 mm a 26 mm de dimetro cada uno, equidistantes del
centro de la placa y equidistantes entre s. Debajo de la superficie de la placa inferior, se fija una tela de alambre de acero
inoxidable tramado que posee una trama cuadrada simple con aberturas de 1,8 mm a 2,2 mm y con un dimetro de alambre
de 0,57 mm a 0,66 mm. Las piezas del aparato se arman y se sostienen rgidamente por medio de tres pernos que pasan a
travs de las dos placas. Se proporciona un medio adecuado para suspender el montaje de canastilla-gradilla del dispositivo de
ascenso y descenso, utilizando un punto de su eje.
El diseo del montaje de canastilla-gradilla se puede variar de alguna forma, siempre que se mantengan las especificaciones
para los tubos de vidrio y el tamao del tamiz de la malla. El montaje de canastilla-gradilla se ajusta a las dimensiones que se
encuentran en la Figura 7.
Discos-El uso de discos est permitido exclusivamente cuando est especificado o autorizado en la monografa. Si se es-
pecifica en la monografa individual,. cada tubo presenta un disco cilndrico de 9,5 O, 15 mm de espesor y 20, 7 O, 15 mm
de dimetro. El disco est hecho de un material plstico transparente adecuado, con un peso especfico entre 1, 18 y 1,20.
Cinco orificios paralelos de 2O,1 mm se extienden entre los extremos del cilindro. Uno de los orificios est centrado en el eje
cilndrico. Los otros orificios estn centrados a 6 0,2 mm del eje en lneas imaginarias perpendiculares al eje y paralelas entre
s. Se cortan cuatro planos idnticos de forma trapezoidal en la pared del cilindro, casi perpendiculares a los extremos del cilin-
dro. La forma trapezoidal es simtrica; sus lados paralelos coinciden con los extremos del cilindro y son paralelos a una lnea
imaginaria que conecta los centros de dos orificios adyacentes de 6 mm desde el eje cilndrico. El lado paralelo del trapezoide
en la parte inferior del cilindro tiene un largo de 1,6 O, 1 mm y sus bordes inferiores se encuentran a una profundidad de 1,5
a 1,8 mm de la circunferencia del cilindro. El lado paralelo del trapezoide en la parte superior del cilindro tiene un largo de 9,4
0,2 mm y su centro se encuentra a una profundidad de 2,6O,1 mm de la circunferencia del cilindro. Todas las superficies
del disco son lisas. Si se especifica el uso de discos en la monografa individual,. agregar un disco a cada tubo y hacer funcio-
nar el aparato segn se indica en el Procedimiento. Los discos se ajustan a las dimensiones que se encuentran en la Figura 11.

1 El uso de deteccin automtica empleando discos modificados est permitido cuando se especifica o se autoriza el uso de discos. Tales discos deben cumplir con
los requisitos de densidad y dimensin que se proporcionan en este captulo.
576 (701) Desintegracin / Pruebas Fsicas USP 39

Disco
Montaje de
Canastilla-Gradilla

1,91121,8511
0,9 1,15 superior
_l_

~f
ti
lO
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e.O
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"':.
-,~,-:-:-,~, --~l~ Vista
.....

,' : : ' ' : : ', lateral

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lO
al
20,7 0,15

Vista
inferior

Figura 1. Aparato de desintegracin. (Todas las dimensiones estn expresadas en mm.)

PROCEDIMIENTO

Tabletas Sin Cubierta-. Colocar 1 unidad de dosificacin en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si se indica,
agregar un disco. Hacer funcionar el aparato, usando agua el medio especificado como el lquido de inmersin; mantener a
37 2. Al final del tiempo especificado en la monografa, levantar la canastilla del lquido y observar las tabletas: todas las
tabletas se han desintegrado completamente. Si 1 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
tabletas adicionales. El requisito se cumple si se desintegran no menos de 16 tabletas del total de 18 tabletas analizadas.
Tabletas Con Cubierta Simple-Aplicar la prueba de Tabletas Sin Cubierta, haciendo funcionar el aparato durante el tiem-
po especificado en la monografa individual.
Tabletas de Liberacin Retardada (Recubrimiento Entrico)-Colocar 1 tableta en cada uno de los seis tubos de la ca-
nastilla y, si la tableta tiene una cubierta externa de azcar soluble, sumergir la canastilla en agua a temperatura ambiente du-
rante 5 minutos. Poner el aparato en funcionamiento utilizando fluido gstrico simulado SR a 37 2 como el lquido de in-
mersin. Al cabo de 1 hora de inmersin en el fluido gstrico simulado SR, levantar la canastilla y observar las tabletas: las
tabletas no muestran signos de desintegracin, resquebrajamiento o ablandamiento. Poner el aparato en funcionamiento utili-
zando fluido intestinal simulado SR a 37 2 como lquido de inmersin, durante el tiempo especificado en la monografa. Sa-
car la canastilla del lquido y observar las tabletas: todas las tabletas se desintegran completamente. Si 1 2 tabletas no se
desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas
se desintegran completamente.
Tabletas Bucales-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Despus de 4 horas, sacar la canastilla del lquido y observar
las tabletas: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con
12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (705) Tabletas con Ranurado Funcional 577

Tabletas Sublinguales-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Al final del tiempo especificado en la monografa indi-
vidual: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.
Cpsulas de Gelatina Dura-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Fijar a la superficie de la placa superior del mon-
taje de canastilla-gradilla, una tela de alambre que se pueda desprender, que tenga una trama cuadrada simple con aberturas
de 1,8 mm a 2,2 mm y con un dimetro de alambre de 0,60 mm a 0,655 mm, segn se describe en Montaje de Canastilla-
-Gradilla. Observar las cpsulas dentro del tiempo especificado en la monografa individual: todas las cpsulas se han desinte-
grado excepto los fragmentos de las cubiertas. Si 1 2 cpsulas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
cpsulas adicionales: no menos de 16 del total de 18 cpsulas analizadas se desintegran completamente.
Cpsulas de Gelatina Blanda-Proceder segn se indica en Cpsulas de Gelatina Dura .

(705) ATRIBUTOS DE CALIDAD PARA TABLETAS CUYO ETIQUETADO

INDICA RANURADO FUNCIONAL

PROPSITO

Este captulo provee atributos de calidad para productos cuyo etiquetado aprobado indica que las tabletas se pueden partir
para producir mltiples porciones que tienen una dosis fraccionada (cuyo etiquetado indica ranurado funcional) exacta. La
cantidad declarada en la etiqueta de las porciones partidas debe ser una fraccin simple de la cantidad declarada para la table-
ta intacta basndose en el nmero de ranuras y el tamao de la porcin partida (p.ej., una mitad, un tercio o un cuarto). Al
momento de partirlas, las tabletas intactas deben cumplir con la especificacin de la monografa. Con excepcin de la dosis, se
espera que cada porcin partida de las tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional cumpla con los atributos de calidad
de las tabletas enteras. Las porciones partidas que resultan de subdividir una tableta ranurada funcionalmente deben cumplir
con las pruebas de Particin de las Tabletas con Ranurado Funcional y Disolucin o Desintegracin provistas en este captulo.

ALCANCE

Este captulo se aplica a tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional y a las porciones partidas que representan cual-
quier fraccin declarada de la dosis completa de la tableta ranurada funcionalmente. Las tabletas deben partirse como parte
del procedimiento de prueba y se deben definir las condiciones de almacenamiento de las porciones partidas como parte de
dicho procedimiento. Para las pruebas de Disolucin o Desintegracin, los analistas deben usar slo las porciones partidas de las
tabletas que se consideran aceptables mediante la prueba de Particin de las Tabletas con Ranurado Funcional.

PARTICIN DE LAS TABLETAS CON RANURADO FUNCIONAL

Procedimiento de Prueba

1. Tomar una muestra aleatoria de 30 tabletas intactas y proceder segn se indica a continuacin.
2. Pesar con exactitud cada tableta y registrar su peso.
3. Para cada tableta intacta, determinar el peso esperado de las porciones partidas dividiendo el peso de la tableta entera
por el nmero designado de porciones partidas indicado en el etiquetado.
4. Partir manualmente cada tableta (sin ayuda mecnica) en el nmero designado de porciones partidas y pesar cada por-
cin partida.
5. Para cada tableta, determinar el porcentaje del peso esperado en cada porcin partida.
Una tableta aceptable se parte en el nmero designado de porciones y cada porcin partida tiene no menos de 75% y no
ms de 125% del peso esperado para la porcin de tableta partida. (NOTA-Separar las porciones de tableta partida obtenidas
de las tabletas aceptables para someterlas al anlisis subsiguiente de disolucin o desintegracin.]
Criterios de aceptacin: No menos de 28 de las 30 tabletas son aceptables.

DISOLUCIN

Usar porciones partidas de las tabletas que son aceptables de acuerdo con la prueba de Particin de las Tabletas con Ranura-
do Funcional.
578 (705) Tabletas con Ranurado Funcional / Pruebas Fsicas USP 39

Tabletas de Liberacin Inmediata

La disolucin para tabletas de liberacin inmediata se realiza en la etapa S2 (ver Disolucin (711 )). Analizar 12 porciones de
tableta partida de acuerdo con las especificaciones para Medio, Aparato, Tiempos y Anlisis. El promedio de los 12 resultados es
no menor que Q y ningn resultado es menor que Q- 15%.

Tabletas de Liberacin Prolongada

Realizar el anlisis de disolucin de porciones de tableta partida a partir de tabletas de liberacin prolongada usando uno de
los dos procedimientos alternativos. La monografa especifica el procedimiento que se debe usar.
Procedimiento 1 (Procedimiento para Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada, Disolucin (711 )): Analizar individual-
mente 12 porciones de tableta partida y 12 tabletas intactas.
Medio, Aparato y Anlisis: Proceder segn se indica en la monografa siguiendo la prueba apropiada que se indica en el
etiquetado. Los tiempos de muestreo de la prueba del perfil de disolucin se determinan segn se indica a continuacin. Usar
los tiempos de muestreo provistos en la prueba de disolucin apropiada de la monografa. Como mnimo, usar tres tiempos de
muestreo, de modo que no ms de uno de ellos exceda el 85% disuelto.
Calcular el factor de similitud (f2) para los resultados de las tabletas intactas y los resultados de la porcin partida de tableta:

Rt = porcentaje acumulativo del frmaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las tabletas intactas en cada uno
de los tiempos de muestreo n seleccionados
Tt = porcentaje acumulativo del frmaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las porciones de tableta partida
en cada uno de los tiempos de muestreo n seleccionados
Criterios de aceptacin: El valor calculado f2 es no menos de 50 (intervalo aceptable: 50-100).
Procedimiento 2 (Procedimiento para Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada, Disolucin (711 )): Usar una porcin par-
tida de tableta como la unidad de dosificacin. Analizar individualmente 12 unidades de dosificacin.
Medio, Aparato, Tiempos y Anlisis: Conforme a lo provisto en la monografa siguiendo el nmero de prueba apropiado
que se indica en el etiquetado.
Criterios de aceptacin: Las cantidades liberadas, como porcentajes de la cantidad declarada, en los tiempos especificados,
cumplen con los criterios de aceptacin para el nivel L2 de la Tabla de Aceptacin 2 del captulo (711 ).

DESINTEGRACIN
La prueba de desintegracin slo es necesaria cuando se usa como sustituta de la prueba de disolucin conforme a lo espe-
cificado en la monografa. Seguir el procedimiento usando porciones de las tabletas partidas que sean aceptables de acuerdo
con la prueba de Particin de fas Tabletas con Ranurado Funcional como la unidad de dosificacin (ver Desintegracin (701 )).

(711) DISOLUCIN

Cambio en la redaccin:
El captulo general Disolucin (711) est siendo armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la
Farmacopea japonesa. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armoni-
zado.
Las partes del texto de este captulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armoniza-
do, estn indicadas con smbolos (.) para especificar este hecho.
Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento de los requisitos de disolucin si estuvieran indicados en la mono-
grafa individual. de las formas farmacuticas administradas oralmente. Para los fines de este captulo general, una unidad de
dosificacin est definida como 1 tableta, 1 cpsula o la cantidad que se especifique. De los tipos de aparatos que se descri-
ben en este captulo, utilizar el que se especifica en la monografa individual. Cuando la etiqueta indica que el artculo tiene
recubrimiento entrico, y cuando la monografa individual incluye una prueba de disolucin o desintegracin sin establecer
especficamente que se aplica a artculos de liberacin retardada, emplear el procedimiento y la interpretacin indicados para
Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (711) Disolucin 579

PARA FORMAS FARMACUTICAS QUE CONTIENEN O ESTN RECUBIERTAS CON GELATINA

Si la forma farmacutica que contiene gelatina no cumple con los criterios de la Tabla de Aceptacin correspondiente (ver
Interpretacin, Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata, Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada o Formas Farmacu-
ticas .de Liberacin Retardada) debido a que existe evidencia de entrecruzamiento, el procedimiento de disolucin debe repetir-
se agregando enzimas al medio, segn se describe a continuacin, y los resu.ltados de la disolucin deben evaluarse comen-
zando por la primera etapa de la Tabla de Aceptacin correspondiente. No es necesario continuar el anlisis hast<1 la ltima
et<1pa (hasta 24 unidades) cuando los criterios no se cumplen durante la primera etapa del anlisis y se observa evidencia de
entrecruwmiento.
La gelatina puede experimentar entrecruzamiento en presencia de ciertos compuestos y/o en ciertas condiciones de almace-
namiento, incluidas entre otras, temperatura y humedad elevadas. Puede formarse una pelcula en la superficie externa y/o
interna de la cubierta de la cpsula de gelatina o en la forma farmacutica que impida la liberacin del frmaco durante la
prueba de disolucin (para ms informacin ver Cpsulas-Pruebas de Disolucin y Atributos de Caldad Relacionados (1094}).
NOTA-Todas las referencias a captulos con nmeros superiores a <1000} se proveen nic<1mente para propsitos informati-
vos que se pueden usar <;orno recursos tiles. Estos captulos no son obligatorios a menos que se exija explcitamente su aplica-
cin.

Medio de Disolucin de pH ~4,0

Enzima: Pepsina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento en pepsina purificada de la seccin Espe-
cificaciones de Reactivos
Cantidad! Una cantidad de pepsina que resulta en uria actividad de no ms de 750 000 Unidades/l de medio de disolu-
cin.

Medio de Disolucin de pH >4,0 y <6,8

Enzimas: Papana, cuya actividad ha sido determinada mediante la prueba de Valoracin en la monografa de Papana; o
bromelina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento en bromelina de la seccin Especificaciones de
Reactivos.
Cantidad: Una cantidad de papana que resulta en una actividad de no ms de 550 000 Unidades/l de medio de disolu-
cin, o una cantidad de bromelina que resulta en una actividad de no ms de 30 unidades de digestin de gelatina (GDU,
por sus siglas en ingls)/L de medio de disolucin.

Medio de Disolucin de pH :::::6,8

Enzima: Pancreatina, cuya actividad de proteasa ha sido determinada mediante el procedimiento de Valoracin de activi-
dad de proteasa (Poder de digestin de casena) en 1<1 monografa de Pancreatina
Cantidad: Una cantidad de pancreatna que resulta en una activid<1d de no ms de 2000 Unidades/L de proteasa en el
medio de disolucin

Medios de Disolucin que Contienen Aqentes Tensoactivos u Otros Ingredientes que

Desnaturalizan las Enzimas

S el medio de disolucin contiene agentes tensoactivos u otros ingredientes que desnaturalizan la enzima usada, se puede
implementar una etapa de pretratamiento en la prueba de disolucin de la forma farmacutica. Esta etapa de pretratamiento
se realiza usando el medio de disolucin especificado sin el agente tensoactivo o ingrediente y agregando la cantidad apropia-
da de enzima segn el pH del medio. La cantidad de enzima agregada es apropiada para el volumen de medio de disolucin
usado en el pretratamiento. Para obtener el volumen de medio especificado para la prueba de disolucin final, la etapa de
pretratamiento se puede realizar con un volumen ms pequeo de medio sin el ingrediente, de manera que el volumen final
se obtenga al agregar el ingrediente al final de la etapa de pretratamiento. Todas las dems condiciones de prueba (aparato,
rotacin o velocidad de flujo) deben mantenerse conforme a lo descrito en el mtodo o la monografa. Tpicamente, la dura-
cin de la etapa de pretratamiento es no mayor de 15 minutos. El tiempo requerido de pretratamiento debe evaluarse para
cada caso en particular y justificarse con bases cientficas. Este tiempo debe incluirse en el tiempo total de fa prueba. Por ejem-
plo, si el tiempo total de la prueba es 45 minutos y 15 minutos se usan para la etapa de pretratamiento, la prueba continuar
durante 30 minutos despus de agregar el ingrediente. 4 usm
Estndares de Referencia USP (11 )-ER Tabletas de Prednisona USP .
580 (711) Disolucin / Pruebas Fsicas USP 39

APARATO

Aparato 1 (Aparato con Canastilla)

El aparato consta de: un vaso, con o sin tapa, de vidrio u otro material inerte y transparente; 1 un motor; un eje propulsor
metlico y una canastilla cilndrica. El vaso est parcialmente sume"rgido en un bao de agua adecuado de cualquier dimensin
conveniente o recibe calor de un dispositivo adecuado, como por ejemplo una camisa de calentamiento. Durante el transcurso
de la prueba, el bao de agua o el dispositivo de calentamiento mantienen la temperatura en el interior del vaso a 37 0,5 y
garantizan que el fluido del bao se mantenga en movimiento suave y constante. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual est colocado, aumenta significativamente el movimiento, agitacin o vibracin, por encima de los producidos por el
elemento de agitacin que gira con suavidad. Es preferible emplear un aparato que permita observar la muestra y el elemento
de agitacin durante la prueba. El vaso es cilndrico y de fondo semiesfrico con las siguientes dimensiones y capacidades:.
para 1 L de capacidad nominal., la altura es de 160-21 O mm y el dimetro interno es de 98-106 mm; para 2 L de capacidad
nominal, la altura es de 280-300 mm y el dimetro interno es de 98-106 mm; y para 4 L de capacidad nominal, la altura es de
280-300 mm y el dimetro interno es de 145-155 mm . Las paredes del vaso cilndrico tienen un reborde en el extremo supe-
rior. Se puede utilizar una tapa para retardar la evaporacin. 2 Colocar el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde
una distancia mxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones
significativas que pudieran afectar los resultados. Emplear un dispositivo para regular la velocidad con el objeto de seleccionar
y mantener la velocidad de rotacin del eje propulsor a la velocidad especificada en la monografa individual. con una aproxi-
macin de 4%.

Los componentes del eje y de la canastilla del elemento de agitacin son de acero inoxidable tipo 316 o de otro material
inerte, segn las especificaciones de la Figura 7. Se puede emplear una canastilla con un recubrimiento de oro de aproximada-
mente 0,0001 pulgadas (2,5 m) de espesor. La unidad de dosificacin se coloca en una canastilla seca al comienzo de cada
prueba. La distancia entre el fondo interno del vaso y el fondo de la canastilla se mantiene a 25 2 mm durante la prueba.

1 Los materiales deben ser tales que no produzcan sordn, reacciones ni interferencias con la muestra en anlisis.
2 Si se usa una tapa, verificar que cuenta con orificios para insertar fcilmente un termmetro y para retirar las muestras.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (711) Disolucin 581

6,3 a 6,5
9,4 a 10,1 mm
Orificio de ventilacin

2,0 0,5 mm de dimetro

Seguro de retencin con

3 lengetas radiales a 120 entre s 5,10,5 mm
~
Abertura libre
20,2 1,0 mm
___Jr.==='1_,_,lP-
Tamiz O.D.
22,2 1,0 mm
1 t
27,0
37,0 1,0 mm Tamiz con entramado soldado:
3,0mm malla
0,22-0,31 mm de dimetro del alambre
abierta
_l~ con aberturas en el alambre de
0,36-0,44 mm.
A/ [Nota-La malla podra alterarse
ligeramente despus de soldarla.]
[Nota- La mxima desviacin permisible
en "A" es 1,0 mm cuando la parte
se gira sobre un eje lineal central con
la cantastilla montada.]

25,0 3,0 mm

Figura 1 . Elemento de agitacin de canastilla

Aparato 2 (Aparato con Paleta)

Emplear el Aparato 7, excepto que se usa una paleta compuesta por un aspa y un eje como elemento de agitacin. Colocar
el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde una distancia mxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje
vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. La lnea central vertical
del aspa est alineada con el eje propulsor de forma tal que el extremo inferior del aspa est nivelado con el extremo inferior
del eje propulsor. La paleta cumple con las especificaciones que se indican en la Figura 2. La distancia entre el fondo interno
del vaso y el borde inferior del aspa se mantiene a 25 2 mm durante la prueba. El aspa y el eje rgidos, metlicos o de otro
material inerte adecuado forman una sola unidad. En algunos casos, se puede usar un dispositivo desmontable de dos partes
adecuado, siempre y cuando las partes permanezcan firmemente ajustadas durante la prueba. El eje y el aspa de la paleta pue-
den estar recubiertos con un material inerte adecuado. Dejar que la unidad de dosificacin se hunda hasta el fondo del vaso
antes de empezar a rotar el aspa. A las unidades de dosificacin se les puede agregar una pieza pequea, suelta, de algn
material no reactivo, como por ejemplo un par de vueltas de alambre, para evitar que floten. La Figura 2a ilustra un dispositivo
de sumersin alternativo. Tambin se pueden emplear otros dispositivos de sumersin validados.
582 (711) Disolucin / Pruebas Fsicas USP 39

Dimetro de
9,4 a 10,1 mm

NOTAS
(1) Las dimensiones A y B
no deben variar en ms
de 0,5 mm cuando esta
pieza se gira sobre el eje
lineal central.
(2) Las tolerancias son de
1,O mm, a menos que
se indique lo contrario.

'~
Radio41,5mm

Radlo1,20,2~
,-.
7-------~

i A
________:i .. ,:L
35,Bmm

j:t_ "'--~~!--~-'
0,5mm

..L.

4,01,0mm

1 J-.............__---.-------.1 _ L
l.__~--............,,.
74,0 mma 75,0 mm
.,~
- .

Figura 2. Elemento de agitacin de paleta

t
3,5-4,o:f= I3.s-4,o
.

12,00,2
A: Tapa de alambre resistente a los cidos
B: Soporte de alambre resistente a tos cidos

Figura 2a. Dispositivo de sumersin alternativo. Todas las dimensiones estn expresadas en mm.

Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

El equipo se compone de un grupo de vasos cilndricos de vidrio de fondo plano, un grupo de cilindros oscilantes de vidrio,
accesorios de un material inerte (de acero inoxidable tipo 316 o de otro material adecuado) y mallas de un material adecuado
no absorbente ni reactivo, que se fijan a la parte superior e inferior de los cilindros oscilantes; un motor y una transmisin que
hacen oscilar los cilindros en sentido vertical dentro de los vasos y, de ser necesario, traslada los cilindros oscilantes en sentido
horizontal hacia otra hilera de vasos. Los vasos estn parcialmente sumergidos en un bao de agua adecuado de un tamao
conveniente que permita mantener la temperatura a 37 0,5 durante la prueba. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual el equipo est colocado, produce una cantidad importante de movimiento, agitacin o vibracin, que exceda la oscila-
cin vertical suave del cilindro oscilante. Se usa un dispositivo que permite elegir la velocidad de oscilacin y mantenerla a la
velocidad de inmersin especificada en la monografa individual,. dentro de 5%. Es preferible emplear un aparato que per-
mita observar las muestras y los cilindros oscilantes. Los vasos cuentan con una tapa de evaporacin que permanece colocada
durante la prueba. Los componentes se ajustan a las dimensiones que se indican en la Figura 3, a menos que se especifique
algo diferente en la monografa individual .
USP 39 Pruebas Fsicas/ (711) Disolucin 583

50,8 1
' I/ Orificios para aire
Dimetro 3,9 O, 1

~--rl
1
- 1
+I 1 1 Tapa para evaporacin
CXl
1
g- :
1 1
1

Cilindro de oscilacin
vertical de vidrio

+I
oQ)
Vaso de vidrio

L..-- __ .J

Figura 3. Aparato 3 (cilindro oscilante)

Aparato 4 (Celda de Flujo)

El equipo se compone de un depsito y una bomba para el Medio de disolucin, una celda de flujo y un bao de agua que
mantiene el Medio de disolucin a 37 0,5. Usar la celda del tamao especificado en la monografa individual .
La bomba desplaza el Medio de disolucin a travs de la celda de flujo en direccin ascendente. La bomba tiene un intervalo
de operacin de 240 a 960 mL/h y las velocidades de flujo estndares son de 4 mL, 8 mL y 16 mL/min. La bomba debe sumi-
nistrar un flujo constante (5% de la velocidad de flujo nominal); el perfil del flujo es sinusoidal con una pulsacin de 120 1O
pulsos por minuto. Se puede usar tambin una bomba no pulstil. Los procedimientos de la prueba de disolucin en los que se
usa una celda de flujo deben estar caracterizados con respecto a la velocidad y a las pulsaciones.
La celda de flujo (ver Figura 4 y Figura 5) de un material transparente e inerte, est montada verticalmente con un sistema de
filtro (especificado en la monografa individual) que impide que se escapen partculas no disueltas de la parte superior de la
celda; el dimetro estndar de la celda se ubica entre 12 mm y 22,6 mm; la base cnica de la celda est generalmente llena de
pequeas perlas de vidrio de aproximadamente 1 mm de dimetro y una de esas perlas, de aproximadamente 5 mm, est
ubicada en el pice para proteger el tubo de entrada del fluido; se dispone de un portatabletas (ver Figura 4 y Figura 5) para
colocar formas farmacuticas especiales, p.ej., tabletas estratificadas. La celda se sumerge en un bao de agua y se mantiene la
temperatura a 370,5.
584 (711) Disolucin / Pruebas Fsicas USP 39

Cmara del filtro

Tamiz con malla N 40

Dimetro del alambre = 0,2
Apertura = 0,45
U)
ci
+I
U)
'--...
~ Muesca para el soporte
de tabletas

(03)
1
- __ J ___ '
min3

t __L 0 0,8 0,05

0 =Dimetro

V__
3

24,00,5

Figura 4: Celda grande para tabletas y cpsulas (arriba) y portatabletas para la celda grande (abajo) del Aparato 4. (Todas las
dimensiones estn expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)
USP 39 Pruebas Fsicas / (711) Disolucin 585

Cmara del fihro

-.----'-- 'Y""~~.;i,~~J~-Tamiz con malla N 40

Dimetro del alambre =0,2
=
Apertura 0,45

"'o+I
"'o+I "'ari
o
"'
12112 0 2 "-Muesca para el soporte
~ de tabletas

0=Dimetro

13,5 0,5

Figura 5: Celda pequea para tabletas y cpsulas (arriba) y portatabletas para celda pequea (abajo) del Aparato 4. (Todas
las dimensiones estn expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)

El aparato emplea un mecanismo de abrazadera y dos juntas tipo anillo (0-rings) para fijar la celda. La bomba est separada
de la unidad de disolucin a fin de proteger a esta ltima de las vibraciones que pueda originar la bomba. La bomba no debe
estar colocada en un nivel superior al de los recipientes de depsito. Las conexiones entre tubos son lo ms cortas posible.
Emplear tuberas de material inerte adecuado, como por ejemplo tefln de aproximadamente 1,6 mm de dimetro interno y
conexiones con terminaciones aplanadas qumicamente inertes.

APTITUD DEL APARATO

La determinacin de la aptitud del aparato que se utilizar en Ja prueba de disolucin debe incluir el cumplimiento de las
dimensiones y tolerancias indicadas anteriormente. Adems, los parmetros de prueba cruciales que es necesario controlar pe-
ridicamente mientras se usa el aparato incluyen el volumen y la temperatura del Medio de disolucin, la velocidad de rotacin
(Aparato 1 y Aparato 2), la velocidad de inmersin (Aparato 3) y la velocidad de flujo del medio (Aparato 4).
Controlar peridicamente que el desempeo del equipo de disolucin sea aceptable. Comprobar la aptitud de un aparato
individual mediante la Prueba de verificacin del desempeo.
586 (711) Disolucin / Pruebas Fsicas USP 39

Prueba de verificacin del desempeo, Aparato 1 y Aparato 2: Analizar el ER Tabletas de Prednisona USP, de acuerdo
con las condiciones operativas especificadas. El aparato es apto si los resultados obtenidos estn dentro del intervalo aceptable
que se indica en la hoja de datos tcnicos especfica para el lote usado y el aparato analizado.
Prueba de verificacin del desempeo, Aparato 3: [Se incluir ms adelante.]
Prueba de verificacin del desempeo, Aparato 4: [Se incluir ms adelante.].

PROCEDIMIENTO

Aparato 1 y Aparato 2

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN INMEDIATA

Colocar el volumen indicado de Medio de disolucin( 1%) en el vaso del aparato indicado en la monografa individual.,
ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de disolucin a 37 0,5 y retirar el termmetro. Colocar 1 unidad de dosificacin en
el aparato, verificando que no queden burbujas de aire en su superficie y poner el aparato en funcionamiento inmediatamente
a la velocidad indicada en la monografa individual . Dentro del intervalo de tiempo especificado, o a cada tiempo especifica-
do, retirar una muestra de una zona equidistante entre la superficie del Medio de disolucin y la parte superior de la canastilla o
aspa rotatoria que no est a menos de 1 cm de la pared del vaso. [NOTA-Si se indica tomar ms de una muestra, usar volme-
nes iguales de Medio de disolucin nuevo a 37 en lugar de las alcuotas tomadas para el anlisis o, si se demuestra que no es
necesario reemplazar el medio, corregir el clculo por el cambio de volumen. Mantener el vaso cubierto durante el transcurso
de la prueba y verificar la temperatura de la mezcla en anlisis con una frecuencia adecuada.] Realizar el anlisis segn se indi-
ca en la monografa individual. empleando un mtodo de valoracin adecuado. 3 Repetir la prueba con otras unidades de la
forma farmacutica.
Si se emplean equipos automticos para muestreo o si se introducen otras modificaciones en el aparato, es necesario verifi-
car que los resultados obtenidos con el aparato modificado son equivalentes a los obtenidos con el aparato estndar descrito
en este captulo general.
Medio de disolucin: Emplear un medio de disolucin adecuado. Emplear el disolvente especificado en la monografa
individual . El volumen especificado se refiere a mediciones realizadas entre 20 y 25. Si el Medio de disolucin es una solucin
amortiguada, ajustar el pH al valor indicado con una aproximacin de 0,05 unidades con respecto al pH indicado en la mono-
grafa individual.. [NOTA-Los gases disueltos pueden causar la formacin de burbujas que pueden alterar los resultados de la
prueba. Si los gases disueltos interfieren en los resultados de la disolucin, eliminarlos antes de iniciar las pruebas. 4 )
Tiempo: Cuando se especifica un solo tiempo, la prueba se puede concluir en un perodo ms corto, siempre y cuando se
cumpla el requisito de cantidad mnima disuelta. Tomar las muestras slo en los tiempos indicados con una tolerancia de 2%.
Procedimiento para una muestra combinada para formas farmacuticas de liberacin inmediata: Usar este procedi-
miento cuando se especifica un Procedimiento para una Muestra Combinada en la monografa individual. Proceder segn se in-
dica en Procedimiento para Aparato 7 y Aparato 2 en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata. Combinar volmenes iguales
de soluciones filtradas de las seis o doce muestras individuales tomadas y emplear la muestra combinada como la muestra de
prueba. Determinar la cantidad promedio del ingrediente activo disuelto en la muestra combinada .

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN PROLONGADA

Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata.

Medio de disolucin: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata.
Tiempo: Los tiempos de prueba, que generalmente son tres, se expresan en horas.

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN RETARDADA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Emplear el Mtodo A o el Mtodo By el aparato especificado en la monografa individual . Todos los tiempos de prueba
especificados deben cumplirse con una tolerancia de 2%, a menos que se especifique algo diferente.

3 Filtrar las muestras de prueba inmediatamente despus de tomarlas, salvo que se demuestre que la filtracin no es necesaria. Usar un filtro inerte que no adsorba
el ingrediente activo y que no contenga sustancias extrables que pudieran interferir en el anlisis.
4 Un mtodo para eliminar los gases es el siguiente: Calentar el medio, mezclando suavemente, hasta aproximadamente 41 ; inmediatamente filtrar al vaco utili-
zando un filtro con un tamao de poro de 0,45 m o menor, mezclando vigorosamente y continuar mezclando al vaco durante aproximadamente 5 minutos.
Tambin se puede emplear otra tcnica de desgasificacin validada para eliminar los gases disueltos.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (711) Disolucin 587

Mtodo A Procedimiento (a menos que se indique algo diferente en la monografa individual).

ETAPA CIDA

Colocar 750 mL de cido clorhdrico O, l N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una tempe-
ratura de 37 0,5. Colocar 1 unidad de dosificacin en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la
velocidad especificada en la monografa.
Despus de funcionar 2 horas con cido clorhdrico O, 1 N, retirar una alcuota del lquido y proceder de inmediato segn se
indica para la Etapa Amortiguada.
Realizar un anlisis de la alcuota empleando un mtodo de valoracin adecuado. El procedimiento se especifica en la mo-
nografa individual .

ETAPA AMORTIGUADA

[NOTA-Completar la adicin de la solucin amortiguadora y ajuste de pH dentro de los 5 minutos.] Con el aparato en fun-
cionamiento a la velocidad indicada en la monografa., agregar 250 mL de fosfato tribsico de sodio 0,20 M previamente
equilibrado a 37 0,5 al lquido del vaso. Ajustar, si fuera necesario, con cido clorhdrico 2 N o hidrxido de sodio 2 N a un
pH de 6,8 0,05. Dejar el aparato funcionando durante 45 minutos o durante el tiempo especificado en la monografa indivi-
dual . Al finalizar ese perodo, retirar una alcuota del lquido y efectuar el anlisis empleando un mtodo de valoracin adecua-
do. El procedimiento se especifica en la monografa individual. La prueba puede concluir en un perodo ms corto que el es-
pecificado para la Etapa Amortiguada si el requisito de cantidad mnima disuelta se cumple antes de lo previsto .

Mtodo B Procedimiento (a menos que se indique algo diferente en la monografa individual).

ETAPA CIDA

Colocar 1000 mL de cido clorhdrico O, 1 N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una tempe-
ratura de 37 0,5. Colocar 1 unidad de dosificacin en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la
velocidad especificada en la monografa . Despus de funcionar 2 horas con cido clorhdrico O, 1 N, retirar una alcuota del
lquido y proceder de inmediato segn se indica para la Etapa Amortiguada.
Realizar un anlisis de la alcuota empleando un mtodo de valoracin adecuado. El procedimiento se especifica en la mo-
nografa individual .

ETAPA AMORTIGUADA

[NOTA-Para esta etapa del procedimiento, emplear una solucin amortiguadora previamente equilibrada a una temperatura
de 37 0,5.] Escurrir el cido del vaso y agregarle 1000 mL de una solucin amortiguadora de fosfato de pH 6,8, preparada
mezclando cido clorhdrico O, l N con fosfato tribsico de sodio 0,20 M (3:1) y ajustando, si fuera necesario, con cido clorh-
drico 2 N o con hidrxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 0,05. [NOTA-Este paso tambin puede llevarse a cabo retirando del
aparato el vaso que contiene el cido, reemplazndolo con otro vaso que contenga la solucin amortiguadora y transfiriendo
la unidad de dosificacin al vaso que contiene la solucin amortiguadora.]
Dejar funcionar el aparato durante 45 minutos o durante el tiempo especificado en la monografa individual . Al cabo de
ese perodo, retirar una alcuota del lquido y analizarla empleando un mtodo de valoracin adecuado. El procedimiento se
especifica en la monografa individual. La prueba puede concluir en un perodo ms corto que el especificado para la Etapa
Amortiguada si el requisito de cantidad mnima disuelta se cumple antes de lo previsto .

Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN INMEDIATA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Colocar el volumen indicado del Medio de disolucin en cada vaso del aparato, ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de
disolucin a 37 0,5 y retirar el termmetro. Colocar 1 unidad de la forma farmacutica en cada uno de los seis cilindros osci-
lantes, procurando eliminar las burbujas de aire de la superficie de cada unidad de dosificacin y poner en funcionamiento el
aparato inmediatamente, segn se especifica en la monografa individual . Durante el recorrido ascendente y descendente, los
cilindros oscilantes recorren una distancia total de 9,9-1O,1 cm. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o en cada tiempo
especificado, elevar los cilindros oscilantes y retirar una porcin de la solucin en anlisis de una zona equidistante entre la
superficie del Medio de disolucin y el fondo de cada vaso. Efectuar el anlisis segn se indica en la monografa individual . Si
fuera necesario, repetir la prueba con otras unidades de forma farmacutica.
Medio de disolucin: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
Tiempo: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
588 (711) Disolucin / Pruebas Fsicas USP 39

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN PROLONGADA

Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 3.

Medio de disolucin: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada en Aparato 1 y Aparato
2.
Tiempo: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada en Aparato 1 y Aparato 2.

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN RETARDADA

Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada, Mtodo Ben Aparato 1 y Aparato 2 usando una fila
de vasos para los medios de la etapa cida y la siguiente fila de vasos para los medios de la etapa amortiguada, y usando los
volmenes de medio especificados (generalmente 300 ml).
Tiempo: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.

Aparato 4 (Celda de Flujo)

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN INMEDIATA

Colocar las perlas de vidrio en la celda especificada en la monografa. Colocar 1 unidad de dosificacin sobre las perlas o, si
as se especifica en la monografa,. sobre un soporte de alambre. Ensamblar la tapa del filtro y unir las partes mediante una
abrazadera adecuada. Introducir con la bomba el Medio de disolucin entibiado a 37 0,5 a travs del extremo inferior de la
celda a fin de obtener la velocidad de flujo especificada en la monografa individual. y medida con una exactitud del 5%.
Recoger el eluato en fracciones en cada tiempo indicado. Efectuar el anlisis segn se indica en la monografa individual . Re-
petir la prueba con otras unidades de forma farmacutica.
Medio de disolucin: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.
Tiempo: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN PROLONGADA

Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 4.

Medio de disolucin: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 4.
Tiempo: Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 4.

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN RETARDADA

Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada en Aparato 1 y Aparato 2 empleando los medios
indicados.
Tiempo-Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada en Aparato 1 y Aparato 2.

INTERPRETACIN

Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual,. se cumplen los requisitos si las cantidades de ingre-
diente activo disuelto a partir de las unidades de dosificacin analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptacin 1. Continuar con las
tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a 51 o 52 La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo
disuelto especificada en la monografa individual,. expresada como un porcentaje del contenido declarado de la unidad de
dosificacin; los valores de 5%, 15% y 25% en la Tabla de Aceptacin 1 son los porcentajes del contenido declarado de forma
que estos valores y Q estn expresados en unidades equivalentes.
Ta bl a d e Aceptac1on
"' 1
Nde
Unidades Anall-
Etapa zadas Criterios de Aceptacin
5, 6 Ninquna unidad es menor que Q + 5%.
5, 6 El promedio de 12 unidades (5 1 + 5,) es :?.Q, y ninguna unidad es <Q - 15%.
El promedio de 24 unidades (5 1 + 52 +53) es :?.Q, no ms de 2 unidades son <Q- 15%, y ninguna unidad
5, 12 es <Q- 25%.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (711) Disolucin 589

Muestra Combinada para Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se cumple con los requisitos si las cantidades de in-
grediente activo disuelto a partir de la muestra combinada se ajustan a la Tabla de Aceptacin para una Muestra Combinada
adjunta. Continuar con las tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a 51 o 52 La cantidad, Q, es la cantidad
de ingrediente activo disuelto especificada en la monografa individual, expresada como un porcentaje del contenido declara-
do.
Tabla de Aceptacin para una Muestra Combinada
N de
Unidades Anali- Criterios de
Etapa zadas Aceptacin
5, 6 La cantidad disuelta promedio no es menor que Q + 10%.
57 6 La cantidad disuelta promedio (5 7 + 57) es zQ + 5%.
53 12 La cantidad disuelta promedio (5 1 + 52 + 5 1) es zQ.

Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual., se cumplen los requisitos si las cantidades de ingre-
diente activo disuelto a partir de las unidades de dosificacin analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptacin 2. Continuar con los
tres niveles de prueba a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2 Los lmites de la cantidad de ingrediente activo disuelto
se expresan como porcentajes del contenido declarado. Los lmites comprenden cada valor de Q;, que representa la cantidad
disuelta en cada intervalo fracciona! de dosificacin especificado. Si se especifica ms de un intervalo en la monografa indivi-
dual., los criterios de aceptacin se aplican por separado a cada intervalo.
Tabla de Aceptacin 2
Nde
Unidades Anall-
Nivel zadas Criterios
Ningn valor individual se encuentra fuera de los intervalos especificados y, en el momento final de la
L, 6 prueba, ningn valor individual es menor que la cantidad especificada.
El valor promedio de las 12 unidades (L 1 + L2) se encuentra dentro de cada intervalo especificado y no es
menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; ningn valor representa >del
10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; y ningn valor representa> del
10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prue-
L, 6 ba.
El valor promedio de las 24 unidades (L 1 + L2 + L3) se encuentra dentro de los intervalos especificados y
no es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; no ms de 2 de las 24
unidades presentan ms del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; no
ms de 2 de las 24 unidades presentan > del 10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad
especificada en el momento final de la prueba; y ninguna de las unidades presenta > del 20% del con-
tenido declarado fuera de cada uno de los intervalos especificados ni presenta >del 20% del contenido
L, 12 declarado por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba.

Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Etapa cida: A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual., se cumplen los requisitos de esta
parte de la prueba si las cantidades, basadas en el porcentaje de contenido declarado, de ingrediente activo disuelto a partir
de las unidades analizadas, se ajustan a la Tabla de Aceptacin 3. Continuar con todos los niveles de prueba a menos que los
resultados de la Etapa cida y la Etapa amortiguada se ajusten en un nivel previo.
Tabla de Aceptacin 3
N de
Unidades Anali-
Nivel zadas Criterios
A, 6 Ningn valor individual de la cantidad disuelta excede el 10%.
El promedio de la cantidad disuelta de las 12 unidades (A 1 + A2) no es ms del 10% y ninguna unidad
A? 6 individual se disuelve > del 25%.
El promedio de la cantidad disuelta de las 24 unidades (A 1 + A2 + A3) no es ms del 10% y ninguna
A, 12 unidad individual se disuelve > del 25%.
590 (711) Disolucin / Pruebas Fsicas USP 39

Etapa amortiguada: A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual., se cumplen los requisitos si
las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptacin 4. Continuar
con los tres niveles de prueba a menos que los resultados de las dos etapas se ajusten antes de lo previsto. El valor de Q en la
Tabla de Aceptacin 4 es el 75% disuelto a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual . La cantidad,
Q, especificada en la monografa individual., representa la cantidad total de ingrediente activo disuelto en la Etapas acida y la
Etapa amortiguada, expresada como un porcentaje del contenido declarado. Los valores de 5%, 15% y 25% que aparecen en
la Tabla de Aceptacin 4 son los porcentajes del contenido declarado de forma que estos valores y Q estn expresados en los
mismos trminos.
Tabla de Aceptacin 4
N de
Unidades Anall-
Nivel zadas Criterios
81 6 Cada unidad no es menor que Q + 5%.
82 6 El promedio de 12 unidades (8 1 + 82) es ?:Q y ninguna unidad es <Q - 15%.
El promedio de 24 unidades (8 1 + 82 + 83) es ?:Q, no ms de 2 unidades son <Q - 15%, y ninguna un-
83 12 dad es <Q - 25%.

(721) INTERVALO DE DESTILACIN

Para determinar el intervalo de temperaturas dentro del cual se destila un lquido oficial, o el porcentaje de material que se
destila entre dos temperaturas especificadas, emplear el Mtodo 1 o el Mtodo 11 segn se indica en la monografa individual.
El lmite inferior del intervalo es la temperatura indicada por el termmetro cuando la primera gota del condensado deja la pun-
ta del condensador y el lmite superior es el Punto Seco, es decir, la temperatura a la cual la ltima gota de lquido se evapora
del fondo del matraz de destilacin, sin tener en cuenta el lquido que pueda quedar en las paredes del matraz, o la tempera-
tura observada al recogerse la proporcin especificada en la monografa individual.
NOTA-Enfriar todos los lquidos que destilan por debajo de 80 a entre 1 O y 15 antes de medir la muestra a destilar.

MTODO 1

Aparato-Emplear un aparato similar al especificado para el Mtodo 11, excepto que se debe usar un matraz de destilacin
que tenga una capacidad de 50 a 60 mL y que tenga un cuello de 1 O a 12 cm de largo y 14 a 16 mm de dimetro interno. La
perforacin de la placa aislante superior, si se emplea una, debe ser tal que cuando el matraz se fija en ella, la porcin del
matraz que queda por debajo de la superficie superior del material aislante tenga una capacidad de 3 a 4 ml.
Procedimiento-Proceder segn se indica en el Mtodo 11, pero colocar en el matraz slo 25 mL del lquido a analizar.

Cambio en la redaccin:

MTODO 11

Aparato-Emplear un aparato que conste de las siguientes partes:

Matraz de Destilacin-Un matraz de destilacin de fondo redondo, de vidrio resistente al calor, de 200 mL de capacidad y
con una longitud total de 17 a 19 cm y un cuello de 20 a 22 mm de dimetro interno. A media distancia del cuello, aproxima-
damente a 12 cm del fondo del matraz, tiene conectado un brazo lateral de 1 O a 12 cm de largo y 5 mm de dimetro interno,
que forma un ngulo de 70 a 75 con la parte inferior del cuello.
Condensador-Un condensador recto de vidrio de 55 a 60 cm de largo con una camisa de agua de aproximadamente 40
cm de largo, o un condensador de otro diseo con una capacidad de condensacin equivalente. El extremo inferior del con-
densador puede ser curvo para que acte como tubo de salida, o puede conectarse a un adaptador acodado que cumpla con
el mismo propsito.
Placas Aislantes-Dos piezas de placas aislantes cuadradas de 5 a 7 mm de espesor y de 14 a 16 cm de lado, apropiadas
para concentrar el calor en la parte inferior del matraz. Cada placa tiene un orificio en el centro y las dos placas difieren slo en
el dimetro del orificio, es decir, los dimetros son 4 cm y 1 O cm, respectivamente. Cuando se utilizan, las placas se colocan
una sobre la otra en un trpode u otro soporte adecuado, con la placa que tiene el orificio ms grande colocada sobre la otra.
Receptor-Una probeta graduada de 100 mL con subdivisiones de 1 ml.
Termmetro-Para evitar la necesidad de correccin por vstago emergente, se recomienda un termmetro exactamente
normalizado, de inmersin parcial con subdivisiones lo ms pequeas posibles (no ms de 0,2). Los termmetros adecuados
estn disponibles como series ASTM E-1 de 37C a 41Cyde102C a 107C (ver Advertencias y Requisitos Generales, 6.80.30.
Dispositivos de Medicin de Temperatura (AFOl-may-2016). Cuando se coloca en posicin, el vstago queda ubicado en el centro
USP 39 Pruebas Fsicas/ (724) Liberacin de Frmacos 591

del cuello y la parte superior de la cmara de contraccin (o bulbo, si se emplea uno de 37C o 38C) est a la altura del borde
inferior de la salida del brazo lateral.
Fuente de Calor-Un mechero Bunsen pequeo, o un calentador o manto elctricos con una capacidad de ajuste compara-
ble a la de un mechero Bunsen.
Procedimiento-Ensamblar el aparato y colocar en el matraz 100 ml del lquido a analizar, evitando que penetre lquido
por el brazo lateral. Insertar el termmetro, proteger todo el ensamble de mechero y matraz de las corrientes de aire externas
y aplicar calor, regulndolo para que transcurran entre 5 y 1O minutos hasta que la primera gota del destilado caiga del con-
densador. Continuar la destilacin a una velocidad de 4 a 5 ml de destilado por minuto, recogiendo el destilado en el recep-
tor. Observar la temperatura cuando la primera gota del destilado caiga del condensador y nuevamente cuando la ltima gota
de lquido se evapora del fondo del matraz o cuando el porcentaje especificado haya destilado. A menos que se especifique
algo diferente en la monografa individual, aplicar la correccin por vstago emergente cuando sea necesario e informar las
temperaturas ajustando la presin baromtrica por la siguiente frmula:
t = t 0 +[(t0 10-4 + 0,033)(760 - p)]

en donde tes la temperatura de ebullicin corregida, en la escala Celsius; t 0 es la temperatura de ebullicin medida, en la
escala Celsius; y p es la presin baromtrica al momento de la medicin, en mm Hg.

(724) LIBERACIN DE FRMACOS

ALCANCE

Esta prueba se provee para determinar el cumplimiento con los requisitos de liberacin o disolucin de frmacos cuando se
declara en las monografas individuales para sistemas transdrmicos (STO) y otras formas farmacuticas. A partir de los tipos de
aparatos aqu descritos, usar el especificado en la monografa individual.

NORMAS GENERALES DE LIBERACIN DE FRMACOS

Aparato 5 (Paleta sobre Disco)

Aparato: Usar la paleta y el vaso del Aparato 2 segn se describe en Disolucin (711 ), agregando un dispositivo en forma de
disco diseado para mantener el STO en el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco est diseado para minimizar todo
volumen "muerto" entre el disco y el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco mantiene el STO plano y se coloca de tal
manera que la superficie de liberacin sea paralela a la parte inferior del aspa de la paleta (ver la Figura 1a, la Figura 1by la
Figura 1e). Se mantiene una distancia de 25 2 mm entre el aspa de la paleta y la superficie del dispositivo en forma de disco
durante la prueba. Se pueden usar otros dispositivos adecuados (ver la Figura 2), siempre que no adsorban o absorban, reac-
cionen o interfieran con la muestra en anlisis.
592 (724) Liberacin de Frmacos / Pruebas Fsicas USP 39

Vaso de disolucin

4-------l'--- Paleta

Dispositivo en forma
de disco

Dispositivo en forma
de disco

Figura 1a. Paleta sobre disco.

(Todas las mediciones se expresan en mm a menos que se indique de otro modo.)

Tamiz de malla 17
090mm Paleta
(Ver <711>)

idrio c;te reloj 090mm

Figura 1b. Paleta sobre disco (malla y vidrio de reloj).

USP 39 Pruebas Fsicas/ (724) Liberacin de Frmacos 593

O 76mm x 45
d~ permetro -

Material:
PVDF

Figura 1 c. Broche para sujetar la malla y el vidrio de reloj.

Figura 2. Malla de alambre de sujecin.

Aptitud del aparato: Proceder segn se indica en Aparato 2 en Disolucin (711 ), Aptitud del Aparato, Prueba de Verificacin del
Desempeo, Aparatos 7 y 2.
Medio: Proceder segn se indica en Medio de Disolucin en Disolucin (711 ), Procedimiento, Aparato 7 y Aparato 2, Formas Far-
macuticas de Liberacin Inmediata.
Procedimiento
Colocar el volumen declarado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 0,5.
Aplicar el STD al dispositivo en forma de disco, asegurndose de que la superficie de liberacin est lo ms lisa posible y que
el STD est completamente sujeto al disco con firmeza. El STD con la superficie de liberacin hacia arriba puede sujetarse al
disco usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una malla o una
membrana. Se debe tener cuidado de evitar fa presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la pre-
sencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado la capa protectora del STD sin daar la superficie de ste ltimo.
Colocar el dispositivo en forma de disco de forma plana en el fondo del vaso con la superficie de liberacin hacia arriba y
paralela borde del aspa de la paleta y de la superficie del Medio. Asegurarse de que la superficie del STD est libre de burbujas
de aire. El borde inferior de la paleta est a 25 2 mm de la superficie del dispositivo en forma de disco. Se puede cubrir el
vaso durante la prueba para minimizar la evaporacin.
Poner en funcionamiento inmediatamente el aparato a la velocidad especificada en la monografa.
En cada intervalo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte superior
del aspa, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso.
Realizar el anlisis en cada alcuota de muestra segn se indica en la monografa individual, corrigiendo por cualquier prdi-
da de volumen, segn sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STD adicionales como sean necesarios.
594 (724) Liberacin de Frmacos/ Pruebas Fsicas USP 39

Tiempo: Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras se deben retirar dentro de
una tolerancia de 15 minutos o 2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo
ms corto.
Interpretacin: A menos que se indique de otro modo en la monografa individual, los requisitos se cumplen si las cantidades
de ingrediente activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptacin 7 siguiente. Continuar analizando a lo largo de los
tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2
Tabla de Aceptacin 1
Nmero de Unidades
Nivel Analizadas Criterios
L1 6 Ningn valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado.
El valor promedio de las 12 unidades (L 1 + L2) se encuentra dentro del intervalo especifi-
cado. Ningn valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado en ms de
L2 6 10% del promedio del intervalo especificado.
El valor promedio de las 24 unidades (L 1 + L2 + L3) se encuentra dentro del intervalo es-
pecificado. No ms de 2 de las 24 unidades se encuentran fuera del intervalo especifica-
do en ms de 10% del promedio del intervalo especificado; y ninguna de las unidades
se encuentra fuera del intervalo especificado en ms de 20% del promedio del intervalo
Li 12 especificado.

Aparato 6 (Cilindro)

Aparato: Usar el vaso segn se describe en Disolucin (711 ), Aparato, Aparato 7 (Aparato con Canastilla), excepto que se debe
reemplazar la canastilla y el eje con un elemento mezclador cilndrico de acero inoxidable con las especificaciones mostradas
en la Figura 3. Este elemento mezclador cilndrico consta de dos partes, una comprende el eje y el cilindro superior, y la otra es
la extensin del cilindro. Puesto que ambas partes se enumeran en serie, se recomienda mantenerlas pareadas, debido a que el
ajuste de friccin se realiza de manera individual para cada cilindro, lo que permite un calce muy ajustado. La distancia entre la
parte inferior interna del vaso y el cilindro se mantiene a 25 2 mm durante la prueba.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (724) Liberacin de Frmacos 595

Radio mximo
0,300

Tolerancias:
0,0127
-+--4,064 0,051 -
1 Esta seccin del
Terminacin:
Todas las superficies adaptador se debe
deben tener 32 micropulgadas usar para sistemas

-
en promedio geomtrico. grandes.
Desengrasar antes del

~
ensamblaje final de la varilla
y del cilindro.

Material:
Acero inoxidable 316L

5,740

~11
--4,450,02--

Figura 3. Elemento mezclador cilndrico.

(Todas las medidas se expresan en cm a menos que se indique de otro modo.)

Medio: Ver Medio de Disolucin en Disolucin (711 ), Procedimiento, Aparato 1 y Aparato 2, Formas Farmacuticas de Liberacin
Inmediata.
Procedimiento
Colocar el volumen indicado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 0,5.
Aplicar el STO al cilindro, asegurndose de que la superficie de liberacin est lo ms lisa posible y que el STO est completa-
mente sujeto al cilindro con firmeza. El STO con la superficie de liberacin hacia el Medio puede sujetarse al cilindro usando un
procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una membrana o una red de
nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STO, o la presencia
de arrugas en la superficie del STO. Retirar con cuidado la capa protectora del STO sin daar la superficie. Si se requiere refor-
zar ms la sujecin del STO al cilindro, se puede usar un alambre de metal inerte o un anillo de polmero.
Colocar el cilindro en el aparato y hacer rotar inmediatamente a la velocidad especificada en la monografa individual. Se
puede cubrir el vaso durante la prueba para minimizar la evaporacin.
En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte
superior del cilindro rotatorio, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso.
Realizar el anlisis en cada alcuota de muestra segn se indica en la monografa individual, corrigiendo por cualquier prdi-
da de volumen, segn sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STO adicionales como sean necesarios.
Tiempo: Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una
tolerancia de 15 minutos o 2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo ms
corto.
596 (724) Liberacin de Frmacos/ Pruebas Fsicas USP 39

Interpretacin: A menos que se indique de otro modo en la monografa individual, los requisitos se cumplen si las cantidades
de ingrediente activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptacin 7 anterior. Continuar analizando a lo largo de los
tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L, o L2

Aparato 7 (Soporte Oscilante)

Aparato: El ensamblaje consta de (1) un grupo de recipientes para soluciones volumtricamente calibrados o tarados hechos
de vidrio o de otro material inerte adecuado que no deben adsorber o absorber, reaccionar ni interferir con la muestra que se
est analizando; (2) un motor y una transmisin que hacen oscilar el sistema en sentido vertical y que, si se desea, trasladan
automticamente el sistema en sentido horizontal hacia otra hilera de vasos; y (3) un grupo de portamuestras adecuados (ver
la Figura 4 y las Figuras Sa, Sb, Se y Sd).

H\ :::-Radio 0,1143 r Dimetro 0,3175 -Presionar para ajustar el cabezal

~e .. -.+
T
(Dibujo tpico - el diseo o la forma puede variar)
.. 1-s
D

Las dimensiones estn indicadas en centmetros

CABEZAL VARILLA ARGOLLA

Sistema A (Dimetro) B e Materiait> D Materia!C (no se muestra)
1,6cm2 1,428 0,9525 0,4750 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-113-V884-75
2,5cm2 1,778 0,9525 0,4750 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-016-V884-75
5cm2 2,6924 0,7620 0,3810 SSNT 8,890 SS/P Parker 2-022-V884-75
7cm2 3,1750 0,7620 0,3810 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-124-V884-75
10cm2 5,0292 0,6350 0,3505 SSNT 31,01 SS/P Parker 2-225-V884-75

a Medidas de sistemas tpicos

b SSNT =acero inoxidable (SS) o Tefln virgen (VT)
e SS/P = acero inoxidable (SS) o Plexigls (P)

Figura 4. Disco oscilante portamuestras.

Argolla Parker
Placa 1,98 0 usar junta tipo anillo 2-225-V884-75
o
Placa 1,42 0 usar junta tipo anillo 2-218-V884-75

Tubo de acero inoxidable

12" X 3116" O

"= dimetro
Figura Sa. Portamuestras de sistemas transdrmicos-disco angular.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (724) Liberacin de Frmacos 597

Cilindro de Tefln virgen 3 518" x 1 3/8" 0

I
Varilla de acero inoxidable
8" X 1/8" 0
Junta tipo anillo Parker 2-026-V884-75

" = dimetro

Figura 5b. Portamuestras de sistemas transdrmicos-cilindro.

Varilla de acrlico 12" x 1/8" "

e
/
" =dimetro
Figura 5c. Portatabletas para tabletas orales de liberacin prolongada-varilla, puntiaguda para encolado.

Tubo de acero inoxidable

Resorte de acero inoxidable 11" X 1/8" 0

Dimensiones del resorte

de acero inoxidable
A 8
1,45 ,580
1,40 ,31 0
,96 ,330
,60 ,250

0 = dimetro

Figura 5d. Portatabletas para tabletas orales de liberacin prolongada-soporte de resorte.

Durante la prueba, los recipientes para soluciones se sumergen parcialmente en un bao de agua adecuado de cualquier
tamao conveniente que permite mantener la temperatura dentro de los recipientes a 32 0,5 para STD o a 37 0,5 para
otras formas farmacuticas.
Ninguna parte del equipo, incluyendo el entorno en el que ste se coloca, contribuye con movimiento, agitacin o vibracin
importante ms all de la debida al movimiento oscilante suave y vertical del portamuestras.
Se prefiere un aparato que permita la observacin del sistema y del portamuestras durante la prueba.
Usar un portamuestras y recipiente del tamao especificado en la monografa individual.
Medio: Ver Medio de Disolucin en Disolucin (711 ), Procedimiento, Aparato 7 y Aparato 2, Formas Farmacuticas de Liberacin
Inmediata.
Preparacin de la muestra A (para tabletas de bomba osmtica): Sujetar cada unidad a analizar a un portamuestras adecuado
usando un procedimiento apropiado y validado tal como el uso de un adhesivo para adherir el borde de la tableta al porta-
muestras (p.ej., Figura Se), al soporte de resorte (Figura Sd), a una pequea bolsa de red de nailon o a una membrana.
Preparacin de la muestra B (para STO): Aplicar el STO al portamuestras adecuado, asegurndose de que la superficie de libe-
racin est lo ms lisa posible y que el STO est completamente sujeto al portamuestras con firmeza. El STO puede sujetarse al
portamuestras con la superficie de liberacin contra el Medio usando un procedimiento apropiado y validado tal como un ad-
hesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una membrana o una red de nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de
burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la presencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado
la capa protectora del STO sin daar la superficie de ste ltimo. Si se requiere reforzar ms la sujecin del STO al portamues-
tras, se puede usar un alambre de metal inerte o un anillo de polmero.
598 (724) Liberacin de Frmacos/ Pruebas Fsicas USP 39

Preparacin de la muestra C (para otras formas farmacuticas): Sujetar cada forma farmacutica a analizar al portamuestras
adecuado.
Procedimiento: Colocar el volumen declarado de Medio en los recipientes para soluciones y equilibrar a la temperatura de
prueba.
Suspender cada portamuestras preparado en un agitador de oscilacin vertical de modo que cada sistema se sumerja conti-
nuamente en Medio durante toda la prueba.
Hacerlos oscilar a una frecuencia de aproximadamente 30 ciclos/minuto con una amplitud de aproximadamente 2 cm, o
conforme se especifique en la monografa individual, durante el tiempo especificado.
En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar los recipientes para solucin del bao, enfriar a temperatura ambiente y
agregar suficiente disolvente (es decir, agua, en la mayora de los casos) para corregir por prdidas por evaporacin.
Realizar el anlisis en cada muestra segn se indica en la monografa individual. Repetir esta prueba con tantos sistemas
transdrmicos adicionales como sean necesarios.
Tiempo: - Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una
tolerancia de 15 minutos o 2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo ms
corto.
Interpretacin: A menos que se indique de otro modo en la monografa individual, los requisitos se cumplen si las cantidades
de ingrediente activo liberado del STD se ajustan a la Tabla de Aceptacin 7 anterior o a la tabla de aceptacin apropiada en
Disolucin (711) para las dems formas farmacuticas. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a menos que los resul-
tados se ajusten a L1 o L2 .

(729) DISTRIBUCIN DEL TAMAO DE GLBULOS EN EMULSIONES

INYECTABLES DE LPIDOS

INTRODUCCIN
Las emulsiones inyectables para administracin intravenosa, que se utilizan en la terapia de nutricin parenteral total (TPN,
por sus siglas en ingls), son emulsiones estriles de aceite de soja en agua utilizadas para proveer un suministro amplio de
cidos grasos esenciales, linoleico y linolnico, que se dispersan con la ayuda de un agente emulsionante en Agua para Inyec-
cin. Como alternativa, se puede mezclar el aceite de soja con otros aceites adecuados (triglicridos neutros), como el aceite
de crtamo, triglicridos de cadena media (MCT, por sus siglas en ingls) derivados de aceites de coco o de semilla de palma,
aceite de oliva o un aceite marino como el de arenque. El tamao de las gotitas de lpidos es crtico: debido a la filtracin
mecnica, los glbulos de grasa de mayor tamao (>5 m) pueden quedar atrapados en los pulmones. Las caractersticas
esenciales del tamao de una emulsin inyectable de lpidos para uso intravenoso incluyen el dimetro medio de las gotitas de
lpidos y el intervalo de los distintos dimetros de gotitas que se distribuyen alrededor del dimetro medio, lo que se expresa
como la desviacin estndar. Especficamente, las cantidades de glbulos de grasa que constituyen la cola de la curva de distri-
bucin correspondiente al mayor tamao de glbulos son particularmente importantes con respecto a la seguridad de la infu-
sin. Se debe controlar que estas dos regiones de la distribucin del tamao de glbulos (el tamao medio de las gotitas y la
cola de la curva de distribucin correspondiente al mayor tamao de gotitas) se mantengan dentro de los lmites especifica-
dos.
Para la determinacin del dimetro medio de las gotitas de lpidos y la distribucin de los tamaos de glbulos de mayor
dimetro en las emulsiones inyectables de lpidos se utilizan los dos mtodos que se describen a continuacin. El Mtodo I y el
Mtodo 11 deben ser validados. Los mtodos que se describen a continuacin para evaluar la calidad de las emulsiones inyecta-
bles de lpidos se deben realizar en dos etapas.

MTODO 1-MTODO DE DISPERSIN DE LA LUZ

Para la determinacin del tamao medio de las gotitas de las emulsiones inyectables de lpidos, puede usarse una de las dos
tcnicas de dispersin de la luz ms comunes: (1) dispersin dinmica de la luz (DDL), conocida tambin como espectroscopa
de correlacin fotnica (ECF) o (2) dispersin clsica de la luz, basada en la teora de dispersin de Mie. La tcnica DDL o ECF
se basa en el anlisis de las fluctuaciones temporales rpidas en la intensidad de la luz dispersada que se producen debido al
movimiento Browniano aleatorio, o difusin, de cualquier partcula, incluidas las gotitas de lpidos, suspendidas en un lquido.
La intensidad se mide a un ngulo determinado (por lo general 90) por medio de un detector adecuado (p.ej., un tubo foto-
multiplicador) capaz de medir la intensidad de la luz dispersada, que flucta rpidamente, producida por las gotitas en difu-
sin, suspendidas. Generalmente, estos datos de intensidad de luz dispersada se utilizan para calcular la funcin de autocorre-
lacin de intensidad, que es una funcin de decaimiento exponencial simple en funcin del tiempo para gotitas de tamao
uniforme. La distribucin de los tamaos de las gotitas se expresa por funciones exponenciales de distintos tiempos de decai-
miento. La funcin de autocorrelacin que generan los datos de intensidad de luz dispersada obtenidos a partir de una emul-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (729) Distribucin del Tamao de Glbulos 599

sin dada puede ser "invertida" por medio de un algoritmo adecuado de deconvolucin para obtener la distribucin aproxi-
mada de coeficientes de difusin ponderados por intensidad. A partir de sta, se calcula la distribucin de gotitas de dimetro
pequeo, mediante la ecuacin de Stokes-Einstein y las reglas de la dispersin clsica de la luz (Mie).
Por el contrario, la dispersin clsica de la luz basada en la teora de Mie analiza la variacin espacial, no la temporal, de la
intensidad de la luz dispersada al medir a la ltima como una funcin del ngulo de dispersin, tpicamente a lo largo de un
gran intervalo de ngulos detectados. Las fluctuaciones temporales en la intensidad de dispersin debidas al movimiento
Browniano se promedian en el tiempo para cada medicin angular. Esta variacin angular se produce como consecuencia de
la interferencia mutua de las ondas individuales dispersadas que llegan al detector con fases distintas desde puntos diferentes
dentro de una gotita de lpidos dada as como desde otras partculas. La amplitud de la variacin angular es significativa toda
vez que el dimetro de la gotita no sea pequeo en comparacin con la longitud de onda de la luz lser (tpicamente, 635
nm). Las gotitas de un tamao e ndice de refraccin determinados producen una curva nica de intensidad de dispersin en
funcin del ngulo de dispersin. La distribucin de los tamaos de gotitas origina una dependencia angular final que repre-
senta la superposicin o suma de las curvas individuales (distintas) de intensidad en funcin del ngulo. La dependencia angu-
lar medida de la intensidad de dispersin obtenida a partir de una muestra de emulsin dada puede ser invertida por medio de
un algoritmo adecuado de deconvolucin y la teora de dispersin de Mie para obtener la distribucin aproximada del tamao
de gotitas.
As, la dispersin de la luz, mediante la dispersin dinmica de la luz (es decir, fluctuaciones temporales debidas a la difusin
de las gotitas) o la dispersin clsica de la luz/teora de Mie (es decir, intensidad promedio en funcin del ngulo), puede pro-
porcionar resultados aceptables para el dimetro medio y la desviacin estndar de la distribucin del tamao de las gotitas.
Para ilustrar el mtodo usado en el Mtodo 1, se describe una tcnica de dispersin dinmica de la luz. Para una gua sobre los
instrumentos que utilizan la dispersin clsica de la luz - teora de Mie, ver Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de
Luz (429).
Aparato-Un instrumento DDL/ECF adecuado, con o sin la capacidad de dilucin automtica de muestra, y controlado por
un software validado, se utiliza para llevar a cabo la medicin con el ngulo de dispersin generalmente ajustado a 90. Se
informan los resultados ponderados por intensidad (dimetro medio y desviacin estndar), siempre que se indique claramen-
te cules son los valores que se proveen y que tambin se den los valores de los parmetros necesarios para los clculos reque-
ridos.
Agua-Pasar agua destilada a travs de un filtro con un tamao de poro de 0,2 m y desgasificar por ultrasonido o usar
Agua Estril para Inyeccin almacenada en un envase de vidrio.
Preparacin Estndar-Agregar una cantidad adecuada de suspensin concentrada, conteniendo partculas estndar de l-
tex de poliestireno rastreables al NIST u otras nanoesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suave-
mente los lquidos para obtener una suspensin homognea. La suspensin diluida tendr un aspecto levemente turbio. Si el
instrumento DDL/ECF est equipado con un sistema de dilucin automtico, se puede analizar la muestra concentrada inicial
por inyeccin directa en el instrumento con una jeringa, producindose automticamente una dilucin adicional para optimi-
zar la concentracin de gotitas para el anlisis. Alternativamente, la muestra requerira una dilucin manual mayor con Agua
(tpicamente por un factor de 1O, por lo menos, sobre la primera dilucin) y su instilacin posterior en una celda de goteo. Las
especificaciones del instrumento determinarn el esquema ptimo de dilucin que logre la intensidad de dispersin adecuada
para el anlisis por celda. As, se debe optimizar la concentracin de ltex en la muestra final para el instrumento DDL/ECF
utilizado. Esto se deber llevar a cabo separadamente para tres estndares de tamao distintos de aproximadamente 100 nm,
250 nm y 400 nm (anlisis triplicado por tamao) y los resultados correspondientes del dimetro medio ponderado por inten-
sidad y la desviacin estndar deben coincidir con los valores esperados dentro de errores aceptables.
Preparacin de Prueba-Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsin inyectable de lpidos a un volumen
preestablecido de agua. Mezclar suavemente los lquidos para obtener una suspensin homognea. La suspensin diluida ten-
dr un aspecto levemente turbio. Si el instrumento DDL/ECF est equipado con un sistema de dilucin automtico, se puede
analizar la muestra concentrada inicial por inyeccin directa en el instrumento con una jeringa. Automticamente se producir
una dilucin adicional de la muestra para optimizar la concentracin de gotitas para el anlisis, lo que asegura que no se pro-
duzcan artefactos debidos a la dispersin mltiple o las interacciones entre las gotitas. Alternativamente, la muestra podra re-
querir una dilucin manual mayor con Agua (tpicamente por un factor de 1O, por lo menos, sobre la primera dilucin) y su
instilacin posterior en una celda "de goteo". Las especificaciones del instrumento determinarn el esquema ptimo de dilu-
cin que logre la intensidad de dispersin adecuada para el anlisis por celda. As, se debe optimizar la concentracin de la
emulsin inyectable de lpidos en la muestra final para el instrumento DDL/ECF utilizado.
Aptitud del Sistema-Usando la Preparacin Estndar, medir el dimetro medio de partculas ponderado por intensidad y
la desviacin estndar correspondiente. El sistema es apto una vez que la temperatura de la muestra alcanza el equilibrio y los
resultados se han estabilizado y se obtienen por triplicado las mediciones del dimetro medio de las gotitas. El coeficiente de
variacin (CV) no debe superar el 10% del dimetro medio de las gotitas rastreables al NIST. Un valor mayor de CV indica que
las microesferas de ltex no son aptas como estndar porque carecen inherentemente de uniformidad o se han aglomerado a
un nivel inaceptable. En este caso, se debe seleccionar y probar otra suspensin ltex estndar.
Procedimiento e Interpretacin-Si el instrumento DDL/ECF est equipado con un sistema de dilucin automtico, usar
una jeringa desechable para cargar la Preparacin Estndar o la Preparacin de Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilucin
automtico, transferir la preparacin adecuadamente diluida a una celda y colocarla en el espectrmetro. Dejar que la muestra
se equilibre a una temperatura controlada preestablecida cercana a la temperatura ambiente (entre 20 y 25, como en la defi-
600 (729) Distribucin del Tamao de Glbulos / Pruebas Fsicas USP 39

nicin de la USP que se encuentra en Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)). Ajustar el ngulo de dispersin del ins-
trumento a 90 y llevar a cabo las mediciones. En tanto que la bondad del ajuste chi cuadrado (x 2 ) se mantenga aceptable-
mente bajo (de acuerdo con las especificaciones del instrumento), los resultados para la Preparacin de Prueba son aceptables.
Los valores excesivos del parmetro x2 sugieren que la distribucin de gotitas no es normal y pueden indicar una emulsin
inestable. El dimetro medio de las gotitas ponderado por intensidad (MDD) para las emulsiones inyectables de lpidos debe
ser inferior a 500 nm o 0,5 m, independientemente de la concentracin de la fase lpida dispersa.

MTODO 11-MEDICIN DEL CONTENIDO DE GLBULOS GRANDES POR EL MTODO DE

OBSTRUCCIN O EXTINCIN DE LUZ
Para la determinacin de la extensin de la cola de la curva de distribucin correspondiente al mayor tamao de gotita (>5
m) de las emulsiones inyectables de lpidos se usa un mtodo de obstruccin de la luz (LO, por sus siglas en ingls) o extin-
cin de la luz (LE, por sus siglas en ingls) que emplea la tcnica de determinacin ptica del tamao de partculas individuales
(glbulos) (SPOS, por sus siglas en ingls). Durante la aplicacin de la tcnica LE/SPOS, el pasaje de una gotita a travs de una
zona estrecha de deteccin ptica causa el bloqueo de una porcin del haz de luz incidente, lo que provoca la reduccin mo-
mentnea de la intensidad de la luz que alcanza al detector de "extincin". Idealmente, la magnitud de esta reduccin en la
seal es proporcional al rea de seccin transversal de la gotita (considerada ms pequea que el espesor de la zona de detec-
cin), es decir, al cuadrado del dimetro de la gotita. Durante la optimizacin del instrumento LE/SPOS para una muestra de
emulsin determinada, debe probarse una serie de diluciones para lograr uniformidad entre las muestras. El objetivo es la iden-
tificacin de un intervalo estndar de diluciones que produzcan datos uniformes y sean las ms adecuadas para la formulacin
evaluada. Idealmente, cuando se comparan emulsiones distintas, se utiliza el mismo nmero aproximado de glbulos en cada
determinacin de tamao y una vez que se alcanza un estndar, se lo incorpora al plan de muestreo de rutina para las pruebas
de validacin. Siempre que la concentracin de glbulos de grasa est por debajo del "lmite de coincidencia" del sensor (de-
terminado por la celda de flujo y el diseo ptico), slo pasar un glbulo, como mximo, a travs de la zona de deteccin en
un momento determinado, lo que permite que se lo cuente y se mida con exactitud (con menos de 1o/o de eventos de coinci-
dencia). Es necesario conocer el lmite de coincidencia y la velocidad ptima del flujo para el sensor LE/SPOS usado. Adems,
es prudente que se realicen las mediciones de dimetro grande a una concentracin reducida de la emulsin para que la con-
centracin mensurable de gotitas desde un umbral de deteccin (p.ej., > 1,8 m) hasta un lmite superior (p.ej., 50 m) slo
sea aproximadamente un tercio del lmite nominal de coincidencia para el sensor usado. Las alturas resultantes de los pulsos
individuales se convierten en dimetros de gotitas mediante una curva de calibracin estndar construida previamente a partir
de microesferas de poliestireno de tamao uniforme rstreables al NIST con dimetros conocidos. Para una gua adicional en el
uso de la metodologa de obstruccin de la luz, consultar el captulo general Partculas en Inyectables (788).
Aparato-Para la medicin se usa un instrumento de obstruccin de la luz adecuado, con o sin capacidad de dilucin auto-
mtica de la muestra y controlado por un ordenador personal (PC). Se informan los datos de distribucin del tamao de part-
culas ponderado por nmero y volumen, siempre que se indique claramente cules son los valores que se proveen y que tam-
bin se den los valores de los parmetros necesarios para todos los clculos requeridos.
Agua-Pasar agua destilada a travs de un filtro con un tamao de poro de 0,2 m o usar Agua Estril para Inyeccin alma-
cenada en un envase de vidrio.
Preparacin Estndar-Agregar una cantidad adecuada de suspensin concentrada, conteniendo partculas estndar de l-
tex de poliestireno rastreables al NIST u otras microesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suave-
mente los lquidos para obtener una suspensin homognea. Si el instrumento de obstruccin de la luz est equipado con un
sistema de dilucin automtico, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyeccin directa en el instrumento con
una jeringa o una lnea de muestreo de Tefln. Luego, se produce automticamente una dilucin adicional de la muestra para
optimizar la concentracin de partculas para el anlisis. Alternativamente, la muestra requerira una dilucin manual mayor
con agua (tpicamente por un factor de 1 O, por lo menos, sobre la primera dilucin). La muestra diluida resultante se instila
luego en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estril Tipo 1, antes de pasarla por el sensor. En cual-
quiera de los casos, la concentracin final de partculas debe estar por debajo del lmite de coincidencia del sensor. Se debe
obtener la exactitud de la determinacin de tamao y recuento del instrumento de obstruccin de la luz mediante dos estn-
dares de tamao distintos de aproximadamente 5 m y 1 O m (anlisis triplicado por tamao). Para los estndares despus de
la calibracin del sistema, ajustar el umbral de deteccin del instrumento a 1,8 m, extendido a un lmite superior de 50 m.
Los resultados correspondientes del dimetro medio deben coincidir con los valores esperados, dentro de 10% de la desvia-
cin estndar relativa y una exactitud de tamao de 90%-110%. Adems, el nmero de recuento de partculas obtenido por
mL tambin debe coincidir dentro de 10% con los valores de concentracin certificados en la documentacin provista con
cada estndar de tamao rastreable al NIST.
Preparacin de Prueba-Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsin inyectable de lpidos (anlisis triplicado
por muestra) a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los lquidos para obtener una suspensin homog-
nea. La emulsin diluida tendr un aspecto levemente turbio. Si el instrumento de obstruccin de la luz est equipado con un
sistema de dilucin automtico, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyeccin directa en el instrumento con
USP 39 Pruebas Fsicas/ (730) Espectroqumica de Plasma 601

una jeringa o lnea de muestreo de Tefln no reactiva*. Luego, se produce automticamente una dilucin adicional de la mues-
tra para optimizar la concentracin de gotitas/glbulos para el anlisis. Alternativamente, la muestra requerira una dilucin
manual mayor con agua (tpicamente por un factor de por lo menos 1 O sobre la primera dilucin). La muestra diluida resultan-
te se instila en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estril Tipo l. En cualquiera de los casos, la con-
centracin final de gotitas/glbulos debe estar por debajo del lmite de coincidencia del sensor.
Aptitud del Sistema-Realizar antes del procedimiento de prueba, usando la Preparacin Estndar de partculas de 5 y de
1O m rastreables al NIST. Medir por triplicado el dimetro de partcula ponderado por nmero y los conteos/mL del estndar.
El sistema es adecuado cuando las mediciones por triplicado del dimetro medio de partcula ponderado por nmero estn
dentro de 10% del valor estipulado, tanto en trminos de repetibilidad (CV) como de la cercana al tamao certificado en la
etiqueta del estndar rastreable al NIST.
Procedimiento e Interpretacin-Si el instrumento de obstruccin de la luz est equipado con un sistema de dilucin au-
tomtico, usar una jeringa o lnea de muestreo de Tefln desechable para cargar la Preparacin Estndar o la Preparacin de
Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilucin automtica, transferir la muestra a un recipiente limpio y adecuado, de gran
volumen, como un vaso de vidrio estril Tipo 1 conteniendo un volumen adecuado de agua. Dejar que la muestra y el agua se
mezclen bien para obtener una suspensin homognea. Ajustar el umbral de deteccin del instrumento a 1,8 m, extendido a
un lmite superior de 50 m, y variar la concentracin y/o los tiempos de la recoleccin de datos de tal manera que haya al
menos un factor de dos en la diferencia del nmero total de glbulos que miden >5 m entre al menos dos corridas de la
muestra. En cualquier caso, el nmero de glbulos que miden >5 m debe ser lo suficientemente grande para representar un
nmero de glbulos adecuado que sea estadsticamente representativo de la poblacin de dimetro mayor de la cola de la
curva de distribucin correspondiente a la emulsin nativa. Los lmites de la fase dispersa para los glbulos de grasa de dime-
tro mayor ponderado por volumen, expresados como el porcentaje de grasa en glbulos mayores de 5 m (PFAT5) para una
emulsin inyectable de lpidos dada, no deben exceder de 0,05%.

(730) ESPECTROQUMICA DE PLASMA

Cambio en la redaccin:

,\INTRODUCCIN
Las tcnicas instrumentales basadas en plasma que son till;!.s en el anlisisfarmacutico se clasifican en dos grandes grupos:
a) tas tcnicas que se basan en plasma inductivamente acoplado yb) las tcnicas en las que el plasma se genera en la superfi-
cie de la muestra o cerca de ella. El plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en ingls) es una fuente de excita<:in
de afta temJ)eratura que desolvata, vaporiza y ato.miza muestras aerosolizadas e io.nl:za los tomos rSultantS. EStos.iet1s y
toms excitados pueden deteetrse posteriormente . mediante la o.bser'vadn. de sus lneas de emisin, un mtodo den()mlna:
do espectroscopfa de emisin ptia de plasma iriductivmente acoplado {1cp::.:....0ES1 por. sus siglas en ingls), que tarntifn se
conoce como espectfoscopa de emisin atmica d plasma inductivamente acoplado (ICP::.:....AES, por sus siglas ~rdrigls},
los ines exdtads o en estdo fundamental pueden determinarse mediante una tcnica que. se denomina espectrbtn~tra'de
masas de plasma inductivamente acoplado (JCP,;,.MS1 por sus siglas en ingls)>bteP:...oES y fJI ICP-MS son tenies que. permi~
ten analizar uno o varios elementos y se .usan tanto en anlisis secuendales cmo para anlisis simultneos; cori bUena senslbf~
lidad en un amplio intervalo lineal.
Para mayor informacin sobre la teora y los principios de mediciones, ver el captulo Espectroqumica de Plasma-Teora y
Prctica (1730).

CALIFICACIN DE ESPECTRMETROS .DEPLASMA

La calificacin de los ICP-OES o de los ICP-MS se puede Oividir eri tres elementos: calificadn .de la instaladn (IQ, por sus
siglas en ingls), calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y calificacin del desempeo {PQ, por sus siglas .en in
gls)-Vertambin el captulo general Calfcacin de Instrumentos Analticos (1058/,

Calificacin de la Instalacin
Los requisitos de califieacin de la instalacin proveen pruebas de que el hardware y el software se han instalad de manera
apropiada en el lugar deseado, y de que el ambiente en el que se usar el instrumento es adecuado.

* El cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en ingls) con dietilhexilftalato (DEHP, por sus siglas en ingls) demostr inducir el rompimiento de las emulsiones
inyectables de lpidos (Sistema de Presentacin de Informes sobre Problemas con Productos Farmacuticos. Acceso a Archivo No. 111 73 de la USP, el 15 de mayo,
1991).
602 (730) Espectroqumica de Plasma / Pruebas Fsicas USP 39

Calificacin Operativa
El propsito de la calificacin operativa es demostrar que el desempeo del instrumento es adecuado. En la califieacin ope~
rativa, se caracteriza el desempeo de un nstrutnento usando estndares con propiedades espectrales conocidas para.verificar
que el sistema opera dentro de Jils especificaciones esperadas.. la calficacin operativa es una verificacin de los parmetros
operativos clave que seJleva accabo despus de la instalacin, de reparaciones yo de mantenrllliento.los proveedores de ins-'
trumentos a menudo tienen disponibles muestras y parmetros de. pruebas como parte del paquete de calificacin de la insta"
lacin/calificacin Qperativa.

Calificacin del Desempeo

La calificacin del desempeo determina si el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los
parmetros que pueden afectar la calidad de la medicin. Dependiendo del us tpico, las especificaciones.de calificacin del
desempeo pedenserdiferentes a las especificaciones del fabricante. Para mtodos validados, se pueden usar pruebas de ca"
Hficacindel desempea especficas, tambin conocidas comoprubasd aptitud.del sistema, en lugar delOsrequisitos de
califcaci<)n del desempeo .. Se debe volver a valorar una solucin usada paratrazar la curva estndar ifcialde un instrumento
ICP,-OES oJCP-MS a modo.de verif:adn a intervalos apropiados prestableddos durante el anlisis de todo el conjunto de
mvestras.
Para Jos anlisis Jcp;:.oES de un nico>elemento, cO:n longitudes de onda anafticas comprendidas entre 200 y 500 nm o ton
contentraciorres de >1 . g/mL, el estndar revalorado debe concordar con su valor esperado i::qn una aproxrmacin de ::l::l0%,
o segn lo espedfitado en un.a mom;>grafa individual. Para los anlisis ICP"-'OES de mltiples elementos, con longitudes de on-
da analticas de <200 o :>500 nm o con concentraciones de <:T g/mL, .el estndar revalorado debe concordar con st1valor
terico con una aproidmacin de :1:20%~ o segn lo especificado eh una monografa individual. Para los anlisis ICP-!)llS de un
nico ~lemento 1 con masaranallticas exentas de interferencias y con concentraciones de > 1 ng/m[, eLestndar revalorado. de.
be concordar con su valor esper;cl <:;.on una aproximacir:i de l0%, o segn. lo especificado en una monografa individual.
Para los anlisis ICP-MS de mltiples elementos, o con concenttadorjes de d ng/ml, o panfanlisis de .un solo elemento en
los que pudieran presentarse interferencias, l estndar revalorado debe concordar con su va.lar esperado con una aproxima-
cin de 20%, o segn lo especificado en una monografa individual.
Si la monografa Individual proporciona pautas diferentes .co11 respecto al estndar de verificacin rey;;ilqrado para lCP-:-OE$ o
ICP,-MS, debern cmplirse los requisitos de la monografa. Los procedimientos especfcos, criterios de aceptacin e intervalos
de tiempo para la caracterizacin del desempeo de la lCfl..OE$ o ICfl,..MS dependen del instrumento y de la aplicacin previs-
ta.

PROCEDIMIENTO
Los suarlos deben evaluar y. seledonarel tipc) de material de construccin, el tratamiento pl'.eVioy.lalimpieza del material
deJabprtorio al1alticoempJeado en los <tnliss.ICP"E,S e ICP--M.S. ~lmaterial .debe ser !nel'te.y,.dependiendo di; l aplicacin
espe(;fica, reslstente a sustancia~c~u~ficil:s, . cid!Js y}() qisolventes orgnico~ . Eri algunos anHsi~, se .debe proceder con la.dili-
gencia d~bda pra prev~nir la. ad sqrci<SQ de analitos $Gbre la superfide de. unrec;ipiente; la c;ontaminacimde llssoluciopes
muestta..a partir de foetalese..iones pJ;sentes enel envase puede llevar.a resulta(:los.inexactos. Para ef anlisis de.un.el.emento
ubi<;uo, a. menudo es necesario sr el grado fll~ PU'O de reactivo Q disolvente disponible. $e .debe verificar la presencia de
contaminacin .elemental en todas las soh.iciones antes de usadas en un anlisis;

Solucin .Estndar
Las soluciones estndar se usan para estandarizar el. instrumento en el momento de su uso; estas sOlucines deben preparar-
se segn se indic;;i en la m.onogr"lfa ndiYiduilk [NOTAr---Se pu.edenvsar solu;:iqnes de elementos individuales o de mltiples
efem.eflts disponibles comercialmente, rastreables al N1sr o a una otganiZ~Kin. metrolgka nacional, en la preparacin de
soluciones. estndar.] las.soluciones. estndar, especialmente aquell(ls empleadas en los anlisis a nivel deultratraza, pueden
tener un(l.vjda (jtil lmitada. La estabilidad de las soluciones estndar puede variar dependiendo de la concentracin, delanijfi
to de inters, del tipo de recipiente de lmacenamlentoy de las condicin~s. de. almacenamiento, Pqr estas t.zones, la$ solucio-
nes estndar cori mncentradones <10 ppm (p/v) no deben conservarseporms qe 24 horas, a menos que se demuestre su
estabilidad poda va experimental.
El mtodo de estndar agregado puede emplearse para la estandarizacin del instrumento. Este mtodo implica agregar a la
muestra una concen~raqn c()noc;idadelelemento.analito a no menos dedos niveles de concentracineh comparnci()n con
una preparad611 pe la muestra sin e[agregado de cantidades conocidas. Lq respuesta del instrumento se graf:a en funcin de
la concentracin del elemento analifo. agregado5r se traza Ja recta de regresin lineal correspondiente a Jos datos. El valor ab-
so.luto de la interseccin x multiplicado por cualquier factor de dilucin es la concentracin del anallto en Ja muestra; muchos
instrumentos realizarn el clculo del anHto au~omticamente. Una vez que el mtodo se ha desarrollado y se emplea. de for-
ma.rutnari:, eJitstrumentose puede calibrar con. un blanco)' Un nico estndar; Es apropiado emplear Ja calibradn. de .un
USP 39 Pruebas Fsicas/ (730) Espectroqumica de Plasma 603

nico punto en las pruebas de lmite de materiales de producdn yproductos finales si la m{ltodologa se ha validado de for-
ma rigurosa en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisin, tolerancia y robustez.

Solucin Muestra
Aunque se pueden analizar muestrls slidas o sernislidas, porlo gener~I ernecesario preparar las sol4ciones de las muestr:ts
para anlsis segn lo. indcado en. la monografa individQal. Las muestras pueden disolverse en cal.quier dsolvente,iticluyendo
disolventes orgnicos o cidos/bases, que seancompatibles con el sistema instrumental. Las mestr$ que no son~olubl~ en
un disolvente requieren digestin. Se pueden usar diversas tcnicas de digestin para disolver una .muestra, .la.s. cuales lriciuyen
digestiones en placa caliente y digestiones asistidas pormicroondas,con mtodos de recipiente abierto o de recipiente cerra-
do. Debe tenerse en cuenta que no se recomienda la digestin en recipientes abiertos en los anlisis de metales voltiles; por
ejemplo, selenio y mercurio,

Anlisis
El instrumento debe estandarizarse pata cuantificacin almomento de su uso, siguiendo el procedimiento indicado eli la
monografaindividual para los parmetros instrumentales. la respuesta de las soluciones esthdatque abarcan los extremos de
concentracin esperada de .un analito en .una muestra se determina en funcin de nblanco apropiado; lti! respuesta del de
tector se grafka como una funcin de la concentracin de analito. Al realizar un anlisis en o cerca del lmite de deteccir', el
analistt'! no siempre puede usar un estndar que abarque los extremos de concentracin. Eht.al c;::aso, se debe correr por tripli-
cado un estndar preparado en o cerca (con una aproximacin de 10%) del lmite de deteccin, con un criterio de acepta"
cin de 10% del. valor terico del estndar en el caso de estndares de elementos individuales, yde 20% del valor terico
del estndar en el caso de estndares de elementos mltiples.
Para demostrar la estabilidad de la estandarizacin inicit'!I del. sistema, el analista debe volver a valorar una solc;in usada
para trazar la curva estndar inicial como un estndar de verificacin a intervalos apropiados previamente establecidos durante
el anlisis de todo el conjunto de muestras. A menos que se ir)dique d otro. modo en la monografa individul, el estndar
revalorado debe cumplir con los mismos criterios de aceptacin que los descritos en la seccin de calificacin del desempeo
detallada anteriormente. Las concentraciones de la muestra se calculan enfuncin de li:i curva de trabajo que se oi:)tiene grafi-
cando la respuesta del detector en funcin de la concentracin del analitoen las soluciones estnclar,Muchos instrumentos
realizan este clculo automticamente.

VALIDACIN Y VERIFICACIN
Validacin
La valic::l<lcin es necesaria cuando el mtodo de J()P-.QESo ICP--Ms estdestinadopar<i l:lso comotma.alt!llrnati\/a: al procecli-
miento farmacopeico para el anlisis de un artculo oficill. El objetivo de la validacin r~diante el procedimieot<) d ICP""OES
o ICP-MS es demostrar que la medicin es adecuada para el propsito previsto, incluida la determinacin cuantitativa del
componenteprincipal en. un frmaco o en un medicamento (valori:iciones de Categora .1), de.terrninacin cuantitativa de im-
purezas o lmites de prueba (Categorfa 11), y pruebas de identificacin {Categora IV). [NOTA~Para definiciones sobre distintas
categoras, ver V(Jlidadn de Pm<:edimientos Farmac;:opeicos (1225).] Depen(;f iendo de la categora d.e la pruf;!l;)a, la v;ilidacin del
procedirniento analtico para ICP,..,OES o ICP~MSrequif;!re un anlisis de)inealidad, .if')tervalo, e1'<iCtitud, e$pecificid<.\d, .precisin,
lrnite (:le deteq::in, lmite. de cuantificacin y robustez. Estas caractersticas de desellJpeo analtico S!il aplican a mtodos con
calibracin externa y al mtodo de estndar agregado.
El captulo general (1225) provee definiciones y pautas generales sobre los procedimientos para. validacin analtica sin ir)di-
car criterios de validacin especficos para cada caracterstic(l. La. intencin de las siguientes st;!cc;::iones es proveer al usari 0 cri-
terios .(.fo validacin espedficos que representan Jasexpectativas mnima~para esta tecnologa.

EXACTITUD

Para las valoraciones de Categora 1 o las pruebas de Categora 11, la exactitud puede determinarse realizando estudios de
recperacin con la matriz apropiada adicionando concentraciones conocidas de los elementos. Asimismo, se. considera una
pr~:tica aceptable comparar los resultados obtenidos usando. el proced.miento JCP-QES o ICP-MS .que se est v(J.lidando con
los de un procedimiento. analtico establecido, En los mtodos de estndar agregado, las evaluaciones de exactitud se. basan .en
la conc;::entracin final en .la interseccin, no en la recuperacin calculada a partir de adidones de estndar individuales.
C:l'.'iterios de validacin: Una recuperacin media. de 95,Qo/o...105,0%para la valoracin, y una recuperacin media de
70,0o/o-:-150,0% para el anlisis de impurezas. Estos criterios aplican en todo el intervalo previsto.
604 (730) Espectroqumica de Plasma / Pruebas Fsicas USP 39

Precisin

REPETIBIUDAD

El procedmiento analtico se evala midiendo las concentraciones de seis soluciones muestras preparadas de forma indepen-
diente al 1 00% de la concentracin de prueba de la valoracin,
Criterios de validacin: .La desviacin estndar relativa es no ms de 510% par la valoracin del frmaco, no ms de 5,0%
para la valoracin del medicamento y no ms de 20% para el anlisis de impurezas,

PRECISIN INTERMEDIA

Se debe establecer el efecto de los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento. Las variables tpicas rr'
cluyen realizar los anlisis en das distintos, usando instrumentos diferentes o que el mtodo sea realizado por dos () ms analis-
tas. Como mnimo, cualquier combinacin de estos factores que totalice tres experimentos proveer una estimacin de Ja pre-
cisin intermedia. Por ejemplo, esta combinacin puede ser un analista en 3 das diferentes, o un analista usando dos sets de
equipos en dos das diferentes, uno para cada instrumento; o tres analistas ppdran trabajar c<:>o el.mismo equipo.
Criterios ele validacin: L desviacin estndar rlativa es no ms de 8,0% para la valoracin del frmaco, no ms de 8~0%
para la valoracin del medicamento y no ms de 25,0% para elanlisis d Impurezas.

ESPECIFICIDAD

El procedimiento debe ser capaz de evaluar inequvocamente i::ada elemento analito en presencia de crnponentes que se
espera estarn presentes, incluido cualquier componente de la matriz.
Criterios de validacin: Se demuestran mediante el cumplimiento del requisito de exactitud.

LMITE bE CUANTIFICACIN

El lmite de cantif::acin (QL, por sus siglas en ingls) se estima calculando la desviacin estndar de n menos. d 10 qe-
terminaciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 10. Al validar un procedimiento usando el metodode es-
tndar agregado, se usa la pendiente de estndares aplicados a una solucin del material de prueba. Se pueden usar otrs
enfoques adecuados (ver el captulo (1225)).
Para confirmar fa exactitud se debe realizar la medicin de una solucin. de prueba preparada a partir de una matriz de
muestra representativa con cantidades agregadas conocidas a la concentracin del lmite de cuantificacin estimado, Al validar
un procedimiento usando el mtodo de estndar agregado, ls criterios de validacin se aplican al resultado experimental fi-
nal, no a la recuperacin de cantidades agregadas conocidas en cada nivel de adicin del estndar.
Criterios de validacin: .El procedimiento analtico debe ser capaz de determinar el anatltC1 <;on precisin y exactitud a un
nivel quvalente al 50% de la especificacin.

LINEALIDAD

Preparar una curva de respuesta entre la concentracin de analito y i;ibsrbanda a partir de no menos. de dos soluciones
estndar y un blanc (para urr total de tres puntos de datos), a.oncentraciones que abarquen la concentrain arrtklpada de
la solucin de prueba. Posteriormente, evaluar la curva estndar usando mtodos .estadstkos apropfodos, tales>coi:no la regre-
sin de mnimos cuadrados.
Para experimentos que ro producen una relacin lineal entre la concentracin de analto y fa respuesta del ICP;..;OES o lCP-
MS, se deben aplicar mtodos estadsticos apropiados para describir la respuesta nalftca.
Criterios de validacin: El coefidente de correladn (R), es no menos de 0,995pal'a valradones deCategotaiy no menos
de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categora 11.

INTERVALO

El intervalo se refiere al intervalo entre las concentraciones (cantidades) super<:>r e inferior de.an:alto en: la muestra (ncluyen~
do esas concentraciones) para las que se ha demostrado que el procedimiento arialtico tiene tln rivef adecuado de precisiH,
exactitud y linealidad que se demuestra cumpliendo con los requisitos de precisin, exactiti.ld y linealidad.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora 1, el intervalo .de validacin para critei:ios.de aceptacin centrdt)s en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criteros de aceptacin no centrados, el intervalo de validadn es. 10,00/o por debaj del lmite
inferior ha.sta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validacin es 70,0%-
130,0%. Para las pruebas de Categora 11, el intervalo de validacin abarca 70,0%-130,0% de los criterios de aceptacin.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (731) Prdida por Secado 605

ROBUSTEZ

La confabilidad de la medicin analtica se demuestra mediante cambios deliberados en los.parmetros exp~rmentales. De~
bido a que ciertos cambios en los parmetros experimentales pueden resultar en problemas potenciales de seguricjad o daos
en el equipo, la robustez se demuestra cumpliendo con los requisitos de precisin intermedia establecidos anteriormente.

Verificadll

Las reglamentaciones sobre las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes en los EE.UU. (Ttulo 21 del CFR 2.11.194(a)(2)] in-
dican que los usuarios de los procedimientos analticos, segn se indica en el compe:ndo LISP-,.f:\IF1 no esth obligados a validar
estos procedimientos siempre que se provean en una monografa. En .su lugar1 .los. usuarios simplemente deeen verificar su ap
titud en las condiciones reales de uso.
El objetivo de li't verificacin del procedimiento de ICP-OES o ICP-MS es demostrar que el procedimiento, segtllo des.crito
en la monografa, debe ser reali;!:ado por.el usuario con lil e.l(actitud; especifi:eldad y precisin adecuadas; usando los instru-
mentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De a:cuerc;fo con el captulo verificacin de Procedlmientosfarmatopeitos
(1226), si la verificacin del procedimiento farmacor:>eico siguiendo la monografl no es exitosa; el procedimiento podra no
sei: adecuapo Pilra su uso con el artculo en anlisis. Puede ser. necesario desarrollar y validar un procedrniento altema:tivo con~
forme .a lo permitido en las Adve.rtencias y RequisitQsGenerafes.6.30.
La verificacin de mtodos farmacopetcos lCP-()ES o ICP-MS debe, como mnimo, incluir la ejecucin de. los. parmetros de
validacin sobre especificidad, exactitud, precisin, linea:lidad y lmJte de cuantificacin, cuando resulte apropiado, seg,:. se
indica en Validacin ..t..USPJ9

(731) PRDIDA POR SECADO

El procedimiento que se establece en este captulo determina la cantidad de materia voltil de cualquier tipo que se elimina
en las condiciones especificadas. Para sustancias que parecen contener agua como nico constituyente voltil, es apropiado
aplicar el procedimiento que se indica en el captulo Determinacin de Agua (921) y as se especifica en la monografa indivi-
dual.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, realizar la determinacin en una muestra de prueba
de 1 a 2 g. Mezclar la sustancia a examinar y, si estuviera en forma de partculas grandes, reducir el tamao de las partculas
aproximadamente a 2 mm, triturando rpidamente la muestra antes de pesarla. Tarar un frasco para pesada adecuado, de po-
ca profundidad, con tapn de vidrio que se haya secado durante aproximadamente 30 minutos bajo las mismas condiciones
que deben emplearse en la determinacin y enfriado a temperatura ambiente en un desecador. Colocar la muestra a analizar
en el frasco, volver a colocar el tapn y pesar con exactitud el frasco y el contenido. Distribuir la muestra a analizar tan unifor-
memente como sea posible, agitando suavemente hacia los lados, hasta lograr una profundidad de aproximadamente 5 mm
por lo general, y no ms de 1 O mm en caso de materiales voluminosos. Colocar el frasco cargado en la cmara de secado,
retirando el tapn y dejndolo tambin en la cmara. Secar la muestra de prueba a la temperatura y durante el tiempo especi-
ficado en la monografa. [NOTA-La temperatura especificada en la monografa debe considerarse comprendida en el intervalo
de 2 de la cifra especificada.] Cuando en una monografa se especifica "secar hasta peso constante", el secado deber conti-
nuarse hasta que dos pesadas consecutivas no difieran en ms de 0,50 mg por g de sustancia tomada, realizando la segunda
pesada despus de una hora adicional de secado. Al abrir la cmara, cerrar rpidamente el frasco, permitiendo que llegue a
temperatura ambiente en un desecador antes de pesarlo.
Si la sustancia se funde a una temperatura inferior a la que se especifica para la determinacin de la Prdida por Secado, man-
tener el frasco y su contenido durante 1 a 2 horas a una temperatura de 5 a 1O inferior a la temperatura de fusin y luego
secar a la temperatura especificada.
Si se van a analizar cpsulas, utilizar una porcin del contenido mezclado de no menos de 4 cpsulas.
Si se van a analizar tabletas, utilizar el polvo de no menos de 4 tabletas.
En caso de que la monografa individual indique que la prdida por secado debe determinarse mediante anlisis termogravi-
mtrico, utilizar una electrobalanza sensible.
En el caso de que la monografa individual indique secado al vaco sobre un desecador, utilizar un desecador al vaco, una
pistola de secado al vaco u otro aparato de secado al vaco adecuado.
En el caso de que se especifique secado en un desecador, debe tenerse especial cuidado para asegurarse de que el desecante
se mantenga siempre completamente eficaz mediante su recambio frecuente.
En caso de que la monografa individual indique secar en un frasco con tapn con perforacin capilar1 al vaco, utilizar un
frasco o tubo con un tapn con un capilar de 225 25 m de dimetro y mantener la cmara de calentamiento a una presin

1 Disponible como "antibiotic moisture content flask" de Kimble-Kontes, 1022 Spruce St., Vineland, NJ 08362-1502.
606 (731) Prdida por Secado / Pruebas Fsicas USP 39

de 5 mm de mercurio o menor. Al final del periodo de calentamiento, dejar entrar aire seco a la cmara de calentamiento,
retirar el frasco y con el tapn con perforacin capilar todava en su sitio, permitir que se enfre a temperatura ambiente en un
desecador antes de pesar.

/ /

(733) PERDIDA POR INCINERACION

Este procedimiento tiene como objeto determinar el porcentaje del material de prueba que se volatiliza y se elimina en las
condiciones especificadas. El procedimiento, tal como se aplica generalmente, no es destructivo para la sustancia que se anali-
za; sin embargo, la sustancia puede transformarse, por ejemplo, produciendo un anhdrido.
Realizar la prueba sobre material finamente pulverizado y deshacer los grumos, si fuera necesario, con ayuda de un mortero
antes de pesar la muestra. Pesar la muestra a analizar sin aplicar ms tratamientos, a menos que se especifique un secado preli-
minar a una temperatura inferior u otro pretratamiento especial en la monografa individual. A menos que se especifique otro
equipo en la monografa individual, efectuar la incineracin en una mufla o un horno adecuado que pueda mantener la tem-
peratura dentro de los 25 de variacin con respecto a la temperatura requerida para la prueba, y emplear un crisol adecuado,
completo con su tapa, previamente incinerado durante 1 hora a la temperatura especificada para la prueba, enfriado en un
desecador y pesado con exactitud.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, transferir al crisol tarado una cantidad pesada con
exactitud, en g, de la sustancia que se va a analizar, aproximadamente igual a la calculada por la frmula:
10/L
en donde Les el lmite (o el valor de la media de los lmites) para la Prdida por incineracin, en porcentaje. Incinerar el crisol
destapado cargado y cubrir a la temperatura (25) y durante el periodo de tiempo indicado en la monografa individual. Inci-
nerar durante periodos sucesivos de 1 hora cuando se indique incineracin hasta peso constante. Una vez completada cada
incineracin, cubrir el crisol y dejar enfriar en un desecador hasta temperatura ambiente antes de pesar.

(735) ESPECTOMETRA DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X

INTRODUCCIN
La espectrometra de fluorescencia de rayos X (XRF, por sus siglas en ingls) es un mtodo instrumental basado en la medi-
cin de fotones de rayos X caractersticos originados por excitacin de electrones de las capas internas atmicas mediante una
fuente primaria de rayos X. El mtodo de XRF se puede usar para anlisis cualitativos y cuantitativos de lquidos, polvos y mate-
riales slidos. Los rayos X producidos por un tubo de rayos X incluyen lneas caractersticas que corresponden al material del
nodo y un continuo conocido como radiacin Bremsstrahlung. Se pueden usar ambos tipos de rayos X para excitar tomos e
inducir as los rayos X. El instrumental para XRF se puede dividir en dos categoras: Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de
Longitud de Onda (WDXRF, por sus siglas en ingls) y Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de Energa (EDXRF, por sus siglas en
ingls). El factor principal que distingue a estas tecnologas es el mtodo usado para separar el espectro emitido por los to-
mos en la muestra. La energa de los fotones de rayos X es caracterstica para una transicin electrnica dada en un tomo y es
de carcter cualitativo. La intensidad de la radiacin emitida indica el nmero de tomos excitados en la muestra y constituye el
carcter cuantitativo del mtodo.

CALIFICACIN DE ESPECTRMETROS PARA XRF

Calificacin de la Instalacin

Ver el captulo general USP Calificacin de Instrumentos Analticos (1058).

Calificacin Operativa

El propsito de la calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) es verificar que el sistema opere dentro de las toleran-
cias esperadas usando muestras apropiadas con propiedades espectrales conocidas. La calificacin operativa es una verificacin
de los parmetros crticos de operacin y debe realizarse despus de llevar a cabo la instalacin, reparaciones o mantenimien-
tos importantes que pudiera afectar el desempeo de los instrumentos. Es importante tomar en cuenta que todas las muestras
USP 39 Pruebas Fsicas/ (735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X 607

de calibracin deben manejarse con guantes de algodn o nitrilo y deben almacenarse en envases plsticos sellados. Alternati-
vamente, pueden estar integradas en el instrumento.
Las pruebas y especificaciones de calificacin operativa en las secciones siguientes representan nicamente ejemplos tpicos
(ver las Tablas 7 y 3). Se pueden usar otras pruebas y estndares para establecer tolerancias para estos propsitos. El proveedor
del instrumento a menudo pone a disposicin muestras y parmetros de prueba como parte del paquete de calificacin de la
instalacin.
Tabla 1. Especificaciones de Calificacin Operativa para EDXRF
Criterios de
Prueba Procedimiento Aceptacin
El espectro debe tener un conteo de al menos 3000 en
los mximos de los picos de Al Ka y Cu Ka. La energa
Adquirir un espectro de energa de una muestra de cali- correspondiente a los picos de Al Ka y Cu Ka no debe
Posicin del pico bracin de Al-Cu. diferir en ms de O, 1% de los valores tabulados.
Calcular la resolucin (ancho total a la mitad de su altu-
ra mxima) a la misma energa y a la misma velocidad El valor de resolucin no debe cambiar en ms de 10%
Resolucin del detector de conteo usada para la calificacin de la instalacin. del valor determinado en la calificacin de la instalacin.
Medir la velocidad de recuento en las lneas de Al y Cu Cambia <l 0% con respecto a las mediciones iniciales en
Velocidad de recuento Ka de la muestra de calibracin de energa. la calificacin de la instalacin en cada pico.

Para propsitos de calibracin de espectrmetros EDXRF se ha seleccionado una muestra de calibracin de energa que con-
siste en un disco de aleacin Al-Cu (EN AW-AICu6BiPb; Alloy (Aleacin) 2011, ASTM B211 ). Esta aleacin por lo general se
encuentra disponible, es resistente a la corrosin y provee intensidades adecuadas tanto para Al Ka como para Cu Ka. Estas
lneas caractersticas abarcan las energas tpicas usadas para los anlisis de XRF. Asimismo, se puede obtener informacin sufi-
ciente de los espectros registrados en este material para evaluar la resolucin del detector. La Tabla 2 proporciona una especifi-
cacin ms completa sobre la composicin de esta muestra de calibracin.
Tabla 2. Especificacin de la Concentracin de los Elementos de la Aleacin Al-Cu (el balance remanente es aluminio)
Lmites de Concentracin
Elemento (en % en peso)
Cu 5-6
Zn 0,3 mximo
Fe 0,7 mximo
Bi 0,2-0,6
Pb 0,2-0,6
Si 0,4 mximo

Cuando el intervalo de energa de las lneas analticas para las que se usar el espectrmetro incluya energas superiores a
50 keV, se deber usar tungsteno metlico puro W (99,5% mnimo) en lugar de la aleacin Al-Cu. Este metal es estable, est
fcilmente disponible y provee lneas caractersticas bien definidas a 8,40 keV (lnea L) y 59,3 keV (lnea K).
Tabla 3. Especificaciones de Calificacin Operativa para WDXRF
Criterios de
Prueba Procedimiento Aceptacin
El ngulo correspondiente al pico mximo no debe diferir en
Llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento del fabri- ms de O, 1O grados 28 del ngulo medido en la calificacin
ngulo del pico cante. Repetir para cada cristal. de la instalacin.
Ancho total a la mitad de su altura mxima a longitudes de
onda especificadas a las mismas condiciones de medicin
que al momento de la calificacin de la instalacin. Repe-
Resolucin del detector tir para cada detector disponible. No cambia ms de 20%
Medir la velocidad de conteo en la muestra de monitoreo
especfica a una longitud de onda especificada a las mis-
mas condiciones de medicin que al momento de la cali-
ficacin de la instalacin. Repetir para cada detector dis- Cambia <l 0% con respecto a las mediciones iniciales en la
Velocidad de recuento ponible. calificacin de la instalacin

Usar lnconel 625 (Special Metals Corporation, New Hartford, NY) como una muestra para espectrmetros de WDXRF. Otras
designaciones para esta aleacin son UNS N06625, DIN 2.4856, ASTM B443, ASME SB-443 y AMS 5599. Se trata de una alea-
cin basada en nquel que incluye cromo, molibdeno y niobio como los elementos ms importantes de la aleacin. La Tabla 4
proporciona una especificacin ms completa sobre la composicin.
608 (735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X/ Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 4. Concentraciones Elementales del lnconel 625

Lmites de Concentracin
Elemento (en O/o en Peso)
Ni 58,0 mnimo
Cr 20,0-23,0
Fe 5,0 mximo
Mo 8,0-10,0
Nb 3, 15-4, 15
ste puede incluir Ta.

Una pieza pulida de lnconel 625 jams debera requerir trabajo de superficie siempre que se almacene y use apropiadamen-
te.
Todos los detectores usados en la WDXRF secuencial, sin importar si se trata de detectores de flujo proporcional, de gas se-
llado o de centelleo, pueden detectar las caractersticas de radiacin del nquel. En combinacin con la radiacin Mo K (y L),
las pruebas relacionadas con la posicin del pico y la respuesta del detector de los espectrmetros de WDXRF pueden comple-
tarse fcilmente. La Tabla 5 incluye las longitudes de onda o energas tpicas que se usan en el anlisis de XRF.
Ta bl a 5 Ener ~1asy Long 1tu d es d e Ond a para Al NI Cu, M oy W
' '
Al NI Cu Mo w
Transicin de la lnea Ka 1 K-L,, K-L,, K-L,, K-L, K-L,
Energa de Ka, (eV) 1487 7473 8041 17479 59310
Longitud de onda de Ka 1
() 8,340 1,659 1,542 0,709 0,209
Transicin de la lnea La 1 N/Ab N/A N/A L,-M, L.-M,
Energa de La 1 (eV) N/A N/A N/A 2293,2 8398,2
Longitud de onda de La 1
() N/A N/A N/A 5,4066 1,47632
Obtenido de: Deslattes RD, Kessler EG, lndelicato P, et al. X-ray transition energies: new approach to a comprehensive evaluation. (Energas de transicin de
rayos X: nuevo enfoque para una evaluacin integral) Rev Mod Phys. 2003;75(1 ):35-99. Para Al, Ni y Cu, las energas Ka 1 y Ka2 de la Tabla V se promediaron
con la ponderacin 2:1. La conversin de longitud de onda usa el valor he/E de la pgina 94. Los valores para Mo y W se toman de la Tabla VI.
b N/A =no aplica.

Calificacin del Desempeo

El propsito de la calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todas las mediciones crticas que impacten en la calidad.
Dependiendo del uso tpico, las especificaciones para la calificacin de desempeo pueden ser diferentes de las especifica-
ciones del fabricante. Se pueden usar pruebas de calificacin de desempeo especficas para cada mtodo, tambin conocidas
como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificacin de desempeo para mtodos validados.
Los procedimientos especficos, criterios de aceptacin e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeo de la XRF de-
penden del instrumento y de la aplicacin que se va a usar. La demostracin de un desempeo estable del instrumento duran-
te periodos prolongados provee cierta garanta de que pueden obtenerse mediciones confiables a partir de los espectros de
muestra, usando experimentos de XRF previamente validados.

PROCEDIMIENTO
Recomendaciones Generales

Los analistas deben verificar la aptitud de todos los reactivos y materiales con respecto a la posibilidad de contaminacin
antes de usarlos dependiendo del mtodo usado. El anlisis de un elemento ubicuo a menudo requiere el uso del grado ms
puro de reactivo o material disponible. Los portamuestras y las ventanas de soporte deben ser apropiadas para el anlisis y la
configuracin del instrumento. Los analistas deben evaluar la limpieza del equipo usado para preparar muestras para anlisis
de XRF a fin de evitar la contaminacin cruzada de las muestras.

MUESTRAS

Lquidos: Las muestras lquidas pueden introducirse directamente en el espectrmetro XRF siempre y cuando la solucin
conste de una sola fase y su volatilidad sea suficientemente baja. El anlisis de muestras lquidas requiere el uso de un porta-
muestras especial para lquidos y de una ventana de soporte disponible comercialmente compuesta por una pelcula de pol-
mero adecuado. Alternativamente, las muestras lquidas pueden transferirse a la superficie de un disco y secarse antes de su
USP 39 Pruebas Fsicas/ (735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X 609

anlisis. Por lo general, el experimento se lleva a cabo usando un gas para purga. Se pueden agregar cantidades conocidas de
estndares en solucin directamente a la muestra lquida en concentraciones apropiadas para facilitar la exactitud, la precisin
y las pruebas de especificidad segn se requiera para la validacin del mtodo.
Polvos: Los polvos preparados pueden medirse directamente en un portamuestras para lquidos. Alternativamente, se
pueden comprimir en forma de pellets. Si el polvo tiene propiedades autoaglutinantes deficientes, puede ser necesario un
aglutinante tal como una cera o etilcelulosa.
Asimismo, los polvos pueden prepararse para anlisis de XRF fundiendo el material de muestra en un vidrio usando un fun-
dente, por lo general tetraborato de sodio, tetraborato de litio y metaborato de litio. Debido a que las temperaturas requeridas
para fundir el fundente y disolver la muestra son relativamente elevadas (800-1300), este procedimiento no es adecuado
para el anlisis de elementos voltiles tales como mercurio y arsnico.
Las muestras de polvos se pueden mezclar con cantidades apropiadas de un material estndar de referencia certificado para
mejorar la exactitud, la precisin y las pruebas de especificidad segn se requiera para la validacin del mtodo. Alternativa-
mente, se pueden agregar cantidades conocidas apropiadas de estndares en solucin a las muestras en polvo y posteriormen-
te secarlas, molerlas si fuera necesario y mezclarlas minuciosamente antes del anlisis. Las adiciones de estndares se pueden
usar en los casos en que las propiedades fsicas o qumicas del polvo pueden introducir un sesgo en la respuesta del analito.

Estndares

Se pueden usar materiales de referencia apropiados que sean rastreables al National lnstitute of Standards and Technology
{Instituto Nacional de Normas y Tecnologa)) o equivalentes en la preparacin de estndares de XRF.

Anlisis

Para los parmetros instrumentales (si fuera aplicable) seguir el procedimiento de la monografa individual. Debido a las dife-
rencias entre fabricantes con respecto a las configuraciones de los equipos, los analistas pueden usar las condiciones predeter-
minadas sugeridas por el fabricante. Al momento de su uso, el instrumento debe estandarizarse para el uso pretendido. Los
analistas deben usar estndares de calibracin que abarquen el intervalo esperado de concentraciones tpicas de analito. Al lle-
var a cabo un anlisis en o cerca del lmite de deteccin, los analistas no siempre pueden usar un estndar que abarque todo el
intervalo, lo cual es aceptable para prueba de lmites. Los analistas deberan usar anlisis de regresin de la grfica estndar
para evaluar la linealidad de la respuesta del detector, mientras que las monografas individuales pueden establecer criterios
para el error residual de la lnea de regresin.
Para demostrar la estabilidad de la estandarizacin inicial del sistema, los analistas deben volver a valorar el estndar de cali-
bracin usado en la curva estndar inicial como estndar de verificacin a intervalos apropiados durante el anlisis de la totali-
dad de un conjunto de muestras. Tambin resulta aceptable el uso de un estndar preparado de manera independiente. A
menos que se indique de otro modo en la monografa individual, el estndar revalorado debe coincidir con su valor esperado
con una aproximacin de 2% para la Valoracin o de 20% para un anlisis de impurezas.
Las concentraciones de muestra se calculan en funcin. de la curva de trabajo que se genera al graficar la respuesta del ins-
trumento en funcin de la concentracin del analito en las soluciones estndar.

VALIDACIN Y VERIFICACIN

Las normativas de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes [Ttulo 21 del CFR 211. l 94(a)(2)] indican que los usuarios de
los mtodos analticos descritos en la USP-NF no estn obligados a validar la exactitud y confiabilidad de dichos mtodos, sino
que deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. En este contexto, y de acuerdo con dichas normativas, se requiere
de validacin cuando se usa un procedimiento de XRF para analizar un artculo no oficial y cuando dicho procedimiento se usa
como una alternativa al procedimiento oficial para analizar un artculo oficial (ver las Advertencias Generales 6.30 de la USP-NF).
Por otra parte, la verificacin se debe realizar la primera vez que se analiza un artculo oficial usando un procedimiento USP
(para fines informativos nicamente, referirse al captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos (1226)).

Validacin

El objetivo de la validacin de un mtodo de XRF es demostrar que el procedimiento de medicin sea adecuado para su
propsito esperado, incluyendo la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o forma farmacutica
(valoraciones de Categora 1), la determinacin cuantitativa de impurezas o lmites de prueba (Categora 11) y las pruebas de
identificacin (Categora IV). Dependiendo de la categora de la prueba (ver la Tabla 2 en el captulo Validacin de Procedimien-
tos Farmacopeicos (1225)), el proceso de validacin del mtodo analtico para XRF requiere el anlisis de linealidad, intervalo,
exactitud, especificidad, precisin, lmite de cuantificacin y robustez.
Las caractersticas de desempeo que demuestran la aptitud de un mtodo de XRF son similares a las requeridas para cual-
quier procedimiento analtico. El captulo (1225) trata los principios generales aplicables. Los criterios de aceptacin especficos
61 O (735) Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X/ Pruebas Fsicas USP 39

para cada parmetro de validacin deben ser congruentes con el uso pretendido del mtodo. Las muestras para validacin
deben ser independientes del conjunto de calibracin.

EXACTITUD

Para valoraciones de Categora 1o pruebas de Categora 11, los analistas pueden determinar la exactitud realizando estudios
de recuperacin mediante el uso de la matriz apropiada que tenga concentraciones conocidas agregadas de elementos. Asi-
mismo, se puede usar un material estndar certificado apropiado provisto por la USP. Adems, se considera una prctica acep-
table comparar los resultados de la valoracin obtenidos usando el mtodo XRF que se est validando con aqullos obtenidos
de un mtodo analtico establecido. Cuando los analistas usan el mtodo de estndar agregado, las evaluaciones de exactitud
se basan en la concentracin calculada a partir de la interseccin de la curva, con el eje de concentracin a ordenada cero, no
en la recuperacin calculada a partir de las adiciones de estndares individuales.
Criterios de aceptacin: Recuperacin de 98,0%-102,0% para valoracin de frmacos y formas farmacuticas, recupera-
cin del 70,0%-150,0% para anlisis de impurezas. Estos criterios de aceptacin deben cumplirse en todo el intervalo valida-
do.

PRECISIN

Repetibilidad: Los analistas deben evaluar el mtodo analtico midiendo las concentraciones de seis estndares distintos al
100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, los analistas pueden medir las concentraciones de
tres determinaciones repetidas de tres muestras distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo
suficientemente cercanas de modo que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentracin. En este caso, se
combina la repetibilidad a las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de aceptacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para la valoracin de frmacos, no ms de 2,0%
para la valoracin de formas farmacuticas y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.
Precisin intermedia: Los analistas deben establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisin analtica del mto-
do. Las variables tpicas incluyen realizar el anlisis en das distintos, usando diferentes instrumentos, o que dos o ms analistas
realicen el mtodo. Como mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para totalizar seis experimentos
proveer una estimacin de la precisin intermedia.
Criterios de aceptacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para la valoracin de frmacos, no ms de 3,0%
para la valoracin de formas farmacuticas y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

El procedimiento debe poder determinar de manera inequvoca cada analito elemental en presencia de otros componentes
que se esperan encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz.
Criterios de aceptacin: Se demuestra cumpliendo el requisito de Exactitud.

LMITE DE CUANTIFICACIN

El lmite de cuantificacin (LOQ, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de
6 mediciones repetidas de un blanco y multiplicando por 1O. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver (1225)). Para con-
firmar la exactitud, se debe realizar una medicin de una muestra de prueba preparada a partir de una matriz de muestra re-
presentativa y a la que se le agregan cantidades conocidas de tal manera que la concentracin sea similar a la concentracin
de lmite de cuantificacin.
Criterios de aceptacin: El procedimiento analtico debe ser capaz de determinar de manera precisa y exacta al analito
en un nivel equivalente al 50% de la especificacin.

LINEALIDAD

Los analistas deben demostrar una relacin lineal entre la concentracin del analito y la respuesta de XRF corregida prepa-
rando no menos de cinco estndares a concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la muestra de prueba.
Posteriormente, la curva estndar debe evaluarse usando mtodos estadsticos apropiados tales como la regresin de cuadra-
dos mnimos. Se deben determinar el coeficiente de correlacin (R), la ordenada al origen y la pendiente de la lnea de regre-
sin.
Para experimentos que no tienen una relacin lineal entre la concentracin de analito y la respuesta de XRF, se deben aplicar
mtodos estadsticos apropiados para describir la respuesta analtica.
Criterios de aceptacin: Res no menos de 0,995 para valoraciones de Categora 1y no menos de 0,99 para pruebas
cuantitativas de Categora 11.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (736) Espectrometra de Masas 611

INTERVALO

El intervalo se define como el intervalo entre la concentracin superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (inclu-
yendo concentraciones superior e inferior) para el que se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene un nivel adecua-
do de precisin, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad y exactitud.
Criterios de aceptacin: Para criterios de aceptacin centrados en 100,0%: 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptacin
no centrados: 10% por debajo del lmite inferior de la especificacin hasta 10% por encima del lmite superior de la especifica-
cin. Para uniformidad de contenido: 70,0-130,0%. Para la Categora 11 los requisitos del intervalo son 50,0%-120,0% de los
criterios de aceptacin.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medicin analtica se debe demostrar realizando cambios deliberados a los parmetros experimenta-
les. Para la XRF esto puede incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas.
Criterios de aceptacin: La medicin de la respuesta de un estndar o de una muestra despus de un cambio en los pa-
rmetros experimentales no debe diferir de la medida obtenida con el mismo estndar usando parmetros establecidos en ms
de 2,0% para una valoracin de una forma farmacutica y no ms de 20,0% para un anlisis de impurezas.

Verificacin

El objetivo de una verificacin de un mtodo XRF es demostrar que el procedimiento descrito en la monografa especfica, se
est llevando a cabo con una exactitud, sensibilidad y precisin adecuadas. De acuerdo con el captulo (1226), si no se consi-
gue verificar el procedimiento farmacopeico de acuerdo con la monografa, el procedimiento puede no ser adecuado para su
uso con el artculo en anlisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido
en las Advertencias Generales 6.30 de la USP-NF.
Aunque no se requiere la revalidacin completa de un mtodo de XRF farmacopeico, la verificacin de mtodos de XRF far-
macopeicos debe incluir por lo menos la ejecucin de los parmetros de validacin para especificidad, exactitud, precisin y
lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, segn se indica en la seccin Validacin (anterior).

(736) ESPECTROMETRA DE MASAS

INTRODUCCIN

La espectrometra de masas (MS, por sus siglas en ingls) es una tcnica analtica basada en la medicin de la relacin masa/
carga de especies inicas relacionadas con el analito que se est investigando. La MS se puede usar para determinar la masa
molecular y la composicin elemental de un analito, as como para elucidar en detalle la estructura del analito.
Adems de ser reconocida como una poderosa herramienta de elucidacin estructural, la MS tambin se usa ampliamente
para mediciones cuantitativas. Para informacin adicional, ver el captulo de informacin general Aplicaciones de la Espectrome-
tra de Masas (1736), el cual provee una discusin detallada sobre MS.
El instrumental para MS disponible actualmente ofrece mltiples capacidades para anlisis cualitativo y cuantitativo, lo que
resulta en una amplia variedad de enfoques experimentales disponibles para cada necesidad analtica. Debido a la diversidad
de enfoques, este captulo no presenta procedimientos especficos, sino que provee informacin sobre el diseo experimental
y sobre la aptitud del sistema para los procedimientos de MS.

ANLISIS CUALITATIVO

La MS es una tcnica sensible y altamente especfica para la identificacin de analitos. La identificacin o verificacin de es-
tructuras (es decir, la comparacin contra un estndar autntico) mediante MS es particularmente potente cuando se usa jun-
to con una tcnica de separacin tal como cromatografa de gases (GC, por sus siglas en ingls) o cromatografa de lquidos de
alta resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls). Se puede obtener mayor especificidad en el anlisis usando espectrometra de
masas en tndem (MS/MS, por sus siglas en ingls) o espectrometra de masas de alta resolucin (HRMS, por sus siglas en
ingls). Adems, utilizando HRMS se puede cumplir con requerimientos ms estrictos en cuanto a la exactitud de la masa de-
terminada.

Parmetros Experimentales

Se deben definir los siguientes parmetros experimentales de MS para un procedimiento cualitativo (p.ej., identificacin).
612 (736) Espectrometra de Masas/ Pruebas Fsicas USP 39

RESOLUCIN DE MASAS

La resolucin de masa unitaria es suficiente para la mayora de las pruebas de identificacin. Cuando se requiere mayor reso-
lucin, sta se especifica en el procedimiento y la demostracin de la resolucin adecuada se incluye en las pruebas de aptitud
del sistema para el procedimiento.

EXACTITUD DE MASAS

Una exactitud o concordancia de masas de 0,50 unidades de masa para iones con una sola carga con un estndar conoci-
do debera ser suficiente para la mayora de las aplicaciones. En las pruebas de identificacin, una exactitud o concordancia de
masas de 0,05% con un estndar conocido debera ser suficiente para la identificacin de molculas grandes (mayores de
miz 2000) cuando se utilizan iones con cargas mltiples.
Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, la exactitud de masas se especifica en el procedimiento. Posteriormente,
se incluye una demostracin de este requerimiento en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte
del protocolo establecido para la calificacin del desempeo del instrumento (PQ, por sus siglas en ingls) tema que se trata
ms adelante en este captulo.

INTERVALO DE MASAS

El intervalo de masas que se va a barrer tambin se presenta en el procedimiento. El intervalo de masas debe abarcar todos
los iones usados como parte de la confirmacin de la identificacin.

Aptitud del Sistema

La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir la demostracin del desempeo adecuado para los siguien-
tes atributos experimentales.

RESOLUCIN DE MASAS

Se incluye una demostracin de la resolucin apropiada en las pruebas de aptitud del sistema para un procedimiento. La
prueba de desempeo establecida en el protocolo de calificacin del desempeo del instrumento que se realiza diariamente o
previo al procedimiento, puede ser suficiente. Cuando se requieren resoluciones mayores a las de masa unitaria para un proce-
dimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostracin de una resolucin adecuada junto con sus criterios de acep-
tacin.

EXACTITUD DE MASAS

Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostracin de la exactitud de masas, o alternativa-
mente, sta forma parte del protocolo de calificacin del desempeo del instrumento. Una exactitud o concordancia de 0,50
unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las
aplicaciones. Cuando se requiera una mayor exactitud de masas para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios
de aceptacin apropiados.

Instrucciones para la Interpretacin

Un experimento de identificacin o verificacin implica la comparacin del compuesto de inters con un estndar autntico
(p.ej., un Estndar de Referencia USP). Para esta forma de identificacin o verificacin, el estndar y la muestra se analizan en
condiciones idnticas y deben presentar resultados que estn dentro del error experimental aceptable para el procedimiento.
Las aplicaciones de la MS para propsitos de identificacin en una monografa oficial pueden incorporar los datos de los espec-
tros de masa nicamente, o pueden combinar esta informacin con el tiempo de retencin cromatogrfico si las necesidades
de identificacin de una monografa en particular indican una mayor especificidad.
Adems, el procedimiento debe incluir los criterios establecidos para considerar que existe una correpondencia entre el es-
pectro de masas del compuesto y del estndar autntico. Si el procedimiento representa la nica prueba de identificacin es-
pectroscpica o si ninguna otra prueba de identificacin (p.ej., mapeo de pptidos o anlisis de aminocidos) provee informa-
cin estructural, el espectro del estndar debe tener una alta similitud con el de la muestra y se debe usar para la comparacin
un mnimo de tres iones estructuralmente relevantes, de preferencia uno de los cuales sea un in que represente la masa mole-
cular del analito. Cuando slo se produzca el in que representa la molcula intacta, se puede usar la masa exacta o el espec-
tro MS/MS del in molecular para fortalecer la identificacin. En caso de que tambin se lleven a cabo otras pruebas de identi-
ficacin pertinentes desde el punto de vista estructural, la comparacin se puede realizar con menos iones, siempre y cuando
uno de ellos represente la masa molecular del analito. Por ejemplo, la prueba de identificacin por MS para una protena pue-
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (736) Espectrometra de Masas 613

de examinar slo un in que represente la masa molecular si se realizan otras pruebas para confirmar la estructura de la prote-
na.

ANLISIS CUANTITATIVO

La sensibilidad y especificidad de la MS tambin la vuelve una herramienta analtica adecuada para la cuantificacin de anali-
tos. La cuantificacin es particularmente potente cuando se usa junto con una tcnica de separacin tal como GC o HPLC. Se
puede obtener mayor especificidad en el anlisis usando MS/MS o HRMS.

Parmetros Experimentales

Los siguientes parmetros experimentales deben definirse dentro de un procedimiento cuantitativo de MS (p.ej., identifica-
cin).

RESOLUCIN DE MASAS

La resolucin de masa unitaria es suficiente para la mayora de las pruebas cuantitativas. Cuando se requiere una resolucin
mayor, sta se especifica en el procedimiento y se incluye una demostracin de la exactitud de masas en las pruebas de apti-
tud del sistema para el procedimiento.

EXACTITUD DE MASAS

Las exactitudes de masas citadas en la seccin de anlisis cualitativo anterior deberan ser suficientes para la mayora de las
aplicaciones cuantitativas. Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, sta se especifica en el procedimiento. Se inclu-
ye una demostracin de la exactitud de masas en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte del
protocolo establecido para la calificacin del desempeo del instrumento.

SELECCIN DE MASAS

Las masas que se van a monitorear (p.ej., intervalo de masas, masas individuales o transiciones MS/MS) se detallan en el
procedimiento.

Aptitud del Sistema

La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir una demostracin del desempeo adecuado para los si-
guientes atributos experimentales, segn sea lo apropiado para el procedimiento.

RESOLUCIN DE MASAS

Se incluye una demostracin de la resolucin apropiada para el procedimiento en las pruebas de aptitud del sistema o como
parte del protocolo establecido para la calificacin del desempeo del instrumento. Cuando se requieran resoluciones mayores
que la masa unitaria para un procedimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostracin de la resolucin adecua-
da junto con sus criterios de aceptacin.

EXACTITUD DE MASAS

Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostracin de la exactitud de masas, o alternativa-
mente sta forma parte del protocolo de calificacin del desempeo del instrumento. Una exactitud o concordancia de 0,50
unidades de masa para iones con una sola carga de un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las aplica-
ciones. Si se requiere una exactitud de masas mayor para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios de acepta-
cin apropiados.

PRECISIN

La aptitud del sistema incluye una demostracin de precisin adecuada. Ver la Tabla 1 para lmites mximos de precisin.
Por lo regular, los lmites de aptitud del sistema se ajustan a lmites ms estrictos que los empleados para asegurar la precisin
adecuada para los experimentos de validacin. (Ver tambin la seccin sobre Validacin y Verificacin de Procedimientos Analti-
cos de Espectrometra de Masas.)
614 (736) Espectrometra de Masas/ Pruebas Fsicas USP 39

LINEALIDAD

La aptitud del sistema incluye una demostracin de la linealidad adecuada. Ver la Tabla 7 para lmites de linealidad apropia-
dos. (Ver tambin la seccin sobre Validacin y Verificacin de Procedimientos Analticos de Espectrometra de Masas.)

EXACTITUD

En ciertos casos, las muestras de control de calidad (o de verificacin) tambin pueden ser apropiadas para incluirse en el
procedimiento para asegurar la calidad de la medicin. Normalmente, estas muestras de control de calidad tienen una con-
centracin de analito conocida y se preparan de manera idntica a las muestras de prueba. En caso de utilizarse, las muestras
de control de calidad (o de verificacin) se preparan tambin como forma de verificacin de la exactitud del mtodo en el
momento de su realizacin. El procedimiento especifica el nmero u orden del anlisis de las muestras de control de calidad (o
de verificacin) requeridas. Los criterios de aceptacin de los resultados de las muestras de control de calidad (o de verifica-
cin) deben alinearse con los requisitos de la validacin segn el tipo de aplicacin (es decir, Categora 1o 11) como se describe
en la Tabla 7.

LMITE DE CUANTIFICACIN

En ciertas aplicaciones (p.ej., pruebas de lmites), puede ser necesario incluir una demostracin de la capacidad para detec-
tar el analito a un nivel establecido. Para estas aplicaciones, el procedimiento especifica el lmite y los criterios de aceptacin
(p.ej., relacin seal-ruido).

CALIFICACIN DE INSTRUMENTOS DE ESPECTROMETRA DE MASAS

La calificacin de un instrumento de MS se puede dividir en tres elementos: calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas
en ingls), calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para
informacin adicional, ver el captulo Calificacin de Instrumentos Analticos (1058), que puede ser un recurso til, aunque no
obligatorio.

Calificacin de la Instalacin

La calificacin de la instalacin provee evidencia de que los aparatos y el software se instalan de manera tal que se garantice
el uso seguro y efectivo del instrumento en la ubicacin deseada.

Calificacin Operativa

En la calificacin operativa, se caracteriza el desempeo de un instrumento usando estndares para verificar que el sistema
opera dentro de las especificaciones deseadas. El propsito de la calificacin operativa es demostrar que el desempeo del ins-
trumento es adecuado para una aplicacin dada. Dado que existe una gran variedad de estrategias para la medicin de los
espectros de MS, se recomienda la calificacin operativa mediante estndares con propiedades espectrales conocidas. Debido
a la diversidad del instrumental de MS, de las interfases y de los enfoques experimentales, los instrumentos de MS deben califi-
carse en funcin de las especificaciones deseadas para la aplicacin de inters, no slo respecto a las especificaciones provistas
por el fabricante.

Calificacin del Desempeo

La calificacin del desempeo ayuda a determinar la capacidad del instrumento para cumplir con los requisitos del usuario
para todas las mediciones crticas. La documentacin sobre calificacin del desempeo debe describir lo siguiente:
la definicin de los criterios de desempeo especficos y los procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de
prueba y parmetros instrumentales;
los elementos que se medirn para evaluar los criterios y las especificaciones predefinidas;
el intervalo de prueba, que pueden ser mediciones diarias o en el momento de su utilizacin;
el uso de muestras para enmarcar la muestra problema o grupos de muestras; y
acciones correctivas a implementar si el espectrmetro no cumple con las especificaciones.
La calificacin peridica del desempeo debe incluir un subconjunto de las pruebas de calificacin operativa para asegurar
que el desempeo del instrumento est a un nivel en el que produzca datos que sean adecuados para el uso pretendido. De-
pendiendo del uso tpico del instrumento, las especificaciones para la calificacin del desempeo pueden ser superiores o infe-
riores a las especificaciones de instalacin provistas por el fabricante. Se pueden usar pruebas de calificacin del desempeo
especficas para el mtodo, tambin conocidas como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificacin
del desempeo para procedimientos validados.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (736) Espectrometra de Masas 615

Debido a la diversidad de las configuraciones instrumentales y a las estrategias experimentales de la MS, podra no estar dis-
ponible una muestra o experimento estndar para todas las evaluaciones de calificacin del desempeo. Por ende, a menudo
se necesitan pruebas de calificacin del desempeo especficas para el mtodo o pruebas de aptitud del sistema. El diseo ex-
perimental de la calificacin del desempeo debe ser lo suficientemente robusto para asegurar el desempeo adecuado del
instrumento para la aplicacin pretendida, incluyendo las especificaciones asociadas con la medicin. Como mnimo, los expe-
rimentos de calificacin del desempeo deben incluir lo siguiente.
Para aplicaciones cualitativas, el experimento de calificacin del desempeo incluye una verificacin de la exactitud de
masas obtenida con el instrumento. Una exactitud o concordancia de 0,50 unidades de masa para iones con una sola
carga respecto a un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las aplicaciones.
Para aplicaciones cuantitativas, el experimento de calificacin del desempeo incluye verificaciones de exactitud de masas
y precisin. Una exactitud o concordancia de 0,50 unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estn-
dar conocido debera ser suficiente para la mayora de las aplicaciones. Los criterios de aceptacin para la precisin se
establecen considerando la capacidad del instrumento y del mtodo, y proveen controles suficientes con respecto a las
especificaciones de la medicin en cuestin.

Caracterizacin del Desempeo del Instrumento

Los procedimientos especficos, los criterios de aceptacin y los intervalos de tiempo para la caracterizacin del desempeo
del espectrmetro de masas dependen del instrumento y de las aplicaciones pretendidas. Muchas aplicaciones de MS emplean
experimentos previamente validados que relacionan los espectros de masas con una propiedad qumica de inters. Tpicamen-
te se busca demostrar un desempeo estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta prctica provee cierta garan-
ta de que se pueden tomar mediciones confiables de los espectros de muestra usando experimentos de MS previamente vali-
dados.

VALIDACIN V VERIFICACIN DE PROCEDIMIENTOS ANALTICOS DE ESPECTROMETRA DE

MASAS
La validacin se requiere nicamente cuando un procedimiento de MS es una alternativa al procedimiento oficial para anali-
zar un artculo oficial.
El objetivo de validar un procedimiento de MS es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito, incluyendo la
determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o en un medicamento (valoraciones de Categora 1), de-
terminacin cuantitativa de impurezas (Categora 11) y pruebas de identificacin (Categora IV). [NOTA-Para informacin adi-
cional sobre las diferentes definiciones de categoras, ver el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225).] De-
pendiendo de la categora de la prueba, la validacin del procedimiento analtico requiere un anlisis de linealidad, intervalo,
exactitud, especificidad, precisin, lmite de cuantificacin y robustez. Estas caractersticas de desempeo analtico se aplican a
mtodos con estndar externo y al mtodo de estndar agregado.
El captulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios
especficos de validacin para cada caracterstica. La intencin de las siguientes secciones es proveer al usuario criterios espec-
ficos de validacin que representen las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplicacin particular, pueden re-
querirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso pretendido.

Categoras de Medicin para Procedimientos Analticos de Espectrometra de Masas

Las caractersticas de desempeo requeridas para la validacin de un procedimiento analtico de MS, asumiendo las especifi-
caciones de la USP tpicas para la Categora 1 de 98,0%-1 02,0% para frmacos y 95,0%-105,0% para medicamentos, se listan
en la Tabla 7. Las caractersticas reales de desempeo de la validacin dependern de las especificaciones empleadas y debern
proveer evidencia suficiente de que la capacidad de medicin es suficiente para dichas especificaciones. Un protocolo de vali-
dacin del procedimiento debe especificar los experimentos de validacin y los criterios de validacin requeridos. Estos crite-
rios se determinan de acuerdo con el propsito del procedimiento analtico.
Tabla 1. Requisitos para Mediciones Analticas
Caractersticas del
Desempeo Categora 11
Analtico Categora 1 Cuantitativa
Se asegura usando un estndar de referencia, cuando resulte posible, y por una ausencia demostrable de interfe.
Especificidad rencia de otros componentes
Linealidad Coeficiente de correlacin, (R), no menos de 0,995 Coeficiente de correlacin, (R), no menos de 0,99
616 (736) Espectrometra de Masas/ Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 1. Requisitos para Mediciones Ana r1tlcas (Continuacion)

Caractersticas del
Desempeo Categora 11
Analtico Categora 1 Cuantitativa
Para criterios de aceptacin centrados en 100,0%:
80,0o/o-120,0%.
Para criterios de aceptacin no centrados: 10,0%
por debajo del lmite inferior hasta
10,0% por encima del lmite superior.
Para uniformidad de contenido:
Intervalo 70,0o/o-130,0% 50%-120%
98,0o/o-l 02,0% (frmaco)
Exactitud 95,0o/o-105,0% (medicamento) 80,0%-120,0%
No ms de 1,0% (frmaco)
Repetibilidad No ms de 2,0% (medicamento) No ms de 20,0%
No ms de 1,0% (frmaco)
Precisin intermedia No ms de 3,0% (medicamento) No ms de 25,0%
El procedimiento analtico debe ser capaz de determinar el
analito con precisin y de manera exacta a un nivel equi-
Lmite de cuantificacin - valente al 50% de la especificacin.
La confiabilidad de una medicin analtica debe demostrarse mediante cambios deliberados en los parmetros ex-
Robustez perimentales.

Validacin del Procedimiento Analtico

El objetivo de la validacin del procedimiento analtico es demostrar que ste es adecuado para su propsito mediante la
realizacin de experimentos y obteniendo resultados que cumplan con los criterios de aceptacin predefinidos. Los procedi-
mientos analticos de MS pueden incluir pruebas cuantitativas para componentes principales y contenido de impurezas, prue-
bas de lmite para la presencia de impurezas, cuantificacin de un componente en un producto o formulacin o pruebas de
identificacin.

PARMETROS DE VALIDACIN

Las caractersticas de desempeo que demuestran la aptitud de un procedimiento analtico son similares a las requeridas pa-
ra cualquier procedimiento analtico. Para informacin adicional sobre los principios generales aplicables, ver el captulo
(1225). Los criterios de aceptacin especficos para cada parmetro de validacin deben ser congruentes con el uso pretendido
del procedimiento analtico.
La Tabla 7 provee las caractersticas de desempeo que se requieren como parte de una validacin para cada categora de
procedimientos analticos.
Especificidad: El propsito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las seales pretendidas del
analito estn libres de interferencia de componentes e impurezas en el material de prueba. Se pueden realizar pruebas de es-
pecificidad para comparar los espectros de los componentes y de las impurezas que se conocen a partir de procesos sintticos,
formulaciones y preparaciones de prueba. La especificidad tambin debe demostrarse para cualquier material agregado como
parte del procedimiento (p.ej., especificidad frente a estndares internos marcados con istopos).
Para procedimientos analticos de identificacin por MS (Categoras 1y 11), los experimentos de validacin pueden incluir
experimentos de MS multidimensionales a fin de validar las asignaciones correctas de la estructura u origen de los iones.
Linealidad: La concentracin de analito y la respuesta del instrumento presentan una relacin lineal. sta se demuestra
midiendo las respuestas del analito a partir de no menos de cinco soluciones estndar a concentraciones que abarquen el in-
tervalo de concentracin anticipado de los analitos en la solucin de prueba. Para la Categora 1, las soluciones estndar pue-
den prepararse a partir de materiales de referencia en disolventes apropiados. Para la Categora 11 (procedimientos analticos de
MS que se usan para cuantificar impurezas), las muestras para demostrar linealidad se preparan fortificando muestras de prue-
ba (que contengan bajas concentraciones de analito) con cantidades conocidas de analito, o fortificando muestras de la matriz
a concentraciones en el rango esperado. Posteriormente, se construye la curva de calibracin usando procedimientos analticos
estadsticos apropiados tales como regresin de cuadrados mnimos. Luego, se determinan el coeficiente de correlacin (R), la
ordenada al origen y, la pendiente de la lnea de regresin y el valor cuadrtico medio de los residuos. Los valores absolutos
determinados para estos factores son apropiados para el procedimiento que se est validando.
Intervalo: El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito est dado por el procedimiento analtico de MS
cuantitativo. ste por lo regular se basa en las especificaciones del artculo de prueba de la monografa de la USP. Se trata del
intervalo dentro del cual el procedimiento analtico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisin, y
se puede obtener a partir de una evaluacin de dicho procedimiento analtico.
Los intervalos recomendados para los diversos procedimientos analticos de MS son los siguientes.
Para la Categora 1-valoracin de un frmaco (o producto terminado): 80%-120% de la concentracin de prueba;
USP 39 Pruebas Fsicas/ (7 41) Intervalo o Temperatura de Fusin 61 7

Para la Categora 1-uniformidad de contenido: un mnimo de 70%-130% de la concentracin de prueba;

Para la Categora 11-determinacin de una impureza: 50%-120% de los criterios de aceptacin;
Exactitud: La exactitud de un procedimiento analtico de MS cuantitativo se determina para todo el intervalo analtico re-
querido. Por lo regular, los niveles de concentraciones se evalan usando preparaciones por triplicado en cada nivel.
Preparacin de muestras para exactitud: Para valoraciones de frmacos (Categora 1), la exactitud se determina analizando
un estndar de referencia de pureza conocida. Para valoraciones de medicamentos (Categora 1), se debe usar una muestra
compuesta de un estndar de referencia u otros componentes en un producto farmacutico terminado para la validacin del
procedimiento analtico. Los resultados de la valoracin se comparan con el valor terico del estndar de referencia para esti-
mar errores o recuperacin porcentual. Para la cuantificacin de impurezas (Categora 11), la exactitud del procedimiento anal-
tico se puede determinar realizando estudios con frmacos o productos fortificados con cantidades conocidas del analito en
estudio.
Los resultados de la valoracin obtenidos del procedimiento analtico que se est validando pueden compararse con los de
un procedimiento analtico alternativo establecido.
Precisin:
Repetibilidad: El procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de solu-
ciones estndar en tres concentraciones distintas que abarcan el intervalo analtico. Como alternativa, se pueden medir las
concentraciones de seis soluciones estndar distintas al 100% de la concentracin de prueba. Posteriormente, se evala la des-
viacin estndar relativa a partir de las mediciones de las determinaciones repetidas para determinar si las soluciones cumplen
con los criterios de aceptacin.
Precisin intermedia: Se debe establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento anal-
tico. Las variables tpicas incluyen realizar el anlisis en das distintos, usando diferentes instrumentos que sean adecuados con-
forme a lo especificado en el procedimiento analtico, o siendo dos o ms los analistas que lleven a cabo el procedimiento
analtico.
Lmite de cuantificacin: El lmite de cuantificacin se valida midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de
prueba con cantidades agregadas conocidas de analito al 50% de la especificacin.
A partir de estas determinaciones repetidas, se pueden determinar la exactitud y la precisin. Los ejemplos de especificacio-
nes para determinaciones cuantitativas de Categora 11 consisten en que la concentracin medida est dentro del 70%-130%
de la concentracin de las cantidades agregadas conocidas y la desviacin estndar relativa sea no ms de 15%.
Robustez: La confiabilidad de una medicin analtica se demuestra mediante cambios deliberados en los parmetros ex-
perimentales crticos. Estos pueden incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento, croma-
togrficas y de ionizacin especficas.

Verificacin del Procedimiento Analtico

La Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes de los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los
procedimientos analticos descritos en los compendios USP-NF no necesitan validar los procedimientos que se provean en una
monografa. En su lugar, simplemente deben verificar la aptitud de los procedimientos en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificacin de un procedimiento de MS es demostrar que el procedimiento tal como se especifica en una
monografa especfica puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisin adecuadas usando los
instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el captulo de informacin general Validacin de
Procedimientos Farmacopeicos (1226), si la verificacin del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografa no es exitosa,
el procedimiento puede no ser adecuado para su uso con el artculo en anlisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un
procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificacin de un procedimiento farmacopeico de MS incluye como mnimo la ejecucin de los parmetros de validacin
para especificidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme lo indicado en la sec-
cin Validacin y Verificacin de Procedimientos Analticos de Espectrometra de Masas del presente captulo.

(741) INTERVALO O TEMPERATURA DE FUSIN

Para fines Farmacopeicos, el intervalo de fusin, la temperatura de fusin o el punto de fusin se definen como los puntos
de temperatura entre los cuales o el punto en el que se detecta la primera fase lquida detectable hasta la temperatura en la
cual no hay fase slida aparente, excepto para las Clases 11 y 111, segn se aclara ms adelante. Una transicin de fusin puede
ser instantnea para un material altamente puro, pero por lo general se observa un intervalo desde el comienzo hasta el final
del proceso. Los factores que influyen en esta transicin incluyen el tamao de la muestra, el tamao de las partculas, la efica-
cia de la difusin del calor y la velocidad de calentamiento, entre otras variables, que se controlan a travs de instrucciones del
procedimiento. Se deben aplicar las siguientes condiciones para lograr uniformidad y repetibilidad durante las determinaciones
del punto de fusin. Usar material secado, que ha sido reducido a polvo cuidadosamente e introducido en un tubo capilar
618 (741) Intervalo o Temperatura de Fusin/ Pruebas Fsicas USP 39

hasta una altura nominal de 3 mm, y realizar la determinacin del punto de fusin a una velocidad de calentamiento de 1 /
min. En algunos artculos, el proceso de fusin va acompaado por descomposicin simultnea, la cual se evidencia visualmen-
te como un efecto secundario como oscurecimiento del material, carbonizacin, burbujeo u otro incidente. El impacto visual
de esta reaccin secundaria con frecuencia oscurece el final del proceso de fusin, por lo cual puede ser imposible determinar-
lo con exactitud. En esas circunstancias, slo el comienzo de la fusin se puede establecer con exactitud y se debe informar
como la temperatura de fusin. La exactitud del aparato usado segn se describe a continuacin debe verificarse a intervalos
adecuados mediante el uso de uno o ms de los Estndares de Referencia de Punto de Fusin USP disponibles, preferentemen-
te aqullos que fundan a temperaturas lo ms cercanas posible a las temperaturas de fusin de los compuestos en anlisis (ver
Estndares de Referencia USP (11 )). Los Estndares de Referencia de Punto de Fusin USP estn destinados para verificar la exac-
titud del dispositivo y no son adecuados para la calibracin.
A continuacin se describen ocho procedimientos para la determinacin del intervalo o temperatura de fusin, los cuales
varan segn la naturaleza de la sustancia. Cuando no se designa ninguna clase en la monografa, emplear el procedimiento
para la Clase la para sustancias cristalinas o amorfas y el procedimiento para la Clase 11 para sustancias cerosas.
El procedimiento conocido como determinacin del punto de fusin de mezcla, en el cual el intervalo o temperatura de
fusin de un slido en anlisis se compara con el de una mezcla ntima de partes iguales del slido y de una muestra autntica
del mismo, p.ej., el Estndar de Referencia USP correspondiente, si estuviera disponible, puede emplearse como una prueba de
identificacin confirmatoria. La coincidencia de las observaciones del original y de la mezcla constituye una evidencia confiable
de identidad qumica.

APARATOS
Se pueden usar aparatos con cmaras u otro equipo computarizado que proporcionen ventajas en cuanto a exactitud, sensi-
bilidad o precisin siempre que hayan sido debidamente calificados.
Aparato 1: Un ejemplo de Aparato I adecuado para la determinacin del intervalo de fusin consiste en un recipiente de
vidrio para un bao de lquido transparente, un dispositivo mezclador apropiado, un termmetro exacto y una fuente contro-
lada de calor. El lquido del bao se selecciona de acuerdo con la temperatura requerida pero, por lo general, se utiliza parafina
lquida liviana y ciertas siliconas lquidas que se adaptan bien a intervalos ms altos de temperatura. El lquido del bao tiene la
suficiente profundidad para permitir la inmersin del termmetro a la profundidad especificada de manera que el bulbo quede
aproximadamente a 2 cm del fondo del bao. El calor puede ser suministrado por una llama abierta o elctricamente. El tubo
capilar tiene aproximadamente 1O cm de largo y 0,8-1,2 mm de dimetro interno, con paredes de 0,2-0,3 mm de espesor.
Aparato 11: Se puede emplear un instrumento en los procedimientos para las Clases/, la y lb. Un ejemplo de Aparato 11
adecuado para la determinacin del intervalo de fusin consiste en un bloque de metal que puede calentarse a velocidad con-
trolada, con su temperatura monitoreada mediante un sensor. El bloque permite alojar el tubo capilar que contiene la sustan-
cia de prueba y controlar el proceso de fusin, normalmente por medio de un haz de luz y un detector. Se puede procesar la
seal del detector a travs de una microcomputadora para determinar y mostrar el punto o intervalo de fusin, o bien la seal
del detector se puede graficar para permitir el clculo visual del punto o intervalo de fusin.

PROCEDIMIENTOS
Procedimiento para la Clase 1, Aparato 1: Reducir la sustancia en anlisis a un polvo muy fino y, a menos que se indique
algo diferente, deshidratar la sustancia secndola a la temperatura especificada en la monografa correspondiente cuando con-
tiene agua de hidratacin. Si la sustancia no contiene agua de hidratacin, secarla sobre un desecante apropiado durante no
menos de 16 horas (o en las condiciones indicadas en Prdida por Secado (731 ), si fuera apropiado).
Cargar un tubo capilar de vidrio con un extremo cerrado con suficiente polvo seco para que forme una columna en el fondo
del tubo que tenga 3 mm de altura al compactarla tanto como sea posible golpeteando suavemente sobre una superficie sli-
da. El fabricante del instrumento puede especificar variaciones en el tamao de las muestras en funcin del diseo del mismo.
Calentar el bao hasta que la temperatura est aproximadamente a 1O por debajo del punto de fusin esperado. Retirar el
termmetro y acoplar rpidamente el tubo capilar al termmetro mojando ambos con una gota del lquido del bao o de
alguna otra manera y ajustar su altura para que el material en el capilar quede al nivel del bulbo del termmetro. Colocar el
termmetro nuevamente en el bao y continuar el calentamiento, mezclando constantemente, de manera que la temperatura
ascienda a una velocidad de aproximadamente 3/min. Cuando la temperatura est aproximadamente a 3 por debajo del
lmite inferior del intervalo de fusin esperado, reducir el calentamiento para que la temperatura ascienda a una velocidad de
aproximadamente 1/min. Continuar el calentamiento hasta que se complete la fusin.
La temperatura a la cual la columna de la sustancia en anlisis se colapsa claramente contra las paredes del tubo en cualquier
punto indica el comienzo de la fusin y la temperatura a la cual la sustancia de prueba se torna completamente lquida corres-
ponde al final de la fusin o punto de fusin. Las dos temperaturas caen dentro de los lmites del intervalo de fusin. Si la
fusin ocurre con descomposicin, la temperatura de fusin correspondiente al comienzo de la fusin est dentro del intervalo
especificado.
Procedimiento para la Clase la, Aparato 1: Preparar la sustancia de prueba y cargar el capilar segn se indica en Procedi-
miento para la Clase/, Aparato /. Calentar el bao hasta que la temperatura est aproximadamente a 1O por debajo del punto
de fusin esperado y aumente a una velocidad de aproximadamente 1 /min. Insertar el capilar segn se indica en Procedimien-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (741) Intervalo o Temperatura de Fusin 619

to para Clase/, Aparato I cuando la temperatura est aproximadamente a 5 por debajo del lmite inferior del intervalo de fu-
sin esperado y continuar el calentamiento hasta completar la fusin. Registrar el intervalo de fusin segn se indica en Proce-
dimiento para la Clase 1, Aparato l.
Procedimiento para la Clase lb, Aparato 1: Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una
temperatura de 1O o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el tubo
capilar segn se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado en
un desecador al vaco y secar a una presin que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente despus
de retirar del desecador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo y, tan pronto como sea practicable, proceder con la de-
terminacin del intervalo de fusin segn se indica a continuacin. Calentar el bao hasta que la temperatura est aproxima-
damente a 1O por debajo del intervalo de fusin esperado. Luego, introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de
ascenso de aproximadamente 1 /min hasta completar la fusin. Registrar el intervalo de fusin segn se indica en Procedimien-
to para la Clase 1, Aparato l.
Si el tamao de partcula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba
segn se indic anteriormente. Luego, aplicando la menor presin posible, triturar cuidadosamente las partculas hasta un ta-
mao adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo.
Procedimiento para la Clase 1, Aparato 11: Preparar la sustancia en anlisis y cargar el tubo capilar segn se indica en
Procedimiento para Ja Clase 1, Aparato l. Operar el aparato segn las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la
temperatura est aproximadamente a 1O por debajo del punto de fusin esperado. Insertar el tubo capilar en el bloque de
calentamiento y continuar el calentamiento a una velocidad de ascenso de temperatura de aproximadamente 1/min hasta
completar la fusin.
La temperatura a la cual la seal del detector se desva por primera vez de su valor inicial indica el comienzo de la fusin y la
temperatura a la cual la seal del detector alcanza su valor definitivo corresponde al final de la fusin o punto de fusin. Las
dos temperaturas caen dentro de los lmites del intervalo de fusin. Si la fusin ocurre con descomposicin, la temperatura de
fusin correspondiente al comienzo de la fusin est dentro del intervalo especificado.
Procedimiento para la Clase la, Aparato 11: Preparar la sustancia de prueba y cargar el tubo capilar segn se indica en
Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Operar el aparato segn las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la
temperatura est aproximadamente a 1O por debajo del punto de fusin esperado y aumente a una velocidad de aproxima-
damente 1/min. Insertar el tubo capilar segn se indica en Procedimiento para la Clase/, Aparato I cuando la temperatura est
aproximadamente a 5 por debajo del lmite inferior del intervalo de fusin esperado y continuar calentando hasta completar
la fusin. Registrar el intervalo de fusin segn se indica en Procedimiento para la Clase /, Aparato l. Si la fusin ocurre con des-
composicin, la temperatura de fusin correspondiente al comienzo de la fusin est dentro del intervalo especificado.
Procedimiento para la Clase lb, Aparato 11: Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una
temperatura de 1O, o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el
tubo capilar segn se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado
en un desecador al vaco y secar a una presin que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente des-
pus de retirar del desecador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo, y tan pronto como sea practicable, proceder con la
determinacin del intervalo de fusin segn se indica a continuacin. Operar el aparato segn las indicaciones del fabricante.
Calentar el bloque hasta que la temperatura est aproximadamente a 1O por debajo del intervalo de fusin esperado. Luego,
introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de ascenso de aproximadamente 1/min hasta completar la fusin. Regis-
trar el intervalo de fusin segn se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l.
Si el tamao de partcula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba
segn se indic anteriormente. Luego, aplicando la menor presin posible, triturar cuidadosamente las partculas hasta un ta-
mao adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo.
Procedimiento para la Clase 11: Fundir cuidadosamente el material que se desea probar a la menor temperatura posible y
colocarlo en un tubo capilar con ambos extremos abiertos, a una profundidad de aproximadamente 1O mm. Enfriar el tubo
cargado a 1O o menos durante 24 horas, o mantenerlo en contacto con hielo durante no menos de 2 horas. Luego unir el
tubo capilar al termmetro por medios adecuados, ajustarlo en un bao de agua de manera que el borde superior del material
quede 1O mm por debajo del nivel del agua y calentar segn se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato I excepto que
se debe regular la velocidad de ascenso de temperatura a razn de aproximadamente 1,0/min, dentro de los 5 de la tempe-
ratura de fusin esperada. La temperatura a la cual el material comienza a subir en el tubo capilar es la temperatura de fusin.
Procedimiento para la Clase 111: Fundir lentamente una cantidad de la sustancia de prueba, mientras se mezcla, hasta
que alcance una temperatura de 90-92. Retirar la fuente del calor y dejar que la sustancia fundida se enfre a una temperatu-
ra de 8-10 por encima del punto de fusin esperado. Enfriar el bulbo de un termmetro adecuado a 5, secarlo y mientras
todava est fro colocarlo en la sustancia fundida hasta que quede sumergida aproximadamente la mitad inferior del bulbo.
Retirarlo de inmediato y mantenerlo en posicin vertical lejos del calor hasta que se opaque la superficie de la cera. Luego,
sumergirlo durante 5 minutos en un bao de agua con una temperatura que no exceda de 16.
Fijar el termmetro firmemente a un tubo de ensayo de manera que el punto inferior quede 15 mm por encima del fondo
del tubo de ensayo. Suspender el tubo de ensayo en un bao de agua ajustado a aproximadamente 16 y aumentar la tempe-
ratura del bao a una velocidad de aproximadamente 2/min hasta 30. Luego, cambiar a una velocidad de aproximadamente
1/min y observar la temperatura a la cual se desprende del termmetro la primera gota de sustancia fundida. Repetir la deter-
minacin dos veces con una porcin recin fundida de la sustancia de prueba. Si la variacin de las tres determinaciones es de
620 (741) Intervalo o Temperatura de Fusin/ Pruebas Fsicas USP 39

menos de 1, tomar el promedio de las tres como punto de fusin. Si la variacin de las tres determinaciones es 1o mayor de
1, hacer dos determinaciones adicionales y tomar el promedio de las cinco.

Ellmimir lo $iguiente:
" " .. ' ' ; '

{751) PARTICULAS METALICAS EN UNGUENTOS OFTALMICOS

La siguiente prueba est diseada para limitar un nvel que se considera no objetable el nmero y tamao de partculas
metlicas que puede haber presentes en ungentos oftlmicos.
Procedimiento-Extrudir tanto como sea posible, en forma individual, el contenido de 1 O tubos en sendas placas de Petri
de 60 mm transparentes, de fondo plano y exentas de marcas de cualqUler tipo. Cubrir las placas y cafetitar a 85 durante 2
horas, aumentando la temperatura levemente, si fuera necesario, para asegurar la ootendn del estdo lquido. Tomando pre-
cauciones para no perturbar la muestra fundida, defar enfriar cada una de fas platas a temperatura ambiente hasta lograr ra
solidificacin.
Retirar las tapas e invertir cada placa de Petri en la .platina de un microscopio apropiado ajustado para p'oporeionar tm au-
mento de 30x y eqUipado con un oc\Jlar con micrmetro d disto calibrado para el aument empleado; Adems d la fuente
de luz usual, dirigir otra fuente de iluminacin por encima del ungent a un ngulo de 45 . Exam.inar el fondo de. la placa de
Petri en su totalidad pra verificar la presencia de partculas metlicas; La variacin dela intensidad de laferite de ilu.mlnaein
superior permite que s rconozcan estas partculas metlicas pr su reflexin ca-act.erstica d' la luz.
C:ontar el nrnero de partculas metlicas de 50 m o de mayor tamao. en cualquier dirnensiri~ los rAAuisitos se cumplen si
el nmero total de tales partculas en los JO. tul:fos no excede de soy si no hay riJs.de. f tub que. contenga rns'de 8 partcu-
las metlcas. Sino se obtienen estos resultados, repetir la prueba h 2() tubos adiinales: los rqbisitos se complen si el nu
mero total de. partcolas metlkas que tienen un tamao de .so m o rmfyor en cualquier cfirnens6ri 1 no excede de 150 en ros
30 tubos analizados y si no hay ms de 3 tubos, individualmente, que contengan ms de. 8 partculas de este tipo..,;.t)sp39

<755) LLENADO MNIMO

ALCANCE

Las siguientes pruebas y especificaciones se aplican a artculos tales como cremas, geles, lociones, ungentos, pastas, polvos,
aerosoles y atomizadores envasados. Para minimizar el impacto del aire atrapado en los productos donde el contenido declara-
do se expresa en volumen, la determinacin del llenado se lleva a cabo usando el peso a partir del cual se calcula el volumen
usando la densidad de la preparacin.

PROPSITO

La prueba de llenado mnimo asegura que la cantidad de material llenado en el producto cumple con la cantidad declarada.

PROCEDIMIENTO PARA FORMAS FARMACUTICAS DIFERENTES DE AEROSOLES

Para envases donde el contenido declarado se expresa en peso: Seleccionar una muestra de 1O envases llenos y quitar
todas las etiquetas cuyo peso pueda variar cuando se extrae el contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente
la parte externa de los envases con un medio apropiado y pesar individualmente. Extraer cuantitativamente el contenido de
cada envase, cortndolo de manera tal que quede abierto y lavndolo con un disolvente apropiado, si fuera necesario, tenien-
do cuidado de retener el cierre y las otras partes de cada envase que estuvieron presentes durante el pesaje inicial. Secar y
volver a pesar cada uno de los envases vacos junto con sus partes correspondientes. Determinar el peso neto del contenido
del envase mediante la diferencia.
Para envases donde el contenido declarado se expresa en volumen: Proceder segn se indica anteriormente para envases
donde el contenido declarado se expresa en peso, pero convertir el peso en volumen usando la densidad de la preparacin. A
continuacin se presenta un procedimiento para determinar la densidad de los materiales:
1. Tarar un matraz volumtrico de 100 mL que contenga 50,0 mL de lquido que sea miscible con la formulacin.
2. Agregar aproximadamente 25 mL de una muestra representativa del producto y mezclar agitando por rotacin suave el
contenido de la mezcla.
3. Volver a pesar el matraz.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear 621

4. Desde una bureta, agregar una cantidad medida con exactitud del lquido miscible para llevar el contenido del matraz a
volumen mientras se agita suavemente por rotacin suave. Registrar el volumen tomado de la bureta.
5. Calcular la densidad de la muestra:
W/V
W = peso del material tomado (g)
V= 50,0 mL menos el volumen, en mL, del lquido miscible necesario para ajustar el contenido del matraz a 100 mL
Se pueden emplear otros mtodos para determinar la densidad dependiendo de la formulacin (p.ej., formulaciones sustan-
cialmente no acuosas). De manera similar, si el contenido del envase es de menos de 25 mL, se pueden usar vasos graduados
ms pequeos, ajustando las cantidades de lquido miscible de manera correspondiente.
Como alternativa, verter el contenido de 1O envases en 1O probetas graduadas adecuadas y dejar que escurra por completo.
Registrar el volumen del contenido de cada uno de los 1O envases.

Criterios de Aceptacin

Esta prueba cumple con los criterios de aceptacin en la Etapa 1 o la Etapa 2:

Etapa 1:
1. El contenido neto promedio de los 1O envases es no menor que la cantidad declarada y el contenido neto de cual-
quier envase individual es no menos de 90% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL
o menos, o no menos de 95% de la cantidad declarada en la que la cantidad declarada es ms de 60 g o 60 ml. Si
no se cumplen estos criterios y el contenido neto de no ms de 1 envase es menos de 90% de la cantidad declarada
cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o menos, o 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declara-
da es ms de 60 g o 60 mL, proceder con la Etapa 2.
Etapa 2:
1. Determinar el contenido de 20 envases adicionales.
2. El contenido promedio de los 30 envases es no menor que la cantidad declarada y el contenido neto de no ms de 1
de los 30 envases es menos de 90% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o me-
nos, o menos de 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es ms de 60 g o 60 ml.

PROCEDIMIENTO PARA AEROSOLES Y ATOMIZADORES

Seleccionar una muestra de 1O envases llenos y quitar cualquier etiquetado cuyo peso podra variar durante la remocin del
contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con medios apropiados y pesar
individualmente. Retirar el contenido de cada envase empleando una tcnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la pre-
sin interna, retirar la vlvula y verter). Retirar el contenido residual con disolventes apropiados y luego enjuagar con unas po-
cas porciones de metano!. Retener el envase, la vlvula y todas las partes del mismo como una unidad y calentarlas a 100
durante 5 minutos. Enfriar y volver a pesar cada uno de los envases junto con sus partes correspondientes. La diferencia entre
el peso original y el peso del envase vaco es el peso neto de llenado. Determinar el peso neto de llenado para cada envase
analizado.

Criterios de Aceptacin

Los requisitos se cumplen si el peso neto del contenido de cada uno de los 1O envases es no menor que la cantidad declara-
da.

(761) ESPECTROSCOPA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

INTRODUCCIN

La espectroscopa de resonancia magntica nuclear (RMN) es un mtodo analtico basado en las propiedades magnticas de
ciertos ncleos atmicos. Al igual que con otros tipos de espectroscopa, la absorcin o emisin de energa electromagntica a
frecuencias caractersticas proporciona informacin sobre la estructura. La RMN difiere de otros tipos de espectroscopa en que
los niveles discretos de energa entre los que ocurren las transiciones se presentan slo cuando el ncleo se somete a un campo
magntico.
Aunque se la reconoce ampliamente como una de las ms poderosas herramientas de elucidacin de estructuras qumicas
disponibles, tambin se la puede usar para mediciones cualitativas y cuantitativas exactas, siempre que se use un diseo expe-
622 (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear / Pruebas Fsicas USP 39

rimental apropiado. Consultar el captulo de informacin general (1761) Aplicaciones de la Espectroscopa de Resonancia Magn-
tica Nuclear. [NOTA-Los captulos con nmeros superiores a 1000 se proveen nicamente para fines informativos.]

CALIFICACIN DE INSTRUMENTOS DE RMN

La calificacin de un instrumento de RMN se puede dividir en tres etapas: Calificacin de Instalacin (IQ, por sus siglas en
ingls), Calificacin Operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y Calificacin de Desempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para
un anlisis ms detallado, ver el captulo de informacin general Calificacin de Instrumentos Analticos (1058).

Calificacin de Instalacin
Los requisitos de Calificacin de Instalacin proveen evidencia de una instalacin adecuada de hardware y software para el
instrumento de manera segura y efectiva en la ubicacin deseada.

Calificacin Operativa
En la Calificacin Operativa se caracteriza el desempeo del instrumento usando estndares para verificar que el sistema
opera de acuerdo con las especificaciones esperadas. El propsito de la Calificacin Operativa es demostrar que el desempeo
del instrumento es apto para una aplicacin determinada. Debido a que se encuentran disponibles una gran cantidad de mo-
dos distintos para medir espectros de RMN, se recomienda usar estndares con propiedades espectrales conocidas durante la
Calificacin Operativa. Por lo general, se encuentran disponibles estndares de referencia en tubos para RMN sellados para
determinar la relacin seal-ruido y la forma de la lnea espectral.

Calificacin de Desempeo
La Calificacin de Desempeo ayuda a determinar que el instrumento sea capaz de cumplir con los requisitos del usuario
para todas las mediciones crticas para la calidad. La documentacin de la Calificacin del Desempeo debe describir lo si-
guiente:
1. Criterios de desempeo especficos definidos y procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de prueba y
parmetros del instrumento.
2. Los elementos a medir para evaluar los criterios y las especificaciones definidas a priori para dichos criterios.
3. El intervalo de prueba, que puede ser al momento de usar.
4. El uso de muestras extremas (bracketing) o de un grupo de varias muestras.
5. Una lista definida de las acciones correctivas que podran implementarse si el espectrmetro no cumpliera con las especifi-
caciones.
La Calificacin de Desempeo peridica debe incluir un subconjunto de pruebas de Calificacin Operativa para asegurar que
el instrumento se desempea produciendo datos adecuados para el uso que se le intenta dar. Dependiendo del uso tpico, las
especificaciones de la Calificacin de Desempeo pueden ser ms o menos estrictas que las especificaciones de instalacin del
fabricante. Las mediciones crticas para la calidad de los espectros incluyen una medicin de la relacin seal-ruido y pruebas
de resolucin para todos los ncleos de inters. Las pruebas de Calificacin de Desempeo especficas para un mtodo, tam-
bin conocidas como pruebas de aptitud del sistema, se pueden usar como requisitos de Calificacin de Desempeo en el caso
de procedimientos validados.
Las pruebas y muestras para la Calificacin de Desempeo citadas en las secciones siguientes son slo ejemplos tpicos. Se
pueden usar otras pruebas y muestras para establecer especificaciones para propsitos especficos. Los proveedores de instru-
mentos a menudo suministran muestras y parmetros de prueba que se pueden usar como parte del paquete de Calificacin
de Desempeo.

MEDICIN DE LA RESOLUCIN y DE LA FORMA DE LA LNEA-RMN DE 1 H (ver la Figura 1)

Muestra: Cloroformo al 1% en acetona-d 6 (~ 500 MHz), cloroformo al 3% en acetona-d 6, desgasificada y sellada

Ancho del espectro: < 1 KHz
Tiempo de adquisicin de datos: No menos de 1 O segundos
ngulo de deflexin: 90
Tiempo de relajacin: 60 segundos
Velocidad de giro: Esttica 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisicin sin desacoplamiento
Procesamiento: Sin ensanchamiento de lnea, completado de ceros hasta 128 k
USP 39 Pruebas Fsicas/ (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear 623

* Satlite de 13C
#
Artefactos de Giro

~
#
~

.# !
* * t~
# #
~
-T- ,.-r -~r- -1 ('"' f' . - -r' .r - '")" """ w-r -- -,-----" -. r ---.... r-"' ........."'"""'f" "'" r-- -y--;r-- y--r<>-1--'1 _, -.,-,~. "----"! """
l
-1
8,2 8,1 8,0 7~ 7,8 (ppmJ

Figura 1. Espectro de RMN de 1 H de cloroformo en acetona-d 6 obtenido a 400 MHz. El ancho de la lnea medido a 0,55% y
a O, 11 % de los satlites 13 C fue 2, 7 y 5,5 Hz, respectivamente.

Compensar el magneto con especial atencin a las compensaciones fuera de eje, obtener una sola adquisicin, someter a
correccin de fase para obtener una absorcin pura y medir el ancho de la lnea a 50%, 0,55% y O, 11 % de la intensidad mxi-
ma. El ancho de la lnea debe cumplir con las especificaciones para estas alturas y, adems, la forma de la lnea debe ser lorent-
ziana. Con frecuencia, en los espectrmetros de RMN modernos, la forma de la lnea se obtiene en muestras sin girar, puesto
que es posible compensar muy bien fuera de eje, tanto que no existe ninguna diferencia fundamental entre los espectros obte-
nidos girando la muestra y con la muestra sin girar. Adems, los espectros bidimensionales se deben obtener sobre muestras
estticas.

MEDICIONES DE RELACIN SEAL-RUIDO-RMN DE 1H (ver la Figura 2)

Muestra: Etilbenceno al O, 1% en cloroformo-d, etilbenceno al 1% en cloroformo-d (< 200 MHz) desgasificado y sellado
Ancho del espectro: 1O ppm
Tiempo de adquisicin de datos: 400 milisegundos
ngulo de deflexin: 90
Tiempo de espera para relajacin: 60 segundos
Velocidad de giro: O aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisicin sin desacoplamiento
Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de la lnea de 1 Hz
Referencia: Tetrametilsilano {TMS) = 0,0 ppm o el centro del cuarteto= 2,65 ppm
624 (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear / Pruebas Fsicas USP 39

-
""
2,3,4

"'o
t f . w .. f ' ~ ' - ' 1
6 5

~~,..-....-~---.---,---,-~-,---,--....,-...,.....-,--,--,---,-.....,..---.---,--,-,~--.--,

4 1 (ppm)

Figura 2. Espectro de RMN de 1 H de etilbenceno al O, 1% obtenido a 400 MHz con una relacin seal-ruido de 550:1

Se debe elegir la concentracin de etilbenceno para lograr mediciones de relacin seal-ruido especificadas en el intervalo
de 20-1000. Las concentraciones que generalmente resultan en mediciones fuera de dicho intervalo tienen una utilidad limita-
da para la evaluacin del desempeo del instrumento. Sin embargo, convencionalmente se utilizan soluciones estndar esta-
blecidas. Se debe compensar el magneto lo mejor posible. Idealmente, esta prueba debe realizarse inmediatamente despus
de la prueba de la forma de la lnea puesto que la mayora de las compensaciones estarn casi maximizadas. Obtener una sola
adquisicin, someter el espectro a correccin de fase en el modo de absorcin pura y medir la relacin seal-ruido del cuarteto
de etilbenceno. Este experimento se puede realizar girando la muestra o con la muestra esttica. Si las compensaciones fuera
de eje estn bien ajustadas, el valor de la relacin seal-ruido medido sobre muestras giradas slo debe ser aproximadamente
10% mayor que el obtenido con muestras estticas. Una relacin mayor indica que se puede lograr una compensacin fuera
de eje adicional.
Los espectrmetros modernos tienen un software que lleva a cabo la medicin de la relacin seal-ruido una vez que el ope-
rador ha identificado las regiones de la seal y del ruido. Los clculos tambin pueden realizarse manualmente. Medir la ampli-
tud (A) desde el centro de la lnea base hasta el pico de la ms alta de las dos lneas centrales en el cuarteto. Medir la altura del
ruido entre picos Uf) desde el pico de ruido inferior hasta el pico de ruido superior en la regin de 3-5 ppm. El ruido puede
multiplicarse verticalmente por un factor para obtener una medicin exacta de los espectros con relacin seal-ruido alta. Cal-
cular la relacin seal-ruido segn se indica a continuacin:

S/N = k X 2,5 X Al H [1]

donde k es el factor de expansin vertical de la regin de ruido usada. El factor de 2,5 convierte la relacin seal-ruido entre
picos en la media cuadrtica (rms, por sus siglas en ingls) del ruido, que es la convencin estndar para informar la seal-
ruido en la espectroscopa de RMN. Se pueden usar clculos de seal-ruido computarizados siempre que las especificaciones se
establezcan y analicen usando el mismo procedimiento. El uso de un valor de relacin seal-ruido menor que el especificado
por el fabricante es permisible, a discrecin del espectroscopista, siempre y cuando se determine que dicho valor es suficiente
para la aplicacin en uso.

MEDICIONES DE RELACIN SEAL-RUIDO DE RMN DE 13 C (ver la Figura 3)

Muestra: p-Dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: Aproximadamente 200 ppm
ngulo de deflexin: 90
Tiempo de espera para relajacin: 300 segundos
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisicin sin desacoplamiento
Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de lnea de 3,5 Hz, completado de ceros hasta 32k
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del benceno= 128,4 ppm
USP 39 Pruebas Fsicas/ (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear 625

.i
Benceno-d6

. +
~~~-- Dioxano

120 100

~~~~~~~....-~~---~~~~~-.-~.....-~..---.~--..---...~r---t-----r---~.~

140 120 100 80 60 (ppm)

Figura 3. Espectro de RMN de BC del estndar ASTM de p-dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) obtenido a 100,6 MHz, con
una relacin seal-ruido de 140:1

Usando un magneto bien compensado, obtener una sola adquisicin despus de un tiempo de espera mnimo de 300 se-
gundos, colocar el espectro en fase de absorcin pura y medir la altura del triplete del benceno a aproximadamente 128,4
ppm desde el centro de la lnea base. El ruido entre picos se puede medir segn se indic anteriormente con una expansin
vertical apropiada a 80-120 ppm. Los clculos de la relacin seal-ruido se pueden realizar tal como indica la Ecuacin 7 o
mediante clculo computarizado.
El triplete del benceno-d 6 no se intensifica por efecto nuclear de Overhauser (NOE, por sus siglas en ingls). Por consiguien-
te, esta prueba verifica slo el desempeo del canal 13 C.

DESEMPEO DE LOS CANALES 13 C y 1 H (ver la Figura 4)

Muestra: Etilbenceno hasta al 10% en cloroformo-d (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: 200 ppm
Duracin de la adquisicin de datos: 64k puntos
ngulo de deflexin: 90
Tiempo de espera para relajacin: 300 segundos
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisicin con desacoplamiento de pulso compuesto ajustado al centro del espectro
de 1H
Procesamiento: Exponencial con ensanchamiento de lnea de 0,3 Hz
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del cloroformo-d = 77,23 ppm
626 (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear / Pruebas Fsicas USP 39

2,3
CH
~C,.,..6 3
-~
':::::-.....
(;J
4 CDCl 3
1 6
5

-,---.-~~-.--~-.---.--..-

120 100

Figura 4. Espectro de RMN de BC de etilbenceno al 10% obtenido con una sonda dual 1 H/BC enfriada criognicamente a
150,9 MHz, con una relacin seal-ruido de 640:1

La compensacin debe ser suficiente para cumplir con las pruebas de resolucin y de forma de la lnea descritas anterior-
mente. La medicin de la relacin seal-ruido se realiza a partir de la altura del pico de la mayor de las dos resonancias cerca-
nas a 128 ppm. El ruido se mide segn se indic anteriormente en la regin de 80-120 ppm, con una expansin vertical apro-
piada. La relacin seal-ruido es calculada por la computadora o conforme a la Ecuacin 1.

MEDICIONES DE RELAXOMETRA-RMN DE CAMPO BAJO

La Calificacin de Desempeo debe realizarse antes de la recoleccin de datos experimentales.

Disolver una cantidad pesada con exactitud de cloruro de manganeso (11) tetrahidrato (peso molecular 197,91) en agua y
diluir cuantitativamente con agua para obtener soluciones de comprobacin con concentraciones conocidas de 0,9; 2,7 y 4,5
mM.
Colocar una porcin de cada una de las soluciones en portamuestras adecuados para el modelo de espectrmetro de RMN
de campo bajo en uso. Entibiar a 40 durante no menos de 1 O minutos y medir el tiempo de relajacin espn-entorno (T,) del
agua. El promedio T1 para mediciones repetidas debe estar dentro del 5% de 156; 52 y 32 ms para las soluciones de 0,9; 2,7 y
4,5 mM, respectivamente.

Caracterizacin del Desempeo del Instrumento

Los procedimientos especficos, criterios de aceptacin e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeo del espectr-
metro de RMN dependen del instrumento y del uso que se pretende dar. Muchas aplicaciones de RMN emplean experimentos
previamente validados que relacionan los espectros de RMN con una propiedad fsica o qumica de inters. Se debe demostrar
el desempeo estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta prctica ofrece cierta garanta sobre la confiabilidad
de las mediciones de muestra tomadas a partir de espectros usando experimentos de RMN previamente validados.

ANLISIS DE RMN CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

La espectroscopa de RMN se ha utilizado en un amplio rango de aplicaciones tales como elucidacin de estructuras, estu-
dios termodinmicos, cinticos y mecansticos, y anlisis cuantitativo. Algunas de estas aplicaciones estn ms all del alcance
de los mtodos farmacopeicos.
Todas las caractersticas de las seales-desplazamiento qumico, multiplicidad, ancho de lnea, constantes de acoplamiento,
intensidad relativa y tiempo de relajacin- proveen informacin analtica.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear 627

Aplicaciones Cualitativas

La comparacin de un espectro existente en la bibliografa o de un estndar autntico con el de una muestra de prueba
puede usarse para confirmar la identidad de un compuesto y detectar la presencia de impurezas que generan seales extraas.
Los espectros de RMN con estructuras simples pueden describirse adecuadamente mediante el uso de los valores numricos
para los desplazamientos qumicos y las constantes de acoplamiento, y mediante el nmero relativo de ncleos representados
por la integral de cada seal. (Los instrumentos modernos cuentan con software que genera espectros simulados con estos
datos). Tambin deben proporcionarse detalles experimentales, como por ejemplo el disolvente usado y la referencia para el
desplazamiento qumico.
Para muestras desconocidas, el anlisis de RMN, usualmente combinado con otras tcnicas analticas, es una herramienta
poderosa para la elucidacin de estructuras. Los desplazamientos qumicos proporcionan informacin del entorno qumico de
los ncleos. Existe una amplia bibliografa de referencia con tablas y reglas de correlacin para predecir los desplazamientos
qumicos. La multiplicidad de las seales proporciona informacin estructural importante. La magnitud de la constante de aco-
plamiento escalar, j, entre protones residuales en estructuras aromticas, olefnicas o cicloalqulicas sustituidas se usa para iden-
tificar la posicin relativa de los sustituyentes. Los espectros de rutina de 13 C se obtienen en condiciones de desacoplamiento
protnico, lo que anula todos los acoplamientos heteronucleares BC- 1 H. Como resultado de este desacoplamiento, las seales
de carbono aparecen como singuletes, a menos que estn presentes otros ncleos no desacoplados (p.ej., 19 F,3 1 P).
El intercambio qumico es un ejemplo del efecto de la velocidad de los procesos intermoleculares e intramoleculares en los
espectros de RMN. Si un protn puede experimentar diferentes ambientes en virtud de tal proceso (tautomerismo, rotacin en
torno a un enlace, equilibrios de intercambio, inversin de anillo, etc.), la apariencia del espectro ser una funcin de la veloci-
dad del proceso. Los procesos lentos (en una escala de tiempo de RMN) proporcionan ms de una seal de las especies que se
interconvierten, los procesos rpidos promedian estas seales en una lnea, y los procesos intermedios producen seales an-
chas, que en ocasiones son difciles de encontrar en los espectros.
Los programas de los espectrmetros modernos de RMN por Transformada de Fourier toman en cuenta secuencias de pul-
sos mucho ms complejas que la acumulacin repetitiva de transientes descrita anteriormente. Tales experimentos incluyen
anlisis multidimensionales homonucleares o heteronucleares que determinan la correlacin de acoplamientos y pueden simpli-
ficar la interpretacin de espectros complejos.
Ver el captulo (1761) para descripciones detalladas de los experimentos bidimensionales ms comunes.

Aplicaciones Cuantitativas

l. Consideraciones generales de la RMN cuantitativa: ver el captulo (1761 ).

11. El alcance de esta seccin se limita a la cuantificacin mediante RMN unidimensional. Aunque se puede usar cualquier
ncleo activo de RMN para obtener datos cuantitativos, la informacin de este captulo se limita al 1H. Existen dos tipos
de cuantificacin mediante RMN: relativa y absoluta.
(A) La cuantificacin relativa implica medir cantidades relativas de las especies en una muestra basndose en la integra-
cin de picos debidos a cada una de las especies medidas. Las integrales se normalizan mediante el factor N, es decir,
la integral se divide por el nmero de ncleos equivalentes representados por dicho pico para proporcionar la con-
centracin molar relativa de cada componente.
(B) La cuantificacin absoluta es la medicin directa de la cantidad real de analito independiente de otros componen-
tes contenidos en dicha muestra. Existen dos mtodos bsicos de cuantificacin absoluta basados en el tipo de estn-
dar de referencia usados para calibrar la seal de RMN.
(1) Estndar de referencia interno:
(a) Definicin: El estndar de referencia se disuelve conjuntamente con el analito en la solucin de prueba.
(b) Procedimiento
Preparacin de la solucin tpica para RMN: Una solucin para RMN se prepara con pesos exactos
del analito y del estndar de referencia. La fuente de error ms grande en este mtodo de RMN cuanti-
tativo se deriva del pesaje, por lo que se recomienda usar pesos ms grandes para minimizar errores.
Este mtodo cuantitativo se basa en una comparacin del estndar de referencia y los picos de RMN
del analito y sus respectivas concentraciones. Debido a que el analito y el estndar de referencia se en-
cuentran en la misma solucin, el volumen donde el analito y el estndar de referencia estn conteni-
dos es el mismo, por lo que nicamente se comparan sus masas. Por lo tanto, no es necesario un volu-
men exacto. Por lo general, las soluciones se preparan por triplicado como mnimo.
Adquisicin de datos: Los datos se adquieren en condiciones cuantitativas, ver el captulo
(1761 ). Por ejemplo, se debe esperar al menos 5 veces el T1 ms largo cuando se usa un pulso de
90 antes de repetir el pulso.
Procesamiento de datos: Procesar los datos, usando completado de ceros si fuera necesario, de
modo que haya un nmero suficiente de puntos para definir un pico. Por ejemplo, la experiencia
ha demostrado que se necesitan al menos 16 puntos para obtener una buena representacin
cuantitativa de un pico.
628 (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear /Pruebas Fsicas USP 39

Anlisis: Integrar los picos apropiados. Por ejemplo, evitar el uso de picos superpuestos o los que
se deban a hidrgenos susceptibles de intercambio. La determinacin de la cantidad de analito se
deriva de la proporcionalidad bsica entre la intensidad del pico y la concentracin del soluto.

