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2. FUNDAMENTO TEORICO:
TCNICA DE FERMENTACIN EN TUBO MLTIPLE PARA MIEMBROS
DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES
Los coliformes estn conformados por varios gneros bacterianos de la familia
Enterobacteriaceae y la definicin clsica de este grupo est basada en la
fermentacin de la lactosa. Cuando se usa la tcnica de fermentacin de tubos
mltiples, el grupo coliforme se define como: bacterias Gram negativas,
anaerobias facultativas, no esporuladas, en forma de bastn, fermentadoras de
la lactosa con produccin de gas y cido en 48 horas a una temperatura de
35C. Los coliformes fecales, adems, fermentan la lactosa con produccin de
cido y gas a 44.5C.
En la tcnica de fermentacin por tubos mltiples, los resultados se expresan
en trminos de Nmero Ms Probable (NMP) en 100 mL. Este nmero est
basado en ciertas frmulas de probabilidad y es un estimado de la densidad
media de coliformes en la muestra.
La precisin de cada prueba es funcin de:
El nmero de diluciones realizadas que depende de la experiencia del
analista y la procedencia de la muestra; es inversamente proporcional.
Presencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con mayor
inculo, directamente proporcional.
Ausencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con menor
inculo, inversamente proporcional.
La tcnica tiene 3 fases: presuntiva, confirmativa y completa. En la fase
presuntiva se utiliza el caldo lauril triptosa y la fase confirmativa para
coliformes totales utiliza el caldo verde bilis brillante y para coliformes fecales
el caldo EC. La fase completa se realiza para llevar un control de calidad y
permite establecer o no la presencia de coliformes.
DETERMINACIN DEL N.M.P.
El mtodo del Nmero ms probable (NMP), tambin conocido como el mtodo
de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en
concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia
positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de
poblacin que se emplea cuando una evaluacin cuantitativa de elementos
individuales no es factible.
El mtodo se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo)
de atributos especficos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones
consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el
principio de que una nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo
turbio. El mtodo requiere la realizacin de una serie de diluciones en serie de
la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de
dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las
muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos
tubos que recibieron una o ms clulas microbianas procedentes de la
muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna
clula permanecern transparentes.
Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos
contendrn tan slo un microorganismo y otros tubos no contendrn ninguno.
Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna clula,
se puede estimar el nmero ms probable de microorganismos presentes en la
muestra original, a partir de una tabla estadstica.
La precisin del mtodo del nmero ms probable aumenta con el nmero de
tubos que se usan; cinco tubos por dilucin se consideran como una relacin
adecuada entre precisin y economa.
Una condicin del mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo
especfico de la poblacin en el medio de crecimiento que se emplee. La
estimacin de la densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de
ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el empleo del clculo
probabilstico.
Hay muchas entidades discretas que son fciles de detectar pero difciles de
contar. Una aplicacin es el de cualquier clase de reaccin de amplificacin o
reaccin de catlisis que impide una cuantificacin fcil, pero permite que su
presencia sea detectada de modo muy sensible. Algunos ejemplos comunes
son: crecimiento de microoganismos, accin enzimtica, o catlisis qumica. El
mtodo del NMP supone tomar la disolucin original o muestra y subdividirla en
un factor (frecuentemente 10 veces, o 2 veces) y evaluar la presencia/ausencia
en mltiples subdivisiones.
El grado de dilucin para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los
elementos se han diluido tanto que hay muchas sub muestras en las que no
aparece. Un juego de repeticiones para cualquier concentracin dada permite
una resolucin ms fina, para usar el nmero de muestras positivas y
negativas que estiman la concentracin original dentro del apropiado orden de
magnitud.
3. PROCEDIMIENTO
Prueba presuntiva: Determinacin del N.M.P. de Coliformes:
Tomar muestras de agua de distintos sitios de la universidad y llevarlos
al laboratorio.
Alistar 15 tubos de ensayo y un frasco con 99ml de agua peptonada
estril para la dilucin de 10-2.
Extraer con una pipeta 1.1ml de la muestra de agua y colocar 0.1ml en
un tubo con Caldo Lauril Triptosa y el 1ml restante en otro tubo con el
mismo medio. Repetir este procedimiento para 5 tubos (5 de 1ml y otros
5 de 0.1ml de la muestra). Ob teniendo de esta manera muestras de
caldo lauril triptosa con concentraciones de 1 y 10 -1.
Extraer 1ml de muestra de agua diluida en los 99ml de agua pepetonada
y colocarlo en un tubo con caldo lauril triptosa. Este paso se realiza para
5 tubos.
