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Cintica Enzimtica
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Cintica das Reaes Bioqumicas

As clulas vivas dos organismos heterotrficos e dos organismos autotrficos (na ausncia
de luz) obtm a energia de que necessitam a partir da oxidao dos poliosdios de reserva a
CO2 e gua.

Esse conjunto de reaes, assim como, as reaes de sntese das macromolculas, s

possvel devido interveno dos catalisadores bioqumicos
as enzimas.
enzimas
Todas as enzimas so protenas globulares e catalisadores eficientes.

Catalisadores

Energia de ativao necessria para iniciar um processo qumico pode ser fornecida
pela elevao da temperatura que aumente a agitao molecular.

Em Bioqumica, a temperatura dos sistemas no pode ultrapassar os valores
compatveis com a vida dos organismos (aquecimento desnaturao das
protenas).

Catalisadores bioqumicos funo de baixar a energia de ativao necessria
reao e permitir que a reao ocorra em velocidade muito mais elevada.
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Centro ativo ou stio ativo

constitudo pelo conjunto de aminocidos que entram em contato com o substrato.

Compreende o local de fixao: que se combina com o substrato por ligaes fracas;
e o centro cataltico: que atua sobre o substrato levando-o a sofrer a reao
qumica.

A conformao do local e fixao se modifica em conseqncia da ligao ao
substrato substrato induz a alterao da conformao.

Nas enzimas que atuam atravs de um cofator (metal; grupo prosttico ou
coenzima), essa estrutura se encontra ligada na vizinhana do centro cataltico.
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Velocidade da Reao enzimtica

A velocidade de uma reao enzimtica , em geral, obtida pela medida da quantidade de
produto (ou produtos) formado (s) por unidade de tempo.

S + E P + E S = substrato; E = enzima; P = produto

A determinao experimental da velocidade da reao feita recolhendo do meio

reacional, a intervalos regulares de tempo, alquotas da soluo.

A velocidade de reao num tempo (t) : d [P]

v=
dt

A velocidade pode ser medida, tambm, a partir do decrscimo da concentrao de

substrato:
d [S ]
v=
dt
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Representao grfica:

vo = tg o velocidade inicial de uma reao

1 enzimtica

produto formado
Quantidade de
v1 = tg 1 velocidade num instante t 1

t1 Tempo

At certo ponto da reao, a variao linear.

vantajoso medir a velocidade no incio da reao, quando pouco substrato foi

transformado e a velocidade inversa desprezvel.

A inclinao ento mxima, o que permite ter a velocidade inicial da reao (v0).
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A velocidade da reao diretamente proporcional concentrao da enzima

[P]
Velocidade de uma reao enzimtica
E4 em presena de quantidades crescentes
A velocidade de
de enzima
E3 formao de produto
(E2 = 2E1; E3 = 3E1; etc..)
E2 (dp/dt) constante
4x
E1 para E1 e E2 at o
3x
2x tempo t1
1x

t1 t2 Tempo

v
v =
[P ]
Na determinao de
Variao linear de velocidade inicial
t1
E4 de uma reao enzimtica com a produto formado em
concentrao de enzima intervalo de tempo
E3
mais longo, a resposta
E2 no ser linear em
E1 todas as faixas de [E]

[E]
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Fatores que Influenciam a Atividade Enzimtica

Vrios fatores influenciam a atividade de uma enzima. Os mais importantes so a

temperatura, pH, concentrao de substrato e a presena ou ausncia de inibidores.

Temperatura
A velocidade da maioria das reaes qumicas aumenta
quando a temperatura aumenta. Molculas se movem
mais lentamente a baixas temperaturas do que a altas

Velocidade da reao
temperaturas e, portanto, muitas podem no ter
energia suficiente para promover a reao qumica.
Para as reaes enzimticas, entretanto, elevaes
alm de certa temperatura reduz drasticamente a
velocidade de reao. A temperatura tima para a
maioria das enzimas se situa entre 35 e 40C.
0 10 20 30 40 50 60
A reduo da velocidade de reao acima da
Temperatura (C)
temperatura tima devida desnaturao das
enzimas, ou seja, a perda de sua estrutura
tridimensional caracterstica. A desnaturao de uma
protena envolve o rompimento de ligaes de
hidrognio e outras ligaes no covalentes.
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pH

A maioria das enzimas tem um pH timo no qual sua atividade mxima. Acima ou abaixo
deste valor de pH a atividade enzimtica, e portanto a velocidade de reao, diminui.
Quando a concentrao de H+ (pH) no meio drasticamente alterada, a estrutura
tridimensional da protena tambm alterada. Mudanas extremas na concentrao de
cidos (ou bases) modificam a estrutura tridimensional de protenas porque o H+ (ou OH-)
compete com o hidrognio nas pontes de hidrognio e ligaes inicas presentes na
estrutura da enzima, resultando na sua desnaturao.

