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Lezione 17 16.10.2014 Prof.

ssa Monti

La lezione di oggi verter su spiegare quali sono le caratteristiche fondamentali


dell'immunit acquisita o specifica, vedremo cosa distingue l'immunit
adattativa da quella naturale.

Avrete visto nelle prime lezioni di immunologia che esistono due tipi di
immunit: l'immunit naturale o innata e l'immunit specifica.

L'immunit innata o natura una risposta del nostro organismo verso dei
patogeni che cercano di entrare e questa risposta gi pronta, predisposta
nell'organismo e affronta il patogeno in pochissimo tempo. Si tratta di una
risposta quindi molto precoce e si basa su meccanismi ripetitivi e aspecifici. La
risposta innata sempre uguale, si attivano gli stessi meccanismi, non si
modifica durante contatti con lo stesso patogeno, si dice che stereotipata
quindi se noi entriamo di nuovo in contatto con lo stesso patogeno si attivano
le stesse cellule e si producono componenti che svolgono la loro funzione nella
stessa maniera.

La risposta adattativa invece diversa, entra in gioco quando la risposta innata


non riuscita a debellare il patogeno. una risposta che compare dopo diverso
tempo ed capace di distinguere in maniera straordinariamente specifica le
diverse molecole estranee, quindi ogni patogeno attiva una risposta sua
personale diversa da quelle che possono attivare gli altri patogeni. Inoltre la
risposta acquisita in grado di ricordare l'incontro con il patogeno, si generano
delle molecole di memoria ogni volta che si attiva la risposta e se il nostro
organismo ricontatta lo stesso patogeno la risposta specifica si attiva pi
velocemente perch si stimolano queste cellule di memoria per cui si ha una
risposta specifica molto pi capace di eliminare quel patogeno.

Come vi dicevo le caratteristiche fondamentali dell'immunit innata sono:

risposta rapida nei confronti del patogeno. Abbiamo visto poche ore.
Avrete fatto con il prof annunziato le barriere chimico fisiche dell'immunit
naturale, queste sono gi pronte e nel giro di pochi minuti sono in grado
di combattere i patogeni. Successivamente nel giro di poche ore vengono
attivate le cellule dell'immunit innata che sono: macrofagi, cellule
dendritiche, cellule natural killer che sono cellule dotate di recettori
particolari in grado di riconoscere dei pattern molecolari che si trovano su
numerosi patogeni.

Risposta con bassa specificit . detta anche ad ampio spettro perch


questi patogeni vengono riconosciuti per strutture molecolari comuni a
numerose famiglie di patogeni. I recettori delle cellule per l'immunit
naturale sono poco specifici e riconoscono questi pattern molecolari. Es
toll like receptor, i recettori del mannosio.
Non abbiamo la memoria. un'immunit molto antica. La troviamo anche
negli invertebrati, quella che si sviluppata per prima. Io ho studiato
una lumachina che vive nei nostri laghi e nel sistema circolatorio di
questa lumaca ci sono gli emociti che sono cellule in grado di fagocitare e
riconoscere i patogeni attraverso questi meccanismi.

Caratteristiche dell'immunit acquisita sono:

filogeneticamente recente. Man mano che ci siamo evoluti si sviluppata


questo tipo di immunit che presente dai vertebrati in poi.

Risposta lenta. Prima che compaiano i primi segni di una risposta specifica
devono passare diversi giorni dal contatto con il patogeno.

Risposta specifica. Si dice che c' un riconoscimento specifico e selettivo


perch ogni cellula dell'immunit specifica (linfociti) dotata di un
recettore: per i linfociti B: BCR, per i linfociti T: TCR, e questi recettori
possono riconoscere solo un tipo o parte di un patogeno. un
riconoscimento estremamente selettivo.

Forte risposta di memoria. Ogni volta che questa risposta viene attivata
rimangono nel nostro organismo delle cellule di memoria pronte a
risvegliarsi per rispondere di nuovo allo stesso patogeno.

In questa diapositiva sono riassunte le caratteristiche che abbiamo visto.


Vedete sull'asse delle x il tempo che serve affinch queste immunit si attivino.
Sono indicati anche i tipi cellulari che sono coinvolti in questi tipi di immunit.
Come vedete nell'immunit adattative abbiamo come cellule importanti i
linfociti, in particolare i linfociti B che produrranno l'immunit umorale cio
produranno gli anticorpi e poi abbiamo l'altra popolazione di linfociti che sono
invece responsabili dell'immunit specifica cellulo mediata che sono i linfociti
T. vedremo che questi due tipi di immunit adattativa sono diversi nel modo in
cui vengono attivate e nei metodi con cui eliminano il patogeno.

Ancora in questa diapositiva proprio per sottolineare le differenze di queste


due immunit sono indicati i punti chiave di differenza fra immunit innata e
adattativa.

Come abbiamo detto all'inizio nell'innata i meccanismi sono tutti preesistenti e


in parte vengono indotti, ma le cellule dell'immunit innata non devono essere
prodotte, sono gi nell'organismo. Nell'adattativa invece tutte le cellule devono
essere indotte e stimolate quindi essenziale che avvenga un riconoscimento
del patogeno e poi da questo riconoscimento specifico si dovranno generare
dei cloni delle cellule tutte uguali e tutte in grado di eliminare il patogeno. La
quantit di cellule effettrici quindi deve essere indotta, prodotta e questa si pu
generare quando avviene un riconoscimento da parte di un linfocita.
L'immunit innata, come vi dicevo, riconosce un ampio spettro di patogeni e li
riconosce attraverso un piccolo numero di strutture di riconoscimento che si
trovano sulle cellule dell'immunit dalla diversit limitata. I linfociti della
risposta adattativa invece riconoscono un ampio spettro di patogeni attraverso
dei recettori di numero quasi infinito. La risposta dell'immunit innata quasi
sempre attivata dal legame di pattern molecolari associati a patogeni (PAM) a
recettori di riconoscimento del pattern (PRR), tipo i Toll Like Receptor. La
risposta adattativa invece avviene perch le varie sotto popolazioni dei linfociti
hanno dei recettori che si chiamano BCR per i linfociti B e TCR per i linfociti T.
L'immunit adattativa ha la memoria mentre nessuna memoria per l'immunit
innata. L'immunit innata ha una risposta sempre identica agli stessi patogeni
quindi stereotipata , invece l'immunit adattativa si modifica e le risposte
diventano pi adatte ad eliminare quel patogeno quindi c' un cambiamento
dovuto al secondo contatto con il patogeno.

Esistono due tipi di risposta immunitaria adattativa: l'immunit adattativa


umorale e quella cellulare o cellulo mediata. Le cellule responsabili sono i
linfociti B per quella umorale e i linfociti T per quella cellulare. C' una divisione
dei compiti tra queste diverse sotto popolazioni linfocitarie nell'affrontare il
patogeno che ha resistito alla risposta innata.

I linfociti B a cosa servono? Servono a riconoscere con il loro recettore BCR dei
patogeni extracellulari quindi che vivono e si moltiplicano fuori dalle cellule.
Quando i patogeni entrano nell'organismo i linfociti B attraverso BCR possono
legarli e questo legame comporta l'attivazione dei linfociti B, la loro
moltiplicazione e differenziazione in plasmacellule e la produzione di anticorpi.
Come meccanismo effettore deputato all'eliminazione del patogeno vengono
rilasciati gli anticorpi che non sono altro che il recettore rilasciato ed quindi
specifico per il patogeno. Gli anticorpi si legano alla superficie del patogeno, lo
opsonizzano e lo rendono suscettibile all'attivazione di meccanismi deputati
all'eliminazione. Quando un patogeno rivestito da anticorpi pu essere
fagocitato dai macrofagi, pu attivare la cascata del complemento dalla via
classica e quindi il patogeno viene distrutto con la formazione del poro che
porta alla lisi osmotica. Noi sappiamo per che i microbi possono anche
infettare le cellule del nostro organismo, prendiamo per esempio i virus: questi
entrano nelle cellule, si accrescono, si sviluppano, si riproducono e fuoriescono
e infettano altre cellule. indispensabile quindi che esistano delle forme di
immunit in grado di eliminare tutte le cellule che ad esempio vengono
infettate da virus e qui entra in gioco l'altra popolazione dei linfociti: i linfociti T
citotossici. Questi sono in grado di legare le cellule infettate e rilasciare delle
sostanze che mandano la cellula in apoptosi, ma come avviene il
riconoscimento? I linfociti T, sia citotossici che helper che i T, hanno bisogno
per essere attivati di riconoscere peptidi antigenici sulla superficie delle cellule
in associazione a molecole che appartengono all'organismo: molecole del
complesso maggiore di istocompatibilit. Vedete quindi come i linfociti T hanno
bisogno sempre di una cellula che presenti il peptide antigenico. I nostri
linfociti T citotossici devono riconoscere dei peptidi virali inseriti in molecole
del nostro organismo e solo con questo legame il linfocita si pu attivare e
trasformarsi in cellula effettrice e svolgere la sua funzione di protezione. Poi
abbiamo un'altra sotto popolazione di linfociti T che sono gli HELPER. Come
dice il nome questi linfociti aiutano, sono indispensabili nelle risposte
adattative perch coordinano le risposte specifiche e scelgono, attraverso il
tipo di citochina che producono, qual' la risposta pi adatta per eliminare quel
patogeno. Un ruolo importantissimo. Come funzionano? Come i linfociti T
citotossici anche loro hanno bisogno, per potersi attivare, di riconoscere peptidi
antigenici associati al complesso maggiore di istocompatibilit. Hanno bisogno
quindi di particolari cellule che fagocito i patogeni: macrofagi e cellule
dendritiche, che poi li digeriscono, li tagliano in peptidi e inseriscono questi
peptidi nella tasca del complesso maggiore di istocompatibilit e lo portano in
superficie per mostrarlo. Il recettore di questi linfociti T helper deve riconoscere
le molecole dentro il complesso, una volta avvenuto questo contatto i linfociti si
attivano e svolgono la loro funzione di dirigenti di orchestra producendo le
CITOCHINE. Le citochine sono dei mediatori solubili che servono per coordinare
le varie risposte. A seconda del tipo di citochina che questi linfociti T helper
producono avremo risposte diverse. Vengono prodotte citochine pro
infiammatorie quando si vuole appunto attivare l'infiammazione come
meccanismo effettore della risposta cellulo mediata, si stimolano i macrofagi,
nell'infiammazione cronica i linfociti T helper si attivano producendo grandi
quantit di interferono gamma che una citochina che va ad attivare i
macrofagi rendendoli pi citotossici e quindi pi in grado di eliminare il
patogeno. Oppure il linfocita T helper pu produrre citochine che possono
stimolare la risposta umorale: se capiscono che per eliminare quel patogeno
serve una risposta umorale stimolano i linfociti B a produrre una determinata
classe di anticorpi: quella pi adatta ad eliminare quel patogeno.

L'altra cosa importante che l'immunit adattativa pu essere trasferita da un


soggetto immunizzato ad uno non immunizzato. Come possiamo farlo? O
attraverso il prelievo di anticorpi dal soggetto immunizzato oppure attraverso il
passaggio di cellule antigene specifiche. Se prelevo anticorpi e li trasferisco ho
immunit passiva perch il sistema immunitario non viene stimolato: rendiamo
un individuo immune nei confronti di un patogeno. Esempi di immunit passiva:
siero antitetanico (contiene anticorpi contro la tossina del tetano per il tempo
necessario), siero contro il veleno del serpente. Possiamo avere anche
immunit passiva naturale ad esempio con l'allattamento: importante
allattare perch la mamma trasmette gli anticorpi al figlio rendendolo immune
ai patogeni che la madre ha incontrato; c' un'immunit anche attraverso la
placenta: durante la gravidanza gli anticorpi circolano. Un vaccino invece un
esempio di immunit attiva perch il vaccino in genere una soluzione con il
patogeno reso non attivo che viene inoculato e si ha un'attivazione del
sistema immunitario dell'individuo che risponde con una classica risposta
specifica generando cellule della memoria e l'individuo quindi immune per
lungo tempo. Nell'immunit passiva invece non si genera memoria e l'individuo
immune soltanto per poco tempo.
Vediamo le caratteristiche salienti dell'immunit specifica.

-Specificit: ogni singolo linfocita sulla sua superficie ha migliaia di copie


identiche di un recettore in grado di discriminare le sottili differenze fra i vari
patogeni. Ogni linfocita quindi ha un recettore specifico che si legher sulla
superficie del patogeno, o meglio a parte del patogeno. Le parti del patogeno
che vengono riconosciute dai recettori si chiamano EPITOPI o determinanti
antigenici Ogni volta che c' una risposta specifica si genereranno tante
cellule che riconoscono epitopi diversi sullo stesso patogeno, quindi abbiamo
una risposta policlonale. Abbiamo recettori diversi che riconoscono epitopi
diversi sullo stesso patogeno.

-C' un'ampia DIVERSIFICAZIONE che consente di rispondere a tantissimi


patogeni. Ogni cellula ha il suo recettore e come fanno a generarsi tanti
recettori diversi? C' un sistema detto di ricombinazione somatica: ogni cellula,
ogni linfocita, durante la maturazione a livello degli organi linfoidi primari
genera questi recettori per un processo di ricombinazione. Vengono associati in
modo casuale dei frammenti genici quindi ogni cellula costruisce in modo
casuale e indipendente dall'antigene un recettore. Quando i linfociti sono
maturi non c' ancora stato un contatto con l'antigene quindi mentre questi
recettori si formano deve avvenire una forte selezione perch, essendo casuali,
i recettori potrebbero riconoscere strutture self. Vi dicevo nella lezione
sull'apoptosi che proprio il midollo osseo e il timo, che sono gli organi in cui
avviene la maturazione, sono un cimitero di cellule perch proprio in questi
organi vengono eliminate le cellule attive verso strutture self.

-Abbiamo la MEMORIA che porta ad un potenziamento e ad un miglioramento


delle risposte in caso di esposizioni ripetute allo stesso antigene.

-Le cellule specifiche che si legano al patogeno vanno incontro ad


un'ESPANSIONE CLONALE. Siccome le cellule specifiche per quel patogeno
sono veramente poche indispensabile che si espandano per attivare una
risposta ampia in grado di eliminare il patogeno. Quindi espansione clonale
ovvero capacit di dividersi e moltiplicarsi in risposta alle citochine stimolatorie
e generare un numero molto elevato di cellule tutte uguali, con la stessa
specificit per eliminare il patogeno.

