Sei sulla pagina 1di 9

Universitas Scientiarum

ISSN: 0122-7483
revistascientificasjaveriana@gmail.com
Pontificia Universidad Javeriana
Colombia

Navarro-Hernndez, J.; Perea-Triana, A.P.; Pineda-Mndez, J.A.; Dez-Arbelez, O.; Mercado-Reyes,


M.; Trespalacios-Rangel, A.A.
EVALUACIN DE LA PRODUCTIVIDAD DE TRES MEDIOS DE CULTIVO PARA LA
RECUPERACIN DE Helicobacter pylori
Universitas Scientiarum, vol. 12, nm. III, julio-diciembre, 2007, pp. 79-86
Pontificia Universidad Javeriana
Bogot, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=49912308

Cmo citar el artculo


Nmero completo
Sistema de Informacin Cientfica
Ms informacin del artculo Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal
Pgina de la revista en redalyc.org Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
Julio-diciembre
UNIVERSITAS 2007
SCIENTIARUM
Revista de la Facultad de Ciencias
Vol. 12, edicin especial III, 79-86

EVALUACIN DE LA PRODUCTIVIDAD DE TRES MEDIOS


DE CULTIVO PARA LA RECUPERACIN DE Helicobacter
pylori
EVALUATION OF PRODUCTIVITY OF THREE CULTURE
MEANS FOR RECOVERY OF Helicobacter pylori
J. Navarro-Hernndez, A.P. Perea-Triana, J.A. Pineda-Mndez, O. Dez-Arbelez, M.
Mercado-Reyes, A.A. Trespalacios-Rangel
Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana.
Carrera 7 # 43-82, Bogot, Colombia
alba.trespalacios@javeriana.edu.co

Resumen
La infeccin por Helicobacter pylori desde su descubrimiento por los mdicos australianos Barry Marshall
y Robin Warren en 1982, ha sido uno de los fenmenos cientficos de mayor importancia en la literatura
biomdica mundial, ya que juega un papel significativo en la etiologa y patognesis de diversas enferme-
dades gastrointestinales como gastritis crnica y ulcera pptica, adems de ser un factor de riesgo impor-
tante para el desarrollo de cncer gstrico. El mtodo ms especfico de diagnstico de este microorganismo
es sin duda el cultivo. No obstante su sensibilidad vara notablemente en relacin con diferentes variables:
la coleccin, transporte, almacenamiento de la muestra; medios de cultivo utilizados y las condiciones de
incubacin. En este trabajo se evalu la productividad de tres medios de cultivo para recuperar H. pylori,
utilizando el mtodo ecomtrico. Los medios mostraron una baja productividad. Los valores de ICA
fueron menores a 2,5, para cada uno de los medios de cultivo. La proporcin de medios con ICA mediana
y bajamente productivos fueron respectivamente los siguientes: Agar ATS: 7,6% y 92,3%, Agar BHI: 0%
y 100%, Agar Brucella: 6,6% y 93,3%.
Palabras clave: Helicobacter pylori, medios de cultivo, mtodo ecometrico, productividad

Abstract
Infection of Helicobacter pylori since its discovery by Australian doctors Barry Marshall and Robin
Warren in 1982 has been one of the scientific phenomena of greater importance in world-wide biomedical
literature. Since then, numerous investigations have been developed to study this bacterium because it
plays a significant role in etiology and pathogenesis of diverse gastrointestinal diseases like chronic
gastritis and peptic ulcer, in addition to being a factor of important risk for development of gastric cancer.
Cultivation is the most specific method to diagnose this microorganism. Despite its sensibility it varies
notably in relation to different variables: collection, transport and storage of samples; cultivation media
and incubation conditions. This work evaluated the productivity of three culture media for H. pylori
recovery by ecometric method. All culture media showed low productivity. ICA values were lower than
2,5 on all cultivation media. Culture media with ICA values of low and mid production were: Agar ATS:
7,6% and 92,3%, Agar BHI: 0% and 100%, Agar Brucella: 6,6% and 93,3%.
Key words: Helicobacter pylori, culture media, ecometric method, productivity.