[A]1H = [RSJ1H [2]

JA/NA /Rs/NRS
donde / = integral; N = factor de normalizacin; y [ ]lH = 1H concentracin molar relativa y los
subndices A y RS representan el analito y el estndar de referencia, respectivamente.
Por consiguiente, la masa del analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuacin.

donde MA = masa del analito, MM= masa molar y P = pureza del estndar de referencia.
(c) Una aplicacin comn de la cuantificacin absoluta es la determinacin de la pureza de una muestra. La
pureza porcentual en peso se calcula mediante
M
pureza %en peso =-A x100% [4]
Ms
donde M 5 es la masa total de la muestra con contribuciones del analito ms cualquier contaminante que
pudiera estar presente en la muestra como por ejemplo agua y sales. Al combinar las Ecuaciones 3 y 4, la
pureza porcentual en peso se calcula mediante

(2) Estndar de referencia externo

(a) Definicin: El mtodo clsico de estndar de referencia externo consiste en soluciones de un estndar de
referencia y un analito que se encuentran en tubos para RMN separados. Una variacin del mtodo del es-
tndar de referencia externo es insertar la solucin de prueba del estndar contenida en un tubo coaxial en
la solucin de prueba del analito contenida en un tubo para RMN. Otra variacin consiste en la introduc-
cin de una seal generada por computadora en el espectro de una solucin estndar de referencia de con-
centracin conocida para calibrar la respuesta de la seal (intensidad por concentracin molar 1H, en el ca-
so de la RMN de 1H), seguida por la insercin de una seal calibrada generada por computadora en el es-
pectro de una solucin de prueba del analito. Esta seccin tratar el uso de una referencia externa en el
sentido clsico.
(b) Procedimiento
Preparacin de la solucin para RMN: Las soluciones para RMN con concentraciones conocidas de
analito y de estndar de referencia se preparan usando pesos y volmenes exactos. Nuevamente, se
recomienda el uso de pesos ms grandes para minimizar el error de pesaje. Por lo regular, se preparan
soluciones repetidas del analito y del estndar de referencia. El analito y el estndar de referencia de-
ben prepararse usando el mismo disolvente para minimizar las diferencias de ajuste.
Adquisicin y procesamiento de datos: Igual que en 11.B.1.b, estndar de referencia interno. Aplicar
los mismos parmetros de adquisicin y procesamiento a los espectros del analito y del estndar de
referencia.
Anlisis: Integrar los picos apropiados en los espectros del analito y del estndar de referencia. La can-
tidad de analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuacin:

_!A_x NRS x~x MMA xM xP

MA- ~
[6]
IRS NA VRS MMRS
donde V= volumen.
Aplicacin a la pureza porcentual en peso: Los valores de pureza porcentual en peso se pueden calcu-
lar de manera similar a la indicada en la Ecuacin 5.
(C) Los mtodos de estndar de referencia interno y externo tienen cada uno sus propias ventajas y desventajas.
(1) Interacciones qumicas: La preparacin del estndar de referencia y del material de prueba en soluciones sepa-
radas previene interacciones qumicas entre la muestra de prueba y el estndar de referencia que de otro modo
podran ocurrir con un estndar de referencia interno.
(2) Superposicin de espectros: El uso de un estndar de referencia externo tambin previene la superposicin po-
tencial entre los picos del estndar de referencia y de la muestra de prueba que puede ocurrir con un estndar
interno.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear 629

(3) Calibracin: Una vez que se ha calibrado la respuesta de RMN con soluciones de estndares de referencia exter-
nos, dicha calibracin puede aplicarse a cualquier otra muestra en el mismo disolvente siempre que i) se haya
demostrado la estabilidad del instrumento durante el tiempo entre el que se lleva a cabo la calibracin y el mo-
mento en que se adquieren los datos en el material de prueba, ii) se haya establecido la aptitud del sistema en el
da en que se realiza la medicin del material de prueba y iii) se comparen las integrales absolutas. Para los es-
tndares de referencia internos, la medicin del estndar de referencia y de la muestra de prueba se lleva a cabo
en condiciones absolutamente idnticas.
(4) Exactitud y precisin: Se pueden preparar soluciones mltiples de estndares de referencia para promediar los
errores en las mediciones de masa y volumen durante la preparacin de la muestra, con lo que se mejora la
exactitud de la respuesta de RMN calibrada. Para los estndares de referencia internos, se realizan mediciones
individuales del estndar de referencia y del analito para cada solucin de prueba duplicada. Los errores combi-
nados que se derivan de las mediciones de masa del estndar de referencia y de la muestra de prueba, as como
las variaciones electrnicas de los instrumentos determinan la desviacin estndar del promedio MA o de los va-
lores de pureza porcentual en peso.

VALIDACIN Y VERIFICACIN DE PROCEDIMIENTOS ANALTICOS DE RMN

Cuando se proporciona un procedimiento de RMN en una monografa, es necesario verificar su aptitud en las condiciones
reales de uso (ver el captulo (1226)). La validacin es necesaria nicamente cuando un mtodo de RMN se presenta como
alternativa al procedimiento oficial para el anlisis de un artculo oficial. El objetivo de la validacin de un procedimiento de
RMN es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito deseado, incluyendo lo siguiente: determinacin cuantitati-
va del componente principal en un frmaco o producto farmacutico (valoraciones de Categora 1), determinacin cuantitativa
de impurezas (valoraciones de Categora 11) y pruebas de identificacin (valoraciones de Categora IV). [NOTA-Para definicio-
nes sobre las diferentes categoras, consultar el captulo (1225) Validacin de Procedimientos Farmacopeicos.] Dependiendo de la
categora de la prueba, la validacin del procedimiento analtico requerir el anlisis de la especificidad, linealidad, intervalo,
exactitud, precisin, lmite de cuantificacin y robustez. Dichas caractersticas de desempeo analtico se aplican a mtodos
estandarizados externamente y los mtodos de estndares agregados.
El captulo (1225) ofrece definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios
de validacin especficos para cada caracterstica. La intencin de las secciones siguientes es proveer al usuario de criterios de
validacin especficos que representan las expectativas mnimas para esta tecnologa. Podran requerirse criterios de aceptacin
ms rigurosos para cada aplicacin particular a fin de demostrar la aptitud para el uso deseado.

Validacin de Procedimientos Analticos

El objetivo de la validacin de un procedimiento analtico es demostrar que dicho procedimiento es adecuado para el prop-
sito al que est destinado, mediante la realizacin de experimentos y que los resultados obtenidos a partir de ellos cumplan
con criterios de aceptacin predefinidos. Los procedimientos analticos de RMN pueden incluir lo siguiente: pruebas cuantitati-
vas para componentes principales y contenido de impurezas, pruebas de lmite para detectar la presencia de impurezas, cuan-
tificacin de componentes en un producto o formulacin y/o pruebas de identificacin.
Las caractersticas de desempeo que demuestran la aptitud de un procedimiento analtico son similares a las requeridas pa-
ra cualquier procedimiento analtico. El captulo (1225) presenta una discusin sobre los principios generales aplicables. Los
criterios de aceptacin especficos para cada parmetro de validacin deben ser congruentes con el uso pretendido del proce-
dimiento analtico.
A continuacin se proporcionan las caractersticas de desempeo requeridas como parte de una validacin para cada una de
las categoras de procedimientos analticos.

ESPECIFICIDAD

El propsito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las seales del analito a medir estn exentas
de interferencia proveniente de los componentes e impurezas en el material de prueba. La especificidad se puede aplicar a
todas las categoras y es un requisito de la Categora IV. Como prueba de especificidad se pueden comparar los espectros de
RMN del analito con los de otros componentes de las formulaciones y las preparaciones de prueba, as como los de impurezas
conocidas derivadas de los procesos sintticos. Para un procedimiento analtico de identificacin por RMN (Categora IV), las
pruebas de validacin pueden incluir experimentos de RMN multidimensionales para validar las correctas asignaciones de los
desplazamientos qumicos y as confirmar la estructura del analito.
Criterios de validacin: La especificidad se asegura mediante el uso de un estndar de referencia, siempre que sea posi-
ble, as como la demostracin de la ausencia de interferencias procedentes de otros componentes.
630 (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear / Pruebas Fsicas USP 39

LINEALIDAD

La relacin de linealidad es aqulla exhibida entre la concentracin de analito y la respuesta del instrumento, la cual se debe
demostrar midiendo las respuestas del analito de no menos de cinco soluciones estndar a concentraciones que abarquen el
intervalo de concentracin anticipado de analitos de la solucin de prueba. Para la Categora 1, las soluciones estndar se pue-
den preparar a partir de materiales de referencia en un disolvente para RMN apropiado. Para la Categora 11, en procedimien-
tos analticos de RMN que se usan para cuantificar impurezas, se pueden preparar muestras de linealidad agregando cantida-
des conocidas de muestras de prueba adecuadas que contengan bajas cantidades de analito o agregando cantidades conoci-
das de una matriz conteniendo el analito en concentraciones incluidas en el intervalo esperado. Posteriormente, se debe cons-
truir la curva estndar usando procedimientos analticos y estadsticos adecuados tales como la regresin de cuadrados mni-
mos. Asimismo, se debe determinar el coeficiente de correlacin (R), la ordenada al origen y la pendiente de la lnea de regre-
sin. Los valores absolutos determinados para dichos factores deben ser apropiados para el procedimiento que se est validan-
do.
Criterios de validacin: El coeficiente de correlacin (R) debe ser no menos de 0,995 para las valoraciones de Categora 1,
y no menos de 0,99 para las pruebas cuantitativas de Categora 11.

INTERVALO

El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito se proporciona mediante el procedimiento analtico de RMN
cuantitativa. Por lo regular, ste se basa en las especificaciones del artculo de prueba de la monografa USP. Se trata del inter-
valo dentro del cual el procedimiento analtico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisin, obte-
niendo de este modo un valor confiable de dicho procedimiento analtico. A continuacin se proporcionan intervalos reco-
mendados para varios procedimientos analticos de RMN.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora 1, cuando los criterios de aceptacin est centrados en 100,0%, el in-
tervalo de validacin es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptacin no centrados, el intervalo de validacin comprende desde
10,0% por debajo del lmite inferior hasta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo es
70,0%-1 30,0%. Para las pruebas cuantitativas de Categora 11, el intervalo de validacin abarca 50,0%-120,0% de los criterios
de aceptacin.

EXACTITUD

La exactitud de un procedimiento analtico de RMN cuantitativo se debe determinar a travs del intervalo analtico requeri-
do. Por lo general, se evalan tres niveles de concentracin usando preparaciones por triplicado en cada nivel.
Para valoraciones de frmacos (Categora 1), la exactitud se puede determinar analizando un estndar de referencia de pure-
za conocida. Para productos farmacuticos (Categora 1), se debe usar una muestra compuesta de estndar de referencia y de
otros componentes de un producto farmacutico terminado para la validacin del procedimiento analtico. Los resultados de
la valoracin se comparan con el valor terico del estndar de referencia para estimar errores o recuperacin porcentual. Para
la cuantificacin de impurezas (Categora 11), la exactitud del procedimiento analtico se puede determinar mediante estudios
con frmacos o productos con cantidades agregadas y concentraciones conocidas del analito en anlisis. Tambin resulta
aceptable comparar los resultados de valoracin del procedimiento analtico que se est validando con los de un procedimien-
to analtico alternativo ya establecido.
Criterios de validacin: 98,0%-102,0% de recuperacin para frmacos, 95,0o/o-l 05,0% de recuperacin para valoracin
de productos farmacuticos terminados preparados magistralmente y 80,0%-120,0% de recuperacin para los anlisis cuanti-
tativos de impurezas. Estos criterios deben cumplirse durante todo el intervalo pretendido.

PRECISIN

Repetibilidad: El procedimiento analtico debe ser evaluado midiendo las concentraciones de seis soluciones estndar dis-
tintas al 100% de la concentracin de prueba. Se debe evaluar el cumplimiento de la desviacin estndar relativa de las deter-
minaciones repetidas con los criterios de aceptacin. Como alternativa, es posible medir las concentraciones de tres determi-
naciones repetidas de tres soluciones muestra distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo sufi-
cientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentracin. Si esto se lleva a cabo, se
combina la repetibilidad de las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para frmacos, no ms de 2,0% para productos
farmacuticos terminados preparados magistralmente y no ms de 20,0% para los anlisis cuantitativos de impurezas.
Precisin intermedia: Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del proce-
dimiento analtico. Las variables tpicas incluyen llevar a cabo el anlisis en diferentes das usando diferentes instrumentos que
sean adecuados de acuerdo con lo especificado en el mtodo analtico y/o que dos o ms analistas realicen el procedimiento
analtico. Como mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos ofrece-
rn una estimacin de la precisin intermedia.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (761) Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear 631

Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para frmacos, no ms de 3,0% para productos
farmacuticos terminados preparados magistralmente y no ms de 25,0% para anlisis cuantitativos de impurezas.

LMITE DE CUANTIFICACIN (QL, POR SUS SIGLAS EN INGLS)

El lmite de cuantificacin se puede validar midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de prueba con cantidades
agregadas conocidas de analito al 50% de la especificacin.
A partir de estas determinaciones repetidas es posible determinar la exactitud y la precisin. Algunos ejemplos de especifica-
ciones para las determinaciones cuantitativas de Categora 11 son que la concentracin medida est dentro del 70,0%-130,0%
de la concentracin agregada conocida y la desviacin estndar relativa es no ms de 15%.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medicin analtica se debe demostrar mediante cambios deliberados en parmetros experimentales
crticos. Esto puede incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, retraso
entre pulsos con una ligera variacin, temperatura de la sonda y posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La
robustez es necesaria para los mtodos cuantitativos de Categora 1y Categora 11.

Verificacin de Procedimientos Analticos

Los reglamentos de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes de los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 21 l .194(a)(2)] indican que
los usuarios de procedimientos analticos descritos en los compendios USP-NF no requieren validar dichos procedimientos
cuando se proporcionen en una monografa, sino que simplemente deben verificar su aptitud ante condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificacin de un procedimiento de RMN es demostrar que ste, conforme a lo descrito en una monografa
especfica, puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisin adecuadas usando los instrumentos,
analistas y matrices de muestras disponibles. De acuerdo con el captulo de informacin general (1226) Verificacin de Procedi-
mientos Farmacopeicos, cuando falla la verificacin del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografa, el procedimiento
podra no ser adecuado para su uso con el artculo de prueba. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alter-
nativo segn lo permitido por las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificacin de un procedimiento de RMN farmacopeico debe como mnimo incluir la ejecucin de los parmetros de
validacin para especificidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, segn se indica en esta
seccin.

GLOSARIO

Estndar interno: Un estndar interno (IS, por sus siglas en ingls) es una sustancia que se agrega a una solucin muestra en
una concentracin conocida. Se debe seleccionar un estndar interno que presente al menos una resonancia de RMN que no
se superponga con las del analito. El cociente entre las reas de los picos de un estndar interno especfico y un analito se usa
para determinar la concentracin del analito. Se debe conocer el nmero de ncleos correspondiente a los picos integrados en
el estndar interno y los espectros de analito.
Referencia de RMN: Una referencia de RMN, tambin conocida como referencia de desplazamiento de RMN, es una sustan-
cia agregada a una muestra y a partir de la cual se establece el desplazamiento qumico para la escala o. Los ejemplos comunes
de anlisis de protones y de carbono por RMN incluyen tetrametilsilano (TMS) para su uso en disolventes orgnicos y la sal
sdica del cido 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sulfnico (DSS) o 3-trimetilsililpropionato de sodio (TMSP) para su uso en medios
acuosos. En ambos casos, el desplazamiento qumico de los picos de metilo se define como 0,0 ppm.
Estndar de referencia: Un estndar de referencia es una sustancia cuya estructura qumica especfica se confirma por me-
dios experimentales. En la espectroscopa de RMN, un estndar de referencia generalmente se usa para los anlisis cualitativos
de un material de prueba. La estructura se puede confirmar al comparar directamente los desplazamientos qumicos y las mul-
tiplicidades de los picos en el espectro de RMN del material de prueba contra el espectro del estndar de referencia adquirido
en condiciones experimentales comparables.
632 (771) Productos Oftlmicos / Pruebas Fsicas USP 39

(771) PRODUCTOS
USP 39 Pruebas Fsicas/ (771) Productos Oftlmicos 633

poliacrlico-y muchos derivados de celulosa, tales como la hipromelosa y la hidroxietikelulosa-se usan comnmente como
mejoradores de la viscosidad debido a su compatibilidad fisiolgica y a sus propiedades fisicoqumicas satisfactorias.
Otra fc>nna de incrementar el .tiempo .de contacto crneo implica eLso d(;lpolmerosq!Je pr()v~eo al fQrrnula~jonJq!.Jida
una consistncia semisHdaslo cuando se coloca en.el ra<conjuntiva oenlacrnea. De{1staforma, afo instila<;insim!J!e de
la solucinlesigue una permanencia prolongada como resultado delas propiedades visfoelstitasdel.hidrogel forfriad. IS1
"hidrogel" o los "geles en base acuosa" sori redes tridimensionales de cadenasde.polmersquei;;ontienell.aga dentroelela
red. La red puede ser una estructura entrecruzada fsica o qumicamente (un enlace covalente) entre cadenas de polmerc>S. El
contenido de agua de los hidrogeles puede ajustarse modula11do l<J cQmposii;;in yla conformacn de los polmero$, tales co-
mo el balance hidrfilo/hidrfobo de las cadenas de polmeros y los grupos colgantes y el grado de entrecn.Jzamiento. Hfen~
meno de gelificacin in situ es ocasionado por un cambio en la confcmnacin de los polrnerqs que puede ser desencaciePad()
por.estmulos externos,. tales.como la. temperatura, el pH, .elcontenido in.ico y eUluidq.lagrirnaJ. al friornento de<laadmirjistta~
Cin en fojo. Adms, algnos polmeros pueden interactuar, mediante enlaces no covalents, CQn l;,:i mucina conjuntvaly
mantener la formulacin en contacto con los tejidos crneos.
Las soluciones pueden inyectarse no slo por la vfa intravtrea, sinq tambinpor otras vas, tales como lils vas subconuntiva,
subtennica, retrobulbar, supracoroidal y subretinal.

[:NTA...-En esta seccin se incluyen aquellos .productos slidos que, al.recpnstitui~os d~acuerdo con las instrucciones enAa
etiqueta, dan lugara una suspensin.]
Se puede considerar el uso. de wspensiones acuo$aS u. qteosas.por ur:la: v~ri{1dad de razones, tales como)as siguiente5;1)
medicarnento5. pqcosolubles en.agua;2) medicamentos.con bajaesti.bllifa;dacuosa;y3Jen.casos.en . lo(queeOe!!:~saf~
ini::rernentar.el tiempo de.contacto con.elojo e< incrementar la humectlli::iqnfel ojd.El ~amao de pattculadelrn~~icamentq a
menud() se ~educe a niveles <lO rn en un intento por evitar la produccin excesiva de lgrjmas.
Despus de la instilacin tpica, se espera que. las partculas 5e mantengan er:l el tondq de Sil<:o y que etfrro~~q ~ disuel"a:
o se libere lentamente a partir de la$ estructuras polimricas mediante difu$ir), disolucin, degradaeiri polimrica o inter<;:am~
bio inico.
Las suspensiones pueden inyectarse no slo poda va intravtr~asino tambin por otras vas1tales comosubconjuntiva, .sub-
tennica, retrobulbar, supracoroidaly subretinal.

Un.gehtos
Los ungentos oftlmicos son productos semislidos que pqrlo generafestn destinados a aplicein en la t()rijntiva; la
crnea o el prpado.Tienen un mayor Herripo de contacto en comparad<Jn co1muchas soluciones; Una base parating.ietito
pftlmico adecuada no.provocairritacin en el ojo y permite la difusin delfrmaco a trvsde lasseeredones queb~i'lanel
ojo.
La rnayorfa .de las bases oleosas y exentas de agua para ungento <oftlmico estn comptiJe:;tas de petrolato blanco.Y petrol'-
to1ql.lido.(acelte mineral) O la base paraungUenfo oftlmico .es.uha mdlrkadn cielfrmla b<1$a{~.e11. petrqlatQ. ~~!1
disead.as. para fundfrse .a la temperatura i::orporat. lambif,.sepueden ti5r ptrstipos dba.ses. lfppflica$ p;lra ngei'.lft. I.Jn
vehculo nhidr puede presentar ventajas para los medicalT)entos ~ensibles a lhl.lmedad.

Geles
Los productos semislidos de tipo gel son una alternativa a los ungritos tradicionales y se basan e11 el efecto. de incremen-
tar la viscosidad para prolongar la retencin del frmaco n. el 0 jo. se pueden usar varios tipos de agentes gelantes, tales como
derivados del cido poliacrlco, carbmero e hipromelosa.

Eroulsiones
Las emulsiones oftlmicas tpicas por lo general se preparan disolviendo o. dispersand.p el frmacq en una fse>Qleosa~g~e
ganclo agentes emulsii:mahtes y de suspensin. adecuados, y mezclando co1;1 aguavigor()samente para formaf1Jn<i.em1.1lsitSn
uniforme de aceite en agua. Cada fase por lo general se este.rillza antes o d(trante ll carg~. en eL va~.() de .mezclado. Se p!.Jde
usar homogenizacin de alto corte para reducir. el tamao .de las gotitas de a~eite a tamaos sul:)micr9li~o$, fo. cualpuecie
mejorar la estabilidad fsica de las rnicelas de aceite evitando que se fusionen. La forma farmacutica resultante debecpntener
gotitas de aceite pequeas suspendidas de manera uniforme.
La justificacin ms comn para desarrollar Llria emulsin oftlmica es la limitada solubilidad en agua de los frmacos. los
frmacos pueden agregarse a la fase en la que sean solubles al inicio del proceso deJabricacin, o el fmaco puede ser agre-
gad() despus de preparar la emulsin mediante un proceso adecuado ddispersin.
La establldad fsica de la emulsin puede medirse mediante tcnicas de dispersin de luz que caracte.rizan l distril::n.Jtion del
tamao de glbulos en la fase oleosa. Se pueden agregar surfactantes. adecudos Para mejorar la establidad de la eml.lsloh.
634 (771) Productos Oftlmicos / Pruebas Fsicas USP 39
USP 39 Pruebas Fsicas/ (771) Productos Oftlmicos 635

Este captulo se aplica slo al componente de la forma farmacutica del producto de combinacin de medicamento oftlm-
co-dispositivo. Las reglamentaciones apropiadas de la FDA con respecto a los dispositivos mdicos deben usarse para el com-
ponente del dispositivo.

CALIDAD DEL MEDICAMENTO

Los procedimientos y los criterios de aceptacin para el anlisis de productos oftlmkos se dividen en dos categoras: 1)
aquellos que evalan los atributos generales de calidad, p.ej., identificacin, potencia, pureza (e impurezas), esterilidad y part-
culas; y 2) aquellos que evalan el desempeo in vitro del producto, es decir, disolucin o liberacin de los frmacos a partir
del producto. Las pruebas de calidad evalan la integridad de la forma farmacutica, mientras que las pruebas de desempeo
evalan la liberacin de frmacos y otros atributos que se relacionan con el desempeo in vivo. En con}unto, las pruebas de
calidad y de desempeo aseguran la identidad, contenido, calidad, pureza y eficacia del. medicamento. Este captulo trata las
pruebas de calidad para productos oftlmicos. las pruebas de desempeo (disolucin/liberacin defrmacos) se tratan e el
captulo Productos Oftlmicos-Pruebas de Desempeo (l 771 ).

Pruebas Universales

En este captulo, la divisin de las pruebas de calidad del producto en pruebas universales.y en pruebas especficas no sigue
de manera estricta la gua de la ICH Q6A Specifications: Test Pmcedures ami Acceptan;e Criterio for New Dtug Substavce.s. and
New Drug Products: Chemical Substances (disponible en ingls en www.ich.org). En este <:;aptulo, .pruebas universales..se refiere
a l.as pruebas que son aplicables a todos los productos oftlmicos, independientemente. del. tipo de forma farmac~utica.

DESCRIPCIN

Se d~l;>e proveer una descripcin cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptacin deben coliteoer la apariencia final
aceptable, que induy la transparenda y el color de la forma farmacutica y del envasad(); SI el .color cambia .dura!'.lte el ~ma._
cenamierito, puede ser apropiado un pro<:edimiento cuantitativo. Esta no es una prueba farmacopeica,. aunque forma part; de
l especifli::aciri del fabricante del medicamento.

IDENTIFICACIN

Las prul;!bas de. identifi.tacin. se tratan en las Advertencias yRequisitos Gener{;Jles. $A o. ~s pruebas de identificacin qeben
establece~ la identidad del. frmeo o.frmacos presentes en el artulo y deben discriminar entre cof:lpuestos d:in estru<:fras
estrecf'!a[Tiente rlaciC;>na<;i~s potencialmente presentes. Las pruebas de identidad deben ser especficas para los frmacos [p\ej.,
espctr9sc0pa en el infi"arr()jo (lR, por sus siglas en li)glt'!s)]. Los mtt:>dos espectrofofomtritosen li1'.}ft11rrojocryano (NlR;
por SS i;igl(ls erfjrigls) o Ra:mafi pueden ser aceptables para la identificacin del medicarrie!'.ltO. tos procedimientos de iderlti~
ficacin de uso ms amplio para frmacos contenidos en formas farmacuticas son los procedimientos cromatogrficos que
incluyen una comparacin con los estndares apropiados (ver los captulos Cromatpgraffa (621) y Prueba. de Identificacin por
Cromatografa en Capa Delgada (201)). La identificacin mediante un solo tiempo de reten.cin cromatogrfico no constituye
unapruebaespeefica.

VAi.ORACiN

Se debe usar una prueba especfica e indicadora de la estabilidad para deter01inar la contentratin (tortt!'nido) del.Medica:~
mento. Para casos en los que se justifique el uso de una valoracin no especfica, se deben usar otroiprocedfmientos analticos
para lograr la especificidad general. Se debe usar un procedimiento especfico cuando exista evidencia de interferencia de exei-
pientes con la prueba de valoracin no especfica. Se. encuentra disponible informacin adicional sobre valoraciones especficas
en los captulos Antibiticos-Va/oraciones Microbiolgicas (81 ), Cromatografa {621) y Cromatografa fnica (1065).

IMPUREZAS

Pueden estar presentes impurezas del proceso, subproductos sintticos y otras impurezas orgnicas e inorgnicas en el Jr
maco y en los excipientes usados en la fabricacin del medicamento. Estas impurezas son controladas por las monografas de
frmacos y excipientes. Se deben monitorear las impurezas orgnicas que surgen de la degradacin del frmaco en el medica-
mento y aquellas impurezas que surgen durante el proceso de fabricacin del medicamento. Todos los artculos cumplen tori
los requisitos de los captulos Impurezas Elementales-Lmites {232) y Disolventes Residuales (467).
636 (771) Productos Oftlmicos / Pruebas Fsicas USP 39
USP 39 Pruebas Fsicas/ (771) Productos Oftlmicos 637

de irrigacinoftlmica y no ms de 2,0 UE/dosis/qjo.paralos. medicamentos inyectado.so implantados .. Por lo general,esta

prueba no es requerida para los productos oftlmicos de aplicacin tpica. Este captulo no trata los lmites de endotoxina para
los dispositivos que se inyectan o implantan.

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DEDOSIFICACIN

Esta prueba es aplicable a.lasJorrnasfarrnacuticas erwasadas en envases un itari~s.Jndt,iye taflto la rnasa de la formafarma
cutica y el contenido deHrmaco en la forma farmacutica. La prueba puede realizarse mediante uniformidad de contenido o
variacin.de peso(ver eicaptulo Uhitormidad de Unidades.deOosifcqcin\905)),

CONTENIDO DE LOS ENVASES

Se debe determinar el contenido de los envases de los productos oftlmicos (ver el captulo Llenado Mriirno <755));

El sistema de envase no debe interactuar fsica niqufmieafente ci:mel producto de ninguna manera que altere el conteni-
do, la calidad o la pureza d~I medicamento. El sistema de envase debe cumplir con los requisitos de los captulosTaponesBas-
tomricospamlnyett(;Jb/es (38.l ), Env(JseS . Viaiio{66Q), Materiales Plsticos de CqnstrC:ciori\661.1 }y Sistemas deEriva~es; PJa.stfc
cos paraUsoFatmac'LJticO \p61.2/; .Se puede enco11trar informacin.adicionalsobre lossistemas de envase en losC:aptulos
Evatuaen. qeSustancias Extrable.S Relacionada$ con.Ehvasesfqrmacuticos.y.Sistemas de Administrqci111<1 p63~..y .EvalLJ(cin de
Sustancias Lixiviables Refacionadas . e:on:Envases Farrm:ttutfto~ y Sistemas de,4dministra(:i6n(1664)..La evlcnde.posiblesisus
tandas lixiviables y sustndas extrables y el establecimiento de C:riterios de aceptacin pabtestos c:ompestos deben)enrn
c:uenta.la evaluacin de riesgos del producto, su Indicacin y el sistema de envase.
Adems,sedebeteneren cuenta que una evaluacin de riesgos del impacto de las sustanciasextrables/sustancias lixlvia-
bles, en una va de administracin tpica o intraocular .es una actividad desafiante. Las evaluaciones toxicolgicas o de seguri
dad de las sustancias lixiviables o de las sustancias exfrables en Jos cofoponentes de envases primarios o secundarios por lo
regular no estn disponibles para vas de admi11istracin oftlmicas. Una evaluacin de riesgos puede incluir la evaluacin de la
toxicologa y la seguridad a partir de otras vas de administracin y una evaluacin de la lngesta Diaria Total de las sustanC:ias
extrafbles/sustanciaslixiviables que se estn eva1uando .. La preponderancia de dich.asevaluaciones conlleva a una estimacin
del riesgo de las s1,1standas extrafb!es/sustancias lixiviables mediante la administradn ocul;r al paciente,

INTEGRIDAD DEL ENVASFCIERRE

El sistema de envase debe cerrarse o sellarse de manera tal que se prevenga la contaminacin o la prdida de contenidos y
debe demostrar que es a prueba de alteracin intencional. La validacin de la integridad del envase debe .demostrar la ausi;!n-
cia de pene~racin de. conta;minadpn mlcrobiana ode impurezas qumicas o fsicas (ver el. captulo Envases de Pro(iuctosEStri-
les-Evq/uacn de la Integridad (1207)).

Pruebas Especficas
VISCOSIDAD

Un incremento en la vistosidad aumenta el tiempo de residencia en el ojo. Sin embargo, la difusin del frmaco desde la
formulacin hacia el ojo podra verse inhibida debido a la alta viscosidad del producto, los ungentos oftlmicos estn disea"
dos para tener una viscosidad muy alta a fin de prolongar el tiempoderesidencia en el ojo.la inclusin dela evaluacin de l.;i
viscosidad en la especificacin del producto debe basarse en el tipo de forma farmacutica y en si. los cambios en la vistosidad
del producto afectarn su desempeo. Esta no es una prueba farmacopeica, aunque forma parte de la especificacin deUabri
cante del medicamento. Ver los captulos Vscosidad~Mtods Capilares \911 ), Viscosidad---:"Mtodos RotatoriS (912) y Viscosi-
dad--Mtodo de Bola Rodante (913).

CONTENIDO DE ANTIOXIDANTES

Si el mediamento presenta antioxidantes, se deben establecer pruebas para detel'minar el contenido delos mismos, a me-
nos que se pueda detectar la degradacin por oxidacin usando otro mtodo de prueba, tal como un al1lisis de impurezas, se
deben establecer criterios de aceptacin para el contenido de antioxidantes, los uales deben basarse en los hi\leles de antQ~i
dantes necesarios para mantener la estabilidad del producto en todas las etapas a lo largo del uso propuesto y de su vida til.
638 (771) Productos Oftlmicos / Pruebas Fsicas USP 39

(776) MICROSCOPA PTICA

La microscopa ptica para la caracterizacin de partculas por lo general es una tcnica adecuada para partculas con un
tamao de 1 m o mayor. El lmite inferior est determinado por la resolucin del microscopio. El lmite superior es menos
estricto y est determinado por las dificultades que presenta para caracterizar partculas de mayor tamao. Adems de la mi-
croscopa ptica, existen diversas tcnicas alternativas para la caracterizacin de partculas. La microscopa ptica es una tcni-
ca sumamente recomendable para caracterizar partculas que no son esfricas, mtodo que tambin puede constituir la base
de otros mtodos de calibracin ms rutinarios y ms rpidos.
Aparato-Emplear un microscopio estable y protegido de vibraciones. Es necesario que el aumento del microscopio (resul-
tado del aumento del objetivo, ocular y de otros componentes adicionales) sea suficiente para caracterizar adecuadamente
hasta la partcula ms pequea de la muestra en anlisis. Buscar para cada intervalo de aumento, el mayor valor de apertura
numrica del objetivo. En algunos casos, se recomienda usar los filtros polarizadores con analizadores y placas de retardo ade-
cuadas. Con objetivos acromticos se recomienda emplear un filtro cromtico de poca transmisin espectral, de preferencia
apocromticos, y son necesarios para obtener los colores que correspondan en la microfotografa. Con la lmpara y los acceso-
rios colocados debajo de la platina del microscopio se deben emplear condensadores corregidos al menos por aberracin esf-
rica. La apertura real del diafragma del condensador y la presencia de aceites de inmersin afectan la apertura numrica del
condensador de los accesorios ubicados por debajo de la platina y es necesario que sta coincida con la del objetivo en las
condiciones de uso.
Ajuste-Es de suma importancia que todos los elementos del sistema ptico estn alineados con precisin y que el enfoque
sea el adecuado. Enfocar los elementos segn las recomendaciones del fabricante del microscopio. Se recomienda alinear el eje
con precisin.
Iluminacin-Para que la iluminacin sea adecuada, es necesario que la intensidad de la luz sea uniforme y regulable en
todo el campo visual. Se recomienda emplear la iluminacin de Kohler. Si se trabaja con partculas coloreadas, elegir el color
de los filtros para controlar el contraste y el detalle de la imagen.
Caracterizacin Visual-Es necesario que el aumento y la apertura numrica sean suficientes para permitir la correcta reso-
lucin de las imgenes de las partculas a caracterizar. Determinar el aumento real con un micrmetro de objetivo calibrado
para ajustar un micrmetro ocular. Una forma de reducir los errores al mnimo es trabajar con un aumento suficiente para que
la imagen de la partcula sea de al menos 1 O divisiones del ocular. Calibrar cada objetivo por separado. Para calibrar la escala
del ocular, verificar que la escala del micrmetro del objetivo y la escala del ocular estn alineadas. De esta forma, se puede
determinar con precisin la distancia entre las divisiones del ocular del portaobjeto. En algunos casos, es necesario emplear
distintos aumentos para caracterizar materiales con una amplia distribucin de tamaos.
Caracterizacin Fotogrfica-Si se emplean mtodos fotogrficos para determinar el tamao de las partculas, tomar las
precauciones necesarias para que el objetivo est bien enfocado en el plano de la emulsin fotogrfica. Fotografiar un micr-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (776) Microscopa ptica 639

metro de objetivo calibrado con una pelcula fotogrfica de velocidad, resolucin y contraste adecuados para determinar el
aumento real. La exposicin y el procesamiento deben ser idnticos para las fotografas de la muestra de prueba y para la de-
terminacin del aumento. Tanto la resolucin del microscopio como la exposicin y los procesos de revelado e impresin influ-
yen en el tamao aparente de la imagen fotogrfica.
Preparacin del Medio de Montaje-El medio de montaje se selecciona segn las propiedades fsicas de la muestra de
prueba. Para ver los detalles de los bordes de la muestra, es necesario un contraste adecuado, aunque no excesivo, entre la
muestra y el medio de montaje. Para distinguir las partculas individuales en estudio, es necesario que estn dispuestas en un
mismo plano y con la dispersin adecuada. Adems, es necesario que las partculas sean representativas de la distribucin del
tamao de las partculas y que no sufran ninguna alteracin durante la preparacin del medio de montaje. Tomar las precau-
ciones necesarias para que se cumpla este importante requisito. Para seleccionar el medio de montaje adecuado, considerar la
solubilidad del analito.
Caracterizacin de la Cristalinidad-Si la monografa individual de un frmaco indica caracterizar la cristalinidad, se pue-
de determinar por microscopa ptica. Montar algunas partculas de la muestra en aceite mineral y colocar el preparado sobre
un portaobjetos de vidrio limpio, a menos que la monografa individual especifique algo diferente. Analizar el preparado con
un microscopio de luz polarizada: al girar la platina del microscopio, las partculas presentan birrefringencia (interferencia de
colores) y posiciones de extincin.
Prueba de Lmite del Tamao de Partculas por Microscopa-Pesar una cantidad adecuada del polvo a analizar (entre
1O mg y 100 mg, por ejemplo) y suspenderla en 1O mL de un medio adecuado, en el que el polvo no se disuelva y agregar, si
fuera necesario, un agente humectante. Suspender las partculas en un medio de densidad igual o similar y agitar para mante-
ner la homogeneidad de la suspensin de partculas. Introducir una porcin de la suspensin homognea en una celda de con-
teo adecuada, observar en un rea del microscopio que corresponda a no menos de 1O g del polvo a analizar. Contar las
partculas cuya dimensin mxima supera el lmite de tamao indicado. El lmite de tamao y el nmero mximo de partculas
que exceden el lmite se definen para cada sustancia.
Caracterizacin del Tamao de Partculas-La complejidad de la medicin del tamao de las partculas vara segn la for-
ma de la partcula, y el nmero de partculas caracterizadas debe ser suficiente para garantizar un grado de incertidumbre
aceptable en los parmetros de medicin. La norma ISO 9276, por ejemplo, proporciona informacin adicional sobre la medi-
cin del tamao de las partculas, tamao de la muestra y anlisis de los datos. Si se trata de partculas esfricas, el tamao est
definido por el dimetro. Si se trata de partculas irregulares, hay distintas definiciones del tamao de partcula. En general,
para partculas de forma irregular, la caracterizacin del tamao debe incluir informacin sobre el tipo de dimetro medido y
sobre la forma de la partcula. A continuacin se describen varias medidas usadas comnmente para el tamao de partculas
(ver la Figura 7):

Dimetro de Feret

Dimetro de Martin
Dimetro del rea proyectada
Intercepcin mxima horizontal

Figura 1: Medidas comnmente usadas para el tamao de partculas.

Dimetro de Feret-La distancia entre lneas paralelas imaginarias tangentes a una partcula orientada de forma aleatoria y
perpendicular a la escala del ocular.
Dimetro de Martn-El dimetro de la partcula en el punto en el que divide una partcula orientada de forma aleatoria en
dos reas proyectadas iguales.
Dimetro del rea Proyectada-El dimetro de un crculo cuya rea proyectada es la misma que la de la partcula.
Longitud-La medida ms larga tomada de extremo a extremo de la partcula orientada en paralelo a la escala del ocular.
Ancho-La medida ms larga de la partcula tomada en ngulo recto a la longitud.
640 (776) Microscopa ptica/ Pruebas Fsicas USP 39

Caracterizacin de la Forma de la Partcula-Si se trata de partculas de forma irregular, la caracterizacin del tamao
debe incluir informacin sobre la forma de la partcula. Verificar la homogeneidad del polvo usando el aumento que corres-
ponda. A continuacin se describen algunos de los descriptores usados comnmente para la forma de la partcula (ver la Figura
2):

0---0
Cubos o Esferas
J-~~
Escama

~~
Placa

Columnar

Figura 2: Medidas usadas comnmente para la forma de la partcula.

Acicular-Partcula fina, en forma de aguja, de ancho y espesor similares.

Columnar-Partcula larga y fina, de ancho y espesor superiores a los de una partcula acicular.
Escama-Partcula fina y plana, de longitud y ancho similares.
Placa-Partculas planas de longitud y ancho similares pero de mayor espesor que las escamas.
Listn-Partcula larga y fina en forma de hoja.
Cubos o esferas-Partculas cbicas o esfricas, de largo, ancho y espesor de dimensiones similares.
Consideraciones Generales-La partcula se considera, en general, la unidad discreta ms pequea. Una partcula puede
estar en estado de gotita lquida o semislida, un cristal nico o policristalina, en estado amorfo o como aglomerado. En algu-
nos casos, las partculas estn asociadas. El grado de asociacin se puede describir en los siguientes trminos:
Laminar-Placas superpuestas.
Agregado-Masa de partculas adheridas.
Aglomerado-Partculas amalgamadas o cementadas.
Conglomerado-Mezcla de dos o ms tipos de partculas.
Esferulita-Crupo con estructura radial.
Drusa-Partcula recubierta de pequesimas partculas.
La partcula se puede describir en los siguientes trminos:
Bordes-Angulares, redondeados, lisos, filosos o fragmentados.
ptico-Color (usando filtros de compensacin del color apropiados), transparente, translcida, opaca.
Defectos--Oclusiones, inclusiones.
Las caractersticas de la superficie se pueden describir en los siguientes trminos:
Resquebrajada-Divisin parcial, rotura o fisura.
Lisa-Sin irregularidades, proyecciones ni reas rugosas.
Porosa-Con orificios o canales.
spera-No lisa, con protuberancias o dispareja.
Punteada-Con pequeas hendiduras.

(781) ROTACIN PTICA

INTRODUCCIN

Muchas sustancias farmacuticas son pticamente activas dado que rotan el plano incidente de la luz polarizada de manera
que la luz transmitida emerge en un ngulo cuantificable con respecto al plano de la luz incidente. Esta propiedad es caracte-
rstica de algunos cristales y de muchos lquidos o soluciones de slidos de uso farmacutico. En aquellos casos en que un lqui-
do o un soluto en solucin posea esta propiedad, por lo general se debe a la presencia de uno o varios centros asimtricos,
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (781) Rotacin ptica 641

normalmente un tomo de carbono con cuatro sustituyentes diferentes. El nmero de ismeros pticos es 2", en donde n es el
nmero de centros asimtricos. La polarimetra, medicin de la rotacin ptica de un artculo farmacutico, puede ser el nico
medio conveniente para distinguir entre s ismeros pticamente activos y, por lo tanto, es un criterio importante de identidad
y pureza.
Las sustancias que poseen la capacidad de mostrar propiedades pticas rotatorias son quirales. Aqullas que rotan la luz en el
sentido de las agujas del reloj, observando hacia la fuente de iluminacin, son dextrgiras, o ismeros pticos(+), y aqullas que
rotan la luz en el sentido contrario a las agujas del reloj se llaman levgiras o ismeros pticos(-). (Los smbolos d- y/- que
anteriormente se empleaban para indicar ismeros dextro- y levgiros ya no se utilizan, debido a la confusin con los smbolos
D- y L-, que se refieren a las configuraciones relacionadas con el o-gliceraldehdo. Los smbolos R y S as como a y fJ tambin
se emplean para indicar la configuracin, es decir, el ordenamiento de los tomos o grupos de tomos en el espacio.)
Las propiedades fsicoqumicas de las sustancias quirales no superponibles que rotan el plano de la luz polarizada la misma
cantidad de grados pero en direcciones opuestas, llamadas enantimeros, son idnticas, salvo por esta propiedad y por sus
reacciones con otras sustancias quirales. Los enantimeros presentan a menudo diferencias profundas en sus caractersticas far-
macolgicas y toxicolgicas, debido al hecho de que los receptores biolgicos y las enzimas son quirales. Muchos artculos de
origen natural, como por ejemplo los aminocidos, las protenas, los alcaloides, los antibiticos, los glicsidos y los azcares,
existen como compuestos quirales. La sntesis de estos compuestos a partir de materiales no quirales usualmente resulta en
cantidades iguales de enantimeros, es decir, los racematos. Los racematos tienen una rotacin ptica neta nula y sus propie-
dades fsicas pueden diferir de las de los enantimeros que los componen. Para obtener los ismeros pticos individuales pue-
den emplearse mtodos de sntesis estereoselectivos o estereoespecficos o de separacin de mezclas racmicas.
La medicin de la rotacin ptica se realiza empleando un polarmetro. 1 La ecuacin general usada en polarimetra es:

[a]' = 1OOa
, le

en donde [a] es la rotacin especfica a la longitud de onda 'A, tes la temperatura, a es la rotacin observada en grados(), I es
la longitud de paso en decmetros y e es la concentracin del analito en g por 100 ml. Por lo tanto, [a] es 100 veces el valor
medido, en grados (), para una solucin que contiene 1 g en 100 mL, medido en una celda con una longitud de paso de 1,0
decmetro en determinadas condiciones de longitud de onda de luz incidente y temperatura. Para algunos artculos Farmaco-
peicos, especialmente los lquidos, tales como los aceites esenciales, el requisito de rotacin ptica se expresa en funcin de la
rotacin observada a, medida en las condiciones definidas en la monografa correspondiente.
Histricamente, la polarimetra se realizaba empleando un instrumento en el cual se estimaba el grado de rotacin ptica al
igualar visualmente la intensidad de los campos divididos. Por este motivo, se empleaba con mayor frecuencia la lnea D de la
lmpara de sodio a la longitud de onda de 589 nm en el espectro visible. 2 La rotacin especfica determinada en la lnea o se
expresa con el smbolo:

y gran parte de los datos disponibles se expresan de esta forma. El empleo de longitudes de onda menores, como por ejemplo
las obtenibles con las lneas de la lmpara de mercurio, aisladas a travs de filtros de mxima transmitancia, aproximadamente
a 546; 436; 405; 365 y 325 nm en un polarmetro fotoelctrico, ha demostrado proporcionar ventajas en sensibilidad con una
reduccin consiguiente de la concentracin del compuesto de prueba. En general, la rotacin ptica observada a 436 nm es
aproximadamente el doble y a 365 nm aproximadamente tres veces la observada a 589 nm. 2 La reduccin de la concentra-
cin del soluto requerida para la medicin a veces puede lograrse mediante la conversin de la sustancia en anlisis en una
sustancia que tenga una rotacin ptica significativamente mayor. La rotacin ptica tambin resulta afectada por el disolven-
te empleado para la medicin y esto debe especificarse en todos los casos.
En la actualidad, es prctica comn emplear otras fuentes de luz, tales como lmparas de xenn o halgenas de tungsteno,
con filtros apropiados, puesto que stas pueden ser menos costosas, adems de ser de larga duracin y tener un amplio rango
de longitudes de onda de emisin con respecto a las fuentes de luz tradicionales.

PROCEDIMIENTOS

Rotacin Especfica

La referencia Rotacin Especfica (781 S) en una monografa significa que esa rotacin especfica se calcular a partir de las
rotaciones pticas observadas en la Solucin de prueba o Solucin muestra, obtenidas segn se indica en ese mismo texto. A

1 Pueden encontrarse calibradores adecuados disponibles en la Office of Standard Reference Materials, National lnstitute of Standards and Technology, NIST (Ofi-
cina de Materiales de Referencia Estndar, Instituto Nacional de Normas y Tecnologa), Gaithersburg, MD 20899, como lotes vigentes de Materiales de Referencia
Estndar, Dextrosa y Sacarosa. Como alternativa, la calibracin puede controlarse empleando un Estndar de Referencia de Polarizacin, que consiste en una placa
de cuarzo montada sobre un soporte perpendicular al paso de la luz. Estos estndares, normalizados respecto a estndares del NIST, se encuentran disponibles en
Rudolph Research Analytical, ubicado en 55 Newburgh Road, Hackettstown, NJ 07840, EE.UU.
2 Todas las referencias a longitudes de onda son en vaco. La lnea D de sodio es 589,44 en vaco y 589,3 en aire.
642 (781) Rotacin ptica / Pruebas Fsicas USP 39

menos que se indique de otro modo, las mediciones de rotacin ptica se realizan en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25 C. 2
Cuando se emplea un polarmetro fotoelctrico, se hace una sola medicin corregida por el blanco de disolvente. Cuando se
emplea un polarmetro visual, se utiliza el promedio de no menos de cinco determinaciones, corregidas por la lectura del mis-
mo tubo con un blanco de disolvente. La temperatura, que se aplica a la solucin o al lquido en anlisis, debe mantenerse con
una aproximacin de 0,5 del valor establecido. Emplear la misma celda para la muestra y el blanco. Mantener la misma orien-
tacin angular de la celda en cada lectura. Colocar la celda de tal manera que la luz la atraviese en la misma direccin cada
vez. La rotacin especfica, a menos que se especifique algo diferente, se calcula con respecto a la sustancia seca cuando se
especifica Prdida por Secado en la monografa correspondiente o con respecto a la sustancia anhidra cuando se especifica
Determinacin de Agua.
La rotacin ptica de las soluciones se debe determinar dentro de los 30 minutos posteriores a la preparacin. En el caso de
sustancias que puedan sufrir racemizacin o mutarotacin, se deben tomar precauciones para estandarizar el tiempo entre la
adicin del soluto al disolvente y la introduccin de la solucin en el tubo polarimtrico.

Rotacin Angular

A menos que se indique de otro modo, la referencia Rotacin Angular (781 A) en una monografa significa que la rotacin
ptica del lquido sin diluir se mide en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25 C, corregida por la lectura del tubo vaco y seco.2

(785) OSMOLALIDAD Y OSMOLARIDAD

INTRODUCCIN
La presin osmtica tiene una importancia fundamental en todos los procesos biolgicos donde hay difusin de solutos o
transferencia de lquidos a travs de membranas. La smosis sucede cuando un disolvente, pero no las molculas de soluto,
pasa a travs de una membrana semipermeable desde regiones de menor a mayor concentracin para llegar al equilibrio. Es
muy importante para los profesionales conocer las presiones osmticas para poder determinar si una solucin parenteral es
hipoosmtica, isoosmtica o hiperosmtica. Una medicin cuantitativa de la presin osmtica facilita la dilucin requerida pa-
ra producir una solucin isoosmtica con respecto a la sangre entera.

PRESIN OSMTICA
La presin osmtica de una solucin depende del nmero de partculas en la solucin y, por lo tanto, se la considera como
una propiedad coligativa. Una partcula puede ser una molcula o unin o una especie agregada (por ejemplo, un dmero)
que puede existir en forma diferenciada en solucin. Una solucin presenta un comportamiento ideal cuando no hay interac-
cin entre los solutos y el disolvente, excepto cuando las molculas del disolvente estn unidas a los solutos mediante enlaces
de hidrgeno o enlaces covalentes coordinados. En el caso de tales soluciones que contienen un soluto no disociado, la pre-
sin osmtica (re) es directamente proporcional a su molalidad (el nmero de moles de soluto por kilogramo de disolvente):

re =(pRT/1 OOO)m
en donde pes la densidad del disolvente a la temperatura T (en la escala absoluta); R es la constante universal del gases; y m es
la molalidad de la solucin. Para el caso de una solucin real que contiene ms de un soluto, la presin osmtica se calcula por
la frmula:

en donde v; es el nmero de partculas formadas por la disociacin de una molcula del isimo soluto (el nmero ordinal del
soluto); v; = 1 para solutos no inicos (que no se disocian); m; es la molalidad del isimo soluto (el nmero ordinal del soluto);
y <I>m; es el coeficiente osmtico molal del isimo soluto. El coeficiente osmtico molal tiene en cuenta la desviacin de una
soluin con respecto al comportamiento ideal. Su valor depende de la concentracin del soluto o los solutos en la solucin,
de sus propiedades qumicas y de sus caractersticas inicas. El valor del coeficiente osmtico molal de un soluto se puede de-
terminar experimentalmente midiendo el descenso del punto de congelacin a diferentes concentraciones molales. A concen-
traciones de inters farmacutico, el valor del coeficiente osmtico molal es menos de uno. El coeficiente osmtico molal dis-
minuye al aumentar la concentracin del soluto (Tabla 7).

OSMOLALIDAD
La osmolalidad de una solucin ~m se representa mediante la frmula
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (785) Osmolalidad y Osmolaridad 643

La osmolalidad de una solucin real se corresponde con la molalidad de la solucin ideal que contiene solutos que no se diso-
cian y se expresa en osmoles o miliosmoles por kilogramo de disolvente (Osmol por kg o mOsmol por kg, respectivamente),
una unidad que es similar a la molalidad de una solucin. As, la osmolalidad es la medida de la presin osmtica ejercida por
una solucin real a cada lado de una membrana semipermeable. Al igual que la presin osmtica, otras propiedades coligati-
vas de la solucin, tales como la disminucin de la presin de vapor, la elevacin del punto de ebullicin y el descenso del
punto de congelacin, tambin estn directamente relacionadas con la osmolalidad de la solucin. As, la osmolalidad de una
solucin se determina tpicamente con la mayor exactitud y conveniencia midiendo el descenso del punto de congelacin
(i'. T1):

i'.T1= k1sm
en donde k1 es la constante crioscpica molal, que es una propiedad del disolvente. Para el agua, el valor de k1 es 1,860 por
Osmol. Es decir, 1 Osmol de un so luto agregado a 1 kg de agua hace descender el punto de congelacin en 1,860.

OSMOLARIDAD

La osmolaridad de una solucin es una cantidad terica expresada en osmoles por L (Osmol por L) de una solucin y se usa
ampliamente en la prctica clnica porque expresa los osmoles en funcin del volumen. La osmolaridad no se puede medir
pero se calcula tericamente a partir del valor de osmolalidad medido experimentalmente.
A veces, la osmolaridad (sJ se calcula tericamente a partir de las concentraciones molares:

Se= LVC
en donde v; es la que se define anteriormente y C; es la concentracin molar del isimo soluto (el nmero ordinal del soluto) en
solucin. Por ejemplo, la osmolaridad de una solucin que se prepara disolviendo 1 g de vancomicina en 100 mL de solucin
de cloruro de sodio al 0,9% se puede calcular de la siguiente manera:

[3 x 1Og/L/l449,25(peso mol. de vancomicina) + 2 x 9 g/L/58,44(peso mol. de cloruro de sodio)] x 1000 = 329 mOsmol/L

El resultado sugiere que la solucin es ligeramente hiperosmtica dado que la osmolalidad de la sangre est entre 285 y 31 O
mOsmol por kg. Sin embargo, la solucin ha resultado ser hipoosmtica y tiene una osmolalidad determinada experimental-
mente de 255 mOsmol por kg. 1 El ejemplo ilustra que los valores de osmolaridad calculados tericamente a partir de la con-
centracin de una solucin se deben interpretar con cautela y este valor puede no representar las propiedades osmticas de las
soluciones de infusin.
La discrepancia entre los resultados tericos (osmolaridad) y los experimentales (osmolalidad) se debe, en parte, al hecho de
que la presin osmtica est relacionada con la osmolalidad y no con la osmolaridad. Ms significativamente, la discrepancia
entre los resultados experimentales y los clculos tericos se debe a que la presin osmtica de una solucin real es menor que
la de una solucin ideal debido a las interacciones entre las molculas del soluto o entre las molculas del soluto y del disolven-
te en una solucin. Estas interacciones reducen la presin que ejercen las molculas del soluto sobre la membrana semiper-
meable, lo que reduce los valores experimentales de la osmolalidad en comparacin con los valores tericos. Esta diferencia
est relacionada con el coeficiente osmtico molal (<llm,;). El ejemplo tambin ilustra la importancia de determinar experimen-
talmente la osmolalidad de una solucin, en vez de calcular el valor tericamente.

MEDICIN DE LA OSMOLALIDAD

Normalmente, el valor de osmolalidad de una solucin se determina midiendo el descenso del punto de congelacin de una
solucin.
Aparato-El aparato, un osmmetro para medir el descenso del punto de congelacin, consiste en lo siguiente: un medio
para enfriar el recipiente utilizado para la medicin; un resistor sensible a la temperatura (termistor), con un dispositivo ade-
cuado para medir la diferencia de potencial o de corriente y que puede graduarse en funcin de cambios de temperatura o en
osmolalidad; y un mecanismo para mezclar la muestra.
Los osmmetros que miden la presin de vapor de las soluciones se emplean con menor frecuencia. Requieren un volumen
de muestra ms pequeo (generalmente aproximadamente 5 L), aunque la exactitud y precisin de los resultados de las de-
terminaciones de osmolalidad son comparables a las obtenidas mediante el uso de osmmetros que dependen de la observa-
cin del punto de congelacin de las soluciones.
Soluciones Estndar-Preparar las Soluciones Estndar como se indica en la Tabla 7, segn sea necesario. 2

1 Kastango, E.S. y Hadaway, L. lnternational journal of Pharmaceutica/ Compounding 5, (2001) 465-469.

2 Se pueden usar soluciones comercialmente disponibles para calibracin de osmmetros, con osmolalidades iguales o diferentes a las que se listan en la Tabla 1 y
estandarizadas con mtodos rastreables al NIST.
644 (785) Osmolalidad y Osmolaridad / Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 1. Soluciones Estndar para Calibracin del Osmmetro*

Soluciones Estndar Osmolalldad Coeficiente Descenso del
(Peso en g de cloruro de sodio (mOsmol/kg) Osmtico Molal Punto de Congelacin ()
por kg de agua) (~ro) (<Dro Naq) !J.Tr

3,087 100 0,9463 0,186

6,260 200 0,9337 0,372
9,463 300 0,9264 0,558
12,684 400 0,9215 0,744
15,916 500 0,9180 0,930
19,147 600 0,9157 1,116
22,380 700 0,9140 1,302
* Adaptado de la Farmacopea Europea, 4a Edicin, 2002, pg. 50.

Solucin de Prueba-En el caso de un slido para inyeccin, reconstituir con el diluyente apropiado segn se indica en las
instrucciones del etiquetado. En el caso de soluciones, usar la muestra tal como se encuentra. [NOTA-Se puede diluir una solu-
cin para que quede dentro del intervalo de medicin del osmmetro, si fuera necesario, pero el resultado se deber expresar
como el resultado de la solucin diluida y NO se debe multiplicar por un factor de dilucin para calcular la osmolalidad de la
solucin original, a menos que se especifique algo diferente en la monografa. El coeficiente osmtico molal es una funcin de
la concentracin. Por lo tanto, cambia con la dilucin.]
Procedimiento-Primero, calibrar el instrumento segn las instrucciones del fabricante. Confirmar la calibracin del instru-
mento con, por lo menos, una solucin de la Tabla 1 de manera que la osmolalidad de la Solucin Estndar se encuentre den-
tro de 50 mOsmol/kg del valor esperado de la Solucin de Prueba o en el centro del intervalo esperado de osmolalidad de la
Solucin de Prueba. La lectura del instrumento debe estar dentro de 4 mOsmol por kg de la Solucin Estndar. Introducir un
volumen adecuado de cada Solucin Estndar en la celda de medicin conforme a las instrucciones del fabricante y poner en
marcha el sistema de enfriamiento. En general, el dispositivo de mezcla se programa para que opere a una temperatura inferior
a la temperatura ms baja esperada de descenso del punto de congelacin. El aparato indica cuando se ha logrado el equili-
brio. Si fuera necesario, calibrar el osmmetro utilizando un dispositivo de ajuste adecuado de modo que la lectura correspon-
da a la osmolalidad o al valor de descenso del punto de congelacin de la Solucin Estndar que aparece en la Tabla 1. [NOTA-
Si la lectura del instrumento indica el descenso del punto de congelacin, la osmolalidad se puede derivar usando la frmula
apropiada en Osmolalidad.] Repetir el procedimiento con cada Solucin de Prueba. Leer la osmolalidad de la Solucin de Prueba
directamente o calcularla a partir del valor obtenido para el descenso del punto de congelacin.
Suponiendo que el valor del coeficiente osmtico es esencialmente el mismo ya sea que la concentracin se exprese en mo-
lalidad o molaridad, la osmolalidad de una solucin determinada experimentalmente se puede convertir en osmolaridad de la
misma manera que la concentracin de una solucin se convierte de molalidad a molaridad. A menos que una solucin est
muy concentrada, la osmolaridad de una solucin (~e) se puede calcular a partir de su osmolalidad determinada experimental-
mente (~ro):

~e= 1000~m f (1000 / p + LWV)

donde W; es el peso en g; y v; es el volumen especfico parcial, en mL por g, del isimo soluto (el nmero ordinal del soluto). El
volumen especfico parcial de un soluto es el cambio en volumen de una solucin cuando se disuelve 1 g adicional de soluto
en la solucin. Este volumen se puede determinar midiendo las densidades de la solucin antes y despus de agregar el soluto.
Los volmenes especficos parciales de las sales son generalmente muy pequeos, alrededor de O, 1 mL por g. Sin embargo, los
otros solutos son generalmente mayores. Por ejemplo, los volmenes especficos parciales de los aminocidos estn entre 0,6
mL y 0,9 mL por g. Se puede demostrar por la ecuacin anterior que correlaciona la osmolaridad con la osmolalidad que,

donde pes la densidad de la solucin y e es la concentracin de soluto total, ambas expresadas en g por ml. Por lo tanto,
alternativamente, la osmolaridad puede calcularse tambin a partir de la osmolalidad determinada experimentalmente a partir
de la medicin de la densidad de la solucin mediante un mtodo adecuado y el peso total del soluto, despus de la correc-
cin por contenido de agua, disuelto por mL de la solucin.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (786) Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula 645

(786) ESTIMACIN DE LA DISTRIBUCIN DEL TAMAO DE

PARTCULA POR TAMIZADO ANALTICO

El tamizado es uno de los mtodos ms antiguos para clasificar los polvos y los grnulos segn la distribucin del tamao de
partcula. El tamizado utilizando un lienzo tejido como tamiz, consiste bsicamente en clasificar las partculas segn su tamao
intermedio (es decir, segn su ancho o amplitud). Se recomienda el tamizado mecnico si la mayora de las partculas superan
los 75 m aproximadamente. Si se trata de partculas ms pequeas, durante el tamizado se observa que su escaso peso no
ejerce la fuerza suficiente para contrarrestar las fuerzas de adhesin y cohesin superficial, que hacen que las partculas se aglu-
tinen unas con otras y al tamiz. Por este motivo, las partculas que se esperara que pasaran por el tamiz, en realidad no lo
hacen. Para este tipo de materiales se recomienda emplear otros mtodos de agitacin, como por ejemplo el tamizado con un
chorro de aire o el tamizado snico. No obstante, el tamizado se puede emplear en algunos casos para algunos polvos o gr-
nulos cuya mediana de tamao de partcula sea inferior a 75 m, siempre que el mtodo se pueda validar. En trminos farma-
cuticos, el tamizado es el mtodo de preferencia para clasificar polvos o grnulos sin mezclas ms gruesos. El mtodo es espe-
cialmente atractivo ya que tanto los polvos como los grnulos se clasifican solamente en funcin del tamao de partcula y en
la mayora de los casos el anlisis se puede efectuar con el material seco.
Entre los factores limitantes que presenta el mtodo se encuentran la necesidad de contar con una cantidad de muestra
apreciable (segn sea la densidad del polvo o de los grnulos y el dimetro de los orificios del tamiz, generalmente como mni-
mo 25 g) y la dificultad que presentan polvos o grnulos oleosos o cohesivos que obstruyen los orificios del tamiz. En esencia,
el mtodo estima el tamao en dos dimensiones ya que el pasaje a travs del orificio del tamiz a menudo presenta mayor
dependencia del ancho y del espesor mximos que del largo.
Este mtodo est destinado a estimar la distribucin del tamao de partcula total de un material sin mezclar. No est dise-
ado para determinar la proporcin de partculas que pasan o que se retienen por uno o dos tamices.
A menos que la monografa individual especifique algo diferente, estimar la distribucin del tamao de partcula segn se
describe en Mtodo de Tamizado en Seco. Si se presentan dificultades para alcanzar el punto final (es decir, el material no pasa
fcilmente por los tamices) o si fuera necesario emplear los tamices con los orificios ms pequeos del intervalo de tamizado
(de menos de 75 m), se debe evaluar si no sera conveniente emplear otro mtodo para determinar el tamao de partcula.
Se debe tamizar en condiciones tales que no generen ni prdida ni aumento del contenido de humedad de la muestra. Con-
trolar la humedad relativa ambiente del lugar donde se efecta el tamizado de forma de impedir que la muestra absorba o
pierda humedad. El tamizado analtico de prueba normalmente se realiza en condiciones de humedad ambiente salvo que hu-
biera pruebas que indicaran lo contrario. Cualquier condicin especial aplicable al material en cuestin debe estar detallada en
la monografa individual.

PRINCIPIOS DEL TAMIZADO ANALTICO

Los tamices analticos constan de una malla de alambre, de tejido simple, que se asume deja aberturas casi cuadrangulares y
que est sellada en la base de un recipiente cilndrico abierto. El mtodo analtico de base consiste en apilar los tamices uno
sobre el otro, encimndolos en orden ascendente de tamao de orificio y luego colocar el polvo de muestra en el tamiz supe-
rior.
Someter a agitacin el grupo de tamices apilados durante un tiempo normalizado y luego determinar con exactitud el peso
del material retenido en cada tamiz. Por este mtodo se calcula el porcentaje, en peso, del polvo retenido en cada uno de los
tamices utilizados.
El procedimiento para estimar la distribucin del tamao de partcula de un nico polvo farmacutico est diseado, en ge-
neral, para trabajar con polvos en los que al menos el 80% de las partculas supera los 75 m. El parmetro dimensional que se
emplea para determinar la distribucin del tamao de partcula por tamizado analtico es el largo de uno de los lados del orifi-
cio cuadrangular ms pequeo a travs del cual pasar la partcula.

TAMICES ANALTICOS
Los tamices analticos adecuados para efectuar las pruebas farmacopeicas cumplen con las especificaciones contenidas en la
versin ms actualizada de la Norma ISO 3310-1 de la Organizacin Internacional de Normalizacin: Tamices Analticos-Re-
quisitos Tcnicos y Pruebas (ver la Tabla 1). A menos que la monografa especifique algo diferente, emplear los tamices ISO
que se enumeran como tamao principal en la Tabla 1. A menos que la monografa especifique algo diferente, emplear los
tamices ISO que figuran en la Tabla 1 segn la recomendacin indicada para ese tamiz.
646 (786) Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula / Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 1. Tamaos de las Serles de Tamices Estndar segn el Intervalo de Inters

Abertura Nominal ISO
Tamaos Tamices USP Tamiz Tamiz
Principales Tamaos Adicionales Tamiz No. Recomendados Europeo fapons
R20/3 R20 R40/3 EE.UU. (micrones) No. No.
11,20 mm ll,20mm 11,20mm 11200
10,00 mm
9,50 mm
9,00 mm
8,00 mm 8,00 mm 8,00 mm
7,lOmm
6,70 mm
6,30 mm
5,60 mm 5,60 mm 5,60 mm 5600 3,5
5,00 mm
4,75 mm 4
4,50 mm
4,00 mm 4,00mm 4,00 mm 5 4000 4000 4,7
3,55 mm
3,35 mm 6 5,5
3,15 mm
2,80 mm 2,80 mm 2,80 mm 7 2800 2800 6,5
2,50 mm
2,36 mm 8 7,5
2,24 mm
2,00 mm 2,00 mm 2,00 mm 10 2000 2000 8,6
1,80 mm
1,70 mm 12 10
1,60mm
1,40 mm 1,40 mm 1,40mm 14 1400 1400 12
1,25 mm
1,18 mm 16 14
1,12mm
1,00mm 1,00mm 1,00mm 18 1000 1000 16
900m
850 m 20 18
800m
710 m 710m 710 m 25 710 710 22
630 m
600 m 30 26
560m
500 m 500 m 500 m 35 500 500 30
450m
425 m 40 36
400 m
355 m 355 m 355 m 45 355 355 42
315 m
300 m 50 50
280 m
250m 250m 250 m 60 250 250 60
224 m
212 m 70 70
200m
180 m 180m 180m 80 180 180 83
160 m
USP 39 Pruebas Fsicas/ (786) Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula 647

Tabla 1. Tamaios de las Series de Tamices Estndar segn el Intervalo de Inters (Continuacin)
Abertura Nominal ISO
Tamaios Tamices USP Tamiz Tamiz
Principales Tamaios Adicionales Tamiz No. Recomendados Europeo Japons
R20/3 R20 R40/3 EE.UU. (micrones) No. No.
150m 100 100
140m
125 m 125 m 125 m 120 125 125 119
112 m
106m 140 140
100 m
90 m 90 m 90m 170 90 90 166
80 m
75 m 200 200
71 m
63 m 63 m 63 m 230 63 63 235
56m
53 m 270 282
50 m
45 m 45 m 45 m 325 45 45 330
40 m
38m 38 391

Seleccionar los tamices de forma que todos los tamaos de partcula de la muestra de prueba estn comprendidos en el
intervalo. Se recomienda emplear un grupo de tamices encajados con una progresin de "2 del rea de los orificios del tamiz.
Encajar los tamices de forma que la malla con orificios ms grandes quede en el extremo superior y la que tenga los orificios
ms pequeos en el extremo inferior. Clasificar los orificios del tamiz asignndoles un valor en micrmetros o en milmetros.
[NOTA-Los nmeros de malla que figuran en la tabla se proporcionan exclusivamente para realizar conversiones.] Los tamices
analticos son preferentemente de acero inoxidable o, en su defecto, de bronce o de otro alambre no reactivo adecuado.
Tanto la primera calibracin del tamiz analtico como las subsiguientes se realizan segn lo dispuesto en la versin ms ac-
tualizada de la norma ISO 3310-1. Antes de emplear un tamiz, examinarlo cuidadosamente en busca de fracturas y distorsio-
nes considerables, sobre todo en las juntas de la malla y el cilindro. En algunos casos, se pueden emplear mtodos pticos para
calibrar el tamiz, estimando el tamao promedio del orificio y la variabilidad que pudieran presentar los orificios de la malla.
Alternativamente tambin se pueden emplear Esferas de Vidrio Estndar para medir los orificios reales de los tamices analticos
en el intervalo de 212 m a 850 m. A menos que la monografa individual especifique algo diferente, analizar el tamiz con
temperatura ambiente controlada y en condiciones de humedad relativa ambiente.

Limpieza de los Tamices Analticos

En condiciones ideales se recomienda limpiar los tamices solamente con un chorro de aire o con un chorro de lquido. Si
despus del chorro de lquido o de aire, todava se observan orificios obstruidos por partculas del material en estudio, emplear
un cepillo como ltimo recurso pasndolo suavemente y tomando las precauciones necesarias para no daar el tamiz.

Muestra de Prueba

Si la monografa del material en estudio no indica el peso de la muestra de prueba, emplear una muestra de prueba de 25 g
a 100 g, dependiendo de la densidad aparente, y tamices analticos de 200 mm de dimetro. Para tamices de 76 mm calcular
la cantidad de material adecuada considerando que es aproximadamente 1/7 de la cantidad que puede colocarse en un tamiz
de 200 mm. Determinar el peso ms apropiado para un material dado, tamizando muestras de distintos tamaos pesadas con
exactitud, por ejemplo 25 g, 50 g y 100 g colocadas en un agitador mecnico durante el mismo periodo de tiempo. [NOTA-Si
los resultados obtenidos con las muestras de 25 g y 50 g son similares, pero el porcentaje obtenido en el tamiz de orificios ms
pequeos con la muestra de 100 g es menor, la muestra de 100 g es demasiado grande.] Si slo se dispone de una muestra de
1Og a 25 g, se pueden emplear tamices analticos de menor dimetro que cumplan con las mismas especificaciones de la ma-
lla. En este caso, volver a determinar el punto final. En algunos casos, puede ser necesario emplear muestras con una masa
menor (por ejemplo, hasta 5 g). Para materiales con densidad de partculas aparente baja, o de materiales compuestos princi-
palmente por partculas de forma muy isodiamtrica, puede ser necesario emplear una muestra de menos de 5 g en un tamiz
de 200 mm, para as evitar la obstruccin excesiva de los orificios del tamiz. En la validacin de un mtodo de tamizado anal-
tico en particular, se asume que el problema de la obstruccin de los orificios se tom en consideracin.
648 (786) Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula / Pruebas Fsicas USP 39

Si el material en estudio es propenso a absorber o a perder cantidades de agua considerables con las variaciones de hume-
dad, efectuar la prueba en un ambiente controlado apropiado. De forma anloga, si se sabe que el material en estudio genera
carga electrosttica, tomar las precauciones necesarias para garantizar que esa carga no altere los resultados del anlisis. En
algunos casos, se recomienda agregar un 0,5 por ciento (m/m) de un agente anti-esttico, como un dixido de silicio coloidal
u xido de aluminio, para reducir el efecto a un mnimo. Si no se puede eliminar la carga esttica ni la absorcin o prdida de
agua, es necesario emplear otra tcnica para determinar el tamao de partcula.

Mtodos de Agitacin

Todos los distintos tipos de dispositivos de agitacin para tamices y polvos estn disponibles comercialmente y son adecua-
dos para el tamizado analtico. Sin embargo, las distintas fuerzas y las diferencias de magnitud de estas fuerzas sobre las part-
culas en estudio que emplean los distintos mtodos de agitacin producirn resultados distintos y tendrn puntos finales dis-
tintos. Algunos mtodos emplean la agitacin mecnica o electromagntica que induce un cierto grado de oscilacin vertical o
de movimiento circular en el plano horizontal o golpes suaves o una combinacin de golpes suaves y de movimiento circular
en el plano horizontal. Otro mtodo consiste en arrastrar las partculas en un chorro de aire. Es necesario indicar en los resulta-
dos qu mtodo de agitacin se emple y con qu parmetros (si estn sujetos a variacin), ya que los cambios en las condi-
ciones de agitacin generan cambios en los resultados del tamizado analtico y en la determinacin del punto final y en algu-
nos casos la variacin es lo suficientemente amplia como para dar resultados que no cumplan con los requisitos en ciertas cir-
cunstancias.

Determinacin del Punto Final

El tamizado analtico se da por concluido cuando el peso de cualquiera de los tamices no presenta variaciones de ms de 5%
o de O, 1 g (10% si se emplean tamices de 76 mm) del peso previo obtenido en ese mismo tamiz. Si en cualquiera de los
tamices hay menos del 5% del total de la muestra, aumentar el punto final para ese tamiz hasta un cambio de peso de no ms
de 20% del peso previo obtenido en ese tamiz.
Si se encuentra ms del 50% del peso total de la muestra en cualquiera de los tamices, a menos que esta circunstancia est
indicada en la monografa, repetir la prueba agregando a ese conjunto de tamices un tamiz con orificios ms grandes, de ta-
mao intermedio entre el tamao del tamiz que contiene el exceso de peso y el siguiente tamiz en el orden del grupo original,
es decir, agregando el tamiz de la serie ISO omitido en el conjunto de tamices.

MTODOS DE TAMIZADO
Agitacin Mecnica

MTODO DE TAMIZADO EN SECO

Tarar cada tamiz con una aproximacin de O, 1 g. Colocar una cantidad de la muestra de prueba pesada con exactitud en el
tamiz superior (el de orificios ms grandes) y tapar. Agitar el conjunto de tamices durante 5 minutos. A continuacin desmon-
tar cuidadosamente cada tamiz del conjunto de tamices sin que haya prdida de material. Volver a pesar cada tamiz y determi-
nar el peso del material en cada uno de ellos. Determinar el peso del material utilizando una bandeja recolectora u otro admi-
nculo similar para recolectar el material. Volver a montar el conjunto de tamices y agitar durante 5 minutos. Desmontar y
pesar cada uno de los tamices como se describi anteriormente. Repetir los pasos hasta obtener los resultados del punto final
(ver Determinacin del Punto Final en Tamices Analticos) Una vez completado el anlisis, conciliar los pesos del material. Las
prdidas totales no exceden de 5% del peso de la muestra original.
Repetir el anlisis con una muestra nueva, pero usando un solo tiempo de tamizado igual a la sumatoria de los tiempos men-
cionados anteriormente. Confirmar que este tiempo de tamizado cumple con los requisitos de la determinacin de punto final.
Una vez validado el punto final para un material especfico, ese tiempo nico de tamizado fijado se puede usar en los prximos
anlisis, siempre y cuando la distribucin del tamao de partcula est comprendida dentro de los lmites de la variacin nor-
mal.
Si se observara que las partculas retenidas en uno cualquiera de los tamices estn en forma de agregados y no de partculas
individuales, es poco probable que el tamizado mecnico en seco proporcione una buena reproducibilidad. En ese caso se de-
be emplear otro mtodo de anlisis del tamao de partcula.

Mtodos de Arrastre por Aire

TAMIZADO CON UN CHORRO DE AIRE O TAMIZADO SNICO

Hay disponibles comercialmente varios tipos distintos de equipos para tamizar que utilizan una corriente de aire circulante.
El sistema que emplea un nico tamiz por vez se denomina tamizado por chorro de aire. En lneas generales, la metodologa es
USP 39 Pruebas Fsicas/ (787) Partculas Subvisibles en Inyectables 649

similar a la descrita para el Mtodo de Tamizado en Seco con un chorro de aire normalizado en lugar del mecanismo de agita-
cin descrito. La distribucin del tamao de partcula se obtiene mediante anlisis secuenciales en tamices individuales comen-
zando por el tamiz con orificios ms pequeos. A menudo, el tamizado por chorro de aire se realiza con tamices de orificios
ms pequeos que los empleados en el tamizado en seco. La tcnica resulta ms adecuada si slo es necesario cuantificar las
fracciones que estn por encima o por debajo de un lmite de tamao.
El mtodo de tamizado snico emplea un conjunto de tamices y la muestra circula en un columna de aire que oscila vertical-
mente y eleva la muestra y la devuelve a los orificios de la malla a un cierto nmero de pulsos por minuto. En algunos casos, si
se emplea el tamizado snico es necesario disminuir el tamao de la muestra a 5 g.
Los mtodos de tamizado por chorro de aire y snico pueden ser tiles para polvos o grnulos con los que no se obtienen
un anlisis significativo empleando las tcnicas de tamizado mecnico.
Estos mtodos dependen en gran medida de que la dispersin del polvo en la corriente de aire sea apropiada. Puede ocurrir
que se encuentren dificultades para cumplir con este requisito si el mtodo se emplea con los tamices en el extremo inferior
del intervalo (es decir, de menos de 75 m), cuando las partculas tienden a tener mayor cohesin y en particular si el material
presenta una tendencia a cargarse electrostticamente. Los motivos expuestos subrayan la importancia de la determinacin del
punto final y que es crucial confirmar que el material cuyo tamao excede el previsto est compuesto de partculas aisladas y
no de agregados.

INTERPRETACIN

Los datos sin procesar deben incluir el peso de la muestra en anlisis, el tiempo total de tamizado y la descripcin precisa de
la metodologa de tamizado empleada as como los valores fijados para todo parmetro variable, adems de los pesos del ma-
terial retenido en cada tamiz individual y del peso en la bandeja. En algunos casos se recomienda convertir estos datos en una
distribucin acumulativa del peso y, si se desea expresar la distribucin en trminos del peso acumulado de partculas de tama-
o inferior al esperado, el intervalo de tamices empleados debe incluir un tamiz por cuyos orificios pasa todo el material. Si se
observan indicios de que el material retenido en los tamices est compuesto por agregados formados durante el proceso de
tamizado, el anlisis no es vlido.

, ,
(787) PARTICULAS SUBVISIBLES EN INYECTABLES DE PROTEINAS
TERAPUTICAS

Este captulo se puede usar como alternativa al captulo general Partculas en Inyectables (788) de la USP. Este captulo trata
especficamente de inyectables de protenas teraputicas y preparaciones relacionadas, lo cual permite el uso de volmenes de
los productos y alcuotas de prueba ms pequeas para determinar el contenido de partculas, con instrucciones para la mani-
pulacin de las muestras que toman en cuenta las cuestiones asociadas con el anlisis de estos materiales. Aunque la metodo-
loga y los lmites presentados en este captulo son los preferidos para inyectables de protenas teraputicas, se considera acep-
table el uso de mtodos analticos alternativos aceptados por las autoridades reglamentarias con lmites de partculas subvisi-
bles adecuadamente desarrollados.
Los inyectables de protenas teraputicas son productos de protenas o pptidos, obtenidos por biotecnologa, 11
11iflll!Wl:rlliI
as como otros inyectables de protenas teraputicas tales como protenas teraputicas obtenidas de fuentes na-
incluyendo sus preparaciones finales para infusin. No se incluyen en este captulo ciertas preparaciones que no se
pueden adaptar a estas pruebas, tales como las vacunas profilcticas.
Las partculas en inyectables de protenas teraputicas son sustancias mviles no disueltas que pueden originarse de diversas
fuentes. Las partculas pueden ser (a) verdaderamente extraas o "extrnsecas", p.ej., material extrao inesperado, tal como
celulosa; (b) "intrnsecas" resultantes del proceso de fabricacin, mediante incorporacin o por limpieza deficiente, tales como
metales o juntas del tanque, lubricantes, equipo de llenado, o que resultan de la inestabilidad, p.ej., cambios por el paso del
tiempo, tales como formas salinas insolubles de frmacos o degradacin del empaque; y (c) "inherentes", tales como partcu-
las de la protena o de los componentes de la formulacin. Todos estos tipos de partculas se pueden detectar y contar usando
el mtodo de prueba descrito en este captulo. Asimismo, para los mtodos de obstruccin de luz (OL), las burbujas de gas por
lo regular se cuentan durante el anlisis de partculas y se consideran artefactos del recuento. Para la determinacin de partcu-
las subvisibles en inyectables de protenas teraputicas, el mtodo preferido es la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin
de Luz. La Prueba de Conteo Microscpico de Partculas similar a la descrita en el captulo (788) puede ser til para casos en los
que las partculas que se estn analizando sean en su mayora no proteinceas, o para casos en los que pudiera considerarse
importante examinar las caractersticas de las partculas. Los resultados de esta prueba no son equivalentes a los de la prueba
de OL.
 650 (787) Partculas Subvisibles en Inyectables / Pruebas Fsicas USP 39

No todos los inyectables de protenas teraputicas pueden examinarse directamente para determinar la presencia de partcu-
las subvisibles con el mtodo de OL. Cuando el mtodo de prueba no se puede aplicar de forma directa a muestras de prueba
especficas, segn se determine por cualquier problemtica con la verificacin del mtodo (reproducibilidad, linealidad), se
puede realizar una dilucin cuantitativa con un diluyente apropiado para permitir el anlisis mediante obstruccin de luz. La
verificacin del mtodo puede ser necesaria para garantizar la idoneidad de los procedimientos de manejo de la muestra y el
desempeo del mtodo para cada medicamento.
En las pruebas descritas a continuacin, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o grupo de unidades para
determinar la presencia de partculas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que an no han sido analizadas. Por
consiguiente, se deben desarrollar planes de muestreo basndose en factores operativos conocidos para sustentar inferencias
vlidas derivadas de los datos observados a fin de caracterizar el nivel de partculas en un grupo grande de unidades. Los pla-
nes de muestreo se deben basar considerando el volumen de producto, nmero de partculas histricamente encontradas en
comparacin con los lmites, distribucin del tamao de partcula y variabilidad de los recuentos de partculas entre unidades.
Los productos que se usan con un filtro final durante su administracin (en lnea) estn exentos de estos requisitos, siempre
que se cuente con datos cientficos para justificar la exencin.

PRUEBA DE CONTEO DE PARTCULAS POR OBSTRUCCIN DE LUZ

Los analistas deben usar un instrumento adecuado que se base en el principio de bloqueo de luz y que permita una determi-
nacin automtica del tamao y del nmero de partculas.
El sensor seleccionado debe ser apropiado para el intervalo de tamao de partcula que se quiere determinar y el nmero de
partculas esperado. Diversas etapas de estandarizacin, tales como exactitud del volumen de muestra, velocidad de flujo de la
muestra, resolucin del sensor, calibracin y exactitud del recuento de partculas, resultan importantes para la operacin apro-
piada del aparato y se discuten con mayor detalle en el captulo de informacin general Mtodos para Ja Determinacin de Par-
tculas en Inyectables y Soluciones Oftlmicas (1 788). 1
Para propsitos de calibracin del equipo, usar estndares de tamao de partcula rastreables al NIST o estndares rastrea-
bles equivalentes; ver el captulo (1788). Estos estndares por lo general son de entre 2 y 100 m. Los analistas deberan verifi-
car el desempeo del aparato usando el ER Recuento de Partculas USP dispersado en agua exenta de partculas usando un
volumen apropiado. Se debe tener cuidado de evitar la aglomeracin de partculas durante la dispersin en el proceso de cali-
bracin. La definicin de Agua Exenta de Partculas se encuentra en la seccin introductoria de Reactivos, Indicadores y Solucio-
nes.

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten el ingreso de partculas, de preferencia en una cabina de flujo laminar. Se
debe limpiar y manipular adecuadamente todo el material de vidrio y el equipo usado para evitar la introduccin de partculas.
Se debe tener cuidado de minimizar la agitacin y dems situaciones de estrs para las preparaciones (para lquidos o polvos
reconstituidos) y de prevenir la introduccin de burbujas de aire en la preparacin en anlisis. Esto ltimo es de particular im-
portancia al combinar o transferir las preparaciones al recipiente en el que se llevar a cabo la determinacin.

Etapas Preparatorias

El material de vidrio seleccionado para el mtodo debe ser adecuado para el volumen de las alcuotas de blanco y de mues-
tra, permitir un mezclado fcil y una limpieza repetitiva a fin de prevenir cualquier contribucin significativa a los recuentos de
partculas. Por lo regular, se utilizan vasos dedicados nica y exclusivamente para esta prueba. La limpieza y enjuague del ma-
terial de vidrio del mtodo debe realizarse en una zona contigua al rea del recuento.
El rea de trabajo y el equipo deben estar separados del trfico general del laboratorio. Debe disponerse de un buen sumi-
nistro de agua filtrada (que cumpla con el requisito de Agua Exenta de Partculas) y de un equipo de soporte mantenido en
buenas condiciones para el trabajo de rutina. Consultar el captulo de informacin general (1788). 1
Se recomiendan dos tipos de controles del sistema: una Prueba Blanco y una Verificacin de la Aptitud del Sistema.
1 . La Prueba Blanco involucra lo siguiente:
a. La que se realiza al inicio del da o del anlisis para asegurar que se ha tenido especial cuidado durante la preparacin
del sitio y del aparato que se va a usar (Blanco Ambienta0.
b. Todos los blancos adicionales que se realizan durante el da (por ejemplo entre familias de productos) tambin deben
cumplir con los requisitos de la Prueba Blanco (Blanco de Procedimiento).
2. La Verificacin de Ja Aptitud del Sistema se realiza para verificar el recuento/mL apropiado y la relacin con respecto al ER
Recuento de Partculas USP vigente o el estndar comercial equivalente. Ver el captulo de informacin general (1788). 1

1 Slo para propsitos de informacin, los analistas pueden referirse al captulo (1 788), el cual puede ser til, aunque no obligatorio.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (787) Partculas Subvisibles en Inyectables 651

Prueba Blanco

La siguiente prueba se lleva a cabo para verificar que (a) el ambiente es adecuado para Ja prueba, (b) el material de vidrio se
ha limpiado apropiadamente y que (c) el agua o disolvente adecuado que se va a usar se encuentra exento de partculas (by c
constituyen el "blanco"). Determinar el recuento en cinco alcuotas de agua exenta de partculas o disolvente adecuado desga-
sificados, que sean representativas del volumen de prueba del producto (pero no menos de 1 mL). Si el nmero de partculas
con un tamao de 1 O m o mayor excede de 1 partcula por mL para el volumen combinado de las alcuotas, entonces no han
sido suficientes las precauciones tomadas para Ja prueba. Repetir las etapas preparatorias hasta que el entorno, el material de
vidrio y el agua sean adecuados para la determinacin de Ja prueba. En principio, Ja Prueba Blanco debe realizarse cada da
(entorno) y se recomienda durante toda la rutina diaria, en especial entre familias de productos (procedimiento).

Verificacin de la Aptitud del Sistema

Para verificar la aptitud del sistema, el Agua Exenta de Partculas y el ER Recuento de Partculas USP o la suspensin acuosa
estndar comercial equivalente se analizan en el mismo tipo de envase, o similar a los de las muestras de producto, se desgasi-
fican de la misma manera y, por lo general, se manipulan de la misma manera que el artculo de prueba. Asegurar que el siste-
ma puede cumplir con el requisito de la Prueba Blanco. Determinar las partculas en una muestra del ER Recuento de Partculas
USP que corresponda al volumen de prueba del producto, de acuerdo con el mtodo descrito a continuacin. Los resultados
obtenidos de Ja Preparacin estndar deben caer dentro de las especificaciones establecidas del Estndar de Referencia.

Mtodo

Las muestras de producto se analizan de Ja manera que represente Ja entrega lo ms adecuadamente posible (p.ej., el conte-
nido descargado de una jeringa). Para productos parenterales con un volumen suficiente (es decir, un volumen lo suficiente-
mente grande para facilitar el anlisis), el anlisis de unidades individuales tiene a menudo un carcter diagnstico. Para pro-
ductos parenterales que no cuentan con un volumen suficiente, mezclar con cuidado y de manera minuciosa cada unidad,
luego combinar el contenido de un nmero adecuado de unidades en un recipiente distinto para obtener el volumen requeri-
do para una sola prueba (por lo general, 0,2-5,0 mL). Si se lleva a cabo una dilucin, asegurar que el recipiente del blanco
tenga un volumen suficiente para el producto y los diluyentes y que se introduzca el menor nmero de partculas posible du-
rante el proceso. Abrir cada unidad con cuidado, retirar el cierre sellante y evitar la contaminacin del contenido antes del
muestreo, de Ja dilucin o, si fuera necesario, de la combinacin.
Cuando se especifique un disolvente del producto, p.ej., para slidos liofilizados o polvos para uso parenteral, la reconstitu-
cin o dilucin debe realizarse con Ja cantidad apropiada de disolvente especificado. En este caso, se puede analizar el disol-
vente mismo para asegurar que no representa una fuente significativa de partculas. No se permite restar el recuento de part-
culas del disolvente al recuento total.
La eliminacin de burbujas de gas es un paso clave, en especial para productos proteinceos que atrapan gas fcilmente. Se
recomiendan dos mtodos: dejar en reposo el fluido del producto bajo presin ambiental o aplicando un vaco suave (p.ej., 75
Torr). Se pueden usar otros mtodos siempre que se demuestre su idoneidad. Se debe evitar el uso de ultrasonido.
Una vez que las muestras han sido desgasificadas, se deben volver a mezclar suavemente para suspender todas las partculas,
mezclando suavemente, pero de manera minuciosa, el contenido de Ja muestra usando medios adecuados, tal como Ja agita-
cin manual del envase por rotacin suave y lenta. No es recomendable mezclar el fluido del producto mediante inversin en
ningn momento.
Inmediatamente despus de mezclar, retirar no menos de cuatro alcuotas, cada una con un volumen apropiado para la ca-
pacidad del instrumento (por lo general, 0,2-5,0 mL). Contar el nmero de partculas que estn por encima del intervalo de
tamao seleccionado, incluyendo las partculas con tamaos iguales o mayores de 1O y 25 m. No tomar en cuenta el resulta-
do obtenido para Ja primera alcuota y calcular el nmero promedio de partculas en cada intervalo de tamao para las alcuo-
tas remanentes de Ja preparacin en anlisis. Asimismo, se puede aplicar un volumen de tara para controlar el muestreo que
debe ser representativo del intervalo dinmico del sensor y del volumen de la aguja.

Consideraciones Generales

Se permite diluir siempre que se demuestre que el diluyente y los mtodos son apropiados y que se utilice el menor nivel de
dilucin que permita un anlisis reproducible. En ciertas circunstancias, puede ser necesario diluir las muestras para obtener
resultados confiables. ste puede ser el caso de productos con altas concentraciones y/o productos de alta viscosidad que no
se puedan retirar para su transferencia apropiada al instrumento; productos que ocasionen Ja saturacin del sensor del instru-
mento debido a recuentos elevados, en especial para los intervalos de tamao menores de 1O m; y en casos en los que la alta
concentracin resulte en diferencias muy pequeas en el ndice de refraccin entre la solucin y Jos agregados proteicos, entre
otros. En situaciones en las que se lleve a cabo Ja dilucin de Ja muestra, se debe demostrar que la dilucin y la aptitud del
esquema de dilucin seleccionado, incluida la seleccin del diluyente, estn justificadas. La aptitud del esquema de dilucin y
del diluyente se puede evaluar demostrando la uniformidad de los resultados a lo largo de un intervalo de dilucin. Se deben
 652 (787) Partculas Subvisibles en Inyectables / Pruebas Fsicas USP 39

considerar estudios que relacionen el recuento de partculas con y sin dilucin en los intervalos de tamao esperados. Asimis-
mo, se deberan realizar estudios que exploren el impacto de la dilucin sobre la reduccin del nmero de agregados o el in-
cremento de las partculas debidas a los cambios en la proporcin de protena con respecto a los excipientes. Se puede verifi-
car el impacto de la dilucin usando una tcnica ortogonal para justificar la aptitud del mtodo.

Evaluacin

Los valores siguientes se derivan histricamente de los captulos generales (788) y (789). Si las especificaciones son distintas
a las establecidas a continuacin, se indicarn en las monografas individuales siempre que estuvieran disponibles.
Para productos parenterales que son inyectables de protenas teraputicas para infusin o inyeccin provistos en envases con
un contenido nominal menor o igual a 100 mL:
El nmero promedio de partculas con un tamao igual o mayor de 1O m presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 6000 por envase,
y las de tamao igual o mayor de 25 m no debe exceder de 600.

Para inyectables de protenas teraputicas provistos en envases con un contenido nominal de ms de 100 mL, y preparacio-
nes o inyectables para infusin parenteral con un contenido nominal de ms de 100 mL:
El nmero promedio de partculas con un tamao igual o mayor de 1O m presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 25/ml, y las de
tamao igual o mayor de 25 m no debe exceder de 3/ml. Asimismo, la carga total de partculas con un tamao igual o mayor de 1O m no debe
exceder de 6000 por envase y las de tamao igual o mayor de 25 m no debe exceder de 600 por envase.

Los productos que se usan con un filtro final durante su administracin (en lnea) estn exentos de estos requisitos, siempre
que se cuente con datos cientficos para justificar la exencin. No obstante, se espera que los filtrados cumplan con este cap-
tulo. Para productos que se proveen en <100 mL o que se reconstituyen primero en <100 mL y luego se diluyen para infusin
en un volumen > 1 00 mL, se debe evaluar el contenido de partculas antes y despus de la dilucin, y evaluarse segn su volu-
men final.

PRUEBA DE RECUENTO MICROSCPICO DE PARTCULAS

Como se indic anteriormente, el mtodo de obstruccin de luz es el mtodo preferido para inyectables de protenas tera-
puticas e infusiones parenterales. No obstante, se puede usar el mtodo microscpico cuando resulte necesario, como en el
caso de la determinacin exclusiva de partculas de tipo extrnseco e intrnseco. Sin embargo, al utilizar este mtodo, se debe
demostrar que tambin se estn contando otras clases de partculas (p.ej., inherentes). Para la determinacin de la aceptabili-
dad del producto, aplicar los lmites para la prueba microscpica con membrana del captulo general (788). Debido a la inter-
ferencia de algunas partculas de protenas y de sus caractersticas fsicas (frgiles o translcidas), los resultados de la Prueba de
Conteo Microscpico de Partculas no son equivalentes a los de la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz, y dichos
mtodos no pueden considerarse intercambiables.

(788) PARTCULAS EN INYECTABLES

Cambio en '" redactin:

Este captulo general est armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armonizado. Las partes del tex-
to de este captulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, estn indicadas
con smbolos (.. ) para especificar este hecho.
Las partculas en inyectables e infusiones parenterales consisten en partculas no disueltas mviles extraas, que no son bur-
bujas gaseosas, accidentalmente presentes en las soluciones.
Segn se indica en Medicamentos Inyectables y en Implantes {1 >
(AFo 1.rmiy-m16l, las soluciones para inyeccin que se adminis-
tran por va intramuscular o subcutnea deben cumplir con los requisitos de Partculas en Inyectables (788). Este requisito ha
sido pospuesto indefinidamente para productos de uso veterinario. Las preparaciones parenterales envasadas y etiquetadas ex-
clusivamente para usar como soluciones de irrigacin estn exentas de los requisitos de Partculas en Inyectables (788). Las pre-
paraciones radiofarmacuticas estn exentas de los requisitos de Partculas en Inyectables (788). Los productos parenterales cu-
yo etiquetado especifica el uso de un filtro final antes de la administracin estn exentos de los requisitos de Partculas en Inyec-
tables (788), siempre que se disponga de datos cientficos que justifiquen dicha exencin .
Para la determinacin de las partculas, se especifican a continuacin dos procedimientos, el Mtodo 1 (Prueba de Conteo de
Partculas por Obstruccin de Luz) y el Mtodo 2 (Prueba de Conteo Microscpico de Partculas). Cuando se examinan inyecciones
e infusiones parenterales para detectar la presencia de partculas subvisibles, es preferible aplicar el Mtodo 1. Sin embargo,
USP 39 Pruebas Fsicas/ (788) Partculas en Inyectables 653

puede ser necesario analizar algunas preparaciones mediante la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz seguida
de la Prueba de Conteo Microscpico de Partculas para determinar en forma concluyente si cumple con los requisitos.
No todas las preparaciones parenterales se pueden examinar con uno de estos mtodos o con ambos para detectar la pre-
sencia de partculas subvisibles. Cuando el Mtodo 1 no es aplicable, p.ej., en el caso de preparaciones que presenten una
transparencia reducida o una viscosidad aumentada, se debe llevar a cabo la prueba segn el Mtodo 2. Las emulsiones, coloi-
des y preparaciones liposomales son algunos ejemplos. De la misma manera, los productos que producen burbujas de aire u
otro gas cuando se aspiran dentro del sensor tambin pueden requerir un anlisis de conteo microscpico de partculas. Si la
viscosidad de la preparacin a analizar es lo suficientemente alta como para impedir el anlisis por cualquiera de los dos mto-
dos, se puede realizar una dilucin cuantitativa con un diluyente adecuado para reducir su viscosidad, segn sea necesario, y
as permitir la realizacin del anlisis.
Los resultados obtenidos al analizar una unidad discreta o un grupo de unidades para detectar la presencia de partculas no
pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo tanto, si se desean realizar inferencias vli-
das a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partculas en un grupo grande de unidades, se deben desarro-
llar planes de muestreo estadsticamente confiables.
A los fines de este captulo, preparacin parenteral de pequeo volumen es sinnimo de inyeccin de pequeo volumen, y
preparacin parenteral de gran volumen es sinnimo de inyeccin de gran volumen .

MTODO 1 PRUEBA DE CONTEO DE PARTCULAS POR OBSTRUCCIN DE LUZ

Usar un aparato adecuado basado en el principio de bloqueo de la luz que permita una determinacin automtica del tama-
o de las partculas y el nmero de partculas segn el tamao. La definicin de agua exenta de partculas se proporciona en
Especificaciones de Reactivos-Reactivos, Indicadores y Soluciones.
Calibrar el aparato usando dispersiones que contengan partculas esfricas de tamaos conocidos entre 1 O m y 25 m. Dis-
persar el estndar de partculas en agua exenta de partculas. Se deben tomar las precauciones necesarias para evitar el agrega-
do de partculas durante la dispersin. La aptitud del sistema puede verificarse usando el ER Partculas para Conteo USP .

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partculas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y equipo de filtracin usados, excepto los filtros de membrana, con una
solucin de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente. Inmedia-
tamente antes de usar, enjuagar el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y luego por adentro, con agua exenta de part-
culas.
Procurar no introducir burbujas de aire en la preparacin a analizar, especialmente cuando se transfieren porciones de la
preparacin al recipiente en el cual se llevar a cabo la determinacin.
Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio se ha limpiado correctamente y que el
agua a usar se encuentra exenta de partculas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presencia de partculas en cinco
muestras de agua exenta de partculas de 5 mL cada una, segn el mtodo que se describe ms adelante. Si el nmero de
partculas con un tamao igual o mayor de 1O m excede de 25 para la muestra combinada de 25 mL, las precauciones toma-
das para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas preparatorias hasta que el ambiente, material de vidrio y
agua sean adecuados para la prueba.

Mtodo

Mezclar el contenido de la muestra invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidadosa-
mente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partculas y quitar el cierre, evitando la contaminacin del contenido. Eliminar las burbujas gaseosas mediante las medidas
apropiadas tales como dejar en reposo durante 2 minutos o someter a ultrasonido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pe-
queo volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1 O o ms unidades en un recipiente limpio para obtener un
volumen de no menos de 25 mL; la solucin de prueba puede prepararse mezclando el contenido de un nmero adecuado de
viales y diluyndolo hasta 25 mL con agua exenta de partculas o con un disolvente exento de partculas adecuado cuando el
agua exenta de partculas no es adecuada. Las preparaciones parenterales de pequeo volumen con un volumen de 25 mL o
ms pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partculas o con un disolvente exento de partculas apropiado
cuando el agua exenta de partculas no es adecuada.
En el caso de envases a granel para farmacias para uso parenteral etiquetados con la leyenda "No Destinado para Infusin
Directa", proceder segn se indica para preparaciones parenterales de pequeo volumen cuando el volumen sea 25 mL o ms.
Calcular el resultado de la prueba en una porcin que sea equivalente a la dosis mxima provista en el etiquetado. Por ejem-
654 (788) Partculas en Inyectables / Pruebas Fsicas USP 39

plo, si el volumen total del envase a granel es 100 ml y el volumen de dosis mxima es 1O ml, entonces el conteo promedio
de partculas por ml se multiplicara por 1O para obtener el resultado de prueba basndose en la dosis mxima de 1O ml.
[NOTA-Para los clculos de los resultados de la prueba, considerar esta porcin de dosis mxima equivalente al contenido de
un envase lleno.]
los productos envasados con compartimentos duales diseados para contener un producto farmacutico y un disolvente
deben ser preparados y analizados segn se indica para preparaciones parenterales de gran volumen o preparaciones parente-
rales de pequeo volumen, dependiendo del volumen del envase. Mezclar cada unidad segn se indica en el etiquetado, acti-
vando y agitando para asegurar el mezclado minucioso de los componentes individuales y la disolucin del medicamento .
El nmero de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluacin estadsticamente vlida. Para prepa-
raciones parenterales de gran volumen o de pequeo volumen con un volumen de 25 ml o ms, se pueden analizar menos de
1 O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Tomar cuatro porciones, de no menos de 5 ml cada una, y contar el nmero de partculas iguales o mayores de 1O m y 25
m. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porcin y calcular el nmero medio de partculas para la prepa-
racin a examinar.

Evaluacin
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de ms de 100 ml, aplicar los criterios de la Prueba
1.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 ml, aplicar los criterios de la Prueba
1.8.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 ml, aplicar los criterios de la Prueba 1.8.
[NOTA-la Farmacopea Japonesa usa la Prueba 1.A..]
Si el nmero promedio de partculas excede los lmites, analizar la preparacin mediante la Prueba de Conteo Microscpico de
Partculas.
Prueba 1.A (Soluciones para infusin parenteral o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de ms de 100 mL)-la preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presentes en las unidades anali-
zadas no excede de 25 partculas iguales o mayores de 1O m por ml y no excede de 3 partculas iguales o mayores de 25 m
por ml.
Prueba 1.B (Soluciones para infusin parenteral o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de menos de 100 mL)-la preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presentes en las unidades
analizadas no excede de 6000 partculas iguales o mayores de 1O m por envase y no excede de 600 partculas iguales o ma-
yores de 25 m por envase.

MTODO 2 PRUEBA DE CONTEO MICROSCPICO DE PARTCULAS

Usar un microscopio binocular adecuado, un dispositivo de filtracin para retener partculas y un filtro de membrana para el
anlisis.
Ajustar el microscopio con aumentos de 100 1Ox y equiparlo con un micrmetro ocular calibrado con un micrmetro ob-
jetivo, una platina mecnica capaz de sostener y recorrer toda la superficie de filtracin del filtro de membrana y dos ilumina-
dores adecuados para proporcionar iluminacin episcpica adems de la iluminacin oblicua.
El micrmetro ocular es una retcula circular para la medicin del dimetro de partculas (ver la Figura 1) y consiste en un
crculo grande que tiene filamentos sealadores que lo dividen en cuadrantes, crculos de referencia transparentes y de color
negro, con dimetros de 1O m y 25 m en aumentos de 1OOx, y una escala lineal con graduaciones en incrementos de 1O
m. Calibrar empleando un micrmetro de platina, certificado por una institucin de normalizacin nacional o internacional.
Un error relativo de la escala lineal de la retcula dentro de 2% es aceptable. El crculo grande se denomina campo reticular
(GFOV, por sus siglas en ingls).
Se requieren dos iluminadores. Uno es un iluminador episcpico interno de campo brillante, el otro es un auxiliar externo de
foco regulable para dar iluminacin oblicua reflejada en un ngulo de incidencia de 10-20.
El dispositivo de filtracin para retener las partculas consiste en un soporte de filtro, de vidrio u otro material adecuado,
provisto de una fuente de vaco y un filtro de membrana adecuado.
El filtro de membrana tiene un tamao adecuado, de color negro o gris oscuro, reticulado o no y con un tamao nominal
de poro de 1,0 m o menor.
USP 39 Pruebas Fsicas / (788) Partculas en Inyectables 655

Oe

- - Crculo GFOV

O O Cruce de filamentos
_ - sealadores

9 1 - - - - - - - - + " ' " ' - - - - - - l 9_ Crculo de

i i ~m~

O O

Escala lineal
Oe /

11111[1111111111111111111[1111111111111111111111111111111n11111111111111111111111111111111111111111
o ~ w ~ ~ w w ro oo m ~

Fig. 1. Retcula circular para la medicin del dimetro de partculas. El crculo grande que est dividido por filamentos en
cuadrantes se denomina campo reticular (GFOV, por sus siglas en ingls). Los crculos transparentes y de color negro, con di-
metros de 1 O m y 25 m en 1OOx, se proporcionan como elementos de comparacin para clasificar las partculas por tama-
o.

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partculas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y de ensamblaje para filtracin usados, excepto los filtros de membrana,
con una solucin de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente.
Inmediatamente antes de usar, enjuagar ambos lados del filtro de membrana y el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y
luego por adentro, con agua exenta de partculas.
Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio y el filtro de membrana se han limpiado
correctamente y que el agua a usar se encuentra exenta de partculas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presen-
cia de partculas en 50 mL de agua exenta de partculas, segn el mtodo que se describe ms adelante. Si ms de 20 partculas
con un tamao igual o mayor de 1O m o si ms de cinco partculas con un tamao igual o mayor de 25 m estn presentes
dentro del rea de filtracin, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas prepara-
torias hasta que el ambiente, material de vidrio, filtro de membrana y agua sean adecuados para la prueba.

Mtodo

Mezclar el contenido de las muestras invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidado-
samente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partculas y quitar el cierre, evitando la contaminacin del contenido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pe-
queo volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1O o ms unidades en un recipiente limpio; la solucin de
prueba puede prepararse mezclando el contenido de un nmero adecuado de viales y diluyndolo hasta 25 mL con agua exen-
ta de partculas o con un disolvente exento de partculas apropiado cuando el agua exenta de partculas no es adecuada. Las
preparaciones parenterales de pequeo volumen con un volumen de 25 mL o ms pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partculas o con un disolvente exento de partculas adecuado
cuando el agua exenta de partculas no es adecuada.
El nmero de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluacin estadsticamente vlida. Para prepa-
raciones parenterales de gran volumen o de pequeo volumen con un volumen de 25 mL o ms, se pueden analizar menos de
1O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Humedecer con varios mL de agua exenta de partculas el interior del soporte de filtro provisto con el filtro de membrana.
Transferir al embudo de filtracin el volumen total de una solucin combinada o una unidad individual y aplicar vaco. Si fuera
necesario, agregar gradualmente porciones de la solucin hasta filtrar todo el volumen. Despus de la ltima adicin de solu-
cin, empezar a enjuagar las paredes internas del soporte de filtro empleando un chorro de agua exenta de partculas. Mante-
ner el vaco hasta que la superficie del filtro de membrana se encuentre exenta de lquidos. Colocar el filtro de membrana en
una placa de Petri y dejarlo secar al aire con la tapa ligeramente abierta. Despus de que el filtro de membrana se haya secado,
colocar la placa de Petri en la platina del microscopio, recorrer todo el filtro de membrana bajo la luz reflejada por un dispositi-
vo de iluminacin y contar el nmero de partculas mayores o iguales a 1O m y el nmero de partculas mayores o iguales a
656 (788) Partculas en Inyectables / Pruebas Fsicas USP 39

25 m. Como alternativa, se permite el conteo parcial del filtro de membrana y la determinacin del conteo total del filtro por
clculos. Calcular el nmero medio de partculas para la preparacin que se va a analizar.
El proceso de medicin del tamao de partculas usando la retcula circular se lleva a cabo estimando el dimetro equivalen-
te de la partcula en comparacin con los crculos de referencia de 1O m y 25 m de la retcula. De esta forma, no se mueven
las partculas de sus lugares originales dentro del campo reticular y no se superponen en los crculos de referencia para la com-
paracin. El dimetro interno de los crculos de referencia transparentes de la retcula se usa para medir las partculas blancas y
transparentes, mientras que el dimetro externo de los crculos de referencia negro opaco de la retcula se usa para medir el
tamao de las partculas oscuras.
Cuando se realiza la Prueba de Conteo Microscpico de Partculas, no se debe intentar la medicin o el conteo de materiales
amorfos, semilquidos, o morfolgicamente indiferenciados y que tengan la apariencia de una mancha o decoloracin en el
filtro de membrana. Estos materiales muestran poco o ningn relieve y presentan un aspecto gelatinoso o similar al de una
pelcula. En tales casos, puede facilitarse la interpretacin del conteo analizando una muestra de la solucin mediante la Prueba
de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz.

Evaluacin

Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de ms de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.8.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 2.8.
[NOTA-La Farmacopea japonesa usa la Prueba 2.A.]
Prueba 2.A (Soluciones para infusin parenteral o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de ms de 700 ml)-La preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presente en las unidades anali-
zadas no excede de 12 partculas iguales o mayores de 1 O m por mL y no excede de 2 partculas iguales o mayores de 25 m
por ml.
Prueba 2.8 (Soluciones para infusin parentera/ o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de menos de 700 ml)-La preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presente en las unidades
analizadas no excede de 3000 partculas iguales o mayores de 1O m por envase y no excede de 300 partculas iguales o ma-
yores de 25 m por envase.

(789) PARTCULAS EN SOLUCIONES OFTLMICAS

Las partculas estn formadas por sustancias extraas, mviles, de diversos orgenes, que no son burbujas de gas, que no
pueden cuantificarse por medio de un anlisis qumico debido a la pequea cantidad de material que representan y debido a
su composicin heterognea. Las soluciones oftlmicas deben estar esencialmente exentas de partculas que se puedan obser-
var en una inspeccin visual. Las pruebas aqu descritas son pruebas fsicas desarrolladas con el propsito de contar las partcu-
las extraas dentro de intervalos especficos de tamao.
Cada solucin oftlmica est sujeta a los lmites de partculas establecidos para la prueba que se est aplicando, a menos que
se especifique algo diferente en la monografa individual. Cuando sean adecuados lmites ms altos, stos estarn especificados
en la monografa individual. Las preparaciones oftlmicas que sean suspensiones, emulsiones o geles estn exentas de estos
requisitos, al igual que lo estn los dispositivos mdicos. Consultar la monografa especfica cuando surja alguna duda sobre la
aplicacin de la prueba.
Los procedimientos de obstruccin de luz y microscpico para la determinacin de partculas en soluciones oftlmicas son
idnticos a los de las inyecciones; por lo tanto, cuando corresponda, habr una referencia cruzada con Partculas en Inyectables
(788). Este captulo describe un mtodo de prueba consistente en dos etapas. En primer lugar, la solucin oftlmica se analiza
por medio del procedimiento de obstruccin la luz (etapa 1). Si no cumple con los lmites establecidos, se debe pasar a la
prueba microscpica (etapa 2) con sus lmites propios. Cuando por razones tcnicas la solucin oftlmica no pueda ser analiza-
da por obstruccin de luz, se podr utilizar la prueba microscpica exclusivamente. Se requiere documentacin que demuestre
que no se puede analizar la solucin oftlmica por el procedimiento de obstruccin de luz, o que ste produce resultados inv-
lidos.
Se espera que la mayora de los artculos cumplan con los requisitos usando simplemente la prueba de obstruccin de luz;
sin embargo podra ser necesario someter algunos artculos a la prueba de obstruccin de luz seguida de la prueba microscpi-
ca para determinar en forma concluyente si se cumple con los requisitos. Todo producto que no sea una solucin pura y que
tenga una transparencia y viscosidad que se aproximen a las del agua puede proporcionar datos errneos cuando se lo analiza
con el mtodo de conteo por obstruccin de luz. Estos materiales pueden analizarse por medio del mtodo de conteo micros-
cpico. En ciertos casos, la viscosidad de un material a analizar puede ser lo suficientemente alta como para impedir el anlisis
USP 39 Pruebas Fsicas/ (789) Partculas en Soluciones Oftlmicas 657

por cualquiera de los dos mtodos de prueba. En este caso, se puede realizar una dilucin cuantitativa con un diluyente ade-
cuado para reducir la viscosidad lo necesario y permitir la realizacin del anlisis.
En las pruebas descritas a continuacin, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o un grupo de unidades
para detectar la presencia de partculas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo
tanto, si se desean realizar inferencias vlidas a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partculas en un gru-
po grande de unidades, se deben desarrollar planes de muestreo estadsticamente confiables basados en factores de operacin
conocidos. Los planes de muestreo deben basarse en el volumen de producto, el nmero de partculas encontrado histrica-
mente en comparacin con los lmites, la distribucin de tamaos de partculas presentes y la variabilidad del conteo de part-
culas entre unidades.

PRUEBA DE CONTEO DE PARTCULAS POR OBSTRUCCIN DE LUZ

Esta prueba se aplica a las soluciones oftlmicas, incluidas las soluciones que han sido reconstituidas a partir de slidos estri-
les, para los cuales se especifica una prueba de deteccin de Partculas en la monografa individual. La prueba cuenta las part-
culas slidas o lquidas en suspensin.

Aparato de Prueba, Normalizacin del Instrumento, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba

y Clculos
Proceder como se indica en la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz en Partculas en Inyectables (788).

Interpretacin

La solucin oftlmica cumple con los requisitos de la prueba si el nmero promedio de partculas presente en las unidades
analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 1. Si el nmero promedio de partculas excede del lmite,
analizar el artculo mediante la Prueba de Conteo de Partculas Microscpicas ..
Ta bl a 1 Prueb a d e Con t eo de Part1cu
' 1as por Obstrucc I'on de Luz
Dimetro
:2'.10m 1 :2'.50m
Nmero de partculas 50 por mL 1 2/ml

PRUEBA DE CONTEO MICROSCPICO DE PARTCULAS

Algunos artculos no pueden analizarse en forma satisfactoria con el mtodo de obstruccin de luz. En dichos casos, las mo-
nografas individuales especifican claramente que slo se debe realizar un recuento microscpico de partculas. La prueba de
recuento de partculas microscpicas enumera partculas subvisibles, esencialmente slidas, en soluciones oftlmicas, luego de
recogerlas sobre un filtro de membrana microporosa. Algunas soluciones oftlmicas, tales como soluciones que no se filtran
fcilmente debido a su alta viscosidad, pueden quedar exentas de anlisis utilizando la prueba microscpica.
Cuando se realiza la prueba microscpica, no se debe intentar la medicin o el conteo de materiales amorfos, semilquidos o
morfolgicamente indiferenciados de algn otro modo y que tengan la apariencia de una mancha o coloracin en la superficie
de la membrana. Estos materiales muestran poco o ningn relieve en la superficie y presentan un aspecto gelatinoso o similar
al de una pelcula. Debido a que este material en solucin consiste en unidades en el orden de 1 m o menores, que se pue-
den contar slo despus de la agregacin o deformacin en una membrana analtica, puede facilitarse la interpretacin del
recuento analizando una muestra de la solucin por medio del mtodo de recuento de partculas por obstruccin de luz.

Aparato de Prueba, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba y Enumeracin de Partculas

Proceder segn se indica para la Prueba de Conteo de Partculas Microscpicas en Partculas en Inyectables (788).

1nterpretacin

La solucin oftlmica cumple con los requisitos de la prueba si el nmero promedio de partculas presente en las unidades
analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 2.
Tabla 2. Conteo de Partculas por Mtodo Microscpico
Dimetro
:2'.10m 1 :2'.25 m 1 :2'.50m
Nmero de partculas 50 por ml 1 5 por ml 1 2 por ml
658 (790) Partculas Visibles en Inyectables/ Pruebas Fsicas USP 39

(790) PARTCULAS VISIBLES EN INYECTABLES

Cambio en la redaccin:

INTRODUC(IN._usm
Todos los productos destinados para administracin parenteral deben inspeccionarse visualmente para determinar la presen-
cia de partculas conforme a lo especificado en el captulo Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 ). (AF Ol-may.2016) Los sli-
dos secos, a partir de los cuales se preparan las soluciones reconstituidas para inyeccin, cumplen con los requisitos para
Totalidad y transparencia de soluciones (AF 01 _may- 2016) en Medicamentos Inyectables y en Implantes (1) (AF ol-may.2016i cuando se
preparan justo antes de su uso. A lo largo de este captulo, el trmino esencialmente libre de significa que, cuando los medica-
mentos inyectables se inspeccionan conforme a lo descrito en este captulo, no se observan partculas visibles en un nmero de
unidades mayor al especificado. Las partculas se definen en el captulo Partculas en Inyectables (788) como partculas extraas
mviles no disueltas, que no son burbujas de gases, involuntariamente presentes en las soluciones. Ver Partculas Subvisibles
en Inyectables de Protenas Teraputicas (787) para informacin adicional sobre partculas inherentes, intrnsecas y extrnse-
cas .._usP39 Entre los ejemplos de dichas partculas se incluye, entre otros, fibras, vidrio, metal, materiales elastomricos y precipi-
tados. No obstante, algunos productos "'USP39 pueden contener partculas inherentes o aglomerados; en tales casos, los requi-
sitos para "'estas especficas._usm partculas visibles se especifican en la monografa individual o en la solicitud reglamentaria
aprobada pero son aplicables los criterios de control y aceptacin para partculas extraas que se describen en este captu-
'usP39
Cuando las caractersticas del contenido o del sistema de envase-cierre limita la capacidad de inspeccin del contenido to-
tal, se debe inspeccionar una muestra de los envases de la partida como complemento de la inspeccin al 100%, mediante la
inspeccin del contenido reconstituido o retirado de los envases (polvos secos, envases mbar oscuros, suspensiones, o lqui-
dos con colores intensos) de una muestra de los envases de la partida. Las caractersticas destructivas de estas pruebas requiere
el uso de una muestra ms pequea 1 que el muestreo aceptable tradicionalmente utilizado en pruebas no destructivas luego
de la inspeccin al 100%. Aunque las pruebas descritas en este captulo pueden ser tiles durante la realizacin de estudios
para examinar la estabilidad del producto, este captulo no pretende establecer requisitos nuevos de anlisis para estudios de
estabilidad.

PROCEDIMIENTO DE INSPECCIN

Cuando se usa junto con una inspeccin al 100% durante el proceso de fabricacin, este procedimiento resulta suficiente
para demostrar que la partida est esencialmente exenta de partculas visibles. No obstante, un programa completo para el
control y monitoreo de partculas contina siendo un prerrequisito esencial.
Las unidades inspeccionadas deben estar exentas de partculas visibles cuando se examinan sin aumento (excepto la correc-
cin ptica, segn se requiera para establecer una visin normal) contra un fondo negro y contra un fondo blanco. La ilumina-
cin en el punto de inspeccin se mantiene a una intensidad mnima de entre 2000 y 3750 lux, lo cual se puede lograr me-
diante el uso de dos lmparas fluorescentes de 13 W 15 W (p.ej., Fl 3/T5 Fl 5/T8). Se recomienda el uso de un balastro de
alta frecuencia para reducir el parpadeo de las lmparas fluorescentes. Asimismo, son aceptables las fuentes de luz alternativas
(p.ej., incandescentes, diodo emisor de luz o LED, por sus siglas en ingls) que proveen iluminacin en el punto de inspeccin
dentro del intervalo de intensidad mnimo especificado. Se recomienda una intensidad de iluminacin mayor para examinar
soluciones coloreadas o productos en envases de materiales diferentes al vidrio transparente.
Antes de realizar la inspeccin, retirar cualquier etiqueta adherida al envase, y lavar y secar el exterior del mismo. La unidad
que se va a inspeccionar debe agitarse por rotacin suave y/o invertirse, asegurando que no se produzcan burbujas de aire, e
inspeccionarse durante aproximadamente 5 segundos contra cada fondo. Se debe registrar la presencia de cualquier partcula.

MUESTREO PARA LA LIBERACIN DE PARTIDAS (A CONJINUACIN DE LA INSPECCIN AL 100%

DE LA FABRICACION)

Muestrear e inspeccionar la partida usando las normas ANSl/ASQ Zl .4 ( ISO 2859-1 ). Inspeccin General de Nivel 11, planes
de muestreo individual para inspeccin normal con un lmite de calidad de aceptacin (AQL, por sus siglas en ingls) de
0,65%. Resultan aceptables los planes de muestreo alternativos con una proteccin equivalente o mejor. No ms que el nme-
ro de unidades especificadas contiene partculas visibles.

1 Los planes de muestreo con niveles especiales descritos en las normas ANSl/ASQ Z1 .4-2008 o ISO 2859 son apropiados para su uso como guas en la seleccin
del tamao de la muestra y de los criterios de aceptacin para este propsito.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (791) pH 659

PRODUCTO EN DISTRIBUCIN 2

Si fuese necesario evaluar el producto que se ha enviado a los clientes (p.ej., debido a una queja o inters reglamentario),
muestrear e inspeccionar 20 unidades. Si no se observan partculas en la muestra, la partida se considera esencialmente libre
de partculas visibles. Si se encuentran disponibles, pueden examinarse unidades adicionales para obtener mayor informacin
sobre el riesgo de presencia de partculas en la partida.

(791) pH

INTRODUCCIN
Para propsitos farmacopeicos, el pH se define como el valor dado por un sensor potenciomtrico adecuado, apropiada-
mente estandarizado, y un sistema de medicin. [NOTA-El sistema de medicin comnmente recibe el nombre de "medidor
de pH". Aunque el medidor de pH an es de uso comn, el sistema de medicin tambin puede incluirse dentro del sensor de
pH y la seal de pH se puede transmitir de manera digital a un dispositivo externo tal como una computadora, Controlador
Lgico Programable (PLC, por sus siglas en ingls), Sistema de Control Distribuido (DCS, por sus siglas en ingls), sistema de
adquisicin de datos, terminal u otro dispositivo controlado por microprocesador.] Por definicin, el pH es igual a -log 10 [aH+]
donde aH+ es la actividad del hidrgeno (H+) o del in hidronio (Hp+) y la actividad de iones de hidrgeno se aproxima de
manera muy cercana a la concentracin de iones de hidrgeno.
La escala prctica del pH se define de la manera siguiente:

pH = pH, +[(E - Es)!k]

E= potencial medido cuando la celda galvnica contiene la solucin en anlisis (pH)

Es= potencial medido cuando la celda galvnica contiene la solucin amortiguadora de normalizacin apropiada (pH,)
k =cambio en el potencial por cambio de unidad en el pH y se deriva de la ecuacin de Nernst (segn se indica a conti-
nuacin)
k = loge(l O) x (RT/nF)

R = 8, 314 j/mol/K
T =temperatura (K)
n = moles por reaccin media
F = constante de Faraday, 96485 C/mol
La ecuacin resultante es [0,05916 + 0,0001984(T - 25)] voltios a la temperatura T. Los valores de k de 15-35 se proveen
en la Tabla 7.
Tabla 1. Valores de k para Diversas Temperaturas
Temperatura k
(C} (V)
15,00 0,05718
20,00 0,05817
25,00 0,05916
30,00 0,06016
35,00 0,06115

Los valores de k a otras temperaturas pueden determinarse a partir de la ecuacin anterior. Para propsitos prcticos, los
valores de k se determinan a partir de la calibracin del sensor de pH.

SISTEMA DE MEDICIN DE PH

El sistema de medicin consta de: (1) un electrodo de medicin sensible a la actividad de los iones hidrgeno, por lo regular
un electrodo de vidrio, aunque son posibles otros tipos de electrodos, (2) un electrodo de referencia adecuado, por ejemplo,
un electrodo de plata-cloruro de plata y (3) un sistema de medicin de voltaje con una resistencia de entrada capaz de medir
a una impedancia de entrada alta del sensor de pH. El electrodo de medicin y de referencia pueden estar separados o combi-
nados. El sistema de medicin de voltaje puede estar separado del sensor de pH o integrado en el sensor. Para la mayora de
las aplicaciones, ser necesaria una medicin de la temperatura para compensar la influencia de la temperatura descrita ante-

2 El anlisis descrito en Producto en Distribucin es permisible nicamente si el Muestreo paro la Liberacin de Partidas (A Continuacin de la Inspeccin al 700% de la
Fabricacin) se ha realizado exitosamente.
660 (791) pH / Pruebas Fsicas USP 39

riormente en la ecuacin de Nernst. Se puede incluir un dispositivo de temperatura en el sensor de pH, o se puede usar un
dispositivo de temperatura externo.

REQUISITOS INSTRUMENTALES
El sistema de medicin debe ser capaz de llevar a cabo una calibracin del pH de 2 puntos (ver ms adelante). La exactitud
del sistema de medicin de pH se describe en la seccin Calibracin. La resolucin del sistema de medicin de pH debe ser al
menos un pH de 0,01. El instrumento deber ser capaz de compensar la temperatura en la medicin del sensor de pH para
convertir la seal de milivoltios en unidades de pH a cualquier temperatura, ya sea de forma automtica usando un dispositivo
de temperatura incorporado en el sistema del sensor o mediante el ingreso manual de la temperatura de la muestra en el siste-
ma de medicin. La exactitud del sistema de medicin de la temperatura deber ser 1 C. La resolucin del sistema de medi-
cin de la temperatura deber ser de al menos O, 1 C. Las mediciones de pH realizadas en laboratorio por lo regular se realizan
a 25 2 C a menos que se especifique de otro modo en la monografa individual o en este captulo. No obstante, resultan
aceptables temperaturas fuera de este rango si la preparacin de las muestras es ms conveniente a temperaturas alternativas.
Los ejemplos de mediciones no realizadas en laboratorio incluyen muestras de prueba del interior de los tubos del proceso,
contenedores y tanques, as como otras condiciones de procesamiento no estndar. [NOTA-Las definiciones de pH, de la esca-
la de pH y de los valores asignados a las soluciones amortiguadoras de estandarizacin se proveen con el propsito de estable-
cer un sistema prctico y operativo, de modo que los resultados puedan compararse entre laboratorios. Los valores de pH as
medidos no se corresponden exactamente con los obtenidos por la definicin, pH = -log aH+, sino que los valores obtenidos
estn estrechamente relacionados con la actividad del in hidrgeno en soluciones acuosas.] [NOTA-Cuando un sistema de
medicin de pH se estandariza usando una solucin amortiguadora acuosa y luego se usa para medir el "pH" de sistemas no
acuosos, la constante de ionizacin del cido o de la base, la constante dielctrica del medio, el potencial de unin lquida
(que puede originar errores de aproximadamente 1 unidad de pH), as como la respuesta del in hidrgeno del electrodo de
vidrio, cambian totalmente. Por estas razones, los valores as obtenidos con soluciones que slo son de naturaleza parcialmente
acuosa se pueden considerar nicamente como valores aparentes de pH.]

SOLUCIONES AMORTIGUADORAS DE NORMALIZACIN DEL SISTEMA DE MEDICIN DE PH

Las soluciones amortiguadoras de normalizacin se preparan conforme a lo indicado en la Tabla 2. 1 Las sales amortiguadoras
de pureza requerida se pueden obtener del Instituto Nacional de Normas y Tecnologa, de otras autoridades nacionales o de
otros proveedores. Las soluciones amortiguadoras deben almacenarse en envases adecuados que aseguren la estabilidad del
pH hasta la fecha de caducidad y que estn equipados con un cierre hermtico. Para soluciones amortiguadoras con valores
superiores a 11, el almacenamiento debe realizarse en envases que sean resistentes al dixido de carbono o que minimicen su
intrusin, ya que esto podra disminuir el pH de la solucin amortiguadora. En el caso de soluciones amortiguadoras con valo-
res menores de 11, deben prepararse en intervalos que no excedan de 3 meses. Las soluciones amortiguadoras con valores
superiores a 11, comnmente deben prepararse y usarse en el momento a menos que se restrinja el ingreso de dixido de
carbono. Todas las soluciones amortiguadoras deben prepararse usando Agua Purificada. La Tabla 2 indica el pH de las solucio-
nes amortiguadores como una funcin de la temperatura. Las instrucciones presentadas en este captulo estn destinadas a la
preparacin de soluciones con concentraciones molales (m) designadas. Sin embargo, para facilitar su preparacin, las instruc-
ciones se proveen en molaridad. La diferencia entre la concentracin de preparaciones molales y molares para estas soluciones
amortiguadoras es menos del 1 % y la diferencia de pH es inapreciable. La calibracin usando soluciones amortiguadoras debe
realizarse en el intervalo de temperatura de las soluciones amortiguadoras citadas en la Tabla 2. [NOTA-La compensacin de
temperatura en la ecuacin de Nernst corrige nicamente el cambio que produce la temperatura en los milivoltios de salida
del electrodo, no el cambio real del pH de la solucin amortiguadora con la temperatura, el cual es nico para cada solucin
amortiguadora.] Se encuentran disponibles caractersticas tales como reconocimiento automtico de solucin amortiguadora o
correccin del pH-temperatura de la solucin amortiguadora que proveen la conveniencia al acomodar la influencia de la tem-
peratura sobre las soluciones amortiguadoras. La respuesta de pH-temperatura se puede determinar a partir de los valores de
la Tabla 2.

1 Se pueden usar soluciones amortiguadoras disponibles comercialmente para el sistema de medicin de pH, normalizadas mediante mtodos rastreables al Insti-
tuto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST) u otras autoridades nacionales, cuya etiqueta indique un valor de pH con una exactitud de 0,02 unidades de pH. Se
pueden usar soluciones preparadas a partir de los materiales de grado reactivo de la ACS u otros materiales adecuados, siempre y cuando el pH de la solucin
resultante sea el mismo que el de la solucin preparada a partir del material certificado del NIST (u otras autoridades nacionales). Las soluciones amortiguadoras
con valores superiores a 12 deben usarse inmediatamente o se deben preparar usando agua recientemente calentada a ebullicin y almacenarse en condiciones
que minimicen la absorcin y el ingreso de dixido de carbono.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (791) pH 661

Tabla 2. Valores de pH de Soluciones Amortiguadoras de Normalizacin

Fosfato
Dicido
de Carbona-
Potasio, to
0,0087 M de Sodio,
Tetra Tartrato y Tetra 0,025 My Hidrxido
oxalato cido de Citrato Biftalato Fosfato borato Bicarbo de
Temper- de pota- Potasio Dicido de de Fosfato cido de- nato de- Calcio,
atura slo, Saturado Potasio, Potasio, Equlmolal, Disdico, sodio, Sodio, Saturado a
(C) 0,05m a 25 0,05M 0,05 m 0,05m 0,0303 M 0,01 m 0,025 M 25
10 1,67 - - 4,00 6,92 - 9,33 - 13,00
15 1,67 - 3,80 4,00 6,90 7,45 9,28 10,12 12,81
20 1,68 - 3,79 4,00 6,88 7,43 9,23 10,06 12,63
25 1,68 3,56 3,78 4,01 6,86 7,41 9,18 10,01 12,45
30 1,68 3,55 3,77 4,02 6,85 7,40 9,14 9,97 12,29
35 1,69 3,55 3,76 4,02 6,84 7,39 9,10 9,93 12,13
40 1,69 - - 4,04 6,84 - 9,07 - 11,98
45 1,70 - - 4,05 6,83 - 9,04 - 11,84
50 1,71 - - 4,06 6,83 - 9,01 - 11,71
55 1,72 - - 4,08 6,83 - 8,99 - 11,57
60 1,72 - - 4,09 6,84 - 8,96 - 11,45
ilpH/ilC 0,0010 -0,0014 -0,0022 0,0018 -0,0016 -0,0028 -0,0074 -0,0096 -0,0310

La preparacin de volmenes alternativos a las mismas concentraciones que las indicadas ms adelante es aceptable.
Tetraoxalato de potasio, 0,05 m: Disolver 12,61 g de KH 3(CP 4 ) 2 2HP y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Tartrato cido de potasio, saturado a 25: Agregar C4 H5 K0 6 a agua hasta exceder la saturacin a 25. Posteriormente,
filtrar o decantar.
Citrato dicido de potasio, 0,05 M: Disolver 11,41 g de C6 H7 K0 4 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml.
Biftalato de potasio, 0,05 m: Disolver 1O,12 g de KHC 8 HP4, previamente secados a 11 O durante 1 hora y diluir con
agua hasta obtener 1000,0 ml.
Fosfato equimolal, 0,05 m: Disolver 3,53 g de Na 2 HP04 y 3,39 g de KH 2 P0 4 , cada uno previamente secado a 120 du-
rante 2 horas y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Fosfato dicido de potasio, 0,0087 M y fosfato cido disdico, 0,0303 M: Disolver 1, 18 g de KH 2 P0 4 y 4,30 g de
Na 2 HP04 , ambos secados durante 2 horas a 120 2, y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml.
Tetraborato de sodio, 0,01 m: Disolver 3,80 g de Na 2 B4 0 7 1OH 2 0 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml. Proteger
de la absorcin de dixido de carbono.
Carbonato de sodio, 0,025 M y bicarbonato de sodio, 0,025 M: Disolver 2,64 g de Na 2 C0 3 y 2,09 g de NaHC0 3 y
diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml.
Hidrxido de calcio, saturado a 25: Agregar Ca(OH) 2 a agua hasta exceder la saturacin a 25. Usar agua recientemente
calentada a ebullicin y protegida de la atmsfera para limitar la absorcin de dixido de carbono. Posteriormente, filtrar o
decantar.

CALIBRACIN
Debido a las variaciones en la naturaleza y la operacin de los sistemas de medicin de pH disponibles, resulta poco prctico
proveer instrucciones universales para la estandarizacin del sistema de medicin. Sin embargo, los prrafos siguientes estable-
cen los principios generales a seguir. Examinar los electrodos, especialmente el electrodo de referencia y el nivel de electrlito,
cuando se usa electrlito lquido. Si fuera necesario, volver a llenar el suministro de electrolito y tomar las dems precauciones
indicadas por los fabricantes del instrumento y el electrodo.
La calibracin o verificacin del sistema de medicin de pH debe realizarse peridicamente. El desempeo histrico del siste-
ma de medicin, la criticidad de la medicin de pH, el mantenimiento del sensor de pH y la frecuencia de la operacin de
medicin se usan para determinar la frecuencia de la calibracin/verificacin.
Si el pH de la solucin amortiguadora es sensible al dixido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se
haya calentado a ebullicin recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseado para minimizar el
ingreso de dixido de carbono.
1. Para estandarizar el sistema de medicin de pH, seleccionar tres soluciones amortiguadoras de normalizacin, de prefe-
rencia las provistas en la Tabla 2, de modo que el pH esperado del material en anlisis caiga dentro de su intervalo. Se
usan dos de las soluciones amortiguadoras para el proceso de calibracin, y la tercera solucin amortiguadora se usa para
la verificacin. El valor de la solucin amortiguadora de verificacin debe estar entre los valores de las soluciones amorti-
guadoras de calibracin. Si el intervalo operativo del sensor de pH est por encima del intervalo de pH de las soluciones
662 (791) pH / Pruebas Fsicas USP 39

amortiguadoras en la Tabla 2, entonces 1) seleccionar dos soluciones amortiguadoras de la Tabla 2 con pH cercano o 2)
seleccionar una de la Tabla 2 y otra solucin amortiguadora preparada y documentada que est fuera del intervalo.
2. Enjuagar el sensor de pH varias veces con agua y luego con la primera solucin amortiguadora.
3. Sumergir el sensor de pH en la primera solucin amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2.
4. Si la medicin de temperatura y la compensacin automtica no se incluyen en el sistema de medicin, ingresar manual-
mente en el instrumento la temperatura de la solucin amortiguadora y el valor de pH de la solucin amortiguadora a
dicha temperatura. Para las temperaturas que no se encuentren listadas en la Tabla 2, usar interpolacin lineal para deter-
minar el valor de pH como una funcin de temperatura.
5. Iniciar la secuencia de calibracin de 2 puntos con la primera solucin amortiguadora de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
6. Retirar el sensor de pH de la primera solucin amortiguadora y enjuagar los electrodos con agua y luego la segunda solu-
cin amortiguadora.
7. Sumergir el sensor de pH en la segunda solucin amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2.
8. Si la medicin de temperatura y la compensacin automtica no se incluyen en el sistema de medicin, ingresar manual-
mente en el instrumento la temperatura de la solucin amortiguadora y el valor de pH de la solucin amortiguadora a
dicha temperatura.
9. Continuar la secuencia de calibracin de 2 puntos con la segunda solucin amortiguadora de acuerdo con las instruccio-
nes del fabricante.
1O. Despus de completar el proceso de calibracin de 2 puntos, verificar que la pendiente y el desplazamiento de pH estn
dentro de los parmetros aceptables. Los parmetros tpicos aceptables son pendientes en el intervalo del 90%-105% y
un desplazamiento de 30 mV (0,5 unidades de pH a 25 C). Dependiendo del instrumental de pH, la pendiente y el
desplazamiento de pH se pueden determinar mediante software o mtodos manuales. Si estos parmetros no estn den-
tro de los parmetros aceptables, se debe limpiar el sensor adecuadamente, volver a llenar, realizar un servicio de mante-
nimiento o reemplazarlo, y se debe repetir el proceso de calibracin de 2 puntos.
11. Retirar el sensor de pH de la segunda solucin amortiguadora y enjuagar minuciosamente con agua y, posteriormente,
con la solucin amortiguadora de verificacin.
12. Sumergir el sensor de pH en la solucin amortiguadora de verificacin a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla
2.
1 3. Si la medicin de temperatura y la compensacin automtica no se incluyen en el sistema de medicin, ingresar manual-
mente en el instrumento la temperatura de la solucin amortiguadora y el valor de pH de la solucin amortiguadora a
dicha temperatura.
14. La lectura de pH deber estar dentro de 0,05 unidades de pH del valor en la Tabla 2 a la temperatura de la solucin
amortiguadora.

OPERACIN

Todas las muestras de prueba deben prepararse usando Agua Purificada, a menos que se especifique algo diferente en la
monografa. Todas las mediciones de prueba deben usar compensacin de temperatura en la ecuacin de Nernst manual o
automtica.
1. Preparar el material de prueba de acuerdo con los requisitos en la monografa o de acuerdo con procedimientos especfi-
cos. Si el pH de la muestra de prueba es sensible al dixido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se
haya calentado a ebullicin recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseado para minimi-
zar el ingreso de dixido de carbono.
2. Enjuagar el sensor de pH con agua, luego con algunas porciones del material de prueba.
3. Sumergir el sensor de pH en el material de prueba y leer el valor de pH y la temperatura.
En todas las mediciones de pH, permitir un tiempo suficiente para la estabilizacin de la temperatura y la medicin de pH.
Las funciones de diagnstico tales como la medicin de la resistencia del electrodo de vidrio o de referencia pueden estar
disponibles para determinar las deficiencias del equipo. Consultar con el proveedor del electrodo para informacin sobre he-
rramientas de diagnstico para asegurar la funcin apropiada del electrodo.
Cuando sean suficientes los valores de pH aproximados, pueden ser adecuados los indicadores y papeles de prueba (ver
Indicadores y Papeles Indicadores de Prueba, en la seccin de Reactivos, Indicadores y Soluciones).
Para informacin sobre soluciones amortiguadoras y sobre la composicin de las soluciones amortiguadoras estndar reque-
ridas en las pruebas y valoraciones farmacopeicas, ver Soluciones Amortiguadoras en la seccin Soluciones. Esta seccin referida
no tiene el propsito de reemplazar el uso de las soluciones amortiguadoras de calibracin de pH listadas en la Tabla 2.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (795) Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles 663

(795) PREPARACIN MAGISTRAL-PREPARACIONES NO ESTRILES

INTRODUCCIN
El propsito de este captulo es proporcionar a los preparadores pautas sobre la aplicacin de buenas prcticas de prepara-
cin magistral para la preparacin magistral de formulaciones no estriles para su dispensacin y/o administracin en huma-
nos o animales. La preparacin magistral es una parte integral de la prctica farmacutica y es esencial para brindar atencin
mdica. Este captulo y las monografas aplicables sobre formulacin ayudan a definir las buenas prcticas de preparacin ma-
gistral. Asimismo, este captulo proporciona informacin general para mejorar la capacidad del preparador en las instalaciones
de preparacin magistral para que elabore preparaciones magistrales extemporneas de contenido, calidad y pureza acepta-
bles. Los farmacuticos, profesionales de la salud y dems personas implicadas en la preparacin magistral de medicamentos
deben cumplir con las legislaciones, reglamentaciones y pautas estatales y federales sobre preparacin magistral.

CATEGORAS DE LA PREPARACIN MAGISTRAL

Cada una de las tres categoras generales de preparaciones no estriles descritas en esta seccin est asociada con diferentes
niveles de experiencia, capacitacin e instalaciones fsicas.
Los criterios usados para determinar la clasificacin general incluyen:
grado de dificultad o complejidad del proceso de preparacin magistral
informacin y advertencias sobre la estabilidad
requisitos de envasado y almacenamiento
formas farmacuticas
complejidad de los clculos
disposicin biolgica local contra sistmica
nivel de riesgo para el preparador
potencial de riesgo de daos al paciente
Ver Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles (797) para niveles de riesgo relacionados con preparaciones estriles. Las
reas de especialidad tales como la de preparados radiofarmacuticos requieren de capacitacin especial y sobrepasan el alcan-
ce del presente captulo. Los preparadores debern adquirir y mantener conocimientos y habilidades en todas las reas (p.ej.,
formas farmacuticas, poblacin de pacientes y especialidad mdica) para las que elaboran preparaciones.

Descripcin de las Categoras

SIMPLE

Elaboracin de una preparacin que cuenta con una monografa de preparacin magistral en la Farmacopea de los Estados
Unidos de Amrica (USP) o que se presenta en un artculo de una publicacin de referencia que contiene cantidades especficas
de todos los componentes, un procedimiento y equipo de preparacin magistral y datos de estabilidad para dicha formulacin
con las FLU apropiadas; o reconstitucin o manipulacin de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o
ms ingredientes segn lo indicado por el fabricante. Entre los ejemplos se incluye Captopril, Solucin Oral, lndometacina, Gel
Tpico y Bromuro de Potasio, Solucin Oral para Uso Veterinario.

MODERADA

Elaboracin de una preparacin que requiere de clculos o procedimientos especiales (tales como calibracin de cavidades
en moldes de unidades de dosificacin) para determinar las cantidades de los componentes por cada preparacin o por cada
unidad de dosificacin individualizada; o elaborar una preparacin que carece de datos de estabilidad para su formulacin es-
pecfica. Entre los ejemplos se incluye Sulfato de Morfina, Supositorios, trociscos de clorhidrato de difenhidramina y mezcla de
dos o ms cremas fabricadas cuando no se conoce la estabilidad de la mezcla.

COMPLEJA

Elaboracin de una preparacin que requiere de capacitacin, entorno de trabajo, instalaciones, equipo y procedimientos
especiales para asegurar resultados teraputicos apropiados. Entre los ejemplos de posibles tipos de preparaciones complejas
se incluyen formas farmacuticas transdrmicas, preparaciones de liberacin modificada y algunos insertos y supositorios para
efectos sistmicos.
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RESPONSABILIDADES DEL PREPARADOR

La responsabilidad del preparador es obtener preparaciones magistrales de contenido, calidad y pureza aceptables de con-
formidad con la receta u orden de medicacin. Adems, es responsabilidad del preparador dispensar la preparacin terminada,
con el envasado y etiquetado apropiados y conforme a los requisitos establecidos por las agencias estatales, consejos de farma-
cia estatales, legislaciones federales y dems agencias reglamentarias aplicables, cuando corresponda. Los individuos que parti-
cipen en la preparacin magistral de medicamentos o suplementos dietticos debern tener la competencia necesaria en pre-
paracin magistral y debern expandir sus conocimientos continuamente sobre la preparacin magistral participando en semi-
narios y/o estudiando la literatura apropiada. Adems, debern tener conocimiento sobre el contenido de este captulo y estar
familiarizados con los captulos (797), Formas Farmacuticas (1151 ), Clculos en la Prctica Farmacutica (1160), Garanta de Ca-
lidad en la Preparacin Magistral (1163),Balanzas y Aparatos Volumtricos para Prescripciones (1176), (1191 ), Informacin Escrita
de los Medicamentos Recetados-Guas (1265) y dems legislaciones, pautas y normas sobre preparacin magistral aplicables.
Para asegurar la calidad de las preparaciones magistrales, los preparadores debern apegarse a los siguientes principios ge-
nerales (se proporciona informacin adicional sobre estos principios generales en la seccin siguiente).

Principios Generales de Preparacin Magistral

1. El personal est capacitado de manera apropiada y tiene la competencia y calificaciones necesarias para realizar las tareas
asignadas. Dicha capacitacin debe estar documentada.
2. Los ingredientes para la preparacin magistral tienen la identidad, pureza y calidad apropiadas, se adquieren de fuentes
confiables, y se almacenan de manera apropiada de acuerdo con las especificaciones del fabricante o las normas USP.
3. Los envases de componentes a granel cuentan con las etiquetas apropiadas de comunicacin de riesgo de la Occupatio-
nal Safety and Health Administration (OSHA) (ver www.OSHA.gov) y las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales
(MSDS, por sus siglas en ingls) para todos los frmacos y qumicos usados en la preparacin estn disponibles para el
personal de preparacin magistral.
4. Todo el equipo usado en la preparacin magistral se conserva limpio, recibe el mantenimiento apropiado y se usa de ma-
nera apropiada.
5. El ambiente de preparacin magistral es adecuado para su propsito previsto; y se implementan procedimientos para pre-
venir la contaminacin cruzada, especialmente cuando se elaboran preparaciones con frmacos (p.ej., frmacos peligro-
sos y alrgenos conocidos como la penicilina) que requieren de precauciones especiales.
6. Slo se permite personal autorizado en las inmediaciones de las operaciones de preparacin magistral.
7. Existe garanta de que los procesos siempre se llevan a cabo segn se especifica o en la forma prevista y que son reprodu-
cibles.
8. Las condiciones de la preparacin magistral son adecuadas a fin de prevenir errores.
9. Todos los aspectos de la preparacin magistral se documentan de manera apropiada.
1 O. Existen procedimientos y registros adecuados para investigar y corregir fallas o problemas en la preparacin magistral, el
anlisis o la preparacin misma.

PROCESO DE PREPARACIN MAGISTRAL

El preparador es responsable de asegurar que cada preparacin magistral individual cumpla con los criterios provistos en
esta seccin (se proporciona informacin adicional sobre estos criterios en las secciones siguientes).

Criterios para la Elaboracin de una Preparacin Magistral para Cada Frmaco

1. Se ha evaluado la aptitud de la dosis, la seguridad y el uso previsto de la preparacin o dispositivo en trminos de:
las propiedades qumicas y fsicas de los componentes
forma farmacutica
aptitud teraputica y va de administracin, incluyendo la disposicin biolgica local y sistmica
limitaciones legales, si las hubiera.
2. Se debe crear un Registro Maestro de Formulacin antes de elaborar la preparacin por primera vez. Este registro deber
seguirse cada vez que se elabore dicha preparacin. Adems, debe completarse un Registro de Preparacin Magistral cada
vez que se elabore una preparacin.
3. Los ingredientes usados en la formulacin debern tener la identidad, calidad y pureza esperadas. Si la formulacin es
para uso en humanos, los ingredientes no debern estar incluidos en la lista de frmacos o medicamentos especficos re-
conocidos en instancias federales que hayan sido retirados o extrados del mercado por razones de seguridad o eficacia
(ver www.FDA.gov). Si la formulacin es para animales con los que se producen alimentos, los ingredientes no debern
estar incluidos en una lista de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos. Se
han consultado los Certificados de Anlisis, cuando sea aplicable, y las MSDS para todos los ingredientes usados.
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4. La preparacin magistral se elabora en un rea limpia y sanitizada de manera apropiada, dedicada a esta actividad (ver la
seccin Instalaciones de Preparacin Magistra0.
5. Se elabora nicamente una preparacin a la vez en un espacio de trabajo especfico.
6. Se ha seleccionado el equipo de preparacin magistral apropiado y se ha inspeccionado su limpieza y funcionamiento
correcto, y se usa de manera apropiada.
7. Se establece una FLU confiable para asegurar que la preparacin terminada tiene su potencia, pureza, calidad y caracters-
ticas aceptadas, al menos hasta la FLU indicada en el etiquetado.
8. El personal que participa en la preparacin magistral mantiene una buena higiene de manos y usa vestimenta limpia,
apropiada para el tipo de preparacin magistral que se elabora (p.ej., protectores para el cabello, chaquetas, batas, guan-
tes, mscaras faciales, zapatos, delantales u otros artculos) segn sea necesario para proteger al personal de la exposicin
a sustancias qumicas y para prevenir la contaminacin de los frmacos.
9. La preparacin se elabora de acuerdo con este captulo, otras normas oficiales referidas en este captulo, e informacin y
datos cientficos pertinentes.
1 O. El preparador verifica los procesos crticos (incluyendo, entre otros, pesaje, medicin y mezclado) para asegurar que los
procedimientos, cuando se usen, darn constantemente como resultado la calidad esperada de la preparacin terminada.
11. La preparacin final se evala usando factores tales como peso, aptitud de mezclado, claridad, olor, color, consistencia,
pH y anlisis analtico, segn sea apropiado; y esta informacin se registra en el Registro de Preparacin Magistral (ver
(1163)).
12. La preparacin se envasa segn se recomienda en la seccin Envasado y Envases de Preparaciones Magistrales de este cap-
tulo.
1 3. El envase de la preparacin se etiqueta de conformidad con todas las legislaciones estatales y federales aplicables. El eti-
quetado deber incluir la FLU y la informacin de almacenamiento y manipulacin. El etiquetado debe indicar que "sta
es una preparacin magistral".
14. El preparador ha revisado el Registro Maestro de Formulacin y el Registro de Preparacin Magistral para asegurarse que
no hayan ocurrido errores en el proceso de preparacin magistral y que la preparacin es adecuada para su uso.
15. La preparacin se entrega al paciente o al proveedor de cuidados con la consulta apropiada.

INSTALACIONES DE PREPARACIN MAGISTRAL

Las instalaciones de preparacin magistral debern tener un espacio adecuado especficamente diseado para preparar las
prescripciones. Este espacio deber mantener la colocacin ordenada del equipo y materiales para prevenir confusiones entre
ingredientes, envases, etiquetas, materiales en proceso y preparaciones terminadas; asimismo, su diseo, disposicin y uso se
enfoca en prevenir contaminacin cruzada accidental. Las reas destinadas a las preparaciones estriles debern estar separa-
das y ser distintas de las usadas para las preparaciones no estriles (ver Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles (797), Cali-
dad y Control Ambienta0.
Se debe proveer agua potable para el lavado de manos y equipo. Esta agua cumple con normas establecidas en National
Primary Drinking Water Regulations (Reglamentaciones Bsicas sobre Agua Potable) de la Environmental Protection Agency
(Agencia de Proteccin Ambiental) (40 CFR Parte 141). Se deber usar Agua Purificada (ver la monografa de Agua Purificada)
para elaborar preparaciones de medicamentos no estriles cuando las formulaciones indiquen el uso de agua. Se debe usar
Agua Purificada para enjuagar el equipo y los utensilios. Cuando se usa agua para elaborar una preparacin estril, se deben
seguir las monografas y los captulos generales apropiados (ver Agua para Uso Farmacutico (1231 )).
El sistema de caeras deber estar libre de defectos que pudieran contribuir a la contaminacin de las preparaciones magis-
trales. Se debe contar con acceso fcil a instalaciones de lavado de manos y equipo en las reas de preparacin magistral. Di-
chas instalaciones debern incluir, entre otros, agua caliente y fra, jabn o detergente y secadores de aire o toallas desecha-
bles o de un solo uso. Las reas usadas para la preparacin magistral debern mantenerse limpias, ordenadas y en condiciones
sanitarias, y debern mantenerse en buenas condiciones de mantenimiento. La basura debe depositarse y desecharse de ma-
nera sanitaria y oportuna y de conformidad con las pautas locales, estatales y federales.
Toda el rea de preparacin magistral y de almacenamiento debe mantenerse bien iluminada. Hay que controlar los siste-
mas de calefaccin, de ventilacin y de aire acondicionado para evitar la descomposicin y contaminacin de los productos
qumicos (ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659) y las condiciones de almacenamiento dispuestas por el fabrican-
te). Se debe mantener un monitoreo adecuado de temperatura y humedad segn se requiera para ciertos componentes y for-
mas farmacuticas preparadas. Todos los componentes, equipos y envases deben almacenarse alejados del piso a fin de preve-
nir la contaminacin y permitir la inspeccin y limpieza del rea de elaboracin y almacenamiento de la preparacin magistral.
Los frmacos peligrosos deben ser almacenados, preparados y manipulados por personal adecuadamente capacitado en
condiciones que protejan a los trabajadores del cuidado de la salud y dems personal. A continuacin se presentan referencias
para la manipulacin segura de frmacos antineoplsticos y peligrosos en instalaciones de cuidados de la salud:
OSHA Technical Manual (Manual Tcnico de OSHA)-Seccin VI: Captulo 2, Controlling Occupational Exposure to Hazar-
dous Drugs (Control de Exposicin Ocupacional a Frmacos Peligrosos)
NIOSH Alert (Alerta de NIOSH): Preventing Occupational Exposure to Antineoplastic and Other Hazardous Drugs in Health
Care Settings(Prevencin de Exposicin Ocupacional a Frmacos Antineoplsticos y Otros Frmacos Peligrosos en Instala-
ciones de Cuidados de la Salud) [DHHS (NIOSH) Publicacin No. 2004-165) y actualizaciones.
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La eliminacin de todos los frmacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales corres-
pondientes. Todo el personal que lleve a cabo la eliminacin de desechos y actividades de limpieza rutinaria en las reas de
almacenamiento y preparacin de frmacos peligrosos deber estar capacitado en los procedimientos adecuados para prote-
gerse a s mismos y prevenir la contaminacin.

EQUIPO PARA ELABORAR LA PREPARACIN MAGISTRAL

El equipo y los utensilios usados para elaborar la preparacin magistral de un medicamento debern tener un diseo y capa-
cidad apropiados. Para no afectar ni alterar la pureza de las preparaciones, la composicin del equipo deber ser adecuada, de
modo que las superficies que entran en contacto con los componentes no reaccionen, no provoquen adiciones, ni los adsor-
ban. El tipo y las dimensiones del equipo dependen de las formas farmacuticas y las cantidades que se preparen (ver (1176) y
los manuales de instrucciones suministrados por el fabricante del equipo).
El equipo deber almacenarse para protegerlo de la contaminacin y deber estar ubicado de forma tal que se facilite su
uso, mantenimiento y limpieza. El equipo automatizado, mecnico, electrnico y de otros tipos usado en la elaboracin o an-
lisis de preparaciones magistrales deber inspeccionarse de manera rutinaria, calibrarse segn sea necesario, y verificarse para
asegurar el desempeo adecuado. El preparador deber inspeccionar el equipo para determinar su aptitud de uso inmediata-
mente antes de realizar las operaciones de preparacin magistral. El equipo deber limpiarse apropiadamente despus de su
uso.
Se debe tener extremo cuidado al limpiar el equipo usado en la elaboracin de preparaciones magistrales que requieran de
precauciones especiales (p.ej., antibiticos, materiales citotxicos y otros materiales peligrosos). Cuando sea posible, se debe
destinar equipo especial para tal propsito, o cuando se use el mismo equipo para todos los productos farmacuticos, se debe
contar con procedimientos adecuados para permitir la limpieza meticulosa del equipo antes de usarlo con otros medicamen-
tos. Cuando sea posible, se debe usar equipo desechable para reducir la probabilidad de biocarga o contaminacin cruzada.

SELECCIN, MANIPULACIN V ALMACENAMIENTO DE COMPONENTES

Las siguientes pautas se deben seguir al seleccionar, manipular y almacenar componentes para las preparaciones magistra-
les.
1. Se recomienda una sustancia de calidad Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP), Formulario Nacional (NF) o
Food Chemicals Codex (FCC) como fuente de ingredientes para elaborar todas las preparaciones.
2. Los preparadores deben intentar primero usar componentes fabricados en una instalacin registrada con la FDA. Cuando
no sea posible obtener componentes de una instalacin registrada con la FDA, los preparadores deben usar su criterio
profesional al seleccionar una fuente aceptable y confiable y deben establecer la pureza y la seguridad mediante mtodos
razonables, los cuales deben incluir un Certificado de Anlisis, reputacin del fabricante y confiabilidad de la fuente.
3. Las preparaciones magistrales oficiales se elaboran a partir de ingredientes individuales que cumplen con los requisitos de
la monografa oficial para los ingredientes que cuentan con monografa. Estas preparaciones se pueden etiquetar con las
siglas USP o NF, segn corresponda.
4. Cuando no sea posible obtener componentes de calidad farmacopeica, se pueden usar componentes de alta calidad tales
como aqullos que son qumicamente puros, de grado reactivo analtico o certificados por la American Chemical Society.
No obstante, estos componentes se deben usar con cuidado puesto que los estndares para reactivos analticos o los ma-
teriales de grado certificado por la American Chemical Society no consideran si una impureza presente implica riesgos de
seguridad para humanos o animales.
5. Para componentes en envases con una fecha de caducidad proporcionada por el fabricante o distribuidor, el material pue-
de usarse en la preparacin magistral antes de dicha fecha de caducidad (a) cuando el material se almacene en su envase
original en condiciones que eviten la descomposicin de las sustancias qumicas (ver (1191) y (659), a menos que se citen
otras condiciones en la etiqueta), (b) cuando exista una exposicin mnima del material remanente cada vez que se extrae
material del envase y (c) cuando cualquier extraccin del envase es llevada a cabo por personal capacitado en la manipu-
lacin adecuada del material. Si el componente ha sido transferido a un envase distinto, dicho envase deber identificarse
con el nombre del componente, proveedor original, lote o nmero de control, fecha de transferencia y fecha de caduci-
dad, y deber ofrecer una integridad equivalente o mejor que la del envase original.
6. Para componentes que no tienen fechas de caducidad asignadas por el fabricante o el proveedor, el preparador deber
etiquetar el envase con la fecha de recepcin y asignar una fecha de caducidad prudente al componente que no exceda
de tres aos a partir de la fecha de recepcin (ver Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en Conservacin,
Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales) basndose en la naturaleza del componente
y su mecanismo de degradacin, el envase en el que est envasado y las condiciones de almacenamiento.
7. Cuando se usa un medicamento fabricado como fuente del ingrediente activo, el medicamento deber haber sido fabrica-
do en una instalacin registrada con la FDA y el envase del producto provisto por el fabricante deber estar etiquetado
con un nmero de control de partida y una fecha de caducidad. Cuando se elaboran preparaciones magistrales con medi-
camentos fabricados, el preparador debe considerar todos los ingredientes, incluidos los excipientes presentes en el medi-
camento con respecto al uso previsto de la preparacin magistral, as como el efecto que tendr la manipulacin del me-
dicamento sobre la aptitud teraputica y la estabilidad de los componentes.
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8. Cuando la preparacin est destinada para su uso como suplemento diettico o nutricional, el preparador deber respetar
este captulo y deber cumplir con todos los requisitos federales y estatales. En general, los suplementos dietticos se pre-
paran con ingredientes que cumplen con las normas USP, FCC o NF. Cuando no existan tales estndares, se pueden usar
sustancias con una calidad de grado alimenticio comprobada usando otros procedimientos adecuados.
9. Cuando un componente se deriva de animales rumiantes (p.ej., bovinos, caprinos, ovinos), el proveedor deber propor-
cionar garanta por escrito de que el componente cumple con todas las leyes federales que rigen los requisitos de procesa-
miento, uso e importacin para estos materiales.
1 O. Cuando se elaboran preparaciones magistrales para humanos, el preparador deber consultar la lista de componentes que
han sido retirados o extrados del mercado por la FDA por razones de seguridad o eficacia (ver www.FDA.gov). Cuando se
elaboran preparaciones magistrales para animales con los que se producen alimentos, el preparador debe consultar la lista
de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos.
11. Todos los componentes usados en la elaboracin de preparaciones magistrales deben almacenarse segn las instrucciones
del fabricante o de acuerdo con los requisitos de la monografa USP, NF o FCC, en un rea limpia y en condiciones de
temperatura y humedad apropiadas (temperatura ambiente controlada, refrigerador o congelador). Todos los componen-
tes deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminacin, y rotarse de modo que
se use primero el componente ms antiguo. Todos los envases deben etiquetarse apropiadamente.

CRITERIOS DE ESTABILIDAD Y DETERMINACIN DE LA FECHA LMITE DE USO

La FLU es la fecha despus de la cual la preparacin magistral no debe usarse y se determina a partir de la fecha de elabora-
cin de la preparacin. Debido a que las preparaciones magistrales estn destinadas a administrarse inmediatamente o luego
de un perodo de almacenamiento corto, las fechas lmite de uso pueden determinarse en funcin de criterios distintos a los
utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados.
Las FLU deben fijarse de manera conservadora. Para determinar la FLU, los preparadores deben consultar y aplicar la infor-
macin disponible en la documentacin y literatura sobre la estabilidad en general y la del frmaco en particular, y deben con-
siderar:
la naturaleza del frmaco y su mecanismo de degradacin
la forma farmacutica y sus componentes
el potencial de proliferacin microbiana en la preparacin
el envase en el que est envasado
las condiciones de almacenamiento esperadas
la duracin prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en Conservacin, Envasado,
Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales).
Cuando se usa un producto fabricado como fuente del ingrediente activo farmacutico para una preparacin magistral no
estril, la fecha de caducidad del producto no podr usarse como nico elemento para fijar una FLU para la preparacin magis-
tral, sino que el preparador deber referirse a la informacin de estabilidad provista por el fabricante y a la literatura para obte-
ner informacin aplicable sobre estabilidad, compatibilidad y degradacin de ingredientes, adems de considerar los factores
de estabilidad presentados en (1191 ); asimismo, deber usar sus conocimientos de preparacin magistral y experiencia. Todos
los datos de estabilidad deben ser cuidadosamente interpretados en funcin de la formulacin preparada real.
Es necesario que el preparador observe el medicamento preparado para detectar signos de inestabilidad durante todas las
etapas del proceso de preparacin, dispensacin y almacenamiento. En (1191 ), Consideraciones sobre Estabilidad en la Prctica
de Dispensacin, se encuentran detalles ms especficos sobre algunos signos de deterioro fsico comunes. Sin embargo, la de-
gradacin qumica excesiva y otras prdidas de concentracin del frmaco ocasionadas por reacciones suelen ser invisibles.

Pautas Generales Para Fijar la Fecha Lmite de Uso

Ante la ausencia de informacin de estabilidad del frmaco y de la preparacin especficos, la siguiente tabla presenta las
fechas lmite de uso mximas recomendadas para preparaciones magistrales de frmacos no estriles que se envasan en enva-
ses impermeables y resistentes a la luz y se almacenan a temperatura ambiente controlada, a menos que se indique algo distin-
to (ver (659)). Los frmacos o qumicos que tienden a descomponerse requerirn de FLU ms cortas.
FLU por Tipo de Formulacin
Para Formulaciones No Acuosas-La FLU no deber ser mayor al tiempo restante hasta la fecha de caducidad ms cercana de cualquier ingrediente
activo farmacutico o 6 meses, lo que ocurra primero.
Para Formulaciones Orales que Contienen Agua-La FLU no deber ser mayor de 14 das cuando se almacenan a temperaturas fras controladas.
Para Formulaciones Lquidas o Semislidas que Contienen Agua, de aplicacin Tpica/Drmica o sobre Mucosas-La FLU no deber ser mayor
de 30 das.
Las siguientes FLU mximas se recomiendan para preparaciones magistrales de medicamentos no estriles cuando no se cuenta con informacin de estabilidad
del frmaco o la preparacin especficos. La FLU no deber ser mayor a la fecha de caducidad indicada en el envase de cualquier componente.
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Las preparaciones susceptibles deben contener agentes anti microbianos adecuados que las protejan de la contaminacin
por bacterias, levaduras y hongos introducidos inadvertidamente durante o despus del proceso de preparacin magistral.
Cuando existe una contraindicacin para conservantes antimicrobianos en estas preparaciones magistrales, ser necesario al-
macenar la preparacin a temperatura fra controlada; para asegurar el almacenamiento y la manipulacin adecuados de tales
preparaciones magistrales por parte del paciente o el proveedor de cuidados, resulta esencial instruir y ofrecer consulta apro-
piada al paciente. No se deben usar conservantes antimicrobianos como sustitutos de las buenas prcticas de preparacin ma-
gistral.
Para informacin sobre asignacin de FLU para medicamentos reenvasados para dispensacin o administracin, ver Fecha de
Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requi-
sitos Generales y Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (11 36).
Es obligatorio garantizar la esterilidad de una preparacin magistral estril. La preparacin y el envasado de medicamentos
estriles, (incluidas las preparaciones oftlmicas) requieren un cumplimiento estricto de las pautas contenidas en (797) y en las
instrucciones de etiquetado del fabricante.

Cambio en la redaccin:

ENVASADO Y ENVASES DE PREPARACIONES MAGISTRALES

El preparador debe asegurar que los envases y cierres de envases usados en el envasado de preparaciones magistrales cum-
plen con los requisitos de USP (ver (659); Envases-Vidrio (660); Sistemas de Envases Plsticos y sus tytaterales <Je Construccin
(661 }; Materiales Plsticos de Construccin (661.1 ); Sistemas de Envases Plsticos par(/ Uso Farmacutico (66L2); (AF-Ol-may-2106)
Envases-Pruebas de Desempeo (671 ); (1136)); y cuando estn disponibles, las monografas de preparacin magistral. No se
espera que los preparadores realicen las pruebas descritas en los captulos mencionados, pero deben tener conocimiento acer-
ca de las normas en ellos descritas. Los proveedores de envases deben proporcionar, cuando se les solicite, la verificacin del
cumplimiento del envase con USP. Los envases y cierres de envases destinados para la elaboracin de preparaciones magistra-
les estriles deben manipularse segn se indica en (797).
Los envases y cierres debern estar fabricados con material limpio y adecuado a fin de no alterar la calidad, contenido o
pureza de la preparacin magistral. Utilizar un envase seleccionado segn las propiedades fsicas y qumicas de la preparacin
magistral. Se debe considerar la interaccin envase-frmaco para sustancias con propiedades adsortivas o de lixiviacin.
Los envases y cierres deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminacin, y rotarse
de modo que se usen primero los ms antiguos. Los envases y cierres de envases deben almacenarse de modo que se permita
la inspeccin y limpieza del rea de almacenamiento.

DOCUMENTACIN SOBRE PREPARACIN MAGISTRAL

La documentacin, escrita o electrnica, permite al preparador rastrear, evaluar y repetir sistemticamente los pasos inclui-
dos en todo el proceso de elaboracin de una preparacin magistral, siempre que lo necesite. Todos los preparadores que dis-
pensan recetas deben cumplir con los requisitos de manutencin de registros de sus consejos estatales de farmacia. No se re-
quiere documentacin adicional cuando el preparador elabora una preparacin magistral de acuerdo con las instrucciones del
etiquetado provistas por el fabricante. Todas las dems preparaciones magistrales requerirn de documentacin adicional se-
gn se describe en esta seccin.
El perodo de conservacin de los registros es idntico al perodo dispuesto por la legislacin estatal para cualquier receta
mdica. El registro puede ser una copia de la prescripcin, escrita o en forma de registro electrnico, que incluya el Registro
Maestro de Formulacin y el Registro de Preparacin Magistral.

Registro Maestro de Formulacin

Este registro deber incluir:

nombre oficial o asignado, contenido y forma farmacutica de la preparacin
clculos requeridos para determinar y verificar cantidades de componentes y dosis de ingredientes farmacuticos activos
descripcin de todos los ingredientes y sus cantidades
informacin sobre compatibilidad y estabilidad, incluyendo referencias cuando estn disponibles
equipo necesario para elaborar la preparacin, cuando corresponda
instrucciones de mezclado que debern incluir:
1. orden de mezclado
2. temperaturas de mezclado u otros controles ambientales
3. duracin del mezclado
4. otros factores pertinentes a la reproduccin de la preparacin a medida que se elabora.
informacin de etiquetado de la muestra, que deber contener, adems de la informacin legalmente requerida:
1 . nombre genrico y cantidad o concentracin de cada ingrediente activo
2. FLU asignada
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3. condiciones de almacenamiento
4. nmero de prescripcin o de control, segn corresponda.
envase usado para la dispensacin
requisitos de envasado y almacenamiento
descripcin de la preparacin final
procedimientos de control de calidad y resultados esperados.

Registro de Preparacin Magistral

El Registro de Preparacin Magistral deber contener:

el nombre oficial o asignado, contenido y dosis de la preparacin
referencia al Registro Maestro de Formulacin para la preparacin
nombres y cantidades de todos los componentes
fuentes, nmeros de lote y fechas de caducidad de los componentes
cantidad total preparada
nombre de la persona que elabor la preparacin, nombre de la persona que llev a cabo los procedimientos de control
de calidad y nombre del preparador que aprob la preparacin
fecha de preparacin
nmero de control o prescripcin asignado
FLU asignada
doble etiqueta segn se describe en el Registro Maestro de Formulacin
descripcin de la preparacin final
resultados de los procedimientos de control de calidad (p.ej., intervalo de peso de las cpsulas llenadas, pH de lquidos
acuosos)
documentacin de cualquier problema de control de calidad y cualquier reaccin adversa o problema de la preparacin
informados por el paciente o el proveedor de cuidados.

Procedimientos Operativos Estndar

Todos los procedimientos significativos realizados en el rea de preparacin magistral deben estar cubiertos por procedi-
mientos operativos estndar (POE) escritos. Deben desarrollarse procedimientos para instalaciones, equipo, personal, prepara-
cin, envasado y almacenamiento de preparaciones magistrales para asegurar la confiabilidad, exactitud, calidad, seguridad y
uniformidad de la preparacin magistral. La aplicacin de POE establece una uniformidad en los procedimientos, adems de
proveer referencias para la orientacin y capacitacin del personal.

Archivos de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales

Las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales (MSDS, por sus siglas en ingls) deben ser de fcil acceso para todos los
empleados que trabajan con medicamentos o productos qumicos a granel ubicados en las instalaciones de preparacin ma-
gistral. Debe instruirse a los empleados acerca de cmo conseguir e interpretar la informacin necesaria.

CONTROL DE CALIDAD

La seguridad, la calidad y el desempeo de las preparaciones magistrales dependen de una correcta utilizacin de los ingre-
dientes, clculos bien hechos, mediciones precisas y exactas, condiciones y procedimientos de formulacin adecuados y el
ejercicio prudente del criterio farmacutico. El preparador deber realizar una ltima verificacin de cada procedimiento utili-
zado en el proceso de preparacin magistral. El preparador, con el fin de asegurar la exactitud y la integridad, deber observar
la preparacin terminada para determinar que su apariencia es la esperada y deber investigar cualquier discrepancia, adop-
tando las medidas necesarias para corregirlas antes de dispensar la receta mdica al paciente.

Controles para la Preparacin Magistral

1. Es necesario seguir el Registro Maestro de Formulacin, el Registro de Preparacin Magistral, y los procedimientos escritos
relacionados durante la ejecucin del proceso de preparacin magistral. Cualquier desviacin en los procedimientos debe
ser documentada.
2. El preparador deber realizar una verificacin y posteriormente volver a verificar cada procedimiento en cada etapa del
proceso. Cuando sea posible, una segunda persona capacitada debe verificar cada etapa crtica del proceso de prepara-
cin.
3. El preparador deber contar con procedimientos establecidos por escrito que describan las pruebas o exmenes realizados
a la preparacin magistral (p.ej., el grado de variacin de peso entre cpsulas) para asegurar su uniformidad e integridad.
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4. Se deben establecer procedimientos de control adecuados para monitorear los resultados y para verificar el desempeo
de los procesos de preparacin y equipos que pudieran ser responsables de las variaciones en las preparaciones magistra-
les finales.
5. Para ms informacin y pautas sobre los procesos de control de calidad recomendados, ver (1163).

CONSEJOS AL PACIENTE

Al momento de dispensar la receta, se debe aconsejar al paciente o al representante del paciente sobre el uso, almacena-
miento, manipulacin y desecho apropiados de la preparacin. Adems, se debe instruir al paciente o al representante del pa-
ciente para que informe sobre cualquier evento adverso y para que observe e informe al preparador sobre cualquier cambio en
las caractersticas fsicas de la preparacin magistral (ver (1191 ), Responsabilidad del Farmacutico). El preparador deber investi-
gar y documentar cualquier problema informado que se relacione con una preparacin magistral, y deber tomar las medidas
correctivas.

CAPACITACIN

Todo el personal implicado en la preparacin, evaluacin, envasado y dispensacin de preparaciones magistrales deber re-
cibir capacitacin adecuada para el tipo de preparacin magistral realizada. Es responsabilidad del preparador asegurar la im-
plementacin de un programa de capacitacin y que ste se aplique de manera continua. El personal de preparacin magistral
debe ser evaluado por lo menos una vez al ao. Las etapas en el proceso de capacitacin incluyen lo siguiente:
Todos los empleados implicados en la preparacin magistral farmacutica debern leer y familiarizarse con este captulo.
Adems, deben estar familiarizados con el contenido de la USP Pharmacists' Pharmacopeia y dems publicaciones perti-
nentes, lo cual incluye cmo leer e interpretar las MSDS.
Todos los empleados debern leer y familiarizarse con cada uno de los procedimientos relacionados con la preparacin
magistral, incluyendo aqullos que involucren las instalaciones, equipo, personal, preparacin magistral en s misma, eva-
luacin, envasado, almacenamiento y dispensacin.
Todo el personal que elabore preparaciones magistrales de frmacos peligrosos deber estar totalmente capacitado en al-
macenamiento, manipulacin y desecho de estos frmacos. Esta capacitacin se debe dar antes de preparar o manipular
frmacos peligrosos. Para informacin sobre capacitacin de personal que elabora preparaciones magistrales de frmacos
peligrosos, ver las referencias en la seccin Instalaciones de Preparacin Magistral de este captulo.
Todas las actividades de capacitacin debern quedar documentadas. El preparador deber reunirse con los empleados
para revisar su trabajo y responder cualquier pregunta de los empleados en relacin con los procedimientos de prepara-
cin magistral.
El preparador deber hacer una demostracin de los procedimientos para el empleado y deber observar y guiar al em-
pleado durante todo el proceso de capacitacin. Posteriormente, el empleado repetir el procedimiento sin recibir ayuda
alguna por parte del preparador pero bajo su supervisin directa.
Cuando el empleado haya demostrado al preparador un conocimiento verbal y funcional del procedimiento se le permiti-
r realizar el procedimiento sin supervisin directa. No obstante, el preparador deber estar presente fsicamente y deber
aprobar todos los ingredientes y sus cantidades, as como la preparacin final.
Cuando el preparador est satisfecho con el conocimiento y competencia del empleado, el preparador deber firmar los
registros de documentacin para demostrar que el empleado ha recibido la capacitacin adecuada.
El preparador deber monitorear continuamente el trabajo del empleado y asegurar que los clculos y el trabajo del em-
pleado sean exactos y se realicen de manera adecuada.
El preparador es el nico responsable de la preparacin terminada.

PREPARACIONES MAGISTRALES PARA PACIENTES ANIMALES

La responsabilidad del preparador para proporcionar preparaciones magistrales de alta calidad a los pacientes se extiende
ms all de los seres humanos. Todas las partes de este captulo se aplican a preparaciones magistrales formuladas para pacien-
tes animales. Se deber determinar antes de realizar la preparacin magistral si la misma est destinada al uso de un paciente
animal (p.ej., de compaa, de competicin, para alimento).
Debido a que el alimento derivado de pacientes animales puede ser consumido por seres humanos, se debe tener cuidado
para prevenir que los residuos del frmaco ingresen en la cadena alimenticia humana cuando se elaboran preparaciones ma-
gistrales para su uso en pacientes animales. Por esta razn, todos los preparadores que preparan formulaciones para animales
deben tener conocimientos funcionales sobre regulacin y aplicacin de frmacos en pacientes animales. Por ley, los veterina-
rios estn obligados a proporcionar a los cuidadores de animales con los que se producen alimentos un periodo de retencin
de los tejidos de animales tratados (p.ej. carne, leche, huevo) antes de introducirlos en el suministro alimenticio humano. Este
periodo se denomina tiempo de retiro (WDT, por sus siglas en ingls) y, por ley, tambin se debe incluir en la etiqueta de
dispensacin de cada prescripcin preparada para especies que se usan en la produccin de alimentos.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (795) Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles 671

El uso de frmacos en cualquier animal de competicin est estrictamente regulado por los gobiernos federal y estatales,
adems de los rganos que rigen cada una de las disciplinas especficas. Las penas por infringir dichas reglas pueden ser seve-
ras para todos los que contribuyan con la falta, incluidos veterinarios, farmacuticos y cuidadores.
El farmacutico deber estar apercibido de las limitantes para las especies especficas en su capacidad fisiolgica y metabli-
ca que pudieran resultar en toxicidad cuando se usan ciertos frmacos o excipientes en las preparaciones magistrales. Por esta
razn, los preparadores que elaboran preparaciones para animales deben usar, cuando sea posible, formulaciones desarrolla-
das especficamente para pacientes animales. Cuando dichas formulaciones no estn disponibles, el preparador deber revisar
la literatura para determinar si un componente especfico de la frmula es txico para las especies a tratar. La extrapolacin de
formulaciones que se preparan magistralmente destinadas para su uso en humanos puede no ser adecuada para especies ani-
males y puede ocasionar resultados negativos.
Los veterinarios y farmacuticos que elaboran preparaciones para pacientes animales deben estar familiarizados con todas las
legislaciones estatales y federales relacionadas con el uso de frmacos en animales, incluyendo, entre otras, la Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley de Alimentos, Frmacos y Cosmticos); la Animal Drug Amendment (Enmienda sobre Frmacos en Anima-
les); la Animal Medicinal Drug Use Clarification Act (Ley de Aclaracin del Uso Medicinal de Frmacos en Animales); y la Com-
pliance Policy Guideline for Compounding of Drugs for Use in Animal Patients (Gua sobre las Polticas de Preparacin Magis-
tral de Frmacos para su Uso en Pacientes Animales) de la FDA.

GLOSARIO

Ingrediente Farmacutico Activo (API, por sus siglas en ingls): Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a
su uso en una preparacin magistral de medicamentos, convirtindose as en el ingrediente activo de dicha preparacin y que
proporciona una actividad farmacopeica u otro efecto directo en el diagnstico, cura, mitigacin, tratamiento o prevencin de
enfermedades en humanos y animales o que afecta la estructura y funcin del cuerpo.
Sustancias Agregadas: Son ingredientes necesarios para elaborar una preparacin pero sin la intencin ni la expectativa
de causar una respuesta farmacolgica si se administran aisladamente en la cantidad o concentracin contenida en una dosis
nica de la preparacin magistral. El trmino se usa como sinnimo con los trminos ingredientes inactivos, excipientes e ingre-
dientes farmacuticos.
Fecha Lmite de Uso (FLU): Es la fecha despus de la cual no debe usarse una preparacin magistral y se determina a
partir de la fecha de elaboracin de la preparacin.
Componente: Cualquier ingrediente usado en la elaboracin de una preparacin magistral de frmacos, incluyendo cual-
quier ingrediente activo o sustancia agregada que se usa en su preparacin.
Preparador: Profesional autorizado por la jurisdiccin apropiada para elaborar preparaciones magistrales de acuerdo con
una receta u orden de medicacin de un prescriptor autorizado.
Preparacin magistral: La preparacin, mezcla, reconstitucin, alteracin, envasado y etiquetado de un medicamento,
dispositivo de administracin del medicamento o dispositivo de acuerdo con la prescripcin, orden de medicacin o iniciativa
de un profesional autorizado basado en la relacin entre el profesional, el paciente, el farmacutico y el preparador en el curso
de una prctica profesional. La preparacin magistral incluye lo siguiente:
La preparacin de formas farmacuticas para pacientes humanos y animales
La preparacin de medicamentos o dispositivos anticipando recetas de medicamentos basadas en patrones rutinarios de
prescripcin observados con regularidad
La reconstitucin o manipulacin de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o ms ingredientes
La preparacin de medicamentos o dispositivos con el propsito de investigacin (clnica o acadmica), enseanza o an-
lisis qumico, o como resultado incidental de los mismos
La preparacin de medicamentos y dispositivos para uso en el lugar de trabajo del prescriptor cuando as lo permita la
legislacin federal y estatal
Frmaco Peligroso: Cualquier frmaco identificado por al menos uno de los seis criterios siguientes:
Carcinogenicidad
Teratogenicidad o toxicidad en el desarrollo
Toxicidad reproductiva en humanos
Toxicidad en rganos a dosis bajas en humanos o animales
Genotoxicidad
Nuevos frmacos que reproduzcan frmacos peligrosos en su estructura o toxicidad [se pueden encontrar ejemplos en las
publicaciones vigentes del National lnstitute for Occupational Safety and Health (NIOSH)]
Fabricacin: La produccin, propagacin, conversin o procesamiento de un frmaco o dispositivo mdico, ya sea directa
o indirectamente, mediante extraccin del frmaco de sustancias de origen natural o mediante sntesis qumica o biolgica. La
fabricacin tambin puede incluir cualquier envasado o reenvasado de las sustancias o etiquetado o reetiquetado de envases
para su reventa en farmacias, por parte de profesionales u otras personas.
Preparacin: A los efectos de este captulo, se refiere a una forma farmacutica o suplemento diettico elaborado por pre-
paracin magistral o un dispositivo en el que el preparador ha introducido un frmaco. Este trmino se usar para describir
formulaciones preparadas magistralmente; el trmino producto se usar para describir formas farmacuticas fabricadas. (Para
las definiciones de sustancia oficial y productos oficiales, ver Advertencias y Requisitos Generales.)
672 (795) Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles/ Pruebas Fsicas USP 39

Estabilidad: Se define como la conservacin, dentro de ciertos lmites especficos y durante todo el periodo de almacena-
miento y utilizacin, de las mismas propiedades y caractersticas que posea la preparacin cuando se elabor (ver en Conside-
raciones sobre Estabilidad en la Prctica de Dispensacin (1191 ), la tabla Criterios de Niveles Aceptables de Estabilidad).
Vehculo: Componente de uso interno o externo empleado como portador o diluyente en el que se suspenden o disuel-
ven lquidos, semislidos o slidos. Ejemplos de vehculos incluyen, entre otros, agua, jarabes, elxires, lquidos oleaginosos,
portadores slidos y semislidos y productos de propiedad exclusiva.

(797) PREPARACIN MAGISTRAL-PREPARACIONES ESTRILES

Cambio en Ja redaccin:

INTRODUCCIN
El objetivo de este captulo es describir las condiciones y prcticas para evitar lesiones, e incluso la muerte de pacientes como
resultado de (1) contaminacin microbiana (no esterilidad), (2) endotoxinas bacterianas en exceso, (3) variabilidad en la con-
centracin pretendida de los ingredientes correctos, que exceda bien sea los lmites de la monografa para artculos oficiales
(ver "Oficial" y "Artculos Oficiales" en las Advertencias y Requisitos Generales) o 10% para los artculos no oficiales, (4) contami-
nantes qumicos y fsicos no esperados, y (5) ingredientes de calidad inadecuada en las preparaciones magistrales estriles
(PME). Las PME contaminadas son potencialmente ms riesgosas para los pacientes cuando se administran en cavidades cor-
porales, los sistemas nervioso y vascular, los ojos y las articulaciones y cuando se usan como baos para rganos y tejidos vi-
vos. Cuando las PME contienen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) son potencial-
mente ms riesgosas para los pacientes cuando se administran dentro del sistema nervioso central.
A pesar de la exhaustiva atencin dedicada en este captulo a la provisin, mantenimiento y evaluacin de la calidad de aire,
resulta fundamental evitar la contaminacin directa o por contacto fsico. Por lo general, se reconoce que el contacto fsico o
directo de sitios crticos de las PME con contaminantes, especialmente fuentes microbianas, representa la ms alta probabilidad
de riesgo para los pacientes. Por lo tanto, el personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente
cuidadoso en evitar la contaminacin por contacto de las PME, tanto dentro de las reas ISO Clase 5 (ver Tabla 7), como fuera
de ellas.
Con el fin de conseguir las cinco condiciones y prcticas descritas anteriormente, este captulo proporciona las normas mni-
mas de prctica y calidad para las PME de frmacos y nutrientes, basadas en la informacin cientfica actual, as como en las
mejores prcticas para preparaciones magistrales estriles. El uso de tecnologas, tcnicas, materiales y procedimientos distin-
tos de los descritos en este captulo no est prohibido mientras se pruebe que son equivalentes o superiores, con significacin
estadstica, a los descritos aqu. Las normas de este captulo no se refieren a la administracin clnica de PME a pacientes me-
diante aplicacin, implantacin, infusin, inhalacin, inyeccin, insercin, instilacin e irrigacin, que son las rutas de adminis-
tracin. En este captulo se describen cuatro categoras especficas de PME: nivel de riesgo bajo, nivel de riesgo mediano y nivel
de riesgo alto, y uso inmediato. La preparacin magistral estril difiere de la preparacin no estril (ver Preparacin Magistral-
Preparaciones No Estriles (795) (Atol-may-2016) principalmente al requerir el mantenimiento de la esterilidad cuando se prepa-
ran exclusivamente con ingredientes y componentes estriles (es decir, PME de uso inmediato, PME de nivel de riesgo bajo y
PME de nivel de riesgo mediano) y la consecucin de esterilidad al prepararlas con ingredientes y componentes no estriles (es
decir, PME de nivel de riesgo alto). Algunas diferencias entre las normas para la preparacin magistral estril en este captulo y
aquellas de las preparaciones magistrales no estriles en Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles (795) incluyen, entre
otras, ambientes de aire con clasificacin ISO (ver Tabla 1); vestimenta y guantes del personal; capacitacin del personal y
pruebas sobre principios y prcticas de manipulaciones aspticas y esterilizacin; especificaciones de calidad ambiental y moni-
toreos; y desinfeccin de guantes y superficies de fuentes ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
Tabla 1. Clasificacin ISO de Partculas en el Aire Ambiental (los lmites se expresan en partculas mayores o iguales a 0,5 m por metro cbico
[ISO actual] y pie cbico [anteriormente Norma Federal N 209E, y en Jo sucesivo FS 209E (siglas en ingls)])*
Nombre de la Clase Recuento de Partculas
Clase ISO FS 209E de EE.UU. ISO, m 3 FS 209E, pie3
3 Clase 1 35,2 1
4 Clase 1O 352 10
5 Clase 100 3520 100
6 Clase 1000 35 200 1000
7 Clase 10 000 352 000 10000
* Adaptado de la FS N 209E, Administracin de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1 :1999, Cleanrooms
and associated controlled environments-Part 1: Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partculas mayores o iguales a 0,5 m por m 3 (ISO Clase 5)
equivalen a 100 partculas por pie 3 (Clase 100) (1 m3 = 35,2 pies 3).
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 673

Tabla 1. Clasificacin ISO de Partculas en el Aire Ambiental (los lmites se expresan en partculas mayores o iguales a 0,5 m por metro cbico
[ISO actual] y pie cbico [anteriormente Norma Federal N 209E, y en lo sucesivo FS 209E (siglas en ingls)])* (Continuacin)
Nombre de la Clase Recuento de Partculas
Clase ISO 1 FS 209E de EE.UU. ISO, m 3 1 FS 209E, ple3
8 1 Clase 1 00 000 3 520000 1 100000
Adaptado de la FS N 209E, Administracin de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1 :1999, Cleanrooms
and associated controlled environments-Part 1: Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partculas mayores o iguales a 0,5 m por m 3 (ISO Clase 5)
equivalen a 1 00 partculas por pie3 (Clase 100) (1 m 3 = 35,2 pies 3).

Las normas en este captulo estn destinadas a todas las personas que elaboren PME y todos los sitios donde se preparen
PME (p.ej., hospitales y otras instituciones de salud, clnicas de tratamiento de pacientes, farmacias, instituciones de prctica
mdica y otras instalaciones y sitios en donde se preparen, almacenen y transporten PME). Entre las personas que hacen las
preparaciones magistrales estriles se cuentan farmacuticos, enfermeras, tcnicos de farmacia y mdicos. Estos trminos reco-
nocen que la mayora de las preparaciones magistrales estriles las realizan o supervisan farmacuticos en farmacias y tambin
que este captulo aplica a todo el personal de salud que prepara, almacena y transporta PME. A los efectos de este captulo,
PME incluye cualquiera de las siguientes:
(1) Preparaciones magistrales de productos biolgicos, de diagnstico, frmacos, nutrientes y productos radiofarmacuticos,
incluyendo, entre otras, a las siguientes formas farmacuticas que deben estar estriles cuando se administran a pacientes:
inhalaciones bronquiales y nasales acuosas, baos y soluciones para rganos y tejidos vivos, inyecciones (p.ej., dispersio-
nes coloidales, emulsiones, soluciones, suspensiones), irrigaciones para heridas y cavidades corporales, gotas y ungentos
oftlmicos e implantes tisulares.
(2) Productos estriles fabricados, que se preparan estrictamente de acuerdo con las instrucciones que aparecen en el etique-
tado aprobado del fabricante (prospectos adjuntos del producto) o se preparan en forma diferente a lo publicado en di-
cho etiquetado. [NOTA-La FDA estipula que "la Preparacin Magistral no incluye mezclado, reconstitucin o acciones si-
milares que se efecten de acuerdo con las instrucciones contenidas en el etiquetado aprobado suministrado por el fabri-
cante del producto, as como otras instrucciones del fabricante que concuerden con el etiquetado" [21 USC 321 (k) y
(m)]. Sin embargo, el etiquetado aprobado por la FDA (prospecto adjunto del producto) rara vez describe la calidad am-
biental (p.ej., designacin de Clase ISO del aire, la duracin de la exposicin a aire no clasificado por ISO, la vestimenta y
guantes del personal, ni otras precauciones aspticas bajo las cuales se preparan los productos estriles para administra-
cin). La fecha o el tiempo lmite de uso y almacenamiento (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparacin Magis-
tral-Preparaciones No Estriles (795)) para productos estriles que han sido abiertos o preparados para administracin no
se especifican en todos los prospectos adjuntos de todos los productos estriles. Adems, cuando se especifican, tales du-
raciones pueden referirse a la estabilidad qumica y no necesariamente a la pureza o seguridad microbiolgicas.]

