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Il DNA

Il DNA il progetto di ogni organismo alla radice di tutti gli enti biologici. La matrice del
progetto la scrittura. Il progetto in grado di riprodursi autonomamente nellambiente in cui
si trova (il virus non un organismo).
La riproduzione dei batteri dura ca 30 min ed hanno ca 3000 geni.

Il DNA nel replicarsi (con una frequenza che circa 10 -6) genera mutazioni che pu essere sia
una sorgente di variabilit che permette alla specie di sopravvivere, sia in grado di ridurre le
capacit o la sopravvivenza dellorganismo.

Riproducibileletto e copiato
Mutabile
Interpretabile in prodotti adattato allambiente

Noi siamo il risultato dellunione di met del progetto materno e met del progetto paterno (
ricombinazione casuale, per cui la possibilit di sopravvivere nellambiente molto
aumentata). importante la capacit di riprodursi nellambiente e la capacit di portare la
propria prole al momento riproduttivo.

Il DNA composto di simboli, che devono essere leggibili. Questi simboli hanno una base
comune uguale con piccole parti diverse e portano uninformazione diversa.

Il DNA ha una struttura a doppia elica, essenziale sia per la replicazione.

Franklin: generatore di elettroni che colpivano un oggetto e venivano raccolti in una lastra.
Quando colpiva il dna si formava una figura circolare e cerano quattro momenti in cui la
diffrazione era particolare.

Watson & Crick: hanno elaborato la struttura a doppia elica del DNA.

Gran parte del DNA codifica per proteine anche se recentemente stato scoperto che anche
lRNA ha una sua parte.

Il DNA ha una linearit e polarit: due nucleotidi dello stesso filamento sono attaccati tra loro
con legami covalenti tra il c3 e il P. Si avr quindi un terminale fosforico e un terminale
ossidrilico.

Scoperta del principio trasformante:

Mendel ipotizz lesistenza di geni;

Miescher (1869) isol i nuclei partendo da cellule della serie bianca del sangue presenti nel
pus; in seguito al trattamento dei nuclei con alcali, scopr una sostanza anomala che chiam
nucleina, formata prevalentemente da DNA. Studi il DNA anche sullo sperma di salmone.
Inizialmente pens che il DNA fosse coinvolto nella trasmissione dellespressione ereditaria
ma poi abbandon questidea perch le sue tecniche di misurazione indicavano erroneamente
che la cellula uovo contenesse pi DNA dello spermatozoo.

Zacharias (ca 1880) osserv che lestrazione del DNA dalle cellule portava alla scomparsa
della colorazione dei cromosomi e dedusse che il DNA fosse il materiale genetico.

1900 lerrata interpretazione di alcuni esperimenti di colorazione port alla conclusione che la
quantit di DNA poteva cambiare drasticamente allinterno delle cellule; ci non era
compatibile con la funzione.
1910-1940 si pens che il materiale genetico fosse rappresentato dalle proteine (erano
costituite da 20 amminoacidi che davano moltissime combinazioni mentre il DNA era
considerato una molecola semplice costituita dalla ripetizione monotona della stessa
sequenza di quattro basi ATCG)

Griffith (1928): studiando due ceppi di pneumococco, il ceppo S (patogeno liscio a causa di
una capsula polisaccaridica) e il ceppo R (non patogeno e rugoso per lassenza della capsula)
not che cera qualcosa nel ceppo virulento che rimaneva attivo nonostante il calore. Le
proteine venivano distrutte mentre il principio trasformante rimaneva attivo.

Avery (1944): il frazionamento di estratti cellulari del ceppo batterico S permise di dimostrare
che solo la frazione degli acidi nucleici era in grado di causare la trasformazione; inoltre
lattivit era specificamente eliminabile mediante trattamento con la desossiribonucleasi, un
enzima che degrada in DNA.

Hershey e Chase (1952) dimostrarono che nel batteriofago T2 il DNA il materiale genetico
(attraverso la marcatura radioattiva dello zolfo nelle proteine e del fosforo nel DNA).