79
Universitas Scientiarum, Vol 12, edicin especial III, 79-86

Introduccin mer lugar la cantidad utilizada, ya que un


aumento en la proporcin del 7-10% mejo-
Helicobacter pylori (H. pylori), es un baci- ra significativamente el crecimiento en
lo Gram negativo de forma espiral, mide de comparacin al 5%. En segundo lugar el
2.5 a 5 micras, con 4 a 8 flagelos unipolares tipo de sangre utilizada, encontrndose un
lo que lo hace altamente mvil. Desarrolla crecimiento ms denso con sangre de caba-
colonias pequeas, grises, como gotas de llo al 10% y lisada al 7% (Alarcn et al.,
roco (Tummala et al., 2007). Su caracters- 2004). Los antibiticos adicionados a los
tica bioqumica ms sobresaliente es la medios de cultivo son: vancomicina,
abundante produccin de la enzima ureasa, trimetropim sulfa, polimixina y anfoterici-
que cataliza la hidrlisis de la urea en na B (Kusters et al., 2006).
amonio y bixido de carbono; la produc-
cin de amonio es un mecanismo impor- Para la recuperacin de la bacteria pueden
tante para la supervivencia de la bacteria utilizarse medios no selectivos y medios
en un ambiente con pH tan cido, como lo selectivos, dentro de los medios no selecti-
es el jugo gstrico (Rojas et al., 2004). La vos se encuentran: Agar Columbia con
resistencia para sobrevivir a estas condi- 10% de sangre caballo o cordero, Agar cho-
ciones extremas es un requisito previo para colate con 1% de Isovitalex, Agar Colum-
la supervivencia de esta bacteria en el est- bia con 10% de yema de huevo, 1%
mago (Hofman et al., 2004). Isovitalex y 0,04% de cloruro de trifenil
tetrazolium; Agar infusin cerebro y cora-
Para su desarrollo en medios de cultivo, H. zn con 10% de suero fetal bovino, 1% de
pylori requiere de medios complejos ya sea extracto de levadura y 0,04% de cloruro de
slidos o lquidos con suplementos como: trifenil tetrazolio. Dentro de los medios se-
sangre de caballo, hemoglobina, suero fe- lectivos se encuentran: Agar de Wilkins-
tal bovino, carbn vegetal o emulsin de Chalgren con 10% de sangre (caballo o
yema, adems de nutrientes como peptona, cordero) suplementado con antibitico,
triptona, extracto de levadura, glucosa, clo- Agar Columbia con 10% de sangre (caba-
ruro de sodio y bisulfito de sodio. Para una llo o cordero) suplementado con antibiti-
buena recuperacin del microorganismo se co y Agar Pylori, el cual contiene suero de
adicionan antibiticos que minimizan la caballo, extracto de levadura y suplemen-
colonizacin de otras bacterias. Este mi- tado con antibitico, diseado para aisla-
croorganismo es de crecimiento lento, re- miento primario de H. pylori (Alarcn et
quiere de una temperatura de 35C a 37C al., 2004). La identificacin final del mi-
en condiciones de microaerobiosis (5-10% croorganismo se hace a travs de la morfo-
de O2, 5-10% de CO2 y 80-90% de N2), una loga de la colonia, tincin de Gram y
humedad del 95%, un pH de 5,5 - 8,0 y un caractersticas bioqumicas, en donde la
periodo de incubacin de 3 a 10 das. (Bruce prueba de la catalasa, oxidasa y ureasa son
et al., 1997). Dentro de los medios de culti- positivas.
vos slidos ms utilizados se encuentran el
Agar Mueller Hinton y el Agar Columbia, Teniendo presente que en Colombia el diag-
suplementados con sangre o sus derivados. nstico de la infeccin por H. pylori se rea-
Otros suplementos y nutrientes usados son liza en biopsias tomadas por endoscopia,
el suero de caballo, lisado de eritrocitos, el cultivo slo se recomienda para estudios
hemina, extracto de levadura, peptona e de susceptibilidad a los antimicrobianos,
isovitalex. Dos aspectos importantes a con- de manera rutinaria se recomienda utilizar
siderar en relacin con la sangre es en pri- medios de cultivo selectivos para recupe-