-ALTA SPECIALIZZAZIONE. Consente la generazione di risposte specifiche


ottimali per ogni tipo di patogeno. Come vi dicevo il coordinamento tra le
risposte fondamentale proprio per scegliere il modo giusto per eliminare il
patogeno.

-AUTOLIMITAZIONE delle risposte. Le risposte devono essere finemente


regolate. Una volta che il patogeno stato eliminato tutti questi cloni di cellule
non servono pi, anzi occupano uno spazio immunologico e se non venissero
eliminate non ci potrebbe essere la risposta ad altri patogeni perch hanno
occupato lo spazio immunologico. Al termine della risposta questi cloni devono
andare incontro a morte apoptotica. Questo processo di regolazione si
chiama processo di omeostasi.
-TOLLERANZA AL SELF. Il sistema specifico, i linfociti, durante lo sviluppo,
devono essere educati. Nel timo e nel midollo osseo si insegna ai linfonodi
come riconoscere le cellule dell'organismo da quelle estranee. Se i linfonodi
riconoscono il self devono essere eliminati o perlomeno inibiti per prevenire
la comparsa di malattie autoimmuni. Vedremo poi che questa tolleranza pu
essere rotta e si possono generare queste malattie.

In questa diapositiva sono riassunte le caratteristiche che abbiamo descritto


fino ad adesso. In questo grafico abbiamo preso la risposta umorale e sull'asse
delle x abbiamo il tempo mentre sull'asse delle ordinate abbiamo la quantit di
anticorpi che viene prodotta.

Ogni volta che c' un contatto con l'antigene si attiva una risposta specifica
che chiamata risposta primaria. Si dice risposta primaria quando un linfocita
naive, vergine, che non ha mai incontrato il suo antigene viene attivato. Questa
risposta raggiunge il massimo di produzione di anticorpi dopo un paio di
settimane. La risposta primaria caratterizzata anche dal produrre una
determinata classe di anticorpi: le IgM. Le IgM sono anticorpi pentamerici,
costituite da 5 unit base, che sono bravissimi ad attivare il complemento.
Come attivazione del complemento si ha un aumento della risposta innata.
Quando finalmente il patogeno viene debellato si ha la riduzione dei cloni, la
loro morte e si formano delle cellule della memoria. Se abbiamo un secondo
contatto con l'antigene le cellule della memoria, che sono in numero maggiore
rispetto alle cellule naive della risposta primaria, vengono attivate
immediatamente. Vedete che nel giro di pochissimi giorni si ha un aumento di
produzione di anticorpi e questa la risposta secondaria. La risposta
secondaria differisce da quella primaria sia quantitativamente che
qualitativamente, cosa vuol dire? Vedete che vengono prodotti pi anticorpi in
minor tempo e questi anticorpi sono diversi, sono pi affini, quindi nella
risposta secondaria aumenta l'affinit: si legano con maggior capacit al
patogeno, e in pi cambia la classe di anticorpi che viene prodotta: non
produciamo pi le IgM, ma produciamo la classe di anticorpi pi adatta ad
eliminare quel patogeno come possono essere le IVA, IgG, IgE. Naturalmente a
coordinare sempre queste modificazioni delle risposte umorali specifiche
giocano un ruolo importante i linfociti T helper.

Qui abbiamo le diverse fasi delle risposte immunitarie adattative. L'elemento


pi importante la fase di riconoscimento che avviene negli organi linfoidi
secondari. Questo perch i linfociti vergini, naive sono pochi necessario che ci
sia un luogo dove gli antigeni dei patogeni vengono concentrati e dove questi
linfociti specifici passano pi volte al giorno. Abbiamo quindi che gli antigeni
vengono concentrati a livello degli organi linfoidi secondari. Voi sapete che la
linfa deriva dall'assorbimento dei liquidi interstiziali attraverso i vasi linfatici e
sappiamo che lungo i vasi linfatici abbiamo i linfonodi e sappiamo che l
avviene il riconoscimento e l'inizio della risposta specifica e gli antigeni
vengono trasportati nei linfonodi indirettamente o direttamente attraverso le
cellule dendritiche. Dopo la fase di riconoscimento abbiamo la fase di
attivazione con l'espansione clonale e la formazione delle cellule effettrici
quindi i linfociti B diventano plasmacellule e producono anticorpi e i linfociti T
genereranno i linfociti T effettori, questi lasceranno gli organi secondari e
andranno in periferia dove c' l'attacco del patogeno e l svolgeranno la loro
funzione cercando di eliminare il patogeno. Una volta che il patogeno stato
eliminato abbiamo la fase di declino della risposta o dell'omeostasi e quindi
riduzione, eliminazione di tutti quei cloni che si sono espansi e mantenimento
delle cellule della memoria che possono rimanere in circolo ma solitamente si
trasferiscono nel midollo osseo per poi al bisogno tornare in circolo.

Le strutture antigeniche che sono in grado di stimolare le risposte immunitarie


specifiche sono tantissime: oltre 10 alle nona, ma ogni linfociti B o T riconosce
una e solo una struttura antigenica. I linfociti riconoscono molte strutture
diverse grazie alla ricombinazione somatica con la quale si formano i recettori,
senza che ci sia contatto con l'antigene. Successivamente, dopo che si sono
formati questi linfociti T vergini o naive, si ha il contatto con l'antigene e come
reagiscono le cellule? Abbiamo detto che il linfocita T vergine prodotto negli
organi linfoidi primari viene immesso nel circolo ematico e circola negli organi
linfoidi secondari alla ricerca del suo antigene specifico. Se incontra l'antigene
si attiver e dar origine all'espansione clonale. l'antigene quindi che sceglie
il suo linfocita vergine all'interno degli organi linfoidi secondari e lo attiva.

Vediamo le diverse classi di linfociti.

-Linfociti B: responsabili dell'immunit umorale, riconoscimento di microbi


extracellulari ed hanno come funzioni effettrici quelle di: produrre cloni del
linfocita B attivato che secerne anticorpi. Questi anticorpi possono
neutralizzare il patogeno legandolo e impedendo il loro ingresso nelle cellule
oppure possono opsonizzare i patogeni e favorire la fagocitosi da parte delle
cellule che hanno il recettore per il frammento cristallizzabile degli anticorpi
oppure possono attivare la via classica del complemento.

-Linfociti T helper. A seconda di quali citochine producono vengono suddivisi


in due sotto popolazioni: Th1 e Th2. I Th1 sono la sotto popolazione che quando
viene attivata produce citochine pro infiammatorie, quindi citochine che
stimolano l'infiammazione e producono anche l'interferono gamma che attiva i
macrofagi. L'altra sotto popolazione, i Th2, una volta attivati producono
citochine che favoriscono il differenziamento dei linfociti T ma soprattutto mi
vanno a favorire la risposta umorale stimolando i linfociti B a cambiare la classe
di anticorpi prodotta. Vedremo che ci sono alcune citochine come
l'interleuchina 4 e l'interleuchina 5 che mi stimolano i linfociti B specifici a
produrre per es come anticorpo le IgE piuttosto che altre classi. Le IgE mi
aiutano a combattere gli elminti, i vermi, quindi se i linfociti T helper sono
attivati da questo patogeno inizieranno a produrre delle citochine che
stimolano i linfociti B a produrre delle IgE che sono fondamentali per attivare i
granulociti eosinofili e i mastociti che sono l'unica popolazione in grado di
ledere la cuticola di questi patogeni. Vedete quali coordinamento c'.

-Linfociti T citotossici. Abbiamo detto che attaccano direttamente le cellule


infettate da virus.

-Linfociti T regolatori. Sono una sotto popolazione scoperta recentemente


ma si visto essere importante. Sono una classe particolare che ha la funzione
di inibire le risposte immunitarie e sembra che giochino un processo
importante nell'autoimmunit.

-Cellule Natural Killer. Queste cellule in realt come morfologia assomigliano


ai linfociti, ma in realt sappiamo che sono cellule che vengono considerate
cellule dell'immunit naturale. La loro funzione assomiglia a quella dei linfociti
T citotossici: non sono dotati di recettori specifici ma svolgono una funzione
nell'eliminare le cellule infettate da virus o le cellule tumorali.

Dal punto di vista didattico si trattano questi due tipi di immunit, adattativa e
naturale, separatamente ma in realt c' una stretta collaborazione tant' che
molti meccanismi effettori dell'immunit specifica non sono altro che
meccanismi dell'immunit innata ed ogni volta che abbiamo una risposta
innata abbiamo anche l'induzione di un processo dell'immunit adattativa. Ogni
volta che un patogeno entra nel nostro organismo e supera le barriere fisiche
dell'immunit naturale si attiva l'immunit innata con una risposta non
specifica dopo di che abbiamo l'induzione della risposta dell'immunit
specifica. Vedete che c' stretta collaborazione.
PATOLOGIA Lezione 18 20.10.2014 Prof.ssa Monti

Oggi parleremo degli anticorpi, della struttura e della loro funzione sia come
recettore dei linfociti B sia come molecole che vengono secrete per la fase
finale di attivazione del sistema immunitario. Abbiamo detto che le cellule
responsabili dell'immunit specifica sono:
i linfociti B
i linfociti T, i quali si suddividono a loro volta in
-linfociti T citotossici, cellule che attaccano direttamente le cellule
che sono state infettate da patogeni che vivono all'interno della
cellula, come i virus;
-linfociti T helper o CD4+, cellule responsabili di tutte le risposte
immunitarie perch a seconda di quale citochina producono
coordinano e organizzano le risposte specifiche sia producendo
mediatori che possono attivare le risposte umorali, sia producendo
dei mediatori che possono stimolare la risposta cellulo-mediata,
come l'attivazione dei macrofagi o l'attivazione dei linfociti T CD8+

Riconoscimento dell'antigene:
Su queste cellule esistono dei recettori specifici che sono indispensabili per la
loro attivazione nel riconoscere in maniera finemente specifica il patogeno o il
microorganismo o l'antigene.
I diversi linfociti riconoscono l'antigene in due modi differenti:
i linfociti B sono dotati di un recettore, anticorpi o BCR, in grado di
riconoscere gli antigeni in forma nativa e pu riconoscere antigeni di
diversa natura, pu cio riconoscere proteine, il DNA, zuccheri,
glicoproteine, lipidi... Hanno perci un maggior campo di riconoscimento.
i linfociti T sono dotati di un recettore chiamato TCR caratterizzato
dall'impossibilit di riconoscere direttamente gli antigeni ma
indispensabile che peptidi antigenici, cio sequenze amminoacidiche di
proteine, gli vengano mostrati da una cellula dell'organismo che funziona
da cellula presentante l'antigene o APC.
Questa la grande differenza tra queste due popolazioni linfocitarie; i B
riconoscono antigeni extracellulari in tutte le loro forme e strutture, i T invece
hanno bisogno di qualche cellula dell'organismo che gli prepari l'antigene che
deve essere riconosciuto e glielo mostri in associazione a molecole che fanno
parte dell'organismo che si chiamano molecole del complesso maggiore di
istocompatibilit.

Fase di riconoscimento:
Le molecole responsabili del riconoscimento degli antigeni sono:
anticorpi per l'immunit umorale
MHC (molecole del complesso maggiore di istocompatibilit)
TCR (T cell receptor) espresso direttamente dai linfociti T
Questi sono i tre tipi di recettori responsabili della fase di
riconoscimento.

GLI ANTICORPI
Gli anticorpi funzionano come recettori sui linfociti B e, una volta che
quest'ultimo viene attivato e ha quindi riconosciuto il suo antigene, va incontro
ad un'espansione clonale, la cellula cio si divide tante volte generando un
clone di tante cellule tutte uguali con lo stesso recettore e questo clone poi
differenzia in plasmacellule, cio cellule che producono l'anticorpo che avevano
sulla loro superficie come recettore; esiste quindi una forma secreta degli
anticorpi con la stessa specificit del recettore che si trovava sulla cellula che
ha riconosciuto l'antigene.
Gli anticorpi sono importanti sia nella prima fase di riconoscimento sia nelle
fasi finali cio nella fase effettrice quando gli anticorpi vengono secreti e vanno
a svolgere i loro compiti.
Nella fase di riconoscimento abbiamo l'anticorpo di membrana che riconosce
l'antigene, invece nella fase effettrice l'anticorpo libero, viene rilasciato nel
sangue o negli spazi interstiziali e pu andare a legarsi al patogeno che ha
evocato la risposta immunitaria.
I meccanismi che l'anticorpo secreto pu attivare, una volta che si lega
all'antigene, sono diversi; l'anticorpo pu:
neutralizzare microbi o prodotti microbici tossici. Se un microbo produce
delle tossine possiamo avere degli anticorpi che legano e bloccano la
funzione della tossina e non la rendono pi deleteria.
attivare il sistema del complemento (il complemento si attiva con 3
modalit ma le pi frequenti sono la modalit classica e alternativa. Se il
complemento si attiva con la presenza di anticorpi che hanno
opsonizzato il patogeno viene attivata la via classica.)
opsonizzare gli antigeni cio gli anticorpi si legano alla superficie del
patogeno con le parti specifiche, lasciando libero il frammento
cristallizzabile che verr riconosciuto da fagociti che sono ad esempio
granulociti neutrofili o macrofagi che sono dotati di un recettore specifico
in grado di riconoscere questa parte anticorpale. Il legame cono i fagociti
comporta l'induzione della fagocitosi e cos patogeni, microbi e antigeni
rivestiti di anticorpi opsonizzati, cio preparati al pasto, possono essere
mangiati dalle cellule che svolgono questa funzione.
indurre la citotossicit anticorpo dipendente. In questo caso abbiamo
sempre la produzione di anticorpi specifici che si legano al patogeno e
favoriscono il riconoscimento del patogeno, attraverso il riconoscimento
dell'anticorpo, e vengono rilasciate cellule che svolgono una attivit
citotossica. Cellule citotossiche dell'immunit naturale sono ad esempio
le cellule natural Killer che sono dotate di un particolare recettore in
grado di riconoscere gli anticorpi che hanno opsonizzato i patogeni; le NK
arrivano, riconoscono l'anticorpo sul patogeno e rilasciano in vicinanza di
questo patogeno sostanze tossiche che postano alla distruzione della
cellula infettata o del patogeno stesso.