Los tubos inoculados se incuban a 35C 0.5C tras 24 2 horas,
agtese cada tubo suavemente y se observa si se produce gas o un
crecimiento cido (color amarillo) y en caso contrario reincbese y
vulvase a examinar al final de 48 7 horas. Regstrese la presencia o
ausencia de gas, sino se ha utilizado el vial, un crecimiento con acidez
significa una presunta reaccin positiva.
Recuento de Bacterias Heterotrficas:
Extraer con una pipeta estril de 1.1ml agua del frasco de muestreo y
agregar 0.1ml en una placa de Petri y el 1ml restante en otra placa.
Agregar el agar nutritivo en las placas anteriores. Esperar 5min para su
solidificacin.
Las placas se incuban 35C durante 48 horas.
4. RESULTADOS
Prueba Presuntiva:
Temperatu
Grupo Muestra Fecha Hora
ra
Estanque
de
N 1
arquitectur
a
Estanque
N 2 de
electrnica
Determinacin de nmero ms probable (NMP) de coliformes
totales
Tiempo Dilucin
de
Muestra NMP/100ml
incubaci 1ml 10-1 10-2
n
Estanque
de
48 horas 4/5 2/5 0/5 22*10=200
arquitectu
ra
Estanque
de
48 horas 4/5 0/5 0/5 13*10=130
electrnic
a
Recuento de bacterias heterotrficas
Dilucin
Muestra UFC/ml
1ml 10-1 10-2
Estanque de
142 57 6
arquitectura
Estanque de
0 0 4
electrnica
Nota : El tiempo de incubacin fue de 72 horas.
5. DISCUSIN OBSERVACION:
7. RECOMENDACIONES:
1. OBJETIVO:
Confirmar la presencia de los microorganismos (bacterias) presentes en
los tubos positivos tras una prueba en el agar BVLB.
2. FUNDAMENTO TEORICO:
Fase presuntiva
Utilcese un medio liquido de lauril triptosa en la porcin presuntiva de
la prueba de tubo mltiple. Como alternativa, puede emplearse un
medio lquido de lactosa, siempre que se haya demostrado que no
aumenta la frecuencia de resultados positivos falsos ni enmascara los
coliformes que existen en las muestras de agua potable. Si se ha
refrigerado el medio despus de su esterilizacin, se incubara de un da
a otro a 35C antes de utilizarlo. Rechcense los tubos que muestren
crecimiento, burbujas o ambas cosas. Hgase el medio de lauril triptosa
con fuerza suficiente como para que al aadir 100ml o 10ml de
muestra, la concentracin de los ingredientes no sea menor que la del
medio estndar
Fase confirmativa
Es un procedimiento mediante el cual una reaccin negativa excluye la
presencia de coliformes fecales, mientras que una reaccin positiva
indica su presencia inequvoca. Deben someterse a esta prueba todos
los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva.
Prueba complementaria
Para establecer definitivamente la existencia de bacterias coliformes y
obtener datos sobre el control de calidad, practquese la prueba
completa en todos los tubos positivos confirmados. Puede utilizarse la
doble confirmacin en medio lquida verde brillante de lactosa bilis para
coliformes totales y el medio liquido EC para coliformes fecales.
Considrese como respuesta positiva de la prueba completa los
resultados positivos en medio liquido EC a temperatura elevada
(44.5C). Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante
lactosa bilis y negativos en medio EC indican la presencia de coliformes
no fecales y, por tanto, deben ser sometidos a la prueba completa para
obtener un valor del NMP.
3. PROCEDIMIENTO:
Prueba Confirmativa:
Llevar a la fase confirmativa todos los tubos en los que haya aparecido
cualquier cantidad de gas.
Agitar suavemente o girar, para que se produzca una suspensin de los
microorganismos.
Con un esterilizador pasar una gota de cultivo al tubo de fermentacin
que contiene el medio Verde Brillante Bilis.
Repetir esta operacin en todos los tubos posiblemente positivos.
Incubar el medio Verde Brillante de la lactosa bilis a 35 0.5C durante
48 3 horas.
Procedimiento del N.M.P. de Coliformes Fecales:
Aplicar este procedimiento a los tubos presuntivos que hayan mostrado
alguna cantidad de gas.
Agitar suavemente o girar los tubos de fermentacin que muestres gas.
Con un asa estril pasar el cultivo de cada tubo de fermentacin al
medio EC.
Incubar los tubos con medio EC inoculados en un bao de agua mara a
44.5 0.2C durante 24 2 horas.