Chargaf (1944-1952): studi la composizione in basi del DNA. Regole di Chargaff:


1) il DNA isolato da cellule diverse in una data specie mostra la stessa percentuale di ognuna
delle quattro basi che non varia nemmeno in individui e tessuti diversi o al variare dellet,
dello stato nutrizionale o dellambiente.
2) la composizione in basi del DNA varia da specie a specie.
3) per ogni campione di DNA esaminato, il numero di adenine uguale a quello delle timine
(A=T) e quello delle guanine uguale a quello delle citosine (G=C).

Watson e Crick (1953)definizione della struttura tridimensionale del DNA con il modello a
doppia elica. Alla loro scoperta contribuirono gli studi sulla diffrazione ai raggi X del DNA
effettuati da Rosalind Franklin che indicava che il DNA avesse una struttura elicoidale con un
motivo strutturale ripetuto ogni 0,34 nm e un altro ripetuto ogni 3,4 nm.
Lelica destrorsa; la struttura contiene dieci coppie di nucleotidi per giro dellelica e avanza
di 0,34 nm per ogni coppia di nucleotidi. Ogni giro completo aggiunge 3,4 nm alla lunghezza
della molecola. Il diametro dellelica di 2 nm (dovuto allappaiamento purina-pirimidina). I
due filamenti del DNA sono complementari e antiparalleli e il modo in cui sono avvolti crea un
solco maggiore (su cui sono esposti gruppi chimici donatori H e accettori O,N di legami
idrogeno, cos come gruppi metilici) e un solco minore.

Lelica destrorsa di Watson e Crick rappresenta una versione idealizzata di quello che viene
definito DNA-B che, sebbene rappresenti la conformazione maggioritaria, non lunica
conformazione esistente:
- DNA-Z doppia elica sinistrorsa. Il suo nome deriva dallandamento a zig zag dello scheletro
zucchero-fosfato e la sua struttura risulta pi lunga e sottile di quella del DNA-B. Si origina in
regioni di DNA che contengono sia unalternanza di purine e pirimidine, sia citosine con un
radicale metilico aggiuntivo. Brevi tratti di DNA passano transitoriamente nella conformazione
Z durante un processo che porta allattivazione dellespressione di determinati geni.
- DNA-A doppia elica destrorsa pi corta e pi spessa del DNA-B, che si pu creare
artificialmente disidratando questultimo.

Il DNA si pu interconvertire fra lo stato di superavvolgimento e lo stato rilassato. Il


superavvolgimento (che pu essere positivo o negativo in base alla direzione dellulteriore
avvolgimento), influenzando sia lorganizzazione spaziale sia lo stato energetico del DNA,
condiziona la capacit del DNA di interagire con altre molecole (il positivo riduce le possibilit
di interazione mentre il negativo le aumenta). Linterconversione catalizzata dalle
topoisomerasi che catalizzano il processo di rilassamento della molecola:
- tipo I: introducono nel DNA rotture transitorie su un singolo filamento permettendo quindi al
DNA di ruotare e al filamento intatto di passare attraverso la rottura prima che il filamento
tagliato venga saldato. Non richiede energia.
- tipo II: introducono rotture transitorie su entrambi i filamenti facendo passare un segmento
della doppia elica intatto attraverso la rottura prima della risaldatura. Richiede energia
derivante dallidrolisi dellATP.

Inoltre i procarioti possiedono una topoisomerasi di tipo II detta DNA girasi che pu indurre sia
il rilassamento sia il superavvolgimento. Essa richiede ATP per generare il superavvolgimento,
ma non per rilassare.

Il GENOMA di un organismo o di un virus costituito dalla quantit di DNA che contiene una
copia completa di tutte le informazioni genetiche di quellorganismo o quel virus. La sua
dimensione espressa come numero totale di coppie di basi nucleotidiche, o paia di basi (pb).

Polimorfismo per un singolo nucleotide (SNP): siti del genoma in cui si trovano basi
differenti con alta frequenza nella popolazione. Rappresentano lo 0,3% delle basi che pu
variare da persona a persona, mentre il restante 99,7% delle basi del genoma umano
corrisponde perfettamente tra tutti gli individui. Tuttavia la maggior parte degli SNP non
localizzata nelle regioni codificanti dei geni.