Tanti sono i meccanismi indotti da questi anticorpi.


Immunit specifica e immunit naturale cooperano sempre cercando di
difendere l'organismo da ci che pu infettarlo e pu indurre una malattia.

Localizzazione degli anticorpi:


Gli anticorpi si trovano principalmente:
sulla membrana dei linfociti B (e nel RE e nel Golgi);
nelle secrezioni mucose (in particolar modo IgA). Lo stress riduce le
risposte immunitarie e sono stati fatti degli studi proprio sugli anticorpi
presenti nella saliva analizzando la saliva degli studenti prima di un
esame e si potuto osservare che un forte stress riduce la quantit di IgA
presente nella saliva.
poco nei fluidi interstiziali
nella parte fluida del sangue (siero)

Gli anticorpi sono delle gammaglobuline:


Gli anticorpi sono anche chiamati gammaglobuline o immunoglobuline
perch sono stati messi in evidenzia con un esperimento effettuato da Tiselius
e Kabat nel 1939. Questi due studiosi volevano verificare dove si trovavano gli
anticorpi nel siero e per fare ci presero dell'ovoalbumina e immunizzarono un
coniglio. Questa proteina iniettata nel coniglio induceva una risposta
immunitaria specifica con una grande produzione di anticorpi contro questa
proteina. I due prelevarono il siero del coniglio e fecero correre in un gel
elettroforetico il siero e cos le proteine si separarono in funzione della carica
elettrica e della massa. Le proteine del siero si dividono in:
albumine
globuline
alfa
beta
gamma
Il siero di coniglio mostrava un picco elevato a livello delle gammaglobuline.
Questo per non era sufficiente a dimostrare che gli anticorpi si trovassero
nelle gammaglobuline e perci presero il siero del coniglio e lo incubarono con
l'ovoalbumina. In questo modo gli anticorpi si legano alla proteina e
precipitano e dopo un'incubazione con l'antigene il siero non contiene pi
anticorpi perch formano un reticolo e si separano. Se il siero cos trattato
veniva fatto correre sul gel elettroforetico presentava un andamento in cui le
gammaglobuline sono notevolmente ridotte.

Struttura degli anticorpi:


Gli anticorpi funzionano da recettori nella fase di riconoscimento e durante la
fase effettrice invece vengono rilasciati quando il linfocita B attivato si
differenzia in plasmacellula e comincia a produrre una quantit enorme di
anticorpi. La struttura di questi anticorpi, sia della fase di riconoscimento sia di
quella effettrice, identica.
Gli anticorpi hanno una forma a Y, sono delle glicoproteine e sono costituiti da:
2 catene pesanti, pesanti perch sono di maggiori dimensioni
2 catene leggere
Le due catene pesanti sono legate insieme da ponti disolfuro e sempre un
ponte di solfuro lega la catena leggera alla catena pesante.
Esistono 5 diversi tipi di catene pesanti che determinano la classe o isotipo degli
anticorpi:




La catena pesante determina la classe degli anticorpi, cio a seconda di quale


catena viene espressa dall'anticorpo noi parliamo di:
IgG se presente la catena pesante
IgE se presente la catena pesante
IgA se presente la catena pesante
IgM se presente la catena pesante
IgD se presente la catena pesante
Esistono invece 2 tipi di catene
leggere:
K

Ogni anticorpo ha o due catene o due catene K, non possiamo avere un
anticorpo che presenta una catena e una catena K. La catena leggera non
determina nessun tipo di caratteristica all'anticorpo. Sia la catena pesante sia
la catena leggera che costituiscono gli anticorpi sono costituite da:
regioni variabili (VH e VL) che si trovano all'estremit amminica e,
come dice il nome, sono quelle che determinano la specificit, quelle che
dovranno entrare in contatto con l'antigene. Ogni anticorpo quindi avr
una regione variabile diversa da un altro.
regioni costanti (CH e CL) che si trovano all'estremit carbossilica della
catena leggere, che resta uguale in tutti gli anticorpi che esprimono
quella catena. Nella catena pesante invece ci sono un numero pi elevato
di regioni costanti; possiamo avere 3 o 4 regioni costanti.
I Domini sono particolari strutture che caratterizzano gli anticorpi; si
caratterizzano per la forma ovoidale e vi si trovano diversi strands
amminoacidici. Questa struttura a dominio non tipica soltanto degli anticorpi
ma questa struttura cos globulare la troviamo in tanti altri recettori che fanno
parte del sistema immunitario. Esiste la super-famiglia delle immunoglobuline
che sono una serie di molecole che hanno alla base della loro struttura i domini
immunoglobulinici. Questi domini sono costituiti nella loro lunghezza da circa
110 amminoacidi, i quali danno origine alla struttura ovoidale, e sembra che
questi domini derivino da un gene ancestrale che si duplicato durante
l'evoluzione e, siccome era una struttura che molto probabilmente dal punto
evolutivo funzionava bene, stato utilizzato in molti recettori che giocano un
ruolo importnate nelle risposte immunitarie.
Il dominio immunoglobulinico ha una forma a sandwich, costituito da
foglietti planari, ciascuno dei quali formato da nastri amminoacidici in
configurazione antiparallela. Abbiamo quindi questi foglietti che vanno in
senso antiparallelo e formano legami tra di loro.
Ogni dominio costante caratterizzato da 7 8 segmenti peptidici posti su due
piani, uno sotto e uno sopra, mantenuti insieme da un ponte disolfuro ed ogni
strands costituito da nastri amminoacidici antiparalleli mantenuti insieme
anche a delle zone che legano i diversi strands meno organizzati.
Il dominio variabile invece un po' pi complesso ma mantiene sempre la
struttura del dominio; presenta 4 strands antiparalleli e invece l'altro strands
costituito da 5 elementi con sequenza antiparallela e anche in questo caso
abbiamo il ponte disolfuro.
Nei domini variabili sono molto importanti i nastri che collegano i vari strands
antiparalleli nella parte esterna perch questi determineranno il riconoscimento
specifico dell'antigene e andranno a costituire il sito di legame con l'antigene.
Nelle parti esterne troviamo infatti le regioni di ipervariabilit o CDR
(Complementary determing Regions), regioni che entrano in contatto e
formano legami con l'antigene. Queste regioni sono quelle che variano di pi
da anticorpo ad anticorpo perch determinano la specificit; le CDR legano,
accolgono e riconoscono l'antigene con una sorta di morsa che permette poi
l'attivazione del linfocita.
La massima variabilit tra un anticorpo e l'altro risiede nei diversi CDR (CDR1,
CDR2, CDR3) che direttamente prendono contatto con l'antigene mentre il
resto del dominio meno variabile rispetto alle CDR e perci vengono definite
zone cornice perch sono pi comuni e meno diverse da anticorpo ad
anticorpo.
Catena leggera dominio variabile catena pesante costituiscono il sito di
legame per l'antigene il quale viene riconosciuto da queste zone di
ipervariabilit e, una volta bloccato, si lega e ci porta all'attivazione del
linfocita o al riconoscimento dle patogeno se siamo nella fase effettrice. Il
riconoscimento avviene secondo il modello chiave-serratura quindi c'
proprio un adattamento e non abbiamo mai la formazione di legami covalenti
ma bens legami di van der Waals, elettrostatici, idrofobici... e quindi l'antigene
pu anche staccarsi.
Un'altra importante parte degli anticorpi la zona cerniera che si trova tra il
primo dominio costante e il secondo dominio costante della catena pesante.
Questa zona fondamentale per la funzione dell'anticorpo in quanto gli
consente di aprire e chiudere le braccia che contengono il sito di
riconoscimento dell'antigene, in questo modo l'anticorpo reso adattabile alla
struttura dell'antigene per favorire il riconoscimento dei determinanti
antigenici. Non tutte le classi di anticorpi hanno la zona cerniera, questa infatti
tipica delle IgG, delle IgA e IgD, mentre le IgE e le IgM non hanno la zona
cerniera che qui quindi sostituita da un altro dominio costante e perci sono
delle strutture pi rigide. Le IgE e le IgM avranno 4 domini costanti e saranno
pi rigide a causa della assenza della zona cerniera. La regione cerniera
permette flessibilit alle molecole anticorpali.

Esperimento di Porter:
Come si capito quali fossero le funzioni delle diverse componenti degli
anticorpi? Per la prima volta furono messe in evidenzia le funzioni degli
anticorpi con l'esperimento di Porter nel 1962. la digestione delle IgG con
papaina e pepsina ha permesso di costruire un modello di struttura delle Ig.
Porter infatti prese delle IgG di conigli che era stato immunizzato con una
determinata proteina e tratt questi anticorpi quali la papaina e la pepsina che
si conosceva il livello al quale tagliavano questi anticorpi. Nel primo
esperimento prese gli anticorpi e li tratt con la papaina che va a tagliare le
IgG sopra la zona cerniera. Da questa digestione si formano tre parti:
due frammenti Fab
un frammento cristallizzabile (Fc)
Porter dimostr che i due frammenti fab che contenevano i domini variabili
erano in grado di riconoscere l'antigene, quindi la parte specifica dell'anticorpo
per la prima volta si dimostr essere quella amminoterminale che conteneva i
domini variabili sia della catena pesante sia della della catena leggera. Il
frammento Fc invece, cio la parte costante della catena pesante degli
anticorpi, era la responsabile di tutte le attivit effettrici. Tutto ci che
determina poi la fase effettrice cio l'attivazione del complemento,
l'opsonizzazione, l'attivazione della citotossicit... dipende tutto dal frammento
cristallizzabile costituito dagli ultimi 2 domini costanti della catena pesante.
Porter poi fece una controprova e pens di trattare delle IgG di ratto con un
altro enzima che la pepsina che taglia invece sotto la zona cerniera. Dalla
digestione con la pepsina si generano un unico frammento Fab2, costituito da
entrambe le braccia che contengono la parte variabile delle immunoglobuline,
mentre il frammento cristallizzabile viene completamente tutto degradato.
Mettendo a contatto il tutto con l'antigene osserv che il frammento Fab2
aveva una funzione specifica di riconoscimento dell'antigene, quindi
effettivamente il Fab che riconosce l'antigene e in questa situazione, in cui Fc
completamente degradato, non era possibile avere gli effetti della risposta
effettrice. In questo modo stato dimostrato che Fc che determina
l'attivazione dei meccanismi della fase effettrice.

Gli anticorpi esistono sia come recettori sia come molecole solubili.
Gli anticorpi che devono funzionare da recettori per l'antigene e quindi devono
rimanere ancorati alla superficie dei linfociti B, durante la loro sintesi, vengono
arricchiti di un peptide che viene legato all'estremit carbossilica dell'anticorpo,
il peptide M, un peptide idrofobico che non consente, al momento della
secrezione, quando la vescicola del Golgi viene trasportata verso la superficie
cellulare, la secrezione dell'anticorpo ma lo blocca sulla superficie della cellula.
Questo peptide M costituito da una zona idrofobica che si incastra nel doppio
strato lipidico e blocca l'anticorpo. In pi il peptide M dotato di una coda
citoplasmatica che resta all'interno del citoplasma del linfocita B e questa coda
citoplasmatica relativamente importante nella trasduzione del segnale di
attivazione, quando questo recettore si lega al patogeno.
Nel caso in cui la nostra cellula sia differenziata in plasmacellula non viene
prodotto il peptide M ma verr prodotto invece il peptide S che una
sequenza di amminoacidi idrofilica che favorir, quando la vescicola dal Golgi si
porta verso le membrane, la secrezione degli anticorpi; non ci sar nessun
segmento che bloccher l'anticorpo sulla membrana.
Il passaggio da Ig di membrana a Ig di secrezione dipende da meccanismi di
splicing alternativo.

Gli anticorpi che funzionano da recettori:


I linfociti naive, cio quelli vergini che non hanno mai incontrato l'antigene, che
vengono prodotti continuamente dagli organi linfoidi primari e immessi
nelcircolo ematico, hanno come recettori IgM e IgD. La specificit la stessa
mentre cambia la catena pesante. Ogni linfocita pu riconoscere un solo
antigene quindi la specificit la stessa.
Nelle risposte immunitarie umorali abbiamo una risposta primaria, che
coinvolger questo recettore, ma possiamo avere anche delle risposte di
memoria anamnestiche, quando si rientra in contatto con lo stesso patogeno.
In quest'ultimo caso sulla superficie dei linfociti B che hanno gi incontrato
quell'antigene si ha un cambiamento da IgM e IgD in IgG, IgE e IgA.
Naturalmente cambia la classe ma la specificit resta la stessa, verso quel
determinato patogeno anche se vedremo che pu migliorare addirittura
l'affinit e il legame con il patogeno perch nelle risposte anamnestiche
migliora la qualit della risposta immunitaria e aumenta l'affinit.
Nell'anticorpo che funziona da recettore abbiamo detto che presente una
brevissima coda intracitoplasmatica che in alcune classi di anticorpi pu essere
costituita da 2-3 amminoacidi. Con le due braccia riconosce l'antigene mentre
la coda, essendo cos breve, non pu svolgere un ruolo di attivazione, pu
trasdurre il segnale all'interno della cellula per attivarla una volta che ha legato
l'antigene. La brevit le impedisce di svolgere queste funzioni, infatti mancano
dei segmenti che possono attivare la trasduzione del segnale. Quando gli
anticorpi funzionano da recettori troviamo sempre associati al BCR il complesso
Ig e Ig, complesso che serve a trasdurre il segnale che l'anticorpo ha legato
l'antigene e quindi di mandare segnale di attivazione al nucleo del linfocita B.
Questo complesso costituito da due catene, una e una , costituite dai
domini immunoglobulinici; anche questo complesso apparterr alla famiglia
delle immunoglobuline. Queste due catene associate a BCR hanno una lunga
coda citoplasmatica nella quale sono presenti anche le sequenze ITAM,
sequenze che, una volta che il recettore si legato, vengono fosforilate e
questa fosforilazione porta alla cascata di attivazione e al segnale che porta il
linfocita B a moltiplicarsi e a dare origine al clone e poi alle plasmacellule.
PATOLOGIA (Immunologia) Lezione 22 23.10.2014 Prof.ssa Monti

Slides corrispondenti: Maturazione dei linfociti, espressione e


riarrangiamento dei geni per i recettori degli antigeni

Sui linfociti naive troviamo due classi di recettori: le IgM e le IgG. Questi
recettori non sono in grado di trasdurre il segnale quando si legano allantigene
con le due braccia specifiche perch non presente nella molecola degli
anticorpi una coda citoplasmatica con la presenza degli enzimi in grado di
fosforilare e attivare tutta la cascata di trasduzione del segnale dellavvenuto
legame. Quindi sulla superficie dei linfociti B noi troviamo sempre affiancate al
recettore due molecole che appartengono anche queste alla superfamiglia
delle immunoglobuline che sono Ig-beta e Ig-alfa. Queste due molecole si
attivano quando gli anticorpi legano lantigene e hanno una coda
citoplasmatica che contiene particolari motivi, chiamati ITAM. Questi motivi
contengono tirosine che vengono fosforilate al momento del legame.
Lattivazione di queste due catene porta allavvio della cascata di trasduzione e
quindi di attivazione del linfocita B. Questo segnale non sufficiente ma
indispensabile per lattivazione dei linfociti B un secondo segnale. Questo per
quanto riguarda gli anticorpi che funzionano da recettore.