ORGANIZACIN DE ESTE CAPTULO

Las secciones de este captulo estn organizadas para facilitar a los profesionales de salud la comprensin de las prcticas
fundamentales relativas a la exactitud y calidad requeridas para preparar las PME. Proporcionan la base para el desarrollo e
implementacin de procedimientos esenciales para la elaboracin segura de PME de niveles de riesgo bajo, mediano y alto, y
PME de uso inmediato, las cuales se clasifican segn el potencial de contaminacin microbiana, qumica y fsica. El captulo se
divide en las siguientes secciones principales:
Responsabilidad del Personal de Preparacin Magistral
Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana en las PME
Capacitacin y Evaluacin del Personal en Tcnicas de Manipulacin Asptica
PME de Uso Inmediato
Envases Monodosis y Multidosis
Frmacos Peligrosos como PME
Preparados Radiofarmacuticos como PME
Extractos de Alrgenos como PME
Verificacin de la Exactitud y Esterilidad de la Preparacin Magistral
Calidad y Control Ambiental
Procedimientos Operativos Estndares (POE) Sugeridos
Elementos de Control de Calidad
Verificacin de Dispositivos Automatizados de Preparacin Magistral (DAP) para Nutricin Parenteral
Controles y Pruebas de Liberacin de las Preparaciones Terminadas
Almacenamiento y Fechado de Lmite de Uso
Mantenimiento de la Esterilidad, Pureza y Estabilidad de las PME Dispensadas y Distribuidas.
Capacitacin del Paciente o Persona Encargada de Su Cuidado
Monitoreo del Paciente e Informe de Eventos Adversos
Programa de Garanta de Calidad (QA)
Abreviaturas y Acrnimos
674 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles/ Pruebas Fsicas USP 39

Glosario
Apndices 1-V
Los requisitos y recomendaciones en este captulo se resumen en el Apndice /. Al final del texto principal, antes de los Apn-
dices, se incluye una lista de abreviaturas y acrnimos.
Todo el personal que participa en la elaboracin de PME tiene la responsabilidad de comprender estas prcticas y precaucio-
nes fundamentales, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos proce-
dimientos y la calidad de la PME final para evitar daos.
Cambio en la redaccin:

RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIN MAGISTRAL

El personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de asegurar que las PME estn debidamente identificadas, me-
didas, diluidas y mezcladas, y correctamente purificadas, esterilizadas, envasadas, selladas, etiquetadas, almacenadas, dispensa-
das y distribuidas. Estas responsabilidades incluyen el mantenimiento de condiciones higinicas apropiadas y el suministro de
etiquetado e instrucciones suplementarias para la administracin clnica correcta de las PME.
Los supervisores de preparacin magistral deben asegurar, ya sea mediante la evaluacin directa o a travs de fuentes de
informacin apropiadas, que cada PME mantiene el contenido declarado hasta su FLU dentro de los lmites de la monografa
correspondiente de USP, o dentro de un 10% de variacin en los casos no especificados. Todas las PME deben prepararse de
manera tal que se mantenga la esterilidad y se reduzca al mnimo la introduccin de partculas.
Todo procedimiento escrito de garanta de calidad debe incluir los siguientes controles de proceso, los cuales debern apli-
carse, segn corresponda, a las PME especficas: exactitud y precisin de la medicin y pesado; requisitos de esterilidad; mto-
dos de esterilizacin y purificacin; intervalos y lmites seguros de concentracin de ingredientes, endotoxinas bacterianas y
partculas; pH; totalidad y exactitud de la informacin incluida en el etiquetado; asignacin de la FLU; y requisitos de empaque
y almacenamiento. El dispensador deber, cuando corresponda y sea factible, obtener y evaluar los resultados de las pruebas
de identidad, contenido, pureza y esterilidad antes de dispensar una PME. Los profesionales de la salud, calificados y autoriza-
do, a cargo de supervisar la preparacin magistral y la dispensacin de las PME debern asegurar que se cumplan los siguien-
tes objetivos:
1. El personal de preparacin magistral debe contar con las habilidades, educacin, instruccin y capacitacin apropiadas
para realizar y documentar correctamente las siguientes actividades relacionadas con sus responsabilidades en la prepara-
cin estril:
a. realizar la limpieza antisptica de manos y desinfeccin de las superficies de preparacin no estriles;
b. seleccionar y colocarse la vestimenta en forma apropiada;
c. mantener o conseguir la esterilidad de las PME en dispositivos CIP, ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y proteger al personal y
a los ambientes de preparacin magistral de la contaminacin por frmacos radioactivos, citotxicos y quimiotxicos
(ver Frmacos Peligrosos como PME y Preparados Radiofarmacuticos como PME);
d. identificar, pesar y medir los ingredientes; y
e. manipular los productos estriles en forma asptica, esterilizar las PME de nivel de riesgo alto y etiquetar e inspeccio-
nar la calidad de las PME.
2. Los ingredientes deben tener la identidad, calidad y pureza correctas.
3. Los envases de ingredientes abiertos o parcialmente usados que se van a emplear posteriormente en PME deben almace-
narse apropiadamente bajo condiciones de acceso restringido en las instalaciones donde se realiza la preparacin magis-
tral. Dichos envases no podrn utilizarse cuando se detecte en una inspeccin visual que hay roturas no autorizadas en el
envase, cierre y sello; cuando el contenido no posea el aspecto, aroma y textura esperados; cuando el contenido no pase
las pruebas de identificacin especificadas por la institucin responsable de la preparacin magistral, y cuando haya exce-
dido la FLU o fecha de caducidad.
4. Las PME que contienen agua y que son no estriles durante cualquier fase del procedimiento de preparacin deben esteri-
lizarse dentro de las 6 horas posteriores a la finalizacin de la preparacin, para reducir al mnimo la generacin de endo-
toxinas bacterianas.
5. Los mtodos de esterilizacin deben lograr la esterilidad de las PME, manteniendo el contenido declarado de los ingre-
dientes activos y la integridad fsica del envase.
6. Los dispositivos utilizados para medicin, mezclado, esterilizacin y purificacin deben estar limpios y ser apropiadamente
exactos y eficaces para los usos a los que estn destinados.
7. Se debe evaluar cuidadosamente el dao potencial relacionado con las sustancias agregadas, y las diferencias en el grado
y la velocidad de biodisponibilidad de los ingredientes activos para las vas de administracin no oral antes de dispensar y
administrar dichas PME.
8. El envase seleccionado para las PME debe ser apropiado para conservar la esterilidad y el contenido hasta la FLU.
9. Durante su uso, el entorno de preparacin magistral debe mantener la esterilidad o la pureza previa a la esterilizacin de
la PME, segn corresponda.
1O. Las etiquetas de las PME deben indicar los nombres y las cantidades o concentraciones de los ingredientes activos; y las
etiquetas o etiquetado de inyecciones (ver Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Re-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 675

quisitos Generales) enumeran los nombres y las cantidades o concentraciones de todos los ingredientes (ver 1~!11~111
iRl1!1Jl~ilfiiil> Antes de su dispensacin o administracin, debe verificarse visualmente la transparencia de las solucio-
nes y, adems, deben revisarse la identidad y la cantidad de los ingredientes, los procedimientos de preparacin y esterili-
zacin de las PME y los criterios de liberacin especficos para asegurarse de que sean exactos y completos.
11. Las FLU deben asignarse basndose en pruebas directas o por extrapolacin de publicaciones de referencia y otra docu-
mentacin confiables (ver Criterios de Estabilidad y Fecha Lmite de Uso en Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles
(795)).
12. Los procedimientos para medir, mezclar, diluir, purificar, esterilizar, envasar y etiquetar deben ajustarse a la secuencia co-
rrecta y al nivel de calidad establecido para cada PME en particular.
13. Las deficiencias en la preparacin magistral, etiquetado, envasado y pruebas e inspeccin de calidad deben poder detec-
tarse y corregirse rpidamente.
14. Cuando el tiempo y la disponibilidad de personal lo permitan, las manipulaciones y los procedimientos de preparacin
magistral deben estar separados de la inspeccin y revisin de calidad postpreparacin que se llevan a cabo antes de la
dispensacin de las PME.
Este captulo enfatiza la necesidad de mantener estndares elevados de calidad y control en relacin con los procesos, com-
ponentes y ambientes de preparacin, y en relacin con las habilidades y los conocimientos del personal a cargo de la elabora-
cin de las PME. El rigor de los controles de calidad durante el proceso, de la inspeccin y pruebas de calidad posteriores a la
preparacin, aumenta en forma proporcional al nivel de riesgo potencial que supone la va de administracin. Por ejemplo, la
falta de esterilidad, la contaminacin excesiva con endotoxinas bacterianas, los errores significativos en la concentracin de los
ingredientes y el uso de ingredientes incorrectos en las PME son potencialmente ms peligrosos para los pacientes cuando s-
tas se administran en el sistema vascular y en el sistema nervioso central que cuando se lo hace a travs de las otras vas.

NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIN MICROBIANA EN LAS PME

Las tres categoras de contaminacin descritas para PME en esta seccin se asignan principalmente de acuerdo con el poten-
cial de contaminacin microbiana durante la preparacin magistral de PME de nivel de riesgo bajo y nivel de riesgo mediano o
el potencial que representa la falta de esterilizacin de las PME de nivel de riesgo alto, en donde cualesquiera de stas podra
ocasionar daos, o incluso la muerte del paciente. Las PME de nivel de riesgo alto se deben esterilizar antes de administrarlas a
los pacientes. Para asignar a una PME el nivel de riesgo correspondiente-bajo, mediano o alto-deben tenerse en cuenta las
probabilidades de que sta sufra (1) contaminacin microbiana (p.ej., microorganismos, esporas y endotoxinas) y (2) contami-
nacin qumica y fsica (p.ej., sustancias qumicas y materias fsicas extraas). Las fuentes potenciales de contaminacin inclu-
yen, entre otras, sustancias slidas y lquidas provenientes del personal y los objetos utilizados en la preparacin magistral;
componentes no estriles empleados e incorporados antes de la esterilizacin terminal; las condiciones inapropiadas dentro del
ambiente controlado de preparacin; los procedimientos de preesterilizacin prolongados en el caso de preparaciones acuo-
sas; y formas farmacuticas no estriles usadas en la elaboracin de las PME.
Las caractersticas que se describen a continuacin para PME de nivel de riesgo bajo, mediano y alto deben considerarse
como una gua sobre el grado y rigor de cuidado necesario en la preparacin magistral, pero no es exhaustiva ni prescriptiva.
Los profesionales de la salud autorizados, a cargo de supervisar las preparaciones magistrales tienen la responsabilidad de de-
terminar las prcticas de calidad de los procedimientos y del ambiente, y los atributos necesarios para el nivel de riesgo asigna-
do a cada PME.
Estos niveles de riesgo se aplican a la calidad de las PME inmediatamente despus del mezclado o llenado aspticos finales o
inmediatamente despus de la esterilizacin final, a menos que lo impidan las caractersticas especficas de la preparacin. Des-
pus del almacenamiento y transporte de las PME recin terminadas, debe esperarse un aumento en los riesgos de degrada-
cin qumica de los ingredientes, contaminacin por daos fsicos en los envases y permeabilidad de los envases de plstico y
elastomricos. En estos casos, el personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de considerar los riesgos adiciona-
les potenciales para la integridad de las PME al momento de asignar las FLU. La duracin del almacenamiento previo a la admi-
nistracin y los lmites de temperatura especificados en las siguientes subsecciones se aplican cuando no existan resultados di-
rectos de pruebas de esterilidad que justifiquen lmites diferentes para las PME especficas.

PME de Nivel de Riesgo Bajo

Las PME preparadas en las siguientes condiciones tienen un riesgo bajo de contaminacin.
Condiciones de Riesgo Bajo-
1. Las PME se preparan mediante manipulacin asptica y en un ambiente con una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1)
o una calidad de aire superior usando nicamente ingredierites, productos, componentes y dispositivos estriles.
2. La preparacin magistral slo incluye manipulaciones de transferencia, medicin y mezclado usando no ms de tres em-
paques de productos estriles fabricados comercialmente y no ms de dos ingresos en cualquier envase estril o empaque
(p.ej., bolsa, vial) del producto estril o envase/dispositivo de administracin para preparar la PME.
3. Las manipulaciones se limitan a la apertura asptica de ampollas, la penetracin de tapones desinfectados de viales con
agujas y jeringas estriles, y la transferencia de lquidos estriles en jeringas estriles a dispositivos de administracin est-
ril, envases de otros productos estriles y envases para almacenamiento y dispensacin.
676 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo bajo, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas de
Esterilidad (71 )), los perodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administracin,
las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no ms de 48 horas a temperatura ambiente con-
trolada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no ms de 14 das a temperatura fra (ver Advertencias y Requisitos
Generales) y durante 45 das en estado slido de congelacin entre -25 y -1 O.
Ejemplos de Preparacin Magistral de Riesgo Bajo-
1. Transferencias nicas de formas farmacuticas estriles desde ampollas, frascos, bolsas y viales, usando jeringas estriles
con agujas estriles, otros dispositivos de administracin y otros envases estriles. El contenido de la solucin de las ampo-
llas debe pasarse a travs de un filtro estril para retirar cualquier partcula.
2. Medicin y transferencia asptica simple con no ms de tres empaques de productos estriles fabricados comercialmente,
incluyendo una solucin para infusin o diluyente para elaborar las mezclas de frmacos y soluciones nutricionales.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos-Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los
requisitos descritos en Colocacin de Controles de Ingeniera Primarios o es una cabina de flujo laminar (CFL) o una cabina de
seguridad biolgica (CSB) que no puede ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces slo
se pueden preparar PME no peligrosas y preparados radiofarmacuticos de nivel de riesgo bajo, segn las rdenes de un mdi-
co para un paciente especfico y la administracin de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparacin o
segn lo recomendado en el prospecto adjunto del fabricante, cualquiera que sea menor. Las PME de nivel de riesgo bajo y
con FLU de 12 horas o menos deben cumplir con los cuatro criterios siguientes:
1. Los CIP (CFL, CSB, CAi, CACI) deben certificarse y mantenerse como ISO Clase 5 (ver Tabla 1) segn se describe en Diseo
de la Instalacin y Controles Ambientales para la exposicin de sitios crticos y deben estar en un rea segregada de prepa-
racin magistral y restringida a actividades de preparacin estril que minimicen el riesgo de contaminacin de la PME.
2. El rea segregada de preparacin magistral no debe estar en una instalacin que tenga ventanas o puertas sin sellar que
conecten con el exterior o que tenga un flujo de trfico alto, o que est adyacente a sitios de construccin, almacena-
miento o preparacin de alimentos. Se debe tener en cuenta que sta no pretende ser una lista exhaustiva.
3. El personal debe seguir los procedimientos descritos en Limpieza y Vestimenta del Persona/y Requisitos Adiciona/es del Perso-
nal antes de la preparacin magistral. Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
los lavabos deben estar separados del rea inmediata del dispositivo de CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
4. Segn se describe en el captulo, se deben seguir las especificaciones de Limpieza y Desinfeccin de las reas de Preparacin
Magistral Estril, Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Pro-
cedimientos de Limpieza y Desinfeccin, as como Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) para Partculas Viables y No Viables.
El personal de preparacin magistral debe reconocer que la ausencia de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7)
en un ambiente general no controlado aumenta la probabilidad de contaminacin microbiana, y que la duracin de la admi-
nistracin de PME contaminadas con microbios que exceda de unas cuantas horas aumenta el potencial de colonizacin mi-
crobiana clnicamente significativa y por lo tanto de dao para el paciente, especialmente si se trata de pacientes crticamente
enfermos o inmunocomprometidos.
Garanta de Calidad-Las prcticas de garanta de calidad incluyen, entre otras, las siguientes:
1. Desinfeccin rutinaria y pruebas de calidad del aire del entorno de preparacin directo para reducir al mnimo la contami-
nacin microbiana de las superficies y mantener una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
2. Verificacin visual de que el personal de preparacin magistral est usando correctamente los elementos y los tipos de
vestimenta protectora apropiados, incluyendo gafas y mscaras.
3. Revisin de todas las rdenes y envases de ingredientes para asegurar que la identidad y cantidad de los ingredientes in-
corporados en la preparacin magistral fueron los correctos.
4. Inspeccin visual de las PME para asegurar la ausencia de partculas en las soluciones, la ausencia de fugas en los viales y
bolsas y la informacin exacta y completa del etiquetado.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe ser efectuada al menos una vez
al ao por cada persona autorizada para realizar una preparacin en un entorno de nivel de riesgo bajo, en condiciones que
simulen las situaciones ms difciles o extremas que se encuentran durante la elaboracin de PME de nivel de riesgo bajo. Una
vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de un entorno de
calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir tres series de cuatro alcuotas de 5 ml de Medio de Digerido de Casena y
Soja estril (tambin conocido como caldo tripticasa de soja o agar tripticasa de soja [TSA]), con la misma combinacin de
jeringa de 1O ml y aguja con venteo estriles, a viales separados de 30 ml, transparentes, vacos, sellados y estriles (es decir,
cuatro alcuotas de 5 ml a cada uno de los tres viales de 30 ml). Fijar aspticamente sellos adhesivos estriles a los tapones de
goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20 y 25 o entre 30 y 35 durante un mnimo de 14 das. Si
se usan dos temperaturas para la incubacin de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos debern incubar-
se durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico
(1116)). Inspeccionar los viales durante 14 das para detectar cualquier crecimiento microbiano, segn se describe en la sec-
cin Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de
Limpieza y Desinfeccin.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 677

PME de Nivel de Riesgo Mediano

Cuando las PME se preparan aspticamente bajo Condiciones de Riesgo Bajo, y existe una o ms de las siguientes condiciones,
dichas PME tienen un riesgo mediano de contaminacin.
Condiciones de Riesgo Mediano-
1. Se combinan o agrupan mltiples dosis individuales o pequeas de productos estriles para preparar una PME que se ad-
ministrar a varios pacientes o a un solo paciente en varias ocasiones.
2. El proceso de preparacin magistral incluye manipulaciones aspticas complejas, aparte de la transferencia de volumen
nica.
3. El proceso de preparacin magistral tiene una duracin inusualmente prolongada, como la requerida para completar la
disolucin o el mezclado homogneo.
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo mediano, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas
de Esterilidad (71 )), los perodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administra-
cin, las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no ms de 30 horas a temperatura ambiente
controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no ms de 9 das a temperatura fra (ver Advertencias y Requi-
sitos Generales) y durante 45 das en estado slido de congelacin entre -25 y -1 O.
Ejemplos de Preparacin Magistral de Riesgo Mediano-
1. Preparacin magistral de lquidos para nutricin parenteral total usando dispositivos manuales o automatizados durante la
que se realizan varias inyecciones, desconexiones y conexiones de los productos que se usan como fuente de nutrientes al
dispositivo o mquina para suministrar todos los componentes nutricionales a un envase estril final.
2. Llenado de los reservorios de dispositivos de inyeccin e infusin con ms de tres productos farmacuticos estriles y eva-
cuacin del aire presente en dichos reservorios antes de dispensar el dispositivo llenado.
3. Transferencia de volmenes de mltiples ampollas o viales a uno o ms envases estriles finales.
Garanta de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo mediano incluyen los mismos
procedimientos utilizados para las PME de riesgo bajo y, adems, una prueba de llenado de medios ms exigente, que debe
realizarse en forma anual o con mayor frecuencia.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe realizarse al menos anualmente
en condiciones que simulen las situaciones ms difciles o extremas que se encuentran durante la elaboracin de preparaciones
magistrales. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de
un entorno de calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir aspticamente por gravedad seis alcuotas de 100 mL de
Medio Digerido de Casena y Soja estril a travs de tubuladuras separadas, a sendos recipientes estriles evacuados. A conti-
nuacin, distribuir los seis recipientes en tres pares y usar una combinacin estril de jeringa de 1O mL y aguja de calibre 18
para intercambiar dos alcuotas de 5 mL de medio de un recipiente al otro del par. Por ejemplo, despus de agregar una al-
cuota de 5 mL del primer recipiente al segundo recipiente del par, agitar este ltimo durante 1O segundos, tomar una alcuota
de 5 mL y volver a colocarla en el primer recipiente del par. Luego, agitar el primer recipiente durante 1 O segundos y transferir
la siguiente alcuota de 5 mL de vuelta al segundo recipiente del par. Despus de los dos intercambios de alcuotas de 5 mL en
cada par de recipientes, inyectar aspticamente una alcuota de 5 mL de medio de cada recipiente en un vial de 1 O mL, trans-
parente, vaco, sellado y estril, usando una jeringa de 1O mL y una aguja con venteo estriles. Fijar aspticamente sellos adhe-
sivos estriles a los tapones de goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20 y 25 o entre 30 y 35 por
un mnimo de 14 das. Si se usan dos temperaturas para la incubacin de las muestras de llenado de medios, entonces tales
envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Am-
bientes de Procesamiento Asptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 das para detectar cualquier crecimiento microbia-
no, segn se describe en la seccin Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de
Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin.

PME de Nivel de Riesgo Alto

Las PME elaboradas bajo cualquiera de las condiciones indicadas a continuacin estn contaminadas o tienen un riesgo alto
de contaminarse.
Condiciones de Riesgo Alto-
1. Se incorporan ingredientes no estriles, incluyendo productos fabricados comercialmente que no estn destinados para
vas de administracin estriles (p.ej., oral) o se emplea un dispositivo no estril antes de la esterilizacin terminal.
2. Cualquiera de los siguientes elementos se exponen a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante ms de 1
hora (ver PME de Uso Inmediato):
contenido estril de productos fabricados comercialmente,
PME que carecen de conservantes antimicrobianos eficaces, y
superficies estriles de dispositivos y envases para la preparacin, transferencia, esterilizacin y envasado de PME.
3. El personal de preparacin magistral tiene vestimenta y guantes inapropiados (ver Limpieza del Personal y Uso de Equipo
Protector de Barrera).
4. Las preparaciones no estriles que contienen agua se almacenan durante ms de 6 horas antes de su esterilizacin.
678 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

5. Se presume, sin verificar el etiquetado y la documentacin de los proveedores o sin determinacin directa, que la pureza
qumica y el contenido de los ingredientes cumplen con sus especificaciones originales o farmacopeicas en envases no
abiertos o abiertos de ingredientes a granel (ver Seleccin de Ingredientes en Preparacin Magistral-Preparaciones No Estri-
les (795)).
Si las preparaciones esterilizadas de nivel de riesgo alto no han pasado una prueba de esterilidad, los perodos de almacena-
miento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administracin, las PME deben almacenarse de forma apropiada
y exponerse durante no ms de 24 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante
no ms de 3 das a temperatura fra (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 das en estado slido de congelacin
entre -25 y -1 O. [NOTA-No se requieren pruebas de esterilidad para PME esterilizadas en autoclave, a menos que se prepa-
ren en lotes de ms de 25 unidades.]
Todos los dispositivos de medicin, mezclado y purificacin no estriles deben enjuagarse bien con agua estril apirgena y
luego deben escurrirse o secarse en su totalidad inmediatamente antes de utilizarlos para realizar preparaciones magistrales de
riesgo alto. Todas las soluciones PME de nivel de riesgo alto sometidas a esterilizacin terminal deben prefiltrarse, pasndolas
por un filtro con un tamao de poro nominal de no ms de 1,2 m, antes o durante el llenado de los envases finales, con el fin
de retirar las partculas. La esterilizacin por filtracin de las PME de nivel de riesgo alto debe realizarse con un filtro estril de
tamao de poro nominal de 0,2 m o 0,22 m, totalmente en un entorno con calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o
superior.
Ejemplos de Condiciones de Riesgo Alto-
1. Disolucin de polvos de frmacos y nutrientes a granel no estriles para preparar soluciones que se esterilizarn en forma
terminal.
2. Exposicin de los ingredientes y componentes estriles usados para preparar y envasar PME en una calidad de aire inferior
a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante ms de 1 hora (ver PME de Uso Inmediato).
3. Medicin y mezclado de ingredientes estriles en dispositivos no estriles antes de su esterilizacin.
4. Se supone, sin evidencia apropiada ni determinacin directa, que los envases de ingredientes a granel contienen al menos
un 95% en peso de su parte qumica activa y que no se han contaminado ni adulterado entre un uso y otro.
Garanta de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo alto incluyen los mismos procedi-
mientos que para las PME de riesgo bajo. Adems, cada persona autorizada para elaborar PME de riesgo alto, debe realizar
semestralmente una prueba de llenado de medios que represente una preparacin magistral de nivel de riesgo alto.
Procedimiento de Llenado de Medios para PME Esterilizadas por Filtracin-Esta prueba, u otra equivalente, debe reali-
zarse en condiciones que simulen las situaciones ms difciles o extremas que se encuentran durante la elaboracin de prepara-
ciones magistrales de nivel de riesgo alto. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo del proce-
dimiento de prueba (en la siguiente secuencia):
1. Disolver en 100 mL de agua no bacteriosttica 3 g de Medio de Digerido de Casena y Soja no estril disponible comer-
cialmente para preparar una solucin no estril al 3%.
2. Extraer 25 mL del medio en tres jeringas estriles de 30 ml. Transferir 5 mL de cada jeringa a sendos viales de 1 O mL
estriles. Estos viales son los controles positivos para generar un crecimiento microbiano exponencial, el cual se evidencia
por una turbidez visible despus de su incubacin.
3. Bajo condiciones aspticas y utilizando tcnicas aspticas, fijar a cada jeringa una unidad de filtracin estril con un tama-
o de poro nominal de 0,2 m o 0,22 m y una aguja de calibre 20. Inyectar los siguientes 1 O mL de cada jeringa en tres
viales de 1 O mL estriles. Repetir el proceso en tres viales ms. Etiquetar todos los viales, fijar sellos adhesivos estriles al
cierre de los nueve viales e incubarlos a una temperatura de 20 a 25 o de 30 a 35 durante un mnimo de 14 das. Si se
usan dos temperaturas para la incubacin de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos debern incu-
barse durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento
Asptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 das para detectar cualquier crecimiento microbiano, segn se descri-
be en la seccin Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y
Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin.

CAPACITACIN Y EVALUACIN DEL PERSONAL EN TCNICAS DE MANIPULACIN ASPTICA

El personal encargado de la preparacin de las PME deber recibir capacitacin competente y a conciencia por parte de per-
sonal experto, con ayuda de instruccin audiovisual y publicaciones profesionales, sobre los principios tericos y los conoci-
mientos prcticos en las manipulaciones aspticas, as como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO
Clase 5 (ver Tabla 1) antes de empezar a preparar las PME. Inicialmente, el personal de preparacin magistral deber realizar
una revisin didctica y pasar pruebas escritas y de llenado de medios para evaluar la destreza en la manipulacin asptica; en
adelante, se sometern a dichas pruebas al menos una vez al ao, en el caso de preparaciones magistrales de niveles de riesgo
bajo y mediano, y semestralmente, en el caso de preparaciones de nivel de riesgo alto. El personal de preparacin magistral
que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonizacin microbiana profu-
sa, deber recibir de inmediato una nueva capacitacin y someterse a una nueva evaluacin a cargo de personal experto en
preparacin magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de prctica asptica.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 679

Prueba de Desafo de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME aspticamente se puede evaluar
usando una verificacin de llenado de medios de cultivos bacterianos lquidos y estriles 1 (es decir, transferencia de un medio
de cultivo bacteriano estril a travs de una jeringa y aguja estriles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
prctica asptica del personal de preparacin magistral. Las pruebas de llenado de medios representan las condiciones ms
exigentes o difciles con las que el personal en proceso de evaluacin puede encontrarse durante la elaboracin de PME de un
determinado nivel de riesgo y durante la esterilizacin de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafo de llenado de
medios que simulan la elaboracin de PME de nivel de riesgo alto se usan tambin para verificar la capacidad del ambiente y
del proceso de preparacin magistral para producir una preparacin estril.
Los medios lquidos de cultivo estriles disponibles comercialmente, como el Medio de Digerido de Casena y Soja (ver Prue-
bas de Esterilidad (71 )), debern promover la colonizacin exponencial de las bacterias que el personal de preparacin magis-
tral y el entorno suelen transmitir a las PME. Los viales llenados con medios deben incubarse a una temperatura de 20 a 25 o
de 30 a 35 durante 14 das como mnimo. Si se usan dos temperaturas para la incubacin de muestras de llenado de medios,
entonces tales envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Mo-
nitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico (1116)). Si el medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 das, signifi-
ca que no se ha pasado la prueba.

PME DE USO INMEDIATO

La provisin de uso inmediato est destinada slo a aquellas situaciones en las cuales es necesario administrar de emergencia
o en forma inmediata una PME a un paciente. Dichas situaciones pueden incluir reanimacin cardiopulmonar, tratamiento en
sala de emergencias, preparacin de agentes de diagnstico, o terapia crtica donde la preparacin de la PME bajo las condi-
ciones descritas para PME de Nivel de Riesgo Bajo somete al paciente a un riesgo adicional debido a las demoras en la terapia.
Las PME de uso inmediato no estn destinadas a almacenamiento para necesidades anticipadas o preparacin magistral de
lotes. Las preparaciones magistrales que tienen nivel de riesgo mediano y nivel de riesgo alto no deben prepararse como PME
de uso inmediato.
Las PME de uso inmediato estn eximidas de los requisitos descritos para PME de Nivel de Riesgo Bajo, slo cuando se cum-
plen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparacin magistral incluye la transferencia simple de no ms de tres empaques fabricados comercialmen-
te de productos estriles no peligrosos o productos radiofarmacuticos de diagnstico desde los envases originales del fa-
bricante, y no ms de dos ingresos dentro de cualquier envase estril o empaque individual (p.ej., bolsa, vial) de solucin
estril para infusin o envase/dispositivo de administracin. Por ejemplo, los antineoplsticos no deben prepararse como
PME de uso inmediato porque son frmacos peligrosos.
2. A menos que la preparacin lo requiera, el procedimiento de preparacin magistral es un proceso continuo que no debe
exceder 1 hora.
3. Durante la preparacin, se sigue una tcnica asptica y, de no administrarse inmediatamente, la PME terminada permane-
ce bajo supervisin continua para minimizar el potencial de contacto con superficies no estriles, la introduccin de part-
culas o lquidos biolgicos, la mezcla con otras PME y el contacto directo de las superficies externas.
4. La administracin comienza a ms tardar una hora despus de haber comenzado la preparacin de la PME.
5. A menos que el prepador administre inmediata y completamente la PME, o el preparador vigile la administracin inme-
diata y completa de la misma, la PME debe llevar una etiqueta que indica la informacin de identificacin del paciente, los
nombres y las cantidades de todos los ingredientes, el nombre o iniciales de la persona que prepar la PME, as como la
FLU de 1 hora y la hora exactas.
6. Si la administracin no ha comenzado dentro de 1 hora de haberse iniciado la preparacin de la PME, sta debe descar-
tarse de inmediato en forma segura y adecuada.
La preparacin en condiciones inferiores a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) aumenta la probabilidad de contaminacin microbiana,
y la duracin de la administracin de PME contaminadas con microbios cuando excede de unas cuantas horas aumenta el po-
tencial de colonizacin microbiana clnicamente significativa y por lo tanto de dao para el paciente, especialmente si se trata
de pacientes crticamente enfermos o inmunocomprometidos.

ENVASES MONODOSIS Y MULTIDOSIS

Los envases monodosis abiertos o perforados con aguja, tales como bolsas, frascos, jeringas y viales de productos estriles y
PME se deben usar dentro de 1 hora si se abren en aire de calidad inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) (ver PME de Uso Inmedia-
to) y desechar cualquier contenido restante. Los viales monodosis expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o ms limpio se
pueden usar hasta 6 horas despus de la perforacin inicial con la aguja. Las ampollas monodosis abiertas no se deben almace-
nar por ningn perodo. Los envases multidosis (p.ej., viales) estn formulados para retirar porciones en mltiples ocasiones,
porque generalmente contienen conservantes antimicrobianos. La FLU despus de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 das (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto.

1 U.S. Food and Drug Administration, Guidance far lndustry, Steri/e Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice, septiembre
de 2004.
680 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles/ Pruebas Fsicas USP 39

FRMACOS PELIGROSOS COMO PME

Aunque los beneficios teraputicos potenciales de las preparaciones magistrales estriles de frmacos peligrosos por lo gene-
ral sobrepasan los riesgos de sus efectos adversos en pacientes enfermos, los profesionales de la salud expuestos se arriesgan a
efectos adversos similares, sin ningn beneficio teraputico. La exposicin ocupacional a frmacos peligrosos pueden llevar a
(1) efectos agudos, como erupciones cutneas; (2) efectos crnicos, incluso eventos adversos reproductivos; y (3) posiblemen-
te cncer (ver Apndice A de NIOSH Publication N 2004-165).
Los frmacos peligrosos se deben preparar para administracin slo bajo condiciones que protejan a los profesionales de la
salud y a otro personal en las reas de preparacin y almacenamiento. Los frmacos peligrosos se deben almacenar separados
de otro inventario, de manera que se evite la contaminacin y la exposicin del personal. Muchos frmacos peligrosos tienen
presiones de vapor suficientes que permiten la volatilizacin a temperatura ambiente; por lo tanto, se prefiere el almacena-
miento dentro de un rea de contencin, tal como un cuarto de presin negativa. El rea de almacenamiento debe tener sufi-
ciente ventilacin general de salida, con al menos 12 cambios de aire por hora (CAPH) 2 para diluir y retirar cualquier contami-
nante areo.
Los frmacos peligrosos se deben manejar con precaucin en todo momento, usando guantes apropiados para quimiotera-
pia durante la recepcin, distribucin, aprovisionamiento, inventariado, preparacin para administracin y eliminacin. Los fr-
macos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7), con controles de ingeniera protectores y si-
guiendo las prcticas aspticas especificadas para los niveles de riesgo de contaminacin apropiados definidos en este captulo.
Se debe limitar el acceso a las reas donde se almacenen y elaboren preparaciones de frmacos para proteger a las personas
que no estn involucradas en tal proceso.
Todos los frmacos peligrosos se deben preparar en una CSB3 o un CACI que cumple o excede los estndares para CACI en
este captulo. Las CSB o los CACI ISO Clase 5 (ver Tabla 7) deben ubicarse en un rea ISO Clase 7 (ver Tabla 7) que est fsica-
mente separada (es decir, un rea diferente de las reas de preparacin) y que tenga ptimamente una presin negativa de no
menos de 0,01 pulgadas de columna de agua con respecto a las antesalas adyacentes de presin positiva ISO Clase 7 (ver
Tabla 7) o mejor, proporcionando as un flujo hacia adentro para contener cualquier partcula de frmaco presente en el aire.
Se debe instalar un indicador de presin en el que pueda consultarse fcilmente la correcta presurizacin del cuarto. Las CSB y
los CACI deben estar ptimamente ventilados en un 100% al exterior a travs de filtracin HEPA.
Si un CACI que cumple los requisitos de este captulo se usa fuera de una zona amortiguadora, el rea de preparacin ma-
gistral debe mantener una presin negativa mnima de 0,01 pulgadas de columna de agua y tener un mnimo de 12 CAPH.
Cuando se usan dispositivos de sistema cerrado para transferencia de vial (CSTD, por sus siglas en ingls) (es decir, sistemas
de transferencia del vial que no permiten ventilacin ni exposicin de la sustancia peligrosa al ambiente), deben estar dentro
del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) de una CSB o un CACI. Se prefiere el uso de un CSTD debido a su proceso de sistema
cerrado inherente. En instalaciones que preparan un volumen bajo de frmacos peligrosos, se acepta el uso de dos niveles de
contencin (p.ej., un CSTD dentro de una CSB o un CACI que est ubicado en un cuarto de presin no negativa).
Cuando se usan CSTD y se realiza una preparacin magistral en una CSB o un CACI, debe usarse equipo protector para el
personal (EPP) apropiado. El EPP debe incluir batas, mscaras, gafas protectoras, gorras, cubrecalzado o calzado destinado a
ese propsito, doble enguantado con guantes estriles similares a los usados en quimioterapia y el cumplimiento con las reco-
mendaciones del fabricante al usar un CACI.
Todo el personal que elabora preparaciones con frmacos peligrosos debe capacitarse ampliamente en el almacenamiento,
manipulacin y eliminacin de estos frmacos. La capacitacin debe ocurrir antes de preparar o manipular PME peligrosas y su
eficacia debe ser verificada probando tcnicas especficas de preparacin para frmacos peligrosos. Dicha verificacin debe ser
documentada para cada persona al menos anualmente. Esta capacitacin debe incluir el repaso didctico de los frmacos peli-
grosos, incluyendo las propiedades mutagnicas, teratognicas y carcinognicas, y debe incluir capacitacin continua para ca-
da nuevo frmaco peligroso que entre al mercado. El personal de preparacin magistral que est en edad reproductiva debe
confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los frmacos peligrosos. La capacitacin debe incluir al menos los
siguientes puntos: (1) prcticas de manipulacin asptica segura; (2) tcnicas de presin negativa cuando se utiliza una CSB o
un CACI; (3) uso correcto de dispositivos CSTC; (4) procedimientos de contencin, limpieza y eliminacin en caso de rupturas
y derramamientos; y (5) tratamiento del personal en caso de exposicin por contacto o inhalacin.
NOTA-Dado que las normas de valoracin y las cantidades inaceptables de contaminacin de cada frmaco no han sido estable-
cidos en la literatura, el siguiente prrafo es slo una recomendacin. A medida que se desarrollen y prueben estos mtodos de ensa-
yo se adoptarn las normas apropiadas.
Con el fin de garantizar la contencin, especialmente en operaciones de preparacin que involucren grandes volmenes de
frmacos peligrosos, se deben tomar muestras ambientales rutinariamente para detectar frmacos peligrosos no contenidos
(p.ej., inicialmente como punto de referencia y al menos cada 6 meses o ms a menudo segn sea necesario para verificar la
contencin). Este muestreo ambiental debe incluir la obtencin de muestras con paos (wipe sampling) de la superficie del
rea de trabajo de una CSB y un CACI; mostradores donde se colocan las preparaciones terminadas; reas adyacentes a una
CSB y un CACI, incluso el piso directamente debajo del rea de trabajo; y reas de administracin a pacientes. Los marcadores

2 Guidelines for Environmental lnfection Control in Health-Care Facilities, Recommendations of CDC and the Healthcare lnfection Control Practices Advisory Com-
mittee (HICPAC), MMWR, vol. 52, no. RR-1 O, junio 6, 2003, figura 3, pg. 12.
3 NSF/ANSI 49.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 681

comunes de frmacos peligrosos que se pueden analizar incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, metotrexato y fluorouracilo. Si se
encuentra alguna contaminacin mensurable (se ha visto que concentraciones de ciclofosfamida mayores que 1,00 ng por cm 2
causan captacin del frmaco en humanos) por cualquiera de estos procedimientos de garanta de calidad, los profesionales
de salud deben tomar la decisin de identificar, documentar y contener la causa de la contaminacin. Tal accin puede incluir
la recapacitacin, limpieza cuidadosa (utilizando un jabn de pH elevado y agua) y mejora de los controles de ingeniera. Algu-
nos ejemplos de formas de mejorar los controles de ingeniera incluyen (1) ventilar la CSB o el CACI 100% hacia el exterior; (2)
implementar un CSTD; o (3) reevaluar los tipos de CSB o CACI.
La eliminacin de desechos de frmacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales. Todo
el personal que efecta las actividades rutinarias de eliminacin de desechos y limpieza en las reas de almacenamiento y pre-
paracin con frmacos peligrosos debe recibir capacitacin en los procedimientos apropiados para protegerse y prevenir la
contaminacin.

PREPARADOS RADIOFARMACUTICOS COMO PME

En el caso de la produccin de preparados radiofarmacuticos para tomografa por emisin de positrones (PET), el captulo
Preparados Radiofarmacuticos para Tomografa por Emisin de Positrones-Preparacin Magistral (823) reemplaza este captulo.
Despus de la liberacin de un preparado radiofarmacutico para PET como producto farmacutico terminado de una instala-
cin de produccin, el posterior manejo, manipulacin o uso del producto ser considerado como preparacin magistral y el
contenido de esta seccin y captulo es aplicable.
A los efectos de este captulo, los preparados radiofarmacuticos magistrales elaborados a partir de componentes estriles en
envases estriles cerrados y con un volumen de 100 mL o menos monodosis o no ms de 30 mL tomados
de un envase multidosis (ver se deben nombrar segn las nor-
mas para PME de Nivel de Riesgo Bajo y cumplir con ellas.
Al preparar magistralmente estos productos radiofarmacuticos, se deben usar jeringas y viales apropiadamente blindados
dentro de un CIP que funcione adecuadamente y que est certificado como ISO Clase 5 (ver Tabla 1), localizado en un am-
biente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o ms limpio, que permita el cumplimiento con los requisitos especiales de manipula-
cin, proteccin y flujo de aire negativo.
Los viales de productos radiofarmacuticos destinados a mltiples usos, preparados magistralmente con tecnecio 99m, ex-
puestos a un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y perforados por agujas sin contaminacin por contacto directo, pueden usar-
se hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante. El almacenamiento y transporte de los viales adecuadamente
blindados de PME radiofarmacuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado sin una designacin especifica de clase
ISO.
Los sistemas generadores de tecnecio 99m/molibdeno 99 deben almacenarse y eluirse (manejarse) bajo las condiciones re-
comendadas por el fabricante y las reglamentaciones estatales y federales aplicables. Dichos sistemas generadores deben eluir-
se en un ambiente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o ms limpio que permita cumplir con los requisitos especiales de manipu-
lacin, proteccin y flujo de aire. Para limitar la exposicin aguda y crnica del personal de inspeccin a un nivel de radiacin
tan bajo como sea razonablemente posible (ALARA), se debe efectuar la inspeccin visual directa, de acuerdo con ALARA, de
las PME radiofarmacuticas que contengan concentraciones altas de dosis de radioactividad.
Los preparados radiofarmacuticos elaborados como PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos se deben pre-
parar en un rea segregada. Se debe fijar una lnea de demarcacin que defina el rea de preparacin magistral segregada. Los
materiales y la vestimenta expuestos en el rea de atencin y tratamiento del paciente no deben cruzar una lnea de demarca-
cin dentro del rea de preparacin magistral segregada.

EXTRACTOS DE ALRGENOS COMO PME

Los extractos de alrgenos como PME son inyecciones monodosis y multidosis para uso intradrmico o subcutneo, prepara-
dos por mdicos especialmente capacitados y el personal bajo su supervisin directa. Los extractos de alrgenos como PME
quedan exentos de los requisitos indicados para el personal, ambiente y almacenamiento de todos los Niveles de Riesgo de Con-
taminacin Microbiana en las PME descritos en este captulo, slo cuando se cumplen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparacin magistral involucra la transferencia simple por medio de agujas y jeringas de productos estriles
comerciales de alrgenos y sustancias estriles apropiadas agregadas (p.ej., glicerina, fenol y cloruro de sodio para inyec-
cin).
2. Todos los extractos de alrgenos como PME deben contener sustancias apropiadas en concentraciones eficaces para pre-
venir el crecimiento de microorganismos. Los extractos de alrgenos no conservados deben cumplir con los requisitos
apropiados de nivel de riesgo para PME en este captulo.
3. Antes de comenzar las actividades de preparacin magistral, el personal sigue un procedimiento cuidadoso de lavado de
manos para quitar los detritos bajo las uas con un limpiador de uas bajo agua tibia corriente, seguido por un lavado
vigoroso de manos y brazos hasta el codo, durante al menos 30 segundos, con un jabn antimicrobiano o no antimicro-
biano y agua.
 682 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles/ Pruebas Fsicas USP 39

4. El personal de preparacin magistral se coloca gorras, mascarillas que cubran el vello facial, batas y mscaras.
5. El personal de preparacin magistral realiza el lavado antisptico de manos con un exfoliante quirrgico a base de alcohol
con actividad persistente.
6. El personal de preparacin magistral utiliza guantes estriles exentos de polvo que sean compatibles con alcohol isoprop-
lico al 70% (IPA) antes de comenzar las manipulaciones de la preparacin magistral.
7. El personal de preparacin magistral desinfecta los guantes intermitentemente con IPA estril al 70% cuando prepara
mltiples extractos de alrgenos como PME.
8. Los cuellos de las ampollas y los tapones de viales en los envases de ingredientes estriles fabricados comercialmente se
desinfectan frotndolos cuidadosamente con hisopos empapados en IPA estril al 70% para garantizar que los sitios crti-
cos estn hmedos durante al menos 1 O segundos y se dejen secar antes de usarlos para la preparacin de extractos de
alrgenos como PME.
9. Las manipulaciones aspticas de las preparaciones magistrales minimizan la contaminacin directa por contacto (p.ej., de
las puntas de los dedos de los guantes, sangre, secreciones orales y nasales, piel y cosmticos descamados, otros materia-
les no estriles) con sitios crticos (p.ej., agujas, ampollas abiertas, tapones de viales).
1 O. La etiqueta de cada vial multidosis (VMD) de extractos de alrgenos como PME incluye el nombre de un paciente especfi-
co as como la FLU y el intervalo de temperatura de almacenamiento que se asignan basndose en las recomendaciones
del fabricante o publicaciones de referencia.
11. Las ampollas monodosis de extractos de alrgenos como PME no se deben almacenar para uso adicional subsiguiente.
El personal que prepara extractos de alrgenos como PME debe ser consciente del mayor riesgo potencial de contaminacin
microbiana y con materia extraa cuando los extractos de alrgenos como PME se preparan cumpliendo con criterios anterio-
res en vez de seguir las normas ms rigurosas de este captulo para Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana en las PME.
Aunque los extractos de alrgenos como PME pueden representar riesgos para la salud de los pacientes cuando se inyectan
intradrmica o subcutneamente, estos riesgos son sustancialmente mayores si el extracto se inyecta por va intravenosa inadver-
tidamente.

VERIFICACIN DE LA EXACTITUD V ESTERILIDAD DE LA PREPARACIN MAGISTRAL

Los procedimientos de preparacin magistral y los mtodos de esterilizacin de PME deben corresponder con los especifica-
dos en la documentacin escrita, debidamente confeccionada y verificada por la institucin responsable de la preparacin ma-
gistral. La verificacin requiere pruebas planificadas, monitoreo y documentacin que permitan demostrar el cumplimiento de
los requisitos de calidad ambiental, las prcticas del personal y los procedimientos crticos para conseguir y mantener la esterili-
dad, exactitud y pureza de las PME terminadas. Por ejemplo, pueden realizarse pruebas de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad
para el Producto a Examinar en Pruebas de Esterilidad (71 )) con muestras de PME de riesgo bajo y mediano, y deben agregarse
indicadores biolgicos (IB) estndar autocontenidos a muestras no dispensables de PME de nivel de riesgo alto antes de su
esterilizacin terminal para determinar en la evaluacin posterior si el ciclo de esterilizacin fue adecuado (ver Indicadores Biol-
gicos para Esterilizacin (1035)). Las PME envasadas y etiquetadas deben inspeccionarse visualmente para verificar su integridad
fsica y aspecto esperado, incluyendo la cantidad de llenado final. La exactitud de las identidades, concentraciones, cantidades
y purezas de los ingredientes de las PME se deben confirmar revisando las etiquetas en los envases, observando y documentan-
do las mediciones correctas con los dispositivos aprobados y correctamente estandarizados, y revisando la informacin en el
etiquetado y en los certificados de anlisis proporcionados por los proveedores. Cuando no se pueda confirmar la identidad, la
pureza, el contenido y la esterilidad correctas de los ingredientes y componentes de las PME (por ejemplo, en caso de jeringas
sin etiquetado, ampollas abiertas, tapones de viales y bolsas perforados, envases de ingredientes con etiquetado incompleto),
dichos ingredientes y componentes se deben desechar de inmediato.
Algunos ingredientes individuales, como frmacos a granel, no se etiquetan con las fechas de caducidad cuando se mantie-
nen estables indefinidamente en sus empaques comerciales, bajo las condiciones de almacenamiento declaradas. Sin embargo,
a pesar de conservar estabilidad qumica completa, dichos ingredientes pueden ganar o perder humedad durante el almacena-
miento y uso. Los cambios en el contenido de humedad pueden requerir pruebas (ver Prdida por Secado (731 )) para determi-
nar la cantidad correcta que se debe pesar para obtener el contenido exacto de las partes qumicas activas en las PME (ver
Clculos en Ja Prctica Farmacutica (1160)).
Aunque no se requiere, se recomienda realizar un ensayo qumico cuantitativo indicador de estabilidad para garantizar la
exactitud de la preparacin de las PME, especialmente de aquellas que contienen ingredientes farmacuticos con un estrecho
intervalo de concentracin teraputica en plasma.

Mtodos de Esterilizacin

Los profesionales de la salud autorizados que estn a cargo de supervisar las preparaciones magistrales son responsables de
asegurar que el mtodo de esterilizacin seleccionado (ver Mtodos de Esterilizacin en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de
Artculos Farmacopeicos (1211 )) esterilice y mantenga el contenido, pureza, calidad e integridad del envase de las PME. El pro-
ceso de esterilizacin seleccionado se obtiene a partir de la experiencia y de las fuentes de informacin apropiadas (p.ej., ver
Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos (1211 )) y, preferentemente, se verifica hasta donde sea posible
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 683

para conseguir la esterilidad de las PME especficas. stas son algunas guas generales para asignar un mtodo de esterilizacin
apropiado a una PME y sus componentes:
1. Debe comprobarse que las PME se mantienen fsica y qumicamente estables cuando se las somete al mtodo de esterili-
zacin seleccionado.
2. Los dispositivos de vidrio y metal pueden cubrirse hermticamente con papel de aluminio y luego exponerse a calor seco
en un horno a una temperatura media de 250 durante 30 minutos para lograr la esterilidad y despirogenizacin (ver
Esterilizacin por Calor Seco en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos (1211 )) y Prueba de Endoto-
xinas Bacterianas (85)). Dichos artculos deben usarse de inmediato o almacenarse hasta su uso en un ambiente adecuado
para la elaboracin de las PME de Nivel de Riesgo Bajo y Mediano.
3. El personal debe determinar, a partir de fuentes de referencia apropiadas, si el filtro de membrana microporosa estril usa-
do para esterilizar las soluciones de PME, ya sea durante su preparacin magistral o su administracin, es qumica y fsica-
mente compatible con la PME.

ESTERILIZACIN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR FILTRACIN

Los filtros estriles disponibles comercialmente deben estar aprobados para la esterilizacin de lquidos farmacuticos de uso
en seres humanos. Los filtros estriles usados para esterilizar las PME deben estar exentos de pirgenos y tener un tamao no-
minal de poro de 0,2 0,22 m. El fabricante debe certificar que retienen al menos 10 7 microorganismos de una cepa de
Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta en cada centmetro cuadrado del rea superficial de la cara superior del filtro en condi-
ciones similares a las que se utilizarn para esterilizar las PME (ver Condiciones de Alto Riesgo en PME de Nivel de Riesgo Alto).
El supervisor de preparacin magistral debe asegurar, en forma directa o a partir de documentacin apropiada, que los fil-
tros sean qumica y fsicamente estables en las condiciones de presin y temperatura que se utilizarn, que tengan capacidad
suficiente para filtrar los volmenes requeridos y que logren la esterilidad y mantengan la calidad farmacutica previa a la filtra-
cin, incluida la concentracin de ingredientes de la PME especfica. Las dimensiones del filtro y el lquido a esterilizar deben
permitir que el proceso de esterilizacin se complete rpidamente sin reemplazar el filtro durante el proceso. Cuando se sabe
que la PME contiene una cantidad excesiva de partculas, debe colocarse un prefiltro de membrana con un tamao nominal de
poro mayor, antes del filtro de esterilizacin, para eliminar las partculas contaminantes grandes y aumentar al mximo la efica-
cia del filtro de esterilizacin.
Las unidades de filtracin usadas para esterilizar las PME tambin deben someterse a las pruebas de integridad recomenda-
das por el fabricante, como la prueba de punto de burbuja.
El personal de preparacin magistral debe verificar que los filtros seleccionados logren la esterilizacin de las PME que se
estn esterilizando. Las desviaciones significativas respecto de las propiedades qumicas y fsicas normales o esperadas de las
PME (p.ej., alcoholes miscibles en agua) podran causar daos no detectables en la integridad del filtro y la reduccin de los
microorganismos a un tamao ms pequeo que el de los poros del filtro.

ESTERILIZACIN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR VAPOR

El proceso de esterilizacin trmica utilizando vapor saturado bajo presin, o esterilizacin en autoclave, es el mtodo prefe-
rido para la esterilizacin terminal de preparaciones acuosas que, segn se ha verificado, mantienen su estabilidad qumica y
fsica bajo las condiciones empleadas (ver Esterilizacin por Vapor en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmaco-
peicos (1211 )). Para lograr la esterilidad, todos los materiales deben exponerse al vapor a una temperatura de 121 , bajo una
presin de aproximadamente 1 atmsfera o 15 psi, durante un tiempo que, segn se haya verificado mediante pruebas, logre
la esterilidad de los artculos. Por lo general, este tiempo es de 20 a 60 minutos en el caso de las PME. Debe contemplarse el
tiempo requerido para que el material alcance los 121 antes de medir la duracin de la exposicin de esterilizacin.
Si no se exponen directamente los artculos a vapor presurizado, pueden sobrevivir algunos microorganismos y esporas. An-
tes de su esterilizacin, los dispositivos de plstico, vidrio y metal deben envolverse hermticamente en un papel o tela de bajo
desprendimiento de partculas o sellarse en sobres que impidan la penetracin microbiana despus de su esterilizacin. Inme-
diatamente antes de llenar las ampollas y viales que se esterilizarn con vapor, las soluciones deben pasarse por un filtro con
un tamao nominal de poro de no ms de 1,2 m para eliminar las partculas. Los envases sellados deben poder generar vapor
internamente; en consecuencia, los viales vacos con tapn y precintados deben contener una pequea cantidad de humedad
para generar vapor.
La descripcin de las condiciones y duracin de la esterilizacin por vapor para cada PME debe estar documentada por escri-
to en la institucin responsable de la preparacin magistral. La eficacia de la esterilizacin con vapor debe verificarse utilizando
IB apropiados de Bacillus stearothermophilus (ver Indicadores Biolgicos (1035)) y otros mtodos de verificacin, como los dispo-
sitivos sensores de temperatura (ver Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos (1211) y Pruebas de Esterili-
dad (71 )).
684 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles/ Pruebas Fsicas USP 39

ESTERILIZACIN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR CALOR SECO

La esterilizacin por calor seco se realiza por lo general como un proceso por lotes en un horno destinado a esterilizacin. El
aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a travs de la cmara, por medio de un dispositivo ventilador. El horno
debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposicin. La esterilizacin por calor seco requie-
re temperaturas ms altas y tiempos de exposicin ms prolongados que la esterilizacin por vapor. El calor seco se debe usar
slo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daa el material o ste es impermea-
ble. Durante la esterilizacin se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulacin del aire
caliente. La descripcin de las condiciones y duracin de la esterilizacin por calor seco para cada PME debe estar documenta-
da por escrito en la institucin responsable de la preparacin magistral. La eficacia de la esterilizacin por calor seco debe veri-
ficarse utilizando IB apropiados de Bacillus subtilis (ver Indicadores Biolgicos (1035)) y otros mtodos de verificacin, como los
dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos (1211) y Pruebas de
Esterilidad (71 )). [NOTA-La esterilizacin por calor seco se puede efectuar a una temperatura ms baja de la que podra ser
eficaz para la despirogenizacin].

Despirogenizacin por Calor Seco

La despirogenizacin por calor seco se debe usar para eliminar los pirgenos y los microbios viables de los materiales o enva-
ses de vidrio, como los viales. Un ciclo tpico sera de 30 minutos a 250. La descripcin del ciclo de despirogenizacin por
calor seco y su duracin para artculos de una carga especfica debe estar documentada por escrito en la institucin responsa-
ble de la preparacin magistral. La eficacia del ciclo de despirogenizacin por calor seco se debe verificar usando viales para
desafo de endotoxinas (VDE). La prueba de endotoxinas bacterianas se debe efectuar en los VDE para verificar que el ciclo es
capaz de conseguir una reduccin de 3 log en endotoxinas (ver Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos
(1211) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)).

CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL

Lograr y mantener la esterilidad y la ausencia total de contaminacin de una PME depende de la calidad de los componen-
tes incorporados, del proceso utilizado, del desempeo del personal y de las condiciones ambientales en las que se realiza el
proceso. Los niveles de exigencia requeridos en relacin con las condiciones ambientales dependen del grado de exposicin
esperado de la PME al entorno inmediato durante su procesamiento. En esta seccin se describen la calidad y el control de las
condiciones ambientales para cada nivel de riesgo de operacin. Adems, las operaciones que utilizan componentes no estri-
les requieren el uso de un mtodo de preparacin diseado para obtener una preparacin estril.

Exposicin de Sitios Crticos

Mantener la esterilidad y la limpieza (es decir, ausencia de materia extraa estril) de los sitios crticos es una salvaguarda
importante para las PME. Los sitios crticos son aquellos que incluyen cualquier componente o superficie de recorrido de lqui-
dos (p.ej., septos de viales, puertos de inyeccin, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores
de agujas) expuestos y en riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secre-
ciones orales o mucosas), o contaminacin por contacto. El riesgo o probabilidad de que los sitios crticos se contaminen con
microorganismos y materia extraa se incrementa con el aumento del rea expuesta de los sitios crticos, la densidad o con-
centracin de los contaminantes y la duracin de la exposicin a una calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1). Los
ejemplos incluyen una ampolla abierta o un tapn en un vial de 1O mL o de mayor volumen o un puerto de inyeccin en un
envase de solucin intravenosa que tiene un rea ms grande que la punta de la aguja o de una jeringa.
Las caractersticas del sitio crtico tambin influyen en el grado de riesgo de contaminacin. Despus de frotarla con una
gasa embebida en IPA estril al 70%, la superficie relativamente spera y permeable de un tapn elastomrico retiene microor-
ganismos y otros contaminantes con ms facilidad que la superficie de vidrio ms lisa del cuello de una ampolla. En conse-
cuencia, puede esperarse que la desinfeccin de la superficie sea ms eficaz en el caso de una ampolla.
En la prctica de preparacin magistral estril, se debe dar la ms alta prioridad a la proteccin de los sitios crticos, evitando
el contacto fsico y los contaminantes areos. Los contaminantes areos, especialmente aquellos generados por el personal de
preparacin magistral estril, tienen muchas ms probabilidades de llegar a los sitios crticos que los contaminantes que estn
adheridos al piso o a otras superficies por debajo del nivel de trabajo. Ms an, las partculas grandes y de alta densidad que se
generan e introducen mediante las manipulaciones de la preparacin magistral y el personal tienen el potencial de asentarse
en los sitios crticos incluso cuando dichos sitios estn expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1).

Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas

Las fuentes ms comunes de aire de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposicin de sitios crticos son CFL horizontales y
verticales, CAi y CACI. Un cuarto limpio (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico (1116))
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 685

es un ambiente para preparaciones magistrales provisto con HEPA o aire filtrado con HEPA, el cual cumple con ISO Clase 7 (ver
Tabla 7), y cuyo acceso est limitado al personal capacitado y autorizado para realizar la preparacin magistral estril y la lim-
pieza de las instalaciones. Una zona amortiguadora es un rea provista con aire de calidad ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como
mnimo.
La Figura 7 es una representacin conceptual de la colocacin de un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) en un rea de preparacin
magistral segregada, usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Este plano muestra el rea de
operacin ms crtica localizada dentro del CIP en un rea designada (ver definicin de rea de Preparacin Magistral Segrega-
da) separada de las actividades no esenciales para la preparacin de las PME. La colocacin de dispositivos (p.ej., computado-
ras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales para la preparacin magistral en el rea segregada
debe estar restringida o limitada, dependiendo de su efecto sobre la calidad del aire en el CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1).

Representacin conceptual de los

requisitos de las instalaciones del
Captulo <797> de la USP

Figura 1. Representacin conceptual de la colocacin de un CIP ISO Clase 5 en un rea de preparacin magistral segregada,
usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos.
La Figura 2 es una representacin conceptual de la distribucin de una instalacin para la preparacin de PME clasificadas
como de nivel de riesgo bajo, mediano y alto. La calidad del aire ambiental aumenta con el movimiento desde el lmite exter-
no hacia el rea directa de preparacin magistral (ADP). La colocacin de dispositivos en las antesalas y las zonas amortiguado-
ras est dictada por su efecto sobre la calidad ambiental designada de las atmsferas y superficies, que debe ser verificada por
monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partculas Viables y No Viables). Cada instalacin de preparacin magis-
tral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposicin de sitios crti-
cos y esterilizacin por filtracin estn adecuadamente ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.

Figura 2. Representacin conceptual de la distribucin de una instalacin para la preparacin de PME clasificadas como de
riesgo bajo, mediano y alto.
La colocacin de los dispositivos (p.ej., computadoras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales
para la preparacin magistral en las antesalas y las zonas amortiguadoras est dictada por su efecto sobre la calidad ambiental
requerida para las atmsferas y superficies, que debe ser verificada por monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de
Partculas Viables y No Viables). Cada instalacin de preparacin magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes
de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para exposicin de sitios crticos y esterilizacin por filtracin estn adecuadamente
ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.
686 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

Diseo de la Instalacin y Controles Ambientales

Las instalaciones de preparacin magistral estn fsicamente diseadas y ambientalmente controladas para minimizar el con-
tacto de la contaminacin area con los sitios crticos. Estas instalaciones deben proporcionar tambin un ambiente de trabajo
cmodo y bien iluminado, por lo general con una temperatura de 20 o menos, para brindar condiciones de comodidad al
personal de preparacin magistral para que se desempee correctamente mientras est ataviado con la vestimenta requerida
para la preparacin magistral asptica. Los CIP por lo general incluyen, entre otros, CFL, CSB, CAi y CACI, los cuales brindan
un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la exposicin de sitios crticos. Los CIP deben mantener las condiciones ISO Clase 5
(ver Tabla 7) o mejores para las partculas de 0,5 m (condiciones dinmicas de funcionamiento) mientras se preparan PME.
Los controles de ingeniera secundarios, tales como zonas amortiguadoras y antesalas, por lo general sirven como centro para
la ubicacin del CIP. Las zonas amortiguadoras estn diseadas para mantener condiciones ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como
mnimo, para partculas de 0,5 m bajo condiciones dinmicas, y condiciones ISO Clase 8 (ver Tabla 7) para partculas iguales
o mayores de 0,5 m bajo condiciones dinmicas para las antesalas. El control de contaminacin area se logra en el CIP por
medio de filtros HEPA. El flujo de aire en el CIP debe ser unidireccional (flujo laminar) y debido a la eficiencia de recoleccin de
partculas del filtro, cuando se trata de preparacin magistral asptica, el "primer aire" en la cara del filtro est libre de conta-
minacin por partculas areas. El aire filtrado por HEPA debe suministrarse en las reas crticas (ISO Clase 5, ver Tabla 7) a una
velocidad suficiente para arrastrar las partculas lejos del rea de preparacin magistral y mantener el flujo de aire unidireccio-
nal durante las operaciones. El diseo y control apropiados evitan la turbulencia y el aire estancado en el rea crtica. En el rea
crtica se debe realizar un anlisis del patrn de aire in situ por medio de estudios con humo para demostrar el flujo unidirec-
cional del aire y la accin de arrastre sobre el producto bajo condiciones dinmicas.
Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar
en el proceso de preparacin magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas. Las polticas y procedi-
mientos para el mantenimiento y trabajo dentro del rea del CIP se deben poner por escrito y cumplir. Las polticas y procedi-
mientos estarn determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparacin magistral asptica utilizadas
durante la preparacin de las PME. El ambiente de trabajo de la PME est diseado para tener las superficies de trabajo ms
limpias (CIP) localizadas en una zona amortiguadora. La zona amortiguadora deber mantener condiciones ISO Clase 7 (ver
Tabla 7) como mnimo, para las partculas iguales o mayores de 0,5 m bajo condiciones de operacin dinmicas. El cuarto
debe estar segregado de los espacios circundantes no clasificados, para reducir el riesgo de que se soplen, arrastren o introduz-
can de otra manera contaminantes dentro del ambiente de flujo unidireccional de aire filtrado y tal segregacin debe monito-
rearse en forma constante. Para cuartos que proporcionan una separacin fsica por medio de paredes, puertas y cabinas de
transferencia de materiales (pass-throughs), se requiere una presin positiva diferencial mnima de 0,02 a 0,05 pulgadas de
columna de agua. Para zonas amortiguadoras no fsicamente separadas de las antesalas, se debe emplear el principio de des-
plazamiento del flujo de aire. Este concepto utiliza un principio de baja presin diferencial y alto flujo de aire. El uso de despla-
zamiento del flujo de aire requiere por lo general una velocidad de aire igual o mayor a 40 pies por minuto desde la zona
amortiguadora, pasando por la lnea de demarcacin hacia la antesala.
El concepto de desplazamiento no debe usarse para preparacin magistral de alto riesgo. 4 El CIP debe estar ubicado dentro
de una zona amortiguadora de tal manera que se eviten condiciones que podran afectar adversamente su funcionamiento.
Por ejemplo, las corrientes de aire fuertes provenientes de las puertas abiertas, el trfico del personal o los flujos de aire prove-
nientes de los sistemas de HVAC pueden alterar el flujo de aire unidireccional en cabinas de frente abierto. Los operadores tam-
bin pueden producir alteraciones en el flujo de aire con sus propios movimientos y al colocar objetos sobre la superficie de
trabajo. El CIP debe ubicarse fuera del flujo de trfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto
no causen perturbaciones. Los intercambios de aire del cuarto por lo general se expresan como CAPH. Se necesita un adecua-
do flujo de aire filtrado por HEPA y suministrado a la zona amortiguadora y a la antesala, con el fin de mantener la clasificacin
de limpieza durante la actividad operativa a travs de los CAPH. Los factores que deben considerarse al determinar los requisi-
tos de cambio de aire incluyen la cantidad de personas que trabajan en el cuarto y los procesos de preparacin magistral que
generan partculas, as como los efectos de la temperatura. Una zona amortiguadora y una antesala ISO Clase 7 (ver Tabla 7)
provistas de aire filtrado por HEPA deben recibir no menos de 30 CAPH. El CIP es una buena forma de incrementar los cambios
de aire en el suministro de aire de un rea, pero no puede ser la nica fuente de aire filtrado por HEPA. Cuando el rea cuenta
con un dispositivo de recirculacin ISO Clase 5 (ver Tabla 7) se considera adecuado un mnimo de 15 CAPH a travs de los
filtros HEPA que abastecen el rea, siempre y cuando los CAPH combinados no sean menores de 30. Se pueden requerir ms
intercambios de aire, dependiendo de la cantidad de personas y procesos. El suministro de aire filtrado por HEPA se debe intro-
ducir por el cielo raso y los retornos se deben montar a un nivel bajo en la pared, creandose as una dilucin general, de arriba
hacia abajo, del aire del rea con el aire filtrado por HEPA. No se recomienda ubicar los retornos en el cielo raso. Debe probar-
se la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamao de partcula ms penetrante y deben probarse por fugas en la fbrica
y de nuevo in situ despus de la instalacin.s
Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se tra-
baja en un ambiente controlado. Slo pueden llevarse a este cuarto los muebles, equipos, suministros y otros materiales reque-

4 ISO 14644-4:2001 Cleanrooms and associated controlled environments-Design, construction, and start-up, Case Posta/e 56, CH-1211 Geneve 20, Switzerland,
tel. +41 22 749 0111.
5 Por definicin {IEST RP CC 0001.4), los filtros HEPA tienen como mnimo una eficacia de 99,97% cuando se prueban usando un fotmetro y partculas de 0,3
m generadas termalmente o clasificadas segn el tamao de partcula ms penetrante, usando un contador de partculas.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 687

ricios para realizar las actividades de preparacin magistral y stos deben ser impermeables, lavables, resistentes a los desinfec-
tantes y no desprender partculas. Cada vez que se lleva alguno de estos elementos al cuarto, primero se lo debe limpiar y
desinfectar. Siempre que sea posible, los equipos y otros elementos usados en la zona amortiguadora no deben retirarse del
cuarto, salvo para su calibracin, reparacin u otras actividades asociadas con el mantenimiento correcto del equipo.
Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora de-
ben ser lisos e impermeables, no deben tener grietas y no deben desprender partculas para facilitar su limpieza y reducir al
mnimo los espacios en los que podran acumularse microorganismos y otros contaminantes. Las superficies deben ser resisten-
tes a los daos causados por agentes desinfectantes. Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o
enmasilladas para evitar la formacin de grietas donde pueda acumularse polvo. Si los cielos rasos constan de paneles incrusta-
dos, stos se deben impregnar con un polmero para hacerlos impermeables e hidrfobos y, adems, se debe enmasillar todo
su permetro para sellar la unin con el armazn que hace de soporte. Las paredes pueden ser de material flexible (p.ej., pol-
mero de alta densidad), paneles unidos entre s y sellados o placas de yeso con revestimiento epxico. Preferentemente, los
pisos deben cubrirse con planchas anchas de revestimiento vinlico, trmicamente soldadas y arqueadas hacia los zcalos. De-
be evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberas de servicios que pasan por el cielo raso o
las repisas de las ventanas. La superficie externa de los artefactos de iluminacin embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar
sellada y al ras del cielo raso. Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado. La zona
amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar cons-
truidas con materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plstico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfec-
tarse fcilmente. Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plstico no poroso o planchas metlicas, con ruedas de
buena calidad y fciles de limpiar para facilitar su movilidad. Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben
ser lisos, de material impermeable y fciles de limpiar y desinfectar y, adems deben estar libres de grietas y no desprender
partculas; la cantidad, el diseo, y la forma de instalacin deben ser tales que faciliten una limpieza y sanitizacin eficaces.

Colocacin de los Controles de Ingeniera Primarios

Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) de acceso res-
tringido (ver Figura 1), con las siguientes excepciones para CAl/CACI:
Slo el personal autorizado y los materiales requeridos para la preparacin magistral y la limpieza deben permitirse en la
zona amortiguadora.
Los procedimientos de preesterilizacin para las PME de alto riesgo, como por ejemplo pesar y mezclar, se deben comple-
tar en un ambiente no inferior a ISO Clase 8 (ver Tabla 1).
Los CIP deben ubicarse fuera de las vas de trfico y lejos de las corrientes de aire del cuarto que pudieran perturbar los
patrones de flujo de aire deseados.
Los CAi y los CACI deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) a menos que cumplan con
todas las condiciones siguientes:
El aislador debe proporcionar aislamiento del cuarto y mantener la ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante las condiciones din-
micas de operacin, incluso la transferencia de ingredientes, componentes y dispositivos dentro y fuera del aislador y du-
rante la preparacin de PME.
Los recuentos de partculas de muestras tomadas aproximadamente 6 a 12 pulgadas ms arriba del sitio de exposicin
crtica deben mantener niveles ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la preparacin magistral.
No se deben contar ms de 3520 partculas (0,5 m y ms grandes) por m 3 durante la transferencia de material, con la
sonda del contador de partculas ubicada tan cerca de la puerta de transferencia como sea posible, sin obstruir la transfe-
rencia.6
El personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de obtener del fabricante la documentacin indicando que los
CAl/CACI cumplirn con esta norma cuando se ubiquen en ambientes donde los recuentos de partculas excedan ISO Clase 8
(ver Tabla 1) para partculas iguales o mayores de 0,5 m. Cuando se usen aisladores para la preparacin magistral estril, el
tiempo de recuperacin para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) se debe documentar y se deben desarrollar
los procedimientos internos para garantizar que deje transcurrir el tiempo de recuperacin adecuado despus de transferir los
materiales, antes y durante las operaciones de preparacin magistral.
Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los requisitos arriba mencionados o es una CFL o una CSB que no se
puede ubicar dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces slo se pueden preparar PME no peligro-
sas y radiofarmacuticas de nivel de riesgo bajo, segn las rdenes de un mdico, para un paciente especfico, y la administra-
cin de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparacin o segn lo recomendado en el prospecto del em-
paque del fabricante, cualquiera que sea menor.

Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partculas Viables y No Viables

El programa de muestreo ambiental debe proporcionar informacin al personal y a los directivos para demostrar que el CIP
mantiene un ambiente dentro del rea de preparacin magistral, que garantiza en forma constante niveles de partculas via-

6 Los procedimientos de muestreo se detallan en CETA Applications Guide CAG-002-2006, seccin 2.09.
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bles y no viables aceptablemente bajas. El rea de preparacin magistral incluye los CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) (CFL, CSB,
CAi y CACI), las zonas amortiguadoras, las antesalas y las reas segregadas de preparacin magistral.
El muestreo ambiental se debe tomar como parte de un programa integral de gestin de la calidad y se llevar a cabo, como
mnimo, bajo cualquiera de las siguientes condiciones:
como parte de la puesta en servicio y certificacin de nuevas instalaciones y equipo;
despus de cualquier reparacin de las instalaciones y equipos;
como parte de la recertificacin de las instalaciones y equipos (es decir, cada 6 meses);
en respuesta a problemas identificados en los productos terminados o tcnicas del personal; o
en respuesta a problemas con las PME, prcticas de trabajo observadas del personal de preparacin magistral o infeccio-
nes relacionadas con el paciente (donde la PME se considera una fuente potencial de la infeccin).

PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTCULAS AMBIENTALES NO VIABLES

Un programa de muestras de partculas areas no viables difiere del de partculas viables en que est planeado para que
mida directamente el desempeo de los controles de ingeniera usados para crear los diversos niveles de limpieza de aire, por
ejemplo, ISO Clase 5, 7, u 8 (ver Tabla 7).
Verificacin del Desempeo de los Controles de Ingeniera-Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) y los controles de ingeniera
secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) son componentes esenciales de la estrategia de control general de contamina-
cin para la preparacin magistral asptica. Por lo tanto, es fundamental que funcionen tal como estn diseados y que los
niveles de contaminacin resultantes estn dentro de lmites aceptables. Los procedimientos de certificacin, como aquellos
sealados en Certification Guide for Sterile Compounding Facilities (CAG-003-2006)7 deben ser efectuados por una persona califi-
cada, por lo menos cada 6 meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique o altere o se haga una reparacin mayor en
las instalaciones.
Recuento Total de Partculas-La certificacin que cada rea con clasificacin ISO, por ejemplo, ISO Clase 5, 7 y 8 (ver
Tabla 7) est dentro de las normas establecidas, se debe realizar al menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o
el CACI se reubiquen o la estructura fsica de la zona amortiguadora o de la antesala se alteren. Las pruebas deben ser efectua-
das por operadores calificados, usando equipo electrnico de ltima tecnologa con los siguientes resultados:
ISO Clase 5: no ms de 3520 partculas iguales o mayores de 0,5 m por metro cbico de aire para cualquier CFL, CSB,
CAi y CACI;
ISO Clase 7: no ms de 352 000 partculas iguales o mayores de 0,5 m por metro cbico de aire para cualquier zona
amortiguadora;
ISO Clase 8: no ms de 3 520 000 partculas iguales o mayores de 0,5 m por metro cbico de aire para cualquier antesa-
la.
El personal de supervisin u otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificacin para
garantizar que los ambientes controlados cumplan con la limpieza de aire, las presiones del cuarto y CAPH apropiados.

MONITOREO DE LA PRESIN DIFERENCIAL

Se debe instalar un manmetro o velocmetro para supervisar el diferencial de presin o flujo de aire entre la zona amorti-
guadora y la antesala y entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparacin magistral. Los resultados debe-
rn revisarse y documentarse en un cuaderno de bitcora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mnima debe
ser diariamente) o mediante un dispositivo de grabacin continua. La presin entre el rea ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y el rea
general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua). En instalaciones donde se preparan
PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mnima de 0,2 metros por
segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.

PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTCULAS AREAS AMBIENTALES VIABLES

El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prcticas de vestuario apropiadas, de la tcnica asptica del personal de preparacin magistral
y de la presencia de contaminacin superficial, asumiendo que todo el trabajo se desempea en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla
7) y controles de ingeniera secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 7),
certificados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacien-
tes porque el personal de preparacin magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estriles
con el fin de conseguir la esterilidad.
Un programa de muestreo junto con una auditora de observacin estn diseados para evaluar la competencia de las prc-
ticas de trabajo del personal de preparacin magistral, permitiendo la implementacin de las acciones correctivas de manera
continua (ver Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedi-
mientos de Limpieza y Desinfeccin).

7 Controlled Environment Testing Association, 1500 Sunday Orive, Ste. 102, Raleigh, NC 27607; www.CETAinternational.org.
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Plan de Muestreo-Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partculas areas viables, basado
en la evaluacin de riesgo de las actividades de preparacin magistral efectuadas.
Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y en las zonas
ISO Clase 7 y 8 (ver Tabla 1), as como en las zonas segregadas de preparacin magistral con ms alto riesgo de contamina-
cin (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5 [ver Tabla 7], mostradores cercanos a las puertas, cabinas de trans-
ferencia de materiales (pass-through boxes)). El plan debe incluir: ubicacin de la muestra, mtodo de recoleccin, frecuencia
de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del da, en lo que respecta a la actividad de la zona de preparacin magistral
y los niveles de accin.
La revisin de los datos generados durante un muestreo puede detectar cantidades elevadas de biocarga microbiana area;
dichos cambios pueden ser indicio de cambios adversos en el ambiente. Se recomienda que el personal de preparacin magis-
tral se remita a Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico (1116) y a las "Guidelines for Environ-
mental lnfection Control in Healthcare Facilities, 2003", de los CDC (Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades)
para ms informacin.
Medio de Crecimiento-Para facilitar el crecimiento bacteriano se debe utilizar un medio de crecimiento microbiolgico
general, como el Medio de Digerido de Casena y Soja. En los ambientes de preparacin magistral con nivel de riesgo alto se
debe usar un agar con extracto de malta u otro medio que facilite el crecimiento de hongos. Los medios usados para el mues-
treo de superficies deben complementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej., TSA
con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partculas Areas Viables-La evaluacin de microorganismos areos usando mtodos volumtricos de reco-
leccin en los ambientes de aire controlado (CFL, CAi, cuarto limpio o zonas amortiguadoras y antesalas) debe efectuarla per-
sonal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
El mtodo de impacto debe ser el mtodo preferido de muestreo volumtrico de aire. El uso de placas de sedimentacin
para muestreo cualitativo de aire puede no ser capaz de determinar adecuadamente la calidad del aire en el ambiente contro-
lado. La sedimentacin de partculas por gravedad en placas de cultivo depende del tamao de la partcula y puede estar in-
fluenciada por el movimiento del aire. Por consiguiente, la cantidad de unidades formadoras de colonias (ufc) en una placa de
sedimentacin puede no siempre estar relacionada con las concentraciones de las partculas viables en el ambiente muestrea-
do.
Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares pro-
pensos a la contaminacin, durante las actividades de preparacin magistral y otras actividades como clasificacin de compo-
nentes, etiquetado, vestimenta y limpieza. Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro
de la CFL y otras reas donde la turbulencia de reflujo de aire puede ingresar a la zona de preparacin magistral (puertas de
entrada, dentro y alrededor del CIP y ambientes ISO Clase 5 [ver Tabla 1]). Debe considerarse el efecto general que el mtodo
de muestreo escogido tendr sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de preparacin magistral.
Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, preparada en un CIP (CFL, CSB, CAi) que mantiene una ISO
Clase 5 (ver Tabla 1), el muestreo del aire se debe efectuar en lugares dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras reas (ver Tabla
1) que estn muy cerca del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la certificacin del CIP.
Dispositivos de Muestreo de Aire-Existe una gran cantidad de fabricantes de equipos electrnicos para muestreo de aire.
Es importante que el personal consulte los procedimientos recomendados por el fabricante al usar un equipo para efectuar el
muestreo volumtrico de aire. Se deben seguir las instrucciones en el manual del usuario provisto por el fabricante en lo que
respecta a la verificacin y uso de muestreadores elctricos de aire que recolectan activamente volmenes de aire para anlisis.
Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar seleccionado, con el fin de maximizar la sensi-
bilidad. Los dispositivos volumtricos para muestreo de aire tienen que calibrarse y repararse segn lo recomendado por el
fabricante.
Se recomienda que el personal de preparacin magistral se remita tambin a Metodologa e Instrumental para Cuantificacin
de Microorganismos Viables Transportados por el Aire en Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aspti-
co (1116), que proporciona ms informacin sobre el uso de muestreadores volumtricos de aire y el volumen de aire que se
debe recolectar para detectar variaciones de la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire-Como parte de la recertificacin de instalaciones y equipos, el muestreo del
aire se debe efectuar al menos dos veces al ao (es decir, cada 6 meses). Si la preparacin magistral se realiza en mltiples
ubicaciones dentro de una institucin (p.ej., farmacia principal, satlites), se requiere el muestreo ambiental para cada rea de
preparacin individual. Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo
electrnico para muestreo de aire. Cualquier actividad de construccin o de reparacin de equipos dentro de una instalacin
puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Perodo de Incubacin-Al final del perodo de muestreo o exposicin indicado para la toma de muestras de aire se recu-
peran las placas de medio de crecimiento microbiano, se aseguran sus tapas (p.ej., con cinta) y luego se invierten e incuban a
una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos. El TSA se debe incubar a una tempe-
ratura de 30 a 35 durante un perodo de 48 a 72 horas. El agar con extracto de malta u otro medio apto para hongos se
debe incubar entre 26 y 30 durante 5 a 7 das. Se debe contar e informar la cantidad de colonias discretas de microorganis-
mos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de muestreo ambiental. Los recuentos de las muestras de
aire se deben transformar en ufc por metro cbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
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Niveles de Accin, Documentacin y Evaluacin de Datos-El muestreo microbiano viable del aire en el ambiente de
preparacin magistral adquiere valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una situacin inaceptable. Los datos
de muestreo se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
preparacin magistral. Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consul-
tar al personal competente de microbiologa.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin (ver Tabla 2) debe dar lugar a una reevaluacin de la
aptitud de las prcticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtracin de aire dentro de las instalaciones de preparacin magistral asptica. Se debe investigar la fuente de la contamina-
cin. Las posibles fuentes incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA daados y cambios en la vestimenta o prcticas de traba-
jo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el rea afectada y tomar nuevas muestras.
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de accin se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 2 deben usarse slo como gua. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la farmacia, las acciones
correctivas futuras se tomarn de acuerdo con la identificacin de los microorganismos recuperados (al menos el gnero) he-
cha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc, usando un muestreador de
aire por impacto. Los microorganismos altamente patgenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilococos coagulasa positivo,
hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben PME y deben ser elimina-
dos de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbilogo competente, un profesional de
control de infecciones o un higienista industrial.
Tabla 2. Niveles de Accin Recomendados para Contaminacin Microbiana
t(ufc por metro cbico [1000 litros] de aire por placa)
Claslflcacln Muestra de Airet
ISO Clase 5 >1
ISO Clase 7 >10
ISO Clase 8 o menor calidad > 100
* Guidance for lndustry-Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice-US HHS, FDA, septiembre de 2004.

Requisitos Adicionales para el Personal

Los alimentos, bebidas y materiales expuestos en reas de cuidado y tratamiento de pacientes no deben introducirse en an-
tesalas, zonas amortiguadoras o reas segregadas para preparacin magistral en las que haya componentes e ingredientes de
PME. Cuando las actividades de preparacin magistral requieran la manipulacin de materiales derivados de la sangre del pa-
ciente u otros materiales biolgicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones
deben hacerse claramente aparte de los procedimientos de rutina para manejo de material y equipo usado en las actividades
de preparacin de PME y deben controlarse por medio de POE especficos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. Los
suministros y componentes empacados para preparacin magistral, como agujas, jeringas, sets de tubos y soluciones parente-
rales de pequeo y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA
estril al 70%) de ser posible en una antesala de calidad de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1), antes de pasarlos a las zonas amorti-
guadoras. La higiene de manos y los procedimientos de vestimenta del personal se efectan tambin en la antesala, la cual
puede contener un lavabo que se pueda accionar sin usar las manos y un sistema cerrado dispensador de jabn para minimizar
el riesgo de contaminacin extrnseca. Deber existir algn tipo de demarcacin que separe la antesala de la zona amortigua-
dora. Despus de entrar a la zona amortiguadora deben tomarse las medidas adecuadas para efectuar la limpieza antisptica
de manos usando un exfoliante quirrgico a base de alcohol con actividad persistente, seguido del uso de guantes estriles.

Limpieza y Desinfeccin del rea de Preparacin Magistral

El contacto ambiental es una fuente importante de contaminacin microbiana de las PME. Por consiguiente, se requiere
atencin escrupulosa en la limpieza y desinfeccin de las reas de preparacin magistral estril para minimizar dicha fuente de
contaminacin de las PME.
Las prcticas de limpieza y desinfeccin, as como las frecuencias mencionadas en esta seccin aplican a las zonas de prepa-
racin magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposicin de sitios crticos, as como a las zonas amortiguadoras, antesalas y
zonas segregadas de preparacin magistral. El personal de preparacin magistral es responsable de garantizar que la frecuen-
cia de limpieza est de acuerdo con los requisitos estipulados en la Tabla 3 y determinar los productos para limpieza y desin-
feccin que se van a usar (ver Apndice 11). El personal de preparacin magistral debe tener en cuenta toda poltica organizacio-
nal o institucional relacionada con la seleccin de desinfectantes. Todas las prcticas y polticas de limpieza y desinfeccin para
la preparacin de PME se deben incluir por escrito en los POE y las debe seguir todo el personal de preparacin magistral.
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Tabla 3. Frecuencia Mnima de Limpieza y Desinfeccin de las Zonas de Preparacin Magistral

Lugar Frecuencia Mnima
Control de Ingeniera Primario ISO Clase 5 (ver Tabla 7) Al comenzar cada turno, antes de cada lote, a ms tardar 30 minutos despus de la de-
(p.ej., CFL, CSB, CAi, CACI) sinfeccin previa de la superficie cuando se estn llevando a cabo actividades de prepa-
racin magistral, despus de derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la su-
perficie est contaminada
Mostradores y superficies de trabajo fcilmente limpiables Diariamente
Pisos Diariamente
Paredes Mensualmente
Cielos rasos Mensualmente
Estantes de almacenamiento Mensualmente

La seleccin y uso de desinfectantes en instituciones de salud est dictada por varias propiedades, tales como actividad mi-
crobicida, inactivacin por materia orgnica, residuos y vida til (ver Apndice JI). En general, los desinfectantes altamente txi-
cos, como el glutaraldehdo no se usan sobre las superficies del ambiente (p.ej., pisos, mostradores). Muchos desinfectantes
registrados por la EPA son de un solo paso. Esto significa que el desinfectante est formulado para ser eficaz en presencia de
suciedad leve a moderada, sin un paso previo de limpieza.
Las superficies en CFL, CSB, CAi y CACI, a las que estn expuestos los sitios crticos, requieren desinfeccin ms frecuente
que las superficies del ambiente como paredes y cielos rasos. La desinfeccin de zonas de preparacin magistral estril debe
hacerse de manera peridica con los intervalos mencionados en la Tabla 3 cuando ocurren derramamientos, cuando las super-
ficies estn visiblemente sucias y cuando se sabe o se sospecha que se ha introducido contaminacin microbiana en las zonas
de preparacin magistral.
Cuando la superficie que se va a desinfectar est muy sucia, se recomienda una limpieza antes de la aplicacin del desinfec-
tante. El personal de preparacin magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en prctica los pro-
cedimientos de limpieza y desinfeccin del rea directa de preparacin magistral (ADP) escritos en los POE. La limpieza y de-
sinfeccin deben hacerse antes de la preparacin magistral. Para hacer la limpieza, se deben quitar todos los artculos y limpiar
las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos slidos solubles en agua
se quitan con agua estril (para inyeccin o irrigacin) y paos que no desprendan partculas. Luego se pasa un pao con un
agente desinfectante que no deje residuos, como IPA al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparacin magistral.
Las prcticas ms crticas antes de la preparacin de las PME son la limpieza y desinfeccin de las superficies en CFL, CSB,
CAi y CACI. Por consiguiente, dichas superficies se deben limpiar y desinfectar con frecuencia: al comenzar cada turno de tra-
bajo, antes de la preparacin de cada lote, cada 30 minutos durante los perodos continuos de preparacin de PME individua-
les, cuando haya derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie est contaminada debido a fallas procedimen-
tales.
Las superficies de trabajo en las zonas amortiguadoras ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y las antesalas ISO Clase 8 (ver Tabla 1), as
como las zonas segregadas de preparacin magistral se deben limpiar y desinfectar por lo menos diariamente, y el polvo y los
detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparacin
magistral, usando un mtodo que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8 (ver Tabla 1) (ver Desinfectantes y Antispticos
(1072)).
Los pisos en la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona de preparacin magistral segregada se friegan con un agente
limpiador y desinfectante una vez al da, a una hora en que no se est realizando ninguna operacin asptica. La limpieza del
suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE
escritos. El personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de garantizar que dicha limpieza se haga apropiadamen-
te. En la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona segregada de preparacin magistral, se deben limpiar y desinfectar
mensualmente las paredes, cielos rasos y estanteras. Slo deben utilizarse agentes de limpieza y desinfeccin aprobados te-
niendo en cuenta su compatibilidad, eficacia y la generacin de residuos inapropiados o txicos (ver Apndice //). Sus crono-
gramas de uso y mtodos de aplicacin deben concordar con los POE escritos y el personal de apoyo y el de preparacin ma-
gistral deben cumplirlos.
Todos los materiales de limpieza, como paos, esponjas y trapeadores, no deben desprender partculas, y deben estar com-
puestos preferentemente por microfibras sintticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras o limpias, antesalas y reas
segregadas de preparacin magistral, de las cuales no deben retirarse a menos que sea para desecharlos. Pueden usarse tra-
peadores, tanto en la zona amortiguadora o cuarto limpio como en la antesala, pero nicamente en ese orden. Lo ideal sera
que todas los enseres de limpieza se descartaran despus de un uso, recolectndolos en bolsas plsticas apropiadas y retirndo-
los del lugar con la mnima agitacin. Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar proce-
dimientos (basndose en las recomendaciones de los fabricantes) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se
mantiene y el uso repetido no incrementa la biocarga del rea que se est limpiando.
Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej.,
IPA estril al 70%), empleando un frasco rociador u otro mtodo de aplicacin adecuado. Despus de rociar o limpiar con el
desinfectante la superficie a desinfectar, sta se debe dejar secar y durante este tiempo el artculo no se debe usar para la pre-
paracin magistral.
692 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

Para desinfectar puntos de entrada de bolsas y viales, es preferible limpiar con hisopos pequeos estriles impregnados en
IPA al 70%, los cuales se consiguen comercialmente en envases laminados sellados individuales (o un mtodo comparable),
dejando secar el IPA antes de perforar los tapones con agujas estriles y de romper los cuellos de las ampollas. La superficie de
los hisopos estriles con IPA al 70% usados para desinfectar puntos de entrada de envases y dispositivos estriles no debe en-
trar en contacto con ningn otro objeto antes de tocar la superficie del punto de entrada. No se deben utilizar compresas de
gasa empapadas en IPA estril al 70% ni otros materiales que desprendan partculas para desinfectar los puntos de entrada
estriles de envases y dispositivos.
Cuando se reciben suministros estriles en bolsas selladas destinadas a conservarlos estriles hasta el momento de abrirlos,
los suministros estriles se pueden retirar de las bolsas que los recubren cuando se introducen en el CIP (CFL, CSB, CAi, CACI)
ISO Clase 5 (ver Tabla 1) sin que sea necesario desinfectar los artculos individuales del suministro estril. No se pueden llevar
cajas de embalaje ni otros envases externos a la zona amortiguadora o limpia ni al rea segregada de preparacin magistral.

Limpieza y Vestimenta del Personal

La cuidadosa limpieza de manos y brazos y el uso correcto del adecuado equipo protector para el personal (EPP) por parte
del personal de preparacin magistral constituye el primer paso ms importante en la prevencin de contaminacin microbia-
na de las PME. Adems, el personal debe ser completamente competente y estar muy motivado para realizar manipulaciones
aspticas impecables con ingredientes, dispositivos y componentes de las PME. Del cuerpo humano normalmente se despren-
den clulas escamosas a una velocidad de 106 o ms por hora y esas partculas de la piel estn cargadas de microorganismos. 8 9
Cuando los individuos tienen prurito, quemaduras de sol, lceras exudantes, conjuntivitis, infeccin respiratoria activa o usan
cosmticos, estas partculas se desprenden incluso a mayor velocidad. Las partculas desprendidas por el personal de prepara-
cin magistral representan un incremento en el riesgo de contaminacin microbiana de los sitios crticos de PME. Por lo tanto,
el personal de preparacin magistral que presenta alguna de las afecciones antes mencionadas debe ser excluido del trabajo
en zonas de preparacin magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 7) e ISO Clase 7 (ver Tabla 7), hasta que dichas afecciones desaparez-
can.
Antes de ingresar en una zona amortiguadora o en una zona segregada de preparacin magistral (ver PME de Nivel de Riesgo
Bajo con FLU de 72 Horas o Menos), el personal de preparacin magistral debe quitarse las prendas personales exteriores (p.ej.,
bandanas, abrigos, sombreros, chaquetas, bufandas, suteres, chalecos), todos los cosmticos, porque desprenden escamas y
partculas, y todas las joyas de las manos y muecas, as como otras joyas y accesorios visibles (p.ej., aretes, pendientes para
labios o cejas (pirsins)) que puedan interferir con la eficacia del EPP (p.ej., ajuste de guantes y puos de mangas). El uso de
uas postizas o prolongaciones est prohibido mientras se trabaja en el ambiente estril de preparacin magistral. Las uas
naturales se deben mantener limpias y recortadas.
El personal debe usar el siguiente EPP en un orden que vaya de las actividades consideradas ms sucias hasta las ms limpias.
Las actividades de vestimenta consideradas ms sucias incluyen el calzado de zapatos destinados a la preparacin magistral o
cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial (p.ej., cubiertas para la barba, adems de mscaras), mscaras pro-
tectoras para la cara y ojos. Los protectores para los ojos son opcionales, a menos que se trabaje con irritantes como agentes
germicidas desinfectantes o se elaboren preparaciones con frmacos peligrosos.
Despus de ponerse el calzado especial o cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial, y mscaras, se debe
realizar un procedimiento de limpieza de manos para retirar los detritos debajo de las uas con un limpiador de uas, bajo
agua tibia corriente, seguido de una limpieza meticulosa de las manos. Las manos y los antebrazos se deben lavar hasta los
codos con agua y jabn (bien sea antimicrobiano o no), durante 30 segundos al menos, mientras se est en la antesala. No se
recomienda el uso de cepillos antimicrobianos porque causan irritacin y lesiones cutneas. Se secan las manos y los antebra-
zos completamente hasta los codos, bien sea con toallas desechables sin pelusas o con un secador de manos electrnico. Des-
pus de completar el lavado de manos, se viste una bata con mangas que no desprenda partculas, que ajuste de manera c-
moda alrededor de las muecas y cierre en el cuello. Se deben usar batas destinadas para la zona amortiguadora, que sean de
preferencia desechables. Si se visten batas reutilizables, se deben lavar apropiadamente para uso en la zona amortiguadora.
Una vez dentro de la zona amortiguadora o del rea segregada de preparacin magistral (ver PME de Nivel de Riesgo Bajo con
FLU de 72 Horas o Menos) y antes de calzar guantes estriles sin talco, se debe efectuar una limpieza antisptica de manos con
un exfoliante quirrgico para manos exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente 10, siguiendo las recomenda-
ciones del fabricante. Las manos se deben dejar secar completamente antes de calzar los guantes estriles.
Los guantes estriles deben ser el ltimo artculo puesto antes de comenzar la preparacin magistral. Los guantes se conta-
minan cuando entran en contacto con superficies no estriles durante las actividades de preparacin magistral. La desinfeccin
de las manos enguantadas se debe hacer frotando o untando IPA estril al 70% en todas las superficies de contacto de los
guantes y dejando secar completamente las manos enguantadas. Usar slo guantes cuya compatibilidad con la desinfeccin
con alcohol haya sido probada por el fabricante. Durante todo el procedimiento de preparacin magistral se debe aplicar IPA
estril al 70% en forma rutinaria, al igual que siempre que se toquen superficies no estriles (p.ej., viales, mostradores, sillas,

8 Agalloco ], Akers JE. Aseptic Processing: A Vision of the Future. Pharmaceutical Technology, 2005. Aseptic Processing supplement, sl 6.
9 Eaton T. Microbial Risk Assessment for Aseptically Prepared Products. Am Pharm Rev. 2005; 8 (5, Sep/Oct): 46-51.
1
Guideline for Hand Hygiene in Hea/th care Settings, MMWR, el 25 de octubre de 2002, vol. 51, N RR-16 disponible en Internet en http://www.cdc.gov/handhy-
giene/.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 693

carros). Los guantes se deben inspeccionar rutinariamente, durante el uso, en busca de orificios, pinchazos o rasgones, reem-
plazndolos de inmediato si stos se detectan. La limpieza antisptica de manos se debe efectuar como se indic anteriormen-
te. Se debe capacitar y evaluar al personal de preparacin magistral sobre cmo evitar el contacto con los sitios crticos.
Cuando el personal de preparacin magistral sale del rea de preparacin durante un turno de trabajo, se debe quitar la
bata exterior, conservndola en el rea de preparacin magistral si no est visiblemente sucia, para volvrsela a poner durante
ese mismo turno nicamente. Sin embargo, los cubrecalzado, las mascarillas que cubran el vello facial y gorras, mscaras pro-
tectoras para la cara y ojos, as como los guantes se deben reemplazar por otros nuevos antes de volver a entrar al rea de
preparacin magistral y se debe efectuar de nuevo la higiene de las manos.
Durante las actividades de preparacin magistral de alto riesgo que preceden a la esterilizacin terminal, como son el pesa-
do y mezclado de ingredientes no estriles, el personal de preparacin magistral debe estar vestido y enguantado igual que si
estuviera realizando una preparacin magistral en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1). El personal de preparacin magistral
adecuadamente vestido y enguantado que se exponga a un aire cuya calidad se sepa o sospeche inferior a ISO Clase 7 (ver
Tabla 1) debe cambiar EPP, adems de lavarse las manos apropiadamente, efectuando limpieza antisptica de la manos con un
exfoliante quirrgico a base de alcohol, sin agua, y calzar guantes estriles al volver a ingresar a la zona amortiguadora ISO
Clase 7 (ver Tabla 1). Cuando las fuentes del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) son CAi o CACI, los requisitos de vestimenta y
guantes para el personal de preparacin magistral deben ser iguales a los descritos anteriormente, a menos que el fabricante
del aislador pueda proporcionar documentacin por escrito, basada en pruebas ambientales validadas, de que no se requiere
algn componente del EPP o de la limpieza del personal.

Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de

Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin

El personal encargado de la preparacin de las PME deber recibir capacitacin competente y a conciencia por parte de per-
sonal experto, con ayuda de instruccin multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios tericos y los conoci-
mientos prcticos de los procedimientos de vestimenta, prcticas aspticas de trabajo, as como en la forma de conseguir y
mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y procedimientos de limpieza y desinfeccin. Esta capacitacin se
debe completar y documentar antes de que cualquier miembro del personal comience la elaboracin de PME. El personal de
preparacin magistral debe completar la capacitacin didctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a
evaluaciones de destreza usando herramientas de auditora de observacin y pruebas de llenado de medios (ver Apndices 111-
V).
Las pruebas de las destrezas para el trabajo asptico mediante el llenado de medios se efectan inicialmente antes de co-
menzar a preparar PME y luego anualmente, al menos, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y
semestralmente para preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto.
El personal de preparacin magistral que no pase las pruebas escritas o las auditoras de observacin o cuyos viales de prue-
ba de llenado de medios tengan una o ms unidades que muestren contaminacin microbiana visible deber recibir de inme-
diato una nueva capacitacin y someterse a una nueva evaluacin a cargo de personal experto en preparacin magistral, para
asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de prctica asptica. El personal de preparacin magistral
debe aprobar todas las evaluaciones antes de reiniciar la prctica de preparacin magistral estril. Adems de la evaluacin
didctica y llenado asptico de medios, el personal de preparacin magistral debe demostrar competencia en la higiene apro-
piada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza.
En caso de que el personal de apoyo (p.ej., personal de limpieza/mantenimiento y servicios ambientales institucionales) efec-
te tambin procedimientos de limpieza y desinfeccin, un experto calificado en preparacin magistral asptica debe capaci-
tarlos en la higiene de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza y desinfeccin. Despus de terminar la capacita-
cin, el personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluacin de desempeo en la higiene apropiada de las ma-
nos, vestimenta y todos los procedimientos de limpieza y desinfeccin, que llevar a cabo un experto calificado en preparacin
magistral asptica.

EVALUACIN DE COMPETENCIA EN VESTIMENTA Y PRCTICAS ASPTICAS DE TRABAJO

El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prcticas de vestuario apropiadas; de la tcnica asptica del personal de preparacin magistral
y de la presencia de contaminacin superficial, asumiendo que todo el trabajo se realiza en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y
controles de ingeniera secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 1), certifi-
cados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacientes
porque el personal de preparacin magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estriles con
el fin de conseguir la esterilidad. El personal de preparacin magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la
elaboracin de PME y siempre que se efecte un llenado de medios asptico, usando un formulario como el Formulario de
Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparacin Magis-
tral (ver Apndice llf) y el procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal, segn se indica a
continuacin.
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Evaluacin de la Prctica Asptica de Trabajo por Medio del Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del
Personal-El muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparacin magistral se debe realizar en la
elaboracin de PME de todos los niveles de riesgo, dado que la contaminacin por contacto directo es la fuente ms probable
de introduccin de microorganismos en las PME preparadas por seres humanos. El muestreo de las puntas de los dedos en-
guantados se debe usar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de las manos y vestimenta,
as como para educar al personal de preparacin magistral en las prcticas de trabajo apropiadas, las cuales incluyen desinfec-
cin frecuente y repetida de guantes, usando IPA estril al 70% durante la preparacin de las PME. Todo el personal debe
demostrar competencia en los procedimientos adecuados de higiene de las manos y vestimenta, as como en las prcticas
aspticas de trabajo (p.ej., desinfeccin de las superficies de los componentes, desinfeccin rutinaria de manos enguantadas,
etc.).
Se deben usar placas estriles de contacto con agar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del
personal de preparacin magistral despus de vestirse, con el fin de evaluar la competencia en el uso de vestimenta, y despus
de completar la preparacin de llenado de medios (sin aplicar IPA estril al 70%) con el fin de evaluar si las prcticas aspticas
de trabajo son adecuadas, antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano y para que el personal ms
experimentado mantenga su calificacin en el proceso mencionado.
Evaluacin de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes-El personal de preparacin magistral debe ser inspeccio-
nado visualmente durante los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta (ver Limpieza y Vestimenta del Per-
sona/ en Capacitacin y Evaluacin del Personal en Tcnicas de Manipulacin Asptica, arriba). La inspeccin visual debe docu-
mentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas
con la Vestimenta del Personal de Preparacin Magistral (ver Apndice 111) y mantenerse para tener un registro permanente y eva-
luacin a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados-Todo el personal de preparacin magistral debe completar exitosa-
mente una evaluacin inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados (cero
ufc) no menos de tres veces antes de que se le permita comenzar a elaborar PME para uso humano. Inmediatamente despus
de que el empleado de preparacin magistral complete la higiene de las manos y el procedimiento de vestimenta (p.ej., calza-
do de guantes estriles antes de cualquier desinfeccin con IPA estril al 70%), el evaluador recolectar una muestra de las
puntas de los dedos y pulgares enguantados de ambas manos del empleado en placas de agar apropiadas, presionando ligera-
mente el agar con cada dedo. Las placas se incubarn durante un perodo de incubacin apropiado a la temperatura adecuada
(ver Perodo de Incubacin). Despus de completar la evaluacin inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, una
vez al ao, como mnimo, se debe hacer una reevaluacin de la competencia de todo el personal de preparacin magistral que
elabore PME de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestralmente al personal que elabore PME de nivel de riesgo alto, usando
una o ms muestras recolectadas durante cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios, antes de que se les permi-
ta continuar elaborando PME para uso humano.
No se deben desinfectar los guantes con IPA estril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras. La desinfeccin
de los guantes inmediatamente antes de la toma de muestras proporcionar resultados falsos negativos. Cuando se tomen
muestras de las puntas de los dedos del personal se usarn placas que contengan agar nutritivo con agentes neutralizantes
como lecitina y polisorbato 80. El personal debe "tocar" el agar con las puntas de los dedos de ambas manos en placas separa-
das, de manera que se cree una ligera impresin en el agar. Despus de la toma de muestras, los guantes se deben desechar
de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar nutritivo se deben incubar como se estipula a
continuacin (ver Perodo de Incubacin). Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por emplea-
do por mano (mano izquierda, mano derecha). El nivel de accin de ufc para las manos enguantadas estar basado en la canti-
dad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
Perodo de Incubacin-Al final del perodo de muestreo indicado para las actividades de evaluacin de la competencia
del personal de preparacin magistral (superficie o personal), se recuperan las placas de agar, se aseguran sus tapas y luego se
invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos. El TSA con leci-
tina y polisorbato 80 se debe incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 48 a 72 horas.
Evaluacin de la Competencia en Manipulacin Asptica-Despus de completar exitosamente una Evaluacin de Com-
petencia en Higiene de las Manos y Vestimenta, todo el personal de preparacin magistral debe someterse una evaluacin de
su competencia en la tcnica asptica y prcticas relacionadas, inicialmente durante el Procedimiento de Prueba de Llenado de
Medios y en los subsiguientes Procedimientos de Prueba de Llenado de Medios, anual o semestralmente. Los registros de estas
evaluaciones se mantendrn usando un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluacin de Tcnicas Aspticas y Prcti-
cas Relacionadas del Personal de Preparacin Magistral (ver Apndice IV) y se conservarn para tener un registro permanente de
la evaluacin a largo plazo de la competencia del personal.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME aspticamente se debe evaluar
usando la verificacin de llenado de medios de cultivos bacterianos lquidos y estriles (es decir, transferencia de un medio de
cultivo bacteriano estril por medio de una jeringa y aguja estriles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
prctica asptica del personal de preparacin magistral. Las pruebas de llenado de medios deben representar las condiciones
ms exigentes o difciles con las que el personal puede encontrarse durante la elaboracin de PME de nivel de riesgo bajo y
mediano y durante la esterilizacin de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafo de llenado de medios se usan tam-
bin para verificar la aptitud del ambiente de preparacin magistral y de los procesos para producir una preparacin estril.
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Por lo general, se usa un medio lquido de cultivo estril disponible comercialmente, como el Medio de Digerido de Casena
y Soja (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), que sea capaz de promover la colonizacin exponencial de las bacterias que el personal
de preparacin magistral y el entorno suelen transmitir a las PME. Para PME de nivel de riesgo alto se puede usar un Medio de
Digerido de Casena y Soja no estril, disponible comercialmente, para preparar una solucin al 3%. Se deben imitar los pasos
de procesamiento normales, incluyendo la esterilizacin por filtracin. Los viales llenados con medios deben incubarse a una
temperatura de 20 a 25 o de 30 a 35 durante 14 das como mnimo. Si se usan dos temperaturas para la incubacin de
muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura
(ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico (1116)). Si cualquiera de las unidades llenas de
medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 das, significa que no se ha pasado la prueba. Se pueden considerar
otros mtodos recomendados por un microbilogo competente para mejorar el tiempo de recuperacin y la sensibilidad para
detectar contaminacin microbiana (ver ejemplos de procedimientos de llenado de medios en Niveles de Riesgo de Contamina-
cin Microbiana en las PME).

MUESTREO Y EVALUACIN DE LIMPIEZA Y DESINFECCIN DE SUPERFICIES

La toma de muestras de superficies es un componente importante del mantenimiento de un ambiente microbiolgicamente

controlado para elaboracin de PME, especialmente si se considera que la transferencia de contaminacin microbiana a partir
del contacto inadvertido por parte del personal de preparacin magistral con superficies desinfectadas inadecuadamente, pue-
de ser una fuente potencial de contaminacin para las PME. Adems, se considera til para evaluar los procedimientos de lim-
pieza y desinfeccin de las instalaciones y superficies de trabajo, as como la competencia de los empleados en las prcticas de
trabajo como la desinfeccin de superificies de componentes/viales. En todas las reas ISO se deben tomar muestras de las
superficies en forma peridica. Los muestreos se pueden hacer usando placas de contacto o hisopos y se deben realizar al ter-
minar la preparacin magistral. Se deben definir los lugares en donde se van a tomar muestras en un plan o formulario de
muestreo. El tamao de la placa que se va a usar para cada lugar muestreado tiene, por lo general, entre 24 y 30 cm2. Las
placas de contacto se llenan con medio agar slido de crecimiento general y agentes neutralizantes por encima del borde de la
placa y se usan para tomar muestras de superficies parejas o planas. Se pueden usar hisopos para tomar muestras de superfi-
cies irregulares, especialmente para equipos (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico
(1116)).
Evaluacin de Competencia en Limpieza y Desinfeccin-Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparacin
magistral y dems personal responsable de la limpieza durante la realizacin de los procedimientos de limpieza y desinfeccin,
durante la capacitacin inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y
despus de la terminacin de cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios (ver Limpieza y Desinfeccin del rea de
Preparacin Magistra0.
La inspeccin visual debe documentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluacin de Procedimientos
de Limpieza y Desinfeccin (ver Apndice \/) y conservarse para tener un registro permanente y la evaluacin a largo plazo de la
competencia del personal.
Mtodos de Recoleccin en la Superficie-Para tomar muestras usando una placa de contacto, se debe tocar suavemente
el rea de muestreo con la superficie del agar y deslizar la placa sobre la superficie a muestrear. La placa de contacto dejar un
residuo de medio de crecimiento; por lo tanto, inmediatamente despus de tomar la muestra con la placa de contacto, el rea
muestreada se debe limpiar cuidadosamente con un pao que no desprenda partculas, empapado en IPA estril al 70%.
Si se toma una muestra con el mtodo del hisopo, la recoleccin de la muestra se hace con los procedimientos apropiados
que determinen un rea superficial equivalente a la de la placa de contacto. Despus de pasar los hisopos por la superficie
muestreada, los hisopos se colocan en un diluyente apropiado y una alcuota se siembra en el agar nutritivo especificado. Los
resultados se deben informar como ufc por unidad de rea superficial.

Niveles de Accin, Documentacin y Evaluacin de Datos

El monitoreo microbiano viable de las puntas de los dedos enguantados y de las superficies de los componentes, as como
del ambiente de preparacin magistral adquieren valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una prctica de
trabajo inaceptable. Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el
control general del ambiente de preparacin magistral. Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de creci-
miento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiologa.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin (ver Tabla 4) debe dar lugar a una reevaluacin de la
aptitud de las prcticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtracin de aire dentro de las instalaciones de preparacin magistral asptica. Se debe investigar la fuente de la contamina-
cin. Las posibles fuentes de contaminacin incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA daados y cambios en la vestimenta o
prcticas de trabajo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el rea afectada y tomar nuevas muestras.
Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de accin despus de la
incubacin apropiada, se debe efectuar y documentar una revisin de los procedimientos de higiene de las manos y de vesti-
menta, as como de los procedimientos de desinfeccin de guantes y superficies y prcticas de trabajo. Puede ser necesario
capacitar al empleado para corregir la fuente del problema.
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Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de accin se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 4 deben usarse slo como gua. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la instalacin de prepara-
cin magistral, las acciones correctivas futuras se tomarn de acuerdo con la identificacin de los microorganismos recupera-
dos (al menos el gnero), hecha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc,
usando un muestreador de aire por impacto. Los microorganismos altamente patgenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilo-
cocos coagulasa positivo, hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben
PME y deben ser eliminados de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbilogo compe-
tente, un profesional de control de infecciones o un higienista industrial.
Tabla 4. Niveles de Accin Recomendados para Contaminacin Microbiana
Muestra de las Puntas Muestra de Superficie (Placa de Contacto)
Claslficacln de los Dedos (ufc por placa)
ISO Clase 5 >3 >3
ISO Clase 7 N/D >5
ISO Clase 8 o menor calidad N/D > 100
Pharmaceutical lnspection Co-operation Scheme (PIC/S) Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes PE 009-6, 5 de abril de 2007.

PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTNDARES (POE) SUGERIDOS

La instalacin de preparacin magistral debe tener POE escritos y debidamente aprobados, diseados para asegurar la cali-
dad del entorno en el que se elabora la PME. Se recomienda adoptar los siguientes procedimientos:
1. Restringir el acceso a la zona amortiguadora a personal calificado con responsabilidades especficas o tareas asignadas en
el rea de preparacin magistral.
2. Descontaminar en el rea todos los materiales empacados, retirndolos de sus cajas y limpindolos o rocindolos con un
agente desinfectante que no deje residuos, mientras se los transfiere a un carro limpio y adecuadamente desinfectado o a
otro medio de transporte para su introduccin en la zona amortiguadora. Se seguirn las instrucciones del fabricante o los
datos publicados para el tiempo mnimo de contacto. No es necesario limpiar los materiales que vienen en bolsas indivi-
duales estriles, ya que las bolsas pueden retirarse a medida que se introducen los materiales en la zona amortiguadora.
3. Los suministros requeridos con frecuencia o que deben tenerse a mano pero que no son necesarios para las operaciones
programadas en un determinado turno deben descontaminarse y almacenarse en los estantes de la antesala.
4. Los carros usados para llevar materiales desde la sala de almacenamiento no pueden desplazarse ms all de la lnea de
demarcacin de la antesala y aquellos usados en la zona amortiguadora no pueden llevarse ms all de la lnea de demar-
cacin a menos que se limpien y desinfecten antes de volverlos a introducir.
5. Por lo general, los materiales requeridos para las operaciones programadas en cada turno deben limpiarse con un agente
desinfectante apropiado y llevarse a la zona amortiguadora, preferiblemente en uno o ms carros mviles. Los materiales
de reserva o de uso general para las operaciones pueden almacenarse en el estante designado en la zona amortiguadora,
pero debe evitarse la acumulacin excesiva de materiales.
6. Los objetos no esenciales que desprendan partculas no pueden llevarse a la zona amortiguadora, incluyendo lpices, cajas
de cartn, toallas de papel y artculos de algodn (p.ej., compresas de gasa).
7. Los productos esenciales a base de papel (p.ej., envolturas de papel de las jeringas, registros de trabajo guardados en una
funda protectora), se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado antes de llevarlos a la zona amortiguadora.
8. Debe reducirse al mnimo el flujo de trfico hacia y desde la zona amortiguadora.
9. El personal que se prepara para entrar a la zona amortiguadora debe retirarse todas las prendas personales externas, cos-
mticos (porque desprenden escamas y partculas) y todas las joyas de manos y muecas, as como otras joyas y acceso-
rios visibles que puedan interferir con la eficacia del EPP.
1 O. El personal que entra en la antesala debe vestir la ropa descrita en Limpieza y Vestimenta del Personal y Capacitacin del
Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desin-
feccin.
11. El personal deber luego lavarse cuidadosamente las manos y los antebrazos hasta el codo con agua y jabn, por lo me-
nos durante 30 segundos. Despus de lavarse, se debe usar un secador de aire o toallas desechables que no desprendan
partculas para secarse las manos y los antebrazos.
12. El personal que entra en la zona amortiguadora debe efectuar la limpieza antisptica de manos con un exfoliante quirrgi-
co exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente, antes de calzarse guantes estriles.
13. No se puede ingresar con goma de mascar, bebidas, golosinas ni ningn tipo de alimentos a la zona amortiguadora ni a
la antesala. Los materiales expuestos en reas de cuidado y tratamiento de pacientes nunca deben introducirse en reas
en las que hayan presentes componentes e ingredientes para la elaboracin de PME.
14. Al comienzo de cada sesin de preparacin magistral, y siempre que se derrame un lquido, las superficies del ambiente
directo de preparacin magistral deben limpiarse primero con Agua Purificada USP para eliminar los residuos hidrosolu-
bles. Inmediatamente despus, se desinfectan las mismas superficies con un agente que no deje residuos, usando un pao
que no suelte pelusa.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 697

15. Los controles de ingeniera primarios deben estar en funcionamiento continuo durante la actividad de preparacin magis-
tral. Cuando el sistema ventilador est apagado, y antes de que ingrese otro personal para realizar actividades de prepara-
cin magistral, slo una persona debe ingresar en la zona amortiguadora a los efectos de encender el ventilador (durante
al menos 30 minutos) y desinfectar las superficies de trabajo.
16. El trfico en el rea directa de preparacin magistral (ADP) debe reducirse al mnimo y controlarse.
17. Se deben juntar los materiales a usar en el ADP para los procedimientos planificados y luego descontaminarse limpiando o
rociando la superficie externa de los mismos con solucin de IPA al 70% o retirando el envoltorio externo en el lmite del
ADP a medida que se introduce el artculo en el rea asptica de trabajo.
18. Los materiales deben disponerse en el ADP de manera tal que se evite su acumulacin y que se logre el flujo de trabajo
ms eficiente y ordenado posible.
19. Despus de introducir en forma correcta en el ADP nicamente los materiales requeridos para las operaciones asignadas,
deben organizarse de manera tal que un flujo ininterrumpido transparente de aire filtrado por HEPA bae todos los sitios
crticos en todo momento durante los procedimientos planificados. Es decir, no se debe colocar ningn objeto entre el
primer aire de los filtros HEPA y un sitio crtico expuesto.
20. Todos los procedimientos deben realizarse de manera tal de reducir al mnimo el riesgo de contaminacin por contacto.
Los guantes deben desinfectarse con la frecuencia necesaria con un desinfectante aprobado, como IPA estril al 70%.
21. Todos los tapones de goma de los viales y frascos y el cuello de las ampollas se desinfectan pasndoles un pao con IPA
estril al 70% durante al menos 1O segundos antes de usarlos para preparar PME.
22. Despus de la preparacin de cada PME, el contenido del envase se debe mezclar bien y luego inspeccionar para asegu-
rarse de que no tenga partculas, signos de incompatibilidad u otros defectos.
23. Una vez finalizados los procedimientos, se retiran las jeringas, frascos, viales y otros materiales utilizados, pero con un m-
nimo de salidas y entradas al ADP para reducir al mnimo las probabilidades de introducir contaminacin en el espacio
asptico de trabajo.

ELEMENTOS DE CONTROL DE CALIDAD

En cada centro debe desarrollarse una descripcin por escrito del programa de capacitacin especfica y de evaluacin del
desempeo para todo el personal que utiliza tcnicas aspticas en la preparacin de productos estriles. Este programa debe
preparar al personal otorgndole los conocimientos apropiados y la instruccin necesarias en el desarrollo de las habilidades
requeridas para realizar las tareas asignadas. Cada una de las personas asignadas al rea asptica para la preparacin de pro-
ductos estriles debe completar con xito un curso de capacitacin especializado en tcnicas aspticas y prcticas del rea
asptica antes de poder elaborar PME (ver la seccin Capacitacin y Evaluacin del Personal en Tcnicas de Manipulacin Asptica
y Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Lim-
pieza y Desinfeccin).

Ingredientes y Dispositivos

El personal de preparacin magistral debe establecer que los ingredientes utilizados en la elaboracin de las PME tengan la
identidad y calidad correctas, utilizando la siguiente informacin: etiquetas del proveedor, etiquetado del producto, certifica-
dos de anlisis, anlisis qumico directo y conocimiento de las condiciones de almacenamiento de las instalaciones de prepara-
cin.

INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS ESTRILES

Los productos farmacuticos estriles disponibles comercialmente y los envases y dispositivos estriles listos para usar son
ejemplos de componentes estriles. Debe seguirse un procedimiento escrito para la inspeccin fsica de cada unidad antes de
su uso para asegurarse de que estos componentes sean estriles, estn libres de defectos y sean adecuados para el uso al que
estn destinados.

INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS NO ESTRILES

Si se usan componentes no estriles, incluyendo envases e ingredientes, para elaborar una PME, dicha PME debe ser de alto
riesgo. Los ingredientes activos y sustancias agregadas o excipientes no estriles utilizados en la elaboracin de PME deben ser
preferentemente artculos que cumplan con las normas oficiales de la USP o NF. Cuando se utilizan ingredientes no oficiales,
deben estar acompaados por certificados de anlisis de sus proveedores para que el personal de preparacin magistral pueda
evaluar su identidad, calidad y pureza en relacin con el uso que se les dar en cada PME. Es necesario realizar una inspeccin
fsica del envase de los ingredientes para asegurarse de que no tenga roturas, tapas o cierres flojos y que el contenido no tenga
ninguna desviacin en relacin con el aspecto, aroma y textura esperados.
Las sustancias farmacuticas a granel, o no formuladas, y las sustancias agregadas o excipientes deben almacenarse en enva-
ses hermticamente cerrados bajo las condiciones de temperatura, humedad e iluminacin indicadas en las monografas oficia-
698 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

les o aprobadas por los proveedores. La fecha de recepcin en la instalacin de preparacin magistral debe estar clara e indele-
blemente marcada en cada envase del ingrediente. Una vez recibidos por la institucin responsable de la preparacin magis-
tral, los envases de ingredientes que no tienen una fecha de caducidad del proveedor no podrn utilizarse despus de transcu-
rrido un ao, a menos que una inspeccin o anlisis apropiado indique que el ingrediente ha conservado su pureza y calidad
para su uso en la elaboracin de PME.
Debern considerarse y evaluarse cuidadosamente las fuentes de ingredientes no estriles, especialmente cuando la PME ha
de administrarse en el sistema vascular, en el sistema nervioso central o en los ojos.
La persona a cargo de la preparacin magistral debe realizar una inspeccin visual de cada lote de frmaco o excipiente a
granel recibido que se utilizar en la elaboracin de las PME para detectar cualquier deterioro, otras caractersticas de calidad
inaceptable o identificacin errnea. La inspeccin visual de la sustancia farmacutica o excipiente a granel debe realizarse pe-
ridicamente segn se describe en el protocolo escrito correspondiente.

Equipos

Es necesario que los equipos, aparatos y dispositivos utilizados en la preparacin magistral de una PME funcionen correcta-
mente en todo momento y dentro de los lmites de tolerancia aceptables. Deben establecerse por escrito, y seguirse, los proce-
dimientos de calibracin del equipo, mantenimiento anual, monitoreo de funcionamiento correcto, y procedimientos controla-
dos para el uso del equipo, as como las frecuencias especficas para todas estas actividades. En estos POE se deben describir el
mantenimiento de rutina y las frecuencias. Los resultados de la calibracin de los equipos, informes de mantenimiento anual y
mantenimiento de rutina deben conservarse en los archivos durante toda la vida til del equipo. Se prepara al personal me-
diante una combinacin apropiada de capacitacin especfica y experiencia, para hacer funcionar o manipular cualquier equi-
po, aparato o dispositivo que pudieran tener que usar para la elaboracin de PME. La capacitacin debe incluir los conocimien-
tos necesarios para determinar si un equipo determinado est funcionando correctamente o si tiene algn desperfecto.

VERIFICACIN DE DISPOSITIVOS AUTOMATIZADOS DE PREPARACIN MAGISTRAL (DAP)

PARA NUTRICIN PARENTERAL

Los DAP para la preparacin de mezclas para nutricin parenteral son ampliamente utilizados por los farmacuticos en hos-
pitales y otros mbitos de atencin de la salud. Estn diseados para agilizar los procesos ms engorrosos requeridos para la
preparacin magistral de estas formulaciones de varios componentes, administrando automticamente los componentes nutri-
cionales individuales en una secuencia predeterminada bajo control computarizado. Por lo general, las mezclas para nutricin
parenteral contienen 20 o ms aditivos individuales que representan hasta 50 o ms componentes individuales (p.ej., 15 a 20
aminocidos cristalinos, dextrosa monohidrato y lpidos; 1O a 12 sales electrolticas; 5 a 7 oligominerales y 12 vitaminas). En
consecuencia, los DAP pueden mejorar la exactitud y precisin del proceso de preparacin magistral en comparacin con los
mtodos de preparacin magistral manuales tradicionales.

Exactitud

La exactitud de un DAP puede determinarse de varias maneras para asegurar que se suministren las cantidades correctas de
nutrientes, electrlitos u otros componentes nutricionales al envase de infusin final. Inicialmente, debe evaluarse el DAP para
verificar la exactitud del volumen y peso. Para verificar la exactitud del volumen, debe programarse el DAP para administrar un
volumen adecuado de Agua Estril para Inyeccin USP, que represente un volumen tpico de aditivo (p.ej., 40 mL para un
intervalo de volumen pequeo de 1 a 100 mL; o 300 mL para un intervalo de volumen grande de 100 a 1000 mL) y adminis-
trarse al recipiente volumtrico apropiado. Luego, el personal de preparacin magistral debe consultar en la seccin Aparatos
Volumtricos (31) los parmetros apropiados para evaluar el desempeo volumtrico del DAP. Para verificar la exactitud gravi-
mtrica, debe evaluarse la balanza utilizada junto con el DAP, usando diferentes tamaos de pesas que representen las cantida-
des normalmente usadas administrar los diferentes aditivos. El personal de preparacin magistral debe consultar en la sec-
cin las tolerancias aceptables de las pesas usadas. Adems, debe pesarse posteriormente el mis-
mo volumen de Agua para usado para evaluar la exactitud volumtrica en la balanza usada con el DAP. Por
ejemplo, si se utilizaron 40 mL de agua en la evaluacin volumtrica, su peso correspondiente debera ser de aproximadamen-
te 40 g (suponiendo que la densidad relativa del agua es de 1,0). Adems, durante el uso del DAP, tambin pueden probarse
ciertos aditivos, como cloruro de potasio (corregido segn las diferencias de densidad) como si fuera una prueba realizada du-
rante el proceso.
Por ltimo, pueden realizarse pruebas adicionales de exactitud para determinar el contenido de ciertos ingredientes en el
volumen final de la mezcla para nutricin parenteral. Por lo general, los departamentos de una farmacia no tienen la capacidad
para realizar en forma rutinaria anlisis qumicos, como anlisis de concentraciones de dextrosa o electrlitos. En consecuencia,
es posible que los laboratorios de los hospitales o instituciones deban encargarse de realizar estas pruebas de garanta de cali-
dad. No obstante, los mtodos utilizados por dichos laboratorios suelen estar diseados para sistemas biolgicos, no farmacu-
ticos. En consecuencia, debe verificarse que sus procedimientos de prueba cumplan con los requisitos USP especificados en la
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 699

monografa individual correspondiente al componente que se desea analizar. Por ejemplo, en Dextrosa, Inyeccin, se especifica
lo siguiente: Contiene no menos de 95,0% y no ms de 105,0% de la cantidad declarada de C6 H1P 6 H20. Los laboratorios
de qumica de la institucin u hospital pertinente deben validar sus mtodos para aplicarlos a este intervalo y corregirlos segn
su medicin tpica de dextrosa anhidra en relacin con dextrosa monohidrato. Existen intervalos y cuestiones similares, por
ejemplo, para las inyecciones de gluconato de calcio, sulfato de magnesio y cloruro de potasio. El punto crtico es el uso de
referencias USP y posibles diferencias de procedimiento entre laboratorios.

Precisin

La precisin intermedia del DAP puede determinarse teniendo en cuenta las variaciones diarias en los resultados de las medi-
ciones de exactitud. En consecuencia, el personal de preparacin magistral debe llevar un registro diario de las evaluaciones de
exactitud antes descritas y revisar los resultados a lo largo del tiempo. Esta revisin debe realizarse al menos cada semana para
evitar errores acumulativos clnicamente significativos con el tiempo, especialmente en el caso de aditivos con un ndice tera-
putico estrecho, como el cloruro de potasio.

CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS

Las siguientes mediciones de calidad se deben efectuar para todas las PME antes de dispensarlas o administrarlas.

Inspeccin de Formas Farmacuticas en Solucin y Revisin de los Procedimientos de Preparacin

Magistral

Todas las PME que se preparan como soluciones deben examinarse visualmente para asegurarse de que no contengan part-
culas y, en caso afirmativo, no deben administrarse ni dispensarse. Antes de administrar o dispensar las PME de cualquier nivel
de riesgo de contaminacin, se deben inspeccionar las recetas, los procedimientos escritos de preparacin magistral, los regis-
tros de preparacin y los materiales usados en su elaboracin, para verificar las identidades y cantidades correctas de sus ingre-
dientes, el mezclado asptico y esterilizacin, el envasado, etiquetado y aspecto fsico esperado.

INSPECCIN FSICA

Despus de su preparacin magistral, las PME terminadas deben inspeccionarse en forma individual, segn los procedimien-
tos por escrito. Si no se distribuyen de inmediato, estas PME deben inspeccionarse en forma individual justo antes del momen-
to en que abandonan el rea de almacenamiento. Las PME que no se distribuyen de inmediato deben almacenarse en un lugar
apropiado segn se describe en los procedimientos escritos. Inmediatamente despus de su preparacin magistral y como
condicin para su liberacin, se debe inspeccionar cada unidad de PME, siempre que sea posible, contra un fondo blanco o
negro iluminado, o ambos, para asegurarse de que no contenga partculas visibles ni otras materias extraas. La inspeccin
previa a la liberacin tambin incluye la inspeccin de la integridad del sistema de envase-cierre y cualquier otro defecto visual
evidente. Las PME que presenten defectos deben desecharse de inmediato o marcarse y aislarse de los productos aceptables de
manera que evite su administracin. Cuando las PME no se distribuyan de inmediato despus de su preparacin, debe realizar-
se una inspeccin previa a la distribucin para asegurarse de que una PME con defectos como precipitado, turbidez y prdidas,
que pueden desarrollarse entre el momento de su liberacin y su distribucin, no sea liberada.

Controles de Exactitud de la Preparacin Magistral

Deben seguirse los procedimientos por escrito para verificar la exactitud de la preparacin magistral de cada PME durante su
preparacin e inmediatamente antes de su liberacin. El sistema de doble verificacin debe cumplir con las reglamentaciones
estatales e incluir la exactitud de la informacin incluida en la etiqueta y de la adicin de todos los productos farmacuticos o
ingredientes usados para preparar el producto terminado, as como sus volmenes o cantidades. Los envases de los aditivos
usados y, en el caso de aditivos para los que no se consumi la totalidad del envase, las jeringas usadas para medir el aditivo
deben dejarse en cuarentena con los productos finales hasta haber terminado el control del producto final. El personal de pre-
paracin magistral debe confirmar visualmente que los ingredientes medidos en las jeringas coincidan con los indicados en la
receta escrita que se est preparando. Preferentemente, una persona que no sea la que realiz la preparacin magistral debe
verificar que se hayan medido correctamente los volmenes de ingredientes utilizados en la elaboracin de cada PME. Por
ejemplo, el personal de preparacin magistral debera colocar de nuevo el mbolo de la jeringa en el volumen medido.
En aquellos casos en que sea factible, debe confirmarse la exactitud de las mediciones, pesando un volumen del lquido me-
dido y calculando luego ese volumen, dividiendo el peso por el valor exacto de la densidad, o peso especfico, del lquido me-
dido. Debe confirmarse que los valores de densidad o peso especfico programados en los DAP, que miden segn el peso
usando el cociente del volumen programado dividido por la densidad o peso especfico, sean exactos antes y despus de ad-
ministrar los volmenes de los lquidos asignados a cada canal o puerto. Estos controles de exactitud del volumen y los siguien-
700 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

tes controles adicionales de seguridad y exactitud que se describen en esta seccin deben.incluirse en el manual de POE de la
institucin responsable de la elaboracin de PME.

Pruebas de Esterilidad

Todas las PME de nivel de riesgo alto que se preparan en grupos de ms de 25 envases individuales monodosis idnticos
(p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis (VMD) para administracin a mltiples pacientes o que estn
expuestos por ms de 12 horas a temperaturas entre 2 y 8 y por ms de 6 horas a temperaturas superiores a 8 antes de ser
esterilizados deben cumplir con Ja prueba de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad (71 )) antes de ser dispensadas o administra-
das. El mtodo de Filtracin por Membrana es el mtodo preferido en los casos en que sea factible (p.ej., cuando los compo-
nentes son compatibles con la membrana). Puede usarse un mtodo no descrito en Ja USP si los resultados de la verificacin
demuestran que la alternativa es al menos tan eficaz y confiable como el mtodo de Filtracin por Membrana USP o el mtodo
de Inoculacin Directa del Medio de Cultivo USP cuando el mtodo de Filtracin por Membrana no es factible.
Cuando las PME de nivel de riesgo alto se dispensan antes de que Jos resultados de sus pruebas de esterilidad estn disponi-
bles, debe haber un procedimiento escrito que exija la observacin diaria de las muestras de prueba en incubacin y el retiro
inmediato de la PME dispensada cuando exista evidencia de crecimiento microbiano en las muestras de prueba. Adems, el
paciente al que se pudo haber administrado una PME contaminada, y su mdico, deben ser notificados acerca del riesgo po-
tencial. Si los resultados de la prueba de esterilidad son positivos, debe realizarse una investigacin inmediata y sistemtica de
la tcnica asptica, control ambiental y otros controles de garanta de esterilidad para identificar las fuentes de contaminacin
y solucionar los problemas existentes en los mtodos o procesos.

Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirgenos)

Todas las PME de nivel de riesgo alto, excepto las destinadas a inhalacin o administracin oftlmica, que se preparan en
grupos de ms de 25 envases individuales monodosis idnticos (p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis
(VMD) para administracin a mltiples pacientes o que estn expuestos por ms de 12 horas a temperaturas entre 2 y 8 y
por ms de 6 horas a temperaturas superiores a 8 antes de ser esterilizados deben examinarse para garantizar que no contie-
nen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) y Prueba de Pirgenos (151 )). En caso de
que no se indique un lmite de endotoxinas bacterianas en la monografa oficial o en otra fuente de la formulacin de la PME,
aquel no deber exceder la cantidad de Unidades USP de Endotoxinas (Unidades por hora por kg de peso corporal o metros
cuadrado de superficie corporal) especificadas en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), mencionada anteriormente, segn la
va de administracin apropiada.

Verificacin de la Identidad y Concentracin de los Ingredientes

La institucin responsable de Ja elaboracin de preparaciones magistrales debe contar como mnimo con los siguientes pro-
cedimientos escritos para verificar la identidad y calidad de las PME antes de dispensarlas y administrarlas:
1. Que las etiquetas de las PME tengan Jos nombres y cantidades o concentraciones de ingredientes correctos, el volumen
total, la FLU, las vas de administracin apropiadas, las condiciones de almacenamiento y otra informacin para su uso
seguro.
2. Que las identidades, purezas y cantidades de ingredientes sean correctas, comparando la receta original con el registro de
preparacin magistral escrito de la PME.
3. Que se han obtenido los volmenes de llenado correctos en las PME y las cantidades correctas de unidades llenadas de las
PME. Cuando no se puede confirmar que el contenido de las PME terminadas es exacto, segn las tres inspecciones que
se describen ms arriba, las PME deben valorarse utilizando mtodos especficos para los ingredientes activos.

ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LMITE DE USO

Por lo general, las FLU para preparaciones magistrales se asignan basndose en la experiencia profesional, que debera incluir
la cuidadosa interpretacin de las fuentes de informacin apropiadas para las mismas formulaciones u otras formulaciones si-
milares (ver Criterio de Estabilidad y Fechado de Lmite de Uso en Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles (795)). Las
fechas lmite de uso de las PME rara vez se basan en los resultados de valoraciones qumicas especficas a cada preparacin, las
cuales se usan con la ecuacin de Arrhenius para determinar las fechas de caducidad (ver Advertencias y Requisitos Generales)
de productos fabricados. La mayora de las PME son soluciones acuosas en las que la reaccin de degradacin qumica ms
comn es la hidrlisis de los ingredientes disueltos. El grado de hidrlisis y otras reacciones de degradacin catalizadas por
calor en cualquier momento en particular de Ja vida til de una PME representan Ja suma termodinmica de las temperaturas y
duraciones de exposicin. Dicha exposicin de la estabilidad de la vida til del producto est representada en el clculo de Ja
temperatura cintica media (ver Clculos en la Prctica Farmacutica (1160)). Las velocidades de hidrlisis de los frrnacos au-
mentan en forma exponencial con el.aumento aritmtico de la temperatura; en consecuencia, la exposicin de una solucin
de un antibitico beta-lactmico durante un da a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales)
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 701

tendr un efecto equivalente sobre el grado de hidrlisis de aproximadamente 3 a 5 das a temperaturas fras (ver Advertencias
y Requisitos Generales).
El personal a cargo de preparar, dispensar y administrar las PME debe almacenarlas estrictamente conforme a las condicio-
nes especificadas en la etiqueta de los ingredientes y PME terminadas. Cuando se sabe que las PME han estado expuestas a
temperaturas superiores al lmite declarado o a temperaturas ,por encima de 40 (ver Advertencias y Requisitos Generales) duran-
te ms de 4 horas, dichas PME deberan desecharse a menos que se verifique su estabilidad a travs de la documentacin apro-
piada o una valoracin directa.

Determinacin de las Fechas Lmite de Uso

Las fechas lmite de uso y fecha de caducidad no son lo mismo (ver Advertencias y Requisitos Generales). Las fechas de caduci-
dad para la estabilidad qumica y fsica de los productos estriles fabricados comercialmente se determinan a partir de los resul-
tados de rigurosas pruebas analticas y de desempeo y son especficas de una formulacin en particular en su envase y a las
condiciones de exposicin indicadas de iluminacin y temperatura. Cuando las PME se desvan de las condiciones indicadas en
el etiquetado aprobado de los productos fabricados contenidos en las PME, el personal de preparacin magistral puede solici-
tar al fabricante del producto en cuestin asesoramiento sobre la asignacin de FLU basada en parmetros de estabilidad qu-
mica y fsica. Las FLU de las PME que se preparan estrictamente conforme al etiquetado del producto del fabricante deben ser
las especificadas en dicho etiquetado o deben basarse en la literatura apropiada o en pruebas directas. Las FLU para las PME
que carecen de justificacin proveniente de fuentes de literatura apropiadas o de pruebas directas se deben asignar segn se
describe en Criterios de Estabilidad y Fechas Lmite de Uso en Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles (795).
El personal de preparacin magistral podr tambin consultar las publicaciones pertinentes para obtener informacin acerca
de la estabilidad, compatibilidad y degradacin del frmaco o de frmacos similares. Al asignar una fecha lmite de uso, el per-
sonal de preparacin magistral debera consultar la documentacin y literatura especficas sobre la estabilidad en general y la
del frmaco en particular en aquellos casos en que se cuente con ellas, y debera considerar la naturaleza del frmaco y su
mecanismo de degradacin, el envase en el que est contenido, las condiciones de almacenamiento esperadas y la duracin
prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales). La
informacin de estabilidad debe interpretarse cuidadosamente en relacin con la formulacin preparada y sus condiciones de
almacenamiento y uso. Las predicciones basadas en otra evidencia como publicaciones, cuadros, tablas slo permiten obtener
fechas lmite de uso tericas. El fechado de lmite de uso estimado en forma terica est sujeto a diferentes grados de hiptesis
y, en consecuencia, a una probabilidad de error o al menos de inexactitud. El grado de error o inexactitud dependera del
grado de las diferencias entre las caractersticas de la PME (p.ej., composicin, concentracin de ingredientes, volumen de lle-
nado o tipo y material del envase) y las caractersticas de los productos de los que deben extrapolarse los datos o informacin
de estabilidad. Cuanto mayor sea la duda respecto de la exactitud de las fechas lmite de uso estimadas en forma terica, ma-
yor ser la necesidad de determinar el fechado de perodos en forma experimental. Las fechas lmite de uso estimadas en for-
ma terica deberan considerarse con cuidado para las PME preparadas a partir de ingredientes activos a granel no estriles
que tienen actividad teraputica, especialmente en aquellos casos en que se prev que la preparacin de la PME se realizar en
forma rutinaria. Cuando las PME son para distribucin y administracin en domicilios particulares y no en centros de salud, al
asignar las FLU debe tenerse en cuenta el efecto de las condiciones de temperatura potencialmente no controladas y no vigila-
das. Debe establecerse que las PME no estn expuestas a temperaturas clidas (ver Advertencias y Requisitos Generales) a menos
que la institucin responsable de la preparacin magistral tenga evidencia que justifique la estabilidad de las PME a esas tem-
peraturas.
Debe reconocerse que la nica evidencia vlida de estabilidad para predecir el fechado de lmite de uso puede obtenerse
solamente a travs de estudios experimentales especficos con cada producto. Los procedimientos semicuantitativos, como
una cromatografa en capa delgada (TLC), pueden ser aceptables para muchas PME. No obstante, los ensayos cuantitativos
indicadores de estabilidad, como las valoraciones por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), seran ms apropiados
para ciertas PME, como por ejemplo aquellas con un ndice teraputico reducido, en las que se requiere un monitoreo ovalo-
racin estrictos de las dosis para asegurar su eficacia teraputica y evitar la toxicidad; aquellas en que el perodo de fechado de
lmite de uso estimado en forma terica slo es avalado por evidencia marginal, o en aquellos casos en que no se puede verifi-
car un margen significativo de seguridad para el perodo de fechado de lmite de uso propuesto. En sntesis, debido a que los
perodos de fechado de lmite de uso establecidos a partir de datos especficos de un producto obtenidos mediante anlisis
con instrumental apropiado son sin duda ms confiables que los determinados en forma terica, se recomienda enfticamente
utilizar el primer enfoque para avalar los perodos que superen los 30 das.
Para asegurar prcticas constantes en la determinacin y asignacin de fechas lmite de uso, la instalacin de preparacin
magistral debe contar con normas y procedimientos escritos para la determinacin de las fechas lmite de uso para todos los
productos preparados magistralmente. Cuando se intente predecir una fecha lmite de uso terica, un producto preparado o
mezclado magistralmente debe considerarse como un sistema nico que tiene propiedades fsicas y qumicas y caractersticas
de estabilidad que difieren de las de sus componentes. Por ejemplo, las propiedades antioxidantes, de amortiguacin o antimi-
crobianas de un vial estril para inyeccin (VEI) pueden perderse al diluirlo y podran afectar seriamente la estabilidad qumica
del ingrediente activo del VEI o la estabilidad fsica o microbiolgica de la formulacin de dicho vial. En consecuencia, por lo
general no puede esperarse que las propiedades estabilizadas en la formulacin del VEI se trasladen al producto preparado o
702 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

mezclado magistralmente. Se prefieren los protocolos de evaluacin de datos de estabilidad determinados en forma experi-
mental para cada preparacin, en lugar de la informacin sobre estabilidad publicada.
Cuando se carece de resultados de valoraciones qumicas directas, el personal de preparacin magistral que asigna fechas
lmite de uso a PME debe interpretar y evaluar en forma crtica las fuentes de informacin disponibles ms apropiadas para
determinar una FLU conservadora y segura. El manual de POE de la institucin responsable de la preparacin magistral y los
registros de formulacin de cada PME deben describir los fundamentos generales sobre los que debe basarse la asignacin de
la FLU y las condiciones de almacenamiento.
Cuando se usan viales multidosis (ver Envases Multidosis en Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Ad-
vertencias y Requisitos Generales) de ingredientes estriles fabricados comercialmente en la elaboracin de PME, se inspecciona
la integridad fsica de los tapones de los VMD y se desinfectan frotndolos con un hisopo empapado en IPA estril al 70%
antes de cada penetracin con un dispositivo estril para retirar el contenido. Cuando se sospechan u observan contaminantes
o propiedades anormales en un VMD, ste deber descartarse. La FLU despus de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 das (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto.

Sistemas de Bolsas y Viales de Propiedad Exclusiva

Las fechas lmites de uso para la estabilidad, esterilidad y almacenamiento de pares de envases de productos farmacuticos
para administracin intravascular (p.ej., ADD-Vantage, Mini Bag Plus) conectados y activados (activado significa que se pro-
dujo el contacto entre el diluyente y el frmaco que estaban separados previamente) se deben aplicar segn lo indica el fabri-
cante. Es decir, se deben seguir las instrucciones del fabricante para manipular y almacenar los productos ADD-Vantage, Mini
Bag Plus, Add A Vial, Add-Ease y cualquier otro.

Monitoreo de reas de Almacenamiento Controladas

Para asegurarse de que el producto conserva su potencia hasta la fecha de caducidad indicada por el fabricante en la etique-
ta, el personal de preparacin magistral debe monitorear las reas de almacenamiento de frmacos dentro de las instalaciones
de preparacin magistral. Las reas de temperatura controlada en las instalaciones de preparacin magistral incluyen tempera-
tura ambiente controlada, entre 20 y 25 con temperatura cintica media de 25; temperatura fra controlada, entre 2 y 8
con temperatura cintica media de 8; temperatura fra, entre 2 y 8; temperatura de congelacin, entre -25 y -1 O (ver
Advertencias y Requisitos Generales) si se necesita alcanzar la congelacin, y el intervalo de temperatura especfico del medio
para medios de cultivo microbianos. Un rea de temperatura controlada se debe monitorear al menos una vez al da, docu-
mentando los resultados en una bitcora de temperatura. Asimismo, el personal de preparacin magistral debe observar la
temperatura de almacenamiento al colocar el producto en la unidad de almacenamiento o al retirarlo de ella a fin de controlar
cualquier desvo en la temperatura. Los dispositivos de registro de temperatura adecuados pueden incluir un dispositivo de
registro continuo calibrado o un termmetro calibrado segn las normas del National lnstitute of Standards and Technology
(Instituto Nacional de Normas y Tecnologa, NIST) que tenga una exactitud y sensibilidad satisfactorias para el propsito al
que est destinado y sea calibrado correctamente a intervalos adecuados. Si la instalacin de preparacin magistral usa un dis-
positivo continuo de registro de la temperatura, el personal debe verificar al menos una vez al da que dicho dispositivo est
funcionando correctamente.
Los mecanismos detectores de temperatura deben colocarse en forma adecuada en el rea de almacenamiento de tempera-
tura controlada para que reflejen de forma exacta su temperatura real. Asimismo, la instalacin de preparacin magistral debe
seguir procedimientos apropiados para todas las reas de almacenamiento controlado, para asegurar que dichos espacios no
estn sometidos a fluctuaciones de temperatura significativamente prolongadas como las que podran ocurrir, por ejemplo, al
dejar la puerta de un refrigerador abierta demasiado tiempo.

MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y

DISTRIBUIDAS
Esta seccin resume las responsabilidades de las instalaciones de preparacin magistral para mantener la calidad y el control
de las PME que se dispensan y administran dentro de sus organizaciones matrices de salud.
El personal de preparacin magistral debe garantizar el adecuado almacenamiento y la seguridad de las PME preparadas o
dispensadas por la instalacin de preparacin magistral hasta que se alcance su FLU o sean administradas a los pacientes. Co-
mo parte de esta responsabilidad general, la instalacin de preparacin magistral es responsable del envasado, manipulacin,
transporte y almacenamiento correctos de las PME que prepara o dispensa, incluyendo la enseanza, capacitacin y supervi-
sin apropiadas del personal de preparacin magistral asignado a dichas funciones. La instalacin de preparacin magistral de-
bera colaborar en la enseanza y capacitacin del personal ajeno a la preparacin magistral responsable de llevar a cabo cual-
quier aspecto de estas funciones.
La instalacin de preparacin magistral tambin tiene la responsabilidad de establecer, mantener y asegurar el cumplimiento
de las polticas y procedimientos escritos relacionados con dichas responsabilidades. Cuando se asigna personal que no es de
preparacin magistral a tareas que involucran cualquiera de estas responsabilidades, las polticas y procedimientos que abarcan
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 703

estas tareas deben ser desarrolladas por los supervisores de preparacin magistral. Las actividades de calidad y control relacio-
nadas con la distribucin de las PME se resumen en las cinco subsecciones siguientes. Las actividades o asuntos que debe aten-
der la instalacin de preparacin magistral como parte de dichas responsabilidades son los que se indican a continuacin.

Envasado, Manipulacin y Transporte

Los procesos o tcnicas inapropiados relacionados con el envasado, manipulacin y transporte pueden afectar adversamente
la calidad y la integridad del envase de las PME. Aunque el personal de preparacin magistral realiza en forma rutinaria muchas
de las tareas asociadas con estas funciones, algunas de ellas, como el transporte, manipulacin y almacenamiento, pueden rea-
lizarlas personal ajeno a la preparacin magistral que no se encuentra bajo el control administrativo directo de la instalacin de
preparacin magistral. En estos casos, la instalacin de preparacin magistral deber establecer POE apropiados, en colabora-
cin con los departamentos o servicios cuyo personal sea responsable de llevar a cabo las tareas relacionadas con las PME en
las que la instalacin de preparacin magistral tiene un inters directo. Se debe controlar el desempeo del personal ajeno a la
preparacin magistral para asegurarse de que cumpla con las polticas y procedimientos establecidos.
Los requisitos fundamentales que son exclusivos de las PME y necesarios para asegurar la calidad de la PME y la integridad
del envase se deben tratar por escrito en POE. Por ejemplo, deberan especificarse tcnicas para evitar el empuje de los mbo-
los de las jeringas o que las puntas de las jeringas se salgan durante su manipulacin y transporte. Adems, debe evitarse la
desconexin de los componentes de un sistema (p.ej., cuando las PME se dispensan con equipos de administracin conecta-
dos a estas) hasta la FLU de la PME. Los insertos o rellenos de espuma resultan particularmente tiles cuando las PME deben
transportarse mediante sistemas de tubos neumticos. Independientemente de los mtodos usados, la instalacin de prepara-
cin magistral debe evaluar la eficacia y la confiabilidad de la proteccin utilizada. La evaluacin debera ser continua, por
ejemplo, mediante un sistema de vigilancia, incluyendo un sistema de reporte de problemas a la instalacin de preparacin
magistral.
El transporte y la manipulacin inapropiados pueden afectar adversamente la calidad de ciertas PME que tienen requisitos de
estabilidad nicos. Por ejemplo, la agitacin fsica que puede tener lugar durante el transporte mediante tubo neumtico, o la
exposicin indebida al calor o a la luz, debe tratarse en cada preparacin de forma especfica. Podran ser necesarios modos de
transporte alternativos o medidas de embalaje adicionales para asegurar debidamente la calidad de estas PME. El uso de cierres
y sellos que evidencian alteracin intencional en los puertos de las PME puede ser una medida adicional de seguridad para
asegurar la integridad del producto independientemente del mtodo de transporte usado.
Las PME quimiotxicas u otras PME peligrosas requieren salvaguardas para mantener su integridad y reducir al mnimo el
potencial de exposicin de estos productos al entorno y al personal que podra entrar en contacto con ellos. El transporte por
tubo neumtico no es recomendable debido a posibles roturas y contaminacin. Los requisitos especiales asociados con el en-
vasado, transporte y manipulacin de estos agentes incluyen la prevencin de exposicin o derrame accidentales y la capacita-
cin del personal en caso de una exposicin o derrame. Otros ejemplos de requisitos especiales para estos agentes incluyen las
estrategias de reduccin de la exposicin, como el uso de jeringas con cierre Luer y conexiones, tapas para jeringas, tapas en
los puertos de los envases, bolsas plsticas selladas, envases resistentes a los impactos y etiquetas con las precauciones perti-
nentes.

Uso y Almacenamiento

La instalacin de preparacin magistral es responsable de asegurar que las PME que se encuentran en el entorno en que se
prestan cuidados al paciente mantengan su calidad hasta el momento de su administracin. El etiquetado inmediato del enva-
se de la PME debe mostrar en forma prominente y clara los requisitos para su almacenamiento correcto y su fecha de caduci-
dad. El personal de suministro y del entorno de cuidado del paciente debe estar debidamente capacitado para colocar la PME
en el lugar de almacenamiento apropiado. Las PME vencidas y no utilizadas deben devolverse a la instalacin de preparacin
magistral para su eliminacin.
Debe contarse con POE para asegurar que las condiciones de almacenamiento en el entorno en que se prestan cuidados al
paciente sean adecuadas para los requisitos especficos de cada PME. Estos procedimientos incluyen la supervisin y documen-
tacin diaria de los refrigeradores de almacenamiento de las preparaciones de frmacos para asegurarse de que mantienen una
temperatura entre 2 y 8 y la inspeccin mensual de todos los lugares de almacenamiento de preparaciones de frmacos por
el personal de preparacin magistral. Las inspecciones deben confirmar el cumplimiento de las condiciones de almacenamien-
to apropiadas, la separacin de frmacos y alimentos, el uso correcto de VMD y que no se usen productos monodosis como
VMD. Las PME, as como todos los dems productos farmacuticos, deben almacenarse en el rea en donde se prestan cuida-
dos al paciente de tal manera que el personal no autorizado, los visitantes y los pacientes no tengan acceso a ellos.

Preparacin para Administracin

Los procedimientos esenciales para asegurar la calidad general del producto, especialmente su esterilidad, al preparar una
PME para su posterior administracin, incluyen el lavado apropiado de las manos, el uso de tcnica asptica, el cuidado del
sitio y el cambio de los equipos de administracin. Tambin pueden ser fundamentales otros procedimientos adicionales para
704 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

ciertas PME, dispositivos o tcnicas, por ejemplo, en la filtracin en lnea, la operacin de dispositivos de control de infusin
automticos y la reposicin de PME en los reservorios de bombas de infusin implantables o porttiles. Cuando es probable
que las PME se expongan a temperaturas superiores a 30 por ms de 1 hora durante su administracin a pacientes, se debe
confirmar que mantengan su esterilidad y estabilidad, bien sea por medio de fuentes confiables y relevantes o por pruebas
directas.

Redispensacin de PME

La instalacin de preparacin magistral debe tener toda la autoridad de determinar cundo se pueden volver a dispensar las
PME devueltas, sin abrir. Las PME devueltas pueden volverse a dispensar slo cuando el personal responsable de la preparacin
magistral estril pueda garantizar que dichas PME son estriles, puras y estables (contienen la concentracin de ingredientes
declarada). Puede considerarse que una PME brinda dicha garanta si: la PME se mantuvo bajo refrigeracin continua y prote-
gida de la luz, de ser necesario, y no presenta evidencia de alteracin intencional ni de ninguna preparacin para el uso fuera
de la instalacin de preparacin magistral. La asignacin de nuevas fechas de almacenamiento y fechas lmites de uso que ex-
cedan las fechas originales para las PME devueltas se permite tan slo cuando existe evidencia de respaldo proveniente de
pruebas de esterilidad y valoracin cuantitativa de los ingredientes. En consecuencia, la preparacin inicial y los tiempos de
descongelacin deben documentarse y realizarse mediciones confiables para evitar y detectar cualquier alteracin intencional.
El cumplimiento con todos los procedimientos asociados con el mantenimiento de la calidad del producto es fundamental. Las
PME no deben volver a dispensarse si no puede asegurarse de manera satisfactoria que se mantuvieron en forma continua la
calidad de la preparacin y la integridad del envase (incluyendo las conexiones de los dispositivos, cuando corresponda) entre
el momento en que la PME egres de la instalacin de preparacin magistral y el momento en que volvi a ella. Asimismo, las
PME no deben volver a dispensarse si la redispensacin no puede respaldarse con la FLU originalmente asignada.

Educacin y Capacitacin

La garanta de calidad de la PME y de la integridad del envasado depende en gran medida de que todo el personal cumpla
con los POE pertinentes. El personal de preparacin magistral debe disear, implementar y mantener un programa formal de
enseanza, capacitacin y evaluacin de competencia que cubra todas las funciones y tareas descritas en las secciones anterio-
res y que incluya a todo el personal al que se asignen dichas funciones y tareas. Este programa incluye la evaluacin y docu-
mentacin de incumplimientos del procedimiento, errores de administracin, efectos colaterales, reacciones alrgicas y com-
plicaciones asociadas con la dosificacin o administracin, como la extravasacin. Este programa debe coordinarse con los pro-
gramas de informe de eventos adversos e incidentes de la institucin responsable.

Envase y Transporte de PME

Las siguientes secciones describen cmo mantener la esterilidad y estabilidad de las PME hasta que sean entregadas en los
sitios de atencin del paciente para su administracin.

EMBALAJE DE PME PARA SU TRANSPORTE

Cuando las PME se distribuyen a lugares fuera de las instalaciones en las que se preparan, el personal de preparacin magis-
tral debe seleccionar envases y materiales de embalaje que mantengan la integridad fsica, esterilidad y estabilidad de las PME
durante su transporte. Debe seleccionarse un embalaje que proteja las PME contra daos, prdidas, contaminacin y degrada-
cin y, al mismo tiempo, que proteja de posibles lesiones al personal a cargo de transportarlas. El manual de POE de la institu-
cin responsable de la preparacin magistral describe especficamente los envases de embalaje y los materiales de aislamiento
y relleno apropiados, segn las especificaciones del producto, la informacin de los proveedores y la experiencia del personal
de preparacin magistral. Se proporcionan instrucciones escritas a los pacientes y otros destinatarios que explican claramente
cmo abrir en forma segura los envases de las PME embaladas.

TRANSPORTE DE PME

Las instituciones responsables de la preparacin magistral que envan PME a otros lugares deben seleccionar modos de
transporte que permitan entregarlas debidamente embaladas sin que sufran daos, y en condiciones estriles y estables a sus
destinatarios.
El personal de preparacin magistral debe verificar que las temperaturas de las PME durante el transporte por el medio selec-
cionado no excedan las temperaturas ms altas especificadas en el intervalo de temperatura de almacenamiento indicado en
las etiquetas de las PME. Se recomienda que el personal de preparacin magistral se comunique directamente con la empresa
de transporte para conocer la duracin del transporte y las condiciones de exposicin que pueden encontrar las PME.
El personal de preparacin magistral debe incluir instrucciones de manipulacin y exposicin especficas en la parte externa
de los embalajes que contienen las PME que se deben transportar, y debe obtener una garanta razonable de cumplimiento de
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 705

dichas condiciones por parte de los transportistas. El personal de preparacin magistral debe evaluar peridicamente el desem-
peo de las empresas de transporte para verificar que las PME se estn transportando en forma eficiente y apropiada.

Almacenamiento en Sitios Fuera de las Instalaciones de Preparacin Magistral

Las instituciones responsables de la preparacin magistral que envan PME a pacientes y otros destinatarios que se encuen-
tran en otros lugares deben verificar o garantizar, segn sea apropiado, lo siguiente:
1. Las etiquetas y etiquetado accesorio de las PME incluyen en forma claramente legible las FLU, instrucciones de almacena-
miento e instrucciones de eliminacin para las unidades vencidas.
2. Los pacientes u otros destinatarios pueden almacenar las PME en forma correcta, incluyendo el uso de un refrigerador y
congelador que funcionen adecuadamente si el etiquetado indica que las PME necesitan dicho tipo de almacenamiento.

CAPACITACIN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO

Debe proporcionarse un programa de capacitacin formal a fin de que el paciente o la persona encargada de su cuidado
pueda entender y cumplir con las numerosas responsabilidades especiales y complejas que tiene en cuanto al almacenamiento,
manipulacin y administracin de PME. Los objetivos instructivos del programa de capacitacin incluyen todas las responsabili-
dades del cuidado domiciliario de la PME que se espera que asuma el paciente o la persona encargada del cuidado de ste y
deben especificarse en trminos de competencias del paciente o de la persona encargada de su cuidado.
Al terminar el programa de capacitacin, el paciente o la persona encargada de su cuidado debera estar en condiciones de
hacer lo siguiente, en forma correcta y consistente:
1. Describir la terapia en cuestin, incluyendo la enfermedad o trastorno para la que se receta la PME, los objetivos de la
terapia, el resultado teraputico esperado y los efectos colaterales potenciales de la PME.
2. Inspeccionar todos los productos farmacuticos, PME, dispositivos, equipos y materiales en el momento de recibirlos para
asegurarse de que se han mantenido las temperaturas correctas durante el transporte y que los artculos recibidos no pre-
sentan evidencia de deterioro o defectos.
3. Manipular, almacenar y controlar todos los productos farmacuticos, PME y materiales y equipos relacionados en la casa,
incluyendo todos los requisitos especiales relacionados con ellos.
4. Inspeccionar visualmente todos los productos farmacuticos, PME, dispositivos y otros elementos que el paciente o la per-
sona encargada de su cuidado debe utilizar inmediatamente antes de la administracin, en una forma que garantice que
todos los elementos estn en condiciones de ser utilizados. Por ejemplo, las PME deben estar libres de prdidas, grietas en
los envases, partculas, precipitado, turbidez, decoloracin u otras desviaciones respecto de su aspecto normal esperado y
los envases inmediatos de los dispositivos estriles deben estar completamente sellados sin que haya evidencia de deterio-
ro de la integridad del envase.
5. Verificar las etiquetas inmediatamente antes de su administracin para asegurar que se trate del medicamento, la dosis, el
paciente y el momento de administracin correctos.
6. Limpiar el rea de preparacin en el domicilio, lavar y refregar las manos, usar la tcnica asptica apropiada y manipular
todos los envases, equipos, aparatos, dispositivos y materiales usados para la administracin.
7. Emplear todas las tcnicas y precauciones asociadas con la administracin de PME, por ejemplo, preparacin de materia-
les y equipos, manipulacin de dispositivos, preparacin de las tuberas e interrupcin de una infusin.
8. Cuidar los catteres, cambiar vendajes y mantener la patencia del sitio segn lo indicado.
9. Monitorear y detectar las ocurrencias de complicaciones teraputicas, tales como infecciones, flebitis, desequilibrio elec-
troltico y mala colocacin del catter. .
1O. Responder de inmediato a situaciones de emergencia o crticas, como rotura o salida de su lugar del catter, desconexin
de una tubera, formacin de cogulos, bloqueo del flujo y mal funcionamiento de equipos.
11. Saber cundo y cmo recurrir a servicios de emergencia profesional o asesoramiento profesional.
12. Manipular, contener y eliminar el material desechado, como agujas, jeringas, dispositivos, derrames o residuos tjue consti-
tuyan un riesgo biolgico y sustancias infecciosas.
Los programas de capacitacin deben incluir demostraciones prcticas y la prctica con elementos reales que el paciente o la
persona encargada de su cuidado debern utilizar, como envases de PME, dispositivos y equipos. El paciente o la persona en-
cargada de su cuidado debe practicar las tcnicas aspticas y de inyeccin bajo la observacin directa del profesional de la
salud.
La instalacin de preparacin magistral, junto con el personal de enfermera o mdico, es responsable de asegurar inicial-
mente y en forma continua que el paciente o la persona encargada de su cuidado comprenda, domine y est en condiciones y
dispuesto a cumplir con todas estas responsabilidades relacionadas con el cuidado domiciliario. Esto se logra a travs de un
programa de evaluacin formal por escrito. Todas las competencias especificadas en el programa de capacitacin del paciente
o la persona encargada de su cuidado deben evaluarse de manera formal. El paciente o la persona encargada de su cuidado
debe demostrar al personal pertinente del cuidado de la salud su dominio de las actividades asignadas antes de que se le per-
mita administrar la PME sin la supervisin de un profesional de la salud.
El material impreso, como listas de control o instrucciones proporcionadas durante la capacitacin, pueden servir como re-
fuerzo del aprendizaje despus de la capacitacin o como recordatorio de las responsabilidades especficas del paciente o la
706 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

persona encargada de su cuidado. Tambin puede utilizarse peridicamente el asesoramiento oral despus de la capacitacin,
segn sea apropiado, para reforzar la capacitacin y asegurar el cumplimiento correcto y completo de las responsabilidades.

MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS

Las instituciones responsables de la preparacin magistral deben monitorear clnicamente a los pacientes tratados con PME
segn las reglamentaciones y guas establecidas por las juntas reguladoras del ejercicio de la medicina de su respectivo estado
o las normas de prctica aceptadas. Las instituciones responsables de la preparacin magistral deben proporcionar a los pa-
cientes y otros destinatarios de PME alguna manera de obtener respuestas a sus preguntas e informar cualquier inquietud que
pudieran tener en relacin con las PME y sus dispositivos de administracin.
Los manuales de POE de la institucin responsable de la preparacin magistral deben describir las instrucciones especficas
para recibir, acusar recibo y fechar los informes recibidos, y para registrar, o archivar, y evaluar los informes de eventos adver-
sos y de la calidad de la preparacin asociada con las PME. Los informes de eventos adversos con PME deben ser analizados de
inmediato y a fondo por los supervisores de preparacin magistral para tomar medidas correctivas y evitar que se vuelvan a
repetir en el futuro. Se recomienda al personal de preparacin magistral que participe en los programas de informe de eventos
adversos y defectos de productos de la FDA y la USP.

PROGRAMA DE GARANTA DE CALIDAD

Un proveedor de PME debe implementar un programa formal de garanta de calidad destinado a ofrecer un mecanismo pa-
ra monitorear, evaluar, corregir y mejorar las actividades y procesos descritos en este captulo. El nfasis del programa de ga-
ranta de calidad debe centrarse en mantener y mejorar la calidad de los sistemas y la provisin de cuidados al paciente. Ade-
ms, el programa de garanta de calidad asegura que cualquier plan enfocado a corregir los problemas identificados incluya
tambin el seguimiento apropiado para garantizar que se tomaron las acciones correctivas eficaces. 11
Un plan de garanta de calidad debe incluir las siguientes caractersticas:
1. Formalizacin por escrito;
2. Consideracin de todos los aspectos de las preparaciones y dispensacin de los productos segn se describe en este cap-
tulo, incluyendo las pruebas ambientales y los resultados de la verificacin;
3. Descripcin de las actividades especficas de monitoreo y evaluacin;
4. Especificacin de cmo se deben informar y evaluar los resultados;
5. Identificacin de los mecanismos de seguimiento apropiados cuando se exceden los lmites o umbrales de accin; y
6. Descripcin de las personas responsables de cada aspecto del programa de garanta de calidad.
Al desarrollar un plan especfico, debe ponerse nfasis en establecer indicadores objetivos y mensurables para las actividades
de monitoreo y los procesos considerados de alto riesgo, de volumen elevado o propensos a problemas. En general, la selec-
cin de indicadores y la eficacia del programa de garanta de calidad deben reevaluarse anualmente.

ABREVIATURAS Y ACRNIMOS

ADP rea directa de preparacin magistral

IPA alcohol isoproplico
ALARA tan bajo como sea razonablemente posible
ASHRAE American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers
CACI aislador asptico de contencin para preparacin magistral
CAi aislador asptico para preparacin magistral
CAPH cambios de aire por hora
CDC Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades
CETA Controlled Environment Testing Association
CFL cabina de flujo laminar
CIP control de ingeniera primario
CSB cabina de seguridad biolgica
CSTD dispositivo de sistema cerrado para transferencia de
vial
HVAC calefaccin, ventilacin y aire acondicionado
DAP dispositivo automatizado de preparacin magistral
EPP equipo protector para el personal
FDA Food and Drug Administration (Administracin de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos)

11 El uso de recursos adicionales, tales como el Accreditation Manual for Home Care de la joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations, pueden
resultar tiles en el desarrollo de un plan de garanta de calidad.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 707

FLU fecha lmite de uso

HEPA alta eficiencia para partculas areas
HICPAC Healthcare lnfection Control Practices Advisory Committee
IB indicador biolgico
ISO lnternational Organization far Standardization (Organizacin Internacional para la Normalizacin)
MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report
NIOSH Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional
NIST National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnologa)
PME preparacin magistral estril
psi libras por pulgada cuadrada
QA garanta de calidad
POE procedimiento operativo estndar
PET tomografa por emisin de positrones
TSA agar tripticasa de soja
UE Unidad de Endotoxina
ufc unidad( es) formadora(s) de colonias
USP Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (United States Pharmacopeia)
VDE vial para desafo de endotoxinas
VEI vial estril para inyeccin
VMD viales multidosis

Cambio en la redaccin:

GLOSARIO

Aislador Asptico de Contencin para Preparacin Magistral (CACI, por sus siglas en ingls): Un aislador asptico pa-
ra preparacin magistral (CAi, por sus siglas en ingls) diseado para proteger al trabajador de la exposicin a concentraciones
indeseables de frmacos dispersados en el aire durante los procesos de preparacin y transferencia del material y para propor-
cionar un ambiente asptico para la elaboracin de preparaciones magistrales estriles. No debe ocurrir intercambio de aire
con el medio que lo rodea, a menos que el aire pase primero a travs de un sistema de filtro de retencin microbiana (HEPA,
como mnimo) capaz de retener las concentraciones de partculas areas del tamao y estado fsico del frmaco que se est
preparando magistralmente. Cuando se trabaja con frmacos voltiles peligrosos, el aire de salida del aislador se debe extraer a
travs de una ventilacin debidamente diseada en el edificio.
Aislador Asptico para Preparacin Magistral (CAi, por sus siglas en ingls): Una forma de aislador especficamente
diseado para la elaboracin magistral de ingredientes o preparaciones farmacuticas. Est diseado para mantener un am-
biente asptico de preparacin dentro del aislador, durante los procesos de preparacin magistral y transferencia de material.
No debe ocurrir intercambio de aire entre el aislador y el medio que lo rodea, a menos que el aire haya pasado primero a
travs de un filtro de retencin microbiana (HEPA, como mnimo). 12
Antesala-Una sala ISO Clase 8 (ver Tabla 7) o mejor, donde el personal efecta procedimientos de higiene de manos y
vestimenta, clasificacin de componentes, ingreso de rdenes, etiquetado de PME y otras actividades que producen gran can-
tidad de partculas. Es tambin un rea de transicin que (1) brinda la garanta de que las relaciones de presin se mantienen
constantemente de forma que el aire fluya de las zonas limpias a las sucias y (2) reduce la necesidad de que el control del
sistema de calefaccin, ventilacin y aire acondicionado (HVAC) responda a perturbaciones grandes.13
rea Crtica: Un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
rea Directa de Preparacin Magistral (ADP): Un rea crtica dentro de un control de ingeniera primario (CIP) ISO Cla-
se 5 (ver Tabla 7) donde los sitios crticos se exponen a aire unidireccional filtrado por HEPA, conocido tambin como primer
aire.
rea Segregada para Elaboracin de Preparaciones Magistrales: Un espacio reservado, bien sea un rea demarcada o
un cuarto, que se restringe a la preparacin de PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Dicha rea debe
contener un dispositivo que proporcione flujo de aire unidireccional de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la elaboracin de
PME y no debe destinarse a actividades ni contener materiales que sean extraos a la preparacin magistral estril.
Cabina de Seguridad Biolgica (CSB): Una cabina ventilada para proteccin ambiental, de la PME, del personal y del
producto, que tiene un frente abierto, con flujo de aire hacia el interior para proteccin del personal, flujo de aire laminar des-
cendente con filtracin de alta eficiencia para partculas areas (HEPA, por sus siglas en ingls) para proteccin del producto y
salida de aire con filtracin HEPA para proteccin ambiental.

12 CETA Applications Cuide far the Use of Compounding lsolators in Compounding Sterile Preparations in Healthcare Facilities, CAG-001-2005, Controlled Environment
Testing Association (CETA), 8 de noviembre de 2005.
13 Ver Laboratory Design Cuide (Gua de diseo del laboratorio) de la American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers, /ne. (ASHRAE).
708 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

Control de Ingeniera Primario {CIP): Un dispositivo o cuarto que brinda un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la
exposicin de sitios crticos cuando se elaboran las PME. Dichos dispositivos incluyen, entre otros, cabinas de flujo laminar
(CFL), cabinas de seguridad biolgica (CSB), aisladores aspticos para preparacin magistral (CAi) y aisladores aspticos de
contencin para preparacin magistral (CACI).
Cuarto de Presin Negativa: Un cuarto que est a presin ms baja que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo
neto de aire es hacia el cuarto. 2
Cuarto de Presin Positiva: Un cuarto que est a presin ms alta que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo neto
de aire es hacia afuera del cuarto. 2
Cuarto Limpio: (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico (1116) y tambin la defini-
cin de Zona Amortiguadora) Un cuarto en el que se controla la concentracin de partculas en el are para que cumpla con
una clasificacin de limpieza especificada de partculas areas. Se montorean los microorganismos en el ambiente para que la
concentracin microbiana en el are, las superficies y el atuendo del personal no exceda el lmite de limpieza especificado.
Desinfectante: Un agente, generalmente un agente qumico pero en ocasiones fsico, que libra de la infeccin y destruye
los patgenos causantes de enfermedad u otros microorganismos peligrosos, pero que no necesariamente elimina esporas
bacterianas o fngicas. Se refiere a sustancias aplicadas a objetos inanimados.
Empaque a Granel para Farmacias: (ver (659) CAFoi.may-ao 16~ Un envase de una preparacin estril para uso parenteral
que contiene muchas dosis nicas. El contenido est destinado para su uso en un programa de mezclas de farmacia y est
restringido a la preparacin de mezclas para infusin o, a travs de un dispositivo de transferencia estril, para el llenado de
jeringas estriles vacas. El cierre se perforar slo una vez despus de la reconstitucin, usando un dispositivo de transferencia
o set de dispensacin estril y adecuado que permita la distribucin medida del contenido. El empaque a granel para farma-
cias slo se emplear en un rea de trabajo adecuada, como por ejemplo una campana de flujo de are laminar (o un rea
equivalente de preparacin magistral de aire limpio).
Cuando se ofrezca un envase como empaque a granel para farmacias, la etiqueta debe (a) indicar en forma visible "Empa-
que a Granel para Farmacias, No Usar para Infusin Directa," (b) contener o referir a informacin sobre las tcnicas apropiadas
para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una leyenda que limite el plazo dentro del cual se puede utili-
zar el envase una vez que ha sido perforado, siempre y cuando se mantenga bajo las condiciones de almacenamiento declara-
das.
Envase Monodosis: (ver Advertencias y Requisitos Generales y (659) (AF oi-may-2016) Un envase monodosis es un envase
unitario para artculos (ver Advertencias y Requisitos Generales) o preparaciones destinadas solamente a la administracin por va
parenteral. Est destinado a un solo uso. Debe estar etiquetado como envase monodoss. Ejemplos de envases monodoss son:
jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por fusin y envases con cierres sellados, cuando se los etiquete como tales.
Envase Multidosis: (ver Advertencias y Requisitos Generales y \659/ woi-may-w16) Un envase de unidades mltiples para
artculos o preparaciones destinadas a administracin parenteral solamente y que por lo general contiene conservantes antm-
crobanos. La fecha lmite de uso (FLU) para un envase multidoss abierto o perforado (p.ej., perforado con aguja), que tiene
conservantes anti microbianos, es de 28 das (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique
algo distinto.
Esterilizacin por Filtracin: Paso de un lquido o solucin a travs de una membrana de grado de esterilizacin para
producir un efluente estril.
Esterilizacin Terminal: Aplicacin de un proceso letal (p.ej., vapor bajo presin o autoclavado) a los envases sellados,
con el fin de conseguir un nivel de garanta de esterilidad predeterminado, generalmente menor que 10-6, o una probabilidad
de menos de uno en un milln de que haya una unidad no estrl.3
Etiquetado: [ver Advertencias y Requisitos Generales y 21 USC 321 (k) y (m)] Trmino que se refiere a todas las etiquetas o
marbetes y dems materiales escritos, impresos o grficos que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artculo
o preparacin, sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio en que est incluido, con excepcin de los embalajes exter-
nos destinados al transporte. El trmino "etiqueta" designa la parte del etiquetado que se encuentra sobre el envase primario.
Frmacos Peligrosos: Los frmacos se clasifican como peligrosos si los estudios en anmales o humanos indican que la
exposicin a ellos tiene potencial para causar cncer, toxicidad reproductiva o del desarrollo, o daos a los rganos. (Ver la
publicacin actual de NIOSH).
Fecha Lmite de Uso (FLU): (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparacin Magistral-Preparaciones No Estriles
(795)) A los efectos de este captulo, la fecha u hora despus de la cual no se debe almacenar o transportar una PME. Esta
fecha se determina a partir de la fecha u hora de preparacin.
Flujo Unidireccional: (ver nota 3 al pie de pgina) Un flujo de aire que se mueve en una sola direccin de una forma
robusta y uniforme y a una velocidad suficiente como para barrer las partculas lejos del rea crtica de prueba o procesamien-
to, en forma reproducible.
Membranas de Grado de Esterilizacin: Membranas para las que se ha documentado que retienen 100% de un cultivo
de 10 7 microorganismos de una cepa de Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta por centmetro cuadrado de superficie de
membrana bajo una presin de no menos de 30 psi (2,0 bar). Dichas membranas de filtro tienen tamao de poro nominal de
0,22 m o 0,2 m, dependiendo de la prctica utilizada por el fabricante.
Preparacin: Una preparacin, o una PME, que es un medicamento o nutriente estril preparado magistralmente en una
farmacia autorizada u otra institucin relacionada con la salud, de acuerdo con la orden de un prescriptor autorizado; el artcu-
lo puede contener productos estriles o no.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 709

Primer Aire: El aire que sale del filtro HEPA en una corriente unidireccional que carece prcticamente de partculas.
Procesamiento Asptico: (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico (1116)) Una mo-
dalidad de procesar productos farmacuticos y mdicos que involucra la esterilizacin por separado del producto y del empa-
que (envases y cierres o material de empaque para dispositivos mdicos) y la transferencia del producto al envase y su cierre en
condiciones ISO Clase 5 (ver Tabla 1) como mnimo.
Producto: Un medicamento o nutriente estril fabricado comercialmente, cuya seguridad y eficacia han sido evaluadas
por la FDA. Los productos van acompaados de informacin completa para prescribir, la cual se conoce comnmente como el
etiquetado del fabricante aprobado por la FDA o prospecto adjunto del producto.
Prueba de Llenado de Medios: (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamient9 Asptico (1116))
Una prueba utilizada para calificar los procesos o la tcnica asptica del personal que elabora la preparacin magistral, y con el
fin de garantizar que con los procesos usados se puedan elaborar productos estriles sin contaminacin microbiana. Durante
esta prueba, se sustituye el producto farmacutico real con un medio de crecimiento microbiano, como el Medio de Digerido
de Casena y Soja, para simular la mezcla de la preparacin magistral. 1 Los puntos que se deben considerar en el desarrollo de
la prueba de llenado de medios son: procedimientos de llenado de medios, seleccin de medios, volumen de llenado, incuba-
cin, tiempo y temperatura, inspeccin de las unidades llenas, documentacin, interpretacin de los resultados y posibles ac-
ciones correctivas requeridas.
Sitio Crtico: Un sitio que incluye cualquier componente o superficies de recorrido de lquidos (p.ej., septos de viales,
puertos de inyeccin, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores de agujas) expuestos y en
riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secreciones orales o mucosas) o
contaminacin por contacto. En el sitio crtico, el riesgo de contaminacin microbiana por partculas aumenta con el tamao
de las aberturas y el tiempo de exposicin.
Zona Amortiguadora: El sitio donde est localizado fsicamente el control de ingeniera primario (CIP). Las actividades
que ocurren en esta rea incluyen la preparacin y clasificacin de componentes y suministros usados al preparar la PME.