Impacchettamento del DNA

I procarioti impacchettano il DNA in cromosomi e plasmidi batterici:


Il cromosoma batterico, costituito da una molecola circolare di DNA e da alcune proteine
associate, si localizza in una regione della cellula chiamata nucleoide, mantenendo un confine
netto seppur non circondato da membrana. Il DNA del cromosoma batterico superavvolto
negativamente e ripiegato in una numerosa serie di anse con una lunghezza media di 20 000
pb. Le due estremit di ogni ansa sono ancorate a componenti strutturali presenti allinterno
del nucleoide (si pensa RNA e molecole proteiche).
I plasmidi batterici sono molecole di DNA circolare relativamente piccole che contengono
geni sia per la loro replicazione autonoma sia per una o pi funzioni cellulari non essenziali.
Quasi tutti i plasmidi sono superavvolti e la loro replicazione di solito sufficientemente in
sincronia con quella del cromosoma batterico.

Gli eucarioti impacchettano il DNA nella cromatina e nei cromosomi:


Impacchettamento del DNA eucariota pi complesso di Gli ISTONI sono un gruppo di proteine,
quello procariote in quanto la lunghezza della molecola di relativamente piccole, il cui elevato
contenuto in amminoacidi basici arginina e
DNA molto maggiore e in quanto, interagendo con un
lisina le rende cariche positivamente.
maggior numero e con una grande variet di proteine, la Linterazione tra istoni e DNA, che carico
sua complessit strutturale pi elevata. negativamente, quindi stabilizzata da
legami ionici.
Lunit base dellimpacchettamento del DNA il Esistono cinque classi maggiori: H1, H2A,
nucleosoma, una particella (core) costituita da 146 pb H2B, H3 e H4. La cromatina contiene una
massa circa uguale di istoni e DNA e
di DNA superavvolto che forma 1,7 giri attorno a un
unuguale quantit di ognuno dei quattro
complesso di otto molecole istoniche. Le particelle istoni H2A, H2B, H3 e H4 (in quanto
nucleosomiche sono connesse fra loro da un tratto di lottamero istonico formato dal legame di
DNA di collegamento (DNA linker), in genere di circa 60 due dimeri del complesso H2A-H2B e due
dimeri di H3-H4) e circa la met di questo
pb. valore per listone H1.
La ripetizione regolare dei nucleosomi costituisce la cromatina che ha appunto una
struttura a collana di perle. Le fibre di cromatina isolate che mostrano questa struttura
hanno un diametro di circa 10 nm, ma le fibre osservate direttamente allinterno delle cellule
possiedono spenno una struttura a 30 nm di diametro, facilitata dallistone H1.
Il successivo livello di impacchettamento della cromatina rappresentato dallulteriore
ripiegamento della fibra di 30 nm per formare dei domini ad ansa, che mostrano una
lunghezza media di circa 50 000-100 000 pb. Questa organizzazione ad anse stabilizzata
dallancoraggio periodico del DNA a una rete di proteine non istoniche insolubili, che
costituiscono limpalcatura del cromosoma, al quale sono legate le lunghe anse del DNA.
La cromatina pu essere ulteriormente compattata in:
- eterocromatina segmenti di cromatina formata da DNA trascrizionalmente inattivo, cos
altamente impacchettati da essere visibili al microscopio elettronico come macchie scure;
- eucromatina la forma di cromatina meno condensata, associata a DNA attivamente
trascritto.
Inoltre, quando una cellula si prepara alla divisione, tutta la sua cromatina diventa altamente
impacchettata, generando i cromosomi, strutture visibili al microscopio costituito da due
unit chiamati cromatidi.

Gli eucarioti, inoltre, contengono parte del loro DNA in mitocondri e cloroplasti. Queste
molecole di DNA sono circolari e prive di istoni (origine endosimbiontica), hanno dimensioni
relativamente piccole (simili al genoma virale) e permette perci a mitocondri e cloroplasti di
essere semi-autonomi.

Nucleo

Il luogo allinterno della cellula eucariota dove sono localizzati e replicati i cromosomi e dove il
DNA in essi contenuto viene trascritto.