Poi una volta che il linfocita B stato attivato, si quindi moltiplicato, ha dato
origine a un clone di cellule, va incontro a una differenziazione, ovvero i linfociti
B diventano plasmacellule che secernono gli anticorpi specifici che avevano
sulla loro superficie e quindi abbiamo la produzione di grandi quantit di
anticorpi.
Vengono prodotte diverse classi di anticorpi (5 classi). Nelle risposte primarie,
cio nelle risposte umorali da primo contatto con lantigene, vengono prodotte
soprattutto delle IgM. Nei contatti successivi, nelle risposte secondarie, le IgM
invece vengono sostituite dalle altre classi di anticorpi: viene scelta, diciamo, la
classe migliore, pi capace di eliminare pi velocemente quellantigene.

A differenza degli anticorpi che funzionano da recettori, che sono sempre


monomerici; negli anticorpi che vengono secreti possiamo avere delle classi
polimeriche (costituite da pi unit base che si legano tra di loro).
Le classi di anticorpi secrete in forma polimerica sono:
- le IgA (dimeriche o trimeriche): nella forma dimerica le due strutture
fondamentali vengono tenute insieme dalla catena J;
- le IgM (pentameri o esameri): nella parte carbossi-terminale le unit base
formano legami per mantenere la struttura polimerica e in pi, anche in
questo caso, viene prodotta la catena J che lega le varie unit base.
Invece le altre classi di anticorpi (IgG, IgD e IgE) sono sempre secrete in forma
monomerica, come unit base semplici.

Levoluzione ha scelto di produrre diverse classi di anticorpi. Gli isotipi, che


sono determinati dalla catena pesante, determinano di fatto la funzione di
questi anticorpi. I meccanismi effettori delle risposte immunitarie specifiche
sono mediate proprio dallisotipo degli anticorpi.

Le IgA sono costituite dalla catena pesante alfa e ne esistono due sottotipi
(IgA1 e IgA2). Alfa-1 e alfa-2 differiscono soprattutto nella zona-cerniera, parte
importantissima soprattutto per il movimento nello spazio delle braccia
dellanticorpo. La zona-cerniera molto probabilmente si modificata perch le
IgA vengono prodotte soprattutto a livello delle mucose, soprattutto a livello
dellintestino, e quindi si formata una zona-cerniera resistente agli enzimi che
molti batteri possono produrre e che taglierebbero gli anticorpi che si trovano
nelle mucose. Nellevoluzione abbiamo quindi avuto un cambiamento nella
zona-cerniera della catena alfa per resistere a questo danno che potrebbe
essere esercitato dai batteri della flora intestinale.
Le IgA si trovano nel siero in piccola quantit; hanno emivita molto breve e si
ritrovano soprattutto nelle secrezioni corporee: a livello di mucose, lacrime,
saliva etc. Vengono secrete in forma dimerica o trimerica.
Le IgD vengono definite un relitto evoluzionario, di fatto non vengono
secrete: funzionano, quindi, principalmente solo da recettore sui linfociti B
naive. A livello del siero troviamo solo tracce di IgD, la secrezione di questa
classe non viene effettuata e non si sa bene eventualmente quale sarebbe
stata la sua funzione.

Le IgE sono anticorpi che si trovano in piccolissime quantit a livello del siero e
hanno emivita molto breve. Da un punto di vista dellimmunit, le IgE vengono
prodotte quando c uninfezione da parassiti, come ad esempio gli elminti (i
vermi) perch possono essere riconosciute, una volta opsonizzato il patogeno,
soltanto dai granulociti eosinofili, che hanno il recettore per il Fc delle IgE e
sono lunico tipo di cellule, con la secrezione dei granuli che contengono, di
ledere e di danneggiare la parete dei parassiti.
Questa la funzione fisiologica di questi anticorpi, poi esistono anche degli
aspetti patologici: le IgE sono anche coinvolte nelle allergie. Vengono prodotte
in organismi predisposti a produrre IgE per antigeni che, normalmente, nella
popolazione non danno risposte immunitarie. Il recettore per questi anticorpi si
trova anche su cellule responsabili dellinfiammazione, i mastociti. Il soggetto
allergico si sensibilizza; produce grandi quantit di IgE, che si legano alla
superficie del mastocita, dove restano legate fino al secondo contatto con lo
stesso antigene. Il legame dellantigene con il mastocita porta a
degranulazione del mastocita stesso; i granuli dei mastociti contengono
istamina (importantissimo mediatore solubile dellinfiammazione che agisce
su vasodilatazione e permeabilit); successivamente i mastociti, per sintesi de
novo producono anche i mediatori che derivano dalla. arachidonico che hanno
azione sul microcircolo, andando a indurre il processo infiammatorio.

Le IgG sono la classe di anticorpi pi comune. Si conoscono 4 sottoclassi di IgG,


con funzioni effettrici leggermente diverse tra loro (1, 2, 3, 4). Questa la
classe pi presente nel siero, quella che viene secreta nel sangue, con
unemivita pi lunga. Vengono sempre secrete in forma monomerica e questi
anticorpi hanno moltissime funzioni effettrici:
- sono responsabili dellopsonizzazione: i patogeni vengono rivestiti dalle IgG
e molti fagociti
hanno i recettori che riconoscono il Fc delle IgG;
- attivano il complemento attraverso la via classica, solo se ci sono almeno due
molecole molto vicine sulla superficie del patogeno. Tutte le volte che
abbiamo il legame antigene-anticorpo abbiamo un piccolo cambiamento
conformazionale del Fc dellanticorpo che favorisce le risposte effettrici;
- possono dare anche lattivazione della citotossicit anticorpo-mediata: le
cellule NK, cellule citotossiche dellimmunit innata, sono dotate di un
recettore (CD16) che riconosce il Fc delle IgG.La cellula infettata da un
patogeno espone dei determinanti antigenici sulla superficie; lanticorpo (IgG)
arriva, riconosce la parte del patogeno sulla cellula infettata e a questo punto
arriva la cellula NK, col suo recettore per il Fc; si attacca e libera le sostanze
tossiche per la cellula che stata infettata;
- passano nel circolo fetale durante la gravidanza e danno unimmunit
passiva al feto (sono gli unici anticorpi in grado di attraversare la placenta e
raggiungere il feto)
Le IgG sono gli anticorpi che vengono prodotti in grandi quantit o alla fine
delle risposte primarie o in quelle secondarie, quando c il cambiamento di
classe e laumento anche dellaffinit. Le IgG sono dunque anticorpi pi affini
rispetto alle IgM che sono anticorpi che vengono prodotti nelle risposte
primarie, da primo contatto.

Le IgM in forma di monomero funzionano da recettori per le cellule naive,


mentre invece vengono secrete in pentameri e sono gli anticorpi delle risposte
primarie. La cui affinit non come nelle altre classi in cui abbiamo switch
isotipico. Le IgM attivano il complemento molto bene perch sono gi
pentameri e potrebbero in teoria legare 10 epitopi. Pagano la loro minor affinit
(sono le prime ad essere prodotte quindi non c stato ancora aumento
dellaffinit) con il fatto che possono attivare velocemente il complemento.

Le diverse sottoclassi di anticorpi si differenziano per le funzioni effettrici


leggermente diverse.
Ad esempio nelle IgG, per quanto riguarda lattivazione del complemento, il
tipo 1 e 3 sono molto brave ad attivare il complemento, le 2 cos e cos e le 4
addirittura non riescono ad attivare il complemento.

Nelle IgA, oltre alla catena J, viene anche prodotto un ulteriore peptide, la
componente secretoria che serve a favorire la secrezione di questi anticorpi.
Le IgA vengono prodotte dai linfociti B che si trovano a livello delle zone linfoidi
dellapparato respiratorio, digerente, nella sottomucosa (es. placche del Peyer).
Le IgA sono le uniche capaci di legare il recettore poli-Ig che si trova sulla
parete baso-laterale delle cellule epiteliali. Tutte le volte che queste molecole si
legano al recettore vengono internalizzate in vescicole che attraversano tutta
la cellula per poi passare al polo opposto per liberare le IgA con la componente
secretoria nel lume. A questo punto le IgA svolgeranno la loro funzione:
saranno, ad esempio, in grado di bloccare il patogeno allesterno e ne
impediscono linternalizzazione.

La citotossicit cellulo-mediata prevede lintervento di cellule NK che hanno il


recettore Fc-gamma- III (CD16). Quando una cellula infettata viene riconosciuta
dalle IgG, le cellule NK legano il Fc e degranulano causando morte cellulare
attraverso un processo di apoptosi, perch rilasciano enzimi in grado di attivare
la cascata delle caspasi.
Poi abbiamo la citotossicit mediata dai granulociti eosinofili, anchessi con
capacit citotossiche, sono capaci di uccidere quando rilasciano i loro granuli.
Quando abbiamo infestazioni da parassiti vengono prodotte IgE che si
attaccano; vengono richiamati granulociti eosinofili perch i mastociti, che si
attivano, producono sostanze chemiotattiche e abbiamo il tentativo di
eliminazione di questi patogeni. I fagociti hanno diversi tipi di recettori, a
seconda delle cellule, con una diversa affinit.
Il microbo viene bloccato dagli anticorpi che ne impediscono lingresso nella
cellula che dovrebbe essere infettata.

Durante le risposte umorali avvengono dei cambiamenti nella struttura degli


anticorpi. Gli anticorpi che funzionano da recettori, una volta attivate le
risposte immunitarie, vanno incontro ad aumento dellaffinit per mutazioni
somatiche a livello delle regioni variabili sia della catena pesante che della
catena leggera. Quindi ci sono mutazioni puntiformi che avvengono durante lo
sviluppo e la crescita dei cloni che sottendono ad un aumento dellaffinit degli
anticorpi. laltro cambiamento, che avviene sempre nelle risposte umorali di
tipo secondario, quindi quando c una seconda risposta nei confronti di quel
patogeno il cambiamento di classe.

Maturazione dei linfociti, espressione e riarrangiamento dei geni per i recettori


degli antigeni
Questo repertorio di anticorpi, uno diverso dallaltro, in grado di riconoscere
qualsiasi determinante antigenico che entra nel nostro organismo.
Molti meccanismi utilizzati da BCR sono comuni anche a TCR.
Il recettore dei linfociti B viene prodotto durante la maturazione dei linfociti,
quindi la preparazione del recettore avviene negli organi linfoidi primari (per
quanto riguarda i linfociti B, dove tutto lo sviluppo avviene nel midollo osseo, si
verificher appunto nel midollo osseo). I linfociti B, come anche i T e tutte le
cellule del sangue, si originano da una cellula staminale totipotente, poi sotto
leffetto di particolari citochine, iniziano la differenziazione. I linfociti B si
generano da una cellula staminale emopoietica, la quale sotto effetto
soprattutto di IL-7 (fattore di crescita stimolante per le cellule staminali
ematopoietiche) va incontro ad espansione clonale, cio queste cellule si
dividono, si moltiplicano, proliferano e danno origine ad un elevato numero di
pro-linfociti. I pro-linfociti sono delle cellule che iniziano a riarrangiare i geni del
recettore per lantigene, cio cominciano a modificare le sequenze di DNA per
produrre un recettore in grado di riconoscere gli antigeni. Tutti questi
meccanismi avvengono in maniera casuale e indipendente dallantigene, le
cellule si stanno sviluppando allinterno del midollo osseo. Dal pro-linfocita B
inizia il riarrangiamento dei geni delle Ig e i primi geni che iniziano a
riarrangiare sono i geni delle catene pesanti. Se viene prodotta una catena
pesante funzionale, questa viene associata a un surrogato di catena pesante e
viene espressa sulla superficie di queste cellule che da pro- linfociti diventano
pre-linfociti, quindi non abbiamo ancora il riarrangiamento della catena
leggera. Se questo recettore, che deriva dal rimaneggiamento delle catene
pesanti, funzionante, riceve dei segnali di stimolazione: questi pre-linfociti
vanno di nuovo incontro a divisione e viene attivato il meccanismo per il
riarrangiamento della catena leggera. Se al termine di questa elaborazione si
forma una catena leggera funzionale, viene associata alla catena pesante che
si era riarrangiata precedentemente e si forma un recettore finito, quindi
costituito da catene pesanti e catene leggere funzionanti, che vengono
espresse sulla superficie. Questo il linfocita immaturo. In genere la catena
pesante che viene espressa la catena M, quindi sono le IgM.
A questo punto le cellule devono andare incontro ad una selezione perch il
recettore si formato in maniera del tutto casuale, non c stata selezione,
quindi si pu essere sviluppato qualsiasi tipo di combinazione. Si possono
essere sviluppate anche combinazioni della parte variabile che riconoscono
degli antigeni self, quindi assolutamente indispensabile a livello centrale che
avvenga una selezione che vada ad eliminare tutte quelle cellule pericolose per
lorganismo, in quanto potrebbero attaccare molecole self, andando a causare
malattie autoimmuni. Nel linfocita immaturo abbiamo quindi una grande
selezione: tutte le cellule in grado di riconoscere con molta affinit le molecole
self vengono delete, indotte in apoptosi. La maggior parte dei linf. che si sono
generati vengono deleti; sopravvivono soltanto quei linf. che non riconoscono
nessuna molecola self o riconoscono molecole self in maniera molto poco
affine, in maniera labile. I linf., a questo punto, che hanno avuto il contatto con
gli antigeni self, diventano quindi, quelli che hanno superato leducazione a
livello dei centri primari, dei linfociti maturi e quindi possono essere immessi in
circolo. Avranno il BCR sulla loro superficie che sar costituito in parte da delle
IgM, in parte da delle IgD. I linf. maturi dal sangue potranno passare
continuamente agli organi linfoidi secondari a verificare che non ci siano
antigeni specifici attirati e concentrati negli organi linfoidi secondari. Se
incontrano il loro antigene specifico abbiamo attivazione delle risposte
immunitarie con produzione di plasmacellule, la secrezione di anticorpi che
avranno la stessa specificit dei recettori di superficie, ma possono ad esempio
nella risposta secondaria modificare la classe. I meccanismi deputati a questi
eventi li vedremo nella prossima lezione.
IMMUNOLOGIA 27-10-2014 Lezione25

La volta scorsa avevamo parlato di come si formano gli anticorpi, di come si


forma il recettore e delle varie fasi di maturazione dei linfociti B. Abbiamo detto
che durante la maturazione si forma il recettore grazie a un meccanismo di
ricombinazione cromatica e che, successivamente, viene esposto sulla
superficie delle cellule. Dopo l'esposizione del recettore, sempre a livello del
midollo osseo, i linfociti B vanno incontro ad un processo di selezione che
consiste nell'eliminare le cellule che possono essere autoreattive, ovvero, in
grado di riconoscere le molecole self (appartenti all'organismo) e di
distruggerle. Tutte le cellule che superano questa selezione sono linfociti B
maturi, che vengono immessi nel circolo ematico e che possono passare dal
sangue agli organi linfoidi secondari per perlustrare il nostro organismo alla
ricerca dellantigene in modo da potersi attivare e dare origine a una risposta
immunitaria.