80
Julio-diciembre 2007

rar la bacteria a partir de las biopsias y el inoculado en agar chocolate en ambiente


uso de medios no selectivos para el mante- microaeroflico e incubado a 37C por 48
nimiento de las cepas recuperadas y para la horas. La verificacin de la cepa se realiz
realizacin de antibiogramas (McNulty et con el sistema RapIDTM NH (Neisseriaceae,
al., 2002). En este estudio se evalu la pro- Haemophilus) System REMEL (ref.
ductividad de tres medios de cultivo: Agar 8311001).
Tripticasa Soya, Agar BHI y Agar Brucella,
adicionndoles sangre de cordero al 5%, Recuperacin de E. coli CMDM PUJ
para seleccionar el medio o los medios que 076
recuperen con mejor eficiencia aislamien-
tos de H.pylori y que puedan ser utilizados Un criovial con 2 ml de suspensin bacte-
para pruebas de susceptibilidad y manteni- riana a -70C, fue descongelado a 37C
miento de las cepas. durante 5 minutos incubadora y luego ino-
culado en agar tripticasa soya e incubado a
MATERIALES Y MTODOS 37C, en ambiente aerbico por 18 horas.
La verificacin de la cepa se realiz con el
Cepas bacterianas sistema RapID ONE System (For the
identification of Enterobacteriaceae)
Las cepas bacterianas que se utilizaron en REMEL (ref. 8311006).
este estudio fueron H. pylori NCTC 11637,
H. influenzae ATCC 33930 y E. coli CMDM Mtodo ecomtrico
PUJ 076, estas dos ltimas se usaron como
controles interferente y referente respecti- Para evaluar la productividad de los me-
vamente. dios de cultivo se utiliz la tcnica cuanti-
tativa de siembra por estra, denominada
Recuperacin de la cepa H. pylori mtodo ecomtrico (Mossel et al., 1983).
NCTC 11637 Para ello, luego de confirmar la pureza de
las cepas, se procedi a hacer un inculo
Un criovial con 2 ml de suspensin bacte- en caldo Brucella ajustndolo al patrn n
riana a -70C, fue descongelado a 37C 3 de la escala de Mac-Farland con cada una
durante 5 minutos en incubadora y luego de las cepas a utilizar: H. pylori NCTC
inoculado en su totalidad en medio selec- 11637 (microorganismo prueba), H.
tivo Agar Wilkins-Chalgren-Brucella. La influenzae ATCC 33930 (microorganismo
incubacin se realiz por 3 das a 37C, en interferente) y E. coli CMDM PUJ 076
campana de microaerofilia (Gas Pak EZ: (microorganismo referente). Para H. pylori
ref. 260680). Luego del periodo de incu- se sembraron en 15 cajas de petri con Agar
bacin el crecimiento en medio de culti- Brucella, Agar BHI y Agar Tripticasa Soya,
vo fue confirmado por observacin de todos suplementados con 5% de sangre de
colonias pequeas, translucidas o grises, cordero. Para los microorganismos referen-
Gram negativas y pruebas de catalasa, te e interferente se sembraron 10 cajas de
oxidasa y ureasa positivas. petri con los tres medios en estudio. Cada
medio de cultivo fue sembrado con 10 l
Recuperacin de H. influenzae ATCC de suspensin bacteriana con asa calibrada
33930 desechable. Los medios de cultivo sembra-
dos con H. pylori se incubaron por 3 das a
Un criovial con 2 ml de suspensin bacte- 37C en microaeroflia (Gas Pak EZ: ref.
riana a -70C, fue descongelado a 37C 260680), los medios de cultivo sembrados
durante 5 minutos en incubadora y luego con H. influenzae se incubaron por 48 ho-