Struttura dellinvolucro nucleare:


Il nucleo circondato da un involucro nucleare, costituito da due membrane: le membrane
nucleari interna ed esterna (ciascuna spessa ca 7-8nm) e separate da uno spazio
perinucleare con dimensione interna di circa 20-40 nm ed in continuit con il lume del
reticolo endoplasmatico. La membrana interna appoggiata su una rete di fibre di sostegno
chiamata lamina nucleare mentre quella esterna in comunicazione con il reticolo
endoplasmatico e spesso costellata da ribosomi attivi nella sintesi proteica. Inoltre la
membrana esterna si lega attraverso specifiche proteine, allactina e ai filamenti intermedi,
che costituiscono lo scheletro cellulare ancorando cos il nucleo agli altri organelli o alla
membrana plasmatica.
Linvolucro nucleare presenta aperture specializzate, i pori nucleari, piccoli canali cilindrici a
livello dei quali le membrane esterna ed interna sono fuse tra loro, permettendo la
comunicazione fra il citosol e il nucleoplasma. Il canale tappezzato da una struttura proteica
chiamata complesso del poro nucleare (NPC), costituito da circa 30 proteine diverse chiamate
nucleoporine. Il complesso del poro presenta unorganizzazione ad anelli di otto subunit, che
protrudono da entrambi i lati dellinvolucro. Inoltre sono presenti granuli centrali, i
trasportatori, responsabili del movimento delle macromolecole attraverso linvolucro. La
densit dei pori varia con il tipo e lattivit cellulare; un tipico nucleo di mammifero presenti in
circa 3000-4000 pori per cui ca 10-20 pori per m2.

Linvolucro nucleare protegge lRNA appena sintetizzato dallessere utilizzato dagli organelli
citoplasmatici o dagli enzimi prima che sia stato completamente maturato.

Entrata ed uscita delle molecole dal nucleo attraverso i pori nucleari:

Il complesso del poro contiene minuscoli canali acquosi di diffusione attraverso i quali piccole
molecole e particelle con peso inferiore ai 30 000 dalton possono liberamente muoversi in
quanto i canali acquosi di diffusione misurano circa 9nm di diametro i nucleosidi trifosfato
necessari per la sintesi del DNA e dellRNA diffondono liberamente attraverso i pori. Anche gli
istoni possono diffondere passivamente (hanno peso di 21 000 dalton o inferiore).
Invece gli enzimi della sintesi del DNA e dellRNA (peso molecolare di 100 000 dalton), le
molecole di mRNA e le subunit ribosomali e altre particelle di grandi dimensioni richiedono
un meccanismo di trasporto attivo selettivo che richiede energia e che coinvolge un legame
specifico della sostanza da trasportare con proteine della membrana (il massimo diametro del
trasporto attivo 26 nm).
Le proteine che devono essere attivamente trasportate dal citosol al nucleo posseggono uno o
pi segnali di localizzazione nucleare (NLS) costituiti da sequenze amminoacidiche
(normalmente contengono prolina) che permettono alla proteina di essere riconosciuta da
una proteina recettoriale, limportina. Il complesso proteina-importina-NLS trasportato
allinterno del nucleo dal trasportatore. Allinterno del nucleo limportina si associa con la
Ran, una proteina che lega il GTP e che permette il rilascio della proteina-NLS in modo da
poter essere usata nel nucleo. Successivamente il complesso Ran-GTP-importina viene
ritrasportato nel citoplasma attraverso un poro nucleare dove limportina rilasciata per
essere riutilizzata ed il tutto accompagnato dallidrolisi del GTP che fornisce energia
allimportazione.
La maggior parte delle molecole di RNA vengono esportate dal nucleo sotto forma di un
complesso ribonucleoproteico. Le componenti proteiche di questi complessi contengono
segnali di esportazione nucleare (NES), sequenze amminoacidiche che convogliano la
proteina e lRNA legato ad essa verso i pori nucleari, dove sono riconosciuti da proteine
recettoriali chiamate esportine. Il legame NES-esportine favorito dal complesso Ran-GTP.

quindi fondamentale per limportazione e lesportazione mantenere la concentrazione di


Ran-GTP elevata allinterno del nucleo e bassa allesterno e ci avviene grazie al GEF
allinterno che favorisce la sostituzione del GDP con il GTP e nel citosol grazie al GAP che
favorisce lidrolisi del GTP ad opera di Ran. Inoltre il trasportatore nucleare NTF2 riporta Ran-
GDP nel nucleo.

Strutture di sostegno del nucleo:

Le strutture di sostegno del nucleo sono la matrice nucleare e la lamina nucleare.