Oggi affronteremo i meccanismi coinvolti nel processo di produzione degli


anticorpi dei linfociti B, ovvero, di come si generano i cos detti BCR (B-cell
receptor), mentre, la maturazione dei linfociti T verr affrontata
successivamente, anche se molto simile a quella dei linfociti B.
Perci, come si generano i recettori per l'antigene? Rispondere a questa
domanda fu complesso per i ricercatori perch esistono particolari condizioni
da considerare. Intanto, vi l'esistenza, nell'anticorpo, di una parte variabile e
di una costante: il dominio variabile cambia da anticorpo ad anticorpo e invece
la parte costante uguale per tutti gli anticorpi che appartengono alla stessa
classe. Inoltre, nel nostro organismo, possono esistere almeno 10^9
(ultimamente ne sono stati registrati 10^11) anticorpi o recettori diversi: vi
una spiccata diversit e variabilit. Infine, esistono diversi isotipi con la stessa
specificit: abbiamo detto che nelle risposte secondarie la specificit
dell'anticorpo, cio la parte variabile, resta specifica per l'antigene, ma cambia
l'isotipo.
Furono pensati modelli genetici che potessero spiegare la formazione degli
anticorpi. Ne furono presentati due: la teoria germinale e la teoria della
variabilit somatica. La teoria germinale diceva che esiste un gene per
ciascuna diversa catena immunoglobulinica che il nostro organismo pu
produrre e che gran parte del repertorio lo ereditiamo dai nostri genitori.
Sembra quasi impossibile che possa essere vera questa ipotesi perch ci
dovrebbe essere un repertorio di 10^11 molecole diverse, ovvero, tutto il DNA
delle cellule.
La teoria della variabilit somatica diceva, invece, che esistono un numero
limitato di geni che codificano per le catene immunoglobuliniche, ma che
durante lo sviluppo, si modificano, vengono mutate potendo cos generare
molecole una diversa dall'altra. Per, anche tale ipotesi, non riusciva a spiegare
la grande variabilit degli anticorpi e soprattutto quegli scambi che ci sono tra
la catena variabile e quella pesante. La verit sta nel mezzo: stato proposto
nel 1976 da Tonegawa il modello genetico che sostiene che ciascuna regione V,
cio la parte variabile che cambia da anticorpo ad anticorpo, generata dalla
combinazione casuale di pi segmenti genici che noi ereditiamo dai nostri
genitori. Combinando questi segmenti genici in maniera casuale possiamo
generare un grande repertorio. Come fu dimostrata lipotesi? Tonegawa prese il
DNA di cellule somatiche o embrionali (non di origine linfoide), estrasse il DNA
e lo tratt con enzimi di restrizione che lo tagliarono in punti ben precisi e che
formarono frammenti di dimensioni costanti a meno che non ci fosse stata
un'alterazione della parte interna del frammento. Quindi, con un particolare
enzima di restrizione, si otteneva un frammento che andava da un segmento
genico variabile (V) a un segmento genico chiamato J e, nelle cellule non di
origine B, si formava un frammento di 6 kb. Questo risultato si poteva vedere
grazie a un Southern Blot: facendo quindi correre il DNA cos tagliato in un gel e
utilizzando una sonda che riconosceva il segmento J si formava una banda a 6
kb. Se invece veniva utilizzato DNA proveniente da linfociti B immaturi, con lo
stesso enzima di restrizione, questo frammento da 6 kb diventava di 2.5 kb. Se
ne dedusse che le cellule che stavano diventando linfociti B avevano
riarrangiato il segmento genico V verso il segmento genico J eliminando il DNA
interposto a questi due segmenti. Durante la maturazione dei linfociti B, i
diversi geni che codificano per la parte variabile, vengono avvicinati in maniera
casuale per formare il dominio variabile dell'anticorpo. Se analizziamo linfociti B
ancora pi maturi vediamo che addirittura l'enzima di restrizione forma
segmenti pi piccoli (1.5 kb) e quindi si vede che c stato, ulteriormente, un
altro avvicinamento dei due segmenti genici con eliminazione di DNA
interposto. Questa fu la prima dimostrazione di come avveniva il
riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline.
Per concludere: le cellule embrionali hanno i geni che codificano per la parte
variabile e la regione costante disposti molto lontani sul DNA e, durante lo
sviluppo delle cellule B, i geni per la zona variabile si ricombinano e si
avvicinano a i geni della parte costante.

Successivamente si dimostrato come sono disposti e quali sono i geni che


codificano per le immunoglobuline. Sono una famiglia costituita da diversi
segmenti genici (sequenze codificanti separate da sequenze non codificanti).
Per la catena delle immunoglobuline vediamo 3 loci che codificano per le
diverse catene (la catena pesante e per le due leggere) e ogni locus si trova su
un cromosoma diverso. Il locus per la catena Lambda lo troviamo sul
cromosoma 22, per la catena K sul cromosoma 2 e per la catena pesante sul
cromosoma 14. Per la catena leggera lambda abbiamo una trentina di segmenti
genici chiamati V che si devono, per formare la parte variabile, associare grazie
a un processo di ricombinazione con un segmento genico J che troviamo
separato da V, vicino alla parte costante: questi segmenti genici sono separati
tra di loro da lunghe sequenze di DNA intronico che non viene codificato. Per la
catena K c' una disposizione diversa: abbiamo segmenti genici V e J che
codificheranno una volta che verranno ricombinati in maniera casuale.
La catena pesante pi complessa: vi l'aggiunta, per la formazione del
dominio variabile, oltre che dei segmenti genici V e J, di un certo numero di
segmenti chiamati "di diversit", che sono i segmenti D.
Per avere il dominio variabile di una catena pesante abbiamo due
ricombinazioni: una
prima ricombinazione DJ (viene scelto
casualmente un gene J e avvicinato a un gene D) e
poi una ricombinazione che unisce al segmento DJ
appena formato un segmento genico V scelto
in maniera casuale. Da questa ricombinazione si
forma la parte variabile che poi viene unita ai
segmenti genici costanti.

Questi segmenti genici costanti possono essere la parte costante Mu che si


forma sempre nelle IgM e quindi nelle risposte primarie oppure, nelle risposte
secondarie, la parte costante M verr sostituita dalla parte costante delle altre
diverse classi.
Possono essere presenti diversi domini costanti.

Adesso andiamo a vedere il numero dei vari segmenti genici che troviamo nelle
catene (leggere o pesanti) i quali vanno a formare la regione di 110
amminoacidi che varia da anticorpo ad anticorpo.
Nella catena leggera K esistono almeno 40 segmenti genici che codificano per
la parte variabile V, non ci sono i segmenti di diversit D (poich caratterizzano
solo le catene pesanti) e ci sono 5 segmenti di giunzione J. Avremo quindi la
ricombinazione tra 40 e 5.
Per la catena Lambda abbiamo 30 segmenti variabili V e solo 4 segmenti di
giunzione J.
La catena pesante pi complessa perch abbiamo i segmenti di diversit: ci
sono quindi circa 40 segmenti V, 25 segmenti D e 6 segmenti di giunzione J.

Quali le modali p
determin la diversi
t d
er
repertori
are t el
o?
Il meccanismo principale che crea la
maggiore variabilit la "diversit combinatoria"
e quindi il processo dato dalla ricombinazione
somatica di diversi segmenti genici
(VJ o VDJ).
In secondo luogo abbiamo una diversit giunzionale: nei punti dove avviene
una ricombinazione possono essere aggiunti amminoacidi che creano diversit.
Infine una terza diversit per creare variabilit la diversit nell'associazione
tra la catena pesante e la catena leggera le quali si ricombinano tra loro, ma
ogni cellula produce una sua catena pesante e una sua catena leggera.
Tutti questi processi avvengono, nella prima fase della maturazione, all'interno
degli organi linfoidi centrali: midollo osseo per quanto riguarda i linfociti B e
timo per i linfociti T.
Esiste un ulteriore processo che crea variabilit nel repertorio anticorpale,
ovvero, lipermutazione somatica caratterizzata da mutazioni puntiformi a
livello della regione variabile degli anticorpi, specialmente nelle zone di
ipervariabilit. L'ipermutazione somatica viene indotta al livello degli organi
linfatici periferici nelle risposte secondarie quando vi il contatto con un
antigene estraneo o quando vi cooperazione con i linfociti T helper che
producono citochine le quali vanno a favorire la maturazione dell'affinit
tramite questo processo.

Torniamo a parlare del riarrangiamento della catena pesante Mu.


Il primo evento durante la maturazione dei linfociti il riarrangiamento della
catena pesante. Ad esempio abbiamo a disposizione diversi segmenti genici e
quindi, nella disposizione del DNA germinale, vediamo che ci sono 40 segmenti
V, 25 D e 6 J disposti lungo il cromosoma 14 e separati tra di loro da DNA non
codificante a cui seguono esoni per la parte costante.
- La prima cosa che avviene un primo riarrangiamento che si verifica grazie
all'avvicinamento di un segmento genico J ad un segmento D. Questo processo
del tutto casuale perch viene scelto uno qualsiasi di questi geni, vengono
avvicinati e il DNA posto tra i due segmenti genici viene eliminato. Rimane solo
un segmento genico DJ che fa parte della zona variabile dell'anticorpo.
-Dopo la prima ricombinazione segue una seconda ricombinazione e, questo
frammento che si riarrangiato (DJ), deve essere avvicinato e legato a un
segmento V in maniera assolutamente casuale. Anche stavolta la parte di DNA
frapposta ai due segmenti viene tagliata. Si viene quindi a formare il segmento
ricombinato VDJ.
- A questo punto inizia la trascrizione e si forma un trascritto primario che
trascrive VDJ (per la parte variabile) e i segmenti genici per Mu.
Successivamente questo trascritto primario va incontro a un processo di
splicing (vengono eliminati gli introni e le parti non codificanti) e si forma RNA
messaggero che codifica per la catena pesante Mu.
Durante la maturazione questo segmento viene tradotto in proteina e nei
linfociti pro-B , se questa proteina funzionante, viene associata a una catena
che mima la catena leggera ed esposta con essa come recettore sulla
superficie del linfocita B.
A questo punto pro-B, che riceve segnali di attivazione dati dal fatto che la
catena funzionale, inizia a proliferare e viene indotto il riarrangiamento della
catena leggera. Quindi, si deduce che solo le cellule che formano catene Mu
funzionanti vengono stimolate e possono continuare nella maturazione.

-Viene stimolato il riarrangiamento della catena leggera. Nella catena leggera


abbiamo solo la ricombinazione tra J e V. Un gene J casuale viene avvicinato a
V, si forma il segmento di ricombinazione, abbiamo la trascrizione nel trascritto
primario, un processo di splicing e si forma la catena leggera che verr
associata alla catena pesante prodotta precedentemente. Quindi, finalmente
avremo la formazione di un anticorpo funzionante che viene espresso sulla
superficie del linfocita B.

Il Linfocita B immaturo e deve andare incontro a selezione positiva e negativa


in modo che non si possano generare dei cloni autoreattivi (che riconoscono
come estranee cellule del proprio organismo). Se supera questo esame le
cellule non autoreattive esporranno sulla superficie BCR con la stessa
specificit. Saranno IgM o IgD che potranno essere secrete e mandate in circolo
per svolgere la loro funzione immunitaria.

Questo processo molto ben ordinato e regolato perch dobbiamo evitare che
sulla stessa cellula si formino anticorpi con diversa specificit.
Come possibile questo?
Ci sono delle regole ben precise: quando il linfocita B nella fase pro-B inizia a
riarrangiare la catena pesante Mu, gli riarrangiamenti avverranno solo su un
allele e l'altro verr bloccato. Se questo riarrangiamento VDJ funzionante e
non ha problemi, il linfocita B esprimer sulla sua superficie un recettore e
passer nella fase pre-B. Una volta che viene attivato e espone sulla superficie
la catena, andr a inibire il riarrangiamento dell'altro allele facendo s che
questo non possa produrre VDJ. Per questo motivo ogni linfocita B ha un'unica
specificit.
Se, invece, sul primo allele il riarrangiamento VDJ non ha funzionato allora
viene stimolato il riarrangiamento sul secondo allele. In questa maniera si d
un'opportunit in pi per non perdere la cellula. Se funziona questa seconda
possibilit viene espresso il recettore con il frammento della catena leggera
surrogato sul linfocita Pro-B. Se, invece, non funziona anche il secondo VDJ
allora la cellula va in apoptosi e non possibile rimaneggiare.
Questo meccanismo di controllo del riarrangiamento e quindi l'inibizione
dell'allele non utilizzato si chiama "esclusione allelica" ed importante per
impedire la produzione di anticopri con la stessa specificit.