APNDICES

Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Captulo (797) de la USP
NOTA-Este apndice tabular resume y condensa selectivamente el texto completo del captulo (797) slo para referencia rpida. El personal de prepa-
racin magistral es responsable de leer, comprender y cumplir con el texto completo y toda la terminologa, contenido y condiciones oficiales de la
USP.
INTRODUCCIN
t El propsito del captulo consiste en evitar daos y muerte a pacientes tratados con PME.
t El captulo se refiere a la preparacin, el almacenamiento y el transporte de PME, mas no a su administracin.
t Personal e instituciones a las cuales se aplica el (797); por lo tanto, para quin y para las cules puede ser ejecutable por las autoridades reglamenta-
rias y de acreditacin.
t Los tipos de preparaciones diseadas como PME segn sus formas fsicas y los sitios y rutas de administracin a los pacientes.
t El personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente cuidadoso en evitar la contaminacin por contacto de las PME,
tanto dentro como fuera de las reas ISO Clase 5.
ORGANIZACIN
t Todo el personal que participa en la elaboracin de PME tiene la responsabilidad de comprender las prcticas y precauciones fundamentales que se
encuentran en el captulo (797) de la USP, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos proce-
dimientos y la calidad de la PME final para evitar daos.
RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIN MAGISTRAL
t Las prcticas y garantas de calidad requeridas para preparar, almacenar y transportar PME que son estriles y aceptablemente precisas, puras y esta-
bles.
NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIN MICROBIANA EN LAS PME
t La capacitacin apropiada y la evaluacin del personal, la limpieza y vestimenta adecuada del personal, la limpieza y desinfeccin adecuada de los
ambientes de trabajo de preparacin magistral y el mantenimiento y monitoreo apropiados de las instalaciones de ambiente controlado (todas las
cuales se detallan en sus respectivas secciones).
PME de Nivel de Riesgo Bajo
t Manipulaciones aspticas dentro de un ambiente ISO Clase 5 usando tres, o menos de tres, productos estriles y entradas en cualquier envase.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no ms de 48 horas a temperatura ambiente controlada, 14 das a temperatura fra y 45 das en
estado congelado slido entre -25 y -1 O o ms fro.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparacin magistral.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos
t Cumplir totalmente con los cuatro criterios especficos.
t Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP ISO Clase 5.
t Los lavabos deben estar separados del rea inmediata del CIP ISO Clase 5.
PME de Nivel de Riesgo Mediano
71 O (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles/ Pruebas Fsicas USP 39

Appendix l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:!: "debieran") en el Captulo (797) de la USP (Continuacin)
t Manipulaciones aspticas dentro de un ambiente ISO Clase 5, usando mezclado y transferencia prolongados y complejos, ms de tres productos
estriles y entradas dentro de cualquier envase, y combinacin de ingredientes de mltiples productos estriles para preparar mltiples PME.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no ms de 30 horas a temperatura ambiente controlada, 9 das a temperatura fra y 45 das en
estado congelado slido entre -25 y -1 O o ms fro.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparacin magistral.
PME de Nivel de Riesgo Alto
t Presencia confirmada de ingredientes y dispositivos no estriles, o exposicin confirmada o sospechada de ingredientes estriles por ms de una
hora a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 antes de la esterilizacin final.
t Mtodo de esterilizacin verificado para conseguir la esterilidad para la cantidad y tipo de envases.
t Cumplir Jos lmites permisibles para endotoxinas bacterianas.
t Mantener la concentracin y pureza aceptables de Jos ingredientes y la integridad de Jos envases involucrados despus de Ja esterilizacin.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no ms de 24 horas a temperatura ambiente controlada, 3 das a temperatura fra y 45 das en
estado congelado slido entre -25 y -1 O o ms fro.
t Prueba de llenado de medios al menos semestralmente, hecha por el personal de preparacin magistral.
CAPACITACIN Y EVALUACIN DEL PERSONAL EN TCNICAS DE MANIPULACIN ASPTICA
t Inicialmente, aprobar la evaluacin didctica y prctica de destrezas y llenado de medios, seguida por una evaluacin anual para preparacin magis-
tral de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestral para preparacin magistral de nivel de riesgo alto.
t El personal de preparacin magistral que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonizacin
microbiana profusa, deber recibir de inmediato una nueva capacitacin y someterse a una nueva evaluacin a cargo de personal experto en prepa-
racin magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de prctica asptica.
PME DE USO INMEDIATO
t Cumplir totalmente con Jos seis criterios especificados.
ENVASES MONODOSIS Y MULTJDOSJS
t Fecha lmite de uso de 28 das, a menos que el fabricante especifique Jo contrario, para envases multidosis de cierre sellado, despus de Ja apertura o
entrada inicial.
t Fecha lmite dP uso de 6 horas, a menos que el fabricante especifique Jo contrario, para envases monodosis de cierre sellado en aire ISO Clase 5 o
ms limpio, despus de la apertura o entrada inicial.
t Fecha lmite de uso de 1 hora para envases monodosis de cierre sellado despus de su apertura o entrada bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase
5.
t No se permite el almacenamiento de ampollas monodosis abiertas.
FRMACOS PELIGROSOS COMO PME
t Equipo protector apropiado para el personal.
t Los controles de ingeniera primarios apropiados (CSB y CACI) se usan para la proteccin simultnea del personal y la exposicin de sitios crticos.
t Los frmacos peligrosos se deben almacenar separados de otro inventario, de manera que se evite la contaminacin y la exposicin del personal.
t Presin negativa al menos de 0,01 pulgadas de columna de agua y 12 cambios de aire por hora en cuartos no limpios en donde se ubiquen los
CACJ.
t Los frmacos peligrosos se deben manejar con precaucin en todo momento, usando guantes apropiados para quimioterapia durante la recepcin,
distribucin, aprovisionamiento, inventariado, preparacin para administracin y eliminacin.
t Los frmacos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5, con controles de ingeniera protectores y siguiendo las prcticas aspticas
especificadas para los niveles de riesgo de contaminacin apropiados.
t El acceso a reas de elaboracin de preparaciones de frmacos debe estar limitado al personal autorizado.
t Se debe instalar un indicador de presin que pueda monitorear fcilmente Ja presurizacin del cuarto, que se documenta diariamente.
t Documentacin anual para Ja capacitacin completa del personal en Jo que respecta a almacenamiento, manipulacin y eliminacin de frmacos
pe/ ig rosos.
t Si se usa un CSTD, ste se emplear en un dispositivo de control de ingeniera primario ISO Clase 5.
t Se requiere presin negativa de al menos 0,01 pulgadas de columna de agua para la preparacin magistral de frmacos peligrosos.
:j: La zona amortiguadora de presin negativa no se requiere para preparaciones magistrales de bajo volumen cuando se usa un CSTD en una CSB o
un CACI.
t El personal de preparacin magistral que est en edad reproductiva debe confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los frmacos
peligrosos.
t La eliminacin de todos los desechos de frmacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales.
:j: Salida externa total de Jos controles de ingeniera primarios.
:j: Ensayo de muestras de frotacin de superficies cada 6 meses.
PREPARADOS RADIOFARMACUTJCOS COMO PME
t Tomografa de Emisin de Positrones se rige por el captulo (823) de Ja USP.
t Controles de ingeniera primarios apropiados y contencin y blindaje de radioactividad.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 711

Appendix l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "debieran") en el Captulo (797) de la USP (Continuacin)
t Los preparados radiofarmacuticos elaborados a partir de componentes estriles en recipientes estriles cerrados y con un volumen de 100 mL o
menos para inyeccin monodosis, o no ms de 30 mL tomados de envases multidosis se deben nombrar segn las normas para PME de nivel de
riesgo bajo y cumplir con ellos.
t Los viales de preparados radiofarmacuticos destinados a mltiples usos, preparados con tecnecio 99m, expuestos a ambiente ISO Clase 5 y perfora-
dos por agujas, sin contaminacin directa, pueden usarse hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante.
t Ubicacin de controles de ingeniera primarios permitidos en un ambiente controlado ISO Clase 8.
t Generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 usados de acuerdo con los requisitos federales, estatales y del fabricante.
t Los preparados radiofarmacuticos como PME de nivel de riesgo bajo, con fecha lmite de uso de 12 horas o menos se deben preparar en un rea
segregada.
t Los materiales y la vestimenta expuestos en el rea de atencin y tratamiento del paciente no deben cruzar una lnea de demarcacin dentro del
rea de preparacin magistral segregada.
t Los generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 se deben eluir en condiciones ISO Clase 8.
t El rea de preparacin magistral segregada se indicar con una lnea de demarcacin.
:j: El almacenamiento y transporte de los viales debidamente blindados de PME radiofarmacuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado
sin una designacin especfica de clase ISO.
EXTRACTOS DE ALRGENOS COMO PME
t Los extractos de alrgenos como PME no estn sujetos a los requisitos descritos para personal, ambiente y almacenamiento de PME de todos los
Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana cuando se cumplen ciertos criterios.
VERIFICACIN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIN MAGISTRAL
t Revisar etiquetas y documentar las mediciones, manipulaciones aspticas y procedimientos de esterilizacin correctos para confirmar la identidad,
pureza, concentracin de ingredientes y esterilidad de la PME.
:j: Valorar las PME terminadas para confirmar la identidad correcta y/o concentracin de ingredientes.
:j: Prueba de esterilidad para PME terminadas.
Mtodos de Esterilizacin
t Verificar que los mtodos permiten lograr la esterilidad a la vez que mantienen el contenido, pureza, calidad e integridad del envase apropiados.
:j: Probar la eficacia segn el captulo (71) de la USP, o mediante pruebas de esterilidad equivalentes o superiores.
Esterilizacin de PME de Nivel de Riesgo Alto por Filtracin
t Membranas estriles de tamao nominal de poro de 0,2 m que sean qumica y fsicamente compatibles con la PME.
t Completar rpidamente sin reemplazar el filtro.
t Someter el filtro a la prueba de integridad recomendada por el fabricante (p.ej., prueba del punto de burbuja) despus de filtrar la PME.
Esterilizacin de PME de Nivel de Riesgo Alto por Vapor
t Probar hasta verificar que todos los envases que se van a esterilizar queden estriles despus del tiempo de exposicin seleccionado en el autoclave
particular.
t Garantizar que el vapor vivo entre en contacto con todos los ingredientes y superficies que se van a esterilizar.
t Pasar las soluciones a travs de un filtro de tamao nominal de poro de 1,2 m o menor a los envases finales para retirar las partculas antes de la
esterilizacin.
t El aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a travs de la cmara, por medio de un ventilador.
t El calor seco se debe usar slo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daa el material o ste es imper-
meable.
t Se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulacin del aire caliente.
t La descripcin de las condiciones y duracin de la esterilizacin por calor seco para cada PME debe estar documentada por escrito en la institucin
responsable de la preparacin magistral. La eficacia de la esterilizacin por calor seco se debe verificar usando los indicadores biolgicos apropiados y
otros mtodos de confirmacin.
:j: El horno debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposicin.
Despirogenizacin por Calor Seco
t La despirogenizacin por calor seco se debe usar para eliminar los pirgenos y los microbios viables de los artculos o envases de vidrio, como viales.
t La descripcin del ciclo de despirogenizacin por calor seco y su duracin para una carga especfica de artculos debe estar documentada por escrito
en la institucin responsable de la preparacin magistral.
t La eficacia del ciclo de despirogenizacin por calor seco se debe verificar usando viales para desafo de endotoxinas (VDE).
:j: La prueba de endotoxinas bacterianas debe efectuarse en los VDE con el fin de verificar si el ciclo es capaz de conseguir una reduccin de 3 log en
endotoxinas.
CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL
Exposicin de Sitios Crticos
t Aire ISO Clase 5 o mejor.
t Evitar la contaminacin por contacto directo (p.ej., tacto y secreciones).
Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas
t Una zona amortiguadora es un rea provista con aire de calidad ISO Clase 7 como mnimo.
712 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

Appendlx l. Competencias Prlnclpales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (f "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Captulo (797) de la USP (Continuacin)
t Nuevas representaciones de la distribucin de la instalacin.
t Toda instalacin de preparacin magistral debe garantizar que cada fuente de ambiente ISO Clase 5 para exposicin de sitios crticos y esterilizacin
por filtracin est adecuadamente ubicada, manejada, mantenida, supervisada y verificada.
t Los dispositivos (p.ej., computadoras e impresoras) y objetos (p.ej., carros y gabinetes) se pueden ubicar en zonas amortiguadoras y deben verificar-
se mediante pruebas o monitoreo.
Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partculas Viables y No Viables
t El muestreo ambiental se debe realizar como parte de un programa integral de gestin de la calidad y deber ocurrir como mnimo cuando existan
varias condiciones.
t El programa de muestreo ambiental debe proporcionar informacin al personal y directivos para demostrar que los controles de ingeniera mantie-
nen un ambiente dentro del rea de preparacin magistral que garantiza en forma constante concentraciones de partculas viables y no viables acep-
tablemente bajas.
Programa de Pruebas para Partculas Ambientales No Viables
t La certificacin y pruebas de los controles de ingeniera primarios (CFL, CSB, CAi y CACI) y secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) las debe
efectuar una persona calificada por lo menos cada seis meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique, altere o se haga una reparacin
importante a la instalacin. Se deben usar los procedimientos de certificacin, como aquellos sealados en Certification Guide for Sterile Compoun-
ding Facilities (CAG-003-2006) de CETA.
Recuento Total de Partculas
t La certificacin por medio de la cual se certifica que cada rea con clasificacin ISO, (p.ej., ISO Clase 5, 6, 7 y 8) est dentro de las normas estableci-
das, se debe hacer por lo menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o el CACI se reubiquen o la estructura fsica de la zona amortigua-
dora o de la antesala se alteren.
t Las pruebas las deben efectuar operadores calificados, usando equipo electrnico de ltima tecnologa con resultados que cumplan con ISO Clase 5,
7 u 8, dependiendo de los requisitos de la zona.
t El personal de supervisin y otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificacin para garantizar que los am-
bientes controlados cumplan con la limpieza de aire, presiones del cuarto y CAPH apropiados.
Monitoreo de la Presin Diferencial
t Se debe instalar un manmetro o velocmetro para supervisar el diferencial de presin o flujo de aire entre la zona amortiguadora y la antesala y
entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparacin magistral.
t Los resultados debern revisarse y documentarse en un cuaderno de bitcora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mnima debe ser
diaria) o en un dispositivo de grabacin continua.
t La presin entre el rea ISO Clase 7 y la zona general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua (w.c.)).
t En instalaciones donde se preparan PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mnima de 0,2
metros por segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.
Programa de Pruebas para Partculas Areas Ambientales Viables-Plan de Muestreo
t Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partculas areas viables, basado en la evaluacin de riesgo de las actividades
de preparacin magistral efectuadas.
t Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 y en las zonas ISO Clase 7 y 8, as como en las zonas
segregadas de preparacin magistral con ms alto riesgo de contaminacin (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5, mostradores
cerca de las puertas, cabinas de transferencia de materiales (pass-through boxes)).
t El plan debe incluir: ubicacin de la muestra, mtodo de recoleccin, frecuencia de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del da, relativa a
la actividad de la zona de preparacin magistral, y niveles de accin.
t Se recomienda que el personal de preparacin magistral consulte el Captulo Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aspti-
co (1116) de la USP y las Guidelines for Environmental lnfection Control in Healthcare Facilities-2003 de los CDC para ms informacin.
Medio de Crecimiento
t Se debe utilizar un medio de crecimiento microbiano como el Medio de Digerido de Casena y Soja (tambin conocido como caldo (TSB) o agar
(TSA) tripticasa de soja) para propiciar el crecimiento de bacterias.
t En los ambientes de preparacin magistral con nivel de riesgo alto se debe usar un agar con extracto de malta (MEA) u otro medio que facilite el
crecimiento de hongos.
t Los medios usados para el muestreo de superficies deben suplementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej.,
TSA con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partculas Areas Viables
t La evaluacin de microorganismos areos usando mtodos volumtricos de recoleccin en los ambientes de aire controlado debe efectuarla perso-
nal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
t El mtodo de impacto debe ser el mtodo preferido de muestreo volumtrico de aire.
t Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares propensos a la contamina-
cin durante actividades de preparacin magistral y otras actividades como preparacin, etiquetado, vestimenta y limpieza.
t Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro de la cabina de flujo laminar y otras reas en donde la turbulen-
cia de reflujo de aire pueda ingresar en el rea de preparacin magistral.
t Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, el muestreo de aire se debe hacer en sitios dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras
reas que estn muy cerca del ambiente ISO Clase 5, durante la certificacin del control de ingeniera primario.
USP 39 Pruebas Fsicas / (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 71 3

Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Captulo (797} de la USP (Continuacin)
t Debe considerarse el efecto general que el mtodo de muestreo escogido tendr sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de
preparacin magistral.
Dispositivos de Muestreo de Aire
t Se deben seguir las instrucciones en el manual de usuario del fabricante en lo que respecta a la verificacin y uso de muestreadores elctricos de aire
que recolectan activamente volmenes de aire para evaluacin.
t Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar de muestreo, con el fin de maximizar la sensibilidad.
t Se recomienda que el personal de preparacin magistral consulte tambin el Captulo USP (1116} que puede proporcionar ms informacin sobre el
uso de muestreadores volumtricos de aire y el volumen de aire que debe tomarse para detectar variaciones en la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire
t Como parte de la recertificacin de instalaciones y equipos, se debe efectuar el muestreo del aire al menos dos veces al ao (es decir, cada 6 meses)
en el rea donde estn ubicados los controles de ingeniera primarios.
t Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo electrnico para muestreo de aire.
t Cualquier construccin o reparacin de equipo en una instalacin puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Perodo de Incubacin
t Las placas de medio para crecimiento microbiano usadas para recolectar muestreos ambientales se recuperan, se aseguran las tapas (p.ej., con cin-
ta), se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos.
t Se debe contar e informar el nmero de colonias discretas de microorganismos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de
monitoreo ambiental. Los recuentos de las muestras de aire se deben transformar en ufc por metro cbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
t El TSA se debe incubar a una temperatura de 35 2 durante un perodo de 2 a 3 das.
t MEA u otro medio apto para hongos se debe incubar a 28 2 durante 5 a 7 das.
Niveles de Accin, Documentacin y Evaluacin de Datos
t Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparacin
magistral.
t Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiologa.
t Se debe investigar la fuente de la contaminacin.
t Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin debe dar lugar a una reevaluacin de la idoneidad de las prcticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtracin de aire dentro de la instalacin de preparacin magistral asptica.
t La tabla titulada Niveles de Accin Recomendados para Contaminacin Microbiana se debe usar slo como gua.
Diseo de la Instalacin y Controles Ambientales
t Las instalaciones de preparacin magistral estn fsicamente diseadas y ambientalmente controladas para minimizar el contacto de la contamina-
cin area con los sitios crticos.
t Las instalaciones de preparacin magistral deben proporcionar un ambiente de trabajo cmodo y bien iluminado, por lo general con una tempera-
tura de 20 o menos, para brindar condiciones de comodidad al personal de preparacin magistral mientras est ataviado con la vestimenta requeri-
da para la preparacin magistral asptica.
t Los controles de ingeniera primarios proporcionan aire HEPA unidireccional (es decir, laminar) a una velocidad suficiente para prevenir el contacto
de partculas areas con los sitios crticos.
t En el rea crtica se debe realizar un anlisis del patrn de aire in situ por medio de estudios de humo para demostrar el flujo unidireccional del aire y
la accin de barrido sobre el producto bajo condiciones dinmicas.
t Las polticas y procedimientos para mantener y trabajar dentro del rea de control de ingeniera primario se deben poner por escrito y cumplir. Las
polticas y procedimientos estarn determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparacin magistral asptica utilizadas du-
rante la preparacin de las PME.
t Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar en el proceso de prepara-
cin magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas.
t Los cuartos limpios para PME no peligrosas y no radioactivas se suministran con HEPA que entra desde el cielo raso, con ventilaciones de retorno en
la parte baja de las paredes, y proporciona no menos de 30 cambios de aire por hora.
t Las zonas amortiguadoras mantienen una presin positiva de 0,02 a 0,05 pulgadas de columna de agua y no contienen lavabos ni drenajes.
t La velocidad de aire de las zonas o cuartos amortiguadores a las antesalas es al menos 40 pies/minuto.
t El control de ingeniera primario debe estar ubicado dentro de una zona amortiguadora, de tal manera que se eviten condiciones que podran afec-
tar adversamente su funcionamiento.
t El control de ingeniera primario debe ubicarse fuera del flujo de trfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto no
causen perturbaciones.
t El suministro de aire filtrado por HEPA se debe introducir por el cielo raso.
t Debe probarse la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamao de partcula ms penetrante y someterlos a pruebas contra fugas en la fbrica,
y nuevamente in situ despus de la instalacin.
t Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se trabaja en un ambiente con-
trolado.
t Al cuarto slo se deben llevar los muebles, equipos, suministros y otros materiales requeridos para las actividades de preparacin magistral que se
van a desempear.
714 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:t: "debieran") en el Captulo (797) de la USP (Continuacin)
t Las superficies y el amoblado esencial en los cuartos o zonas amortiguadoras y en los cuartos limpios deben ser lisos, impermeables, limpiables,
resistentes a desinfectantes y no ser porosos ni desprender partculas.
t Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e impermea-
bles, no deben tener grietas o rajaduras, y no deben desprender partculas para facilitar su limpieza y reducir al mnimo los espacios en los que po-
dran acumularse microorganismos y otros contaminantes.
t Las superficies deben ser resistentes a los daos causados por agentes desinfectantes.
t Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o enmasilladas para evitar la formacin de grietas donde pueda acumularse
polvo.
t Los paneles del cielo raso se deben enmasillar en todo su permetro para sellarlas al armazn de soporte.
t La superficie externa de los artefactos de iluminacin embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar sellada y al ras del cielo raso.
t Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado.
t La zona amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con
materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plstico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfectarse fcilmente.
t Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plstico no poroso o planchas metlicas, con ruedas de buena calidad y fciles de limpiar para
facilitar su movilidad.
t Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben ser lisos, de material impermeable y fciles de limpiar y desinfectar y, adems de-
ben estar libres de grietas y no desprender partculas.
t La cantidad, el diseo y la forma de instalacin de los artculos antes mencionados debe facilitar la limpieza y desinfeccin eficaces.
:j: Si los cielos rasos tienen paneles incrustados, stos deben impregnarse con un polmero para hacerlos impermeables e hidrfobos.
:j: Debe evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberas de servicio que pasan por el techo o las repisas de las venta-
nas.
:j: Los retornos de aire deben estar instalados en la parte inferior de la pared para crear una dilucin general de arriba hacia abajo del aire ambiental
con el aire filtrado por HEPA.
Colocacin de los Controles de Ingeniera Primario dentro de Zonas Amortiguadoras ISO Clase 7
t Los controles de ingeniera primarios para PME no peligrosas y no radiactivas se colocan en las zonas amortiguadoras, excepto en el caso de CAi que
prueben mantener aire ISO Clase 5 cuando los recuentos de partculas se hacen entre 6 y 12 pulgadas ms arriba de las reas de exposicin del sitio
crtico durante la realizacin de la transferencia normal de materiales hacia adentro y afuera, y durante manipulaciones de preparacin magistral,
cuando dichos CAi se ubican bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase 7.
t Los procedimientos de preesterilizacin para las PME de alto riesgo, como el pesado y mezclado, se deben completar en un ambiente no inferior a
ISO Clase 8.
t Los controles de ingeniera primarios deben ubicarse fuera de las vas de trfico y lejos de corrientes de aire que pudieran perturbar los patrones de
flujo de aire deseados del cuarto.
t Cuando se usen aisladores para la preparacin magistral estril, el tiempo de recuperacin para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 se debe docu-
mentar y desarrollar los procedimientos internos para garantizar que se permita el tiempo de recuperacin adecuado despus de la transferencia de
materiales, antes y durante las operaciones de preparacin magistral.
t Cuando las actividades de preparacin magistral requieran la manipulacin de materiales derivados de la sangre del paciente u otros materiales bio-
lgicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones deben hacerse claramente aparte de los procedi-
mientos de rutina para manejo de material y equipos usados en las actividades de preparacin de PME y deben controlarse por medio de POE espec-
ficos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas.
t Alimentos, bebidas y artculos expuestos en las zonas de atencin de paciente, as como desempacar suministros a granel y actividades de aseo y
vestimenta del personal estn prohibidos en los cuartos o zonas amortiguadores.
t Designacin de demarcacin entre cuartos o zonas amortiguadoras y antesalas.
t Limpieza antisptica de manos y guantes estriles en los cuartos o zonas amortiguadoras.
:j: Los suministros y componentes empacados para preparacin magistral, como agujas, jeringas, conjuntos de tubos y soluciones parenterales de pe-
queo y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA estril al 70%) de ser posible en una
antesala de calidad de aire ISO Clase 8, antes de pasarlos a las zonas amortiguadoras.
Limpieza y Desinfeccin del rea de Preparacin Magistral Estril
t El personal capacitado escribe los procedimientos detallados que incluyen limpiadores, desinfectantes y materiales para refregar y trapear que no
desprenden partculas.
t Las superficies de la CFL, la CSB, el CAi y el CACI se deben limpiar y desinfectar con frecuencia, incluyendo: al comenzar cada turno de trabajo, antes
de la preparacin de cada lote, cada 30 minutos durante los perodos continuos de preparacin de PME individuales, cuando haya derramamientos y
cuando se sepa o sospeche que la superficie est contaminada debido a fallas procedimentales.
t El personal de preparacin magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en prctica los procedimientos de limpieza y
desinfeccin del rea directa de preparacin (ADP) escritos en los POE.
t La limpieza y desinfeccin deben hacerse antes de la preparacin magistral. Se deben quitar todos los artculos de las reas a limpiar y a continua-
cin limpiar las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos slidos solubles en agua se quitan
con Agua Estril (para Inyeccin o Irrigacin) y paos que no desprendan partculas. Luego se pasa un pao con un agente desinfectante que no deje
residuos, como IPA estril al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparacin magistral.
t Las superficies de trabajo en zonas ISO Clase 7 y 8 y en las zonas de preparacin magistral segregadas se limpian al menos una vez al da.
t El polvo y los detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparacin magistral,
con un mtodo que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 715

Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Captulo (797) de la USP (Continuacin)
t Los pisos en las reas ISO Clase 7 y 8 se limpian diariamente cuando no hay preparacin magistral en proceso.
t El IPA (alcohol isoproplico al 70%) permanece en las superficies que se van a desinfectar al menos durante 30 segundos antes de que se usen para
elaborar PME.
t Los estantes vacos, las paredes y los cielos rasos en las antesalas se limpian y desinfectan al menos una vez al mes.
t La limpieza del suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE escri-
tos.
t Los agentes limpiadores y desinfectantes, sus cronogramas de uso y mtodos de aplicacin deben concordar con los POE escritos y el personal de
apoyo y/o el de preparacin magistral debe cumplirlos.
t Todos los materiales de limpieza, como paos, esponjas y trapeadores deben ser del tipo que no desprenda partculas, de preferencia compuestos
por microfibras sintticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras, antesalas y reas segregadas de preparacin magistral, de las cuales no
deben retirarse a menos que sea para desecharlos.
t Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar procedimientos (basndose en las recomendaciones del fabrican-
te) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se mantiene y que el uso repetido no incrementa la biocarga del rea que se est lim-
piando.
t Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej., IPA estril al 70%), aplica-
do con un frasco rociador u otro mtodo de aplicacin adecuado.
t Despus de rociar o limpiar con el desinfectante la superficie a desinfectar, se debe dejar secar y durante este tiempo el artculo no se debe usar para
preparacin magistral.
t Las compresas de gasa empapadas en IPA estril al 70% u otro material que desprenda partculas no se deben usar para desinfectar los puntos de
entrada estriles de paquetes y dispositivos.
Limpieza y Vestimenta del Personal
t El personal debe ser tambin competente y estar muy motivado para desempear manipulaciones aspticas impecables con ingredientes, dispositi-
vos y componentes de las PME.
t El personal con prurito, quemaduras de sol, lceras exudantes, conjuntivitis, infeccin respiratoria activa y cosmticos tiene prohibido preparar PME.
t El personal de preparacin magistral debe retirarse los atuendos personales exteriores, cosmticos, uas postizas, joyas de las manos, muecas y
cuerpo que puedan interferir con el uso de batas y guantes; tambin debe retirarse los pirsins visibles por encima del cuello.
t Orden para asearse y vestir atuendo de preparacin magistral en la antesala: zapatos y cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran la barba, ms-
caras, limpieza de uas, lavado y secado de manos y antebrazos, bata que no desprende partculas.
t Orden para asearse y calzarse los guantes en el cuarto o zona amortiguadora: lavado de manos con un producto de actividad persistente a base de
alcohol, dejar secar las manos, calzar guantes estriles.
t Desinfectar rutinariamente los guantes con IPA estril al 70% despus de tocar objetos no estriles.
t Inspeccionar los guantes para determinar que no estn agujereados y reemplazarlos cuando se detecten fallas.
t El personal repite los procedimientos apropiados despus de exponerse a contaminacin por contacto directo o aire inferior a ISO Clase 8.
t De estos requisitos estn eximidos las PME de uso inmediato y los CAi para los cuales los fabricantes proporcionan documentacin escrita, basada en
pruebas validadas, de que dichas prcticas no son necesarias para mantener la esterilidad en las PME.
Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y De-
sinfeccin
t El personal encargado de la preparacin de las PME deber recibir capacitacin competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda
de instruccin multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios tericos y los conocimientos prcticos de los procedimientos de vesti-
menta, prcticas aspticas de trabajo, as como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 y procedimientos de lim-
pieza y desinfeccin.
t Esta capacitacin se debe completar y documentar antes de que ningn miembro del personal comience a elaborar PME.
t El personal de preparacin magistral debe completar la capacitacin didctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a eva-
luaciones de destreza usando herramientas de auditora de observacin y pruebas de llenado de medios.
t Las pruebas de las destrezas aspticas de trabajo mediante el llenado de medios se efectan inicialmente antes de comenzar a preparar PME y al
menos anualmente, en adelante, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para preparaciones magistrales
de nivel de riesgo alto.
t El personal de preparacin magistral que no pase las pruebas escritas o las auditoras de observacin o cuyos viales de prueba de llenado de medios
tengan una o ms unidades que muestren contaminacin microbiana visible deber recibir de inmediato una nueva capacitacin y someterse a una
nueva evaluacin a cargo de personal experto en preparacin magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en prcticas
aspticas de trabajo.
t El personal de preparacin magistral debe pasar todas las evaluaciones antes de reiniciar la prctica de preparacin magistral estril.
t Adems de la evaluacin didctica y llenado asptico de medios, el personal de preparacin magistral debe demostrar competencia en higiene apro-
piada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza congruentes.
t Cuando los procedimientos de limpieza y desinfeccin los efecta personal de apoyo, ste debe recibir de un experto calificado en preparacin
magistral asptica, capacitacin cuidadosa en procedimientos apropiados de higiene de las manos, vestimenta, limpieza y desinfeccin.
t El personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluacin de desempeo en la apropiada higiene de las manos, vestimenta y todos los
procedimientos de limpieza y desinfeccin, la que llevar a cabo un experto calificado en preparacin magistral asptica.
Evaluacin de Competencia en Vestimenta y Prcticas Aspticas de Trabajo
716 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

Appendix l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Captulo (797) de la USP (Continuacin)
t El personal de preparacin magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la elaboracin de PME y siempre que se efecte un llenado
de medios asptico, usando un Formulario para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de
Preparacin Magistral y los procedimientos de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal.
Evaluacin de la Prctica Asptica de Trabajo por Medio de Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del Personal
t El monitoreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparacin magistral se debe efectuar para todos los niveles de riesgo de
elaboracin de PME.
t El muestreo de las puntas de los dedos enguantados se debe utilizar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de
las manos y vestimenta, as como para educar al personal de preparacin magistral en las prcticas de trabajo apropiadas.
t Todo el personal debe demostrar competencia en procedimientos apropiados de higiene de las manos y vestimenta, adems de las prcticas aspti-
cas de trabajo.
t Las placas estriles de contacto con agar se deben usar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparacin
magistral despus de vestirse para evaluar la competencia en el uso de vestimenta y despus de completar la preparacin de llenado de medios.
t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras.
Evaluacin de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes
t El personal de preparacin magistral debe ser inspeccionado visualmente durante el proceso de higiene de las manos y uso de vestimenta.
t La inspeccin visual debe documentarse en un Formulario para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del
Personal de Preparacin Magistral y conservarse para tener un registro permanente y una evaluacin a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados
t Inmediatamente despus de que el preparador magistral completa el procedimiento de higiene de las manos y vestimenta, el evaluador debe reco-
lectar una muestra de la punta de los dedos y pulgar enguantados de ambas manos del preparador en placas de agar apropiadas, presionando lige-
ramente el agar con cada dedo.
t Las placas se deben incubar durante un perodo de incubacin apropiado a la temperatura adecuada.
t Todos los empleados deben completar exitosamente una evaluacin inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los
dedos enguantados (cero ufc) no menos de tres veces antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano.
t Despus de completar la evaluacin inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, se debe hacer una reevaluacin de todo el personal
de preparacin magistral al menos anualmente para PME de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para PME de nivel de riesgo alto antes
de permitrsele continuar elaborando PME.
t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estril al 70% antes de la prueba.
t Despus de la toma de muestras, los guantes se deben desechar de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar
nutritivo se deben incubar como se estipula ms adelante.
t El nivel de accin de ufc para las manos enguantadas estar basado en la cantidad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
:j: Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por empleado por mano (mano izquierda, mano derecha).
Perodo de Incubacin
t Al final del perodo de muestreo designado, las placas de agar se recuperan, se aseguran las tapas, se invierten e incuban a una temperatura y por un
tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos. El agar tripticasa de soja (TSA) con lecitina y polisorbato 80 se debe incubar a 35 2
por 2 a 3 das.
Evaluacin de la Competencia en Manipulacin Asptica
t Todo el personal de preparacin magistral deber someterse a la evaluacin de su competencia en tcnicas aspticas y prcticas relacionadas, inicial-
mente durante el procedimiento de prueba de llenado de medios, as como en los subsiguientes procedimientos de prueba de llenado de medios
anuales o semestrales, mediante el Formulario para Evaluacin de Tcnicas Aspticas y Prcticas relacionadas del Personal de Preparacin Magistral.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios
t La destreza del personal en la elaboracin asptica de PME se debe evaluar por medio de una verificacin de llenado de medios lquidos de cultivo
bacteriano estril.
t Los viales llenos de medio se deben incubar a 35 2 durante un perodo de 14 das.
Muestreo y Evaluacin de Limpieza y Desinfeccin de Superficies
t La toma de muestras de superficies se debe hacer en todas las reas clasificadas ISO en forma peridica y por medio de placas de contacto y/o
hisopos, al momento de terminar la preparacin magistral.
t Se deben definir los lugares donde se van a tomar muestras en un plano o formulario de muestreo.
Evaluacin de Competencia en Limpieza y Desinfeccin
t Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparacin magistral y dems personal responsable de la limpieza durante el proceso de limpieza y
desinfeccin, durante la capacitacin inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y al termi-
nar cualquier Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios.
t La inspeccin visual debe documentarse en un Formulario para Evaluacin de Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin y conservarse para tener
un registro permanente y una evaluacin a largo plazo de la competencia del personal.
Mtodos de Recoleccin en la Superficie
t Inmediatamente despus de tomar la muestra de una superficie con la placa de contacto, el rea muestreada se debe frotar cuidadosamente con un
pao que no desprenda partculas, empapado en IPA estril al 70%.
:j: Los resultados se deben informar como ufc por unidad de rea superficial.
Niveles de Accin, Documentacin y Evaluacin de Datos
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 717

Appendlx l. Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Captulo (797) de la USP (Continuacin)
t Los datos de muestreo ambiental se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
preparacin magistral.
t Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar el personal competente de microbiologa.
t Se debe investigar la fuente de la contaminacin.
t Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de accin despus de la incubacin apropiada, se
debe efectuar y documentar una revisin de los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta, as como de los procedimientos de
desinfeccin de guantes y superficies y las prcticas de trabajo.
:j: Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin debe dar lugar a una reevaluacin de la idoneidad de las prcticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtracin de aire dentro de las instalaciones en las que se elaboran preparacio-
nes magistrales aspticas.
PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTNDAR SUGERIDOS
t Todas las instalaciones deben contar con los mismos y los procedimientos deben incluir al menos los puntos enumerados en esta seccin.
CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS
Inspeccin de Formas Farmacuticas en Solucin y Revisin de los Procedimientos de Preparacin Magistral
t Revisar procedimientos y documentos para garantizar la esterilidad, pureza, identidades y cantidades de ingredientes correctas, y estabilidad.
t Inspeccionar visualmente para determinar que no tenga partculas y color anormales, y que los envases y sellos estn intactos.
Pruebas de Esterilidad
t PME de nivel de riesgo alto preparadas en lotes de ms de 25 envases idnticos o expuestas por ms de 12 horas entre 2 y 8 y 6 horas a ms de 8
antes de ser esterilizadas.
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirgenos)
t PME de nivel de riesgo alto, excluyendo aquellas para administracin oftlmica o inhalacin, preparadas en lotes de ms de 25 envases idnticos o
expuestas por ms de 12 horas entre 2 y 8 y 6 horas a ms de 8 antes de ser esterilizadas.
Verificacin de la Identidad y Concentracin de los Ingredientes
t Procedimientos escritos para verificar la identidad, calidad, cantidad y pureza correctas de los ingredientes usados en PME.
t Procedimientos escritos para garantizar que las etiquetas de las PME contengan los nombres correctos y las cantidades o concentraciones de ingre-
dientes, volmenes totales, fechas lmite de uso, condiciones de almacenamiento y vas de administracin.
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LMITE DE USO
Determinacin de la Fecha Lmite de Uso
t Usar los criterios generales del captulo (795) de la USP en ausencia de ensayos directos indicadores de estabilidad o literatura autorizada que respal-
de la duracin ms prolongada.
MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y DISTRIBUIDAS.
t Procedimientos escritos para envasado, almacenamiento y condiciones de transporte apropiados para mantener la esterilidad, calidad, pureza y con-
tenido de las PME.
Redispensacin de PME
t Cuando se pueden garantizar la esterilidad, pureza, contenido y calidad aceptables.
t La asignacin de tiempos de almacenamiento en esterilidad y fechas lmite de uso en estabilidad posteriores a las de las PME originalmente dispensa-
das debe basarse en resultados de pruebas de esterilidad y valoracin cuantitativa de ingredientes.
Envase y Transporte de las PME
t El envase mantiene la integridad fsica, esterilidad, estabilidad y pureza de las PME.
t Modos de transporte que mantienen las temperaturas apropiadas y evitan daos a las PME.
CAPACITACIN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO
t Programa formal de capacitacin en mltiples componentes para garantizar que los pacientes y las personas encargadas de su cuidado entienden el
almacenamiento, manipulacin, uso y eliminacin apropiados para las PME.
MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS
t Los procedimientos estndar escritos describen la manera en que los pacientes pueden preguntar e informar inquietudes y eventos adversos relacio-
nados con PME y, en el caso de los supervisores de preparacin magistral, la forma de corregir y prevenir futuros problemas.
:j: Los eventos adversos y los defectos de las PME se informan a los programas MedWatch de la FDA y a MEDMARX de la USP.
GLOSARIO
t Se definen veintiocho trminos que forman parte integral del cumplimiento con el captulo (797) de la USP.
718 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles/ Pruebas Fsicas USP 39

Apndice 11. Desinfectantes Comunes Usados en la Atencin de Salud para Superficies Inanimadas
y DI spos1t1vos no Cr1t
' 1cos y su Aet 1V Id ad MI ero bl ana y Prop1e
1 da d es 1
Categora Qumica del Desinfectante

Amonio
Cuaterna-
rio (p.ej.,
Perxido cloruro de Cloro Yodforos
de dodecll di- (p.ej., hipo- (p.ej., po-
Alcohol hidrgeno metll amo- Fenli- clorito de vidona-yo-
lsoproplico acelerado nlo) cos sodio) do)
Concentra-
cln 0,4-1,60/o 0,4- 100-5000 30-50
Usada 60-95% 0,5/o 3 aq 1,6% aq oom oom
Bacterias + + + + + +
Virus lipoflicos + + + + + +
lnactivacin Virus hidroflicos + +
Microbiana2 M.tuberculosis + + + +
Agentes micticos (hongos) + + + + +
Esporas Bacterianas - - - - + -
Vida til > 1 semana + + + + + +
Efectos corrosivos o perjudiciales - - -
Residuo no evaporable - - + + - +
Propiedades
Fsicas & lnactivado por materia orgnica + + + +
Qumicas Irritante cutneo - + + +
Importantes
Irritante ocular + - + + + +
Irritante respiratorio - - - - + -
Toxicidad sistmica + - + + + +
Clave para las abreviaturas y smbolos: aq = diluido en agua; oom = partes por milln; + = s; - = no; = resultados variables.
1 Modificado de World Health Organization, Laboratory Bio Safety Manual 1983 y Rutala WA, "Antisepsis, disinfection and sterilization in the hospital and rela-
ted institutions," Manual of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1995, pginas 227-245.
2 La inactivacin de los microorganismos ms comunes (es decir, bacterias) ocurre con un tiempo de contacto de o>l minuto; la inactivacin de esporas requiere
tiempos de contacto ms prolongados (p.ej., 5 a 1O minutos para solucin de cloro a 5000 ppm contra esporas de C. difficile). Referencia: Perez /, Springthorpe
VS, Sattar SA, "Activity of selected oxidizing microbicides against the spores of Clostridium diffici/e: Relevance to environmental control", American /ournal of lnfection
Control, August 2005, pginas 320-325.
3 El perxido de hidrgeno acelerado pertenece a una nueva generacin de germicidas basados en perxido de hidrgeno en los cuales la potencia y el desem-
peo del ingrediente activo se ha mejorado y acelerado por medio del uso de cidos y detergentes apropiados.

Apndice 111. Formulario de Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos

y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparacin Magistral

Nombre en letras de imprenta y cargo o ttulo de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institucin o instalacin:
------------------
Higiene de las Manos y Prcticas de la Vestimenta: El evaluador calificado pondr una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona
evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotar N/A si la actividad no es aplicable a la sesin de evaluacin o N/O si la activi-
dad no se observ.

Se presenta aseado y con ropa limpia apropiada.

No usa cosmticos ni joyas (reloj, anillos, aretes, etc., incluidos pirsins) al entrar en las antesalas.
No lleva ni conserva alimentos o bebidas en las antesalas o zonas amortiguadoras.
Est consciente de la lnea de demarcacin que separa los lados limpios y sucios y observa las actividades requeridas.
Se pone el cubrecalzado o los zapatos destinados al rea limpia, uno a la vez, colocando el pie cubierto o calzado en el lado limpio de la
lnea de demarcacin, segn sea apropiado.
Utiliza mascarillas para cubrir la barba, de ser necesario.
Usa gorra y se asegura de que todo el cabello est cubierto.
Se pone mscara para cubrir el puente de la nariz e incluir la barbilla.
Efecta el procedimiento de higiene de manos humedeciendo las manos y antebrazos y lavndolos con agua tibia y jabn durante 30
segundos por lo menos.
Se seca las manos y los antebrazos con una toalla que no suelte pelusa o con un secador de manos.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles 719

Apndice 111. Formulario de Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos

y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparacin Magistral (Continuacin)
Selecciona la bata de talla apropiada y revisa que no tenga agujeros, rasgones u otros defectos.
Se pone la bata y se asegura de que est bien cerrada.
Se desinfecta las manos de nuevo con un exfoliante quirrgico a base de alcohol, sin agua, y con actividad persistente, y las deja secar
completamente antes de ponerse los guantes estriles.
Calza guantes estriles del tamao apropiado, asegurndose que queden bien ajustados y no sobre material del guante en las puntas de
los dedos.
Examina los guantes, verificando que no tengan defectos, agujeros o rasgones.
Mientras desempea actividades de preparacin magistral estril, desinfecta peridicamente los guantes con IPA estril al 70% antes de
trabajar en el rea directa de preparacin magistral (ADP) y despus de tocar artculos o superficies que podran contaminar los guan-
tes.
Se quita el EPP en el lado limpio de la antesala.
Se quita los guantes y se higieniza las manos.
Se quita la bata y la descarta o la cuelga en un gancho si la va a reutilizar el mismo da de trabajo.
Se quita y descarta la mscara, gorra y mascarilla que protege la barba (si la usa).
Se quita el cubrecalzado o los zapatos, uno a la vez, asegurndose de colocar el pie descubierto en el lado sucio de la lnea de demarca-
cin y se higieniza las manos nuevamente. (Se quita y desecha los cubrecalzado todas las veces que sale del rea de preparacin ma-
gistral).

*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/O) y se le muestran e informan las correcciones especficas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letra de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

Apndice IV. Formularlo de Muestra para Evaluacin de las Tcnicas Aspticas

y Prcticas Relacionadas del Personal de Preparacin Magistral

Nombre en letras de imprenta y cargo o ttulo de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institucin o instalacin:
-----------------
Tcnica Asptica, Seguridad y Prcticas de Garanta de Calidad: El evaluador calificado pondr una marca de visto bueno en cada espacio en el
que la persona evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotar N/A si la actividad no es aplicable a la sesin de evaluacin o
N/O si la actividad no se observ.*

_ _ _ _ _ Completa el Formulario de Evaluacin de Competencia en Higiene de Manos y Procedimientos de Vestimenta.

Efecta los procedimientos apropiados de higiene de manos, vestimenta y enguantado de acuerdo con los POE.
Desinfecta las superficies de los dispositivos ISO Clase 5 con un agente apropiado.
Desinfecta los componentes/viales con un agente apropiado antes de colocarlos en reas de trabajo ISO Clase 5.
Introduce slo los materiales esenciales en un orden apropiado en el rea de trabajo ISO Clase 5.
No interrumpe, obstaculiza o desva el flujo de primer aire a los sitios crticos.
Se asegura de que las jeringas, agujas y tubos permanezcan en su empaque individual y slo se abran en un rea de trabajo ISO Clase 5.
Efecta las manipulaciones slo en el ADP apropiada del dispositivo ISO Clase 5.
No expone los sitios crticos a contaminacin por contacto o aire de calidad infeior a ISO Clase 5.
Desinfecta los tapones, los puertos de inyeccin y los cuellos de las ampollas, frotndolos con IPA estril al 70% y los deja secar durante
el tiempo suficiente.
Fija las agujas a las jeringas sin contaminacin por contacto.
Perfora los tapones de viales y conecta los puertos de infusin sin contaminacin por contacto.
Etiqueta las preparaciones correctamente.
Desinfecta los guantes estriles en forma peridica, frotndolos con IPA estril al 70% durante manipulaciones de preparacin magistral
prolongadas.
Limpia, grada y calibra el dispositivo automatizado de preparacin magistral (p.ej., "preparador magistral de NPT") de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Desecha los elementos cortantes y desperdicios de acuerdo con las polticas institucionales o las guas reconocidas.
720 (797) Preparacin Magistral-Preparaciones Estriles / Pruebas Fsicas USP 39

Apndice IV. Formularlo de Muestra para Evaluacin de las Tcnicas Aspticas

y Prcticas Relacionadas del Personal de Preparacin Magistral (Continuacin)

*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/0) y se le muestran e informan las correcciones especficas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letra de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

Apndice V. Formularlo de Muestra para Evaluacin de Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin

Nombre en letras de imprenta y cargo o ttulo de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institucin o instalacin:

Prcticas de Limpieza y Desinfeccin: El evaluador calificado pondr una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona evaluada ha
completado aceptablemente la actividad descrita, anotar N/A si la actividad no es aplicable a la sesin de evaluacin o N/O si la actividad no se
observ.*

Tareas Diarias:
Prepara la concentracin correcta de solucin desinfectante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Usa un envase apropiadamente etiquetado para el tipo de superficie que va a limpiar (piso, pared, tolvas de produccin, etc.).
Documenta la preparacin de solucin desinfectante.
Sigue los procedimientos de vestimenta cuando efecta cualquier actividad de limpieza.
Al comienzo de cada turno, limpia todos los dispositivos ISO Clase 5 antes de la preparacin magistral, en el siguiente orden: paredes,
barra IV, preparadores magistrales automatizados y superficies de trabajo.
Utiliza un pao que no suelte pelusa, empapado en IPA estril al 70% u otra solucin desinfectante aprobada y deja secar por comple-
to.
Al final de cada turno, retira todos los componentes del preparador y limpia todas las reas ISO Clase 5 como se especific anteriormen-
te.
Limpia todos los mostradores y superficies de trabajo fcilmente limpiables.
Friega pisos, usando los trapeadores etiquetados como "pisos", comenzando en la pared opuesta a la puerta de entrada del cuarto, con
movimientos uniformes del trapeador, hacia el operador. Mueve los carros segn sea necesario para limpiar toda la superficie del piso.
El uso de un sistema de limpieza de microfibra es una alternativa aceptable a los trapeadores.
En la antesala, limpia los lavabos y todas las superficies de contacto; limpia el piso con una solucin desinfectante o usa un sistema de
limpieza de microfibra.

Tareas Mensuales:
Efecta la limpieza mensual en un da designado. Prepara una solucin desinfectante segn se especific en las tareas diarias, que es
apropiada para las superficies que se van a limpiar.
Limpia el cielo raso de las zonas amortiguadoras y las antesalas, las paredes y los estantes de almacenamiento con una solucin desin-
fectante y un trapeador o un sistema de limpieza de microfibra.
Una vez que el rea ISO Clase 5 est limpia, limpia el cielo raso del cuarto de preparacin magistral, seguido de las paredes y por ltimo
el piso. Usa los trapeadores o el sistema de limpieza de microfibra debidamente etiquetados.
Limpia todas las cajas y los estantes de almacenamiento de la zona amortiguadora, retirando el contenido y, usando un pao que no
suelte pelusa, empapado en detergente germicida, limpia las superficies internas de la caja y luego toda la superficie externa. Deja
secar las cajas. Antes de volver a poner el contenido dentro de las mismas, las frota con IPA estril al 70% para quitar el residuo de
desinfectante. Usa paos nuevos de ser necesario.
Limpia todos los carros de la zona amortiguadora, retirando el contenido y usando paos que no suelten pelusa empapados en deter-
gente germicida, limpia todos los carros, comenzando desde el estante superior y la parte superior de la barra, avanzando hacia abajo,
hasta las ruedas. Limpia la parte de abajo de los estantes de la misma manera. Usa un pao nuevo para cada carro. Deja secar. Frota
los carros con un pao que no suelte pelusa, empapado en IPA estril al 70% para quitar cualquier residuo de desinfectante. Usa paos
nuevos de ser necesario.
Limpia las sillas de la zona amortiguadora, el interior y exterior de los recipientes de basura, usando un pao que no suelte pelusa, em-
papado en solucin desinfectante.
Documenta todas las actividades de limpieza anotando quin las efectu, con fecha y hora.

*La persona evaluada es informada de inmediato de todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A
o N/O) y se le muestran e informan las correcciones especficas.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (801) Polarografa 721

Apndice V. Formulario de Muestra para Evaluacin de Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin (Continuacin)

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letras de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

(801) POLAROGRAFA

La polarografa es un mtodo de anlisis electroqumico basado en la medicin del flujo de corriente resultante de la electr-
lisis de una solucin en un microelectrodo polarizable, en funcin de un voltaje aplicado. El polarograma (ver Figura 7) obteni-
do por esta medicin proporciona informacin cualitativa y cuantitativa de sustancias electro-reducibles y electro-oxidables. El
intervalo normal de concentraciones para las sustancias que se analizan es de 10-2 molar a 1 o-s
molar.
En la polarografa de corriente directa (cd), el microelectrodo es un electrodo de goteo de mercurio (EGM) que consiste en
pequeas gotas de mercurio reproducibles que fluyen del orificio de un tubo capilar conectado a un reservorio de mercurio. El
electrodo de referencia ms comnmente empleado es un electrodo de calomel saturado (ECS) que posea una superficie ex-
tensa. El voltaje aplicado a la celda se aumenta gradualmente y slo fluye una corriente residual muy pequea hasta que la
sustancia que se valora experimenta reduccin u oxidacin. Al principio la corriente aumenta gradualmente, luego lo hace de
manera casi lineal con el voltaje y gradualmente alcanza un valor lmite, como se muestra en la Figura 7.

-- --

VOLTAJE APLICADO

Fig. 1. Polarograma tpico que muestra el cambio en el flujo de corriente en funcin del aumento del potencial aplicado al
electrodo de goteo de mercurio.

En la porcin ascendente inicial de la onda polarogrfica, el aumento del flujo de corriente provoca una disminucin en la
concentracin de las especies electroactivas en la superficie del electrodo. A medida que aumentan el voltaje y la corriente, la
concentracin de las especies reactivas disminuye an ms hasta alcanzar un valor mnimo en la superficie del electrodo. La
corriente queda limitada entonces por la velocidad de difusin de las especies reaccionantes desde el seno de la solucin hasta
la superficie del microelectrodo. El incremento final de la corriente es provocado por la reaccin del electrlito soporte. Esta
gran concentracin de electrlito es inerte dentro del intervalo de potencial utilizado para el anlisis e impide que las especies
reactivas alcancen el electrodo por migracin elctrica. De este modo, se asegura que la corriente limitante est controlada por
la difusin.
722 (801) Polarografa / Pruebas Fsicas USP 39

Dado que, en el caso del EGM, la superficie del electrodo se renueva constantemente en forma cclica, la corriente aumenta
desde un valor pequeo, cuando la gota comienza a formarse, hasta alcanzar un valor mximo cuando la gota cae. Mediante
el empleo de un registrador apropiado para medir la corriente, se obtiene el registro caracterstico con perfil dentado. La co-
rriente limitante es la suma de las corrientes residual y de difusin. La corriente residual se resta de la corriente limitante para
obtener la altura de la onda.
Ecuacin de llkovic-La relacin lineal entre la corriente de difusin (id) y la concentracin de especies electro-activas se
muestra por la ecuacin de llkovic:
id = 708nD112cm2J3t1i6
en la cual id es la corriente mxima en microamperios; n es el nmero de electrones requeridos por molcula de sustancia elec-
tro-activa; D es el coeficiente de difusin, en centmetros cuadrados por segundo; C es la concentracin, en milimoles por L; m
es la velocidad de flujo de mercurio del EGM, en mg por segundo; y t es el tiempo de cada de la gota, en segundos.
Los polargrafos modernos estn equipados con registradores capaces de determinar la corriente hasta la ltima porcin de
la vida de la gota; en consecuencia, registran la mxima fluctuacin de corriente. Cuando la corriente se mide slo al final de la
vida de la gota, la tcnica se denomina polarografa cd por muestreo. En este caso, slo se registran los mximos de corriente y
no se observan las oscilaciones debidas al crecimiento de la gota.
Para instrumentos equipados con galvanmetros para medir la corriente, o en el caso de los registradores operados en mo-
dalidad de curva suavizada, las ondas dentadas son oscilaciones alrededor de la corriente promedio. En el ltimo caso, la medi-
da de la corriente es el promedio de las oscilaciones. Para los polarogramas obtenidos de esta manera, la id dada por la ecua-
cin de llkovic es la corriente promedio en microamperios observada durante la vida de la gota en lugar de la corriente mxi-
ma, y entonces el coeficiente 708 se reemplaza por 607.
Control de la Corriente de Difusin-La ecuacin de llkovic identifica las variables que deben ser controladas para asegu-
rar que la corriente de difusin sea directamente proporcional a la concentracin de material electro-activo. A 25 los coefi-
cientes de difusin para soluciones acuosas de muchos iones y molculas orgnicas aumentan 1o/o a 2% por grado de aumento
en la temperatura. Por lo tanto, la temperatura de la celda polarogrfica debe controlarse en un margen de 0,5. Las cantida-
des m y t dependen de las dimensiones del capilar y de la altura de la columna de mercurio por encima del electrodo. Si bien
es posible comparar resultados obtenidos con capilares diferentes si se conoce el producto m2i3t1i6, es recomendable utilizar el
mismo capilar con una altura de mercurio constante durante una serie de anlisis. La corriente de difusin es proporcional a la
raz cuadrada de la altura de la columna de mercurio. Un reservorio de mercurio con un dimetro de ms de 4 cm previene
una disminucin significativa del nivel de mercurio durante una serie de determinaciones.
El capilar para el EGM tiene un orificio de aproximadamente 0,04 mm y una longitud de 6 cm a 15 cm. La altura de la
columna de mercurio, medida desde el extremo del capilar hasta la parte superior del depsito de mercurio, oscila entre 40
cm y 80 cm. La longitud exacta del capilar y la altura de la columna de mercurio se ajustan de modo que el tiempo de cada
est entre 3 y 5 segundos con el circuito abierto y con el capilar inmerso en la solucin de prueba.
Se encuentran disponibles equipos que permiten controlar los tiempos de goteo desde fracciones de segundo hasta varios
segundos. Como el detalle dentro de un polarograma se relaciona con el nmero de gotas proporcionadas durante un cambio
de potencial dado, los tiempos cortos de goteo permiten un registro ms rpido del polarograma.
La corriente que fluye a travs de la solucin de prueba durante el registro de un polarograma est en el orden de los mi-
croamperios. Por lo tanto, el flujo de corriente produce cambios inapreciables en la solucin de prueba y es posible realizar
varios polarogramas con la misma solucin de prueba sin obtener diferencias significativas.
Potencial de Media Onda-El potencial de media onda (E 112) tiene lugar, en el polarograma, al punto medio de la distan-
cia entre la corriente residual y la meseta de la corriente limitante. Este potencial es caracterstico de las especies electro-activas
y, por lo general, es independiente de su concentracin o del capilar empleado para obtener la onda. Depende de la composi-
cin de la solucin y puede cambiar con variaciones en el pH o en el sistema de disolventes, o con la adicin de agentes for-
madores de complejos. El potencial de media-onda, por lo tanto, sirve como criterio para la identificacin cualitativa de una
sustancia.
El potencial del EGM es igual al voltaje aplicado frente al electrodo de referencia despus de la correccin para la cada iR (el
potencial necesario para pasar la corriente, i, a travs de la solucin con una resistencia R). Resulta especialmente importante
hacer esta correccin para soluciones no acuosas, las cuales suelen poseer alta resistencia, si se necesita un potencial exacto
para el EGM. No se necesita la correccin del potencial de media-onda para el anlisis cuantitativo. A menos que se indique de
otro modo, se entiende que los potenciales representan mediciones realizadas frente al ECS.
Eliminacin del Oxgeno Disuelto-Puesto que el oxgeno se reduce en el EGM en dos pasos, primero a perxido de hi-
drgeno y despus a agua, interfiere cuando los polarogramas deben realizarse a potenciales ms negativos que aproximada-
mente O voltio en funcin de ECS, y por lo tanto debe ser eliminado. Esto puede realizarse introduciendo burbujas de nitrge-
no libre de oxgeno a travs de la solucin durante 1O a 15 minutos inmediatamente antes de registrar la onda; el nitrgeno
primero debe pasarse a travs de una porcin separada de la solucin para "acondicionarlo" y de este modo reducir al mnimo
los cambios debidos a la evaporacin.
Es necesario que la solucin est en reposo y libre de vibraciones durante el tiempo en que se registra la onda, a fin de ase-
gurar que la corriente dependa solamente de la difusin. Por lo tanto, el burbujeo con nitrgeno debe detenerse y el gas se
debe dirigir para que fluya sobre la superficie de la solucin antes de registrar un polarograma.
USP 39 Pruebas Fsicas / (801) Polarografa 723

En medios alcalinos, se puede agregar bisulfito de sodio para eliminar el oxgeno, siempre que el reactivo no reaccione con
otros componentes del sistema.
Medicin de la Altura de la Onda-Para usar un polarograma cuantitativamente, es necesario medir la altura de la onda.
Como sta es una medida de la magnitud de la corriente de difusin, se mide verticalmente. Para compensar la corriente resi-
dual, el segmento de la curva que precede al aumento de la onda se extrapola ms all del ascenso en la onda. Para una onda
bien formada donde esta extrapolacin es paralela a la meseta de la corriente limitante, la medicin no es ambigua. Para on-
das no muy bien definidas, puede utilizarse el siguiente procedimiento a menos que se especifique algo difrente en la mono-
grafa individual. Se extrapolan con lneas rectas tanto la corriente residual como la corriente limitante, tal como se muestra en
el grfico (Figura 7). La altura de la onda se toma como la distancia vertical entre las lneas extrapoladas medida a nivel del
potencial de media onda.
Procedimiento-[ Precaucin-El vapor de mercurio es txico y el mercurio metlico tiene una presin de vapor significativa a
temperatura ambiente. El lugar de trabajo donde se utiliza mercurio debe construirse de modo que cualquier salpicadura o gota de
mercurio derramada pueda recuperarse completamente con relativa facilidad. Limpiar meticulosamente los derrames de mercurio
despus de cada uso del instrumento. Trabajar en un laboratorio bien ventilado, teniendo cuidado de limpiar cualquier derrame de
mercurio.] Transferir una porcin de la dilucin final de la sustancia valorada a una celda polarogrfica apropiada inmersa en un
bao de agua regulado a 25 0,5. Pasar una corriente de nitrgeno a travs de la solucin durante 1O a 15 minutos para
eliminar el oxgeno disuelto. Comenzar el goteo de mercurio desde el capilar, insertar el capilar en la solucin de prueba y
ajustar la altura del reservorio de mercurio. Modificar el flujo de nitrgeno de modo que pase sobre la superficie de la solucin
y registrar el polarograma en el intervalo de potencial indicado en la monografa individual, empleando un registrador o galva-
nmetro de sensibilidad adecuada para obtener una onda apropiada. Medir la altura de la onda y, a menos que se indique de
otro modo en la monografa, compararla con la altura de la onda obtenida con el Estndar de Referencia USP apropiado, me-
dida bajo las mismas condiciones.
Polarografa de Pulsos-En la polarografa de cd convencional, la corriente se mide continuamente mientras se aplica un
potencial como una rampa lineal (ver Figura 2).

imedlda continuamente

TIEMPO

Fig. 2. Polarografa de Corriente Directa (cd).

Esta corriente se compone de dos elementos. El primero, la corriente de difusin (faradaica), que se produce por la sustancia
que experimenta la reduccin u oxidacin en el electrodo de trabajo y es directamente proporcional a la concentracin de esta
sustancia. El segundo elemento es la corriente capacitativa (relacionada con la carga de la doble capa electroqumica). Ambas
corrientes cambian a medida que vara el tamao de la gota de mercurio. Estos cambios producen las oscilaciones presentes
en los tpicos polarogramas de cd.
En la polarografa de pulso normal, se aplica un pulso de potencial al electrodo de mercurio cerca del final de la vida de la
gota, manteniendo el potencial inicial durante el perodo de crecimiento de la gota (ver Figura 3).

imedida

~
!-TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO-j

Fig. 3. Polarografa de pulso.

724 (801) Polarografa / Pruebas Fsicas USP 39

A cada gota siguiente se le aplica un pulso ligeramente mayor, con una constante de incremento determinada por la velocidad
de barrido seleccionada. La corriente se mide al final del pulso cuando la corriente capacitativa es cercana a cero y, por lo
tanto, se mide principalmente la corriente faradaica (ver Figura 4).

PULSO ---------t

w
!zw
ce
a:
8

1
1
TIEMPO l medida

Fig. 4 Grfico de corriente en funcin del tiempo en polarografa de pulso.

Adems, como el pulso que se aplica es de corta duracin, la capa de difusin no se agota tanto como en la polarografa de
cd, y se obtienen niveles de corriente ms elevados para concentraciones equivalentes. Se pueden medir concentraciones de
tan slo 1 Q-6 M, lo que permite una sensibilidad aproximadamente 1 O veces mayor que la polarografa de cd. Los valores de la
corriente limitante se miden ms fcilmente, dado que las ondas estn libres de oscilaciones.
La polarografa de pulso diferencial es una tcnica mediante la cual se aplica un pulso de altura fija al final de la vida de cada
gota, superpuesta a una corriente directa aumentada linealmente (ver Figura 5).

f.--nEMPO DE GOTEO --1-- TIEMPO DE GOTEO---!

Fig. 5. Polarografa de pulso diferencial.

El flujo de corriente se mide justo antes de la aplicacin del pulso y nuevamente al final del pulso. La diferencia entre estas dos
corrientes se mide y se representa en el registrador. Dicha seal diferencial proporciona una curva que se aproxima a la deriva-
da de la onda polarogrfica y presenta un pico. El potencial del pico es equivalente a:

E112 -AE/2

en donde AE es la altura del pulso. La altura del pico es directamente proporcional a la concentracin a velocidades de barrido
constantes y a alturas de pulso constantes. Esta tcnica es especialmente sensible (pueden determinarse concentraciones de
10-7M) y proporciona mejor resolucin entre ondas poco espaciadas.
Voltamperometra de Redisolucin Andica-La voltamperometra de redisolucin andica es una tcnica electroqumica
por la cual se concentran (reducen) vestigios de sustancias en solucin sobre un electrodo y luego se redisuelven (oxidan) en la
USP 39 Pruebas Fsicas/ (811) Finura de Polvos 725

solucin barriendo andicamente el voltaje aplicado. La medicin del flujo de corriente como una funcin de este voltaje y la
velocidad de barrido proporcionan informacin cualitativa y cuantitativa sobre dichas sustancias. El paso de concentracin per-
mite realizar anlisis a concentraciones de 10-7M a 10-9 M.
El instrumental bsico incluye un generador de rampa de voltaje, un conjunto de circuitos para medicin de corriente, una
celda con electrodos de trabajo, electrodos de referencia y contraelectrodos, y un registrador u otro dispositivo de lectura. Los
instrumentos que tienen capacidades polarogrficas de cd o de pulso generalmente son muy adecuados para aplicacin en
redisolucin. El electrodo de trabajo comnmente utilizado es el electrodo de gota de mercurio colgante (EGMC), si bien el
electrodo de capa fina de mercurio (ECFM) ha sido aceptado. Para el anlisis de metales como por ejemplo plata, platino y
oro, cuyos potenciales de oxidacin son ms positivos que los del mercurio, y del mercurio mismo, se requiere el uso de elec-
trodos slidos como por ejemplo platino, oro y carbn. Un electrodo de calomel saturado o un electrodo de plata-cloruro de
plata sirve como electrodo de referencia excepto para el anlisis de mercurio o de plata. Como contraelectrodo se suele utilizar
un alambre de platino.
Las muestras que contienen el electrlito adecuado se colocan con pipeta en la celda. El oxgeno disuelto se elimina hacien-
do burbujear nitrgeno en la celda durante 5 a 1 O minutos.
En general, se aplica un potencial de electrlisis equivalente a 200 a 300 mV ms negativo que el potencial de media onda
del material que se debe analizar (aunque este potencial se debe determinar experimentalmente), con agitacin durante 1 a
1 O minutos. Para obtener resultados reproducibles, hay que mantener condiciones constantes (a saber, tiempo de deposicin,
velocidad de agitacin, temperatura, volumen de la muestra y tamao de la gota, si se utiliza EGMC).
Despus de la deposicin, la agitacin se suspende y la solucin y el electrodo se dejan equilibrar durante un breve perodo.
El potencial luego se barre andicamente con rapidez (1 O mV/segundo o ms en polarografa de cd y 5 mV/segundo en pola-
rografa de pulso diferencial). Al igual que en la polarografa, la corriente limitante es proporcional a la concentracin de las
especies (altura de la onda en cd y pulso, altura del pico en pulso diferencial), mientras que el potencial de media onda (cd,
pulso) o el potencial de pico (pulso diferencial) identifica la especie. Para obtener un desempeo satisfactorio, es fundamental
elegir cuidadosamente el electrlito de soporte. Por lo general, la cuantificacin se logra por el mtodo de adicin del estndar
o por calibracin.
Esta tcnica es apropiada para el anlisis de vestigios de metales pero tiene un uso limitado en las determinaciones orgni-
cas, dado que muchas de estas reacciones son irreversibles. Al analizar sustancias tales como el cloruro, se puede emplear vol-
tamperometra de redisolucin catdica. La tcnica es la misma que la voltamperometra de redisolucin andica, excepto en
que la sustancia se deposita andicamente y luego se redisuelve mediante un barrido de voltaje catdico.

(811) FINURA DE POLVOS

La distribucin del tamao de partcula se debe calcular mediante Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por
Tamizado Analtico (786) o aplicando otros mtodos, cuando resulte conveniente. En este captulo, se proporciona una clasifi-
cacin de finura de polvos, en trminos descriptivos y sencillos. La medida de la finura de los polvos se realiza, por motivos
prcticos, mediante tamices. El tamizado es el mtodo ms adecuado si la mayora de las partculas superan aproximadamente
los 75 m, aunque tambin se puede usar para algunos polvos cuyos tamaos de partcula son inferiores, cuando el mtodo se
pueda validar. La difraccin de luz es otra tcnica que tambin se utiliza ampliamente para medir el tamao de una gran varie-
dad de partculas.

CLASIFICACIN DE FINURA DE POLVOS

Cuando la distribucin acumulativa se determina mediante tamizado analtico u otros mtodos, la finura de los polvos se
puede clasificar de la siguiente manera:
x90 = dimensin de partcula correspondiente al 90% de la distribucin acumulativa de partculas de tamao inferior al
esperado
x50 = mediana de la dimensin de partcula (es decir, 50% de las partculas son de menor tamao y 50% de las partculas
son de mayor tamao)
x10 = dimensin de partcula correspondiente al 10% de la distribucin acumulativa de partculas de tamao inferior al
esperado
Se reconoce que el smbolo d tambin se utiliza ampliamente para designar estos valores. Por tanto, se pueden emplear los
smbolos d90, d5 oy dio
Los siguientes parmetros se pueden definir basndose en la distribucin acumulativa. QR(x) = distribucin acumulativa de
partculas con una dimensin menor o igual a x, donde el subndice R representa el tipo de distribucin.

R Tipo de Distribucin
o Nmero
1 Longitud
726 (811) Finura de Polvos / Pruebas Fsicas USP 39

R Tipo de Distribucin
2 rea
3 Volumen

Por consiguiente, por definicin:

1. QR(x) = 0,90 cuando x = X90
2. QR(x) = 0,50 cuando x = x50
3. QR(x) = 0, 1 O cuando x = x 10
La tabla que figura a continuacin presenta un mtodo alternativo, aunque menos informativo, para clasificar la finura de los
polvos.
Clasificacin de los Polvos segn su Finura
Distribucin Acumulativa
Trmino Basada en Volumen,
Descriptivo X,n (m) Ql(x)
Grueso >355 Q,(355) <0,50
Moderadamente Fino 180-355 Q,(180) <0,50 y Q,(355) 20,50
Fino 125-180 Q,(125) <0,50 y Q,(180) 20,50
Muy Fino ,,;125 Qil 25) 20,50

(821) RADIOACTIVIDAD

Los productos farmacuticos radioactivos requieren tcnicas especializadas para su manejo y anlisis para poder obtener re-
sultados correctos y reducir al mnimo los riesgos para el personal. Todas las operaciones deben ser llevadas a cabo o supervi-
sadas por personal capacitado en el manejo de materiales radioactivos.
Por lo general, las instalaciones para la produccin, uso y almacenamiento de productos farmacuticos radioactivos estn
sujetas a la obtencin de una licencia que otorga la Comisin de Reglamentacin Nuclear Federal (Nuclear Regulatory Com-
mission), aunque en ciertos casos esta atribucin ha sido delegada a agencias estatales. El Departamento de Transporte, en el
orden federal, reglamenta las condiciones del transporte de materiales radioactivos. Las agencias estatales y locales suelen apli-
car reglamentaciones especiales adicionales. Todos los fabricantes o usuarios deben conocer exhaustivamente las reglamenta-
ciones federales aplicables de la Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosmticos (Food, Drug, and Cosmetic Act), as como
los requisitos adicionales del Servicio de Salud Pblica de los Estados Unidos (U. S. Public Health Service) y de los organismos
estatales y locales relativos a los artculos en cuestin.
En este captulo se establecen definiciones, consideraciones especiales y procedimientos relativos a las monografas de la Far-
macopea sobre medicamentos radioactivos.
Cambio en lo redaccin:

CONSIDERACIONES GENERALES

Ley Fundamental de Desintegracin

La velocidad de desintegracin de una fuente radioactiva se describe por la ecuacin:

en donde N1 es el nmero de tomos de la sustancia radioactiva en el tiempo transcurrido t, N0 es el nmero de tomos cuan-
do t = O y le es la constante de transformacin o desintegracin, la cual tiene un valor caracterstico para cada radionucleido.
La vida media, T112, es el tiempo requerido para que una actividad dada de un radionucleido alcance la mitad de su valor inicial
y est relacionada con la constante de desintegracin por la ecuacin:
T112 = 0,69315/'A
La actividad de una fuente radioactiva (A) est relacionada con el nmero de tomos radioactivos presentes, por la ecuacin:
A='AN
a partir de la cual puede calcularse el nmero de tomos radioactivos en el tiempo t y, por lo tanto, puede determinarse la
masa del material radioactivo.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (821 > Radioactividad 727

La actividad de una sustancia radioactiva pura en funcin del tiempo puede obtenerse a partir de la ecuacin exponencial o
de tablas de desintegracin, o bien por medio de grficas basadas en la vida media (ver Grfica Normalizada de Desintegracin,
Figura 7).

VIDA MEDIA

Figura 1. Grfica Normalizada de Desintegracin.

La actividad de un material radioactivo se expresa como el nmero de transformaciones nucleares por unidad de tiempo. La
unidad fundamental de radioactividad, el curio (Ci), se define como 3,700 x 1010 transformaciones nucleares por segundo. El
milicurio (mCi) y el microcurio (Ci) son subunidades de uso comn. El "nmero de transformaciones nucleares por unidad de
tiempo" es la suma de las velocidades de desintegracin de todos los modos de desintegracin concurrentes del nucleido de
origen. Antes de que la actividad de cualquier radionucleido en una muestra medida pueda expresarse en curios, suele ser ne-
cesario conocer las abundancias de las radiaciones emitidas y medidas.

Geometra

La validez de la calibracin y medicin relativas de radionucleidos depende de la reproducibilidad de la relacin de la fuente

con el detector y su entorno. Debe tenerse en cuenta la configuracin de la fuente.

Radiacin de Fondo

Los rayos csmicos, la radioactividad presente en el detector y en los materiales de proteccin y la radiacin proveniente de
fuentes radioactivas que no cuentan con un blindaje adecuado y que estn en las inmediaciones del equipo de medicin son
factores que contribuyen al conteo de la radiacin de fondo. Todas las mediciones de radioactividad deben corregirse restando
el conteo de radiacin de fondo del conteo bruto de la muestra de prueba.

Estadsticas de Conteo

Dado que el proceso de desintegracin radioactiva es un fenmeno aleatorio, los eventos a contar tambin forman una se-
cuencia aleatoria en funcin del tiempo. Por esta razn, el conteo durante un tiempo definido slo permite obtener una esti-
macin del conteo real. La precisin de esta estimacin, sujeta a fluctuaciones estadsticas, depende del nmero de cuentas
acumuladas en una medicin dada y puede expresarse en funcin de la desviacin estndar cr. Una estimacin de cr es
m
en donde n es el nmero de conteos acumulados en una medicin dada. La probabilidad de que una sola medicin se en-
cuentre dentro de
728 (821) Radioactividad / Pruebas Fsicas USP 39

1001-Vn%
con respecto a la media de una serie de mediciones es 0,68. Es decir, si se realizara una serie de mediciones de un nmero n
de conteos cada una, aproximadamente dos tercios de las observaciones se encontraran dentro de
1001-Vn%
de la media y el resto quedara fuera.
Debido a la naturaleza estadstica de la desintegracin radioactiva, el conteo repetido de una fuente no alterada en un dis-
positivo para conteo produce valores de conteo que se ajustan a la frecuencia de una distribucin normal. Las desviaciones de
estos valores respecto de la distribucin normal responden a la prueba de xi. Por este motivo, suele aplicarse la prueba de xi
para determinar el rendimiento y correcto funcionamiento de un dispositivo para conteo. En la seleccin de instrumentos y
condiciones para la valoracin de fuentes radioactivas, debe maximizarse la cifra del valor ei/B (en donde e= eficiencia del
contador = velocidad observada de conteo/velocidad de desintegracin de la muestra y B = velocidad de conteo de radiacin
de fondo).

Prdidas en el Conteo

El tiempo mnimo requerido para que el contador resuelva dos pulsos de seal consecutivos se denomina tiempo muerto.
Por lo general, el tiempo muerto vara entre unos microsegundos, en el caso de contadores proporcionales y de centelleo, has-
ta cientos de microsegundos, en el caso de contadores de Geiger-Mller. Los eventos nucleares producidos durante el tiempo
muerto del contador no se registrarn. Para obtener la velocidad de conteo corregida, R, a partir de la velocidad de conteo
observada, r, es necesario emplear la frmula:
R = r/(l - r,)
en donde -r es el tiempo muerto. La frmula de correccin anterior supone un tiempo muerto no prolongable. Por lo tanto,
para la validez general, el valor de r, no debe exceder de O, 1. La velocidad de conteo observada, r, se refiere a la velocidad de
conteo bruto de la muestra y no se debe corregir por la radiacin de fondo antes de su uso en la ecuacin anterior.

Estndares de Calibracin

Realizar todas las valoraciones de radioactividad empleando sistemas de medicin calibrados con estndares de radioactivi-
dad debidamente certificados. Estos estndares de calibracin pueden adquirirse directamente del Instituto Nacional de Nor-
mas y Tecnologa (NIST, por sus siglas en ingls) o de otras fuentes con valores rastreables al Instituto Nacional de Normas y
Tecnologa mediante su participacin en un programa de mediciones intercomparadas. En aquellos casos en que estos estn-
dares de calibracin no se encuentren disponibles, la Farmacopea proporciona los datos de desintegracin nuclear requeridos
para la calibracin. Estos datos, as como los valores de vida media, se obtienen del Archivo de Datos sobre Estructura Nuclear
Evaluada del Proyecto de Datos Nucleares de Oak Ridge (Evaluated Nuclear Structure Data File of the Oak Ridge Nuclear Data
Project) y reflejan los ltimos valores disponibles a la fecha de publicacin.

Transportador

La masa total de tomos o molculas radioactivas en una fuente radioctiva dada es directamente proporcional a la actividad
del radionucleido para una vida media dada y, por lo general, la cantidad presente en los preparados radiofarmacuticos es
demasiado pequea para ser medida por mtodos qumicos o fsicos comunes. Por ejemplo, la masa de 131 1 con una actividad
de 100 mCi es 8 x 10-7 g. Como cantidades tan pequeas de material se comportan qumicamente de manera anmala, se
pueden agregar istopos no radioactivos del mismo radionucleido para actuar como transportadores durante el procesamiento
para facilitar su manipulacin. En muchos casos, la adsorcin puede impedirse simplemente aumentando la concentracin de
iones hidrgeno en la solucin. Sin embargo, las cantidades de este material deben ser lo suficientemente pequeas como
para que no se produzcan efectos fisiolgicos indeseables. La expresin "sin transportador" se refiere nicamente a preparacio-
nes radioactivas donde no hay istopos no radioactivos del radionucleido. Esto implica que los preparados radiofarmacuticos
producidos a travs de (n, y) reacciones no pueden considerarse exentas de transportador.
La actividad por unidad de volumen o peso de un medio o vehculo que contiene un radionucleido, ya sea con o sin trans-
portador, se denomina concentracin radioactiva, en tanto que el trmino actividad especfica se refiere a la actividad de un
radionucleido por gramo de su elemento.

Pureza Radioqumica

La pureza radioqumica de una preparacin radiofarmacutica se refiere a la fraccin del radionucleido declarado presente
en la forma qumica declarada. Las impurezas radioqumicas en preparados radiofarmacuticos pueden ser el resultado de la
descomposicin y de procedimientos de preparacin indebidos. La radiacin causa la descomposicin del agua, uno de los
USP 39 Pruebas Fsicas / (821) Radioactividad 729

ingredientes principales de la mayora de los preparados radiofarmacuticos, lo cual produce tomos reactivos de hidrgeno y
radicales hidroxilo, electrones hidratados, hidrgeno, iones hidrgeno y perxido de hidrgeno. Este ltimo se forma en pre-
sencia de radicales oxgeno, los cuales se originan a partir de la descomposicin radioltica del oxgeno disuelto. Muchos pre-
parados radiofarmacuticos tienen mejor estabilidad si se excluye el oxgeno. La radiacin tambin puede afectar al preparado
radiofarmacutico en s mismo, produciendo un aumento de iones, radicales y estados excitados. Estas especies se pueden
combinar entre s o con las especies activas formadas a partir del agua. La descomposicin por radiacin puede reducirse al
mnimo mediante el uso de agentes qumicos que captan electrones o radicales. Los electrones atrapados en slidos provocan
un cambio de color debido a la formacin de centros F y un ejemplo del caso es el oscurecimiento de los envases de vidrio que
contienen preparados radiofarmacuticos. La pureza radioqumica de los preparados radiofarmacuticos se determina por cro-
matografa en columna, papel o en capa delgada u otras tcnicas apropiadas de separacin analtica, segn se especifique en
la monografa individual correspondiente.

Pureza Radionuclidica

La pureza radionuclidica de una preparacin radiofarmacutica se refiere a la proporcin de radioactividad debida al radio-
nucleido deseado en la radioactividad total medida. La pureza radionuclidica es importante para la estimacin de la dosis de
radiacin recibida por el paciente cuando se le administra la preparacin. Las impurezas radionuclidicas pueden surgir de im-
purezas en los materiales originales, diferencias en los valores de diferentes secciones cruzadas de produccin competentes y
funciones de excitacin a la energa o energas de las partculas bombardeantes durante la produccin.

Trminos y Definiciones

La fecha de fabricacin es la fecha en la cual se completa el ciclo de fabricacin del producto terminado.
La fecha de valoracin es la fecha (y hora, si fuera aplicable) en la cual se realiza la valoracin concreta de la radioactividad.
La fecha de calibracin es una fecha y hora arbitrariamente asignadas, momento en el que se calcula la radioactividad del
producto para la comodidad del usuario.
La fecha de caducidad es la fecha lmite para el uso del producto. El perodo de caducidad (es decir, el tiempo transcurrido
entre la fecha de fabricacin y la fecha de caducidad) se basa en el conocimiento de las propiedades radioactivas del producto
y los resultados de los estudios de estabilidad de la forma farmacutica terminada.

Etiquetado

Las monografas correspondientes a cada producto radiofarmacutico indican la fecha de caducidad, la fecha de calibracin
y la advertencia "Precaucin-Material Radioactivo". El etiquetado indica que, al realizar los clculos de dosificacin, deben
hacerse las correcciones necesarias por desintegracin radioactiva y asimismo indica cul es la vida media radioactiva del radio-
nucleido. Los artculos que son Inyecciones deben cumplir con los requisitos de'''". , ,.. ' . '"b ;,:'' "~ . ', , '.:, .. . . " .
lllll!llllltl"rlll-lllllrll, mientras que los que son Productos Biolgicos deben cumplir con los requisitos de
Etiquetado en Productos Biolgicos (1041 ).

IDENTIFICACIN Y VALORACIN DE RADIONUCLEIDOS

Instrumental

CMARAS DE IONIZACIN

Una cmara de ionizacin es un instrumento donde se aplica un campo elctrico a travs de un volumen de gas con el pro-
psito de recoger los iones producidos por un campo de radiacin. Los iones positivos y los electrones negativos migran a lo
largo de las lneas de fuerza del campo elctrico y se captan en electrodos, produciendo una corriente de ionizacin. En una
cmara de ionizacin de tipo pozo adecuadamente diseada, la corriente de ionizacin no debe depender demasiado de la
posicin de la muestra radioactiva y el valor de la corriente por unidad de actividad, conocido como factor de calibracin, es
caracterstico de cada radionucleido emisor de rayos gamma.
La corriente de ionizacin producida en una cmara de ionizacin est relacionada con la energa media de la radiacin emi-
tida y es proporcional a la intensidad de la radiacin. Si se emplean fuentes estndar de velocidad de desintegracin conocida
para calibrar la eficiencia, se puede utilizar la cmara de ionizacin para determinaciones de actividad entre algunos microcu-
rios y varios cientos de milicurios o ms. Por lo general, el lmite superior de actividad que puede medirse en una cmara de
ionizacin no est definido con exactitud y puede estar limitado por consideraciones relativas a la saturacin, la capacidad del
amplificador y el diseo de la cmara en s. Deben revisarse los datos suministrados u obtenidos de un instrumento especfico
para evaluar los intervalos tiles de energas e intensidades del dispositivo. ,
730 (821) Radioactividad / Pruebas Fsicas USP 39

Se puede alcanzar fcilmente una reproducibilidad con un margen de aproximadamente un 5% en alrededor de 1 O segun-
dos, con una cmara de pozo profundo re-entrante. La forma ms comnmente empleada de cmara de ionizacin para me-
dir las actividades de preparados radiofarmacuticos se conoce como calibrador de dosis.
Aunque el factor de calibracin para un radionucleido puede interpolarse a partir de la curva de respuesta a la energa de la
cmara de ionizacin, en este procedimiento hay varias fuentes posibles de error. Por lo tanto, se recomienda que todas las
calibraciones de la cmara de ionizacin se lleven a cabo con el uso de fuentes autnticas de referencia de los radionucleidos
individuales, segn se describe ms adelante.
La calibracin de un calibrador de dosis debe mantenerse relacionando la respuesta medida de un estndar con la de un
estndar de larga vida, como es el caso del radio 226 en equilibrio con sus productos de desintegracin. El instrumento debe
verificarse diariamente con 226Ra u otra fuente para evaluar su estabilidad durante un perodo prolongado. Esta verificacin de-
be incluir lecturas del estndar de funcionamiento en todas las posiciones de radionucleido empleadas. Para obtener la activi-
dad (A.) del radionucleido medido, emplear la relacin:
Ax= RxRIRn
en donde Rn es la nueva lectura para el radio u otra fuente, Rx es la lectura para la misma fuente obtenida durante el procedi-
miento de calibracin inicial y R es la lectura observada para la muestra del radionucleido. Obviamente, primero hay que apli-
car las correcciones necesarias por desintegracin radioactiva de la fuente de referencia. El uso de este procedimiento debe
reducir al mnimo cualquier efecto debido a la desviacin en la respuesta del instrumento. La actividad recomendada del 226 Ra
u otro indicador usado en el procedimiento descrito anteriormente es entre 75 Ci y 150 Ci. Se recomienda tambin verificar
la reproducibilidad o estabilidad de instrumentos de intervalos mltiples para todos los intervalos con el uso de estndares
apropiados.
El tamao y la forma de una fuente radioactiva pueden afectar la respuesta de un calibrador de dosis y suele ser necesario
realizar una pequea correccin cuando se mide una muestra voluminosa.

DETECTORES DE CENTELLEO Y DETECTORES SEMICONDUCTORES

Cuando se disipa la totalidad o parte de la energa de la radiacin beta o gamma dentro de los centelladores, se producen
fotones de intensidad proporcional a la cantidad de energa disipada. Un fototubo multiplicador de electrones detecta estos
pulsos y los convierte en pulsos elctricos, que posteriormente se analizan con un analizador de altura de pulso para obtener
un espectro de altura de pulso relacionado con el espectro de energa de la radiacin emitida por la fuente. En general, un
espectro de altura de pulso por centelleo de partculas beta se aproxima al espectro verdadero de energa beta, siempre que la
fuente de partculas beta est preparada de tal manera que la autoabsorcin se reduzca al mnimo. Se pueden obtener espec-
tros de rayos beta utilizando fluoruro de calcio o antraceno como centellador, mientras que los espectros de rayos gamma
suelen obtenerse con un cristal de yoduro de sodio activado con talio o con un detector semiconductor de gran volumen de
germanio desplazado por litio. Los espectros de partculas cargadas tambin pueden obtenerse empleando detectores semi-
conductores de silicio y/o contadores proporcionales de gas. Los detectores semiconductores son, en esencia, cmaras de ioni-
zacin de estado slido, pero la energa requerida para crear un par electrn-hueco o para elevar un electrn desde la capa de
valencia a la capa de conduccin en el semiconductor es aproximadamente de un dcimo de la energa requerida para crear
un par inico en una cmara de ionizacin llena de gas o un contador proporcional y es mucho menor que la requerida para
producir un fotn en un cristal Nal{TI) de centelleo. En la espectrometra de rayos gamma, un detector de Ge(Li) puede produ-
cir una resolucin de energa de 0,33% para rayos gamma de 1,33 MeV provenientes de 6Co, mientras que un cristal de
Nal{TI) de 3 x 3 pulgadas (7,6 x 7,6 cm) permite obtener un valor de 5,9% para la misma energa de rayos gamma. La resolu-
cin de energa es una medida de la capacidad para distinguir la presencia de dos rayos gamma estrechamente espaciados en
energa y se define por convencin como el ancho total del fotopico a la mitad de su altura mxima (FWHM por sus siglas en
ingls), expresado como porcentaje de la energa del fotopico.
Los espectros de rayos gamma presentan uno o ms fotopicos ntidos tpicos o picos de energa total, como resultado de la
absorcin total en el detector de la energa completa de radiaciones gamma provenientes de la fuente; estos fotopicos son
tiles para fines de identificacin. Otros picos secundarios se observan como consecuencia de retrodispersin, radiacin de ani-
quilacin, suma de coincidencia, rayos X fluorescentes, etc., acompaados por una banda amplia conocida como el efecto
continuo Compton que surge de la dispersin de los fotones en el detector y de los materiales circundantes. Dado que la res-
puesta del fotopico vara con la energa del rayo gamma, la calibracin de un espectrmetro de rayos gamma debe realizarse
con estndares de radionucleidos que tengan energas de rayos gamma y velocidades de emisin conocidas. La forma del es-
pectro de rayos gamma depende de la forma y tamao del detector y los tipos de materiales de blindaje empleados.
Para verificar la identidad de un radionucleido por espectrometra de rayos gamma, es necesario hacer una comparacin del
espectro de la muestra con el de una muestra de pureza conocida del mismo radionucleido obtenida con parmetros instru-
menta/es idnticos e idntica geometra de muestra. Cuando los radionucleidos emiten radiaciones coincidentes X o gamma, el
carcter de la distribucin de la altura de pulso suele cambiar drsticamente debido al efecto de suma de estas radiaciones
coincidentes en el detector a medida que aumenta la eficiencia de la deteccin (por ejemplo, al acercar la fuente al detector).
Este efecto es particularmente evidente en el caso del yodo 125. Entre las aplicaciones ms tiles de la espectrometra de rayos
gamma estn aquellas que sirven para la identificacin de radionucleidos y la determinacin de impurezas radionuclidicas.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (821) Radioactividad 731

Cuando no es posible confirmar la identidad de un radionucleido dado a travs de una comparacin directa con el espectro
de una muestra del mismo radionucleido de pureza conocida, la identidad del radionucleido en cuestin debe establecerse
con el siguiente mtodo. Deben medirse dos o ms de los siguientes parmetros del esquema de desintegracin nuclear de la
muestra del radionucleido que se desea identificar, los cuales deben concordar dentro de 10%: (1) vida media, (2) energa de
rayos gamma o rayos X emitidos, (3) la abundancia de cada emisin y (4) el Emx para aquellos radionucleidos que se desinte-
gren con emisin de partculas beta. Estas mediciones deben realizarse segn se indica en las secciones Identificacin y Va/ora-
cin de este captulo. La coincidencia de dos o ms de los parmetros medidos con los datos correspondientes publicados del
esquema de desintegracin nuclear constituye la confirmacin de la identidad del radionucleido.

CONTADORES DE CENTELLEO LQUIDO

Los radionucleidos emisores de radiacin alfa y beta pueden analizarse con un sistema de detectores de centelleo lquido. En
el lquido de centelleo, la energa de radiacin se transforma finalmente en cuantos de luz que son detectados generalmente
por dos fototubos multiplicadores preparados para contar slo radiacin de coincidencia. El lquido de centelleo es una solu-
cin constituida por un disolvente, solutos primarios y secundarios, y aditivos. La partcula cargada disipa su energa en el di-
solvente y una fraccin de esta energa se transforma en fluorescencia en el soluto primario. La funcin del soluto secundario
es desplazar la radiacin de fluorescencia a longitudes de onda ms largas que son detectadas ms eficientemente por los foto-
tubos multiplicadores. Los disolventes empleados con ms frecuencia son tolueno y p-xileno; los solutos primarios son 2,5-dife-
niloxazol (PPO) y 2-(4'-terc-butilfenil)-5-(4-bifenilil)-1,3,4-oxadiazol (butil-PBD) y los solutos secundarios son 2,2'-p-fenilen-
bis[4-metil-5-feniloxazol] (dimetil-POPOP) y p-bis(o-metilestrilil)benceno (bis-MSB). Para lograr compatibilidad y miscibilidad
con muestras acuosas a analizar, se incorporan tambin en el centellador muchos aditivos, tales como agentes tensoactivos y
agentes de solubilizacin. Para una determinacin exacta de la radioactividad de la muestra se debe prestar atencin al prepa-
rar una muestra verdaderamente homognea. La presencia de impurezas o color en la solucin disminuye la produccin de
fotones del centellador, lo cual se denomina extincin. Una medicin exacta de la radioactividad requiere una correccin por
prdida de velocidad de conteo debida a extincin.
La velocidad de desintegracin de una fuente de partculas beta puede determinarse mediante un procedimiento que con-
siste en medir el conteo total de la muestra en funcin del umbral discriminador de la altura de pulso y la velocidad de emisin
se obtiene luego extrapolando a un umbral de cero. Los emisores de partculas alfa energticas pueden medirse de forma simi-
lar utilizando este mtodo.

Identificacin

Un radionucleido puede identificarse por su modo de desintegracin, su vida media y las energas de sus emisiones nuclea-
res.
La vida media radioactiva se determina fcilmente mediante el conteo sucesivo de una fuente dada del radionucleido duran-
te un perodo ms prolongado que su vida media. La respuesta del dispositivo para conteo cuando se emplea para la medicin
de la desintegracin de radionucleidos de larga vida debe supervisarse con una fuente de referencia de vida an ms larga
para evaluar y compensar errores que surjan de la derivacin electrnica del aparato. Para radionucleidos de vida corta, cuan-
do el perodo de conteo es una fraccin significativa de la vida media del radionucleido, la velocidad de conteo registrada de-
be corregirse al tiempo en que se inicia el conteo, del siguiente modo:
Rt = rA.t/(1 - e-1.t)

en donde R1 es la velocidad de conteo al comienzo de un perodo de conteo, res la velocidad del conteo observada a travs
del perodo total de conteo, t es la duracin del perodo total de conteo, /..., es la constante de desintegracin del radionucleido
y e es la base del logaritmo natural. Cuando t es pequeo en comparacin con la vida media del radionucleido en anlisis, de
tal modo que /. .,1 < 0,05, (1 - e-u) se aproxima a /...,t y no se necesita correccin.
La energa de emisiones nucleares suele determinarse por el intervalo mximo de penetracin de la radiacin en la materia
(en el caso de partculas alfa y beta) y por el pico o fotopico de energa total en el espectro de rayos gamma (en el caso de
rayos X y rayos gamma). Puesto que las partculas beta son emitidas con un espectro de energa continuo, la energa beta
mxima, EmXI es un ndice nico para cada radionucleido emisor beta. Adems del intervalo mximo y del espectro de energa
de las partculas beta, el coeficiente de absorcin, cuando se obtiene bajo condiciones de conteo reproducibles, puede servir
como un ndice confiable para la identificacin de un emisor beta. Fortuitamente, las partculas beta se absorben en la materia
de una manera aproximadamente exponencial y la grfica del logaritmo de la velocidad de conteo de partculas beta en fun-
cin del espesor del absorbente se conoce como la curva de absorcin. La porcin inicial de la curva de absorcin muestra
linealidad, a partir de la cual puede obtenerse el coeficiente de absorcin. El intervalo mximo est determinado por el uso de
absorbentes de espesor variable y el espectro de energa se mide por espectrometra de centelleo de rayos beta.
La absorcin de rayos gamma en la materia es estrictamente exponencial pero las capas de valor medio de atenuacin no
han sido muy tiles para la caracterizacin de radionucleidos. Los rayos gamma de ~ada transicin isomrica son monoenerg-
ticos; su energa puede ser medida directamente por espectrometra de rayos gamma. Debido a su resolucin de alta energa,
los detectores de estado slido [Ge(Li)] son muy superiores a los detectores de centelleo [Nal(TI)] en la espectrometra de rayos
gamma.
732 (821) Radioactividad / Pruebas Fsicas USP 39

Las actividades de las soluciones radiofarmacuticas suelen aproximarse a los milicurios por ml. Por lo general, estas solucio-
nes deben diluirse considerablemente antes de que puedan valorarse con exactitud. El diluyente debe ser compatible con el
preparado radiofarmacutico en lo que se refiere a factores como pH y potenciales redox, para que no ocurra ninguna hidrli-
sis o cambio en el estado de oxidacin con la dilucin, lo que podra conducir a adsorcin y separacin del radionucleido de la
solucin.

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA

Procedimiento del Coeficiente de Absorcin de Masa-Depositar y secar una alcuota de la solucin de fsforo 32 ra-
dioactivo sobre una pelcula plstica delgada para reducir al mnimo la retrodispersin y colocar la alcuota bajo un contador
apropiado. Determinar sucesivamente las velocidades de conteo, empleando no menos de seis "espesores" diferentes de alu-
minio, cada uno entre 20 mg/cm 2 y 50 mg/cm 2 y un solo absorbente de espesor no mayor de 800 mg/cm 2 , que se emplea
para medir la radiacin de fondo. (Los absorbentes se insertan entre la muestra de prueba y el contador pero se colocan ms
cerca de la ventana del contador para reducir al mnimo la dispersin.) El conteo neto de partculas beta se obtiene despus de
restar la velocidad de conteo hallada con el absorbente de espesor de 800 mg/cm 2 o mayor. Graficar el logaritmo de la veloci-
dad neta de conteo de partculas beta en funcin del "espesor" total del absorbente. El "espesor" total del absorbente es el
"espesor" de los absorbentes de aluminio ms el "espesor" de aire equivalente (la distancia en centmetros entre la muestra y
la ventana del contador multiplicada por 1,205 mg/cm 3 a 20 y 76 cm de mercurio), expresado en mg/cm 2 El resultado es
una lnea aproximadamente recta.
Elegir dos "espesores" totales del absorbente que difieran en 20 mg/cm 2 o ms y que caigan sobre la grfica lineal y calcular
el coeficiente de absorcin de masa, , por medio de la ecuacin:
= 1 /(t2 - t 1) In (N 11 /N 12) = (2,303/(t2 - t 1 )) x (log Ntl - log N12)
en donde t 1 y t 2 representan el total de los "espesores," en mg/cm 2, siendo t 2 el absorbente de mayor espesor; y Nt1 y Nt2 son
las velocidades de conteo neto de partculas beta con los absorbentes t 1 y t 2, respectivamente.
Para la caracterizacin del radionucleido, el coeficiente de absorcin de masa debe estar dentro de un 5% del valor encon-
trado para una muestra pura del mismo radionucleido cuando se determina bajo condiciones idnticas de conteo y geometra.
Otros Mtodos de Identificacin-Otros mtodos para la determinacin de la identidad de un emisor beta tambin de-
penden de la determinacin de la fmx Se puede llevar a cabo de varias maneras. Por ejemplo, (1) mediante la utilizacin de
relaciones de intervalos de energa entre partculas beta en un absorbente o (2) mediante la determinacin de Emx a partir de
un espectro de partculas beta obtenido con un espectrmetro para radiacin beta calibrado por energa empleando una fuen-
te delgada del radionucleido (ver Detectores de Centelleo y Detectores Semiconductores en este captulo).

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA

El espectro de rayos gamma de un radionucleido es una herramienta valiosa para la identificacin cualitativa de radionuclei-
dos emisores de rayos gamma. Se identifica el pico de energa total, o el fotopico, por la energa de transicin de rayos gamma
que se libera en el esquema de desintegracin del radionucleido.
Para determinar la pureza e identidad de un radionucleido, se obtiene el espectro de rayos gamma de una sustancia radioac-
tiva por medio de un cristal de Nal(TI) o un detector semiconductor de Ge(Li). La resolucin de este ltimo es mayor en ms
de una orden de magnitud que el anterior y es el preferido para fines analticos. El espectro obtenido es idntico en forma al
de una muestra del radionucleido puro, medido con el mismo sistema de deteccin y en la misma geometra. El espectro de
rayos gamma del producto radiofarmacutico deber contener slo fotopicos identificables por las energas de transicin de
los rayos gamma encontrados en el esquema de desintegracin del mismo radionucleido. En el caso de eficiencias geomtricas
bajas, las reas bajo los fotopicos, despus de corregir por la eficiencia de medida del detector, son proporcionales a la abun-
dancia o velocidad de emisin de los respectivos rayos gamma en el radionucleido.

IMPUREZAS RADIONUCLIDICAS

Debido a que los nucleidos emisores de rayos alfa son sumamente txicos, debe limitarse su uso en preparaciones radiofar-
macuticas. Los procedimientos para la identificacin de radionucleidos activos gamma y beta, segn se ha indicado previa-
mente, se aplican a la deteccin de contaminantes gamma y, comnmente, contaminantes beta.
La actividad bruta de partculas alfa en preparaciones radiofarmacuticas puede medirse mediante el uso de un contador
proporcional sin ventanas o un detector de centelleo que emplee un detector fosforescente de sulfuro de cinc activado por
plata o por las tcnicas de conteo de centelleo lquido.
La gran ionizacin causada por partculas alfa facilita la medicin de radionucleidos emisores de rayos alfa en presencia de
grandes cantidades de nucleidos beta y gamma activos mediante el uso de tcnicas apropiadas para diferenciar la amplitud de
los pulsos de seal. En el conteo proporcional, la regin de voltaje operativo para conteo de partculas alfa denominada "mese-
ta alfa" es considerablemente menor que la "meseta beta" para conteo de radiaciones beta y gamma. La calibracin de voltaje
USP 39 Pruebas Fsicas/ (821) Radioactividad 733

tpica para la "meseta alfa" y la "meseta beta" con gas de conteo P-1 O es de 900 voltios a 1300 voltios y de 1600 voltios a
2000 voltios, respectivamente.
Cuando se emplean detectores fosforescentes de sulfuro de cinc activado por plata para la deteccin de partculas alfa, stas
pueden distinguirse de otras radiaciones de interferencia por la diferenciacin de la altura de pulso. Se debe tomar la precau-
cin de reducir al mnimo la autoabsorcin en la fuente cuando se preparan las muestras para el conteo de partculas alfa.

Valoracin

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA

Procedimiento-La velocidad de desintegracin (A) de una muestra emisora de partculas beta se obtiene mediante el con-
teo de una alcuota cuantitativamente depositada en una geometra fija segn la frmula:
A= R/(E X f, X fb X f,)
en donde a es la eficiencia del contador, f, es el factor de correccin por tiempo muerto del contador, fb es el factor de correc-
cin por retrodispersin y f, es el factor de correccin por autoabsorcin. La velocidad de conteo para un absorbente cero se
obtiene por extrapolacin de la porcin lineal inicial de la curva de absorcin a un "espesor" cero del absorbente, consideran-
do los mg/cm2 de "espesor" de cubierta de la muestra, la ventana del contador y el espacio de aire presente entre la muestra y
la ventana del contador. La eficiencia del contador, e, se determina mediante el uso de un estndar secundario de larga vida
con caractersticas espectrales similares. RaD + E se ha utilizado con frecuencia para la calibracin de eficiencia de los contado-
res para fsforo 32. Mediante el uso de condiciones de medicin idnticas para la muestra y el estndar (y extrapolacin a
absorbente cero), el cociente entre los valores de f,, fb y f, para el estndar y la muestra se acerca a la unidad.
La relacin anterior es vlida tambin cuando se ha calibrado el contador con un estndar del radionucleido que se va a
analizar. En este caso, sin embargo, no se requieren las extrapolaciones a "espesor" cero del absorbente para la muestra y el
estndar, ya que las dos correcciones para absorcin se cancelan para una geometra dada.
Otro mtodo til que se emplea con frecuencia para la determinacin de la velocidad de desintegracin de radionucleidos
emisores de rayos beta es el conteo por centelleo lquido, que tambin utiliza una extrapolacin del conteo de la muestra a un
umbral cero para el discriminador de altura de pulso.

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA

Se proporcionan tres mtodos para la valoracin de radionucleidos emisores de rayos gamma. La seleccin del mtodo pre-
ferido depende de la disponibilidad de un estndar de calibracin del radionucleido a analizar y la pureza radionuclidica del
producto en s.
Se requiere la comparacin directa con un estndar de calibracin si el estndar de calibracin del radionucleido a analizar
est disponible y si se ha determinado que el lmite superior de error aceptable en la determinacin de las actividades debido a
la presencia de impurezas radionuclidicas es menos de 3%. Cuando el estndar de calibracin requerido no es fcil de obte-
ner, como probablemente sea el caso para un radionucleido de vida corta, pero ha estado disponible en algn momento pre-
vio a la ejecucin de la valoracin para determinar la eficiencia del sistema de conteo del radionucleido a analizar, emplear un
sistema de conteo calibrado siempre que el contenido de impurezas radionuclidicas de la muestra cumpla los requisitos esta-
blecidos para el mtodo de comparacin directa. Si los requisitos de cualquiera de los dos primeros mtodos no se pueden
cumplir, emplear el mtodo para determinacin de la actividad a partir de una curva de calibracin.
Con excepcin del primer mtodo, se realiza un seguimiento de los sistemas de conteo empleados para verificar la estabili-
dad. Este requisito se cumple mediante verificaciones diarias con una fuente de larga vida para verificar el funcionamiento y
verificaciones semanales con al menos tres fuentes que cubran una gama amplia de energas de emisin de rayos gamma (por
ejemplo, s1co, mcs y 60(o). Si se encuentra una discrepancia en cualquiera de las medidas antedichas, recalibrar completa-
mente el sistema o reparar y recalibrar el sistema antes de volver a usarlo.
Valoracin por Comparacin Directa con un Estndar de Calibracin-Para este procedimiento no se requiere un siste-
ma de medicin selectiva de energa (por ejemplo, un analizador de altura de pulso). Se emplea una cmara de ionizacin o
un sistema integral de conteo con un detector de Nal(TI). Para obtener resultados exactos es esencial un factor de geometra
reproducible de manera constante de muestra a muestra. Tomando precauciones adecuadas, la exactitud de este mtodo se
aproxima a la exactitud con la cual se determina la velocidad de desintegracin del estndar de calibracin.
Determinar la velocidad de conteo del sistema de detectores para un estndar de calibracin del radionucleido a valorar (por
ejemplo, suficientemente activo para dar estadsticas confiables de medicin dentro de un lapso razonable, pero no tan activo
como para causar problemas graves de tiempo muerto), seleccionando un estndar que permita una exactitud ptima con el
equipo especfico utilizado. Colocar una alcuota exactamente medida de la muestra desconocida a valorar (diluida, si fuera
necesario) en un recipiente idntico al usado para el estndar y medir la muestra aproximadamente al mismo tiempo y bajo las
mismas condiciones geomtricas que el estndar. Si el tiempo transcurrido entre las mediciones del estndar de calibracin y
la muestra excede las 12 horas, verificar la estabilidad del sistema de medicin dentro de las 8 horas a partir del momento en
que se midi la muestra, con una fuente de larga vida para verificacin del funcionamiento. Registrar la respuesta del sistema
734 (821) Radioactividad/ Pruebas Fsicas USP 39

con respecto a la misma fuente de verificacin en el momento de la calibracin y, si las verificaciones posteriores exceden la
respuesta original registrada en ms de 3%, recalibrar el sistema. Corregir ambas determinaciones de actividad por radiacin
de fondo y calcular la actividad, en Ci por mL, por la frmula:

SD(g/b)
en donde S es la concentracin Ci del estndar; D es el factor de dilucin; y g y b son los valores medidos de la velocidad de
conteo para la muestra y el estndar, respectivamente.
Valoracin con un Sistema de Conteo Integral Calibrado-Se aplican el procedimiento y las precauciones mencionadas
para el mtodo anterior de comparacin directa, excepto que se debe determinar y registrar la eficiencia del sistema de detec-
tores para cada radionucleido que se desea analizar, en lugar de registrar simplemente la velocidad de conteo del estndar. Por
lo tanto, la eficiencia para un radionucleido determinado, x, se determina por ex = bxf sx, en donde bx es la velocidad de con-
teo, corregida por radiacin de fondo y tiempo muerto, para el estndar de calibracin del radionucleido, x, y sx es la actividad
correspondiente al estndar de calibracin certificado en transformaciones nucleares por segundo. Para valoraciones posterio-
res de la muestra, la actividad est dada por la frmula:

Ax= Dgxfex

en donde Des el factor de dilucin, gx es la velocidad de conteo de la muestra (corregida por la radiacin de fondo y el tiem-
po muerto) y ex es la eficiencia correspondiente para el radionucleido.
Determinacin de la Actividad a Partir de una Curva de Calibracin-La versatilidad en las mediciones de intensidad
absoluta de rayos gamma puede lograrse mediante un anlisis de altura de pulso en canales mltiples. La eficiencia de un siste-
ma de deteccin para fotopicos puede determinarse como una funcin de la energa de los rayos gamma a travs de una serie
de muestras de estndares de emisores de rayos gamma; la velocidad de emisin de rayos gamma de un radionucleido para el
cual no se disponga de ningn estndar puede determinarse por la interpolacin en la curva de eficiencia. Sin embargo, es
necesario definir la curva de eficiencia para el sistema de deteccin adecuadamente sobre la regin total de inters, usando un
nmero suficiente de puntos de calibracin a lo largo del eje de energa del fotopico.
Seleccin de un Equipo de Conteo-Para la identificacin de radionucleidos que emiten rayos X o gamma en su desintegra-
cin se emplea un espectrmetro de rayos gamma. Los requisitos para un equipo apropiado para la identificacin y valoracin
de los radionucleidos empleados en productos radiofarmacuticos son: (a) que la resolucin del detector basada en el fotopico
de 137 Cs- 137mBa de 662-keV sea 8,0% o mejor, (b) que el detector cuente con un soporte de muestra diseado para facilitar la
repeticin exacta de la geometra de conteo y (c) que el analizador de altura de pulso tenga canales suficientes para delinear
claramente el fotopico bajo observacin.
Procedimiento--Los requisitos mnimos para el mantenimiento de las calibraciones del instrumento son verificaciones sema-
nales de funcionamiento con una fuente apropiada de referencia y una recalibracin semestral completa. Si la verificacin de
funcionamiento semanal se desva del valor determinado en el momento de la calibracin en ms de 4,0%, debe recalibrarse
totalmente el instrumento.
Este mtodo se divide en tres pasos bsicos: la integracin del fotopico, la determinacin de la curva de eficiencia para foto-
picos y el clculo de la actividad de la muestra.
INTEGRACIN DEL FOTOPICO-EI mtodo para determinar el rea de un fotopico utiliza una aproximacin gausiana para el
ajuste del fotopico. Puede obtenerse una fraccin fija del nmero total de conteos del fotopico tomando el ancho del pico, a, a
una fraccin del mximo donde se ha determinado experimentalmente que la forma es muy cercana a la gausiana y multipli-
cndolo por el canal de conteo mximo, P, despus de corregir por contribuciones por el efecto Compton y la radiacin de
fondo. Por lo general, esta radiacin de fondo puede determinarse correctamente mediante una interpolacin lineal. Este pro-
cedimiento se ilustra en la Figura 2.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (821) Radioactividad 735

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Fig. 2 Espectro Tpico de Rayos Gamma que muestra la Seleccin del Canal de Conteo Mximo, P, despus de la Correccin
por Contribuciones por el Efecto Compton y la Radiacin de Fondo.

La curva del fotopico adopta una forma cercana a una lnea recta a 0,606P y la contribucin al valor de a de los canales
fraccionarios puede calcularse exactamente por interpolacin. Calcular a por la ecuacin:

a= D' - D + [(d - 0,606P)/(d - c)] + [(d' - 0,606P)/(d' - c')]

en donde c y d y tambin c' y d' son los canales de conteo individuales a cada lado de 0,606P y D y D' son los nmeros de los
canales (ubicacin) de d y d', respectivamente. La posicin de las variables requeridas sobre el fotopico se ilustra en la Figura 3.

--1-'------~1--- 0,606 p
ow
....
z
o(.J
w
e ! .J
llIJ
e
;:
~
~

d. 0,606 p d' 0,606 p

-d--c- ~

ENERGA-

Fig. 3 Ubicacin de las Variables Requeridas para la Determinacin del Ancho del Pico, a, a 0,606P.

A partir de los valores conocidos de velocidad de conteo P en el canal de conteo mximo del fotopico y el ancho del pico
0,606P, a, se obtiene una fraccin calibrada del rea del fotopico a partir del producto, (aP).
Para resumir los procedimientos utilizados para obtener una fraccin calibrada del rea del fotopico empleando este mto-
do, las etapas o clculos necesarios se detallan paso a paso a continuacin:
(1) Restar del fotopico que se desea medir cualquier contribucin por efecto Compton y radiacin de fondo.
(2) Determinar la velocidad de conteo P del canal de conteo mximo (mxima velocidad de conteo del canal despus de
restar el valor Compton y la radiacin de fondo).
(3) Multiplicar P por 0,606 y ubicar la lnea horizontal correspondiente al ancho del pico, a.
(4) Obtener el ancho del pico, a, asignando los valores de las variables (obtenidos segn se muestra en la figura precedente)
en la ecuacin correspondiente para calcular a.
(5) La fraccin calibrada del rea del pico es igual al producto de a por P o F = aP, en donde F es un rea fraccionaria del
pico proporcional a la velocidad de emisin de la fuente.
736 (821) Radioactividad / Pruebas Fsicas USP 39

Este mtodo proporciona un medio rpido y exacto para determinar la velocidad de emisin de los rayos gamma de las
fuentes mientras que evita, en gran medida, las estimaciones subjetivas de la forma detallada de las colas de Jos picos. El error
debido al empleo de Ja mxima velocidad de conteo del canal, en lugar del canal de conteo mximo terico, es del orden de
1,0% si a es 6 o mayor.
CALIBRACIN DE LA EFICIENCIA DEL FOTOPICO-Los radionucleidos como los listados en la tabla siguiente junto con algunos de
sus datos de desintegracin nuclear, se encuentran disponibles como estndares certificados de referencia.* Debe seleccionarse
un nmero suficiente de fuentes radioactivas de referencia estndar para obtener la curva de calibracin en el intervalo desea-
do. En lo posible, se deben incluir fuentes estndar de los radionucleidos que se desean analizar.
Propiedades Nucleares de los Estndares de Calibracin Selecclonados<l,Z)
Fotones
Energa por 100
Emisiones de Fotones Principales (keV) Desintegraciones
13 3Ba (T112 = 10,5 aos)
K1 30,97 63,4
K2 30,62 34,2
Kn 35,0 22,8
y, 53,15 2,14
y, 79,62 2,55
y, 80,99 33,0
Y< 276,39 6,9
Y1 302,83 17,8
Y 356,0 60,0
Yo 383,85 8,7
137Cs-137mBa (T,,, = 30, 1 7 aos)
KN, 32,19 3,82
KN, 31,82 2,07
KR 36,4 1,39
Media Ponderada(4) (32,9) (7,28)
Y1 661,6 89,98
22Na (T,,, = 2,60 aos)
hv 511 179,80(5)
y, 1274,54 99,94
60Co (T112 = 5,27 aos)
Y1 1173,2(6) 100,0
Y2 1332,5(6) 100,0
s1co (T112 = 270,9 das)
LXK 7,0 56,0
Y1 14,4 9,5
y, 122,06 85,51
y, 136,47 10,60
Media Ponderada (125,0) (96, 11)
(y,+ y,)(4)

54 Mn (Tw = 312,7 das)

LXK 6,0 25,0
y, 834,83 99,98
109cd-109Ag (T,, 2 = 464 das)
(l) En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoracin, la radiacin fluorescente de blindaje de plomo (especficamente, rayos X -76 ke V por
K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiacin; una manera satisfactoria
de absorber esta radiacin es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con
cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor.
<2> Por lo general, slo se incluyen aquellas emisiones del fotn que tienen ~1 % de abundancia.
<3) la notacin K se refiere a emisiones de rayos X.
<4 ) Se proporcionan las energas medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de Nal(TI).
(S) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen.
(6) Cascada.

Se pueden obtener estos estndares de referencia certificados del Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST, por sus siglas en ingls), Washington, DC
20234.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (821) Radioactividad 737

Propiedades Nucleares de los Estndares de Calibracin Seleccionados< 12) (Continuacin)

Fotones
Energa porlOO
Emisiones de Fotones Principales (ke V) Desintegraciones
K,,1 22,16 35,3
Ka2 21,99 18,6
Ka 24,9 11,4
Media Ponderada(4) 63,5
Y1 88,0 3,72
1291(T, 12 = 1,57 x 10 7 aos)
K (3) 29,78 37,0
'nl

Ka2 29,46 20,0

KR 13,2 37,0
Y1 39,58 7,52
Media Ponderada<4l (31,3) (77,80)
(l) En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoracin, la radiacin fluorescente de blindaje de plomo (especficamente, rayos X -76 ke Vpor
K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiacin; una manera satisfactoria
de absorber esta radiacin es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con
cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor.
( 2 ) Por lo general, slo se incluyen aquellas emisiones del fotn que tienen ;> 1o/o de abundancia.
<3) La notacin K se refiere a emisiones de rayos X.
(4) Se proporcionan las energas medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de Nal(TI).
(S) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen.
<6l Cascada.

Calcular la velocidad de emisin de rayos gamma por la ecuacin:

r = A,b

en donde A, es la actividad, en desintegraciones por segundo, del estndar usado y bes el nmero de rayos gamma por desin-
tegracin a ese nivel de energa. Medir con exactitud cantidades de soluciones estndar de cada radionucleido en recipientes
idnticos y determinar el rea fraccionaria del fotopico (F) para cada uno de los estndares.
Empleando la ecuacin EP = F/, calcular la eficiencia del fotopico, EP y construir una grfica log-log de EP en funcin de la
energa de rayos gamma como se muestra en la Figura 4.

1,0 1 1 1
~~
~

_,
--..;;;:
~
1 1 1 1
1
1 1 1 1 1
~.

0,5 \\ ' "'~ POZO DE 3x3;

' 1/2 x 1 1/2 pulgadas

o
(.)
\'\'\ ~ \

o::
...J
w
\' \.'\ ~ ::i;i
\ \
\
1\
o -e~
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(.)
w 0,2
\\ ~
\
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1'111'\ l\.l'..-3x3_
en
!\~ \ r'-3x2
z
~
V
a: POZO DE 1 3/4 X 2;
~
~
1- i'o-2x2
~ 518 X 1 1/2 pulgadas
\
< 1\.
(.)
zw
0,1
"" \.
3Xi-

\.
: \
w o
0,05
CRISTALES SLIDOS: FUENTE A 9,3 cm

0,02
--------
CRISTALES DE POZO: FUENTE EN EL POZO
~

-- ---

0,1 0,2 0,5 1,0 2,0

ENERGIA (Mev)

Fig. 4. Curvas Tpicas de Calibracin de la Eficiencia de Fotopicos para Varios Detectores de Nal(TI).

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA MUESTRA-De la misma manera que en la preparacin de la curva de calibracin, deter-
minar el rea fraccionaria (F) del fotopico principal de la muestra valorada o una alcuota medida con exactitud ajustada al
738 (821) Radioactividad / Pruebas Fsicas USP 39

mismo volumen en un recipiente idntico al usado para los estndares. A partir de la curva de calibracin, determinar el valor
de eP para este radionucleido. Empleando la ecuacin r = F/ep, calcular la velocidad de emisin de los rayos gamma (r). Calcu-
lar la actividad (A), en desintegraciones por segundo, de la muestra empleando la ecuacin A= {r/b)(D), en donde bes el
nmero de rayos gamma por desintegracin y D es el factor de dilucin. Para obtener la actividad, en Ci o mCi, dividir A por
3,7 x 10 4 3,7 x 10 7, respectivamente. La relacin anterior es igualmente vlida para la obtencin de la actividad de una
muestra no diluida o una cpsula; en este caso, el factor de dilucin, D, es la unidad.

(823) FRMACOS PARA TOMOGRAFA DE EMISIN DE POSITRONES

PARA USO EN PREPARACIONES MAGISTRALES, INVESTIGACIN
CLNICA Y ESTUDIOS CIENTFICOS

INTRODUCCIN

Los radionucleidos usados para la tomografa de emisin de positrones {TEP) a menudo tienen vidas medias fsicas cortas,
T112 (p.ej., T, 12 de iso = 2,03 min, 62Cu = 9,67 min, BN = 9,96 min, 11c = 20,4 min, 6BGa = 67,7 min, 1sF = 109,8 min, 64Cu =
12,7 h). Como resultado, estos radionucleidos a menudo se obtienen mediante tcnicas de aceleracin de partculas (p.ej.,
ciclotrones) o en generadores, y luego se procesan para fabricar el producto farmacutico terminado para TEP, muy cerca del
sitio donde se llevar a cabo el procedimiento de TEP.
Las cortas vidas medias de los radionucleidos para TEP derivan en limitaciones nicas para la preparacin y anlisis de pro-
ductos farmacuticos para TEP. Este captulo describe guas para la elaboracin y anlisis de productos farmacuticos para TEP,
basndose en las siguientes limitaciones:
No es posible completar todo el anlisis antes de usar los productos farmacuticos para TEP.
Un solo vial puede contener una partida o subpartida completa de producto farmacutico para TEP. Las muestras retira-
das para el anlisis de control de calidad (CC) son representativas de toda la partida o subpartida.
Una partida o subpartida completa puede administrarse a un nico paciente.
La masa del frmaco para TEP en un producto farmacutico para TEP a menudo se encuentra en cantidades que varan
desde nanogramos hasta microgramos.
Los productos farmacuticos para TEP no entran en una cadena de distribucin de medicamentos tradicional, sino que
estos se usan internamente o se entregan en el lugar de uso por servicios de distribucin especializados.
Las instalaciones de produccin a pequea escala para la preparacin de productos farmacuticos para TEP cuentan con
personal y recursos limitados, los cuales requieren lo siguiente:
- Facilitar la realizacin de operaciones mltiples en un rea con controles adecuados;
- Facilitar la fabricacin y el anlisis de mltiples productos farmacuticos para TEP usando equipo compartido;
- Requerimientos apropiados para operaciones aspticas;
- Requerimientos apropiados para la aptitud del equipamiento y dems actividades en el da de uso;
- Requisitos de control de calidad para componentes, materiales e insumos;
- Autoverificacin de etapas importantes en la produccin de radionucleidos, produccin de frmacos para TEP o pre-
paracin magistral y anlisis; y
- Supervisin de la produccin y preparacin magistral, revisin de registros de partida y autorizacin para la libera-
cin por parte de una sola persona.
El alcance de este captulo incluye la produccin y preparacin magistral de productos farmacuticos para TEP para adminis-
tracin en humanos para su uso (a) de conformidad con la prctica mdica y farmacutica regulada por el estado, (b) de con-
formidad con una solicitud de nuevo frmaco en investigacin aprobada {IND, por sus siglas en ingls) (ver el Ttulo 21 del
CFR 312) y (c) de conformidad con los requisitos para uso en estudios cientficos bajo la supervisin de un Comit de Estudios
Cientficos para Frmacos Radioactivos (Radioactive Drug Research Committee o RDRC; ver el Ttulo 21 del CFR 361 ). El alcan-
ce de este captulo no incluye actividades de dispensacin conforme a lo definido en otros captulos generales de la USP.

DEFINICIONES
Las siguientes definiciones se aplican a los trminos y frases empleados en este captulo.
Actividad Especfica: La radioactividad de un radionucleido por unidad de masa del elemento o compuesto. La unidad de
actividad especfica se expresa en unidades de radioactividad por unidad de masa en gramos o en moles, (p.ej., mCi/g
[MBq/g], Ci/mmol [GBq/mmol]).
Certificacin del Fabricante: Documentacin que incluye, entre otros, certificados de anlisis, certificados de cumpli-
miento o certificados de calidad obtenidos del fabricante, proveedor o vendedor de un material o componente, el cual
describe las caractersticas de calidad crticas usadas para determinar la aceptabilidad de uso.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones 739

Concentracin: La concentracin de radioactividad del frmaco para TEP en el producto farmacutico para TEP por uni-
dad de volumen, determinada al momento de la calibracin. La unidad de concentracin es la cantidad de radioactividad
por unidad de volumen al momento de la calibracin (p.ej., mCi/mL [MBq/mL]).
Control de Calidad (CC): Sistema para analizar la calidad de los componentes, materiales, insumos y productos farma-
cuticos para TEP mediante procedimientos, pruebas, mtodos analticos y criterios de aceptacin.
Frmaco para TEP: Sustancia radioactiva (ingrediente farmacutico activo) que presenta ncleos inestables de desintegra-
cin espontnea mediante la emisin de positrones y que se incorpora en un producto farmacutico para TEP para produ-
cir un efecto directo en el diagnstico o seguimiento de una enfermedad o manifestacin de una enfermedad en huma-
nos, o para el seguimiento del tratamiento de una enfermedad o procedimientos teraputicos (p.ej., terapia para tumo-
res).
Fuera de la Especificacin (OOS, por sus siglas en ingls): Resultado de la prueba de control de calidad para un pro-
ducto farmacutico para TEP que no cumple con los criterios de aceptacin establecidos.
Garanta de Calidad (GC): Sistema planeado para asegurar, mediante procedimientos, pruebas y mtodos analticos,
que un producto farmacutico para TEP posee la identidad, concentracin, calidad y pureza requeridos para el propsito
esperado.
Liberacin Condicionada Final: Se refiere a una liberacin final para administracin en pacientes antes de haber comple-
tado las pruebas requeridas debido a una falla del equipo analtico.
Liberacin de Lnea: Segregacin y limpieza de diferentes reas de procesamiento y trabajo para evitar la contaminacin
cruzada y las mezclas entre la produccin y/o la preparacin magistral de diferentes productos farmacuticos para TEP.
Lote: Cantidad de materiales (p.ej., reactivos, disolventes, gases, columnas de purificacin y dems materiales auxiliares)
que tienen un carcter y calidad uniformes dentro de los lmites especificados y que se usan para fabricar un producto
farmacutico para TEP.
Partida: Cantidad de producto farmacutico para TEP que se supone tiene un carcter y calidad uniformes, dentro de los
lmites especificados, y que se prepara en un solo ciclo operativo de acuerdo con una o ms rdenes de produccin.
Preparacin Magistral: Conforme a lo descrito en la Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos, (Food, Drug and
Cosmetic Act) (1997) Captulo 11, Seccin 121 (a) (ii) (1) (B), se refiere a la prctica de sintetizar o formular un producto
farmacutico para TEP, por parte o por orden de un profesional acreditado por un Estado para preparar magistralmente o
para ordenar la preparacin magistral de un producto farmacutico para TEP, y que se prepara magistralmente de confor-
midad con la ley de dicho Estado, para un paciente o con propsitos de estudios cientficos, de enseanza o de control de
calidad.
Producto Farmacutico para TEP: Forma farmacutica terminada que contiene un frmaco para TEP, sin importar si se
encuentra o no en asociacin con uno o ms ingredientes.
Produccin: Proceso de sntesis o formulacin de un producto farmacutico para TEP que incluye procesamiento, envasa-
do, etiquetado, reprocesamiento y anlisis para investigacin mdica o estudios cientficos.
Subpartida: Cantidad de producto farmacutico para TEP con carcter y calidad uniformes, dentro de los lmites especifi-
cados, que se produce durante una sucesin de irradiaciones mltiples, usando una operacin de sntesis o purificacin
determinada. Un grupo de subpartidas forman colectivamente una partida que se supone cuenta con un carcter y cali-
dad uniformes, dentro de los lmites especificados. Las subpartidas pueden ser necesarias para productos farmacuticos
para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas (p.ej., 13 N y 15 0) debido a que no es posible completar las pruebas de
control de calidad antes de su uso.
Validacin: Confirmacin mediante evidencia documental de que un mtodo, proceso o sistema cumple con los requisi-
tos de desempeo esperados.
Verificacin: Confirmacin de que un mtodo, proceso o sistema establecido cumple con los criterios de aceptacin pre-
determinados.

PERSONAL

Se debe contar con un nmero suficiente de personal con educacin, capacitacin y experiencia apropiadas para la prepara-
cin y anlisis de productos farmacuticos para TEP. El nmero depende del tamao y la complejidad de las operaciones efec-
tuadas en cada instalacin.
Requisitos de Capacitacin: Se debe capacitar al personal antes de que comience a fabricar y a analizar productos farma-
cuticos para TEP. La capacitacin se puede llevar a cabo mediante diversos mtodos, que incluyen la instruccin presencial, la
instruccin audiovisual y el estudio de publicaciones. La capacitacin debe tratar, pero no limitarse a, tcnicas de produccin
de radionucleidos, mtodos de sntesis y purificacin, materiales, componentes, reactivos, soluciones madre, aparatos automa-
tizados y manuales usados para fabricar productos farmacuticos para TEP, as como mtodos de ce, incluyendo equipos, soft-
ware y documentacin. La capacitacin se debe documentar.
Capacitacin en Operaciones Aspticas: La capacitacin debe tratar las manipulaciones aspticas y las tcnicas y equipos
usados para lograr y mantener las condiciones ambientales Clase 5 de la lnternational Organization far Standardization (ISO). La
capacitacin tambin debe tratar todas las operaciones aspticas, incluyendo el ensamble de componentes estriles, la prepa-
racin magistral y el filtrado. Las manipulaciones de soluciones estriles deben ser llevadas a cabo por operadores calificados
para el uso de tcnicas aspticas (ver Instalaciones y Equipo a continuacin).
740 (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones/ Pruebas Fsicas USP 39

Se debe evaluar peridicamente al personal implicado en operaciones aspticas mediante simulaciones aspticas en las que
se utilice medio de crecimiento microbiolgico para evaluar la calidad de la operacin asptica. Las simulaciones aspticas de-
ben cumplir con lo siguiente:
Incluir todas las manipulaciones requeridas para el montaje asptico del ensamble del vial de producto farmacutico para
TEP (p.ej., vial, filtro y ensamble de jeringa, entre otros).
Representar los casos ms extremos para operaciones aspticas.
Deben realizarse por triplicado para calificar a un nuevo operador. Cada operador debe someterse anualmente a una reca-
lificacin mediante por lo menos un llenado de medios.
Se debe realizar siempre que se presenten cambios significativos en los procedimientos.
Despus del proceso de simulacin, los medios deben estar exentos de contaminacin despus de la incubacin a una tem-
peratura adecuada durante 14 das. Un operador que no apruebe las evaluaciones escritas o cuyas simulaciones aspticas pre-
senten crecimiento microbiano deber ser inmediatamente reinstruido y reevaluado a fin de asegurar la correccin de las defi-
ciencias en su prctica asptica.

GARANTA DE CALIDAD

La GC es un concepto amplio que abarca todos los aspectos que influyen en la identidad, concentracin, calidad y pureza
de un producto farmacutico para TEP. El control de calidad es un subconjunto de la GC que trata el anlisis de materiales y de
productos farmacuticos para TEP para determinar si cumplen con los criterios de aceptacin. La funcin de la GC por lo gene-
ral consiste en actividades de supervisin, mientras que la funcin del control de calidad se basa en actividades de ejecucin.
Las funciones del control de calidad incluyen lo siguiente.
Evaluar cada lote de material entrante para asegurar que cumple con las especificaciones establecidas antes de su uso en
la preparacin o anlisis de productos farmacuticos para TEP.
Evaluar cada partida de un producto farmacutico para TEP para asegurar que sta cumple con las especificaciones esta-
blecidas antes de autorizar su liberacin final.
Las funciones de supervisin relacionadas con la GC incluyen lo siguiente:
Revisar los registros de partida una vez completos para verificar su exactitud y que estn completos.
Aprobar procedimientos, especificaciones, procesos y mtodos.
Asegurar que el personal est apropiadamente capacitado y calificado, segn corresponda.
Asegurar que los productos farmacuticos para TEP posean una identidad, concentracin, calidad y pureza suficientemen-
te definidos.
Asegurar que los cambios en la calidad de los componentes, proveedores, cambios en los procedimiento de produccin y
los cambios en los procedimientos de anlisis y especificaciones sean apropiados y que se implementen de manera corres-
pondiente.
Investigar errores y asegurar que se tomen las acciones correctivas y de prevencin correspondientes para prevenir su re-
currencia.
Gestin de quejas.
Asegurar que la produccin, anlisis, etiquetado, liberacin y distribucin de los productos farmacuticos para TEP se lle-
ven a cabo de conformidad con los procedimientos y prcticas establecidos en la instalacin para productos farmacuti-
cos para TEP.
Llevar a cabo auditoras peridicas para monitorear el cumplimiento de los procedimientos y prcticas establecidos para
productos farmacuticos para TEP.
El personal de la instalacin puede ejercer funciones tanto de GC como de CC.

INSTALACIONES V EQUIPO

Las instalaciones deben ser adecuadas para la produccin, preparacin magistral y anlisis de productos farmacuticos para
TEP. Las reas de trabajo deben mantenerse organizadas para evitar contaminacin cruzada, mezclas y errores, especialmente
en las reas usadas para la fabricacin de mltiples productos farmacuticos para TEP. El personal debe limpiar las reas de
trabajo peridicamente para prevenir la contaminacin de equipos, materiales, componentes o productos farmacuticos para
TEP o aquellas condiciones del entorno, que pudieran tener un impacto negativo sobre la calidad del producto farmacutico
para TEP. Estos requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio rutinario de
los mismos.
Controles Ambientales para Productos Farmacuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas
de esterilidad para productos farmacuticos parenterales para TEP se obtienen despus de la liberacin, las instalaciones y
equipos deben salvaguardar la esterilidad de un producto farmacutico para TEP.
Estacin de Trabajo Asptica-El control ambiental primario para operaciones aspticas es un filtro de partculas del aire de alta
eficiencia (HEPA, por sus siglas en ingls) capaz de producir aire con un nivel de limpieza ISO Clase 5. Esto se puede lograr con
una estacin de trabajo con flujo de aire laminar, aislador asptico, cabina de seguridad biolgica u otro dispositivo adecuado
(reciben el nombre genrico de estaciones de trabajo aspticas). La estacin de trabajo asptica debe estar protegida de fuen-
tes de contaminacin microbiana y se debe situar en un rea en la que el trnsito de personal sea limitado. El rea circundante
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones 741

a la estacin de trabajo asptica no debe usarse para el almacenamiento de materiales que desprendan grandes cantidades de
partculas (p.ej., cajas corrugadas).
La operacin adecuada de la estacin de trabajo asptica se debe certificar midiendo las partculas en el aire, analizando la
integridad del filtro HEPA, analizando la presin diferencial, o por otros medios. Las pruebas especficas a realizar dependen del
tipo de estacin de trabajo asptica. La certificacin debe llevarse a cabo al inicio de las operaciones y, posteriormente, por lo
menos una vez al ao o despus de reparar o reemplazar el filtro HEPA. Estos requisitos reemplazan cualquier otro requisito
provisto en los captulos de informacin general de la USP (p.ej., Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesa-
miento Asptico (1116)).
El rea de trabajo dentro de la estacin de trabajo asptica debe estar limpia. Las superficies internas deben ser fciles de
limpiar y desinfectar. Las superficies internas se deben limpiar y desinfectar usando desinfectantes apropiados esterilizados por
filtracin o con certificacin de esterilidad demostrada mediante certificado del fabricante.
Pruebas Microbiolgicas-Se deben llevar a cabo pruebas microbiolgicas del ambiente para evaluar la calidad del aire y la de-
sinfeccin de la superficie de las reas aspticas. Esto se puede lograr mediante placas de muestreo por sedimentacin o con
placas activas para muestreo de aire. La desinfeccin de superficies crticas (p.ej., la superficie de trabajo de la estacin de tra-
bajo asptica o los dedos del operador) se debe evaluar con un hisopo o placas de contacto. Para el anlisis microbiolgico de
la estacin de trabajo asptica, se debe analizar el aire como parte de la calificacin de la estacin de trabajo (p.ej., semestral-
mente), mientras que la superficie se debe evaluar (usando un hisopo o placas de contacto) despus de su uso, cada da de
uso. Los recuentos de partculas no viables se pueden determinar con menor frecuencia despus de la certificacin de la Esta-
cin de Trabajo Asptica (ver anteriormente).
Se deben establecer lmites de alerta e intervencin para muestras obtenidas durante las pruebas microbiolgicas. Los niveles
de alerta tpicos se establecen a menos de tres unidades formadoras de colonias (ufc) por placa. Ms de tres ufc requieren
acciones correctivas que pueden incluir la recapacitacin del operador, recertificacin de la estacin de trabajo asptica u otras
acciones. Los resultados de las pruebas microbiolgicas tambin deben usarse para la investigacin de pruebas de esterilidad
positivas.
Equipo: El equipo usado para fabricar y analizar productos farmacuticos para TEP debe ser apropiado para el propsito al
que se destina y se debe instalar, limpiar y mantener de la manera correspondiente. El equipo debe ser capaz de producir re-
sultados uniformes.
Los siguientes requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio de los mis-
mos.
1 . Instalacin de Equipo Nuevo-El equipo recin instalado debe ser calificado con suficiente detalle antes de usarlo en la fa-
bricacin o anlisis de productos farmacuticos para TEP, basndose en la complejidad del equipo. Todas las actividades
de calificacin deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona que llev a ca-
bo la calificacin. Para equipos ms complejos, la calificacin consiste en tres fases:
Calificacin de la Instalacin (Cl)-La CI es una verificacin de los puntos requeridos para la instalacin apropiada del
equipo, los cuales incluyen ubicacin fsica, servicios e insumos requeridos, interfases y condiciones ambientales. La
CI debe describir el procedimiento de instalacin para el equipo.
Calificacin Operativa (CO)-La CO es una verificacin de las especificaciones operativas del equipo, las cuales inclu-
yen configuracin del equipo, pruebas de funcionalidad de subsistemas y la operacin general adecuada. La CO de-
be describir los procedimientos operativos para el equipo.
Calificacin del Desempeo (CD)-La CD demuestra que el equipo es capaz de realizar las tareas requeridas para la
fabricacin y anlisis de productos farmacuticos para TEP en el ambiente operativo y que el equipo proporciona los
resultados pretendidos. La CD debe describir las tareas que el equipo debe desempear.
2. Calibracin del Equipo-La calibracin del equipo analtico se debe llevar a cabo antes de su uso, segn corresponda. Se
debe desarrollar un programa de recalibracin que cuente con una frecuencia suficiente para asegurar resultados exactos.
Las actividades de calibracin deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona
que llev a cabo la calibracin.
3. Mantenimiento Preventivo del Equipo-Se debe desarrollar un programa de mantenimiento preventivo para equipo impor-
tante de produccin y anlisis, incluyendo mdulos de anlisis qumicos automatizados, cromatgrafos de gases, croma-
tgrafos de lquidos de alta resolucin, entre otros. El programa debe contar con una frecuencia suficiente para minimizar
el tiempo de inactividad del equipo. Las reparaciones serias pueden requerir recalibracin y recalificacin. Las actividades
de mantenimiento preventivo deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha de la accin y el nombre
de la persona que la llev a cabo.
Limpieza de Equipos y Componentes: El equipo usado en la produccin o preparacin magistral de productos farmacuti-
cos para TEP incluye dispositivos automatizados controlados por computadoras, as como aparatos de operacin manual. An-
tes de su uso en la fabricacin de productos farmacuticos para TEP, el equipo debe limpiarse de manera apropiada para ase-
gurar que el producto farmacutico para TEP resultante cumpla con las especificaciones establecidas de identidad, concentra-
cin, calidad y pureza (ver Controles y Criterios de Aceptacin para Productos Farmacuticos para TEP Terminados a continuacin).
Una vez limpio, el equipo debe mantenerse en dicho estado antes de su uso.
Es posible utilizar el equipo para fabricar mltiples partidas de uno o ms productos farmacuticos para TEP. Por lo que se
debe demostrar mediante estudios documentados la efectividad de los procesos de limpieza entre partidas. Se deben controlar
todas las impurezas a niveles que cumplan con las especificaciones establecidas para identidad, concentracin, calidad y pure-
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za. Los procedimientos escritos para la liberacin de lneas entre partidas de diferentes productos farmacuticos para TEP de-
ben describir la realizacin de los procesos de limpieza.
Verificaciones en el Da de Uso: Son necesarias ciertas verificaciones en el da de uso para asegurar el funcionamiento apro-
piado del equipo de procesamiento. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos para las verificaciones en el da de
uso. Estos procedimientos deben estar diseados para verificar parmetros clave al inicio de cada ciclo de operaciones (p.ej.,
temperatura, integridad de la presin, suministro de gas, suministro de vaco, seleccin de lnea de entrega apropiada, vol-
menes de entrega de reactivos, velocidades de flujo de gases, monitores de radiacin y dems sensores del proceso). Algunos
parmetros pueden verificarse peridicamente como parte de los programas de calibracin y mantenimiento preventivo, se-
gn se describi anteriormente.
Aptitud del Sistema para Equipo de CC: Las pruebas de aptitud del sistema para el equipo de CC son necesarias para ase-
gurar que el conjunto de equipo, sus componentes y el personal operador (es decir, el sistema considerado como un todo)
funcionen apropiadamente para ejecutar el mtodo analtico deseado. Las pruebas de aptitud del sistema se deben realizar
antes de usar el equipo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos
para las pruebas de aptitud del sistema, y se deben documentar los resultados de dichas pruebas.
Las pruebas de aptitud del sistema requeridas para mtodos cromatgraficos incluyen factor de asimetra, inyecciones repe-
tidas y resolucin. Cuando el cromatograma de prueba usado para la aptitud del sistema contiene un nico pico, entonces el
factor de asimetra, las inyecciones repetidas y la eficiencia de la columna (platos tericos) son suficientes. Para estas determi-
naciones, es necesario el uso de estndares internos o externos con una concentracin conocida. Los estndares deben prepa-
rarse a partir de materiales bien caracterizados o materiales certificados por el fabricante. A continuacin se presentan dos en-
foques aceptables que se pueden usar para mtodos cromatogrficos:
1. Crear una curva de calibracin a partir de una serie de estndares en un intervalo de concentraciones conocidas. Las con-
centraciones de los estndares deben comprender las condiciones de uso para el mtodo cromatogrfico. La curva de ca-
libracin se debe utilizar durante un periodo adecuadamente especificado (p.ej., seis meses), despus del cual se debe
crear una nueva curva de calibracin. Se debe crear una nueva curva de calibracin cada vez que se altere el sistema cro-
matogrfico. La aptitud del sistema de rutina para inyecciones repetidas consiste en una sola inyeccin de un estndar
conocido y una medicin de la concentracin basada en la curva de calibracin. Si la concentracin medida concuerda
con la concentracin conocida dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10% para inyecciones manuales y 5% para in-
yecciones automatizadas) esto demuestra la aptitud del sistema en inyecciones repetidas y asegura que la curva de cali-
bracin es apropiada para su uso en inyecciones de muestra subsiguientes. El factor de asimetra y la resolucin (o eficien-
cia de la columna, segn corresponda) se deben determinar a partir del mismo cromatograma.
2. Al inicio de cada ciclo de anlisis, crear una calibracin de un solo punto, a partir de dos inyecciones de un estndar cono-
cido. El rea medida de los picos para estas inyecciones debe concordar dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10%
para inyecciones manuales y 5% para inyecciones automatizadas). Posteriormente, los resultados se promedian y utilizan
con la concentracin estndar para proporcionar un factor de calibracin que se usa en inyecciones de muestra subsi-
guientes para ese da. El factor de asimetra y la resolucin (o eficiencia de la columna, segn corresponda) se deben de-
terminar a partir de uno de los dos cromatogramas.
Otros parmetros cromatogrficos, tales como la relacin seal-ruido, el lmite de deteccin y el lmite de cuantificacin, se
pueden determinar como parte de un anlisis rutinario de la aptitud del sistema.
Las pruebas de aptitud del sistema tambin pueden ser apropiadas para otro equipo de CC, incluyendo calibradores de do-
sis, escneres para radio-cromatografa en capa delgada (radio-TLC) y analizadores multicanal. Cuando se utilizan, estas prue-
bas deben realizarse al momento de instalar, reubicar y, posteriormente, en intervalos apropiados. En estas pruebas, se deben
usar estndares conocidos para demostrar el funcionamiento apropiado del equipo, por ejemplo:
1. Calibrador de Dosis-La exactitud, geometra y linealidad se deben evaluar al momento de la instalacin y, posteriormen-
te, en intervalos apropiados. El instrumento debe calibrarse de conformidad con estndares reconocidos a nivel nacional o
con las instrucciones del fabricante. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificacin de cons-
tancia con una fuente de radionucleidos de alta energa adecuada.
2. Escner para Radio-TLC-La unformidad, exactitud posicional, linealidad del detector y resolucin se deben evaluar con
una fuente de radionucleido adecuada. La prueba de aptitud del sistema de rutina debe incluir verificaciones para estos
parmetros.
3. Analizador Multicanal-La sensibilidad y la resolucin se deben evaluar al momento de la instalacin y, posteriormente, en
intervalos apropiados. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificacin de constancia con una
fuente de radionucleidos de alta energa adecuada.

CONTROL DE COMPONENTES, MATERIALES E INSUMOS

Se deben controlar los componentes, materiales e insumos que se usan en la preparacin de productos farmacuticos para
TEP para evitar la contaminacin, mezclas y errores. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas
actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de exmenes y pruebas completados para
componentes, materiales e insumos se deben conservar durante un ao despus de su vencimiento o durante un ao despus
de la liberacin del lote, lo que represente el periodo ms largo. Es necesario establecer y llevar a cabo las siguientes activida-
des:
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1. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentracin, calidad y pureza de ingredientes, reactivos, materia-
les diana y gases.
2. Establecer especificaciones escritas para la identidad y calidad de viales vacos estriles, lneas de transferencia, llaves de
paso estriles, agujas estriles, filtros de membrana estriles y otros componentes usados en el ensamble del vial del pro-
ducto farmacutico para TEP.
3. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentracin, calidad y pureza de insumos analticos (p.ej., disol-
ventes, columnas cromatogrficas y estndares autnticos), medios de pruebas de esterilidad y reactivos para pruebas de
endotoxinas usados en el anlisis de productos farmacuticos para TEP.
4. Establecer condiciones de almacenamiento apropiadas (basadas en calor, luz, humedad y otros factores) para componen-
tes, materiales e insumos usados para fabricar y analizar productos farmacuticos para TEP.
5. Almacenar componentes, materiales e insumos en un rea con acceso controlado, de acuerdo con las condiciones de al-
macenamiento establecidas. Segregar componentes, materiales e insumos, segn corresponda, para evitar mezclas y erro-
res.
6. Anotar cada lote de envo de componentes, materiales e insumos, y registrar la fecha de recepcin, cantidad recibida,
fabricante, nmero de lote del fabricante y fecha de caducidad. Si el fabricante no designa una fecha de caducidad, asig-
nar una basndose en el conocimiento de sus propiedades fsicas y qumicas y en la experiencia de uso previa. Para sustra-
tos orgnicos y reactivos que son potencialmente susceptibles a la degradacin o a cambios en su composicin, la fecha
de caducidad se debe basar en la estabilidad del material.
7. Determinar que cada lote de componentes, materiales e insumos cumple con las especificaciones escritas establecidas. El
cumplimiento de las especificaciones se puede demostrar inspeccionando el etiquetado o inspeccionando la certificacin
del fabricante. La identidad de cada lote de componentes, materiales e insumos debe ser verificada mediante procedi-
mientos y pruebas definidas, o con la certificacin documentada del fabricante, segn corresponda. Realizar una prueba
de identidad para precursores (p.ej., determinacin del punto de fusin u otras pruebas adecuadas). Como alternativa, se
puede usar la certificacin del fabricante como el nico criterio de aceptacin para un precursor, si se asegura mediante el
anlisis del producto farmacutico para TEP que se ha utilizado el precursor correcto. Los estndares de referencia usados
en los procedimientos cromatogrficos deben contar con documentacin adecuada sobre identidad y pureza. Se pueden
aceptar otros componentes basndose nicamente en la certificacin del fabricante.
8. Los filtros de membrana usados con productos farmacuticos parenterales para TEP deben contar con la certificacin del
fabricante. Examinar la certificacin del fabricante para cada lote a fin de asegurar el cumplimiento de la especificaciones
escritas.
9. Los medios usados en las pruebas de esterilidad de productos farmacuticos para TEP se pueden obtener de fuentes co-
merciales. Si los medios se obtienen de fuentes comerciales, entonces la prueba de promocin de crecimiento que emplea
una sola especie de organismo adecuada se debe llevar a cabo durante la calificacin inicial del proveedor y, en adelante,
peridicamente (p.ej., trimestralmente).

CONTROLES DE PROCESO Y OPERATIVOS

Controles de Proceso: Los siguientes controles de proceso deben establecerse y resumirse en una frmula maestra para el
producto farmacutico para TEP. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas actividades se lle-
ven a cabo y se completen de manera apropiada.
1. Se deben establecer criterios de aceptacin escritos para la identidad, concentracin, calidad y pureza de cada producto
farmacutico para TEP. Para productos farmacuticos para TEP destinados para administracin parenteral, las especifica-
ciones deben incluir esterilidad y endotoxinas bacterianas. Cuando existe una monografa de la USP o cuando existen es-
pecificaciones previamente aceptadas por la agencia reglamentaria correspondiente (p.ej., FDA), entonces estos estnda-
res, si corresponde, pueden utilizarse como los criterios de aceptacin mnimos.
2. Los procedimientos escritos para la preparacin de cada producto farmacutico para TEP deben incluir lo siguiente:
Incorporar, para cada producto farmacutico para TEP destinado para administracin parenteral, filtracin por mem-
brana estril (0,22 m) o esterilizacin por vapor;
Incorporar, para cada producto farmacutico para TEP destinado para inhalacin, filtracin de partculas (0,45 m);
Describir procedimientos de limpieza de rutina para el equipo y las instalaciones;
Describir componentes, materiales e insumos usados para fabricar productos farmacuticos para TEP, incluyendo pre-
cursores, estndares, reactivos, soluciones madre y artculos relacionados;
Describir el proceso y los pasos empleados para fabricar el producto farmacutico para TEP;
Describir el proceso de formulacin, incluyendo el uso de estabilizadores, soluciones amortiguadoras y otros agentes;
Describir los clculos realizados para parmetros cuantitativos relacionados con la fabricacin y el anlisis de CC del
producto farmacutico para TEP (p.ej., incluir rendimiento radioqumico, pureza radioqumica, actividad especfica,
cantidades de disolvente, etc.);
Describir pruebas de control de calidad para el producto farmacutico final para TEP (ver Controles y Criterios de Acep-
tacin para Productos Farmacuticos para TEP Terminados a continuacin), incluyendo un programa que defina las
pruebas que se deben realizar para cada partida y que indique si los resultados deben estar completados al momento
de la liberacin.
744 (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones/ Pruebas Fsicas USP 39

3. Se debe verificar la calidad de cada partida de un producto farmacutico para TEP, mediante el anlisis del producto ter-
minado total, antes de su uso para asegurar que el producto cumple con todas las especificaciones.
4. Para los casos en los que no sea posible o prctico llevar a cabo el anlisis descrito en el prrafo anterior, la calidad de un
producto farmacutico para TEP tambin se puede asegurar mediante estudios de validacin documentados, en lugar de
pruebas previas a la liberacin. Estos estudios deben cumplir con lo siguiente:
Demostrar que el proceso es uniforme y adecuado para la preparacin del producto farmacutico para TEP deseado;
Realizarse en tres partidas fabricadas de acuerdo con la frmula maestra, en donde todas estas partidas deben cum-
plir con los criterios de aceptacin;
Incluir la evaluacin de identidad y pureza radioqumica, identidad y pureza radionuclidica, actividad especfica, es-
terilidad (para productos farmacuticos parenterales para TEP), endotoxinas bacterianas (para productos farmacuti-
cos parenterales para TEP), pH, apariencia, pureza estereoqumica (para compuestos aplicables), disolventes residua-
les, otros productos qumicos txicos que pudieran haberse usado durante el procedimiento de sntesis o purifica-
cin, concentracin efectiva de un estabilizante (si lo hubiere), pureza qumica del producto farmacutico para TEP y
equivalencia de subpartidas iniciales y finales (ver la seccin anterior, Definiciones);
Repetirse si el proceso y los pasos descritos en la frmula maestra han sido alterados de alguna manera que pudiera
cambiar la identidad, concentracin, calidad o pureza del producto farmacutico para TEP;
5. Los procesos y pasos descritos en la frmula maestra deben actualizarse segn se requiera y revisarse anualmente para
asegurar su vigencia. Antes de implementar cualquier actualizacin, ser necesario llevar a cabo y aprobar una validacin
y/o verificacin.
Los controles apropiados de los equipos controlados por computadora deben asegurar que los cambios en el proceso sean
instituidos nicamente por personal autorizado y que tales cambios sean documentados y verificados. Es indispensable crear
copias de seguridad y controlar los mtodos de produccin, preparacin magistral y anlisis para evitar el uso accidental de
mtodos desactualizados. En lo que respecta a procesos o mtodos de prueba de un proveedor que se usan sin alteraciones, es
aceptable basarse en la certificacin del proveedor para la verificacin del software y la operacin adecuada.
Controles Operativos: Los controles operativos siguientes deben establecerse y resumirse en un registro de partida que es
una parte de la frmula maestra para el producto farmacutico para TEP. El registro de partida debe documentar de manera
adecuada el proceso de rutina para la fabricacin del producto farmacutico para TEP. Se debe designar a una persona como
responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de partida
completados y la documentacin relacionada deber conservarse durante un ao despus de la liberacin de partida.
1. Se deben ejecutar los procedimientos de liberacin de lnea adecuados para evitar mezclas y contaminacin cruzada, que
incluyan la inspeccin de reas usadas para fabricar y analizar productos farmacuticos para TEP y la inspeccin de la lim-
pieza y aptitud de todo el equipo antes de su uso. Retirar materiales y etiquetas que no correspondan a la partida de estas
reas y equipos.
2. Asegurar la identidad, concentracin, calidad y pureza correctos de componentes, materiales e insumos usados en la pre-
paracin del producto farmacutico para TEP. Etiquetar componentes segn corresponda para propsitos de identidad y
rastreabilidad.
3. Ejecutar procedimientos de limpieza de rutina para los equipos e instalaciones.
4. Preparar el producto farmacutico para TEP de acuerdo con la frmula maestra vigente y mantener un registro de partida
para cada partida. Los registros de partida pueden constar de documentacin en papel, registros electrnicos o una com-
binacin de los mismos. Se deben verificar las planillas de clculo y dems herramientas electrnicas para conservacin de
registros, a fin de asegurar la rastreabilidad, integridad de los datos, exactitud de resultados para clculos, entre otros. El
registro de partida debe incluir lo siguiente:
Los nmero de lote u otros identificadores nicos para todos los componentes, materiales e insumos usados para fa-
bricar el producto farmacutico para TEP;
Una descripcin de los procedimientos individuales realizados;
Las iniciales, firma u otro identificador del individuo responsable de confirmar que se hayan completado los pasos y
procesos crticos usados para fabricar y analizar el producto farmacutico para TEP;
El rendimiento porcentual calculado con respecto a la cantidad conocida o esperada del radionucleido inicial que se
incorpora sintticamente al producto farmacutico para TEP;
Los datos analticos brutos de cada partida de producto farmacutico para TEP;
Etiquetado para el producto farmacutico para TEP (ver Etiquetado a continuacin);
Clculos para parmetros clave definidos en la frmula maestra;
Resultados obtenidos de las pruebas de control de calidad del producto farmacutico para TEP, incluyendo cromato-
gramas, listados impresos y dems datos de prueba;
Las iniciales del analista que realiz cada prueba de control de calidad;
Indicacin del resultado de cada prueba de control de calidad, indicando si el resultado cumple o no con los criterios
de aceptacin;
La fecha y hora de la liberacin y la firma del individuo que asume la responsabilidad general y el cumplimiento con
los procedimientos definidos para fabricar la partida y que autoriza la liberacin de la partida para administracin en
humanos; y
Documentacin de las desviaciones del proceso en el registro de partida, cuando corresponda.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones 745

Las entradas en los registros de partida se deben realizar inmediatamente despus de haber llevado a cabo la actividad y
deben incluir las iniciales, firma u otro identificador de la persona que registra la entrada. Las correcciones a las entradas en
papel deben incluir fechas e iniciales, firmas o anotaciones con un identificador de la persona que efecta las correcciones pero
dejando la entrada original legible.
Operaciones Aspticas para Productos Farmacuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas
de esterilidad para productos farmacuticos parenterales para TEP se obtienen despus de la liberacin para administracin en
humanos, las operaciones y procedimientos aspticos deben asegurar de manera adecuada la esterilidad del producto farma-
cutico para TEP estril. Todos los productos farmacuticos para TEP preparados aspticamente para administracin parenteral
se deben filtrar a travs de un filtro de membrana estril con un tamao de poro de 0,22 m o menor en un vial o envase
cerrado estril o esterilizado mediante esterilizacin por vapor. Aunque la sntesis qumica de un producto farmacutico paren-
teral para TEP se puede llevar a cabo en un aparato abierto o cerrado, la filtracin por membrana del producto farmacutico
para TEP se debe realizar en un sistema cerrado posterior al filtro de membrana. Este sistema se debe ensamblar aspticamen-
te, usando componentes preesterilizados, disponibles comercialmente.
Componentes-Los componentes estriles usados en el aparato ensamblado aspticamente, por lo general, consisten en un vial
vaco, agujas, filtros de membrana, agujas de venteo, jeringas, sistemas de tubos, llaves de paso, entre otros. Todos los compo-
nentes deben ser artculos preesterilizados disponibles comercialmente y de un solo uso. Si los componentes del aparato en-
samblado aspticamente se esterilizan en la instalacin donde se lleva a cabo la TEP, se deben verificar los procesos de esterili-
zacin. La configuracin exacta del ensamble del vial de producto farmacutico para TEP depende de cada proceso. Un ejem-
plo tpico es un vial vaco, estril, con un filtro de membrana con un tamao de poro de 0,22 m, unido a una aguja que se
inserta a travs del septo del vial para filtracin, un filtro de membrana con un tamao de poro de 0,22 m unido a una aguja
que se inserta a travs del septo del vial para ventear el vial durante la filtracin, y una jeringa con una aguja insertada a travs
del septo del vial para retirar la muestra de control de calidad despus de completar la filtracin.
Ensamble del Vial de Producto Farmacutico para TEP-Se deben usar tcnicas aspticas en el ensamblaje del vial de producto
farmacutico para TEP, especialmente en el ensamble de todos los componentes subsiguientes al filtro de esterilizacin por
membrana. Estas operaciones deben llevarse a cabo en un ambiente ISO Clase 5 (ver la seccin anterior, Instalaciones y Equi-
po).
Despus de ensamblar el vial de producto farmacutico para TEP en el ambiente ISO Clase 5, el ensamble puede ser retirado
hacia otra localizacin para filtracin. Esta ubicacin puede ser un ambiente no controlado siempre que no se comprometa
durante el proceso la integridad del ensamble del vial de producto farmacutico para TEP. Todo ensamble de vial de producto
farmacutico para TEP cuya integridad se vea comprometida durante dicho proceso, deber ser desechado.
Tcnicas Aspticas-Cualquier componente estril posterior al filtro de membrana que entre en contacto con el producto far-
macutico para TEP, deber manipularse usando tcnicas aspticas adecuadas, dentro de la estacin de trabajo asptica. Du-
rante las operaciones aspticas, los operadores deben usar vestimentas adecuadas, que incluyen una bata de laboratorio lim-
pia, mangas para antebrazos, cubre cabello, guantes higienizados que cubran las muecas y cubrebarbas/bigote (segn co-
rresponda). Durante un solo ciclo operativo asptico es posible preparar mltiples ensambles de viales de productos farmacu-
ticos para TEP. Las condiciones de almacenamiento y el tiempo de ensamble de los viales debe basarse en datos obtenidos de
simulaciones aspticas.
Inoculaciones para Pruebas de Esterilidad-Se deben llevar a cabo pruebas de esterilidad para evaluar la calidad de los productos
farmacuticos para TEP destinados para administracin parenteral. La inoculacin de los medios para pruebas de esterilidad se
debe realizar de tal manera que se ajuste a los requisitos de exposicin del personal a la radiacin, al tiempo que minimice el
riesgo de falsos positivos ocasionados por contaminacin adventicia durante el proceso de inoculacin. Para tubos de medios
con abertura mediante tapa de rosca, la inoculacin se debe realizar en la estacin de trabajo asptica. Los tubos de medios
con una tapa de septo se pueden inocular en un rea blindada que no contenga un filtro HEPA.

ESTABILIDAD

Se deben establecer especificaciones escritas para la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento de cada pro-
ducto farmacutico para TEP. La fecha de caducidad debe basarse en los resultados de las pruebas de estabilidad (y en requisi-
tos de actividad especficos, segn corresponda). Las pruebas de estabilidad del producto farmacutico para TEP se deben lle-
var a cabo a la concentracin ms alta del producto farmacutico para TEP y en el vial o envase final previsto. Se deben alma-
cenar por lo menos tres partidas del producto farmacutico para TEP de acuerdo con las condiciones propuestas y debern
examinarse una vez transcurrido un periodo equivalente a la vida til propuesta. Asimismo, el producto farmacutico para TEP
debe cumplir con los criterios de aceptacin para pureza radioqumica, apariencia (color y claridad), pH y efectividad del esta-
bilizante (segn corresponda) y pureza qumica al momento de la caducidad. Los mtodos analticos deben ser confiables, sig-
nificativos y especficos. Los estudios de estabilidad deben repetirse si se presenta un cambio en la concentracin, en el conte-
nido de estabilizante (o conservante) que pudiera afectar la estabilidad, el vial o envase final, las condiciones de almacena-
miento o la fecha de caducidad. Se deben documentar los resultados de las pruebas de estabilidad.
746 (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones/ Pruebas Fsicas USP 39

CONTROLES Y CRITERIOS DE ACEPTACIN PARA PRODUCTOS FARMACUTICOS PARA TEP

TERMINADOS

Se deben establecer especificaciones escritas para la identidad, concentracin, calidad y pureza de cada producto farmacu-
tico para TEP. Para productos farmacuticos para TEP destinados para administracin parenteral, se deben incluir especificacio-
nes sobre esterilidad y endotoxinas bacterianas.
Se deben desarrollar procedimientos escritos para pruebas de control de calidad. Se deben establecer requisitos sobre con-
trol de calidad y documentacin para cada partida o subpartida de un producto farmacutico para TEP (ver la seccin anterior,
Controles de Proceso y Operativos). Todas las pruebas de control de calidad deben ser ejecutadas por personal calificado y capa-
citado de acuerdo con los procedimientos escritos.
La corta vida media de los radionucleidos para TEP con frecuencia impide completar todas las pruebas de control de calidad
antes del envo del producto farmacutico para TEP, lo que genera dos niveles de liberacin, uno para distribucin y el otro
para administracin en humanos. Lo anterior es aceptable siempre y cuando las pruebas de control de calidad requeridas para
la liberacin del producto farmacutico para TEP para administracin en humanos (ver a continuacin) se completen antes de
la administracin. Los controles usados en la liberacin para distribucin debern establecerse previamente por escrito y docu-
mentarse de manera rutinaria. No es necesario conservar muestras de reserva de productos farmacuticos para TEP.
Cuando se usa un procedimiento farmacopeico de la USP, ste deber ser verificado para demostrar que la prueba funciona
en las condiciones de uso reales. Los procedimientos de prueba no farmacopeicos usados para analizar un producto farmacu-
tico para TEP deben ser confiables y especficos. Los datos que respaldan todos los mtodos analticos deben estar documenta-
dos. Algunas pruebas de control de calidad se pueden omitir basndose en datos obtenidos de controles realizados durante el
proceso o de estudios realizados sobre el proceso. Un ejemplo de este tipo de procedimiento es la exencin de la determina-
cin de clorodesoxiglucosa cuando se analiza PF]fludesoxiglucosa. Se deben documentar los controles durante el proceso y
los datos que respaldan los estudios realizados sobre los procesos.
Pruebas de Control de Calidad: Las siguientes pruebas de control de calidad se deben llevar a cabo en cada partida antes
de su liberacin para adminstracin:
1. Apariencia mediante inspeccin visual del color y transparencia (ausencia de partculas) para formas farmacuticas paren-
terales.
2. Medicin del pH para formas farmacuticas parenterales.
3. Determinacin de la pureza radioqumica e identidad para todas las formas farmacuticas.
4. Determinacin de la identidad radionuclidica de todas las formas farmacuticas por medicin de vida media.
5. Determinacin de la concentracin.
6. Determinacin de la actividad especfica de productos farmacuticos para TEP cuya localizacin sea dependiente de la
masa o cuya toxicidad sea preocupante.
7. Determinacin de disolventes residuales usados en los procesos de sntesis o purificacin.
8. Determinacin de la pureza qumica y compuestos residuales usados en los procesos de sntesis o purificacin (p.ej., el
criptando [2.2.2]).
9. Determinacin de conservante o estabilizante, si estuvieran presentes.
Para productos farmacuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas, preparar una subpartida inicial para control
de calidad que sea representativa de las subpartidas subsiguientes que se preparan en un ciclo operativo definido. Las pruebas
de control de calidad descritas en el prrafo anterior se deben tomar en cuenta para la subpartida de control de calidad antes
de la liberacin de subpartidas subsiguientes para administracin en humanos. Para partidas subsiguientes de formas farma-
cuticas parenterales y de inhalacin, se debe llevar a cabo una inspeccin visual antes de la administracin en humanos. En
algunos casos, puede ser apropiado realizar un anlisis limitado de cada subpartida antes de su administracin (p.ej., determi-
nacin de pH en el caso de [BN]amonaco producido por la aleacin de Devarda).
Pruebas Peridicas Indicadoras de Calidad: En todos los productos farmacuticos para TEP, se debe medir peridicamente
la pureza radionuclidica de muestras desintegradas del producto, a fin de evaluar la presencia de radionucleidos de vida larga
producidos durante el bombardeo con el acelerador de partculas. En productos farmacuticos para TEP marcados con ciertos
radionucleidos (p.ej., 94mTc, 124 1, 64 Cu, 76Br, entre otros), se deber considerar la medicin de pureza radionuclidica mediante
espectrometra por emisin de rayos gamma. Las pruebas peridicas indicadoras de calidad de productos farmacuticos para
TEP tambin incluyen impurezas no txicas de bajo nivel (p.ej., disolventes residuales Clase 3). Las pruebas peridicas deben
llevarse a cabo en intervalos predeterminados en lugar de partida por partida.
Pruebas Microbiolgicas para Productos Farmacuticos para TEP Estriles: Para productos farmacuticos para TEP desti-
nados para administracin parenteral, realizar las siguientes pruebas de control de calidad, adems de las descritas anterior-
mente:
1. Determinar la integridad del filtro de membrana. Las unidades de filtro usadas para esterilizar productos farmacuticos
para TEP deben someterse a las pruebas de integridad recomendadas por el fabricante, como por ejemplo, la prueba de
punto de burbuja. La prueba de integridad del filtro se realiza despus de completar la filtracin y antes de liberar el pro-
ducto farmacutico para TEP para administracin en humanos. En el caso de productos farmacuticos para TEP con
T, 12 < 1 O minutos, el producto farmacutico para TEP se puede liberar para administracin en humanos antes de comple-
tar la prueba de integridad del filtro. En este caso, la prueba debe completarse lo ms pronto posible, despus de la libe-
racin.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones 747

2. Efectuar una prueba de endotoxinas bacterianas en cada partida o subpartida de control de calidad de un producto far-
macutico para TEP. La prueba se puede llevar a cabo usando los procedimientos reconocidos en la USP (ver Prueba de
Endotoxinas Bacterianas (85)). Independientemente de la prueba que se utilice, sta debe iniciarse antes de la liberacin de
cada partida para administracin en humanos. Para productos farmacuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy
cortas, completar la prueba en la subpartida de control de calidad antes de la liberacin de subpartidas subsiguientes para
administracin en humanos. Luego de haber registrado el xito de una prueba de endotoxinas bacterianas en un produc-
to farmacutico para TEP en particular, slo ser necesario analizar la primera partida de cada da para dicho producto.
3. Efectuar una prueba de esterilidad en cada partida o en cada subpartida de control de calidad. La prueba de esterilidad
consiste en la inoculacin e incubacin de una muestra en cada uno de dos medios: caldo tripticasa de soja y tioglicolato
lquido. El volumen inoculado se puede ajustar para evitar prdidas excesivas debidas a la prueba de esterilidad (p.ej., O, 1
mL inoculados en 1O mL de medio). El periodo de incubacin para pruebas de esterilidad debe comenzar dentro de las
30 horas posteriores a la filtracin por membrana. Las muestras se pueden inocular inmediatamente despus de comple-
tar la filtracin por membrana, o se puede dejar que se deterioren en un rea blindada durante un mximo de 30 horas
antes de la inoculacin. Se permite exceder el periodo de 30 horas debido a fines de semana o das feriados siempre y
cuando se demuestre que dicha extensin no reduce de manera significativa la viabilidad de un organismo indicador ade-
cuado en la muestra. La prueba de esterilidad se puede llevar a cabo usando otros procedimientos reconocidos en la USP
(ver Pruebas de Esterilidad (71 )). Las muestras deben analizarse individualmente y no se pueden combinar. Una vez que se
haya establecido el registro de una prueba de esterilidad exitosa para un producto farmacutico para TEP en particular,
slo ser necesario analizar la primera partida preparada cada da para dicho producto farmacutico para TEP.
Pruebas de Liberacin Condicionada Final: Puede ser apropiado liberar condicionalmente una partida cuando no sea posi-
ble completar una prueba de control de calidad requerida para un producto farmacutico para TEP debido a una falla en el
equipo de anlisis. Los productos farmacuticos para TEP no pueden ser liberados sin determinar su identidad y pureza radio-
qumicas. La partida puede liberarse siempre que se cumplan las siguientes condiciones:
1. Revisar los datos histricos de control de calidad para evaluar la frecuencia de resultados fuera de la especificacin o fallas
relacionadas con la prueba de control de calidad. La liberacin condicionada es apropiada nicamente cuando los datos
histricos develan un registro de culminacin exitosa de la prueba de control de calidad.
2. Confirmar que los criterios de aceptacin se cumplen para todas las dems pruebas de control de calidad para la partida.
3. Conservar una muestra de la partida que es objeto de liberacin condicionada.
4. Corregir lo antes posible la falla del equipo de prueba.
5. Completar la prueba de control de calidad omitida en la muestra lo ms pronto posible, despus de que se haya corregi-
do la falla. Este ltimo paso no ser necesario si el resultado del control de calidad omitido es intrascendente una vez que
el producto farmacutico para TEP se haya desintegrado.
6. Si la muestra no pasa la prueba de control de calidad omitida, notificar inmediatamente al mdico o a la instalacin re-
ceptora que orden el producto farmacutico para TEP.
7. Documentar todas las acciones relacionadas con la liberacin condicionada del producto farmacutico para TEP, incluyen-
do la justificacin de la liberacin, los resultados de la prueba completada, as como cualquier notificacin y accin co-
rrectiva y preventiva que haya resultado del incidente.
Adems de la prueba de control de calidad terminada, otras determinaciones de laboratorio apropiadas pueden implicar lo
siguiente: anlisis durante el proceso de un atributo que sea equivalente al anlisis del producto terminado de dicho atributo;
monitoreo estadstico continuo del proceso; o una combinacin de estos procedimientos con el anlisis concluido de cada pro-
ducto farmacutico para TEP.

PRODUCTOS FARMACUTICOS PARA TEP QUE NO CUMPLEN CON LAS ESPECIFICACIONES

Cuando el resultado de una prueba de control de calidad para un producto farmacutico para TEP no cumple con los crite-
rios de aceptacin establecidos, el resultado se considera fuera de la especificacin. Un resultado fuera de la especificacin no
necesariamente significa que el producto farmacutico para TEP es fallido y que debe rechazarse, sino que se debe llevar a
cabo una investigacin para resultados fuera de la especificacin a fin de determinar si dicho resultado indica una falla real o
un error analtico.
Si la investigacin de los resultados fuera de especificacin determina que dicho resultado fue ocasionado por un error anal-
tico, se debe invalidar la prueba original. Si hay una impresin de los resultados de la prueba, se debe marcar dicho resultado
impreso como invlido, conservarlo en el registro de partida y repetir la prueba.
Si la investigacin de los resultados fuera de especificacin determina que dicho resultado fue una falla real, la partida debe-
r ser rechazada y no se podr liberar para administracin en humanos. Segregar la partida para evitar que sea utilizada. Inves-
tigar todas las fallas y documentar los resultados de acuerdo con los procedimientos escritos. La investigacin debe incluir, en-
tre otros elementos, la evaluacin de procesos, operaciones y registros de partidas previas, as como quejas y dems fuentes de
informacin pertinentes. De ser posible, se debe asignar una causa real o probable a la falla, adems de documentar las accio-
nes correctivas tomadas como resultado de la investigacin. Dependiendo de la naturaleza de la falla, el producto farmacuti-
co para TEP puede reprocesarse de acuerdo con los procedimientos escritos preestablecidos (ver la seccin Reprocesamiento a
continuacin).
748 (823) Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones/ Pruebas Fsicas USP 39

Cuando una prueba de esterilidad de un producto farmacutico para TEP presenta seales de crecimiento microbiano, el
resultado de la prueba se considera fuera de especificacin, por lo que deber ser investigado. Una vez completada la investi-
gacin, notificar de inmediato a todas las instalaciones receptoras si el producto no cumple con el criterio de esterilidad, inclu-
yendo los hallazgos microbiolgicos de la investigacin.

REPROCESAMIENTO

Si un producto farmacutico para TEP es rechazado debido a una falla real, la partida podra reprocesarse de acuerdo con los
procedimientos establecidos. Aunque resulta imposible describir todas las operaciones de reprocesamiento, a continuacin se
presentan algunos ejemplos:
Ajuste de pH;
Cuando se presente una prueba de integridad del filtro fallida, un segundo pasaje a travs de un filtro de membrana; y
Un segundo pasaje por una columna de purificacin para eliminar una impureza.
Cuando se reprocesa un producto farmacutico para TEP, la partida reprocesada debe someterse a pruebas para asegurar
que cumple con los criterios de aceptacin establecidos para el producto farmacutico para TEP antes de su liberacin para
administracin en humanos.

ETIQUETADO

La siguiente informacin debe aparecer en la etiqueta adherida al envase final del producto farmacutico para TEP:
El nombre del producto farmacutico para TEP, incluyendo la forma farmacutica;
El nmero de partida asignado; y
Declaraciones o smbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigacin clnica, radioactivo).
La siguiente informacin debe aparecer en el blindaje del producto farmacutico para TEP:
El nombre del producto farmacutico para TEP, incluyendo la forma farmacutica;
El nmero de partida asignado;
La fecha y hora de la calibracin;
Declaraciones o smbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigacin clnica, radioactivo);
La radioactividad total en MBq (o mCi) o la concentracin en MBq/mL (o mCi/mL) al momento de la calibracin, segn
corresponda;
Fecha y hora de caducidad;
Sustancias agregadas (p.ej., ingredientes inactivos del estabilizante);
El nombre del establecimiento productor donde se fabric el producto farmacutico para TEP o el nombre del distribui-
dor;
Cualquier otra advertencia aplicable (p.ej., "No usar si presenta turbidez o si contiene partculas" o etiquetado para uso
en investigacin clnica); y
Cualquier otra informacin relevante (si se requiere), como por ejemplo, condiciones de almacenamiento y vida media.

(831) NDICE DE REFRACCIN

El ndice de refraccin (n) de una sustancia es la relacin entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz en la
sustancia. Es valioso en la identificacin de sustancias y en la deteccin de impurezas.
La temperatura estndar en las determinaciones farmacopeicas es 25 pero a menudo las especificaciones en las monografas
individuales indican que es necesario calcular el valor del ndice de refraccin a 20. Es necesario ajustar y mantener la tempe-
ratura cuidadosamente ya que el ndice de refraccin vara considerablemente con la temperatura.
Los valores del ndice de refraccin indicados en esta Farmacopea son para la lnea D de sodio (doblete a 589,0 nm y 589,6
nm). La mayora de los instrumentos disponibles estn diseados para usarse con luz blanca pero estn calibrados para expre-
sar el ndice de refraccin con respecto a la lnea D de la luz de sodio.
El refractmetro Abb mide la gama de ndices de refraccin de los materiales farmacopeicos para los cuales se indican di-
chos valores. Se pueden utilizar otros refractmetros de igual o mayor precisin.
Para lograr la exactitud terica de 0,0001, es necesario calibrar el instrumento contra un estndar suministrado por el fabri-
cante y comprobar con frecuencia el control de temperatura y la limpieza del instrumento mediante la determinacin del ndi-
ce de refraccin de agua destilada, cuyos valores son 1,3330 a 20 y 1,3325 a 25.
 USP 39 Pruebas Fsicas / (841) Peso Especfico 749

(841) PESO ESPECFICO

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, la determinacin del peso especfico slo se aplica a
lquidos y, a menos que se especifique algo diferente, se calcula como el cociente entre el peso de un lquido en el aire a 25 y
el de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Si en la monografa individual se indica una temperatura, el peso
especfico es el cociente entre el peso del lquido en el aire a la temperatura indicada y el de un volumen igual de agua a la
misma temperatura. Si la sustancia es un slido a 25, determinar el peso especfico del material fundido a la temperatura indi-
cada en la monografa individual y referirse al agua a 25.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, la densidad se define como la masa de una unidad
de volumen de la sustancia a 25, expresada en kilogramos por metro cbico o en gramos por centmetro cbico (1 kg/m3 =
10-3 g/cm 3). Cuando se conoce la densidad, la masa se puede convertir a volumen o viceversa, mediante la frmula: volumen
= masa/densidad.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, usar el Mtodo /.

MTODO 1
Procedimiento-Seleccionar un picnmetro escrupulosamente limpio y seco que haya sido previamente calibrado median-
te la determinacin de su peso y el peso de agua recin hervida contenida en l a 25. Ajustar la temperatura del lquido apro-
ximadamente a 20 y llenar el picnmetro. Ajustar la temperatura del picnmetro lleno a 25, retirar todo exceso de lquido y
pesar. Cuando la monografa especifique una temperatura diferente a 25, los picnmetros llenos deben elevarse a la tempera-
tura de la balanza antes de ser pesados. Restar el peso de tara del picnmetro del peso llenado.
El peso especfico del lquido es el cociente que se obtiene al dividir el peso del lquido contenido en el picnmetro por el
peso del agua contenida en ste, ambos determinados a 25, a menos que en la monografa individual se especifique algo
diferente.

MTODO 11
El procedimiento incluye el uso del densmetro transductor oscilante. El aparato consiste en lo siguiente:
un tubo en forma de U, por lo general de vidrio de borosilicato, que contiene el lquido que se va a examinar;
un sistema de excitacin magnetoelctrico o piezoelctrico que hace oscilar al tubo como un oscilador en voladizo a una
frecuencia caracterstica que depende de la densidad del lquido que se va a examinar;
un medio para determinar el perodo de oscilacin (7), que el aparato puede convertir para arrojar una lectura directa de
densidad o que puede ser utilizado para calcular densidades a travs de las constantes A y B descritas ms adelante; y
un medio para determinar y/o controlar la temperatura del transductor oscilante que contenga el lquido que se va a pro-
bar.
El perodo de oscilacin es una funcin de la constante del resorte (e) y de la masa del sistema:

T2 = {{M/c) + [{p x V)/c]} x 4rr2

en donde pes la densidad del lquido que se va a analizar, Mes la masa del tubo y V es el volumen del tubo lleno.
La introduccin de dos constantes A= c/{4rr 2 x V) y B = (M/V), lleva a la ecuacin clsica del transductor oscilante:

p=Ax T2-B
El peso especfico del lquido se provee mediante la frmula:

PrL/PrwJ
en donde P!L! y Prw son las densidades del lquido y del agua, respectivamente, ambas determinadas a 25, a menos que se
especifique algo diferente en la monografa individual.
Calibracin-Las constantes A y B se determinan al operar el instrumento con el tubo en forma de U llenado con dos mues-
tras diferentes con densidad conocida (p.ej., agua desgasificada y aire). Llevar a cabo las mediciones de control diariamente
usando agua desgasificada. Los resultados mostrados para la medicin de control usando agua desgasificada no se desvan del
valor de referencia {p25 = 0,997043 g/cm 3) ms all del error especificado. La precisin es una funcin de la capacidad de repe-
ticin y de la estabilidad de la frecuencia del oscilador. Los densmetros pueden obtener mediciones con un error del orden de
1xl0-3 g/cm3 a 1 xl o-s g/cm3 y una capacidad de repeticin de 1xl0-4 g/cm3 a 1xl0-6 g/cm3. Por ejemplo, un instrumento
especificado a 1xl0-4 g/cm 3 debe mostrar 0,9970 0,0001 g/cm 3 para poder usarse en mediciones posteriores o, de lo con-
trario, necesitar un ajuste. Se debe llevar a cabo la calibracin regular con materiales de referencia certificados.
Procedimiento-Seguir las instrucciones del fabricante para llevar a cabo mediciones empleando el mismo procedimiento
utilizado para la Calibracin. Si fuera necesario, equilibrar el lquido que ser examinado a 25 antes de introducirlo en el tubo
para evitar la formacin de burbujas y reducir el tiempo necesario para obtener la medicin. Los factores que afectan la preci-
sin incluyen los siguientes:
750 (841 ) Peso Especfico / Pruebas Fsicas USP 39

uniformidad de la temperatura en todo el tubo,

falta de linealidad en un rango de densidad,
efectos resonantes parsitos, y
viscosidad, si los densmetros transductores oscilantes empleados no proporcionan compensacin automtica para la in-
fluencia de la viscosidad de la muestra.

(846) REA SUPERFICIAL ESPECFICA

INTRODUCCIN
El rea superficial especfica de un polvo se determina mediante la adsorcin fsica de un gas sobre la superficie del slido,
calculando la cantidad de gas adsorbida que corresponde a una capa monomolecular en la superficie. La adsorcin fsica es el
resultado de fuerzas relativamente dbiles (fuerzas de van der Waals) entre las molculas del gas adsorbato y la superficie ad-
sorbente del polvo de prueba. Generalmente, la determinacin se lleva a cabo a la temperatura del nitrgeno lquido. La canti-
dad de gas adsorbido puede medirse por un procedimiento volumtrico o de flujo continuo.

TEORA DE BRUNAUER, EMMETT Y TELLER {BET) Y DETERMINACIN DE REA ESPECFICA

Medicin de Mltiples Puntos

Los datos se tratan segn la ecuacin de la isoterma de adsorcin de Brunauer, Emmett y Teller (BET):

p = presin parcial de vapor de gas adsorbato en equilibrio con la superficie a 77,4 K (punto de ebullicin del nitrgeno lquido),
en Pa,
Po = presin de saturacin del gas adsorbato, en Pa;
v. = volumen de gas adsorbido a temperatura y presin estndar (STP, por sus siglas en ingls) [273, 15 K y presin atmosfrica de
(1,013 x 1os Pa)], en ml;
vm = volumen de gas adsorbido a STP que produce una monocapa aparente en la superficie de la muestra, en ml;
e = una constante adimensionada relacionada con la entalpa de adsorcin del gas adsorbato sobre la muestra de polvo.

Se mide un valor de v. en cada uno de no menos de tres valores de P/P 0

Luego, el valor BET

se grafica en funcin de P/P 0 , conforme a la ecuacin (1 ). Este grfico debe producir una lnea recta en el intervalo de presin
relativo aproximado de 0,05 a 0,3. Los datos se consideran aceptables si el coeficiente de correlacin, r, de la regresin lineal
no es menor de 0,9975; es decir, r2 no es menor de 0,995. A partir de la grfica lineal resultante, la pendiente, que es igual a
(C - 1)/Vme y la interseccin, que es igual a 1/Vme, se evalan por anlisis de regresin lineal. A partir de estos valores, Vmse
calcula como 1/(pendiente+ interseccin), mientras que C se calcula como (pendiente/ interseccin) + 1. A partir del valor de Vm
as determinado se calcula el rea especfica, S, en mz g-1 , por la ecuacin:

S = (VmNa)/(m x 22 400) (2)

N = constante de Avogadro (6,022 x 1023 mol-1),

a = rea efectiva de seccin transversal de una molcula de adsorbato, en nanmetros cuadrados (O, 162 nm 2 para el nitr-
geno y O, 195 nm 2 para el criptn),
m = masa de polvo de prueba, en g
22400 = volumen, en ml, ocupado por 1 mol de qas adsorbato a STP, admitiendo pequeas desviaciones del estado ideal.

Es necesario un mnimo de tres datos. Se pueden llevar a cabo mediciones adicionales, especialmente cuando falta linealidad
a un valor P/P 0 cercano a 0,3. Como la no linealidad se obtiene a menudo con valores P/P0 por debajo de 0,05, no se reco-
miendan los valores en esta regin. La prueba de linealidad, el tratamiento de los datos y el clculo del rea superficial especfi-
ca de la muestra se han descrito anteriormente.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (846) rea Superficial Especfica 751

Medicin con un nico Punto

Normalmente se necesitan como mnimo tres mediciones de v., cada una a distintos valores de P/P 0 , para determinar el rea
superficial especfica mediante la tcnica de la adsorcin de gas por flujo dinmico (Mtodo /) o mediante la tcnica volumtri-
ca de adsorcin de gas (Mtodo 11). Sin embargo, bajo ciertas circunstancias que se describen a continuacin, puede ser acep-
table determinar el rea superficial especfica de un polvo con un nico valor de v. medido a un nico valor de P/P0 como por
ejemplo 0,300 (correspondiente a 0,300 moles de nitrgeno o a una fraccin molar de criptn de 0,001038), empleando la
siguiente ecuacin para calcular vm:

Luego se calcula el rea superficial especfica a partir del valor de Vm con la ecuacin (2) indicada anteriormente.
El mtodo de un nico punto puede emplearse directamente para una serie de muestras de polvo de un material dado
cuando la constante del material C es mucho mayor que la unidad. Estas circunstancias pueden verificarse por comparacin de
los valores de rea especfica determinados por el mtodo de un nico punto con los valores determinados por el mtodo de
puntos mltiples para una serie de muestras de polvo. La semejanza estrecha entre los valores obtenidos con un nico punto y
con mltiples puntos sugiere que 1 /C se aproxima a cero.
El mtodo de un nico punto puede emplearse indirectamente para una serie de muestras de polvo similares de un material
dado cuando la constante del material C no es infinita, pero se puede suponer que no vara. En estas circunstancias, el error
asociado al mtodo de un nico punto puede reducirse o eliminarse empleando el mtodo de puntos mltiples para evaluar C
para una de las muestras de las serie a partir del grfico de BET, en el cual C se calcula como (1 +pendiente /interseccin).
Luego se calcula Vm a partir del valor nico de v. medido a un nico valor de P/P 0 , por la ecuacin:
vm = v.[(Po/P)-1] [(l/C) + ((C -1)/C) X (P/Po)l (4)
Luego se calcula el rea especfica a partir del valor de Vm con la ecuacin (2) antedicha.

TCNICAS EXPERIMENTALES

Esta seccin describe los mtodos que se utilizan para la preparacin de la muestra, la tcnica de adsorcin de gas por flujo
dinmico (Mtodo /)y la tcnica volumtrica de adsorcin de gas (Mtodo 11).

Preparacin de la Muestra

DESGASIFICACIN

Antes de determinar el rea superficial especfica de la muestra, es necesario eliminar los gases y vapores adsorbidos fsica-
mente en la superficie despus de la fabricacin y durante el tratamiento, manipulacin y almacenamiento. Si no se logra la
desgasificacin, el rea superficial especfica podra reducirse o variar, puesto que parte de la superficie estara cubierta con
molculas de los gases o vapores previamente adsorbidos. Las condiciones de desgasificacin son de vital importancia para
obtener la precisin y la exactitud requeridas de las mediciones de rea especfica de sustancias farmacuticas debido a la sen-
sibilidad de la superficie de los materiales.
Se debe demostrar que las condiciones de desgasificacin proporcionan grficos BET reproducibles, un peso constante de
polvo de prueba y ningn cambio fsico o qumico detectable en el polvo de prueba.
Las condiciones de desgasificacin definidas por la temperatura, la presin y el tiempo deben elegirse de tal modo que la
superficie original del slido se reproduzca lo ms posible. Con frecuencia, la desgasificacin de muchas sustancias se logra
mediante la aplicacin de vaco o purgando la muestra en una corriente de un gas no reactivo, seco o aplicando un mtodo
de ciclos de desorcin y adsorcin. En cualquiera de los casos, algunas veces se aplican temperaturas elevadas para aumentar
la velocidad de eliminacin de los contaminantes desde la superficie. Se debe tener cuidado cuando se desgasifiquen muestras
de polvo con temperaturas elevadas, con el fin de evitar la degradacin de la muestra.
Si se emplea calor, la temperatura y el tiempo de desgasificacin recomendados deben ser tan bajos como sea posible para
lograr mediciones de rea superficial especfica reproducibles dentro de un plazo aceptable. Para desgasificar muestras sensi-
bles, se pueden emplear otros mtodos de desgasificacin, tal como el mtodo de los ciclos de desercin y adsorcin.

ADSORBATO

La tcnica estndar es la adsorcin de nitrgeno de calidad analtica a la temperatura del nitrgeno lquido.
Para polvos de rea superficial especfica pequea (<0,2 m2g-1), la proporcin adsorbida es pequea. En tales casos, se pre-
fiere usar criptn a la temperatura del nitrgeno lquido porque su baja presin de vapor reduce el error en gran medida. El
uso de cantidades mayores de muestra, cuando fuera posible (equivalentes a reas totales de 1 m 2 o mayores empleando ni-
trgeno), pueden compensar los errores para determinar reas pequeas.
Todos los gases empleados deben estar exentos de humedad.
752 (846) rea Superficial Especfica / Pruebas Fsicas USP 39

CANTIDAD DE MUESTRA

Medir con exactitud una cantidad de polvo de prueba desgasificado de forma tal que el rea de la superficie total sea como
mnimo de 1 m 2 cuando el adsorbato es nitrgeno y de 0,5 m 2 cuando el adsorbato es criptn.
Se pueden emplear cantidades menores de muestra despus de la validacin correspondiente.

Mediciones

Como la cantidad de gas adsorbido a una presin dada tiende a aumentar cuando disminuye la temperatura, las mediciones
de adsorcin por lo general se realizan a temperaturas bajas. Las mediciones se realizan a 77,4 K, el punto de ebullicin del
nitrgeno lquido.

Mtodo 1: Mtodo de Flujo Dinmico

PRINCIPIO

En el mtodo de flujo dinmico (ver Figura 1), el gas adsorbato recomendado es criptn o nitrgeno secos, mientras que se
emplea helio como gas diluyente, el cual no se adsorbe bajo las condiciones recomendadas.
Se requiere un mnimo de tres mezclas del gas adsorbato apropiado con helio dentro de un intervalo de P/P 0 entre 0,05 y
0,30.
El detector de gas-integrador debe proporcionar una seal que sea aproximadamente proporcional al volumen de gas que
lo atraviesa en condiciones definidas de presin y temperatura. Con este fin, entre los distintos tipos de dispositivos adecuados
se cuenta un detector de conductividad trmica con un integrador electrnico. Se determina un mnimo de tres puntos dentro
del intervalo recomendado de 0,05 a 0,30 de P/P 0

Argollas
de sello
Septo de
Conexin rpida autosellante

fr Flujmetro J
Vlvula
de control
='
o="
calibracin Vlvula
selectora
de paso Difusor
de flujo :.
"'
"'
.e
tram-
=
=:
;: Celda de Estacin
pa fri ::i.
o muestra de desga-
Controlador .... sificacin
de flujo "'' Balastro
diferencial
Vlvula de

::;
o
de paso
corto
Balastro
de paso
,._--._largo
encendido/
apagado
A B Venteo
Entrada
Detector Detector
de Gas

Figura 1. Diagrama esquemtico del aparato para el mtodo por flujo dinmico.

PROCEDIMIENTO

Se hace pasar una mezcla conocida de gases, por lo general nitrgeno y helio, a travs de una celda de conductividad trmi-
ca, nuevamente a travs de la muestra, a travs de la celda de conductividad trmica y posteriormente hasta un potencime-
tro registrador.
La celda de muestra se sumerge en nitrgeno lquido y la muestra adsorbe nitrgeno de la fase mvil. Esto desequilibra la
celda de conductividad trmica y se genera un pulso en la grfica del registrador.
Se retira la muestra del refrigerante; esto proporciona un pico de desorcin igual en rea y en direccin opuesta al pico de
adsorcin. Debido a que ste est mejor definido que el pico de adsorcin, es el que se emplea para la determinacin.
Para efectuar la calibracin, se inyecta en el sistema una cantidad conocida de adsorbato, suficiente para proporcionar un
pico de magnitud similar al pico de desorcin y se obtiene la proporcin de volumen de gas por unidad de rea de pico.
Para una determinacin en un nico punto se emplea una mezcla de nitrgeno y helio; y para la determinacin de puntos
mltiples se usan varias mezclas similares o mezclas previas de dos corrientes de gas.
Los clculos son los mismos que en el mtodo volumtrico.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (846) rea Superficial Especfica 753

Mtodo 11: Mtodo Volumtrico

PRINCIPIO

En el mtodo volumtrico (ver Figura 2), el gas adsorbato recomendado es nitrgeno, que puede acceder al espacio vaco
ubicado encima de la muestra de polvo previamente desgasificada para proporcionar una presin de equilibrio definida, P, del
gas. El empleo de un gas diluyente, tal como helio, es por lo tanto innecesario, a pesar de que el helio puede emplearse para
otros fines, como por ejemplo para medir el volumen muerto.
Dado que se emplea solamente gas adsorbato puro, en lugar de una mezcla de gases, al emplear este mtodo se evitan los
efectos de interferencia de la difusin trmica.

A las trampas fras

vaco y bombas de vaco
7.
8
Reservorio
de helio

Manmetro de
presin de vapor

Figura 2. Diagrama esquemtico del aparato para el mtodo volumtrico.

PROCEDIMIENTO

Colocar una cantidad pequea de nitrgeno seco en el tubo de la muestra para evitar la contaminacin de la superficie lim-
pia, retirar el tubo de la muestra, taparlo y pesarlo, y calcular el peso de la muestra. Conectar el tubo de la muestra al aparato
volumtrico. Cuidadosamente aplicar vaco sobre la muestra a la presin especificada (por ejemplo, entre 2 Pa y 1O Pa). Alter-
nativamente, algunos instrumentos se operan aplicando vaco a una velocidad definida de cambio de presin (por ejemplo,
menos de 1 3 Pa/30 s) y mantenindola durante un perodo de tiempo antes de comenzar el siguiente paso.
Si el principio de operacin del instrumento requiere la determinacin del volumen muerto en el tubo de la muestra, por
ejemplo, mediante la admisin de un gas no adsorbido, tal como helio, este procedimiento se lleva a cabo en este momento,
seguido de la aplicacin de vaco a la muestra. La determinacin del volumen muerto se puede evitar usando mediciones dife-
renciales: es decir, por medio de tubos de referencia y de muestra conectados mediante un transductor diferencial. Luego se
mide la adsorcin de nitrgeno gaseoso como se describe a continuacin.
Elevar el vaso Dewar que contiene nitrgeno lquido a 77,4 K hasta un punto definido en la celda de muestra. Dejar entrar
una cantidad suficiente de gas adsorbato para proporcionar la presin relativa deseada ms baja. Medir el volumen adsorbido,
v. Para mediciones de mltiples puntos, repetir la medicin de v. a valores P/P0 sucesivamente mayores. Cuando se utiliza
nitrgeno como gas adsorbato, los valores de P/P 0 de O, l O; 0,20 y 0,30 son a menudo adecuados.

Materiales de Referencia

Verificar peridicamente el funcionamiento del aparato empleando materiales de referencia apropiados de reas conocidas
que tengan un rea superficial especfica similar a la de la muestra que se debe examinar.
754 (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz/ Pruebas Fsicas USP 39

Eliminar lo siguiente:

(851) ESPECTROFOTOMETRA Y DISPERSIN DE LUZ

MEDICIONES EN EL ULTRAVIOLETA, VISIBL,E, INFRARROJO, ~BSORCIN ATMICA,

FLUORESCENCIA, TURBIDIMETRIA, NEFELOMETRIA V RAMAN
La espectrofotometra de absorcin es la medicin de una interaccin entre una radiacin electromagntica y las molculas o
tomos de una sustancia qumica. Las tcnicas que se emplean frecuentemente en el anlisis farmacutico incluyen la espec-
troscopia de absorcin atmica, en el espectro UV, en el visible y en el IR. La medicin espectrofotomtrica en la regin visible
anteriormente se denominaba colorimetra; sin embargo, es ms preciso emplear el trmino "colorimetra" slo en aquellos ca-
sos en que se considera la percepcin humana del color.
La Espectrofotometra de Fluorescencia es la medicin de la emisin de luz de una sustancia qumica cuando se expone a la
radiacin UV, visible u otra radiacin electromagntica. Por lo general, la luz emitida por una solucin fluorescente tiene una
intensidad mxima a una longitud de onda mayor que la de la radiacin de excitacin, por lo general en aproximadamente 20
30 nm.
La Dispersin de Luz implica la medicin de la luz dispersada debido a inhomogeneidades submicroscpicas de densidad p-
tica de las soluciones y es til para la determinacin de pesos moleculares promedio de sistemas polidispersos en el intervalo
de pesos moleculares que varan desde 1000 a varios cientos de millones. Dos de estas tcnicas utilizadas en el anlisis farma-
cutico son la turbidimetra y la nefelometra.
La Espectroscopia Raman (dispersin de luz inelstica) es un proceso de dispersin de luz en el que la muestra a examinar se
irradia con luz monocromtica intensa (generalmente luz lser) y luego se analiza la luz dispersada por Ja muestra para detec-
tar cambios de frecuencia.
El intervalo de longitud de onda disponible para estas mediciones se extiende desde las longitudes de onda corta del UV
hasta el IR. Por conveniencia, este intervalo espectral est aproximadamente dividido en el UV (190 a 380 nrn), el visible (380 a
780 nm), el IR cercano (780 a 3000 nm) y el IR (2,5 a 40 m o 4000 a 250 cm- 1).

UTILIDAD COMPARATIVA DE INTERVALOS ESPECTRALES

En el caso de muchas sustancias farmacuticas, las mediciones pueden hacerse con mayor exactitud y sensibilidad en las
regiones del UVy visible del espectro que en las del IR cercano e IR. Cuando se observan soluciones en celdas de 1 cm, las
concentraciones de aproximadamente 1 O g de muestra por ml a menudo producen absorbancias entre 0,2 y 0,8 en el UV o
la regin de luz visible. En el IR e IR cercano, pueden ser necesarias concentraciones de 1 a 1O mg por rnL y de hasta 100 mg
por mL, respectivamente, para que se produzca una absorcin suficiente; para estos intervalos espectrales, se utilizan celdas
con longitudes de 0,01 mm a ms de 3 mm.
Por lo general, los espectros UV y visible de las sustancias no tienen un alto grado de especificidad. Sin embargo, son muy
apropiados para realizar valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son tiles como medios adicionales de
identificacin.
Se ha observado un creciente inters en el uso de la espectroscopia del IR cercano en anlisis farmacuticos, especialmente
para la identificacin rpida de un gran nmero de muestras y tambin para la determinacin del agua.
La regin del IR cercano es especialmente apropiada para la determinacin de grupos -OH y-NH, como por ejemplo agua
en alcohol, -OH en presencia de aminas, alcoholes en hidrocarburos y aminas primarias y secundarias en presencia de aminas
terciarias.
El espectro IR es nico para cualquier compuesto qumico dado, con la excepcin de los ismeros pticos que tienen espec-
tros idnticos. Sin embargo, en algunas ocasiones, el polimorfismo puede ser responsable de una diferencia en el espectro IR
de un compuesto en estado slido. Con frecuencia, pequeas diferencias en la estructura producen diferencias significativas en
los espectros. Debido al gran nmero de valores mximos en un espectro de absorcin IR, a veces es posible medir cuantitati
vamente los componentes individuales de una mezcla con una composicin cualitativa conocida sin separacin previa.
El espectro Raman y el espectro IR proporcionan datos similares, aunque las intensidades de los espectros estn gobernadas
por diferentes propiedades moleculares. La espectroscopia Raman y la IR muestran diferentes sensibilidades relativas para dife-
rentes grupos funcionales; por ejemplo, la espectroscopia Rarnan es particularmente sensible a enlaces mltiples C-S y C-C y
algunos compuestos aromticos se identifican ms fcilmente mediante sus espectros Raman. El agua tiene un espectro de ab-
sorcin IR muy intenso, pero un espectro Raman particularmente dbil. En consecuencia, el agua tiene nicamente "ventanas"
limitadas en el IR, que se pueden utilizar para examinar solutos acuosos, mientras que su espectro Raman es casi completa-
mente transparente y til para la identificacin de solutos. Las dos limitaciones principales de la espectroscopia Raman son que
la concentracin mnima detectable de la muestra generalmente es de 10-1 M a 10-2 M y que las impurezas presentes en mu-
chas sustancias son fluorescentes e interfieren con la deteccin de la seal Raman dispersada.
Las mediciones de reflectancia ptica proporcionan informacin espectral similar a la obtenida por mediciones de transmi-
sin. Dado que las mediciones de reflectancia investigan slo la composicin superficial de la muestra, las dificultades asocia-
USP 39 Pruebas Fsicas / (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz 755

das con el espesor ptico y las propiedades de dispersin de luz de la sustancia se eliminan. De esta manera, frecuentemente
es ms sencillo realizar mediciones de reflectancia en materiales que absorben intensamente la radiacin. Una tcnica particu-
larmente comn empleada para las mediciones de .reflectancia IR se denomina reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas
en ingls}, tambin conocid com.o reflectancia interna mltiple (MIR, por sus siglas en ingls). En la tcnica de ATR, el haz del
espectrmetro IR se. hace pasar a travs de una ventana construida con un material apropiado para la radiacin IR (por ejem-
plo, KRS-5, una mezcla eutctica de TIBr-Tll), que est cortado con un ngulo tal que el haz IR atraviesa la primera superficie
de la ventana (frente) pero se refleja totalmente cuando incide en la segunda superficie (posterior); es decir, el ngulo d inci-
dencia de la radiacin sobre la segunda superficie de la ventana. excede el ngulo crtico para es material. Mediante fa cons-
truccin de ventanas adecuadas es posible obtener muchas reflexiones internas del haz IRantes de que ste se transmita fuera
de la ventana. Si una muestra se coloca en contacto con la ventana a lo largo de los lados que reflejan totalmente el haz 1R, la
intensidad de la radiacin reflejada se reduce con cada longitud de onda {frecuenc;:ia) que absorbe fa muestra. De este modo,
la tcnica de ATR proporciona un espectro de.reflectancia que se ha incrementado en intensidad, en compara<::in con una
medicin de reflectancia sencilla, el nmero de veces que el haz IR se refleja dentro de la ventana. La tcnica de ATR propor-
ciona una sensibilidad excelente, pero produce mala reproducibilidad y no es una tcnica cuantitativa confiable a menos que
cada muestra de prueba se mezcle muyhien con un estndar interno.
La Espectrofotometra de Fluorescencia es a menudo ms sensible que la espectrofotometra de absorcin; En mediciones d~
absorcin, se compara la transmitancia de la muestra con la de un blanco y a concentraciones bajas, ambas soluciones.propor-
cionan seales altas; Por el ontrario, en la espectrofotometra de fluorescncia, el blanco de disolvente tiene misiones bajas
en vez de altas, de manera que la radiacin de fondo, que puede interferir con las determinaciones a concentraciones bajas, es
mucho menor. Debido a que pocos compuestos pueden determinarse de manera conveniente mediante absorcin de luz.a
concentraciones por debajo de 10-5 M, no es inusual emplear concentraciones de 10-7 M a 1o-sM en la espectrofotometra de
fluorescencia.