Atividade Enzimtica

4 6 8 10
pH
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Concentrao de Substrato

Existe uma taxa mxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar uma reao
especfica. Apenas quando a concentrao de substrato extremamente alta, esta taxa
mxima pode ser alcanada.
Sob condies de alta concentrao de substrato, a enzima est em saturao, isto , seus
stios ativos esto todos ocupados por molculas de substrato ou produto. Nesta condio,
um aumento na concentrao de substrato no afetar a taxa de reao porque todos os
stios ativos j estaro sendo utilizados. Em condies celulares normais, as enzimas no
esto saturadas com o substrato. Em um determinado tempo, algumas das molculas de
enzima podero estar inoperantes por falta de substrato, assim, a velocidade de reao
influenciada pela concentrao de substrato.

Inibidores

Uma forma efetiva de controlar o crescimento de um microrganismo, por exemplo,

controlar suas enzimas.
Qualquer substncia que reduza a velocidade de uma reao enzimtica pode ser
considerada como inibidor.
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Cintica Enzimtica
Na reao enzimtica se forma um complexo transitrio entre enzima e substrato.

A reao catalisada enzimaticamente se processa k1

em duas etapas: E+S ES
k2

A enzima se liga reversivelmente ao substrato
ES
k
E+P
3

formando um complexo enzima-substrato (ES)

k1

O produto liberado e a enzima volta forma E +S ES
k
E + P3

k2
livre podendo, ento, se ligar a outra molcula
de substrato.

O estudo das reaes enzimticas se baseia em medidas de velocidade da reao catalisada.

Velocidade de uma reao quantidade de produto formado em um tempo determinado.
Velocidade inicial de uma reao medida em tempos suficientemente curtos para que no
mximo 5% do substrato sejam transformados em produto.

Em uma reao enzimtica tpica, a 1 fase ocorre a velocidades muito maiores do que a
2 fase. Equaes de velocidade para estas fases so:

v1 = k1 [E ] [S ]
v3 = k 3 [ES ]
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k1
E+S E+P
k3
ES
k2

A medida real da velocidade da reao, ou seja, a medida da velocidade de formao do

produto igual a v3, que a etapa mais lenta e limitante do processo.

Nas reaes enzimticas, a concentrao de enzima , normalmente, muito menor que a
concentrao de substrato.
Um equilbrio entre E, S e ES (com concentraes definidas e constantes de cada espcie)
se estabelece muito rapidamente.

Tendo ocorrido a formao de ES, se inicia a segunda parte da reao enzimtica, aquela
que efetivamente forma o produto, com uma velocidade proporcional concentrao de
ES.

O fato de ES estar sendo consumido na formao do produto no provoca diminuio da
sua concentrao, uma vez que h excesso de substrato para se combinar com a enzima
liberada quando se forma o produto.

Esta situao se mantm por algum tempo (tempo inicial): contnua formao do produto e
concentraes estveis de ES e S.
A pequena e contnua diminuio da concentrao de S no significativa, face ao seu
grande excesso.
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medida que se aumenta a concentrao inicial do substrato, as velocidades de

formao do produto se tornaro cada vez maiores. No equilbrio da 1 etapa
existir cada vez mais complexo ES. Nestas condies haver a maior concentrao
possvel do complexo ES; a reao ser processada na mxima velocidade possvel.

Existir uma determinada concentrao de substrato que provocar a formao de uma

concentrao de ES igual metade da mxima possvel. Nestas condies, a velocidade
ser, naturalmente, a metade da maior velocidade possvel.
Esta concentrao definida de substrato igual Constante de Michaelis-Menten ou Km.