Una volta che Pre-B ha espresso la catena Mu funzionante, va incontro a


proliferazione e viene sia bloccato il riarrangiamento sull'altro allele che
attivato il riarrangiamento della catena leggera.
Adesso viene riarrangiato il gene VDJ per la catena K e ci sono le stesse regole
descritte precedentemente: viene riarrangiato un primo allele, se funziona
viene espresso sulla superficie, allora abbiamo un recettore completo
funzionante e quindi il linfocita B maturo. Se non funziona il primo allele viene
indotto il secondo, se non funziona neanche il secondo allele si passa
all'attivazione del riarrangiamento della catena Lambda sul primo allele come
catena leggra. Se funziona si avr un BCR che contiene la catena Lamda, se
non funziona neanche il riarrangiamento di VDJ del secondo allele la cellula
muore. Questa la seconda modalit di controllo e viene chiamato esclusione
isotipica e riguarda le catene leggere.
Recentemente si osservato che anche queste cellule che hanno utilizzato
tutte le loro possibilit per produrre molecole utili al sistema immunitario
possono comunque andare incontro a un processo di editing del recettore.
Infatti ci sono ancora tutti gli enzimi implicati nel riarrangiamento che possono
"riacchiappare" queste cellule e produrre un riarrangiamento dei diversi alleli
per dare un'ultima possibilit a cellule che dovrebbero andare incontro ad
apoptosi.

Cosa viene riconosciuto dagli enzimi della ricombinazione per favorire


l'avvicinamento dei diversi segmenti genici con l'eliminazione del DNA
interposto? Esistono delle sequenze segnale di ricombinazione che guidano e
regolano in maniera precisa il riarrangiamento. Si chiamano sequenze
nucleotidiche RS e sono costituite da sequenze di 7 nucleotidi e 9 nucleotidi
palindromici molto ben conservati separati da sequenze non conservate
spaziatrici di 12 o 23 paia di basi. Quindi a valle dei segmenti genici
troviamo la sequenza eptamero-23pb-nonamero oppure eptamero-12 pb-
nonamero. Queste sono le sequenze che poi sono riconosciute dagli enzimi
coinvolti nel processo di ricombinazione. Perch sono 12 o 23 le basi che
separano eptameri e nonameri? Queste corrispondono ai giri del DNA: quando
abbiamo 23 paia di basi che separano gli eptameri dai nonameri vi sono 2 giri
della molecola di DNA e 1 giro quando vi sono 12 paia di basi.
Immaginiamo che ci sia il segmento genico V: abbiamo a valle un eptamero
palindromico e ben conservato, poi la sequenza di 23 nucleotidi meno
mantenuta del precedente e infine un nonamero ben conservato. Invece per il
gene J abbiamo 12 nucleotidi non conservati e 9 ben conservati.
Adesso verranno avvicinati questi due segmenti V e J, successivamente degli
enzimi riconoscono gli eptameri legati ai geni che devono essere avvicinati e
quindi potranno tagliare le parti di DNA interposto.
I geni che possono essere avvicinati devono avere sempre in sequenza
l'eptamero, il nonamero e questo gruppo di 23 o 12 basi interposte. Un
segmento genico deve avere i nucleotidi interposti in numero di 23, e l'altro in
numero di 12. Si parla della "regola del 12 e 23" che dice che non possono
essere mai avvicinati dei segmenti genici che hanno come nucleotidi interposti
due 23 o due 12; per questo motivo nelle catene pesanti abbiamo sempre una
prima ricombinazione DJ dove J ha uno spaziatore 12 e, successivamente, viene
associato MuH che ha uno spaziatore 23. Questi sono meccanismi per
controllare che il riarrangiamento avvenga in maniera ordinata e corretta.

Esistono due enzimi, RAG1 e RAG2, che sono espressi soltanto nei linfociti in
fase di maturazione e fanno parte del complesso enzimatico responsabile della
ricombinazione VDJ. Questi enzimi riconoscono gli eptameri e i nonameri
separati da 12 e 23 e quindi riavvicinano due segmenti genici nella catena
leggera VJ, formano un loop con tutto il DNA frapposto e tagliano liberando
questo DNA circolare all'interno del citoplasma della cellula.
Una volta che RAG1 e RAG2 hanno tagliato il DNA, all'estremit delle sequenze
geniche V e J si formano dei legami fosfodiesterere e quindi una struttura a
forcina chiusa cos che non si lasci il DNA a singola catena libero. Intervengono
quindi degli enzimi di riparazione del DNA, come q70 e q80 che riconoscono la
rottura, si legano all'estremit del DNA tagliato dove sono presenti le forcine e
richiamano una proteina chinasi DNA dipendente (DNAPK). Questa proteina
attiva un altro enzima: Artemis che una endonucleasi che si occupa di
tagliare le forcine formando sequenze di DNA a singolo filamento. A questo
punto devono essere chiuse le rotture presenti sul filamento. In questi siti
interviene un enzima attivo solo nei linfociti B, la terminal deossinucleotidil
transferasi (TdT), che aggiunge nucleotidi in maniera casuale all'estremit dei
filamenti che sono stati tagliati quindi nei punti di giunzione tra i segmenti
genici; in questo caso parliamo "diversit giunzionale".
I frammenti di DNA formati vengono legati tra di loro grazie all'intervento di
una DNA ligasi, si riforma una doppia elica di DNA e quindi un gene che potr
essere tradotto in mRNA. I punti di taglio dove sono stati aggiunti casualmente
i nucleotidi le chiameremo zone di ipervariabilit (CDR3, CDR1)
La diversit giunzionale pu avvenire anche in maniera diversa in processi di
escissione di nucleotidi.
Variabilit per escissione: poich sulle estremit V e J possono intervenire
anche delle endonucleasi che vanno a tagliare una tripletta, al momento della
traduzione, abbiamo una sostituzione con un altro amminoacido. In tutti questi
processi possiamo avere delle modificazioni di lettura per cui si possono creare
triplette che non possono poi essere tradotte in amminoacido.

Infine un altro tipo di diversit la diversit di associazione tra la catena


pesante e quella leggera. Ogni cellula va a riarrangiare una sua catena pesante
e una sua catena leggera e, unendole, abbiamo un altro fattore di diversit.

Sono stati fatti dei conti a seconda del riarrangiamento dei segmenti genici
delle diverse catene e si visto che esistono circa 6000 combinazioni per H,
200 per K e 120 per Lamda. L'associazione tra H e L ha 6000x320=1.9 x 10^6
possibilit diverse di produrre anticorpi diversi, poi abbiamo la variabilit
giunzionale che circa altre 3x10^6 quindi ipoteticamente possiamo avere una
diversit totale durante questi primi meccanismi di 5x10^13 molecole diverse.

Negli organi linfoidi periferici nel momento del contatto con l'antigene questi
anticorpi possono andare incontro a ipermutazione somatica dipendente dalla
attivazione dei linfociti B e dalla cooperazione dei linfociti T helper che
producono determinate citochine. Queste citochine possono favorire
l'attivazione della cellula e soprattutto l'attivazione dell'enzima AID che la
citidina deaminasi indotta dall'attivazione. Le persone alle quali manca questo
enzima non avranno il cambio di classe quindi produrranno solo IgM e anticopri
con la stessa affinit. Quindi, la deaminasi AID durante la proliferazione delle
cellule, soprattutto nella ipermutazione somatica, va a sostituire al livello della
parte variabile del DNA le citidine in uridine e questo comporta una modifica
della sequenza del DNA. Poich interverranno meccanismi di riparazione che
sostituiranno le uridine con altri nucleotidi si creer un punto di diversit.

Naturalmente tutte le cellule che vanno incontro a questo meccanismo di


ipermutazione somatica dovranno essere selezionate al livello dei centri
germinativi degli organi linfoidi dove sono presenti delle cellule che sono le
cellule dendritiche follicolari che mostrano l'antigene ai linfociti B che hanno
modificato per mutazione puntiforme il loro recettore. Il recettore viene
"provato" e le cellule che si legano con pi affinit procedono nell'attivazione.
PATOLOGIA Lezione 35 06.11.2014 Prof.ssa Monti

Le tre vie di processazione degli antigeni

Abbiamo iniziato a parlare della presentazione dell'MHC di classe I e abbiamo


visto quali sono i compartimenti interessati, abbiamo detto degli antigeni dei
patogeni intracellulari che la cellula non distingue che siano delle molecole che
non appartengono al suo contenuto e quindi vengono trattate come se fossero
delle proteine self, quindi vengono eliminate e rese visibili al proteasoma. Il
proteasoma abbiamo detto questo complesso multifunzionale, non fa altro
che tagliare i peptidi in dimensioni giuste per essere inseriti nella tasca
dell'MHC; quindi questo taglio avviene a livello del citoplasma. Abbiamo detto
che nelle cellule possono esistere due tipi di proteasoma: il primo il
proteasoma classico che quello che si trova normalmente in tutte le cellule,
il secondo tipo l'immunoproteasoma, che, sotto l'effetto di citochine, tra cui
l'interferone e le citochine infiammatorie, sostituisce alcune subunit con
altre e diventa capace di tagliare i peptidi proprio a livello di quegli aminoacidi
capaci di legarsi nella tasca del complesso maggiore di istocompatibilit
di classe I. Quindi una sorta di regolazione. I peptidi prodotti sono migliori. I
peptidi vengono rilasciati dall' immunoproteosoma nei pressi del reticolo
endoplasmatico, ma si trovano nel citoplasma, quindi assolutamente
indispensabile che i peptidi vengano dal citoplasma captati e portati dentro al
reticolo endoplasmatico dove in maniera costitutiva le molecole MHC di
classe I vengono sintetizzate.E' indispensabile che siano presenti due
particolari tipi di trasportatori di peptidi che si chiamano TAP1 e TAP2 che sono
inseriti nella membrana del reticolo endoplasmatico. Questi due trasportatori
sono ATP dipendenti, quindi la funzione di trasporto consuma ATP, quindi
consuma energia e questi peptidi per essere riconosciuti si devono associare a
delle proteine come le heat shock protein, proteine trasportatrici che aiutano
questo passaggio all'interno del reticolo endoplasmatico. Vengono portati
all'interno del reticolo peptidi di dimensioni di 8-13 aminoacidi, l'ideale per
l'inserimento nella tasca. Se entrano dei peptidi leggermente pi grandi o
questi che entrano non sono adatti, all'interno del reticolo endoplasmatico
possono essere presenti delle proteasi che fanno un ulteriore taglio per riuscire
a preparare dei peptidi idonei da inserire nella tasca.
Slide: Vediamo la I via di processazione degli antigeni citosolici. L'azione
dell'immunoproteosoma che prepara i peptidi e questi peptidi vengono
internalizzati dentro al reticolo endoplasmatico. TAP1 legato a una molecola
chiamata tapasina e questa proteina localizzata l perch servir a
stabilizzare la molecola dell'MCH che nel frattempo viene sintetizzata e a
avvicinarla alla zona dove sono presenti TAP1 e TAP2 per favorire il legame del
peptide antigenico. Nel frattempo all'interno del reticolo abbiamo la sintesi
della catena dell' MHC di classe I che viene stabilizzata, gli viene data una
conformazione grazie all'aiuto della caudexina, che la regge e la protegge,
viene sintetizzata contemporaneamente la 2 microglobulina, che l'altra
componente della molecola del complesso maggiore di istocompatibilit che si
associa quindi alla catena dell'MHC e la caudexina viene sostituita dalla
calreticolina che un'altra proteina che sempre aiuta il mantenimento, la
struttura della molecola MHC.Poi abbiamo anche l'intervento di un'altra
proteina l'erp57 che favorisce l'avvicinamento di questo complesso verso la
zona dove ci sono TAP1 TAP2 e dove c' anche la tapasina.A un certo punto
abbiamo la formazione di questa struttura formata da tutte queste proteine e
l'erp57 proprio favorisce l'inserimento dei peptidi che si sono generati, che
sono entrati nel reticolo endoplasmatico.Al termine di tutta questa elaborazione
abbastanza complessa abbiamo un MHC di classe 1 che ha legato il peptide
antigenico, se questo avvenuto e si stabilizzata, un trimero, questa
molecola pu abbandonare il reticolo endoplasmatico e attraverso il Golgi e le
vescicole di esocitosi essere trasportata sulla superficie della cellula per
presentare questo peptide antigenico al linfocita T citotossico.
Non sempre per ci possono essere dei peptidi che vengono riconosciuti
dall'MHC1. Che fine far l'MHC che non lega nessun peptide antigenico? Non
si stabilizza e andr incontro a degradazione.
Le cellule nucleate esprimono sempre l'MHC1 anche quando non ci sono delle
infezioni in corso. Quindi sulla superficie delle cellule all'interno della tasca
dell'MHC1 chi ci sar? Ci deve essere per forza un peptide, sar un peptide
(..?). Abbiamo detto che il meccanismo con cui vengono preparati i peptidi il
meccanismo classico di rielaborazione delle proteine self: quando non sono ben
formate, quando sono degradate, quando sono invecchiate, la cellula non
distingue self da non self, quindi nella cellula noi avremo, quando non c'
l'infezione, degli MHC che sopprimono, hanno dentro dei peptidi, delle proteine
self. Perch non si attiva la risposta immunitaria, perch non si attivano i
linfociti T citotossici? Vengono uccisi. Durante tutta la maturazione c' una
caratteristica principale del sistema immunitario che i linfociti T durante la
maturazione vengono selezionati, vengono eliminate tutte quelle cellule che
potrebbero riconoscere peptidi self all'interno dell'MHC.