TEORA Y DEFINICIONES
La potencia de un haz de luz radiante disminuye en relacin con la distancia que recorre en un medio de absorcin. Tam-
bin disminuye en relacin a la concentracin de molculas o iones absorbentes con los que se encuentra en ese medio. Estos
dos factores determinan la proporcin de la energa incidente total que emerge. La disminucin de la potencia de una radia-
cin monocromtica que atraviesa un medio de absorcin hmogneo se determina cuantitativamente mediante la ley de
Beer, log 10(1 /T) =A= abe, en donde los trminos son los definidos a continuacin.
Absorbancia [Smbolo: A]--Es el logaritmo, en base 1O, del recproco de la transmitancia (T). [NOTA-Los trminos descrip-
tivos empleados anteriormente inch,iyen densidad ptica, absorbencia y extincin.}
Absortividad [Smbolo: a]-Es el cociente de la absorbanda (A) dividido por el producto de la concentracin de la sustan-
cia (c), expresada en g por L, y la longitud de paso de absorcin (b) en cm. [NOTA'-NO debe confundirse con el ndite de
absorbancia, la extincin especfica o el coeficiente de extincin.}
Absortividad Molar [Smbolo: s}-.,-Es el c;:ociente de la absorbancia (A) dividido por el producto de la concentracin de la
sustancia, expresado en molespor Ly la longitud de paso de absorcin en cm. Tambin es el producto entre la absortividad.(a)
y el peso molecular de la sustancia. [NorA--'"'clos trminos empleados anteriormente incluyen el ndice de absorbancia molar, el
coeficiente de extincin molar y el coeficiente de absorcin molar.]
Para la mayora de los sistemas empleados en espectrofotometra de absorcin, la absortividad de una sustancia es tma cons-
tante independiente de la intensdad de la radiacin incidente, la longitud interna de las celdas y. la concentracin, por lo cual
la concentracin puede determinarse fotomtricamente.
La ley de Beer no da indicaciones del efecto de la temperatura, la longitud de onda o el tipo de disolvente. Para la mayora
de los trabajos analticos, los efectos de la variacin normal de la temperatura son inapreciables.
Las desviaciones de la ley de Beer pueden ser causadas por varial{les qumicas o instrumentales. Una falla aparente de la ley
de Beer puede ser el resultado de un cambio de concentracin en las molculas de soluto debidoa la asociacin entre las mo-
lculas de soluto o entre el soluto y las molculas del disolvente, o debido a disociacin o ionizacin. Otras desviaciones pue-
den estar causadas por efectos instrumentales, como por ejemplo la radiacin policromtica, los efectos de ancho de rendija o
de luz espuria.
Incluso a una temperatura fija en un disolvente dado, es posible que la absortividad no sea verdaderamente constante. Sin
embargo, en el caso de muestras que tienen un solo componente absorbente, no es necesario que el sistema de absorcin se
ajuste a la ley de Beer para utilizarlo en anlisis cuantitativos. La concentracin de una sustancia desconocida se puede deter-
minar mediante la comparacin con una curva estndar determinada experimentalmente.
Aunque, en el sentido ms estricto, la ley de seer no es aplicable en la espectrofotometra de absorcin atmica qebiqo a la
falta de propiedades cuantitativas de la longitud de la celda y la concentracin, el proceso de absorcin que tiene lugar en la
llama bajo condiciones de aspiracin reproducibles, en principio, se ajusta a la relacin de Beer. Espetficamente, eHogaritmo
negativo de la transmitancia, o de la absorbancia, es directamente proporcional al coeficiente de absorcin y, por consiguin-
te, es proporcional al nmero de tomos absorbentes: Sobre esta base, pueden elaborarse curvas de calibracin para permitir
la evaluacin de v:lores de absorcin desconocidos en funcin de la concentracin del elemento en solucin.
Espectro de Absorcin-Es una representacin grfica de la absorban ca, o cualquier funcin de absorbancia, en funcin
de la longitud de onda o a una funcin de la longitud de onda.
756 (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz / Pruebas Fsicas USP 39

Transmitancia [Smbolo; IJ-.,.Es el cociente entre la potencia radiante transmitid;: por una muestra y la potencia radiante
incidente s(,>bre la muestra, [NOTA-Los trminos empleados anteri.ormente incluyen la transmitancia y la transmisin.]
Intensidad de Fluoresc:en.cia[Smbolo: #]-Es una expresin emprica de la actividad fluorescente, comnmente expresada
en funcin de unidades arbitrarias proporcionales a la respuesta del detector. El espectro de emisin de.ffuorescencia es una re-
presentadngrfica.dela distribucin.espectral de la radiacin emitida por una sustancia activada, que muestra la intensidad
de fa rad.acin emitida como la ordenada y la longitud de onda como la abscisa. El espectro de xcitacin de..flvorescencia es
una representacin grfica del espectro de activacin~ que muestra la intensidad de 1a radiacin emitida por una 11ustancia acti-
vada como la ordenada y la longitud de onda de la radiacin incidente (activante) como la abscisa. Como en la espectrofoto-
metra de absorcin, las regc>nes importantes del espectro electrmagntico abarcadas .por la fluorescencia de compuestos or-
gnifos son elUV, el Visfleyel.lRcercano; es decir, la regin de 250 a 800 nm. Despusde que una molcula ha absorbido
radiacin, la energa puede perder5e tomo calor puede liberarse en forma de radiacin de la misma longitud de onda que la
absrbidac>mayor; Tanto laabsc>l'cin como la emisin de radiacin se deben a las transiciones de electrones entre diferentes
nlvelesdeer:lerga,uorbitales, ('lela.rnolc:ula. Existe una demora de tiempo entre la absorcin y la emisin de luz; esteinter-
valo;.la duradrl del estadc> de exdtacin, se ha medido 'J dura aproximadamente de l 0-9 segundos a 10-8 segundos para la
mayora de las soluciones florescentes orgnicas. La corta vida de la fluorescencia distingue este tipo de luminiscencia de ta
fo$f9resc~ncia; que es una posluminiscencia que excede el tiempo de excitacin y que puede durar de l 0~ 3 segundos hasta
varios minutos.
Turbidantia {Smbol: S]LEs elefecto de dispersin de luz causado por partculas en suspensin. La cantidad de materia
en ssp.ensin sepuedemeditmediante la observacin de la luz transmitida (turbidimetra) o. de. la luz dispersada {nefelome
tra}~
Turi)iciez[Smblo:.i-]...;..En mediciones de dispersin.de luz; la turbidez es la medida dela disminucin de intensidad del
haz inddentepor unidad de longitud de una suspensin dada;
Actividad. Dispersante RamanLEs la propiedad rnc>lecular (expresada en unidades de cm 4 por g) que gobierna la intensi-
dad de una banda observada en el espectro Raman para una rnllestra orientada aleatoriamente. La actividad dispersante se
determinpartir de la derivada de lapolarizabilidad molecular en to que se refiere al movimiento.molecular.que eleva la
band:9.desplaz9da d~ Raman. En g.enernl,.la intensidad de la banda Raman es linealmente proporc;ional ala concentracin. del
analito.

USO DE ESTNDARES DE REFERENCIA

ton pocas excepciones, las pruebasy\1aloraciof'les espectrofotorntl'icas FarmacpekasreqiereM unatornparacin cohun
Estndar de Referencia USP, Esto tiene como propl!sito asegurar la.rnedidn ertcohdidones Idnticas pata. la muestra de prue-
ba y lrsustanda de" refefenda, Estas c:c>9diclone:s it]ctoyen el:ajste clla lofl.gitud de oni;ta, elaloste det ancho cie .rendija, la
Ubita{,:ih y(S(.ir~ecci(}h delas celdas}' los nvele$.deitrarls1Jlitar:lcia. l)ei:)e bservar'seque las Celdas qupresentntina.trnSmi-
tanda idntica a na lorig!tud de onda Ciada pueden diferir conslderb!emente en. tral1smital1cia aotrs fongitudes de nda.
cuando se~ tjecesri(),sedeb~n esl'.<lblce:ryernplearirrec;cione:saptopiadas paralas.teldas.
las: expresiones. ''preparacrn.~fmllar'' y.'fsolciHsin1ilar,f' tal. corno se emplean..en laspn..iebasy vale> raciones relacionadas
ccf 'i'l espe:ctrof0tl)n1tfa, indicartquelanues~t de referencia~ generalmente un Estndar de Referencia USP;. debe.prepararse
}'observarsedemaneraidntica,paratodoslospropsitos.prctico:s;a1aqt1eseernplepara,1;1n1oestl'adepreba.Cieneral-
ttienteial prepa~atlasll.ICirdelEstridar l'.le.Rererencia es.peclflcaci,. sepreparaonasolucin. deapro1<i.madamente.1a con-
cehtrado!'.1 dseada.(pO.rxetetflplo, ton unaaproximad6hdel10%) }l.se.calcoJa. labsortyidad c0cn. respecto .a. la cantidad .de
ssfandaexactamehtepesada;snosenautilizadounEstndardeReferenciaprevamentesecado1laabs0:rt\lidacl11eca!Cula
cohrespecto a 1asustancianhidra.
Las expresiones, . "determinar. <:nfomitantementeKy ."medido. concomitantemente," tal como se emplean en las pruebas y
valoraciones ~elactcinadastl)n la espettrofofornetr!l1 . indicanque lasab~orbancias de laslucl(')hque.cntiene la muestra de
prcieba.}'Jso1d6nque coritiehe.1a rriUesfrade.ref~l'enda1 en rela<:in con. el blanco espedfic<ido en Ja prueba, se. medirn en
sucesin inmediata.

APARATOS
Estn dsponifes muchos tps de espectrofoton1etrds. Fndrneotalmente1 ta mayorade ellos, excepto ls.empleados para
espedrfotometra IR, pfoportjonahun pasaede energa radiante esencialmente monocromtica a trnvs de una muestra en
forma adecuada y una medc:;ion de la fraccin de la intensidad que se trnsmite: Ls espectfofotfoetros IRportl'nsformada
de =oul'iefen1plean uhate<ff!i<;ainterferorn~rica triedante l cualtaradiadn pdlcromtica pasa a travs delanaflto y llega a
ufldetectofqegenet'adatos~e1nteflsidaden.fondn.deltiempo.los espectrofotmetrosUV,vrsiblese.IRdispersivoscc>rn-
prehdeh una tuente deenergaffrdlspostivo de dispersin (por ejemplo, n prisma o red de difraccin), ranuras. para selec-
do:1ar l banda de longitddM8,n celda o Un sporte para la muestra de prueba, un detector de energa radiante,
amplficadores sociado5ydsposfvosde medicin. Enfos espectrofotmetros con red de didos, fa energa dela fonteatra-
viesa la muestra deprueba ylvego sedispetsa atravs de un retculo, incidiendo sobrevaric>s cientos de didos sensibles a la
1uzy cada Uno de estos didos genera a su vez una seal proporcional al nmero de fotones dentro de un pequeo intervalo
de longitudes de onda. Luego, estas seales pueden ser computadas a intervalos de tiempo cortos, seleccionados para obtener
USP 39 Pruebas Fsicas / (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz 75 7

o:
758 (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz/ Pruebas Fsicas USP 39

tamao de muestra de prueba adecuado para la medicin es de 2 a 3 mL, pero algunos instrumentos pueden equiparse con
celdas pequeas que contienen de 100 a 300L o con un soporte capilar que requiere una cantidad an ms pequea de
muestra.
Existen instrumentos para la medicin de la dispersin de luz y por lo general consisten en una lmpara de mercurio con
filtros para las lneas espectrales verdes o azules fuertes, un obturador, un conjunto de filtros neutros con transmitancia conoci-
da y un fotomultiplicador sensible, montado en un brazo que puede rotarse alrededor de la celda con la solucin y fijarse en
cualquier ngulo de -135 a O a +135 mediante un comando exterior al receptculo hermtico. las celdas para la solucin
son de diversas formas: cuadradas para mediciones de dispersin a 90; semioctagonales para mediciones de dispersin a 45,
90 y 135 y cilndricas para mediciones de dispersin en todos los ngulos. Dado que la determinacin del peso molecular
requiere una medida precisa de la diferencia de ndice de refraccin entre la solucin y el solvente [(n - n0)/cJ, se necesita un
segundo instrumento, un refractmetro diferencial, para medir esta pequea diferencia.
los espectrmetros Raman incluyen los siguientes componentes principales: una fuente de radiacin monocromtca intensa
(invariablemente un rayo lser); un sistema ptico para recoger la luz dispersada por la muestra de prueba; un monocromador
(doble) para disipar la luz dispersada y rechazar la frecuencia incidente intensa; y un sistema apropiado para la deteccin y
amplificacin de luz. la medicin Raman es sencilla ya que la mayor parte de las muestras se examinan directamente en capi-
lares para punto de fusin. Debido a que la fuente lser puede concentrarse en un punto, se necesitan solamente unos pocos
microlitros de muestra.

PROCEDIMIENTO

Espectrofotometra de Absorcin

Los fabricantes proporcionan instrucciones detalladas para operar los espectrofotmetros. Para lograr resultados significati-
vos y vlidos, el operador de un espectrofotmetro debe conocer los lmites de ste y las fuentes potenciales de error y varia-
cin. El manual de instrucciones debe seguirse con suma atencin en lo que se refiere al cuidado, limpieza y calibracin del
instrumento y las tcnicas de manipulacin de las celdas de absorcin, as como tambin las instrucciones para la operacin.
Se debe poner un nfasis especial en Jos siguientes puntos.
Controlar la exactitud de la calibracin del instrumento. Cuando se emplee una fuente de energa radiante continua, se de-
be prestar atencin tanto a la longitud de onda como a la escala fotomtrica; en el caso de que se emplee una fuente con una
lnea espectral, slo se necesitar controlar la escala fotomtrica. Hay varias fuentes de energa radiante que tienen lneas es-
pectrales de intensidad adecuada, espaciadas apropiadamente en todo el intervalo espectral seleccionado. La mejor fuente de
espectros de calibracin de UVy visible es el arco de cuarzo-mercurio, del cual pueden emplearse las lneas a 253,7; 302,25;
313, 16; 334, 15; 365,48; 404,66 y 435,83 nm. El arco de vidrio-mercurio es igualmente til por encima de 300 nm. Tambin
se pueden emplear las lneas a 486, 13 nm y 656,28 nm de una lmpara de descarga de hidrgeno. La escala de longitud de
onda puede calibrarse tambin a travs de filtros de vidrio apropiados, que tengan bandas de absorcin tiles a travs de las
regiones visible y UV. Se han empleado ampliamente vidrios estndar que contienen didimio (una mezcla de praseodimio y
neodimio), a pesar de que los vidrios que contienen holmio se consideran superiores. Recientemente, la solucin de xido de
holmio estndar ha reemplazado el empleo del vidrio con holmio. 1 Las escalas de longitud de onda de los espectrofotmetros
IR e IR cercano se controlan fcilmente mediante el uso de bandas de absorcin proporcionadas por pelculas de poliestireno,
dixido de carbono, vapor de agua o amonaco gaseoso.
Para verificar la escala fotomtrica se encuentran disponibles diferentes filtros de vidrio inorgnico estndar, as como solu-
ciones estndar de transmitancias conocidas, como por ejemplo el dicromato de potasio. 2
Por lo general, las mediciones cuantitativas de absorbancias se realizan en soluciones de la sustancia colocadas en celdas pa-
ra contener lquidos. Como el disolvente y la ventana de la celda absorben luz, debe hacerse un ajuste para compensar esta
contribucin a la absorbancia medida. Comercialmente se pueden obtener celdas iguales para comparacin para espectrofoto-
metra UV y visible, para las cuales no se necesita ninguna correccin de celda. Sin embargo, en los procedimientos con espec-
trofotometra IR, por lo general se deben realizar correcciones por causa de las diferencias de los valores de las celdas. En tales
casos, se llenan pares de celdas con el disolvente seleccionado y se determina la diferencia en sus absorbancias a la longitud de
onda seleccionada. la celda que presenta una mayor absorbancia se emplea para la solucin de la muestra de prueba y la
absorbancia medida se corrige restando la diferencia entre las celdas.
Esta correccin no es necesaria cuando se usa un sistema IR por transformada de Fourier computarizado, ya que la misma
celda puede emplearse tanto para el blanco de disolvente como para la solucin de prueba. Sin embargo, es necesario asegu-
rarse de que las propiedades de transmisin de la celda sean constantes.
Una muestra de prueba se podr comparar mejor con un Estndar de Referencia en un pico de absorcin espectral para el
compuesto relevante. las valoraciones que prescriben el uso de espectrofotometra proporcionan la longitud de onda comn-
mente aceptada para los picos de absorcin espectral de la sustancia en cuestin. Se sabe que diferentes espectrofotmetros

1 National lnstitute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg, MD 20899: "Spectral Transmittance Characteristics of Holmium Oxide in Perchloric Acid,"
f. Res. Nati. Bur. Stds. 90, No. 2; 115 (1985). Se debe verificar el rendimiento de un filtro no certificado por comparacin con un estndar certificado.
2 Para ms detalles referentes a la verificacin de la escala fotomtrica de un espectrofotmetro, consultar las siguientes publicaciones del NIST: /. Res. Nalt. Bur.
Stds. 76A, 469 (1972) (re: SRM 931, "Liquid Absorbance Standards for UV and Visible Spectrophotometry" y tambin la informacin referente a los patrones de
cromato de potasio y dicromato de potasio]; NIST Spec. Pub!. 260-116 (1994) [re: SRM 930 and SRM 1930, "Glass Filters for Spectrophotometry".
USP 39 Pruebas Fsicas/ (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz 759

pueden mostrar una variacin pequea en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prcticas requieren que las
comparaciones se lleven a cabo a la longitud de onda en la que ocurra un pico de absorcin. Si esto difiriere en ms de 1 nm
de la longitud de onda especificada en la monografa individual, se puede requerir la recalibracin del instrumento.

PREPARACIN DE PRUEBA

En las determinaciones que utilizan espectrofotometra UV o visible, la muestra usualmente se disuelve en un disolvente. A
menos que se indique otra cosa en la monografa, las determinaciones se hacen a temperatura ambiente empleando una lon-
gitud de paso de 1 cm. Hay muchos disolventes apropiados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloroformo, hi-
drocarburos de cadena corta, teres y soluciones diluidas de cidos y lcalis fuertes. Se deben tomar precauciones para utilizar
disolventes libres de contaminantes que absorban en la regin espectral que se utiliza. Por lo general, es aconsejable emplear
como disolvente metanol o alcohol libre de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adicin de metano! pero que no con-
tenga benceno u otras impurezas que interfieran con la prueba. Existen en el comercio disolventes de calidad espectrofotom-
trica especial que garantizan la ausencia de contaminantes. Otros disolventes orgnicos de grado reactivo analtico pueden
contener trazas de impurezas que tienen alto grado de absorcin en la regin UV. Deber verificarse la transparencia de lotes
nuevos de estos disolventes y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparacin de la solucin de
prueba, la solucin estndar y el blanco.
Ningn disolvente con un espesor apreciable es completamente transparente en todo el espectro IR cercano e IR. El tetraclo-
ruro de carbono (hasta 5 mm de espesor) es prcticamente transparente a 6 m (1666 cm-1). El dsulfuro de carbono (1 mm
de espesor) es adecuado como disolvente a 40 m (250 cm- 1) con la excepcin de la regin de 4,2 m a 5,0-m (2381 cm-1 a
2000 cm- 1) y de Ja regin de 5,5 m a 7,5 m (1819 cm-1 a 1333 cm-1), donde presenta una fuerte absorcin. Otros disolven-
tes tienen regiones relativamente estrechas de transparenca. Otra condicin adiconal para que un disolvente se considere
apropiado para espectrofotometra IR es que no debe afectar el material del que est hecha la celda (generalmente cloruro de
sodio). La muestra de prueba tambin se puede preparar dispersando en aceite mineral la muestra slida reducida a polvo fino
o mezclndola muy bien con una sal de haJuro alcalino previamente secada (por lo general bromuro de potasio). Las mezclas
con sales de haluros alcalinos pueden examinarse directamente o como discos transparentes o perlas obtenidos mediante Ja
compresin de dichas mezclas en una matriz. Las condiciones de secado tpicas para el bromuro de potasio son 105 al vaco
durante 12 horas, aunque existen grados comercialmente disponibles que no requieren secado. Es preferible la microscopa de
infrarrojo o una dispersin en aceite mineral cuando haya una desproporcin entre el haluro alcalino y la muestra de prueba.
En el caso de materiales adecuados, la muestra de prueba se puede preparar pura como una muestra delgada para microsco-
pa IR o puede suspenderse pura como una pelcula delgada para dispersin en aceite mineral. La mayora de los disolventes
ms comunes son apropiados para la espectrometra Raman, en la cual pueden emplearse celdas normales de vidrio (no fluo-
rescente). La regin IR del espectro electromagntico se extiende desde 0,8 hasta 400 m. La regin de 800 a 2500 nm (0,8 a
2,5m) se considera generalmente como la regin IR cercano (NIR, por sus siglas en ingls); la regin de 2,5 a 25 m, (4000 a
400 cm-1) se considera generalmente como la regin intermedia (mid-IR, por sus siglas en ingls); y la regin de 25 a 400 m
es considerada la regin de IR lejano (FIR, por sus siglas en ingls). A menos que se indique otra cosa en la monografa indivi-
dual, se debe utilizar la regin de 3800 a 650 cm- 1 (2,6 a 15 m) para asegurar el cumplimiento con las especificaciones de la
monografa para absorcin IR.
Cuando se proporcionan los valores de los picos del espectro IR en una monografa individual, las letras s, m y w significan
absorcin fuerte, mediana y dbil, respectivamente; sh significa un hombro, bd significa una banda y v significa "muy". Los
valores pueden variar tanto como O, 1 m o 1 O cm-1, segn el instrumento especfico empleado. El polimorfismo aumenta las
variaciones en los espectros IR de muchos compuestos en estado slido. En consecuencia, cuando se realicen pruebas de ab-
sorcin IR, si aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del estndar, disolver en volmenes iguales de un disol-
vente apropiado porciones iguales de la sustancia en anlisis y del estndar, evaporar las soluciones hasta sequedad en envases
similares bajo condiciones idnticas y repetir la prueba con los residuos.
En la espectroscopa NIR la mayor parte del inters actual est centrado en fa facilidad del anlisis. Se pueden analizar mues-
tras en polvo o, mediante tcnicas de reflectancia, con poca o ninguna preparacin. El cumplimiento de las especificaciones
internas del laboratorio puede determinarse mediante una comparacin computarizada de los espectros previamente obteni-
dos a partir de materiales de referencia. Muchos de los materiales farmacuticos muestran poca absortividad en esta regin del
espectro, lo que permite que la radiacin del JR cercano incidente penetre las muestras ms profundamente que la radiacin
UV, visible o IR. La espectrofotometra NIR se puede emplear para observar modificaciones en las matrices y con una calibra-
cin apropiada se puede usar en anlisis cuantitativos.
En la espectrofotometra de absorcin atmica se debe prestar especial atencin a la naturaleza del disolvente y Ja concen-
tracin de slidos. Un disolvente ideal es aquel que interfiere en grado mnimo en la absorcin o en los procesos de emisin y
que produce tomos neutros en la llama. Si hay una diferencia significativa entre la tensin en la superficie o la viscosidad de la
solucin de prueba y la solucin estndar, las soluciones se aspiran o atomizan a velocidades diferentes, lo que causa diferen-
cias significativas en las seales generadas. La concentracin de cidos de las soluciones tambin afecta a los procesos de ab-
sorcin. As, los disolventes empleados en la preparacin de la muestra de prueba y el estndar deben ser los mismos, o tan
parecidos como sea posible, y deben producir soluciones que se aspiren fcilmente a travs del tubo de muestra del mechero-
-aspirador. Dado que los slidos no disueltos presentes en las soluciones pueden producir interferencias de matriz o de volu-
men, el contenido total de los slidos no disueltos en todas las soluciones debe mantenerse, en lo posible, debajo de 2%.
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USP 39 Pruebas Fsicas/ (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz 761

nuacin. En las aplicaciones analticas, es preferible que la sealde fluorescencia est relacionada linealmente con la concentra
cin; pero si una muestra d prueba estuviera demasiado concentrada, una parte significativa de la luz entrante ser. absorbida
por la muestra. ms prfma a la superficie de la celda y la Juz que llega al centro s reduce. Es decir la. misma muestra act~a
cmo un "filtro internd' .Sin embargo, la espectroffometra deJluorescencia es intdnsicaITJente una tcnica de alta sensibili-
dad y, con frecuencia., se emplean concentraciones de 10-5.M a 10~1 M. Para cualquierprocedimiento analtico, es necesario
realizar .una curva de trabajo de intensidad de fluorescencia en fun('.in de la con('.entracin para.establecer una relacin lineaL
Todas las lecturas deben corregirse para un blanco de disolvente.
Las mediciones de fluorescencia son sensibles a la. presencia de polvo y otras partculas slidas en la muesffd. preba. Tales
impurez:aspueden reducir la intensidad del haz de excitacin o proporcionar lecturas errneamente altas del::!ido a los reflej9s
mltiples en la celda de la muestra. Por lo tanto, es conveniente eliminar las partculas slidas mediante centrifugacin; tam-
bin se puede emplear la filtracin, aunque algunos papeles de filtro contienen impurezas fluorescentes.
A menudo, la regulacin de la temperatura es importante en laespectrofotometra de fluoresceneia. Para algunas sustancias,
la eficiencia de la fluorescencia puede reducirse hasta entre 1 % y 2% por grado de ascenso de temperatura. En tales casos, si
se desea mayor precisin, es conveniente el uso.de celdasparamu.estra:contemperaturacontrlada. Para los anlisis de rutina,
puede ser suficiente realizar las mediciones con la rapidez necesaria como para que la muestra no se caliente demasiado debi-
do a la exposicin a la fuente de iluminacin intensa.Muchos compuestos fluorescentes son fotosensibles. Expuestos en 1.Jn
fluormetro, pueden ser fotodegradados en productos ms o .menos fluorescentes. Dichos efectos pueden detectarse a travs
de la observacin de la respuesta del detector en relacin al tiempo ypeden reducirse atenuando la fuente de il.irninacin
conflltros o pantallas.
Los cambios de disolvente pueden afectarnotablemente la intensidad y distribdn espectral de la fluorescencia, Poflo tan-
to, rio es aconsejable alterar el dsolvent especificado en los mtodos establecidos sin una cuidadosa Jnvestlgac:iri prelirnlnar.
Muchos compuestos son fluorescentes en disolventes orgnicos pero prcticamente no son fluorescentes en aglla;.podo tan-
to, se deben probar varios disolventes antes d que se decida si un compustoes o no fluorescente. En muchos djsol\/'erites
orgnicos, lafntensidad de la fluorescencia aumenta mediante la elminaci.n del oxgeno disuelto, que ejerce un fuerte efecto
de extincin. El oxgeno puede eliminarse mediante burbujeo de uri gas inerte, como por ejemplo nitrgeno helio, a fra;vs
de la muestra de prueba.
Una medida sernicuantitativa de la f1,1erza de. la fltJorescencia. est.dada por el cociente ;ntre.fo ifitensidad de fluorescencia
de una muestra de prueb<1 y la de un stlldat obtetlido con los mismos parmetros de ajust:ede los instrumentos. Frecuente~
mente, se emplea como estndar de referencia una solucin de concentracin conocida de quinina en cidosulfrico O,l No
de fluorescena en hidrxido de sodio O,l N.

Dispersin de Luz
La turbidez puede medirse con un espectrofotmetro o un fotmetro de filtro fotoelctrico estndar, preferentemente con
iluminacin en la porcin azul del espectro. Las mediciones nefelomtricas requieren un instrumento con una fotocl.ula situa-
da para recibir la luz dispersada en lugar de la luz transmitida; esta geometra se aplica tarr)bina los flurrnetros, d manera
que, en general, los fluormetros pueden emplearse como nefelmetros, mediante la seleccin de fltrosadecuados. Un turbi-
dmetro de relacin combina la tecnologa de la nefelometra a 90 y la de la turbdimetra: contiene fotoclulas que reciben y
miden la luz dispersada a un ngulo de 90 de la muestra as corno tambin reciben y miden 1a dispersin directa frente a la
muestra; tambin rnide la luz transmitida d rectamente a travs de la muestra. La linealidad se obtiene al calcular la rlcin
entre la medicin de la luz dispersada a un ngulo de 90 y la suma de la medida de la luz dispersada directa y la medida de la
luz transmitida. La ventaja de emplear un sistema de turbJdimetra de relacin es que la medida de la luz perdida es inaprecia-
ble.
En la prctica, es aconsejable asegurarse de que la sedimentacin de las partculas que sern medidas sea inapreciable. Ge-
neralmente esto se logra incluyendo un coloide protector en el medio de suspensin lquido. Es importante que los resultados
sean interpretados mediante comparacin de lecturas con las de un material en suspensin de concentracin conocid, produ-
cidas exactamente bajo las mismas condiciones.
La turbidmetra o nefelornetrfa puede ser til para la medicin de precipitados formados por la interaccin de soluciones
altamente diluidas de reactivos u otras partculas, como por ejemplosuspensiones de clulas bacterianas. Para que puedan lo-
grarse resultados consistentes, todas las variables deben controlarse cuidadosamente. En los casos en los que dicho control sea
posible, se pueden medir suspensiones sumamente diluidas.
La muestra se disuelve en eldisolvente a varias concentraciones diferentes conocidas con exactitud, la eleccin de las con-
centraciones depende del peso molecular del so luto y vara desde 1% para Mw = 1O000 a 0,01 % para Mw = 1 000 000. Cada
solucin debe limpiarse muy cuidadosamente antes de lamedicin mediante filtracin repetida a travs de filtros finos. Una
partcula de polvo en la solucin vida la intensidd de. la luz dispersada medida. Un criterio. para tJna solucin transparente .es
que la disimetra, la relacin. de intnsidad dispersada a 45/135, haya alcanzado un mnimo.
Se miden la turbidez y el ndice de refraccin de las soluciones. A partir de la ecuacin general de dispersin de luz a 90, se
traza un grfico de HC/t en funcin de C y se extrapola a dilucin infinita y se calcula el peso molecular promedio, M, a partir
de la interseccin, 1 / M.
762 (851) Espectrofotometra y Dispersin de Luz/ Pruebas Fsicas USP 39

Comparacin Visual

Cuando se indica una comparacin de color o una comparacin de turbidez, deben utilizarse tubos para comparacin de
color que sean tan idnticos como sea posible en dimetro interno y en cualquier otra caracterstica. Para la comparacin de
color, los tubos deben observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con la ayuda de una fuente de iluminacin dirigida
desde debajo de la parte inferior de los tubos, mientras que para la comparacin de turbidez los tubos deben observarse hori-
zontalmente, contra un fondo oscuro, con la ayuda de una fuente de iluminacin lateral.
Al realizar pruebas de lmites que incluyan una comparacin de color en dos recipientes iguales (por ejemplo, tubos para
comparacin de color iguales), podr utilizarse un instrumento apropiado, en lugar de realizar una observacin visual directa.
AUSP39

(852) ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA

INTRODUCCIN
La espectroscopa de absorcin atmica (AA) es un mtodo analtico para la identificacin y/o la cuantificacin de elemen-
tos. Para estas aplicaciones, el mtodo de AA se utiliza en procedimientos que miden la absorbancia de radiacin a una longi-
tud de onda caracterstica por parte de un vapor compuesto de tomos en estado fundamental. Un instrumento tpico consta
de una fuente de energa primaria que produce el espectro del elemento en anlisis, un monocromador y un detector adecua-
do.
Para obtener informacin sobre teora y principios de mediciones, ver el captulo Espectroscopa de Absorcin Atmica-Teora
y Prctica (1852), recurso que puede ser til, aunque no es obligatorio.

CALIFICACIN DE ESPECTROFOTMETROS DE ABSORCIN ATMICA

La calificacin de un espectrofotmetro de AA puede dividirse en tres elementos: calificacin de la instalacin (IQ, por sus
siglas en ingls), calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y calificacin de desempeo (PQ, por sus siglas en ingls);
ver tambin el captulo de informacin general Calificacin de Instrumentos Analticos (1058).

Calificacin de la Instalacin

Los requisitos de calificacin de la instalacin proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuada-
mente en el lugar deseado.

Calificacin Operativa

En la calificacin operativa, se caracteriza el desempeo de un instrumento usando estndares con propiedades espectrales
conocidas para verificar que el sistema opera dentro de las especificaciones esperadas (ver la Tabla 7 y la Tabla 2). El propsito
de la calificacin operativa es demostrar que el desempeo del instrumento es adecuado. La calificacin operativa es una verifi-
cacin de los parmetros operativos clave que se realiza despus de la instalacin y despus de las reparaciones y/o el manteni-
miento.
Las pruebas de calificacin operativa discutidas en las secciones siguientes son ejemplos tpicos. Se pueden usar otras prue-
bas y muestras para establecer las especificaciones para la calificacin operativa. Los proveedores de instrumentos a menudo
proveen muestras y parmetros de prueba como parte del paquete de Calificacin de la Instalacin/Calificacin Operativa.
Tabla 1. Prueba de Calificacin Operativa y Criterios de Aceptacin para Espectrofotmetros de AA a la Llama
Prueba Procedimiento Criterios de Aceptacin
Aspirar un estndar de Zn de 0,3 g/ml y registrar la absor-
Sensibilidad bancia. 20% de UN especificada por el fabricante del instrumento
Aspirar el blanco y estndares de Zn de 0,05; 0,075; O, 1 O;
0,25 y 0,50 g/ml. Generar una curva de calibracin y regis-
Linealidad trar el coeficiente de correlacin (R). Coeficiente de correlacin, no menos de 0,995
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estndar
de Zn de O, 1 O g/ml en funcin de la curva estndar gene-
rada para la prueba de Linealidad. Calcular la %RSD de los 5
Precisin resultados en g/ml. %RSDb, no ms de 3%
UA = unidad de absorbancia.
b %RSD = desviacin estndar relativa porcentual.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (852) Espectroscopa de Absorcin Atmica 763

Tabla 2. Prueba de Calificacin Operativa y Criterios de Aceptacin para Espectrofotmetros de AA con Horno de Grafito
Prueba Procedimiento Criterios de Aceptacin
Preparar un estndar de Cu y medir la masa caracterstica segn 20% de masa caracterstica de Cu segn lo especificado
Sensibilidad lo descrito por el fabricante. por el fabricante

Generar una curva de calibracin a partir de un blanco y estn-
dares de Cu de 25; 50; 75 y 100 g/L. Inyectar cada estndar
Linealidad por triplicado y registrar la o/oRSD.
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estndar
de Cu de 50 ftg/L en funcin de la curva estndar generada
para la prueba de Linealidad. Inyectar cada determinacin re-
Precisin petida por triplicado.
Coeficiente de correlacin, no menos de 0,995
o/oRSD para inyecciones por triplicado de cada estndar de
Cu, no ms de 5% (sin incluir el blanco)
o/oRSD para 5 determinaciones repetidas, no ms de 3%
o/oRSD para inyecciones por triplicado, no ms de 5%

Calificacin de Desempeo

La calificacin de desempeo determina que el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los
parmetros que pueden afectar la calidad de la medicin.
Dependiendo del uso tpico, las especificaciones de calidad de desempeo pueden diferir de las especificaciones del fabri-
cante. Para mtodos validados, las pruebas de calidad de desempeo especficas, tambin conocidas como pruebas de aptitud
del sistema, se pueden usar en lugar de los requisitos de calificacin de desempeo.
Los procedimientos especficos, criterios de aceptacin e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeo de un espec-
trofotmetro de AA dependen del instrumento y de la aplicacin para la que se utiliza. Demostrar el desempeo estable del
instrumento durante periodos prolongados provee cierta garanta de que se pueden tomar mediciones confiables a partir de
los espectros de la muestra de prueba usando procedimientos validados de AA.

PROCEDIMIENTO

Evaluar y seleccionar el tipo de material de fabricacin, y mtodos de pretratamiento y limpieza del material de laboratorio
analtico usado en los anlisis de AA. El material debe ser inerte y, dependiendo de la aplicacin especfica, resistente a disol-
ventes custicos, cidos u orgnicos. Para algunos anlisis, se debe tomar adecuada precaucin para prevenir la adsorcin de
analitos en la superficie del recipiente, especialmente en los anlisis a nivel de ultratraza. La contaminacin de las soluciones de
muestra derivada de metales e iones presentes en el recipiente tambin puede generar resultados inexactos.
Para el anlisis de un elemento ubicuo, a menudo resulta necesario usar el grado ms puro disponible de un reactivo o disol-
vente. Verificar todas las soluciones (diluyentes, soluciones modificadoras de matriz, soluciones para supresin de ionizacin,
reactivos y otros) para detectar contaminacin elemental antes de usarlas en un anlisis.

Solucin Estndar

Preparar segn se indica en la monografa individual. [NOTA-Se pueden usar soluciones estndar de elementos individuales
o multielementos disponibles comercialmente, rastreables al Instituto Nacional de Normas y Tecnologa) (National lnstitute of
Standards and Technology o a una organizacin de metrologa nacional equivalente, para la preparacin de las soluciones es-
tndar.] Las soluciones estndar, en especial aqullas usadas en el anlisis a nivel de ultratraza, pueden tener una vida til limi-
tada. Las soluciones estndar deben conservarse durante no ms de 24 horas, a menos que su estabilidad se demuestre experi-
mentalmente.
Asimismo, se puede usar el mtodo de estndar agregado. Este mtodo implica agregar a la muestra una concentracin co-
nocida del elemento analito a no menos de dos niveles de concentracin con respecto a una preparacin de la muestra sin el
agregado de cantidades conocidas. La respuesta del instrumento se grafica en funcin de la concentracin del elemento anali-
to agregado y se traza una lnea de regresin lineal con los puntos correspondientes a los datos. La concentracin del analito
de la muestra se obtiene multiplicando el valor absoluto del punto donde la recta corta el eje x-por el factor de dilucin que
corresponda.

Solucin Muestra

Preparar segn se indica en la monografa individual.

Pueden indicarse diversas tcnicas de digestin para disolver la muestra. stas pueden incluir digestiones en placa caliente o
digestiones asistidas por microondas, y mediante aproximaciones con recipiente abierto o cerrado. Debe tomarse en cuenta
que la digestin en recipientes abiertos por lo general no se recomienda en los anlisis de metales voltiles, p.ej., selenio y
mercurio.
764 (852) Espectroscopa de Absorcin Atmica/ Pruebas Fsicas USP 39

Anlisis

Seguir el procedimiento segn se indica en la monografa individual con respecto a los parmetros instrumentales.
El instrumento debe estandarizarse para cuantificacin al momento de su uso. La absorbancia de las soluciones estndar que
abarcan la concentracin esperada se determina en funcin de un blanco apropiado. La respuesta del detector se grafica como
una funcin de la concentracin del analito. Al realizar un anlisis en el lmite de deteccin o en su cercana, no siempre es
posible usar un estndar que abarque la concentracin esperada (bracketing standard). Esto es aceptable para pruebas cualita-
tivas, pero no para pruebas cuantitativas. El anlisis de regresin de la grfica estndar debe usarse para evaluar la linealidad de
la respuesta del detector, y las monografas individuales pueden establecer criterios para el error residual de la lnea de regre-
sin.
Para demostrar la estabilidad de la estandarizacin inicial del sistema, se debe volver a valorar una solucin usada en la curva
estndar inicial como un estndar de verificacin en intervalos apropiados durante todo el anlisis del conjunto de muestras. A
menos que se indique de otro modo en la monografa individual, el estndar nuevamente analizado debe concordar con su
valor esperado con una aproximacin de 3% para una valoracin, o de 20% para un anlisis de impurezas.
Las concentraciones de la muestra se calculan en funcin de la curva de calibracin que se genera graficando la respuesta
del detector en funcin de la concentracin del analito en las soluciones estndar.

VALIDACIN V VERIFICACIN

Validacin

La validacin es necesaria cuando un mtodo de AA se destina para su uso como una alternativa al procedimiento oficial
para el anlisis de un artculo oficial.
El objetivo de una validacin de un procedimiento de AA es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito pre-
visto, incluyendo la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o medicamento (valoraciones de Ca-
tegora 1), la determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora 11) y las pruebas de identificacin (Cate-
gora IV). [NOTA-Para definiciones sobre las diversas categoras, ver el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
(1225).) Dependiendo de la categora de la prueba, la validacin del procedimiento analtico para AA puede requerir el anlisis
de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisin, el lmite de deteccin, el lmite de cuantificacin y la
robustez. Estas caractersticas de desempeo analtico se aplican a mtodos con estndar externo y a mtodos de estndar
agregado.
El captulo de informacin general (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos ana-
lticos sin indicar criterios de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es proveer al
usuario criterios especficos de validacin representativos de las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplica-
cin particular, pueden requerirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

Para valoraciones de Categora 1o pruebas de Categora 11, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recupe-
racin con la matriz apropiada adicionada con concentraciones conocidas del elemento a analizar. Tambin es una prctica
aceptable comparar los resultados de la valoracin obtenidos usando el procedimiento de AA que se est validando con aqu-
llos de un procedimiento analtico establecido. En los mtodos de estndar agregado, la evaluacin de la exactitud se basa en
la concentracin final calculada a partir de la ordenada al origen, y no en la recuperacin calculada a partir de las adiciones de
estndar individuales.
Criterios de validacin: 95,0%-105,0% de recuperacin media para la valoracin del frmaco y la valoracin del medica-
mento, y 70,0%-150,0% de recuperacin para el anlisis de impurezas. Estos criterios se aplican a todo el intervalo previsto.

Precisin

REPETIBILIDAD

El procedimiento analtico debe evaluarse midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas de manera
independiente al 100% de la concentracin de la prueba de valoracin. Alternativamente, se pueden usar tres determinaciones
repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo sufi-
cientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentraciones. En este caso, la repetibi-
lidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptacin. Si se valida un procedimiento
usando el mtodo de estndar agregado, el criterio de precisin se aplica al resultado experimental final, no a la exactitud de
los niveles individuales de estndar agregado.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 5,0% para la valoracin del frmaco, no ms de 5,0%
para la valoracin del medicamento y no ms de 20% para el anlisis de impurezas.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (852) Espectroscopa de Absorcin Atmica 765

PRECISIN INTERMEDIA

Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento. Las variables
tpicas incluyen realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o ms analistas realicen el mtodo.
Como mnimo, el procedimiento analtico debe evaluarse realizando la prueba de repetibilidad en cualquiera de las condicio-
nes mencionadas previamente (con un total de 12 mediciones).
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 8,0% para la valoracin del frmaco, no ms de 8,0%
para la valoracin del medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

El procedimiento debe ser capaz de evaluar inequvocamente cada analito elemental en presencia de componentes que se
espera encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz.
Criterios de validacin: Se demuestran mediante el cumplimiento con el requisito de exactitud.

LMITE DE CUANTIFICACIN

El lmite de cuantificacin (QL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de
seis mediciones repetidas de una solucin blanco, dividida por la pendiente de una curva estndar y multiplicando por 1O. Si
se valida un procedimiento usando el mtodo de estndar agregado, se usa la pendiente de los estndares aplicados a una
solucin del material de prueba. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver el captulo (1225>).
Se debe llevar a cabo una medicin de una solucin de prueba, preparada a partir de una matriz de muestra representativa
a la que se le han agregado cantidades conocidas, a la concentracin de lmite de cuantificacin para confirmar la exactitud. Si
se valida un procedimiento usando el mtodo de estndar agregado, el criterio de validacin se aplica al resultado experimen-
tal final, no a la recuperacin de cantidades agregadas conocidas de los niveles de adicin de estndar individuales.
Criterios de validacin: El procedimiento analtico debe ser capaz de determinar el analito con precisin y exactitud a un
nivel equivalente al 50% de la especificacin.

LINEALIDAD

Se prepara una curva de respuesta entre la concentracin del analito y la absorbancia, a partir de no menos de cinco solucio-
nes estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la solucin de prueba. Posteriormente, la cur-
va estndar se evala usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de cuadrados mnimos.
Para experimentos que no generen una relacin lineal entre la concentracin de analito y la respuesta de AA, se deben apli-
car mtodos estadsticos apropiados para describir la respuesta analtica.
Criterios de validacin: Coeficiente de correlacin (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categora 1y no menos de
0,99 para pruebas cuantitativas de Categora 11.

INTERVALO

El trmino intervalo se refiere al rango entre las concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (in-
cluyendo estas concentraciones) para las que se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene un nivel adecuado de
precisin, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisin y exactitud.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora 1, el intervalo de validacin para criterios de aceptacin centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptacin no centrados, el intervalo de validacin es 10,0% por debajo del lmite
inferior hasta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validacin es 70,0%-
1 30,0%. Para pruebas de Categora 11, el intervalo de validacin abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptacin.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medicin analtica se demuestra mediante cambios deliberados en los parmetros experimentales.
Para la AA esto puede incluir, entre otros, las etapas de preparacin de la muestra y los programas de calentamiento, incluyen-
do el tiempo de espera de atomizacin o la temperatura de atomizacin. Se debe tener cuidado al cambiar los flujos de com-
bustible y gas de oxidacin as como las partes del mechero, ya que podran crearse condiciones de retroceso de la llama.

Verificacin

Las reglamentaciones de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes para los EE.UU. [ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indi-
can que los usuarios de los procedimientos analticos, segn se describen en los compendios USP-NF, no estn obligados a
766 (852) Espectroscopa de Absorcin Atmica / Pruebas Fsicas USP 39

validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografa. En vez de esto, los usuarios simplemente deben verificar
su aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificacin del procedimiento de AA es demostrar que el usuario puede llevar a cabo el procedimiento,
segn se describe en la monografa especfica, con una exactitud, especificidad, linealidad y precisin adecuadas usando los
instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopei-
cos (1226), si la verificacin del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografa, no resulta exitosa, el procedimiento
puede no ser adecuado para su uso con el artculo en anlisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y validar un
procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencia Generales 6.30.
La verificacin de los mtodos farmacopeicos de AA deben, como mnimo, incluir la ejecucin de los parmetros de valida-
cin para especificidad, linealidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme a lo in-
dicado en Validacin.

(853) ESPECTROSCOPA DE FLUORESCENCIA

INTRODUCCIN

La fluorescencia es un proceso de dos etapas que requiere la absorcin de luz a una longitud de onda especfica (excitacin)
seguida de emisin de luz, por lo regular a una longitud de onda mayor. La emisin de luz se denomina fluorescencia.
El tipo ms comn de muestra fluorescente es una solucin transparente submicromolar que absorbe la luz siguiendo la Ley
de Lambert-Beer-Bouguer y emite fluorescencia con una intensidad que es directamente proporcional a la concentracin, a la
absortividad y al rendimiento cuntico de fluorescencia de las especies fluorescentes o del fluorforo.
A diferencia de la espectroscopa de absorcin, en donde la desviacin de la linealidad es la excepcin, la linealidad de la
fluorescencia puede verse afectada por una variedad de efectos relacionados con la muestra. Para obtener informacin adicio-
nal, ver el captulo Espectroscopa de Fluorescencia-Teora y Prctica (1853).
Los mtodos de fluorescencia tambin se denominan exentos de fondo debido a la poca luz de excitacin que alcanza el de-
tector. Esta caracterstica hace que la deteccin de fluorescencia sea altamente sensible, hasta el punto de lograr la deteccin
de una sola molcula en algunos casos. La deteccin de fluorescencia tambin puede ser altamente especfica debido a que un
fluorforo tiene un patrn de emisin caracterstico. La especificidad y la sensibilidad son dos de los puntos fuertes ms impor-
tantes de los mtodos de fluorescencia.

CALIFICACIN DE INSTRUMENTOS DE FLUORESCENCIA

Los analistas aseguran la aptitud de un instrumento especfico para un procedimiento dado usando una evaluacin paso a
paso para la aplicacin deseada, desde la seleccin, hasta el retiro del instrumento: calificacin del diseo (DQ, por sus siglas
en ingls); calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls); una calificacin inicial del desempeo con respecto a la
especificacin, tambin conocida como calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls); y una continua calificacin del de-
sempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para obtener informacin adicional, ver el captulo general Calificacin de Instrumentos
Analticos (1058).
La calificacin del diseo y la calificacin de la instalacin quedan fuera de la consideracin de este captulo. El propsito de
esta seccin es proveer mtodos de prueba y criterios de aceptacin para asegurar que el instrumento es adecuado para su uso
previsto (calificacin operativa) y que continuar funcionando adecuadamente durante periodos extensos (calificacin del de-
sempeo).
Al igual que con cualquier dispositivo espectromtrico, se debe calificar la exactitud y precisin de la longitud de onda (eje
x) y la intensidad relativa (eje y o eje de seal) de un espectrofluormetro. Asimismo, se debe establecer la sensibilidad. La
calificacin operativa debe abarcar los intervalos de operacin requeridos para las escalas de intensidad y de longitud de onda.

Calificacin Operativa de Instrumentos

Las tolerancias provistas en la calificacin de la operacin y del desempeo del instrumento son aplicables para su uso gene-
ral. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones particulares pueden variar dependiendo del procedimiento analtico
usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los proveedores de instrumentos a menudo ponen a disposicin muestras y
parmetros de prueba como parte del paquete de Calificacin de la Instalacin/Calificacin Operativa.
Siempre que sea posible, para las etapas que se detallan a continuacin, deben usarse materiales de referencia certificados
para propsitos de calibracin en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Cuando los materiales de referencia certifi-
cados se obtengan de una fuente acreditada reconocida, debern tener asignaciones de valores rastreables y verificados de
manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (853) Espectroscopa de Fluorescencia 767

En este captulo se diferencian dos tipos generales de mediciones instrumentales: espectrales (es decir, aqullas que miden la
intensidad en funcin de la longitud de onda) y fijas (es decir, aqullas que miden la intensidad a una longitud de onda y
ancho de banda fijos).

CONTROL DE LONGITUDES DE ONDA

El nivel de confianza de las posiciones observadas de los picos se define mediante la exactitud de la longitud de onda para
mediciones espectrales. La determinacin de la exactitud de una gran cantidad de longitudes de onda a lo largo del intervalo
de longitud de onda deseado demuestra si es necesaria la calibracin adicional en ms de un solo punto. La calibracin en
mltiples puntos implica medir los sesgos de la longitud de onda a mltiples longitudes de onda y corregir por la dependencia
de la longitud de onda del sesgo. A menudo, se puede aplicar una calibracin en un solo punto al eje de la longitud de onda
en el software de un instrumento antes de recopilar los datos, pero una calibracin en mltiples puntos puede requerir que se
aplique la correccin a los espectros despus de recopilarlos.
Para mediciones fijas, la posicin de la longitud de onda y el ancho de banda deben ser reproducibles. Para la seleccin de
longitudes de onda basadas en filtros, se requiere nicamente usar el mismo filtro al comparar datos a lo largo del tiempo. Si
se debe usar un filtro distinto (p.ej., cuando los datos se comparan entre instrumentos y laboratorios), entonces deben compa-
rarse las curvas de transmisin de los filtros.
La precisin de la longitud de onda debe determinarse sobre el intervalo de operacin usando al menos seis mediciones
repetidas. La desviacin estndar no debe exceder de 1 nm.

ESPECTROS DE LNEAS ATMICAS

Este procedimiento se describe como la aplicacin primaria debido a que las lneas de emisin producidas a partir de una
lmpara de descarga son caractersticas del elemento fuente y, como estndar fsico fundamental, dichas longitudes de onda
han sido medidas con una incertidumbre de no ms de 0,01 nm. En la espectrofluorometra en solucin, el sesgo de la longi-
tud de onda requerida raramente excede de 1,0 nm. Por estas razones, los valores del estndar atmico de lnea se citan sin la
incertidumbre. La lmpara debe colocarse en la posicin de la fuente del espectrofluormetro.
Una lmpara de mercurio de baja presin comnmente empleada tiene una variedad de lneas intensas que abarcan una
gran parte del intervalo UV y visible. Los fabricantes usan a menudo dos lneas de xenn a partir de la fuente a 260,5 y 541,9
nm como una verificacin interna de la calibracin, debido a que es posible verificar la exactitud de los monocromadores de
excitacin y de emisin y usarla para propsitos de diagnstico (ver la Tabla 7). 1
Tabla 1. Longitudes de Onda de Espectros de Lineas de E ementos
Longitud de Onda
Elemento (nm)
Hg 253,7
Xe 260,5
Hq 296,7
Hq 365,0
Hq 404,7
Hq 435,8
Xe 541,9
Hg 546,1
Hg 577,0
Hg 579,1

USO DE SOLUCIONES DE XIDOS DE TIERRAS RARAS

Este procedimiento emplea una solucin de xido de tierras raras que se prepara mediante disolucin en medio cido. La
ms frecuente est compuesta de xido de holmio en cido perclrico en combinacin con un reflector difuso localizado en la
posicin de la muestra. Se encuentran disponibles comercialmente materiales de referencia certificados adecuados. 2 Se debe
retirar el selector de longitud de onda que no est siendo escaneado; si no resulta prctico retirarlo, se deber ajustar a orden
cero (en esta posicin una red de difraccin se comporta como un espejo que refleja todas las longitudes de onda). El reflector
difuso se escanea con y sin la muestra de tierra rara en posicin, y se calcula el cociente entre las dos intensidades para obtener
un espectro de transmitancia efectiva. Los mnimos en el cociente entre las intensidades corresponden a los picos de absorcin

1 Los valores redondeados se toman de la Norma E388-04 (2009) de la ASTM.

2 La norma NIST SRM 2034 ya no est disponible.
768 (853) Espectroscopa de Fluorescencia/ Pruebas Fsicas USP 39

de la muestra. Para una solucin al 4% (p/p) de xido de holmio en cido perclrico a un ancho de banda espectral de 1,0 nm
y una longitud de paso de 1 cm, estos mnimos se encuentran en la Tabla 2.3
Tabla 2
Longitud de Onda
(nm)
241,1
249,9
278,1
287,2
333,5
345,4
361,3
385,6
416,3
451,4
467,8
485,2
536,6
640,5

Si el intervalo operativo del espectrofotmetro se encuentra fuera de 240-650 nm, se usan otros xidos de tierras raras certi-
ficados u otras soluciones.
El didimio (una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estndar rastreable en presentaciones
tanto en solucin como vidrio. El didimio es similar en su preparacin a los materiales de holmio y tiene caractersticas de pico
tiles en la regin de 730-870 nm. Los picos tiles se encuentran en la solucin de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0;
794, 1; 799,0 y 864,4 nm.

USO DE REFERENCIAS DOPADAS CON POLIMETILMETACRILATO

Este procedimiento usa materiales de referencia slidos fabricados mediante la polimerizacin de una variedad de compues-
tos activos fluorescentes de anillo aromtico en una matriz de polimetilmetacrilato (PMMA) inerte. Estos materiales se proveen
en forma de bloques pulidos para su uso en un portacubetas estndar (ver la Tabla 3).
Tabla 3. Datos de Dopante, Excitacin y Emisin para Materiales de Referencia Seleccionados
Excitacin le Emisin le
Dopante (nm) (nm)
p-Terfenilo 295 338
Ovaleno 342 482
Tetrafenilbutadieno 348 422
Antraceno 360 402

Verificacin del Desempeo

Los resultados obtenidos del anlisis diario de estndares de intensidad fotoestable se usan para verificar el desempeo de
un instrumento. Si la intensidad medida no cambia con respecto a la observada al momento de calificar el instrumento, enton-
ces se considera que el desempeo del instrumento no ha cambiado y contina en estado calificado. Usar dichos estndares
para determinar una escala de intensidad casi absoluta o basada en artefactos permite que las intensidades y la sensibilidad de
los instrumentos medidas puedan compararse con el paso del tiempo o entre instrumentos. Las mediciones de las intensidades
deben estar dentro del intervalo lineal del sistema de deteccin del instrumento antes de que los analistas intenten realizar
comparaciones de las intensidades, y se vern afectadas por cualquier efecto instrumental directamente relacionado con la se-
al de fluorescencia, p.ej., cambios en la intensidad de la fuente, respuesta del detector, entre otros.
Para instrumentos con seleccin de longitud de onda basada en filtros, se usan estndares de fluorescencia para correccin
espectral a fin de determinar las diferencias esperadas entre intensidades ocasionadas por filtros con diversos perfiles de trans-
misin. Mediante la compensacin de estas diferencias de intensidad debidas a la falta de correspondencia espectral, es posi-
ble determinar una escala de intensidad casi absoluta para dichos instrumentos. Los analistas deben abordar las comparaciones

3 Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorcin estndar a la longitud de onda intrnseca provistos en Travis et al.} Phys Chem Ref Data
2005; 34(1 ):41. La incertidumbre de la medicin del 95% del mximo es 0,06 nm.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (853) Espectroscopa de Fluorescencia 769

entre instrumentos con particular precaucin debido a que las incertidumbres implicadas son relativamente grandes y difciles
de cuantificar.

USO DE AGUA DE BAJA CONDUCTIVIDAD (18 MO)

La banda Raman del agua se usa para medir las relaciones seal-ruido en instrumentos de fluorescencia. La banda Raman del
agua es inherentemente reproducible y no se degrada con el tiempo. El agua es conveniente de obtener en un estado puro y
permite realizar comparaciones entre laboratorios con un alto nivel de confianza. No se requiere preparacin o dilucin. La
banda Raman es una seal de bajo nivel que provee una buena prueba para los componentes pticos y electrnicos de un
sistema instrumental.
La banda Raman del agua no se debe a un fenmeno de fluorescencia, sino que es el resultado de la dispersin Raman. Para
el agua, la banda Raman siempre presenta un desplazamiento hacia el rojo de 3382 cm-1 con respecto a la excitacin. 4 Esta
banda por lo regular se mide mediante excitacin a 350 nm, lo que resulta en un pico Raman a 397 nm, aunque tambin se
puede usar radiacin de hasta 500 nm como longitud de onda de excitacin, y el pico de emisin correspondiente es 602 nm.

USO DE ESTNDARES DE INTENSIDAD

Se encuentran disponibles diversos materiales fluorescentes dopados con slidos. 5 Estos polmeros o materiales vtreos per-
miten la correccin espectral relativa y la calificacin diaria del desempeo de instrumentos de fluorescencia a lo largo de las
regiones UV, visible e infrarrojo cercano de 320 a 830 nm. La alta fotoestabilidad de los materiales los hace particularmente
tiles como estndares de intensidad para uso diario, incluso cuando no se requiere la correccin espectral o cuando la longi-
tud de onda de excitacin difiere de la usada para certificacin. Se provee un espectro de emisin en estado estacionario certi-
ficado con cada material de referencia certificado, junto con las incertidumbres totales estimadas. La referencia est disponible
en forma de cubeta de vidrio slido, de tamao estndar (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) con tres caras largas pulidas para
deteccin a 90 y una cara larga esmerilada para deteccin de cara frontal o de epifluorescencia.
Como alternativa, se pueden usar soluciones de fluorforos que hayan demostrado ser estables. 67

MEDICIONES CUALITATIVAS V CUANTITATIVAS DE FLUORESCENCIA

Por lo regular se llevan a cabo dos clases de procedimientos de medicin generales mediante espectrometra de fluorescen-
cia: cualitativa y cuantitativa.

Mediciones Cualitativas de Fluorescencia

Las mediciones cualitativas de fluorescencia se usan para detectar la presencia de analitos particulares y brindar una respues-
ta positiva o negativa. Las longitudes de onda de excitacin y de emisin a menudo se seleccionan en el mximo del pico del
fluorforo que se va a detectar. Se debe considerar la cantidad mnima de analito requerida para obtener un resultado positivo
que asegure que el mtodo es apropiado para la aplicacin particular. La observacin de fluorescencia en la posicin del pico
por encima del lmite de deteccin (generalmente 3 veces el nivel de ruido) indica un resultado positivo.

Mediciones Cuantitativas de Fluorescencia

Las mediciones cuantitativas de fluorescencia se usan para determinar las cantidades o concentraciones de analitos en mues-
tras desconocidas. Estas cantidades pueden determinarse en unidades absolutas, tales como moles o moles por L, o en unida-
des relativas, tales como el cociente entre las concentraciones de dos analitos fluorescentes contenidos en una sola solucin
desconocida. Dichas determinaciones usan la siguiente proporcionalidad, que relaciona la seal de fluorescencia (S) con la
concentracin de analito fluorescente (e) en un par dado de longitudes de onda de excitacin y de emisin O"ex, A.,m) :
5 oc / 0 x n x Rd x a x <I> x e
/0 = intensidad del haz de excitacin
n =fraccin de la fluorescencia recolectada por el sistema de deteccin
Rd = capacidad de respuesta del sistema de deteccin
a = coeficiente de absorcin

4 El valor de desplazamiento hacia el rojo se toma de Parker CA. Raman spectra in spectrofluorimetry. Analyst. 1959; 84:446-453.
s Disponibles a travs de proveedores comerciales y en el NIST como SRMs 2940 (emisin naranja), 2941 (emisin verde), 2942 (emisin UV), 2943 (emisin azul)
y 2944 (emisin roja/IR).
6 Los proveedores comerciales proporcionan una solucin de 1 mg/L de sulfato de quinina deshidratado en cido perclrico O, 105 M que ha sido completamente
caracterizada por el NIST como SRM 936a.
7 Se encuentra disponible una serie de Estndares de Intensidad para uso diario en el Instituto Federal Alemn para Investigacin y Anlisis de Materiales (BAM, por
sus siglas en alemn).
770 (853) Espectroscopa de Fluorescencia/ Pruebas Fsicas USP 39

<I> = rendimiento cuntico de fluorescencia

e = concentracin del analito fluorescente
Esta proporcionalidad lineal con la concentracin se aplica a muestras pticamente diluidas (p.ej., soluciones con una absor-
bancia de menos de 0,05 a una longitud de paso de 1 cm).

BUENA PRCTICA ESPECTROSCPICA

La mejor manera de realizar comparaciones de una muestra de prueba con un Estndar de Referencia es en un pico de emi-
sin espectral para el compuesto de inters. Los ensayos basados en espectrofluorometra proveen las longitudes de onda co-
mnmente aceptadas para la excitacin y para la emisin de pico espectral de la sustancia de inters. Espectrofluormetros
diferentes pueden presentar variaciones menores en la longitud de onda aparente de este pico. Las comparaciones deben reali-
zarse a la longitud de onda en la que ocurre el pico de emisin. Si sta difiere de la longitud de onda especificada en la mono-
grafa en ms de 1 nm en el intervalo de 200-400 nm o en ms de 2 nm en el intervalo de 400-800 nm, puede ser una
indicacin de la necesidad de recalibrar el instrumento.

Uso de Estndares de Referencia

Salvo algunas excepciones, los procedimientos espectrofluoromtricos farmacopeicos proveen resultados mediante compa-
racin contra un Estndar de Referencia USP. Esto asegura una medicin en condiciones idnticas para la muestra de prueba y
el Estndar de Referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la seleccin del ancho de banda
espectral, la colocacin y correccin de la celda, y los niveles de intensidad. Las celdas que presentan caractersticas de fluores-
cencia ptica idnticas a una longitud de onda especfica pueden diferir considerablemente a otras longitudes de onda. Se
deben establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando as se requiera.
Los trminos preparacin similar y solucin similar en pruebas y valoraciones que implican espectrofluorometra indican que el
Estndar de Referencia debe prepararse y observarse de una manera idntica a la usada para la muestra en anlisis. Por lo regu-
lar, cuando se prepara una solucin del Estndar de Referencia especificado a (es decir, dentro del 10% de) la concentracin
deseada, la intensidad de fluorescencia se calcula basndose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se haya usado una
muestra previamente secada del Estndar de Referencia, esta intensidad deber corregirse con respecto a la sustancia anhidra.
Las expresiones determinar concomitantemente y medidos(as) concomitantemente segn se usan en los procedimientos que
implican espectrofluorometra indican que la fluorescencia de la solucin muestra y de la solucin estndar, con respecto al
blanco de prueba especificado, deben medirse de manera sucesivamente inmediata.

Preparacin de la Solucin Muestra

Para determinaciones en las que se usa espectrofluorometra UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disol-
vente. A menos que se indique de otro modo en la monografa, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente usan-
do una longitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloro-
formo, hidrocarburos pequeos, teres y soluciones diluidas de cidos fuertes y lcalis. Los disolventes deben estar libres de
contaminantes que emitan fluorescencia en la regin espectral que se est analizando. Para el disolvente, se debe usar metanol
o alcohol exentos de agua, o alcohol que se haya desnaturalizado mediante la adicin de metano!, pero que no contenga ben-
ceno u otras impurezas interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotomtrica que garantizan estar exentos de contami-
nantes estn disponibles comercialmente de diversos proveedores, pero algunos disolventes analticos orgnicos de grado
reactivo pueden contener trazas de impurezas que emiten una fuerte fluorescencia en la regin UV. Se debe verificar la trans-
parencia de los nuevos lotes de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la prepara-
cin de la solucin muestra, de la solucin estndar y del blanco. Se deben usar disolventes que no tengan una seal de fluo-
rescencia interferente a las longitudes de onda de inters. En el uso normal, la intensidad de la lnea base de fluorescencia no
debe ser ms del 2% de la seal de la medicin esperada a menos que se haya justificado previamente un valor mayor.
Las valoraciones en la regin visible por lo regular exigen comparar concomitantemente las intensidades de fluorescencia
producidas por la solucin muestra con la producida por una solucin estndar que contenga una cantidad aproximadamente
igual de un Estndar de Referencia USP. En algunos casos, se puede permitir la omisin del uso de un Estndar de Referencia.
Lo anterior es posible cuando las valoraciones espectrofluoromtricas se llevan a cabo con una frecuencia de rutina, cuando
hay una curva estndar adecuada disponible, preparada con el Estndar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia
valorada cumple con la Ley de Lambert-Beer-Bouguer dentro del intervalo de aproximadamente 75%-125% de la concentra-
cin final usada en la valoracin. En estas circunstancias, la intensidad de fluorescencia encontrada en la valoracin se puede
interpolar en la curva estndar y se puede calcular el resultado de la valoracin. Dichas curvas estndar deben ser confirmadas
con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofluormetros o nuevos lotes de reactivos.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (853) Espectroscopa de Fluorescencia 771

VALIDACIN V VERIFICACIN

Validacin

La validacin es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento basado en espectroscopa de fluorescencia como alter-
nativa al procedimiento oficial. El objetivo de una validacin es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito de-
seado, lo cual incluye lo siguiente: la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o un medicamento
(valoraciones de Categora 1), la determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora 11) y las pruebas de
identificacin (Categora IV). Dependiendo de la categora de la prueba (para informacin adicional, ver la Tabla 2 del captulo
Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225)), el proceso de validacin del procedimiento analtico para fluorescencia re-
quiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisin, el lmite de deteccin, el lmite de cuantifi-
cacin y la robustez. Estas caractersticas de desempeo analtico se aplican a procedimientos con estndar externo y a aqu-
llos que emplean estndar agregado. El captulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedi-
mientos analticos sin indicar criterios de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es
proveer al usuario criterios especficos de validacin que representan las expectativas mnimas para la tecnologa de fluorescen-
cia. Para cada aplicacin particular, pueden requerirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

Para procedimientos de Categora I , Categora 11 y Categora 111, la exactitud se determina realizando estudios de recupera-
cin agregando concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de
la valoracin obtenidos usando el procedimiento de fluorescencia que se est validando con aqullos de un procedimiento
analtico establecido.
Criterios de validacin: 98,0%-102,0% de recuperacin media para un frmaco, 95,0%-105,0% de recuperacin media
para la valoracin de un medicamento y 80,0%-120,0% de recuperacin media para el anlisis de impurezas. Estos criterios
deben cumplirse en todo el intervalo previsto.

Precisin

REPETIBILIDAD

La repetibilidad del procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, la repetibilidad puede
evaluarse midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferen-
tes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente similares para que la repetibilidad sea similar en
todo el intervalo de concentracin. Si esto se lleva a cabo, la repetibilidad en las tres concentraciones se puede combinar para
compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para la valoracin de un frmaco, no ms de
2,0% para un medicamento y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.

Precisin Intermedia

Se debe evaluar el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento. Las variables tpicas
incluyen realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o ms analistas realicen el mtodo. Como
mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveern una estima-
cin de la precisin intermedia.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para un frmaco, no ms de 3,0% para la valora-
cin de un medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

En las mediciones de fluorescencia, la especificidad se asegura mediante el uso de un Estndar de Referencia siempre que sea
posible y se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz.
Criterios de validacin: Se demuestran cumpliendo con los requisitos de exactitud.

LMITES DE DETECCIN

El lmite de deteccin (DL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de seis
mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviacin estndar puede determi-
772 (853) Espectroscopa de Fluorescencia / Pruebas Fsicas USP 39

narse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibracin o demostrando que la relacin seal-ruido es >3,3.
Adems, se debe confirmar el lmite de deteccin estimado analizando muestras a la concentracin calculada.

LMITE DE CUANTIFICACIN

El lmite de cuantificacin (QL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de
seis mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 1 O. Como alternativa, la desviacin estndar puede de-
terminarse a partir del error en la ordenada al origen de una curva de calibracin o demostrando que la relacin seal-ruido es
>10.
Para confirmar una sensibilidad suficiente y una precisin adecuada, se mide una solucin de muestra preparada a partir de
una matriz de muestra representativa a la que se le han agregado cantidades conocidas a la concentracin del lmite de cuanti-
ficacin requerido. La relacin seal-ruido observada en el lmite de cuantificacin requerido debe ser >1 O.
Criterios de validacin: Para considerar que el lmite de cuantificacin estimado es vlido, la concentracin medida debe ser
exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificacin.

LINEALIDAD

Se prepara una curva de respuesta entre la concentracin del analito y la seal de fluorescencia a partir de no menos de
cinco Soluciones estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la solucin muestra. Posterior-
mente, se debe evaluar la linealidad de la curva estndar usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de
cuadrados mnimos. La desviacin de la linealidad pude derivarse de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y pue-
de reducirse a niveles aceptables mediante la reduccin de la concentracin del analito y, por consiguiente, de los valores de
absorbancia relacionados.
Criterios de validacin: El coeficiente de correlacin (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categora 1 y no
menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categora 11.

INTERVALO

El intervalo de operacin de un instrumento analtico (y el procedimiento analtico en su totalidad) es el intervalo entre las
concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha
demostrado que la funcin de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora 1, el intervalo de validacin para criterios de aceptacin centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptacin no centrados, el intervalo de validacin es 10,0% por debajo del lmite
inferior hasta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validacin es 70,0o/o-
1 30,0%. Para pruebas de Categora 11, el intervalo de validacin abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptacin.

ROBUSTEZ

Se debe demostrar la confiabilidad de una medicin analtica mediante cambios deliberados en los parmetros experimenta-
les. En el caso de la fluorescencia, estos cambios pueden incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de
almacenamiento especificadas, la variacin del pH, la eliminacin del oxgeno y la adicin de posibles muestras interferentes,
por citar algunos ejemplos. Los analistas deben determinar la robustez de manera simultnea usando un diseo experimental
adecuado.

Verificacin

Los procedimientos analticos descritos en los compendios USP-NF no requieren validacin. En vez de esto, se usa una verifi-
cacin para determinar la aptitud de un procedimiento en condiciones reales de uso.
Por lo tanto, el objetivo de la verificacin del procedimiento de fluorescencia es demostrar la aptitud de un procedimiento
de prueba en condiciones reales de uso. Las caractersticas de desempeo que verifican la aptitud de un procedimiento de
fluorescencia son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analtico. Para informacin adicional, el captulo Verifi-
cacin de Procedimientos Farmacopeicos (1226) incluye un anlisis sobre los principios generales aplicables. La verificacin debe
realizarse usando material de referencia y una matriz bien definida. La verificacin de los procedimientos farmacopeicos de
fluorescencia deben, como mnimo, incluir la ejecucin de los parmetros de validacin para especificidad, exactitud, precisin
y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme a lo indicado en Validacin.

Requisitos para Mediciones Indirectas

Algunos procedimientos de fluorescencia emplean reacciones cromognicas. Por lo general, se deben usar los requisitos para
los parmetros de desempeo analtico. En algunos casos, puede no ser posible conseguir la exactitud y la precisin requeridas
USP 39 Pruebas Fsicas/ (854) Espectroscopa en el Infrarrojo Medio 773

para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisin pueden ampliarse hasta un 50%.
Sin embargo, cualquier ampliacin de este tipo debe justificarse con bases cientficas y pruebas documentadas. En tales casos,
podra incrementarse la cantidad de repeticiones requeridas para producir un valor de informe cientficamente slido.

(854) ESPECTROSCOPA EN EL INFRARROJO MEDIO

INTRODUCCIN

La espectroscopa en el infrarrojo medio es un mtodo instrumental que se usa para medir la absorcin de la radiacin elec-
tromagntica sobre el intervalo de nmero de onda entre 4000 y 400 cm-1 (correspondiente a longitudes de onda entre 2,5 y
25 m). A menos que se especifique algo diferente en una monografa u otro procedimiento validado, se debe usar la regin
de 3800 a 650 cm-1 (correspondiente a longitudes de onda de 2,6 a 15 m) para asegurar el complimiento con las especifica-
ciones de la monografa para absorcin IR. La absorcin de fotones ocasiona la promocin de molculas de un estado funda-
mental de su modo vibratorio a un estado vibratorio excitado.
Los modos vibratorios se definen por el movimiento de todos los tomos en una molcula. Cuando las molculas contienen
ciertos grupos funcionales, la absorcin IR a menudo ocurre en intervalos espectrales estrechos especficos. En estos casos, los
nmeros de onda en los que ocurren dichas transiciones se conocen como frecuencias de grupos funcionales. Cuando un mo-
do vibratorio implica movimientos atmicos de ms de unos pocos tomos, las frecuencias ocurren en intervalos espectrales
ms amplios y no son caractersticos de un grupo funcional particular, sino que son ms caractersticos de las molculas en
conjunto. Dichas bandas se conocen como bandas de huella dactilar. Todas las bandas fuertes que absorben a nmeros de
onda por encima de 1500 cm- 1 son frecuencias de grupos funcionales. Las bandas fuertes que absorben por debajo de 1500
cm- 1 pueden ser frecuencias de grupos funcionales o bandas de huella dactilar.
Para obtener informacin sobre la teora y principios de las mediciones, ver Espectroscopa en el Infrarrojo Medio-Teora y
Prctica (1854), que puede ser un recurso til aunque no es obligatorio.

CALIFICACIN DE ESPECTROFOTMETROS IR

La calificacin de espectrofotmetros en el infrarrojo medio se divide en tres componentes: Calificacin de la Instalacin (IQ,
por sus siglas en ingls), Calificacin Operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y Calificacin del Desempeo (PQ, por sus siglas en
ingls). Para obtener informacin adicional, ver el captulo Calificacin de Instrumentos Analticos (1058).

Calificacin de la Instalacin

Los requisitos de calificacin de la instalacin proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuada-
mente en el lugar deseado.

Calificacin Operativa

Debido a que la mayora de los espectros de IR medio se miden mediante espectrofotmetros IR por transformada de Fou-
rier (FTIR, por sus siglas en ingls), este captulo nicamente trata de dichos instrumentos. [NOTA-Este captulo no incluye
valores recomendados para la relacin seal-ruido o estabilidad de la lnea al 100% debido a que pueden variar dependiendo
del fabricante, modelo y edad del instrumento.]

EXACTITUD DEL NMERO DE ONDA

El estndar de nmero de onda de uso ms comn para espectrofotometra IR es una pelcula de poliestireno mate de apro-
ximadamente 35 m de espesor. El espectro de dicha pelcula presenta varias bandas pronunciadas a 3060,0; 2849,5; 1942,9;
1601,2; 1583,0; 1154,5 y 1028,3 cm- 1 La banda que se selecciona con mayor frecuencia para la determinacin de la exacti-
tud del nmero de onda se encuentra a 1601,2 cm- 1 Usando una pelcula de poliestireno adecuada u otro estndar de nme-
ro de onda bien caracterizado, barrer nmeros de onda desde 3800 hasta 650 cm- 1 y comparar el nmero de onda de la res-
puesta mxima de la banda seleccionada, usando el centro de gravedad, el procedimiento de polinomios spline u otros algo-
ritmos de seleccin de picos, con el nmero de onda de absorcin conocido del estndar. La tolerancia aceptable para el n-
mero de onda medido es 1,0 cm- 1
774 (854) Espectroscopa en el Infrarrojo Medio/ Pruebas Fsicas USP 39

Calificacin del Desempeo

El propsito de la calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todos los parmetros que pueden afectar la calidad de la medicin.

PROCEDIMIENTO

Los espectros en el infrarrojo medio se pueden medir mediante transmisin, reflexin externa, reflexin interna (a menudo
denominada reflexin atenuada total), reflexin difusa y espectroscopa fotoacstica. Se encuentran disponibles diversas tcni-
cas de preparacin de la muestra para dichas opciones. A continuacin se presentan las tcnicas ms comunes de preparacin
de muestra.

Discos de Bromuro de Potasio (KBr)

Algunos haluros alcalinos en polvo tales como bromuro de potasio, cloruro de potasio y yoduro de cesio se fusionan a alta
presin y pueden formar discos autoportantes que son transparentes a la radiacin en el infrarrojo medio. El haluro alcalino
que se usa ms comnmente es el bromuro de potasio seco en polvo de alta pureza, que es transparente a una radiacin en el
infrarrojo medio por encima de 400 cm- 1
Se encuentran disponibles prensas y matrices comerciales en una variedad de dimetros para la preparacin de discos de
haluros alcalinos y similares.

Suspensiones de Aceite Mineral

Un procedimiento tpico para preparar una suspensin es colocar 10-20 mg de la muestra en un mortero de gata y luego
moler la muestra hasta obtener un polvo con un tamao fino de partcula aplicando un movimiento rotatorio y vigoroso con la
mano del mortero. Se agrega una pequea gota del agente de suspensin al mortero. El movimiento rotatorio de la mano del
mortero se usa para mezclar los componentes hasta formar una pasta uniforme, la cual se transfiere al centro de una ventana
limpia y transparente para IR (p.ej., bromuro de potasio, cloruro de sodio, bromuro de plata o yoduro de cesio). Se coloca una
segunda ventana igual, que calce sobre la parte superior de la suspensin y se aplica presin a la suspensin para formar una
pelcula delgada y translcida libre de burbujas.
El agente de suspensin ms usado para la regin del infrarrojo medio es aceite mineral de hidrocarburos saturados (parafina
lquida, Nujol).

Pelculas de Polmero Autoportantes

En ocasiones, el espectro de transmisin en el infrarrojo medio de muchos polmeros usados como materiales de envasado
se registra a partir de muestras preparadas a manera de pelculas delgadas autoportantes usando moldeado por compresin en
calor o microtoma.

Pelculas Capilares

Los lquidos no voltiles pueden examinarse sin diluirlos, usando una capa delgada colocada entre dos ventanas iguales que
sean transparentes a la radiacin en el infrarrojo medio. La capa de lquido debe estar exenta de burbujas y cubrir completa-
mente el dimetro del haz del infrarrojo que se enfoca sobre la muestra.

Lquidos y Soluciones en Celdas de Transmisin

Para examinar muestras lquidas y en solucin, se encuentran disponibles comercialmente montajes de celdas de transmisin
que constan de un par de ventanas, un espaciador, puertos de llenado y un soporte, en configuraciones para macro y micro
muestras.
Para aplicaciones de laboratorio, los espaciadores por lo regular estn hechos de plomo, poli(tetrafluoroetileno) o poli(etiln
tereftalato) y, dependiendo de los materiales del espaciador, se pueden ofrecer en longitudes de paso con espesores estndar
que van de aproximadamente 6 m hasta 1 mm o ms.

Gases

Las celdas de transmisin de infrarrojo medio para muestreo esttico o en flujo de gases y vapor estn disponibles en una
amplia variedad de materiales que se ajustan a la aplicacin, desde escalas de laboratorio hasta escalas de proceso. En el labo-
ratorio, la celda tradicional para gas ha sido un cilindro de 1O cm de largo hecho de vidrio de borosilicato o acero inoxidable
con una apertura de aproximadamente 40 mm en cada extremo. Cada extremo abierto est cubierto con una tapa que con-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (854) Espectroscopa en el Infrarrojo Medio 775

tiene una ventana transparente para infrarrojo medio hecha de, por ejemplo, bromuro de potasio, selenio de cinc o fluoruro
de calcio.

Reflexin Total Atenuada

La espectroscopa de reflectancia total atenuada se basa en el fenmeno ptico de la radiacin pasando a travs de un me-
dio con un alto ndice de refraccin a un cierto ngulo de incidencia que se refleja totalmente de manera interna en un borde
que est en contacto con un material con un ndice de refraccin ms bajo. El medio con alto ndice de refraccin tambin se
conoce como elemento de reflexin interna.
La muestra en anlisis debe colocarse en contacto cercano con el elemento de reflexin interna, por ejemplo, diamante, ger-
manio, selenuro de cinc u otro material adecuado con un alto ndice de refraccin. El contacto cercano y uniforme entre la
sustancia y toda la superficie de cristal debe asegurarse mediante la aplicacin de presin para las muestra slidas o disolvien-
do la sustancia en el disolvente apropiado y luego cubriendo el elemento de reflexin interna con la solucin y evaporndola
hasta sequedad.

Reflexin Difusa

La forma ms importante y de uso comn para la preparacin de muestras para reflexin difusa es diluir la muestra mezcln-
dola ntimamente con diluyentes transparentes al infrarrojo al 90%-99% tales como bromuro de potasio o cloruro de potasio
reducidos a polvo fino. Diluir la muestra tiene el beneficio adicional de reducir las intensidades de las bandas de absorcin
hasta un nivel apropiado.

Muestreo Microscpico

Acoplar un microscopio de luz a un espectrofotmetro de infrarrojo medio permite obtener espectros a partir de muestras
muy pequeas. Esto generalmente se aplica a modos de transmitancia o reflectancia y provee, por ejemplo, una herramienta
poderosa para obtener datos espectroscpicos de contaminantes en muestras farmacuticas.

VALIDACIN V VERIFICACIN

Validacin

La validacin es necesaria cuando se pretende usar un mtodo IR como alternativa al procedimiento oficial para analizar un
artculo oficial.
El objetivo de una validacin de un mtodo IR es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito deseado, el cual
incluye la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o medicamento (valoraciones de Categora 1), la
determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora 11) y las pruebas de identificacin (Categora IV, ver la
Tabla 2 en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225)). Dependiendo de la categora de la prueba, la validacin del
proceso para IR puede requerir el anlisis de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisin, el lmite de
deteccin, el lmite de cuantificacin y la robustez. Si el procedimiento IR emplea un modelo quimiomtrico calculado en fun-
cin de la respuesta de otra tecnologa analtica (p.ej., HPLC), entonces se debern aplicar los principios del captulo Espectros-
copa en el Infrarrojo Cercano (1119), especficamente la seccin Validacin del Mtodo.
El captulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios
de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios especfi-
cos de validacin representativos de las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplicacin particular, pueden re-
querirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

Para procedimientos de Categora 1y 11, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperacin agregando
concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Tambin es una prctica aceptable comparar los resultados de la
valoracin obtenidos usando el procedimiento IR que se est validando con aqullos obtenidos de un procedimiento analtico
alternativo establecido.
Criterios de validacin: 98,0%-102,0% de recuperacin media para frmacos, 95,0%-105,0% de recuperacin media para
la valoracin de un medicamento y 70,0%-150,0% de recuperacin media para el anlisis de impurezas. Estos criterios deben
cumplirse en todo el intervalo previsto.
776 (854) Espectroscopa en el Infrarrojo Medio/ Pruebas Fsicas USP 39

PRECISIN

Repetibilidad: El procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de seis preparaciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, se puede basar en medi-
ciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres con-
centraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentra-
cin. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para un frmaco, no ms de 2,0% para un medi-
camento y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.
Precisin intermedia: Es necesario evaluar el efecto de la precisin analtica ocasionado por cambios en las variables tales
como realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o ms analistas realicen el mtodo. Como
mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores en un total de seis experimentos proveern una estimacin
de la precisin intermedia.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para un frmaco, no ms de 3,0% para la valora-
cin de un medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

Para las pruebas de Categora IV, se debe asegurar la identidad del analito. Con respecto a los procedimientos de Categora 1
y 11, el requisito de exactitud tambin demuestra la especificidad para los analitos esperados.
En el caso de las pruebas de identificacin, se debe demostrar la capacidad de seleccionar entre compuestos cuyas estructu-
ras estn estrechamente relacionadas y que probablemente estarn presentes. Esto debe confirmarse obteniendo resultados
positivos (quizs mediante comparacin con un material de referencia conocido) a partir de muestras que contengan el anali-
to, junto con resultados negativos obtenidos de muestras que no contengan el analito y confirmando que los materiales con
estructura similar o estrechamente relacionados con el analito no generan una respuesta positiva.

LMITE DE CUANTIFICACIN

El lmite de cuantificacin se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de 6 mediciones repetidas de
una solucin blanco, dividida por la pendiente de la lnea de calibracin y multiplicando por 1 O. Se pueden usar otros enfo-
ques adecuados (ver el captulo (1225)). Se debe llevar a cabo una medicin de una matriz de muestra representativa a la
concentracin de lmite de cuantificacin estimada para confirmar la exactitud.
Criterios de validacin: Para considerar que el lmite de cuantificacin estimado es vlido, la concentracin medida debe ser
exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificacin.

LINEALIDAD

Una relacin lineal entre la concentracin del analito y la respuesta del espectro IR se demuestra preparando no menos de 5
preparaciones estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la preparacin de prueba. Posterior-
mente, la curva estndar debe evaluarse usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de cuadrados mni-
mos. Para experimentos que no generen una relacin lineal entre la concentracin de analito y la respuesta del espectro IR, se
deben aplicar mtodos estadsticos apropiados para describir la respuesta analtica.
Criterios de validacin: Coeficiente de correlacin (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categora 1y no menos de
0,99 para pruebas cuantitativas de Categora 11

INTERVALO

Este parmetro se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisin y exactitud.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora 1, el intervalo de validacin para criterios de aceptacin centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptacin no centrados, el intervalo de validacin es 10,0% por debajo del lmite
inferior hasta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validacin es 70,0%-
130,0%. Para pruebas de Categora 11, el intervalo de validacin abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptacin.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medicin analtica se demuestra mediante cambios deliberados en los parmetros experimentales.
Para el infrarrojo medio, esto puede incluir cambios en el procedimiento de preparacin de la muestra o cambios en la confi-
guracin del hardware, entre otros.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (855) Nefelometra, Turbidimetra y Comparacin Visual 777

Verificacin

Las reglamentaciones de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes para los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 211. l 94(a)(2)] indi-
can que los usuarios de los procedimientos analticos, segn se describen en los compendios USP-NF, no estn obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografa. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su
aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificacin del procedimiento IR es demostrar que el mtodo, segn se describe en las monografas espe-
cficas, se est ejecutando con una exactitud, sensibilidad y precisin adecuadas. El captulo Verificacin de Procedimientos Far-
macopeicos (1226) indica que si la verificacin del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografa, no resulta exitosa, el
procedimiento no es adecuado para su uso con el artculo en anlisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y vali-
dar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
Aunque no se requiere una revalidacin completa de un procedimiento farmacopeico, la verificacin del procedimiento far-
macopeico de infrarrojo medio incluye la ejecucin de ciertos parmetros crticos. Cuando el mtodo que se est verificando
sea para propsitos de identificacin, el nico parmetro requerido ser la especificidad. Para aplicaciones cuantitativas, se es-
tudian parmetros de validacin adicionales, los cuales, por lo general, incluyen exactitud, precisin y lmite de cuantificacin,
conforme a lo indicado en Validacin.

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111M1~~~~in,1i!~~1.~i!i1'.~l~.~;:~ll9;rUJ:i:M~Q'1vg~s .n~tl~M~rr~~sr~fu~~n ijorr:f&t(ij!J!i!.~Bto.~~r:i.ij~~~tQi:i~lg~.~i11~
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~iildifrl~:un~;9t,1t~~'.9Q~.:y:;lais~ma ~t:r;:~q~tcf:l l;feltjz arspe!'Sada ttr,i'1f jrf. medit:i.o~1~~ttan$Ml.tli(i1: El:b~n~fl~o
d.b~iiurl~!~~aml ~~liidim~tf~~e~a[a:tloas.que la 'medidn .qe 1uz:p~dlda sev1;Jel~ifla:P~ia:P~'las.4.rtiQ.aC!es 1:e.~utbi~
de!ad:e U:n nefalrmatr.() ~liPi'adcf~~ deril!Jf;!:linh unidades de turbidez nefelortitric:as (NTU,~r sus sigla~ .eri ngl~s). Las f'.l'f!J
778 (855) Nefelometra, Turbidimetra y Comparacin Visual / Pruebas Fsicas USP 39

exigen especficamente una tcnica de medicin a 90 y tambin se basan en la turbidez generada por formazina (una suspen-
sin que se prepara mezclando soluciones de sulfato de hidrazina y hexametlentetramna en agua), aunque en la actualidad,
se encuentran disponibles comercialmente suspensiones de perlas de polmeros ms seguras que se reconocen como una alter-
nativa aceptable. Otras unidades reconocidas para turbidez incluyen la unidad de turbidez de formazina (FTU, por sus siglas en
ingls) y la unidad nefelomtrica de formazina (FNU, por sus siglas en ingls) y cuando las mediciones en estas unidades se
realizan a 90conforme a lo descrito anteriormente, dichas unidades son comparables a las NTU.
En la prctica, se recomienda estar seguro de que la sedimentacin de las partculas que se estn midiendo sea inapreciable.
Por lo general, se logra asegurar que la sedimentacin de las partculas es inapreciable incluyendo un coloide protector en el
medio de suspensin lquido. Es importante que los resultados se interpreten mediante comparacin de las lecturas con aqu-
llas que representan concentraciones conocidas de materia suspendida, producidos exactamente en las mismas condiciones.
La turbidimetra o nefelometra puede ser til para la medicin de precipitados formados mediante la interaccin de solucio-
nes altamente diluidas de reactivos u otras partculas tales como suspensiones de clulas bacterianas. Para lograr resultados
consistentes, todas las variables deben controlarse cuidadosamente. Cuando es posible lograr dicho control, se pueden medir
suspensiones extremadamente diluidas.
El soluto de muestra se disuelve en el disolvente a diversas concentraciones diferentes conocidas con exactitud, en donde la
seleccin de concentraciones depende del peso molecular del soluto y van desde 1% para Mw = 1O000 hasta 0,01 % para Mw =
1 000 000. Antes de obtener las mediciones, cada solucin debe limpiarse con sumo cuidado mediante filtracin repetida a
travs de filtros finos (las monografas especficas proveern instrucciones para la filtracin de la muestra). Una partcula de
polvo en la solucin vicia la intensidad de la luz dispersa medida. Un criterio para una solucin transparente es que la disime-
tra, cociente de intensidad dispersa a 45/135, haya alcanzado un mnimo.
Se mide la turbidez y el ndice de refraccin de las soluciones. A partir de la ecuacin general de dispersin de luz a 90, se
genera una grfica de HC/r. en funcin de C y se extrapola hasta dilucin infinita, y el peso molecular pron;)edio en peso, M, se
calcula a partir de la interseccin, 1 /M.
En los sistemas polidispersos, la concentracin, la turbidez y el peso molecular promedio se relacionan mediante la ecuacin:
HC/t = 1/M
H = grupo de constantes [(16itK)/3] a partir de las ecuaciones de dispersin usadas para relacionar intensidades con la turbi-
dez
C = concentracin
r. = coeficiente de turbidez
M= peso molecular promedio en peso

Comparacin Visual
Cuando se indica la comparacin de un color o turbidez, se deben usar tubos para comparacin de color lo ms parecidos
posible con respecto al dimetro interno y a todas las dems caractersticas. Para la comparacin de color, los tubos deben
observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con ayuda de una fuente de luz dirigida desde abajo de la parte inferior de los
tubos. Sin embargo, para la comparacin de turbidez, los tubos deben observarse de manera horizontal contra un fondo oscu-
ro con ayuda de una fuente de luz dirigida desde los costados de los tubos. Al realizar pruebas de lmite que impliquen una
comparacin de colores en dos recipientes similares (p.ej., tubos idnticos para comparacin de color), se puede usar un ins-
trumento adecuado en lugar de la observacin visual directa.
Cuando se indica una comparacin de turbidez:
Recipientes para comparacin: Se deben usar tubos para comparacin de color lo ms parecidos posible con respecto al
dimetro interno y a todas las dems caractersticas.
Condiciones de observacin: Los tubos deben observarse .de manera horizontal contra un fondo oscuro con ayuda de una
fuente de luz dirigida desde los costados de los tubos.
Cuando se instruye una comparacin de color:
Recipientes para comparacin: Se deben usar tubos para comparacin de color lo ms parecidos posible con respecto al
dimetro interno y a todas las dems caractersticas.
Condiciones de observacin: La iluminacin tpica de cuarto es adecuada para llevar a cabo la evaluacin. Se puede usar
una fuente de luz si Ja prctica es uniforme entre los materiales que se estn comparando.
4USP39
USP 39 Pruebas Fsicas/ (857) Espectroscopa UV-Vis 779

(857) ESPECTROSCOPA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

INTRODUCCIN

Los espectros en el ultravioleta-visible (UV-Vis) se obtienen cuando la interaccin entre la radiacin incidente y la nube de
electrones en un cromforo resulta en una transicin de electrones, la cual implica la promocin de uno o ms de los electro-
nes de la capa externa o de unin de un estado fundamental a un estado de energa ms elevado. Las bandas de los espectros
UV y visibles de las sustancias por lo general son amplias y sin un alto grado de especificidad para identificacin de compues-
tos. Sin embargo, son adecuados para valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son tiles como formas
adicionales de identificacin.
En la ley de Lambert-Beer, la absorbancia (A;) de una solucin a una longitud de onda dada, A, se define como el logaritmo
en base 1O de la inversa de la transmitancia (T,):

I; = intensidad de la radiacin transmitida a la misma longitud de onda A

fw = intensidad de la radiacin incidente a la longitud de onda A
Ante la ausencia de cualquier otro factor fsico o qumico, A; es proporcional a la longitud del paso o camino ptico, b, a
travs del cual pasa la radiacin, y a la concentracin, e, de la sustancia en la solucin de acuerdo con lo siguiente:

= absortividad molar
IJ;.
e= concentracin de soluto (mol/L)
b =longitud de paso (cm)
Si la concentracin, e, se expresa en g/L, la constante IJ;_ se vuelve a;, la cual se denomina absortividad.
La expresin
.111%
~cm

que representa la absorbancia especfica de una sustancia disuelta, se refiere a la absorbancia de una solucin de 1Og/L (al 1%
m/v) en una celda de 1 cm medida a una longitud de onda definida, de modo que:

M = concentracin molar de la solucin

Cuando se miden soluciones en celdas de 1 cm, las concentraciones de aproximadamente 1 O g de la muestra por mL a
menudo producen absorbancias de 0,2-0,8 en la regin UV o visible.
Para obtener informacin sobre teora y principios de mediciones, ver el captulo de informacin general Espectroscopa Ul-
travioleta-Visible-Teora y Prctica (1857), el cual no es un recurso obligatorio.

CALIFICACIN DE ESPECTROFOTMETROS UV-VIS

La aptitud de un instrumento especfico para un procedimiento dado se asegura usando una evaluacin paso a paso del
ciclo de vida para la aplicacin deseada desde la seleccin hasta el retiro del instrumento: calificacin del diseo (DQ, por sus
siglas en ingls); calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls); una calificacin inicial del desempeo con respecto
a la especificacin, tambin conocida como calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls); y una calificacin continua del
desempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para ms detalles, ver el captulo Calificacin de Instrumentos Analticos (1058).
El propsito de este captulo es proveer mtodos de prueba y criterios de aceptacin para asegurar que el instrumento es
adecuado para su uso previsto (calificacin operativa) y que continuar funcionando adecuadamente durante periodos exten-
sos como parte de la calificacin del desempeo. Al igual que con cualquier dispositivo espectromtrico, se debe calificar la
exactitud y precisin de la longitud de onda (eje x) y fotomtrica (eje y o eje de seal) de un espectrofotmetro UV-Vis, ade-
ms de que se deben establecer los parmetros fundamentales de luz espuria y de resolucin. La calificacin operativa debe
abarcar los intervalos operativos requeridos en el laboratorio para las escalas de absorbancia y de longitud de onda.

Calificacin de la Instalacin

Los requisitos de calificacin de la instalacin proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuada-
mente en el lugar deseado.
780 (857) Espectroscopa UV-Vis /Pruebas Fsicas USP 39

Calificacin Operativa

Los criterios de aceptacin para parmetros crticos del instrumento que establecen la "aptitud para su propsito" se verifi-
can durante la calificacin de la instalacin y la calificacin operativa. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones par-
ticulares pueden variar dependiendo del procedimiento analtico usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los provee-
dores de instrumentos a menudo proveen muestras y parmetros de prueba como parte del paquete de Calificacin de la Ins-
talacin/Calificacin Operativa.
Siempre que sea posible para los procedimientos detallados a continuacin, se deben usar materiales de referencia certifica-
dos (CRM, por sus siglas en ingls) en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Dichos materiales de referencia certifi-
cados deben obtenerse de una fuente acreditada reconocida, y deben incluir asignaciones de valores rastreables y verificados
de manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas. Los materiales de referencia certificados deben mante-
nerse limpios y libres de polvo. La recertificacin debe llevarse a cabo peridicamente para mantener la validez de la certifica-
cin.

Control de Longitudes de Onda

Se debe asegurar que la exactitud del eje de la longitud de onda (eje x) en todo el intervalo operativo deseado sea correcto
dentro de los lmites aceptables.
Para instrumentos sin detectores de arreglo de diodos, la exactitud y la precisin de la longitud de onda se determinan en
todo el intervalo operativo usando al menos seis mediciones repetidas. Para la exactitud de la longitud de onda, la diferencia
entre el valor medio medido y el valor certificado del CRM no debe exceder 1 nm en la regin UV (200-400 nm), mientras
que en la regin visible (400-700 nm) no debe exceder 2 nm. Para la precisin de la longitud de onda, la desviacin estndar
de la media no debe exceder 0,5 nm. Para instrumentos con arreglo de diodos, se requiere nicamente la medicin de la exac-
titud de una longitud de onda, y no es necesario realizar la determinacin de la precisin. La diferencia entre el valor certifica-
do y el medido del material de referencia certificado no debe exceder 1 nm en la regin UV (200-400 nm), mientras que en
la regin visible (400-700 nm) no debe exceder 2 nm.

ESPECTROS DE LNEAS ATMICAS

Este procedimiento se describe como la aplicacin primaria debido a que las lneas de emisin producidas a partir de una
lmpara de descarga son caractersticas del elemento fuente y, como estndar fsico fundamental, dichas longitudes de onda
han sido medidas con una incertidumbre de no ms de 0,01 nm. En la espectrometra en solucin, la exactitud de la longi-
tud de onda requerida raramente excede 0,5 nm. Por estas razones, los valores del estndar de lneas atmicas se citan sin la
incertidumbre. La lmpara debe colocarse en la posicin de la fuente del espectrofotmetro; por lo tanto, slo se puede usar
en espectrofotmetros que puedan operarse en un modo de simple haz y en la prctica, slo debe implementarse en un siste-
ma diseado para acomodar dichas fuentes, por ejemplo, como un accesorio.
Las lmparas de mercurio de baja presin comnmente empleadas tienen una variedad de lneas intensas que abarcan una
gran parte de los espectros UV y visibles. Los fabricantes usan a menudo dos lneas de deuterio de la fuente a 486,0 y 656, l
nm como una verificacin interna de la calibracin y se pueden usar para propsitos de diagnstico (ver la Tabla 7). 1
Tabla 1. Lneas Atmicas Recomendadas a partir de Lmparas de Mercurio y Deuterio de Baja Presin para Calibracin de
Longitudes de Onda
Elemento nm
Hg 253,7
Hg 296,7
Hg 365,0
Hg 404,7
Hg 435,8
D2 486,0
Hg 546,l
Hg 577,0
Hg 579,1
D2 656,1

SOLUCIONES DE XIDOS DE TIERRAS RARAS

Este procedimiento emplea soluciones de xidos de tierras raras que se preparan mediante disolucin en medios cidos. La
ms utilizada est compuesta de xido de holmio en cido perclrico. La solucin de xido de holmio ha sido aceptada inter-

1 Los valores redondeados se toman de la Norma E275-08 de la ASTM.

 USP 39 Pruebas Fsicas/ (857) Espectroscopa UV-Vis 781

nacionalmente como un estndar de longitud de onda intrnseco, y se encuentran disponibles comercialmente materiales de
referencia certificados. 2 Los mximos de picos observados se determinan usando el modo de barrido normal en el espectrofo-
tmetro. Los mximos de picos para una solucin al 4% m/v de xido de holmio en cido perclrico a un ancho de banda
espectral de 1,0 nm y una longitud de paso de 1 cm se presentan en la Tabla 2.3
Tabla 2. Mximos de Picos Recomendados a partir de una Solucin al 40/o de xido de Holmio en cido Perclrico para Calibracin
de Longitudes de Onda
nm
241,1
249,9
278,1
287,2
333,5
345,4
361,3
385,6
416,3
451,4
467,8
485,2
536,6
640,5

Si el intervalo operativo del espectrofotmetro se encuentra fuera del intervalo de 240-650 nm, se pueden usar otros xidos
de tierras raras certificados u otras soluciones siempre que sean rastreables a un estndar nacional o internacional. El didimio
(una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estndar rastreable tanto en solucin como en vi-
drio. El didimio es similar en su preparacin a los materiales de holmio y tiene picos caractersticos tiles en la regin de 730-
870 nm. Los picos tiles se encuentran en la solucin de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0; 794, 1; 799,0 y 864,4 nm.

MATERIALES VTREOS DE TIERRAS RARAS

Este procedimiento usa vidrios que se fabrican fundiendo el xido de tierra rara en una matriz vtrea base. El material de uso
ms frecuente es el holmio, cuyas longitudes de onda de referencia han sido bien definidas. Aunque la fabricacin puede oca-
sionar variacin entre las partidas de estos vidrios, pueden utilizarse materiales de referencia certificados comercialmente dis-
ponibles. Los valores tpicos para vidrio de holmio usando un ancho de banda espectral de 1,0 nm son los siguientes: 241,5;
279,2; 287,5; 333,8; 360,9; 418,8; 445,8; 453,7; 460,2; 536,5 y 637,7 nm.

Control de Absorbancia

Para establecer la exactitud, la precisin y la linealidad de la transmitancia de un sistema dado, es necesario verificar la exac-
titud de la absorbancia de un sistema a lo largo de su intervalo operativo usando los siguientes procedimientos segn corres-
ponda para los intervalos requeridos de longitud de onda y absorbancia.

SOLUCIONES DE DICROMATO DE POTASIO CIDO EN CIDO PERCLRICO 0,001 M

En el intervalo de 0-200 mg/L, las soluciones de dicromato de potasio proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de
absorbancia a uno de los valores certificados de 235; 257; 313 350 nm. Estas soluciones estn disponibles como materiales
de referencia certificados o se pueden preparar de acuerdo con el estndar SRM 935a del NIST. Cuando se usan soluciones de
dicromato de potasio, la exactitud de la absorbancia debe ser 1%A (para valores por encima de l ,OA) o 0,01 OA (para valores
por debajo de l ,OA), lo que sea mayor. La precisin de la absorbancia se puede determinar como la desviacin estndar de al
menos seis mediciones repetidas en dos o ms niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviacin estndar
no debe exceder 0,5%A (para valores por encima de l ,OA) o 0,005A (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea mayor.

2 La norma NIST SRM 2034 ya no est disponible.

3 Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorcin estndar a la longitud de onda intrnseca disponibles en: Travis JC, Acosta JC, Andor G, et
al. lntrinsic wavelength standard absorption bands in holmium oxide solution for UV/visible molecular absorption spectrophotometry. f Phys Chem Ref Data.
2005;34(1 ):41-57. La incertidumbre mxima de la medicin al 95% es 0,06 nm.
 782 (857) Espectroscopa UV-Vis / Pruebas Fsicas USP 39

FILTROS DE VIDRIO DE DENSIDAD PTICA NEUTRA

Estos filtros de vidrio grises se fabrican con vidrio dopado y tienen un espectro nominalmente plano en la regin de las lon-
gitudes de onda de calibracin. Adems, proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de absorbancia a los valores certifi-
cados de 440; 465; 546, 1; 590 y 635 nm. Estos filtros estn disponibles como materiales de referencia certificados que son
rastreables a los estndares SRM 930e, 1930 y 2930 del NIST. Se pueden usar otras soluciones estndar o filtros pticos certifi-
cados siempre que sean rastreables a un estndar nacional o internacional. Cuando se usan filtros grises, la exactitud de la
absorbancia debe ser 0,8%A (para valores por encima de l ,OA) o 0,00BOA (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea
mayor. La precisin de la absorbancia se puede determinar como la desviacin estndar de al menos seis mediciones repetidas
en dos o ms niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviacin estndar no debe exceder 0,5%A (para
valores por encima de 1,0A) o 0,005A (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea mayor.

Lmite de Luz Espuria (Energa Radiante Espuria)

Aunque la medicin de absorbancia o transmitancia es una medicin de cocientes de intensidades y, por lo tanto, es terica-
mente independiente de la fuente intensidad monocromtica, la presencia de radiacin no deseada llamada "energa radiante
espuria" o ;'luz espuria" afecta las mediciones en la prctica. Adems, el efecto adverso de la luz espuria se incrementa con el
envejecimiento de los componentes pticos y lmparas de un espectrofotmetro. Los efectos son ms pronunciados en los
extremos de los intervalos operativos del detector y de la lmpara. Se debe monitorear el nivel de luz espuria a las longitudes
de onda apropiadas como parte de la calificacin del desempeo. La luz espuria puede detectarse a una longitud de onda
dada con un filtro lquido adecuado. Estas soluciones estn disponibles como materiales de referencia certificados o se pueden
preparar a las concentraciones presentadas en la Tabla 3 usando materiales de grado reactivo.
Ta bl a 3 . 1nterva os Espectra es d e M ater1a 1es se 1ecc ona d os para Mon 1toreo d e Luz Espura
Intervalo Espectral
(nm) Lquido o Solucin
190-205 Cloruro de potasio acuoso (12 g/L)
210-259 Yoduro de sodio o yoduro de potasio acuosos (1 O g/L)
250-320 Acetona
300-385 Nitrito de sodio acuoso (50 g/L)

Cuando se usa una celda con longitud de paso de 5 mm (rellena con el mismo filtro) como celda de referencia y luego se
mide la celda de 1O mm en todo el intervalo espectral requerido, es posible calcular el valor de luz espuria a partir de la absor-
bancia mxima observada, usando la frmula:
5, = 0,25 X 10-lA;t

A.:t = mxima absorbancia observada

Criterios de aceptacin: 5.:t es :o;0,01. A.:t ?.0,7 A.
El procedimiento simplemente requiere contrastar la medicin de la celda de 1O mm con la de la celda de 5 mm (rellena
con el mismo filtro) y, por lo tanto, se puede lograr mediante referencia espacial o cronolgica en cualquier tipo de espectrofo-
tmetro. Como alternativa, se puede medir la absorbancia de los filtros especificados en la Tabla 3 contra la referencia apropia-
da y registrar el valor de mxima absorbancia. (Un valor de 5.:t de 0,01 se produce con un valor A.:t de 0,7 A, lo cual corresponde
a un valor de mxima absorbancia de 2A, medida usando este procedimiento alternativo.) [NOTA-Para algunos instrumentos
en los que no es posible informar directamente los valores de absorbancia mayores a 3A, este procedimiento puede requerir un
proceso de dos etapas en el que el haz de la muestra se atena inicialmente usando un filtro de 1 a 2A, cuyo valor se mide y
registra. Despus de ajustar a cero el instrumento con este filtro colocado, medir el filtro de luz espuria y registrar nuevamente
el valor de absorbancia. El valor de luz espuria estimado es ahora la suma de estas dos lecturas de absorbancia.]

Resolucin

Si se deben llevar a cabo mediciones de absorbancia exactas en compuestos bencenoides u otros compuestos con bandas
de absorbancia pronunciadas (ancho medio de banda natural de menos de 15 nm), el ancho de banda espectral del espectro-
fotmetro usado no debe ser mayor que 1/8 del ancho medio de banda natural de la absorcin del compuesto.
Determinar la resolucin del espectrofotmetro usando el procedimiento siguiente. Medir el cociente de absorbancias de
una solucin al 0,020% (v/v) de tolueno en hexano (de grado UV) en el mximo y el mnimo a aproximadamente 269 y 266
nm, respectivamente, usando hexano como referencia. El cociente de absorbancias obtenido depende del ancho de banda
espectral del instrumento. Para la mayora de los propsitos cuantitativos farmacopeicos, es suficiente un ancho de banda es-
pectral de 2 nm y el criterio de aceptacin para el cociente es no menos de 1,3.
El efecto que tienen el ancho de banda espectral y la temperatura de medicin sobre el cociente se presenta en la Tabla 4.4

4 ASTM E958 2011.

USP 39 Pruebas Fsicas/ (857) Espectroscopa UV-Vis 783

Tabla 4. Ancho de Banda Espectral y Temperatura de Medicin

Temperatura de Ancho de Banda Espectral

Medicin 0,5 nm 0,1 nm 1,0 nm 0,1 nm 1,5 nm 0,1 nm 2,0 nm 0,2 nm 3,0 nm 0,2 nm
20 1 2,4-2,5 2,0-2,1 1,6-1,7 1,3-1,4 1,0-1,1
25 1 2,3-2,4 1,9-2,0 1,6-1,7 1,3-1,4 1,0-1,1
30 l 2,1-2,2 1,8-1,9 1,5-1,6 1,3-1,4 1,0-1,1

Tambin se pueden usar materiales de referencia certificados adecuados para esta medicin. Como alternativa, se puede ba-
rrer una lnea atmica adecuada en el modo de haz individual y se puede determinar el ancho del pico a la altura media del
pico. Este ancho del pico a la altura media del pico es igual al ancho de banda del espectrofotmetro.

Calificacin del Desempeo

El propsito de la calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todos los parmetros que pueden afectar la calidad de la medicin y asegurar que
ste funcionar adecuadamente durante periodos extensos.

PROCEDIMIENTO
Salvo algunas excepciones, las pruebas y valoraciones espectrofotomtricas farmacopeicas requieren una comparacin con-
tra un Estndar de Referencia USP. Esto ayuda a asegurar una medicin en idnticas condiciones para la muestra de prueba y
la sustancia de referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la seleccin del ancho de banda
espectral, la colocacin y correccin de la celda y los niveles de transmitancia. Las celdas que presentan caractersticas de
transmitancia idnticas a una longitud de onda dada pueden diferir considerablemente en otras longitudes de onda. Se deben
establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando as se requiera.
La mejor manera de realizar comparaciones entre una muestra de prueba y un estndar de referencia es en un mximo de
absorcin espectral para el compuesto de inters. Las valoraciones que se realizan mediante espectrofotometra proveen la lon-
gitud de onda comnmente aceptada para el pico de absorcin espectral de la sustancia en cuestin. Diferentes espectrofot-
metros pueden presentar una variacin menor en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prcticas requieren
que las comparaciones se realicen a la longitud de onda en la que ocurre el pico de absorcin. Si sta difiere de la longitud de
onda especificada en la monografa individual en ms de 1 nm (en el intervalo de 200-400 nm) o 2 nm (en el intervalo de
400-800 nm), puede ser una indicacin de la necesidad de recalibrar el instrumento.
Los trminos "preparacin similar" y "solucin similar", segn se usan en pruebas y valoraciones que implican espectrofoto-
metra, indican que la referencia para comparacin, que es por lo regular un Estndar de Referencia USP, debe prepararse y
observarse, para todos los propsitos prcticos, de una manera idntica a la usada para la muestra de prueba. Generalmente,
al preparar una solucin del estndar de referencia especificado, se prepara una solucin de aproximadamente (es decir, den-
tro del 10% de) la concentracin deseada y se calcula la absortividad basndose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se
haya usado una muestra del estndar de referencia previamente secada, la absortividad se calcula con respecto a la sustancia
anhidra. Las expresiones "determinar concomitantemente" y "medir concomitantemente", segn se usan en las pruebas y va-
loraciones que implican espectrofotometra, indican que las absorbancias de la solucin que contiene la muestra de prueba y la
solucin que contiene la muestra de referencia, con respecto al blanco de prueba especificado, deben medirse en sucesin
inmediata.

Preparacin de la Solucin Muestra

Para determinaciones usando espectrofotometra UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disolvente. A me-
nos que se indique de otro modo en la monografa, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente, usando una lon-
gitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, hidrocarburos
pequeos, teres y soluciones diluidas de cidos y lcalis fuertes. Se debe tener cuidado de usar disolventes que estn exentos
de contaminantes que absorban en la regin espectral que se est analizando. Para el disolvente, se utiliza tpicamente meta-
no! o alcohol exentos de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adicin de metanol pero sin benceno u otras impurezas
interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotomtrica especial, que garantizan estar exentos de contaminantes, estn
disponibles comercialmente de diversos proveedores. Algunos otros disolventes analticos orgnicos de grado reactivo pueden
contener trazas de impurezas que absorben fuertemente en la regin UV. Se debe verificar la transparencia de los nuevos lotes
de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparacin de la solucin de prueba,
de la solucin estndar y del blanco. La mejor prctica consiste en usar disolventes que tengan una transmitancia de no menos
de 40% (39,9% T = 0,399A) a la longitud de onda de inters.
Las valoraciones en la regin visible por lo regular exigen comparar concomitantemente la absorbancia producida por la
preparacin de valoracin con la producida por una preparacin estndar que contenga una cantidad aproximadamente igual
de un Estndar de Referencia USP. En algunas situaciones, se puede omitir el uso de un estndar de referencia (p.ej., cuando
784 (857) Espectroscopa UV-Vis /Pruebas Fsicas USP 39

las valoraciones espectrofotomtricas se llevan a cabo rutinariamente) cuando se dipone de una curva estndar adecuada, pre-
parada con el Estndar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia valorada cumple con la Ley de Lambert-Beer den-
tro del intervalo de aproximadamente 75%-125% de la concentracin final usada en la valoracin. En estas circunstancias, la
absorbancia medida en la valoracin se puede interpolar en la curva estndar y se puede calcular el resultado de la valoracin.
Dichas curvas estndar deben ser confirmadas con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofotmetros o
nuevos lotes de reactivos.

VALIDACIN Y VERIFICACIN

Validacin

La validacin es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento UV-Vis como alternativa al procedimiento oficial para
analizar un artculo oficial.
El objetivo de una validacin de un procedimiento UV-Vis es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito pre-
visto, el cual incluye la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o un medicamento (valoraciones
de Categora 1), la determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora 11) y las pruebas de identificacin
(Categora IV). Dependiendo de la categora de la prueba (ver la Tabla 2 del captulo Validacin de Procedimientos Farmacopei-
cos (1225)), el proceso de validacin del mtodo analtico para UV-Vis requiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud,
la especificidad, la precisin, el lmite de deteccin, el lmite de cuantificacin y la robustez. Estas caractersticas de desempeo
analtico se aplican a procedimientos con estndar externo y a mtodos de estndar agregado.
El captulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios
de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios especfi-
cos de validacin representativos de las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplicacin particular, pueden re-
querirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

Para procedimientos de Categora 1, 11 y 111, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperacin agregando
concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de la valoracin
obtenidos usando el procedimiento de UV-Vis que se est validando con aqullos de un procedimiento analtico establecido.
Criterios de validacin: 98,0o/o-l 02,0% de recuperacin media para frmacos, 95,0%-105,0% de recuperacin media para
la valoracin de un medicamento y 80,0%-120,0% de recuperacin media para el anlisis de impurezas. Estos criterios deben
cumplirse en todo el intervalo previsto.

Precisin

REPETIBILIDAD

La repetibilidad del procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, se puede evaluar midien-
do las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentracio-
nes. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo
de concentraciones. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de
aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para el frmaco, no ms de 2,0% para la valora-
cin del medicamento y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.

PRECISIN INTERMEDIA

Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del mtodo. Las variables tpicas
incluyen realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o ms analistas realicen el mtodo. Como
mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveer una estimacin
de la precisin intermedia.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,5% para el frmaco, no ms de 3,0% para la valora-
cin del medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

En las mediciones UV-Vis, la especificidad se asegura mediante el uso de un estndar de referencia siempre que sea posible y
se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (857) Espectroscopa UV-Vis 785

LMITES DE DETECCIN

El lmite de deteccin (DL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de 6
mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviacin estndar puede determi-
narse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibracin o determinando que la relacin seal-ruido es
>3,3. Adems, se debe confirmar el lmite de deteccin estimado analizando muestras a la concentracin calculada.

LMITE DE CUANTIFICACIN

El lmite de cuantificacin (QL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de
6 mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 1 O. Como alternativa, la desviacin estndar puede deter-
minarse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibracin o determinando que la relacin seal-ruido es
>10.
Se debe llevar a cabo una medicin de una solucin de prueba preparada a partir de una matriz de muestra representativa a
la que se han agregado cantidades conocidas a la concentracin del lmite de cuantificacin requerida para confirmar una sen-
sibilidad y exactitud suficientes. La relacin seal-ruido observada en el lmite de cuantificacin requerido debe ser> 1 O.
[NOTA-La norma ASTM 1657-98 (2006) Standard Practice for the Testing of Variable-Wave/ength Photometric Detectors Used in
Liquid Chromatography provee un procedimiento adecuado para medir la relacin seal-ruido.]
Criterios de validacin: Para considerar que el lmite de cuantificacin estimado es vlido, la concentracin medida debe ser
exacta y precisa a un nivel ~50% de la especificacin.

LINEALIDAD

Se debe demostrar una relacin lineal entre la concentracin del analito y la respuesta UV-Vis preparando no menos de cin-
co soluciones estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la solucin de prueba. Posteriormen-
te, la curva estndar se evala usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de cuadrados mnimos. La des-
viacin de la linealidad es el resultado de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y puede reducirse a niveles acepta-
bles mediante la reduccin de la concentracin del analito y, por consiguiente, de los valores de absorbancia relacionados.
Criterios de validacin: El coeficiente de correlacin (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categora 1 y no
menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categora 11.

INTERVALO

El intervalo operativo de un instrumento analtico (y el procedimiento analtico en su totalidad) es el intervalo entre las con-
centraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha
demostrado que la funcin de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora 1, el intervalo de validacin para criterios de aceptacin centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptacin no centrados, el intervalo de validacin es 10,0% por debajo del lmite
inferior hasta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validacin es 70,0%-
130,0%. Para pruebas de Categora 11, el intervalo de validacin abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptacin.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medicin analtica se demuestra mediante cambios deliberados en los parmetros experimentales.
En el caso de la UV-Vis, esto puede incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especifi-
cadas, la variacin del pH y la adicin de posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La robustez se determina
de manera paralela usando un diseo adecuado para el procedimiento experimental.

REQUISITOS PARA MEDICIONES INDIRECTAS

Para ciertos procedimientos UV-Vis, se emplean reacciones cromognicas. Por lo general, se usan los requisitos para las ca-
ractersticas de desempeo analtico. En algunos casos, puede que no sea posible cumplir con los criterios de exactitud y preci-
sin requeridos para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisin pueden ampliarse
hasta un 50%. Cualquier ampliacin de este tipo debe justificarse con bases cientficas y pruebas documentadas. Puede ser
necesario incrementar la cantidad de determinaciones repetidas requeridas para producir un valor de informe cientficamente
slido.
786 (857) Espectroscopa UV-Vis / Pruebas Fsicas USP 39

Verificacin

Las reglamentaciones de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes para los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indi-
can que los usuarios de los procedimientos analticos, segn se describen en los compendios USP-NF, no estn obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografa. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su
aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificacin del procedimiento de UV-Vis es demostrar la aptitud de un procedimiento de prueba en condi-
ciones reales de uso. Las caractersticas de desempeo que verifican la aptitud de un procedimiento de UV-Vis son similares a
las requeridas para cualquier procedimiento analtico. El captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos (1226) incluye un
anlisis sobre los principios generales aplicables. La verificacin por lo general se realiza usando un material de referencia y una
matriz bien definida. La verificacin de los mtodos farmacopeicos de UV-Vis incluye como mnimo la ejecucin de los parme-
tros de validacin para especificidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme a lo
indicado en Validacin.

(861) SUTURAS-DIMETRO

El calibrador para determinar el dimetro de las suturas es del tipo de peso muerto, mecnico o elctrico, y est equipado
con un dial de lectura directa, un visor digital o una impresora. Emplear un calibrador graduado a 0,002 mm o un calibrador
ms pequeo. El yunque del calibrador tiene aproximadamente 50 mm de dimetro y el pie compresor es de 12,70 0,02
mm de dimetro. El pie compresor y las partes mviles conectadas a ste se gradan de manera que se aplique una carga total
de 21 O 3 g a la muestra. Las superficies del pie compresor y del yunque son planas, con desviaciones no mayores de 0,005
mm, y paralelas entre s con una aproximacin de 0,005 mm. Para medir el dimetro de las suturas de 0,4 y menor tamao
mtrico, retirar el peso adicional del pie compresor para que la carga total sobre la sutura no exceda de 60 g.

SUTURA QUIRRGICA ABSORBIBLE DE COLGENO

Determinar el dimetro inmediatamente despus de haberla retirado del envase primario y sin estirarla. Colocar el hilo a tra-
vs del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir
el dimetro de cada hilo en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos de su
longitud.

SUTURA QUIRRGICA ABSORBIBLE SINTTICA

Proceder segn se indica para Sutura Quirrgica No Absorbible:

SUTURA QUIRRGICA NO ABSORBIBLE

Colocar el hilo a travs del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta que todo su peso descanse
sobre la sutura. Medir las suturas no absorbibles, ya sea que estn envasadas en seco o en lquido, inmediatamente despus de
haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos.
Medir el dimetro de la sutura en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos
de su longitud. En el caso de suturas trenzadas de tamaos mayores de 3-0 (tamao mtrico 2), hacer dos mediciones en cada
punto, una en ngulo recto respecto de la otra, y emplear el promedio como el dimetro observado en ese punto.
Cuando se midan suturas de multifilamento, fijar una porcin de la seccin designada del hilo en una pinza fija, de manera
que el hilo pase a travs del centro del yunque. Mientras se sostiene el hilo en el mismo plano que la superficie del yunque,
someter el hilo a tensin por medios adecuados, como por ejemplo, pasando el extremo libre del hilo alrededor de un cilindro
o polea y uniendo dicho extremo libre a una pesa de aproximadamente la mitad del lmite de nudo-traccin para la sutura de
Clase 1 no esterilizada del tamao en cuestin, con cuidado de no dejar que el hilo, si fuera retorcido, pierda la torsin. Medir
el dimetro en los puntos designados en el hilo y calcular el dimetro promedio segn las indicaciones dadas.

(871) SUTURAS-SUJECIN DE AGUJAS

Las suturas quirrgicas absorbibles (de colgeno) y las no absorbibles con Sujecin de Aguja Estndar tienen las agujas sujetas
firmemente y estn diseadas para que stas no se desprendan. Las suturas suministradas con sujecin de agujas sin ojo corres-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (871) Suturas-Sujecin de Agujas 787

ponden a las categoras de suturas con Sujecin de Aguja Estndar o con Sujecin de Aguja Desprendible. La Sujecin de Aguja
Desprendible, tanto de las suturas quirrgicas absorbibles como de las no absorbibles, permite separar la aguja a voluntad con
un simple tirn. Ambos tipos de sujecin son sometidos a pruebas con un equipo, segn se especifica en Resistencia a la Ten-
sin (881 ).

PROCEDIMIENTO

Tomar 5 suturas y colocar una por una en el tensimetro, sujetando la aguja con la pinza fija, dejando toda la parte embuti-
da expuesta, y en la misma direccin de la fuerza que ejerce la pinza mvil sobre la sutura. Determinar la fuerza necesaria para
desprender la sutura de la aguja. En el caso de suturas con Sujecin de Aguja Estndar, la sutura puede romperse sin despren-
derse de la aguja.

Sujecin de Aguja Estndar

Cumple con los requisitos si ni el promedio de los 5 valores ni ningn valor individual es inferior al lmite fijado para el tama-
o especificados en la Tabla 7.
Tabla 1. Sujecin de Aguja Estndar para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamao Mtrico (Calibre N) Lmites de la Sujecin de Aguja
Sutura No Ab-
Sutura sorbible y Ab-
Absorbible de sorbible Sinttl- Promedio Individual Promedio Individual
Colgeno ca Tamao USP (en kgf) (Mn.) (en kgf) (Mn.) (en N) (Mn.) (en N) (Mn.)
0,1 11-0 0,007 0,005 0,069 0,049
0,2 10-0 0,014 0,010 0,137 0,098
0,4 0,3 9-0 0,021 0,015 0,206 0,147
0,5 0,4 8-0 0,050 0,025 0,490 0,245
0,7 0,5 7-0 0,080 0,040 0,784 0,392
1 0,7 6-0 0,17 0,08 1,67 0,784
1,5 1 5-0 0,23 0,11 2,25 1,08
2 1,5 4-0 0,45 0,23 4,41 2,25
3 2 3-0 0,68 0,34 6,67 3,33
3,5 3 2-0 1,10 0,45 10,8 4,41
4 3,5 o 1,50 0,45 14,7 4,41
5 4 1 1,80 0,60 17,6 5,88
6 y superior 5 y superior 2 y superior 1,80 0,70 17,6 6,86

Sujecin de Aguja Desprendible

Cumple con los requisitos si los valores individuales de las 5 suturas se encuentran dentro de los lmites establecidos en la
Tabla 2. [NOTA-Para ambos tipos de sutura, si no ms de uno de los valores individuales se encuentra fuera de los lmites
establecidos, repetir la prueba con 1O suturas adicionales: cumple con los requisitos si ninguno de los 1O valores adicionales se
encuentra fuera de los requisitos del lmite individual.]
Tabla 2. Sujecin de Aguja Desprendible para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamao Mtrico (Calibre) Lmites de la Sujecin de Aguja
Sutura No Ab-
Sutura sorbible y Ab-
Absorbible de sorbible Sintti- Mnimo Mximo Mnimo Mximo
Colgeno ca Tamao USP (en kgf) (en kgf) (en N) (en N)
1,5 1 5-0 0,028 1,59 0,274 15,6
2 1,5 4-0 0,028 1,59 0,274 15,6
3 2 3-0 0,028 1,59 0,274 15,6
3,5 3 2-0 0,028 1,59 0,274 15,6
4 3,5 o 0,028 1,59 0,274 15,6
5 4 1 0,028 1,59 0,274 15,6
6 5 2 0,028 1,59 0,274 15,6
788 (881) Resistencia a la Tensin/ Pruebas Fsicas USP 39

(881) RESISTENCIA A LA TENSIN

Los dispositivos para la medicin de la resistencia a la tensin empleados en los Estados Unidos pueden calibrarse en unida-
des del sistema ingls de medidas. Las siguientes instrucciones se dan en unidades mtricas con la comprensin de que pue-
den emplearse los equivalentes ingleses correspondientes.

SUTURA QUIRRGICA

Determinar la resistencia a la tensin de las suturas quirrgicas en una mquina a motor para medir la resistencia a la ten-
sin, que tenga pinzas adecuadas para sostener la muestra con firmeza, y emplear el principio de velocidad de carga constante
sobre la muestra o el principio de velocidad de elongacin constante de la muestra, segn se describe a continuacin. El apa-
rato tiene dos pinzas para sostener el hilo de la sutura. Una de estas pinzas es mvil. Las pinzas estn diseadas para que la
sutura que se va a probar pueda ser fijada sin posibilidad de que se deslice. La longitud calibrada de prueba se define como la
distancia interior entre las dos pinzas. Para longitudes calibradas de prueba entre 125 y 200 mm, la pinza mvil es accionada a
una velocidad de elongacin constante de 30 5 cm por minuto. Para longitudes calibradas de menos de 125 mm, la veloci-
dad de elongacin por minuto se ajusta para que equivalga a 2 veces la longitud calibrada por minuto. Por ejemplo, si la longi-
tud es de 5 cm, la velocidad de elongacin ser de 1O cm por minuto.
Determinar la resistencia a la tensin de la sutura, ya sea que est envasada en seco o con lquido, inmediatamente despus
de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos. Sujetar uno de los extremos de la sutura a la pinza
del extremo de carga de la mquina, pasar el otro extremo a travs de la pinza opuesta, aplicando tensin suficiente para que
la muestra quede tirante entre las pinzas, y cerrar la segunda pinza. Realizar tantas rupturas como se especifiquen en la mono-
grafa individual. Si la ruptura ocurre en la pinza, descartar la lectura de la muestra.

Procedimiento para una Mquina que Opera por el Principio de Velocidad de Carga Constante
sobre la Muestra

Esta descripcin se aplica a la mquina conocida como Comprobador de Plano Inclinado ("Incline Plane Tester").
El carro empleado en cualquier prueba es de un peso tal que al ocurrir la ruptura, la posicin de la pluma registradora sobre
la grfica queda entre el 20% y el 80% de la capacidad que pueda registrarse en la grfica. La friccin en el carro es suficiente-
mente baja como para permitir que la pluma registradora se aparte de la lnea cero de la grfica en un grado que no exceda
de 2,5% de la capacidad de la grfica cuando no haya ninguna muestra sujeta en las pinzas.
Para suturas quirrgicas de tamaos intermedios y ms grandes, la pinza para sostener la muestra es del tipo rodillo, con
una superficie de sujecin plana. El rodillo tiene un dimetro de 19 mm y la superficie de sujecin plana no es menor de 25
mm de longitud. La longitud de la muestra, una vez que se inserta en las pinzas, es de por lo menos 127 mm de un extremo a
otro. La velocidad de inclinacin del plano del comprobador es tal que alcanza su inclinacin mxima de 30 sobre la horizon-
tal en 20 1 segundos desde el comienzo de la prueba.
Para suturas quirrgicas de tamaos pequeos, la pinza apropiada tiene una superficie de sujecin plana de no menos de 13
mm de longitud. La velocidad de inclinacin del plano es tal que alcanza su inclinacin mxima de 30 sobre la horizontal en
60 5 segundos desde el comienzo de la prueba.
Excepto cuando en la monografa de la sutura se indique traccin recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba reali-
zando un nudo de cirujano con una vuelta de sutura, alrededor de un tubo de goma flexible con un dimetro interno de 6,5
mm y un espesor de pared de 1,6 mm. El nudo de cirujano es un nudo cuadrado en el cual el extremo libre se pasa primero
dos veces por el lazo, en lugar de una vez, y se ajusta tirante, luego se pasa una vez por un segundo lazo y se tensan los extre-
mos de manera que quede un nudo sencillo superpuesto a un nudo doble. Comenzar el primer nudo con el extremo izquierdo
sobre el extremo derecho, ejerciendo tensin suficiente para atar el nudo con firmeza. Cuando la muestra de prueba incluya
un nudo, colocar la muestra en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pinzas.
Dejar el tubo de goma flexible en su lugar mientras dure la prueba.

Procedimiento para una Mquina que Opera por el Principio de Velocidad de Elongacin
Constante de la Muestra

Esta descripcin se aplica a cualquier mquina adecuada para determinar la resistencia a la tensin que opera segn el prin-
cipio de velocidad constante de elongacin de la muestra.
Excepto cuando en las monografas de las suturas se indique traccin recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba
por medio de un nudo simple, colocando un extremo del hilo, sostenido con la mano derecha, por encima del otro extremo,
sostenido con la mano izquierda, pasando un extremo sobre el hilo y a travs del lazo que se form y luego ajustando el nudo
con firmeza. La muestra se coloca en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pin-
zas.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (891) Anlisis Trmico 789

TELAS TEXTILES Y PELCULAS

Determinar la resistencia a la tensin de las telas textiles, incluyendo la cinta adhesiva, en un aparato comprobador de velo-
cidad constante o de tipo pndulo, con la siguiente descripcin general.
Las pinzas para sostener la muestra son mordazas lisas, planas y paralelas, de no menos de 25 mm de longitud en paralelo a
la direccin de aplicacin de la carga. Cuando el ancho de la tira a probar no excede de 19 mm, las mordazas de la pinza
deben tener al menos 25 mm de ancho. Si el ancho de la tira es mayor de 19 mm y no mayor de 44 mm, el ancho de las
mordazas de la pinza debe ser de no menos de 50 mm. Si el ancho de la muestra es ms de 44 mm, cortar una tira de 25 mm
y usar una pinza con mordazas de no menos de 50 mm de ancho. Redondear todos los bordes que puedan tener una accin
cortante sobre la muestra hasta un radio de 0,4 mm. Las mordazas tienen una separacin entre s de 76,2 mm al comienzo de
la prueba y se separan a una velocidad de 30,5 cm 13 mm por minuto. La mquina tiene una capacidad tal que cuando se
produce la ruptura, la desviacin del pndulo de la vertical est entre 9 y 45.

(891) ANLISIS TRMICO

INTRODUCCIN
Los sucesos termodinmicos determinados con precisin, como por ejemplo un cambio de estado, pueden indicar la identi-
dad y la pureza de los frmacos. Desde hace mucho tiempo se han venido estableciendo normas farmacopeicas para las tem-
peraturas de fusin y de ebullicin de las sustancias. Estas transiciones ocurren a temperaturas caractersticas y de esta manera
las normas farmacopeicas contribuyen a la identificacin de las sustancias. Dado que las impurezas afectan a estos cambios de
manera predecible, las mismas normas farmacopeicas contribuyen al control de la pureza de las sustancias.
El anlisis trmico, en el sentido ms amplio, es la medicin de las propiedades fsicas y qumicas de los materiales en fun-
cin de la temperatura. Los mtodos instrumentales han suplantado, en gran medida, a mtodos ms antiguos, que depen-
dan de la inspeccin visual y de mediciones bajo condiciones fijas o arbitrarias, debido a que los mtodos instrumentales son
objetivos, proporcionan ms informacin, generan registros permanentes, y por lo general son ms sensibles, precisos y exac-
tos. Adems, pueden suministrar informacin sobre la desolvatacin, la deshidratacin, la descomposicin, la perfeccin del
cristal, el polimorfismo, la temperatura de fusin, la sublimacin, las transiciones vtreas, la evaporacin, la pirlisis, las interac-
ciones slido-slido y la pureza. Tales datos resultan tiles para la caracterizacin de sustancias en lo que respecta a la compati-
bilidad, estabilidad, envasado y control de calidad. A continuacin se describen las mediciones que se utilizan con mayor fre-
cuencia en el anlisis trmico, es decir, temperaturas de transicin y punto de fusin mediante calorimetra diferencial de barri-
do (DSC, por sus siglas en ingls), anlisis termogravimtrico, microscopa de platina caliente y anlisis de impurezas eutcti-
cas.

TEMPERATURAS DE PUNTO DE FUSIN Y DE TRANSICIN

Cuando se calienta una muestra, se pueden observar las transiciones usando DSC, anlisis trmico diferencial (DTA, por sus
siglas en ingls), o microscopa de platina caliente (hot-stage microscopy). La DSC por flujo de calor (heat-flux DSC) sirve para
determinar el diferencial de calor entre la muestra y el material de referencia. En la DSC por compensacin de calor (power
compensation DSC), la muestra y los materiales de referencia se mantienen a la misma temperatura, usando elementos de ca-
lentamiento individuales, y se registra la diferencia en el consumo de energa de los dos calentadores. La DTA monitorea la
diferencia de temperaturas entre la muestra y la referencia. Las transiciones que se pueden observar incluyen aquellas que se
presentan en la Tabla 7 a continuacin. En el caso de la fusin, puede determinarse en forma objetiva y reproducible tanto el
"inicio" como el "pico" de temperatura, a menudo con una aproximacin de unas pocas dcimas de grado. Aunque estas
temperaturas son tiles para la caracterizacin de sustancias y la diferencia entre las dos temperaturas es un indicador de pure-
za, los valores no pueden compararse directamente con valores de "intervalos de fusin" o de "punto de fusin" visuales ni con
constantes tales como el punto triple del material puro.
Asimismo, se debe tener cuidado al comparar los resultados obtenidos a travs de diferentes mtodos de anlisis. Los mto-
dos pticos pueden medir el punto de fusin como la temperatura en la que se funde la ltima traza de material slido. Por el
contrario, los puntos de fusin medidos con DSC pueden referir a la temperatura de inicio o a la temperatura en la que se
observ la velocidad de fusin mxima (vertex). No obstante, el vertex es sensible al peso de la muestra, a la velocidad de
calentamiento y a otros factores, mientras que la temperatura de inicio se ve menos afectada por tales factores. Cuando se
emplean tcnicas trmicas, es necesario considerar las limitantes de la formacin de soluciones slidas, la insolubilidad en la
fusin, el polimorfismo y la descomposicin durante el anlisis.
Tabla 1
Slido a lquido Fusin Endotrmica
Lquido a gas Vaporizacin Endotrmica
790 (891) Anlisis Trmico/ Pruebas Fsicas USP 39

Tabla 1 (Continuacin)
Conqelacin Exotrmica
Lquido a slido
Cristalizacin Exotrmica
Slido a gas Sublimacin Endotrmica
Transicin vtrea Evento de sequndo orden
Desolvatacin Endotrmica
Slido a slido
Amorfo a cristalino Exotrmica
Polimorfo Endotrmica o Exotrmica

Informe de Resultados de Mtodos Instrumentales-Cada termograma debera estar acompaado por una descripcin
completa de las condiciones empleadas, incluyendo la marca y el modelo del instrumento; el registro de la ltima calibracin;
el tamao y la identificacin de la muestra (incluyendo el historial trmico); el envase; la identidad, la velocidad de flujo y la
presin de la atmsfera gaseosa; la direccin y la velocidad de cambio de temperatura; y la sensibilidad del instrumento y del
registrador.

DETERMINACIN DE TEMPERATURA DE TRANSICIN (TEMPE~TURA DE INICIO DE FUSIN)

V TEMPERATURA DE PUNTO DE FUSION
Aparato-Usar instrumental para DTA o DSC equipado con un dispositivo de programacin de temperatura, detector(es)
trmico(s) y un sistema de registro que se pueda conectar a una computadora, a menos que la monografa individual para la
que se emplea el captulo indique algo distinto.
Calibracin-Calibrar el instrumental para cambios de temperatura y entalpa usando indio u otro material adecuado certi-
ficado. La calibracin de la temperatura se lleva a cabo calentando un estndar a travs de la transicin de fusin y comparan-
do el inicio extrapolado del punto de fusin del estndar con el inicio certificado de punto de fusin. La calibracin de la tem-
peratura se debera realizar a la misma velocidad de calentamiento que el experimento. La calibracin de la entalpa se lleva a
cabo calentando un estndar a travs de la transicin de fusin y comparando el calor de fusin calculado con el valor terico.
Procedimiento-Pesar con exactitud una cantidad apropiada de la sustancia a examinar en el receptculo de la muestra
(sample pan), segn se describe en la monografa especfica. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento, la
direccin del cambio de temperatura y la temperatura final segn se especifica en la monografa. Si no se especifican en la
monografa, estos parmetros se determinan segn se indica a continuacin: realizar un anlisis preliminar sobre un amplio
intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposicin, o aproxi-
madamente 1O a 20 por encima del punto de fusin) y sobre un amplio intervalo de velocidades de calentamiento (1 a 20
por minuto) para evidenciar cualquier efecto inesperado. Posteriormente, determinar una velocidad de calentamiento ms baja
de modo que se minimice la descomposicin y que no se comprometa la temperatura de transicin. Determinar un intervalo
de temperatura que comprenda la transicin de inters de modo que la lnea base se pueda extender hasta intersectar con la
tangente de la fusin (ver Figura 7).

1ss.1gc
102,3J/g

(
\

190.3PC
170
+--------------------<210
Exo Up T1mpu1tur1C-C)

Figura 1. Termograma.

Al examinar materiales cristalinos puros, pueden ser apropiadas velocidades tan bajas como 1 por minuto, mientras que
para materiales polimricos y dems materiales semicristalinos resultan ms apropiadas velocidades de hasta 20 por minuto.
Comenzar el anlisis y registrar la curva del anlisis trmico diferencial con la temperatura en el eje x y el cambio de energa en
el eje y. La temperatura de fusin (temperatura de inicio de fusin) es la interseccin (188,79) de la extensin de la lnea base
con la tangente al punto de mayor pendiente (punto de inflexin) de la curva (ver Figura 7). El vrtice es la temperatura en el
pico de la curva (190,31 ). La entalpa del evento es proporcional al rea bajo la curva despus de aplicar una correccin de la
lnea base.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (891) Anlisis Trmico 791

ANLISIS TERMOGRAVI MTRICO

El anlisis termogravimtrico incluye la determinacin de la masa de una muestra como una funcin de la temperatura, o
del tiempo de calentamiento, o ambos. Por lo general se usa para investigar los procesos de deshidratacin/desolvatacin y la
descomposicin de compuestos. Cuando la termogravimetra se aplica apropiadamente, sta suministra informacin de mayor
utilidad que la prdida por secado a temperatura fija, que frecuentemente se realiza durante un tiempo fijo y por lo general en
una atmsfera mal definida. Por lo general, la prdida de disolvente absorbido en la superficie puede distinguirse del disolven-
te en la red cristalina y de las prdidas por degradacin. Las mediciones pueden llevarse a cabo en atmsferas con una hume-
dad y una concentracin de oxgeno controladas para revelar interacciones con el frmaco, entre frmacos y entre sustancias
activas y excipientes o materiales del envase.
Aparato-Mientras que los detalles dependen del fabricante, las caractersticas esenciales del equipo son una balanza que
registra los pesos y una fuente de calor programable. Los equipos difieren en la capacidad para manejar muestras de diversos
tamaos, la manera en que se registra la temperatura de la muestra y el intervalo de control de la atmsfera.
Calibracin-Se requiere una calibracin para todos los sistemas; es decir, la balanza se calibra usando pesas estndar, y la
calibracin de temperatura implica el uso de materiales estndar, puesto que se asume que la temperatura de la muestra es la
temperatura del horno. La calibracin de peso se lleva a cabo midiendo la masa de una pesa certificada o estndar y compa-
rando la masa medida con el valor certificado. La calibracin de la temperatura se lleva a cabo analizando un estndar magn-
tico de alta pureza, tal como nquel, para determinar su temperatura de Curie y comparando el valor medido con el valor te-
rico.
Procedimiento-Aplicar el mtodo a la muestra, empleando las condiciones descritas en la monografa, y calcular la ga-
nancia o prdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje. Alternativamente, colocar una cantidad adecuada
de material en el portamuestras y registrar el peso. Debido a que la atmsfera de anlisis es crtica, se especifica la presin o
velocidad de flujo y la composicin del gas. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento y la temperatura final
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e iniciar el aumento de temperatura. Alternativamente, analizar el termograma
sobre un amplio intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descompo-
sicin, o 1 O a 20 por encima del punto de fusin a una velocidad de calentamiento de 1 a 20 por minuto). Calcular la
ganancia o prdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje.

MICROSCOPA DE PLATINA CALIENTE

La microscopa de platina caliente es una tcnica analtica que implica el monitoreo de las propiedades pticas de la muestra
como una funcin de la temperatura usando un microscopio. La microscopa de platina caliente se puede usar como tcnica
complementaria de otras tcnicas de anlisis trmico, tales como DSC, DTA y difraccin de rayos X de temperatura variable
para polvos, para la caracterizacin del estado slido de compuestos farmacuticos. Resulta de utilidad para confirmar transi-
ciones tales como fusiones, recristalizaciones y transformaciones al estado slido usando una tcnica visual. El microscopio de
platina caliente debe someterse a una calibracin de temperatura.

ANLISIS DE IMPUREZAS EUTCTICAS

La base de cualquier mtodo de pureza calorimtrica es la relacin entre la disminucin del punto de fusin y de congela-
cin y el nivel de impurezas. La fusin de un compuesto est caracterizada por la absorcin del calor latente de fusin, LiH 1, a
una temperatura especfica, T0 En teora, una transicin de fusin para un compuesto cristalino totalmente puro debe ocurrir
dentro de un intervalo infinitamente estrecho. Una ampliacin del intervalo de fusin, debido a impurezas, proporciona un
criterio de pureza sensible. El efecto es evidente mediante el examen visual de termogramas de muestras que difieren por unas
pocas dcimas de porcentaje en el contenido de impurezas. Un material con 99% de pureza se funde aproximadamente en un
20% a una temperatura de 3 por debajo del punto de fusin del material puro (ver Figura 2).
792 (891) Anlisis Trmico / Pruebas Fsicas USP 39

- Temperatura

Acido Benzoico

Patrn Primario (NIST)

Figura 2. Termogramas superpuestos en los que se muestra el efecto de las impurezas sobre la forma del pico de fusin en
una DSC.

Los parmetros de fusin (intervalo de fusin, dH1 y la pureza eutctica calculada) se obtienen fcilmente a partir del termo-
grama de un solo evento de fusin empleando una muestra de prueba pequea y el mtodo no requiere mediciones mltiples
de temperatura reales y precisas. Las unidades del termograma se convierten directamente a transferencia de calor, en milica-
loras por segundo.
El descenso del punto de congelacin en soluciones diluidas por molculas de tamao casi igual se expresa mediante la ecua-
cin de van't Hoff modificada:

en donde T = temperatura absoluta en grados Kelvin; X2 =fraccin molar del componente menor (soluto; impureza), dH 1 =
calor molar de fusin del componente principal en joules por mol: R = constante de gases en joules por mol x grados Kelvin; y
K0 = cociente de distribucin del soluto entre la fase slida y la fase lquida.
Asumiendo que el intervalo de temperatura es pequeo y que no se forman slidos en solucin (K 0 = O), la integracin de la
ecuacin de van't Hoff proporciona la siguiente relacin entre la fraccin molar de la impureza y la disminucin del punto de
fusin:

(2)

en donde T0 = punto de fusin del compuesto puro, en grados Kelvin, y Tm = punto de fusin de la muestra de prueba, en
grados Kelvin.
Sin formacin de slidos en la solucin, la concentracin de la impureza en la fase lquida, a cualquier temperatura durante
la fusin, es inversamente proporcional a la fraccin fundida a esa temperatura y la disminucin del punto de fusin es directa-
mente proporcional a la fraccin molar de la impureza. Un grfico de la temperatura observada de la muestra de prueba, T,,
frente al recproco de la fraccin fundida, 1/ F, a una temperatura T,, debe producir una lnea recta con una pendiente igual a
la disminucin del punto de fusin (T0 - Tm> El punto de fusin terico del compuesto puro se obtiene mediante extrapola-
cin a 1/F = O:

La sustitucin de los valores obtenidos en forma experimental para T0 - Tm dH 1 y T0 en la ecuacin (2) produce la fraccin
molar de la impureza eutctica total, la cual, cuando se multiplica por 100 da el porcentaje molar de impurezas eutcticas
totales.
*
Las desviaciones del grfico lineal terico tambin pueden ser producto de la formacin de soluciones slidas (K 0 O), por lo
tanto se debe prestar atencin al interpretar estos datos.
Para observar el efecto lineal de la concentracin de impurezas sobre la disminucin del punto de fusin, la impureza debe
ser soluble en la fase lquida o la fase fundida del compuesto, pero insoluble en la fase slida, es decir, no se forma ninguna
solucin slida. Para que se produzca la solubilidad en el material fundido son necesarias algunas semejanzas qumicas. Por
ejemplo, la presencia de compuestos inicos en compuestos orgnicos neutros y la descomposicin trmica quiz no se refle-
jen en las estimaciones de pureza. El alcance de estas limitaciones tericas se ha estudiado slo en forma parcial.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificacin 793

Las impurezas presentes provenientes de la ruta sinttica a menudo son similares al producto final, en consecuencia no hay
generalmente ningn problema de solubilidad en el material fundido. Las impurezas compuestas por molculas de igual for-
ma, tamao y carcter que las del componente principal pueden acomodarse en la matriz del componente principal sin modi-
ficar la retcula, formando soluciones slidas o inclusiones; tales impurezas no son detectables por DSC. En tales casos, las esti-
maciones de pureza son demasiado altas. Esto es ms comn con cristales menos ordenados, segn lo indican los valores bajos
de calor de fusin.
Adems, el mtodo es confiable cuando la pureza del componenete principal es mayor de 98,5 mol% y los materiales no se
descomponen durante la fase de fusin.
Los niveles de impurezas calculados a partir de los termogramas son reproducibles y generalmente confiables con una apro-
ximacin de O, 1% para compuestos ideales.
Los compuestos que existen en forma polimorfa no pueden usarse en la determinacin de pureza a menos que el compues-
to se convierta completamente a una forma. Por otro lado, la DSC y el DTA son intrnsicamente tiles para detectar y en con-
secuencia realizar el seguimiento del polimorfismo.
Procedimiento-El procedimiento vigente y los clculos a emplear para el anlisis de impurezas eutcticas dependen del
instrumento especfico usado. Consultar la tcnica ms apropiada para un instrumento dado en la bibliografa del fabricante
y/o en la bibliografa de anlisis trmico. De todas formas, es imperativo recordar las limitaciones de formacin de soluciones
slidas, la insolubilidad en el material fundido, el polimorfismo y la descomposicin durante el anlisis.

..
(905) UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIN

Este captulo de pruebas generales ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y la Farma-
copea japonesa. Los textos del captulo que son textos USP de aplicacin nacional y que no forman parte del texto armonizado
estn marcados con los smbolos (.) para indicar esta situacin.
NOTA-En este captulo, los trminos unidad y unidad de dosificacin son sinnimos .
Para garantizar la uniformidad de las unidades de dosificacin, cada unidad en un lote debe tener un contenido de frmaco
dentro de un intervalo estrecho alrededor de la cantidad declarada. Las unidades de dosificacin se definen como formas far-
macuticas que contienen una nica dosis o parte de una dosis de un frmaco en cada unidad. Para suspensiones, emulsiones
o geles en envases de dosis nica destinadas para administracin externa o cutnea no se aplica la especificacin de uniformi-
dad de unidades de dosificacin.
El trmino "uniformidad de unidades de dosificacin" se define como el grado de uniformidad en el contenido del frmaco
entre las unidades de dosificacin. Por lo tanto, los requisitos de este captulo son aplicables a cada frmaco incluido en unida-
des de dosificacin que contengan uno o ms frmacos, a menos que se especifique algo diferente en otra parte de esta Far-
macopea.
La uniformidad de las unidades de dosificacin se puede demostrar mediante uno de los siguientes mtodos, Uniformidad de
Contenido o Variacin de Peso. (ver la Tabla 1). La prueba de Uniformidad de Contenido para preparaciones que se presentan en
unidades de dosificacin se basa en la valoracin individual del contenido de un frmaco o frmacos en un nmero de unida-
des de dosificacin para determinar si el contenido individual se encuentra dentro de los lmites fijados. El mtodo de Uniformi-
dad de Contenido se puede aplicar en todos los casos.
La prueba de Variacin de Peso. es aplicable para las siguientes formas farmacuticas:

(Wl) Soluciones contenidas en envases de dosis nica y en cpsulas blandas;

(W2) Slidos (incluidos los polvos, grnulos y slidos estriles) envasados en envases unitarios y que no contienen sustancias activas o
inactivas agregadas;
(W3) Slidos (incluidos los slidos estriles) envasados en envases unitarios, con o sin sustancias activas o inactivas agregadas, que
hayan sido preparados por liofilizacin a partir de soluciones verdaderas en sus envases finales y que declaran este mtodo de
preparacin; y
(W4) Cpsulas duras, tabletas sin cubierta o tabletas recubiertas con pelculas que contengan 25 mg o ms de un frmaco que co-
rresponda al 25% o ms, en peso, de la unidad de dosificacin o, en el caso de cpsulas duras, el contenido de las cpsulas,
excepto que se demuestre la uniformidad de otros frmacos presentes en proporciones menores en cumplimiento de los re-
quisitos de Uniformidad de Contenido.
794 (905) Uniformidad de Unidades de Dosificacin / Pruebas Fsicas USP 39

La prueba de Uniformidad de Contenido se requiere para todas las formas farmacuticas que no cumplen las condiciones enu-
meradas anteriormente para la prueba de Variacin de Peso. 1
Ta bl a 1 A p11caeI'on d e 1as Prue bas d e Umform1d add e eonten Ido (UC) y V ar1acI'on d e Peso (VP) para Formas Farmaceut1cas
Dosis y
Proporcin de
Frmaco
Forma ~25 mg <25mg
Farmacutica Tloo Subtipo y ~250/o o <25/o
Tabletas Sin cubierta VP uc
Recubiertas Pelcula VP uc
Otras uc uc
Cpsulas Duras VP uc
Blandas Suspensin, emulsin o uc uc
gel
Soluciones VP VP
Slidos en envases Componente nico VP VP
unitarios Varios componentes Solucin liofilizada en en- VP VP
vase final
Otros uc uc
Soluciones en envases de dosis nica y VP VP
en cpsulas blandas.
Otros uc uc
UNIFORMIDAD DE CONTENIDO

Seleccionar no menos de 30 unidades y proceder segn se indica a continuacin para cada forma farmacutica especificada.
Cuando se utilizan procedimientos diferentes para la valoracin de la preparacion y para la prueba de Uniformidad de Conte-
nido, puede ser necesario establecer un factor de correccin que deber aplicarse a los resultados de esta ltima.

Formas Farmacuticas Slidas

Valorar 1O unidades individualmente usando un mtodo analtico apropiado. Calcular el valor de aceptacin (ver la Tabla 2).

Formas Farmacuticas Lquidas o Semislidas

Valorar 1O unidades individualmente usando un mtodo analtico apropiado. Realizar la valoracin sobre la cantidad de ma-
terial bien mezclado que se retira de un envase individual en condiciones normales de uso y expresar los resultados como la
dosis entregada. Calcular el valor de aceptacin (ver la Tabla 2).

Clculo del Valor de Aceptacin

Calcular el valor de aceptacin, por la frmula:

en donde los trminos se definen en la Tabla 2.

Tabla 2
Variable Definicin Condiciones Valor
Media de los contenidos individuales (x 1,
Xi- ... , Xn), expresados como el porcenta-
X: je de la cantidad declarada

1 Textos de la Farmacopea Europea y la Farmacopea japonesa no aceptados por la Farmacopea de los Estados Unidos: Como alternativa, para los productos lista-
dos en el punto (4) anterior que no cumplen con el lmite de umbral de 25 mg/25%, se puede analizar la uniformidad de las unidades de dosificacin mediante
Variacin de Masa en lugar de la prueba de Uniformidad de Contenido si la desviacin estndar relativa (RSD) de la concentracin del frmaco en las unidades de
dosificacin finales no es ms de 2%, basndose en los datos de validacin del proceso y en los datos de desarrollo, y si existiese una aprobacin reglamentaria
para dicho cambio. La RSD de la concentracin es la RSD de la concentracin por unidad de dosificacin (p/p o p/v), en donde la concentracin por unidad de
dosificacin es igual al resultado de la valoracin por unidad de dosificacin dividido por el peso de la unidad de dosificacin individual. Ver la frmula para la RSD
en la Tabla 2 .
USP 39 Pruebas Fsicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificacin 795

Tabla 2 (Continuacin)
Variable Definicin Condiciones Valor
X, X2, , Xn Contenido individual de las unidades anali-
zadas, expresado como porcentaje de la
cantidad declarada
n Tamao de la muestra (nmero de unida-
des en una muestra)
k Constante de aceptabilidad Si n = 1O, entonces k = 2,4
Si n = 30, entonces k = 2,0
s Desviacin estndar de la muestra 1

~(x;-X)
r. n-1 'J'
RSD Desviacin estndar relativa (la desviacin lOOs/X
estndar de la muestra expresada como
porcentaje de la media)
M (caso 1) a aplicar cuando Valor de referencia Si 98,5% ~X ~101,5%,
T~lOl,5 entonces M =X (AV= ks)
M = 98,5%
Si X <98,5%, entonces (AV= 98,5 - X+ ks)
Si X >101,5%, M = 101,5%
entonces (AV= X - 101,5 + ks)
M (caso 2) a aplicar cuando Valor de referencia Si 98,5 ~X ~T, M=X
T>101,5 entonces (AV= ks)
M =98,5%
Si X <98,5%, entonces (AV= 98,5 - X+ ks)
M=T%
Si X>T, entonces (AV= X- T + ks)
Valor de aceptacin (AV) Frmula general:

L1 Mximo valor de aceptacin permitido
L2 Mximo intervalo permitido para la desvia-
cin de cada unidad de dosificacin anali-
zada a partir del valor calculado de M
T Contenido deseado por unidad de dosifica-
cin al momento de la fabricacin, expre-
sado como porcentaje de la cantidad de-
clarada. A menos que se indique de otro
modo, T es 100,0% o Tes el contenido
deseado aprobado por el fabricante por
unidad de dosificacin.
IM-Xl+ks
(Ms arriba se especifican clculos
para cada uno de los casos.)
L1 = 15,0 a menos que se especifi-
que algo diferente
Para los valores inferiores, nin- L2 = 25,0 a menos que se especifi-
gn resultado de unidad de que algo diferente
dosificacin puede ser menor
de [1-(0,01 )(L2)]M, mientras
que para los valores superiores,
ningn resultado de unidad de
dosificacin puede ser mayor
de [1 + (0,01 )(L2)]M. (Esto es-
t basado en un valor de L2 de
25,0.)

VARIACIN DE PESO.
Llevar a cabo una valoracin del (de los) frmaco(s) en una muestra representativa del lote usando un mtodo analtico
apropiado. Este valor es el resultado A, expresado como porcentaje de la cantidad declarada (ver Clculo del Valor de Acepta-
cin). Se debe asumir que la concentracin (peso del frmaco por peso de unidad de dosificacin) es uniforme. Seleccionar no
menos de 30 unidades de dosificacin y proceder segn se indica a continuacin para la forma farmacutica designada.
796 (905) Uniformidad de Unidades de Dosificacin/ Pruebas Fsicas USP 39

Tabletas sin Cubierta o Recubiertas con Pelcula

Pesar con exactitud 1O tabletas individualmente. Calcular el contenido, expresado como porcentaje de la cantidad declara-
da, a partir del peso de la tableta individual y del resultado de la Valoracin. Calcular el valor de aceptacin.

Cpsulas Duras

Pesar con exactitud 1O cpsulas individualmente, teniendo cuidado de preservar la identidad de cada cpsula. Retirar el con-
tenido de cada cpsula por un medio adecuado. Pesar individualmente con exactitud las cubiertas vacas y calcular para cada
cpsula el peso neto de su contenido restando el peso de la cubierta del peso bruto respectivo. Calcular el contenido de
frmaco de cada cpsula a partir del peso neto del contenido de la cpsula individual y del resultado de la Valoracin. Calcu-
lar el valor de aceptacin.

Cpsulas Blandas

Pesar con exactitud 1O cpsulas intactas individualmente para obtener sus pesos brutos, teniendo cuidado de preservar la
identidad de cada cpsula. Luego cortar y abrir las cpsulas con ayuda de un instrumento cortante seco, limpio y adecuado,
como por ejemplo una tijera o una cuchilla afilada, y retirar el contenido lavando con un disolvente adecuado. Dejar que el
disolvente ocluido se evapore de las cubiertas a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30 minutos,
tomando precauciones para evitar la absorcin o la prdida de humedad. Pesar las cubiertas individuales y calcular el conteni-
do neto. Calcular el contenido de frmaco en cada cpsula a partir del peso del producto retirado de la cpsula individual y
del resultado de la Valoracin. Calcular el valor de aceptacin.

Formas Farmacuticas Slidas Diferentes de Tabletas y Cpsulas

Proceder segn se indica para Cpsulas Duras, tratando cada unidad como all se describe. Calcular el valor de aceptacin.

Formas Farmacuticas Lquidas

Pesar con exactitud la cantidad de lquido que se retira de cada uno de 1O envases individuales en condiciones normales de
uso. Si fuera necesario, calcular el volumen equivalente despus de determinar la densidad. Calcular el contenido de frmaco
en cada envase a partir de la masa de producto retirada de los envases individuales y del resultado de la Valoracin. Calcular el
valor de aceptacin.

Clculo del Valor de Aceptacin

Calcular el valor de aceptacin como se muestra en Uniformidad de Contenido con la excepcin de que el contenido indivi-
dual de las unidades se reemplaza por el contenido estimado individual, como se define a continuacin.

X1, X7, ... , Xn = contenido estimado individual de las unidades analizadas, en donde X;= W; x A/ W,
w1,wJ, ... ,wn = pesos. individuales de las unidades analizadas
A = contenido de frmaco (% de la cantidad declarada) obtenido usando un mtodo analtico
apropiado
w = media de pesos. individuales
(w 1, w,, ... , wn)

CRITERIOS

Aplicar los siguientes criterios, a menos que se especifique algo diferente.

Formas Farmacuticas Slidas, Lquidas y Semislidas

Se cumple con los requisitos de uniformidad de dosificacin si el valor de aceptacin de las primeras 1O unidades de dosifi-
cacin es menor o igual a L1%. Si el valor de aceptacin es mayor que L1%, analizar las siguientes 20 unidades y calcular el
valor de aceptacin. Se cumple con los requisitos si el valor de aceptacin final de las 30 unidades de dosificacin es menor o
igual a L1%, y si el contenido individual de ninguna. unidad de dosificacin es menor de [1 - (0,01 )(L2)]M ni mayor de [1 +
(0,01 )(L2)]M como se especifica. en Clculo del Valor de Aceptacin en Uniformidad de Contenido o en Variacin de Peso. A
menos que se especifique algo diferente, L1 es 15,0 y L2 es 25,0.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (911) Viscosidad-Mtodos Capilares 797

"'
(911) VISCOSIDAD-METODOS CAPILARES

Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una vis-
cosidad que es independiente de la velocidad de corte o cizallamiento. [NOTA-Para ms informacin, ver el captulo Reome-
tra (1911 ).]
MTODO l. VISCOSMETRO CAPILAR DE NIVEL SUSPENDIDO (O TIPO UBBELOHDE)
Aparato: La determinacin se puede llevar a cabo con un viscosmetro capilar de nivel suspendido (Figura 7).

L M N

Figura 1. Viscosmetro capilar de nivel suspendido (o tipo Ubbelohde).

Se pueden usar otros viscosmetros, siempre que la exactitud y la precisin no sean menores que las obtenidas con los vis-
cosmetros descritos en este captulo.
Procedimiento: Llenar el viscosmetro a travs del tubo (L) con una cantidad suficiente del fluido muestra, que sea apro-
piada para el viscosmetro en uso, o siguiendo las instrucciones del fabricante. Llevar a cabo el experimento con el tubo en
posicin vertical. Llenar el bulbo (A) con el lquido y asegurarse tambin de que el nivel del lquido en el bulbo (B) est por
debajo de la salida al tubo de venteo (M). Sumergir el viscosmetro en un bao de agua o aceite estabilizado a la tempera-
tura especificada en la monografa individual y controlar la temperatura a 0, 1 , a menos que se especifique algo distinto
en la monografa individual. Mantener el viscosmetro en posicin vertical durante un periodo de no menos de 30 minutos
para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Cerrar el tubo (M) y elevar el nivel del lquido en el
tubo (N) hasta un nivel de aproximadamente 8 mm por encima de la marca (E= h 1). Mantener el lquido a este nivel ce-
rrando el tubo (N) y abriendo el tubo (M). Abrir el tubo (N) y medir el tiempo requerido para que el nivel del lquido baje
desde la marca (E= h,) hasta la marca (F = h2), usando un dispositivo apropiado para la medicin exacta del tiempo.
[NOTA-El tiempo de flujo mnimo debe ser 200 segundos.]
Calibracin: Calibrar cada viscosmetro a la temperatura de prueba usando fluidos con viscosidades conocidas de estnda-
res de viscosidad apropiados para determinar la constante del viscosmetro, k. Los valores de viscosidad de los estndares
de calibracin deben abarcar el valor de viscosidad esperado del fluido muestra.
Calcular la constante del viscosmetro, k, en mm2;s2:
k = rf(p X t)
r =viscosidad conocida del lquido (mPa s)
p = densidad del lquido (g/mL)
t = tiempo de flujo requerido para que el lquido pase desde la marca superior hasta la marca inferior (s)
798 (911) Viscosidad-Mtodos Capilares / Pruebas Fsicas USP 39

Clculo de las viscosidades cinemtica y newtoniana del fluido muestra: Seleccionar un viscosmetro capilar de modo
que el tiempo de flujo, t, sea no menos de 200 segundos; y la correccin de energa cinemtica sea, por lo regular, menos
de 1%. Si se conoce la constante de viscosidad, k, usar la siguiente ecuacin para calcular la viscosidad cinemtica, v, en
mm 2 /s, a partir del tiempo de flujo, t, en segundos.
V=kxt
Si se conoce la densidad del fluido a la temperatura de la medicin de la viscosidad, entonces la viscosidad newtoniana, r,
en mPa s, se calcula:
r=vxp
p = densidad del fluido (g/mL)
El tiempo de flujo del fluido en anlisis es la media de no menos de tres determinaciones consecutivas. El resultado es vli-
do si la desviacin estndar relativa porcentual (%RSD) para las tres lecturas es no ms de 2,0%.
MTODO 11. VISCOSMETRO CAPILAR SIMPLE DE TUBO EN FORMA DE U (O TIPO 0STWALD)
Aparato: La determinacin se puede llevar a cabo con un viscosmetro capilar simple de tubo en forma de U (Figura 2).

l_

Figura 2. Viscosmetro capilar simple de tubo en forma de U (o tipo Ostwald).

Las variables y los nmeros de las lneas en la Figura 2 se definen como:

Lnea 1 = marca superior en el tubo
V = volumen dado del fluido (m3)
Lnea 2 = marca inferior en el tubo
L = longitud del tubo capilar (m)
Se pueden usar otros viscosmetros, como los viscosmetros capilares tipo Ostwald modificados, 1 siempre que la exactitud y
la precisin no sean menores que las obtenidas con los viscosmetros descritos en este captulo.
Procedimiento: Llenar el tubo con una cantidad de la muestra que sea apropiada para el viscosmetro en uso o siguiendo
las instrucciones del fabricante. El volumen de fluido usado debe ser tal que el bulbo inferior no se vace completamente
cuando el fluido se direcciona hacia arriba a travs del tubo capilar hasta la marca de graduacin ms alta. Llevar a cabo el
experimento con el tubo en posicin vertical. Sumergir el viscosmetro en un bao de agua o aceite estabilizado a la tem-
peratura especificada en la monografa individual y controlar la temperatura a 0, 1 , a menos que se especifique algo dis-
tinto en la monografa individual. Mantener el viscosmetro en posicin vertical durante un periodo de no menos de 30
minutos para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Usando succin, direccionar hacia arriba el
fluido a travs del tubo capilar hasta que el menisco alcance el nivel de la graduacin ms alta. Con el tubo de llenado y el

1 Por ejemplo, el viscosmetro capilar Cannon-Fenske es uno de los viscosmetros capilares simples de tubo en forma de U y tambin se conoce como viscosmetro
capilar tipo Ostwald modificado.
USP 39 Pruebas Fsicas / (912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios 799

tubo capilar abiertos a la presin atmosfrica, registrar el tiempo, en segundos, requerido para que el lquido fluya desde la
marca superior hasta la marca inferior en el tubo capilar. [NOTA-El tiempo de flujo mnimo debe ser 200 segundos.]
Calibracin y Clculo de las viscosidades cinemtica y newtoniana del fluido muestra: Proceder segn se indica en el
Mtodo l. Para ciertos viscosmetros capilares simples de tubo en forma de U, determinar la constante del viscosmetro a la
misma temperatura que el lquido de muestra en anlisis.

(912) VISCOSIDAD-MTODOS ROTATORIOS

El principio del mtodo se basa en medir la fuerza (torque) que acta sobre un rotor cuando ste rota a una velocidad angular
constante o velocidad de rotacin en un lquido. Los remetros o viscosmetros rotatorios se usan para medir la viscosidad
de fluidos newtonianos y no newtonianos. Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de fluidos
newtonianos o la viscosidad aparente de fluidos no newtonianos. La viscosidad calculada de los fluidos newtonianos debe
ser la misma (dentro del error experimental), independientemente de la velocidad de corte (o velocidad de rotacin). Dada
la dependencia de la viscosidad con respecto a la temperatura, la temperatura de la sustancia que se est midiendo se debe
controlar dentro de 0, 1 , a menos que se especifique algo distinto en la monografa individual. [NOTA-Para ms informa-
cin, ver el captulo Reometra (1911 ).]
MTODO l. VISCOSMETROS DE ROTOR
Aparato: En el viscosmetro de rotor, la viscosidad aparente se determina haciendo girar un rotor con forma de cilindro o
disco, segn se muestra en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente, sumergido en un gran volumen de lquido.

Figura 1. Rotores con forma de cilindro.

Figura 2. Rotores con forma de disco.

No se puede calcular una viscosidad absoluta debido a la gran distancia existente entre el rotor y la pared del recipiente, o
a la geometra del rotor. El torque empleado para mantener una velocidad angular dada proporciona una medida de la
resistencia del lquido a fluir, pero a menudo esto se describe como una viscosidad aparente.
Se pueden usar otros tipos de viscosmetros de rotor, siempre que la exactitud y la precisin no sean menores que las obte-
nidas con los viscosmetros descritos en este captulo.
800 (912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios / Pruebas Fsicas USP 39

Procedimiento: Cuando la medicin de la viscosidad se realiza en un vaso de precipitados o vaso, y debido a que la veloci-
dad de corte es desconocida, para poder conseguir reproducibilidad entre laboratorios que miden la viscosidad usando ins-
trumentos diferentes, deben informarse los siguientes parmetros junto con la medida de la viscosidad:
1. Tamao y especificaciones geomtricas del rotor
2. Velocidad angular o velocidad de rotacin del rotor
3. Temperatura de la sustancia de prueba
El rotor debe sumergirse a la profundidad recomendada, manteniendo al menos 1 cm de distancia con el fondo y con las
paredes del recipiente.
La preparacin de la muestra de prueba, incluyendo la equilibracin de temperatura, se especifica en cada monografa in-
dividual. Seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento con respecto a la carga de la muestra, la seleccin del
rotor y la operacin del viscosmetro.
Comprobacin de la calibracin: Comprobar la calibracin de la configuaracin de un viscosmetro particular a la tempe-
ratura de prueba, usando uno o ms fluidos de viscosidad conocida (estndares de viscosidad newtoniana). Los valores de
viscosidad de los estndares de calibracin deben contener el valor de viscosidad esperado del lquido de muestra. [NOTA-
Para ayudar a verificar la linealidad del aparato, se sugiere realizar mediciones de un estndar de viscosidad newtoniana a
distintas velocidades de rotacin a la temperatura de prueba.]
Se considera que un viscosmetro est calibrado cuando las viscosidades aparentes medidas estn dentro de 5% de los
valores indicados.
En general, la calibracin, operacin y limpieza del viscosmetro se deben llevar a cabo de acuerdo con las recomendacio-
nes del fabricante del instrumento.
MTODO 11. REMETROS DE CILINDROS CONCNTRICOS
Aparato: En los remetros de cilindros concntricos, la viscosidad aparente se determina colocando el lquido en el espacio
entre el cilindro interno y el cilindro externo. Los remetros rotatorios de tensin controlada y de velocidad controlada es-
tn disponibles comercialmente en configuraciones con especificaciones geomtricas absolutas (p.ej., espacios anulares
muy pequeos entre los cilindros concntricos) que permiten calcular las viscosidades aparentes de fluidos no newtonia-
nos. Los remetros de tensin de corte controlada miden las velocidades de corte resultantes al aplicar una fuerza o torque
dado (la tensin). Los remetros de velocidad de corte controlada miden la tensin de corte (del torque sobre el eje del
rotor) resultante de la aplicacin de una velocidad de corte dada (o velocidad de rotacin). Los remetros rotatorios de
cilindros concntricos en ocasiones reciben el nombre de remetros de vaso y cilindro ("cup-and-bob"). El uso de estos
remetros implica consideraciones adicionales de diseo, dependiendo de si lo que gira es el cilindro externo (el vaso) o el
cilindro interno (el cilindro). Los remetros de vaso rotatorio reciben el nombre de sistemas Couette, mientras que los re-
metros de cilindro interno rotatorio se denominan sistemas Searle, segn se muestra en la Figura 3 y la Figura 4, respectiva-
mente.
Las variables en la Figura 3 y la Figura 4 se definen como:
M = torque que acta sobre la superficie del cilindro (N m)
R0 = radio del cilindro externo (m)
R, = radio del cilindro interno {m)
h = altura de inmersin del cilindro interno en el medio lquido (m)
w = velocidad angular (radianes/s)
r = viscosidad (Pa s)
v =velocidad (m/s)
Procedimiento: Colocar una cantidad suficiente de fluido de prueba en el remetro y dejar que la muestra alcance el equi-
librio trmico, segn se indica en la monografa individual. Poner en funcionamiento el remetro siguiendo el procedimien-
to recomendado por el fabricante del instrumento. Para sistemas no newtonianos, la monografa indica el tipo de remetro
que se debe usar y las velocidades de corte a las que se deben realizar las mediciones. Determinar las viscosidades aparen-
tes, cambiando la velocidad de corte (o la tensin de corte, si se usa un remetro de tensin de corte controlada) en un
intervalo apropiado para el uso del material en anlisis. A partir de una serie de este tipo de mediciones de viscosidad, se
puede obtener la relacin entre la velocidad de corte y la tensin de corte de un lquido no newtoniano.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios 801

Ro
Ri~

T--
h

J_ - w
,,,------ ~

r V

Figura 3. Sistema de cilindros concntricos Couette para reometra rotacional.

802 (912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios / Pruebas Fsicas USP 39

-r h

_ _ _ _ ~

Figura 4. Sistema de cilindros concntricos Searle para reometra rotacional.

MTODO 111. REMETROS DE CONO Y PLACA

Aparato: En los remetros de cono y placa, el lquido se introduce en el espacio fijo entre un disco o placa planos y un
cono los cuales forman un ngulo definido. El ngulo del cono garantiza una velocidad de corte constante debido al au-
mento del espacio y de la velocidad lineal conforme aumenta la distancia desde el origen. La medicin de viscosidad se
puede realizar haciendo girar el cono o la placa, segn se muestra en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente. (NOTA-
Puesto que el volumen de muestra es pequeo, incluso una pequea prdida absoluta de disolventes puede ocasionar un
gran cambio porcentual en la viscosidad. Dicha prdida tiene una importancia particularmente relevante para disolventes
voltiles pero puede ser significativa incluso para disolventes no voltiles como el agua.]
USP 39 Pruebas Fsicas/ (912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios 803

Figura 5. Remetro rotatorio de cono y placa con cono giratorio.

R_:
1
1
1

Figura 6. Remetro rotatorio de cono y placa con placa giratoria.

Las variables en la Figura 5 y la Figura 6 se definen como:

w =velocidad angular (radianes/s)
M = torque que acta sobre la superficie de la placa plana o del cono (N m)
a =ngulo entre la placa plana y el cono (radianes)
R = radio del cono (m)
Procedimiento: Proceder segn se indica en el Mtodo //. Remetros de Cilindros Concntricos.
MTODO IV. REMETROS DE PLACAS PARALELAS (O DE DISCOS PARALELOS)
Aparato: Los remetros de placas paralelas son similares a los remetros de cono y placa, salvo que la muestra que se va
medir se introduce en el espacio entre las dos placas o discos planos paralelos. Las mediciones se realizan normalmente
manteniendo la placa o disco inferior estacionario mientras que la placa o disco superior rota a una velocidad angular cons-
tante, w (Figura 7).
804 (912) Viscosidad-Mtodos Rotatorios / Pruebas Fsicas USP 39

(!)

r= R

Figura 7. Remetro rotatorio de placas paralelas.

Las variables en la Figura 7 se definen como:
co =velocidad angular (radianes/s)
R = radio de la placa (m)
h =distancia entre las dos placas paralelas (m)
A diferencia de lo que ocurre con el remetro de cono y placa, la velocidad de corte entre las placas paralelas aumenta con
la distancia desde el origen del eje de rotacin debido a que las velocidades lineales aumentan para una velocidad angular
dada con un espacio constante. De esta manera, se obtiene una velocidad de corte promedio. A pesar de esto, algunas de
las ventajas del remetro de placas paralelas incluye la facilidad de carga de la muestra (especialmente para lquidos muy
viscosos o semislidos blandos) y su aptitud para suspensiones de partculas. Para suspensiones, el espacio debe fijarse a
una altura suficiente para evitar que las partculas se muelan entre las placas. El usuario puede definir el espacio entre las
placas paralelas (dentro de lmites prcticos) y por lo tanto, ante la ausencia de partculas grandes, se pueden usar espa-
cios ms estrechos. Al igual que con los remetros de cono y placa, la prdida de disolvente por evaporacin puede afec-
tar en gran medida la viscosidad de la muestra, por lo que deben tomarse precauciones para minimizar la prdida de
disolvente.
Procedimiento: Proceder segn se indica en Mtodo 11. Remetros de Cilindros Concntricos.

(91 3) VISCOSIDAD-MTODO DE BOLA RODANTE

El siguiente procedimiento se usa para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una viscosi-
dad que es independiente de la tensin o velocidad de corte. [NOTA-Para ms informacin, ver el captulo Reometra (1911 ).]

APARATO

Ver la Figura 1.
El diseo bsico de un viscosmetro de bola rodante consiste en un tubo (o capilar) que contiene el lquido de muestra en
anlisis y una bola cuyo tiempo de rodado deber ser al menos 20 segundos en el ngulo de medicin en el lquido de mues-
tra.
 USP 39 Pruebas Fsicas/ (913) Viscosidad-Mtodo de Bola Rodante 805

Fv: Fuerza de viscosidad

F8: Fuerza de flotacin
Fe: Gravedad

Figura 1. Diseo bsico para un viscosmetro de bola rodante.

PRINCIPIO DE MEDICIN
La medicin de viscosidad por medio de la bola rodante se basa en la Ley de Stokes y se ve influenciada por el ngulo de
inclinacin del tubo (o capilar). Calcular la viscosidad newtoniana, YJ, en mPa s:
1J = [(p 1 - p 2 ) x g x r2 x sinBJ/v00

p 1 = densidad de la bola usada (g/mL)

p 2 =densidad del lquido de muestra (g/mL)
g = constante gravitacional (mm/s2)
r = radio de la bola (mm)
B =ngulo de inclinacin del tubo (o capilar)
v =velocidad terminal de la bola (mm/s)
00

Determinar la viscosidad del lquido, observando el tiempo de rodado de una esfera slida (bola) bajo la influencia de la
gravedad en un tubo cilndrico inclinado relleno del lquido de muestra. Medir el tiempo que la bola tarda en recorrer la dis-
tancia establecida entre dos marcas de anillo o sensores de medicin. Para cada uno de los tiempos de rodado medidos, la
viscosidad resultante se puede expresar como viscosidad dinmica (mPa s) o como viscosidad cinemtica (mm2/s) para una
muestra con una densidad conocida.

PROCEDIMIENTO
Seleccionar un sistema de medicin [combinacin de tubo (o capilar) y bola] dentro del intervalo anticipado de viscosidad
del lquido de muestra. Calentar el tubo limpio y seco y la bola del viscosmetro a la temperatura especificada en la monografa
individual y controlar la temperatura a 0, 1segn sea necesario, a menos que se especifique algo distinto en la monografa
individual. Seleccionar un ngulo de medicin para obtener un tiempo de rodado mnimo de 20 segundos. Llenar el tubo con
el lquido de muestra, procurando evitar la formacin de burbujas. Cerrar el tubo y colocarlo en el instrumento. Para un visco-
smetro de bola rodante con un tubo de dimetro grande, dejar que se equilibre a la temperatura especificada durante no
menos de 15 minutos. Para un viscosmetro de microbola rodante, seguir las instrucciones del fabricante con respecto al equili-
brio de la temperatura. Soltar la bola y registrar el tiempo requerido para que la bola ruede desde la marca de anillo superior
hasta la marca de anillo inferior (o sensor de medicin). Repetir la prueba al menos cuatro veces.
El tiempo de rodado en el fluido en anlisis es la media de no menos de cuatro determinaciones consecutivas. El resultado es
vlido si la desviacin estndar relativa porcentual (%RSD) para las cuatro lecturas es no ms de 2,0%.

CLCULO V CALIBRACIN
Calcular la viscosidad newtoniana, YJ, en mPa s:

Y] = k X (p, - P2) X t
k =constante de calibracin del instrumento (mm 2/s 2) a un ngulo y temperatura de medicin especificados
p 1 = densidad de la bola usada (g/mL)
p 2 =densidad del lquido de muestra (g/mL)
t = tiempo de rodado de la bola (s)
Calibrar cada combinacin de tubo (o capilar) y bola a la temperatura y ngulo de prueba usando fluidos con viscosidades y
densidades conocidas (estndares de viscosidad) para determinar la constante del sistema de medicin, k. [NOTA-Algunos vis-
cosmetros automatizados emplean una funcin polinmica para determinar la calibracin para diversos ngulos y temperatu-
ras.] Los valores de viscosidad de los estndares de calibracin deben contener el valor de viscosidad esperado del lquido de
muestra.
806 (91 3) Viscosidad-Mtodo de Bola Rodante / Pruebas Fsicas USP 39

Las calibraciones son especficas para el radio y densidad de la bola, la temperatura y el ngulo de prueba. Siempre que se
cambie alguno de estos parmetros ser necesaria una recalibracin.
Cuando no se dispone de valores de referencia a la temperatura de prueba requerida, se deben seguir las instrucciones del
fabricante para aplicar las correcciones matemticas a la funcin de calibracin. Cuando los materiales de la bola y el tubo no
son similares, se deben aplicar correcciones calculadas usando los coeficientes de expansin trmica lineal de los materiales.

Agregar lo siguiente:

(914) VISCOSIDAD-MTODOS POR MEDIDA DE PRESIN

INTRODUCCIN
Los viscosmetros/remetros que se incluyen en este captulo pueden usarse para medir la viscosidad de los fluidos newtonia-
nos y no newtonianos. Los dispositivos incluyen viscosmetros/remetros de ranura y viscosmetros capilares de extrusin.
Los viscosmetros capilares que se describen en el captulo Viscosidad-Mtodos Capilares (911) se basan en el principio de que
el flujo est controlado por la gravedad y estos viscosmetros pueden clasificarse bajo uno de los mtodos por medida de
presin. Sin embargo, las limitaciones de los viscosmetros capilares de vidrio los vuelven inherentementeinadecuadospara
su uso en la caracterizacin de fluidos no newtonianos, adems de que su uso en mediciones de fluidos de alta viscosidad
tambin resulta imprctico. El presente captulo (914) no trata dichos viscosmetros.
[NOTA-Para informacin adicional, ver Reometra (1911 ).]
MTODO l. VISCOSMETROS/REMETROS DE RANURA
Aparato: Ver la figura 1.
El diseo bsico de un viscosmetro/remetro de ranura consta de un canal ranurado rectangular con un rea de seccin
transversal uniforme. Se bombea un lquido de prueba a una velocidad de flujo constante a travs de este canal. Mltiples
sensores de presin que se montan empotrados al ras a distancias lineales a lo largo de la direccin. de 1<1 t::orriente miden
la cad<! de presin, segn se representa en la Figura 7.

Figura l. Diseo bsico del visrnsmetro/remetro de ranura.:

Principio c;le medicin: El vscosmetro/remetro de ranura est basado en el principio fundamental de que un lqudq vise
coso resiste el flujo, por lo que presenta una presin que disminuye a lo Jarg.o dela ranura. La reduccin ocada de ll
presin (LlP) se correlaciona con ta tensin dexorte enJa unin de las paredes. La velocjdad de corte.aparente est directa.,
mente relacionada con la velocidad de flujo y la dimensin de la ranura. La velocid<1d de corte aparente (y.), la. tensin de
corte (o) y la viscosidad aparente (rJ, respectivamente, se calculan de la siguiente manera:

y;, = velocidad de corte aparente (s~1)

Q = velocidad de flujo {L/s)
w = ncho del canaldeflujo(mm)
h = profundidad de' canal c:le flujo (mm)
rr = tensin de corte (Pa)
LlP = diferencia de presin entre el sensor de presin inicial y el ltimo sensor de presin (Pa)
USP 39 Pruebas Fsicas/ (921) Determinacin de Agua 807

=distancia entre el sensor de presin inicial y el ltimo sensor de presin (mm)

r0 = viscosidad aparente (Pa s)
Para determinar la viscosidad de un lquido, bombear la muestra lquida a travs del canal ranurado a una velocidad de
flujo constante y medir la cada de la presin. Usando las ecuaciones mostradas anteriormente, calcular la viscosidad apa-
rente para la velocidad de corte aparente. Para un lquido newtoniano, la viscosidad aparente es la misma que la viscosi-
dad verdadera, y es suficiente la medicin de una velocidad de corte individual. Para lquidos no newtonianos, la viscosi-
dad aparente no es la viscosidad.verdadera. Para obtener la viscosidad verdadera, medir las viscosidades aparentes a ml-
tiples velocidades de corte aparentes .. Calcular las viscosidades verdaderas, r, a diversas velocidades de corte usando el
factor de correccin Weissenberg-Rabinowitsch-Mooney:

.!."'_l_x( 2 + dlnf")
t 2x17 0 dlno-

La viscosidad verdadera calculada deber ser igual al valor que se obtiene usando un remetro de cono y placa a la misma
velocidad de corte.
Procedimiento: Seleccionar dimensiones de ranura y presin mxima de los sensores de presin para obtener el intervalo
deseado de viscosidad y velocidades de corte. Cargar una muestra de prueba en una jeringa de vidrio con una bomba de
jeringa que controle la velocidad de flujo o intercambiablemente la velocidad de corte. Segn sea necesario, controlar la
temperatura de la muestra con una aproximacin de 0, 1 con la jeringa y el viscosmetro de ranura especificado eh el pro-
cedimiento individual, a menos que se especifique de otro modo. Dejar que se equilibre a la temperatura especificada du-
rante aproximadamente 3-5 minutos. Ajustar cada sensor de presin a cero. Seleccionar la primera velocidad de flujo o
velocidad de corte. Bombear la muestra a la velocidad de flujo y medir las lecturas de presin una vez que se hayan alcan-
zado valores de estado estacionario. Incrementar la velocidad de flujo (o velocidad de corte) hasta que la lectura de presin
del sensor ltiicial sea >5% del valor de la escala completa. Tomar el promedio de cada sensor de presin con el paso del
tiempo y calcular las cadas de presin. Calcular la viscosidad aparente. Si el procedimiento lo requiere, repetir las medtio-
nes cuatro veces. Si la muestra de prueba es no newtoniana, variar la velocidad de corte y calcular las viscosidades aparen
tes correspondientes.
Cfculo y calibracin: Calcular la viscosidad aparente dividiendo la tensin de corte por la velocidad de corte aparente.
Para lquidos no newtonianos, aplicar las correcciones Weissenberg-Rabinowitsch-Mooney para obtener la curva de viscosi-
dad verdadera. los viscosmetros comerciales incluyen un sistema de correccin en el mismo equipo.
Calibrar los sensores individuales de presin siguiendo las recomendaciones del fabricante. No obstante, el viscosmetro de
ranura puede calibrarse con un estndar newtoniano de viscosidad conocida. Seleccionar un estndar que abarque el in~
tervalo de viscosidad de inters para la ranura seleccionada y para los sensores de presin. Medir las viscosidades a las
velocidades de corte para el 10%, 50% y 90% de la escala completa del sensor de presin inicial y obtener el promedio.
Calcular una constante (k) como el cociente entre el valor de referencia (rre1) y el valor medido (T/meas) y registrar.

k == llrer
17mcos

Tfref =viscosidad de referencia (Pa. s)

rmeas =viscosidad medida (Pa s)
Multiplicar los nuevos datos de viscosidad por k, debido a que el valor de k corregir la incertidumbre y la variacin de la
geometra de la ranura. Idealmente, el valor de k debe permanecer constante dentro de un cambio de temperatura de
100. Si el valor k vara en> 1%, consultar con el fabrcante respecto a la compensacin de temperatura de los sensores de
presin.
AUSP39

(921) DETERMINACIN DE AGUA

Numerosos artculos farmacopeicos son hidratos o contienen agua en forma adsorbda. Como consecuenca, la determina-
cin del contenido de agua es importante para demostrar el cumplimiento con las normas farmacopeicas. Por lo general, en
cada monografa se exige uno de los mtodos que se describen a continuacin, en funcn de la naturaleza del artculo. En
algunos casos poco comunes se permite elegir entre dos mtodos. Si el artculo contiene agua de hidratacin, se utiliza el
Mtodo /(Volumtrico), el Mtodo 11 (Azeotrpico) o el Mtodo 111 (Gravimtrico), segn se indica en la monografa individual, y el
requsito se especifica bajo el encabezado Agua.
El encabezado Prdida por Secado (ver Prdida por Secado (731)) se utiliza en aquellos casos en los que la prdida por calenta-
miento puede no ser totalmente de agua.
808 (921) Determinacin de Agua / Pruebas Fsicas USP 39

MTODO 1 (VOLUMTRICO)
Determinar el agua mediante el Mtodo la, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.