Vmax
b

Vmax

Km [S ]

a cintica de 1 ordem (velocidade proporcional concentrao de substrato)

b cintica de ordem zero (velocidade independente da concentrao de substrato)
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Variao de velocidade da reao com a concentrao de substrato

Teoria de Michaelis-Menten (com um nico substrato)

k1 k3 E = Enzima
E + S ES E + P S = Substrato
k2 k4 ES = Complexo enzima-substrato
P = Produto

Propostas
 A enzima e o substrato reagem rapidamente para formar o complexo enzima-substrato
(ES)
 A fase mais lenta a formao de produto (P)
 H excesso de substrato (S)
 Todas as determinaes de produto (P) so feitas no incio da reao quando a
velocidade de formao do complexo enzima-substrato (ES) a partir de enzima (E) +
produto (P) muito pequena e pode ser desprezada velocidades iniciais
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Deduo
[E ] t = [E ]+ [ES ]
v = k 3 [ES ]
k1 k3
E + S ES E + P
k2 Vmax = k 3 [E ] t

Qual a velocidade de formao de [ES] ? k1 [E ][S ]

Qual a velocidade de decomposio de [ES] ? k 2 [ES ]+ k 3 [ES ]

d [ES ]
Variao de [ES] com o tempo: = k1 [E ][S ]k 2 [ES ] k 3 [ES ]
dt
d [ES ]
Como no estado estacionrio [ES] no varia =0
dt

k 1 [E ][S ] = (k 2 + k 3 )[ES ]
[E ][S ] = k 2 + k 3 [ES ] k2 + k 3 = Km
k1 k1
[E ][S ] = Km [ES ]
Km = Constante de Michaelis ou
Constante de dissociao do complexo ES (Ks)
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muito difcil quantificar [ES], porm, se sabe que: [E ]t = [E ]+ [ES ] [E ] = [ES ]+ [E ]t

Substituindo em : [E ][S ]= Km[ES ]
[S ]([E ]t [ ES ]) = Km [ES]
Km
[E ] t [ES ] = [ ] k3
[S ] ES
k 3 [E ]t = k 3 [ES ] + k 3 [ES]
Km
[S ]
Km
V max = + 1 v
[S ]

V max . [S ]
v = Equao de Michaelis-Menten
Km + [S ]

v = velocidade observada na reao quando a concentrao de substrato [S]

Km = Constante de Michaelis-Menten
Vmax = velocidade mxima da reao. Ocorre quando o substrato est presente em
concentraes de saturao.

A equao de Michaelis e Menten permite, aps a determinao experimental das
variveis v em funo de [S], obter o valor de Vmax e calcular Km.
Em geral, os valores de Km esto compreendidos entre 10-2 e 10-8 M.
Atribui-se a Km unidades de concentrao.
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Curva de Michaelis-Mentem

Variao da velocidade de reao em funo da concentrao do substrato
v
Equao de Michaelis-Mentem:
Vmax
c
V max . [S ]
v =
Vmax b Km + [S ]

Km [S]
Analisando a curva:
Vmax [ S ] V
a. Quando [S] << Km v= v = max [S ]
1 ordem
Km + [ S ] Km
 desprezado
1 V [S ] Km + [ S ] = 2[ S ]
Km tem dimenses de
b. Quando v = Vmax Vmax = max
2 Km + [ S ] Km = [ S ] concentrao

Vmax [S ]
c. Quando [S] >> Km v= v = V max
Ordem zero
Km + [ S ]
 no depende da [S]
 negligencivel
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Por que determinar Km ?

Km estabelece o valor aproximado para o nvel de substrato intracelular.
[S]intracelular << Km v seria muito sensvel a variaes de S (1 ordem) e o poder cataltico da enzima
seria desperdiado, pois v << Vmax.
[S]intracelular >> Km no h sentido fisiolgico pois v no pode exceder Vmax. Quando [S] >> Km; v se
torna insensvel a variaes de S.

Km especfico para uma dada enzima.

Serve de meio de comparao entre enzimas extradas de diferentes fontes, mas que catalisam a
mesma reao.
Pode-se determinar se duas enzimas so idnticas ou se so protenas diferentes que catalisam a
mesma reao.