Quando naturalmente c' una rottura invece della tolleranza, ci sono delle
anomalie, ci sono delle risposte anomale, delle risposte patogenetiche, allora il
sistema immunitario si attiva e possiamo avere in questo caso una malattia
autoimmune come potrebbe essere il diabete insulinodipendente.
Questa la via principale con cui vengono processati gli antigeni citosolici.
Poi c' una II via di processazione che tipica solo delle cellule
dendritiche. Si osservato che le cellule dendritiche possono presentare dei
peptidi antigenici ai linfociti T citotossici anche se la cellula non infettata, o
meglio quando questi antigeni arrivano attraverso fagocitosi o
internalizzazione. Nella II via la cellula dendritica fagocita, internalizza, quindi
si tratta di patogeni extracellulari, si tratta di cellule apoptotiche infettate, o di
cellule necrotiche infettate che vengono fagocitate, internalizzate e quindi qui
ci aspetteremo che parte di questi peptidi antigenici vengano presentati
attraverso l'MCH di classe I, invece per le APC succede questo ma pu
succedere anche che proprio l'internalizzazione dentro gli endosomi, non si sa
ancora, non ben conosciuto, ancora oggetto di studi, parte di queste
proteine che sono state internalizzate sfuggono a queste vescicole e quindi
passano nel compartimento citoplasmatico, quindi seguono, entrano nella via
dell' MHC di classe 1, quindi queste proteine verranno ordinate e quindi
riconosciute dal proteasoma o dall'immunoproteasoma e quindi presentati
questi peptidi sulla superficie dell'APC come con l'MHC I per attivare i
citotossici. Questo tipo di comportamento si chiama cross- presentazione ed
caratteristico proprio delle cellule dendritiche. Le cellule dendritiche anche
se non sono infettate possono per favorire, attivare i linfociti T citotossici
attraverso questo meccanismo di cross- presentazione, ed molto utile ad
esempio per eliminare le cellule tumorali. Queste APC possono fagocitare
anche le cellule neoplastiche, magari necrotiche morenti o presentarle e
creare quindi dei cloni, dei linfociti T citotossici, che attaccano le cellule che
esprimono determinati antigeni.
Slide Qui rappresentata la cross-presentazione: abbiamo la cellula infettata
dai virus o una cellula tumorale che viene captata, catturata da queste cellule
APC dendritiche, poi attraverso questo processo di cross presentazione,
abbiamo la possibilit di attivare linfociti T virus specifici, i quali verranno poi
stimolati, daranno origine a un clone virus specifico che andr in periferia a
cercare e a uccidere le cellule che sono infettate da quei virus ed
esprimeranno le cellule di quel determinato peptide antigenico caratteristico
del virus. Queste cellule., le APC abbiamo visto durante il loro percorso per
presentare il peptide antigenico ai linfociti T durante la maturazione
aumentano notevolmente l'espressione delle molecole del complesso
maggiore di istocompatibilit di classe 1 sotto l'effetto di citochine
proprio per favorire al meglio la presentazione e stimolare questa via di
presentazione. Le cellule dendritiche sono particolarmente efficienti oltre che
per presentare gli antigeni esogeni anche presentare antigeni attraverso
questa via di cross- presentazione. Solo le cellule dendritiche sono in grado
di presentare questi antigeni endocitati dall'esterno anche attraverso la via
citosolica (..?) peptide MHC classe I.
Quindi la cross-presentazione porta alla generazione di risposte T
citotossiche contro virus che non infettano le cellule dendritiche ma servono
solo a stimolare lo sviluppo del clone virus specifico che diventer il clone
effettore che andr in periferia.
Naturalmente tutti questi sistemi si sono evoluti proprio per combattere virus
e patogeni. Dall'altra parte anche i virus ed i patogeni avranno cercato dei
metodi per cercare di non attivare il sistema immunitario e poter quindi
moltiplicarsi nelle nostre cellule. Ci sono infatti alcuni virus che evadono il
sistema proprio inibendo o bloccando la presentazione degli antigeni ad
esempio via MHC1.
Slide In queste diapositive sono rappresentati alcuni tipi di peptidi, di molecole
che sono prodotte da alcuni virus per inibire o bloccare la via di presentazione.
Ad esempio abbiamo alcuni virus che producono delle sostanze che vengono
chiamate evasive US6 e ICP47 che praticamente all'interno del reticolo
endoplasmatico vanno a bloccare la presentazione dell'antigene, prevenendo il
movimento dei peptidi, cio bloccano l'ingresso dei peptidi citoplasmatici
all'interno del reticolo endoplasmatico, cio fanno una sorta di tappo, quindi i
peptidi antigenici di origine virale non riescono ad entrare nel reticolo e quindi
non vengono associati alle molecole MHC di classe 1 quindi non si former
nessun trimero e quindi l'MHC verr degradato. Oppure abbiamo la proteina
E19 dell'adenovirus che compete con la Tapasina, che si associa sempre a
TAP e quindi anche in questo caso abbiamo una inibizione del caricamento del
peptide sull' MHC nascente che si sta formando e quindi chiaro che in questo
caso il virus sopravviver e potr anche attaccare altre cellule, perch non si
sviluppa mai un clone di linfociti T citotossico specifico per quel virus. Il
citomegalovirus poi ricchissimo di queste strategie che eludono l'attivazione
dei linfociti T citotossici.
Slide: per esempio vediamo la proteina OS11 che si associa a un'altra proteina
che si chiama verdina(?) che causa la dislocazione dell'MHC nascente e
favorisce, quindi impedisce di fatto la formazione dell 'MHC,che quindi non
forma il trimero e va incontro a degradazione. Questi sono alcuni esempi, ma
vedete ce ne sono moltissimi altri: i virus hanno adottato moltissime strategie
che intervengono proprio in questi processi. Ci sono anche molte molecole che
controllano anche la funzionalit del proteasoma, dell'immunoproteasoma,
ne bloccano l'attivit e quindi non vengono fatti i peptidi.

Slide: qui sono molecole che bloccano soprattutto le Tap e la formazione del
polimero.
L'ultima cosa, abbiamo parlato che c'era una III via di presentazione degli
antigeni ai linfociti, era la via attraverso il CD1, che era una sorta di molecola
del complesso maggiore di istocompatibilit che non era una classica forma, i
geni del CD1 non codificano nel locus dell'MHC e sono in grado queste
molecole di presentare i lipidi ai linfociti. Come avviene questo processo?
Intanto le molecole CD1 sono delle proteine, quindi vengono sintetizzate a
livello del reticolo endoplasmatico, e qui la catena si associa alla
2microglobulina, si forma anche in questa situazione una molecola costituita
da due componenti. Sempre all'interno del reticolo endoplasmatico sembra,
sono studi nuovi, che la molecola CD1 venga associata a dei lipidi endogeni.
Quindi all'interno di questa tasca particolare che idrofobica, quindi pu legare
i lipidi, vengono inseriti dei lipidi endogeni, si forma questo trimero, quindi la
conformazione stabilizzata e dal reticolo endoplasmatico passa al Golgi e poi
alle vescicole di esocitosi, il CD1 cos composto viene espresso sulla superficie
e resta sulla superficie per un determinato tempo. Successivamente la struttura
del CD1 viene di nuovo internalizzata ed entra nel compartimento vescicolare
dell'endosoma. Che cosa avviene all'interno di queste vescicole? Il CD1 viene
liberato del lipide endogeno e viene sostituito con un lipide che invece ha
unorigine non interna della cellula che pu derivare dalla processazione di un
patogeno oppure di patogeni che vivono all'interno della cellula e quindi questi
lipidi derivati dal patogeno vengono inseriti nella tasca del CD1 che di nuovo
viene riportato sulla superficie della nostra cellula. Lei pu quindi presentare
questo lipide extracellulare di origine quindi patogeno ai linfociti. Seguono
questa via di presentazione alcuni tipi di micobatteri, come il micobatterio della
tubercolosi e anche alcuni tipi particolari patogeni come la leishmania. Per
questo CD1 presenta questi lipidi attraverso questo complesso non ai linfociti T
e classici ma a una particolare sottopopolazione che si chiamano NKT che
sono dei linfocitiT con caratteristiche simili all'NK oppure ai linfociti T che
sono sempre un'altra sottopopolazione che hanno un recettore molto
particolare che presenta meno variabilit di riconoscimento rispetto agli altri
linfociti T. Negli ultimi anni si evidenziata questa III modalit di
presentazione.
Slide: questo come avviene il contatto e l'attivazione del linfocita T.
Naturalmente non partecipano a questo legame tra APC e linfociti T diverse
molecole. Il primo riconoscimento fondamentale il TCR: deve riconoscere il
peptide e l'MHC rispettivo, se CD4 MHC di classe 2 se CD8 MHC di
classe 1. Sempre legato al TCR presente sempre un corecettore che pu
essere CD4 o CD8 e questi due recettori rafforzano il legame del TCR perch
abbiamo detto si legano alla componente della molecola del complesso
maggiore di istocompatibilit, quella che non cambia: l' 3 o 2. Poi
naturalmente oltre a questo primo segnale di attivazione per i linfociti T devono
intervenire altre molecole stimolatorie che danno il 2 segnale di attivazione.
Anche i linfociti T possono entrare in ciclo e moltiplicarsi solo se hanno un
doppio segnale di attivazione. Per quanto riguarda il doppio segnale di
attivazione per i linfociti T il legame tra il CD28 che presente sui linfociti T
che una molecola con un recettore importantissimo che si lega sull'APC ai
cosiddetti B7. Questo il II riconoscimento, legame che deve avvenire, a
questo punto parte la cascata di trasduzione del segnale di attivazione dei
linfociti T, quindi queste sono le interazioni. Questi naturalmente sono i segnali
pi importanti, poi abbiamo tutta una serie di altre molecole di adesione che
comunque sono utili per mantenere queste cellule vincolate finch si attivi la
cascata di trasduzione del segnale. Questa slide era solo per mostrare quante
molecole particolari siano coinvolte in questo riconoscimento, che servono
proprio a favorire la trasduzione del segnale. Vediamo ci sono molte moltissime
molecole di adesione e altre molecole che saranno spiegate nelle prossime
lezioni. Questa unione tra le cellule chiamata sinapsi immunologica,
proprio per questa complessit presente. Al centro della parte pi centrale,
quella fondamentale, abbiamo il riconoscimento specifico del TCR con le
molecole costimolatorie e poi attorno, pi perifericamente, abbiamo tutte
queste altre molecole di adesione che servono a mantenere il legame e
costituiscono questa sorta di sinapsi immunologica.
Ultima cosa: esistono delle molecole che vengono prodotte da virus, che
vengono chiamate superantigeni. Sono molecole capaci di legarsi all'MHC e
a TCR in maniera anomala all'esterno e favoriscono l'attivazione dei linfociti T e
creano quindi un'espansione. Quindi il riconoscimento, l'attivazione non
avviene attraverso il riconoscimento specifico del TCR con l'MHC e il peptide,
ma abbiamo questo superantigene, questa proteina che si lega esternamente
alla catena del TCR e attiva comunque il linfocita T e da origine
all'espansione clonale. Superantigeni esogeni batterici sono ad es ... dello
stafilococco che d .......... dentale oppure la tossina 1 che d la sindrome da
shock tossico proprio perch hanno la capacit di attivare in maniera massiva i
linfociti T perch si legano direttamente all'MHC e al TCR.d8d
PATOLOGIA Lezione 37 10.11.2014 Prof. Daniela Monti

VIE E MECCANISMI DELLA RECLUTAZIONE E DELLHOMING


(ACCASAMENTO) LINFOCITARIO

Vi ricorderete che una caratteristica fondamentale delle cellule del sistema


immunitario la motilit: la capacit dei linfociti di perlustrare continuamente
il nostro organismo per andare ad individuare gli antigeni. Una volta che i
linfociti maturano negli organi linfoidi primari vengono immessi in circolo e
per tutta la loro vita continuano a circolare, proprio allo scopo di individuare
gli antigeni extracellulari. Una volta che li hanno individuati vi si legano e
possono dare origine alle risposte immunitarie con lespansione clonale e con
la produzione di cellule effettrici che dovranno, dagli organi linfoidi secondari,
dirigersi in periferia dove c lattacco da parte dei patogeni.
Questo processo di circolazione chiamato HOMING LINFOCITARIO ed
controllato e regolato da tutta una serie di molecole che adesso vedremo.
Quindi, finch i linfociti non vengono attivati, ricircolano continuamente in
tutto lorganismo, proprio al fine di farsi trovare in un tessuto in cui potrebbe
avvenire la captazione dellantigene. Questo sistema di traffico definito
appunto TRAFFICO LINFOCITARIO.
La ricircolazione, come detto, continua finch non abbiamo il contatto con
lantigene. Avviene cos il cos detto priming ed i linfociti vergini divengono
linfociti effettori.

I linfociti sono prodotti negli organi primari (T nel Timo, B nel Midollo Osseo) e
poi vengono immessi nel torrente circolatorio. Dal sangue queste cellule
possono poi passare passano nei linfonodi, attraverso le venule post-capillari
ad endotelio alto. Questultimo passaggio regolato da una serie di molecole
apposite. [A tal proposito sono stati studiati sia linfociti B che linfociti T, ma
questi meccanismi sono meglio conosciuti per quanto riguarda i linfociti T;
pertanto parleremo soprattutto dellhoming dei linfociti T] Quindi i linfociti T
(1) passano attraverso le venule post-capillari ad alto endotelio, (2) vanno
nella zona paracorticale a loro adibita e (3) qui perlustrano alla ricerca di un
APC che gli presenti un antigene specifico. Se questo non avviene (4) il
linfocita T fuoriesce dal linfonodo attraverso il linfatico efferente e continua la
propria circolazione negli altri linfonodi fino ad arrivare attraverso la linfa nel
dotto toracico per poi ritornare al circolo sanguigno.
Durante questo percorso pu succedere che, in qualche organo linfoide
secondario, ci sia (5) lincontro con una APC che mostri lantigene. A questo
punto il linfocita T si blocca allinterno del linfonodo e l riceve dei messaggi di
attivazione. Come sapete, (6) dopo il riconoscimento abbiamo una fase di
espansione clonale: ovverosia la cellula attivata va incontro ad una serie di
divisioni cellulari e si formano tantissime copie della cellula originale. (7)
Questi cloni antigene-specifici si trasformano poi in cellule effettrici che
abbandonano lorgano linfoide secondario.
(8) Arrivano poi, attraverso i linfatici, alla periferia per raggiungere il sito in
cui avvenuta linfezione. Qui svolgeranno la loro funzione.

Vedremo che c tutta una serie di molecole che regolano e controllano


questo homing, questo traffico linfocitario.
Tra laltro ci sono diverse vie di homing; esistono tante sottopopolazioni
linfocitarie, ognuna delle quali avr un homing particolare. Diverse vie di
homing assicurano che diverse sottopopolazioni linfocitarie si localizzino dei
microambienti tissutali dove occorre attivare una risposta immunitaria.