Mtodo la (Valoracin Volumtrica Directa)

Principio-La determinacin volumtrica del agua est basada en la reaccin cuantitativa del agua con una solucin anhi-
dra de dixido de azufre y yodo en presencia de una solucin amortiguadora que reacciona con los iones hidrgeno.
En la solucin volumtrica original, conocida como Reactivo de Karl Fischer, el dixido de azufre y el yodo se disuelven en
piridina y metanol. La muestra de prueba puede valorarse con el Reactivo directamente o el anlisis puede realizarse mediante
un procedimiento de valoracin residual. La estequiometra de la reaccin no es exacta y la reproducibilidad de la determina-
cin depende de factores tales como las concentraciones relativas de los ingredientes del Reactivo, la naturaleza del disolvente
inerte utilizado para disolver la muestra de prueba y la tcnica utilizada en la determinacin en cuestin. Por lo tanto, para
conseguir la exactitud deseada se utiliza una tcnica empricamente estandarizada. La precisin del mtodo depende en gran
parte de la medida en que la humedad atmosfrica es eliminada del sistema. Normalmente la valoracin de agua se realiza
utilizando metanol anhidro como disolvente para la muestra de prueba. En algunos casos pueden utilizarse otros disolventes
adecuados para muestras de prueba especiales o no habituales. En estos casos, se recomienda la adicin de al menos 20% de
metanol u otro alcohol primario.
Aparato-Puede utilizarse cualquier aparato que garantice una exclusin de la humedad atmosfrica y una determinacin
del punto final adecuadas. En el caso de una valoracin directa de una solucin incolora, el punto final se puede observar vi-
sualmente como un cambio de color de amarillo canario a mbar. El caso inverso se observa cuando se realiza una valoracin
residual de una muestra de prueba. Sin embargo, de forma ms habitual el punto final se determina de forma electromtrica
utilizando un aparato con un circuito elctrico simple que genera un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV entre
un par de electrodos de platino sumergidos en la solucin que se desea valorar. En el punto final de la valoracin un ligero
exceso de reactivo aumenta el flujo de corriente entre 50 y 150 microamperios durante un perodo de 30 segundos a 30 mi-
nutos, dependiendo de la solucin que se est valorando. Este perodo es menor en el caso de sustancias que se disuelven en
el reactivo. En algunos valoradores volumtricos automticos el cambio abrupto de corriente o de potencial en el punto final
hace cerrar una vlvula operada por solenoide que controla la bureta que suministra la solucin volumtrica. Los aparatos dis-
ponibles comercialmente comprenden por lo general un sistema cerrado que consta de una o dos buretas automticas y un
vaso de valoracin cubierto hermticamente equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magntico. El aire en el
sistema se mantiene seco con un desecante adecuado y el vaso de valoracin puede purgarse mediante una corriente de nitr-
geno seco o de aire seco.
Reactivo-Preparar el Reactivo de Karl Fischer segn se indica a continuacin. Agregar 125 g de yodo a una solucin que
contenga 670 mL de metanol y 1 70 mL de piridina, y enfriar. Colocar 100 mL de piridina en una probeta graduada de 250 mL
y, manteniendo la piridina fra en un bao de hielo, introducir dixido de azufre seco hasta alcanzar un volumen de 200 ml.
Agregar lentamente esta solucin a la mezcla de yodo enfriada, agitando. Agitar hasta disolver el yodo, transferir la solucin al
aparato y dejar la solucin en reposo durante la noche antes de estandarizar. Un mL de esta solucin recientemente preparada
equivale aproximadamente a 5 mg de agua; como esta solucin se deteriora gradualmente, se recomienda estandarizarla den-
tro de un perodo de 1 hora antes de su uso o diariamente si su uso es continuo. Proteger la solucin de la luz mientras se est
utilizando. Almacenar el reactivo preparado a granel en un recipiente con tapn de vidrio adecuadamente sellado, totalmente
protegido de la luz y refrigerado. Para determinar agua en cantidades de trazas (menos de 1%), es preferible usar un Reactivo
con un factor de equivalencia de agua de no ms de 2,0, el cual generar el consumo de un volumen ms significativo de
solucin volumtrica.
Puede utilizarse una solucin estabilizada de reactivo de tipo Karl Fischer disponible comercialmente. Tambin pueden utili-
zarse reactivos disponibles comercialmente que contengan disolventes o bases diferentes a la piridina o alcoholes diferentes al
metanol. stos pueden ser soluciones individuales o reactivos formados in situ combinando los componentes de los reactivos
presentes en dos soluciones distintas. El Reactivo diluido requerido en algunas monografas debe diluirse de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Como diluyente puede utilizarse metanol u otro disolvente adecuado, como el ter monometlico
de etilenglicol.
Preparacin de Prueba-A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, utilizar una cantidad pesa-
da o medida con exactitud de la muestra en anlisis con un contenido de agua estimado de 2-250 mg. La cantidad de agua
depende del factor de equivalencia de agua del Reactivo y del mtodo de determinacin del punto final. En la mayora de los
casos, se puede estimar la cantidad mnima de la muestra, en mg, por la frmula:

FCV/KF
en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo, en mg por mL; Ces el volumen usado, en porcentaje, de la capa-
cidad de la bureta; V es el volumen de la bureta, en mL; y KF es el lmite o contenido razonable de agua esperado en la mues-
tra, en porcentaje. C est generalmente entre 30% y 100% para la valoracin manual, y entre 10% y 100% para el mtodo
instrumental de determinacin del punto final. [NOTA-Se recomienda que el producto de FCV sea mayor o igual a 200 para el
clculo, a fin de asegurar que la cantidad mnima de agua valorada sea mayor o igual a 2 mg.]
USP 39 Pruebas Fsicas/ (921) Determinacin de Agua 809

Si la muestra en anlisis es un aerosol con propelente, conservarla en el congelador durante no menos de 2 horas, abrir el
envase y analizar 10,0 ml de la muestra bien mezclada. Para valorar la muestra, determinar el punto final a una temperatura
de 1O o mayor.
Si la muestra en anlisis son cpsulas, utilizar una porcin del contenido mezclado de no menos de 4 cpsulas.
Si la muestra en anlisis son tabletas, utilizar el polvo de no menos de cuatro tabletas molidas hasta polvo fino en una at-
msfera con valores de temperatura y humedad relativa que se sepa que no afectan los resultados.
En los casos en los que la monografa especifique que la muestra en anlisis es higroscpica, colocar una porcin del slido,
pesada con exactitud, en un vaso de valoracin, procediendo inmediatamente y procurando evitar la absorcin de humedad
atmosfrica. Si la muestra est constituida por una cantidad definida de slido como producto liofilizado o polvo dentro de un
vial, utilizar una jeringa seca para inyectar un volumen adecuado de metanol, u otro disolvente adecuado, medido con exacti-
tud, en un recipiente tarado y agitar hasta disolver la muestra. Con la misma jeringa, retirar la solucin del recipiente y transfe-
rirla a un vaso de valoracin preparado segn se indica en Procedimiento. Repetir el procedimiento con una segunda porcin
de metanol u otro disolvente adecuado, medido con exactitud, agregar este lavado al vaso de valoracin y valorar inmediata-
mente. Determinar el contenido de agua, en mg, de una porcin de disolvente con el mismo volumen total que el utilizado
para disolver la muestra y para lavar el recipiente y la jeringa, segn se indica en Estandarizacin de la Solucin de Agua para
Valoraciones Volumtricas Residuales, y restar este valor del contenido de agua, en mg, obtenido en la valoracin de la muestra
en anlisis. Secar el recipiente y su cierre a 100 durante 3 horas, dejar que se enfren en un desecador y pesar. Determinar el
peso de la muestra analizada a partir de la diferencia en peso con respecto al peso inicial del recipiente.
Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conecta-
do al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrgeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formacin de agua como resultado de la deshidratacin debida a la descomposicin de los componentes de la muestra, lo cual
puede invalidar este mtodo.
Estandarizacin del Reactivo-Colocar una cantidad suficiente de metanol o de otro disolvente adecuado en el vaso de
valoracin para cubrir los electrodos y agregar suficiente Reactivo para obtener el color caracterstico del punto final, o
100 50 microamperios de corriente continua con un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV.
Se puede usar Agua Purificada, tartrato de sodio dihidrato, un Estndar de Referencia USP, o estndares comerciales con un
certificado de anlisis rastreable hasta un estndar nacional para estandarizar el Reactivo. El factor de equivalencia del reactivo,
el volumen de valoracin recomendado, el tamao de la bureta y la cantidad de estndar que se va a medir son factores a
considerar al momento de seleccionar el estndar y la cantidad que se va a usar. 1 Para Agua Purificada o estndares de agua,
agregar rpidamente el equivalente a entre 2 y 250 mg de agua. Calcular el factor de equivalencia del agua, F, en mg de agua
por ml de reactivo, por la frmula:

W/V
en donde W es el peso, en mg, del agua contenida en la alcuota de estndar usado; y V es el volumen, en ml, del Reactivo
usado en la valoracin. Para tartrato de sodio dihidrato, agregar rpidamente 20-125 mg de tartrato de sodio dihidrato
(C4 H4 Nap6 2H 2 0), pesados con exactitud por diferencia, y valorar hasta el punto final. El factor de equivalencia de agua F, en
mg de agua por ml de reactivo, se calcula por la frmula:

WIV (36,04/230,08)
en donde 36,04 es dos veces el peso molecular de agua y 230,08 es el peso molecular de tartrato de sodio dihidrato; W es el
peso, en mg, del tartrato de sodio dihidrato; y Ves el volumen, en ml, del Reactivo consumido en la segunda valoracin. To-
mar en cuenta que la solubilidad del tartrato de sodio dihidrato en metanol es tal que podra necesitarse metanol nuevo para
valoraciones adicionales del estndar de tartrato de sodio dihidrato.
Procedimiento-A menos que se especifique algo diferente, transferir suficiente metanol u otro disolvente adecuado al va-
so de valoracin asegurndose de que el volumen sea suficiente para cubrir los electrodos (aproximadamente 30-40 ml) y
valorar con el Reactivo hasta el punto final electromtrico o visual para consumir la humedad que pudiera estar presente. (No
tomar en cuenta el volumen consumido, ya que no se utiliza en los clculos). Agregar rpidamente la Preparacin de Prueba,
mezclar, y volver a valorar con el Reactivo hasta el punto final electromtrico o visual. Calcular el contenido de agua de la
muestra tomada, en mg, por la frmula:

SF
en donde Ses el volumen, en ml, del Reactivo consumido en la segunda valoracin; y Fes el factor de equivalencia de agua
del Reactivo.

1 Considerar una configuracin en la que el factor de equivalencia del reactivo sea de 5 mg/ml y el volumen' de la bureta sea de 5 ml, as como un punto final
instrumental. Se pueden usar cantidades de estndar equivalentes a entre 2,5 mg y 22,5 mg de agua (10%-90% de la capacidad de la bureta) basndose en la
bu reta y el factor de equivalencia del reactivo. El lmite superior de este intervalo implicara una cantidad excesiva de tartrato de sodio dihidrato. Si se pesa Agua
Purificada o un estndar, se requiere una balanza analtica apropiada para la cantidad pesada.
81 O (921) Determinacin de Agua/ Pruebas Fsicas USP 39

Mtodo lb (Valoracin Volumtrica Residual)

Principio-Ver la informacin que figura en la seccin Principio en Mtodo la. En la valoracin residual se agrega un exceso
de Reactivo a la muestra de prueba, se espera un tiempo suficiente para que se complete la reaccin y se valora el Reactivo no
consumido con una solucin estndar de agua en un disolvente como el metanol. El procedimiento de valoracin residual se
aplica de forma general y evita los problemas que pueden surgir en la valoracin directa de sustancias en las que el agua unida
se libera lentamente.
Aparato, Reactivo y Preparacin de Prueba-Usar el Mtodo la.
Estandarizacin de la Solucin de Agua para Valoraciones Volumtricas Residuales-Preparar una Solucin de Agua di-
luyendo 2 mL de agua con metanol u otro disolvente adecuado hasta 1000 ml. Estandarizar esta solucin valorando 25,0 mL
con el Reactivo, previamente estandarizado segn se indica en Estandarizacin del Reactivo. Calcular el contenido de agua, en
mg por mL, de la Solucin de Agua tomada, por la frmula:

V'F/25
en donde V es el volumen del Reactivo consumido y Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo. Determinar el conteni-
do de agua de la Solucin de Agua semanalmente y estandarizar peridicamente el Reactivo contra ste segn sea necesario.
Procedimiento-Si la monografa individual especifica que el contenido de agua debe ser determinado por el Mtodo lb,
transferir suficiente metanol u otro disolvente adecuado al vaso de valoracin, asegurndose de que el volumen sea suficiente
para cubrir los electrodos (aproximadamente 30-40 mL) y valorar con el Reactivo hasta el punto final electromtrico o visual.
Agregar rpidamente la Preparacin de Prueba, mezclar y agregar un exceso, medido con exactitud, de Reactivo. Esperar un
tiempo suficiente para que se complete la reaccin y valorar el Reactivo no consumido con la Solucin de Agua estandarizada
hasta el punto final electromtrico o visual. Calcular el contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la frmula:
F(X' - XR)
en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo; X' es el volumen, en mL, del Reactivo agregado despus de intro-
ducir la muestra; X es el volumen, en mL, de la Solucin de Agua estandarizada necesaria para neutralizar el Reactivo no consu-
mido; y R es el cociente, V /25 (mL de Reactivo/mL de Solucin de Agua), determinado a partir de la Estandarizacin de la Solu-
cin de Agua para Valoraciones Volumtricas Residuales.

Mtodo le (Valoracin Culombimtrica)

Principio-Para la determinacin culombimtrica del agua se utiliza la reaccin de Karl Fischer. El yodo, sin embargo, no se
agrega en forma de solucin volumtrica sino que se obtiene por oxidacin andica en una solucin que contiene yoduro. La
celda de reaccin consta normalmente de un amplio compartimiento andico y de un pequeo compartimiento catdico, se-
parados entre s por un diafragma. Tambin pueden utilizarse otros tipos adecuados de celdas de reaccin (p.ej., sin diafrag-
ma). Cada compartimiento tiene un electrodo de platino que conduce la corriente a travs de la celda. El yodo, que se produ-
ce en el electrodo andico, reacciona inmediatamente con el agua que est presente en el compartimiento. Cuando se ha
consumido toda el agua, se produce un exceso de yodo que normalmente se detecta electromtricamente, lo que indica el
punto final. La humedad se elimina del sistema mediante pre-electrlisis. No es necesario cambiar la solucin de Karl Fischer
despus de cada determinacin ya que las diferentes determinaciones pueden realizarse de forma sucesiva en la misma solu-
cin reactivo. Un requisito de este mtodo es que cada componente de la muestra de prueba sea compatible con los dems
componentes y que no se produzcan reacciones secundarias. Normalmente las muestras son transferidas al vaso en forma de
solucin mediante la inyeccin a travs de un septo. Los gases se pueden introducir en la celda utilizando un tubo de entrada
de gas adecuado. La precisin del mtodo depende fundamentalmente del grado de eliminacin de la humedad atmosfrica
en el sistema; por tanto, la introduccin de slidos en la celda puede requerir precauciones tales como trabajar en una cmara
cerrada con guantes en una atmsfera de gas inerte seco. El control del sistema se puede efectuar midiendo la deriva de la
lnea base, lo cual no excluye la necesidad de una correccin con un blanco cuando se usa como vehculo de introduccin de
la muestra. Este mtodo es especialmente adecuado para sustancias qumicas inertes como hidrocarburos, alcoholes y teres.
En comparacin con la valoracin volumtrica de Karl Fischer, la culombimetra es un micromtodo.
Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conecta-
do al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrgeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formacin de agua como resultado de reacciones de descomposicin por la deshidratacin de los componentes de la muestra,
lo cual puede invalidar este mtodo.
Aparato-Resulta adecuado cualquier aparato comercialmente disponible que conste de un sistema absolutamente herm-
tico equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magntico. El microprocesador del instrumento controla el proce-
dimiento analtico y muestra los resultados. No es necesario calibrar el instrumento ya que la corriente consumida puede me-
dirse de forma absoluta.
Reactivo-Ver las recomendaciones del fabricante.
Preparacin de Prueba-Cuando la muestra sea un slido soluble, se puede disolver una cantidad apropiada, pesada con
exactitud, en metanol anhidro u otros disolventes adecuados.
USP 39 Pruebas Fsicas/ (921) Determinacin de Agua 811

Cuando la muestra sea un slido insoluble, se puede extraer una cantidad apropiada, pesada con exactitud, usando un di-
solvente anhidro adecuado y se puede inyectar en la solucin del anolito. Alternativamente, se puede usar una tcnica de eva-
poracin en la que el agua se libere y evapore por calentamiento de la muestra en un tubo en una corriente de gas inerte seco.
El gas pasa luego al interior de la celda.
Cuando la muestra se va a usar directamente sin disolver en un disolvente anhidro adecuado, se puede introducir una canti-
dad apropiada, pesada con exactitud, directamente en la cmara.
Cuando la muestra es un lquido y es miscible con metano! anhidro u otros disolventes adecuados, se puede agregar una
cantidad apropiada, pesada con exactitud, al metanol anhidro u otros disolventes adecuados.
Procedimiento-Usando un dispositivo seco, inyectar o agregar directamente en el anolito una cantidad, medida con
exactitud, de la muestra o de la preparacin de la muestra que se estima contiene entre 0,5 y 5 mg de agua, o la cantidad
recomendada por el fabricante del instrumento, mezclar, y llevar a cabo la valoracin culombimtrica hasta el punto final elec-
tromtrico. Leer el contenido de agua de la Preparacin de Prueba lquida directamente de la pantalla del instrumento y calcu-
lar el porcentaje presente en la sustancia. Realizar una determinacin con un blanco, segn sea necesario, y realizar las correc-
ciones necesarias.

MTODO 11 (AZEOTRPICO-DESTILACIN CON TOLUENO)

Aparato-Utilizar un matraz de vidrio de 500 mL, A, conectado mediante una trampa, B, a un condensador de reflujo, C,
usando juntas de vidrio esmerilado (ver la Figura 7).

E- -D

A---

Figura 1. Aparato para Determinacin Azeotrpica con Tolueno

Las dimensiones crticas de las piezas del aparato son las siguientes. El tubo de conexin, D, tiene un dimetro interno de 9-
11 mm. La trampa tiene una longitud de 235-240 mm. El condensador, si es del tipo de tubo recto, tiene una longitud apro-
ximada de 400 mm y un dimetro interior de no menos de 8 mm. El tubo receptor, E, tiene una capacidad de 5 mL y su parte
cilndrica, con una longitud de 146-156 mm, est graduada en subdivisiones de O, 1 mL, de forma que el error de lectura no es
mayor de 0,05 mL para cualquier volumen indicado. La fuente de calor es preferiblemente un calentador elctrico con control
de restato o un bao de aceite. La parte superior del matraz y el tubo de conexin pueden estar aislados.
Limpiar el tubo receptor y el condensador con un limpiador adecuado, enjuagar exhaustivamente con agua y secar en un
horno. Preparar el tolueno que se va a utilizar agitando con una pequea cantidad de agua, separando el exceso de agua y
destilando el tolueno.
Procedimiento-Colocar en un matraz seco una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud al centgramo ms prxi-
mo, para obtener de 2-4 mL de agua. Si la sustancia es de tipo pastoso, pesar sobre una lmina metlica ovalada con un ta-
mao que pase justo a travs del cuello del matraz. Si existe la posibilidad de que al ingresar la sustancia se produzcan proyec-
ciones, agregar una cantidad suficiente de arena lavada y seca para cubrir el fondo del matraz o una serie de tubos capilares de
punto de fusin, con una longitud aproximada de 100 mm, sellados por el extremo superior. Colocar aproximadamente 200
mL de tolueno en el matraz, conectar el aparato y llenar el tubo receptor, E, con tolueno vertido a travs de la parte superior
del condensador. Calentar el matraz suavemente durante 15 minutos y, una vez que el tolueno empiece a hervir, destilar a una
velocidad de aproximadamente dos gotas por segundo hasta que la mayor parte del agua haya sido arrastrada y despus de
aumentar la velocidad de destilacin aproximadamente a cuatro gotas por segundo. Cuando aparentemente se haya destilado
toda el agua, enjuagar el interior del tubo del condensador con tolueno mientras se cepilla el tubo en forma descendente con
812 (921) Determinacin de Agua / Pruebas Fsicas USP 39

un cepillo para tubos fijado a un alambre de cobre y saturado con tolueno. Continuar la destilacin durante cinco minutos;
luego retirar la fuente del calor y dejar que el tubo receptor se enfre a temperatura ambiente. Si quedan gotitas de agua adhe-
ridas a las paredes del tubo receptor, arrastrarlas hacia abajo con un cepillo formado por una cinta de goma envuelta alrededor
de un alambre de cobre y humedecida con tolueno. Una vez que el agua y el tolueno se hayan separado totalmente, leer el
volumen de agua y calcular el porcentaje que estaba presente en la sustancia.

MTODO 111 (GRAVIMTRICO)

Procedimiento para Sustancias Qumicas-Proceder segn se indica en la monografa individual preparando la sustancia
qumica segn se indica en Prdida por Secado (731 ).
Procedimiento para Sustancias Biolgicas-Proceder segn se indica en la monografa individual.
Procedimiento para Artculos de Origen Botnico-Colocar en una cpsula de evaporacin tarada aproximadamente
1 Og del frmaco, pesados con exactitud, y preparados segn se indica (ver Mtodos de Anlisis en Artculos de Origen Botnico
(561 )). Secar a 105 durante 5 horas y pesar. Continuar el secado y la pesada a intervalos de 1 hora hasta que la diferencia
entre dos pesadas sucesivas no sea mayor de 0,25%.

(941) CARACTERIZACIN DE SLIDOS CRISTALINOS Y

PARCIALMENTE CRISTALINOS POR DIFRACCIN DE RAYOS X SOBRE
POLVO (DRXP)

INTRODUCCIN
Toda fase cristalina de una sustancia determinada produce un patrn caracterstico de difraccin de rayos X. Los patrones de
difraccin (o difractogramas) se pueden obtener a partir de un polvo cristalino orientado aleatoriamente, compuesto de crista-
litos o fragmentos de cristal de tamao finito. En esencia, de un patrn de difraccin de un polvo se pueden obtener tres tipos
de informacin: la posicin angular de las lneas de difraccin (dependiendo de la geometra y el tamao de la celda unidad),
las intensidades de las lneas de difraccin (dependiendo principalmente del tipo y arreglo de los tomos y de la orientacin de
las partculas dentro de la muestra) y los perfiles de las lneas de difraccin (dependiendo de la resolucin instrumental, el ta-
mao de los cristalitos, la tensin y el espesor de la muestra).
Los experimentos que arrojan posiciones angulares e intensidades de las lneas se pueden utilizar para aplicaciones como el
anlisis cualitativo de las fases (p.ej., la identificacin de las fases cristalinas) y el anlisis cuantitativo de las fases de materiales
cristalinos. Tambin se puede hacer un clculo de las fracciones amorfas y cristalinas. 1
El mtodo de difraccin de rayos X sobre polvo (DRXP) ofrece una ventaja sobre otros mtodos de anlisis pues por lo gene-
ral es de naturaleza no destructiva (para garantizar una muestra orientada aleatoriamente, la preparacin de la muestra se limi-
ta habitualmente a una molienda). Las investigaciones por DRXP se pueden efectuar tambin bajo condiciones in situ en mues-
tras expuestas a condiciones no ambientales, tales como temperatura y humedad bajas o altas.

PRINCIPIOS
La difraccin de rayos X resulta de la interaccin entre los rayos X y las nubes de electrones de los tomos. Dependiendo del
ordenamiento atmico, pueden surgir interferencias de los rayos X dispersados. Estas interferencias son constructivas cuando la
diferencia de recorrido entre dos ondas difractadas de rayos X es un mltiplo entero de la longitud de onda. Esta condicin
selectiva est descrita por la ecuacin de Bragg, llamada tambin ley de Bragg (ver la Figura 1).
2dhkl senehkl = nA.

1 Existen muchas otras aplicaciones de la tcnica de difraccin de rayos X sobre polvo que se pueden aplicar a las sustancias farmacuticas cristalinas, como son la
determinacin de las estructuras cristalinas, el refinamiento de las estructuras cristalinas, la determinacin de la pureza cristalogrfica de las fases cristalinas y la
caracterizacin de la textura cristalogrfica. Estas aplicaciones no se describen en este captulo.
 USP 39 Pruebas Fsicas / (941) Difraccin de Rayos X sobre Polvo 81 3

Figura 1. Difraccin de rayos X por un cristal, de acuerdo con la ley de Bragg.

La longitud de onda, A, de los rayos X es del mismo orden de magnitud que la distancia entre planos sucesivos de la red
cristalina, o dhkl (tambin llamada espaciamiento d). ehkl es el ngulo entre el rayo incidente y la familia de planos reticulares y
sen ehkl es inversamente proporcional a la distancia entre planos cristalinos sucesivos o espaciamiento d.
La direccin y espaciado de los planos con referencia a los ejes de la celda unidad estn definidos por los ndices de Miller
{hkl}. Estos ndices son los recprocos, reducidos al nmero entero inmediatamente inferior, de las intersecciones que realiza un
plano con los ejes de la celda unidad. Las dimensiones de la celda unidad estn dadas por los espaciamientos a, by c, y los
ngulos entre ellos a, fJ y y.
El espaciado interplanar para un conjunto especfico de planos paralelos hkl se indica por dhkl Cada una de estas familias de
planos puede presentar rdenes de difraccin mayores cuando los valores d para las familias de planos relacionados nh, nk, ni
son reducidos por el factor 1/n (siendo n un nmero entero: 2, 3, 4, etc.).
Cada conjunto de planos en un cristal tiene un ngulo de difraccin de Bragg correspondiente, ehkl, asociado con l (para
una A especfica).
Se supone que una muestra de polvo es policristalina, de manera que en cualquier ngulo ehkl hay siempre cristalitos en una
orientacin que permite la difraccin de acuerdo con la ley de Bragg. 2 Para una longitud de rayos X determinada, las posicio-
nes de los picos de difraccin (tambin conocidos como "lneas", "reflexiones" o "reflexiones de Bragg") son caractersticas de
la red cristalina (espaciamientos d), sus intensidades tericas dependen del contenido de la celda unidad cristalogrfica (natu-
raleza y posiciones de los tomos) y los perfiles de las lneas dependen de la perfeccin y extensin de la red cristalina. Bajo
estas condiciones, el pico de difraccin tiene una intensidad finita que depende del arreglo atmico, tipo de tomos, desplaza-
miento trmico e imperfecciones estructurales, as como de las caractersticas del instrumento.
La intensidad depende de muchos factores como la estructura, la temperatura, la cristalinidad, la polarizacin, la multiplici-
dad y el factor de Lorentz.
Las principales caractersticas de los perfiles de las lneas de difraccin son: posicin 28, altura del pico, rea del pico y forma
del pico (caracterizada, por ejemplo, por el ancho o asimetra del pico, o por una funcin analtica o representacin emprica).
Un ejemplo del tipo de patrones de polvo obtenidos para cinco fases slidas diferentes de una sustancia se presenta en la
Figura 2.

2 Un polvo ideal para experimentos de difraccin consta de un gran nmero de cristalitos pequeos, esfricos, orientados aleatoriamente (dominios cristalinos que
difractan coherentemente). Si este nmero es suficientemente grande, siempre habr suficientes cristalitos en cualquier orientacin difractante para producir patro-
nes de difraccin reproducibles.
814 (941) Difraccin de Rayos X sobre Polvo/ Pruebas Fsicas USP 39

Forma D

Forma C

Forma B

Forma A

--
_ _ _ __ . . . . . ..
_.-.. -
u -,...,..,,...
--- - 1-...-
... - - -~~-----
,.......

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1111111111 1111 111 1 1 1 1 1 11111111 1

~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
amorfa

1 1 1

~ ~ ~ ~
1 i 1 '1 1

28(A Cu) Escala

Figura 2. Patrones de difraccin de rayos X sobre polvo obtenidos para cinco fases slidas diferentes de una sustancia (las
intensidades estn normalizadas).

Adems de los picos de difraccin, un experimento de difraccin de rayos X genera tambin un ruido de fondo ms o me-
nos uniforme sobre el cual se superponen los picos. Aparte de la preparacin de la muestra, otros factores contribuyen al ruido
de fondo, por ejemplo, el portamuestras, la dispersin difusa del aire y el equipo, y otros parmetros instrumentales como el
ruido del detector y la radiacin general del tubo de rayos X. La relacin pico-ruido puede aumentarse minimizando el ruido
de fondo y escogiendo tiempos de exposicin prolongados.

INSTRUMENTO

Configuracin del Instrumento

Los experimentos de difraccin de rayos X generalmente se efectan usando difractmetros de polvo o cmaras de polvo.
Un difractmetro de polvo por lo general consta de cinco partes principales: una fuente de rayos X; el sistema ptico del haz
incidente, el cual puede efectuar la monocromatizacin, filtrado, colimacin y/o enfoque del haz; un gonimetro; el sistema
ptico del haz de difraccin, que puede incluir monocromatizacin, filtrado, colimacin y enfoque o paralelizacin del haz; y
un detector. Tambin se requieren sistemas de recoleccin y procesamiento de datos, que por lo general estn incluidos en los
equipos modernos de medicin de difraccin.
Dependiendo del tipo de anlisis que se va a efectuar (identificacin de fases, anlisis cuantitativo, determinacin de los pa-
rmetros de la red, etc.) se requieren diferentes configuraciones y niveles de desempeo del instrumento de DRXP. Los instru-
mentos ms simples para medir los patrones de difraccin de polvo son las cmaras de polvo. El reemplazo de la pelcula foto-
grfica, como mtodo de deteccin, por los detectores fotnicos ha llevado al diseo de difractmetros en los cuales el arreglo
geomtrico del sistema ptico no hace un enfoque real sino un paraenfoque, tal como en la geometra de Bragg-Brentano. La
configuracin de paraenfoque de Bragg Brentano es la ms usada actualmente y por lo tanto se describe aqu brevemente.
Un instrumento dado puede proporcionar una geometra 8/28 horizontal o vertical o una geometra 8/8 vertical. Para ambas
geometras, el haz incidente de rayos X forma un ngulo 8 con el plano de superficie de la muestra y el haz de rayos X difracta-
do forma un ngulo 28 con la direccin del haz de rayos X incidente (un ngulo 8 con el plano de superficie de la muestra). En
la Figura 3 se representa el arreglo geomtrico bsico. El haz de radiacin divergente del tubo de rayos X (llamado haz prima-
USP 39 Pruebas Fsicas/ (941) Difraccin de Rayos X sobre Polvo 815

rio) pasa a travs de un conjunto de colimadores de placas paralelas y de una ranura de divergencia e ilumina la superficie
plana de la muestra. Todos los rayos difractados por cristalitos adecuadamente orientados en la muestra en un ngulo 20 con-
vergen en una lnea en la ranura receptora. Un segundo set de colimadores de placas paralelas y una ranura de dispersin se
puede colocar bien sea detrs o delante de la ranura receptora. Los ejes del foco de la lnea y de la ranura receptora estn a
igual distancia del eje del gonimetro. Los cuantos de rayos X se cuentan con un detector de radiacin, por lo general un
contador de centelleo, un contador proporcional de gas sellado o un detector de estado slido sensible a la posicin, tal como
una placa de imgenes o un detector de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en ingls). El montaje de la ranura recep-
tora y el detector se ensamblan juntos y se mueven tangencialmente al crculo de enfoque. Para barridos 0/20 el gonimetro
hace rotar la muestra sobre el mismo eje que el detector, pero a la mitad de la velocidad de rotacin, en un movimiento 0/
20.La superficie de la muestra permanece de esa manera tangencial al crculo de enfoque. El colimador de placas paralelas
limita la divergencia axial del haz y por lo tanto controla parcialmente la forma del perfil de la lnea difractada.

/ B

A {
1
/

/ ~'
/
1
""-
\ F

\'
-----
I

""- ,. /
'

A. tubo de rayos X D. ranura de anti-difusin G. ranura receptora del detector

B. ranura de divergencia E. ranura receptora H. detector

C. muestra F. monocromador J. circulo de enfoque

Figura 3. Arreglo geomtrico de la geometra de paraenfoque de Bragg-Brentano.

Tambin se puede usar un difractmetro en modo de transmisin. La ventaja de esta tecnologa es que disminuye los efec-
tos debidos a la orientacin preferencial. Tambin se puede usar un capilar de aproximadamente 0,5 a 2 mm de espesor para
cantidades pequeas de muestra.

Radiacin de Rayos X

En el laboratorio, los rayos X se obtienen bombardeando un nodo metlico con electrones emitidos por efecto termoinico
y acelerados en un campo elctrico fuerte (usando un generador de alto voltaje). La mayor parte de la energa cintica de los
electrones se convierte en calor, lo cual limita la potencia de los tubos y requiere un enfriamiento eficaz del nodo. Con el uso
de nodos rotatorios y sistemas pticos de rayos X se puede obtener un aumento de 20 a 30 veces en brillantez. Como alter-
nativa, se pueden producir fotones de rayos X en instalaciones a gran escala (sincrotrn).
El espectro emitido por un tubo de rayos X que funciona a un voltaje suficiente consta de un fondo continuo de radiacin
policromtica y una radiacin caracterstica adicional que depende del tipo de nodo. Solo esta radiacin caracterstica se usa
en experimentos de difraccin de rayos X. Las fuentes principales de radiacin usadas para difraccin de rayos X son tubos de
vaco que usan cobre, molibdeno, hierro, cobalto o cromo como nodos; los rayos X del cobre, molibdeno o cobalto se em-
plean ms comnmente para sustancias orgnicas (el uso de un nodo de cobalto puede preferirse especialmente para separar
distintas lneas de rayos X). La eleccin de la radiacin que se va a usar depende de las caractersticas de absorcin de la mues-
tra y la posible fluorescencia de los tomos presentes en la muestra. Las longitudes de onda usadas en la difraccin de polvos
generalmente corresponden a la radiacin K del nodo. Por consiguiente, resulta ventajoso hacer que el haz de rayos X sea
"monocromtico", eliminando todos los dems componentes del espectro de emisin. Esto puede conseguirse parcialmente
con filtros Kp, es decir, con filtros metlicos seleccionados por tener una discontinuidad de absorcin entre las longitudes de
816 (941 ) Difraccin de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Fsicas USP 39

onda K y Kp emitidas por el tubo. Dicho filtro usualmente se inserta entre el tubo de rayos X y la muestra. Otra forma ms
comnmente usada para obtener un haz de rayos X monocromtico consiste en usar un cristal monocromador grande (deno-
minado por lo general "monocromador"). Este cristal se coloca delante o detrs de la muestra y difracta los diferentes picos
caractersticos del haz de rayos X (es decir,~ y Kp) a diferentes ngulos, de forma que slo uno de ellos puede seleccionarse
para ingresar al detector. Incluso es posible separar las radiaciones ~ 1 y ~2 usando un monocromador especializado. Desafor-
tunadamente, la ganancia producida por la obtencin de un haz monocromtico al usar un filtro o un monocromador se con-
trarresta por una prdida en intensidad. Otra forma de separar longitudes de onda ~y Kp consiste en usar espejos curvos
para rayos X que puedan simultneamente monocromar y enfocar o paralelizar el haz de rayos X.

PROTECCIN CONTRA LA RADIACIN

La exposicin de cualquier parte del cuerpo humano a los rayos X puede ser nociva para la salud. Por lo tanto, siempre que
se use equipo de rayos X es fundamental tomar las precauciones adecuadas para proteger al operador y a cualquier persona
que se encuentre cerca. La prctica recomendada para protegerse de la radiacin, as como los lmites de los niveles de exposi-
cin a los rayos X son los establecidos por la legislacin nacional de cada pas. Si no existieran reglamentaciones o recomenda-
ciones oficiales en un pas, se deben aplicar las recomendaciones ms recientes de la Comisin Internacional de Proteccin
Radiolgica.

PREPARACIN Y MONTAJE DE LA MUESTRA

La preparacin del material en polvo y el montaje de la muestra en un soporte adecuado son pasos crticos en muchos m-
todos analticos, en particular para el anlisis por difraccin de rayos X sobre polvo, puesto que pueden afectar en gran medida
la calidad de los datos que se van a recolectar.3 Las principales fuentes de error debido a la preparacin y montaje de la mues-
tra se discuten brevemente en la siguiente seccin para instrumentos que operan en la geometra de paraenfoque de Bragg-
-Brentano.

Preparacin de la Muestra

En general, la morfologa de muchas partculas cristalinas tiende a dar una muestra que presenta cierto grado de orientacin
preferencial en el soporte de la muestra. Esto es especialmente evidente para los cristales en forma de aguja o de placa cuando
la reduccin de tamao proporciona agujas o plaquetas ms finas. La orientacin preferencial en la muestra influye sobre la
intensidad de las diversas reflexiones, de forma que algunas son ms intensas y otras menos intensas, comparado con lo que se
esperara de una muestra completamente aleatoria. Se pueden emplear diversas tcnicas para mejorar la aleatoriedad en la
orientacin de los cristalitos (y por lo tanto para minimizar la orientacin preferencial), pero una reduccin mayor del tamao
de la partcula es a menudo el mejor y ms simple de los mtodos. La cantidad ptima de cristalitos depende de la geometra
del difractmetro, la resolucin requerida y la atenuacin del haz de rayos X por la muestra. En algunos casos, tamaos de
partculas tan grandes como 50 m pueden proporcionar resultados satisfactorios en la identificacin de las fases. Sin embar-
go, una molienda excesiva (tamaos de cristalitos de menos de aproximadamente 0,5 m) puede ocasionar un ensanchamien-
to de las lneas y cambios significativos en la muestra misma, tales como:
contaminacin de la muestra por partculas desprendidas de los instrumentos de molienda (mortero, mano de mortero,
bolas, etc.),
reduccin del grado de cristalinidad,
transicin del estado slido a otro polimorfo,
descomposicin qumica,
introduccin de tensin interna, y
reacciones en estado slido.
Por lo tanto, es aconsejable comparar el patrn de difraccin de la muestra sin moler con el patrn correspondiente a una
muestra de tamao de partcula ms pequeo (p.ej., una muestra molida). Si el patrn de difraccin de rayos X sobre polvo es
de la calidad adecuada teniendo en cuenta el uso previsto, entonces es posible que la molienda no sea necesaria.
Cabe anotar que si una muestra contiene ms de una fase y si se usa el tamizado para aislar partculas de un tamao espec-
fico, se puede alterar la composicin inicial.

3 De manera similar, pueden ocurrir cambios en la muestra durante la recoleccin de datos, en el caso de muestras que no estn en equilibrio (temperatura,
humedad).
 USP 39 Pruebas Fsicas / (941 ) Difraccin de Rayos X sobre Polvo 81 7

Montaje de la Muestra

EFECTO DEL DESPLAZAMIENTO DE LA MUESTRA

Una superficie de muestra compensada por D con referencia al eje de rotacin del difractmetro causa errores sistemticos
que son muy difciles de evitar totalmente; para el modo de reflexin, esto produce desplazamientos absolutos D. cos04 en las
posiciones 20 (por lo general del orden de 0,01 en 20 en los ngulos inferiores
[cos8=1]

para un desplazamiento D = 15 m) y ensanchamiento asimtrico del perfil hacia valores 20 bajos. El uso de un estndar inter-
no apropiado permite la deteccin y correccin de este efecto simultneamente con el efecto debido a la transparencia de la
muestra. Este efecto constituye la mayor fuente de errores en los datos recolectados con difractmetros bien alineados.

EFECTO DEL ESPESOR Y TRANSPARENCIA DE LA MUESTRA

Cuando el mtodo de DRXP se aplica en modo de reflexin, a menudo es preferible trabajar con muestras de "espesor infini-
to". Para minimizar el efecto de transparencia, es aconsejable usar un sustrato no difractante (soporte con ruido de fondo nu-
lo); por ejemplo, una placa de silicio monocristalino cortada en paralelo a los planos reticulares 510. 5 Una ventaja del modo de
transmisin es que los problemas relacionados con la altura y transparencia de la muestra son menos importantes.
El uso de un estndar interno apropiado permite la deteccin y correccin de este efecto simultneamente con el efecto
debido al desplazamiento de la muestra.

CONTROL DEL DESEMPEO DEL INSTRUMENTO

El gonimetro y el sistema ptico correspondiente del haz de rayos X incidente y difractado tienen muchas partes mecnicas
que necesitan ajuste. El grado de alineacin o desalineacin influye directamente sobre la calidad de los resultados de una in-
vestigacin por DRXP. Por lo tanto, los diferentes componentes del difractmetro se deben ajustar cuidadosamente (sistemas
pticos y mecnicos, etc.) para minimizar adecuadamente los errores sistemticos a la vez que se optimizan las intensidades
recibidas por el detector. La bsqueda de intensidad y resolucin mximas es siempre antagnica cuando se alinea un difract-
metro. Por ello, se debe buscar el mejor equilibrio entre ambas cuando se efecta el procedimiento de alineacin. Existen mu-
chas configuraciones diferentes y los equipos de cada proveedor requieren procedimientos de alineacin especficos. El desem-
peo general del difractmetro se debe examinar y monitorear peridicamente usando materiales de referencia certificados
adecuados. Dependiendo del tipo de anlisis, tambin se pueden emplear otros materiales de referencia bien definidos, aun-
que se prefiere el uso de materiales de referencia certificados.

ANLISIS CUALITATIVO DE LAS FASES (IDENTIFICACIN DE FASES)

La identificacin de la composicin de las fases de una muestra desconocida por DRXP por lo general se basa en la compara-
cin visual o asistida por computadora, de una porcin de su patrn de difraccin de rayos X con el patrn experimental o
calculado de un material de referencia. Idealmente, estos patrones de referencia se obtienen de muestras monofsicas bien
caracterizadas. Este mtodo permite, en la mayora de los casos, identificar una sustancia cristalina por sus ngulos de difrac-
cin 20 o espaciamientos d y por sus intensidades relativas. La comparacin asistida por computadora del patrn de difraccin
de la muestra desconocida con los datos de referencia se puede basar bien sea en un intervalo 20 ms o menos extendido del
patrn de difraccin total o en un conjunto de datos reducidos derivados del patrn. Por ejemplo, la lista de espaciamientos d
y de las intensidades normalizadas, lnormi llamada lista (d, lnorm) extrada del patrn, es la huella cristalogrfica del material y
puede compararse con listas (d, lnorm) de muestras monofsicas compiladas en bases de datos.
Para la mayora de los cristales orgnicos, al usar radiacin Cu K"" resulta apropiado registrar el patrn de difraccin en un
intervalo 20 desde lo ms cerca posible a O hasta por lo menos 40. La concordancia en los ngulos de difraccin 20 entre la
muestra y la referencia est dentro de 0,2 para la misma forma cristalina, mientras que las intensidades relativas entre la mues-
tra y la referencia pueden variar considerablemente debido a los efectos de la orientacin preferencial. Por su misma naturale-
za, se sabe que los hidratos y solvatos variables tienen dimensiones de celda unidad variables y por esa razn ocurren desplaza-
mientos en las posiciones de los picos de los patrones de DRXP medidos para estos materiales. En estos materiales exclusivos,
no es inesperada una discrepancia en las posiciones 20 mayores de 0,2. Por esa razn, las variaciones dentro de 0,2 en la
posicin del pico no son aplicables a estos materiales. Para otros tipos de muestras (p.ej., sales inorgnicas), puede ser necesa-

4 Cabe anotar que un desplazamiento en la alineacin en cero del gonimetro ocasionara un desplazamiento constante en todas las posiciones 28 observadas; es
decir, todo el patrn de difraccin se mueve en este caso por una desviacin de Z en 28.
5 En el caso de una muestra delgada con baja atenuacin, se pueden hacer mediciones exactas de las posiciones de las lneas con configuraciones de enfoque del
difractmetro en geometra de transmisin o de reflexin. Las mediciones exactas de las posiciones de las lneas sobre muestras con baja atenuacin se hacen
preferiblemente con difractmetros que tengan sistemas pticos de haces paralelos. Esto ayuda a reducir los efectos del espesor de la muestra.
81 8 (941 ) Difraccin de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Fsicas USP 39

ro ampliar el barrido de la regin 29 hasta bastante ms all de los 40. Por lo general es suficiente hacer un barrido de las 1O
reflexiones ms fuertes identificadas en las bases de datos de difraccin de rayos X sobre polvo monofsico.
En ocasiones es difcil o incluso imposible identificar fases en los siguientes casos:
sustancias no cristalizadas o amorfas,
los componentes a identificar estn presentes en bajas fracciones de masa respecto a las cantidades del analito (general-
mente menos de 10% m/m),
efectos de orientacin preferencial pronunciados,
la fase no est archivada en la base de datos usada,
la formacin de soluciones slidas,
la presencia de estructuras desordenadas que alteran la celda unidad,
la muestra comprende demasiadas fases,
la presencia de deformaciones de la red cristalina,
la similitud estructural de diferentes fases.

ANLISIS CUANTITATIVO DE LAS FASES

Si la muestra bajo investigacin es una mezcla de dos o ms fases conocidas, de las cuales no ms de una es amorfa, en
muchos casos se puede determinar el porcentaje (en volumen o masa) de cada fase cristalina y de la fase amorfa. El anlisis
cuantitativo de las fases se puede basar en las intensidades integradas, en las alturas de los picos de varias lneas de difraccin
individuales6 o en el patrn de difraccin completo. Estas intensidades integradas, alturas de los picos o datos del patrn com-
pleto se comparan con los valores correspondientes de los materiales de referencia. Estos materiales de referencia deben ser
monofsicos o una mezcla de fases conocidas. Las dificultades encontradas durante el anlisis cuantitativo se deben a la prepa-
racin de la muestra (la exactitud y precisin de los resultados requieren, en particular, homogeneidad de todas las fases y una
distribucin apropiada del tamao de partculas en cada fase) y a los efectos de la matriz.
En casos favorables, en matrices slidas se pueden determinar cantidades de fases cristalinas tan pequeas como 10%.

Muestras Polimrficas

Para una muestra compuesta de dos fases polimrficas a y b, se puede usar la siguiente expresin para cuantificar la fraccin
F" de la fase a:

La fraccin se obtiene midiendo la relacin de intensidad entre las dos fases, si se conoce el valor de la constante K. K es la
relacin de las intensidades absolutas de las dos fases polimrficas puras l0 ./l 0 b. Su valor puede determinarse midiendo mues-
tras del estndar.

Mtodos que Usan un Estndar

Los mtodos ms comnmente usados para el anlisis cuantitativo son:

el mtodo del estndar externo,
el mtodo del estndar interno, y
el mtodo de adicin (tambin llamado a menudo mtodo de adicin de estndar o mtodo de estndar agregado).
El mtodo del estndar externo es el ms general y consiste en comparar el patrn de difraccin de rayos X de la mezcla, o
las intensidades de las lneas respectivas con las medidas de una mezcla de referencia o con las intensidades tericas de un
modelo estructural, si se conoce totalmente.
Para limitar errores debidos a los efectos de la matriz, se puede usar un material de referencia interno que tenga un tamao
de cristalitos y un coeficiente de absorcin de los rayos X comparables con los de los componentes de la muestra y un patrn
de difraccin que no se solape en absoluto con el de la muestra que se va a analizar. Una cantidad conocida de este material
de referencia se agrega a la muestra a analizar y a cada una de las mezclas de referencia. Bajo estas condiciones existe una
relacin lineal entre la intensidad de las lneas y la concentracin. Esta aplicacin, llamada el mtodo del estndar interno, re-
quiere mediciones precisas de las intensidades de difraccin.
En el mtodo de adicin (o mtodo de adicin de estndar), parte de la fase pura a se agrega a la mezcla que contiene la
concentracin desconocida de a. Se hacen mltiples adiciones para preparar una grfica de intensidad en funcin de la con-
centracin en donde la interseccin negativa del eje x es la concentracin de la fase a en la muestra original.

6 Si se conocen las estructuras cristalinas de todos los componentes, se puede usar el mtodo de Rietveld para cuantificarlas con una buena exactitud. Si no se
conocen las estructuras cristalinas de los componentes se puede usar el mtodo de Pawley o el mtodo de cuadrados mnimos parciales (PLS, por sus siglas en
ingls).
USP 39 Pruebas Fsicas / (941) Difraccin de Rayos X sobre Polvo 819

CLCULO DE LAS FRACCIONES AMORFAS V CRISTALINAS

En una mezcla de fases amorfas y cristalinas se pueden calcular las fracciones amorfas y cristalinas de varias maneras. La elec-
cin del mtodo usado depende de la naturaleza de la muestra:
Si la muestra consta de fracciones cristalinas y una fraccin amorfa de composiciones qumicas diferentes, las cantidades
de cada una de las fases cristalinas individuales puede calcularse usando sustancias estndar apropiadas, segn se descri-
bi anteriormente. La fraccin amorfa se deduce luego indirectamente por sustraccin.
Si la muestra consta de una fraccin amorfa y una cristalina, bien sea como una mezcla de 1 fase o 2 fases, con la misma
composicin elemental, la cantidad de la fase cristalina (el "grado de cristalinidad") se puede calcular midiendo tres reas
del difractograma:
A= rea total de los picos que surgen de la difraccin de la fraccin cristalina de la muestra,
B = rea total por debajo del rea A,
C =rea de ruido de fondo (debido a dispersin del aire, fluorescencia, equipo, etc.).
Una vez medidas estas reas, el grado de cristalinidad se puede calcular en forma aproximada como:
% de cristalinidad = 1OOA/(A + B - C)
Debe mencionarse que este mtodo no arroja un grado absoluto de valores de cristalinidad y por lo tanto se usa generalmente
para propsitos comparativos nicamente. Tambin se cuenta con mtodos ms sofisticados, como el de Ruland.

ESTRUCTURA DEL MONOCRISTAL

En general, la determinacin de las estructuras cristalinas se efecta a partir de los datos de difraccin de los rayos X obteni-
dos usando monocristales. Sin embargo, el anlisis de la estructura cristalina de los cristales orgnicos es una tarea exigente,
puesto que los parmetros de la red son comparativamente grandes, la simetra es baja y las propiedades de dispersin son
normalmente muy bajas. Para cualquier forma cristalina dada de una sustancia, el conocimiento de la estructura cristalina per-
mite el clculo del patrn correspondiente de DRXP, proporcionando en consecuencia un patrn de referencia de DRXP exen-
to de orientacin preferencial, el cual se puede usar para la identificacin de las fases.
820 (1005) Emisin Acstica / Informacin General USP 39

Captulos Generales
Informacin General

Informacin General

Los captulos de esta seccin son de carcter informativo y no contienen normas, pruebas, valoraciones, ni otras especifica-
ciones de cumplimiento obligatorio para ningn artculo farmacopeico, a excepcin de las citas de Leyes y reglamentos federa-
les que puedan ser aplicables. Las citas de Leyes y reglamentos federales se incluyen en esta seccin debido a que no son de la
autora de la Farmacopea. Las revisiones o reformas de los requisitos federales que afecten al contenido de estas citas se publi-
carn en los Suplementos de los compendios USP-NF a la brevedad posible. Los requisitos oficiales de los artculos farmacopeicos
se establecen en las Advertencias Generales, las monografas individuales y en los captulos referentes a Pruebas y Valoraciones
Generales de esta Farmacopea.

(1005) EMISIN ACSTICA

INTRODUCCIN
Las tcnicas ultrasnicas se pueden categorizar en dos tipos especficos: emisin acstica (modo pasivo) y espectroscopa
ultrasnica (modo activo). Ambas tcnicas tienen muchas aplicaciones.
La tcnica de emisin acstica se basa en la deteccin y anlisis de sonidos producidos por un proceso o sistema. En esencia
esto es equivalente a escuchar el proceso o sistema, aunque estos sonidos a menudo estn muy por encima de las frecuencias
que el odo humano puede detectar. Por lo general, las frecuencias son audibles hasta 15 kHz aproximadamente.
En el caso de la espectroscopa ultrasnica, el instrumento est diseado para generar ondas de ultrasonido en un intervalo
de frecuencia definido. Estas ondas viajan a travs de la muestra y se miden por medio de un receptor. Se puede establecer
una analoga con la espectroscopa UV visible o la espectroscopa IR, por cuanto el espectro ultrasnico detectado refleja cam-
bios en la velocidad o atenuacin del sonido debido a la interaccin con una muestra a travs de un intervalo de frecuencias.
Sin embargo, puesto que el alcance de este captulo se limita a la emisin acstica, no discutiremos en detalle la espectrosco-
pa ultrasnica.
La emisin acstica es bien conocida en el estudio de la mecnica de fractura, y por lo tanto, se usa ampliamente entre los
cientficos de materiales. Tambin se usa mucho como una tcnica de pruebas no destructiva y se aplica en forma rutinaria
para la inspeccin de alas de aviones, recipientes de presin, estructuras y componentes de soporte de carga. La emisin acs-
tica tambin se usa en ingeniera para monitorear el desgaste de mquinas.
En trminos de aplicaciones farmacuticas, la dependencia de la medicin de la emisin acstica de propiedades fsicas co-
mo el tamao de las partculas, la resistencia mecnica y la cohesin de los materiales slidos permite el uso de esta tcnica
para el control y deteccin del punto final de procesos como la granulacin de alta velocidad, secado en lecho fluido, molien-
da y micronizacin.

Principios Generales

Las emisiones acsticas se pueden propagar por diferentes modos. En slidos, los modos compresionales y de corte o trans-
versales son importantes. Los modos compresionales tienen la velocidad ms alta y por lo tanto alcanzan el detector acstico
(o transductor de emisin acstica) primero. Sin embargo, en la mayora de las aplicaciones de emisin acstica en procesos,
existen muchas fuentes y cada una de ellas produce descargas cortas de energa; por consiguiente, los diferentes modos no se
pueden resolver fcilmente. Por ejemplo, la seal detectada en la pared de un vaso es una mezcla compleja de muchas formas
de ondas superpuestas provenientes de muchas fuentes y modos de propagacin.
USP 39 Informacin General/ (1005) Emisin Acstica 821

En las interfases, dependiendo de la impedancia acstica relativa de los dos materiales, mucha de la energa se refleja de
vuelta hacia la fuente. En un lecho fluido, por ejemplo, las emisiones acsticas slo sern detectadas a partir de partculas que
impacten directamente las paredes del lecho prximas al transductor.
Un mtodo conveniente de estudiar la emisin acstica de los procesos es usar el "nivel medio de seal". Se puede usar un
convertidor de valor eficaz a corriente continua (convertidor RMS a CC; RMS-to-DC, por sus siglas en ingls) para convertir la
seal portadora de amplitud modulada (AM) en una seal de corriente continua (CC) que vara ms lentamente. Esto se cono-
ce como nivel medio de seal (ASL, por sus siglas en ingls). El ASL puede entonces muestrearse digitalmente (por lo general a
una frecuencia de muestreo de aproximadamente 50 Hz) y almacenarse electrnicamente para el procesamiento adicional de
la seal.
La forma ms sencilla de estudiar los datos acsticos consiste en examinar cambios en el ASL. Sin embargo, se puede recabar
otra informacin al examinar el espectro de potencia del ASL. El espectro de potencia se calcula tomando el cuadrado comple-
jo del espectro de amplitud y se puede obtener efectuando una Transformada Rpida de Fourier (TRF) sobre el registro de
datos digitalizados sin procesar. Los espectros de potencia se pueden promediar para producir un clculo confiable de la densi-
dad espectral de potencia o para obtener una "huella digital (fingerprint)" de un rgimen de proceso particular. La interpreta-
cin del espectro de potencia se complica por el hecho de que la seal acstica originada en el sistema se distorsiona por va-
rios factores, incluyendo la transmisin, reflexin y caractersticas de la seal de transferencia.
La forma del espectro de potencia en el registro del ASL es una funcin de la dinmica del proceso. Los procesos peridicos
(p.ej., mezclado mecnico o burbujeo peridico de un lecho fluido) muestran alta potencia a determinadas frecuencias discre-
tas. Los procesos aleatorios muestran propiedades de tipo parpadeante (flicker noise), donde la potencia es inversamente pro-
porcional a la frecuencia, o propiedades del ruido blanco en donde la potencia es independiente de la frecuencia. La amplitud
del espectro de potencia tambin se ve afectada por la energa de las emisiones acsticas producidas por el proceso. Por ejem-
plo, si se est procesando un material duro, la emisin acstica producida por el impacto de las partculas ser mayor que la
producida por un material blando.

INSTRUMENTACIN
Por lo general, los sensores piezoelctricos se usan para detectar y cuantificar las seales acsticas producidas por un proce-
so. Los transductores piezoelctricos se fabrican a partir de slidos cristalinos piezoelctricos conectados a circuitos de control
de transductores por contactos elctricos. Cuando est configurado como un detector, una onda acstica que incide sobre el
elemento piezoelctrico se transforma en una seal elctrica en el circuito de control del transductor. Cuando se lo configura
como generador acstico, una seal elctrica aplicada al elemento piezoelctrico por el circuito de control genera una onda
acstica que puede propagarse por el medio al cual est conectado el transductor. Por lo general, esto significa que los detec-
tores de emisin acstica pueden funcionar tambin como generadores de ondas acsticas y esta caracterstica se usa para
garantizar el buen desempeo del sensor segn se describe ms adelante (ver Calificacin y Verificacin de Instrumentos de Emi-
sin Acstica).
En las aplicaciones generales de emisin acstica, a menudo se usan sensores con frecuencias de resonancia diferentes (p.ej.,
70 y 190 kHz, aunque frecuencias ms altas podran ser ms apropiadas a menores escalas de funcionamiento), que compren-
den varios pasos de banda. A medida que el sonido (ultrasonido) del intervalo de frecuencia apropiada alcanza estos sensores,
se genera una seal elctrica cuya amplitud es directamente proporcional a la energa (amplitud) de las ondas de sonido inci-
dentes.
Estas seales se procesan por medio de:
(1) un preamplificador (que incluye filtrado de seales),
(2) un convertidor RMS a CC,
(3) un amplificador de ganancia variable y
(4) una terminal de recoleccin de datos conectada a una computadora, la cual cuenta tambin con un software de control.
El equipo de emisin acstica por lo general permite usar varios sensores simultneamente, con la incorporacin de mlti-
ples canales electrnicos en un solo instrumento.

Procesamiento de la Seal

La seal de un transductor resonante se asemeja a una seal de radio de amplitud modulada (AM). A la frecuencia de reso-
nancia del transductor, la seal consiste en una onda transportadora cuya amplitud es modulada por el proceso. Para demodu-
lar la seal se usa un convertidor RMS a CC. La potencia de salida de este dispositivo es la seal o envolvente de modulacin.
El envolvente se vuelve a muestrear digitalmente a una frecuencia apropiada para el proceso. Por ejemplo, 50 Hz es la tasa
habitual de muestreo digital para un secador de lecho fluido o un granulador de alta velocidad.

FACTORES QUE AFECTAN LA MEDICIN

Los siguientes factores pueden afectar los datos acsticos obtenidos y deben tenerse en consideracin al instalar un sistema
de emisin acstica.
822 (1005) Emisin Acstica / Informacin General USP 39

1. Falla o Dao Fsico-Al igual que cualquier otro tipo de sensor, los sensores de emisin acstica pueden fallar con el tiem-
po o como resultado de dao fsico. Es importante verificar la funcin del sensor como parte del mantenimiento de rutina
del instrumento. Si se instalan mltiples sensores en el mismo recipiente, .se puede generar una seal activa desde un sen-
sor y sta se puede usar para verificar la deteccin en otro sensor. Este ejercicio debera garantizar que los sensores estn
detectando las seales acsticas generadas por el proceso. Al comenzar, en la mitad y al final del proceso se debe deter-
minar y monitorear tambin la "seal acstica aceptable mnima" para los sensores, que sea estadsticamente vlida, con
el fin de garantizar el desempeo de los sensores durante una corrida del proceso. Esto se puede establecer a partir de
experimentos rutinarios de la seal de mantenimiento o basndose en los datos histricos de los sensores.
2. Problemas de Interfase del Sensor-Los sensores se instalan por lo general en la pared exterior del recipiente usado en el
proceso. Para asegurar el sensor a la pared exterior se pueden usar varios tipos de adhesivos (temporales o permanentes).
Durante las limpiezas y movimientos repetidos del recipiente, se puede alterar la unin del sensor al recipiente. La verifica-
cin de la integridad de la instalacin debe formar parte del mantenimiento rutinario. En forma similar al punto 1 tratado
anteriormente, se puede usar una seal activa para garantizar la unin apropiada entre el sensor y el recipiente, lo cual
ayuda a confirmar la correspondencia de la impedancia acstica.
3. Influencia del Ruido Mecnico-El uso de altas frecuencias reduce significativamente la contribucin del ruido mecnico a la
seal acstica detectada, especialmente en funcionamiento a menor escala, aunque no lo elimina completamente. Si se
analiza el efecto de varios ajustes de motor, por ejemplo, se puede determinar si la seal acstica detectada es una fun-
cin del ruido mecnico. Si el efecto es significativo, puede ser necesario usar frecuencias ms altas. Es importante recono-
cer y considerar la contribucin del ruido mecnico, no importa qu tan reducido sea, a medida que los motores enveje-
cen o se reemplazan.
4. Influencia de las Caractersticas de la Pared del Recipiente-Dado que los sensores se colocan a menudo en la pared exterior
del recipiente, el espesor de dicha pared puede afectar la calidad de la seal detectada. Si el recipiente est encamisado,
la amplitud de la seal acstica se puede reducir. Si se agregan ms sensores al recipiente se puede mejorar la calidad de
la seal. Como alternativa, se puede obtener un aumento en la seal si se colocan sensores en un lugar donde exista con-
tacto entre las paredes exteriores e interiores, lo que bsicamente proporciona una gua de onda entre el sensor y la fuen-
te de sonido. Las guas de onda se pueden incluir tambin en el diseo del equipo de fabricacin para permitir el monito-
reo de la emisin acstica. Es necesario efectuar la validacin apropiada para garantizar que esto no afecte adversamente
el desempeo del equipo.
5. Efecto de las Propiedades de los Materiales-Durante el funcionamiento, la seal acstica recolectada es una suma de diver-
sos eventos que ocurren en el proceso. Por ejemplo, la seal acstica generada cuando las partculas golpean la pared en
un granulador es una funcin de las propiedades materiales de los grnulos (es decir, densidad, tamao, porosidad). Por
lo tanto, los cambios significativos en cualquiera de estos parmetros pueden afectar la seal acstica y la calidad de la
prediccin resultante.
6. Influencia de Factores Relacionados con el Proceso-En forma similar al punto 5 mencionado anteriormente, las propiedades
relacionadas con el proceso (es decir, fuerza del impacto, frecuencia del impacto, cantidad de material) pueden afectar
tambin la seal acstica y la calidad de la prediccin resultante.
7. Impacto de las Condiciones Ambientales-Por ltimo, tambin se debe tener en cuenta la influencia de los factores ambien-
tales (es decir, temperatura, humedad).
Los datos de emisin acstica recolectados son especficos del recipiente o equipo. No es aconsejable aplicar a un equipo un
modelo generado en otro, porque la informacin acstica puede diferir como resultado de los problemas comentados en los
puntos 3, 4 y 5.

Calificacin y Verificacin de Instrumentos de Emisin Acstica

Se debe adoptar un enfoque de aptitud del sistema en lo que respecta al desempeo del instrumento, estableciendo la pti-
ma configuracin de las mediciones y comparando despus el desempeo del instrumento con los valores obtenidos durante
el uso rutinario con aquellos obtenidos durante la calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls).
Este enfoque ofrece respuesta a las inquietudes relacionadas con el muestreo porque, a diferencia de otros sistemas analti-
cos en lnea, los transductores pueden ubicarse ptimamente y conectarse para recibir la seal mxima sin modificacin del
recipiente.
Las tasas de muestreo tienen que cumplir con el teorema de muestreo de Nyquist, el cual afirma que una seal se debe
muestrear a una tasa que sea el doble del componente de frecuencia ms alto en la seal. Se debe usar un filtro de paso bajo
para retirar los componentes de frecuencia que sean mayores que la mitad de la frecuencia de muestreo (frecuencia de
Nyquist). Si no se cumple con este criterio se puede incurrir en solapamiento (aliasing).
Debido a la naturaleza de los transductores piezoelctricos y dado que las frecuencias de resonancia son propiedades natura-
les de los cristales, no es necesario analizar la variacin (reproducibilidad) o derivar en el dominio de frecuencia. Esto puede ser
necesario si se usan otros tipos de transductores. Cualquier cambio considerable en el dominio de frecuencia se registrar co-
mo un descenso en la intensidad de la potencia a la frecuencia de resonancia y por lo tanto est cubierto por los anlisis de
intensidad de potencia.
Las dos reas principales para la verificacin del desempeo del instrumento son la intensidad de la potencia y la temporiza-
cin. Cualquier cambio en la intensidad de la seal afectar la seal cruda y el ASL y, por lo tanto, afectar tambin el espectro
USP 39 Informacin General/ (1005) Emisin Acstica 823

de la potencia. Como consecuencia de los cambios en el proceso (p.ej., variacin en dureza o humedad en las partculas que
impactan la pared del recipiente) o de los cambios en la conduccin acstica del proceso al transductor se pueden presentar
cambios en la intensidad de la potencia.
La reproducibilidad de la conduccin acstica se debe evaluar usando un segundo transductor para registrar un pulso o
"ping" en la frecuencia de resonancia del sensor receptor. Este valor de reproducibilidad representa el ruido de la seal y pue-
de usarse en clculos del lmite de deteccin (LOD, por sus siglas en ingls) y el lmite de cuantificacin (LOQ, por sus siglas en
ingls), donde LOD se define como tres veces el ruido de la seal y LOQ es diez veces el ruido de la seal. El ruido a nivel de la
seal de fondo (en la emisin acstica, esta seal de fondo se debe principalmente al ruido del amplificador) se debe calcular a
partir de veinte valores secuenciales de ASL adquiridos a la frecuencia de muestreo usada para el funcionamiento normal. Esta
prueba se debe repetir a la inversa con el fin de establecer que se pueden obtener valores de intensidad estadsticamente simi-
lares en ambos canales.
La reproducibilidad a corto plazo permite calcular el ruido. Sin embargo, no proporciona una medida de la integridad de la
conduccin acstica en el tiempo o, ms especficamente, de los cambios causados por el proceso (p.ej., variaciones en las
propiedades adhesivas con cambios del proceso tales como calentamiento y enfriado). La prueba de ruido se debe repetir
mientras se ejecutan los parmetros normales de procesamiento (usando un recipiente vaco) y se debe calcular la deriva en el
ASL. Se deben tomar las precauciones necesarias para garantizar que la deriva en la seal (debido a la variacin normal en los
parmetros del proceso) no impacte los modelos quimiomtricos usados para la determinacin del punto final. Para los grfi-
cos de tendencia, se debe demostrar que la deriva no es estadsticamente significativa; caso contrario, se deber corregir la
deriva. Los valores de ruido, deriva y ASL absoluto se deben registrar y guardar, y repetir las pruebas si se hacen cambios al
equipo de procesamiento o al sistema de emisin acstica. Si no se hacen cambios, las pruebas se deben repetir todos los me-
ses. De esta forma se puede demostrar que la calidad de la conduccin acstica est intacta y cualquier cambio a la intensidad
de la seal se puede aislar y atribuir al proceso mismo.
Durante el uso rutinario se recomienda ejecutar la prueba de ruido (como se describe anteriormente) antes de cada corrida
del proceso y calcular la intensidad de la potencia y el ruido. Estos valores se deben registrar y comparar con los generados
tanto durante el uso previo como durante la instalacin. El impacto de la desviacin con respecto a valores previos depender
del modelo de prediccin y se debe considerar mediante la validacin del mtodo.
Los datos de ruido (de lo anterior) se pueden usar tambin para calcular el tiempo de vuelo del pulso. Si la activacin del
pulso y la recepcin de la seal estn sincronizados, se puede medir el tiempo tomado por el pulso para transmitir a travs del
recipiente. Esta es una buena indicacin de la medicin electrnica, as como de la condicin general de la conduccin acsti-
ca. Sin embargo, esta prueba se debe considerar como una medicin de la condicin del "sistema" y se debe ejecutar slo si
se han hecho cambios al equipo del proceso o al sistema de emisin acstica, o cada 6 meses. La correlacin de los tiempos
medidos con los histricos debe ser estadsticamente vlida. De no ser as, esto es un indicador de que el sistema de emisin
acstica puede necesitar recalificacin por parte del fabricante o proveedor del instrumento o de que hay cambios en la con-
duccin acstica.
Todas estas pruebas requieren el uso de un pulso acstico generado elctricamente. Una falla en cualquiera de las pruebas
antes mencionadas se puede atribuir a la generacin misma de la seal. Se recomienda que el sistema de generacin de pulsos
elctricos sea recalificado y certificado de acuerdo con estndares rastreables al Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa
(NIST, por sus siglas en ingls) cada 12 meses.

ANLISIS DE LOS DATOS

La emisin acstica de granuladores y secadores de lecho fluido se conoce como emisin acstica continua. La emisin acs-
tica continua es afsica (es decir, la seal no tiene comienzo ni interrupcin). Esto significa que no es necesario usar las tcnicas
de procesamiento de la seal que preservan la fase. El anlisis espectral de potencia es una tcnica til para procesar las seales
de emisin acstica. La informacin en los espectros de potencia, a diferencia de las seales crudas de emisin acstica, es
coherente en el corto plazo, permitiendo promediar la seal. Esto proporciona un mejor clculo de la densidad espectral de
potencia que el proporcionado por un nico espectro de potencia.
Para detectar puntos finales en procesos de lotes (p.ej., punto final de granulacin o secado) es apropiado un modelo multi-
variado cualitativo (p.ej., PCA o SIMCA). Efectuar la siguiente secuencia de operaciones:
(1) Entrenamiento o Calibracin-Obtener los espectros de emisin acstica que sean representativos del punto final.
(2) Modelado-Crear un modelo multivariado que describa la distribucin de las seales de emisin acstica en el punto final.
(3) Prediccin-Comparar los espectros de emisin acstica contra el modelo. Monitorear el ajuste al modelo (expresado por
lo general en trminos de un nmero de desviaciones estndar). A medida que el sistema se aproxima al punto final, el
ajuste mejora y se establece la finalizacin del proceso una vez que el modelo concuerda con los criterios predefinidos. El
modelo de prediccin se genera a partir de los espectros de emisin acstica obtenidos del proceso funcionando en con-
diciones normales. Las perturbaciones (p.ej., la aglomeracin indeseada en los equipos de recubrimiento) se detectan ob-
servando las desviaciones estadsticamente vlidas con respecto al modelo.
El modelado adaptativo tambin se ha propuesto para la deteccin de perturbaciones. Esto implica generar continua-
mente modelos multivariados a medida que se adquieren las seales de emisin acstica. La desviacin inusual de la seal
de emisin acstica indica la ocurrencia de una perturbacin del proceso. La ventaja del modelo adaptativo es que no es
necesario efectuar un paso de calibracin por separado.
824 (1005) Emisin Acstica / Informacin General USP 39

GLOSARIO
Amplitud: La magnitud o potencia de una forma de onda variable.
Convertidor RMS a CC (RMS-to-DC, por sus siglas en ingls): Es un dispositivo electrnico que convierte una seal alterna
a un nivel de voltaje proporcional a la potencia promedio en la seal.
Densidad Espectral de Potencia: La medida de la potencia de emisin acstica en cada elemento de resolucin del espectro
de potencia.
Emisin Acstica Continua: Seales de emisin acstica que no se pueden separar en el tiempo y son tpicas de procesos
farmacuticos tales como granulacin y secado en lecho fluido.
Espectro de Potencia: El espectro de potencia de una seal es una representacin de la potencia de la seal en funcin de la
frecuencia. El espectro de potencia se calcula a partir de la seal del dominio tiempo por medio de un algoritmo de Transfor-
mada Rpida de Fourier (TRF). Resulta til estudiar las seales de emisin acstica en el dominio espectral o de frecuencia, ya
que a menudo el espectro es caracterstico del mecanismo. Se pueden obtener mejoras en la relacin seal-ruido al promediar
un nmero de espectros de potencia, ya que estos son coherentes.
Filtrado de Seal: Filtrar una seal significa atenuar las frecuencias por fuera de un rango prescrito. En trabajos de emisin
acstica, se usa el filtrado de paso de banda para mejorar la relacin seal-ruido al atenuar el ruido fuera del ancho de banda
del sensor. El filtrado de paso bajo se usa para eliminar frecuencias ms altas que la frecuencia Nyquist con el fin de evitar el
solapamiento.
Frecuencia Nyquist: La frecuencia Nyquist est definida como la mitad de la tasa de muestreo digital y es la frecuencia ms
alta que se puede reproducir confiablemente.
Frecuencia Resonante: La frecuencia a la cual es ms sensible un sensor de emisin acstica. Los sensores de emisin acsti-
ca resonantes tienen una frecuencia de resonancia claramente definida, pero por lo general son sensibles a otras frecuencias.
Ganancia: El factor de amplificacin para un componente, expresado generalmente en trminos de decibeles (dB).
Ganancia en dB = 20 log 10 (Voltajede salida Voltajedeentrada).
Impedancia Acstica: La impedancia acstica (Z) se define como Z = :N (donde pes la densidad y ves la velocidad del soni-
do). Es un dato importante que informa la proporcin de la energa del sonido transmitida de un medio a otro y la cantidad de
energa reflejada en la interfase.
Modelado Adaptativo: Es un mtodo que predice el estado de un proceso sin el uso de un modelo generado previamente
(es decir, no hay un entrenamiento ni un paso de calibracin previos).
Modo de Corte (Cizalladura): Un modo transverso de transmisin acstica que se presenta solo en slidos.
Modo Compresiona!: Un modo longitudinal de transmisin acstica encontrado en slidos, lquidos y gases.
Modo Transversal: Un modo de propagacin de la onda donde el desplazamiento del material es perpendicular a la direc-
cin de la propagacin. Estos modos slo se encuentran en materiales slidos.
Nivel Medio de Seal (ASL}: Una medida de la potencia promedio en una seal de emisin acstica.
Paso de Banda: El intervalo de frecuencias dentro de las cuales funciona un componente.
Piezoelctrico: Un material que al comprimirse genera un campo elctrico. Los materiales piezoelctricos se usan en la cons-
truccin de sensores de emisin acstica. Un material comn es el titanato de circonio y plomo (PZT).
Propiedades de Tipo Parpadeante (flicker noise): Un tipo de seal asociada con muchos procesos naturales. Las caractersti-
cas del ruido parpadeante son: la potencia del ruido es directamente proporcional a la seal y tiene aproximadamente una
distribucin de densidad espectral de 1/f (f =frecuencia).
Ruido Blanco: El ruido blanco se caracteriza por un espectro de potencia de densidad espectral uniforme y est asociado con
procesos puramente aleatorios.
Solapamiento (aliasing): Los componentes espurios de baja frecuencia que aparecen en la seal y son en realidad frecuen-
cias por encima de la frecuencia Nyquist.
Transductor de Emisin Acstica: Un dispositivo en estado slido que incorpora por lo general un elemento piezoelctrico
para convertir la onda de emisin acstica a una seal elctrica.

(101 O) DATOS ANALTICOS-INTERPRETACIN Y TRATAMIENTO

INTRODUCCIN
Este captulo proporciona informacin acerca de las prcticas aceptables para el anlisis e interpretacin uniforme de los da-
tos obtenidos de los anlisis qumicos y otros anlisis. Se describen adems algunos mtodos estadsticos bsicos para la eva-
luacin de datos y se analiza en cierto detalle el tratamiento de los resultados aberrantes y la comparacin de procedimientos
analticos.
[NOTA-No debe inferirse que las herramientas de anlisis mencionadas en este captulo conforman una lista exhaustiva.
Pueden utilizarse otros mtodos estadsticos igualmente vlidos a criterio del fabricante y dems usuarios de este captulo.]
 USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 825

La garanta de calidad de los productos farmacuticos se logra combinando una serie de prcticas, que incluyen un diseo
robusto de la formulacin, validacin, anlisis de materias primas, anlisis durante el proceso y pruebas del producto final. Ca-
da una de estas prcticas depende de procedimientos de prueba confiables. Durante el proceso de desarrollo, se desarrollan y
validan procedimientos de prueba para asegurar que los productos fabricados estn perfectamente caracterizados. Las pruebas
del producto final permiten comprobar que los productos son uniformemente seguros y eficaces, y que cumplen con sus espe-
cificaciones.
Las mediciones son intrnsecamente variables y la USP reconoce tal variabilidad para las pruebas biolgicas desde hace mu-
cho tiempo. La necesidad de tener en cuenta esta variabilidad cuando se analizan datos de pruebas biolgicas, por ejemplo, se
trata en el captulo Anlisis de Va/oraciones Biolgicas (1034). Las mediciones de anlisis qumicos comnmente utilizadas para
analizar productos farmacuticos tambin son intrnsecamente variables, aunque en menor grado que las pruebas biolgicas.
No obstante, en muchos casos los criterios de aceptacin son proporcionalmente ms estrictos y, en consecuencia, debe te-
nerse en cuenta esta menor variabilidad aceptable cuando se analizan datos obtenidos por procedimientos analticos. Si no se
caracteriza ni se especifica la variabilidad de una medicin junto con el resultado obtenido, los datos slo pueden interpretarse
en el sentido ms limitado. Por ejemplo, si se especifica que la diferencia entre los promedios de los resultados obtenidos por
dos laboratorios al analizar el mismo conjunto de muestras es del 10%, la interpretacin es limitada en cuanto a la importancia
de dicha diferencia a menos que se especifique la variabilidad dentro de cada laboratorio.
Este captulo proporciona indicaciones para el tratamiento e interpretacin cientficamente aceptables de los datos. Se des-
criben adems herramientas estadsticas que pueden resultar tiles para la interpretacin de los datos analticos. Muchas esta-
dsticas descriptivas, como la desviacin estndar y la media, son de uso difundido. Otras herramientas estadsticas, como las
pruebas de resultados aberrantes, pueden realizarse utilizando diferentes mtodos cientficamente vlidos, de los cuales tam-
bin se incluyen ejemplos y sus aplicaciones. El marco dentro del cual se interpretan los resultados de una prueba farmacopei-
ca se describe en detalle en Advertencias y Requisitos Generales 7. Resultados de Pruebas. En el Apndice G al final de este captu-
lo, se incluye una seleccin de referencias tiles para obtener informacin adicional sobre las herramientas estadsticas aqu
descritas. La USP no avala especficamente las referencias citadas, que no constituyen una lista exhaustiva. Puede encontrarse
informacin adicional sobre cualquiera de los mtodos citados en este captulo en la mayora de los textos de estadstica.

PRE-REQUISITOS PARA LAS PRCTICAS Y PRINCIPIOS DE LABORATORIO

La correcta aplicacin de los principios estadsticos a los datos de laboratorio supone que estos datos han sido obtenidos de
forma rastreable (es decir, documentada) y sin sesgo. Para asegurarse de ello, son tiles las prcticas siguientes.

Mantenimiento Adecuado de Registros

Los registros de laboratorio deben mantenerse con suficiente detalle para que otros analistas igualmente calificados puedan
reconstruir las condiciones experimentales y revisar los resultados obtenidos. Por lo general, al obtener datos, deben utilizarse
ms decimales que los requeridos en la especificacin y las cifras slo deben redondearse una vez realizados los clculos finales,
conforme a lo establecido en las Advertencias y Requisitos Generales.

Consideraciones Relativas al Muestreo

Un muestreo eficaz es un paso importante para la evaluacin de un atributo de calidad de una poblacin. El objetivo del
muestreo es proporcionar datos representativos (la muestra) para estimar las propiedades de la poblacin. La manera en que
se obtiene dicha muestra depende totalmente de la pregunta que se busca responder con los datos de la muestra. Por lo gene-
ral, un proceso aleatorio se considera la manera ms adecuada de seleccionar una muestra. De hecho, es necesario utilizar una
muestra aleatoria e independiente para asegurar que los datos obtenidos produzcan estimaciones vlidas acerca de las propie-
dades de la poblacin. La generacin de una muestra no aleatoria o "de conveniencia" conlleva el riesgo de que las estimacio-
nes estn sesgadas. El tipo de muestreo aleatorio ms directo se conoce como muestreo aleatorio simple y es un proceso en el
que cada unidad de la poblacin tiene la misma probabilidad de aparecer en la muestra. No obstante, en algunos casos, este
mtodo de seleccin de muestra aleatoria no es ptimo ya que no garantiza la misma representatividad en relacin con todos
los factores (es decir, tiempo, lugar, mquina) que podran influir en las propiedades crticas de la poblacin. Por ejemplo, si se
requieren 12 horas para fabricar todas las unidades de un lote y es fundamental que la muestra sea representativa de todo el
proceso de produccin, no sera adecuado tomar una muestra aleatoria simple al finalizar la produccin ya que no se puede
garantizar que contenga una cantidad similar de unidades fabricadas en cada perodo del proceso de 12 horas. En estos casos
es mejor tomar una muestra aleatoria sistemtica, seleccionando al azar una unidad del proceso de produccin a intervalos o
en lugares sistemticamente seleccionados (p.ej., muestreando cada 30 minutos, entre las unidades producidas durante ese
perodo) para asegurarse de incluir en la muestra unidades tomadas durante todo el proceso de fabricacin. Se requerir otro
tipo de procedimiento de muestreo aleatorio si, por ejemplo, un producto se introduce en los viales usando cuatro mquinas
de llenado diferentes. En este caso, sera importante tomar una muestra aleatoria de los viales de cada una de las mquinas de
llenado. Una muestra aleatoria estratificada, mtodo que consiste en tomar una muestra al azar del mismo nmero de viales en
cada una de las cuatro mquinas de llenado, cumple con este requisito. Independientemente del motivo del muestreo (p.ej.,
826 (1 01 O) Datos Analticos / Informacin General USP 39

prueba de liberacin de partida), debe establecerse un plan de muestreo que indique detalladamente cmo se debe obtener la
muestra para asegurar que sea representativa de toda la poblacin y que los datos resultantes tengan la sensibilidad requerida.
La estrategia de muestreo ptima depende del conocimiento de los procesos de fabricacin y medicin analtica. Una vez defi-
nido el plan de muestreo, es probable que incluya cierto elemento de seleccin aleatoria. Por ltimo, debe obtenerse una can-
tidad de muestra suficiente para el anlisis original, los anlisis de verificacin subsiguientes y otros anlisis. Se recomienda
consultar a un estadstico para identificar la estrategia de muestreo ptima.
Las pruebas que se describen en el resto de este captulo suponen que se ha realizado un muestreo aleatorio simple.

Uso de Estndares de Referencia

Cuando una prueba o valoracin de los compendios USP o NF indique el uso de un Estndar de Referencia USP, slo se con-
siderarn concluyentes los resultados obtenidos usando el Estndar de Referencia USP especificado con respecto a la demostra-
cin del cumplimiento de la norma USP o NF. Aunque las normas USP son aplicables durante toda la vida de un artculo, des-
de su produccin hasta su caducidad, la USP no especifica cuando se deben realizar las pruebas ni la frecuencia de anlisis. Por
lo tanto los usuarios de los compendios USP y NF deben aplicar una variedad de estrategias y prcticas para asegurar que los
artculos cumplan con los requisitos farmacopeicos y mantengan dicho cumplimiento, incluyendo el momento y la necesidad
de realizar las pruebas. Dichas estrategias y prcticas pueden incluir el uso de estndares secundarios rastreables al Estndar de
Referencia USP, para complementar o sustentar cualquier anlisis realizado con el propsito de demostrar de manera conclu-
yente el cumplimiento con los estndares farmacopeicos aplicables. Debido a que la asignacin de un valor a un estndar es
uno de los factores ms importantes de la exactitud de un anlisis, es fundamental hacerlo correctamente.

Verificacin del Desempeo del Sistema

La verificacin de un nivel del desempeo aceptable de un sistema analtico que se utiliza en forma rutinaria o continua pue-
de ser una prctica valiosa. Esto se puede lograr analizando una muestra de control a intervalos adecuados o examinando
otros factores, como la variacin entre estndares, las relaciones seal-ruido de fondo, etc. Si se realiza un seguimiento del
parmetro medido, por ejemplo graficando los resultados del anlisis de una muestra de control, se pueden detectar cambios
en el desempeo que requieren el ajuste del sistema analtico. El Apndice A proporciona un ejemplo de una grfica de control.

Validacin del Procedimiento

Todos los procedimientos analticos deben validarse segn se especifica en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
(1225). Los procedimientos analticos publicados en la USP-NF se han validado y cumplen con los requisitos reglamentarios de
Buenas Prcticas de Fabricacin vigentes establecidos en el Cdigo de Reglamentos Federales. Los procedimientos validados
pueden utilizarse para analizar una nueva formulacin (por ejemplo, un nuevo producto, forma de dosificacin o producto
intermedio de un proceso) nicamente despus de verificar que la nueva formulacin no interfiere con la exactitud, linealidad
ni precisin del mtodo. No puede suponerse que un procedimiento validado puede medir correctamente el ingrediente acti-
vo de una formulacin que es diferente a la utilizada para establecer la validez original del procedimiento. [NOTA SOBRE
TERMINOLOGA-La definicin de exactitud en el captulo (1225) y en ICH Q2 corresponde nicamente a ausencia de sesgo. Para
el Vocabulario Internacional de Metrologa (VIM, por sus siglas en ingls) y la documentacin de la Organizacin Internacional
de Normalizacin (ISO, por sus siglas en ingls), exactitud tiene un significado distinto. Para ISO, exactitud combina los concep-
tos de ausencia de sesgo (denominada certeza) y precisin. Este captulo sigue a la definicin del captulo (1225), que corres-
ponde nicamente a veracidad.]

PRINCIPIOS DE MEDICIN Y VARIACIN

Todas las mediciones son, en el mejor de los casos, estimaciones del valor real ("verdadero" o "aceptado"), ya que contie-
nen una variabilidad aleatoria (tambin denominada error aleatorio) y, en algunos casos, un error sistemtico (sesgo). En con-
secuencia, el valor medido difiere del valor real debido a la variabilidad intrnseca de la medicin. Si un conjunto de medicio-
nes consta de resultados individuales representativos del todo, pueden usarse mtodos estadsticos para estimar propiedades
informativas de la totalidad y otras pruebas estadsticas para determinar si es probable que dichas propiedades cumplan con
los requisitos establecidos. Los anlisis estadsticos resultantes deben considerar la variabilidad asociada con el proceso de me-
dicin, as como la variabilidad de la entidad que se est midiendo. Las mediciones estadsticas usadas para evaluar la direccin
y magnitud de estos errores incluyen la media, la desviacin estndar y expresiones derivadas de stas, como el coeficiente de
variacin porcentual (%CV, tambin denominado desviacin estndar relativa porcentual o %RSD). La variabilidad estimada
puede usarse para calcular intervalos de confianza para la media, o mediciones de variabilidad, e intervalos de tolerancia que
capturan una proporcin especificada de las mediciones individuales.
El uso de mediciones estadsticas debe complementarse con el buen juicio, especialmente con respecto al muestreo repre-
sentativo. Los datos deberan ser congruentes con las suposiciones estadsticas usadas para el anlisis. Puede ser necesario el
uso de mtodos alternativos para la evaluacin de los datos si se considera que una o ms de estas suposiciones han sido viola-
 USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 827

das. En particular, la mayora de las mediciones estadsticas y pruebas citadas en este captulo suponen que la distribucin de
la poblacin total es una distribucin normal y que la muestra analizada es un subconjunto representativo de dicha poblacin.
La distribucin normal (o gaussiana) tiene forma de campana, es simtrica respecto de su centro y tiene ciertas caractersticas
requeridas para que estas pruebas sean vlidas. No siempre se puede esperar que los datos sigan una distribucin normal, pu-
dindose requerir de una transformacin para que se ajusten a la misma. Por ejemplo, existen variables que tienen distribucio-
nes cuyo grfico muestra una cola ms larga hacia la derecha que hacia la izquierda. Por lo general, estas distribuciones pue-
den volverse aproximadamente normales mediante una transformacin logartmica. Un mtodo alternativo sera el uso de pro-
cedimientos estadsticos "independientes de la distribucin" o "no paramtricos" que no requieren que la poblacin tenga
una distribucin normal. Cuando el objetivo es determinar un intervalo de confianza para la media o para la diferencia entre
dos medias, por ejemplo, la suposicin de normalidad no es tan importante debido al teorema de lmite central. No obstante,
debe verificarse la normalidad de los datos para calcular intervalos de confianza vlidos para desviaciones estndar y relaciones
de las desviaciones estndar, para realizar algunas pruebas de resultados aberrantes y para determinar lmites de tolerancia es-
tadstica vlidos. En este ltimo caso, la normalidad es una suposicin fundamental. Los mtodos grficos simples, como grfi-
cos de puntos, histogramas y grficos de probabilidad normales, son tiles para verificar esta suposicin.
Una medicin analtica simple puede ser til para evaluar la calidad si la muestra proviene de un lote que se ha preparado
utilizando un proceso documentado debidamente validado y si los errores analticos son bien conocidos. El resultado analtico
obtenido puede condicionarse incluyendo una estimacin de los errores asociados. En algunos casos puede considerarse el uso
de promedios ya que la variabilidad asociada con un valor promedio siempre es menor que la variabilidad de las mediciones
individuales. La opcin de utilizar mediciones individuales o promedios depende de la aplicacin de la medicin y su variabili-
dad. Por ejemplo, cuando se obtienen mediciones mltiples con la misma alcuota de muestra, como en el caso de varias in-
yecciones de muestra en un mtodo de HPLC, por lo general es aconsejable promediar los datos obtenidos, por la razn que
se mencion anteriormente.
La variabilidad se asocia con la dispersin de observaciones en torno al centro de una distribucin. El parmetro estadstico
ms comnmente utilizado para medir el centro es la media de la muestra (x):

La variabilidad del procedimiento analtico puede estimarse de varias maneras diferentes. La evaluacin ms comn y til de
la variabilidad de un procedimiento es la determinacin de la desviacin estndar basada en mediciones independientes repe-
tidas1 de una muestra. La desviacin estndar de la muestra, s, se calcula por la frmula:

en donde X; es la medicin individual en un conjunto de n mediciones; y xes la media de todas las mediciones. A continua-
cin, se calcula la desviacin estndar relativa porcentual (o/oRSD) como:

%RSD = ~X 100%
y se expresa como un porcentaje. Si los datos requieren la transformacin logartmica para lograr la normalidad (p.ej., para
valoraciones biolgicas), existen mtodos alternativos. 2

1 Las mediciones mltiples (o, por equivalencia, los errores experimentales asociados con las mediciones mltiples) son independientes entre s cuando se puede
suponer que representan una muestra aleatoria de la poblacin. En estas muestras, la magnitud de una medicin no est influenciada por otra medicin ni influye
en la magnitud de ninguna otra medicin. La falta de independencia implica que las mediciones estn correlacionadas en funcin del tiempo o del espacio. Consi-
deremos, por ejemplo, una placa de microtitulacin de 96 pocillos. Supongamos que, por causa desconocida, se produce un error experimental con valor bajo
(error negativo) en una muestra colocada en la primera columna, y que entonces esta misma causa produce un valor bajo para una muestra colocada en la segun-
da columna; en este caso, las dos mediciones resultantes no son estadsticamente independientes. Una manera de evitar dichas posibilidades sera aleatorizar la
colocacin de las muestras en la placa.
2 Cuando los datos se han transformado logartmicamente (base e) para lograr la normalidad, la %RSD es:

%RSD = 100% -,/e"-1

Esto puede aproximarse razonablemente segn:

%RSD = 100% (e'-1)

en donde s es la desviacin estndar de los datos transformados logartmicamente (base e).

828 (101 O) Datos Analticos / Informacin General USP 39

Debe realizarse un estudio de precisin para obtener una mejor estimacin de la variabilidad del procedimiento. El estudio
de precisin puede disearse para determinar la precisin intermedia (que incluye los componentes de variabilidad "entre an-
lisis" e "intra-anlisis") y la repetibilidad (variabilidad "intra-anlisis"). Los estudios de precisin intermedia deben permitir
cambios en las condiciones experimentales que podran esperarse, como por ejemplo diferentes analistas, diferentes prepara-
ciones de reactivos, diferentes das y diferentes instrumentos. Para realizar un estudio de precisin, la prueba debe repetirse
varias veces. Cada anlisis debe ser completamente independiente de los dems para obtener estimaciones exactas de los dife-
rentes componentes de variabilidad. Adems, dentro de cada anlisis, deben realizarse determinaciones repetidas para estimar
la repetibilidad. Ver un ejemplo de un estudio de precisin en el Apndice B.
Puede considerarse un intervalo de confianza en la interpretacin de los datos. Estos intervalos se calculan a partir de varios
datos usando la media (x) y la desviacin estndar de la muestra(s) segn la frmula:

-
(X s - s )
- fcx/2, n -1 .-{n 'X + fcx/2, n -1 .-{n

en donde t12,n_1 es un nmero estadstico que depende del tamao de la muestra (n), el nmero de grados de libertad (n - 1)
y el nivel de confianza deseado (1 - a). Sus valores se obtienen a partir de las tablas publicadas de la distribucin t de Student.
El intervalo de confianza proporciona una estimacin del intervalo donde cae la media de la poblacin "verdadera" () y, ade-
ms, evala la confiabilidad de la media de la muestra como una estimacin de la media verdadera. Si se repitiera la misma
configuracin experimental una y otra vez y se calculara cada vez un intervalo de confianza del 95% (por ejemplo) para la
media verdadera, entonces se esperara que el 95% de dichos intervalos incluyera la media verdadera, . No se puede afirmar
con seguridad si el intervalo de confianza derivado de un conjunto de datos especficos obtenidos contiene . No obstante,
suponiendo que los datos representan mediciones independientes entre s generadas en forma aleatoria a partir de una pobla-
cin normalmente distribuida, el procedimiento usado para determinar el intervalo de confianza garantiza que el 95% de di-
chos intervalos de confianza contienen . Debe tenerse en cuenta que es importante definir la poblacin apropiadamente para
capturar todas las fuentes de variacin pertinentes. [NOTA SOBRE TERMINOLOGA-La documentacin de la Organizacin Interna-
cional de Normalizacin (ISO) utiliza diferente terminologa para algunos de los conceptos aqu descritos. En la documenta-
cin de la ISO, al trmino s/'1n, comnmente denominado como error estndar de la media, se denomina incertidumbre es-
tndar. Asimismo, la ISO denomina al trmino t12 , n-l S/'1n como incertidumbre expandida, mientras que denomina a t12,n_ 1
como factor de cobertura. Cuando la desviacin estndar se calcula combinando los estimados de variabilidad de diversas
fuentes, recibe el nombre de incertidumbre estndar combinada. Algunas de estas fuentes podran tener estimaciones no esta-
dsticas de incertidumbre, denominadas incertidumbres Tipo B, como la incertidumbre en la calibracin de una balanza.]

RESULTADOS ABERRANTES

Ocasionalmente, los resultados analticos observados son muy diferentes de los esperados. Las observaciones aberrantes,
anmalas, contaminadas, discordantes, falaces, sospechosas o absurdas, as como otros tipos de valores errticos, se denomi-
nan resultados aberrantes. Al igual que todos los resultados de laboratorio, estos resultados aberrantes se deben documentar,
interpretar y manejar. Dichos resultados pueden ser mediciones exactas de lo que se est midiendo aunque diferentes de los
valores esperados. En otros casos, debido a un error en el sistema analtico, los resultados pueden no ser tpicos, aunque la
entidad que se mide sea tpica. Cuando se obtiene un resultado aberrante, deben realizarse investigaciones sistemticas del
laboratorio y, en algunos casos, de los procesos para establecer la causa de ese resultado. Los factores que deben considerarse
al investigar un resultado aberrante incluyen, entre otros, error humano, error de instrumentacin, error de clculo y deficien-
cias del producto o de sus componentes. Si se encuentra una causa no relacionada con la deficiencia del producto o de sus
componentes, pueden repetirse las pruebas con la misma muestra, en lo posible, o con una muestra nueva. Deben examinarse
la precisin y exactitud del procedimiento, el Estndar de Referencia USP, las tendencias del proceso y los lmites de la especifi-
cacin. Los datos pueden considerarse no vlidos, segn esta investigacin documentada, y eliminarse de los clculos posterio-
res.
Si no se encuentra una causa atribuible que se pueda documentar para el resultado aberrante de laboratorio, el resultado
puede analizarse, como parte de toda la investigacin, para determinar si se trata de un resultado aberrante.
No obstante, se requiere una cuidadosa consideracin cuando se utilizan estas pruebas. Pueden producirse dos tipos de
errores en las pruebas de los resultados aberrantes: (a) identificar observaciones como resultados aberrantes cuando en reali-
dad no lo son; y (b) no identificar resultados aberrantes que s existen. Cualquier conclusin acerca de la aceptabilidad de los
datos en que se observan resultados aberrantes requiere una interpretacin cuidadosa.
La "designacin de resultado aberrante" es el reconocimiento informal de valores de laboratorio sospechosos que deben in-
vestigarse con mtodos ms formales. La eleccin de la tcnica correcta para la identificacin de resultados aberrantes suele
depender del reconocimiento inicial del nmero y ubicacin de los valores. Frecuentemente, la designacin de resultado abe-
rrante se hace visualmente con tcnicas grficas. La "identificacin de resultados aberrantes" es el uso de pruebas de significan-
cia estadstica para confirmar que los valores no cumplen con el modelo estadstico conocido o supuesto.
Cuando se utilizan adecuadamente, las pruebas de resultados aberrantes son herramientas valiosas para los laboratorios far-
macuticos. Existen varias pruebas para detectar resultados aberrantes. Se incluyen en el Apndice C ejemplos ilustrativos de
 USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 829

tres de estos procedimientos: la Prueba de Desviacin Estudentizada Extrema (ESD, por sus siglas en ingls), la Prueba de Di-
xon y la Regla de Hampel.
La eleccin de la prueba de resultados aberrantes adecuada depende del tamao de la muestra y de las suposiciones de
distribucin. Muchas de estas pruebas (p.ej., la Prueba ESD) requieren la suposicin de que los datos generados por el labora-
torio puedan considerarse como una muestra aleatoria de una poblacin normalmente distribuida, posiblemente despus de
su transformacin. Si se realiza una transformacin de los datos, la prueba de resultado aberrante se aplica a los datos transfor-
mados. Las transformaciones ms comunes incluyen tomar el logaritmo o la raz cuadrada de los datos. Existen otros mtodos
para la manipulacin de un resultado aberrante simple y un resultado mltiple que tambin pueden utilizarse, e incluyen prue-
bas que utilizan medidas robustas de dispersin y tendencia central, como por ejemplo la mediana y la desviacin absoluta de
la mediana y mtodos de anlisis exploratorio de datos (EDA, por sus siglas en ingls). El "Acomodamiento de resultados abe-
rrantes" es el uso de tcnicas robustas, tales como pruebas basadas en el orden o rango de cada valor en el conjunto de datos
en lugar del valor real, para producir resultados que no estn adversamente influidos por la presencia de resultados aberrantes.
El uso de dichos mtodos reduce los riesgos asociados con ambos tipos de error en la identificacin de resultados aberrantes.
El "rechazo de resultados aberrantes" es la eliminacin efectiva del resultado aberrante identificado del conjunto de datos.
No obstante, una prueba de resultado aberrante no puede ser el nico medio para eliminar un resultado aberrante de los da-
tos de laboratorio. Una prueba de resultado aberrante puede resultar til como parte de la evaluacin de la significancia de ese
resultado, junto con otros datos. Las pruebas de resultado aberrante no son vlidas en aquellos casos en que se est evaluando
la variabilidad del producto, como por ejemplo la uniformidad del contenido, la disolucin o la determinacin de la velocidad
de liberacin. En estos casos, un valor considerado como resultado aberrante puede ser en realidad un resultado exacto de un
producto no uniforme. Todos los datos, especialmente los resultados aberrantes, deben conservarse para su anlisis futuro. Los
datos inusuales, cuando se observan en el contexto de otros datos histricos, por lo general no son tales sino que reflejan las
influencias de fuentes adicionales de variacin.
En resumen, el rechazo o la conservacin de un resultado aparentemente aberrante puede ser una fuente grave de sesgo.
Deben tenerse en cuenta las caractersticas de las pruebas, as como el conocimiento cientfico del proceso de fabricacin y el
procedimiento analtico, para determinar el origen del resultado aparentemente aberrante. Una prueba de resultado aberrante
nunca puede reemplazar una investigacin de laboratorio exhaustiva sino que debe realizarse nicamente cuando la investiga-
cin no es concluyente y no se observaron desviaciones en la fabricacin o pruebas del producto. Incluso si dichas pruebas
estadsticas indicaran que uno o ms valores son resultados aberrantes, deben conservarse igualmente en los registros. La in-
clusin o exclusin de resultados aberrantes en los clculos para evaluar la conformidad del producto con los criterios de acep-
tacin debe basarse en el juicio cientfico y en las normas internas del fabricante. Suele ser til realizar los clculos con y sin los
resultados aberrantes para evaluar su impacto.
Los resultados aberrantes que se atribuyen a errores en el proceso de medicin deben informarse (es decir, mediante una
nota al pie de pgina), pero no incluirse en los clculos estadsticos posteriores. Al evaluar si el producto cumple con un criterio
de aceptacin en particular, es importante definir si el resultado a informar (el resultado que se compara con los lmites) es un
valor promedio, una medicin individual u otra cosa. Por ejemplo, si el criterio de aceptacin se establece para un promedio,
entonces no es estadsticamente apropiado requerir que las mediciones individuales tambin cumplan con el criterio, ya que la
variabilidad asociada con el promedio de una serie de mediciones es menor que la de cualquier medicin individual.

COMPARACIN DE PROCEDIMIENTOS ANALTICOS

Con frecuencia es necesario comparar dos procedimientos para determinar si hay una diferencia importante en sus resulta-
dos promedios o sus variabilidades. El objetivo de un experimento de comparacin de procedimientos es generar datos ade-
cuados que permitan evaluar la equivalencia de los dos procedimientos en toda una gama de valores. En esta seccin se descri-
ben algunos de los factores que se deben tener en cuenta al realizar dichas comparaciones.

Precisin

La precisin es el grado de coincidencia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimiento analtico se
aplica repetidamente a una muestra homognea. Para considerar que un procedimiento alternativo tiene una precisin "com-
parable" a la del procedimiento vigente, su precisin (ver Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Valoracin) no
debe ser peor que la del procedimiento vigente en un valor considerado importante. Una disminucin en la precisin (o au-
mento en la variabilidad) puede aumentar el nmero de resultados que no cumplan con las especificaciones requeridas. Por el
contrario, un procedimiento alternativo que proporciona una precisin superior es aceptable.
Una manera de comparar la precisin de dos procedimientos es estimando la varianza de cada procedimiento (la varianza
de la muestra, s2 , es el cuadrado de la desviacin estndar de la muestra) y calculando un intervalo de confianza superior unila-
teral para la relacin de varianzas (verdaderas), en donde relacin se define como la varianza del procedimiento alternativo
dividida por la varianza del procedimiento vigente. Se incluye un ejemplo basado en esta suposicin en el Apndice D. El lmite
de confianza superior unilateral debe compararse con un lmite superior considerado aceptable, a priori, por el laboratorio ana-
ltico. Si el lmite de confianza superior unilateral es inferior a este lmite aceptable superior, la precisin del procedimiento al-
ternativo se considera aceptable, ya que el uso del procedimiento alternativo no llevar a una prdida importante de precisin.
830 (101 O) Datos Analticos/ Informacin General USP 39

Debe tenerse en cuenta que si el lmite de confianza superior unilateral es inferior a uno, se ha comprobado que el procedi-
miento alternativo tiene una precisin superior a la del procedimiento vigente.
El mtodo de intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la prueba F en dos muestras para evaluar la
significancia estadstica de la relacin de varianzas. Para realizar la prueba F de dos muestras, la relacin de varianzas calculada
con las muestras se compara con un valor crtico basado en los valores tabulados de la distribucin F para el nivel de confianza
deseado y el nmero de grados de libertad de cada varianza. La mayora de los textos de estadstica incluyen tablas con los
valores F. Si la relacin calculada excede este valor crtico, se dice que existe una diferencia estadsticamente significativa en la
precisin de los dos procedimientos. No obstante, si la relacin calculada es inferior al valor crtico, esto no prueba que los
procedimientos tienen la misma precisin o una precisin equivalente, sino que no hay suficiente evidencia para probar que
existe una diferencia estadsticamente significativa.

Exactitud

La comparacin de la exactitud de los procedimientos (ver Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Valoracin)
proporciona informacin til para determinar si el nuevo procedimiento es equivalente, en general, al procedimiento vigente.
Un mtodo sencillo para realizar esta comparacin es calcular un intervalo de confianza para la diferencia entre las medias ver-
daderas, donde la diferencia se calcula restando la media del procedimiento vigente de la media de la muestra obtenida con el
procedimiento alternativo.
El intervalo de confianza debe compararse con un lmite inferior y un lmite superior considerados aceptables, a priori, por el
laboratorio. Si el intervalo de confianza cae totalmente dentro del rango aceptable, los dos procedimientos pueden considerar-
se equivalentes, ya que la diferencia promedio entre ellos es insignificante en la prctica. El lmite inferior y el superior del inter-
valo de confianza slo muestran el tamao de la posible diferencia real entre los dos procedimientos y no si la diferencia se
considera tolerable. Dicha evaluacin slo puede realizarse dentro del contexto cientfico adecuado. Este enfoque a menudo se
denomina Pruebas Unilaterales Dobles (TOST, por sus siglas en ingls; ver Apndice F).
El mtodo del intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la aplicacin de una prueba t para evaluar la
significancia estadstica de la diferencia en promedios. Una manera de realizar la prueba t es calculando el intervalo de confian-
za y examinando si contiene o no el valor cero. Los dos procedimientos muestran una diferencia estadsticamente significativa
en promedios si el intervalo de confianza excluye el valor cero. Una diferencia estadsticamente significativa puede no tener
una magnitud suficiente para tener importancia prctica en el laboratorio ya que puede haber surgido de datos muy precisos o
de una muestra de un tamao mayor. Por otra parte, es posible que no se encuentre ninguna diferencia estadsticamente sig-
nificativa, lo cual ocurre cuando el intervalo de confianza incluye el valor cero y, de todas maneras, no puede descartarse una
diferencia prctica importante. Esto podra ocurrir, por ejemplo, si los datos son muy variables o si el tamao de la muestra es
demasiado pequeo. En consecuencia, si bien el resultado de la prueba t indica si se ha observado o no una diferencia estads-
ticamente significativa, no determina la presencia o ausencia de una diferencia de importancia prctica.

Determinacin del Tamao de la Muestra

La determinacin del tamao de la muestra se basa en la comparacin de la exactitud y precisin de los dos procedimien-
tos3 y es similar al mtodo utilizado para evaluar la hiptesis acerca de diferencias de promedio y relaciones de varianza, res-
pectivamente, aunque el significado de algunos de los datos es diferente. El primer componente que se debe especificar es o,
la diferencia aceptable ms grande entre los dos procedimientos que, si se logra, permite llegar a una conclusin de equivalen-
o,
cia. Es decir, si los dos procedimientos difieren en no ms de en el promedio, se consideran aceptablemente similares. La
comparacin puede ser bilateral como se acaba de expresar, considerando una diferencia de en cualquier direccin, comoo
cuando se comparan medias. Alternativamente, puede ser unilateral, como cuando se comparan varianzas, en cuyo caso es
deseable una reduccin en la variabilidad y se considera que los mtodos son equivalentes si la relacin entre las varianzas
(mtodo nuevo/mtodo vigente como una proporcin) no es ms de 1,0 + o. El investigador deber especificar el obasndose
en el conocimiento del procedimiento vigente y/o en su uso, o bien puede calcularlo. Un factor que se debe tener en cuenta
cuando hay que cumplir con ciertas especificaciones es que el nuevo procedimiento no debe diferir demasiado del procedi-
miento vigente para que no se generen resultados fuera de la especificacin. En estos casos, se elige un o que represente una
baja probabilidad de que esto ocurra, por ejemplo, comparando la distribucin de datos para el procedimiento vigente con los
lmites de especificacin. Esto puede hacerse grficamente o usando un intervalo de tolerancia, del que se incluye un ejemplo
en el Apndice E. En general, la eleccin de o depende de los requisitos cientficos del laboratorio.
Los dos componentes siguientes se refieren a la probabilidad de error. Los datos podran llevar a una conclusin de similitud
cuando los procedimientos son inaceptablemente diferentes (segn lo definido por el o). Esto se llama falso positivo o error de
Tipo l. El error tambin podra darse en sentido opuesto, es decir, los procedimientos podran ser similares pero los datos no
permiten esa conclusin. Esto se llama falso negativo o error de Tipo 11. Con los mtodos estadsticos, no es posible eliminar
completamente la posibilidad de cualquiera de estos errores. No obstante, al elegir bien el tamao de la muestra, la probabili-
dad de cada uno de estos errores puede reducirse aceptablemente. La probabilidad mxima aceptable de un error de Tipo 1
comnmente se denomina a y suele considerarse del orden del 5%, pero puede elegirse otro valor. La probabilidad mxima

3 En general, el tamao de la muestra requerido para comparar la precisin de dos procedimientos es mayor que el requerido para comparar su exactitud.
USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 831

deseada de un error de Tipo 11 comnmente se denomina f3. Con frecuencia, f3 se especifica indirectamente eligiendo un nivel
deseado de 1 - f3, que se denomina la "potencia" de la prueba. En el contexto de pruebas de equivalencia, la potencia es la
probabilidad de concluir correctamente que dos procedimientos son equivalentes. Normalmente, se toma una potencia del
orden del 80% o 90% (correspondiente a un f3 de 20% o 10%), aunque pueden elegirse otros valores. El protocolo para el
experimento debe especificar el 8, el a y la potencia. El tamao de la muestra depende de todos estos componentes. Se inclu-
ye un ejemplo en el Apndice E. Aunque el Apndice E slo determina un valor nico, suele ser til determinar una tabla de
tamaos de muestras para diferentes opciones de 8, a y potencia. Dicha tabla permite una eleccin mejor fundamentada del
tamao de la muestra para equilibrar mejor los recursos y los riesgos (conclusiones falsamente negativas y falsamente positi-
vas).

APNDICE A: GRFICAS DE CONTROL

La Figura 7 muestra una grfica de control para valores individuales. Existen varios mtodos diferentes para calcular el lmite
de control superior (UCL, por sus siglas en ingls) y el lmite de control inferior (LCL, por sus siglas en ingls). Un mtodo
utiliza el intervalo mvil, que se define como la diferencia absoluta entre dos mediciones consecutivas (x; - x1_ 1). Estos interva-
los mviles se promedian (MR) y se usan en las siguientes frmulas:

x
en donde es la media de la muestra y d2 es una constante comnmente usada para este tipo de grfica, que est basada en
el nmero de observaciones asociadas con el clculo del intervalo mvil. Cuando n = 2 (dos mediciones consecutivas), como
aqu, d2 = 1, 128. Para el ejemplo de la Figura 7, el MR era de 1,7:

UCL=102,0+3 1\~ 8 =106,5

LCL=102,0-3 1 \~ =97,5 8
Existen otros mtodos que permiten detectar mejor pequeas variaciones en la media del proceso, como la suma acumulativa
(tambin conocida como "CUSUM") y el intervalo mvil exponencialmente ponderado ("EWMA").

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - UCL = 106,5
ro 105
::J
-o
:~
-o
.s
L..
Media= 102,0
o
~100

---------------------------- LCL = 97,5

o 50 100
Nmero de Observacin

Fig. 1. Grfica de control para cada X o mediciones individuales de muestras de control. En este ejemplo particular, la media
de todas las muestras (X) es 102,0, el UCL es 106,5 y el LCL es 97,5.

APNDICE B: ESTUDIO DE PRECISIN

La Tabla 7 muestra datos obtenidos de un estudio de precisin. En este estudio se hicieron cinco anlisis independientes y,
dentro de cada anlisis, se obtuvieron los resultados de tres determinaciones repetidas.
832 (101 O) Datos Analticos / Informacin General USP 39

Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisin

N del Anlisis
N de la Repeticin 1 2 3 4 s
1 100,70 99,46 99,96 101,80 101,91
2 101,05 99,37 100,17 102,16 102,00
3 101,15 99,59 101,01 102,44 101,67
Media 100,97 99,47 100,38 102,13 101,86
Desviacin Estndar 0,236 O, 111 0,556 0,321 0,171
%RSD 0,234% 0,111% 0,554% 0,314% 0,167%
%RSD (desviacin estndar relativa porcentual)= 100% x (desviacin estndar/media)

Tabla lA. Tabla de Anlisis de Varianza para los Datos Presentados en la Tabla 1
Fuente de Grados de Libertad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios
Variacin (df) (SS) (MS) F= MSB/MSw
Entre Anlisis 4 14,200 3,550 34,886
lntra-anlisis 10 1,018 0,102
Total 14 15,217
Los Cuadrados Medios Entre (MSB) = SSEntrefdfntre y los Cuadrados Medios lntra (MSw) = SS ntrafdf ntra
1 1

Un anlisis de varianza (ANOVA) con los datos de la Tabla 1 genera la tabla ANOVA (Tabla 1A). Como haba un nmero
igual de determinaciones repetidas por anlisis en el estudio de precisin, los valores de VarianzaAnlisis y VarianzaRep pueden
conseguirse directamente de la tabla ANOVA. Las siguientes ecuaciones calculan la variabilidad asociada con los anlisis y las
determinaciones repetidas, donde MS;nira representa el cuadrado medio de "error" o "intra-anlisis" y MSentre representa el cua-
drado medio "entre anlisis".
VarianzaRep = MSintra = O, 102
.
\j,ananza = MSentre - MSintra - 3,550-0,102 - 1 149
Anlisis N repeticiones por anlisis 3 '

[NOTA-Una prctica comn consiste en utilizar un valor de O para VarianzaAnlisis cuando el valor calculado es negativo]. Las
estimaciones tambin pueden obtenerse con determinaciones repetidas desiguales, pero las frmulas son ms complejas. Mu-
chos programas de software estadstico pueden manejar fcilmente determinaciones repetidas desiguales. Es importante estu-
diar la magnitud relativa de los dos componentes de la varianza cuando se disea e interpreta un estudio de precisin. El cono-
cimiento adquirido puede enfocarse en cualquier esfuerzo de mejoramiento del procedimiento continuo y, lo ms importante,
se puede utilizar para asegurar que los procedimientos tienen la capacidad de respaldar los usos para los que estn destinados.
Al definir cuidadosamente lo que constituye un resultado (es decir, un valor informable), se est aprovechando el poder de
promediar, con lo que se puede lograr prcticamente cualquier precisin deseada. Esto significa que, al basar el valor de infor-
me en un promedio a travs de determinaciones repetidas y/o anlisis, en vez de en un solo resultado, es posible reducir la
%RSD y hacerlo de manera predecible.
La Tabla 2 muestra la varianza computada y la %RSD de la media (es decir, del valor de informe) para diferentes combina-
ciones de nmero de anlisis y nmero de determinaciones repetidas por anlisis, usando las siguientes frmulas:
Varianza de la media =
VarianzaAnalisis Varianza Rep
-----+-------~---
(Nde anlisis) {N de anl)(Nde rep. por anl.)

Desviacin estndar de la media= .Jvarianza de la media

RSD = Desviacin estndar de la media x 1OO%
Promedio de todos los resultados

Por ejemplo, la Varianza de la meda, Desviacin estndar de la meda y %RSD de una prueba de dos anlisis y tres determina-
ciones repetidas por cada anlisis son 0,592; 0,769 y 0,76%, respectivamente, segn se indica a continuacin.
. . 1 149 o 102
Varianza de la media=-'--+-'-=0 592
2 (23) .

Desviacin estndar de la media= ~0,592 =0,769

RSD = (0,769/l 00,96) X 100% = 0,76%

 USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 833

en donde 100,96 es la media para todos los datos en la Tabla 7. Como se muestra en la Tabla 2, aumentar el nmero de
anlisis de uno a dos permite obtener una reduccin ms importante en la variabilidad del valor de informe que aumentar el
nmero de determinaciones repetidas por anlisis.
No se hicieron suposiciones de distribucin sobre los datos de la Tabla 7 ya que el propsito de este Apndice es mostrar los
clculos en un estudio de precisin.
Tabla 2. El Impacto Previsto del Plan de Prueba (N de Anlisis y N de Determinaciones Repetidas por Anlisis) sobre la Precisin
de la Media
N de
N de Determinaciones Repe- Varianza Desviacin Estndar
Anlisis tidas por Anlisis de la Media de la Media % RSD
1 1 1,251 1, 118 1,11
1 2 1,200 1,095 1,09
1 3 1,183 1,088 1,08
2 1 0,625 0,791 0,78
2 2 0,600 0,775 0,77
2 3 0,592 0,769 0,76
La o/oRSD se calcul utilizando un valor de la media de 100,96 (como divisor), basado en los 15 puntos de datos presentados en la Tabla 1.

APNDICE C: EJEMPLOS DE PRUEBAS DE RESULTADOS ABERRANTES PARA DATOS ANALTICOS

Considerando el siguiente conjunto de 1 O mediciones: 100,0; 100, 1; 100,3; 100,0; 99,7; 99,9; 100,2; 99,5; 100,0 y 95,7
(media= 99,5, desviacin estndar= 1,369), hay algn resultado aberrante?

Prueba de Desviacin Estudentizada Extrema (ESO) Generalizada

Esta prueba es una versin modificada de la Prueba ESD que permite analizar hasta un nmero previamente especificado, r,
de resultados aberrantes de una poblacin normalmente distribuida. Para la deteccin de un solo resultado aberrante (r = 1 ),
el procedimiento de ESD generalizado tambin se conoce como prueba de Grubb. No se recomienda la prueba de Grubb para
la deteccin de mltiples resultados aberrantes. Supongamos que res igual a 2 y que n es igual a 1 O.
Etapa 1 (n = 10)-Normalizar cada resultado restando la media de cada valor y dividiendo esta diferencia por la desviacin
estndar (ver la Tabla 3). 4
Tabla 3. Resultados de la Prueba ESO Generalizada
n = 10 n=9
Datos Normalizados Datos Normalizados
100,3 +0,555 100,3 +1,361
100,2 +0,482 100,2 +0,953
100,1 +0,409 100,1 +0,544
100,0 +0,336 100,0 +0,136
100,0 +0,336 100,0 +0,136
100,0 +0,336 100,0 +0,136
99,9 +0,263 99,9 -0,272
99,7 +0,117 99,7 -1,089
99,5 -0,029 99,5 -1,905
95,7 -2,805
Media= 99,54 99,95
SD = 1,369 0,245

Tomar el valor absoluto de estos resultados, seleccionar el valor mximo (R 7 = 2,805), y compararlo con un valor crtico ta-
bulado, previamente especificado, /c 1 (2,290) basado en el nivel de significancia seleccionado (por ejemplo, 5%). El valor mxi-
mo es ms grande que el valor tabulado y se determina que no concuerda con los datos restantes. Las fuentes de los valores le
se incluyen en muchos textos de estadstica. Las tablas estadsticas deben usarse con cautela para asegurarse de utilizar las no-
taciones correctas (es decir, el nivel de error aceptable) cuando se extraen los valores de la tabla.
Etapa 2 (n = 9)-Eliminar la observacin correspondiente al resultado normalizado absoluto mximo del conjunto de datos
originales, de modo tal que n sea ahora igual a 9. Nuevamente, determinar la media y desviacin estndar (Tabla 3, las dos
columnas de la derecha), normalizar cada valor y tomar el valor absoluto de estos resultados. Determinar el mximo de los

4 La diferencia entre cada valor y la media se denomina residual. Existen otras pruebas de resultados aberrantes residuales estudentizados donde el residual, en
lugar de dividirse por la desviacin estndar, se divide por la desviacin estndar multiplicada por la raz cuadrada den - 1 dividido por n.
834 (101 O) Datos Analticos / Informacin General USP 39

valores absolutos de los 9 resultados normalizados (R2 = 1,905), y compararlo con 1..,2 (2,215). El valor mximo no es mayor
que el valor tabulado.
Conclusin-El resultado de la primera etapa, 95,7, se declara resultado aberrante, pero el resultado de la segunda etapa,
99,5, no es un resultado aberrante.

Pruebas Tipo Dixon

La Prueba de Dixon puede ser unilateral o bilateral, dependiendo de si se decide con anterioridad que nicamente se consi-
derarn resultados aberrantes en uno de los lados. Al igual que con la prueba de ESD, la Prueba de Dixon supone que los
datos, en ausencia de resultados aberrantes, provienen de una sola poblacin normal. Siguiendo la estrategia usada para la
prueba de ESD, se procede como si no se hubiera tomado una decisin a priori en relacin con uno de los lados y se utiliza
una Prueba de Dixon bilateral. A partir del anlisis de los datos del ejemplo, se observa que los dos ms pequeos son los que
se examinarn como resultados aberrantes. La Prueba de Dixon permite el anlisis de dos resultados aberrantes de manera
simultnea; sin embargo, estos procedimientos estn ms all del alcance de este Apndice. El procedimiento por pasos que se
discute a continuacin no es un procedimiento exacto para realizar una prueba para el segundo resultado aberrante, ya que el
resultado de la segunda prueba depende del primero. Debido a que el tamao de la muestra tambin se reduce en la segunda
etapa, el resultado final es un procedimiento que no suele tener la sensibilidad de los procedimientos exactos de Dixon.
Etapa 7 (n = 70)-Los resultados se ordenan segn su magnitud (es decir, Xn es la observacin ms grande, Xn es la segunda
observacin ms grande, etc., y X1 es la observacin ms pequea). Las relaciones de la Prueba de Dixon se basan en el tama-
o de la muestra (en este ejemplo, n = 1O); para declarar que X1 es un valor aberrante, se calcula la relacin, r 11 , segn la
frmula siguiente:

Se utilizara otra relacin si el dato ms grande se analiza como resultado aberrante. El resultado r11 se compara con un valor
r11: 0, 05 en una tabla de valores crticos. Si r11 es mayor que r11: 0, 05, se declara que es un resultado aberrante. Para el conjunto de
datos anterior, r11 = (99,5 - 95,7)/(100,2 - 95,7) = 0,84. Esta relacin es mayor que r11 : 0, 05, que es 0,52979 al nivel de signifi-
cancia del 5% para una Prueba de Dixon bilateral. Las fuentes de los valores r11 : 0, 05 se incluyen en muchos textos de estadsti-
ca.5
Etapa 2-Eliminar la observacin ms pequea del conjunto de datos original, de modo que n ahora sea 9. Se utiliza la
misma ecuacin r11 , pero se requiere un nuevo valor crtico r11 ,o,os paran= 9 r11 ; 0, 05 = 0,56420). Ahora r11 =(99,7-99,5)/
(100,2 - 99,5) = 0,29, que es menor que r11 : 0, 05 y no es significativo al nivel del 5%.
Conclusin-Por lo tanto, 95,7 se declara como resultado aberrante, mientras que 99,5 no es un resultado aberrante.

Regla de Hampel

Paso 7-EI primer paso para aplicar la Regla de Hampel es normalizar los datos. No obstante, en lugar de restar la media de
cada dato y dividir la diferencia por la desviacin estndar, se resta la mediana de cada dato y las diferencias resultantes se
dividen por la MAD (ver a continuacin). El clculo de MAD se realiza en tres etapas. En primer lugar, se resta la mediana de
cada dato. A continuacin, se obtienen los valores absolutos de las diferencias, que se denominan desviaciones absolutas. Por
ltimo, se calcula la mediana de las desviaciones absolutas y se multiplica por la constante 1,483 para obtener la MAD. 6
Paso 2-EI segundo paso es tomar el valor absoluto de los datos normalizados. Cualquier resultado mayor que 3,5 se decla-
ra como un resultado aberrante. La Tabla 4 resume los clculos.
El valor de 95,7 vuelve a identificarse como un resultado aberrante. Luego, este valor puede extraerse del conjunto de datos
y volver a aplicarse la Regla de Hampel a los datos restantes. La tabla resultante aparece como la Tabla 5. Al igual que en los
ejemplos anteriores, 99,5 no se considera un resultado aberrante.
Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel
n = 10
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100,3 0,3 0,3 1,35
100,2 0,2 0,2 0,90
100,1 0,1 0,1 0,45
100 o o o

5 Los valores crticos para r en este ejemplo se toman de la Referencia 2 en Apndice G, Pruebas de Resultados Aberrantes.
6 Suponiendo una distribucin normal subyacente, 1,483 es una constante utilizada de modo que la MAD resultante es un estimador uniforme de la desviacin
estndar de la poblacin. Esto significa que a medida que aumenta el tamao de la muestra, MAD se acerca a la desviacin estndar de la poblacin.
 USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 835

Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel (Continuacin)

n = 10
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100 o o o
100 o o o
99,9 -0,1 0,1 0,45
99,7 -0,3 0,3 1,35
99,5 -0,5 0,5 2,25
95,7 -4,3 4,3 19,33
Mediana= 100 0,15
MAD= 0,22

Tabla 5. Resultados de la Prueba Reutilizando la Regla de Hampel

n=9
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100,3 0,3 0,3 2,02
100,2 0,2 0,2 1,35
100,1 0,1 0,1 0,67
100 o o o
100 o o o
100 o o o
99,9 -0,1 0,1 0,67
99,7 -0,3 0,3 2,02
99,5 -0,5 0,5 3,37
Mediana= 100 0,1
MAD= 0,14

APNDICE D: COMPARACIN DE PROCEDIMIENTOS-PRECISIN

El siguiente ejemplo muestra el clculo de un intervalo de confianza del 90% para la relacin de varianzas (verdaderas) a fin
de comparar la precisin de dos procedimientos. Se supone que la distribucin subyacente de las mediciones de la muestra
est bien caracterizada por distribuciones normales. Para este ejemplo, supongamos que el laboratorio aceptar el procedi-
miento alternativo si su precisin (medida por la varianza) no es ms de cuatro veces mayor que la del procedimiento vigente.
Para determinar el tamao de muestra adecuado para la precisin, existe un mtodo de tanteos sucesivos utilizando la si-
guiente frmula:

Potencia= Pr [ F> Fcx. n- 1, n- 1]

donde n es el tamao de muestra ms pequeo requerido para proporcionar la potencia deseada, que es la probabilidad de
afirmar correctamente que el procedimiento alternativo tiene una precisin aceptable cuando los dos procedimientos realmen-
te tienen la misma precisin; a es el riesgo de afirmar errneamente que el procedimiento alternativo tiene una precisin acep-
table; y 4 es el lmite superior permitido para un aumento en la varianza. Los valores F se encuentran en tablas comnmente
disponibles de valores crticos de la distribucin F. Fa, n- l, n- l es el percentil a superior de una distribucin Fcon numerador n -
1 y denominador de n - 1 grados de libertad; es decir, el valor excedido con la probabilidad a. Supongamos inicialmente que
el laboratorio estim necesario un tamao de muestra de 11 por procedimiento (1 O grados de libertad para el numerador y el
denominador); el clculo de la potencia sera el siguiente: 7

Pr [F > 1/4Fa, n- l, n- 11 = Pr [F > 1/4F0, 05, 70, 701 = Pr [F > (2,978/4)1 = 0,6751
En este caso, la potencia fue de slo 68%; es decir, aunque los dos procedimientos tenan varianzas exactamente iguales, con
slo 11 muestras por procedimiento, existe solamente una probabilidad de 68% de que el experimento lleve a datos que per-

7 Esto podra calcularse usando una planilla de clculo de computadora. Por ejemplo, en Microsoft Excel la frmula sera: FDIST((R/A)*FINV(alfa, n - 1, n- 1), n -
1, n - 1), donde Res la relacin de varianzas a las que se determina la potencia (p.ej., R = 1, que fue el valor escogido en los clculos de potencia provistos en la
Tabla 6) y A es la relacin mxima para aceptacin (p.ej., A= 4). Alfa es el nivel de signifcanca, normalmente 0,05.
836 <l 01 O) Datos Analticos / Informacin General USP 39

mitan concluir que la varianza ha aumentado no ms de cuatro veces. Lo ms comn es elegir un tamao de muestra que
tenga una potencia de al menos 80% y en algunos casos de 90% o ms. Para determinar el tamao de muestra adecuado,
pueden probarse diversos nmeros hasta encontrar una probabilidad que exceda el lmite aceptable (p.ej., potencia> 0,90).
Por ejemplo, la determinacin de la potencia para tamaos de muestra de 12-20 se muestran en la Tabla 6. En este caso, la
suposicin inicial de un tamao de muestra de 11 no fue adecuada para comparar la precisin, pero 15 muestras por procedi-
miento proporcionaran un tamao de muestra lo suficientemente grande para una potencia del 80%, o 20 por procedimiento
para una potencia del 90%.
Tabla 6. Determinaciones de Potencia para Diferentes Tamaos de Muestras (Especficas para el Ejemplo del Apndice D)
Tamao de la Muestra Pr[F> '/ Foosn-/n-1
12 0,7145
13 0,7495
14 0,7807
15 0,8083
16 0,8327
17 0,8543
18 0,8732
19 0,8899
20 0,9044

Tpicamente, el tamao de la muestra para las comparaciones de precisin debe ser mayor que para las comparaciones de
exactitud. Si el tamao de la muestra para comparar la precisin es demasiado grande y no es factible llevar a cabo el estudio
en el laboratorio, existen algunas opciones. La primera es reconsiderar la eleccin de un aumento permitido en la varianza.
Para aumentos mayores permitidos en la varianza, el tamao de la muestra requerida para una potencia fija es ms pequeo.
Otra alternativa es planificar un anlisis intermedio con un tamao de muestra ms pequeo, con la posibilidad de continuar
con un tamao de muestra ms grande, si fuera necesario. En este caso, es muy recomendable buscar ayuda profesional de un
experto en estadstica.
Supongamos ahora que el laboratorio opta por una potencia de 90% y obtiene los resultados presentados en la Tabla 7
basados en los datos generados con 20 anlisis independientes por procedimiento.
Relacin =varianza del procedimiento alternativo/varianza del procedimiento vigente = 45,0/25,0 = 1,8
Lmite inferior del intervalo de confianza = relacin/ ~os= 1,8/2, 168 = 0,83

Lmite superior del intervalo de confianza = relacin/ ~ 95 = 1,8/0,461 = 3, 90

Tabla 7. Ejemplo de Mediciones de Varianza para Anlisis Independientes (Especficos para el Ejemplo del Apndice D)
Varianza Tamao de la Grados de
Procedimiento (desviacin estndar) Muestra Libertad
Alternativo 45,0 (6,71) 20 19
Vigente 25,0 (5,00) 20 19

Para esta aplicacin, se utiliza un intervalo de confianza del 90% (bilateral) cuando se busca una prueba unilateral del 5%.
Esta prueba es unilateral ya que slo importa el aumento en la desviacin estndar del procedimiento alternativo. Hay que
tomar algunas precauciones al usar intervalos bilaterales de esta manera, ya que deben tener colas iguales-los intervalos ms
comunes tienen esta propiedad. Como el lmite de confianza superior unilateral, 3,90, es inferior al lmite permitido,4,0, el es-
tudio ha demostrado que el procedimiento alternativo tiene una precisin aceptable. Si se hubieran obtenido los mismos resul-
tados de un estudio con un tamao de muestra de 15-como si se hubiera elegido una potencia del 80%-el laboratorio no
hubiera podido concluir que el procedimiento alternativo tiene una precisin aceptable (lmite de confianza superior de 4,47).

APNDICE E: COMPARACIN DE PROCEDIMIENTOS-DETERMINACIN DE LA MXIMA

DIFERENCIA ACEPTABLE, , ENTRE DOS PROCEDIMIENTOS

Este Apndice describe un mtodo para determinar la diferencia, o, entre dos procedimientos (alternativo-vigente), diferen-
cia que, si se logra, tambin permite concluir que dos procedimientos son equivalentes. Si no existe otra informacin previa
que gue al laboratorio en la eleccin del o, sta es una manera razonable de proceder. En este Apndice se describen los cl-
culos del tamao de la muestra en diferentes situaciones.

Determinacin del Intervalo de Tolerancia

Suponer que no se conocen la media ni la desviacin estndar del proceso, pero una muestra de tamao 50 produjo una
media y una desviacin estndar de 99,5 y 2,0, respectivamente. Estos valores se calcularon usando los ltimos 50 resultados
 USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 837

generados por este procedimiento especfico para una muestra (de control) en particular. Con esta informacin, pueden calcu-
larse los lmites de tolerancia segn la siguiente frmula:

x K 5

x
en donde es la media, s es la desviacin estndar, y Kse basa en el nivel de confianza, la proporcin de resultados a capturar
en el intervalo y el tamao de la muestra, n. Hay disponibles Tablas que proporcionan los valores de K. En este ejemplo, el
valor de K requerido para incluir el 95% de la poblacin con una confianza del 95% para 50 muestras es de 2,382. Los lmites
de tolerancia se calculan de la siguiente manera:

99,5 2,382 X 2,0

en consecuencia, el intervalo de tolerancia es de (94,7; 104,3).

Comparacin de los Lmites de Tolerancia con los Lmites de la Especificacin

Supongamos que el intervalo especificado para este procedimiento es de (90,0; 110,0) y que la media y la desviacin estn-
dar del proceso no han cambiado desde que se estableci este intervalo. Pueden definirse las siguientes cantidades: el lmite
inferior de la especificacin (LSL, por sus siglas en ingls) es 90,0; el lmite superior de la especificacin (USL, por sus siglas en
ingls) es 110,0; el lmite de tolerancia inferior (LTL, por sus siglas en ingls) es 94,7 y el lmite de tolerancia superior (UTL, por
sus siglas en ingls) es 104,3. Calcular la diferencia aceptable, (8), de la siguiente manera:

A= LTL - LSL para LTL LSL

(A= 94,7 - 90,0 = 4,7);
B = USL - UTL para USL UTL
(B = 110,0 - 104,3 = 5,7); y
8 =mnimo (A, B) = 4,7
+---A--.

90,0 94,7
--s--
104,3 110,0
Figura 2. Grfica de los valores calculados anteriormente.

Con esta opcin de 8 y suponiendo que los dos procedimientos tienen una precisin comparable, el intervalo de confianza
para la diferencia en medias obtenidas con los dos procedimientos (alternativo-vigente) debe encontrarse entre -4,7 y +4,7
para afirmar que no existe ninguna diferencia importante entre los dos procedimientos.
Los laboratorios analticos de control de calidad a veces utilizan lmites de tolerancia del 99%, en cuyos casos el intervalo es
mayor. Usando el ejemplo anterior, el valor de K requerido para incluir el 99% de la poblacin con una confianza del 99% para
50 muestras es de 3,390. Los lmites de tolerancia se calculan de la siguiente manera:
99,5 3,390 X 2,0
El intervalo de tolerancia ms amplio resultante es de (92,7; 106,3). De la misma manera, el nuevo LTL de 92,7 y UTL de 106,3
produciran un 8 ms pequeo:

A= LTL - LSL para LTL LSL

(A= 92,7 - 90,0 = 2,7);
B = USL - UTL para USL UTL
(B = 110,0 -106,3 = 3,7); y
8 =mnimo (A, B) = 2,7

Aunque un fabricante puede elegir cualquier 8 que funcione adecuadamente para la determinacin de equivalencia, la elec-
cin de un 8 ms grande, an cuando lleva a un n ms pequeo, presenta el riesgo de una prdida de capacidad para la discri-
minacin entre procedimientos.

Tamao de la Muestra

Existen frmulas que pueden utilizarse para un 8 especfico, suponiendo que se conocen las varianzas de la poblacin y que
son iguales, para calcular el nmero de muestras que se debe analizar por procedimiento, n. El nivel de confianza y la potencia

8 Existen tablas de factores de tolerancia que indican los valores aproximados y, en consecuencia, difieren ligeramente de los valores aqu informados.
838 (1 01 O) Datos Analticos / Informacin General USP 39

tambin deben especificarse. [NOTA-Potencia se refiere a la probabilidad de llegar a la conclusin correcta de que dos proce-
dimientos idnticos son equivalentes.] Por ejemplo, si 8 = 4,7 y se supone que las varianzas de las dos poblaciones son iguales
a 4,0; entonces, para una prueba de un nivel del 5% 9 y una potencia del 80% (con los correspondientes valores z de 1,645 y
1,282, respectivamente), el tamao de la muestra aproximado se calcula segn la siguiente frmula:

2cr 2 2
n ~ 82 (za+ Z1312)

n ~ 2 (4 )2 (1,645 + 1,282)2 = 3,10

(4,7)

En consecuencia, suponiendo que cada procedimiento tiene una varianza poblacional, cr 2, de 4,0, el nmero de muestras, n,
requerido para concluir con una probabilidad de 80% de que los dos procedimientos son equivalentes (el intervalo de confian-
za del 90% para la diferencia en las medias verdaderas se encuentra entre -4,7 y +4,7) cuando, en realidad, son idnticos (la
diferencia de medias verdadera es cero) es 4. Como se utiliz la distribucin normal en la frmula anterior, 4 es en realidad un
lmite inferior en el tamao de muestra requerido. Si es factible, podra convenir un tamao de muestra ms grande. Los valo-
res de z para niveles de confianza comunes se presentan en la Tabla 8. La frmula anterior se basa en tres suposiciones: 1) la
varianza usada en el clculo del tamao de la muestra se basa en una cantidad de datos previos suficientemente grande que
pueden tratarse como conocidos; 2) se utiliza la varianza conocida previa en el anlisis del nuevo experimento, o el tamao de
la muestra para el nuevo experimento es lo suficientemente grande como para que la distribucin normal sea una buena apro-
ximacin a la distribucin t; y 3) el laboratorio est seguro de que no existe ninguna diferencia real en las medias, que es el
caso ms optimista. No es comn que se den estas tres suposiciones. La frmula anterior debe tratarse con ms frecuencia
como una aproximacin inicial. Las desviaciones de estas tres suposiciones conlleva la necesidad de utilizar un tamao de
muestra ms grande. En general, se recomienda recurrir a alguna persona familiarizada con los mtodos necesarios.
Tabla 8. Valores Comunes para una Distribucin Normal Estndar
Valores z
Nivel de Confianza Unilateral (a) Biiaterai (a/2)
99% 2,326 2,576
95% 1,645 1,960
90% 1,282 1,645
80% 0,842 1,282

Cuando se requiere una transformacin logartmica para lograr la normalidad, la frmula de tamao de la muestra debe
ajustarse ligeramente segn se indica a continuacin. En lugar de formular los problemas con respecto a la varianza de la po-
blacin y la diferencia aceptable ms grande, 8, entre los dos procedimientos, ahora se formula con respecto a la %RSD de la
poblacin y la diferencia proporcional aceptable ms grande entre los dos procedimientos.

en donde

a"C = log((%RSD/100) 2 + 1)

y p representa la diferencia proporcional aceptable ms grande entre los dos procedimientos(alternativo-vigente)/(vigente) y

se supone que las %RSDs de la poblacin son conocidas e iguales.

APNDICE F: ANLISIS DE EQUIVALENCIA V PRUEBAS UNILATERALES DOBLES

En un anlisis estadstico clsico de hiptesis, existen dos hiptesis, la nula y la alternativa. Por ejemplo, la hiptesis nula
puede indicar que dos medias son iguales, entonces la hiptesis alternativa indicara que difieren. Con este enfoque clsico, se
rechaza la hiptesis nula en favor de la alternativa si la evidencia contra la hiptesis nula es suficiente. Un error comn es inter-
pretar la incapacidad de rechazar la hiptesis nula como evidencia de que dicha hiptesis es verdadera, cuando en realidad la
incapacidad de rechazar la hiptesis nula slo quiere decir que la evidencia contra sta no fue suficiente. Por ejemplo, el proce-
dimiento usado podra tener una variabilidad demasiado alta o el nmero de determinaciones ser demasiado pequeo.

9 Cuando se analiza la equivalencia, una prueba de nivel del 5% corresponde a un intervalo de confianza del 90%.
USP 39 Informacin General/ (101 O) Datos Analticos 839

La consecuencia de esta interpretacin es que, cuando se busca demostrar la similitud, como en el caso de la comparacin
de los resultados obtenidos por dos laboratorios, es necesaria la similitud como hiptesis alternativa. La prueba estadstica que
emplea la similitud como hiptesis alternativa recibe el nombre de anlisis de equivalencia. Es importante entender que "equi-
valencia" aqu no significa "igualdad". La equivalencia debe entenderse como "suficientemente similar" para la necesidad de
los dos laboratorios. Tal como se indic anteriormente en este captulo, el nivel de similitud que se considera suficiente es un
aspecto que debe decidirse con antelacin.
Como ejemplo especfico, supngase que se est interesado en comparar resultados promedio, como cuando se transfiere
un procedimiento de un laboratorio a otro. (Dicha aplicacin probablemente tambin incluira una comparacin de precisin;
ver el Apndice D.) Se debe definir con antelacin que la diferencia entre las medias no debe ser mayor que un valor positivo, o,
para que los resultados promedio puedan considerarse equivalentes o suficientemente similares. (El Apndice E provee reco-
mendaciones para la seleccin de o.) Entonces, las hiptesis son:
Alternativa (H 7): l 1 - 2 1:<;;o
Nula (H0): 1 1 - 21 >o
donde 1 y 2 son las dos medias que se estn comparando.
El enfoque de pruebas unilaterales dobles (TOST, por sus siglas en ingls) consiste en convertir las hiptesis de equivalencia
anteriores en dos hiptesis unilaterales. La justificacin es que es posible determinar 1 1 - 21:-;;siempre y cuando se puedan
demostrar tanto
1 - 2 :-;; +o como 1 - 2 ~ -o
En su condicin de pruebas unilaterales, se pueden tratar como pruebas-t unilaterales estndar. Para que la prueba de las
hiptesis de equivalencia tenga el nivel a, ambas pruebas unilaterales deben realizarse al nivel a (por lo regular, aunque no
necesariamente, 0,05). A menudo, la prueba unilateral doble se lleva a cabo usando un intervalo de confianza. En este caso, se
rechaza la hiptesis nula en favor de la hiptesis de equivalencia si el intervalo de confianza bilateral 100(1 - 2a)% est com-
pletamente contenido en (-o, +o). ste es el enfoque descrito anteriormente en la seccin Exactitud.

APNDICE G: FUENTES DE INFORMACIN ADICIONALES

Es posible utilizar una gran variedad de pruebas estadsticas para evaluar un conjunto de datos. Este captulo presenta varias
pruebas que permiten interpretar y manejar datos analticos, pero pueden emplearse muchas otras pruebas semejantes. En es-
te captulo simplemente se ilustra el anlisis de datos usando mtodos estadsticamente aceptables. Como se menciona en la
Introduccin, las pruebas especficas se incluyen con fines ilustrativos nicamente y USP no avala ninguna de estas pruebas co-
mo nico mtodo para el tratamiento de los datos analticos. Puede encontrarse informacin adicional y pruebas alternativas
en las referencias enumeradas a continuacin o en muchos textos de estadstica.
Grficas de Control:
1. Manual on Presentation of Data and Control Chart Analysis, 6 ed., American Society for Testing and Materials (ASTM), Phi-
ladelphia, 1996.
2. Grant, E.L., Leavenworth, R.S., Statistical Quality Control, 7 ed., McGraw-Hill, New York, 1996.
3. Montgomery, D.C., lntroduction to Statistical Quality Control, 3 ed., John Wiley and Sons, New York, 1997.
4. Ott, E., Schilling, E., Neubauer, D., Process Quality Control: Troubleshooting and lnterpretation of Data, 3 ed., McGraw-Hill,
New York, 2000.
Diferencias Detectables y Determinacin del Tamao de Muestra:
1. CRC Handbook of Tables for Probability and Statistics, 2 ed., Beyer W.H., ed., CRC Press, lnc., Boca Raton, FL, 1985.
2. Cohen, J., Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences, 2 ed., Lawrence Erlbaum Associates, Hillsdale, NJ, 1988.
3. Diletti, E., Hauschke, D., Steinijans, V.W., "Sample size determination for bioequivalence assessment by means of confi-
dence intervals," lnternational journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 1991; 29, 1-8.
4. Fleiss, J.L., The Design and Analysis of Clinical Experiments, John Wiley and Sons, New York, 1986, pgs. 369-375.
5. juran, J.A., Godfrey, B., juran's Quality Handbook, 5 ed., McGraw Hill, 1999, Seccin 44, Basic Statistical Methods.
6. Lipsey, M.W., Design Sensitivity Statistical Power for Experimental Research, Sage Publications, Newbury Park, CA, 1990.
7. Montgomery, D.C., Design and Analysis of Experiments, John Wiley and Sons, New York, 1984.
8. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbook 91; National lnstitute of Standards and Technology, Gai-
thersburg, MD, 1991 (reimpresin del texto original de agosto de 1963).
9. Kraemer, H.C., Thiemann, S., How Many Subjects?: Statistical Power Analysis in Research,Sage Publications, Newbury Park,
CA, 1987.
1 O. van Belle G., Martin, D.C., "Sample size as a function of coefficient of variation and ratio of means", American Statistician
1993; 47(3): 165-167.
11. Westlake, W.J., response to Kirkwood, T.B.L.: "Bioequivalence testing-a need to rethink," Biometrics 1981; 37:589-594.
Estadstica General Aplicada a Datos Farmacuticos:
1. Bolton, S., Pharmaceutical Statistics: Practica/ and Clinical Applications, 3 ed., Marcel Dekker, New York, 1997.
840 (1 01 O) Datos Analticos / Informacin General USP 39

2. Bolton, S., "Statistics" Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20 ed., Gennaro, A.R., ed., Lippincott Williams
and Wilkins, Baltimore, 2000, pgs. 124-158.
3. Buncher, C.R., Tsay, J., Statistics in the Pharmaceutical lndustry, Marcel Dekker, New York, 1981.
4. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbook 91; National lnstitute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg,
MD, 1991 (reimpresin del texto original de agosto de 1963).
5. Zar, J., Biostatistical Analysis, 2 ed., Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1984.
6. De Muth, J.E., Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications, 3rd ed., CRC Press, Boca Raton, FL, 2014.
Estadstica General Aplicada a Datos de Laboratorios Analticos:
1. Gardiner, W.P., Statisticaf Analysis Methods for Chemists, The Royal Society of Chemistry, London, England, 1997.
2. Kateman, G., Buydens, L., Quality Control in Analytical Chemistry, 2 ed., John Wiley and Sons, New York, 1993.
3. Kenkel, J., A Primer on Quality in the Analytical Laboratory, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 2000.
4. Mandel, J., Evaluation and Control of Measurements, Marcell Dekker, New York, 1991.
5. Melveger, A.J., "Statististics in the pharmaceutical analysis laboratory," Analytical Chemistry in a GMP Environment, Miller
J.M., Crowther J.B., eds., John Wiley and Sons, New York, 2000.
6. Taylor, J.K., Statistical Techniques for Data Analysis, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 1990.
7. Thode, H.C., Jr., Testing for Normality, Marcel Dekker, New York, NY, 2002.
8. Taylor, J.K., Quality Assurance of Chemical Measurements, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 1987.
9. Wernimont, G.T., Use of Statistics to Develop and Evaluate Analytical Methods, Association of Official Analytical Chemists
(AOAC), Arlington, VA, 1985.
1 O. Youden, W.J., Steiner, E.H., Statistical Manual of the AOAC, AOAC, Arlington, VA, 1975.
Estadstica No Paramtrica:
1. Conover, W.J., Practica/ Nonparametric Statistics, 3 ed., John Wiley and Sons, New York, 1999.
2. Gibbons, J.D., Chakraborti, S., Nonparametric Statistical lnference, 3 ed., Marcel Dekker, New York, 1992.
3. Hollander, M., Wolfe, D., Nonparametric Statistical Methods, 2 ed., john Wiley and So ns, NY, 1999.
Pruebas de Resultados Aberrantes:
1. Barnett, V., Lewis, T.,Outliers in Statistical Data, 3 ed., John Wiley and Sons, New York, 1994.
2. Bohrer, Armin, "One-sided and Two-sided Critica! Values for Dixon's Outlier Test for Sample Sizes up to
n = 30," Economic Quality Control, Vol. 23 (2008), No. 1, pgs. 5-13.
3. Davies, L., Gather, U., "The identification of multiple outliers," journal of the American Statistical Association (with com-
ments), 1993; 88:782-801.
4. Dixon, W.J., "Processing data for outliers," Biometrics 1953; 9(1 ):74-89.
5. Grubbs, F.E., "Procedures for detecting outlying observations in samples," Technometrics 1969; 11 :1-21.
6. Hampel, F.R., "The breakdown points of the mean combined with sorne rejection rules," Technometrics, 1985; 27:95-107.
7. Hoaglin, D.C., Mosteller, F., Tukey, J., eds., Understanding Robust and Exploratory Data Analysis, John Wiley and Sons, New
York, 1983.
8. lglewicz B., Hoaglin, D.C., How to Detect and Handle Outliers, American Society for Quality Control Quality Press, Milwau-
kee, WI, 1993.
9. Rosner, B., "Percentage points for a generalized ESD many-outlier procedure," Technometrics, 1983; 25: 165-172.
1 O. Norma E-178-94: Standard Practice for Dea/ing with Outlying Observations,American Society for Testing and Materials
(ASTM), West Conshohoken, PA, septiembre de 1994.
11. Rorabacher, D.B., "Statistical Treatment for Rejections of Deviant Values: Critica! Values of Dixon's "Q" Parameter and Re-
lated Subrange Ratios at the 95% Confidence Level," Analytical Chemistry, 1991; 63(2): 1 39-146.
Precisin y Componentes de Variabilidad:
1. Hicks, C.R., Turner, K.V., Fundamental Concepts in the Design of Experiments, 5 ed., Oxford University Press, 1999 (seccin
titulada Repeatability and Reproducibility of a Measurement System).
2. Kirk, R.E., Experimental Design: Procedures for the Behaviora/ Sciences, Brooks/Cole, Belmont, CA, 1968, pgs. 61-63.
3. Kirkwood, T.B.L., "Geometric means and measures of dispersion," Letter to the Editor, Biometrics, 1979; 35(4).
4. Milliken, G.A., Johnson, D.E., Analysis of Messy Data, Volumen 1: Designed Experiments, Van Nostrand Reinhold Company,
New York, NY, 1984, pgs. 19-23.
5. Searle, S.R., Casella, G., McCulloch, C.E., Variance Components, John Wiley and Sons, New York, 1992.
6. Snedecor, G.W., Cochran, W.G., Statistical Methods, 8 ed., lowa State University Press, Ames, IA, 1989.
7. Norma E-691-87: Practice for Conducting an lnterlaboratory Study to Determine the Precision of a Test Method, ASTM, West
Conshohoken, PA, 1994.
8. Hauck, W. W., Koch, W., Abernethy, D., Williams, R. "Making Sense of Trueness, Precision, Accuracy, and Uncertainty,"
Pharmacopeial Forum, 2008; 34(3).
Determinacin del Intervalo de Tolerancia:
1. Hahn, G.J., Meeker, W.Q., Statistical lnterva/s: A Cuide for Practitioners, John Wiley and Sons, New York, 1991.
2. Odeh, R.E., "Tables of two-sided tolerance factors for a normal distribution," Communications in Statistics: Simulation and
Computation, 1978; 7: 183-201.
USP 39 Informacin General/ (1015) Aparatos Automatizados de Sntesis Radioqumica 841

(1015) APARATOS AUTOMATIZADOS DE SNTESIS RADIOQUMICA

La preparacin y el control de calidad de radiofrmacos de diagnstico marcados con nucleidos de vida media muy corta
que emiten positrones (p.ej., 15 0, 13 N, 11 ( y 18 F cuyas vidas medias son de 2, 1O, 20 y 11 O minutos, respectivamente), estn
sujetos a restricciones diferentes de las que se aplican a los frmacos de uso teraputico: (1) La sntesis debe ser rpida, aunque
se deben tomar medidas para proteger al qumico o al farmacutico de la excesiva exposicin a la radiacin. (2) Excepto en un
grado limitado para el 18 F, la sntesis debe producirse en el momento del uso. (3) A excepcin del 1F, cada partida de radiofr-
macos generalmente se dirige a una sola administracin.
Estos factores aumentan la importancia del control de calidad del producto farmacutico final con relacin a la validacin
del proceso de sntesis. Dado que cada dosis se prepara de forma individual, salvo contadas excepciones, lo ideal sera que
cada dosis fuera sometida a pruebas de control de calidad de pureza radioqumica y otros aspectos de calidad esenciales antes
de su administracin. Debido a que no es posible realizar el control de calidad de cada partida, se seleccionan partidas a inter-
valos regulares para establecer y caracterizar completamente su pureza radiofarmacutica. Esta prueba de calidad rutinaria y
rigurosa de las partidas seleccionadas constituye la base de la validacin del proceso, que es absolutamente esencial para la
evaluacin anticipada de la calidad y pureza de las partidas cuando se trata de radiofrmacos de vida media extremadamente
corta. Puesto que los radiofrmacos empleados en tomografa por emisin de positrones (TEP) se administran por va intrave-
nosa o (en el caso de gases radioactivos) por inhalacin, la variabilidad entre partidas, en relacin con la biodisponibilidad, no
constituye un problema. Es ms, la sntesis en muy pequea escala de radiofrmacos (casi siempre menos de 1 miligramo y a
menudo dentro del rango de los microgramos) y el hecho de que los pacientes generalmente reciben slo una dosis nica de
frmaco radioactivo reducen al mnimo la posibilidad de administrar cantidades nocivas de impurezas qumicas. Estas afirma-
ciones no intentan rebatir la necesidad del control de calidad en el manejo de equipos automatizados de sntesis, sino colocar
la fabricacin de radiofrmacos que emiten positrones en una perspectiva adecuada y enfatizar una vez ms la enorme impor-
tancia de la validacin anticipada de procesos y el control de calidad del producto terminado.
La sntesis de rutina de radiofrmacos puede exponer al personal a dosis innecesariamente altas de radiacin. Los dispositi-
vos automatizados de sntesis radioqumica se han ideado, en parte, para cumplir con el concepto de reducir las exposiciones
del personal a la radiacin "hasta el menor grado razonablemente posible" (ALARA, del ingls "as low as reasonably achieva-
ble"). Estos dispositivos automatizados de sntesis pueden ser ms precisos y eficaces que los mtodos manuales existentes.
Dichos mtodos automatizados son particularmente tiles cuando una sntesis radioqumica requiere manipulaciones repetiti-
vas y uniformes a diario.
Los productos de estos dispositivos automatizados de radiosntesis deben cumplir los mismos criterios de garanta de calidad
que los productos obtenidos mediante sntesis manual convencional. En el caso de radiofrmacos que emiten positrones, estos
criterios incluyen muchas de las mismas determinaciones que se usan para los radiofrmacos utilizados en medicina nuclear
convencional, por ejemplo, pruebas de esterilidad y de endotoxinas bacterianas. Se aplican muchas de las mismas limitaciones.
En general, no se pueden aplicar los procedimientos tpicos, como por ejemplo la espectroscopia, debido a que la cantidad de
producto es tan pequea que cae debajo del nivel de deteccin mnima del mtodo. En todos los casos, el mtodo farmaco-
peico aplicable es el rbitro decisivo (ver Procedimiento en Pruebas y Valoraciones en las Advertencias Generales).
La preparacin de la Inyeccin de Fludesoxiglucosa F 18 y otros radiofrmacos que emiten positrones se puede adaptar fcil-
mente a la sntesis automatizada. En general, el equipo necesario para los mtodos manuales es ms sencillo y menos costoso
que el que se emplea en los mtodos automatizados, pero requiere mayor trabajo. Son de particular inters los mtodos rela-
cionados con la validacin del rendimiento correcto de un aparato automatizado. En un procedimiento manual, la interven-
cin humana y la correccin mediante inspeccin pueden evitar muchos errores de procedimiento. En un sistema automatiza-
do, la retroalimentacin eficaz tambin puede comenzar durante la sntesis. Por ejemplo, los detectores de radiacin pueden
controlar la actividad en varias etapas de la radiosntesis. Cuando no se logra la actividad adecuada se puede activar un sistema
de alarma que conduce a la intervencin humana.
Radioqumicos frente a Radiofrmacos-Se debe establecer una distincin entre un radioqumico y el radiofrmaco co-
rrespondiente. En los centros de investigacin de TEP, los equipos automatizados se emplean para preparar compuestos mar-
cados para experimentos con animales. Estos radioqumicos no se consideran radiofrmacos si (1) no estn preparados de
acuerdo a un proceso validado que proporcione un alto grado de seguridad y garantice que la preparacin cumpla todos los
requisitos establecidos de calidad y pureza; y (2) no han sido certificados por personal calificado (farmacuticos y mdicos au-
torizados) de conformidad con los mtodos farmacopeicos publicados para los radiofrmacos individuales.
Equipo Automatizado-Las consideraciones que se hacen en este captulo corresponden a la sntesis que se lleva a cabo
mediante robots de uso general y aparatos especiales. Ambos son dispositivos automatizados que se emplean en la sntesis de
radioqumicos. El mtodo exacto de control de los dispositivos de sntesis es variable. Tanto los dispositivos de sntesis contro-
lados electrnicamente como los controlados por programas informticos caen dentro de la designacin general y tienen un
espectro que vara desde el equipo manual tradicional, pasando por dispositivos semiautomatizados, hasta dispositivos com-
pletamente automticos.
Elementos Comunes de Equipos Automatizados de Sntesis-Para manipular un aparato qumico que efecte la sntesis de un
radioqumico, es necesario controlar parmetros tales como el tiempo, la temperatura, la presin, el volumen y la secuencia.
Estos parmetros se pueden controlar y restringir para que estn dentro de ciertos lmites.
842 (1015) Aparatos Automatizados de Sntesis Radioqumica / Informacin General USP 39

Garanta de Calidad del Equipo-El objetivo de la garanta de calidad es ayudar a asegurar que el radiofrmaco posterior
cumpla las normas farmacopeicas. Aunque los reglamentos sobre las buenas prcticas de fabricacin (21 CFR 820) no sean
aplicables, pueden resultar tiles para crear un programa de garanta de calidad. En la prctica, esto comprende la medicin y
el control documentados de todos los parmetros fsicos pertinentes controlados por los aparatos de sntesis.
Prueba de Control de Calidad de Rutina-La prueba de control de calidad de un equipo automatizado implica el examen
peridico de todos los parmetros certificados inicialmente durante la calificacin de garanta de calidad. La frecuencia de la
prueba puede ser diaria, dependiendo de la importancia y la estabilidad de los parmetros. Esta evaluacin del funcionamiento
del proceso se debe aumentar por medio de pruebas peridicas del producto final. Por ejemplo, se pueden aceptar las varia-
ciones en la temperatura de un bao de aceite si el radioqumico (producto final) demuestra que cumple todos los criterios
pertinentes de la prueba.
Auditora de Verificacin de Calidad de los Reactivos-Los materiales y reactivos utilizados para la sntesis de radiofrma-
cos deben ajustarse a las especificaciones y las pruebas establecidas de control de calidad. Se deben establecer los procedi-
mientos para las pruebas, el almacenamiento y el uso de estos materiales. En este contexto, un reactivo se define como cual-
quier producto qumico utilizado en el procedimiento que conduce al producto radioqumico final, mientras que los materiales
se definen slo como suministros complementarios (tubos, materiales de vidrio, viales, etc.). Por ejemplo, en algunos procesos
se emplea nitrgeno comprimido para mover reactivos lquidos. En este caso, tanto el nitrgeno como los tubos deben cum-
plir las especificaciones establecidas.
Documentacin de Parmetros del Aparato-Se deben identificar, controlar y documentar las variables fundamentales de
la sntesis. Estas caractersticas comprenden importantes atributos fsicos, qumicos, elctricos y de funcionamiento. Para micro-
procesadores y dispositivos controlados por computadora es particularmente importante un mtodo para especificar, probar y
documentar los programas y las piezas de la computadora. Este procedimiento debe incluir un anlisis general y peridico de
los componentes de la computadora. Adems, se debe examinar peridicamente el cdigo del programa informtico para de-
terminar que no se haya modificado y que contina dando como resultado el producto final que cumple todas las especifica-
ciones. La retroalimentacin durante el proceso es un medio para confirmar que la sntesis est bajo control. Los cambios de
cdigo en los programas deben incluir un procedimiento de autorizacin formal y se deben documentar.
Cada tipo de dispositivo de sntesis radioqumica requiere un conjunto de procedimientos especficos para probar y controlar
la confiabilidad y reproducibilidad de los diversos subsistemas que conforman el sistema total de sntesis.
Es esencial que la calibracin de cada uno de los componentes se confirme de acuerdo con un cronograma de manteni-
miento establecido y que las mediciones o el control se realicen bajo las condiciones reales de sntesis.
Se deben medir los tiempos de entrega, los volmenes de reactivo, las temperaturas, las presiones de los gases y las veloci-
dades de flujo y deben demostrar ser estables y reproducibles dentro de los lmites establecidos. El agregado de los reactivos y
disolventes se debe calibrar peridicamente. Otros componentes que se deben calibrar de forma rutinaria incluyen el sistema
de deteccin de radiaciones y los sensores y el sistema de control de procesos.
Como ejemplo, se indican a continuacin los elementos de validacin de los sistemas de varios componentes representativos
de un dispositivo automtico de sntesis:
Los recipientes de reaccin se pueden limpiar e inspeccionar mediante un mtodo establecido y documentado. Los recipien-
tes se pueden enumerar y se puede hacer un seguimiento de su desempeo.
Los sistemas de calentamiento y enfriamiento (como por ejemplo los baos de aceite) se pueden controlar por medio de
termmetros o termocuplas. Las temperaturas se pueden registrar en una hoja de partida o se pueden imprimir automtica-
mente como parte de un registro computarizado. El mantenimiento implica la calibracin peridica.
Los gases y el funcionamiento del sistema de entrega de gas se pueden controlar por medio de manmetros y flujmetros.
La pureza del gas se puede establecer por medio de certificados de anlisis emitidos por el proveedor o se puede verificar me-
diante una prueba independiente. El mantenimiento de los manmetros y flujmetros implica la calibracin peridica con es-
tndares.
El desempeo motriz dependiente de la posicin se puede verificar por medio de interruptores de lmite. El mantenimiento
podra implicar la medicin real de la distancia recorrida y el tiempo transcurrido.
Las vlvulas solenoides se pueden controlar elctricamente, por medio de pruebas de flujo y presin.
El rendimiento del calentador se evidencia por medio de lecturas adecuadas de la termocupla. Otras pruebas podran incluir
determinaciones de resistencia.
Los reactivos se pueden aceptar sobre la base de los certificados de anlisis del proveedor. Como alternativa, el producto
qumico se podra analizar internamente o enviar a un laboratorio independiente. Segn el grado de estabilidad, puede ser
necesaria la repeticin peridica de pruebas.
Los programas informticos se pueden probar mediante la documentacin del tiempo de sntesis transcurrido, con impresos
que verifiquen que se efectuaron todas las manipulaciones adecuadas, inclusive impresiones de los parmetros pertinentes co-
mo tiempos, temperatura, presiones y actividades.
Los patrones de distribucin de actividades, como por ejemplo la cantidad absoluta de producto, el porcentaje de rendi-
miento y los niveles individuales de actividad de las impurezas, brindan al usuario experimentado una oportunidad para locali-
zar fallas del sistema.
Cambios en el Mtodo de Sntesis-Algunos cambios en los aparatos de sntesis se pueden considerar no significativos. A
menudo, esta categora incluye cambios que no afectan a ninguno de los parmetros controlados. Sin embargo, es importante
tener cuidado para garantizar que los cambios que parecen inofensivos no tengan un efecto inesperado. Por ejemplo, cambios
USP 39 Informacin General/ (1024) Suero Bovino 843

en una lnea de comentario de un programa informtico pueden provocar un cambio inadvertido o la eliminacin de una ins-
truccin importante. Cualquier cambio en los parmetros controlados puede cambiar el resultado del proceso. Si el radioqu-
mico resultante no cumple con las especificaciones o si el radiofrmaco posterior no satisface los criterios farmacopeicos, el
cambio del proceso es inaceptable; se debe corregir la falla y volver a validar el proceso.

(1024) SUERO BOVINO

INTRODUCCIN
El suero bovino es la fraccin lquida de la sangre coagulada de buey (Bos taurus, entre otras especies), de la que se han
eliminado clulas, fibrina y factores de coagulacin. Desde la aparicin del cultivo celular moderno, los fabricantes de produc-
tos biolgicos han usado ampliamente el suero bovino como suplemento de crecimiento para cultivos celulares. Su composi-
cin altamente nutricional de protenas, factores de crecimiento, hormonas, aminocidos, vitaminas, azcares, lpidos, oligoe-
lementos y dems componentes sustenta una amplia gama de aplicaciones de cultivo celular para la investigacin y fabrica-
cin comercial de vacunas, productos biolgicos de origen natural y recombinantes (en lo sucesivo, productos biolgicos), teji-
dos obtenidos por ingeniera y otros productos celulares teraputicos destinados para uso humano o veterinario. El Suero Fetal
Bovino (FBS, por sus siglas en ingls) es el tipo predominante de suero usado en las aplicaciones de investigacin. El suero de
ternero (de animales recin nacidos o mayores) se usa con mucho menor frecuencia, aunque por su bajo costo, sera amplia-
mente usado en la fabricacin comercial.
Al igual que con otros productos de origen animal, el suero bovino conlleva el riesgo potencial de introducir agentes extra-
os en el cultivo celular. Los fabricantes de suero y reguladores deben adoptar procedimientos rigurosos de obtencin y anli-
sis, adems de estrictas guas de procesamiento y produccin para asegurar la calidad del suero bovino.
Con el objetivo de incrementar la calidad y seguridad de los productos biolgicos producidos con suero bovino, y de mitigar
las exigencias reglamentarias, los desarrolladores han investigado alternativas a la suplementacin con suero, lo que ha resulta-
do en formulaciones de medios exentos de suero para aplicaciones especficas. Aunque se reconoce que debe evitarse el uso
de suero bovino siempre que exista la opcin de emplear medio exento de suero, hay casos en los que resulta tcnicamente
imposible o poco prctico.
Este captulo describe cuestiones relacionadas con la obtencin, produccin y caracterizacin de suero bovino para asegurar
su uso seguro. El Apndice 7 presenta una lista de guas y documentos reglamentarios pertinentes. Los fabricantes de suero y
los usuarios finales de suero (fabricantes de productos biolgicos) deben considerar y aplicar, segn se requiera, los controles y
procedimientos establecidos en este captulo para asegurar el uso seguro de componentes de suero bovino en la investigacin
y fabricacin farmacutica.

Tipos de Suero Bovino

El suero fetal bovino (FBS) se obtiene de fetos, previo al parto, de hembras reproductoras bovinas sanas que se consideran
aptas para consumo humano mediante inspeccin ante y postmortem realizada por veterinarios autorizados. El suero se
recolecta en mataderos sujetos a inspeccin y registro gubernamental.
El suero de ternero recin nacido (tambin conocido como suero de bovino recin nacido) se obtiene de animales con
una edad menor de 20 das en mataderos sujetos a inspeccin y registro gubernamental.
El suero de ternero se obtiene de animales con una edad entre 20 das y 12 meses en mataderos sujetos a inspeccin y
registro gubernamental.
El suero de bovino donante (tambin conocido como suero de ternero donante) se obtiene mediante el sangrado repeti-
do de animales donantes pertenecientes a manadas donantes controladas, y sujetas a inspeccin y registro gubernamen-
tal. Los animales tienen entre 12-36 meses de edad.
El suero de bovino adulto se obtiene de ganado con una edad mayor de 12 meses que se declara apto para consumo
humano en mataderos sujetos a inspeccin y registro gubernamental.

SUERO BOVINO: HISTORIA V TIPOS DE USOS

Historia del Uso de Suero Bovino

El suero animal y dems materiales biolgicos complejos se han empleado durante aproximadamente 100 aos en el cultivo
de clulas de mamferos. Fueron varios los factores que llevaron a la adopcin de suero bovino como suplemento estndar
para el cultivo de tejidos. En comparacin con el suero de otras especies animales (caballo, cabra), el suero bovino se obtiene
fcilmente por lo que resulta ms econmico. Muchos investigadores deciden usar suero fetal en sus sistemas experimentales
debido a las inquietudes relacionadas con anticuerpos presentes en suero de recin nacido y de adulto que podran provocar
844 (1024) Suero Bovino/ Informacin General USP 39

una reaccin cruzada con las clulas en cultivo y ocasionar lisis celular mediada por complemento. A fin de terminar con tales
inquietudes, se comenz a usar calor para inactivar el complemento potencialmente presente en el suero. Los estudios de FBS
realizados en la dcada de 1950 en el cultivo de clulas humanas de baja densidad para dilucidar mecanismos de crecimiento
celular demostraron que (1) el componente albmina puede actuar corno portador de molculas pequeas esenciales; (2) la
fetuna, una glicoprotena que se presenta en altos niveles en la fraccin alfa globulina, facilita la adhesin y extensin celular;
y (3) la fetuna inhibe considerablemente la tripsina, y tal actividad antiproteoltica puede jugar un papel en la capacidad de la
fetuna para estimular el crecimiento celular.
Durante las dcadas de 1960 y 1970, la suplernentacin con suero de los medios de cultivo de tejidos se convirti en una
prctica normal, lo que facilit tanto la investigacin biomdica corno los primeros procesos de fabricacin de vacunas a gran
escala. La suplernentacin con suero redujo la necesidad de optimizar las formulaciones de medios para diferentes tipos de
clulas. Adems, se demostr que el FBS proporcionaba una variedad de factores de crecimiento polipeptdicos. Presuntamen-
te, la albmina promova el crecimiento celular debido a sus capacidades para funcionar corno protena portadora de molcu-
las pequeas o lpidos, para unir iones metlicos, para servir corno amortiguador del pH, y para proteger a las clulas de la
ruptura. Asimismo, se encontraron funciones similares en otros componentes del suero corno transferrina, hormonas y otros
factores de adhesin derivados del suero corno fibronectina, vitronectina y larninina.

Usos del Suero Bovino

El suero es una mezcla compleja de rnacrornolculas requerida para el crecimiento celular y la produccin de virus, y su uso
corno materia prima presenta diversos retos, entre los que se incluyen su composicin lote a lote y el riesgo de contaminacin
por agentes adventicios. El desarrollo de medios exentos de suero ha reemplazado al suero en algunas aplicaciones biotecnol-
gicas nuevas de fabricacin; sin embargo, muchas lneas celulares usadas en la fabricacin an no han sido adaptadas a estos
medios exentos de suero. Las restricciones reglamentarias y los retos cientficos por lo general vuelven poco prctico alterar los
procesos de fabricacin existentes en los que se usa suero corno materia prima.
En ocasiones, el FBS es necesario para el bioprocesarniento de clulas y tejidos, lo cual a menudo implica el cultivo de clulas
provenientes de explantes y biopsias de tejidos. Adems, para algunos procesos biolgicos puede ser necesario mantener ca-
ractersticas celulares especficas durante el cultivo. El FBS a menudo parece facilitar tales procedimientos y puede afectar el
comportamiento biolgico de los tipos de clulas exigentes (fastidious cells). Se ha demostrado que el FBS afecta la transcrip-
cin de genes importantes para el desarrollo, la apoptosis y la expresin gnica relacionada con la apoptosis, adems de que
proporciona factores neuroprotectores y antioxidantes, todo lo cual puede ser beneficioso para la supervivencia y el desarrollo
de clulas en cultivo. Por lo tanto, el FBS seguir jugando un papel importante corno suplemento para cultivos celulares en la
produccin de terapias celulares y de tejidos.
En la mayora de los procesos de fabricacin de vacunas de virus los medios usados para la expansin de cultivos celulares y
la infeccin/produccin de virus se suplementan con diferentes tipos de suero a diversas concentraciones. En estos procesos, el
suero bovino ayuda a generar una masa de clulas en un estado fisiolgico ptimo para una replicacin viral eficiente.

RECOLECCIN Y PRODUCCIN DE SUERO BOVINO

Recoleccin de Sangre

Para todos los tipos de suero bovino, la sangre se debe recolectar en instalaciones sujetas a inspeccin y registro guberna-
mental (mataderos y granjas de donantes). La sangre debe ser recolectada por operarios capacitados siguiendo los procedi-
mientos escritos aprobados por el fabricante de suero y usando dispositivos de recoleccin desechables para un slo uso o
equipo de recoleccin reutilizable que cuente con procedimientos de limpieza validados.

SUERO DE BOVINO DONANTE

Para cada lote de suero de animales donantes, los fabricantes de suero deben asegurar la rastreabilidad a la manada donante
mediante registros de produccin y certificados de salud y de origen de los animales. Los animales donantes estn sujetos a
inspecciones veterinarias regulares y se les desangra varias veces siguiendo los procedimientos establecidos. Debe ser posible
rastrear a los animales introducidos a la manada por origen, raza e historial de crianza. Los recolectores deben introducir nue-
vos animales a la manada siguiendo procedimientos especificados y aprobados que incluyen inspeccin y anlisis del animal
previos a la compra, transporte adecuado, un periodo de cuarentena, examen y anlisis veterinario durante el periodo de cua-
rentena y criterios de liberacin de los animales en cuarentena para la produccin del suero. Los recolectores no deben vacu-
nar a los animales donantes contra la diarrea viral bovina (DVB). Los recolectores deben someter los animales a anlisis para
determinar la presencia de cualquier agente y anticuerpo de los que se declara estar exenta la manada.
USP 39 Informacin General/ (l 024) Suero Bovino 845

SUERO DE TERNERO RECIN NACIDO, SUERO DE TERNERO Y SUERO DE BOVINO ADULTO

Los certificados de salud y de origen de los animales y/o los registros de produccin de suero deben asegurar que los fabri-
cantes de suero puedan rastrear el origen del suero bovino derivado de animales sacrificados hasta el matadero. Los fabricantes
de suero deben requerir que los mataderos mantengan la documentacin del origen de los animales para sacrificio. La sangre
se debe recolectar de animales que hayan sido sacrificados para consumo humano en mataderos inspeccionados por la autori-
dad competente del pas de origen. Los inspectores deben inspeccionar a los animales de manera rutinaria tanto antemortem
como postmortem para verificar clnicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, adems de otros proble-
mas o condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clnica de enfer-
medades infecciosas al momento del sacrificio. Deben implementarse procedimientos de recoleccin sangunea que preven-
gan la contaminacin cruzada con otros tejidos y fluidos corporales y el ambiente aledao. El procedimiento de sacrificio es-
tndar consiste en un mtodo aprobado de aturdimiento del animal seguido de desangrado.

SUERO FETAL BOVINO

Las especificaciones de producto y los procedimientos de anlisis para FBS se presentan en el captulo general propuesto
Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90). Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre
fetal bovina a partir de fetos bovinos provenientes de hembras reproductoras que hayan sido sacrificadas. Las hembras repro-
ductoras deben ser declaradas aptas para consumo humano y deben haber sido sacrificadas en mataderos inspeccionados por
la autoridad competente del pas de origen. Los inspectores deben examinar a todos los animales tanto antemortem como
postmortem para verificar clnicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, adems de otros problemas o
condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clnica de enfermedades
infecciosas al momento del sacrificio. El tero debe extraerse y transportarse a un espacio dedicado para recoleccin de sangre
fetal bovina, en donde el personal de recoleccin sangunea evala el feto para detectar signos de muerte fetal, que incluyen
hinchazn, decoloracin de la piel, olor, deformacin, y cada del pelaje. Asimismo, los recolectores deben verificar el color, la
cantidad y la claridad del fluido amnitico. Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre de fetos aceptables mediante
puncin cardaca en un sistema cerrado de recoleccin en condiciones diseadas para minimizar la contaminacin microbiana.
Los fabricantes deben implementar procedimientos que prevengan la contaminacin cruzada con otros tejidos fetales y fluidos
corporales y el ambiente aledao.

Recoleccin y Procesamiento del Suero

La separacin (recoleccin) del suero y dems actividades de procesamiento deben ser realizadas por personal capacitado
siguiendo procedimientos escritos y aprobados. El suero primero se separa y combina, y luego se filtra y deposita en envases
limpios y desinfectados. Si el suero se somete a uno o ms tratamientos de inactivacin viral en el proceso de produccin, los
fabricantes de suero deben validar los procesos de inactivacin viral contra una gama de virus pertinentes. Se recomienda in-
cluir al virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en cualquier estudio de validacin viral debido a que este virus es ubicuo.

SEPARACIN Y RECOLECCIN DEL SUERO

El procesamiento de sangre bovina y la separacin (recoleccin) del suero deben realizarse en una manera que minimice la
contaminacin bacteriana y micoplasmtica, lo cual a su vez minimiza los niveles de endotoxinas en el producto del suero. El
procesamiento cuidadoso y rpido de la sangre ayuda a minimizar la hemlisis, lo que mejora an ms la calidad del producto
del suero. Despus de la recoleccin, primero se deja que la sangre coagule durante un periodo especfico y en condiciones
controladas, y luego se centrifuga en una centrfuga refrigerada. Posteriormente, el suero se separa del cogulo, generalmente
por centrifugacin, se combina y mezcla en un recipiente de combinacin, se transfiere a envases etiquetados, y se congela, a
menos que se esterilice inmediatamente por filtracin. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso y reali-
zar las actividades de procesamiento del suero, incluyendo la recoleccin de muestras y las pruebas de control de calidad du-
rante el proceso, siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.

COMBINACIN DE SUEROS ANTES DEL FILTRADO

Debido a la limitada cantidad de sangre que se puede recolectar de cada animal, los fabricantes de suero combinan el suero
bruto de muchos animales para crear lotes de tamao comercial. Despus de descongelar el suero bruto y antes de la filtra-
cin, el suero se combina en un recipiente de combinacin y se mezcla a una velocidad y temperatura controladas. Las combi-
naciones o lotes de suero de bovino donante pueden consistir en muchas recolecciones separadas de miembros individuales
de la manada. Los lotes de FBS pueden consistir en el suero combinado de miles de animales. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de combinacin de sueros previa al filtrado y deben realizar la descongelacin del suero, la
combinacin previa al filtrado y las actividades de mezclado siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
846 (1024) Suero Bovino/ Informacin General USP 39

FILTRACIN

El suero combinado se mezcla y se pasa aspticamente a travs de filtros con un tamao de poro de 0,2 m o menor, de-
pendiendo de la aplicacin prevista. Deben validarse los procesos de filtracin. Se ha demostrado que la filtracin triple usando
filtros con un tamao de poro de O, 1 m resulta en un alto grado de eliminacin de micoplasmas. Aunque la filtracin puede
eliminar algunos virus de gran tamao y agregados virales del suero, los virus generalmente no pueden eliminarse por comple-
to mediante esta tcnica. Adems, no se ha demostrado que los filtros eliminen el agente causante de la encefalopata espon-
giforme bovina (BSE, por sus siglas en ingls). Despus de la filtracin, los fabricantes de suero llenan envases estriles con el
suero filtrado mediante procesamiento asptico en un ambiente adecuadamente controlado. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de filtracin y deben realizar las actividades de filtrado, llenado y recoleccin de muestras de
suero siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.

RADIACIN

El tratamiento del suero por radiacin gamma es muy comn y representa uno de los mtodos ms efectivos de inactivacin
viral. La dosis mnima usada con ms frecuencia es de 25 kilograys (kGy). Algunos pases especifican requerimientos de dosis
mayores (>30 kGy) para suero importado. La radiacin gamma puede inactivar virus, micoplasma y bacterias, pero los usuarios
finales del suero deben asegurarse de que el proceso de radiacin gamma no afecte negativamente sus aplicaciones especfi-
cas. La radiacin puede tener efectos adversos sobre la calidad del suero, los cuales tienden a incrementarse a mayores dosis.
La validacin de la radiacin gama presenta dos aspectos: (1) la administracin de la dosis en una configuracin de carga
definida y (2) la capacidad de inactivacin. Los parmetros crticos del proceso de radiacin incluyen la temperatura del pro-
ducto (suero), el tamao y la configuracin del envasado, la distribucin de dosmetros y la dosis mnima/mxima definida de
radiacin recibida. Los dosmetros deben usarse para monitorear las posiciones de dosis alta y dosis baja en cada aplicacin de
radiacin. Si el fabricante de suero declara haber realizado inactivaciones, stas deben estar sustentadas mediante estudios de
inactivacin viral bien diseados por el mismo fabricante.

TRATAMIENTO ULTRAVIOLETA (uv)

Los fabricantes de suero pueden usar tratamiento UV para inactivar virus, micoplasmas y bacterias, sin embargo deben vali-
dar el proceso para demostrar su eficacia. Adems, los fabricantes deben ser conscientes de que el tratamiento UV puede tener
un efecto adverso sobre la calidad del suero y por consiguiente deben considerar los efectos del tratamiento UV para cada
aplicacin, como deben hacerlo tambin los usuarios finales del suero.

INACTIVACIN CON CALOR

La inactivacin con calor implica elevar la temperatura del suero a >56 durante al menos 30 minutos para inactivar el com-
plemento. La inactivacin con calor tambin puede inactivar virus, micoplasmas y bacterias, aunque puede tener un efecto
adverso sobre la calidad del suero, por lo que los fabricantes deben validar la aptitud del procedimiento para aplicaciones es-
pecficas. En comparacin con la radiacin, la inactivacin con calor proporciona una garanta de inactivacin significativamen-
te menor.

ESTUDIOS DE DEPURACIN VIRAL

El captulo general Evaluacin de la Seguridad Viral en Productos Biotecnolgicos Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Huma-
no o Animal (1050) y otros documentos reglamentarios proporcionan guas sobre la realizacin de estudios de depuracin viral
que ayudan a validar los procesos de eliminacin/inactivacin. Los fabricantes de suero deben tambin realizar estudios forma-
les con agregado (spiking) de virus pertinentes y representativos (modelo), y deben analizar y comparar muestras de suero con
virus agregado e inactivado, controles negativos y controles positivos.

TRATAMIENTO CON CARBN

Algunos fabricantes de suero usan tratamientos con carbn/dextrano para reducir los niveles de hormonas del suero.

DILISIS

Algunos fabricantes utilizan dilisis o diafiltracin para eliminar componentes de bajo peso molecular del suero.
USP 39 Informacin General/ (1024) Suero Bovino 847

LIMPIEZA Y ESTERILIDAD DEL EQUIPO

Las tuberias y sistemas de acero inoxidable usados en la fabricacin de suero bovino deben limpiarse y esterilizarse para pre-
venir la contaminacin cruzada y el crecimiento de agentes adventicios. Los fabricantes de suero deben validar sus procesos de
limpieza para la eliminacin e inactivacin de agentes de inters. Posteriormente, los fabricantes deben implementar controles
de proceso que verifiquen de manera rutinaria los ciclos de limpieza. La esterilizacin por vapor en el sitio (sterilization-in-pla-
ce) es una tcnica de esterilizacin comn y efectiva. Los fabricantes de suero que usan esta tecnologa deben validar los ciclos
de vapor para demostrar su uniformidad y capacidad para destruir esporas bacterianas resistentes al calor. Los fabricantes pue-
den, alternativamente, usar sistemas desechables estriles que no requieren de validacin de limpieza.

Control de Calidad

RASTREABI LI DAD

Recoleccin en Mataderos: Los materiales recolectados en EE.UU. deben obtenerse de instalaciones registradas en el De-
partamento de Agricultura de EE.UU. (USDA, por sus siglas en ingls). Los fabricantes de suero deben conservar documenta-
cin que permita rastrear un sublote de suero especfico hasta el matadero donde se recolect. Los mataderos mantienen re-
gistros del origen del animal. La prctica industrial general es conservar esta informacin como parte del Registro Maestro del
Dispositivo (DMR, por sus siglas en ingls). Los requisitos generales de conservacin de registros en mataderos autorizados por
el USDA se citan en el Ttulo 9 del Cdigo de Reglamentaciones Federales (en lo sucesivo CFR, por sus siglas en ingls) 320.
Los materiales recolectados en pases aprobados por el USDA para la importacin de productos bovinos a EE.UU. deben
cumplir con los requisitos de la autoridad competente del pas de origen. Adems, los fabricantes de suero deben conservar
registros de anlisis de seguridad requeridos por el USDA para materiales importados (si fuera requerido) como parte de su
Registro Histrico del Dispositivo (DHR, por sus siglas en ingls).
Los fabricantes de suero deben consultar el Ttulo 9 del CFR 309 y el Ttulo 9 del CFR 31 O con respecto a los requisitos de
inspeccin de animales para diversas enfermedades antes y despus del sacrificio. Se recomienda cumplir con tales requisitos
para materiales recolectados fuera de EE.UU.
Recoleccin en Manadas Donantes: Los fabricantes de suero deben mantener la rastreabilidad hasta la granja de anima-
les donantes en la que se recolect la sangre de los animales donantes. En la mayora de los casos, los fabricantes de suero
identifican de manera individual a los animales de la granja y conservan registros sobre las fechas de sangrado y procesamien-
to, lo que permite rastrear la recoleccin sangunea hasta un animal en particular. Los animales deben ser inspeccionados con
regularidad por un veterinario autorizado o individuo designado bajo la gua de un veterinario, quienes deben certificar que los
animales estn libres de enfermedades y son aptos para consumo humano, de conformidad con el Ttulo 9 del CFR 309.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DEL PRODUCTO

El suero debe almacenarse en estado de congelacin a una temperatura de -1 O o menor. El suero se congela tan rpido
como sea posible para preservar la calidad del producto y se almacena en condiciones controladas de almacenamiento. Los
fabricantes de suero deben establecer la estabilidad del producto del suero para respaldar la fecha de caducidad propuesta. La
fecha de caducidad tpica para el suero bovino es de 5 aos a partir de la fecha de filtracin y envasado. El uso de cualquier
tipo de suero bovino despus de la fecha de caducidad indicada depende de la aplicacin y el usuario del suero debe estable-
cer la aptitud continua del producto para su uso.

Etiquetado

Las etiquetas del producto terminado deben contener la siguiente informacin: descripcin del producto, nmero de lote,
condiciones de almacenamiento, nombre y direccin del fabricante y una declaracin que indique el uso previsto. Los materia-
les destinados para propsitos de investigacin estn exentos de las reglamentaciones de etiquetado (Ttulo 21 del CFR 801 ).
Por lo general, los fabricantes de suero proporcionan un Certificado de Anlisis (COA, por sus siglas en ingls) especfico del
lote, el cual se clasifica como parte del etiquetado del producto. Ver los requisitos para el COA en la seccin siguiente.

Certificacin/Documentacin

CERTIFICADO DE ANLISIS

El COA debe proveer informacin sobre un lote de suero especfico, incluidas las pruebas realizadas y los resultados de las
mismas (de acuerdo con las especificaciones de liberacin del fabricante del suero), as como los identificadores crticos del
etiquetado tales como nmero de lote, nmero de catlogo, descripcin del tipo de suero bovino, pas de origen y fecha de
fabricacin o caducidad, o ambas. Este documento es distinto al certificado de salud emitido por la autoridad competente del
pas de origen.
848 (1024) Suero Bovino/ Informacin General USP 39

CERTIFICADO DE ORIGEN Y CERTIFICADO DEL ESTADO DE SALUD DEL ANIMAL

El Certificado de Origen establece el pas en el que se recolect la sangre bovina, as como la certificacin veterinaria de la
salud de los animales antes y despus de la recoleccin (Ttulo 9 del CFR 327.4).

DOCUMENTOS DE IMPORTACIN/EXPORTACIN

Los documentos de importacin/exportacin incluyen una certificacin formal del estado de las enfermedades animales en
el pas de origen y las disposiciones de certificacin negociadas/acordadas, las cuales varan de pas a pas. Cada pas define sus
requisitos de importacin/exportacin a fin de controlar la introduccin de enfermedades animales exticas y su impacto eco-
nmico, as como evaluaciones de seguridad del producto (riesgo vs. investigacin, diagnstico y/o beneficios teraputicos).

INFORMES DE PRODUCCIN

Los informes de produccin son generalmente registros de partidas que documentan las materias primas de manera identifi-
cable y rastreable, mtodos de produccin (centrifugacin o filtracin) usados en la fabricacin, limpieza de equipo e instala-
ciones, pruebas de control de calidad y personal que realiza las actividades requeridas. La materia prima con Certificados de
Origen o registros de produccin de suero facilita la rastreabilidad hasta el origen de la sangre que se us para crear el suero.
Cuando se usa suero como una materia prima para fabricacin, la documentacin del proceso tambin ayuda a demostrar la
fabricacin controlada del suero bovino.

EVALUACIN DE RIESGO DE BSE

A pesar del bajo potencial de riesgo de encefalopatas espongiformes transmisibles (TSE, por sus siglas en ingls) en el suero
bovino, diversas agencias reguladoras de EE.UU. e internacionales han desarrollado guas para ayudar a manejar y reducir an
ms los riesgos potenciales de transmisin. Ante la ausencia de mtodos de prueba apropiados para detectar al agente infec-
cioso en fluidos como la sangre, la recomendacin acordada por varias agencias reguladoras es adoptar buenas estrategias de
evaluacin de riesgos. Esta seccin del captulo proporciona algunos antecedentes de la enfermedad y los mtodos de detec-
cin vigentes; adems seala estrategias de evaluacin de riesgos y de reduccin de riesgos para prevenir potencialmente la
transmisin de la enfermedad a travs del uso de suero en la fabricacin de productos medicinales.

Descripcin de la Enfermedad

Las TSE son enfermedades animales y humanas transmisibles que se caracterizan por una degeneracin del cerebro, relacio-
nada con severos signos y sntomas neurolgicos. Debido a las epidemias de TSE en ganado bovino, denominadas BSE, las
cuales se transmitieron a otras especies, los funcionarios de salud pblica estn preocupados por el riesgo de infeccin de TSE,
incluida la posibilidad de transmisin de TSE por el uso de productos teraputicos que se fabrican usando suero bovino. Se han
encontrado titulas bajos en el fluido cerebroespinal, pulmn, tejido linftico, bazo, rin, hgado e leon del ganado bovino
infectado con BSE. Los estudios han demostrado que la transfusin sangunea a partir de una oveja infectada con BSE o prurito
lumbar pero sin enfermedad evidente puede infectar a una oveja que no ha sido expuesta previamente a la infeccin. Aunque
siempre est presente el riesgo de contaminacin cruzada, a la fecha, ningn estudio ha demostrado que la enfermedad pue-
de transmitirse a partir de la sangre de ganado bovino con BSE. Los embriones de ganado bovino afectado por BSE no han
transmitido enfermedades a ratones. Los terneros nacidos de hembras reproductoras que recibieron embriones de ganado bo-
vino afectado por BSE han sobrevivido por hasta 7 aos, y el examen practicado a los cerebros de las hembras reproductoras
no afectadas y de sus cras no revelaron encefalopata espongiforme.

Estrategias de Deteccin
Ninguno de los procedimientos actualmente disponibles cuenta con una sensibilidad validada que sea suficiente para llevar a
cabo la deteccin antemortem en animales asintomticos, aunque se encuentran en desarrollo mtodos analticos para la de-
teccin y cuantificacin en materiales de baja infectividad como la sangre. La prueba clsica de diagnstico para TSE es el exa-
men histolgico postmortem de tejido cerebral para confirmar la caracterstica degeneracin vacuolar. Otras opciones de an-
lisis incluyen pruebas inmunohistoqumicas que pueden confirmar la presencia de PrPSc, la conformacin anormal especfica
para la enfermedad de la protena prinica (PrP), en las regiones vacuoladas del cerebro; y pruebas inmunoqumicas como
transferencias Western y enzimoinmunoensayos que pueden detectar PrPSc en tejidos con titulas altos o moderadamente al-
tos. Estas pruebas generalmente toman menos tiempo que el examen histolgico (6-8 horas vs. semanas, respectivamente) y
se pueden automatizar parcial o totalmente. Aunque muchas de stas pruebas son postmortem, los estudios han demostrado
la viabilidad de las pruebas antemortem de muestras de tejido linfoide obtenido de las amgdalas o de la membrana nictitante
de animales infectados. Las pruebas inmunoqumicas requieren de una extensa recoleccin y preparacin de muestras y pue-
den ser demasiado caras para emplearse como pruebas y monitoreos de rutina de la enfermedad en manadas grandes. Las
USP 39 Informacin General/ (1024) Suero Bovino 849

estrategias de diagnstico deben considerar la sensibilidad del anlisis en ciertos tejidos, as como la capacidad de la prueba
para detectar la infectividad en los animales antes del desarrollo de signos clnicos de enfermedad. Los resultados negativos no
aseguran la ausencia de infectividad. La deteccin de infectividad es posible si se inocula el tejido sospechoso en animales ex-
perimentales intracranealmente donde el agente causante puede amplificarse. Esta metodologa de deteccin de baja infectivi-
dad puede tomar desde meses hasta aos para arrojar un resultado positivo.

Estrategias de Evaluacin y Reduccin de Riesgos

Los fabricantes de suero deben emplear estrategias de reduccin de riesgos para eliminar el peligro de contaminacin cruza-
da de sangre fetal con otros tejidos, que incluyan la obtencin apropiada de artculos de origen animal y el uso de prcticas
que han demostrado eliminar o minimizar el riesgo de transmisin de TSE mediante productos alimenticios o para el cuidado
de la salud. Los usuarios finales del suero deben realizar una evaluacin de riesgos relacionada con su estrategia de obtencin
del material en la que se considere la cantidad de suero bovino usada en su aplicacin, y deben realizar auditoras a los provee-
dores para asegurar la rastreabilidad del origen, manejo y sistemas de control de calidad apropiados.

ORIGEN Y EDAD DE LOS ANIMALES

Los fabricantes de suero deben monitorear la rastreabilidad de cada lote de suero para asegurar la calificacin del suero bovi-
no, segn se describi previamente en las secciones Recoleccin y Procesamiento del Suero y Control de Calidad. Adems de la
rastreabilidad, la seleccin cuidadosa de materiales de origen es el criterio ms importante para la seguridad de los productos
medicinales. La certificacin de origen debe estar disponible por parte del proveedor y los fabricantes deben conservar esta
informacin en sus archivos. Las recomendaciones de la Administracin de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA, por sus
siglas en ingls) prohben el uso en productos regulados por la FDA (con excepcin de la gelatina) de cualquier material bovi-
no originario de pases con casos reportados de BSE autctona. La regla vigente propuesta califica al FBS como una fuente
improbable de material infeccioso de BSE, puesto que la evidencia actual sugiere que la transmisin de BSE de la vaca al terne-
ro es poco probable. La regla propuesta indica adems que los materiales de ganado bovino prohibidos no incluyen materiales
derivados de fetos de terneros provenientes de vacas inspeccionadas y aprobadas, siempre que los materiales se hayan obteni-
do mediante procedimientos que puedan prevenir la contaminacin con materiales de riesgo especificados. Para productos
biolgicos veterinarios, los reglamentos vigentes aplicados por el Centro de Productos Biolgicos Veterinarios del USDA (US-
DA's Center for Veterinary Biologics o CVB) indican que los ingredientes de origen animal deben obtenerse de pases sin o con
un riesgo bajo de BSE, segn lo definido por el Centro Nacional de Importaciones y Exportaciones de EE.UU. y el Ttulo 9 del
CFR 94.18.
Las fuentes de materiales ms satisfactorias provienen de pases con las siguientes caractersticas:
Sin casos reportados de BSE autctona
Notificacin obligatoria de pruebas positivas
Verificacin obligatoria clnica y en el laboratorio de casos sospechosos
Prohibicin de uso de harina de carne y huesos que contengan protenas de animales rumiantes como fuente alimenta-
cin de animales rumiantes
Sin importacin de ganado bovino de pases donde se haya presentado una alta incidencia de BSE
Sin importacin de progenie de hembras afectadas
La infectividad de la BSE puede incrementarse con la edad del animal. Aunque el suero bovino se considera un material de
bajo riesgo de transmisin de TSE, algunos usuarios finales consideran prudente obtener el suero a partir de hembras repro-
ductoras menores de una edad mxima establecida. Si los fabricantes no pueden determinar la fecha de nacimiento de la
hembra reproductora, deben considerar tanto la fecha de implementacin de la prohibicin alimentaria en el pas de origen y
el periodo de incubacin de BSE a fin de determinar la seguridad de la fuente. En julio de 1988 se impuso una prohibicin
alimentaria para animales rumiantes en el Reino Unido. Estas consideraciones son especficas del lote, por lo que las auditoras
del proveedor de materia prima deben incluir una revisin de los registros.