81
Universitas Scientiarum, Vol 12, edicin especial III, 79-86

ras en microaerofilia a 37C y los medios medianamente productivos (ICA entre 2,5-
sembrados con E. coli se incubaron por 18 4,0) y altamente productivos (ICA mayor
horas en aerobiosis a 37C. Para verificar la a 4,0).
viabilidad de H. pylori tres cajas con agar
selectivo Wilkins-Chalgren- Brucella, fue- Diseo de la investigacin
ron inoculadas e incubadas bajo las mis-
mas condiciones de microaeroflia y Este fue un estudio de tipo observacional
temperatura descritas anteriormente, la via- descriptivo. Para el anlisis de los datos ob-
bilidad de las cepas de H. influenzae ATCC tenidos, se utiliz una estadstica descripti-
33930 se realiz en tres cajas de agar cho- va para variables categricas y se realiz un
colate en condiciones de microaerofilia y anlisis de proporciones para los resultados
para E. coli CMDM PUJ 076, se sembra- con alta y mediana productividad.
ron tres cajas de agar tripticasa soya.
Hiptesis
Sistema de anlisis
La proporcin de medios de cultivo con
resultados altos y medianamente producti-
Despus de la incubacin se observ el cre-
vos es mayor al 90%.
cimiento en cada una de los medios estudia-
dos, en donde se consider valida cualquier
estra que tuviera ms del 25% de crecimien- RESULTADOS
to (Mossel et al., 1983). Para evaluar la pro- Recuperacin y viabilidad de la cepa
ductividad de los medios de cultivo se
calculo el ndice de crecimiento absoluto Se confirm la pureza de la cepa de H. pylori
(ICA); ste se obtuvo de la sumatoria de cada NCTC 11637, la cual mostr a la colora-
una de las 20 lneas de los 4 cuadrantes (cada cin de Gram bacilos curvos Gram negati-
lnea posee un valor de 0,2), ms la lnea vos. Las pruebas de oxidasa, ureasa y
central con un valor de 1. Los medios se catalasa fueron positivas. Los paneles de
clasificaron de acuerdo a su capacidad de REMEL para identificacin bioqumica de
recuperacin del microorganismos en: E. coli y H. influenzae confirmaron la pure-
bajamente productivos (ICA menor a 2,5), za de estas dos cepas. H. pylori, creci al

Tabla 1
Recuperacin del microorganismo interferente (H. influenzae ATCC 33930) en los
medios en estudio

82
Julio-diciembre 2007

Tabla 2
Recuperacin del microorganismo referente (E. coli CMDM PUJ 076) en los
medios en estudio

Tabla 3
Recuperacin del microorganismo prueba (H. pylori NCTC 11637) en los medios
en estudio

tercer da en todos los medios con Wilkins- ninguno de los tres medios en estudio lue-
Chalgren- Brucella verificando la viabili- go de 48 horas de incubacin, con un ICA
dad de la cepa. promedio de 0 (tabla 1). E. coli creci en
los tres medios en estudio con valores de
Anlisis ecomtrico ICA altamente productivos (tabla 2).

Los microorganismos referente e interferen- La recuperacin del microorganismo prue-


te funcionaron adecuadamente observn- ba H. pylori fue baja en los tres medios
dose que H. influenzae, no creci en de cultivo en estudio y se correlacion con

83
Universitas Scientiarum, Vol 12, edicin especial III, 79-86

Tabla 4
Proporcin de medios con productividad alta, media y baja para Helicobacter pylori