La matrice nucleare (o nucleoscheletro) una rete fibrosa insolubile che mantiene la


forma del nucleo e fornisce uno scheletro che organizza le fibre di cromatina.

La lamina nucleare una sottile e densa rete di fibre che tappezza la superficie interna della
membrana nucleare interna e che serve da sostegno per linvolucro nucleare. spessa circa
10-40 nm ed costituita da una classe di filamenti intermedi del citoscheletro costituiti da
proteine chiamate lamne, che si associano a formare strutture resistenti.
Progeria (o malattia di Hutchinson-Gilford) malattia dellinvecchiamento precoce. Mutazioni
nella lamna A, autosomica dominante. Le cellule hanno un nucleo non sferico perch la
lamna non riesce a formare una rete corretta al di sotto dellinvolucro nucleare. Ci non
permette la corretta posizione dei cromosomi e i corretti meccanismi di trascrizione. La lamna
A estremamente scarsa nel cervello per cui le capacit intellettive non vengono inficiate.
Invecchiamento incapacit della cellula di regolare lomestasi. Si associa anche
unincapacit delle lamne di regolare le mutazioni. Le lamne sono importanti anche nel
momento della divisione cellulare.

Disposizione della cromatina:


Le fibre di cromatina corrispondenti ai singoli cromosomi occupano compartimenti distinti
allinterno del nucleo, definiti territori cromosomici. La posizione di questi territori per pu
variare da cellula a cellula nello stesso organismo e durante il ciclo vitale della cellula.
Linvolucro nucleare daiuto nellorganizzare la cromatina legando certi segmenti cromatinici
a siti specifici sulla superficie interna dellinvolucro, strettamente associati ai pori. I segmenti
di cromatina che si legano in questo modo sono costituiti da etero cromatina, soprattutto di
tipo costitutivo (sequenze ripetute semplici centromeri e telomeri.

Nucleolo:

Unulteriore componente strutturale del nucleo eucariota il nucleolo, che pu essere


presente anche in un numero maggiore di uno. Esso presenta una struttura sferica con il
diametro di alcuni m, un organello non circondato da membrana ed costituito da granuli
e fibrille:
granulimolecole di rRNA associate con proteine (importate dal citoplasma) a costituire le
subunit ribosomali.
fibrille contengono DNA che viene trascritto in rRNA.
I nucleoli contengono la regione dellorganizzatore nucleolare (NOR), un blocco di DNA
che contiene copie multiple di geni per lrRNA.

Replicazione del DNA

La replicazione del DNA un processo che avviene nella fase S dellinterfase del ciclo vitale di
una cellule; precede la mitosi e in tal modo ogni cellula figlia potr ricevere una copia della
stessa molecola di DNA della cellula parentale.

Watson e Crick elaborano lipotesi della replicazione semiconservativa, in cui uno dei
due filamenti di ciascuna molecola di DNA neoformata un filamento parentale, mentre laltro
sintetizzato ex novo.

Possibili modelli di replicazione del DNA:


dispersivo;
semiconservativo;
conservativo.
Esperimento di Meselson e Stahl Per dimostrare che sia semiconservativo occorre
marchiare lelica nuova rispetto alla vecchia. Per distinguere i filamenti di DNA neosintetizzati
dai vecchi si utilizzano due isotopi: 14N e 15N. Si fanno crescere dei batteri per molte
generazioni in terreno contenente cloruro di ammonio marcato con 15N in modo che questo
isotopo pesante fosse incorporato nelle molecole di DNA. Si trasferiscono poi le cellule con
DNA marcato dal 15N in un terreno di coltura contenente 14N, lisotopo normale leggero. Dato
che il DNA marcato con 15N molto pi denso del DNA marchiato con 14N, i vecchi filamenti
potevano essere distinti dai nuovi utilizzando la centrifugazione in gradiente di densit.
Il DNA viene posto in una soluzione di cloruro di Cesio e viene centrifugata la soluzione, ad
altissima velocit e per tempi lunghi, almeno una notte. Man mano che va avanti la
centrifugazione le molecole di Cesio, che prima erano disperse nella soluzione in maniera
omogenea, iniziano a migrare verso il fondo del tubo. Le molecole di DNA si distribuiscono nel
gradiente in base al loro coefficiente di sedimentazione, che dovuto sia alla dimensione e il
peso della molecola, sia alla sua conformazione. Inoltre se inseriamo nella soluzione di cloruro
di cesio un po di bromuro di etidio, il bromuro di etidio riesce a inserirsi tra le basi del DNA e
legarsi e ci consente di visualizzare il DNA perch pu essere seguita con i raggi ultravioletti.
Dopo un ciclo di replicazione in 14N ogni molecola di DNA dovrebbe essere formata da un
filamento 15N e da un filamento 14N e la sua densit complessiva dovrebbe essere intermedia
con la centrifugazione si ottiene ununica banda di DNA la cui densit esattamente
intermedia fra quella del DNA-15N e del DNA-14N.
Dopo il secondo ciclo di replicazione trovarono due bande, una alla densit intermedia e una
alla densit del DNA 14N.