PROCESO DE PRODUCCIN

El usuario final debe contar con sistemas de fabricacin para monitorear el proceso de produccin y para delinear la partida
(definicin de partida, separacin de partidas y limpieza entre partidas). El control de contaminacin cruzada potencial con
material posiblemente infeccioso es de primera importancia. Debido a la resistencia documentada de los agentes de TSE a la
mayora de los procedimientos de inactivacin, la obtencin controlada de materiales es el criterio ms importante para lograr
una seguridad aceptable del producto.
Siempre que sea posible, los fabricantes deben identificar las etapas que terica o demostrativamente eliminen o inactiven
agentes durante la fabricacin del material. Los fabricantes deben continuar sus investigaciones sobre mtodos de eliminacin
e inactivacin para identificar etapas/procesos que ayuden a asegurar la eliminacin o inactivacin de agentes de TSE. Los fa-
bricantes deben disear procesos de produccin usando mtodos disponibles que presenten la mayor probabilidad de inacti-
var o eliminar agentes de TSE. Por ejemplo, la exposicin prolongada de tejidos a calor hmedo alto y pH elevado inactiva al
850 (1024) Suero Bovino/ Informacin General USP 39

agente de BSE. No obstante, dichos tratamientos son inapropiados para la extraccin de muchos otros tipos de artculos bovi-
nos tales como el suero, debido a que estos tratamientos conllevan a la destruccin del material. Los procedimientos conven-
cionales qumicos y bioqumicos de extraccin y aislamiento pueden ser suficientes para eliminar al agente infeccioso. Tcnicas
similares pueden ser efectivas para otros artculos bovinos. La investigacin adicional ayudar a desarrollar una comprensin de
la metodologa ms apropiada para los estudios de validacin. Las cuestiones a considerar durante la validacin de un proceso
para eliminar los agentes de TSE incluyen lo siguiente:
La naturaleza del material contaminado intencionalmente (spiked material) y su relevancia para la situacin natural
Diseo del estudio (incluyendo metodologas de reduccin de escala de los procesos)
Mtodo para detectar al agente (ensayos in vitro o in vivo) despus de la contaminacin intencional y despus del trata-
miento
Caracterizacin y estandarizacin de materiales de referencia para la contaminacin intencional
Tratamiento y anlisis de datos (ver Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas (111 ))
Debido a que ningn estudio ha validado con xito mtodos analticos para la deteccin de pequeas cantidades del agente
de TSE, los estudios de validacin para depuracin de TSE por lo general emplean la inyeccin intracraneal de material en pro-
ceso en roedores para la amplificacin y deteccin de infectividad residual potencial.

ANLISIS Y CONTROL DE AGENTES ADVENTICIOS

Introduccin

Los procedimientos de anlisis rigurosos, las guas estrictas de procesamiento y produccin, y las evaluaciones de riesgos
apropiadas ayudan a asegurar la seguridad de los diferentes tipos de suero bovino. Esta seccin analiza pruebas especficas que
pueden detectar y controlar agentes adventicios.

Anlisis de Agentes Adventicios

Los anlisis de agentes adventicios requeridos para la evaluacin de siembras maestras, clulas maestras y productos brutos y
finales se describen en el Ttulo 9 del CFR 113.53 y en las directivas de la Agencia Europea para la Evaluacin de Productos
Medicinales (EMEA, por sus siglas en ingls) (EMEA/CVMP/743/00 y EMEA/CPMP/BWP/1793/02). Los mtodos de anlisis se-
alados en estos documentos pueden detectar una amplia gama de agentes microbianos bovinos en productos de suero. Estos
mtodos de anlisis cumplen con los requisitos de la mayora de las agencias reguladoras mundiales. Los fabricantes de suero
deben analizar una muestra representativa de cada lote de suero para determinar la presencia de agentes adventicios. El anli-
sis se realiza despus de la filtracin pero antes de cualquier procesamiento destinado a inactivar o eliminar virus.
La filtracin con filtros con un tamao de poro de 100 nm (O, 1 m) es un mtodo aceptado de eliminacin de micoplasmas,
mientras que la radiacin gamma(> 25 kGy cuando est congelado) y los tratamientos qumicos (p.ej. con betapropiolactona)
son mtodos aceptados de inactivacin de virus y micoplasmas; los fabricantes de suero usan rutinariamente estas herramien-
tas en las instalaciones de produccin y anlisis. Estos tratamientos no eliminan anticuerpos que puedan interferir con algunas
aplicaciones. Adems, los tratamientos no aseguran la eliminacin ni la inactivacin total de virus, pero pueden reducir signifi-
cativamente el riesgo de actividad viral. La serie de anlisis para determinar la ausencia de agentes adventicios en el suero bovi-
no generalmente incluye lo siguiente:
Anlisis de esterilidad bacteriana y fngica, segn se describe en el Ttulo 9 del CFR 113.26
Anlisis de micoplasmas segn se describe en el Ttulo 9 del CFR 11 3.28
Anlisis viral segn se describe en el Ttulo 9 del CFR 113.53
Los procedimientos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) confirman la ausencia de infeccin bacteriana y fngica. En lo que
respecta a virus, nicamente el cultivo usando clulas sustrato adecuadas puede indicar infectividad y replicacin viral. Aque-
llos que usan suero para investigacin o produccin deben analizar el suero para demostrar la ausencia de agentes adventicios
de una manera que sea congruente con la aplicacin prevista del producto, teniendo en cuenta que el anlisis nicamente
indica la presencia o ausencia de agentes adventicios dentro de los lmites de los procedimientos de anlisis usados.

Anlisis de Micoplasmas

La contaminacin con micoplasmas en el cultivo de tejidos puede surgir de muchas fuentes de origen animal, incluido el
suero, pero resulta con mayor regularidad de la contaminacin cruzada de cultivos infectados. Los micoplasmas son contami-
nantes particularmente insidiosos en el cultivo celular debido a que
no pueden visualizarse mediante microscopia de luz incluso a alta densidad (> 107 unidades formadoras de colonias/mL);
no ocasionan cambios observables de turbidez o pH del fluido de cultivo;
no se pueden eliminar rutinariamente mediante filtros de esterilizacin individuales, aunque se puede lograr la eliminacin
a travs de una serie de tres filtros de O, 1 m;
los antibiticos tradicionales que se usan en el cultivo celular no los afectan; y
provocan una variedad extremadamente amplia de efectos adversos en el cultivo de tejidos.
USP 39 Informacin General/ (1024) Suero Bovino 851

El captulo Pruebas para Micoplasmas (63) describe la deteccin clsica de micoplasmas.

Adems de estos mtodos, los procedimientos de deteccin ms recientes incluyen los ensayos luminiscente y de reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls). El captulo Tcnicas Basadas en cidos Nucleicos-Amplificacin
(1127) describe los principios generales de los ensayos de PCR. El ensayo sensible luminiscente de 20 minutos mide una activi-
dad enzimtica especfica de molicutes que convierte el difasfato de adenosina a trifasfato de adenosina mediante una reac-
cin de luciferasa/luciferina. Los resultados son inequvocos y semicuantitativos. Los mtodos de PCR son rpidos y sensibles y
su funcionamiento es bastante fiable, aunque los resultados falsos positivos ocasionales representan una preocupacin en lo
que respecta a laboratorios de servicios de anlisis comerciales. La PCR puede detectar fragmentos de ADN micoplasmticos
no infecciosos.

Anlisis Viral

Los procedimientos de anlisis viral para productos de suero se citan en el Ttulo 9 del CFR 11 3.52 y en el Ttulo 9 del CFR
113.53. Adems, existen otros documentos que pueden incluir anlisis equivalentes o pertinentes, como por ejemplo EMEA/
CVMP/743/00-Rev.2 del Comit para Productos Medicinales Veterinarios (Committee far Veterinary Medicinal Products o
CVMP) Gua Revisada de Requisitos y Controles Aplicados al Suero Bovino Usado en la Produccin de Productos Medicinales Veterina-
rios Inmunolgicos (Revised Guideline on Requirements and Controls Applied to Bovine Serum Used in the Production of lmmunologi-
cal Veterinary Medicinal Products) y EMEA/CPMP/BWP/1793/02 del Comit para Productos Medicinales de Patente (Committee
far Proprietary Medicinal Products o CPMP) Guas sobre el Uso de Suero Bovino en la Fabricacin de Productos Medicinales Biolgi-
cos de Uso Humanos (Note far Guidance on the Use of Bovine Serum in the Manufacture of Human Biological Medicinal Pro-
ducts). Los fabricantes de suero deben realizar anlisis de virus que cumplan con esta reglamentacin, usando por lo menos
dos lneas de clulas detectoras diferentes y sensibles, de las cuales una debe ser de origen bovino. Las pruebas incluyen el
cultivo de clulas detectoras en medios de cultivo celular suplementados con el suero de prueba al 15% durante al menos 21
das. Las clulas se subcultivan por lo menos dos veces durante este periodo, generalmente a los 7 y 14 das posteriores a la
inoculacin. Una vez terminado el ltimo subcultivo (despus de un total de al menos 21 das de incubacin), las clulas se
examinan para detectar signos generales de amplificacin del virus. Los siguientes puntos finales se usan para la deteccin ge-
neral de virus: examen microscpico celular para agentes citopatognicos tales como el virus de la rinotraqueitis bovina infec-
ciosa, tincin celular y examen microscpico para cuerpos de inclusin, y prueba de hemadsorcin para detectar agentes he-
madsorbentes tales como Pl-3. Adems de esta serie de anlisis y al finalizar el ltimo subcultivo (despus de un total de al
menos 21 das de incubacin), las clulas se tien con anticuerpos especficos fluorescentes contra los siguientes agentes vira-
les especficos:
BVDV
Parvovirus bovino
Adenovirus bovino
Virus de la lengua azul
Virus respiratorio sincicial bovino
Reovirus
Virus de la rabia
Adems de los virus listados anteriormente, otros virus pueden ser agentes causantes de enfermedades y que requieren de
anlisis en diversas aplicaciones del suero bovino. El usuario final del suero es el responsable de determinar si el anlisis com-
pleto del Ttulo 9 del CFR es suficiente y si se deben analizar otros agentes virales especficos. Ejemplos de virus especficos no
cubiertos por la gua de anlisis viral vigente pueden incluir akabane, virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1 ), virus de la parain-
fluenza tipo 3 (Pl-3), leucemia bovina, rotavirus bovino, circovirus bovino, poliomavirus bovino, coronavirus, torovirus, entero-
virus bovino, astrovirus bovino, virus de fiebre aftosa (VFA) y peste bovina. El Apndice 2 proporciona una descripcin general
de estos virus, as como de aquellos para los que se requiere de anlisis. El anlisis de riesgos extensivo por parte del usuario
final del suero debe determinar el alcance del anlisis y las opciones para el tratamiento del suero.

Estrategias de Evaluacin y Deteccin de Riesgos

Los fabricantes de suero y los usuarios finales de suero deben llevar a cabo evaluaciones integrales de riesgos basadas en
datos cientficos (p.ej. anlisis de modos y efectos de falla) a fin de comprender de mejor manera el perfil de seguridad del
producto del suero. Se pueden tomar en cuenta los siguientes elementos de evaluacin de riesgos, aunque es posible incluir
otros elementos segn sea apropiado: pas de origen, regin del pas, estado de enfermedad animal del pas/regin de origen,
edad del animal, proceso de recoleccin sangunea, mtodo de aturdimiento del animal y mtodo de desangrado, proceso de
fabricacin del suero, tipo de sistema de calidad de produccin, controles de produccin durante el proceso, anlisis del pro-
ducto final, inactivacin del virus, segregacin del equipo, procedimiento de limpieza del equipo, capacitacin del personal,
uso/aplicacin del suero, tipo de producto farmacutico y uso previsto.
La barrera de especies proporciona un grado de proteccin en contra de infecciones por algunos agentes etiolgicos anima-
les. Esta barrera no es una alternativa para asegurar de manera proactiva que los productos farmacuticos se fabriquen nica-
mente a partir de materias primas de origen animal que presentan niveles indetectables de agentes adventicios. La inoculacin
de organismos viables en especies no anfitrionas conlleva el riesgo de que los organismos puedan cruzar la barrera de especies.
852 (1024) Suero Bovino/ Informacin General USP 39

Por lo tanto, un rgimen apropiado de anlisis del material del suero debe incluir exmenes para determinar la presencia de
contaminantes potenciales relacionados con la especie de origen y la especie objetivo. Los tratamientos del suero para inactivar
agentes virales son un factor para establecer el rgimen de anlisis adecuado para un material en particular. El nivel de riesgo
ms bajo de contaminacin se relaciona con materiales biolgicos que se esterilizan de manera terminal.
Un nivel de riesgo igual a cero es imposible e irrazonable. Los fabricantes de suero deben describir completamente los reg-
menes de anlisis especficos en las especificaciones del producto, los cuales variarn dependiendo del tipo y origen del suero.
Por tanto, las pautas de deteccin descritas en este captulo nicamente son ejemplificativas y es posible que no se requiera de
la deteccin de todos los virus citados para un material en particular. Algunos fabricantes pueden realizar ciertas pruebas sobre
el producto terminado o los materiales en proceso en lugar de realizarlas sobre los componentes individuales. Los fabricantes
tambin deben evaluar el efecto de dilucin en relacin con el lmite de deteccin del procedimiento de anlisis. La interferen-
cia con el crecimiento o neutralizacin de actividad viral por parte del suero puede ser indicativo de un anticuerpo especfico o
de ciertos factores inespecficos de enmascaramiento del agente viral por parte del suero. Se recomienda que los fabricantes de
suero consideren esta posibilidad al momento de determinar un nivel adecuado de tratamiento en sus estudios de inactivacin
viral o aplicaciones de anlisis viral.
Los fabricantes de suero deben confirmar que la especie de origen es bovina para asegurar la ausencia de otros agentes no
bovinos. Los fabricantes deben realizar anlisis de virus extraos en cultivos celulares apropiados (ver Mtodos de Pruebas Viro-
lgicas (1237) para seleccionar adecuadamente las lneas celulares, dependiendo del ensayo y del agente buscado). Si fuera
necesario, se deben realizar estudios de seroconversin en especies animales susceptibles al virus, usando una respuesta inmu-
ne mediada por anticuerpos en la especie anfitriona como mtodo de deteccin. Los estudios deben usar este procedimiento
despus de una etapa de inactivacin para detectar si el virus estaba presente antes del proceso de inactivacin viral.
Los procesos de fabricacin de suero deben realizarse de manera congruente, siguiendo los procedimientos de fabricacin
establecidos, con sistemas de calidad adecuados incorporados al proceso de produccin. Adems, la segregacin de equipo
(por especies de origen), los procedimientos de limpieza de equipo e instalaciones, y la capacitacin de personal son elemen-
tos importantes en la evaluacin de riesgos del proceso.

Consideraciones de Seguridad

Los usuarios finales de suero bovino de donante pueden requerir que el suero no presente anticuerpos detectables contra el
VDVB u otros agentes especficos, de modo que los usuarios puedan propagar cultivos celulares usados en la produccin de
vacunas, en el anlisis de diagnstico, y en la preparacin de kits de pruebas, especialmente para el mantenimiento de reservas
de clulas maestras y de siembra. Se encuentran disponibles ms de 40 tipos de clulas para la produccin de productos biol-
gicos veterinarios, pero menos de 1 O tipos de medios para su propagacin. Algunos investigadores han propuesto medios
exentos de suero como alternativa para propagar ciertas clulas y virus; sin embargo, esto significa adaptar los procedimientos
de cultivo, lo que puede alterar las clulas y cambiar los resultados de produccin. Si se importan sueros nuevos o diferentes a
EE.UU., los usuarios finales del suero requerirn confirmacin de origen, especies y documentacin de origen de los sueros en
pases libres de FA y peste bovina.

Cambio en la redaccin:

CARACTERIZACIN DE SUERO BOVINO

Introduccin

Ante la ausencia de requisitos especficos del producto final, se debe analizar cada lote de FBS para confirmar que el suero
cumpla con los requisitos del captulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
(90). Esta seccin describe diversos procedimientos claves de caracterizacin para todos los dems tipos de suero. Estos proce-
dimientos no son obligatorios pero representan guas que los fabricantes pueden considerar para sus aplicaciones individuales.
La tabla de la seccin Hemoglobina presenta ejemplos de especificaciones para los diversos tipos de suero bovino.

Identificacin de Especies

El suero bovino debe someterse a ensayos de identificacin tanto inter como intraespecies para confirmar la identidad de la
especie y la integridad de los productos del suero, as como para asegurar que no se encuentren presentes agentes no bovinos.
El ensayo ms comnmente usado para la identificacin de la especie bovina se basa en el perfil electrofortico de protenas
especficas del suero. Con la electroforesis, las protenas del suero por lo general se separan hasta en seis fracciones: albmina,
alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gamma globulinas.
Otros procedimientos usados para la determinacin de especies bovinas incluyen la inmunodifusin radial (IDR) y el mtodo
de difusin doble de Ouchterlony. Estos procedimientos permiten mediciones cualitativas o cuantitativas de los niveles de in-
munoglobulina G en el suero. El mtodo por IDR se basa en la difusin de un antgeno desde un pocillo circular en un gel
homogneo que contiene un antisuero especfico para cada antgeno en particular. Se forma un crculo de antgeno y anti-
cuerpo precipitados y contina creciendo hasta que alcanza el equilibrio. Los dimetros de los anillos son una funcin de con-
USP 39 Informacin General/ (1024) Suero Bovino 853

centracin de antgeno. El mtodo de Ouchterlony es una prueba de difusin doble en gel en la que el antgeno y el anticuer-
po difunden uno hacia el otro en un medio semislido hasta un punto en el medio en el que se alcanza una concentracin
ptima de cada uno, formando un precipitado. Las placas de Ouchterlony contienen pocillos cilndricos-un pocillo de antge-
no central de 8 mm de dimetro, rodeado por seis pocillos de antisuero de 3 mm-que posibilitan el monitoreo simultneo de
mltiples sistemas de antgeno-anticuerpo y la identificacin de antgenos particulares en una preparacin. El captulo general
propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) describe el procedimiento aceptado.

Hemoglobina

La hemoglobina es una protena de subunidades mltiples que forma una unin inestable y reversible con el oxgeno en los
eritrocitos. La forma cargada de oxgeno se denomina oxihemoglobina y es de color rojo brillante. La forma que no est carga-
da de oxgeno se denomina desoxihemoglobina y es de color azul prpura. La oxihemoglobina es la forma predominante en
los eritrocitos.
El bajo contenido de hemoglobina en los sueros es ampliamente aceptado como una buena indicacin general de procesa-
miento rpido y cuidadoso de la sangre que se usar para el suero. Los eritrocitos son frgiles y se rompen fcilmente, liberan-
do hemoglobina en el suero. La manipulacin brusca de la sangre recolectada, el pobre control de temperatura o los retrasos
en el procesamiento elevan el contenido de hemoglobina en el suero. Los niveles aceptables de hemoglobina pueden variar
dependiendo de la aplicacin prevista. Los niveles de hemoglobina se miden usando procedimientos espectrofotomtricos
(ver llllllllllRlllll~-llllllBllilll> segn se describe en el captulo general propuesto Suero Fetal Bovi-
no-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90).

Suero de Suero Suero de

Ternero de Bovino Bovino
FBS Recin Nacido Suero de Ternero Donante Adulto
Prueba de Esterilidad No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta
crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento
Micoplasmas No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Anlisis de virus No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Hemoglobina (mg/dl) <30 <30 <30 <30 <30
Protenas totales (q/dl) 3,0-4,5 3,5-6,0 5,0-8,0 5,0-8,0 6,0-10,0
pH 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00
Osmolalidad (mOsmol/Kg) 280-360 240-340 240-340 240-340 240-340

Perfil Qumico

El anlisis de componentes tales como colesterol, alfa globulina, beta globulina, gamma globulina, albmina, creatinina, bili-
rubina, glucosa, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, fsforo, potasio, calcio y sodio por lo general no se con-
sidera un criterio para liberacin del lote de suero bovino. Algunos fabricantes no realizan anlisis de manera rutinaria sino ni-
camente como anlisis auxiliares. En algunas ocasiones, los laboratorios clnicos hospitalarios pueden llevar a cabo los anlisis.
Los niveles de estas sustancias qumicas en el suero son importantes para los usuarios finales y se pueden usar tambin para
evaluar la variabilidad de lote a lote.

Niveles de Endotoxinas

Aunque los niveles altos de endotoxina no son adecuados para aplicaciones que involucren inyectables, los niveles acepta-
bles en suero bovino varan dependiendo de la aplicacin prevista. Algunos fabricantes pueden pasar por alto la importancia
de los niveles bajos de endotoxinas en el suero bovino usado en aplicaciones de cultivo celular. Las endotoxinas influyen en
ms de 30 actividades biolgicas, algunas de las cuales incluyen activacin de macrfagos, estimulacin mitognica y la induc-
cin de interferones y de factor estimulante de colonias (para algunas aplicaciones, estas pueden ser actividades positivas). Las
endotoxinas tambin pueden conllevar a citoxicidad al iniciar la activacin del complemento. Los mtodos ms comnmente
usados para la deteccin de endotoxinas son el procedimiento semicuantitativo de coagulacin con lisado de amebocitos de
Limulus y el mtodo cromognico cintico cuantitativo descritos en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Tanto para el ensa-
yo de coagulacin como el ensayo cromognico cintico, un ensayo vlido de endotoxinas requiere de tratamiento apropiado
por calor o dilucin a fin de evitar efectos adversos de sustancias interferentes en el suero. Los investigadores deben incluir un
control de producto positivo en cada ensayo para confirmar que se ha superado cualquier interferencia por el tratamiento por
calor o dilucin.
854 (1024) Suero Bovino / Informacin General USP 39

Osmolalidad

La prueba de osmolalidad est diseada para evaluar la concentracin de electrolitos en el suero bovino. Las sustancias qu-
micas que afectan la osmolalidad del suero incluyen sodio, cloruro, bicarbonato, potasio, protenas y glucosa. Los fabricantes
de suero deben medir la osmolalidad de cada partida de suero para verificar el cumplimiento con las especificaciones del pro-
ducto, usando equipos calibrados con estndares rastreables al Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (National lnstitu-
te of Standards and Technology). El captulo Osmolalidad y Osmolaridad (785) describe la forma en que se determina la osmo-
lalidad mediante disminucin del punto de congelamiento de la solucin de suero bovino. Los cientficos emplean por lo me-
nos dos estndares para calibrar el instrumento. La osmolalidad de cada muestra se calcula y relaciona con el contenido de
agua del suero y se expresa en mOsmol/kg H2 0.

Nivel de Protenas Totales

El nivel de protenas totales en el suero se mide para verificar la edad del animal y el cumplimiento con las especificaciones
del producto. El captulo Artculos Obtenidos por Biotecnologa-Valoracin de Protenas Totales (1057) describe dos procedi-
mientos, los mtodos de Biuret y de Bradford, para determinar la concentracin de protena. El usuario final debe evaluar el
nivel aceptable de protena en el suero basndose en la aplicacin prevista.

Propiedades de Crecimiento Celular

Se debe analizar la capacidad de cada lote de suero para sustentar el crecimiento in vitro de lneas celulares especficas. Los
sueros bovinos son muy variables por lo que lotes distintos pueden producir resultados diferentes. Debido a esta variabilidad,
los usuarios finales deben caracterizar y estandarizar las lneas celulares que usarn para este tipo de anlisis. Los usuarios fina-
les deben disear procedimientos de crecimiento celular que les ayuden a verificar la eficacia del suero bovino en la promocin
del crecimiento celular. Los fabricantes de suero se beneficiarn del monitoreo de la promocin de crecimiento celular durante
varias generaciones de subcultivos para detectar cualquier evidencia de citoxicidad o cambios en la morfologa celular. Los fa-
bricantes de suero usan distintos tipos de clulas, y los estudios de crecimiento y las lneas celulares usadas por los fabricantes
de suero tambin pueden variar de aquellos aplicados por los usuarios finales del suero. Al evaluar las propiedades de creci-
miento de una lnea celular especfica en respuesta a un lote especfico de suero, los fabricantes de suero deben tomar en
cuenta la eficiencia del plaqueo y/o la promocin de crecimiento o algunas otras pruebas de funcionalidad que califiquen al
lote de suero para su uso previsto.
La eficiencia del plaqueo a baja densidad celular es un mtodo preferido para analizar la capacidad de proliferacin y la su-
pervivencia de clulas individuales en condiciones ptimas de crecimiento. Este procedimiento puede revelar diferencias en la
velocidad de crecimiento dentro de la poblacin y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tama-
o de las colonias) y la supervivencia de las clulas (nmero de las colonias). La cintica del crecimiento es otro aspecto impor-
tante en el diseo de experimentos celulares. Determinar la curva de crecimiento de cada lnea celular ayuda a definir condi-
ciones de cultivo ptimas, debido a que la variacin en el suero y otros aditivos de crecimiento pueden tener influencia sobre
los parmetros de crecimiento, lo cual puede afectar el resultado del experimento.
Ante la ausencia de pruebas especficas diseadas para sus productos particulares, los usuarios del suero pueden referirse a
las pruebas de funcionalidad descritas en el captulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de
Funcionalidad (90) para determinar si un lote de suero es adecuado para sus aplicaciones. Este captulo proporciona guas sobre
cmo realizar las pruebas de promocin de crecimiento y de eficiencia del plaqueo.

Citotoxicidad In Vitro

Los fabricantes de suero deben usar una lnea celular apropiada para analizar cada lote de suero y deben realizar estudios de
crecimiento a travs de varias generaciones subcultivadas para asegurar que el suero no tenga efectos citotxicos sobre las c-
lulas. La eleccin de una lnea celular depende del uso previsto del suero. Los ensayos de crecimiento celular y de citotoxicidad
deben realizarse en el lote final de suero despus de cualquier etapa de inactivacin viral o de cualquier procesamiento adicio-
nal.

CONCLUSIN
Es probable que el suero bovino se mantenga como un componente importante en la fabricacin de muchos productos bio-
lgicos, en particular de aquellos que dependen del cultivo celular. Al igual que otros materiales similares, la calidad del suero
bovino es intrnsecamente variable. Por consiguiente, los usuarios finales del suero deben establecer pruebas, procedimientos y
criterios de aceptacin adecuados para la introduccin de materiales en el proceso de una aplicacin particular que utilice sue-
ro. Lo anterior puede requerir el anlisis de mltiples lotes de suero bovino para determinar aquellos lotes que cumplen con la
especificacin (ver la seccin Caracterizacin de Suero Bovino).
USP 39 Informacin General/ (1024) Suero Bovino 855

Los fabricantes de productos teraputicos que usan suero bovino son responsables de asegurar y documentar su calidad, as
como el impacto sobre la calidad, seguridad y eficacia del producto final. Adems, es importante asegurar que el desempeo
de cada lote de suero sea equivalente durante la fabricacin. El suero tambin puede interferir con la purificacin del producto
final; por lo tanto, es importante comprender el efecto del suero bovino sobre el proceso de fabricacin a fin de entender el
efecto que pueden tener varios procesos sobre el producto final. Por ltimo, es posible disminuir los riesgos a travs del diseo
de procesos que incluyan etapas que eliminen adecuadamente el material bovino mediante dilucin, separacin o inactiva-
cin, as como el desarrollo de ensayos analticos para evaluar el contenido residual del material bovino durante los procesos y
en el producto teraputico final. Diversos ensayos sensibles pueden proporcionar un medio cuantitativo para detectar el mate-
rial bovino en niveles de picogramos.

Combio en lo redaccin:

APNDICE

Apndice 1: Referencias Reglamentarias Pertinentes

El suero bovino y los productos relacionados con el suero usados en la fabricacin de productos biolgicos se encuentran
reglamentados en el contexto de Requisitos para Ingredientes de Origen Animal Usados en la Produccin de Productos Biolgicos
(Requirements far lngredients of Animal Origin Used far the Production of Biologics), Ttulo 9 del CFR 113.53. En la actualidad,
cada fabricante de suero realiza estudios de deteccin para identificar virus contaminantes. Debido a la potencial comercializa-
cin internacional del suero, los fabricantes de suero necesitan tener en cuenta otros requisitos reglamentarios. Los fabricantes
pueden usar los documentos listados en este captulo como gua para la determinacin de contaminacin por agentes adventi-
cios en sueros bovinos. Debido al riesgo que conllevan los productos de suero derivado de animales, los fabricantes de suero y
los usuarios finales deben asegurar que el pas de origen del material cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables. Aun-
que en la actualidad ningn ensayo de desempeo celular demuestra la ausencia de BSE en el suero, los fabricantes de suero
deben cumplir con los requisitos reglamentarios de los pases donde el suero se obtiene y comercializa a fin de asegurar un
riesgo mnimo de infeccin por BSE/TSE.
Ms all de los captulos de USP pertinentes referidos en este captulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios
as como las mejores prcticas para el desarrollo, fabricacin, control de calidad y garanta de calidad del producto y los proce-
sos.
CFR
Ttulo 9 del CFR 94.18 (CVB, 2001)
Ttulo 9 del CFR 113.46
Ttulo 9 del CFR 113.47
Ttulo 9 del CFR 113.52
Ttulo 9 del CFR 113.53
Ttulo 9 del CFR 113.55
Ttulo 9 del CFR 320
Ttulo 9 del CFR 327.4
Ttulo 21 del CFR 211 Subparte E
Ttulo 21 del CFR 801.1
Ttulo 21 del CFR 809.1 O
FDA
FDA. Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). 2000. Letter to manufacturers of biological products (Carta a
los fabricantes de productos biolgicos). Disponible en http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/
ucml 05877.htm
Use of materials derived from cattle in medicinal products intended for use in humans and drugs intended for use in rumi-
nants (Uso de materiales derivados de ganado bovino en productos medicinales destinados para uso en humanos y medi-
camentos destinados para uso en animales rumiantes) (Regla propuesta). Federal Register (Registro Federal). 2007; 72(8):
1582-1619. Disponible en http://www.reginfo.gov/public/
Reglamentos Internacionales y Documentos Gua
CPMP/Biotechnology Working Party/EMEA (CPMP/BWP/EMEA). 1996. Note far guidance on virus validation studies (Nota
de orientacin sobre estudios de validacin de virus): the design, contribution and interpretation of studies validating the inacti-
vation and removal of virus es (diseo, contribucin e interpretacin de estudios para validar la inactivacin y eliminacin de
virus). Disponible en http://www.ema.europa;eu/docs/enc....GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/
WC500003684.pdfe ERR(01-Qct-W15)
CPMP/BWP/EMEA. 2003. Note far guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal pro-
ducts (Nota de orientacin sobre el uso de suero bovino en la fabricacin de productos medicina/es biolgicos para uso huma-
no). Disponible en http://www.ema.europa.eu/doc$/en_GB/document_libracy/Scientific_guideline/2009/
WC500003675.pdt. ERR(01-QCt2015)
856 (1024) Suero Bovino/ Informacin General USP 39

EMEA/CVMP/743/00-Rev.2 del Committee for Veterinary Medicinal Products (Comit para Productos Medicinales Veteri-
narios o CVMP). Revised guideline on requirements and contro/s applied to bovine serum used in the production of immunologi-
cal veterinary medicinal products (Gua revisada sobre requisitos y controles aplicados al suero bovino usado en la produccin de
::.lll'.1111111
productos medicina/es inmunolgicos para uso veterinario). Disponible en-'.''' "~::,: : :. ::; '.~:::.
1111111111-1111111111_ _ _ _ __
lllllliBfdl
CPMP/CVMP. Note far guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents va human
and veterinary medicinal products (Nota de orientacin sobre la minimizacin del riesgo de transmisin de agentes de encefalo-
pata espongiforme animal mediante productos medicina/es para uso humano y veterinario). Disponible en -
llrlJllllllllllJlllllilllllll1IUlllll_l_ _. . . . . . . _ . . . . . _. .li
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Organizacin Mundial de Sanidad Animal. Cdigo sanitario para los animales 1
~~1111~111m111111111111~1-11111mr11111111-
OMS. 2006. WHO guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible spongiform encephalopathies (Guas de la OMS
sobre la distribucin tisular de la infectividad de encefalopatas espongiformes transmisibles). http://www.who.int/bloodpro-
ducts/cs/TSEPUBLISHEDREPORT.pdf

Apndice 2: Virus a Considerar en el Anlisis de Suero Bovino

A continuacin se presenta una descripcin general de los virus que los fabricantes pueden considerar al determinar la au-
sencia de agentes adventicios en suero bovino. La lista se proporciona nicamente para propsitos de informacin general. La
lista de anlisis requeridos se proporciona en este captulo en la seccin Anlisis Viral.
Akabane-Virus transmitido por insectos que ocasiona anormalidades congnitas del sistema nervioso central de animales
rumiantes. La enfermedad debida al virus de Akabane ha sido reconocida en Australia, Israel, Japn y Corea. Se han encontrado
anticuerpos contra este virus en varios pases en el Sureste Asitico, el Medio Oriente y frica. La enfermedad afecta a los fetos
de ganado bovino, ovejas y cabras. Se ha demostrado serolgicamente la infeccin asintomtica en caballos, bfalos y vena-
dos (aunque no en humanos ni cerdos) en reas endmicas.
Lengua Azul-Enfermedad viral infecciosa no contagiosa transmitida por artrpodos que afecta principalmente a animales
rumiantes domsticos y salvajes. La infeccin por el virus de la lengua azul es comn a nivel mundial pero por lo general es
subclnica o moderada. El virus de la lengua azul corresponde a la especie tipo del gnero Orbivirus de la familia Reoviridae. Se
han identificado 24 serotipos a nivel mundial, aunque no todos los serotipos existen en una sola rea geogrfica: p.ej., se han
reportado nicamente 5 serotipos (2, 1 O, 11, 13 y 17) en los EE.UU. La distribucin a nivel mundial es anloga a la distribucin
espacial y temporal de las especies vector de los jejenes Culicoides, que representan el nico transmisor natural significativo del
virus.
Adenovirus bovino-Se relaciona con un amplio espectro de enfermedades. El adenovirus bovino tipo 3 es el serotipo ms
comnmente asociado con la enfermedad respiratoria bovina. Los adenovirus bovinos son virus de ADN que se han separado
en dos gneros: el Mastadenovirus o adenovirus mamfero y el Aviadenovirus o adenovirus aviar. El gnero Mastadenovirus com-
prende numerosos serotipos especficos de especie, de los cuales se han identificado nueve en el ganado bovino. Tambin se
han podido aislar adenovirus epiteliotrpicos de animales rumiantes que por lo general son clnicamente inaparentes. La enfer-
medad clnica est dictada por varios factores que incluyen la cepa del virus, la infeccin concurrente, el estrs, las condiciones
ambientales y las prcticas de manejo.
Virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1 )-Se relaciona con diversas enfermedades en el ganado bovino entre las que se
incluyen la rinotraqueitis infecciosa bovina, vulvovaginitis pustular infecciosa, balanopostitis, conjuntivitis, aborto, encefalomie-
litis y mastitis. Las infecciones por VHB-1 estn muy extendidas en la poblacin de ganado bovino. La forma respiratoria es la
ms comn en el ganado bovino de engorde a corral.
Leucemia bovina-Oncovirus exgeno tipo C de la familia Retroviridae. La leucemia bovina es una enfermedad viral del
ganado bovino adulto que se caracteriza por la neoplasia de linfocitos y nodos linfticos. La infeccin ocurre por la transferen-
cia iatrognica de linfocitos infectados seguida por una respuesta de anticuerpos permanente. Aunque la prevalencia de la in-
feccin en una manada puede ser elevada, slo unos pocos animales desarrollan linfosarcoma fatal. La infeccin se propaga
por el contacto con la sangre contaminada de un animal infectado.
Reovirus bovino-Virus de cido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) con viriones esfricos sin envoltura de 60-80 nm
de dimetro, los cuales ocasionan enfermedades respiratorias bovinas.
Virus respiratorio sincicial bovino (VRSB)-Virus de ARN clasificado como pneumovirus de la familia Paramixovirus. El
nombre del virus se deriva de su efecto citoptico caracterstico: la formacin de clulas sinciciales. Adems del ganado bovi-
no, las ovejas y cabras tambin pueden resultar infectadas por virus respiratorios sinciciales. El virus respiratorio sincicial huma-
no (VRSH) es un patgeno respiratorio importante en infantes y nios pequeos. El VRSH comprende subtipos antignicos y la
evidencia preliminar sugiere la existencia de subtipos antignicos de VRSB. El VRSB est distribuido por todo el mundo y es
autctono de la poblacin de ganado bovino. Las infecciones por VRSB relacionadas con enfermedades respiratorias ocurren
predominantemente en ganado bovino joven para produccin de carne y leche.
Rotavirus bovino-Virin esfrico de ARNdc de 60-80 nm de dimetro que carece de envoltura. Es la causa viral ms co-
mn de diarrea en terneros y corderos.
USP 39 Informacin General/ (1025) Pancreatina 857

Virus de la diarrea viral bovina (VDVB)-Virus de ARN clasificado como Pestivirus de la familia Flaviviridae. El BDVB puede
atravesar la placenta y parece ser es capaz de inducir la inmunosupresin, lo que permite el desarrollo de neumona bacteriana
secundaria. Se ha informado que el VDVB es el virus asociado con mayor frecuencia con mltiples infecciones virales del tracto
respiratorio en terneros.
Fiebre aftosa (FA)-Enfermedad viral altamente infecciosa del ganado bovino, cerdos, ovejas, cabras, bfalos y especies de
artiodctilos silvestres. En una poblacin susceptible, la morbilidad se acerca al 100%. La enfermedad slo es fatal en raras oca-
siones, excepto en animales jvenes. La FA es ocasionada por un Aftovirus de la familia Picornaviridae. Se conocen siete seroti-
pos inmunolgicamente distintos y dentro de cada serotipo existe un gran nmero de cepas que presentan un espectro de
caractersticas antignicas.
Virus de la parainfluenza tipo 3 (Pl-3)-Virus de ARN clasificado en la familia Paramixovirus. Aunque el Pl-3 es capaz de
ocasionar enfermedad, el virus por lo general se asocia con infecciones moderadas a subclnicas. El papel ms importante del
Pl-3 es actuar como un iniciador que puede llevar al desarrollo de neumona bacteriana secundaria. Las infecciones ocasiona-
das por Pl-3 son comunes en el ganado bovino.
Parvovirus-Virus de ADN de cadena simple relativamente estable al calor de aproximadamente 20 nm de dimetro que se
ha aislado del ganado bovino pero que en condiciones naturales se desconoce si ocasiona enfermedades.
Rabia-Encefalomielitis viral aguda que afecta principalmente a carnvoros y murcilagos, aunque puede afectar a cualquier
mamfero. La rabia es ocasionada por Lisavirus de la familia Rabdovirus. Aunque generalmente estn confinados a una especie
principal de reserva en un rea geogrfica, es comn la extensin a otras especies.
Peste bovina-Morbillivirus estrechamente relacionado con los virus que ocasionan moquillo canino y sarampin. Las cepas
pueden variar en gran medida en cuanto a la gama de huspedes y virulencia. El suero de ganado recuperado o vacunado
provoca una reaccin cruzada con todas las cepas en las pruebas de neutralizacin, aunque se han demostrado diferencias
antignicas menores. El virus es frgil y se inactiva rpidamente con calor y luz, pero permanece viable durante largos periodos
en tejidos enfriados o congelados. La peste bovina es endmica en muchos pases de Asia y frica. Histricamente, el virus se
ha distribuido en gran medida en Europa y frica, pero a la fecha no se ha establecido por s mismo en Norteamrica, Centroa-
mrica, las Islas del Caribe, Sudamrica, Australia ni Nueva Zelanda. La peste bovina se incluye en la lista de enfermedades
transmisibles de la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (Oficina Internacional de Epizootias) de la OMS que tienen un
potencial de propagacin muy rpida y seria, sin distincin de fronteras nacionales, que representan serias consecuencias so-
cioeconmicas o de salud pblica, y que son de alta importancia en el mercado internacional de ganado y productos ganade-
ros.

(1025) PANCREATINA

NDICE
1 . Introduccin
2. Recoleccin de Pncreas y Produccin de Pancreatina
3. Control de Calidad
4. Etiquetado
5. Certificacin y Documentacin
6. Anlisis y Control de Agentes Infecciosos Adventicios
6.1 Informacin General
6.2 Estrategias de Evaluacin de Riesgos
6.3 Pruebas de Identificacin para Panel de Virus Relevantes
6.4 Depuracin Viral por Etapas del Proceso de Fabricacin
6.5 Anlisis Viral
7. Caracterizacin de la Pancreatina
7.1 Descripcin de las Propiedades Fsico-Qumicas
7.2 Contenido Proteico y Enzimtico
7.2.1 Proteasas Pancreticas
7.2.2 Lipasa y Colipasa Pancretica
7.2.3 Fosfolipasa Pancretica A2
7.2.4 Amilasa Pancretica
8. Mediciones de la Actividad Enzimtica
8.1 Actividad de Lipasa
8.2 Actividad de Proteasa
8.3 Actividad de Amilasa
9. Apndice 1: Bibliografa Reglamentaria
1 O. Apndice 2: Bibliografa de Referencia
858 (1 025) Pancreatina / Informacin General USP 39

1. INTRODUCCIN
La pancreatina es una preparacin de enzimas pancreticas que contiene amilasa, proteasa y lipasa aislada de la glndula
pancretica del cerdo Sus scrofa L. var. domesticus Gray (Fam. Suidae). El pncreas es un rgano secretor que desempea un
papel crucial en el proceso digestivo mediante la produccin de bicarbonato para neutralizar el ambiente cido en el duodeno,
hormonas que regulan diversas funciones catablicas, y una variedad de enzimas digestivas para degradar los alimentos en el
intestino delgado. La pancreatina y los productos medicinales que contienen pancreatina se usan para facilitar la digestin y
absorcin de alimentos (carbohidratos, grasa y protenas) en pacientes con insuficiencia pancretica exocrina ocasionada por
fibrosis cstica, pancreatitis crnica y otras condiciones que pueden causar una deficiencia en la secrecin de enzimas pancre-
ticas.
Los productos de enzimas pancreticas de origen porcino se han comercializado en los Estados Unidos para el tratamiento
de la insuficiencia pancretica exocrina desde antes de la promulgacin de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cos-
mticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) de 1938. Las enzimas pancreticas suplementarias estn disponibles en medi-
camentos de venta con receta y de venta libre. Desde el 2004, la Administracin de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.
(FDA, por sus siglas en ingls) ha ordenado que todos los medicamentos de enzimas pancreticas comercializados en los
EE.UU. obtengan la aprobacin de dicha agencia mediante una Solicitud para Nuevo Medicamento (NDA, por sus siglas en
ingls). Aunque los medicamentos de enzimas pancreticas de venta libre estn disponibles sin receta mdica, estos se clasifi-
can como suplementos dietticos en lugar de medicamentos. La pancreatina y la pancreolipasa tienen funciones e indicaciones
similares; sin embargo, la pancreolipasa, que est disponible slo como medicamento de venta con receta mdica, contiene
ms enzima lipasa activa y extracto pancretico purificado que la pancreatina.
Este captulo describe las mejores prcticas relacionadas con la obtencin y fabricacin de materias primas de pancreatina
que se usan en los medicamentos de pancreatina y pancreolipasa; estas mejores prcticas ayudan a asegurar la seguridad y la
eficacia de los medicamentos preparados a partir de este ingrediente farmacutico activo. El Apndice 7: Bibliografa Reglamen-
taria provee una lista de documentos gua reglamentarios aplicables.

2. RECOLECCIN DE PNCREAS V PRODUCCIN DE PANCREATINA

La materia prima de origen animal (pncreas) destinada para procesamiento farmacutico es un subproducto de la produc-
cin de carne y se recolecta en mataderos aprobados por la autoridad nacional competente e inspeccionados por la autoridad
veterinaria pertinente. Los animales a partir de los que se deriva la pancreatina deben cumplir con los requisitos de salud ani-
mal adecuados para consumo humano.
Un ejemplo de un proceso de fabricacin tpico se resume en la descripcin y en el diagrama de flujo (Figura 7) a continua-
cin.
Las glndulas pancreticas deben mantenerse congeladas para prevenir una prdida de actividad enzimtica durante su con-
servacin y transporte. Despus de que el fabricante acepta los materiales congelados, la pancreatina se extrae y se purifica en
condiciones que reducen la carga microbiolgica y otras impurezas potenciales. Para lograr lo anterior, las glndulas pancreti-
cas se maceran hasta obtener una suspensin espesa fina, la cual se trata con activadores para convertir los precursores de
enzimas pancreticas inactivas (zimgenos) en enzimas activas. La activacin se lleva a cabo en condiciones controladas; los
factores tales como tiempo, temperatura, fuerza inica o concentracin se controlan segn lo definido en el proceso de cada
fabricante. Una vez que se ha completado la activacin, esta etapa se detiene agregando acetona, alcohol isoproplico u otros
disolventes compatibles con enzimas. Despus de separar la materia insoluble (cuando corresponda), la mezcla se combina
con disolvente para precipitar la pancreatina. El sobrenadante se separa y el residuo slido se lava con disolvente. Finalmente,
la pancreatina se seca a la temperatura y vaco adecuados. La actividad biolgica puede ajustarse y/o estabilizarse agregando
aditivos adecuados, tales como lactosa; sacarosa que contenga no ms de 3,25% de almidn; pancreatina con bajo poder di-
gestivo; celulosa microcristalina; maltodextrina; o cloruro de sodio.
USP 39 Informacin General/ (1025) Pancreatina 859

Glndulas pancreticas de origen porcino

_ _ Residuo insoluble
(desechado)

Pancreatina Seca (ingrediente farmacutico activo)

Figura 1. Diagrama de flujo que presenta las etapas del proceso de fabricacin de pancreatina.

3. CONTROL DE CALIDAD

Cada lote de pancreatina se somete a un anlisis de control de calidad apropiado. El anlisis de control de calidad debe con-
siderar los requisitos de la monografa correspondiente, as como otros parmetros de calidad identificados. Dichas pruebas
deben incluir apariencia, identificacin, pureza y actividad de la pancreatina. Se deben tener en cuenta las impurezas relacio-
nadas con el proceso y con el producto tales como los disolventes residuales de la extraccin y precipitacin, y la grasa.
El agua es crtica para la actividad y la estabilidad enzimtica, por ende, se debe especificar y monitorear el contenido de
agua usando mtodos analticos apropiados como prdida por secado (ver el captulo (731) Prdida por Secado). Las valoracio-
nes que determinan la actividad enzimtica se aplican para confirmar que la pancreatina cumple con los lmites predefinidos
para los niveles de actividad de lipasa, amilasa y proteasas, que se consideran atributos crticos de calidad.
Debido al origen biolgico de la pancreatina, el control de calidad incluye anlisis microbiano as como pruebas para deter-
minar la ausencia de algunos agentes adventicios patgenos para humanos.
860 (1 025) Pancreatina / Informacin General USP 39

4. ETIQUETADO
El producto debe etiquetarse de conformidad con los requisitos de la monografa y reglamentarios pero tambin de acuerdo
con los requisitos de los clientes cuando corresponda. La etiqueta contiene informacin tal como el nombre y la direccin del
fabricante, la fecha de fabricacin, la fecha de reanlisis, la fecha de caducidad, el nmero de lote, las condiciones de almace-
namiento y las precauciones especficas (p.ej., "proteger de la humedad"), y una declaracin que indique el uso previsto.

5. CERTIFICACIN Y DOCUMENTACIN
El producto debe estar acompaado por los certificados y la documentacin necesarios, cuando corresponda. La documen-
tacin debe incluir un certificado de anlisis u otro certificado que documente el cumplimiento con los requisitos de la mono-
grafa y los resultados de las pruebas de control de calidad; un certificado de origen indicando la especie animal; y certificacio-
nes con respecto a agentes adventicios, incluyendo, cuando corresponda, declaraciones sobre Encefalopata Espongiforme
Transmisible/Encefalopata Espongiforme Bovina. Asimismo, se debe incluir, cuando corresponda, otra informacin pertinente
y requerida, tal como la fecha de reanlisis o caducidad, almacenamiento y recomendaciones de envasado.
El fabricante/proveedor debe ser capaz de proveer documentacin para propsitos reglamentarios que contengan la si-
guiente informacin:
Informacin sobre el nmero de aprobacin/autorizacin de la agencia reglamentaria y la direccin completa del sitio de
fabricacin de la pancreatina.
Una declaracin que indique que las materias primas de origen animal destinadas para procesamiento farmacutico fue-
ron recolectadas y entregadas bajo la supervisin de las autoridades responsables/competentes.
Una lista de los pases de origen de las materias primas recolectadas.
Una declaracin que indique que, durante el transporte, las glndulas pancreticas pueden ser identificadas como subpro-
ductos animales para propsitos farmacuticos mediante documentacin apropiada de acuerdo con los reglamentos lega-
les correspondientes (tales como certificados de salud animal expedidos por veterinarios oficiales o documentacin tcni-
ca de comercio).
Una declaracin que indique que las glndulas pancreticas se recolectan en mataderos aprobados y que los animales de
los que se recolectaron las glndulas pancreticas fueron sometidos a una inspeccin en conformidad con la legislacin
vigente correspondiente y que se les declar adecuados para consumo humano, o que no se detectaron seales visibles
de enfermedades transmisibles a humanos o animales al momento de la matanza .

6. ANLISIS Y CONTROL DE AGENTES INFECCIOSOS ADVENTICIOS

6.1 Informacin General

Aunque no se han presentado informes que documenten enfermedades infecciosas despus del uso de productos medicina-
les derivados de pancreatina, existe un riesgo terico de transmisin de patgenos porcinos a partir de la pancreatina.
La seguridad de los productos de enzimas pancreticas de origen porcino debe mejorarse mediante la implementacin de
mltiples estrategias complementarias y/o superpuestas para el control, depuracin y contencin de agentes adventicios. Los
fabricantes deben emplear continuamente un mtodo basado en posibles riesgos para mejorar la seguridad de estos productos
con respecto a los agentes adventicios, el cual incluya incorporar evaluaciones de riesgos, mitigacin de riesgos y estrategias
de manejo de los materiales del proceso. Cuando resulte apropiado, se debe incluir un anlisis que garantice que los beneficios
teraputicos del producto son considerablemente mayores que los riesgos generados por su consumo, y simultneamente se
garantice la disponibilidad del medicamento para los pacientes.

6.2 Estrategias de Evaluacin de Riesgos

La Gua para la Industria: "Medicamentos para Insuficiencia Pancretica Excrina" (Guidance for lndustry: Exocrine Pancrea-
tic lnsufficiency Drug Products) de la FDA promueve un mtodo basado en riesgos para tratar el potencial de contaminacin
viral de los productos de enzimas pancreticas, de acuerdo con la ICH Q5A(Rl) y el captulo (1050) Evaluacin de la Seguridad
Viral de Productos Biotecnolgicos Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal. En general, el perfil de riesgos de
agentes adventicios de productos biolgicos est supeditado a una variedad de factores, entre los que se incluye el origen del
producto biolgico, el tipo de las materias primas usadas, los procesos de fabricacin y la va de administracin. Debido a que
los procesos de obtencin y de fabricacin pueden variar entre fabricantes, cada fabricante debe establecer e implementar una
evaluacin individual de riesgos completa para agentes adventicios.
Aunque el alcance de la ICH Q5A(Rl) abarca la evaluacin de la seguridad viral de productos biotecnolgicos derivados de
lneas celulares de origen humano y animal, los principios y los mtodos de evaluacin de riesgos pueden proveer los funda-
mentos para una estrategia de evaluacin de riesgos en los productos de pancreatina. A travs de la aplicacin de los princi-
pios de la ICH Q5A(Rl ), la estrategia de minimizacin de riesgos para proteger a los pacientes de la exposicin inadvertida a
agentes adventicios debe reflejar una combinacin de tres componentes:
 USP 39 Informacin General/ (1025) Pancreatina 861

1. Obtencin: Uso de procedimientos de obtencin cuidadosos para limitar el acceso de agentes adventicios al proceso de
fabricacin. Debido a que el material de la pancreatina es un subproducto de la industria de la carne, es importante ase-
gurar que el ingrediente farmacutico activo de pancreatina se produce nicamente a partir de animales adecuados para
consumo humano.
2. Depuracin: Incorporacin de etapas robustas de depuracin en el proceso de fabricacin. La eficacia de estas estrategias
depende de la resistencia de los agentes adventicios al tipo de inactivacin fsica y qumica usado.
3. Anlisis: El control y anlisis de agentes adventicios en etapas adecuadas del proceso de fabricacin para dar garanta de
que cualquier carga remanente de un agente adventicio potencialmente nocivo se encuentra en niveles suficientemente
bajos. Esto se logra usando ensayos de deteccin adecuados contra un panel de virus relevantes. En esta parte de la eva-
luacin de riesgos, se debe tener en cuenta el riesgo potencial para la salud humana que presentan los virus de origen
porcino.
Para identificar agentes adventicios potenciales que pudieran estar presentes en una preparacin de pancreatina, los fabri-
cantes deben identificar los agentes adventicios que estn presentes en el cerdo y evaluar la probabilidad de su presencia en
los materiales de partida y en el ingrediente farmacutico activo. Los captulos (61) Examen Microbiolgico de Productos No Est-
riles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especfi-
cos tratan el anlisis de contaminacin especfica microbiana, segn se define en las monografas pertinentes de productos re-
lacionados con pancreatina. Asimismo, los fabricantes deben evaluar especficamente la presencia potencial de virus porcinos.
En esta evaluacin se deben identificar las etapas de fabricacin que son capaces de eliminar o inactivar virus, y se debe de-
mostrar la eficiencia del proceso para eliminar y/o inactivar virus mediante estudios de validacin viral que sigan las guas co-
rrespondientes. Una vez que se ha establecido la lista de virus crticos potencialmente presentes en el material de partida y/o
en el ingrediente farmacutico activo, los fabricantes debern decidir cules sern las etapas apropiadas del proceso para reali-
zar el anlisis viral y establecer el nivel de anlisis viral que se va a realizar para cada lote. Se deben desarrollar y validar pruebas
para virus especficos, y se deben establecer y usar criterios de aceptacin para tomar decisiones de aceptacin/rechazo de
partidas del ingrediente farmacutico activo de pancreatina.
El potencial carcter zoontico o no zoontico del virus debe tenerse en cuenta al establecer criterios de aceptacin.

6.3 Pruebas de Identificacin para Panel de Virus Relevantes

La estrategia de evaluacin de riesgos descrita anteriormente requiere la identificacin de contaminantes virales potenciales
de los materiales de partida de origen porcino. La Tabla 1 provee una descripcin general de los virus envueltos y sin envoltura
que se conoce estn presentes en cerdos y que pueden presentar un riesgo de contaminacin al usar cerdos que se consideran
adecuados para consumo humano como fuente de materia prima. La evaluacin de riesgos debe tratar al menos los virus lista-
dos; sin embargo, dependiendo del origen de los animales y de la capacidad del proceso de fabricacin, la lista puede adaptar-
se y se pueden considerar virus adicionales (ver el ejemplo en la Figura 2). Los fabricantes deben implementar sistemas para
identificar la emergencia de nuevos virus potencialmente relevantes.
Tabla 1. Identificacin de Peligros: Virus Presentes en Cerdos
Virus con Envoltura Virus sin Envoltura
Virus de la fiebre porcina clsica Virus de la encefalomiocarditis (EMCV, por sus siglas en ingls)
Virus de la fiebre porcina africana (ASFV, por sus siglas en ingls) Virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV, por sus siglas en ingls)
Virus de la influenza Virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV, por sus siglas en ingls)
Virus del Nilo Occidental (WNV, por sus siglas en ingls) Reovirus (REO, por sus siglas en ingls)
Virus de estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en ingls) Virus de la hepatitis E porcina (swHEV, por sus siglas en ingls)
Virus de la encefalitis equina del este (EEEV, por sus siglas en ingls) Rotavirus porcinos (pRotaV, por sus siglas en ingls)
Virus de la rabia (RABV, por sus siglas en ingls) Enterovirus porcino (PEVs, por sus siglas en ingls)
Virus del sndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV, por sus
siglas en ingls) Parvovirus porcino (PPV, por sus siglas en ingls)
Virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV, por sus siglas en ingls) Circovirus porcino tipos 1 y 2 (PCV1 /2, por sus siglas en ingls)
Virus de la pseudo rabia (SuHV-1, por sus siglas en ingls)
Virus Nipah
Retrovirus endgeno porcino (PERV, por sus siglas en ingls)

6.4 Depuracin Viral por Etapas del Proceso de Fabricacin

Demostrar la depuracin viral es un componente crtico para asegurar la seguridad general de los productos derivados de
pancreatina. El objetivo de los estudios de evaluacin de depuracin viral no es nicamente evaluar la capacidad del proceso
de fabricacin para depurar contaminantes virales conocidos y estimar cuantitativamente el nivel general de reduccin de virus
por parte del proceso de fabricacin, sino tambin estimar la capacidad de las etapas del proceso de fabricacin para depurar
virus en general. Los estudios de depuracin viral para el proceso de fabricacin de pancreatina deben llevarse a cabo de
acuerdo con la gua correspondiente vigente, ICH QSA(Rl ).
862 (1 025) Pancreatina / Informacin General USP 39

Los procesos actuales de produccin de pancreatina se consideran efectivos para inactivar virus con envoltura, de acuerdo a
los resultados de los estudios de depuracin viral. Sin embargo, los virus sin envoltura son ms resistentes a la inactivacin
fsico-qumica, lo que genera una mayor variabilidad en su inactivacin. Los ejemplos de virus que se encuentran en la clasifica-
cin de alta resistencia viral al tratamiento y que presentan inactivacin moderada a limitada, incluyen el parvovirus porcino y
el circovirus porcino 1/2 (ver la Figura 2).

Evaluacin de riesgos: ~ REO,

Probabilidad de EMCV,
Virus presentes) ocurrencia debida al Virus con SVDV, PPV,
.. en origen geogrfico, envoltura PEVs, PCV112
teJdos porcino materiales de obtencin, pRotaV,
etc. swHEV

Evaluacin de riesgos:
Resistencia viral a la
inactivadn fisicoqumica

Capacidad de inactivacin del proceso

de fabricacin individual

EMCV,
PPV,
Virus con SVDV,
PCV112
envoltura PEVs,
pRotaV,
swHEV
Ver ICHQ5A(R1 l para la descripcin de los niveles de resistencia.

Figura 2. Ejemplo de un mtodo de evaluacin de riesgos para la identificacin de virus para el panel de prueba.

6.5 Anlisis Viral

Se requiere una estrategia de anlisis cuando no ha sido demostrada la capacidad del proceso para eliminar o inactivar un
virus especfico a niveles apropiados. El potencial carcter zoontico o no zoontico del virus debe tenerse en cuenta al esta-
blecer criterios de aceptacin, en trminos de la sensibilidad del ensayo y del establecimiento de lmites de especificacin. Se
debern rechazar las partidas de ingrediente farmacutico activo que den positivo en las pruebas de virus zoonticos. Como
parte del control de calidad, el anlisis viral debe realizarse en cada lote de ingrediente farmacutico activo. Las pruebas usadas
deben permitir la exclusin de cualquier carga de niveles potencialmente nocivos de agentes adventicios. El Ttulo 9 del Cdi-
go de Reglamentos Federales describe los requisitos que se deben cumplir en la valoracin de productos biolgicos porcinos
incluyendo vacunas de virus vivos y productos de anticuerpos, aunque no trata especficamente la pancreatina. La aplicacin
de los principios del Ttulo 9 del Cdigo de Reglamentos Federales, ensayos para detectar virus porcinos, pueden, por ejemplo,
basarse en el monitoreo de cultivo celular con respecto a efectos citopatgenos durante un tiempo de incubacin apropiado,
anlisis de hemoadsorcin, tcnicas de tincin para virus especficos u otras combinaciones de los mismos (ver tambin el cap-
tulo (1237) Mtodos de Pruebas Virolgicas). Adems de las tecnologas y virus tratados en el Ttulo 9 del Cdigo de Reglamen-
tos Federales, se pueden usar nuevas tecnologas basadas en biologa molecular, y adems otros virus con potencial zoontico
que sean identificados pueden requerir de anlisis. Los ejemplos de virus especficos no tratados por la gua vigente para el
anlisis de virus puede incluir el virus de la hepatitis E porcina.
El fabricante debe justificar la eleccin del panel de virus relevantes, la seleccin de la etapa del proceso apropiada, la apti-
tud del mtodo de prueba y la sensibilidad del mtodo de prueba. Todas las pruebas para virus especficos deben desarrollarse
y validarse de acuerdo con las guas vigentes, por ejemplo, los captulos (1225) Validacin de Procedimientos Farmacopeicos y
(1033) Validacin de Valoraciones Biolgicas, segn corresponda, y se deben establecer y usar criterios de aceptacin para to-
mar decisiones de aceptacin o rechazo de partidas del ingrediente farmacutico activo de pancreatina.

7. CARACTERIZACIN DE LA PANCREATINA

7.1 Descripcin de las Propiedades Fsico-Qumicas

La pancreatina es un polvo amorfo de color ligeramente marrn a bronceado con un olor y sabor a carne cruda. La pancrea-
tina es parcialmente soluble en agua, forma una solucin ligeramente turbia y es insoluble en alcohol y ter. Los siguientes
compuestos pueden degradar la pancreatina: cidos minerales, hidrxidos lcali, agentes de oxidacin y muchas sales metli-
cas; adicionalmente la degradacin de la pancreatina es favorecida por temperatura y humedad elevadas. Las soluciones que
contienen pancreatina deben ser filtradas con precaucin, debido a la potencial retencin de la lipasa y las proteasas en el
filtro. La actividad enzimtica alcanza un mximo en soluciones neutras a dbilmente alcalinas. La actividad disminuye rpida-
mente en soluciones cidas o alcalinas fuertes. Lo mismo se aplica al calentamiento a ebullicin de las soluciones acuosas que
USP 39 Informacin General/ (1 025) Pancreatina 863

contienen pancreatina. En formulaciones sin recubrimiento entrico, no se recomienda exponer el producto a un pH de 4,5 o
menos, debido a que se ha observado la prdida casi total de actividad lipoltica.
Debido a que la pancreatina es de origen biolgico, se encuentran presentes otros componentes adems de las protenas
enzimticamente activas. Estos otros componentes incluyen protenas, aminocidos, pptidos, cidos nucleicos y fragmentos
de los mismos, componentes de tejidos, grasa y sustancias inorgnicas. Estos componentes pueden tener un impacto sobre la
calidad del material final.

7.2 Contenido Proteico y Enzimtico

La pancreatina contiene diferentes enzimas digestivas que en su mayora son producidas y almacenadas como zimgenos
(precursores inactivos) en las clulas pancreticas acinares. En condiciones fisiolgicas, los zimgenos pancreticos se transfor-
man en enzimas activas una vez que la secrecin pancretica alcanza el intestino delgado superior. Una proteasa intestinal, la
enteroquinasa, desencadena el proceso de activacin mediante la escisin del zimgeno de tripsina, el cual seguidamente acti-
va a las otras proteasas. Durante el proceso de produccin, las enzimas presentes en la pancreatina son activadas por la tripsina
(ver la Figura 1).
La Tabla 2 resume algunas de las caractersticas importantes de las enzimas pancreticas principales encontradas en la pan-
creatina.
Tabla 2. Caractersticas de las Enzimas Conocidas Presentes en la Pancreatina Porcina
UniProtKB/
Swlss-Prot Producidos Peso Longitud de
Nmero Aumento de como un Molecular la Punto
Nombre E.C. Nmero Sustratos Precursor (kDa) Secuencia lsoelctrlco
23,8 (zimge- 231 a.a. (zim-
no), 23,5 (acti- geno), 223 a.a. 9,3 (zimgeno),
Tripsina 3.4.21.4 P00761.l Protenas S vado) (activado) 10,5 (activado)
29, 1 (zimge- 268 a.a. (zim-
no), 25,6 (acti- geno), 221 a.a.
Quimotripsina 3.4.21.1 GlARD6_plG Protenas S vado) (activado) 8,7
250 a.a. (zim-
geno), 240 a.a.
Elastasa 3.4.21.36 P00772.1 Protenas S 25,9 (activado) (activado) 8,5
Carboxipeptida- 308 a.a.
sa Al 3.4.17.1 P09954 Protenas S 34,7 (activado) (activado) Desconocido
Carboxipeptida- 305 a.a.
sa B 3.4.17.2 P09955.5 Protenas S 34,7 (activado) (activado) 6,0
246 a.a. (zim-
Calicrena, glan- geno), 239 a.a.
dular 3.4.21.35 P00752.4 Protenas S 25-28 kDa (activado) 4,2-4,3
50, 1 (dos isofor-
mas de glicosi-
Triacilglicerol Triglicridos, ladn, 450 a.a. 4,9 (lipasa A),
lipasa 3.1.1.3 P00591.2 diclicridos No lipasas A y B) (madura) 5,0 (lipasa B)
Sin actividad en- 10,3 (procolipa-
zimtica, cofac- sa A porcina), 93 a.a. (procoli-
tor de lipasa 1O,1 (procoli- pasa A), 95 a.a.
Colipasa P02703.3 pancretica S pasa B porcina) (procolipasa B) Desconocido
14,7 (zimge- 146 a.a. (zim-
no), 14 (activa- geno), 123 a.a.
Fosfolipasa A2 3.1.1.4 P00592 Fosfolpidos S do) (activado) 4,4-4,5
Colesterol
este rasa, Valores carentes
tambin deno- de uniformidad
minada ster steres de coles- en la literatura
carboxlico terol, steres de que van de 65
lipasa (ECL), s- vitamina, mo- a 98 kDa.
ter carboxlico noglicridos, Aunque se han
hidrolasa (ECH) Secuencia com- fosfolpidos, ga- identificado Composicin
o lipasa estimu- pleta de ami- lactolpidos, formas proteo- completa de
lada por nocido algo de activi- lticas, an aminocido
sales biliares an desconoci- dad en triglic- se desconoce el an desconoci-
(LESB) 3.1.1.13, 3.1.1 .1 da en cerdos ricios No peso exacto. da en cerdos 4,2-4,8
5,95 (amilasa 1),
496 a.a. 5,45 (amilasa
a-Amilasa 3.2.1.1 P00690.3 Polisacridos No 55,3 (maduro) 11)
864 (1025) Pancreatina / Informacin General USP 39

7.2.1 PROTEASAS PANCRETICAS

Las proteasas son enzimas que digieren protenas en fragmentos de pptidos ms pequeos y aminocidos mediante la hi-
drlisis de los enlaces peptdicos. La pancreatina contiene cinco proteasas principales: tripsina, elastasa, quimotripsina, carboxi-
peptidasa A 1 y carboxipeptidasa B. La tripsina, la quimotripsina y la elastasa se clasifican como endopeptidasas y serina protea-
sas debido a que escinden los enlaces peptdicos en el lado e-terminal de un amino cido y tienen en sus sitios activos un
residuo de serina catalticamente importante. Las carboxipeptidasas catalizan la hidrlisis de los aminocidos de la posicin del
extremo e-terminal en polipptidos y, por lo tanto, se clasifican como exopeptidasas. Las carboxipeptidasas liberan secuencial-
mente residuos del e-terminal de protenas y pptidos con una especificidad bien definida.
La tripsina acta especficamente en el lado e-terminal de los residuos de aminocidos con carga positiva, especficamente
lisina y arginina. El tripsingeno es secretado por el pncreas como un precursor inactivo y se descarga dentro del duodeno
donde la enteroquinasa convierte el tripsingeno en tripsina activa. La enteroquinasa es secretada en el duodeno por clulas
de la mucosa duodenal. La enteroquinasa elimina un octapptido terminal del tripsingeno y genera una cadena de polippti-
do de tripsina activa entrecruzada por seis puentes disulfuro. La tripsina contiene un sitio de unin de calcio de alta afinidad
requerido para la estabilidad de la enzima.
La quimotripsina acta preferentemente en el lado e-terminal de los residuos de tirosina, fenilalanina y triptfano. Se secreta
como un zimgeno inactivo, quimotripsingeno, que es sometido a procesamiento protelico por la tripsina para formar la
enzima activa. La quimotripsina une un in de calcio por molcula.
La elastasa acta sobre residuos pequeos de aminocidos neutros tales como glicina y alanina, aunque tambin hidroliza
amidas y steres y se distingue porque acta sobre la elastina. La elastasa es producida como un zimgeno y la forma activada
contiene cuatro puentes disulfuro. La elastasa une un in de calcio por molcula.
La carboxipeptidasa A 1 es una exopeptidasa que hidroliza el enlace peptdico adyacente al extremo e-terminal de una cade-
na de polipptido, liberando as el aminocido e-terminal. Escinde residuos aromticos y voluminosos de aminocido aliftico
y presenta una actividad baja o nula con residuos de aminocido de cido asprtico, cido glutmico, arginina, lisina y prolina.
Contiene un in de cinc por molcula. El in de cinc es esencial para la actividad; si se elimina durante la dilisis, debe ser
reemplazado. Por lo tanto, la carboxipeptidasa A 1 tambin se clasifica como una metaloproteasa.
La carboxipeptidasa B cataliza la hidrlisis de los aminocidos bsicos lisina, arginina y ornitina del extremo e-terminal de
una cadena polipeptdica. Tambin puede tener una funcin en la degradacin adicional de productos de digestin trptica. La
enzima une un in de cinc por molcula, que es una parte funcional necesaria para la actividad de la enzima, y, por lo tanto, la
carboxipeptidasa B tambin se clasifica como una metaloproteasa.

7.2.2 LIPASA Y COLIPASA PANCRETICA

La lipasa pancretica (LP, tambin conocida como triacilglicerol acil hidrolasa) es una glicoprotena y es producida directa-
mente como una enzima activa por el pncreas. Dos isoformas de glicosilacin de la LP, la lipasa A y la lipasa B, estn presen-
tes en la pancreatina. Estas dos isoformas tienen composiciones idnticas de aminocidos pero difieren ligeramente en sus pa-
trones de glicosilacin, con lipasa A siendo ms cida que la lipasa B. La LP es una enzima soluble en agua que acta sobre los
sustratos lpidos insolubles, triglicridos, en la interfase de lpido-agua. Su actividad depende de la superficie especfica del sus-
trato accesible a la enzima, y se incrementa con el estado de emulsificacin de los lpidos. La LP hidroliza preferencialmente
enlaces ster en las posiciones C-1 y C-3 de triglicridos y presenta un espectro amplio de especificidad de longitud de cadena
de cido graso. Por lo tanto, la LP se muestra activa contra una amplia variedad de los triglicridos que por lo general estn
presentes en la dieta. Asimismo, acta sobre los diglicridos, pero su actividad sobre los monoglicridos es muy baja. Principal-
mente convierte los triglicridos en monoglicridos y cidos grasos libres; los productos de liplisis de mayor polaridad se ab-
sorben en el intestino delgado. En presencia de diversos amffilos tales como sales biliares a concentraciones micelares, la ab-
sorcin de la LP en la interfase de lpido-agua puede verse obstruida, lo que reduce la actividad lipoltica.
Un pequeo cofactor proteico tambin producido por el pncreas, la colipasa, ayuda a la LP a anclarse a interfases ante la
presencia de amffilos competitivos, restaurando as la actividad de la LP. La colipasa tambin es producida por el pncreas
como un precursor, la procolipasa. La procolipasa es activada por la tripsina.

7.2.3 FOSFOLIPASA PANCRETICA A2

La fosfolipasa A2 (tambin conocida como PLA2 secretora tipo IB) es una enzima termoestable soluble en agua que cataliza
la hidrlisis dependiente de calcio de los grupos 2-acilo en 3-sn-fosfoglicridos. Se produce como un precursor, que es activa-
do por la tripsina.

7.2.4 AMILASA PANCRETICA

La a-amilasa pancretica porcina (glucanohidrolasa 1,4-a-o-glucano) cataliza la hidrlisis de los enlaces glucosdicos 1,4-a-D
internos en polisacridos que contienen tres o ms unidades de o-glucosa con enlace a-1,4 para generar una mezcla de dextri-
nas, maltosa y glucosa. La amilasa existe en dos formas (1 y 11) que tienen propiedades enzimticas similares pero que difieren
USP 39 Informacin General/ (1025) Pancreatina 865

en sus puntos isoelctricos. Ambas formas moleculares de amilasa son glicoprotenas que contienen fucosa, galactosa, manosa
y diversos contenidos de glucosamina. Ambas amilasas constan de una sola cadena polipeptdica con cuatro puentes disulfuro
y contienen un in de calcio fuertemente enlazado.

8. MEDICIONES DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Aunque la pancreatina contiene una variedad de enzimas, por lo regular se caracteriza midiendo las actividades de las tres
clases de enzimas principales, lipasa, proteasa y amilasa.

8.1 Actividad de Lipasa

La actividad de lipasa de la pancreatina sobre los triglicridos con cidos grasos de cadena larga se debe principalmente a Ja
LP, lo que requiere Ja presencia de su cofactor especfico, Ja colipasa, para actuar sobre emulsiones de triglicridos en presencia
de sales biliares que son competidoras para la adsorcin de lipasa en la superficie de las gotitas de lpidos. La colipasa y la
lipasa forman un complejo activo con una estequiometra 1 a 1 . Las preparaciones comerciales de pancreatina por lo regular
contienen colipasa; sin embargo, se recomienda verificar que el proceso de fabricacin del ingrediente farmacutico activo
provee suficiente colipasa para la actividad de lipasa. Este control debe ser parte de una caracterizacin apropiada que se debe
realizar durante Ja validacin del proceso del ingrediente farmacutico activo.
Adems de la LP, la pancreatina tambin contiene carboxil ster lipasa (CEL) pancretica, que hidroliza diversos sustratos
lipidicos. La actividad de la CEL sobre los triglicridos se considera generalmente muy baja, en comparacin con la de la LP, y
su contribucin con Ja actividad de la lipasa de la pancreatina es inapreciable, segn se mide usando la valoracin de actividad
de lipasa USP.
La valoracin de actividad de lipasa descrita en la monografa USP de Pancreatina se basa en la determinacin de la veloci-
dad con que Ja enzima digiere al aceite de oliva emulsificado con acacia (tambin conocida como goma arbiga)'. La actividad
de la muestra de prueba se calcula comparndola con una preparacin estndar de la enzima con actividad conocida. El aceite
de oliva contiene triglicridos con cidos grasos de cadena larga que son representativos de los triglicridos dietticos. La acti-
vidad de lipasa se mide basndose en Ja valoracin volumtrica de Jos cidos grasos libres liberados del aceite de oliva por Ja
liplisis producida por la lipasa presente en Ja pancreatina. Esta valoracin volumtrica usando hidrxido de sodio se realiza a
un pH constante de 9,0 mediante valoracin volumtrica de pH o potencioesttica, en la que Jos cidos grasos de cadena larga
se ionizan completamente. Vale Ja pena notar que este valor de pH no corresponde a las condiciones fisiolgicas (el pH medio
del contenido del intestino delgado es cercano a 6,0 durante una comida), pero permite medir la actividad ptima de lipasa in
vitro. Debido a que la solucin de la valoracin de lipasa USP contiene ER Sales Biliares USP, la deteccin de Ja actividad enzi-
mtica requiere que tanto Ja Jipasa como la colipasa estn presentes en la pancreatina. Una Unidad USP de Ji pasa se define
como la cantidad de enzima que, en las condiciones definidas con el sustrato definido, libera 1 mol de cido graso por minu-
to.
Se encuentran disponibles otras valoraciones de lipasa para monitorear la actividad de lipasa en la pancreatina. Al usar valo-
raciones de lipasa con sustratos no naturales, tales como tributirina, se recomienda confirmar que la muestra de pancreatina
analizada tambin sea activa sobre los triglicridos de cadena larga, en particular usando la valoracin de actividad de Ji pasa
USP con emulsin de aceite de oliva-acacia.

8.2 Actividad de Proteasa

La actividad proteoltica de la pancreatina sobre Jos polipptidos y las protenas es inherente a las enzimas tripsina, quimo-
tripsina, elastasa, carboxipeptidasa A1 y carboxipeptidasa B. Las dos proteasas pancreticas principales son la tri psi na y la qui-
motripsina, y junto con Ja elastasa, estas endopeptidasas generan pequeos polipptidos a partir de protenas ms grandes. La
accin adicional de las exopeptidasas carboxipeptidasa A1 y B genera aminocidos individuales durante Ja digestin.
La valoracin espectrofotomtrica USP para la actividad de proteasa a partir de pancreatina se basa en la velocidad de diges-
tin de casena en las condiciones de Ja prueba. La actividad de la muestra de prueba se calcula comparndola con una prepa-
racin estndar de la enzima con actividad conocida. La casena est compuesta por a (sl) y a (s2)-casenas, j3 -casena y K-
casena, las cuales se fosforilan en los residuos de serina y carecen de puentes disulfuro. La conformacinde la casena es similar
a la de las protenas globulares desnaturalizadas con poca o sin estructura terciaria .. Se recomienda a los usuarios evaluar a los
proveedores de sustrato de casena con respecto a Ja consistencia de la dispersin.
La hidrlisis de casena por parte de las proteasas pancreticas genera aminocidos individuales y pptidos pequeos, y su
liberacin puede cuantificarse midiendo su absorcin a 280 nm. Antes de esta medicin, se deben separar las protenas no
hidrolizadas y los pptidos grandes mediante una precipitacin selectiva con cido tricloroactico, seguida de filtracin. Poste-
riormente, el filtrado se usa para la valoracin espectrofotomtrica de Ja actividad de proteasa, usando tirosina como calibra-
dor. Una Unidad USP de actividad de proteasa est contenida en Ja cantidad de pancreatina que hidroliza Ja casena a una
velocidad inicial de modo que la cantidad de pptidos liberados por minuto y que no sean precipitados por el cido tricloroa-
ctico provea la misma absorbancia a 280 nm que 15 nmol de tirosina.
866 <1025) Pancreatina / Informacin General USP 39

Se encuentran disponibles otras valoraciones para monitorear la actividad de proteasas individuales y totales en pancreatina,
y las asignaciones de unidades son especficas para cada sustrato. El ster etlico de N-acetil-L-tirosina se usa comnmente en
las valoraciones volumtricas y espectrofotomtricas (A= 237 nm) de actividad de quimotripsina. De manera similar, el ster
etlico de N-benzoil-L-arginina se usa comnmente en las valoraciones volumtricas y espectrofotomtricas (A= 253 nm) de la
actividad de tripsina. En ambos casos, la valoracin volumtrica se basa en la hidrlisis de enlaces ster por proteasas y la libe-
racin de grupos cidos, mientras que la valoracin espectrofotomtrica se basa en las propiedades cromognicas de estos ci-
dos. El ster metlico de tolueno-sulfonil-L-arginina es otro sustrato cromognico (A= 247 nm) que se usa para medir la activi-
dad de tripsina. Sin embargo, estos sustratos no son protenas y las valoraciones implican la escisin de un enlace de ster
carboxlico en lugar de un enlace peptdico.
Se han desarrollado otras valoraciones que usan pptidos cromognicos como sustratos para mejorar la especificidad y la
sensibilidad. Asimismo, se han desarrollado valoraciones de proteasa ms especficas y sensibles usando sustratos de pptidos
sintticos cortos (de 3-5 residuos de aminocidos) con un grupo cromognico (4-nitroanilina) acoplado al extremo e-terminal
mediante un enlace amida. El grupo cromognico es eliminado especficamente por proteasas y se mide fotomtricamente. El
cambio en la absorbancia a 405 nm es directamente proporcional a la actividad de proteasa. Los sustratos especficos estn
disponibles comercialmente para tripsina (acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida) y quimotripsina (clorhi-
drato de metil-O-succinoil-arginil-prolil-tirosina-4-nitril-anilida). La casena marcada con isotiocianato de fluorescena tambin
se usa como sustrato general para proteasa. La valoracin se basa en que la fluorescencia de la fluorescena es disminuida
cuando est unida a la casena. Cuando las proteasas digieren a la casena marcada con isotiocianato de fluorescena en ppti-
dos ms pequeos, la fluorescencia a 530 nm (excitacin a 485 nm) se incrementa y se puede medir para determinar la activi-
dad de proteasa.

8.3 Actividad de Amilasa

La actividad glicoltica de la pancreatina se debe a las amilasas tipo a. Dichas enzimas catalizan la hidrlisis de los enlaces
internos a-1,4-glucano en polisacridos que contienen tres o ms unidades de o-glucosa con enlace a-1,4, lo que genera una
mezcla de maltosa y glucosa. Las dos isoformas principales (1 y 11) de amilasas porcinas tienen propiedades enzimticas idnti-
cas. En las ltimas dcadas, se han desarrollado varios mtodos para valorar la actividad de amilasa; muchos de estos se basan
en la deteccin de la hidrlisis de almidn, puesto que este polmero es el sustrato natural de amilasa. El almidn consta de
dos tipos de molculas, amilosa (por lo general 20%-30%) y amilopectina (por lo general 70%-80%). Ambos polmeros resul-
tan del ensamble de unidades de glucosa conectadas mediante enlaces de a-1,4-glucano; adems, en la amilopectina, 1 de
cada 20 residuos aproximadamente, tambin tiene un enlace a-(1---+6), lo que forma puntos de ramificacin.
La valoracin de actividad de amilasa USP en la monografa de Pancreatina se basa en la velocidad de digestin del almidn
por la enzima, y la actividad de la muestra de prueba se calcula comparndola con una preparacin estndar de enzima con
actividad conocida. El almidn es hidrolizado por la amilasa; los grupos reductores resultantes de la hidrlisis reaccionan con
yodo en solucin alcalina; y el yodo en exceso se valora con tiosulfato. Una Unidad USP de actividad de amilasa se define co-
mo la cantidad de pancreatina que descompone el almidn a una velocidad inicial tal que se hidrolizan O, 16 Eq de enlace
glicosdico por minuto en las condiciones de la valoracin.

APNDICE 1: BIBLIOGRAFA REGLAMENTARIA

Code of Federal Regulations, title 9 part 113 section 46. Detection of cytopathogenic and/or hemadsorbing agents. US
Government Printing Office; 2006. p. 640. Disponible en: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2006-title9-voll /pdf/
CFR-2006-title9-voll -chapl-subchapE.pdf
Code of Federal Regulations, title 9 part 113 section 47. Detection of extraneous viruses by the fluorescent antibody tech-
nique. US Government Printing Office; 2006. p. 640-641. Disponible en: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2006-ti-
tle9-voll /pdf/CFR-2006-title9-voll -chapl-subchapE.pdf
Code of Federal Regulations, title 9 part 113 section 53. Requirements far ingredients of animal origin used far produc-
tion of biologics. US Government Printing Office; 2006. p. 644-645. Disponible en: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/
CFR-2006-title9-vol 1/pdf/CFR-2006-title9-vol 1-chapl-su bchapE. pdf
EMEA. CHMP/BWP/398498/2005. Guideline on virus safety evaluation of biotechnological investigational medicinal pro-
ducts. 24 Jul 2008. p. 1-9. Disponible en: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/documenUibrary/Scientific_guideli-
ne/2009/09/WC500003795.pdf
EMEA. CHMP/EWP/9147/2008-corr*. Guideline on the clinical development of medicinal products far the treatment of
cystic fibrosis. 22 Oct 2009. p. 1-27. Disponible en: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/documenUibrary/Scienti-
fic_guideline/2009/l 2/WC500017055.pdf
FDA. Guidance far industry. Exocrine pancreatic insufficiency drug products-submitting NDAs, April 2006. Disponible
en: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/ucm071651.pdf
FDA. Guidance far industry. ICH Q7A: good manufacturing practice guidance far active pharmaceutical ingredients. Aug
2001. p. 1-52. Disponible en: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/ .. ./Guidances/ucm073497 .pdf
FDA. Guidance far industry. ICHQl O pharmaceutical quality system. Apr 2009. p. 1-19. Disponible en: http://
www.fda.gov/ downloads/Drugs/Guidances/ucmO 7 351 7. pdf
USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 867

ICH. ICH harmonised tripartite guideline. Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of hu-
man or animal origin Q5A (Rl ). 23 Sep 1999. p. 1-27. Disponible en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/
ICH_Products/Guidelines/Quality/Q5A_R 1 /Step4/Q5A_R l _ Guideline. pdf
Uniprot Consortium. Disponible en: www.uniprot.org

APNDICE 2: BIBLIOGRAFA DE REFERENCIA

Auld DS. Carboxypeptidase A. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes.
2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 812-821.
Auld DS. Carboxypeptidase A2. En: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzy-
mes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 821-851.
Avils FX, Vendrell J. Carboxypeptidase B. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic
enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 831-833.
Bieth JG. Pancreatic elastase. En: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes.
2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1504-1508.
Bieth JG. Pancreatic elastase 11. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic enzymes.
2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1508-1509.
Bieth JG. Pancreatic endopeptidase E. In: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, et al., editors. Handbook of proteolytic
enzymes. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1510-1511.
Borgstrom B. On the interactions between pancreatic lipase and colipase and the substrate, and the importance of bile
salts. j Lipid Res. l 975;16(6):411-417.
Grf L, et al. Chymotrypsin. En: Barrett AJ, Rawlings ND, Woessner JF, editors. Handbook of proteolytic enzymes. 2nd ed.
Amsterdam: Elsevier; 2004. p. 1495-1501.
Lowe ME. The triglyceride lipases of the pancreas. j Lipid Res. 2002;43(2):2007-2016.
Desnuelle P, Sjostrom H, Noren O, editors. En: Molecular and cellular basis of digestion. Amsterdam: Elsevier; 1986. p.
539.
Peschke GJ. Active components and galenic aspects of enzyme preparations. En: Lankisch PG, editor. Pancreatic enzymes
in health and disease. 1 st ed. Berln: Springer-Verlag:l 991. p. 55-64.
Verger R. Pancreatic lipase. En: Lipases. Borgstrom B, Borockman HL, editors. Amsterdam: Elsevier; 1984. p. 84-150. [re-
view]
Verger R, de Haas GH, Sarda L, Desnuelle P. Purification from porcine pancreas of two molecular species with lipase acti-
vity. Biochim Biophys Acta. l 969;188(2):272-282.

(1027) CITOMETRA DE FLUJO

INTRODUCCIN

La citometra de flujo es un mtodo analtico que desempea un papel crtico en la evaluacin cuantitativa y cualitativa de
poblaciones de clulas en muestras de pacientes y de productos celulares. La capacidad de la citometra de flujo se basa en su
aptitud para analizar de manera rpida y confiable mltiples atributos de clulas individuales dentro de poblaciones de clulas
heterogneas. A pesar del valor de los datos obtenidos mediante citometra de flujo, validar el mtodo presenta desafos-qui-
zs ms que para otros mtodos analticos-debido a los errores y artefactos derivados de mltiples fuentes.
Aunque los mtodos de la citometra de flujo tambin se pueden usar para clasificar y aislar clulas como parte del proceso
de fabricacin para productos biolgicos derivados de clulas y tejidos, el alcance de este captulo se limita al uso de la citome-
tra de flujo como mtodo analtico. Este captulo presenta los aspectos tcnicos del mtodo, incluyendo el instrumental, el
manejo y la tincin de muestras y el anlisis de datos. Las fuentes de error se consideran en el contexto de las caractersticas
tcnicas, y en consideraciones de control de calidad, garanta de calidad y normalizacin. Por ltimo, se presentan las aplica-
ciones actuales y principios de resolucin de problemas del ensayo. Para informacin adicional sobre los fundamentos y aspec-
tos prcticos de la citometra de flujo, ver la edicin vigente de Practica/ Flow Cytometry (Citometra de Flujo Prctica) (Shapiro,
2003).
La citometra de flujo se usa ampliamente en la caracterizacin de productos derivados de clulas y tejidos, aunque la mayo-
ra de los mtodos de ensayo an no han sido normalizados. Adems de los aspectos relacionados con la complejidad tcnica,
se presentan desafos para la normalizacin de los mtodos de citometra de flujo para clases o tipos especficos de productos
en relacin con la naturaleza heterognea de los mismos, incluso para aquellos con procesos de fabricacin y usos clnicos si-
milares. Es posible que las innovaciones vigentes y futuras relacionadas con los instrumentos, los reactivos analticos, los algo-
ritmos analticos y la automatizacin, mejoren las capacidades de la tecnologa, pero es poco probable que eliminen los desa-
fos (p.ej., valoracin biolgica, pruebas de identificacin y otras aplicaciones).
868 (1 027) Citometra de Flujo / Informacin General USP 39

PRINCIPIOS DE OPERACIN, MTODOS, CALIDAD V NORMALIZACIN

El proceso de citometra de flujo requiere que las clulas pasen por una fuente de luz fija que consiste en uno o ms lseres,
de manera que cada clula, individualmente, se pueda observar o se puedan analizar sus caractersticas tales como tamao,
granularidad y presencia de antgenos o molculas intracelulares o en la superficie de la membrana. Las clulas se suspenden
en un lquido en el que el movimiento se controla mediante el tamao y la configuracin de las conexiones de tubos, cmaras
y bombas especficas del instrumento de citometra de flujo. El patrn de las seales de luz producido a partir de la interaccin
de la luz lser con las clulas se captura mediante un sistema de deteccin, tambin especfico del instrumento, y las seales
detectadas se transforman en datos que se pueden analizar y combinar con datos de otras clulas en una muestra dada. Los
datos de una suspensin de clulas se pueden expresar posteriormente en formatos visuales uni, bi o tridimensionales, o en
formatos numricos, para caracterizar la muestra celular y sus subpoblaciones de manera cuantitativa y cualitativa.

Instrumental de Citometra de Flujo

A continuacin se describen los citmetros de flujo, los cuales incorporan elementos para el procesamiento de seales pti-
cas, electrnicas y de fluidos.

FLUIDOS

El sistema de fluidos mueve una mezcla a granel de clulas de manera que se forme una corriente de clulas individuales.
Dentro del citmetro de flujo, la suspensin de clulas individuales pasa a travs de una regin confinada en la que cada clula
es iluminada secuencialmente por una fuente de luz uniforme en el punto de observacin (punto de anlisis). La mayora de
los instrumentos emplean una cmara de flujo (celda de flujo) la cual, despus de que la muestra de clulas se introduce en la
punta de inyeccin de muestra, combina las clulas con fluido envolvente isotnico, usando un ensamble de boquilla cnica
diseado geomtricamente para producir un flujo laminar de fluido (Figura 1). La boquilla de salida de lquido por lo general
tiene un orificio de 50-250 m de dimetro, a travs del cual sale el fluido a una alta velocidad de flujo. Las presiones diferen-
ciales entre la corriente de la muestra de clulas (presin ms baja) y la corriente envolvente (presin ms alta) trasladan las
clulas/partculas en una corriente confinada. La corriente coaxial resultante dentro de una corriente es altamente eficiente y la
corriente de la muestra en el punto de observacin es, por lo general, ligeramente ms grande que las clulas o partculas
contenidas en el interior. Un fabricante emplea, por lo menos, una metodologa alternativa en la que la estrategia de corriente
coaxial se reemplaza mediante el uso de microcapilares para enfocar y dirigir las clulas. Posteriormente, se mide y analiza la
seal de luz desviada o emitida por la clula.
Punta de Inyeccin
de Muestra

Entradas de Fluido
Envolvente

Flujo Laminar

Punto de Observacin

Salida de Flujo

Figura 1. Diagrama esquemtico de una celda de flujo.

PTICA

Cuando las clulas se tien con colorantes fluorescentes o con reactivos con anticuerpos fluorescentes, la luz emitida por el
lser interacciona con el colorante fluorescente para producir una emisin estimulada que presenta ondas coherentes (parale-
las) de luz de longitud de onda, de fase y de polarizacin uniformes. Las seales de luz fluorescente generadas en la interac-
cin de la luz lser con las clulas se recolecta mediante un arreglo de detectores orientados en lnea directa y a 90 con res-
pecto al rayo lser que ingresa. Los lseres para citmetros de flujo ms comunes disponibles comercialmente (con longitudes
de onda correspondientes) son el lser de argn azul (488 nm), el lser de diodos rojos (635 nm) y el lser violeta (405 nm).
USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 869

PROCESAMIENTO DE SEALES ELECTRNICAS Y GENERACIN DE DATOS

Cuando una clula pasa a travs del sistema ptico de un citmetro de flujo, los patrones de dispersin de luz o fluorescen-
cia de cualquier fluorocromo sobre la clula o dentro de la misma son detectados por varios tipos de fotodetectores o tubos
fotomultiplicadores (PMT, por sus siglas en ingls) que transforman la informacin sobre las caractersticas de la clula en una
lectura computarizada. Cada clula analizada genera un evento en cada parmetro (dispersin frontal, dispersin lateral, fluo-
rescencia) para el cual se mide. La Figura 2 presenta un ejemplo de una configuracin tpica de un citmetro de flujo de dos
colores. Los diferentes tipos de clulas presentan conjuntos distintivos de seales en los diversos parmetros. Por ejemplo,
cuando la clula pasa a travs de un haz de luz, a la luz deflectada en direccin frontal (por lo regular aproximadamente 20
de la direccin frontal del lser) se denomina dispersin frontal y se recolecta usando un detector conocido como canal de
dispersin frontal (FSC, por sus siglas en ingls). La cantidad de deflexin en el FSC es proporcional al tamao de la clula. La
luz deflectada a un ngulo de 90 se conoce como dispersin lateral y se recolecta mediante el canal de dispersin lateral (SSC,
por sus siglas en ingls). Este proporciona una medida de la complejidad estructural de la clula provocada por grnulos, rugo-
sidad de la membrana o ncleo, los cuales se asocian con un SSC ms alto. La luz deflectada por otros PMT usando un filtro de
paso de banda especfico se recolecta mediante canales de fluorescencia especficos (FL 1 y FL2 en la Figura 2). Los pulsos elc-
tricos, que se originan de la luz detectada por los PMT, se procesan mediante una serie de amplificadores lineales y logartmi-
cos. La amplificacin logartmica a menudo se usa para medir la fluorescencia de las clulas. Las Figuras 3-7 presentan histo-
gramas para clulas teidas con anticuerpos conjugados con fluorocromos especficos (ver la Tabla 7). Los anticuerpos son es-
pecficos para algunos marcadores de grupos de diferenciacin (CD, por sus siglas en ingls) analizados en lnmunofenotipifica-
cin (ver ms adelante).

c~~J
'
Gii! 1: Al

ll~t- _lfl
:f: . . .i i l !

~
Rayo Lser
Celda de Flujo Detector del FSC

Figura 2. Citmetro de flujo tpico de 2 colores con detectores para FSC, SCC y fluorescencia.
Tabla 1. Fluorocromos Usados Comnmente en Citometra de Flujo
Excitacin
Tpica Pico de
Fluorocromo del Lser (nm) Emisin (nm)
Azul Cascada 375; 401 423
Azul Pacfico 403 455
Ficoeritrina-R (R-PE, por sus siglas en ingls) 480; 565 578
Conjugados PE-Cy5 480; 565; 650 670
Conjugados PE-Cy7 480; 565; 743 767
Rojo 613 (Rojo Texas) 480; 565 613
Clorofil Peridina (PerCP, por sus siglas en ingls) 490 675
Fluorescena (FITC) 495 519
Aloficocianina (APC) 650 660
Conjugados APC-Cy7 650; 755 767

La versatilidad de la citometra de flujo proviene de la capacidad de marcar con fluorescencia la superficie celular, el citoplas-
ma o el ncleo o productos de la clula. Los marcadores fluorescentes unidos a la clula se pueden excitar usando lseres para
emitir luz con longitudes de onda especficas y, posteriormente, esta luz se detecta y analiza de la manera descrita con anterio-
ridad. El tipo y la cantidad de fluorescencia detectada ofrece informacin cualitativa y cuantitativa sobre la clula.
Los fotodetectores convierten la luz en resultados analizables generando una pequea corriente cuyo voltaje tiene una am-
plitud proporcional a la cantidad de luz. El voltaje se amplifica y convierte en seales elctricas lo suficientemente grandes para
ser graficadas por la computadora de distintas maneras. De esta forma, el FSC, el SSC y los detectores fluorescentes recolectan
870 (1027) Citometra de Flujo / Informacin General USP 39

la luz y la convierten en seales elctricas que pueden ser analizadas por la computadora. De esta manera, las seales deriva-
das de cada fotodetector se pueden medir por su intensidad (baja a alta) y clasificarse en canales. Los canales se disponen de
manera continua de tal forma que una poblacin de clulas con muchas clulas grandes tendrn una gran cantidad de even-
tos en los canales ms altos, y una con muchas clulas pequeas tendr una gran cantidad de evento en los canales ms bajos.

ANLISIS DE DATOS

Los datos generados por el citmetro de flujo pueden representarse de diversas maneras, de las cuales la ms bsica es el
histograma de un slo parmetro (Figura 3), en el que los eventos con intensidades de luz similares (dispersin frontal, disper-
sin lateral o fluorescencia) se recolectan en canales y posteriormente se grafican. Esta grfica demuestra el nmero de clulas
con caractersticas pticas similares. La Figura 4 es un ejemplo de grficas que presentan dos parmetros de medicin, una en
el eje x y una en el eje y, y el recuento de clulas como una grfica de densidad (puntos) o mapa acotado. Los parmetros
podran ser el SSC, el FSC o la fluorescencia. Estos parmetros se pueden recolectar en un canal.

o
CXl

Positivo
UI O
.8 co
e:
Q)
:::J
u Negativo
Q) o
ex: '<:!"

o
C\J

Figura 3. Histograma de un slo parmetro que presenta la expresin del antgeno celular CD3 en una mezcla de clulas.

8 ~----~.~. . ~.~---~-~-=--=-=---~--~--~--~---~-~---~--~-~-----~--~----~-~
..
o
.-

o
o
00

8C\I

O+---------------------------.-'
o 200 400 600 800 1000
Altura del FSC
Figura 4. Grfica de puntos de dos variables de clulas presentadas por el FSC y el SSC.
USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 871

Una grfica de puntos presenta un punto para cada clula, mientras que las grficas de densidad y acotadas presentan un
mapa de calor o un mapa topogrfico lineal, respectivamente, basndose en el nmero relativo de clulas en cada canal. El
histograma de dispersin frontal y dispersin lateral es el mtodo ms comn para la identificacin de diferentes tipos de clu-
las hematopoyticas. La Figura 5 presenta una grfica acotada que es una representacin tridimensional del nmero relativo de
clulas en los diversos canales.
"<:!"
e>~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

T"""

C')
o
T"""

o
T""" C\l
o o
T"""

Figura 5. Grfica acotada de dos variables que presenta nmeros relativos de clulas presentes en cada canal que coexpresa
2 marcadores CD.

Cuando las clulas se tien con anticuerpos para epitopes diferentes que portan dos fluorocromos diferentes, los datos se
presentan como una grfica en la que los dos parmetros se grafican uno en funcin del otro. Se pueden establecer cursores
en cada eje para separar poblaciones positivas de poblaciones negativas para cada uno de los atributos. Esto resulta en una
representacin grfica de clulas que son positivas para ambos marcadores, negativas para ambos marcadores y positivas para
uno de los dos marcadores (Figura 6).

para 1 Marcador
.....,_
Poblacin P o s i t i v a - - - - . . . - - - - - - - - -..... Poblacin Positiva
2 Marcadores

Poblacin Negativa

Poblacin Positiva
para 1 Marcador

Figura 6. Presentacin esquemtica de un histograma de 2 parmetros.

El citmetro de flujo permite al usuario establecer lmites positivos y negativos para cada marcador. Los datos del citmetro
de flujo se recolectan en forma de lista, en la que cada seal electrnica de una clula respectiva se presenta en la secuencia en
la que se adquiri. Los archivos en modo de lista se pueden editar posteriormente para incluir o excluir algn evento. Una
872 (1027) Citometra de Flujo / Informacin General USP 39

ventaja bsica de la citometra de flujo es la capacidad para separar los datos correspondientes a las clulas de inters del fon-
do y clulas muertas (p.ej., partculas o desechos no celulares) cuando se trata de dispersiones frontales y laterales y clulas de
otras poblaciones. El usuario debe decidir que seales son precisamente resultantes de la luz relacionada con las clulas, dise-
ar ventanas electrnicas y ordenar a la computadora que considere positivos nicamente los eventos que caigan dentro de
dicha ventana. Las poblaciones celulares pueden variar ampliamente dependiendo de la fuente de tejido o de clulas y las ca-
ractersticas del citmetro de flujo usado. El uso de ventanas permite al usuario determinar las seales que se deben considerar
eventos reales, por lo que este proceso es de primordial importancia para normalizar los datos de la citometra de flujo (Figura
1).
Se puede usar una tcnica conocida como compensacin para separar superposiciones espectrales de fluorocromos con lon-
gitudes de onda similares. Para citmetros de flujo anlogos fabricados antes del final de la dcada de 1990, la compensacin
debe establecerse antes de la adquisicin de datos. En los instrumentos digitales modernos, la compensacin se puede estable-
cer ya sea antes o despus de la adquisicin de datos. El ajuste de compensacin puede ser ms un arte que una ciencia, mien-
tras que una gran parte de la literatura se ha enfocado en los mritos relativos de diversos mtodos para determinar la com-
pensacin correcta para tipos celulares o condiciones experimentales. El analista debe contar con conocimientos considerables
acerca del tipo celular en anlisis a fin de evitar errores en la fenotipificacin que puedan resultar del ajuste inadecuado de
compensacin.
El nmero de eventos contados debe ser adecuado para generar confianza estadstica en los resultados. El instrumento se
puede ajustar de manera que la recoleccin de datos se lleve a cabo hasta que se haya medido cierto nmero de eventos en
un canal. Esta caracterstica permite al operador variar la duracin o el nmero de eventos de la muestra de modo tal que se
generen datos estadsticamente confiables. De esta manera, una muestra que mide un evento poco comn analizar ms clu-
las totales que una muestra que mide un evento comn. El uso de archivos en forma de lista, los archivos de datos electrnicos
que representan a la mayora de los datos no censurados, ofrece una ventaja debido a que estos archivos se pueden analizar
despus de la adquisicin de datos. Es necesario que los investigadores aseguren que todos los datos sin procesar, la documen-
tacin, los protocolos, las muestras y los informes finales se archiven cuando concluye el estudio. Para asegurar la integridad y
calidad de los datos brutos recopilados, es necesario que los investigadores se apeguen a las Regulations for Good Laboratory
Practices (Reglamentaciones para Buenas Prcticas de Laboratorio o GLP) de la FDA de los EE.UU., conforme a lo prescrito en el
Ttulo 21 del CFR Parte 58, Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies (Buenas Prcticas de Laboratorio para
Estudios de Laboratorio No Clnicos); y Parte 11, Electronic Records and Electronic Signatures (Registros y Firmas Electrnicos).

Citometra de Flujo: Elementos de un Procedimiento

Los mtodos de citometra de flujo incluyen la manipulacin, la preparacin y la tincin de la muestra; configuracin y ope-
racin del instrumento; recopilacin, anlisis y almacenamiento de datos; y medidas de control de calidad asociadas.

MANIPULACIN Y TINCIN DE LAS MUESTRAS

Recoleccin, Manipulacin y Anticoagulacin de las Muestras

Con el objetivo de generar conclusiones exactas sobre el producto farmacutico derivado de clulas, el analista debe asegu-
rar que las muestras de productos celulares sean lo ms representativas del producto completo. Las muestras de sangre, afre-
sis y productos de suspensin celular se deben mezclar bien antes del muestreo y se debe tener cuidado de obtener volmenes
de muestra adecuados.
Las muestras celulares que contienen sangre/plasma humano deben someterse a un proceso de anticoagulacin. La hepari-
na o los anticoagulantes basados en citrato (p.ej., Solucin Anticoagulante A de Citrato Dextrosa) se recomiendan ms que el
EDTA, ya que conservan de manera ptima las muestras que se deben manterner por ms de unas pocas horas. En lo que
respecta a muestras que deben mantenerse por plazos ms largos, pueden ser necesarios medios especficos de transporte/
almacenamiento, y se deben realizar estudios de validacin para asegurar que dichas muestras sean equivalentes a las muestras
preparadas en el momento de ser analizadas por citometra de flujo.
Las muestras destinadas a lisis de sangre entera y tincin de antgenos de superficie se deben transportar y almacenar, de
preferencia, en un mezclador de oscilacin lenta a temperatura ambiente. Las muestras fijadas o las preparaciones de clulas
vivas se deben almacenar a 4. Cuando existe la posibilidad de que la muestra sea expuesta a temperaturas extremas, pueden
ser necesarios materiales con control de temperatura (empaques para temperatura ambiente, empaques fros y aislamiento) y
se deben llevar a cabo estudios de validacin para garantizar la integridad de la muestra. Para muestras crticas o de alto valor,
pueden ser necesarios dispositivos de monitoreo de temperatura durante el transporte.
USP 39 Informacin General/ (1 027) Citometra de Flujo 873

o
o
o
T"""

o
o
co 1

o
o
<O
o
(j)
(j)
o
o
"""
o
o
C\I

ol
o 200 400 600 800 1000
FSC

"""
o~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

T"""

T"""
T""" C\I
o o
o T"""

T"""
o
T"""

o O>-=-~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

~ 10 1 102 103 104

Lin
Figura 7. Generacin de ventanas para una poblacin celular con dispersin lateral baja y dispersin frontal alta, la cual es
diferente de otras poblaciones celulares en la muestra.

Una vez obtenidas las muestras, se deben analizar lo ms pronto posible. Resulta necesario prestar atencin especial a aque-
llas situaciones en las que la proliferacin celular y la deplecin metablica de fuentes de energa dentro del medio de trans-
porte/almacenamiento puedan generar apoptosis. Cuando no se requiere un recuento exacto o cuando se sospecha la presen-
cia de agentes infecciosos, se puede usar una solucin comercial para lisado/fijacin para aumentar el tiempo de almacena-
miento y reducir el riesgo de transmisin de enfermedades. Para muestras separadas mediante centrifugacin en gradiente de
 874 (1027) Citometra de Flujo/ Informacin General USP 39

densidad, se recomienda el almacenamiento en una solucin de paraformaldehdo amortiguado (O, 1 o/o a 2,0%) despus de
que ha ocurrido el marcado de las clulas.
Procesamiento, Tincin y Fijacin de las Muestras
Los reactivos usados en el procesamiento, tincin y fijacin de las muestras deben calificarse para su uso previsto. El docu-
mento Q6B de la ICH, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (Especifica-
ciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptacin para Productos Biotecnolgicos/Biolgicos), proporciona pautas
adicionales. Cuando se emplean kits de reactivos, se deben seguir las instrucciones del fabricante para el procesamiento de las
muestras.
El procesamiento de las muestras que requiere centrifugacin, lavado, eliminacin o lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en
ingls), o separacin en gradiente de densidad, por lo general se usa en muchas de las aplicaciones de la citometra de flujo,
pero puede introducir errores y artefactos. Se encuentran disponibles diversas tcnicas y reactivos para la eliminacin y lisis de
RBC. Para una calidad ptima, se recomiendan los reactivos de grado clnico [diagnsticos in vitro (JVD, por sus siglas en in-
gls) o especficos para analitos (ASR, por sus siglas en ingls)], aunque an pueden presentarse artefactos. La centrifugacin
en gradiente de densidad puede introducir errores relacionados con prdidas de clulas variables entre las subpoblaciones que
se estn midiendo. Estas fuentes de error y artefactos se pueden evitar analizando la sangre entera viva siempre que sea posi-
ble.
La mayora de las instrucciones para el lisado de la sangre entera recomiendan la tincin a temperatura ambiente y en Ja
oscuridad. Muchos mtodos incluyen una solucin fijadora diluida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internaliza-
cin de fluorocromo. Por el contrario, las preparaciones de clulas (preparaciones de clulas en gradiente de densidad, mues-
tras por afresis, cultivo de tejidos) se deben teir a 4, lavarse con solucin amortiguadora fra y almacenarse en fro hasta el
momento del anlisis.
La fijacin que tambin conserva los antgenos de la superficie celular se puede conseguir mediante conservantes de leucoci-
tos comerciales o con formaldehdo o paraformaldehdo amortiguados. Existe muy poca informacin sobre la validacin de los
tiempos de almacenamiento, unin de anticuerpos o intensidad de fluorocromo. Cualquier laboratorio que considere el anli-
sis de partidas de muestras fijas debe validar estas tcnicas de manera cabal antes de implementarlas.

USO Y SELECCIN DE FLUOROCROMOS

Fluorocromos
Los fluorocromos se usan para la tincin directa de clulas o como agentes unidos a anticuerpos u otros reactivos para teir
antgenos celulares u otras estructuras. La Tabla 7 cita ejemplos de fluorocromos comunes usados en citometra de flujo y sus
longitudes de onda de excitacin y emisin. Las longitudes de onda (nm) pueden variar ligeramente, dependiendo del entor-
no. Tambin se encuentran disponibles sondas sintticas de fabricantes especficos.1 Los fluorocromos deben coincidir con el
intervalo espectral para los conjuntos de lseres y filtros especficos del citmetro de flujo del usuario.
Al momento de seleccionar fluorocromos para fenotipificacin multicolor, el operador debe referirse a los mtodos estableci-
dos para el instrumento en particular. En general, los fluorocromos ms brillantes se deben usar para detectar antgenos de los
que se espera presenten una baja expresin en la superficie de la clula. El brillo de los colorantes en tndem tambin se pue-
de reducir usando diversos fijadores, algunos de los cuales son menos problemticos que otros. Cuando se disea un procedi-
miento de flujo y de coloracin en tndem multicolor que no ha sido previamente validado, el operador debe consultar con el
servicio tcnico del fabricante, comparar las combinaciones de fijador y colorante en tndem y validar la combinacin de fluo-
rocromo final para asegurar la uniformidad de muestra a muestra.
Los colorantes fluorescentes en tndem son molculas fluorescentes conjugadas duales. Cuando las dos marcas estn muy
cerca una de otra, la energa producida por el lser que excita al fluorocromo dador se transfiere al fluorocromo receptor, libe-
rando un fotn a Ja longitud de onda de emisin del flor receptor (tambin conocido como transferencia de energa de reso-
nancia de fluorescencia o FRET, por sus siglas en ingls). Por ejemplo, el PECy5 se excitar a la longitud de onda de excitacin
para PE (565 nm), transferir energa a Cy5 y emitir a la longitud de onda de emisin para Cy5 (670 nm).
Anticuerpos Marcados con Fluorescencia
La mayora de los anticuerpos disponibles comercialmente son monoclonales, pero puede haber disponibles reactivos poli-
clonales, recomendados, para algunas aplicaciones. La calidad y especificidad de un anticuerpo puede variar ampliamente. Los
anticuerpos dirigidos a un antgeno dado pueden diferir en su especificidad de unin para diferentes epitopes de antgenos o
en la fuerza de unin al mismo epitope. De ser posible, emplear combinaciones de fluorocromo-anticuerpo conjugadas de
grado IVD o ASR. La optimizacin de la concentracin de los anticuerpos para la poblacin de clulas deseada es especfica del
protocolo pero por lo general se consigue usando concentraciones de anticuerpos en aumento con un nmero fijo de clulas
para establecer el brillo ptimo entre la autofluorescencia y la extincin. La extincin es provocada por el fenmeno de prozo-
na, que se presenta cuando un exceso de anticuerpos genera la inmunoprecipitacin y prdida de intensidad de la fluorescen-
cia. Los manuales de mtodos tales como Current Protocols in lmmunology (Protocolos Actuales de Inmunologa (Coligan et al.
1994), presentan detalles adicionales.

1 La serie AlexaFluor (Sondas lnVitrogen/Moleculares) o la serie Cy (GE Healthcare).

USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 875

Tincin del Antgeno de la Superficie de la Clula

Las tcnicas de tincin del antgeno de la superficie varan dependiendo del tipo de muestra. Las tcnicas de lisis de sangre
entera por lo general requieren el marcado de la superficie a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15-30 minutos,
seguido por lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en ingls) y, si se desea, fijacin. Las tcnicas publicadas utilizan cloruro de
amonio (NH 4 CI) para producir la lisis de sangre entera o muestras de mdula seguido por el lavado y posterior marcado de
anticuerpos para inmunofenotipificacin de leucemia. Las muestras de clulas mononucleares o de cultivo que se tien vivas
deben conservarse a 4 o en una solucin amortiguadora con azida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internaliza-
cin de anticuerpos.
Tincin Intracelular
Existen tambin diversos procedimientos normalizados para el marcado de antgenos intracelulares y citoquinas. El operador
debe consultar el protocolo del fabricante y los reactivos estandarizados para estos procedimientos. Debido a que los reactivos
permeabilizantes varan entre procedimientos y fabricantes, no se deben mezclar ni homologar reactivos. Para el marcado de
citoquinas, a menudo se requiere de una etapa de activacin y un bloqueo del Golgi para permitir que se acumule una canti-
dad suficiente de citoquina para su deteccin. Si no se dispone de reactivos o procedimientos estandarizados por parte del
fabricante o si se requiere el anlisis de funciones especializadas, existe un gran nmero de procedimientos y tcnicas habitua-
les en fuentes tales como Current Protocols in lmmunology (Protocolos Actuales de Inmunologa) (Coligan et al., 1994).
Cuantificacin de Antgenos
Algunas aplicaciones requieren cuantificar el nmero promedio y la densidad de molculas de antgenos por clula para pro-
veer una imagen ms completa del comportamiento inmunolgico de las clulas (p.ej. en estudios en los que los antgenos
extracelulares se expresan de forma diferencial en relacin con el estmulo de activacin). La intensidad de una preparacin de
clulas con anticuerpos marcados con fluorocromos se compara con la intensidad de un conjunto de estndares de microper-
las de fluorescencia recolectados a la misma configuracin de voltaje del PMT. Los estndares se calibran en unidades de mol-
culas de fluorescencia soluble (MESF, por sus siglas en ingls), de las que se puede determinar la relacin efectiva entre la fluo-
rescencia y el anticuerpo (F/P), el nmero de molculas de antgeno por clula y la densidad de los sitios disponibles por clu-
la.

CONFIGURACIN Y OPERACIN DEL INSTRUMENTO

Compensacin
La mayora de de los fabricantes de instrumentos ofrecen software y reactivos de prueba (por lo regular perlas fluorescentes)
para configurar los PMT y la compensacin a fin de captar valores hallados con las pruebas clnicas ms comunes (p.ej., fenoti-
pificacin de linfocitos, anlisis de CD34). Asimismo, el operador debe emplear un control biolgico tal como sangre conserva-
da o clulas mononucleares, las cuales se encuentran disponibles comercialmente. La compensacin se debe establecer antes
de adquirir datos en instrumentos anlogos. Los PMT de los instrumentos digitales deben instalarse de manera correcta puesto
que los valores para estas configuraciones no podrn cambiarse una vez que haya sido generado el archivo en forma de lista.
Cuando se examinan eventos poco comunes y/o se usan colorantes intracelulares (p.ej., 7-amino actinomicina D [7-AAD], yo-
duro de propidio [PI, por sus siglas en ingls], Syto-16, entre otros.) en conjunto con anticuerpos marcados por fluorescencia,
el balance de voltaje de los PMT y la superposicin espectral debe monitorearse muy de cerca.
La autofluorescencia (AF) es fluorescencia por encima de la lnea base en ausencia de tincin con fluorocromo. Lo anterior se
presenta en algunas clulas, por lo regular en clulas mieloides (especialmente macrfagos alveolares) y en clulas primarias
cultivadas. Cuando resulte deseable o necesario, la AF puede medirse directamente en un voltaje de PMT fijo o se puede calcu-
lar a partir de un estndar de referencia de preparaciones de perlas fluorescentes (ver la seccin Cuantificacin de Antgenos
anterior). Evitar el uso de la longitud de onda de excitacin a 488 532 nm y la compensacin espectral subsiguiente de la AF
como un fluorocromo adicional.
Adquisicin de Datos y Estrategias para la Creacin de Ventanas
Siempre que sea posible, los eventos deben presentarse en modo de lista, es decir, sin la creacin de ventanas selectivas para
eventos. Las Ventanas vivas, definidas como la creacin de ventanas selectivas para eventos durante la adquisicin, se deben
emplear slo cuando el subconjunto deseado es lo suficientemente raro, y se deben analizar >2 millones de eventos totales
para contar un nmero de eventos significativo (100 o mayor) de la poblacin deseada. Los datos en forma de lista se pueden
adquirir sin compensar cuando se emplea instrumental digital, pero la mayora de los operadores indican que el anlisis es mu-
cho menos difcil y ms rpido si los datos se encuentran en el intervalo de compensacin apropiado antes de su adquisicin.
Adems, a menudo se recomienda establecer umbrales para exclusin de desechos. Por ejemplo, si se establece un umbral de
dispersin frontal se excluyen eventos por debajo de un tamao predeterminado a fin de prevenir un archivo en forma de lista
de gran tamao, que podra formarse si se contaran estos eventos.
Uso de Controles
Las preparaciones de perlas conjugadas con fluorocromo se usan para estandarizar los PMT y la compensacin y para cuanti-
ficar la expresin de marcadores especficos. Asimismo, se recomienda ampliamente el uso de controles biolgicos. Se deben
teir las muestras de clulas con un control de isotipos y anticuerpos primarios y secundarios para evaluar la unin no especfi-
ca, a menos que el laboratorio haya determinado mediante procedimientos rigurosos de validacin que la unin no especfica
no interfiere con los resultados del ensayo.
876 (1027) Citometra de Flujo / Informacin General USP 39

Las poblaciones de clulas con antgenos positivos y negativos (preparadas y teidas de manera idntica a las de los artculos
de prueba) proporcionan estndares internos de aptitud del sistema. Tales poblaciones de clulas de control tambin permiten
al laboratorio evaluar variaciones entre lotes en preparaciones de anticuerpos y reactivos de tincin.
Uso de Colorantes y Ventanas para Viabilidad Celular
Los colorantes para viabilidad celular tales como 7-MD, PI y yoduro TO-PRO se usan comnmente para determinar la pro-
porcin de clulas muertas en un producto de terapia celular. Estos colorantes por lo general se excluyen de las clulas vivas,
pero pasan a travs de las membranas celulares de clulas muertas, tiendo su ADN. La coloracin para viabilidad de las clu-
las se puede combinar con la tincin intracelular o de la membrana de la superficie para evaluar subpoblaciones y la propor-
cin de clulas vivas y muertas teidas con un marcador determinado. La tincin para viabilidad tambin se puede usar en
conjunto con un colorante de membrana en ensayos de citotoxicidad usando citometra de flujo. Estos colorantes para viabili-
dad no deben confundirse con la gran cantidad de reactivos para deteccin de apoptosis disponibles en la actualidad. Las tc-
nicas de validacin para colorantes para viabilidad que no se usan en IVD implican la preparacin de una poblacin de clulas
muertas que se agregan diluidas en serie a un producto de clulas vivas y, posteriormente se evala la fidelidad de la mezcla
de clulas con respecto a la poblacin conocida tiendo con el colorante de inters.
Enumeracin de Clulas
El recuento celular absoluto, expresado como el nmero de clulas en un volumen de muestra dado, se puede determinar
por mtodos de plataforma doble o simple. El mtodo de plataforma doble se basa en un instrumento de recuento automati-
zado separado o en un mtodo de recuento manual para enumerar primero la poblacin de clulas. Despus, se determina el
porcentaje de subgrupos de inters mediante citometra de flujo, el cual se multiplica por el recuento celular y el resultado se
divide por 1OO. Los mtodos de plataforma simple enumeran la poblacin de clulas y del subgrupo directamente contando
las clulas de la muestra simultneamente con perlas de referencia que se han agregado al volumen de muestra en una con-
centracin conocida. Las perlas de referencia a menudo se ofrecen como suspensin de perlas que se agrega a la muestra. De
manera alternativa, se puede agregar un volumen dado de muestra a un nmero conocido de perlas de referencia provistas
como una matriz de fase slida en tubos de poliestireno. Estas metodologas estn sujetas a error de pipeteo, por lo que se
debe tener mucho cuidado para asegurar la exactitud y reproducibilidad.
Configuracin del Instrumento y Garanta de Calidad
Cada laboratorio debe tener un plan de calidad que defina los procedimientos operativos estndar para la configuracin y
calibracin del instrumento, as como el monitoreo, mantenimiento y limpieza regular del instrumento. Los registros del instru-
mento deben documentar estas actividades y a los operadores. En general, se debe seguir el programa del calidad del fabri-
cante para el instrumento a menos que se haya establecido una alternativa adecuada.
Los parmetros del instrumento, como por ejemplo la corriente lser, el voltaje, la respuesta y los voltajes de PMT durante la
calibracin, deben ser monitoreados y registrados siempre que se utilice el instrumento. El monitoreo cuidadoso de los par-
metros de configuracin del instrumento puede ser de utilidad para detectar tendencias y predecir fallas en el lser o el PMT.
Asimismo, los resultados de las pruebas de control biolgico deben monitorearse y registrarse para detectar y prevenir la deriva
del mtodo analtico.
El laboratorio tambin debe participar en un programa de anlisis de competencia que refleje su men de pruebas. Depen-
diendo de las necesidades, esto puede variar de un programa formal como el administrado por el College of American Patho-
logists (Colegio de Patlogos Estadounidenses o CAP) a compartir muestras y anlisis con otro laboratorio. Asegurar que los
operadores estn capacitados, calificados y que su competencia para realizar procedimientos especficos sea evaluada peridi-
camente ayudar a garantizar la uniformidad de las tcnicas y los controles.

GESTIN DE DATOS Y CONSIDERACIONES ESTADSTICAS

Gestin y Almacenamiento de Datos

Los ensayos de control de calidad y los ensayos de anlisis de muestras (en forma de lista) se deben almacenar de tal manera
que se cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables al laboratorio. Lo anterior se puede lograr mediante transferencia a
discos duros, medios extrables o a un servidor tal como un sistema de informacin de laboratorio comercial. El almacenamien-
to de los resultados deber ser rastreable en todo momento hasta el archivo en forma de lista FCS, la configuracin del instru-
mento y los parmetros de control de calidad originales para la muestra en particular. Se debe crear un respaldo de datos para
evitar la prdida de archivos. Se deben establecer procedimientos de almacenamiento y respaldo para registros manuales (en
papel) que podrn ser usados para clculos y resumen de datos.
Anlisis de Datos y Consideraciones Estadsticas
Para la mayora de las aplicaciones de citometra de flujo, el anlisis de datos implica presentar los datos de los archivos en
forma de lista o de las ventanas en vivo mediante una grfica (grfica de histograma de un slo parmetro, grfica de puntos
de dos parmetros con regiones o grfica tridimensional) y medir la distribucin de eventos dentro de la grfica. El anlisis
adicional de datos dentro de poblaciones seleccionadas se puede llevar a cabo mediante ventanas para poblaciones de clulas
especficas. La descripcin de los datos por lo regular incluye el porcentaje de eventos dentro de la poblacin con una caracte-
rstica dada (dispersin frontal, dispersin)ateral, marcador fluorescente). El numerador es el nmero de eventos que presen-
tan la caracterstica, mientras que el denominador puede ser el nmero de eventos totales contados o el nmero de eventos
contados que caen dentro de la ventana. Para grficas bidimensionales, el anlisis a menudo se lleva a cabo usando un softwa-
re informtico que analiza e informa estadsticas regionales (p.ej., cuadrante). Debido a que los grupos de poblaciones de clu-
USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 877

las pueden cambiar de posicin en un archivo de datos con respecto al siguiente, se ha desarrollado un software para el anli-
sis de grupos.
El anlisis estadstico de las aplicaciones cuantitativas de citometra de flujo difiere de las aplicaciones cualitativas en las que
una clula es considerada positiva o negativa para un marcador dado. Para una aplicacin cuantitativa tpica en la que se esti-
ma el nmero de molculas en la superficie celular, la intensidad de fluorescencia media o mediana de las clulas de la muestra
marcadas con un anticuerpo fluorescente, unido a la molcula de inters, se puede comparar con controles apropiados, inclu-
yendo curvas estndar de clulas o partculas con cantidades conocidas de dicha molcula o anticuerpo.
Una consideracin prctica comn para el anlisis por citometra de flujo de productos de terapia celular, en especial los
productos autlogos y alognicos relacionados con el donante, es que el tamao de la muestra que se debe analizar a menudo
est restringido debido al contenido limitado de clulas del producto teraputico mismo. Esto genera desafos especiales cuan-
do las clulas que contienen el marcador de inters se presentan como eventos poco comunes. En tales casos, antes de tomar
una decisin con respecto al tamao de la muestra, el usuario debe considerar las expectativas de deteccin de eventos poco
comunes dentro de un nmero dado de clulas totales (es decir, la prevalencia, variabilidad, y el error de muestreo) en rela-
cin con la precisin deseada del estimado.

Calidad y Estandarizacin

La estandarizacin del uso de la citometra de flujo y de los equipos requiere de prcticas de validacin, garanta de calidad
(QA) y control de calidad (QC). Aunque la citometra de flujo se usa ampliamente tanto en la investigacin como en laborato-
rios clnicos, el anlisis de clulas para el desarrollo de aplicaciones de diagnstico clnico y teraputico se encuentra en creci-
miento, lo que conlleva a requisitos reglamentarios ms amplios y al nfasis en la normalizacin. Por ejemplo, tradicionalmen-
te, los operadores de citometra de flujo han empleado microesferas fluorescentes (perlas) o celdas para la configuracin del
instrumento y el QC, a menudo basndose en las recomendaciones del fabricante. Sin embargo, no ha sido posible convenir
instrucciones uniformes para la aplicacin de estos estndares de control a la configuracin del instrumento y al QC.
Cuando se aplica de manera apropiada, la validacin proporciona evidencia documentada de que el proceso de de fabrica-
cin o anlisis genera constantemente productos que cumplen con las especificaciones predeterminadas. Cuando se basa en
una comprensin cabal de los parmetros crticos del proceso, la validacin ayuda a definir la calidad del producto y a garanti-
zar procesos de fabricacin o anlisis bien controlados y uniformes. La validacin de mtodos por citometra de flujo debe in-
cluir la calificacin del instrumental, la validacin del mtodo analtico y la calificacin del operador.

DOCUMENTACIN

Los procesos que cumplen con las BPL y las BPF requieren de documentacin adecuada tal como procedimientos operativos
estndar (SOP, por sus siglas en ingls) para todos los procesos del laboratorio. Los SOP deben ser actualizados peridicamen-
te y aprobados para reflejar las prcticas vigentes. La capacitacin y la calificacin son indispensables para que el personal de
laboratorio tenga el nivel de competencia apropiado para su responsabilidad asignada. Las competencias del operador deben
ser revisadas y evaluadas de manera continua en relacin con las SOP y los reglamentos.
La integracin de procesos de calidad internos y externos es un elemento importante para la garanta de calidad. Dichos
procesos incluyen la validacin del equipo, los controles y lmites de fabricacin y las especificaciones del producto. Los proce-
sos de validacin de procesos y equipo por lo general requieren de calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls), la
calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y la calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls).

CALIFICACIN DE EQUIPOS Y ENSAYOS

La IQ establece que el instrumento sea recibido con su diseo y especificaciones originales, y que sea instalado adecuada-
mente en un ambiente apropiado. Por lo general, esto significa verificar los requisitos fsicos y de la instalacin para determinar
si el citmetro de flujo se puede instalar adecuadamente. Los factores de calificacin verificados a menudo incluyen la tempe-
ratura, humedad, espacio y capacidades elctricas de las instalaciones en relacin con los requisitos del fabricante para el ins-
trumento. Los procedimientos de IQ tambin garantizan que todos los componentes de hardware y software se instalen ade-
cuadamente por el representante del fabricante del instrumento.
LA OQ demuestra que un instrumento funcionar de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Esto generalmente se
refiere al anlisis de niveles de componentes por parte del representante del fabricante del instrumento o usando los manuales
de validacin del fabricante que gua al usuario final para llevar a cabo esta funcin. Siempre que sea posible, estas pruebas
deben contar con especificaciones con lmites de control cuantitativos correspondientes. Este anlisis asegura que el hardware
y software del instrumento est en condiciones de operar comparndolos con las especificaciones del fabricante.
La PQ demuestra que tanto el instrumento como las pruebas tienen un desempeo conforme a las especificaciones. Para
citometra de flujo, estas especificaciones, por lo general, son determinadas por el laboratorio que realiza el anlisis por citome-
tra de flujo y a menudo incluyen las especificaciones diarias del instrumento y de las pruebas de control de la valoracin. Para
valoraciones especficas, la PQ debe incorporar metodologa normalizada, configuracin y compensacin especfica para la
aplicacin y especificaciones de linealidad, precisin y exactitud de los resultados informados de la valoracin. En algunos cit-
878 (1027) Citometra de Flujo/ Informacin General USP 39

metros de flujo digitales, puede ser necesario configurar la lnea base del instrumento a fin de determinar la configuracin pti-
ma del instrumento para una valoracin dada.

DESEMPEO DEL INSTRUMENTO

Las especificaciones de desempeo pueden ser identificadas por el fabricante del citmetro de flujo y posiblemente no abar-
quen todos los requisitos especificados por el operador. Despus de identificar las especificaciones del fabricante, el laboratorio
debe establecer especificaciones que sean apropiadas para las configuraciones del hardware que se utilizarn, y se deben nor-
malizar las especificaciones. Por ejemplo, el fabricante puede tener una especificacin base para un citmetro de flujo de doble
lser y cuatro colores. Si la especificacin base requiere un lser de diodo rojo estndar a 635 nm, pero se sustituye con un
lser de helio-nen enfriado con aire a 633 nm, la especificacin base deja de ser vlida para el sistema. De manera similar, si
las especificaciones se basan en el uso de un filtro de paso de banda a 660 nm pero se sustituye con un filtro de paso largo a
675 nm, la especificacin base deja de ser vlida debido a las diferencias en las caractersticas del filtro de emisin.

MONITOREO DEL DESEMPEO

El desempeo del instrumento debe monitorearse a diario, usando perlas fluorescentes comercialmente disponibles. Los de-
tectores de luz tales como PMT, fotodiodos (PD, por sus siglas en ingls) y fotodiodos en avalancha (APD, por sus siglas en
ingls) se usan en la mayora de los sistemas para detectar seales y sus ganancias se pueden cambiar para aumentar o dismi-
nuir la sensibilidad de los detectores. Por lo tanto, el monitoreo de las configuraciones de estos detectores es tan importante
como el monitoreo de las seales, y dichas configuraciones deben asociarse con cada archivo de datos sin procesar. La meto-
dologa ms simple consiste en mantener diariamente la misma configuracin del detector del instrumento para medir la in-
tensidad de las seales de fluorescencia. Esta metodologa debe implementarse para todos los parmetros que se deben validar
usando las perlas apropiadas. La sensibilidad del instrumento se basa en la capacidad del sistema de deteccin para resolver la
poblaciones de clulas o perlas con fluorescencia atenuada. Por esta razn, la medicin del coeficiente de variacin (CV) de
poblaciones de perlas con fluorescencia atenuada a moderadamente intensa es una forma de monitorear diariamente la sensi-
bilidad de la fluorescencia. Se deben usar las recomendaciones del fabricante del instrumento para monitorear el desempeo.
La temperatura ambiente alta puede afectar el desempeo del lser y del PMT y tambin debe monitorearse a diario.
La compensacin incorrecta para la superposicin espectral puede afectar en gran medida a los datos durante el anlisis
multicolor. Se han establecido muchas metodologas para este propsito y se han usado algoritmos matemticos recientes en
lugar del circuito anlogo. Los algoritmos, tales como aqullos que emplean lgebra de matrices, permiten al operador o a los
investigadores aplicar criterios objetivos para compensar la superposicin espectral despus de haber recopilado todos los da-
tos. En sistemas ms antiguos, la metodologa estndar ha consistido en compensar usando un ajuste de hardware de sustrac-
cin para los datos preliminares observados, antes de que se hayan recopilado todos los datos. Esta metodologa puede ser
subjetiva y puede no generar resultados exactos como la compensacin por mtodos ms novedosos. Las perlas de captura
unidas a anticuerpos son herramientas valiosas de compensacin debido a que se pueden usar con los mismos colorantes de
anticuerpos y en tndem para todos los fluorforos que se usarn en las clulas. Se debe validar el uso de perlas en lugar de
celdas para propsitos de compensacin.

ESTNDARES

Los estndares de fluorescencia basados en microesferas para citometra de flujo han sido categorizados en base a su prop-
sito:
Los estndares Tipo 1son estndares de alineacin que se usan para realizar ajustes en la alineacin ptica del instrumen-
to. Estos son usados generalmente por los ingenieros de servicio del campo y por los usuarios de sistemas ajustados por el
operador para verificar la alineacin de la seal ptica a fin de mejorar la sensibilidad del instrumento. Por lo regular, estas
partculas son pequeas ("' 2 m) y brillantes y proporcionan la iluminacin ms uniforme.
Los estndares Tipo 11 son perlas de referencia y son los estndares de perlas ms comnmente usados. Estos estndares
por lo general se usan a diario, tienen una intensidad de fluorescencia tenue a moderada y pueden obtenerse con varios
fluorforos insertados. Asimismo, se pueden usar para imitar clulas y, usando un software dedicado, determinar la sensi-
bilidad relativa del instrumento.
Los estndares Tipo 111 se usan para calibrar la fluorescencia. Estos se usan para aplicaciones especializadas que requieren
la calibracin de uno o ms detectores de fluorescencia para cuantificacin de molculas de fluorocromo. La determina-
cin de la relacin entre los fluorforos y el anticuerpo (relacin F/P) permite el clculo subsiguiente del nmero de anti-
cuerpos unidos por clula.
USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 879

CONFIGURACIN DEL INSTRUMENTO Y GARANTA DE CALIDAD

La configuracin del instrumento y la garanta de calidad deben ser actividades independientes de la valoracin biolgica.
Muchas variables relacionadas con el instrumental pueden producir artefactos en los resultados de la valoracin biolgica. Para
garantizar la calidad instrumental se puede usar: la configuracin de la lnea base y la configuracin diaria.
Configuracin de la Lnea Base
En los instrumentos digitales ms novedosos, se recomienda establecer una configuracin de la lnea base en la configura-
cin del instrumento que provea una sensibilidad ptima. Esta configuracin no es un procedimiento diario, pero debe llevarse
a cabo si la configuracin del instrumento ha sido cambiada o si se ha dado servicio al instrumento. Debido a que los voltajes
del PMT y la configuracin del instrumento pueden afectar sobremanera la sensibilidad de ste ltimo, este mtodo debe usar-
se para generar objetividad y una sensibilidad mejorada. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que pro-
vea un CV menor (Figura 8). Estas configuraciones pueden ser usadas para la valoracin biolgica, aunque no aplica para todos
los casos.

10000 ~--------------

490V 605V
1000 --+-- P1 FITC-A CV
---P1 PE-ACV
P1 PerCP-Cy5-5-A CV
P1 APC-Cy7-A CV
--+-- P 1 APC-A CV

--+-- P1 PE-Cy7-A CV

10+----~--~---~---~

200 400 600 800 1000

Voltaje de PMT
Figura 8. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que provea una CV menor.

Configuracin Diaria
Se pueden usar estndares Tipo 11, tales como partculas de referencia, para monitorear la intensidad de la seal, la separa-
cin de partculas moderadamente brillantes y tenues y la resolucin de la seal. Las perlas con fluorforo homologado pro-
porcionan una herramienta de compensacin y un medio para saber si el instrumento es capaz de detectar tales longitudes de
onda. Sin embargo, las perlas con fluorforo homologado no tienen la uniformidad de fluorescencia requerida para medir CV.
Basndose en el desempeo ptico del instrumento, los CV se miden mejor usando perlas duras teidas con brillo moderado y
tenue tales como micropartculas teidas con coumarina que se muestran fluorescentes en un intervalo espectral amplio.
Resulta fcil confundir los controles de valoracin con los controles instrumentales. Las perlas proveen una fluorescencia uni-
forme y constante que no es posible obtener con clulas y, por consiguiente, son tiles para monitorear el desempeo del
instrumento. Por esta razn, resulta mejor emplear una preparacin de clulas para control de proceso a fin de verificar la
compensacin y la aceptabilidad del fluorforo.
Los ajustes que se realizan al instrumento para configurarlo diariamente son, por lo general, los mismos que se usan para los
ensayos. No todas las valoraciones se pueden usar con la misma configuracin instrumental, y no siempre es necesario llevar a
cabo estas actividades para cada configuracin instrumental a menos que la validacin as lo requiera.
Las actividades diarias incluyen configurar el instrumento de manera uniforme da por da, usar una amplia variedad de per-
las de intensidad tenue a moderada y monitorear parmetros clave, incluida la intensidad de fluorescencia de las perlas (abso-
luta y CV%), valores de PMT, temperatura, potencia y longitud de onda del lser.

CONTROL Y GARANTA DE CALIDAD DE LA VALORACIN

La configuracin instrumental para una valoracin especfica debe establecerse para demostrar que todas las poblaciones ce-
lulares pueden identificarse en grficas bivariables para fluorescencia y dispersin de luz. Es de suma importancia que las po-
blaciones positivas estn en escala y apropiadamente compensadas. Esto es crtico cuando las clulas se excitan con lseres
rojos, los cuales no provocan que las clulas generen autofluorescencia significativa. Por esta razn, es importante verificar que
la configuracin sea adecuada para que la poblacin positiva se encuentre en la parte superior de su escala de fluorescencia,
puesto que puede ser extremamente difcil identificar las clulas negativas.
La compensacin de fluorescencia es un ajuste crtico. Los instrumentos digitales ofrecen ajustes objetivos fuera de lnea du-
rante el anlisis; asimismo, se encuentran disponibles instrucciones detalladas para la configuracin adecuada de la compensa-
cin. El uso de clulas o perlas de captura teidas con un solo fluorocromo unido a anticuerpos es, por lo general, la mejor
880 (1027) Citometra de Flujo / Informacin General USP 39

metodologa, aunque las mezclas de perlas marcadas con fluorocromo especficas tambin pueden funcionar bien para com-
pensar la adquisicin y el anlisis multicolor.

CONTROLES DE ISOTIPOS

Un control de isotipo es un control negativo de anticuerpo que no debe reaccionar con el antgeno de inters y que es el
mismo isotipo que el anticuerpo de prueba. La protena de mieloma o la inmunoglobulina que no tiene especificidad para las
especies que se analizan, tienen la misma clase y subclase de cadena lg a medida que el anticuerpo de prueba se conjuga con
un fluorocromo idntico al del anticuerpo de prueba. Resulta ideal que la unin sea mnima o nula cuando se usa el control de
isotipo en paralelo con la prueba. Aunque la unin idiotpica no especfica ocurre con frecuencia, sta es independiente del
isotipo del anticuerpo. Esto muy probablemente se relaciona con otras diferencias en la qumica del anticuerpo y puede ser
especialmente problemtico con ensayos de deteccin de eventos poco comunes, tales como aquellos para ensayos de clulas
madre hematopoyticas en sangre perifrica.

CONTROLES DE FLUORESCENCIA MENOS UNO

Los controles de fluorescencia menos uno (FMO, por sus siglas en ingls) se usan para controlar la tincin no especfica du-
rante un ensayo multicolor. Despus de que sea establecida la compensacin, se analiza un tubo que contiene todos los anti-
cuerpos marcados con fluorocromo, excepto por uno. Si la compensacin se ha establecido de manera apropiada, cualquier
fluorescencia positiva en el parmetro correspondiente al anticuerpo marcado con fluorocromo faltante es ocasionada por tin-
cin no especfica y puede ser indicativa de un exceso de anticuerpos o la degradacin de los colorantes en tndem relaciona-
dos. Aunque los controles de FMO son muy tiles para estimar la sensibilidad de un detector particular en el contexto de otros
reactivos, los controles no toman en cuenta la unin especfica que puede presentarse con la adicin del anticuerpo de prueba.
El uso de los tubos de control de FMO es ms apropiado para resolver problemas o para establecer un nuevo cctel de reacti-
vos multicolor.

CONTROLES DURANTE EL PROCESO

Los controles durante el proceso, tambin conocidos como estndares de aptitud del sistema, toman en cuenta la prepara-
cin de la muestra y la adquisicin de datos. Estos pueden incluir clulas de control conservadas, lneas de clulas o lneas de
clulas comercialmente disponibles, tales como sangre perifrica comn. Asimismo, los controles durante el proceso se pueden
usar para analizar nuevos lotes de reactivos de anticuerpos contra lotes antiguos.

CONTROLES BIOLGICOS

Cuando se comparan clulas tratadas o estimuladas con clulas sin tratar o sin estimular, en ocasiones, las clulas sin tratar o
sin estimular pueden representar el control ms til para establecer un lmite positivo o negativo. No obstante, el uso de con-
troles de isotipo tambin puede aplicarse a estas situaciones, debido a que la estimulacin puede llevar a la regulacin crecien-
te de los receptores para Fe, lo que a su vez conlleva a un aumento en la tincin de fondo, cuya presencia puede dilucidarse
mediante un control de isotipo.

APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO PARA MUESTRAS CELULARES Y PRODUCTOS DE

TERAPIA CELULAR

Se ha desarrollado una gran variedad de aplicaciones de citometra de flujo para investigacin, diagnstico clnico y monito-
reo, desarrollo de frmacos y caracterizacin de productos celulares y evaluacin de su calidad (es decir, controles para la libe-
racin del lote). Las aplicaciones clnicas tradicionales incluyen el monitoreo de la enfermedad por VIH y el diagnstico y moni-
toreo de leucemia y linfoma. Los laboratorios de investigacin farmacutica y acadmica han ampliado la aplicacin de la cito-
metra de flujo desde inmunofenotipificacin hasta ensayos celulares funcionales, as como ensayos multiplex basados en mi-
croesferas capaces de medir parmetros funcionales mltiples en clulas individuales. Los ensayos funcionales de la actualidad
incluyen ensayos que permiten el estudio directo del estado de activacin celular midiendo la produccin de citoquinas intra-
celulares o la secrecin de quimioquinas o citoquinas, usando un ensayo en emparedado de unin a ligandos en microesferas.

lnmunofenotipificacin

La citometra de flujo permite caracterizar subtipos de leucocitos marcando clulas con anticuerpos monoclonales conjuga-
dos con fluorocromos. El sistema de grupo de diferenciacin, CD, define anticuerpos monoclonales que reconocen antgenos
nicos en la superficie celular. Muchas aplicaciones clnicas toman ventaja de las capacidades de la citometra de flujo para
medir mltiples antgenos CD en miles de clulas individuales.
USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 881

ENUMERACIN DE CD4

Al inicio de la dcada de 1980, los investigadores descubrieron que el VIH infecta las clulas T CD4 positivas y que el recuen-
to de clulas T CD4 de la sangre perifrica del paciente es un indicador til del estado inmune. La enumeracin de CD4 se ha
convertido en la prueba de diagnstico ms comnmente usada en pacientes infectados con VIH para determinar la necesidad
de terapia antiretroviral (ARV) y para monitorear la efectividad de los frmacos ARV. Los recuentos de subconjuntos de clulas
T a menudo se expresan en trminos de clulas por microlitro y como porcentaje de linfocitos, usando un reactivo estandariza-
do, software y sistema de instrumentos.

LEUCEMIA Y LINFOMA

El anlisis por citometra de flujo multidimensional permite identificar poblaciones de clulas aberrantes en la mdula sea,
en el tejido linftico y en la sangre perifrica de pacientes con leucemia o linfoma. Esto se logra mediante ccteles de anticuer-
pos monoclonales pertinentes a la oncologa o para linajes especficos. Mediante fluorforos ptimos y configuraciones pti-
cas/electrnicas mejoradas en instrumental de la citometra de flujo, se pueden detectar marcadores celulares adicionales para
identificar de manera ms precisa fenotipos de clulas de leucemia o linfoma y para mejorar la evaluacin del mdico sobre el
estado del paciente. Los mtodos de deteccin de eventos poco comunes han mejorado la capacidad de detectar enfermeda-
des residuales mnimas.

CLULAS DENDRTICAS

Las clulas dendrticas (DC, por sus siglas en ingls) actan como clulas que presentan antgenos que pueden influenciar la
naturaleza y potencia de la respuesta inmune a antgenos especficos. Este hallazgo ha llevado al desarrollo de las DC como
terapias celulares para cncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Las DC tienen morfologas y fenotipifi-
caciones diversas y se pueden derivar de diferentes tipos de clulas. Es posible segregar dos linajes de DC principales, conoci-
das como DC mieloides y plasmocitoides, basndose en su expresin de CDl 1c y CDl 23, respectivamente. Asimismo, la ex-
presin de las molculas coestimulantes CD80 y CD86 se puede monitorear para determinar el estado de madurez de las DC.

CLULAS MADRE Y PROGENITORAS

La expresin de CD34 a menudo se usa para caracterizar las clulas madre hematopoyticas (HSC, por sus siglas en ingls)
en sangre perifrica, sangre del cordn, mdula sea y preparaciones de HSC purificadas de estas fuentes. La identificacin y
enumeracin por citometra de flujo de HSC es posible mediante el uso de anticuerpos monoclonales especficos para el epto-
pe CD34 clase 111, junto con otros reactivos bien caracterizados, software de anlisis y protocolos. La combinacin de anticuer-
pos anti-CD45, anti-CD34 y un colorante de viabilidad tal como 7-MD se usa ampliamente en aplicaciones clnicas. El crecien-
te inters por el desarrollo de terapias celulares a partir de fuentes de tejido embrinico, fetal y adulto ha llevado al uso de una
amplia variedad de marcadores convencionales fenotpicos novedosos para caracterizar clulas de origen y su progenie ms
diferenciada. Se estn desarrollando ensayos por citometra de flujo como parte de bateras de ensayos para evaluar productos
celulares diferenciados derivados de fuentes de clulas madre pluripotentes. Estos ensayos ayudan a definir nmeros apropia-
dos y tipos de poblaciones celulares deseadas, adems de que ayudan a detectar clulas no deseadas tales como clulas pluri-
potentes residuales que pueden ser tumorignicas en el receptor.

LEUCOCITOS

La leucoreduccin de hemoderivados es un proceso que se usa para producir hemoderivados con un contenido de leucoci-
tos residuales de menos de 5 x 106 por unidad. Los datos clnicos sugieren que las reacciones febriles no hemolticas posteriores
a la transfusin se pueden evitar mediante leucodeplecin. La leucodeplecin tambin previene la aloinmunizacin a antgenos
HLA en pacientes que requerirn repetidamente transfusin de hemoderivados. La citometra de flujo se usa a menudo para
cuantificar la contaminacin leucocitaria en hemoderivados sometidos a leucodeplecin.

PLAQUETAS

La citometra de flujo es un mtodo til y rpido para diagnosticar muchos trombocitopatas primarias asociadas con defec-
tos en glicoprotenas estructurales o funcionales (p.ej., expresin anormal de gpllb/llla en trombastenia de Glanzmann o gplb
en el sndrome de Bernard-Soulier). El uso de anaranjado de tiazol, un colorante fluorescente que se une al ARN, permite la
cuantificacin de plaquetas inmaduras (plaquetas reticuladas). El recuento de plaquetas reticuladas se puede usar para deter-
minar la velocidad de trombopoyesis. Esta medicin puede separar las trombocitopenias inexplicables en aquellas con un au-
mento en la destruccin y aquellas con defectos en la produccin de plaquetas.
882 (1027) Citometra de Flujo/ Informacin General USP 39

ERITROCITOS

Las mujeres Rhesus D negativo reciben inmunoglobulina Rh profilctica para prevenir la aloinmunizacin de eritrocitos (RBC)
Rh(D)+. Si se sospecha hemorragia fetomaterna, la sangre de la madre se analiza para determinar la presencia y cantidad de
RBC fetales, usando anticuerpos contra el antgeno Rh(D) o la hemoglobina F marcados con fluorescencia.
El recuento de reticulocitos ayuda a determinar si la mdula sea responde adecuadamente a la necesidad del cuerpo de
RBC y ayuda a clasificar diversos tipos de anemia. Los recuentos de reticulocitos se basan en la identificacin de ribosomas y
ARN residuales en los RBC inmaduros sin ncleo. La enumeracin de reticulocitos por citometra de flujo y su discriminacin de
RBC maduros emplea colorantes fluorescentes que se unen al ARN residual (p.ej., anaranjado de tiazol).

lnmunoensayos Basados en Perlas

Los ensayos por citometra de flujo basados en microesferas multiplex combinan una serie de partculas de tamao discreto
y/o intensidad de fluorescencia con pares de anticuerpos homologados que permiten la deteccin simultnea de analitos solu-
bles mltiples en un citmetro de flujo. La capacidad del citmetro de flujo para discriminar partculas basndose en el tamao
y color permite determinar mltiples resultados de un solo tubo o pocillo. Muchos investigadores emplean tales ensayos para
medir quimioquinas o citoquinas, kinasas, y anticuerpos anti-HLA secretados.

Ensayos de Proliferacin

INCORPORACIN DEL COLORANTE EN EL ADN

La Bromodesoxiuridina (BrdU) es un anlogo de timidina que se puede incorporar en el ADN de las clulas durante la fase S
y que se puede detectar posteriormente usando anticuerpos monoclonales marcados especficos. Mediante la aplicacin de
pulsos a un cultivo de clulas estimulado con BrdU, es posible identificar a las clulas que han proliferado (pasado a travs de
la fase S) durante el tiempo del pulso. Este ensayo se ha convertido en una alternativa til a la incorporacin de 3 H-timidina
como una medicin de proliferacin debido a su radioactividad nula y a que puede identificar fenotipos de clulas que prolife-
ran usando marcadores mltiples y citometra de flujo.

INCORPORACIN DEL COLORANTE EN PROTENAS CELULARES O EN LA MEMBRANA CELULAR

Loe colorantes para el rastreo de clulas tales como succinimidil ster de carboxifluorescena (CFSE, por sus siglas en ingls) y
PKH26 han demostrado ser tiles en la evaluacin de la proliferacin celular. El CFSE se une de manera covalente al citosol y a
las protenas de la membrana, mientras que el PKH26 se une de manera no covalente a las membranas celulares. Cuando las
clulas se dividen, el marcado con CFSE/PKH26 se divide equitativamente entre las clulas hijas, las cuales, por consiguiente,
tienen la mitad de fluorescencia que las clulas paternas. La fluorescencia de cada clula se divide adicionalmente por la mitad
con cada generacin subsiguiente. Esta propiedad hace de los ensayos con CFSE/PKH26 tiles, no solo para determinar la frac-
cin de clulas que han proliferado en un cultivo estimulado, sino tambin, en condiciones ideales, el nmero de generaciones
que han transcurrido. De esta manera, se pueden calcular las frecuencias precursoras de poblaciones pequeas que han proli-
ferado durante varios das en cultivo.

Ensayos Funcionales

EXPRESIN DE CITOQUINAS INTRACELULARES

Las tcnicas de marcado de superficies celulares e intracelulares han sido aplicadas a la identificacin de subconjuntos de
clulas con caractersticas funcionales especficas. Por ejemplo, una estimulacin breve de las clulas, tales como PBMC con
antgenos proteicos o peptdicos, puede resultar en la expresin de los marcadores y citoquinas de activacin, los cuales puede
medirse posteriormente junto con otros marcadores fenotpicos en la superficie de las clulas que responden. El uso de un inhi-
bidor de secrecin tal como brefeldina A o monensina permite la acumulacin intracelular de citoquinas. Posteriormente, las
clulas se fijan, permeabilizan y detectan por un mtodo de citrometra de flujo. Dichos ensayos son tiles para monitorear
subpoblaciones de clulas T que responden a vacunas, agentes de enfermedades infeccionas o cncer. Las propiedades funcio-
nales de otros tipos de clulas, incluidos monocitos, DC y clulas NK, tambin pueden monitorearse usando ensayos funciona-
les con estmulo apropiado.

QUI NASAS

Los intermediarios fosforilados de la activacin celular se pueden identificar usando anticuerpos fosfoespecficos y citometra
de flujo. Estos reactivos son tiles para mapear mecanismos de sealizacin intracelulares, a menudo en el contexto de otros
marcadores fenotpicos de superficie celular. Por lo tanto, la citometra de flujo multicolor puede proveer una evaluacin de
 USP 39 Informacin General/ (1027) Citometra de Flujo 883

clulas individuales en estados de activacin intracelular en poblaciones de clulas complejas. Estos ensayos pueden ser tiles
para la deteccin de estados de sealizacin alterados en clulas cancerosas o en la direccin terapias apropiadas basadas en
las propiedades de sealizacin de las clulas tumorales de un paciente.

APOPTOSIS

La apoptosis, comnmente descrita como muerte celular, es el proceso de muerte celular ocasionada por procesos fisiolgi-
cos regulados. El proceso apopttico se presenta como una serie de cambios morfolgicos, bioqumicos y moleculares en la
clula y se puede iniciar mediante estmulos externos o internos. Un evento central durante la apoptosis es la activacin de
caspasas, una familia de enzimas proteolticas. Las caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas y se activan mediante
otras caspasas o molculas similares. stas forman una cascada que puede llevar a la ruptura de varias protenas citoplasmticas
o nucleares. Se ha informado que la caspasa-3 es crucial para el proceso apopttico, la cual se activa durante las etapas tem-
pranas de la apoptosis.
Los mtodos por citometra de flujo para detectar clulas apoptticas incluyen la medicin de la morfologa, cambios en la
estructura de la membrana, ruptura del ADN por endonucleasas y potencial de la membrana mitocondrial. Se han usado para
este propsito sustratos de caspasas naturales o artificiales o anticuerpos contra la forma activada de la enzima.

VIABILIDAD DE LA CLULA

La citometra de flujo a menudo se usa para discriminar clulas vivas de clulas muertas. El principio de exclusin con colo-
rante de cido nucleico es la base de esta aplicacin. Un colorante de cido nucleico tal como PI o 7-AAD se agrega a las clu-
las en suspensin. Durante el anlisis por citometra de flujo, las clulas que muestran fluorescencia por encima del fondo se
consideran no viables debido a que no pueden excluir el colorante, el cual presenta fluorescencia cuando se une al ADN celu-
lar.

Ensayos de lnmunoglobulinas por Citometra de Flujo

COMPATIBILIZACIN CRUZADA POR CITOMETRA DE FLUJO

Antes del transplante de rganos, se realiza la compatibilizacin cruzada por citometra de flujo (FCXM, por sus siglas en
ingls) en los receptores para detectar anticuerpos antiHLA que puedan ocasionar el rechazo. Los anticuerpos antiHLA se de-
tectan incubando leucocitos con determinado HLA, lneas de clulas B o perlas recubiertas con antgenos HLA con la muestra
de suero, seguido por anticuerpos marcados con fluorescencia de inmunoglobulina antihumana. Los leucocitos se inmunoti-
en para identificar clulas T y B para distinguir entre la actividad de clase 1y 11 de anti-HLA, respectivamente. Adems, tam-
bin ha aumentado el uso del anlisis de donaciones de sangre para detectar anticuerpos anti-HLA para identificar donantes
cuyos hemoderivados pueden presentar un mayor riesgo de ocasionar en los receptores lesiones pulmonares agudas relaciona-
das con la transfusin (TRALI, por sus siglas en ingls).

ANTICUERPOS NEUTRFILOS HUMANOS

Los anticuerpos contra neutrfilos humanos (anti-HNA, por sus siglas en ingls) pueden ocasionar neutropenia y se han rela-
cionado con las TRALI. Las neutropenias autoinmunes se pueden desarrollar en pacientes con trastornos autoinmunes tales co-
mo sndrome de Felty, lupus eritematoso sistmico y tiroiditis de Hashimoto. La ausencia de anticuerpos anti-HNA estrecha el
diagnstico diferencial a causas no inmunes tales como deficiencia en la mdula sea, mielodisplasia o procesos de infiltracin
medular. La citometra de flujo puede detectar anticuerpos antineutrfilos y puede confirmar el origen de la neutropenia o las
TRALI.

ANTICUERPOS CONTRA PLAQUETAS HUMANAS

Los anticuerpos contra plaquetas humanas (anti-HPA, por sus siglas en ingls) se detectan mediante ensayos directos o indi-
rectos de inmunoglobulinas asociadas con plaquetas basados en citometra de flujo. En la prpura trombocitopnica autoin-
mune, no se encuentran con tanta frecuencia anticuerpos libres circulantes (en el suero) como los anticuerpos unidos a pla-
quetas. En los casos de formacin de aloanticuerpos, los anticuerpos del suero se pueden detectar sin evidencia de anticuerpos
asociados con plaquetas.

RESOLUCIN DE PROBLEMAS EN ENSAYOS DE CITOMETRA DE FLUJO

Cuando se desarrolla un mtodo de citometra de flujo, se debe determinar primero el propsito final del ensayo. Para ensa-
yos con propsitos de investigacin, puede ser difcil estandarizar las muestras de clulas, reactivos y protocolos. Los ensayos
destinados para diagnstico de pacientes o para calificar un producto celular para su liberacin antes de la administracin a un
884 (1027) Citometra de Flujo / Informacin General USP 39

paciente requieren de una estandarizacin ms estricta de ensayos y muestras. Los requisitos reglamentarios, el tipo y etapa de
investigacin clnica y el propsito final del ensayo determinan el nivel de rigor requerido para el ensayo.
El desarrollo de ensayos por citometra de flujo debe incluir el establecimiento y calificacin de los parmetros y lmites de
tincin, manipulacin, instrumental y anlisis. Si se asume que el mtodo ha sido desarrollado adecuadamente, que los opera-
dores estn bien capacitados, que el instrumento se ha ajustado de manera adecuada, que se han aplicado los controles apro-
piados para el ensayo y el instrumental y, si fuera necesario, que se han llevado a cabo validaciones del instrumental y del
mtodo, los operadores pueden toparse con instancias en las que ser necesario resolver ciertas problemticas.
Los desafos ms comunes de la citometra de flujo son la alta fluorescencia o fondo con dispersin lateral, tasas anormales
de eventos, alta intensidad de fluorescencia y baja seal de fluorescencia. A continuacin se describen metodologas para dis-
minuir estos problemas.

Alto Contenido de Partculas de Fondo

La manipulacin de clulas en exceso (p.ej., demasiado vrtice), la fijacin inadecuada y la contaminacin bacteriana de las
clulas pueden incrementar las partculas de fondo. Asimismo, si el umbral frontal del instrumento se configura demasiado ba-
jo, los desechos celulares se detectarn como eventos. La manipulacin suave de las clulas, los reactivos frescos y la configura-
cin adecuada del instrumental ayudan a garantizar perfiles de dispersin lateral uniformes.

Alta Fluorescencia de Fondo

La alta intensidad de la fluorescencia se puede atribuir a una concentracin de anticuerpos en exceso, al lavado inadecuado
de las clulas o al bloqueo inadecuado del receptor Fe. Adems, una ganancia inapropiadamente alta del instrumento PMT
puede resultar en un fondo elevado. La concentracin de anticuerpos y la densidad celular uniformes, el lavado y bloqueo ade-
cuados y la configuracin apropiada del instrumento ayudarn a evitar una fluorescencia de fondo anormalmente elevada

Tasa Alta de Eventos

Las tasas anormalmente altas de eventos a menudo se atribuyen a densidades altas de clulas durante la tincin del anticuer-
po o en la muestra de clulas finales. El mezclado inadecuado y la sedimentacin de la muestra de clulas puede resultar en
tasas altas de eventos celulares, al igual que el uso de ventanas inapropiadas o poco uniformes.

Tasa Baja de Eventos

La aglomeracin celular, las densidades celulares finales bajas, los bloqueos en los fluidos del instrumento o el uso de venta-
nas inapropiadas pueden, generalmente, resultar en una deteccin anormalmente baja de eventos. La limpieza, el manteni-
miento y la configuracin adecuadas del instrumento, as como los protocolos de tincin uniformes, pueden lograr resultados
uniformes con sensibilidad suficiente.

Alta Intensidad de Fluorescencia

Al igual que con alta fluorescencia del fondo, una alta fluorescencia celular promedio puede resultar de una cantidad en ex-
ceso de anticuerpos marcados, del lavado de clulas inadecuado o poco uniforme o del bloqueo inadecuado. La inclusin de
detergente en la solucin amortiguadora de lavado, especialmente durante la tincin intracelular, puede ayudar a prevenir la
unin no especfica de anticuerpos.

Intensidad Dbil de Fluorescencia

Son muchos los factores que pueden generar una fluorescencia con intensidad dbil. Los parmetros del instrumento tales
como alineacin deficiente del lser, compensacin inadecuada, configuracin inapropiada, configuraciones de ganancia poco
uniformes y respuesta dbil del lser, pueden afectar negativamente la intensidad de la fluorescencia. Adems, las cuestiones
relacionadas con la fisiologa celular o la preparacin de reactivos, tales como concentracin insuficiente de anticuerpos, ant-
geno blanco lbil o secretado, reactivos de baja calidad o almacenados inadecuadamente (lo que resulta en decaimiento del
fluorocromo) o antgeno blanco inaccesible, pueden resultar en una seal dbil. El desarrollo adecuado de ensayos, el mante-
nimiento apropiado del instrumental y el cumplimiento con protocolos calificados pueden mejorar la intensidad de la seal de
fluorescencia.
La citometra de flujo permite a los investigadores analizar clulas para una gran cantidad de aplicaciones diversas. El nme-
ro y alcance de los ensayos inmunofenotpicos y funcionales est en aumento. Es posible estudiar la presencia de protenas, as
como los procesos celulares y la deteccin de poblaciones poco comunes o anormales. El lector debe referirse a la literatura
tcnica para obtener detalles sobre la aplicacin y el mtodo.
USP 39 Informacin General/ (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas 885

REFERENCIAS

Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Strober W. Current Protocols in Jmmunology. Fourth ed. Hoboken, NJ:
]ohn Wiley and Sons; 1994.
Shapiro HM. Practica/ Flow Cytometry. Fourth ed. Hoboken, NJ; John Wiley and Sons; 2003.

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(1030) CAPITULOS DE VALORACIONES BIOLOGICAS-INFORMACION
GENERAL Y GLOSARIO

El compendio USP-NF contiene cuatro captulos generales relacionados con el desarrollo, validacin y anlisis de valoracio-
nes biolgicas: Diseo y Anlisis de Va/oraciones Biolgicas (111 ), Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas (1032), Validacin
de Va/oraciones Biolgicas (1033) y Anlisis de Valoraciones Biolgicas (1034). Este nuevo captulo propuesto, Captulos de Va/ora-
ciones Biolgicas-Informacin General y Glosario (1030), provee informacin general y algo de material comn para los captu-
los (1032), (1033) y (1034), e incluye un glosario de trminos relacionados con valoraciones biolgicas.
El conjunto de captulos de la USP sobre valoraciones biolgicas se enfoca en valoraciones de potencia relativa. Estas valora-
ciones reconocen la variabilidad inherente en los sistemas de pruebas biolgicas (tanto en animales como en clulas) que se
puede observar entre laboratorios y de un da a otro, la cual compromete la confiabilidad de una medida absoluta de la poten-
cia. En las valoraciones de potencia relativa, la actividad biolgica de un material de Prueba se compara con la actividad de un
Estndar en un sistema de valoracin en el que el uso de un Estndar reduce la influencia de la variabilidad inherente del siste-
ma en la estimacin de la potencia relativa. Las valoraciones de potencia relativa tambin se enfocan en la variabilidad impor-
tante relacionada con la respuesta debida a las diferencias entre los materiales de Prueba y Estndar (si existiese dicha diferen-
cia). Se espera que la Prueba se comporte como una dilucin o concentracin del Estndar y debe presentar la propiedad de
similitud. Aunque estn destinados para las valoraciones biolgicas de potencia relativa, los principios y prcticas desarrollados
en estos captulos pueden tener una aplicacin ms amplia-por ejemplo, en inmunoensayos y valoraciones por unin de re-
ceptor-ligando usadas para determinar la potencia relativa.
El captulo (1032) provee informacin para cientficos que se encuentren desarrollando una nueva valoracin biolgica. Con-
forme a lo mostrado en la Tabla 1, el captulo abarca una variedad de actividades realizadas durante el ciclo de vida de la valo-
racin, con nfasis en el desarrollo que lleva a la validacin, incluyendo la seleccin del sistema de prueba y las consideraciones
del diseo (p.ej., diseo de las placas (plate layout)). Asimismo, el captulo trata estrategias de anlisis de datos que deben
considerarse durante el desarrollo (antes de la validacin) pero que, de rutina, no se tratan posteriormente. Entre dichas estra-
tegias est la seleccin de un esquema de ponderacin, transformacin de datos, si los hubiere, y la seleccin de un modelo
estadstico. Los detalles estadsticos que sustentan estas secciones del captulo (1032) se encuentran en el captulo (1034).
Tabla 1. Secciones Prlnclpales del captulo Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas (1032)
Seccin Ttulo de la Seccin
1 Introduccin
1.1 Propsito y Alcance
1.2 Partes Interesadas
2 Aptitud de las Valoraciones Biolgicas para Su Uso Previsto
2.1 Desarrollo del Proceso
2.2 Caracterizacin del Proceso
2.3 Liberacin de Productos
2.4 Productos Intermedios del Proceso
2.5 Est.:Jbilidad
2.6 Calificacin de Reactivos
2.7 Integridad de los Productos
3 Aspectos Fundamentales de la Valoracin Biolqica
3.1 Valoraciones Biolgicas In Vivo
3.2 Valoraciones Biolgicas Ex Vivo
3.3 Valoraciones Biolgicas (Basadas en Clulas) In Vitro
3.4 Estndar
4 Aspectos Estadsticos de los Elementos Fundamentales de las Valoraciones Biolgicas
4.1 Datos
4.2 Suposiciones
4.3 Heteroqeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin
886 (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

Tabla 1. Secciones Principales del captulo Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas (1032) (Continuacin)
Seccin Ttulo de la Seccin
4.4 Normalidad
4.5 Linealidad de los Datos de Concentracin-Respuesta
4.6 Modelos Comunes de Valoracin Biolgica
4.7 Anlisis de Aptitud
4.8 Valores Aberrantes
4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biolgicas
5 Etapas del Proceso de Desarrollo de la Valoracin Biolgica
5.1 Diseo: Planificacin de la Valoracin, Distribucin por Bloques y Aleatorizacin
5.2 Desarrollo
5.3 Anlisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoracin
5.4 Validacin de la Valoracin Biolgica
5.5 Mantenimiento de Valoraciones Biolgicas

El captulo (1034) provee informacin sobre los anlisis de datos apropiados para las valoraciones biolgicas de potencia re-
lativa comunes, incluyendo modelos de lneas paralelas, de cociente de pendientes, de curvas paralelas y cuantales. El captulo
incluye adems anlisis que sustentan la evaluacin de la aptitud del sistema y de la muestra, y mtodos para combinar resul-
tados de valoraciones independientes (ver la Tabla 2). Este captulo es el ms avanzado estadsticamente de los tres captulos,
pero est diseado para su uso por parte de bilogos y estadsticos. El material conceptual requiere nicamente de experiencia
estadstica mnima. Las secciones sobre mtodos requieren una experiencia estadstica al nivel del captulo Datos Analticos-
Interpretacin y Tratamiento (101 O) y estar familiarizado con la regresin lineal.
Tabla 2. Secciones Principales del captulo Anlisis de Valoraciones Biolgicas (1034)
Seccin Ttulo de la Seccin
1 Introduccin
2 Aspectos Generales del Anlisis de los Datos de la Valoracin Biolgica
3 Modelos de Anlisis
3.1 Respuestas de Valoracin Cuantitativas y Cualitativas
3.2 Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas
3.3 Modelos de Lneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas
3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas
3.5 Modelos de Concentracin-Respuesta de Cociente de Pendientes
3.6 Valoraciones Dicotmicas (Cuantales)
4 Intervalos de Confianza
4.1 Combinacin de Resultados de Mltiples Valoraciones
4.2 Combinacin de Valoraciones Independientes (Mtodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras)
4.3 Mtodos Basados en Modelos
5 Fuentes Adicionales de Informacin

El propsito del captulo (1033) es dar continuacin a los captulos (1032) (desarrollo de valoraciones) y (1034) (desarrollo
de planos para el anlisis de datos). En otras palabras, el captulo (1033) supone una valoracin biolgica completamente de-
sarrollada (incluyendo un plano para el anlisis de datos y al menos valores tentativos para los criterios de aptitud del sistema y
de la muestra, y el formato de la valoracin biolgica) y provee pautas sobre la validacin de dicha valoracin. El captulo trata
las caractersticas de validacin pertinentes a las valoraciones biolgicas de potencia relativa y provee mayores detalles sobre
los mtodos estadsticos usados en la validacin que el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225). Aunque los
principios y prcticas desarrollados en el captulo (1033) estn destinados para las valoraciones biolgicas de potencia relativa,
pueden tener una aplicacin ms amplia. El captulo enfatiza las metodologas de validacin que proveen flexibilidad para
adoptar nuevos mtodos de valoracin biolgica, nuevos medicamentos biolgicos, o ambos (ver la Tabla 3).
Ta bl a 3. Secciones Prmc
1pa 1es d e 1cap1tu
' 1o Va Id ' de Va Ioraciones BioI'ogicas (1033)
i acion
Seccin Ttulo de la Seccin
1 Introduccin
2 Fundamentos de la Validacin de la Valoracin Biolgica
2.1 Protocolo de Validacin para Valoraciones Biolgicas
2.2 Documentacin de los Resultados de la Validacin de la Valoracin Biolgica
2.3 Diseo de Validacin para Valoraciones Biolgicas
2.4 Estrategias de Validacin de las Caractersticas de Desempeo de la Valoracin Biolgica
 USP 39 Informacin General/ (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas 887

Tabla 3. Secciones Principales del captulo Validacin de Valoraciones Biolgicas (1033) (Continuacin)
Seccin Ttulo de la Seccin
2.5 Criterios de Aceptacin Propuestos para la Validacin
2.6 Mantenimiento de la Valoracin
2.7 Consideraciones Estadsticas
3 Ejemplo de Validacin de una Valoracin Biolgica
3.1 Precisin Intermedia
3.2 Exactitud Relativa
3.3 Intervalo
3.4 Uso de los Resultados de la Validacin para Caracterizar una Valoracin Biolgica
3.5 Confirmacin de la Precisin Intermedia y Revalidacin
4 Fuentes Adicionales de Informacin
Apndice Medidas de Localizacin y de Dispersin para Variables de Distribucin Logartmica Normal

GLOSARIO

Este glosario corresponde a valoraciones biolgicas y provee una perspectiva farmacopeica que es congruente con el conjun-
to de captulos sobre valoraciones biolgicas del compendio USP-NF; asimismo, se considera complementario al uso autoriza-
do previo y ofrece un enfoque til para el contexto de las valoraciones biolgicas. En muchos casos, los trminos aqu citados
son de uso comn, aunque carezcan de documentacin, o se definen en el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
(1225) y en la Pauta Q2(Rl) de la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonizacin
o ICH), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Validacin de Procedimientos Analticos: Texto y Metodolo-
ga).1 (El captulo (1225) y la Pauta Q2(Rl) de la ICH concuerdan en las definiciones.) Este Glosario pretende apegarse a estos
usos precedentes, y se proveen notas cuando exista alguna diferencia basada en el contexto de la valoracin biolgica. Las
definiciones del captulo (1225) y de la pauta Q2(Rl) de la ICH se identifican, por ejemplo, mediante"(l 225)" si se tom tal
como se encuentra, o "adaptado del captulo (1225)" si se realiz alguna modificacin menor para su aplicacin en las valora-
ciones biolgicas. La mayora de las definiciones se acompaan con notas que proveen mayor detalle sobre el contexto de las
valoraciones biolgicas.
Los trminos se organizan alfabticamente dentro de cinco secciones por temas:
l. Trminos generales relacionados con las valoraciones biolgicas
11. Trminos relacionados con la realizacin de una valoracin biolgica
111. Trminos relacionados con la precisin y la exactitud
IV. Trminos relacionados con la validacin
V. Trminos relacionados con el diseo y anlisis estadstico
La Tabla 4 presenta cada trmino y la seccin del Glosario en la que se puede encontrar.
Tabla 4. Trminos listados en el Glosario
Trmino Seccin Trmino Seccin
Exactitud 111 Modelo de efectos mixtos V
Anlisis de varianza (ANOVA) V Generacin de modelos estadsticos V
Procedimiento analtico [adaptado de Q2(Rl )] 1 Anidado V
Valoracin 1 Fuera de la especificacin (005, por sus siglas en ingls) 11
Conjunto de datos de la valoracin 1 Paralelismo (de las curvas de concentracin-respuesta) V
Valoracin biolgica 1 Parcialmente cruzado V
Valoracin biolgica 1 Estimacin puntual V
Distribucin en bloques V Potencia [Ttulo 21 del CFR 600.3(s)] 1
Diseo completo por bloques V Precisin 111
Intervalo de confianza V Determinaciones pseudo-repetidas V
Cruzado (y parcialmente cruzado) V Valor P (probabilidad de significancia) V
Diseo de experimentos (DOE, por sus siglas en ingls) Lmite de cuantificacin (lmite inferior de cuantificacin;
[ICH Q8(R2)] V adaptado del captulo (1225)) IV
Linealidad de las diluciones (adaptado del captulo (1225)) IV Efecto aleatorio V
Valoraciones biolgicas directas 1 Error aleatorio 111
Prueba de equivalencia V Factor aleatorio V
Tipos de errores 111 Aleatorizacin V

1 Disponible en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_Rl /Step4/Q2_Rl _Guideline.pdf. Consultada el 29 de mar-

zo de 2012.
888 (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

Tabla 4. Trminos listados en el Glosario (Continuacin)

Trmino Seccin Trmino Seccin
Cuadrado medio esperado V Intervalo (adaptado del captulo (1225)) IV
Diseo experimental V Sesgo relativo 111
Unidad experimental V Potencia relativa 1
Factor V Repetibilidad ((1225)) 111
Diseo factorial V Determinaciones repetidas V
Efecto fijo V Valor de informe 1
Factor fijo V Reproducibilidad (1225) 111
Variabilidad del formato 111 Robustez (adaptado del captulo (1225)) IV
Formato de la valoracin biolgica 11 Corrida 1
Diseo factorial fraccionado V Aptitud de la muestra 11
Diseo factorial completo V Probabilidad de significancia V
Modelo lineal general V Preparaciones similares 1
Coeficiente geomtrico de variacin 111 Similitud (algebraica) 1
Desviacin estndar geomtrica (GSD, por sus siglas en in-
gls) 111 Especificidad (1225) 111
Diseo en bloques incompleto V Error estndar de estimacin V
Independencia V Control estadstico del proceso V
Valoraciones biolqicas indirectas 1 Aptitud del sistema 11
1nteraccin V Error sistemtico 111
Precisin intermedia (adaptado del captulo (1225)) 111 Determinaciones repetidas verdaderas V
Nivel V Sesgo por truncado 111
Linealidad de las diluciones (adaptado del captulo (1225)) IV Error tipo 1 V
Distribucin logartmica normal V Error tipo 11 V
Lmite inferior de cuantificacin (adaptado del captulo
(1225)) IV Validacin de la valoracin IV
Cuadrado medio V Anlisis de los componentes de la varianza V

l. Trminos Generales Relacionados con las Valoraciones Biolgicas

Procedimiento analtico [adaptado de Q2(R1)]: Descripcin detallada de las etapas necesarias para realizar el anlisis.
NOTAS-1. El procedimiento puede incluir, entre otros, la preparacin de la muestra, el Estndar de Referencia y los reacti-
vos; el uso de equipo; la generacin de la curva estndar; el uso de frmulas para los clculos; etctera. 2. La Pauta de la FDA2
provee una lista de la informacin que, por lo general, se debe incluir en la descripcin de un procedimiento analtico.
Valoracin: Procedimiento analtico para determinar la cantidad de uno o ms componentes o la presencia o ausencia de
uno o ms componentes.
NOTAS-1. El trmino Valorar a menudo se usa como verbo sinnimo de analizar o evaluar, tal como en "Voy a valorar (ana-
lizar, evaluar) la presencia de impurezas en el material". En este glosario, valoracin es un sustantivo y es sinnimo de procedi-
miento analtico (q.v.). 2. La frase correr la valoracin significa llevar a cabo el procedimiento analtico conforme a lo especifica-
do. 3. En la prctica comn, valoracin y corrida (q.v.) a menudo se usan de manera intercambiable. Para propsitos de este
glosario, dichos trminos son diferentes. Adems, se puede consultar valoracin biolgica y conjunto de datos de la valoracin.
Conjunto de datos de la valoracin: Se refiere al conjunto de datos usado para determinar una potencia o potencia relativa
nicas para todas las muestras incluidas en la valoracin biolgica.
NoTAS-1. La definicin de un conjunto de datos de la valoracin se puede interpretar, segn sea necesario, como conjunto
mnimo. Puede ser posible determinar una potencia o potencia relativa a partir de un conjunto de datos, pero dicho proceso
podra no realizarse adecuadamente. Esta definicin no pretende dar a entender que un conjunto de datos de la valoracin es
el conjunto mnimo de datos que se pueden usar para determinar una potencia relativa. En la prctica, un conjunto de datos
de la valoracin debe incluir, por lo menos, datos suficientes para evaluar la similitud (q.v.). Tambin puede incluir datos sufi-
cientes para evaluar otras suposiciones. 2. Esta definicin tampoco implica que los conjuntos de datos de la valoracin usados
en conjunto para determinar un valor de informe (q.v.) sean necesariamente independientes el uno del otro, aunque podra
ser conveniente que lo fueran. Cuando una corrida (q.v.) consta de mltiples conjuntos de datos de la valoracin, se debe
evaluar la independencia de los conjuntos de la valoracin dentro de la corrida.
Biovaloracin, valoracin biolgica (En ingls, los trminos bioassay y biological assay se usan de manera
intercambiable): Anlisis (como el de un frmaco) para cuantificar la actividad/actividades biolgicas de uno o ms compo-

2 FDA. Guidance for lndustry. Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. 2000. Disponible en:
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070489.pdf. Consultada el 27 de diciembre de 2011.
USP 39 Informacin General/ (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas 889

nentes mediante la determinacin de su capacidad para producir una actividad biolgica esperada en un cultivo de clulas
vivas (in vitro) o en organismos de prueba (in vivo), la cual se expresa en trminos de unidades.
NOTAS-1. Los componentes de una valoracin biolgica incluyen el procedimiento analtico, el diseo estadstico para la
recoleccin de datos y el mtodo de anlisis estadstico que eventualmente genera la potencia estimada o la potencia relativa.
2. Las valoraciones biolgicas pueden ser directas o indirectas.
Valoraciones biolgicas directas-Valoraciones biolgicas que miden la concentracin de una sustancia requerida para
obtener una respuesta especfica. Por ejemplo, la potencia de la digitalis se puede estimar directamente a partir de la con-
centracin requerida para detener el corazn de un gato. En una valoracin directa, la respuesta debe ser clara y sin ambi-
gedades. La sustancia se debe administrar de tal manera que se pueda medir y registrar fcilmente la cantidad exacta
(umbral de concentracin) requerida para obtener una respuesta.
Valoraciones biolgicas indirectas-Valoraciones biolgicas que comparan la magnitud de las respuestas para concen-
traciones nominalmente iguales de las preparaciones de referencia y de prueba en lugar de las concentraciones de refe-
rencia y de prueba que son necesarias para lograr una respuesta especfica. La mayora de las valoraciones biolgicas en
los compendios USP-NF son valoraciones indirectas que se basan en respuestas cuantitativas o cuantales (s/no).
Potencia [Ttulo 21 del CFR 600.3(s)]: Habilidad o capacidad especfica del producto, segn se indica mediante pruebas de
laboratorio apropiadas o mediante datos clnicos adecuadamente controlados y obtenidos a travs de la administracin del
producto de la manera prevista, para provocar un resultado determinado.
NOTAS-1. A diferencia de una muestra potente, una muestra impotente no tiene capacidad para producir la respuesta espe-
cfica esperada. Las muestras equipotentes producen respuestas iguales con dosis iguales. Por lo regular, la potencia se mide
con respecto a un Estndar de Referencia o preparacin a la que se le ha asignado un valor individual nico (p.ej., 100,0) para
la valoracin; ver potencia relativa. En ocasiones, se usan calificadores adicionales para indicar el estndar fsico empleado (p.ej.,
"unidades internacionales"). 2. Algunos productos biolgicos tienen usos mltiples y valoraciones mltiples. Para tales produc-
tos, pueden existir diferentes lotes de referencia que no presentan respuestas ordenadas uniformemente en toda una coleccin
de distintas valoraciones pertinentes. 3. [Ttulo 21 del CFR 610.1 O] Las pruebas para potencia consistirn en pruebas in vitro o
in vivo, o ambas, que habrn sido especficamente diseadas para cada producto para indicar su potencia de manera adecua-
da a fin de satisfacer la interpretacin de potencia provista por la definicin del Ttulo 21 del CFR 600.3(s).
Potencia relativa: Medida que se obtiene a partir de la comparacin de una Prueba con un Estndar, basndose en la capa-
cidad para producir la potencia esperada.
NOTAS-1. Una perspectiva frecuentemente utilizada se centra en que la potencia relativa es el grado en el que se diluye o
concentra la preparacin de Prueba con respecto al Estndar. 2. La potencia relativa no tiene unidad y se proporciona en la
definicin de cualquier material de prueba, nicamente con respecto al material de referencia y a la valoracin.
Valor de informe: Valor que se comparar con un criterio de aceptacin.
NOTAS-1. El criterio de aceptacin para la comparacin puede encontrarse en la monografa USP o haber sido establecido
por la compaa, p.ej., para la liberacin del producto. 2. El trmino valor de informe est inseparablemente vinculado con el
"uso previsto" de un procedimiento analtico. Las valoraciones se llevan a cabo en muestras para generar resultados que pue-
dan usarse para evaluar algn parmetro. Las valoraciones pueden tener diferentes formatos o valores sumarios para diversos
propsitos (p.ej., liberacin del lote vs calibracin de un nuevo estndar de referencia). El valor de informe probablemente ser
diferente incluso si la mecnica misma de la prueba es idntica. La validacin es necesaria para sustentar las propiedades de
cada tipo de valor de informe. En la prctica, puede existir un documento fsico, que es el procedimiento analtico usado para
ms de una aplicacin, aunque dicho documento debe incluir por separado informacin detallada de cada aplicacin. Alterna-
tivamente, pueden existir documentos distintos para cada aplicacin. 3. Cuando la variabilidad inherente de una respuesta
biolgica, o la del logaritmo de la potencia, impide obtener con un solo conjunto de datos de la valoracin un valor lo sufi-
cientemente exacto y preciso como para cumplir con una especificacin, el formato de la valoracin puede cambiarse, segn
se requiera. El nmero de bloques o repeticiones completas requeridas depende de la exactitud y precisin inherentes de la
valoracin y del uso previsto del valor de informe. Resulta prctico mejorar la precisin de un valor de informe al informar la
potencia media geomtrica de mltiples valoraciones. El nmero de valoraciones usado se determina mediante la relacin en-
tre la precisin requerida para el uso previsto y la precisin inherente del sistema de valoracin.
Corrida: Se refiere a la realizacin del procedimiento analtico con el que se espera obtener precisin y veracidad uniformes;
generalmente, es la valoracin, es decir, el trabajo que puede llevar a cabo un solo analista en un tiempo establecido con un
conjunto determinado nico de factores de valoracin (p.ej., preparaciones estndar).
NOTAS-1. La corrida no necesariamente est relacionada con el conjunto de datos de la valoracion (q.v.). El trmino corrida
es especfico para laboratorio y se relaciona con la capacidad fsica y el ambiente del laboratorio para realizar el trabajo de una
valoracin. Un ejemplo de corrida sera la valoracin simultnea de varias muestras por parte de un analista en un da de traba-
jo prctico. Durante el transcurso de una sola corrida, puede ser posible determinar mltiples valores de informe. Por el contra-
rio, un solo valor de informe puede incluir datos de mltiples corridas. 2. Desde un punto de vista estadstico, una corrida es la
consecucin de los factores asociados con la precisin intermedia (q.v.). Por tanto, la variabilidad dentro de la corrida es la
repetibilidad. Se considera una buena prctica asociar las corridas con factores que representen fuentes significativas de varia-
cin en la valoracin. Por ejemplo, si un nmero de pasajes celulares es una fuente importante de variacin en la respuesta
obtenida de la valoracin, entonces cada cambio en el nmero de pasajes celulares dar inicio a una nueva corrida. Si la va-
rianza asociada con todos los factores que se pudieran asignar a las corridas fuera inapreciable, entonces se podra ignorar la
influencia de las corridas en el anlisis y el anlisis se podra enfocar en combinar conjuntos de datos de anlisis independien-
890 (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

tes. 3. Cuando una corrida incluye mltiples valoraciones, es necesario tomar precauciones con respecto a la independencia de
los resultados de las valoraciones. Los factores que por lo general se asocian a corridas y que pueden generar una falta de inde-
pendencia incluyen preparaciones celulares, grupos de animales, analista, da, una preparacin de un material de referencia
comn y anlisis con otros datos de la misma corrida. Aunque se puede infringir un estricto sentido de independencia debido
a que los conjuntos de valoraciones dentro de una corrida comparten ciertos elementos, el grado en el que se compromete la
independencia puede tener una influencia insignificante sobre los valores de informe obtenidos, lo cual se debe verificar y mo-
nitorear.
Preparaciones similares: Se refiere a la propiedad que indica que la Prueba y el Estndar contienen el mismo componente
efectivo, o los mismos componentes efectivos en proporciones fijas, y todos los dems componentes no tienen efecto en algn
contexto especfico de la valoracin.
NOTAS-1. Contar con preparaciones similares a menudo se resume como la propiedad que indica que la Prueba se compor-
ta como una dilucin (o concentracin) del Estndar. 2. Las preparaciones similares son fundamentales en los mtodos para la
determinacin de la potencia relativa. El uso de preparaciones similares permite calcular, informar e interpretar una potencia
relativa. Ante la ausencia de preparaciones similares, no se puede informar ni interpretar una potencia relativa significativa. 3.
La consecuencia prctica de preparaciones similares es la similitud algebraica (q.v.). (Ver tambin Paralelismo, seccin V.)
Similitud (algebraica): Las curvas de concentracin-respuesta de la Prueba y el Estndar se relacionan algebraicamente de
manera constante con preparaciones similares.
NOTAS-1. Entre los ejemplos de similitud se incluyen el paralelismo (q.v.) de las curvas de concentracin-respuesta y la
igualdad de las ordenadas al origen en los modelos de cociente de pendientes. 2. El no poder demostrar estadsticamente la
falta de similitud entre una Referencia y una Prueba no se considera una demostracin de similitud. Resulta apropiado demos-
trar la similitud en un enfoque de equivalencia; ver los captulos (1032) y (1034). 3. La similitud es por lo regular un criterio de
aptitud de la muestra (q.v.). No obstante, se debe tomar en cuenta que la aptitud es una condicin necesaria, pero no sufi-
ciente, para que las preparaciones sean similares. En la prctica, ante el desconocimiento de las diferencias entre los materiales
de Prueba y Estndar, la demostracin de similitud se acepta como la demostracin de preparaciones similares.

11. Trminos Relacionados con la Realizacin de una Valoracin Biolgica

Configuracin de la valoracin biolgica (tambin conocido como formato de la valoracin): Estrategia de replicacin
dentro de la corrida y entre corridas para la replicacin de los conjuntos de datos de la valoracin que se han determinado por
anlisis de varianza para sustentar el uso de las valoraciones biolgicas.
NOTAS-1. Las modificaciones al formato de la valoracin biolgica pueden ocurrir a medida que se dispone de nueva infor-
macin sobre las fuentes de variabilidad. Dichas modificaciones no incluyen cambios en el esquema de dilucin de las mues-
tras de Prueba o del Estndar ni en la estrategia de replicacin (parte de lo que en ocasiones se denomina configuracin de la
valoracin biolgica). La configuracin de la valoracin puede incluir dimensiones anidadas tales como diseo de la placa,
mltiples placas por da, placas individuales en mltiples das, entre otros. 2. La potencia relativa geomtrica media determina-
da a partir del formato de la valoracin biolgica es el valor de informe, el cual se puede usar para evaluar el cumplimiento con
las especificaciones o como un componente de anlisis subsiguiente (p.ej., evaluacin de la estabilidad).
Fuera de la especificacin (OOS, por sus siglas en ingls): Se refiere a la propiedad de un valor de informe que cae fuera
de su criterio de aceptacin especificado.
NOTA-El trmino fuera de la especificacin no es una propiedad de la valoracin biolgica, sino de las muestras de Prueba. El
trmino se introduce en el captulo (1033) junto con el establecimiento de los criterios de aceptacin para la validacin que
limitan el riesgo de producir resultados de prueba fuera de la especificacin debido a las caractersticas de desempeo de la
valoracin biolgica.
Aptitud de la muestra: Una muestra es apta (se puede usar en la estimacin de potencia) si su curva de respuesta cumple
con los lmites sobre propiedades crticas definidas en el procedimiento de la valoracin.
NOTA-Las propiedades de la curva de respuesta se deben considerar desde un punto de vista general, es decir, incluyendo
valores aberrantes y variabilidad. La ms significativa de estas propiedades para las valoraciones biolgicas es la similitud (q.v.)
con la curva de respuesta del estndar. Asimismo, todos los sistemas de valoracin tienen lmites para el intervalo de valores
sobre los que pueden informar. En el caso de muestras que no cumple con uno o ms de los criterios de aptitud de la muestra
en una valoracin biolgica, no se debe usar la estimacin de potencia obtenida de dichas muestras como un valor de informe
o como un contribuidor para un valor de informe. Para ms informacin consultar tambin el trmino sesgo por truncado en
este Glosario, as como las secciones Aptitud de la Muestra e Intervalo en el captulo general (1032).
Aptitud del sistema: Un sistema de valoracin es adecuado para su uso previsto si es capaz de proveer mediciones legtimas
conforme a lo definido en el protocolo de la valoracin.
NOTA-La aptitud del sistema se puede considerar como la evaluacin de la posibilidad de que exista evidencia acerca de un
problema en el sistema de valoracin. Un ejemplo seran controles positivos y negativos cuando los valores fuera de sus inter-
valos normales sugieren qu sistema de valoracin no trabaja adecuadamente.