valores de ICA por debajo de 2,5, mostran- nutrientes como isovitalex para garantizar
do una baja productividad de estos medios una mejor recuperacin de esta bacteria
para este microorganismo (tabla 3). (Hachem et al., 1995). Por ello es recomen-
dable medir la productividad de medios a
Evaluacin de la productividad en los los que se les adicione suero, sangre de cor-
tres medios dero o de caballo, yema de huevo o
ciclodextrinas, determinando adems, el
La capacidad de recuperacin de los tres
efecto de diferentes concentraciones de es-
medios para H. pylori NCTC 11637 fue baja
tos suplementos (Hachem et al., 1995). Es-
y se correlaciona con un ICA por debajo de
tudios hechos por Yuen y colaboradores en
2,5. Estos resultados indican que ninguno
2005, demostraron que los medios selecti-
de los medios de cultivo pueden ser reco-
vos contienen suplementos que favorecen
mendados para la recuperacin de H. pylori
el crecimiento de H. pylori, conllevando a
(tabla 4).
altas tasas de recuperacin.
DISCUSIN
El medio usado en la fase inicial para la re-
Hasta el momento no se haban hecho estu- cuperacin de H. pylori, Wilkins-Chalgren
dios en nuestro pas que evaluaran la pro- Brucella, es un medio diseado para la
ductividad de los medios de cultivo usados recuperacin de H. pylori a partir de
para la recuperacin de H. pylori. Por ello biopsias gstricas y no puede ser utilizado
en este trabajo se evalu la productividad en ensayos de susceptibilidad a los anti-
de tres medios de cultivo no selectivos biticos; por tanto este medio selectivo no
como Agar Tripticasa Soya, Agar BHI, Agar puede ser comparado con los medios no
Brucella suplementados con sangre de cor- selectivos descritos en la literatura y con
dero al 5%. Se encontr que los medios de los evaluados en este estudio (McNulty et
cultivo utilizados en este trabajo, no tie- al., 2002).
nen buena capacidad para recuperar H.
pylori. Por tanto se debe rechazar el uso de De los tres medios de cultivo estudiados, el
stos para la recuperacin de este microor- Agar BHI con sangre de cordero al 5% fue
ganismo. el de menor productividad con una propor-
cin de 0%. Llama la atencin un estudio
Lo anterior puede deberse a que la canti- realizado por Hachem y colaboradores
dad de sangre adicionada no es suficiente (1995), en donde se demuestra que el Agar
para obtener un buen crecimiento de la bac- BHI recin preparado con sangre de caba-
teria, lo cual hace pensar que sera mejor llo al 7%, demostr ser el mejor y el ms
utilizar medios con concentraciones supe- sensible para el aislamiento primario de H.
riores de sangre ms la adicin de otros pylori de biopsias congeladas de la muco-

84
Julio-diciembre 2007

sa gstrica, recuperndose la bacteria a par- BIBLIOGRAFA


tir de 474 muestras histolgicas (93%) de
un total de 508 muestras. Esta diferencia ALARCN, T., BAQUERO, M., DOMINGO,
en los resultados puede deberse al mayor D., LPEZ, M y ROYO, G. Proced-
porcentaje de sangre utilizada en dicho es- imientos en microbiologa clnica.
tudio. Diagnostico microbiolgico de la
infeccin por Helicobacter pylori, 1a
En cuanto a los medios de cultivo ATS y edicin, Sociedad Espaola de Enfer-
Brucella, la bacteria mostr un mejor medades Infecciosas y Microbiologa
comportamiento que en el medio de culti- Clnica, Madrid, Espaa. 2004, 27.
vo BHI pero igualmente siguen teniendo ANSORG, R., VON RECKLINGHAUSEN,
una baja productividad para recuperar ce- G., POMARIUS, R y SCHMID, N.
pas de H. pylori NCTC 11637, mostrando Evaluation of Techniques for Isolation,
similitud con un estudio en el que H. pylori Subcultivation, and Preservation of
no crece en Agar Tripticasa Soya o Agar Helicobacter pylori. Journal of Clini-
Brucella sin suplementos (Buck y Smith, cal Microbiology, 1991, Jan, 51-3.
1987). En otro estudio Boyanova y cola-
boradores (2003), demostraron que de 102 BOYANOVA, L., KOUMANOVA, R.,
aislamientos de biopsias gstricas, se aisl LAZAROVA, E y JELEV, C. Helico-
la bacteria en medios selectivos en el 31,4% bacter pylori and Helicobacter
y en medios no selectivos en 14,7% de los heilmannii in children. A Bulgarian
casos (Wee et al., 1991; Ansorg et al., 1991). study. Diagnostic Microbiology Dis-
ease, 2003, Aug, 46(4), 249-52.
CONCLUSIONES
BRUCE, E., DUNN, N., HARTLEY, C y
Los medios de cultivo Agar Brucella, Agar BLASER, M.J. Helicobacter pylori.
BHI y Agar Tripticasa Soya suplementados Clinical Microbiology Reviews, 1997,
con 5% de sangre de cordero no cumplen 10(4), 72074.
con los requerimientos mnimos para la re-
cuperacin de cepas puras de H. pylori BUCK, G.E y SMITH, J.S. Medium
NCTC 11637. supplementation for growth of
Campylobacter pyloridis. Journal of
Los tres medios de cultivo usados tuvieron Clinical Microbiology, 1987, Apr; 25
ICA por debajo de 2,5; su productividad (4), 597-9.
fue baja y por consiguiente a la recupera- HACHEM, C.Y., CLARRIDGE, J.E.,
cin del microorganismo escasa. EVANS, D.G y GRAHAM, D.Y. Com-
parison of agar based media for pri-
RECOMENDACIONES mary isolation of Helicobacter pylori.
Journal Clinical Pathology, 1995, 48,
Se recomienda evaluar la utilizacin de
714-6.
medios de cultivo Agar BHI, Agar Tripticasa
Soya y Agar Brucella, adicionndoles su- HOFMAN, P., WAIDNER, B., HOFMAN, V.,
plementos con Isovitalex, suero fetal bovi- BERESWILL, S., BREST, P y KIST,
no, carbn activado, sangre de caballo entre M. Pathogenesis of Helicobacter py-
7-10%, para garantizar una mejor recupe- lori infection. Helicobacter, 2004,
racin de H. pylori. 9(1), 15-22.