Variao no valor de Km induzida por um ligante uma maneira de regular a atividade de uma enzima.
Se Km determinada in vitro for diferente da determinada em condies fisiolgicas, isto pode
indicar a falta de um efetor. Vrios efetores podem ser testados para a identificao de quais atuam
como inibidores ou ativadores.
v

Conhecendo-se o valor de Km pode-se determinar Vmax
que funo da [E]total Vmax
Substrato 1
Utilizando [S] >> Km determina-se Vmax.

Km indica a adequacidade relativa de substratos a uma Substrato 2

Vmax
enzima.
Quando mais baixo o valor de Km maior a afinidade do
substrato com a enzima.
Km1 Km2 [S]
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Mtodo grfico para determinao das constantes cinticas

Em virtude da curva v versus [S] ser uma hiprbole muito difcil determinar Vmax com
preciso e, portanto, a [S] que fornece Vmax ou o Km.
Para facilitar a determinao das constantes cinticas, os dados so lanados em grfico
utilizando um dos mtodos grficos disponveis.
1
Grfico dos recprocos de Lineweaver-Burk: versus 1
v [S ]

Rearranjo da equao de Michaelis-Menten numa forma linear
y = ax + b

V max [ S ] v [S ]
v = =
 Km + [ S ]
Km + [ S ] V max

v Km + [ S ]
Invertendo: =
Vmax [S ]
1 Km + [ S ]
Multiplicando os dois termos: =
v Vmax [ S ]

1 Km [S ]
Separando os termos: = +
v Vmax Vmax [ S ]
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Michaelis-Menten
v
V max [ S ]
Vmax v =
Km + [ S ]

Vmax

Km [S]

Lineweaver-Burk

1/v

1 Km 1 1
= +
v Vmax [ S ] Vmax
tg = Km/Vmax
Onde: a = inclinao da reta
1/V max b = interseo da reta em y

-1/Km
1/[S]
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Questo de cintica enzimtica

Os seguintes dados foram obtidos para a reao enzimtica de transformao de um

substrato (S) em produto (P):
[S] (M) V (nmoles x litro-1x min-1)
6,25 x 10-6 15,00
7,50 x 10-5 56,25
1,00 x 10-4 60,00
1,00 x 10-3 74,90
1,00 x 10-2 75,00

a) Calcule Vmax e Km.

b) Qual seria v com [S] = 2,5 x 10-5M e com [S] = 5,0 x 10-5M?
c) Qual seria a v com [S] = 5,0 x 10-5M, se a concentrao de enzima fosse o dobro?
d) A v dada na tabela a lado foi determinada pela medida da concentrao de produto que
se acumulou por um perodo de 10 minutos. Veja se v representa uma velocidade inicial
verdadeira.
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Resposta da questo

a) v se torna insensvel a mudanas da [S] acima de 10-3M. Portanto, na faixa de [S] de 10-3 a
10-2, v deve ser prximo a Vmax

V = 75 nmoles litro 1 min 1

max

Para calcular Km escolha qualquer valor de v e a correspondente [S]

v [S ] 60 104
= =
Vmax Km + [S ] 75 Km + 104

15 10 4
75 10 4 = 60 Km + 60 10 4 Km = = 0,25 10 4 Km = 2,5 10 5 M
60

b) [ S] = 2,5 10 5M = Km e v = 0,5 Vmax v = 37,5 nmoles litro 1 min 1

v = 5 105 (5) (75)

[S ] = 5,0 105 M = 5 v= v = 50 nmoles litro1 min1
75 (2,5 105) + (5 105 ) 7,5 7,5
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v [S ] [S ]
c) = e V = k [E ] v= k [E ]
V Km + [S ] max 3 t Km + [S ] 3 t
max

v diretamente proporcional concentrao de enzima, para todas as concentraes de

substrato. Portanto, dobrando-se [E]t para a [S] = 5 x 10-5M v dobra

v = 100 nmoles litro 1 min 1

d) Vamos utilizar os valores mais baixos de [S].

[S ] = 6,25 10 6 M e v = 15 nmoles litro 1 min 1 Em 10 min 150 nmoles litro 1

150 109 M (de S utilizado / litro) 0,150 10 6

= = 0,024 ou 2,4%
6,25 10 6 M ( de S originalmente presente/ litro) 6,25 106

Foram utilizados 2,4% de Substrato