I meccanismi di migrazione dei linfociti dai vasi sanguigni negli spazi


extravascolari nei linfonodi e nei tessuti periferici sono simili (cambiano le
molecole coinvolte), e sono a loro volta simili ai meccanismi gi visti di
migrazione dei leucociti verso il sito dellinfiammazione (anche qui cambiano
le molecole).
Le molecole di adesione coinvolte in questi processi sono:
-Selectine
-Integrine
-ICAM (appartenenti alla superfamiglia delle Ig e costituite da domini
immunoglobulinici di 110AA).

Le molecole di adesione espresse dai linfociti si chiamano recettori di


Homing perch gli consentono di raggiungere i siti idonei e di andare a
localizzarsi e a svolgere la loro funzione.
Le molecole dadesione che invece vengono espresse dalle diverse cellule
endoteliali dei vari organi coinvolti vengono complessivamente denominate
Addressine.
Giocano un ruolo importante anche in questo caso le Chemochine, una
famiglia di particolari citochine in grado di favorire ladesione dei linfociti,
trasformando i legami delle integrine da bassa affinit ed alta affinit. Sono
prodotte a livello degli organi linfoidi oppure possono essere indotte nei siti
dinfezione (richiamando cos i leucociti).
Tutte queste molecole dadesione intercellulare regolano i rapporti tra le
cellule. Si tratta di proteine di membrana che permettono:
a) ai linfociti di migrare negli organi linfatici secondari
b) una volta attivati, di migrare in periferia dove c linfezione.
c)linterazione tra i linfociti T e i linfociti B (che avviene a livello dei linfonodi
ed fondamentale per una buona risposta specifica).
Iniziamo quindi a parlare della ricircolazione dei linfociti T naive (vergini),
ovvero quei linfociti che ancora non hanno incontrato lantigene. Questa
ricircolazione avviene tra il sangue e gli organi linfoidi secondari. Sapete che
esiste un repertorio linfocitario vastissimo di 10^12 linfociti T con recettori
diversi. Di questi 10^12, in media solo un linfocita T vergine su 100000
specifico per un determinato antigene. Quindi i linfociti T specifici per un dato
antigene sono rarissimi
La natura ha pensato ad un modo per favorire lincontro dei T col loro
antigene, organizzando gli organi linfoidi secondari in modo da condurvi gli
antigeni (che vi vengono trasportati attraverso la linfa o le APC) e da favorire
al proprio interno la ricircolazione continua dei linfociti T e B. Pensate che
ogni linfocita passa attraverso lo stesso linfonodo almeno una volta al giorno,
Il tutto per sondare la presenza del proprio antigene specifico.
Nel caso ci sia uninfezione in corso come viene favorito il rallentamento del
traffico linfocitario allinterno dei linfonodi cos da trattenere il pi possibile i
linfociti dentro ai linfonodi cos da poter controllare se ci sia lantigene
specifico?
-Quando c uninfiammazione uno dei primi effetti laumento consistente
dellafflusso di sangue: pi sangue arriva, pi linfociti verranno trasportati dal
sangue e quindi entreranno allinterno dei linfonodi. Questo di per s non
sarebbe sufficiente: bisogna anche contenere la fuoriuscita dei linfociti dai
linfonodi stessi.
-La fuoriuscita dei linfociti dai linfonodi viene limitata attraverso linibizione di
un particolare recettore detto Recettore1 per la Sfingosina-1-P. La
sfingosina-1-P un lipide che si trova in grandissime quantit nella linfa e nel
sangue ma in basse concentrazioni negli altri tessuti. Quindi se i nostri
linfociti esprimessero il recettore per questa sfingosina-1-P, dovrebbero
lasciare velocemente il linfonodo seguendone il gradiente di concentrazione.
Quando c infiammazione vengono prodotti interferoni (alfa e beta) che
inibiscono lespressione di questo recettore e quindi il linfocita, non avendo il
recettore per la sfingosina 1, chiaramente non pu seguire il gradiente e
resta per un periodo pi lungo allinterno del linfonodo in modo da poter
cercare bene antigeni specifici.

Come entrano i linfociti nel linfonodo?


I linfociti T e B arrivano ai tessuti linfoidi attraverso il sangue, attraversando
le venule ad alto endotelio (con cellule globose e pi alte) tipico degli organi
linfoidi secondari, milza esclusa. Questo tipo di endotelio, per altro, si pu
sviluppare anche nelle venule post-capillari dove c una flogosi cronica, sotto
leffetto di particolari citochine
I processi che regolano questo passaggio sono gli stessi che avete visto nel
sito dinfiammazione. Quindi abbiamo il rolling" (il rotolamento dei linfociti su
questo endotelio) mediato dalle selectine; poi grazie alle integrine si passa
alla fase di adesione. Perch si abbia ladesione, il blocco dei linfociti, per
fondamentale che queste integrine formino dei legami ad alta affinit. Quindi
indispensabile lattivazione delle chemochine tramite il riconoscimento
recettoriale.
Una volta che i nostri linfociti si sono adesi sulla superficie dellendotelio alto,
abbiamo la trasmigrazione, quindi il passaggio per diapedesi tra una cellula
endoteliale e laltra e quindi lingresso nel tessuto linfoide.

Poi i nostri linfociti T andranno verso la zona paracorticale, i linfociti B


andranno (seguendo sempre particolari chemochine) andranno verso i
follicoli.

Le SELECTINE sono glicoproteine di membrana dotate di un dominio


lectinico: un dominio in grado di legare degli zuccheri. Quindi queste
selectine legano dei gruppi di zuccheri che si trovano nel loro ligando, che
verr espresso poi dai linfociti. Le L-Selectine che sono presenti sui linfociti T
sono delle selectine particolari e vengono chiamate CD62L; si tratta di una
selectina che pu legarsi a particolari gruppi carboidratici che (come
vedremo) sono GlyCAM-1 e CD34. Quindi queste selectine si legano alle
addressine, andando a creare linterazione endotelio-linfocita T. Tramite
questa prima interazione abbiamo il rotolamento del linfocita T sulla
superficie dellendotelio. Le ADDRESSINE (che vengono riconosciute)
possono variare a seconda di quale organo linfoide secondario coinvolto. Ad
esempio le nostre selectine riconoscono nei linfonodi addressine dette CD34
e GlyCAM-1. Nelle placche di Peyer, invece, le nostre selectine riconoscono
una particolare addressina tipica delle mucose detta MAdCAM-1.
Ricapitolando: abbiamo (1) il nostro linfocita T naive che esprime la selectina,
(2) la selectina si lega alladdressina. Nel passaggio successivo avviene (3)
linterazione tra le INTEGRINE, cio i linfociti T naive esprimono una beta2-
integrina che si chiama LFA1 che si lega al suo ligando sulle cellule
endoteliali che ICAM-1. Questo legame non ad alta affinit quindi la
cellula continua a rotolare, non viene bloccata. E assolutamente necessario
che questo legame venga trasformato in un legame ad alta affinit per
bloccare il linfocita T. Qui (4) intervengono le CHEMOCHINE, prodotte dalle
cellule endoteliali stesse e dalle cellule limitrofe. Queste chemochine sono
CCL19 (prodotta costruttivamente dalle cellule epiteliali alte) o CCL21
(espressa da tipi cellulari dei linfonodi e pii trasportata sulla superficie
endoteliale). Esposte sulla superficie dellendotelio, devono naturalmente
legarsi ad un recettore nel linfocita T naive che le riconosca. Questo recettore
si chiama CCR7 ed espresso in gran quantit sui linfociti naive proprio
perch serve ad indirizzare verso i linfonodi le cellule vergini. Quindi il CCR si
allaccia alle chemochine sulla superficie dellendotelio alto e questa unione
consente di trasformare i legami delle interine da basa ad alta affinit. I
linfociti (5) si bloccano e possono cos (6) penetrare allinterno del linfonodo.

I linfociti naive che non riconoscono lantigene allinterno del linfonodo e che
quindi non si attivano devono tornare in circolo. Lo fanno attraverso i linfatici
efferenti, per arrivare quindi al dotto toracico e da qui alla vena cava
superiore. Tutto questo seguendo il gradiente di concentrazione di Sfingosina-
1-P: una molecola lipidica chemoattraente che presente in grandissima
quantit nella linfa e nel sangue, mentre nei tessuti presente un enzima
che la degrada perci vi si trova in basse concentrazioni. I linfociti T naive che
non hanno incontrato lantigene esprimono, dopo un po di tempo, sulla loro
superficie il recettore per la Sfingosina-1-P ed iniziano quindi a seguirne il
gradiente. Per cui dalla paracorticale si spostano attraverso il vaso efferente,
passano nella linfa e riprendono la loro circolazione.
Una volta raggiunto il sangue il recettore lega la Sfingosina. Avvenuto il
legame e saziato il bisogno d sfingosina, per qualche tempo il linfocita non
ha pi il bisogno di seguire il gradiente, e finch non riespone nuovi recettori
libero di rientrare nel linfonodo. Il lasso di tempo per la riesposizione di
qualche ora per i linfociti T naive e di qualche giorno per i linfociti T effettori.
[E stata studiata una molecola detta Fingolimod, in grado di bloccare
lespressione del recettore per la sfingosina-1-p. Questa molecola stata
usata per alcune malattie autoimmuni del sistema nervoso, dimostrando una
azione immunosoppressiva dato che privi del recettore i linfociti vengono
segregati allinterno del linfonodo senza poter raggiungere la periferia e
svolgere la loro funzione.

Passiamo adesso al differenziamento dei Linfociti T naive a Linfociti T effettori.


Affinch avvenga il riconoscimento e lespansione clonale, i linfociti devono
restare per un periodo pi lungo allinterno del linfonodo. Quindi
assolutamente necessario che il recettore per la sfingosina-1-P venga inibito.
In questo processo dinibizione intervengono gli interferoni di tipo 1 (alfa e
beta) prodotti nelle flogosi, che inducono lespressione di CD69 che blocca la
funzionalit e lespressione del recettore per la sfingosina. Pertanto finch i
livelli dinterferone restano elevati il linfocita T naive che ha riconosciuto
lantigene resta allinterno del linfonodo dove ha tutto il tempo per
espandersi clonalmente. Inoltre questi linfociti T effettori vanno incontro pure
ad una modificazione delle loro molecole di superficie. Ad esempio viene
ridotta notevolmente lespressione di CCR7. Di conseguenza queste cellule
effettrici possono uscire dal linfonodo andando in periferia, ma non possono
farvi ritorno.
Successivamente i linfociti effettori dalla linfa e dal sangue dovranno andare
nei tessuti periferici dove c il processo infettivo.
Arrivati nel sito infiammatorio, i linfociti T devono sottoporsi nuovamente a
qui processi che gli consentono di entrare nei tessuti e stabilirvisi. Anche in
questo caso giocano un ruolo importante le selectine, le integrine e le
chemochine che vengono prodotte localmente dallendotelio infiammato.
Quindi la migrazione dei linfociti T verso i luoghi dinfezione avviene in modo
simile alla migrazione dei leucociti. Infatti i linfociti T attivati (sia effettori che
di memoria) esprimono sulla loro superficie i ligandi per le selectine esposte
dalla superficie dellendotelio e questo consentir il roaming, ladesione della
cellula. Dopodich devono intervenire le INTEGRINE. Le interine coinvolte
sono lFA1 e VL4. Anche in questo caso il legame a bassa affinit, quindi le
cellule non riuscirebbero a fermarsi se non intervenissero le CHEMOCHINE
che rendono il legame delle integrine ad alta affinit. Le chemochine
coinvolte sono la CXCL10 e CLCCL4. Queste due chemochine vengono
prodotte dallendotelio e dalle cellule limitrofe ed esposte sulla superficie
endoteliale dove legano particolari recettori presenti sulla superficie dei
linfociti T che sono CXCR3 e CCR5.
Tutto questo favorisce ladesione dei linfociti alla superficie dellendotelio
infiammato.
Alcune cellule effettrici migrano preferenzialmente in determinai tessuti.
Nella cute vanno quelle che esprimono un carboidrato che lega le selectine
chiamato CLA1; CCR4 e CR10 legano invece delle particolari chemochine
(CCL17 e CCL26) che si trovano solo a livello della cute.
Quindi abbiamo anche una selettivit delle cellule effettrici riguardo
la loro destinazione!! Anche a livello dellintestino avremo delle molecole
particolari espresse. Se un linfocita T effettore destinato a svolgere la
propria funzione nella mucosa intestinale deve esprimere integrina alfa4-
beta7 (che lega la MAdCAM1) ed il recettore CCR9 (che lega il CCL25, una
chemochina prodotta dallintestino infiammato).
Ma cos che regola lespressione dei
linfociti T effettori? Sono le APC
(Antigen Presenting Cells).
A livello degli organi linfoidi secondari, durante il riconoscimento, le ACP
daranno anche informazioni su quali molecole e quali recettori esprimere per
far raggiungere agli effettori la giusta posizione. Quali siano i meccanismi e le
molecole coinvolte in questo indirizzamento ancora oggetto di studio.

Abbiamo visto i T effettori. Poi ci sono i Linfociti T di memoria.


Come sapete, tutte le volte che c una risposta immunitaria si generano i
linfociti di memoria. Le cellule di memoria possiedono uneterogenea
espressione delle molecole dadesione e dei recettori per le chemochine ed
hanno una diversa tendenza a migrare nei tessuti periferici.
Per quanto riguarda i linfociti T esistono 2 principali sottopopolazioni di cellule
di memoria:
-CELLULE T DI MEMORIA CENTRALE: restano allinterno degli organi
linfoidi secondari (o per lo meno ci ritornano), pronte a riconoscere di nuovo
lantigene qualora questo tornasse.
Le caratterizzano presenza della fosfatasi CD45R0 (che nei linfociti T naive si
chiama CD45RA perch comprende lesone A che viene perso quando le
cellule divengono cellule di memoria) ed alti livelli di recettore CCR7 (ecco
perch ritornano nei linfonodi) e di L-selectine
-CELLULE T DI MEMORIA EFFETTRICE: anche queste hanno la CD45R0, ma
hanno bassi livelli di CCR7 e di L-selectine. Hanno invece i recettori per le
chemochine infiammatorie. Non possono quindi ritornare nei linfonodi, ma
restano in periferia, nei siti dove erano state richiamate.

Sappiamo poco dellhoming dei linfociti B, ma possiamo assumere che i


meccanismi generali siano gli stessi che coinvolgono i linfociti T.
Naturalmente cambiano i tipi di molecole che vengono riconosciute ma
sostanzialmente il processo lo stesso.