Prueba
presuntiva Dilucin
Muestra
1 ml 10-1 10-2
Prueba confirmativa
Grupo N2
3/4 - -
Estanque de Electrnica
5. DISCUSIN OBSERVACION:
7. RECOMENDACIONES:
1. OBJETIVO:
Determinar la presencia de bacterias gran no esporuladas
procedentes de los cultivos con agar (Demostracin del grupo
coliforme).
2. FUNDAMENTO TEORICO:
RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTRFICAS
La medicin de bacterias hetertrofas en el agua potable puede
proporcionar informacin til a los operadores de plantas de agua,
ingenieros sanitarios, supervisores de la calidad del agua y analistas de
laboratorios de calidad del agua. Durante el tratamiento la densidad
bacteriana vara y en la red de distribucin se puede monitorear el
deterioro de la calidad a travs de los mtodos de recuento heterotrfico
en placas (RHP). La aplicacin constante del mtodo de RHP
seleccionado proporcionar datos bsicos para evaluar cambios en la
calidad bacteriana del agua potable.
RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA
Es un mtodo muy utilizado cuando se necesita determinar el tamao de
la poblacin bacteriana de una muestra. El recuento de
microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno desarrollar
una colonia visible. Pero debido a que una muestra no es totalmente
homognea con respecto a su composicin microbiolgica, es posible
que una colonia se origine de un microorganismo o de cientos de ellos,
dando en este ltimo caso un recuento menor del real. Tambin es
posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan
crecer en las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo,
tiempo, etc.). En este caso el recuento tambin ser inferior al real. Lo
que s se sabe es que cada colonia observada se form a partir de por lo
menos un microorganismo. Esta es una condicin necesaria y suficiente.
Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia (UFC)
a los efectos de los clculos.
3. PROCEDIMIENTO:
Prueba Complementaria:
Las colonias que se desarrollan en el agar LESENDO puede ser tpicas, atpicas
(rosas, rojas blancas o incoloras sin brillo a las 24 horas de incubacin o
negativas (todas las dems).
Tomar de cada placa una o ms colonias tpicas bien definidas, y si no
existen dos o ms entre los que se consideran como probablemente
formadas por m.o. del grupo coliforme y se pasan a un tubo de
fermentacin en medio caldo lauril triptosa ya uno con agar inclinado.
Sembrar las placas de forma que se asegure la existencia de algunas
colonias aisladas, separadas por lo menos 0.5 cm.
Inocular los tubos con el medio caldo lauril triptosa con viales de
fermentacin invertidos a 35C 0.5C durante 24 2 horas si no se
produce gas en este periodo, se prolonga la incubacin hasta 48 3
horas.
Si hay formacin de gas en el tubo con caldo hacer la coloracin
Gram del tubo con cultivo agar inclinado.
4. RESULTADOS:
Prueba Complementaria
6. CONCLUSIONES:
7. RECOMENDACIONES:
2. FUNDAMENTO TEORICO:
3. PROCEDIMIENTO:
PRUEBA VOGUES
PRUEBA DEL CITRATO
PROSKAUER
Incubar a 35 0.5C durante 48 Incubar a 35 0.5C durante 72
horas 96 horas
4. RESULTADOS:
PRUEBA INDOL:
Como el indol es un producto del metabolismo del triptfano, entonces:
Filtro de Membrana:
Temperatu
Grupo Muestra Fecha Hora
ra
Acequia del
4:35p
N 1 CEI 5/12/ 22.5C
m
ingenieritos
Grifo de 4:35p
N 2 4/12 21C
civiles m
5. CONCLUSIONES:
6. RECOMENDACIONES:
Prescott L.M., Harley J.P. and Klein G.A., Microbiologa, 3a edicin, Madrid, Mxico, Mc
GrawHill-Interamericana, 2009, Examen Microbiolgicos del agua, pg :120-
124
8. CUESTIONARIO:
1. Cules son los lmites mximos permisibles de coliformes.
Fecales para las descargas de agua y bienes nacionales as como
a suelos?
2. Mencionar 5 enfermedades transmitidas por el agua,
indicando el agente etiolgico correspondiente?
3. Adems de representar un riesgo para la salud publica el
vertido de aguas residuales tratadas inadecuadamente o sin
tratar a los depsitos naturales, Qu otros efectos indeseables
puede representar?
4. Cules son los lmites mximos permisibles de coliformes
fecales en aguas residuales tratadas que se resan en servicios
pblicos? Indicar NOM