85
Universitas Scientiarum, Vol 12, edicin especial III, 79-86

KUSTERS, G.J., VAN VLIET, H.M., MURPHY, C.K., OSBURNE, M.S.,


ARNOUD, A., KUIPERS, J y ERNST, J. MULLIN, S., BUXTON, D., WAGNER,
Pathogenesis of Helicobacter pylori DA, y KELLY, C.P. Quantifying Gas-
infection. Clinical Microbiology, tric Helicobacter pylori infection: A
2006, July, 449-90. comparison of Quantitative Culture,
Urease Breath Testing and Histology.
MCNULTY, C., OWEN, R., TOMPKINS, D., Digestive Diseases and Sciences,
HAWTIN, P., MCCOLL, K., PRICE, A., 2007, 52, 396-401.
SMITH, G y TEARE, L. Helicobacter
pylori susceptibility testing by disc dif- WEE, T., STEPHEN, F., RICHARD, S. y
fusion. Journal Antimicrobial Chemo- BRIAN, D. Comparative Evaluation of
therapy, 2002, April, 49 (4), 6001-9. Three Selective Media and a Nonse-
lective Medium for the Culture of Heli-
MOSSEL, D.A., BONANTS-VAN, L.,
cobacter pylori from Gastric Biopsies.
LIGTENBERG, M y WERDLER, M.E.
Journal of Clinical Microbiology,
Quality assurance of selective culture
1991, Nov, 2587-9.
media for bacteria, moulds and yeasts:
an attempt at standardization at the
YUEN, B., ZBINDEN, R., FRIED, M.,
international level. Journal Applied
BAUERFEIND, P. y BERNARDI, M.
Bacteriology, 1983, 54(3), 313-27.
Cultural recovery and determination
ROJAS, G., CASTILLO, A., MAZAR- of antimicrobial susceptibility in Heli-
HIRIART, M, y LPEZ-VIDAL, Y. Heli- cobacter pylori by using commercial
cobacter pylori: Focus on CagA and transport and isolation media. Infec-
VacA major virulence factors. Salud tion, 2005, 33(2), 77-81.
Pblica Mxico, 2004, 46, 538-48.
Recibido: 22-02-2007
TUMMALA, S., SHETH, S.G., GOLD-
Aprobado: 30-08-2007
SMITH, J.D., GOLDAR-NAJAFI, A.,

86