111. Trminos Relacionados con la Precisin y la Exactitud

Exactitud (1225): Expresin de la proximidad entre los resultados de prueba obtenidos por el procedimiento y el valor real.
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NOTAS-1. La ICH y la USP ofrecen la misma definicin de exactitud. No obstante, la ISO especficamente considera que la
exactitud tiene dos componentes, el sesgo y la precisin. 3 Esto significa que, para lograr la exactitud conforme a ISO, una me-
dicin debe estar dentro de la diana (tener poco sesgo) y ser precisa. Por el contrario, la pauta Q2(R1) de la ICH indica que la
exactitud, en ocasiones, se denomina "veracidad", aunque no define dicho trmino. La ISO define veracidad como "la proximi-
dad de acuerdo entre el valor promedio obtenido a partir de una serie grande de resultados de prueba y un valor de referencia
aceptado" e indica que "la veracidad, por lo general, se expresa en trminos de sesgo". La pauta Guidance on Bioanalytical
Method Validation del ao 2001 de la FDA4 define el trmino exactitud en trminos de la "proximidad de los resultados de
prueba medios, obtenidos por el mtodo, con el valor verdadero (concentracin) del analito" (nfasis agregado) y es, por lo
tanto, uniforme con el uso de la ICH. Este glosario adopta el enfoque de USP/ICH. Por tanto, exactitud se define como el acuer-
do entre la media (o los resultados esperados) de una valoracin y el valor verdadero, y emplea la frase exacto y preciso para
indicar un sesgo bajo (exacto) y una variabilidad baja (preciso). 2. Se recomienda tomar precauciones considerables durante la
lectura o uso del trmino exactitud. Adems de la falta de uniformidad entre la USP/ICH y la ISO, el uso comn tambin es
poco uniforme. 3. Para propsitos de validacin de una valoracin biolgica, los trminos exactitud y sesgo han sido reempla-
zados con exactitud relativa y sesgo relativo.
Tipos de errores: Dos fuentes de incertidumbre que afectan los resultados de una valoracin biolgica son el error sistemti-
co y el error aleatorio.
Un error sistemtico es aqul que se presenta repetidamente con una magnitud similar y direccin uniforme. ste intro-
duce un sesgo en la determinacin. El diseo experimental efectivo, que incluye aleatorizacin y/o divisin en bloques,
puede reducir el error sistemtico.
Un error aleatorio es aqul cuya magnitud y direccin varan sin un patrn. El error aleatorio es una variabilidad o incerti-
dumbre inherente de la determinacin. La conversin de error sistemtico a aleatorio, a travs del diseo experimental o
la aleatorizacin, incrementa la robustez de una valoracin biolgica y permite un anlisis comparativamente simple de
los datos de la valoracin, aunque puede requerir un tamao de muestra mayor.
Variabilidad del formato: Se refiere a la variabilidad prevista para un formato de valoracin biolgica particular.
Coeficiente geomtrico de variacin: Determinado como antilog(S)-1, donde Ses la desviacin estndar determinada en
la escala logartmica.
NOTA-El coeficiente geomtrico de variacin a menudo se informa como un porcentaje (%GCV, por sus siglas en ingls). Es
importante no confundir el %GCV con el %CV. El %GCV es una medicin de dispersin pertinente a los datos analizados en la
escala [Y= log(X)] transformada logartmicamente, mientras que el %CV es una medicin pertinente a los datos analizados en
la escala (X) original.
Desviacin estndar geomtrica (GSD, por sus siglas en ingls): Se refiere a la variabilidad de los valores transformados en
logaritmos de una respuesta logartmica normal expresada como porcentaje en la escala sin transformar. Se determina como
antilog(S), donde Ses la desviacin estndar determinada en la escala logartmica.
NOTA-Por ejemplo, si la desviacin estndar de la potencia logartmica es S usando logaritmo en base 2, la GSD de la po-
tencia es 100 * 2s.
Precisin intermedia (adaptado del captulo (1225)): Expresa la precisin dentro del laboratorio relacionada con los cam-
bios en las condiciones operativas.
NOTAS-1. Los factores que contribuyen a la precisin intermedia implican cualquier aspecto que pudiera cambiar dentro de
un laboratorio dado y que podran afectar la valoracin, e incluyen das distintos, analistas distintos, equipo distinto, entre
otros. Por consiguiente, la precisin intermedia tiene un alcance "intermedio" entre los extremos de repetibilidad (dentro de la
valoracin) y reproducibilidad (entre laboratorios). 2. Cualquier declaracin de precisin intermedia debe identificar los facto-
res variables. Por ejemplo, "La precisin intermedia asociada con los cambios de equipo y operador es .... " 3. Asimismo, podra
ser valioso identificar por separado la precisin asociada con cada fuente (p.ej., precisin entre analistas). Esto puede formar
parte del desarrollo y la validacin de la valoracin cuando tiene algn valor identificar aquellos factores que contribuyen de
manera importante a la precisin intermedia. 4. Cuando se informa la precisin intermedia, en particular para fuentes indivi-
duales, los analistas deben tener cuidado de distinguir entre la varianza de la precisin intermedia y los componentes de dicha
varianza. La varianza de la precisin intermedia incluye la repetibilidad y, por lo tanto, debe ser necesariamente al menos tan
grande como la varianza de repetibilidad. Un componente de la varianza, p.ej., para el analista, tambin forma parte de la va-
rianza de la precisin intermedia para el analista, pero puede ser insignificante y quizs no requiera tener una magnitud mayor
que la varianza de repetibilidad.
Precisin ((1225)): Medicin del grado de concordancia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimien-
to se aplica repetidamente a mltiples muestreos de una muestra homognea.
NOTAS-1. La precisin se puede considerar en tres niveles: repetibilidad (q.v.), precisin intermedia (q.v.) y reproducibilidad
(q.v.). 2. La precisin se debe investigar usando muestras autnticas y homogneas. No obstante, si no es posible obtener una
muestra homognea, la precisin puede investigarse usando muestras con cantidades agregadas conocidas que simulen una
muestra o solucin muestra verdaderas. 3. La precisin a menudo se expresa como la varianza, desviacin estndar, coeficiente
de variacin o coeficiente de variacin geomtrica.

3 ISO. Norma Internacional 5725-1. Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and Results-Part 1: General Principies and Definitions. Geneva,
Switzerland; 1994.
4 FDA. Guidance for lndustry. Bioanalytical Method Validation. May 2001. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/
Guidances/UCM070107.pdf. Consultada el 7 de diciembee de 2011.
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Sesgo relativo: Medicin del grado de diferencia entre el valor esperado (o medio) y el valor verdadero, expresado como
porcentaje del valor verdadero.
Repetibilidad ((1225)): Se refiere a la expresin de la precisin dentro de un laboratorio en las mismas condiciones operati-
vas durante un intervalo corto de tiempo.
NOTAS-1. La pauta ICH Q2A indica que la repetibilidad tambin recibe el nombre de precisin "intravaloracin". En el con-
texto de la valoracin biolgica, el mejor trmino es intra corrida, mientras que un "intervalo corto de tiempo" se usa para
describir dentro de la corrida. 2. La idea de un "intervalo corto de tiempo" puede ser problemtica con las valoraciones biolgi-
cas. Si una corrida toma varias semanas y consta de un solo conjunto de valoraciones, entonces no sera posible determinar la
precisin intracorrida. Alternativamente, si una corrida consta de dos conjuntos de datos de las valoraciones y se puede llevar a
cabo en un solo da, sera posible evaluar la repetibilidad de la determinacin de la potencia relativa.
Reproducibilidad (1225): Expresa la precisin entre laboratorios.
NOTAS-1. La reproducibilidad incluye contribuciones derivadas de la repetibilidad y de todos los factores que contribuyen a
la precisin intermedia, as como cualquier contribucin adicional de las diferencias entre laboratorios. 2. La reproducibilidad
se aplica a estudios en colaboracin, tales como aqullos realizados para estandarizacin o portabilidad de la metodologa. De-
pendiendo del diseo del estudio en colaboracin, puede ser posible describir por separado los componentes de la varianza
asociados con las fuentes de variabilidad intra y entre laboratorios.
Especificidad (1225): Se refiere a la capacidad de evaluar de manera inequvoca el analito en presencia de aquellos compo-
nentes cuya presencia resulta previsible.
NOTAS-1. Por lo general, estos componentes pueden incluir impurezas, productos de degradacin, componentes de la ma-
triz, entre otros. Ver el captulo (1225) para ms informacin. 2. Esta definicin tambin se relaciona con la selectividad en
otras pautas para mtodos analticos. 3. La especificidad puede significar la medicin del analito especfico de inters y no la
de otro analito similar.
Sesgo por truncado: Se refiere al sesgo que ocurre cuando no se observa o registra alguna porcin de la distribucin de las
respuestas.
NoTAS-1. Cuando existe sesgo por truncado, la distribucin de observaciones registradas no se corresponde con la distribu-
cin real de respuestas. 2. El sesgo por truncado puede ocurrir en una valoracin biolgica que no informa estimaciones de
potencia logartmica fuera de un intervalo de potencia establecido. Por ejemplo, se espera que una muestra con una potencia
real en un lmite de este intervalo no produzca (informe) una estimacin de potencia en aproximadamente la mitad de las
valoraciones en las que aparece. En este ejemplo, la media de las potencias observadas estar sesgada hacia la potencia logart-
mica O.

IV. Trminos Relacionados con la Validacin

Linealidad de las diluciones (adaptado del captulo (1225)): Se refiere a la capacidad (dentro de un intervalo determina-
do) de una valoracin biolgica para obtener potencias relativas medidas que sean directamente proporcionales a la potencia
relativa verdadera de la muestra.
NOTAS-1. Para determinar la linealidad de las diluciones, en ocasiones denominada linealidad analtica de la valoracin bio-
lgica, a travs de un intervalo conocido de valores de potencia relativa, los analistas examinan la relacin entre la potencia
logartmica conocida y la potencia logartmica media observada. Si dicha relacin genera una lnea esencialmente recta con
una ordenada al origen de O y una pendiente de 1, la valoracin tiene una proporcionalidad directa. Si la grfica genera una
lnea esencialmente recta pero la ordenada al origen no es O o la pendiente no es 1, la valoracin tiene una respuesta lineal
proporcional. 2. Evaluar si una pendiente es (cercana a) 1,0 requiere una equivalencia o intervalo de indiferencia a priori. Resul-
ta inadecuado en la prctica estadstica analizar la hiptesis nula que indica que la pendiente es 1,0 contra la alternativa que
indica que no es 1,0 y concluir que una pendiente es 1,0 si esto no se rechaza. La linealidad analtica de la valoracin biolgica
se separa de la consideracin de la forma de la curva de concentracin-respuesta. La linealidad de la concentracin-respuesta
no es un requisito de la linealidad analtica de la valoracin biolgica debido a que sta ltima es posible independientemente
de la forma de la curva de concentracin-respuesta. 3. La linealidad de las diluciones se trata en mayor detalle en el captulo
(1033).
Lmite de cuantificacin (lmite inferior de cuantificacin; adaptado del captulo (1225)): Se refiere a la potencia relativa
conocida ms baja para la que la valoracin tiene una precisin y exactitud adecuadas.
NOTAS-1. Esto se aplica a los resultados de valoracin (potencia logartmica) en lugar del valor de informe. 2. No es comn
determinar el lmite de cuantificacin para las valoraciones biolgicas de potencia relativa. Las valoraciones realizadas en ani-
males con puntos finales de determinacin serolgicos son ejemplos de uso de este trmino.
Intervalo (adaptado del captulo (1225)): El intervalo entre las potencias relativas conocidas superior e inferior (incluyendo
aquellas potencias relativas) por el que se demuestra que la valoracin biolgica tiene un nivel adecuado de precisin, exacti-
tud y linealidad analtica.
NOTA-Esto se aplica a valores de informe (tpicamente una media geomtrica) en lugar de los resultados individuales de la
valoracin.
Robustez (adaptado del captulo (1225)): Se refiere a una medida de la capacidad de un procedimiento analtico para
mantenerse intacto ante variaciones pequeas pero deliberadas en los parmetros del mtodo listados en la documentacin
del procedimiento.
 USP 39 Informacin General/ (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas 893

NOTAS-1. La robustez es una indicacin de la confiabilidad de la valoracin biolgica durante el uso normal. Por ejemplo,
un sistema de valoracin de cultivo celular que es robusto para el nmero de pasajes de clulas puede proveer valores de po-
tencia con exactitud y precisin aceptables en todo un intervalo uniforme de nmeros de pasajes. 2. La norma Q2(Rl) de la
ICH indica que:
La evaluacin de robustez se debe considerar durante la fase de desarrollo y depende del tipo de procedimiento que se
est estudiando. sta debe mostrar la confiabilidad de un anlisis con respecto a las variaciones deliberadas en los parme-
tros del mtodo. Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones analticas, stas ltimas se deben contro-
lar adecuadamente o se debe incluir una declaracin precautoria en el procedimiento. Una consecuencia de la evaluacin
de la robustez deber ser que se establezca una serie de parmetros [q.v.] de aptitud del sistema (p.ej., prueba de resolu-
cin) para asegurar que la validez del procedimiento analtico se mantiene cada vez que se usa. 1
Validacin de la valoracin: Proceso mediante el cual se demuestra y documenta que las caractersticas de desempeo del
procedimiento y su mtodo subyacente cumplen con los requisitos para la aplicacin prevista y que la valoracin es, por tanto,
adecuada para su uso previsto.
NOTA-Las validaciones formales se realizan prospectivamente de acuerdo con un plan escrito que incluye criterios de acep-
tacin justificables sobre los parmetros de validacin. Ver el captulo (1033).

V. Trminos Relacionados con el Diseo y Anlisis Estadstico

Anlisis de varianza (ANOVA): Herramienta estadstica usada para evaluar la contribucin de factores experimentales en la
variabilidad.
Distribucin en bloques: Agrupacin de unidades experimentales relacionadas en diseos experimentales.
NOTAS-1. La distribucin en bloques a menudo se usa para reducir la variabilidad relacionada con un factor que no es de
inters primario. 2. Los bloques pueden consistir, por ejemplo, en grupos de animales (una jaula, una camada o un cargamen-
to), placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas enteras de 96 pocilllos agrupadas por analis-
ta, da o partida de clulas. 3. El objetivo es aislar, mediante diseo y anlisis estadstico, un efecto sistmico, por ejemplo una
jaula, de modo que no obstruya las comparaciones de inters.
En un diseo completo por bloques todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valoracin biolgica, los facto-
res de tratamiento primario son la muestra y la concentracin) se pueden aplicar a las unidades experimentales para dicho
factor dentro de un solo bloque. Se debe tomar en cuenta que los dos factores de tratamiento muestra y concentracin
pueden tener unidades experimentales diferentes. Por ejemplo, si a todos los animales dentro de una jaula se les asigna la
misma concentracin, pero se les asignan muestras nicas, entonces la unidad experimental para concentracin es la jaula
y la unidad experimental para la muestra es el animal; la jaula es un factor de divisin en bloque para la muestra.
En un diseo en bloques incompleto el nmero de niveles de un factor de tratamiento excede el nmero de unidades
experimentales para dicho factor dentro del bloque.
Intervalo de confianza: Se refiere a un intervalo aleatorio producido por un mtodo estadstico que contiene un valor para-
metral verdadero (fijo pero desconocido) con un nivel de confianza declarado en una aplicacin repetida del mtodo estadsti-
co.
NOTA-Ver el captulo (101 O) para ms informacin.
Cruzado (y parcialmente cruzado): Se dice que dos factores estn cruzados (o completamente cruzados) si cada nivel de
cada factor aparece con cada nivel del otro factor. Dos factores estn parcialmente cruzados cuando no estn completamente
cruzados, pero mltiples niveles de un factor aparecen con un nivel comn del otro factor.
NOTAS-1. Por ejemplo, en una valoracin biolgica en la que todas las muestras aparecen en todas las diluciones, las mues-
tras y las diluciones estn (completamente) cruzadas. En un experimento de validacin de valoracin biolgica en el que dos
de cuatro analistas llevan cada uno a cabo valoraciones con el mismo conjunto de muestras durante cada uno de seis das y se
usa un par diferente de analistas en cada da, los analistas estn parcialmente cruzados con los das. 2. Cada factor se puede
aplicar a diferentes unidades experimentales, y los factores pueden ser totalmente cruzados y anidados (q.v.), lo que genera un
diseo de unidad dividida o de grfica dividida (q.v.). 3. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con factores que
estn parcialmente cruzados para llevar a cabo anlisis adecuados. 4. Un diseo en bloques completo aleatorizado (q.v.) es un
diseo en el que un factor de bloque (que a menudo se trata como un factor aleatorio) se cruza con el factor de tratamiento
(que a menudo se trata como un efecto fijo).
Diseo de experimentos (DOE, por sus siglas en ingls) [ICH Q8(R2)]5: Mtodo estructurado y organizado para determi-
nar la relacin entre factores que afectan un proceso y el resultado de dicho proceso.
NOTA-El DOE se usa en el desarrollo de valoraciones biolgicas y en la validacin; ver los captulos (1032) y (1033).
Prueba de equivalencia: Se refiere a una prueba para demostrar la equivalencia (p.ej., similitud o cumplimiento con los cri-
terios de aceptacin de la validacin) de dos cantidades mediante el cumplimiento de un criterio de aceptacin para un inter-
valo.
NOTAS-1. Una prueba de equivalencia difiere de las pruebas estadsticas ms comunes en la naturaleza de las hiptesis esta-
dsticas. La mayora de las pruebas estadsticas comunes son pruebas de diferencia-es decir, la hiptesis nula estadstica es la

5 ICH. Guidance Q8(R2) Pharmaceutical Development. November 2009. Disponible en http://www.fda.gov/downloads/Drugs/

GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM073507.pdf. Consultado el 27 de diciembre de 2011.
894 (1030) Captulos de Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

ausencia de diferencias y la alternativa es que existe alguna diferencia, sin importar la magnitud o la importancia de la misma.
La diferencia puede estar entre una caracterstica de dos poblaciones o entre una caracterstica de una sola poblacin y un
valor aceptado. En el anlisis de equivalencia, la hiptesis nula es que la diferencia no es lo suficientemente pequea, y la hip-
tesis alternativa es que la diferencia es lo suficientemente pequea para que no exista diferencia importante. En una prueba de
diferencia estadstica comn, se puede concluir que no existen pruebas suficientes para establecer el incumplimiento con un
criterio de aceptacin. ste puede ser el resultado de un exceso de variabilidad y/o un diseo inadecuado. En una prueba de
equivalencia, se concluye que los datos cumplen con el criterio de aceptacin (p.ej., las pendientes son paralelas). 2. El proce-
dimiento de pruebas doblemente unilaterales {TOST, por sus siglas en ingls) es un procedimiento estadstico comn usado
para las pruebas de equivalencia. 3. El criterio de aceptacin para el intervalo puede ser unilateral o bilateral. Un ejemplo de
intervalo unilateral es un criterio de aceptacin de validacin para una %GCV de no ms de XX%.
Cuadrado medio esperado: Expresin matemtica de las varianzas estimadas mediante un ANOVA de cuadrados medios.
Diseo experimental: Se refiere a la estructura de asignacin de tratamientos a unidades experimentales.
NOTAS-1. La distribucin en bloques (q.v.), la aleatorizacin (q.v.), la replicacin (q.v.) y la seleccin especfica del diseo
(ver el captulo (1032)) son algunos aspectos del diseo experimental. 2. Los componentes importantes del diseo experimen-
tal incluyen el nmero de muestras, el nmero de concentraciones y la forma en que se asignan las muestras y concentracio-
nes a unidades experimentales y su agrupacin en bloques. 3. El diseo experimental influye en la seleccin de la metodologa
estadstica que se debe usar para lograr el objetivo analtico.
Unidad experimental: Se refiere a la unidad ms pequea a la que se asigna aleatoriamente un nivel de tratamiento distinto.
NOTAS-1. La asignacin aleatoria de los factores de tratamiento a unidades experimentales es esencial en las valoraciones
biolgicas. 2. Los factores de tratamiento diferentes se pueden aplicar a unidades experimentales distintas. Por ejemplo, las
muestras se pueden asignar a las filas en una placa de 96 pocillos, y las diluciones se pueden asignar a las columnas de la
placa. En este caso, las hileras son las unidades experimentales para las muestras, las columnas son las unidades experimentales
para las concentraciones y los pocillos son las unidades experimentales para la interaccin entre muestra y concentracin. 3.
Una unidad experimental debe distinguirse de una unidad de muestreo, en cuya unidad ms pequea se registra una medi-
cin distinta (p.ej., un pocillo). Debido a que la unidad de muestreo es a menudo ms pequea que la unidad experimental,
tratar unidades de muestreo como si fueran unidades experimentales es un error fcil de cometer. Este error se demonina
pseudo-replicacin (q.v.).
Factor: Parmetro de la valoracin o elemento operativo que puede afectar la respuesta de la misma y que vara en un expe-
rimento y entre experimentos.
NOTA-En una valoracin biolgica, habr por lo menos dos factores de tratamiento: muestra y concentracin.
Un factor fijo (efecto fijo) es un factor que se controla y establece deliberadamente a niveles especficos en una valora-
cin biolgica. Se realiza inferencia en los niveles usados en el experimento o en los niveles intermedios. En una valora-
cin biolgica, la muestra y la concentracin son ejemplos de factores fijos.
Un factor aleatorio (efecto aleatorio) es aqul que por lo general no puede ser controlado y cuyos niveles representan
una demostracin de las formas en que dicho factor puede variar. En una valoracin biolgica, los organismos de prueba,
la placa y el da a menudo se consideran factores aleatorios. Tratar un factor como aleatorio o fijo depender del experi-
mento y de las preguntas formuladas.
Diseo factorial: Se refiere al diseo experimental en el que se encuentran mltiples factores, los cuales estn parcial o total-
mente cruzados.
En un diseo factorial completo, cada nivel de un factor se presenta con cada combinacin de niveles de todos los de-
ms factores. Por ejemplo, si los factores son la partida de reactivo y el tiempo de incubacin, para un diseo factorial
completo, se deben incluir todas las combinaciones de tiempo de incubacin y partida de reactivo.
Un diseo factorial fraccionado es un diseo reducido en el que cada nivel de un factor aparece nicamente con un
subconjunto de combinaciones de niveles de todos los dems factores, y algunos efectos de factores (efectos y/o interac-
ciones principales) se confunden deliberadamente con otras combinaciones de efectos de factores. Se debe prestar espe-
cial cuidado al considerar los diseos factoriales fraccionados para propsitos de deteccin y optimizacin. Se considera
que este diseo no presenta riesgos de perder informacin para la validacin.
Modelo lineal general: Modelo estadstico lineal que relaciona factores de estudio, que pueden ser continuos o discretos,
con respuestas experimentales.
Independencia: Para que dos mediciones u observaciones A y B (datos brutos, conjuntos de valoraciones o potencias relati-
vas) sean independientes, los valores de A no deben verse afectados por las respuestas de By viceversa.
NOTA-Una consecuencia de no reconocer la falta de independencia es la caracterizacin deficiente de la varianza. En la
prctica, esto significa que si dos mediciones de potencia o de potencia relativa comparten un factor comn que podra in-
fluenciar el resultado de la valoracin (p.ej., un analista, preparacin celular, incubadora, grupo de animales o alcuota de
muestras estndar) entonces la suposicin inicial correcta es que estas mediciones de potencia relativa no son independientes.
Lo mismo sucede con la falta de independencia cuando se estiman en conjunto dos mediciones de potencia o de potencia
relativa a partir del mismo modelo, o si se relacionan de alguna manera sin incluir en el modelo algn trmino que capture el
hecho de que hay dos o ms mediciones de potencia. A medida que se gana experiencia en las valoraciones, se puede estable-
cer (y monitorear) un fundamento emprico razonable para tratar las mediciones de potencia como independientes incluso si
comparten un nivel comn de un factor. Este es el caso cuando se ha demostrado que un factor prcticamente no tiene efecto
significativo en los resultados a largo plazo de la valoracin biolgica.
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Interaccin: Se dice que dos factores interactan cuando la respuesta de un factor depende del nivel del otro.
Nivel: Se refiere a la ubicacin en la escala de medicin de un factor.
NOTAS-1. Los factores tienen dos o ms niveles distintos. Por ejemplo, si un experimento de validacin de valoracin biol-
gica emplea tres valores de tiempo de incubacin y dos partidas de un reactivo clave, los niveles son las tres veces para el
factor tiempo de incubacin y las dos partidas para el factor partida. 2. Los niveles de un factor en una valoracin biolgica
pueden ser cuantitativos, tales como concentracin, o categricos, tales como muestra (es decir, de prueba y de referencia).
Distribucin logartmica normal: Distribucin de valores (respuestas o potencias de la valoracin) en las que los logaritmos
de los valores tienen una distribucin normal.
NOTAS-1. La mayora de las mediciones en la valoracin biolgica de potencia relativa presentan una distribucin logartmi-
ca normal. 2. La distribucin logartmica normal es una distribucin sesgada que se caracteriza por un incremento en la varia-
bilidad con un aumento en el nivel de respuesta.
Cuadrado medio: Clculo dentro del ANOVA que representa la variabilidad asociada con un factor experimental.
Modelo de efectos mixtos: Modelo estadstico que incluye efectos fijos y aleatorios.
Generacin de modelos estadsticos: Especificacin matemtica de la relacin entre ingresos (Xs) y salidas (Ys) de un proce-
so, p.ej., la relacin concentracin-respuesta en la valoracin biolgica o la generacin de un modelo de los efectos de fuentes
importantes de variacin en la medicin de potencia.
NOTAS-1. La generacin de modelos incluye mtodos para capturar la dependencia que tiene la respuesta de las muestras,
la concentracin, unidades experimentales y los grupos o distribucin de factores en bloques en la configuracin de la valora-
cin. 2. La generacin de modelo para datos de la valoracin biolgica requiere tomar una gran cantidad de decisiones, algu-
nas de las cuales se basan en el diseo de la valoracin y en los datos. Para datos continuos, se puede seleccionar entre mode-
los lineales o no lineales. Para datos discretos, se puede seleccionar entre modelos logit/log dentro de una familia ms grande
de modelos lineales generalizados. Existe literatura enfocada en la limitacin de valoraciones con diluciones en la que se aboga
por los modelos de Poisson y los modelos de binomios en cadena de Markov. Para los datos de la valoracin biolgica, se
pueden usar modelos de efectos fijos o modelos de efectos mixtos. Por un lado, existe una mayor disponibilidad de software
para modelos de efectos fijos cuya configuracin es menos exigente para los estadsticos. Por otra parte, los modelos mixtos
tienen algunas ventajas sobre los fijos: se acomodan ms a los datos faltantes y, lo ms importante, pueden permitir que cada
bloque tenga distintas pendientes, asntotas, concentraciones medias efectivas, requeridas para inducir un efecto del 50%
(EC 50) o potencias relativas. En particular, cuando el analista emplea modelos de lneas rectas ajustados a respuestas no lineales
o en sistemas de valoracin en los que la curva de concentracin-respuesta vara entre bloques, el modelo mixto captura el
comportamiento del sistema de valoracin de manera ms realista e interpretable. 3. Resulta esencial que cualquier metodolo-
ga para la generacin de modelo para datos de la valoracin biolgica utilice todos los datos disponibles de manera simult-
nea para estimar la variacin (o, en un modelo mixto, cada una de varias fuentes de variacin). Puede ser necesario transfor-
mar las observaciones antes de generar el modelo; incluir un modelo de varianza; o ajustar un modelo de medias (en el que
existe un efecto previsto para cada combinacin de muestra y concentracin) para obtener estimaciones combinadas de varia-
cin.
Anidado: Se dice que un factor A est anidado dentro de otro factor B si los niveles de A son diferentes para cada nivel de B.
NOTAS-1. Por ejemplo, en un experimento de validacin de valoracin biolgica, dos analistas pueden cada uno llevar a
cabo valoraciones en cinco das. Si los das naturales para el primer analista son distintos de los del segundo analista, los das
estn anidados dentro del analista. 2. Los factores anidados tienen una relacin jerrquica. 3. Para que dos factores estn ani-
dados, deben cumplir con lo siguiente: a) aplicarse a unidades experimentales de diferentes tamaos; b) la unidad experimen-
tal ms grande contiene ms de una de las unidades experimentales ms pequeas; y c) el factor aplicado a la unidad experi-
mental ms pequea no est totalmente cruzado (q.v.) con el factor aplicado a la unidad experimental ms grande. Cuando se
cumplen las condiciones (a) y (b), y los factores estn parcialmente cruzados, entonces el experimento est parcialmente cru-
zado y parcialmente anidado. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con esta estructura para llevar a cabo anli-
sis adecuados.
Paralelismo (de las curvas de concentracin-respuesta): Calidad en la que las curvas de concentracin-respuesta de la
muestra de Prueba y del Estndar de Referencia son idnticas en forma y presentan nicamente una diferencia horizontal que
es una funcin constante de la potencia relativa.
NOTAS-1. Cuando las preparaciones de Prueba y de Referencia son similares (q.v.) y las respuestas de la valoracin se grafi-
can en funcin de los logaritmos de las concentraciones, la curva resultante para la preparacin de Prueba ser la misma que
para el Estndar pero desviada horizontalmente por una cantidad que es el logaritmo de la potencia relativa. Debido a esta
relacin, la similitud (q.v.) a menudo se equipara con paralelismo, pero son conceptos distintos. Ver la seccin 3.5, Modelos de
Concentracin-Respuesta de Cociente de Pendientes, del captulo (1034), en los que las muestras con relaciones similares de con-
centracin-respuesta tienen una ordenada al origen comn (o casi comn) pero pueden diferir en sus pendientes. 2. En la
prctica, no es posible demostrar que las formas de dos curvas sean idnticas. En lugar de esto, las dos curvas demuestran
tener una forma algebraica los suficientemente similar (equivalente). Se debe tomar en cuenta que similar debe interpretarse
como "se cuenta con evidencia de que las dos curvas son lo suficientemente cercanas en forma" en lugar de "no se cuenta
con evidencia de que las dos curvas sean diferentes en forma". 3. La evaluacin de paralelismo depende del tipo de funcin
usada para ajustar la curva de respuesta. El paralelismo para una valoracin no lineal que usa un ajuste logstico de cuatro par-
metros significa que (a) las pendientes de las curvas de la Prueba y del Estndar de Referencia que cambian rpidamente (es
decir, la pendiente de la tangente con la curva, donde la primera derivada es un mximo) deben ser similares; y (b) las asnto-
896 (1 030) Captulos de Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

tas superior e inferior de las curvas de la respuesta (mesetas) deben ser similares. Para anlisis de lneas rectas, las pendientes
de las lneas deben ser similares.
Estimacin puntual: Estimacin de un valor individual obtenida a partir de clculos estadsticos.
NOTAS-1. Los ejemplos son el sesgo relativo promedio, la %CVG y la potencia relativa. 2. La estimacin puntual puede ser
ms relevante con una estimacin de intervalo (intervalo de confianza; q.v.) que emplea un intervalo para expresar la incerti-
dumbre en la determinacin de la estimacin puntual.
Determinaciones pseudo-repetidas: Se refiere a la identificacin incorrecta de muestras obtenidas a partir de unidades ex-
perimentales como independientes y, por tanto, como determinaciones repetidas verdaderas cuando en realidad no son inde-
pendientes.
NOTAS-Las determinaciones pseudo-repetidas resultan en inferencias errneas debido a la asignacin incorrecta de variabili-
dad y a la aparicin de un nmero de determinaciones repetidas aparentemente mayor al real. 2. El no reconocer las determi-
naciones pseudo-repetidas es peligroso puesto que se trata de un error fcil de cometer y sus consecuencias pueden ser serias.
Por ejemplo, las determinaciones pseudo-repetidas comnmente surgen cuando los analistas realizan una serie de diluciones
para cada muestra en tubos (la serie de diluciones se puede realizar mediante diluciones en serie, mediante diluciones de un
solo punto o mediante cualquier esquema de dilucin conveniente). Posteriormente, el analista transfiere cada dilucin de ca-
da muestra a varios pocillos en una o ms placas de valoracin. Por consiguiente, los pocillos son determinaciones pseudo-
-repetidas puesto que son simplemente alcuotas de un solo proceso de dilucin y por tanto no representan preparaciones in-
dependientes. 3. Una manera simple para analizar datos obtenidos de determinaciones pseudo-repetidas es promediar las de-
terminaciones pseudo-repetidas (si se usa una transformacin de los datos observados, sta debe aplicarse antes de promediar
las determinaciones pseudo-repetidas) antes de ajustar cualquier tipo de modelo de concentracin-respuesta. En muchos siste-
mas de valoracin, promediar determinaciones pseudo-repetidas dejara a la valoracin sin ninguna determinacin repetida.
Una forma ms compleja de usar los datos que contienen determinaciones pseudo-repetidas consiste en emplear un modelo
mixto que trate las determinaciones pseudo-repetidas como un efecto aleatorio distinto. Aunque el valor de las determinacio-
nes pseudo-repetidas es generalmente limitado, pueden ser tiles cuando se cumplen dos condiciones: (a) la variacin de las
determinaciones pseudo-repetidas (es decir, entre pocillos) es muy grande en comparacin con la variacin asociada con las
determinaciones repetidas y (b) el costo de las determinaciones pseudo-repetidas es mucho menor que el costo de las unida-
des experimentales repetidas.
Valor P (probabilidad de significancia): Se refiere a la probabilidad de observar, en ensayos repetidos, que el resultado ex-
perimental es tan o ms extremo que el observado si la hiptesis nula fuera verdadera.
NOTAS-1. Ms extremo significa ms lejano a la hiptesis nula. 2. Comnmente, P< 0,05 se considera un umbral para indi-
car las diferencias estadsticamente significativas, aunque se puede usar cualquier valor para el umbral. Las bases para seleccio-
nar el umbral son los riesgos (costos) de tomar decisiones errneas; ver error tipo/ y error tipo 11.
Aleatorizacin: Proceso de asignacin para tratamiento de unidades experimentales basado en la probabilidad de que todos
los subgrupos de unidades de igual tamao tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado.
NOTAS-1. El mecanismo de probabilidad puede ser un proceso fsico sin sesgo (tirar dados sin sesgo, lanzar una moneda,
sacar de una urna bien revuelta), tablas de nmeros aleatorios o nmeros aleatorizados generados por computadora. Se debe
tener cuidado con la seleccin y uso del mtodo. Resulta una buena prctica utilizar un generador de nmeros aleatorios com-
putarizado validado. 2. El uso de aleatorizacin puede ayudar a prevenir que el error sistemtico se asocie con muestras parti-
culares o con un patrn de dilucin y que ocasione sesgo. Por ejemplo, en valoraciones biolgicas de 96 pocillos, los efectos
de la placa pueden ser importantes y ocasionar sesgo en respuestas observadas o medidas sumarias. En estudios con animales,
son varios los factores relacionados con animales individuales que pueden influenciar las respuestas. Si no se demuestra de ma-
nera rutinaria que los factores extraos que influencian los estudios que usan placas o los estudios que usan animales han sido
eliminados o minimizados hasta un grado que los convierta en insignificantes, la aleatorizacin ser esencial para obtener da-
tos sin sesgo requeridos para el clculo de la potencia verdadera. 3. La aleatorizacin es una buena prctica incluso cuando
existen pruebas de que factores operativos (p.ej., ubicacin, tiempo, lote de reactivo) tienen un efecto menor o nulo sobre el
sistema de valoracin. Aunque la aleatorizacin puede no proteger una valoracin individual (o quizs un bloque de una valo-
racin) de un factor operativo (quizs recientemente) importante, la aleatorizacin provee la seguridad de que los resultados
de un conjunto de valoraciones no presentan sesgo debido a factores operativos.
Determinaciones repetidas: Se refiere al proceso en el que mltiples unidades experimentales independientes reciben el
mismo nivel de un factor de tratamiento.
NOTAS-1. El propsito de las determinaciones repetidas es minimizar los efectos de fuentes de variabilidad aleatoria incon-
trolables. 2. Las determinaciones repetidas pueden ocurrir completamente en bloques aleatorios o en todos los bloques. Por lo
general, las determinaciones repetidas dentro de bloques se denominan pseudo-replicacin (q.v.). 3. La determinacin repeti-
da de factores que contribuyen en mayor medida a la variabilidad, o factores que estn en los niveles ms altos en un diseo
anidado, por lo general generan la reduccin ms efectiva de variabilidad aleatoria.
Determinaciones repetidas verdaderas: Se refiere a las muestras basadas en unidades experimentales independientes.
Error estndar de estimacin: Se refiere a una medicin de la incertidumbre de una estimacin de un valor de informe u
otro parmetro debida a la variacin del muestreo
NOTAS-1. En las valoraciones biolgicas, el enfoque se centra en la precisin (error estndar) de la potencia relativa. 2. Los
errores estndar se pueden minimizar con determinaciones repetidas adicionales. 3. Tcnicamente, el error estndar de una
estimacin es la desviacin estndar de la distribucin de muestreo de la estimacin. El trmino error estndar se usa para dis-
 USP 39 Informacin General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 897

tinguir entre este uso de desviacin estndar (que depende del tamao de la muestra) y el uso comn en el laboratorio en el
que la desviacin estndar (o coeficiente de variacin) se usa para caracterizar la precisin de mediciones individuales obteni-
das de un procedimiento. Esta ltima precisin no depende del tamao de la muestra.
Control estadstico del proceso: Conjunto de mtodos estadsticos empleados para monitorear desviaciones y tendencias
en un proceso.
Error tipo 1: Se refiere al error cometido al juzgar el anlisis de los datos, en el cual se acepta la hiptesis alternativa cuando
sta es falsa.
NOTA-La probabilidad de un error tipo 1 por lo general se indica mediante a.
Error tipo 11: Se refiere al error cometido al juzgar el anlisis de los datos, en el cual se rechaza Ja hiptesis alternativa cuando
sta es verdadera.
NOTA-La probabilidad de un error tipo 11 por lo general se indica mediante f3 .
Anlisis de los componentes de la varianza: Anlisis estadstico que separa las contribuciones a la variabilidad total de los
componentes asociados con los factores que influyen en la valoracin tales como el analista, el da o el instrumento.

(1031) BIOCOMPATIBILIDAD DE LOS MATERIALES USADOS EN

ENVASES DE MEDICAMENTOS, DISPOSITIVOS MDICOS E IMPLANTES

Este captulo proporciona pautas para la identificacin y realizacin de los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad
de los envases de medicamentos, cierres elastomricos, dispositivos mdicos e implantes. La biocompatibilidad se refiere a la
tendencia de estos productos a mantenerse biolgicamente inertes durante todo su perodo de contacto con el organismo.
Los procedimientos de prueba de biocompatibilidad nombrados en este captulo estn diseados para detectar las caractersti-
cas no especficas de reactividad biolgica, fsicas o qumicas de los productos mdicos o de los materiales usados en su cons-
truccin. Junto con las pruebas qumicas, estos procedimientos biolgicos se pueden usar para detectar e identificar la toxici-
dad inherente o adquirida de los productos mdicos antes o durante su fabricacin y procesamiento.
En los siguientes captulos generales se hace referencia a los procedimientos de prueba preclnicos para evaluar la seguridad
de los elastmeros, plsticos u otros polmeros usados en la elaboracin de productos mdicos: Medicamentos Inyectables yen
lmplantes(1 )e .(-!lftil:ma\<-29'.i!i)t Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro (87), Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo (88), Dispositi-
vos Mdicos-Pruebas de Endotoxinas Bacterianas y Pirgenos (161 ), Tapones Elastomricos para Inyectables (381 ), Sstems. de
Envases Plsticos y sus. Matef'fales de C<a~,s(rucc6{1 <MJ>,. Materiqes P#1.stit:x>s de CPnstrl,Jccin (661 .1) y Sistemas de Envases Plsti-
cos para Uso Fqrrnacutfc(661.2:) .. C~F~i~m~-21~~ Los procedimientos de prueba in vitro e in vivo especficos para evaluar la bio-
compatibilidad de productos mdicos en pacientes se describen en (87) y en (88).
Los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad de un producto mdico o de los materiales empleados en su elabora-
cin se han categorizado como un panel de efectos biolgicos (procedimientos de toxicidad): citotoxicidad, sensibilizacin,
irritacin o reactividad intracutnea, toxicidad sistmica aguda, toxicidad subcrnica (repetida), genotoxicidad, implantacin,
hemocompatibilidad, toxicidad crnica (duracin de ms de 10% de la expectativa de vida del animal de prueba o mayor de
90 das), carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradacin. 1 En la Tabla 7 se indican los captulos
generales de Ja USP referentes a los procedimientos de toxicidad para estas categoras. Adems, la pirogenicidad, un tema de
toxicidad especial, se evala en Prueba de Pirgenos (151) y en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Actualmente no existen
captulos generales que detallen los requisitos2 de las pruebas de toxicidad subcrnica, genotoxicidad, toxicidad crnica, carci-
nogenicidad, hemotoxicidad, toxicidad reproductiva o biodegradacin.
Tabla 1. Procedimientos de Determinacin de Toxicidad en los Captulos Generales de la USP
Efecto Biolgico Captulo General de la USP
Citotoxicidad Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro (87)*
Sensibilizacin Pruebas de Sensibilizacin (1184)
Irritacin o reactividad intracutnea Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo (88)t
Toxicidad sistmica (toxicidad aguda) Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo (88)
Implantacin Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo (88)
* Los captulos generales adicionales que se refieren a este efecto biolgico incluyen (161), (381), (p6l), (661.1) y<661.2) (AF01-may-2106)
t Los captulos generales adicionales que se refieren a este efecto biolgico incluyen o >e (F Ol"maY-2016)' (161 ), (381 ), <661), (661.1) y (661.2).
IAF U1-mav-2Hl6)

1 Documento ISO 10993-1 :1997 (o versin actualizada) titulado Biological Evaluation of Medica/ Devices-Part 1: Evaluation and Testing.
2 Ver OECD Guidelines for Testing of Chemicals en www.oecd.org.
898 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados/ Informacin General USP 39

Cambio en la redaccin:

ENVASES DE MEDICAMENTOS

Biocompatibilidad de los Envases de Plstico y de Otros Polmeros para Medicamentos

Los envases farmacuticos consisten en un recipiente y un cierre. Los envases de plstico pueden estar formados por polme-
ros que tras su extraccin no alteran la estabilidad del producto que contienen ni muestran toxicidad. Los requisitos de la
prueba de biocompatibilidad para los envases de medicamentos se especifican en (1 ), (661 ), {661.1 y {661.2) . (AF Olmy-2016)
Segn se indica en estos captulos, el plstico u otras porciones polimricas de estos productos se prueban segn los procedi-
mientos definidos en (87). Los plsticos u otros polmeros que no cumplan con los requisitos de Pruebas de Reactividad Biolgi-
ca, in Vitro (87) no son materiales adecuados para envases de medicamentos. Los materiales que cumplen con los requisitos in
vitro estn calificados como materiales biocompatibles sin la necesidad de pruebas adicionales y se pueden usar para fabricar
envases de medicamentos. Si se desea una designacin de clase (clases 1-VI) para los plsticos u otros polmeros, hay que reali-
zar los procedimientos de prueba adecuados que se presentan en la seccin Pruebas In Vivo y Designacin de Clase.

Cierres Elastomricos

Los cierres elastomricos son cierres que se pueden perforar con una jeringa y mantener su integridad debido a sus propie-
dades elsticas. Los materiales elastomricos pueden estar compuestos de varias entidades qumicas, incluyendo materiales de
relleno, pigmentos, plastificantes, estabilizadores, aceleradores, agentes vulcanizantes y un polmero natural o sinttico. Estos
materiales se usan para la fabricacin de un producto que tenga las propiedades fsicas elastomricas deseadas y a menudo
demuestran reactividad biolgica-degeneracin y malformacin celular-cuando se someten a pruebas con cultivos celulares
in vitro.
La biocompatibilidad de un material elastomrico se evala segn el protocolo de prueba de dos etapas especificado en
Procedimientos para Prueba Biolgica en (381 ). A diferencia de los plsticos u otros polmeros, un material elastomrico que no
cumple con los requisitos de las pruebas de la primera etapa (in vitro) puede aceptarse como material biocompatible si pasa
las pruebas de la segunda etapa (in vivo) que son la Prueba de Inyeccin Sistmica y la Prueba lntracutnea descritas en (88). No
se hace distincin de clase ni de tipo entre los materiales elastomricos que cumplen con los requisitos de las pruebas de la
primera etapa y los aceptables como materiales biocompatibles al cumplir con los requisitos de la segunda etapa. Los materia-
les elastomricos no reciben una designacin de clase 1-VI.

Cambio en la tedtJccln:

DISPOSITIVOS MDICOS E IMPLANTES

Los dispositivos mdicos e implantes etiquetados como apirgenos, en contacto directo o indirecto con el sistema cardiovas-
cular u otros tejidos blandos del cuerpo, cumplen con los requisitos descritos en (161 ). Los productos detallados en este cap-
tulo que cumplen con los criterios son equipos de administracin de soluciones, equipos de extensin, equipos de transferen-
cia, equipos de administracin de sangre, catteres intravenosos, dializadores y tubos y accesorios para dilisis, equipos para
transfusin e infusin y catteres para la administracin intramuscular de frmacos. Los criterios descritos no se aplican a los
productos mdicos tales como productos ortopdicos, guantes de ltex y apsitos para heridas.
Los requisitos de prueba descritos o a los que se hace referencia en (161) incluyen los requisitos de Esterilidad, Endotoxinas
bacterianas, Pirgenos y Otros requisitos. En (85) se define un procedimiento para evaluar la presencia de endotoxinas bacteria-
nas y los lmites se definen en Endotoxinas Bacterianas en (161 ). Para los dispositivos en que no se puede realizar la Prueba de
Endotoxinas Bacterianas (85) debido a caractersticas de promocin o inhibicin no eliminables, se aplica la Prueba de Pirgenos
(151 ). Los procedimientos para evaluar dispositivos mdicos que contienen vas estriles se definen en Dispositivos Estriles en
Pruebas de Esterilidad (71 ). En la Prueba de Seguridad en (88) se define un procedimiento para evaluar la seguridad de los dispo-
sitivos mdicos.
Los componentes de plstico o de otros polmeros de los dispositivos mdicos cumplen con los requisitos especificados para
los plsticos y otros polmeros en (661), (661.1) .y(661.2) (AFOlmay.2106); los fabricados con elastmeros cumplen con los re-
quisitos en (381 ). Segn se indica en estos captulos, la biocompatibilidad de las porciones de plstico, de otros polmeros y los
elastmeros de estos productos se analizan conforme a los procedimientos descritos en (87). Si tambin se requiere la designa-
cin de clase para un plstico u otro polmero, se realizan procedimientos de prueba adecuados descritos en (88).
Al igual que para los cierres elastomricos, los materiales elastomricos que no cumplen con los requisitos in vitro pueden
estar calificados como materiales biocompatibles y usarse en la elaboracin de dispositivos mdicos si cumplen con los requisi-
tos de la Prueba de Inyeccin Sistmica y la Prueba lntracutnea en (88). Al igual que para los envases de medicamentos, los
plsticos y otros polmeros que no cumplen con los requisitos de la prueba in vitro no son materiales aptos para ser utilizados
en dispositivos mdicos.
 USP 39 Informacin General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 899

PRUEBAS IN VITRO, PRUEBAS IN VIVO V DESIGNACIN DE CLASE PARA PLSTICOS V OTROS

POLMEROS

Los requisitos de prueba especificados en (87) y (88) estn diseados para determinar la reactividad biolgica de cultivos
celulares de mamferos y la respuesta biolgica de animales a los materiales elastomricos, plsticos y de otros polmeros que
estn en contacto directo o indirecto con el paciente. La reactividad biolgica de estos materiales puede depender tanto de las
caractersticas de sus superficies como de sus componentes qumicos extrables. Los procedimientos de prueba detallados en
estos captulos a menudo se pueden realizar con el material o un extracto del material en anlisis, a menos que se especifique
algo diferente.

Preparacin de Extractos

La evaluacin de la biocompatibilidad de un producto mdico completo a menudo no es realista; por lo tanto, el uso de
porciones o extractos representativos de materiales seleccionados puede ser la nica alternativa prctica para realizar los ensa-
yos. Cuando se usan porciones representativas de los materiales o extractos de los materiales en anlisis, es importante tener
en cuenta que las materias primas pueden sufrir cambios qumicos durante la fabricacin, el procesamiento y la esterilizacin
de un producto mdico. Si bien la prueba in vitro de materias primas puede servir como un procedimiento de examen inicial
importante, hay que hacer una evaluacin final de la biocompatibilidad de un producto mdico con porciones del producto
terminado y esterilizado.
Los extractos se preparan de acuerdo con los procedimientos expuestos en (87) y en (88). Las extracciones se pueden reali-
zar a diversas temperaturas (121 , 70, 50 o 37) durante diferentes intervalos de tiempo (1 hora, 24 horas o 72 horas) y en
medios de extraccin diferentes. La eleccin del medio de extraccin para los procedimientos de Pruebas de Reactividad Biolgi-
ca, in Vitro (87) incluye la Inyeccin de Cloruro de Sodio (0,9% NaCI) o un medio de cultivo de tejidos con o sin suero. Cuando
se usa un medio con suero, la temperatura de extraccin no puede exceder de 37. El medio de extraccin in vivo incluye los
medios descritos en (88) o el disolvente al cual se expone el medicamento o dispositivo mdico.
Al elegir las condiciones de extraccin, hay que seleccionar las variables de temperatura, disolvente y tiempo que mejor si-
mulen las condiciones "de uso" del producto. Se pueden realizar muchas pruebas en diferentes condiciones para simular varia-
ciones en las condiciones "de uso". Si bien la seleccin cuidadosa de las condiciones de extraccin permite la simulacin de las
condiciones de fabricacin y procesamiento en la prueba de materias primas, se realizar una prueba de la biocompatibilidad
del producto con el producto terminado y esterilizado.

Pruebas In Vitro

Los procedimientos descritos en (87) incluyen una Prueba de Difusin en Agar (prueba de contacto indirecto), una Prueba de
Contacto Directo y una Prueba de Elucin (prueba de extraccin). La muestra es biocompatible si los cultivos celulares no mues-
tran ms que una reactividad leve (Grado 2) al material de prueba, como se describe en (87). La Prueba de Difusin en Agar
est diseada para evaluar la biocompatibilidad de los materiales elastomricos. El material se coloca sobre una capa de agar
superpuesta a la monocapa celular, que protege a las clulas contra el dao fsico debido al material y permite que las sustan-
cias qumicas o materiales lixiviables difundan desde el elastmero y entren en contacto con la monocapa celular. Los extractos
de materiales elastomricos se analizan colocando papel de filtro saturado con un extracto del elastmero sobre la superficie
del agar solidificado. La Prueba de Contacto Directo est diseada para materiales elastomricos o plsticos que no daarn fsi-
camente las clulas con las que entren en contacto directo. Toda sustancia qumica lixiviable difunde desde el material al me-
dio de crecimiento suplementado con suero y entra en contacto directo con la monocapa celular. La Prueba de Elucin est
diseada para evaluar los extractos de materiales polimricos. El material se puede aplicar directamente al medio de cultivo de
tejidos.
La realizacin de la Prueba de Difusin en Agar o la Prueba de Contacto Directo junto con la Prueba de Elucin es el protocolo
de prueba preferido. La extraccin del producto o los materiales para la Prueba de Difusin en Agar o la Prueba de Elucin se
efecta segn se describe en Preparacin de Extractos.

Pruebas In Vivo y Designacin de Clase

De acuerdo con los requisitos de inyeccin e implantacin especificados en la Tabla 7 en (88), los plsticos y otros polmeros
reciben una designacin de clase entre la clase 1y la clase VI. Para obtener la designacin de clase de un plstico u otro pol-
mero, se producen extractos del material de prueba en diversos medios segn los procedimientos especificados.
Para evaluar la biocompatibilidad, los extractos se inyectan por va sistmica e intracutnea en ratones y conejos o cobayos.
Segn los requisitos de inyeccin especificados, un plstico u otro polmero puede pertenecer inicialmente a la clase 1, 11, 111 o
V. Si adems de la prueba de inyeccin, se realiza una prueba de implantacin usando el material en s, el plstico u otro pol-
mero puede clasificarse como clase IV o clase VI.
900 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Informacin General USP 39

BIOCOMPATIBILIDAD DE DISPOSITIVOS MDICOS E IMPLANTES

Adems de la evaluacin de productos mdicos para propsitos farmacopeicos segn los procedimientos especificados en '
f!:!1\lll'illltlllrtS, (87), (88), (161), (381), Bll'lll\B'lali~Plrl~litlll, los dispositivos mdicos e implantes se
en a su capacidad de sensibilizacin, toxicidad subcrnica, genotoxicidad, hemocompatibilidad, toxicidad cr-
nica, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradacin segn lo exijan los organismos regulatorios.
Las pautas suministradas por los organismos regulatorios indican que el nmero de pruebas al que se somete un dispositivo
mdico o un implante depende de los siguientes factores: (1) la similitud y singularidad del producto con respecto a los pro-
ductos previamente comercializados ("comparables") segn se considera en el Diagrama de Flujo de Decisin; (2) la magnitud y
duracin del contacto entre el producto y el paciente, segn se describen en la Categorizacin de Dispositivos Mdicos; y (3) los
materiales que componen el producto segn se considera en los apartados Diagrama de Flujo de Decisin y Prueba In Vivo y
Designacin de Clase.

Diagrama de Flujo de Decisin

Las pautas para la comparacin de un dispositivo mdico o un implante con productos previamente comercializados se pro-
porcionan en el Diagrama de Flujo de Biocompatibilidad (ver la Figura J3 ) segn la adaptacin del Blue Book Memorandum
#G95-1 de la FDA. El propsito del diagrama de flujo es determinar si los datos disponibles de dispositivos previamente comer-
cializados son suficientes para asegurar la seguridad del dispositivo en consideracin. Segn se indica en el diagrama de flujo,
los materiales de composicin y las tcnicas de fabricacin de un producto se comparan con aqullas de productos previamen-
te comercializados para dispositivos que entran en contacto directo con el cuerpo. Adems, el diagrama de flujo exige una
evaluacin de la toxicidad de todo material especial que no se haya usado en dispositivos comparables. Las respuestas a las
preguntas formuladas en el diagrama de flujo llevan a la conclusin de si los datos disponibles son suficientes o si se necesitan
pruebas adicionales para asegurar la seguridad del producto. Cuando se necesitan pruebas adicionales, en la seccin Matriz de
Seleccin de Prueba se proporcionan las pautas para la identificacin de los procedimientos de prueba adecuados.

Categorizacin de Dispositivos Mdicos

Para facilitar la identificacin de los procedimientos de prueba adecuados, los dispositivos mdicos se dividen y subdividen
segn se muestra en la Tabla 2, de acuerdo con el tipo y grado de contacto con el cuerpo. Las principales categoras de dispo-
sitivos mdicos son los dispositivos de superficie, los dispositivos de comunicacin externa y los dispositivos de implante. stas
a su vez se subcategorizan. En la Tabla 2 tambin se presentan algunos ejemplos de dispositivos mdicos e implantes pertene-
cientes a cada una de las subcategoras.

3 Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA ("Use of lnternational Standard IS0-10993. 'Biological Evaluation of Medical Devices-Part 1: Evaluation
and Testing."')
USP 39 Informacin General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 901

Comienzo

Material
en contacto NO

NO

Con-
Es un
s iene sustan-
etal, aleacin
cias txicas: NO
metlica o
un mal. ce-
rmico?

S NO

Consultar el perfil de
toxicologa especfico del NO S
dispositivo para definir _,___ _ _ _ _ _~~----------<
las pruebas adecuadas

S Requisitos de
Biocompatibilidad
Cumplidos

Material Txico

Fig. 1. Diagrama de flujo de biocompatibilidad

902 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Informacin General USP 39

Tabla 2. Clasificacin y Ejemplos de Dispositivos Mdicos

Categora del Subcategora del
Dispositivo Dispositivo Tipo o Grado de Contacto Algunos Ejemplos
Electrodos, prtesis externas, cintas de fija-
Dispositivos en contacto slo con la superfi- cin, vendas para compresin y monitores
Piel ce de la piel intacta de varios tipos
Lentes de contacto, catteres urinarios, dis-
positivos intravaginales e intraintestinales
(tubos estomacales, sigmoidoscopios, co-
Dispositivos de Superficie lonoscopios, gastroscopios), tubos endo-
traqueales, broncoscopios, prtesis denta-
Dispositivos que se comunican con mem- les, dispositivos de ortodoncia y dispositi-
Membrana Mucosa branas mucosas intactas vos intrauterinos
Dispositivos en contacto con superficies Dispositivos para curacin o apsitos para
Superficies Lesionadas o corporales lesionadas o afectadas de algn lceras, quemaduras y tejido de granula-
Afectadas modo cin, y parches oclusivos
Equipos para administracin de soluciones,
Dispositivos en contacto con la va sangu- equipos de extensin, equipos de transfe-
nea en un punto y que sirven de conducto rencia y equipos para administracin de
Va Sangunea, Indirecta para ingresar al sistema vascular sangre
Dispositivos y materiales en comunicacin Laparoscopios, artroscopios, sistemas de
En Comunicacin con Tej- con tejidos, hueso, o el sistema de pulpa y drenaje, cementos dentales, materiales de
Dispositivos Externos de Co-
do, Hueso o Dentina dentina oclusin dental y grapas para piel
municacin
Catteres intravasculares, electrodos tem-
porales de marcapasos, oxigenadores, tu-
bos y accesorios de oxigenador extracor-
poreo, dializadores, tubos y accesorios pa-
Dispositivos en contacto con sangre en cir- ra dilisis, hemoadsorbentes e inmunoad-
Sangre en Circulacin culacin sorbentes
Ejemplos de los primeros son clavos ortop-
dicos, placas, articulaciones de reemplazo,
prtesis seas, cementos y dispositivos in-
traseos; ejemplos de los segundos son
marcapasos, dispositivos de administra-
cin de frmacos, sensores y simuladores
neuromusculares, tendones de reemplazo,
Dispositivos de Implante Dispositivos principalmente en contacto implantes mamarios, laringes artificiales,
con huesos o con tejidos y fluidos de tej- implantes subperiosteales y pinzas de liga-
Tejido o Hueso dos dura
Electrodos de marcapasos, fstulas arterio-
venosas artificiales, vlvulas cardacas, in-
jertos vasculares, catteres internos de ad-
Dispositivos principalmente en contacto ministracin de frmacos y dispositivos de
Sangre con sangre asistencia ventricular

Matriz de Seleccin de Prueba

La matriz proporciona pautas para la identificacin de procedimientos apropiados de pruebas biolgicas para las tres catego-
ras de dispositivos mdicos: pruebas para Dispositivos de Superficie (ver la Tabla 3), pruebas para Dispositivos Externos de Comu-
nicacin (ver la Tabla 4) y pruebas para Dispositivos de Implante (ver la Tabla 5). Cada categora de dispositivos se subcategoriza
y luego se subdivide an ms segn la duracin del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. La duracin del contacto se defi-
ne como (A) limitada (menos de 24 horas); (B) prolongada (de 24 horas a 30 das); o (C) permanente (ms de 30 das). Los
efectos biolgicos que se incluyen en la matriz son citotoxicidad, sensibilizacin, irritacin o reactividad intracutnea, toxicidad
sistmica, toxicidad subcrnica, genotoxicidad, implantacin, hemocompatibilidad, toxicidad crnica, carcinogenicidad, toxi-
cidad reproductiva o del desarrollo y biodegradacin. Los captulos generales que contienen el procedimiento de prueba de
toxicidad para estos efectos biolgicos se indican en la Tabla 7.
Cada subcategora de la matriz tiene un panel asociado de requisitos de prueba. Generalmente, la cantidad de pruebas en el
panel aumenta cuando aumenta la duracin del contacto entre el dispositivo y el cuerpo, y a medida que el dispositivo o im-
plante est en contacto ms cercano con el sistema circulatorio. Dentro de varias subcategoras, la opcin de realizar pruebas
adicionales a las requeridas se deber considerar caso por caso. Para tomar decisiones con respecto a la inclusin de pruebas
reproductivas o de desarrollo, el fabricante deber tomar en cuenta situaciones especficas, como por ejemplo el uso de dispo-
sitivos de implante permanente o dispositivos externos de comunicacin para mujeres embarazadas y nios. En la matriz se
proporcionan las pautas para la identificacin de posibles procedimientos de prueba adicionales para cada subcategora de dis-
positivos mdicos.
USP 39 Informacin General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 903

PAUTAS PARA LA SELECCIN DE LA DESIGNACIN DE CLASE DEL PLSTICO U OTRO

POLMERO PARA UN DISPOSITIVO MDICO

Para proporcionar pautas para la seleccin de la designacin de clase adecuada de un plstico u otro polmero para un dis-
positivo mdico, se asigna a cada subcategora de los Dispositivos de Superficie (ver la Figura 2)

Dispositivos
de Superficie

Membranas Superficies Lesionadas

Piel
Mucosas o Afectadas

Limitada* Permanente

USPClaset USP Clase

1 VI

Fig. 2. Requisitos de USP para la clase de plstico y otros polmeros para dispositivos de superficie.
Categorizacin basada en la duracin del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 das;
permanente-ms de 30 das. t Designacin de la Clase de Plstico segn la USP.

y los Dispositivos Externos de Comunicacin (ver la Figura 3)

Dispositivos Externos
de Comunicacin

Va sangunea En comunicacin con Sangre en

indirecta tejido/hueso/dentina circulacin

Limitada*

USP Claset USP Clase

IV VI

Fig. 3. Requisitos de USP para la clase de plstico y otros polmeros para dispositivos externos de comunicacin.
Categorizacin basada en la duracin del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 das;
permanente-ms de 30 das. t Designacin de la Clase de Plstico segn la USP.

una designacin segn la Clase de Plstico de la USP (ver (88)). Si las pruebas para cada designacin de clase de la USP no son
suficientes para un dispositivo especfico, el fabricante o profesional debe desarrollar un conjunto de pruebas adecuado. El n-
mero de clase numrica indicado aumenta en relacin a la duracin (riesgo) del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. En la
categora de Dispositivos de Implante es obligatorio usar exclusivamente la clase VI. La asignacin de la designacin de la Clase
de Plstico de la USP se basa en las matrices de seleccin de prueba ilustradas en las Tablas 3, 4 y 5.
La asignacin de una designacin de clase de plstico u otro polmero a una subcategora no est destinada a restringir el
uso de clases superiores de plsticos u otros polmeros. Si bien la clase asignada define la clase numrica ms baja de plstico u
otro polmero que se puede usar en el dispositivo correspondiente, el uso de una clase numrica superior de plstico es opcio-
nal. Cuando un dispositivo se puede definir como perteneciente a ms de una categora de dispositivo, el plstico u otro pol-
mero debe cumplir con los requisitos de la clase numrica ms alta.
 Categora del Dispositivo
Tabla 3. Matriz de Seleccin de Prueba para Dispositivos de Superficie*
Efecto Biolgicob
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Irritacin Toxicidad --'

o Reacti- Toxlci- Hemo- Reproduc- o

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Contacto Corporal tacto xi cid ad lizacln tnea (Aguda) crnica dad tacln dad nica cldad rrollo cin 6"
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Afectadas e X X X o X X o - o - - - ~

Leyenda: A-limitada (menos de 24 horas); B-prolongada (de 24 horas a 30 das); C-permanente (ms de 30 das).
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b Leyenda: X-pruebas de evaluacin ISO a considerar; O-pruebas adicionales que pueden ser aplicables. ;:o
* Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 1. Pruebas de Evaluacin Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluacin Suplementarias a Considerar). V>
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Categoras del Dispositivo Efecto Blolgicob v
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Irritacin Toxicidad \O
o Reacti- Toxici- Toxici- Hemo- Reproduc-
Duracin vidad In- dad Sis- dad Geno- compa- Toxici- Carci- tiva o del Biode-
del Con- Citoto- Sensibi- tracu- tmica Subcr- toxici- Implan- tibili- dad Cr- nogeni- Des a- grada-
Contacto Corporal tacto xicidad lizacin tnea (Aguda) nica dad tacin dad nica cid ad rrollo cin
Dispositivos Va Sangu- A X X X X - - - X - - - -
Externos de nea, X X X o - - X - - - -
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Comunica- Indirecta
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En Comuni- A X X X o - - - - - - - -
cacin
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Circulacin

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 Tabla 5. Matriz de Seleccin de Prueba para Dispositivos de Implante* '
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Efecto Biolgicob
Toxicidad
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Duracin vidad In- dad Sis- dad Geno- compa- Toxici- Carel- tiva o del
del Con- Cito to- Sensibi- tracu- t mica Subcr- toxici- Implan- tiblli- dad Cr- nogeni- Desa- Biodegra- O:J
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USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 907

(1032) DISEO Y DESARROLLO DE VALORACIONES BIOLGICAS

1 INTRODUCCIN

1.1 Propsito y Alcance

El captulo general Diseo y Desarrollo de Va/oraciones Biolgicas (1032) presenta metodologas para el desarrollo de procedi-
mientos de valoracin biolgica que cuentan con un diseo experimental slido, capaces de proporcionar datos que pueden
ser analizados mediante principios estadsticos bien fundamentados, y adecuados para su uso especfico.
El captulo general (1032) forma parte del grupo de cinco captulos generales enfocados en valoraciones de potencia relati-
va, en las cuales se cuantifica la actividad de un material de Prueba mediante su comparacin con la actividad de un material
Estndar. No obstante, muchos de los principios se pueden aplicar a otros sistemas de valoracin.
El propsito de este captulo general es servir como gua para el diseo y el desarrollo de una valoracin biolgica para un
frmaco o producto farmacutico destinado para su distribucin comercial. Aunque la adopcin de los mtodos recomenda-
dos en este captulo puede requerir de una importante inversin de recursos durante el desarrollo de la valoracin, su imple-
mentacin temprana puede generar beneficios. Finalmente, las perspectivas y los mtodos descritos en este captulo son los
recomendados entre una gran variedad de alternativas ofrecidas por la teora y prctica contemporneas de las valoraciones
biolgicas.

NFASIS EN LA POTENCIA RELATIVA

Debido a la variabilidad inherente de los sistemas de anlisis biolgicos (incluyendo aquellos que emplean animales, clulas,
instrumentos, reactivos y los que se emplean a diario y entre laboratorios), una medicin absoluta de la potencia es ms varia-
ble que una medicin de la actividad pertinente a un Estndar, lo cual ha llevado a la adopcin de la metodologa de la poten-
cia relativa. Para poder suponer que los materiales Estndar y de Prueba son similares biolgicamente, debera demostrarse una
similitud estadstica (una consecuencia de la similitud del material de Prueba y del Estndar), y se podra esperar que la muestra
de Prueba se comporte como una concentracin o dilucin del Estndar. La potencia relativa es una medida sin unidad que se
obtiene a partir de la comparacin de las relaciones dosis-respuesta de las preparaciones farmacuticas de Prueba y Estndar.
Para los fines de la comparacin relativa del material de Prueba con el Estndar, generalmente se asigna a la potencia del Es-
tndar un valor de 1 (o 100%). El Estndar puede ser un material establecido como tal por una organizacin nacional (p.ej., la
USP) o internacional (p.ej., la OMS), o puede tratarse de un Estndar interno.

1.2 Partes Interesadas

Este captulo est dirigido tanto a expertos en estadstica, como a analistas dedicados a la prctica de valoraciones biolgi-
cas, quienes participan en el desarrollo de una valoracin biolgica. Este captulo servir al analista como gua para implemen-
tar la estructura y metodologa de la valoracin biolgica a fin de alcanzar las metas analticas, a la vez que demuestra de ma-
nera fidedigna la actividad biolgica de inters; por otra parte, servir al estadista para obtener informacin relacionada con las
limitaciones biolgicas que pudieran ser difciles de equilibrar con una prctica rigurosa de estadstica.

2. APTITUD DE LAS VALORACIONES BIOLGICAS PARA SU USO PREVISTO

Para evaluar la aptitud de una valoracin para su uso previsto, el analista debe especificar claramente los propsitos con los
que se lleva a cabo la valoracin biolgica. Los usos comunes para una valoracin biolgica incluyen la liberacin de lotes de
frmacos (ingredientes farmacuticos activos) y productos farmacuticos; la evaluacin de estabilidad; la calificacin del Estn-
dar y de otros reactivos crticos; la caracterizacin de productos intermedios del proceso y formulaciones; la caracterizacin de
contaminantes y productos de degradacin; y la validacin de los cambios en el proceso de produccin del producto. Los re-
quisitos de exactitud relativa, especificidad, precisin y robustez pueden ser diferentes para cada uno de los usos potenciales.
Una buena estrategia consiste en desarrollar y validar una valoracin biolgica para sustentar mltiples usos previstos; por
ejemplo, una valoracin biolgica desarrollada principalmente para la liberacin de partidas puede servir para otros propsitos.
Las decisiones relacionadas con la aptitud de uso deben basarse en consideraciones cientficas y estadsticas, as como en consi-
deraciones prcticas tales como costos, tiempo de culminacin del proceso y requisitos de rendimiento para la valoracin.
Cuando las valoraciones se usan para la liberacin de lotes, una valoracin biolgica de modelo lineal permitira evaluar la
similitud suficientemente. Para valoraciones biolgicas que se usan para sustentar la estabilidad, la comparabilidad, para califi-
car materiales de referencia o reactivos crticos, o que se relacionan con cambios en los procesos de produccin o valoracin,
generalmente resulta til evaluar la similitud usando la curva de concentracin-respuesta completa, incluyendo las asntotas (si
estuvieran presentes).
908 (1032) Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

2.1 Desarrollo del Proceso

Las valoraciones biolgicas por lo general son necesarias para el desarrollo y la optimizacin de la fabricacin de productos,
incluidos los procesos de formulacin y aumento de la escala de produccin. Las valoraciones biolgicas pueden usarse para
evaluar las estrategias de purificacin, optimizar el rendimiento del producto y medir la estabilidad del mismo. Dado que las
muestras tomadas durante todo el proceso se analizan y comparan con regularidad, es necesario estudiar cuidadosamente los
efectos de la matriz de muestras que pudieran afectar la respuesta de la valoracin a fin de determinar la aptitud de una valo-
racin para su uso. Para las mediciones de potencia relativa, puede ser necesario diluir el material Estndar en una matriz ade-
cuada para cuantificacin. La precisin y exactitud de la valoracin biolgica deben ser suficientes para medir el desempeo
del proceso o para evaluar y comparar la estabilidad de las formulaciones propuestas.

2.2 Caracterizacin del Proceso

Las valoraciones biolgicas pueden llevarse a cabo para evaluar los efectos sobre la potencia de la droga relacionados con las
diferentes etapas de la fabricacin del frmaco o con los cambios en el proceso de fabricacin (p.ej. para demostrar la equiva-
lencia del producto antes y despus de aplicar cambios en el proceso). Las valoraciones biolgicas usadas en este tipo de apli-
cacin pueden ser cualitativas o cuantitativas.

2.3 Liberacin de Productos

Las valoraciones biolgicas se usan para evaluar la potencia del frmaco antes de la liberacin del producto comercial. En la
medida de lo posible, la valoracin debe reflejar o imitar el mecanismo de accin conocido o esperado del producto. Cuando
la valoracin biolgica no incluye la biologa funcional directamente relacionada con el mecanismo de accin, puede ser nece-
sario demostrar una relacin entre las determinaciones de la potencia estimada por la valoracin biolgica y las obtenidas con
alguna otra valoracin que refleje mejor o de manera distinta la actividad funcional hipottica.
Para las pruebas de liberacin del producto, las especificaciones del mismo se establecen para definir valores mnimos o in-
tervalos de potencia aceptables para el producto. La precisin del valor de informe obtenido de la valoracin biolgica debe
sustentar el nmero de dgitos significativos establecidos en la especificacin (ver el captulo general Validacin de Valoraciones
Biolgicas (1033)) y, junto con la exactitud relativa, sustentar el intervalo de la especificacin. A fin de cumplir con estas especi-
ficaciones, el control de calidad de la fabricacin deber contar con especificaciones para la liberacin del producto con lmites
lo suficientemente estrechos como para acomodar cualquier prdida de actividad por inestabilidad o incertidumbre en la valo-
racin de liberacin.

2.4 Productos Intermedios del Proceso

La evaluacin de la valoracin biolgica de los productos intermedios del proceso puede proveer informacin con respecto a
la especificidad. Las estrategias de formulacin y llenado pueden basarse en valoraciones biolgicas para asegurarse de que el
producto farmacutico, incluido aqul que se encuentra en el envase final, cumplir con las especificaciones establecidas. Por
ejemplo, se pueden retener los materiales a granel sin formular y evaluar su potencia. Basndose en los resultados de potencia,
se puede decidir si los materiales a granel se combinan con otros lotes de material a granel, si se diluyen, o si se someten a
reprocesamiento. Para estos tipos de aplicaciones, las valoraciones biolgicas deben ser capaces de medir la actividad del pro-
ducto en diferentes matrices. En algunos casos, se puede preparar un material Estndar distinto y utilizarlo para calcular la po-
tencia relativa del producto intermedio del proceso.

2.5 Estabilidad

Las valoraciones de potencia pueden usarse para evaluar la estabilidad de vacunas y productos obtenidos por biotecnologa.
La informacin derivada de los estudios de estabilidad realizados durante el desarrollo en condiciones de almacenamiento rea-
les y/o aceleradas o sometidas a estrs, puede emplearse para establecer la duracin de la vida til, as como para identificar y
estimar velocidades y productos de degradacin. Asimismo, se pueden usar estudios de estabilidad posteriores al otorgamien-
to de la licencia, a fin de monitorear la estabilidad del producto. Es importante contar con conocimientos acerca de la variabili-
dad a corto y largo plazo de la valoracin biolgica para garantizar un nivel aceptable de incertidumbre en las medidas de
potencia obtenidas.

2.6 Calificacin de Reactivos

La caracterizacin cuantitativa de un nuevo Estndar requiere una medicin exacta y precisa de la actividad biolgica del
nuevo Estndar. Esta medicin se usa para establecer que el lote del nuevo Estndar es equivalente al lote previo o para asig-
narle una potencia declarada con la que se puedan comparar las muestras de Prueba. Adems, puede ser necesaria una deter-
minacin repetida adicional (que va ms all del anlisis de rutina) para lograr una mayor precisin en la medicin de potencia
USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 909

del nuevo material Estndar. Asimismo, la valoracin biolgica se puede usar para calificar un reactivo para cultivo celular tal
como suero fetal bovino. La aptitud de uso en dichos casos se vincula con la capacidad de la valoracin para examinar lotes de
reactivo y para asegurar el rechazo de lotes que pudieran generar sesgo o comprometer las mediciones de potencia relativa.

2.7 Integridad de los Productos

Las vacunas, los productos obtenidos por biotecnologa y los productos biolgicos pueden contener una poblacin de mate-
rial heterogneo, incluido el material que se espera predomine en el producto. Algunas impurezas del proceso y productos de
degradacin pueden ser activos, parcialmente activos, inactivos o antagnicos a la respuesta medida en la valoracin biolgi-
ca. Para variantes o derivados del producto cuyos cambios en la estructura o en la composicin relativa pudieran relacionarse
con cambios sutiles aunque caractersticos en la respuesta de la valoracin biolgica (p.ej., cambio en la pendiente o asntota),
la valoracin biolgica puede resultar til para detectar y medir dichos derivados o variantes. Los estudios que identifican cam-
bios caractersticos asociados con variantes del producto esperado ayudan a garantizar el desempeo uniforme del producto.
Siempre que resulte prctico, la valoracin biolgica debe estar acompaada de mtodos ortogonales sensibles a las variantes
del producto, a las impurezas del proceso y/o a los productos de degradacin.

3. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA VALORACIN BIOLGICA

3.1 Valoraciones Biolgicas In Vivo

Las valoraciones de potencia in vivo son valoraciones biolgicas en las que se administran grupos de diluciones de los mate-
riales Estndar y de Prueba a animales, y donde las relaciones de concentracin-respuesta se usan para estimar la potencia.
Para algunas valoraciones con animales, el punto final es simple (p.ej., una valoracin de aumento de peso corporal de la rata
para la hormona de crecimiento humano o una valoracin de peso de los ovarios de la rata para la hormona estimulante del
folculo), pero otras requieren el procesamiento adicional de muestras recolectadas de los animales tratados (p.ej., recuento de
reticulocitos para eritropoyetina, esteroideognesis para gonadotropinas, recuento de neutrfilos para factor estimulante de
colonias de granulocitos o titulacin de anticuerpos despus de la administracin de vacunas). Con la llegada de lneas celula-
res especficas para el mecanismo fisiolgico de accin (MOA, por sus siglas en ingls) hipottico, el uso de animales para la
medicin de potencia ha disminuido de manera importante. Los costos, el bajo rendimiento, as como cuestiones ticas y de
otro tipo abogan contra el uso de valoraciones biolgicas con animales. Asimismo, las agencias reglamentarias han promovido
la limitacin responsable, siempre que sea posible, del uso de animales (ver The lnteragency Coordinating Committee on the
Validation of Alternative Methods, Mission, Vision, and Strategic Priorities; Febrero de 2004). Cuando la actividad in vitro no
est plenamente asociada con la actividad in vivo (p.ej., EPO), la combinacin de valoraciones in vitro basadas en clulas y de
un mtodo fisicoqumico adecuado (p.ej., IEF, anlisis de glicanos) puede ser un reemplazo para las valoraciones in vivo. No
obstante, las valoraciones in vivo pueden continuar siendo necesarias cuando las valoraciones in vitro no son capaces de detec-
tar diferencias crticas relacionadas con la funcin biolgica prevista o esperada del frmaco.
Las respuestas fisiolgicas de los animales a los frmacos biolgicos (incluyendo vacunas) pueden predecir las respuestas de
los pacientes. La seleccin de animales de prueba por especie, cepa, gnero y madurez o intervalo de peso debe guiarse por el
objetivo de desarrollar un modelo representativo y sensible con el cual se evale la actividad de las muestras de Prueba.
Algunos mtodos de valoracin se adaptan al uso de colonias, en lugar de animales que no hayan sido previamente expues-
tos. Por ejemplo, las pruebas de pirgenos e insulina se benefician del uso de conejos de colonias que han sido previamente
expuestas, los cuales proveen una capacidad de respuesta confiable. Si los animales introducidos de manera reciente en la co-
lonia no responden segn lo esperado despus de administrarles varias veces un compuesto, se les deber separar de la colo-
nia para que no provoquen futuros resultados de valoracin invlidos o indeterminados. No obstante, para la valoracin de
compuestos altamente antignicos para pirgenos, se deben usar animales que no hayan sido previamente expuestos, a fin de
evitar resultados inexactos o confusos. Otras ventajas de las colonias incluyen condiciones ambientales controladas (macro/
ambiente y micro/gradilla), programas de alimentacin, aprovisionamiento de agua y rutinas de crianza uniformes.
Se pueden usar datos histricos que incluyan registros de la colonia y datos de la valoracin para identificar factores que
pudieran influenciar el desempeo de la valoracin. Es posible reducir la influencia de factores que pudieran generar sesgo
mediante la aplicacin de principios de aleatorizacin tales como la distribucin de intervalos de peso a travs de grupos de
dosis, asignacin de grupos de los contenedores de transporte a jaulas distintas o uso de patrones generados por computadora
o de plataforma para inyeccin/dosificacin. Para que el animal de prueba sea adecuado para su uso en una valoracin biol-
gica, ste debe estar sano y se le debe dar tiempo para que se estabilice en su ambiente. Los factores que se combinan para
influenciar el estado de salud del animal incluyen una nutricin adecuada, hidratacin, exencin de factores de estrs fsicos y
sicolgicos, saneamiento adecuado del lugar donde se hospeda, ciclo de luz controlado (diurno/nocturno), manipulacin ex-
perimentada, inyecciones y sangrados diestros y ausencia de ruido o vibracin. La observacin diaria de los animales de prueba
es esencial para mantener su salud, adems de que se debe contar con cuidados veterinarios para evaluar cualquier cuestin
que pudiera comprometer la validez de los resultados de la valoracin biolgica.
91 O (1 032) Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

3.2 Valoraciones Biolgicas Ex Vivo

Las clulas o tejidos de donantes humanos o animales se pueden cultivar en el laboratorio y usarse para evaluar la actividad
de una muestra de Prueba. En el caso de las citoquinas, la mayora de las valoraciones emplean clulas del sistema hematopo-
ytico o subconjuntos de clulas hematopoyticas de sangre perifrica, tales como clulas mononucleares de la sangre perifri-
ca o linfocitos de la sangre perifrica. Para protenas que actan sobre tejidos slidos, como por ejemplo factores y hormonas
del crecimiento, el tejido especfico sobre el que actan puede ser extrado de animales, disociado y cultivado durante un pe-
riodo limitado, ya sea como clulas adherentes o semiadherentes. Aunque un sistema de valoracin ex vivo tiene la ventaja de
ser similar al ambiente natural, tambin puede sufrir de variabilidad importante entre donantes, as como dificultades relacio-
nadas con la disponibilidad de clulas apropiadas.
Las valoraciones biolgicas que involucran el uso de tejidos o clulas de un animal (p.ej., el mtodo de glucagn en hepato-
cito de rata) requieren un procesamiento similar al de las valoraciones in vivo para minimizar la variabilidad de la valoracin y el
sesgo. El nivel de esfuerzo para manejar el sesgo (p.ej., mediante aleatorizacin) debe ser adecuado para los propsitos de la
valoracin. Los factores adicionales que podran afectar los resultados de la valoracin incluyen la hora del da, el peso o madu-
rez del animal, el anestsico usado, los componentes de las soluciones amortiguadoras/reactivos, la temperatura y posicin del
bao de incubacin y la viabilidad de las clulas.

3.3 Valoraciones Biolgicas (Basadas en Clulas) In Vitro

Resulta posible utilizar valoraciones biolgicas que empleen lneas celulares que respondan a ligandos o agentes infecciosos
especficos para las valoraciones de liberacin de lote. Estas lneas celulares pueden derivarse de tumores, inmortalizarse como
lneas celulares dependientes de factores o lneas celulares transfectadas con receptores adecuados obtenidas por ingeniera
gentica. Asimismo, tambin es posible utilzar lneas celulares no transformadas que se puedan mantener durante un nmero
suficiente de pasajes (p.ej., fibroblastos). Independientemente de la lnea celular, se espera una respuesta de potencia adecua-
damente equivalente durante un nmero de pasajes continuos. Los avances en la tecnologa de ADN recombinante y el enten-
dimiento de los mecanismos de sealizacin celular han permitido la generacin de lneas celulares modificadas por ingeniera
con respuesta mejorada, expresin estable de receptores y mecanismos de sealizacin, as como una estabilidad ms perdura-
ble. Las respuestas celulares relacionadas con la protena de inters dependen del mecanismo de accin del frmaco y de la
duracin de la exposicin. Dichas respuestas incluyen la proliferacin celular, muerte celular, actividad antiviral, diferenciacin,
secrecin de citoquinas/mediador y activacin de enzimas. Para las valoraciones que implican estas respuestas puede ser nece-
sario incubar las clulas durante varios das, tiempo en el cual puede presentarse contaminacin, evaporacin poco uniforme y
otros efectos de ubicacin. Las autoridades reglamentarias han aceptado las respuestas comparativamente rpidas basadas en
mecanismos de sealizacin intracelular, tales como mensajeros secundarios, activacin de protena kinasa o expresin gnica
del indicador. Finalmente, la mayora de las lneas celulares usadas para valoraciones biolgicas expresan receptores para mlti-
ples citoquinas y factores de crecimiento. Es posible que dicha falta de especificidad no sea perjudicial si se demuestra la espe-
cificidad de la muestra de Prueba.
El diseo de la valoracin biolgica basada en clulas debe reflejar el conocimiento que se tiene sobre los factores que influ-
yen sobre la respuesta de las clulas con respecto al analito activo. La variabilidad de la respuesta a menudo se refleja en par-
metros tales como la pendiente, EC 50 de la curva de concentracin-respuesta o el intervalo de respuesta (respuesta mxima
menos mnima). Aunque la metodologa de la potencia relativa minimiza los efectos de la variacin de estos parmetros entre
valoraciones y entre bloques dentro de una valoracin, en las estimaciones de la potencia relativa, dicha variabilidad de la res-
puesta puede ocasionar que una valoracin sea difcil de administrar (es decir, puede ser difcil evaluar la aptitud del sistema).
Por consiguiente, aunque el desarrollo de la valoracin se debe enfocar principalmente en las propiedades de potencia, tam-
bin resultan adecuados los esfuerzos para identificar y controlar la variacin en la relacin concentracin-respuesta. En el caso
de valoraciones por bloques (p.ej., mltiples placas de cultivo celular en una valoracin) con variacin apreciable en la forma
de la curva entre bloques, un anlisis que no incluya apropiadamente los bloques generara estimaciones infladas de variacin
dentro de la valoracin, ocasionando que la evaluacin de la similitud sea particularmente difcil. Se dispone de dos estrategias
para tratar la variacin entre bloques: la primera es un esfuerzo del laboratorio para identificar y controlar fuentes de variacin,
y la segunda es un esfuerzo estadstico para construir y emplear un diseo y anlisis en bloques. La combinacin de estas estra-
tegias puede resultar particularmente efectiva.
El desarrollo de una valoracin biolgica basada en clulas comienza con la seleccin o generacin de una lnea celular. Uno
de los primeros pasos importantes para desarrollar una valoracin basada en clulas para la evaluacin de un producto comer-
cial consiste en verificar que el uso de la lnea celular de inters no se restrinja nicamente a investigacin. De ser posible, para
asegurar el abastecimiento adecuado y uniforme de clulas para el anlisis de productos, se debe generar un banco de clulas.
Resulta necesario documentar en la medida de lo posible la informacin relacionada con las caractersticas funcionales y gen-
ticas de la lnea celular de la valoracin biolgica, incluyendo detalles del historial de la lnea celular desde el origen hasta su
incorporacin al banco, por ejemplo, la informacin sobre una lnea celular recombinante que podra incluir la identificacin
de la fuente de la lnea celular madre (banco de clulas interno, almacn externo, etc.), de las secuencias de ADN usadas para
transfeccin, y del rgimen subsiguiente de seleccin y anlisis funcional que result en la seleccin de la lnea celular. Aunque
no siempre resulta prctico, es convienente contar con informacin suficiente que permita recrear una lnea celular similar en
caso necesario. La informacin pertinente puede incluir: identidad (p.ej., isoenzima, marcadores fenotpicos, anlisis gentico);
USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 911

morfologa (p.ej., imgenes fotogrficas archivadas); pureza (p.ej., anlisis de deteccin de micoplasmas, bacterias, hongos y
virus); crioconservacin; condiciones de descongelacin y cultivo (p.ej., componentes de los medios, temperatura y mtodo
de descongelacin, mtodos de propagacin, densidades de siembra, condiciones de recoleccin); viabilidad de la desconge-
lacin (inmediatamente despus de haber sido congelada y despus de un tiempo de almacenamiento); caractersticas de cre-
cimiento (p.ej., tiempos de duplicacin de las clulas); y estabilidad funcional (p.ej., ploida).
La caracterizacin de clulas y la vigilancia relacionada con cuestiones del desempeo de la valoracin que se reflejan en el
estado de las clulas son necesarias para asegurar la calidad y longevidad de los bancos de clulas que se usan en el entorno
de Control de Calidad. La salud general y el estado metablico de las clulas al momento de la valoracin biolgica puede
influir de manera importante sobre los resultados de las pruebas. Cuando una lnea celular ha sido caracterizada y est lista
para su inclusin en el banco, los analistas a menudo preparan un banco de dos niveles (Maestro y de Trabajo). El Banco de
Clulas Maestro se crea como fuente para el Banco de Clulas de Trabajo. El Banco de Clulas de Trabajo se obtiene a partir de
la expansin de uno o ms viales del Banco de Clulas Maestro. El tamao de los bancos depende de las caractersticas de
crecimiento de las clulas, del nmero de clulas requerido para cada valoracin y de la frecuencia con que se realizar la valo-
racin. Algunas clulas pueden ser sensibles a la crioconservacin, a la descongelacin y a las condiciones de cultivo, por lo
que los bancos se deben preparar y caracterizar cuidadosamente antes de usarlos en estudios de validacin y para su uso regu-
lar en el laboratorio de Control de Calidad.
Adems, existen factores que pueden afectar la respuesta de la valoracin biolgica y la evaluacin de la potencia, los cuales
son comunes en muchas valoraciones biolgicas basadas en clulas: tipo de clula (adherente o no adherente); descongela-
cin de las clulas; densidad de plaqueo (durante la descongelacin y durante el mantenimiento de la sucesin de siembra) y
confluencia (clulas adherentes); frascos de cultivo; crecimiento, montaje de placas y medios de valoracin; requisitos del sue-
ro (fuente, inactivacin con calor, irradiacin con rayos gamma); condiciones de incubacin (temperatura, C0 2 , humedad,
tiempos de cultivo desde la descongelacin); reactivos y tcnicas para recoleccin de clulas (para clulas adherentes, mtodo
de disociacin); separacin y clasificacin de clulas; recuento de clulas; determinacin de la salud de las clulas (velocidad de
crecimiento, viabilidad, rendimiento); nmero de pasajes de clulas y programa de pasajes; estabilidad de la lnea celular (a
nivel gentico, de receptor, de marcador, de expresin gnica); y etapas de inanicin o estimulacin. La lista anterior no es
definitiva, por lo que el desarrollo de la valoracin debe incluir analistas que cuenten con una amplia comprensin y experien-
cia con respecto a la lnea celular. Estos analistas experimentados deben identificar factores que podran influir en los resulta-
dos de la valoracin y, siempre que sea posible, establecer estrategias para un nivel de control adecuado.

3.4 Estndar

El Estndar es un reactivo crtico en las valoraciones biolgicas debido a la necesidad de contar con un material de prueba
confiable contra el que se pueda comparar cuantitativamente una preparacin de Prueba. Se puede asignar al Estndar una
cantidad de unidades o actividad especfica que represente un material con una potencia total (100%). Siempre que sea posi-
ble, un Estndar debe ser representativo de las muestras que se van a analizar en la valoracin biolgica. El anlisis que se lleva
a cabo para calificar un Estndar puede ser ms riguroso que el anlisis de rutina usado para la liberacin del lote.
Un Estndar debe almacenarse en condiciones que ayuden a conservar toda su potencia durante el tiempo esperado de uso.
Con este propsito, el Estndar se puede almacenar en condiciones diferentes a las del almacenamiento normal del frmaco o
producto farmacutico. Esto puede incluir una temperatura diferente (p.ej., -70 o -20, en lugar de 2-8), un envase dife-
rente (p.ej., viales de plstico en lugar de jeringas), una formulacin diferente (p.ej., formulacin liofilizable o la adicin de
protenas portadoras tales como albmina srica humana, estabilizantes, etc.). El material Estndar debe analizarse para deter-
minar su estabilidad en intervalos apropiados. Los criterios de aptitud del sistema para la valoracin biolgica tales como res-
puesta mxima o de fondo, pendiente EC 50 o potencia del control de la valoracin, pueden usarse para detectar cambios en la
actividad del Estndar. Se pueden realizar estudios de estabilidad acelerados para estimar las velocidades de degradacin y pa-
ra establecer caractersticas reconocibles de inestabilidad del Estndar.
En las etapas posteriores del desarrollo clnico, el Estndar puede prepararse usando el proceso de fabricacin empleado en
los ensayos clnicos claves. Si la formulacin del Estndar es diferente de la usada en el proceso de fabricacin del producto
farmacutico, ser importante demostrar que la evaluacin de la similitud y la estimacin de la potencia realizadas en la valora-
cin no son afectadas por las diferencias en la formulacin. Un Estndar inicial puede recibir el nombre de Estndar Primario.
Los Estndares subsiguientes se pueden preparar usando procesos de fabricacin vigentes y se pueden denominar Estndares
de Trabajo. Puede ser necesario implementar distintos Procedimientos Operativos Estndares, a fin de establecer tales estnda-
res para cada producto. En ocasiones, las mediciones de potencia pueden presentar sesgo si la actividad del Estndar cambia
gradualmente. Asimismo, se puede observar una prdida de similitud si, con el tiempo, el Estndar sufre cambios en la glicosi-
lacin. Resulta prudente archivar alcuotas de cada lote de Estndar para evaluar la comparabilidad con Estndares posteriores
y para investigar cualquier desviacin en la valoracin.

4. ASPECTOS ESTADSTICOS DE LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES DE LAS VALORACIONES

BIOLGICAS

Los elementos estadsticos del desarrollo de valoraciones biolgicas incluyen el tipo de datos, la medicin de la respuesta a
concentraciones variadas, el diseo de la valoracin, el modelo estadstico, el tratamiento de los datos previo al anlisis, los
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mtodos de anlisis de datos, la prueba de aptitud y el anlisis de valores aberrantes. Tales componentes forman el sistema de
valoracin biolgica que se utilizar para estimar la potencia de una muestra de Prueba.

4.1 Datos

Existen, fundamentalmente, dos tipos de datos de valoracin biolgica: cuantitativos y cuantales (categricos). Los datos
cuantitativos pueden ser continuos (que no se limitan a observaciones discretas; p.ej., recopilados de un instrumento), de re-
cuento (p.ej., unidades formadoras de placas) o discretos (p.ej., ttulos de dilucin determinados por punto final). Los datos
cuantales a menudo son dicotmicos; por ejemplo, vida/muerte en un modelo de respuesta animal o positivo/negativo en un
ensayo de infectividad basado en placa que resulte en la destruccin de una monocapa celular despus de la administracin de
un agente infeccioso. Los datos cuantitativos se pueden transformar en datos cuantales seleccionado un umbral que distinga
una respuesta positiva de una respuesta negativa. Dicho umbral se puede calcular a partir de datos obtenidos de un control
negativo, por ejemplo, sumando (o restando) una medida de incertidumbre (tal como dos o tres veces la desviacin estndar
de las respuestas de control negativo) al promedio del control negativo. Los analistas deben ser cuidadosos con respecto a la
transformacin de datos cuantitativos en datos cuantales, puesto que dicha operacin resulta en una prdida de informacin.

4.2 Suposiciones

Una suposicin clave para el anlisis de la mayora de las valoraciones biolgicas es que las muestras Estndar y de Prueba
contienen el mismo analito efectivo o poblacin de analitos y, por consiguiente, se puede esperar que se comporten de mane-
ra similar en la valoracin biolgica. A esto se le denomina similitud. Tal como se presentar en mayor detalle en el captulo
general Anlisis de Datos de Va/oraciones Biolgicas (1034) para modelos estadsticos especficos, la similitud biolgica implica la
presencia de similitud estadstica (para modelos de lneas paralelas y curvas paralelas, las curvas del Estndar y de la muestra de
Prueba son paralelas; para modelos de cociente de pendiente, las lneas del Estndar y de la muestra de Prueba tienen una
misma ordenada al origen). Cualquier afirmacin contraria es falsa. La similitud estadstica (lneas paralelas, curvas paralelas o
misma ordenada al origen, segn corresponda) no asegura la similitud biolgica. No obstante, incumplir con la similitud esta-
dstica puede tomarse como evidencia contra la similitud biolgica. Por lo tanto, la existencia de un par Estndar-muestra de
Prueba que pase la evaluacin de similitud estadstica es una condicin necesaria, pero no suficiente, para cumplir con la supo-
sicin clave de la similitud biolgica. En consecuencia, la similitud biolgica sigue siendo, inevitablemente, una suposicin. Las
desviaciones de la similitud estadstica que presenten valores constantes a travs de valoraciones repetidas pueden indicar efec-
tos de la matriz o diferencias reales entre los materiales Estndar y de Prueba. Lo anterior resulta cierto incluso si la desviacin
de la similitud estadstica es lo suficientemente pequea como para sustentar la determinacin de una potencia relativa.
En muchas valoraciones, mltiples compuestos proporcionarn curvas de concentracin-respuesta similares, por lo que pue-
de resultar razonable emplear un sistema de valoracin biolgica para describir o incluso comparar las curvas de respuesta de
diferentes compuestos. No obstante, no es apropiado informar la potencia relativa a menos que las muestras Estndar y de
Prueba contengan nicamente el mismo analito o poblacin de analitos activos. Los productos biolgicos a menudo presentan
variaciones entre lotes con respecto a la distribucin de analitos (es decir, la mayora de los productos biolgicos contienen un
producto de inters y, en niveles aceptablemente bajos, algunos contaminantes del proceso que pueden mostrarse activos en
la valoracin biolgica). Por lo tanto, la evaluacin de la similitud es, al menos en parte, una evaluacin que determina si la
distribucin de analitos en la muestra de Prueba es lo suficientemente cercana a la distribucin en la muestra Estndar como
para que la potencia relativa sea significativa; en otras palabras, la valoracin es una comparacin de caractersticas. Cuando
existe evidencia (derivada de mtodos diferentes a la valoracin biolgica) de que las muestras Estndar y de Prueba no contie-
nen los mismos compuestos activos, no se cumple con la suposicin de similitud biolgica, por lo que no es apropiado infor-
mar la potencia relativa.
Otras suposiciones estadsticas comunes en el anlisis de valoraciones biolgicas cuantitativas son la varianza constante de
las respuestas alrededor de un modelo ajustado (ver la seccin 4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin
para un anlisis ms profundo), residuos normalmente distribuidos (un residuo es la diferencia entre una respuesta observada y
la respuesta prevista por el modelo) e independencia de los residuos.
La varianza constante, normalidad e independencia estn interrelacionadas en la prctica de la valoracin biolgica. Para va-
loraciones biolgicas con una respuesta cuantitativa, se puede usar una transformacin de datos bien seleccionada para obte-
ner una varianza aproximadamente constante y una distribucin de residuos casi normal. Una vez que se ha impuesto la trans-
formacin, queda pendiente tratar la suposicin de independencia reflexionando sobre la estructura del diseo de la valora-
cin biolgica en el modelo de anlisis. La independencia de los residuos es importante para evaluar la aptitud del sistema y de
la muestra.

4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin

Los anlisis simples de los datos de valoraciones biolgicas cuantitativas requieren que los datos presenten una distribucin
aproximadamente normal con una varianza casi constante cercana de un extremo a otro del intervalo de los datos. Para los
modelos de regresin lineal y no lineal, la varianza referida en este captulo es la varianza residual derivada del ajuste del mode-
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lo. A menudo, no se observa la varianza constante; la heterogeneidad de la varianza se puede manifestar como un incremento
en la variabilidad con un incremento en la respuesta. Si las varianzas no son iguales, pero los datos se analizan como si lo fue-
ran, la estimacin de la potencia relativa an podra ser razonable; no obstante, si no se trata la varianza inconstante alrededor
del modelo de concentracin-respuesta ajustado se obtendr una estimacin poco confiable de la varianza dentro de la valora-
cin. Asimismo, la evaluacin de la similitud estadstica puede no ser exacta y no se deben usar los errores estndar ni los inter-
valos de confianza para todos los parmetros (incluyendo un intervalo para la potencia relativa basado en el Teorema de Fie-
ller). Los intervalos de confianza para la potencia relativa que combinan estimaciones de potencia de mltiples valoraciones
pueden ser errneos si se usa el error dentro de la valoracin para calcular el intervalo de confianza.
La constancia de la varianza se puede evaluar mediante grficas de residuos, anlisis Box-Cox (o ley del poder) o la prueba
de Levene. Con la prueba de Levene, en lugar de basarse en el valor p, el cambio obtenido en la estadstica es til como funda-
mento para juzgar si se ha mejorado o deteriorado la homogeneidad. La varianza se evala mejor en un conjunto grande de
datos de valoracin. Resulta inapropiado usar nicamente la varianza entre determinaciones repetidas de la valoracin vigente,
debido a que existen muy pocos datos para determinar de manera adecuada varianzas verdaderamente representativas, espe-
cficas para cada concentracin. Los datos sobre la varianza son escasos durante el desarrollo; resulta prudente reevaluar la va-
rianza durante la validacin y monitorearla peridicamente durante el uso continuo de la valoracin.
Dos mtodos usados para mitigar la heterogeneidad de la varianza son la transformacin y la ponderacin. La falta de va-
rianza constante puede tratarse mediante una transformacin adecuada. Asimismo, la transformacin puede mejorar la norma-
lidad de los residuos y el ajuste de algunos modelos estadsticos a los datos. Se debe seleccionar una transformacin para un
sistema de valoracin durante el desarrollo, verificarla durante la validacin, usarla de manera uniforme en las valoraciones de
rutina y verificarla peridicamente. Los datos de la valoracin biolgica comnmente se presentan con la concentracin trans-
formada por logaritmo; las valoraciones de cociente de la pendiente se presentan con la concentracin en la escala original.
La transformacin se puede aplicar a los datos de la respuesta, as como a los datos de la concentracin. Las opciones comu-
nes para una transformacin de la respuesta incluyen la transformacin logartmica, por raz cuadrada (para recuentos), rec-
proca y, para el recuento de datos con asntotas conocidas, por logit del porcentaje de mxima respuesta. Las transformacio-
nes logartmicas son de uso comn, debido a que convierten un segmento til de la relacin concentracin-respuesta en un
segmento casi lineal y debido a su facilidad para transformar de vuelta a la escala original para fines de interpretacin. Se pue-
de llevar a cabo un ajuste log-log con datos que presentan un comportamiento no lineal. Asimismo, existen otras alternativas
disponibles, p. ej., los datos se pueden transformar mediante la inversa de la funcin del Poder de la Media (POM, por sus siglas
en ingls). Un coeficiente del Poder de la Media de k = 2 corresponde a una transformacin logartmica de los datos. Para un
anlisis ms extenso de las relaciones entre datos transformados por logaritmos y datos sin transformar, ver el Apndice del
captulo general Validacin de Valoraciones Biolgicas (1033).
Se debe tomar en cuenta que la transformacin de los datos requiere la reevaluacin del modelo usado para ajustar los da-
tos. Desde el punto de vista estadstico, no existe nada especial con respecto a la escala original de medicin; resulta aceptable
cualquier transformacin que mejore la concordancia con las suposiciones. No obstante, los analistas deben reconocer que las
transformaciones, la seleccin del modelo estadstico y la seleccin del esquema de ponderacin estn interrelacionadas. El uso
de una transformacin puede afectar la seleccin del modelo estadstico, es decir, transformar la respuesta mediante un loga-
ritmo o raz cuadrada, por ejemplo, puede cambiar la forma de la curva de respuesta y, para un modelo lineal, puede cambiar
el intervalo de concentraciones cuyas respuestas sean casi rectas y casi paralelas.
Para valoraciones con varianza no constante, una opcin razonable es la adopcin de un anlisis ponderado. Aunque la pon-
deracin no puede tratar la falta de normalidad residual, se considera una metodologa estadstica vlida para poner nfasis en
datos ms precisos. Idealmente, las ponderaciones se pueden basar en la inversa de la varianza prevista dentro de la valoracin
(o dentro de los bloques) de cada respuesta donde los factores que predicen la varianza son independentes de las respuestas
observadas en una valoracin especfica.
En la prctica, muchas valoraciones biolgicas presentan variaciones relativamente grandes en el logaritmo EC 50 (en compa-
racin con la variacin en el logaritmo de la potencia relativa) entre valoraciones (y, en ocasiones, entre bloques dentro de la
valoracin). Cuando no se trata en el modelo de varianza, esta variacin en el logaritmo EC 50 provoca lo que parece ser una
gran variacin en las respuestas cercanas a la media logartmica EC 50, lo cual a menudo resulta en ponderaciones demasiado
bajas para las observaciones cercanas al EC 50
Si la valoracin es lo suficientemente estable (baja variabilidad en el EC 50), la varianza puede considerarse alternativamente
como una funcin de la concentracin. Aunque no es lo ideal, podra ser razonable una metodologa que utiliza varianzas de-
pendientes de la concentracin cuando las ponderaciones se estiman a partir de un gran nmero de valoraciones, las varianzas
son pequeas, cualquier desequilibrio en el nmero de observaciones de todas las concentraciones es tratado en el modelo de
varianza y no se presentan observaciones inusuales (valores aberrantes). Esta posibilidad se puede examinar graficando la va-
rianza de la respuesta en cada concentracin (de preferencia, combinada a travs de mltiples valoraciones) en funcin de la
concentracin y luego contra una funcin de la concentracin (p.ej., concentracin cuadrada). La varianza ser proporcional a
la funcin de concentracin donde esta lnea trazada se aproxime a una lnea recta. La pendiente aparente de esta lnea es
informativa, debido a que una lnea horizontal indica que no es necesaria la ponderacin. Si se puede encontrar una funcin
que genere una grfica lineal, entonces las ponderaciones se consideran proporcionales a la recproca de dicha funcin. Dicha
funcin puede no existir, en particular si la variacin es mayor (o menor) en ambos extremos del intervalo de concentracin
estudiado.
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Independientemente de si se emplea un modelo o datos histricos, el objetivo es capturar la variabilidad relativa en cada
concentracin. No es necesario asumir que el nivel de variabilidad absoluto de la valoracin en uso es idntico al de los datos
usados para determinar la ponderacin, sino que nicamente los intervalos de las varianzas entre concentraciones sean unifor-
mes con los datos histricos o con los datos usados para determinar la funcin de la varianza.
La capacitacin y experiencia apropiadas en mtodos estadsticos son esenciales para determinar una estrategia para generar
un modelo de varianza adecuada. Las fuentes de variabilidad pueden identificarse de manera errnea si se emplea el modelo
incorrecto de varianza. Por ejemplo, los datos pueden presentar una variacin constante a lo largo de una curva logstica de
concentracin-respuesta de cuatro parmetros, pero tambin puede tener una variacin apreciable en el parmetro EC 50 entre
bloques dentro de la valoracin, o entre valoraciones. Si no se reconoce la variabilidad entre bloques o entre valoraciones, po-
dra parecer que esta valoracin tiene una gran variacin en la respuesta para concentraciones cercanas al valor promedio a
largo plazo del EC 50 Un modelo ponderado con ponderaciones bajas para concentraciones cerca del EC 50 podra representar
errneamente una caracterstica principal del sistema de valoracin.

4.4 Normalidad

Muchos mtodos estadsticos para el anlisis de respuestas cuantitativas suponen la normalidad de los residuos. Si no se
cumple la suposicin de normalidad, la estimacin de la potencia relativa y su error estndar pueden considerarse razonables,
pero las pruebas de aptitud y un intervalo de confianza para la estimacin de la potencia relativa podran ser invlidos. La ma-
yora de los mtodos usados en este captulo son razonablemente robustos frente a desviaciones de la normalidad, por lo que
el objetivo es detectar anormalidades importantes. Durante el desarrollo de la valoracin, y con el objeto de descubrir desvia-
ciones importantes de la normalidad, se pueden usar herramientas grficas tales como una grfica de probabilidad normal o
un histograma (o una herramienta similar como las grficas de tallo y hoja o de caja) de los residuos a partir del ajuste del
modelo. El histograma debe ser unimodal y simtrico. La grfica de probabilidad normal debe aproximase a una lnea recta;
una grfica de probabilidad normal que no es recta (p.ej., curva en un extremo, en ambos extremos, o en la parte media)
indica la presencia de anormalidad. Un patrn sobre una lnea recta es indicativo de anormalidad. El comportamiento anormal
puede deberse a mediciones que son logartmicas normales y presentan una variabilidad mayor a niveles ms altos de respues-
ta. Lo anterior se puede considerar un patrn cncavo en los residuos en una grfica normal.
Las pruebas estadsticas de normalidad pueden no ser tiles. De acuerdo con la discusin previa sobre anlisis estadstico de
la constancia de la varianza, cambiar el valor de una estadstica de la prueba de normalidad, en lugar de basarse en un valor p,
funciona para juzgar si la normalidad se ha mejorado o empeorado. En lo que respecta a la evaluacin de la varianza, se debe
evaluar la normalidad en un conjunto de datos tan grande como sea posible durante el desarrollo, reevaluarlos durante la vali-
dacin y monitorearlos peridicamente durante el uso de la valoracin. Las desviaciones importantes de la normalidad a me-
nudo pueden mitigarse mediante una transformacin adecuada. La falta de evaluacin y mitigacin de desviaciones importan-
tes de la normalidad conlleva el riesgo de inhabilitar la deteccin apropiada de valores aberrantes, as como una prdida en la
capacidad de obtener estimaciones confiables de variacin.

4.5 Linealidad de los Datos de Concentracin-Respuesta

Algunos anlisis de valoraciones biolgicas suponen que la forma de la curva de concentracin-respuesta es una lnea recta
o se aproxima a una lnea recta para un intervalo limitado de concentraciones. En dichos casos, se puede evaluar un modelo
de respuesta lineal para determinar si se justifica para los datos disponibles. Los mtodos de anlisis de diferencias para evaluar
la linealidad enfrentan los mismos problemas que los mtodos de anlisis de diferencias aplicados al paralelismo-ms datos y
una mejor precisin incrementan la posibilidad de detectar la falta de linealidad. Debido a que casi siempre la falta de lineali-
dad afecta la estimacin de la potencia, los analistas deben evaluar las desviaciones de la linealidad de manera rutinaria si de-
sean emplear un modelo de respuesta lineal para estimar la potencia.
Si el examen de una grfica revela claramente una desviacin de la linealidad, es suficiente para concluir la falta de lineali-
dad. Sin embargo, una alta variabilidad de los datos puede ocultar una desviacin de la linealidad. Por consiguiente, una me-
todologa general para linealidad puede corresponder con la usada para la similitud, que se desarrolla de manera ms elabora-
da en la seccin 4.7 Anlisis de Aptitud y Aplicacin del Anlisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo).
(1) Especificar una medida de desviacin de la linealidad que se pueda combinar con todas las muestras o que sea especfica
para una muestra. Las posibilidades incluyen la suma de la falta de linealidad de coeficientes cuadrados o cuadrticos.
(2) Se puede emplear una de las cuatro metodologas del Paso 2 de Aplicacin del Anlisis de Equivalencia para Similitud (para-
lelismo) para determinar, durante el desarrollo, un intervalo de valores aceptables (intervalo de aceptacin) para la medida
de la falta de linealidad.
(3) Determinar un intervalo de confianza bilateral del 90% en la medicin de la falta de linealidad, siguiendo el procedimien-
to de Pruebas Doblemente Unilaterales (TOST, por sus siglas en ingls) y comparar el resultado con el intervalo de acepta-
cin segn se determina en (2).
A menudo, se seleccionar un subconjunto de concentraciones medidas en la valoracin para establecer una curva lineal de
concentracin-respuesta, el cual puede identificarse grficamente. Las concentraciones en los extremos del intervalo deben ser
examinadas cuidadosamente, debido a que a menudo tienen un gran impacto sobre la pendiente y los clculos derivados de
la pendiente. Si la intencin en la valoracin final es usar nicamente concentraciones en el intervalo lineal, se debe seleccionar
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un intervalo de concentraciones que genere lneas rectas paralelas para las potencias relativas esperadas durante el uso rutina-
rio de la valoracin; de otro modo, la valoracin no pasar las pruebas de paralelismo cuando la potencia produzca valores de
respuesta de la valoracin que estn fuera del intervalo lineal de respuesta. Cuando la potencia est fuera del intervalo lineal,
podra resultar apropiado ajustar la concentracin de la muestra basndose en dicha potencia estimada y analizar de nuevo
para obtener un resultado de potencia vlido. Las valoraciones repetidas en conjunto con las valoraciones vlidas pueden ge-
nerar una estimacin de potencia sesgada, debido al proceso selectivo de repetir valoraciones cuando la respuesta est en los
extremos de la curva de concentracin-respuesta.
El problema es ms complejo para valoraciones en las que existe incluso una modesta variacin en la forma o ubicacin de la
curva de concentracin-respuesta de corrida a corrida o entre bloques dentro de una valoracin. En tales valoraciones, puede
resultar apropiado seleccionar subconjuntos para cada muestra en cada valoracin, o incluso en cada bloque dentro de una
valoracin. Se debe tomar en cuenta que un modelo de efectos fijos eliminar la necesidad de subconjuntos diferentes en blo-
ques diferentes, pero un modelo de efectos mixtos puede revelar y acomodar diferentes subconjuntos en diferentes bloques
(ver la seccin 4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biolgicas).
Las pautas adicionales con respecto a la seleccin de subconjuntos de datos para la estimacin de potencia relativa mediante
modelo lineal incluyen: usar al menos tres, y de preferencia cuatro, concentraciones adyacentes; que la pendiente del segmen-
to lineal sea lo suficientemente pronunciada; que las lneas que se ajustan a las muestras Estndar y de Prueba sean rectas; y
que las lneas de regresin para el ajuste sean paralelas. Una forma de derivar un criterio de pronunciamiento es calcular una
estadstica t para evaluar si la pendiente es significativamente diferente de cero. Si la pendiente no es significativa, es posible
que la valoracin biolgica tenga un desempeo deficiente; lo anterior se puede observar como un aumento de variacin en
los resultados de potencia. Otro aspecto que sustenta el requisito de pronunciamiento adecuado de la pendiente es el uso de
algoritmos para la seleccin de subconjuntos. Sin un criterio de pronunciamiento de la pendiente, un algoritmo para la selec-
cin de subconjuntos, que busca identificar subconjuntos de tres o ms puntos de datos contiguos que sean rectos y paralelos,
podra seleccionar concentraciones en una asntota. Evidentemente, dichos subconjuntos son inapropiados para su uso en la
estimacin de la potencia. El pronunciamiento o la importancia del pronunciamiento de la pendiente deben depender de la
valoracin. Este criterio debe establecerse durante el desarrollo de la valoracin y, posiblemente, redefinirse durante la valida-
cin de la valoracin.

4.6 Modelos Comunes de Valoracin Biolgica

La mayora de las valoraciones biolgicas consisten en una serie de concentraciones o diluciones de una muestra de Prueba y
de un material Estndar. Un modelo matemtico se ajusta a los datos de concentracin-respuesta y, posteriormente, se puede
calcular una potencia relativa a partir de los parmetros del modelo. La seleccin del modelo puede depender de si se estn
analizando datos cuantitativos o cualitativos.
Para datos cuantitativos, los modelos que emplean perfiles de respuestas paralelas, los cuales sustentan la evaluacin compa-
rativa para determinar la potencia relativa, pueden ofrecer ventajas estadsticas. Si se emplean dichos modelos, las concentra-
ciones o diluciones por lo general se modifican usando una escala geomtrica, p.ej., en incrementos duplicativos, logartmicos
o de logaritmo medio. Si se usa el modelo de cociente de la pendiente, las concentraciones o diluciones se pueden espaciar de
igual manera en la concentracin, en lugar del logaritmo de la concentracin. Es posible usar diversas funciones para ajustar
un modelo de respuesta paralelo a datos cuantitativos, incluyendo una funcin lineal, una funcin polinmica de orden mayor,
una funcin logstica de cuatro parmetros (sigmoidea simtrica) y una funcin logstica de cinco parmetros para sigmoideas
asimtricas. Dichas funciones requieren un nmero suficiente de concentraciones o diluciones para ajustarse al modelo. Para
evaluar la falta de ajuste de cualquier modelo, es necesario contar con al menos una concentracin (o dilucin) -preferible-
mente varias- ms que el nmero de parmetros que se estimarn en el modelo. Asimismo, por lo regular se usa por lo me-
nos una concentracin -de preferencia dos- para sustentar cada asntota.
En ocasiones, se selecciona un modelo lineal debido a su eficiencia aparente y facilidad de procesamiento. Debido a que los
perfiles de respuesta de la valoracin biolgica son, por lo general, no lineales, el laboratorio puede realizar un experimento
con un amplio intervalo de concentraciones para identificar la regin aproximadamente lineal del perfil de concentracin-res-
puesta. Para datos que siguen un modelo logstico de cuatro parmetros, stas son las concentraciones cercanas al centro de la
regin de la respuesta, a menudo una respuesta de 20% a 80% cuando se modifica nuevamente la escala de los datos para las
asntotas. Se deben tomar precauciones apropiadas cuando se emplea un modelo lineal, debido a las diversas razones por las
que una regin aparentemente lineal podra cambiar. Es posible identificar una regin lineal estable despus de acumular sufi-
ciente experiencia con la valoracin y con la variedad de muestras que se espera analizar con la misma. Los datos que siguen la
funcin logstica de cuatro parmetros tambin se pueden linealizar mediante transformacin. La regin inferior de la funcin
es aproximadamente lineal cuando los datos se transforman con logaritmos (ajuste log-log).
Por lo regular, los datos cuantales se ajustan usando modelos matemticos ms complejos. Se puede utilizar un modelo de
probita o de logit para estimar un percentilo de la curva de respuesta (a menudo el percentilo 50) o, de manera ms directa, la
potencia relativa de la Prueba con respecto al Estndar. El anlisis Spearman-Karber es un mtodo sin modelo que se puede
emplear para la determinacin del percentilo 50 de una curva de concentracin-respuesta cuantal.
916 (1032) Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

4.7 Anlisis de Aptitud

La evaluacin de la aptitud del sistema y de la aptitud de la muestra son necesarias para asegurar la calidad de los resultados
de la valoracin biolgica. La aptitud del sistema en la valoracin biolgica, al igual que en otros mtodos analticos, consta de
criterios previamente especificados mediante los cuales se evala la validez de una valoracin (o, posiblemente, una corrida
que contenga varias valoraciones). Los analistas pueden evaluar la aptitud del sistema determinando si algunos de los parme-
tros de la respuesta del Estndar y algunas propiedades (p.ej., variacin residual) de los datos se encuentran en sus intervalos
habituales. A fin de obtener altas tasas de aceptacin en la valoracin, se recomienda aceptar grandes fracciones de estos inter-
valos habituales (99% o ms) y evaluar la aptitud del sistema usando nicamente unos pocos parmetros de respuesta del Es-
tndar sin correlacin. La seleccin de los parmetros de aptitud del sistema y de sus intervalos tambin se puede informar
mediante estudios empricos o de simulacin que midan la influencia de los cambios sobre un parmetro en la estimacin de
la potencia.
La aptitud de la muestra en una valoracin biolgica se evala mediante criterios previamente especificados para la validez
de la estimacin de la potencia de una muestra de Prueba individual y, por lo regular, se enfoca en la evaluacin de la simili-
tud. Es necesario establecer los criterios de aptitud del sistema y de la muestra durante el desarrollo de la valoracin biolgica y
antes de su validacin. Cuando se cuente con poca experiencia con respecto a la valoracin biolgica, dichos criterios pueden
considerarse provisionales.

APTITUD DEL SISTEMA

Los parmetros de aptitud del sistema se pueden seleccionar basndose en el diseo y en el modelo estadstico. No obstan-
te, independientemente del diseo o modelo, los parmetros de aptitud del sistema debe estar directamente relacionados con
la calidad de la valoracin biolgica. Dichos parmetros por lo regular se basan en muestras estndar y de control. Por ejem-
plo, en las valoraciones de lneas paralelas, los valores bajos de la pendiente del Estndar a menudo generan estimaciones de
potencia de baja precisin. En lugar de rechazar las valoraciones con pendientes bajas, el uso de valoraciones repetidas adicio-
nales podra resultar ms efectivo para los analistas hasta que pueda mejorarse el sistema de valoracin para generar estimacio-
nes de potencia con una precisin ms alta de manera constante. El monitoreo del intervalo de niveles de respuesta y ubica-
cin de las asntotas asociadas a controles o con la muestra del Estndar puede ser particularmente importante para establecer
niveles de respuesta apropiados. Cualquier desviacin o tendencia en alguno de los criterios puede ser indicativa de la degra-
dacin de un reactivo crtico o del material Estndar. Se deben implementar mtodos de Control Estadstico de Procesos (SPC,
por sus siglas en ingls) para detectar tendencias en los parmetros de aptitud del sistema.
Dos medidas comunes de aptitud del sistema son la evaluacin de la idoneidad del modelo (capacidad de ajuste) y de la
precisin. El uso de determinaciones repetidas en un diseo completamente aleatorizado permite separar un trmino de error
puro de la evaluacin de falta de ajuste. Se debe tener cuidado al derivar un criterio para la falta de ajuste; el uso de un trmi-
no de error puro incorrecto puede provocar una evaluacin artificial. La falta de ajuste de la suma de cuadrados obtenida a
partir del ajuste del modelo al Estndar puede ser una medida til de idoneidad del modelo, dependiendo de las concentracio-
nes usadas y de cmo difieran los datos obtenidos del modelo. Es posible establecer un umbral basndose en el anlisis de
sensibilidad (evaluacin de la sensibilidad de la valoracin a los cambios en el analito) y/o datos histricos, ms all de los cua-
les el valor de falta de ajuste indica que los datos no son adecuados. Se debe tomar en cuenta que los datos de Prueba no se
usan en esta parte; la idoneidad del modelo para la Prueba es parte de la aptitud de la muestra.
Existen dos alternativas a considerar para evaluar la precisin. Un mtodo emplea el error cuadrtico medio (varianza resi-
dual) a partir del ajuste del modelo con el Estndar nicamente. Dado que esta metodologa puede tener pocos grados de
libertad para la estimacin de la varianza, podra resultar ms til emplear un error cuadrado medio combinado a partir de
ajustes de modelos separados con el Estndar y la Prueba. Una vez que se haya seleccionado la medida, se usan datos histri-
cos y anlisis de sensibilidad para determinar un umbral de aceptacin.

APTITUD DE LA MUESTRA

La aptitud de la muestra en la valoracin biolgica por lo general consiste en la evaluacin de la similitud, la cual nicamen-
te se puede realizar dentro del intervalo de valoracin. La potencia relativa se puede informar nicamente a partir de muestras
que presenten una similitud con el Estndar, que tengan la calidad requerida para el ajuste del modelo y que hayan sido dilui-
das para generar un EC 50 (y potencia) dentro del intervalo del sistema de valoracin.

SIMILITUD

En el contexto de evaluacin de similitud, el anlisis de hiptesis clsico (diferencia) evala la hiptesis nula que establece
que una medida (un parmetro de no similitud que mide la diferencia entre las curvas de concentracin--respuesta del Estn-
dar y de la Prueba) es cero, con una hiptesis alternativa implcita que establece que la medida no es cero o que no se han
cumplido las suposiciones estadsticas. El criterio habitual (la "prueba de diferencia") que indica que el valor p debe ser mayor
que cierto valor crtico para poder declarar que la muestra es similar a la referencia controla la probabilidad de que las mues-
USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 91 7

tras sean falsamente declaradas como no similares; ste es el riesgo del productor, que muestras adecuadas sean rechazadas. El
riesgo del consumidor (es decir, el riesgo de que muestras no similares se declaren similares) se controla mediante la precisin
de la medida de ausencia de similitud y la cantidad de determinaciones repetidas en la valoracin; por lo regular, la evaluacin
de stas es muy deficiente, dejando sin control el riesgo del consumidor.
En contraste con el anlisis de diferencias, el anlisis de equivalencia para similitud (es decir, evaluar si un intervalo de con-
fianza del 90% para una medicin de ausencia de similitud est contenido dentro de los lmites de equivalencia especificados)
permite nicamente una probabilidad del 5% de que muestras con medidas de ausencia de similitud que estn fuera de los
lmites de equivalencia sean declaradas similares (controlando as el riesgo del consumidor). Con el anlisis de equivalencia,
resulta prctico examinar y administrar el riesgo del productor asegurando que la valoracin cuente con suficientes determina-
ciones repetidas para tener una buena precisin al estimar las medidas de ausencia de similitud.
Para la comparacin de pendientes, se han usado tradicionalmente las pruebas de diferencia para establecer el paralelismo
entre una muestra de Prueba y la muestra Estndar. No obstante, el uso de esta metodologa no permite al laboratorio concluir
que las pendientes sean iguales, puesto que los datos pueden ser demasiado variables o el diseo de la valoracin puede ser
demasiado dbil para establecer una diferencia. Sin embargo, el laboratorio puede concluir que las pendientes son lo suficien-
temente similares usando la metodologa del anlisis de equivalencia.
El anlisis de equivalencia presenta ventajas prcticas en comparacin con el anlisis de diferencias, incluyendo que una ma-
yor cantidad de determinaciones repetidas resulta en una mejor precisin de la valoracin, la cual incrementar las probabili-
dades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; que una menor cantidad de determinaciones repetidas o de
precisin de la valoracin reducir las probabilidades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; y que se obtie-
nen metodologas slidas para combinar datos de mltiples valoraciones de la misma muestra para comprender de mejor ma-
nera si una muestra es verdaderamente similar al Estndar o no.
Debido a las ventajas asociadas con el uso del anlisis de equivalencia en la evaluacin de similitud, los analistas pueden
cambiar las valoraciones existentes a anlisis de equivalencia o pueden implementar mtodos de anlisis de equivalencia cuan-
do se realizan cambios a las valoraciones existentes. Con este propsito, es conveniente examinar el riesgo de que la valoracin
no apruebe muestras adecuadas. Este riesgo depende de la precisin del sistema de valoracin, de la estrategia para determi-
naciones repetidas en el sistema de valoracin y de los valores crticos de los parmetros de similitud (esto constituye un anli-
sis de capacidad del proceso). Una metodologa para cambiar una valoracin establecida a partir del anlisis de diferencia a un
anlisis de equivalencia (para similitud) consiste en usar la capacidad de proceso de la valoracin para establecer valores crti-
cos para parmetros de similitud. Esta metodologa resulta razonable para una valoracin establecida, debido a que los riesgos
(de declarar falsamente muestras como similares o no similares) son implcitamente aceptables, dado el historial de uso exitoso
de la valoracin.
Las medidas de similitud se pueden basar en los parmetros de la curva de concentracin-respuesta y pueden incluir la pen-
diente para una valoracin de lnea paralela recta; la ordenada al origen para una valoracin de cociente de la pendiente; la
pendiente y asntotas para una valoracin logstica de lneas paralelas de cuatro parmetros; o la pendiente, las asntotas y el
parmetro de falta de simetra en un modelo de sigmoideo de cinco parmetros. En algunos casos, estas medidas de similitud
tienen un significado interpretable y prctico en la valoracin; algunos cambios en la forma de la curva, por ejemplo, pueden
relacionarse con cambios especficos (tales como la presencia de un contaminante activo especfico) en el producto. Siempre
que sea posible, discutir dichos cambios y sus probables efectos ser de gran valor para establecer los lmites de equivalencia.

APLICACIN DEL ANLISIS DE EQUIVALENCIA PARA SIMILITUD (PARALELISMO)

Conforme a lo indicado anteriormente, muchos procedimientos estadsticos para evaluar la similitud se basan en una hipte-
sis nula que indica la presencia de similitud y en la hiptesis alternativa que indica un estado de ausencia de similitud. Poste-
riormente, la incapacidad para determinar que la similitud es improbable desde el punto de vista estadstico se toma como una
conclusin de similitud. Sin embargo, dicha incapacidad para establecer un fundamento probabilstico de ausencia de similitud
en realidad no prueba la existencia de similitud. El anlisis de equivalencia ofrece un mtodo para que el analista llegue a una
conclusin (si los datos as lo requieren) de similitud suficiente al tiempo que controla el riesgo de hacerlo inadecuadamente. A
continuacin se proporciona una secuencia para el proceso de aplicacin del anlisis de equivalencia.
Paso 1: Seleccionar una medida de ausencia de smltud.
Para el caso de lneas paralelas, sta puede ser la diferencia o el cociente de las pendientes. (El cociente de las pendientes
puede ser menos sensible al valor de la pendiente. Enmarcar la diferencia de la pendiente como un cambio proporcional a
partir del Estndar en lugar de usar unidades de pendiente absolutas tiene la ventaja de ser invariable a las unidades en los
ejes de concentracin y respuesta.) Para una valoracin de cociente de la pendiente, la medida de ausencia de similitud
puede ser la diferencia en las ordenadas al origen entre las muestras de Prueba y Estndar. Nuevamente, enmarcar esta
diferencia como una proporcin del intervalo de respuesta (posiblemente transformado) del Estndar para hacer que la
medida sea invariable a las unidades de la respuesta podra presentar ventajas.
La determinacin de similitud se puede basar en los parmetros individuales, de uno en uno; para el modelo logstico de
cuatro parmetros, la similitud entre las muestras Estndar y de Prueba se pueden evaluar de manera discreta para la asn-
tota superior, la pendiente y la asntota inferior. Si se utilizan curvas sigmoideas con parmetros adicionales para ajustar
los datos de la valoracin biolgica, tambin es importante considerar el tratamiento de la similitud entre las preparacio-
nes Estndar y de Prueba de los parmetros de curva adicionales (p.ej., parmetro de asimetra del modelo de cinco par-
918 (1032) Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

metros). Como alternativa, la evaluacin de similitud se puede basar en una sola medida compuesta de falta de paralelis-
mo, tal como la suma de paralelismo de cuadrados. sta se determina como la diferencia en la suma residual de errores
cuadrados (RSSE, por sus siglas en ingls) entre el valor obtenido del ajuste de las curvas del Estndar y de la Prueba por
separado y el valor obtenido de la imposicin de paralelismo:
Suma de paralelismo de cuadrados = RSSEP - RSSE, - RSSE1
donde los subndices p, s y t denotan el modelo Paralelo, el modelo Estndar y el modelo de Prueba, respectivamente.
Para cualquier medida compuesta, el analista debe considerar la ponderacin relativa implcita de la importancia de las
tres (o ms) regiones de la curva y si la ponderacin es apropiada para el problema en cuestin. Por ejemplo, para la suma
de paralelismo de cuadrados con modelos no lineales, la ponderacin provista a la comparacin de las asntotas depende
de la cantidad de datos en la valoracin en uso sobre y cerca de las asntotas.
Paso 2: Especificar un intervalo de valores aceptables, por lo regular denominado intervalo de equivalencia o "zona de indiferen-
cia", para la medida de falta de similitud.
El desafo de implementar un anlisis de equivalencia radica en establecer lmites de equivalencia apropiados para las me-
didas de ausencia de similitud. Idealmente, se cuenta con informacin disponible para vincular la variacin en las medidas
de similitud con diferencias significativas en la funcin biolgica (segn se miden con la valoracin biolgica). La informa-
cin puede estar disponible a partir de la evaluacin de valoraciones ortogonales. Las cuatro metodologas siguientes pue-
den usarse para determinar este intervalo. Si se han especificado lmites farmacopeicos para una medida definida de falta
de similitud, entonces la valoracin debe satisfacer dichos requisitos.
a. La primera metodologa consiste en compilar datos histricos que comparen el Estndar contra s mismo y usar di-
chos datos para determinar el intervalo de equivalencia como un intervalo de tolerancia para la medida de falta de
paralelismo. La ventaja de usar datos histricos radica en que dan control al laboratorio sobre la tasa de incumpli-
miento falso (la tasa de incumplimiento de una muestra que es en realidad una muestra aceptable). La desventaja es
que no hay control sobre la tasa de cumplimiento falso (la tasa de cumplimiento de una muestra que pudiera tener
una diferencia inaceptable en el desempeo con respecto al Estndar). La especificacin del intervalo de equivalencia
desarrollado de esta manera se basa nicamente en la capacidad de la valoracin. Los laboratorios que emplean esta
metodologa deben ser precavidos debido a que una valoracin imprecisa que requiera mejora podra generar un
intervalo de equivalencia tan amplio que no sera posible contar con una discriminacin til para ausencia de simili-
tud.
b. La metodologa (a) es simple de implementar en la rutina y se puede emplear con diseos de valoraciones que no
ofrezcan estimaciones confiables de variacin dentro de la valoracin y, por ende, intervalos de confianza. No obs-
tante, existe el riesgo de que las valoraciones con cantidades de variacin dentro de la valoracin, mayores a las habi-
tuales, puedan cumplir inapropiadamente. Por consiguiente, la alternativa preferida a la metodologa (a) es determi-
nar un intervalo de tolerancia para el intervalo de confianza para la medida de falta de paralelismo. Lo siguiente re-
sulta particularmente apropiado para cambiar una valoracin existente, con un conjunto importante de datos histri-
cos sobre las muestras Estndar y de Prueba obtenidos a partir de una metodologa de anlisis de diferencia, a una
metodologa de equivalencia:
i. Para cada valor de la medida de falta de paralelismo obtenido a partir de los datos histricos, se debe determi-
nar un intervalo de confianza de 95%, (m,n).
ii. Para cada intervalo de confianza, determinar su desviacin mxima del paralelismo perfecto. Esto es mx(lml, 1
ni) para diferencias, mx(l /m,n) para cocientes y simplemente n para cantidades que deben ser positivas, tales
como la suma de cuadrados.
iii. Determinar un intervalo de tolerancia para las desviaciones mximas obtenidas en (ii), el cual ser un intervalo
de tolerancia unilateral para estas cantidades necesariamente positivas. Se prefiere una metodologa de intervalo
de tolerancia no paramtrico.
iv. Se concluye que los nuevos datos son "suficientemente paralelos" si el intervalo de confianza para la medida de
falta de paralelismo cae completamente dentro del intervalo determinado en (iii).
Las metodologas (a) y (b), basndose en la capacidad del ensayo, controlan nicamente la tasa de incumplimiento
falso y pasan por alto la tasa de cumplimiento falso. La incorporacin de informacin de fuentes distintas a la evalua-
cin de la capacidad de la valoracin provee control sobre la tasa de cumplimiento falso. Las metodologas (c) y (d)
son medios que se pueden usar con este propsito.
c. La tercera metodologa comienza con datos histricos que comparan el Estndar consigo mismo y agrega datos que
comparan el Estndar con fallas conocidas, p.ej., muestras degradadas. Comparar los valores de la medida de ausen-
cia de similitud para datos para los que sea apropiada una conclusin de similitud (Estndar contra s mismo) y para
datos para los que no sea apropiada una conclusin de similitud, p.ej., muestras degradadas. Basndose en esta com-
paracin, determinar un valor de la medida de ausencia de similitud que discrimine entre los dos casos. Si se emplea
esta metodologa, se debe utilizar un intervalo de muestras para el que no sea apropiada una conclusin de similitud,
incluyendo muestras con la ms mnima ausencia de similitud importante. Para modelos no lineales, esta compara-
cin tambin se puede usar para determinar aquellos parmetros que deben evaluarse; algunos pueden no ser sensi-
bles a las fallas que pueden ocurrir con la valoracin especfica o con la recoleccin de muestras no similares.
 USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 919

d. La cuarta metodologa se basa en combinar un anlisis de sensibilidad de la curva de valoracin para parmetros de
ausencia de similitud con lo que se conozca acerca del producto y de la valoracin. Lo anterior es particularmente
til si se dispone de informacin que vincule un cambio en una o ms medidas de ausencia de similitud con las pro-
piedades del producto. Estas medidas pueden ser directas (p.ej., cambios en la conformacin de una protena) o in-
directas (p.ej., cambios en la eficiencia o seguridad de un modelo animal). Otra metodologa complementaria es un
anlisis de sensibilidad limitada, el cual combina el juicio del analista y del bilogo con respecto a la lectura de la
magnitud de los cambios en un parmetro de ausencia de similitud que sean significativos, mediante experimentos
de simulacin y/o en el laboratorio, para demostrar los umbrales para parmetros de similitud que ofrecen protec-
cin contra una ausencia de similitud importante. Asimismo, los anlisis de riesgo se pueden informar utilizando el
ndice teraputico del frmaco.
Paso 3. Examinar si el valor de la medida de falta de similitud se encuentra dentro del intervalo de equivalencia de valores acep-
tables.
Para las metodologas (a) y (b), comparar el valor obtenido de la medida de falta de paralelismo (a) o su intervalo de
confianza (b) con el intervalo obtenido al inicio del Paso 2. El valor debe estar dentro de los lmites si se utiliza (a), o el
intervalo de confianza debe estar completamente dentro de los lmites si se utiliza (b).
Una alternativa a la metodologa descrita anteriormente [para (a)] consiste en usar un valor promedio (histrico) para la
varianza del cociente o diferencia en un parmetro de similitud-obtenido a partir de algn nmero de valoraciones indi-
viduales-para calcular un intervalo de aceptacin para una estimacin puntual del parmetro de similitud. Esta metodo-
loga es ms simple de implementar en la rutina y se puede usar con diseos de valoraciones que no sean capaces de
proveer estimaciones fidedignas de variacin dentro de la valoracin, aunque existe un precio. La metodologa de anlisis
de equivalencia que se basa en las mediciones de variacin especfica de la valoracin (dentro de la valoracin) (es decir,
los intervalos de confianza) presenta una postura conservadora en el sentido de que no aprobar la similitud de las mues-
tras de valoraciones con cantidades mayores a las habituales de variacin dentro de la valoracin. El uso de una regin de
aceptacin para un parmetro de similitud -en lugar de una regin de aceptacin para intervalos de confianza para el
parmetro de similitud-pierde dicho conservadurismo y, por ende, no es la opcin preferida ante la existencia de alter-
nativas.
Para la metodologa (c), se puede emplear una metodologa que esencialmente trate el paralelismo como un problema de
diferenciacin. La seleccin del punto de corte en la metodologa (c) debe tomar en cuenta las tasas de decisiones de
falsos positivos y falsos negativos (as como los riesgos aceptables para el laboratorio) y debe reflejar con precisin la varia-
bilidad entre valoraciones. Por lo tanto, resulta razonable comparar la estimacin puntual de la medida de falta de parale-
lismo con el punto de corte y no usar intervalos de confianza. Esta metodologa es ms simple de implementar en la ruti-
na y se puede usar con diseos de valoraciones que no son capaces de proveer estimaciones confiables de variacin den-
tro de la valoracin.
Para la metodologa (d), se debe demostrar que la medida de ausencia de similitud es significativamente mayor que el
punto final inferior del intervalo de aceptacin y significativamente menor que el punto final superior. (Si el intervalo de
aceptacin es unilateral, se realiza nicamente la prueba individual aplicable.) Este es el uso de la metodologa de Pruebas
Doblemente Unilaterales. En la mayora de los casos, la metodologa de Pruebas Doblemente Unilaterales se puede imple-
mentar de manera simple calculando un intervalo de confianza bilateral del 90%, que corresponde a una prueba de equi-
valencia del 5%. Si este intervalo de confianza cae totalmente dentro del intervalo de equivalencia especificado al inicio
del Paso 2, entonces se habr demostrado con suficiencia la similitud. Para modelos de lneas paralelas, se puede usar (1)
un intervalo de confianza basado en el valor de la diferencia de las pendientes k veces el error estndar de dicho valor o
(2) el Teorema de Fieller para el cociente de las pendientes. Para modelos de cociente de pendientes, se emplea el interva-
lo de confianza para la diferencia de las intersecciones. Para modelos no lineales, existe evidencia de que estos mtodos
simples de intervalo de confianza no alcanzan el nivel de confianza declarado, mientras que los mtodos basados en perfi-
les de probabilidad o remuestreo son ms apropiados.

INTERVALO

El intervalo para una valoracin biolgica de la potencia relativa es el intervalo entre las potencias superior e inferior para las
que la valoracin biolgica presenta niveles de precisin adecuados, exactitud relativa, linealidad del logaritmo de potencia y
tasas de xito para la aptitud del sistema y de la muestra. Resulta fcil determinar si una muestra, que es similar a un Estndar,
tiene o no una potencia relativa dentro del intervalo (validado) del sistema de valoracin. Para muestras que no son similares
de conformidad con los criterios establecidos, resulta ms complicado determinar si se puede obtener una estimacin de la
potencia relativa para la muestra. En una valoracin no lineal de lneas paralelas, se puede suponer que una muestra que no
presenta datos sobre una asntota est fuera del intervalo de potencia de la valoracin. En una valoracin de lnea recta parale-
la, una muestra que no tiene tres o ms puntos en la porcin pronunciada de la curva de respuesta puede estar fuera del inter-
valo de potencia de la valoracin. Para muestras que no hayan mostrado similitud con la referencia, resulta inapropiado infor-
mar la potencia o generar un cociente de los EC 50 a partir de ajustes no restringidos. Puesto que dichas muestras pueden estar
fuera del intervalo de la valoracin, podra ser til cambiar la dilucin de la muestra de prueba para una valoracin subsiguien-
te, basndose en una estimacin de la actividad relativa. Esta actividad relativa estimada puede obtenerse mediante el cociente
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entre las concentraciones del Estndar y la Prueba que genera respuestas que coinciden con la respuesta de referencia en el
EC50 de referencia.

4.8 Valores Aberrantes

Es necesario analizar los datos de la valoracin biolgica para detectar valores aberrantes antes del anlisis de la potencia
relativa. Los valores aberrantes pueden ser simples eventos aleatorios o una seal de un problema sistemtico en la valoracin
biolgica. El error sistemtico que genera valores aberrantes puede deberse a un error de dilucin en una o ms concentracio-
nes de una muestra de Prueba o del Estndar, o debido a un error mecnico (p.ej., mal funcionamiento del sistema). Se pue-
den tener en cuenta diversas metodologas para detectar valores aberrantes. La inspeccin visual se utiliza con frecuencia, aun-
que se debe aumentar su alcance con una metodologa ms objetiva para prevenir un posible sesgo.
Un valor aberrante es un dato que aparentemente est fuera de lugar con respecto a los otros datos presentes. Un valor
aberrante puede tener una causa distinta e identificable, como por ejemplo, un error en la prctica, mal funcionamiento del
equipo o un error de registro de datos, o simplemente puede ser un valor inusual con respecto a la variabilidad comnmente
observada y puede aparecer sin una causa identificable. La pregunta esencial con respecto a un valor aberrante es: El valor
aberrante aparente se obtiene a partir de la misma poblacin que los otros datos menos discrepantes o forma parte de otra
poblacin? Si proviene de la misma poblacin y, por lo tanto, el dato es un valor inusual (aunque legtimo) obtenido de casua-
lidad, entonces el dato debe mantenerse. Si proviene de otra poblacin y el valor inusual del dato se debe a un error humano
o al mal funcionamiento de un instrumento, entonces el dato debe omitirse de los clculos. En la prctica, a menudo se desco-
noce la respuesta a esta pregunta bsica y las investigaciones sobre las causas a menudo son inconclusas. La administracin de
valores aberrantes se basa en procedimientos y prcticas para generar la mejor respuesta posible a dicha pregunta esencial y
para guiar hacia una respuesta correcta.
El captulo general Interpretacin y Tratamiento de Datos Analticos (101 O) trata la designacin, la identificacin y el rechazo
de valores aberrantes, e incluye mtodos estadsticos. Asimismo, el Captulo General (101 O) cita fuentes adicionales de infor-
macin que pueden ofrecer una revisin exhaustiva de la metodologa estadstica pertinente. El Captulo General (101 O) no
ofrece comentarios explcitos con respecto al anlisis de valores aberrantes en regresiones lineales o no lineales. Se pueden usar
tcnicas de anlisis de valores aberrantes apropiadas para datos obtenidos de la regresin de la respuesta sobre la concentra-
cin. Este captulo ofrece algunos comentarios sobre valores aberrantes para el contexto de valoraciones biolgicas a fin de
enfatizar o complementar la informacin del captulo (101 O).
De todos los procedimientos empleados para el anlisis de compuestos farmacuticos y frmacos biolgicos, se puede espe-
rar que la valoracin biolgica presente la mayor tendencia a producir datos aberrantes. La administracin de valores aberran-
tes es adecuada para los datos de valoracin biolgica en al menos dos niveles: cuando se puede verificar un dato individual o
un grupo de datos (p.ej., datos a una concentracin) en funcin de las respuestas esperadas para la muestra y la concentra-
cin; y, por separado, cuando se pueden verificar la uniformidad de las estimaciones de potencia relativa de una valoracin en
funcin de otras estimaciones independientes de la potencia del mismo material.
Tres aspectos importantes de la administracin de valores aberrantes son la prevencin, la designacin y la identificacin.
La prevencin de valores aberrantes se prefiere por razones obvias, y se facilita mediante procedimientos que sean menos
propensos a errores y mediante verificaciones que sean sensibles a los tipos de errores que, dada la experiencia obtenida en el
desarrollo de la valoracin, podran esperarse. En efecto, el error nunca se convierte en un valor aberrante puesto que se pre-
vee su ocurrencia.
Una buena prctica requiere examinar los datos para detectar valores aberrantes y designar ("marcado") las observaciones
sobre aparentes valores aberrantes para su investigacin. Si la investigacin detecta una causa, entonces el dato aberrante se
puede excluir del anlisis. Debido a la presencia comn de variabilidad importante en la respuesta de las valoraciones biolgi-
cas, es probable que una investigacin del laboratorio sobre la observacin de valores aberrantes no determine una causa. Sin
embargo, la falta de evidencia relacionada con la causa de un valor aberrante no es una indicacin clara de que se requiera un
anlisis estadstico de valores aberrantes. El conocimiento sobre el intervalo tpico de la variabilidad de la respuesta de la valo-
racin debe usarse como justificacin para utilizar anlisis estadsticos para valores aberrantes.
La identificacin de valores aberrantes consiste en utilizar reglas para confirmar que los valores no son uniformes con el mo-
delo estadstico conocido o asumido. En el caso de valores aberrantes sin una causa determinada, resulta tentador el uso de
procedimientos estadsticos de identificacin de valores aberrantes para descartar valores inusuales. Descartar datos basndose
nicamente en consideraciones estadsticas debe realizarse con la menor frecuencia posible. El descarte falso de datos conlleva
a estimaciones de variabilidad demasiado optimistas y puede sesgar las estimaciones de potencia. El laboratorio debe monito-
rear la tasa de incumplimiento para su procedimiento de valores aberrantes y debe tomar acciones cuando sta sea significati-
vamente ms alta de lo esperado.
Los procedimientos estadsticos para la identificacin de valores aberrantes depende de suposiciones con respecto a la distri-
bucin de datos sin valores aberrantes. La identificacin de datos como valores aberrantes podra significar nicamente que la
suposicin con respecto a la distribucin es incorrecta. Si es comn la reduccin de valores aberrantes debido a consideracio-
nes estadsticas, en particular si los valores aberrantes tienden a presentarse en valores o respuestas altos, entonces esto puede
indicar que los datos requieren de algn ajuste, por ejemplo una transformacin logartmica, como parte del procedimiento de
valoracin. Dos metodologas para la evaluacin estadstica de valores aberrantes estn basadas en determinaciones repetidas
y en modelos.
 USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 921

METODOLOGAS BASADAS EN DETERMINACIONES REPETIDAS

Cuando se llevan a cabo determinaciones repetidas en concentraciones de una muestra de Prueba y del Estndar, se puede
emplear un criterio de "variabilidad extra" (EV, por sus siglas en ingls) para detectar valores aberrantes. Los datos histricos
pueden analizarse para determinar el intervalo en la variabilidad comnmente observada entre determinaciones repetidas y
dicha distribucin de intervalos se puede usar para establecer un extremo en el intervalo que puede sealar un valor aberrante.
Las mtricas que pueden emplearse incluyen el intervalo simple (repeticin mxima menos repeticin mnima), la desviacin
estndar, o el coeficiente de variacin o desviacin estndar relativa (RSD, por sus siglas en ingls) entre determinaciones repe-
tidas. No obstante, si la valoracin biolgica presenta heterogeneidad en la variabilidad, las suposiciones con respecto a la dis-
persin uniforme de datos son infundadas. Los analistas pueden usar un criterio variable a travs de distintos niveles de la valo-
racin biolgica, o pueden transformar los datos a una escala que produzca una variabilidad homognea. La transformacin se
puede llevar a cabo con una metodologa de Poder de la Media, segn se discuti con anterioridad. Cuando est presente la
heterogeneidad, es muy probable que exista una falta de normalidad, por lo que se debe usar el intervalo en lugar de la des-
viacin estndar o la desviacin estndar relativa.
Las acciones tomadas al detectar un valor aberrante potencial dependen en parte del nmero de determinaciones repetidas.
Si se detecta una variabilidad extra dentro de un par (n = 2) a una concentracin de una muestra de Prueba o del Estndar, no
siempre resultar claro cul de las determinaciones repetidas es aberrante, por lo que el laboratorio deber eliminar la concen-
tracin de cualquier otro procesamiento adicional. Cuando se llevan a cabo ms de dos determinaciones repetidas en cada
dilucin, el laboratorio puede optar por una estrategia que identifique cul de los extremos puede ser el valor aberrante. Como
alternativa, el laboratorio puede optar por eliminar la dilucin del procesamiento adicional.

METODOLOGAS BASADAS EN MODELOS

Las metodologas basadas en modelos se pueden usar para detectar valores aberrantes dentro de los datos de la valoracin
biolgica. Estas metodologas emplean los residuos derivados del ajuste de un modelo apropiado. En general, si se emplean
mtodos basados en modelos para identificar valores aberrantes potenciales, los modelos usados pueden realizar menos supo-
siciones sobre los datos que los modelos usados para evaluar la aptitud y la potencia estimada. Por ejemplo, un modelo de
regresin no paramtrico (suavizado) puede ser til.
Por ltimo, una alternativa para descartar datos aberrantes consiste en usar mtodos robustos que sean menos sensibles a la
influencia de observaciones de valores aberrantes. El uso de la mediana en lugar de la media para describir el centro de los
datos es un ejemplo de una perspectiva robusta. Asimismo, una regresin empleando el mtodo de cuadrados mnimos, que
sustenta muchos de los mtodos tratados en este captulo, no es robusta ante la presencia de valores aberrantes. El uso de
mtodos tales como una regresin robusta puede ser adecuado, pero no est cubierto en los captulos de valoraciones biolgi-
cas de la USP.

4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biolgicas

La eleccin de tratar factores como fijos o aleatorios es importante para el diseo de las valoraciones biolgicas, los experi-
mentos de desarrollo, el anlisis estadstico de datos y la validacin de la valoracin biolgica. Los efectos fijos son factores
para los que todos los niveles, o todos los niveles de inters, se presentan discretamente, como muestra, concentracin, tem-
peratura y duracin de la descongelacin, y tiempo de incubacin. Los datos para una respuesta a cierto nivel o a una combi-
nacin de niveles de un factor fijo puede predecir respuestas futuras. Se espera que los efectos fijos ocasionen un cambio uni-
forme en las respuestas. Los analistas estudian los efectos fijos controlndolos en el diseo y examinando los cambios en las
medias a distintos niveles del factor.
Los efectos aleatorios son factores cuyos niveles en una corrida particular de una valoracin se consideran representativos de
los niveles que pudieran estar presentes. Es decir, no se espera que ningn valor especfico del factor aleatorio tenga influencia
sobre la respuesta, si no que dicho valor pueda variar dependiendo de cierta distribucin de valores esperada y que, por consi-
guiente, pueda ser una fuente de variabilidad. Por ejemplo, no se desea predecir la respuesta de la valoracin para un da espe-
cfico, pero existe inters en predecir la variacin en la respuesta relacionada con el factor "da". Los ejemplos de los efectos
aleatorios incluyen el lote de reactivo, el operador o el da si no existe inters en lotes de reactivos, operadores o das especficos
como fuentes de variabilidad. Los analistas pueden estudiar los efectos aleatorios midiendo los componentes de varianza que
corresponden a cada efecto aleatorio. Los componentes de varianza slo se pueden estimar de manera adecuada si existe un
nmero apreciable de niveles de cada efecto aleatorio. Si, por ejemplo, se cuenta nicamente con dos o tres lotes de reactivo o
analistas presentes, la estimacin de la variacin asociada con dichos factores ser deficiente.
Realizar una seleccin correcta con respecto a la forma de tratar un factor como fijo o aleatorio es importante para el diseo
de la valoracin y para informar apropiadamente su precisin. Por ejemplo, tratar todos los factores como fijos conlleva a su-
bestimar la variabilidad de la valoracin, puesto que ignora todas las fuentes de variabilidad distintas a las determinaciones
repetidas. El objetivo es identificar las fuentes especficas de variabilidad que puedan ser controladas para incluir de manera
apropiada aquellos factores en el diseo y, posteriormente, incluir otros factores como aleatorios.
Si el factor puede cambiar de aleatorio a fijo o viceversa, el factor debe incluirse en el modelo generalmente como un efecto
aleatorio. Por ejemplo, cuando los lotes de reactivo no pueden ser controlados, por lo regular se considera que diferentes lotes
922 (1032) Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

ocasionan variabilidad, por lo que el lote de reactivo se considerara un efecto aleatorio. No obstante, si se ha detectado un
gran cambio en los valores de respuesta en un lote determinado, se puede llevar a cabo una comparacin entre un conjunto
de lotes usando un lote de reactivo como efecto fijo. De manera similar, la secuencia o ubicacin dentro de la valoracin (p.ej.,
bloque, placa, fila de la placa, columna de la placa o pocillo) se puede considerar como una fuente de variacin aleatoria o una
fuente de un efecto constante (fijo).
Los diseos de valoraciones que constan de mltiples factores son eficientes, pero requieren de las tcnicas estadsticas co-
rrespondientes que incorporen los factores en el anlisis como efectos fijos o aleatorios. Cuando todos los factores son fijos, el
modelo estadstico recibe el nombre de modelo de efectos fijos. Si todos son aleatorios, se le denomina modelo de efectos
aleatorios. Si algunos factores son fijos y otros son aleatorios, se trata de un modelo de efectos mixtos. Se debe tomar en cuen-
ta que los conceptos de efectos fijos y aleatorios aplican a modelos para respuestas cuantitativas, cualitativas e integrales. Para
diseos de valoracin que incluyan mltiples unidades experimentales (p.ej., muestras asignadas a conjuntos de tubos y con-
centraciones asignadas a tubos pre-placas), resulta particularmente efectivo un modelo de efectos mixtos en el que las unida-
des experimentales se tratan como efectos aleatorios. La presencia de diseos con efectos aleatorios cruzados {p.ej., cada ope-
rador us material de una o ms partidas de reactivo, pero muchas partidas de reactivos fueron empleadas por mltiples ope-
radores) agrega todava ms complejidad. Esto puede ocasionar desafos metodolgicos y de clculo adicionales para el ajuste
del modelo, en especial cuando los diseos estn desequilibrados.

5. ETAPAS DEL PROCESO DE DESARROLLO DE LA VALORACIN BIOLGICA

Dada la ubicuidad de las valoraciones basadas en clulas y la motivacin para emplear un sistema de valoracin biolgica
para ofrecer un contexto de discusin, el desarrollo de una valoracin biolgica basada en clulas se utilizar para ilustrar las
etapas del continuum del desarrollo de la valoracin biolgica.

5.1 Diseo: Distribucin de la Valoracin, Distribucin por Bloques y Aleatorizacin

La mayora de las valoraciones basadas en clulas se llevan a cabo usando una placa de cultivo celular (placa de microtitula-
cin de 6; 12; 96 384 pocillos). Idealmente, una placa puede proporcionar un sustrato uniforme para tratamientos experi-
mentales en todos los pocillos, incluyendo las etapas posteriores al lavado e incubacin. No obstante, independientemente de
las condiciones de la valoracin con las que se pretenda minimizar el potencial de sesgo (p.ej., buena tcnica del analista, cali-
bracin cuidadosa de pipetas, tiempo de incubacin controlado y temperatura), se pueden observar gradientes sistemticos en
la placa, independientes de los tratamientos experimentales. Estos gradientes pueden ocurrir a travs de filas, columnas o des-
de el borde hacia el centro de la placa, y a menudo se denominan efectos de placa. Incluso los efectos de placa moderados o
inconsistentes deben tratarse durante el desarrollo de la valoracin, mediante estrategias de distribucin de placa, distribucin
por bloques, aleatorizacin y determinaciones repetidas.
Los efectos de placa se pueden evaluar en un ensayo de uniformidad en el que se usa en todos los pocillos de la placa un solo
tratamiento experimental, como por ejemplo una concentracin de valoracin seleccionada a partir de la seccin media de la
curva de concentracin-respuesta. La Figura 1 ofrece un ejemplo de lo que puede llegar a observarse; una tendencia de la
seal a disminuir de derecha a izquierda es evidente. En este caso, se descubri que la lavadora de placas estaba lavando de
manera ms enrgica el lado izquierdo de la placa y fue necesario ajustarla para proveer una intensidad de lavado uniforme y
eliminar el gradiente. Otro efecto de placa comn es un patrn de crecimiento celular diferencial en el que los pocillos exter-
nos de la placa cultivan clulas de tal manera que se atena la seal de la valoracin. ste es un problema tan persistente que a
menudo se opta por no utilizar los pocillos externos de la placa de valoracin. Debido a que los efectos de ubicacin son muy
comunes, se deberan evitar los diseos que emplean determinaciones repetidas (p.ej., de muestra por combinaciones de con-
centracin) en pocillos adyacentes.
USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 923

Uniformidad

2000-2500
AFU 01500-2000
"1000-1500
ro0-1000
1).500

Figura 1. Grfica de cambio en la respuesta de la valoracin a travs de la placa.

La Distribucin por Bloques es el agrupamiento de unidades experimentales relacionadas en diseos experimentales. Los blo-
ques pueden consistir en placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas de 96 pocillos agrupa-
das por analista, por da o por partida de clulas. El objetivo es aislar cualquier efecto sistemtico de modo que no oscurezca
los efectos de inters. Un diseo completo en bloques ocurre cuando todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valo-
racin biolgica, los factores de tratamiento primario son la muestra y la concentracin) se aplican a unidades experimentales
para dicho factor dentro de un solo bloque. Un diseo incompleto en bloques ocurre cuando el nmero de niveles de un factor
de tratamiento excede el nmero de unidades experimentales para dicho factor dentro del bloque.
La Aleatorizacin es un proceso de asignacin de tratamiento a unidades experimentales basado en probabilidad de tal ma-
nera que todas las unidades experimentales tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado. Aunque re-
sulta complicada en la prctica, la aleatorizacin de tratamientos experimentales ha sido defendida como la mejor metodolo-
ga para minimizar el sesgo de la valoracin o, ms precisamente, para proteger los resultados de la valoracin de fuentes co-
nocidas y desconocidas de sesgo, convirtiendo el sesgo en varianza. Aunque la aleatorizacin de muestras y concentraciones
en pocillos individuales de placas puede no resultar prctico, la distribucin de la placa puede disearse para minimizar los
efectos de placa, alterando las posiciones de la muestra a travs de las placas y el patrn de diluciones dentro y a travs de las
placas. Cuando se requieren mltiples placas en una valoracin, el diseo de distribucin de la placa debe, por lo menos, alter-
nar posiciones de muestras a travs de las placas dentro de una corrida de valoracin para evitar un posible sesgo introducido
por los analistas o el equipo en un da determinado. Resulta prudente emplear una rotacin equilibrada de distribuciones en
las placas de modo que la recoleccin de determinaciones repetidas (cada una de las cuales utiliza una distribucin distinta)
proporcione algo de proteccin contra fuentes problables de sesgo.
La Figura 2 presenta un diseo de valoracin en patrones que carece de aleatorizacin y es susceptible al sesgo. Las dilucio-
nes y las determinaciones repetidas de las preparaciones de Prueba (A y B) y del Estndar (R) se colocan juntas de manera
secuencial en la placa. El sesgo debido a un efecto de placa o incubadora puede influenciar parte o la totalidad de las concen-
traciones de una de las muestras. Se debe tomar en cuenta que en las Figuras 2 a 5 los pocillos exteriores de la placa se dejan
como blancos para proteger contra el efecto del borde.
924 (1032) Valoraciones Biolgicas/ Informacin General USP 39

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
e
D
E
F
G

Figura 2. Placa con patrones muy marcados.

Una distribucin que ofrece algo de proteccin de los efectos de placa y que se puede realizar de forma manual es un diseo
de grfica en filas, que se presenta en la Figura 3. En dicha distribucin, las muestras se distribuyen aleatoriamente en filas de
una placa y se llevan a cabo series de diluciones en distintas direcciones en diferentes secciones (bloques) de la placa para
mitigar el sesgo a travs de las columnas de la placa. Una ventaja extra del diseo de grfica en tiras es su capacidad para
detectar efectos de ubicacin mediante la interaccin de la muestra y la direccin de la dilucin (de izquierda a derecha o
viceversa).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
e
D
E
F
G
H

Figura 3. Diseo de una grfica en tiras

La Figura 4 presenta una alternacin de las posiciones de la Prueba (muestra de Prueba 1 = 11 111 ; muestra de Prueba 2 = 11 2")
y del Estndar ( 11 R11 ) en mltiples placas, dentro de una sola corrida de valoracin; esto ofrece proteccin contra los efectos de
fila en la placa. Combinar los dos mtodos ilustrados en las Figuras 3 y 4 puede ayudar a convertir de manera efectiva el sesgo
de la placa en varianza de la valoracin. Posteriormente, se puede tratar la varianza de la valoracin, segn se requiera, me-
diante un nmero mayor de determinaciones repetidas de la valoracin (mayor nmero de placas en una valoracin).
USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 925

Fila de la Placa Placa 1 Placa 2 Placa 3

B R 2 1

e 1 R 2
o 2 1 R

E R 2 1
F 1 R 2
G 2 1 R

Figura 4. Valoracin de placas mltiples con posiciones de Prueba y Estndar variadas.

El diseo de grfica dividida, una alternativa que asigna muestras a las filas de las placas de manera aleatoria y que distribuye
aleatoriamente las diluciones (concentraciones) dentro de cada fila, se presenta en la Figura 5. Dicha estrategia puede ser difcil
de implementar, incluso con el uso de instrumentos robticos.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
e
D
E
F
G
H

Figura 5. Diseo de grfica dividida.

ESTRATEGIA DE DILUCIN

Las concentraciones de valoracin de una muestra de Prueba y del Estndar se pueden obtener de diversas maneras. Los
laboratorios a menudo llevan a cabo diluciones en serie, en las que cada dilucin se prepara a partir de una dilucin previa, en
sucesin. Como alternativa, el laboratorio puede preparar diluciones completamente independientes a partir de la muestra de
Prueba y del Estndar para obtener series de concentraciones independentes. Estas dos estrategias resultan en las mismas con-
centraciones nominales, pero tienen propiedades distintas con respecto al error. Las diluciones seriales estn sujetas a la propa-
gacin del error a travs de las series de diluciones y un error de dilucin cometido en una dilucin temprana tendr como
resultado observaciones correlacionadas no independientes. Las correlaciones tambin se pueden introducir empleando pipe-
tas multicanal. Las diluciones independientes ayudan a mitigar el sesgo que resulta de los errores de dilucin.
Es importante mencionar que cuando se trabaja para mejorar la precisin, las reducciones ms grandes de varianza se logran
mediante determinaciones repetidas en los niveles ms altos posibles de los efectos aleatorios anidados. Lo anterior resulta par-
ticularmente efectivo cuando dichos niveles altos son fuentes de variabilidad. Por ejemplo: llevar a cabo muchas determinacio-
nes repetidas en un da para una valoracin que se sabe presenta una gran variacin entre das no es una forma efectiva de
mejorar la precisin de los valores de informe.

5.2 Desarrollo

Una meta del desarrollo de la valoracin biolgica es obtener una exactitud relativa de la valoracin biolgica y una preci-
sin de la estimacin de potencia ptimas. Un punto final del desarrollo de la valoracin consiste en el desarrollo completo del
procedimiento de valoracin, un protocolo para la realizacin de la valoracin biolgica. El procedimiento debe incluir detalles
suficientes para que un laboratorio calificado con un analista capacitado pueda realizar el procedimiento de manera rutinaria.
Una parte estratgica del desarrollo es buscar que se mantenga el desempeo. Los procedimientos operativos estndar para
926 (1032) Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

calificacin de reactivos y de tcnicos, as como para la calibracin del Estndar de trabajo, ayudan a completar el paquete de
desarrollo de la valoracin biolgica.

LA METODOLOGA DE UN FACTOR A LA VEZ CONTRA EL DISEO DE EXPERIMENTOS

El desarrollo de la valoracin biolgica avanza a travs de una serie de experimentos en los que las condiciones y los niveles
de los factores de la valoracin se varan para identificar aqullos que sustentan una valoracin biolgica confiable y robusta,
calificada para el uso rutinario. Dichos experimentos se pueden llevar a cabo mediante la metodologa de un factor a la vez
(OFAT, por sus siglas en ingls), estudiando cada parmetro por separado para identificar condiciones ideales, o mediante el
uso de un diseo de experimentos de factores mltiples (DOE, por sus siglas en ingls). El diseo de experimentos de factores
mltiples es una estrategia eficiente y efectiva para desarrollar una valoracin biolgica y mejorar el desempeo de la misma,
ayudando de esta manera a obtener un sistema de medicin que cumple con los requisitos. En comparacin con la metodolo-
ga de un factor a la vez, el diseo de experimentos de factores mltiples por lo regular requiere una menor cantidad de expe-
rimentos y tambin ofrece una perspectiva sobre las interacciones de los factores que afectan el desempeo de la valoracin
biolgica. El desarrollo de la valoracin mediante un diseo de experimentos de factores mltiples puede proseguir a travs de
una serie de etapas: mapeo del proceso y anlisis de riesgos, examen, optimizacin de la respuesta y confirmacin.

MAPEO DEL PROCESO Y ANLISIS DE RIESGOS

La optimizacin de la valoracin biolgica puede comenzar con un examen sistemtico y una evaluacin de riesgos para
identificar aquellos factores que podran influenciar la respuesta de la valoracin biolgica. Resulta til visualizar factores de la
valoracin biolgica empleando un mapa del proceso de la misma, como por ejemplo, un diagrama de causa y efecto o de
espina de pescado. Mediante el uso del mapa de proceso como gua, el laboratorio puede examinar los factores que podran
afectar el desempeo de la valoracin, tales como pH de la solucin amortiguadora, temperatura de incubacin y tiempo de
incubacin. Histricamente, la experiencia con una o ms de las etapas de la valoracin biolgica, junto con un juicio cientfico
fundamentado, pueden identificar factores claves que requieran de evaluacin adicional. Una herramienta que se puede em-
plear para priorizar factores es un anlisis del modo y los efectos de la falla. Los factores generalmente se contabilizan combi-
nando su potencial para influenciar la respuesta de la valoracin y su probabilidad de ocurrir. El laboratorio debe prestar aten-
cin para reconocer interacciones potenciales entre los factores de la valoracin.

EXAMEN

Una vez que se han identificado los factores claves mediante el mapeo del proceso y el anlisis de riesgos, el laboratorio
puede llevar a cabo un experimento inicial para explorar los efectos para los que podra ser necesario aplicar controles. Los
diseos de examen como los de tipo factorial y factorial fracciona! se emplean comnmente con este propsito. Existe softwa-
re disponible para ayudar al practicante con la seleccin del diseo y el anlisis subsiguiente. No obstante, el analista debe
tener cuidado de comprender sus suposiciones sobre la seleccin del diseo y el anlisis para asegurar la identificacin exacta
de los factores experimentales.

OPTIMIZACIN DE LA RESPUESTA

Un diseo de examen, por lo general, podr detectar unos cuantos factores importantes de entre aqullos que se estudian.
Dichos factores se pueden estudiar an ms en un diseo de optimizacin de la respuesta. Los diseos de optimizacin de la
respuesta, tales como los diseos centrales compuestos, se llevan a cabo para determinar las configuraciones ptimas para las
combinaciones de factores de la valoracin biolgica, a fin de obtener la respuesta adecuada. La informacin obtenida a partir
de la optimizacin de la respuesta se puede representar como una superficie de respuesta y puede emplearse para establecer
intervalos que provean un desempeo aceptable de la valoracin y que se incorporarn en el procedimiento de la valoracin
biolgica.
En el lenguaje de Calidad por Diseo (QbD, por sus siglas en ingls), la "regin" en la que los niveles combinados de varia-
bles de ingreso y parmetros del proceso han demostrado proveer un desempeo aceptable de la valoracin se describe como
el espacio del diseo para la valoracin biolgica. Establecer un verdadero espacio del diseo para una valoracin biolgica re-
presenta un desafo; no todos los factores y niveles de factores aleatorios se incluirn en el Diseo de Experimentos de Factores
Mltiples del desarrollo, y no existe certeza de que el espacio del diseo no sea sensible a factores aleatorios no estudiados. De
manera similar, no se puede asegurar del todo que la valoracin (espacio de diseo) sea robusta para factores aleatorios que se
estudian usando muestras pequeas (o muestras de niveles no aleatorias). Los elementos del Diseo de Experimentos de Facto-
res Mltiples que se pueden considerar incluyen el uso de bloques; confusin deliberada entre interacciones que son de poco
inters o que no se consideran importantes; diseo robusto (diseos de superficie de respuesta con efectos aleatorios); y uso
de diseos de grfica dividida, grfica en tiras o lote dividido.
USP 39 Informacin General/ (1032) Valoraciones Biolgicas 927

CONFIRMACIN

El modelo matemtico que representa el desempeo de la valoracin como una funcin de cambios en los factores claves de
la valoracin es una aproximacin; por consiguiente, se acostumbra a confirmar el desempeo en las configuraciones ideales
de la valoracin biolgica. La confirmacin puede adquirir la forma de un ensayo de calificacin en el que se lleva a cabo la
valoracin, de preferencia en mltiples ocasiones independientes usando valores ptimos para factores. Alternativamente, el
laboratorio puede determinar que la valoracin fue adecuadamente desarrollada y que se puede proseguir con la validacin.
La calificacin es una buena prctica, no un requisito reglamentario. La decisin de llevar a cabo corridas de calificacin confir-
matorias o de proceder con la validacin depende de la fuerza de la informacin acumulada obtenida durante el desarrollo.

5.3 Anlisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoracin

El anlisis de los datos de la valoracin biolgica durante el desarrollo de la valoracin permite a los analistas tomar decisio-
nes en relacin con el modelo estadstico que se utilizar para el anlisis de rutina, incluyendo la transformacin y/o la ponde-
racin de datos, as como el desarrollo de criterios de aptitud del sistema y de la muestra. El anlisis tambin ofrece informa-
cin relacionada con los elementos de la estructura del diseo que deberan usarse durante la deteccin de valores aberrantes
y el ajuste de un modelo completo. Lo anterior puede incluir adems un plan para seleccionar subconjuntos de datos, como
por ejemplo una porcin lineal para anlisis, o para valoraciones biolgicas no lineales, una estrategia de reduccin del modelo
para muestras similares al Estndar. Una vez que estas decisiones han sido tomadas y que se muestras slidas durante la valida-
cin, no ser necesario volverlas a evaluar con cada desempeo de la valoracin. A continuacin se presenta una metodologa
de proceso para permitir la toma de dichas decisiones.
Paso 1: Seleccionar un modelo estadstico apropiado (ver tambin la seccin 4.6 Modelos Comunes de Valoracin Biolgica).
Debido a la complejidad de las valoraciones biolgicas y a la motivacin para emplear una metodologa que se considere
fidedigna, los modelos analticos adecuadamente estandarizados son comunes en el campo de los anlisis de valoraciones
biolgicas. No obstante, existen muchas consideraciones implcitas en la seleccin del modelo estadstico ms apropiado.
Primero, el modelo debe ser adecuado para el tipo de punto final de la valoracin-continuo, recuento o dicotmico.
Segundo, el modelo debe incorporar la estructura del diseo de valoracin. Para cualquier diseo distinto al completa-
mente aleatorizado, existirn trminos en el modelo para los elementos estructurales. Por ejemplo, la distribucin en blo-
ques dentro de las placas, la ubicacin de la jaula en la instalacin que alberga los animales, el da, entre otros. Una terce-
ra consideracin, aplicable a los puntos finales continuos, implica decidir si se usa un modelo de regresin o un modelo
de media (un anlisis del modelo de varianza que se ajusta a una media distinta en cada nivel de dilucin de cada muestra
analizada), con trminos de error apropiados. Un modelo de media puede ser apropiado en esta etapa debido a que no
realiza ninguna suposicin sobre la forma de la curva de concentracin-respuesta.
Paso 2: Ajustar el modelo estadstico seleccionado a los datos sin la suposicin de paralelismo y posteriormente evaluar la distri-
bucin de los residuos, examinndolos especficamente para detectar desviaciones de la normalidad y de la varianza constante.
Transformar los datos segn se requiera o, si fuera necesario, seleccionar un esquema de ponderacin (ver la seccin 4.3
Heterogeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin). Usar un cuerpo de datos de valoracin, a partir de valoracio-
nes independientes, tan grande como sea posible. El objetivo primario es tratar cualquier desviacin de la normalidad y
de la varianza constante de las respuestas en todo el intervalo de concentraciones en la valoracin. El paso 2 probable-
mente alternar entre imponer una transformacin y evaluar la distribucin de los residuos.
Paso 3: Examinar para detectar valores aberrantes y eliminarlos de manera apropiada.
Esta etapa, por lo regular, sigue a la seleccin inicial de una transformacin adecuada y/o mtodo de ponderacin. El mo-
delo usado para detectar valores aberrantes idealmente contiene los elementos importantes de la estructura del diseo de
la valoracin, permite curvas no similares y realiza menos suposiciones con respecto a la forma funcional de la curva de
concentracin-respuesta que el modelo usado para evaluar la similitud. Ver la Seccin 4.8. Valores Aberrantes y el captulo
general (101 O) para informacin sobre la deteccin y eliminacin de valores aberrantes. En algunos casos, los valores abe-
rrantes pueden ser tan severos que un modelo razonable podra no ajustarse, por lo que los residuos no estaran disponi-
bles. En tales casos, resulta necesario examinar los datos brutos para detectar valores aberrantes antes de intentar el ajuste
del modelo.
Durante el desarrollo de la valoracin, se debe desarrollar una estrategia para la investigacin y tratamiento de una obser-
vacin de valores aberrantes, incluyendo cualquier lmite sobre la cantidad aceptable de valores aberrantes. Estas instruc-
ciones deben incluirse en el Procedimiento Operativo Estndar de la valoracin. La buena prctica incluye registrar el pro-
ceso de una investigacin, las pruebas para valores aberrantes aplicadas y los resultados de las mismas. Se debe tomar en
cuenta que los procedimientos para valores aberrantes deben considerarse de manera independiente a la investigacin y
el tratamiento de un resultado fuera de la especificacin (OOS, por sus siglas en ingls) (valor de informe). Las decisiones
para eliminar un valor aberrante del anlisis de los datos no debe tomarse basndose en el efecto que sufrir el valor de
informe (p.ej., un resultado potencial fuera de la especificacin). La eliminacin de datos como valores aberrantes no de-
be practicarse con regularidad. Si se eliminan muchos valores como valores aberrantes de una corrida, dicha corrida se.
debe considerar sospechosa.
Paso 4: Reajustar el modelo con la transformacin y/o ponderacin previamente impuesta (Paso 2) sin las observaciones identi-
ficadas como valores aberrantes (Paso 3) y volver a evaluar la idoneidad del modelo.
928 (1032) Valoraciones Biolgicas / Informacin General USP 39

Paso 5: Cuando resulte necesario o deseable, seleccionar un esquema para identificar los subconjuntos de datos para su uso en
la estimacin de potencia, ya sea el modelo lineal o no lineal (ver la seccin 4.5 Linealidad de los Datos de Concentracin-
Respuesta).
Paso 6: Calcular una estimacin de potencia relativa analizando los datos de la Prueba y del Estndar al mismo tiempo median-
te un modelo que deber tener lneas o curvas paralelas o intersecciones idnticas.

5.4 Validacin de la Valoracin Biolgica

La validacin de la valoracin biolgica es un estudio basado en protocolos que demuestra que el procedimiento es adecua-
do para su uso. Se puede considerar una metodologa por etapas para la validacin, tal como en una validacin "adecuada
para el uso pretendido" para sustentar la liberacin de material de ensayo clnico, y una validacin final exhaustiva antes de
tramitar la Solicitud para Productos Biolgicos Teraputicos (BLA, por sus siglas en ingls) o la Solicitud para Autorizacin de
Comercializacin (MM, por sus siglas en ingls). Se deben establecer y describir de manera clara los controles de aptitud del
sistema preliminar y de la muestra en el procedimiento de la valoracin; dichos factores se pueden determinar basndose en la
experiencia adicional obtenida en el ejercicio de validacin. El captulo (1033) ofrece una discusin exhaustiva sobre la valida-
cin de valoraciones biolgicas.

5.5 Mantenimiento de Valoraciones Biolgicas

Aunque se trata de operaciones discretas, el desarrollo y la validacin de una valoracin biolgica llevan a la realizacin de
actividades continuas. Las mejoras de la valoracin se pueden implementar a medida que cambia la tecnologa, conforme el
laboratorio se vuelve ms versado con el procedimiento y los cambios a la metodologa de la valoracin biolgica requieran la
reevaluacin del desempeo de la misma. Algunos de estos cambios pueden ser respuestas a un desempeo inesperado du-
rante el procesamiento de rutina. Se deben monitorear las acciones correctivas usando procedimientos de control rutinario.
Los cambios importantes pueden requerir de un estudio para verificar que la valoracin biolgica sigue siendo adecuada para
su uso. Se puede emplear una metodologa de anlisis de equivalencia para demostrar que el cambio ha generado un desem-
peo adecuado. Asimismo, se puede llevar a cabo un estudio de orientacin estadstica para demostrar que el cambio no com-
promete las caractersticas de desempeo de la valoracin previamente aceptables.

TRANSFERENCIA DE LA VALORACIN

La transferencia de la valoracin supone un uso pretendido conocido de la valoracin biolgica en el laboratorio receptor y
la capacidad requerida asociada para el sistema de valoracin. Estos dos factores demarcan implcitamente, aunque quizs no
precisamente, los lmites relacionados con la cantidad de sesgo y la prdida de precisin permitida entre laboratorios. Para uti-
lizar dos laboratorios de manera intercambiable para sustentar un producto ser necesario tomar en cuenta la variacin entre
laboratorios, adems de la precisin intermedia para los requisitos de tamao de las muestras a fin de determinar la capacidad
del proceso. Para informacin y ejemplos relacionados con la interrelacin entre sesgo, capacidad del proceso y validacin, ver
Ejemplo de Validacin de Valoraciones Biolgicas en el captulo general (1033).

MEJORAMIENTO O ACTUALIZACIN DE UN SISTEMA DE VALORACIN BIOLGICA

Una nueva versin de una valoracin biolgica puede mejorar la calidad de sesgo, precisin, intervalo, robustez, especifici-
dad, disminuir los costos de operacin u ofrecer otras ventajas convincentes. Se puede utilizar un estudio puente al momento
de mejorar o actualizar una valoracin biolgica para comparar el desempeo de la nueva valoracin con la ya establecida.
Adems, se puede usar una variedad de muestras (p.ej., liberacin del lote, estabilidad, sometidas a estrs, isoformas crticas)
para demostrar la equivalencia de las potencias estimadas. Aunque los sistemas de valoracin pueden presentar algunas dife-
rencias (p.ej, una valoracin biolgica en animales frente a una valoracin biolgica basada en clulas), si las valoraciones em-
plean tanto el mismo Estndar como el mismo mecanismo de accin, existe una expectativa razonable de obtener potencias
comparables. Si la nueva valoracin emplea un Estndar diferente, el requisito mnimo para una comparacin aceptable es una
pendiente de uno en la relacin logartimica lineal entre las potencias estimadas. Un aspecto importante a considerar sobre
esta recomendacin es que cualquier precisin deficiente o valoracin con sesgo que se haya usado previamente podra tener
un impacto duradero sobre los requisitos de las determinaciones repetidas, incluso si la valoracin se reemplaza posteriormen-
te con una valoracin mejorada.
USP 39 Informacin General/ (1033) Validacin de Valoraciones Biolgicas 929

(1033) VALIDACIN DE VALORACIONES BIOLGICAS

1. INTRODUCCIN

Las Valoraciones Biolgicas forman una parte integral de la evaluacin de calidad requerida para la fabricacin y comercializa-
cin de muchos productos biolgicos y de algunos medicamentos no biolgicos. Las valoraciones biolgicas que comnmente
se utilizan para estimar la potencia de un frmaco se pueden distinguir de las pruebas qumicas por su dependencia de un
sustrato biolgico (p.ej., animales, clulas vivas o complejos funcionales de receptores diana). Debido a los mltiples factores
operativos y biolgicos que surgen de su fundamento biolgico, por lo general presentan una mayor variabilidad que las prue-
bas qumicas.
Las valoraciones biolgicas representan una de las diversas pruebas fisicoqumicas y biolgicas con procedimientos y criterios
de aceptacin que controlan los atributos crticos de calidad de un medicamento biolgico. Conforme a lo descrito en las
Guas de la ICH titulada Specifications: Test Procedures And Acceptance Criteria For Biotechnological/Biological Products
(Q6B), seccin 2.1 .2, las tcnicas de valoracin biolgica pueden medir la respuesta biolgica de un organismo al producto;
una respuesta bioqumica o fisiolgica a nivel celular; velocidades de reaccin enzimticas o respuestas biolgicas inducidas
mediante interacciones inmunolgicas; o unin de ligandos y receptores. A medida que surgen nuevos medicamentos biolgi-
cos y nuevas tecnologas, es probable que aumente el alcance de las metodologas de valoracin biolgica. Por lo tanto, el
presente captulo general, Validacin de Va/oraciones Biolgicas (1033) se centra en metodologas que ofrecen flexibilidad para
adoptar nuevos mtodos de valoracin biolgica, nuevos medicamentos biolgicos, o la combinacin de ambos para evaluar
la potencia del frmaco.
Las buenas prcticas de fabricacin requieren que los mtodos de prueba usados para evaluar el cumplimiento de los pro-
ductos farmacuticos con los requisitos de calidad cumplan con los estndares apropiados de exactitud y confiabilidad. La vali-
dacin de la valoracin es el proceso de demostrar y documentar que las caractersticas de desempeo del procedimiento y de
su mtodo de base cumplen con los requisitos para la aplicacin prevista y que la valoracin es, por lo tanto, adecuada para su
uso previsto. El captulo general de la USP Validacin de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y la gua ICH Q2(Rl) describen las
caractersticas (parmetros) de desempeo de la valoracin que se deben evaluar para procedimientos que sustenten produc-
tos farmacuticos de pequeas molculas. Aunque resulta fcil evaluar estos parmetros de validacin para muchos tipos de
medicamentos bien caracterizados por procesos qumicos, an no se ha delineado claramente su interpretacin y aplicabilidad
para algunos tipos de valoraciones biolgicas. Este captulo trata la validacin de valoraciones biolgicas desde el punto de
vista de la medicin de actividad, en lugar de mediciones de masa o fisicoqumicas, con el propsito de alinear las caractersti-
cas del desempeo de la valoracin biolgica con los usos en la prctica de las valoraciones biolgicas.
La evaluacin del desempeo de las valoraciones biolgicas es un proceso continuo, pero debe realizarse una vez completa-
do el desarrollo. La validacin de valoraciones biolgicas se gua por un protocolo de validacin que describe los objetivos y el
diseo del estudio de validacin. El captulo general (1033) ofrece objetivos de validacin relacionados con las valoraciones
biolgicas de la potencia relativa. Las valoraciones biolgicas de la potencia relativa se basan en una comparacin de las res-
puestas de la valoracin biolgica para una muestra de Prueba contra las de un Estndar designado y ofrecen una medida
cuantitativa de la actividad biolgica de la Prueba con respecto a la del Estndar.
Los parmetros de validacin discutidos incluyen exactitud relativa, especificidad, precisin intermedia e intervalo. Los laborato-
rios pueden usar la linealidad de las diluciones para verificar la exactitud relativa y el intervalo del mtodo. Aunque la robustez no
es un requisito de validacin, el presente captulo general (1033) recomienda evaluar la robustez de la valoracin biolgica
antes de la validacin. Asimismo, el captulo (1033) describe metodologas para el diseo de la validacin (seleccin de mues-
tras y estrategia para determinaciones repetidas), criterios de aceptacin de la validacin, anlisis e interpretacin de datos y,
finalmente, monitoreo del desempeo de la valoracin biolgica a travs del control de calidad. Adems, se analiza la docu-
mentacin de los resultados de la validacin de la valoracin biolgica, con respecto a los experimentos previos a la validacin
que se llevan a cabo para optimizar el desempeo de la valoracin biolgica. Para los objetivos del presente captulo general
(1033), el trmino "valoracin biolgica" deber interpretarse con el sentido de "valoracin biolgica de la potencia relativa".

2. FUNDAMENTOS DE LA VALIDACIN DE LA VALORACIN BIOLGICA

El objetivo de la validacin de la valoracin biolgica radica en confirmar que las caractersticas operativas del procedimiento
sean las adecuadas para el uso previsto del procedimiento. Las cuestiones implicadas en el desarrollo de una valoracin biol-
gica se describen con mayor detalle en el captulo general (1032) y se asume que han sido resueltas al momento en que la
valoracin biolgica entra en la etapa de validacin. Dichas decisiones debern incluir una identificacin de los componentes
de una valoracin y de una corrida para la valoracin biolgica. Las diluciones (concentraciones) mltiples del Estndar y de
una o ms muestras de Prueba constituyen un conjunto de determinaciones repetidas (tambin conocido como conjunto mni-
mo), que contiene un sustrato de prueba (p.ej., un grupo de animales o frascos de clulas) en cada dilucin para cada mues-
tra (Pruebas y Estndar). Una corrida se identifica como el trabajo realizado durante un periodo en el que existe una expectati-
va razonable de que la exactitud (certeza) y la precisin en el sistema de valoracin se mantengan estables. En la prctica, una
corrida con frecuencia consiste en el trabajo realizado por un solo analista en un laboratorio, con un conjunto de equipo, en
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un tiempo corto (tpicamente un da). Una valoracin es el conjunto de datos usados para evaluar la similitud y potencia esti-
mada para cada muestra de Prueba relativa a un Estndar. Una corrida puede contener mltiples valoraciones, una sola valora-
cin o parte de una valoracin. Se pueden combinar mltiples valoraciones para generar un valor de informe para una mues-
tra. El valor de informe es el valor que se compara con una especificacin de producto.
Para valoraciones que implican grupos en cada dilucin (p.ej., 6 muestras, cada una en 1O diluciones, en los pocillos no lo-
calizados en los bordes de cada una de las placas de cultivo celular de 96 pocillos usadas) los grupos {placas) constituyen
bloques estadsticos que deben ser elementos en la valoracin y en los anlisis de validacin (los bloques se analizan en el cap-
tulo (1032)). Las determinaciones repetidas dentro de los bloques para muestras de Prueba no son generalmente rentables.
Este captulo no proporciona un mayor anlisis sobre los bloques, pues ste se encuentra disponible en el captulo general
(1032).
Inicialmente, se asigna un valor de 1,0 100% a la cantidad de actividad (potencia) del Estndar, y la potencia de la mues-
tra de Prueba se calcula comparando las curvas de concentracin-respuesta para el par de la Prueba y el Estndar, cuyo resul-
tado es una medida sin unidad, que es la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la potencia del Estndar. En
algunos casos, se asigna un valor al Estndar correspondiente a otra propiedad, como por ejemplo, la concentracin de prote-
na. En dicho caso, la potencia de la muestra de Prueba es la potencia relativa multiplicada por el valor asignado del Estndar.
Una suposicin de las valoraciones biolgicas de lneas paralelas o de curvas paralelas (p.ej., logsticas de cuatro parmetros) es
que las curvas de dosis-respuesta generadas usando un Estndar y una Muestra de Prueba tienen una forma de curva similar
(paralela), que se diferencia nicamente por un cambio horizontal en la dosis logartmica. Para valoraciones biolgicas de co-
ciente de pendientes, las curvas generadas para las muestras Estndar y la Muestra deben ser lineales, pasar a travs de una
misma ordenada al origen y diferir nicamente en sus pendientes. La informacin sobre cmo evaluar el paralelismo se propor-
ciona en los captulos generales (1032) y (1034).
Para establecer la exactitud relativa y el intervalo de la valoracin biolgica, la validacin de las muestras de Prueba se puede
construir usando una serie de diluciones del Estndar para evaluar la linealidad de las diluciones (linealidad de la relacin entre
la potencia relativa conocida y la medida). Asimismo, el estudio de validacin debe generar una estimacin representativa de
la variabilidad de la determinacin de potencia relativa. Aunque los estudios de robustez por lo general se realizan durante el
desarrollo de la valoracin biolgica, se pueden incluir en la validacin factores claves de estos estudios, tales como el tiempo y
la temperatura de incubacin y, para valoraciones biolgicas basadas en clulas, el nmero de pasajes de clulas y el nmero
de clulas, en particular si interactan con otro factor que se introduzca durante la validacin (p.ej., un reactivo sensible a la
temperatura cuya sensibilidad vara entre lotes). Debido a la potencial influencia sobre la valoracin biolgica de factores como
mltiples analistas, instrumentos o procedencia de los reactivos, el diseo de la validacin de la valoracin biolgica debe con-
siderar dichos factores. La variabilidad de la potencia causada por estos elementos combinados define la precisin intermedia
{IP, por sus siglas en ingls) de la valoracin biolgica. Un estudio adecuado de la variabilidad de los valores de potencia obte-
nidos, incluyendo el impacto de factores intravaloracin y entre corridas, puede ayudar al laboratorio a confirmar una estrate-
gia de anlisis adecuada y a predecir la variabilidad inherente del valor de informe (que puede ser el promedio de mltiples
determinaciones de potencia). Las estimaciones de variabilidad tambin se pueden usar para establecer la magnitud de las di-
ferencias que se pueden distinguir entre muestras analizadas en la valoracin biolgica. (Ver la seccin 3.4 Uso de los Resultados
de la Validacin para la Caracterizacin de Valoraciones Biolgicas.)
Para demostrar la especificidad (tambin conocida como selectividad) se requiere evidencia sobre la falta de influencia de los
componentes de la matriz tales como componentes del proceso de fabricacin o productos de degradacin, de modo que las
mediciones cuantifiquen nicamente la molcula diana. Otros mtodos analticos pueden complementar una valoracin biol-
gica mediante la medicin o identificacin de otros componentes en una mezcla .

. 2.1 Protocolo de Validacin para Valoraciones Biolgicas

Un protocolo de validacin para valoraciones biolgicas debe incluir el nmero y los tipos de muestras que se estudiarn en
la validacin; el diseo del estudio, incluyendo los factores entre corridas e intracorridas; la estrategia para determinaciones
repetidas; los parmetros de validacin predeterminados y los criterios de aceptacin diana justificados para cada parmetro; y
el plan propuesto para el anlisis de los datos. Se debe tomar en cuenta que, con respecto al cumplimiento de los criterios de
aceptacin, el no encontrar un efecto importante desde el punto de vista estadstico no representa una base adecuada para
definir un desempeo aceptable en una valoracin biolgica; el cumplimiento con los criterios de aceptacin se puede evaluar
de mejor manera usando una metodologa de equivalencia.
Asimismo, se deben especificar los criterios de aceptacin para la valoracin, corrida y muestra, tales como la aptitud del
sistema y la similitud, antes de realizar la validacin. Dependiendo del grado de desarrollo de la valoracin biolgica, los crite-
rios se pueden proponer como tentativos y se pueden actualizar con los datos de la validacin. Los incumplimientos de la valo-
racin, de la corrida o de las muestras se pueden reevaluar de acuerdo con criterios definidos en el protocolo de la validacin
y, con justificacin slida, incluirse en la evaluacin general de la validacin. Pueden ser necesarios ensayos de validacin adi-
cionales para sustentar cambios en el mtodo.
El protocolo de validacin de la valoracin biolgica debe incluir criterios de aceptacin diana para los parmetros de valida-
cin propuestos. Los pasos a tomar cuando no se cumpla un criterio de aceptacin diana se deben especificar en el protocolo
de validacin y pueden resultar en un lmite en el intervalo de potencias que se puede medir en la valoracin biolgica o en
una modificacin de la estrategia de determinaciones repetidas en el procedimiento de la valoracin biolgica.
USP 39 Informacin General/ (1033) Validacin de Valoraciones Biolgicas 931

2.2 Documentacin de los Resultados de la Validacin de la Valoracin Biolgica

Los resultados de la validacin de la valoracin biolgica deben documentarse en un informe de validacin. El informe de
validacin debe sustentar la conclusin que indica que el mtodo es adecuado para su uso o debe indicar una accin correcti-
va (tal como un incremento en la estrategia de determinaciones repetidas) que se llevar a cabo para generar resultados lo
suficientemente confiables como para conseguir que sea apto para uso. El informe debe incluir los datos brutos y los resultados
intermedios (p.ej., se deben proveer las estimaciones de los componentes de la varianza adems de la precisin intermedia
general) que facilitaran la reproduccin del anlisis de validacin de la valoracin biolgica por parte de un revisor indepen-
diente. Las estimaciones de los parmetros de validacin se deben informar para cada nivel y a nivel general, segn correspon-
da. Las desviaciones del protocolo de validacin deben documentarse con su respectiva justificacin. Las conclusiones obteni-
das del estudio se deben describir claramente con referencias a las acciones de seguimiento, segn sea necesario. Las acciones
de seguimiento pueden incluir enmiendas en el sistema o en los criterios de aptitud del sistema o modificaciones a la estrategia
de determinaciones repetidas de la valoracin biolgica. Se pueden incluir referencias a exp