Meccanismo di replicazione

Il meccanismo generale della duplicazione concettualmente semplice:

1) I due filamenti originari di DNA si separano; (a questo punto ognuno di essi diventa
uno stampo per lassemblaggio di un filamento complementare a partire da una
riserva di nucleotidi liberi disponibili nellambiente)
2) I nucleotidi si allineano uno alla volta lungo il filamento stampo;
3) Appositi enzimi uniscono i nucleotidi formando il nuovo filamento di DNA.
Se concettualmente semplice, in realt il processo implica una complessa attivit
biochimica:

la molecola deve svolgersi e copiare Il processo


deve essere veloce.
quasi simultaneamente i suoi due filamenti;

Inizio

Il processo ha origine in particolari tratti di DNA che hanno una caratteristica sequenza di
nucleotidi (nei punti dove sono concentrate pi adenine e timine che hanno due legami
idrogeno rispetto ai tre tra la citosina e la guanina) chiamati ORI.
Prima di sintetizzare nuovo DNA la doppia elica viene distesa da tre classi di proteine con
funzioni distinte:
DNA elicasi gli enzimi direttamente responsabili dello svolgimento del DNA ed utilizzano
lenergia ricavata dallidrolisi dellATP per rompere i legami idrogeno dellORI e quindi per
svolgere il DNA dinanzi alla forcella di replicazione.
Topoisomerasi enzimi in grado di ridurne la tensione torsionale (si creerebbe un
superavvolgimento in un punto del DNA per la distensione dello stesso sulla forcella da parte
dellelicasi) in quanto introducono e risaldano rapidamente delle rotture a singolo o doppio
filamento nel DNA; creano quindi dei punti di rotazione.
SSBP (Single-Stranded DNA Binding Proteins) proteine che si legano solo alle porzioni a
singolo filamento del DNA, per stabilizzarlo e mantenerlo in forma denaturata.

DNA CIRCOLARE (procarioti, plasmidi, mitocondri e cloroplasti)


Replicazione teta perch si formano delle strutture intermedie che hanno forma della
lettera greca teta.
Il processo di replicazione inizia in un punto specifico del DNA, lorigine di replicazione. Il
processo ha inizio quando un gruppo di proteine iniziatrici si lega a questa sequenza e,
utilizzando energia derivante dallidrolisi dellATP, svolge la doppia elica consentendo al resto
del macchinario di accedere ai singoli filamenti di DNA e di copiare contemporaneamente i
due filamenti. In questo modo si creano le forcelle di replicazione, dalla tipica forma ad Y.
Nella maggior parte dei casi la replicazione procede in maniera bidirezionale.

DNA LINEARE (eucarioti)

La replicazione delle molecole lineari di DNA che costituiscono i cromosomi eucarioti ha


molteplici siti di inizio, le origini di replicazione, sequenze nucleotidiche ricche di regioni AT.
Da ciascuna origine di replicazione si formano i repliconi, le unit di replicazione lunga
ognuna circa 50 000-300 000 pb.

Linizio pu avvenire solo quando a queste regioni si lega il complesso di pre-inizio (o pre-
replicazione) un gruppo di proteine che legano il DNA formate da:
- ORC (Complesso di Riconoscimento dellOrigine), un complesso proteico multisubunit che
si lega allorigine di replicazione;
- complesso MCM (proteine di mantenimento del minicromosoma) che contiene diverse DNA
elicasi che svolgono la doppia elica;
- caricatori dellelicasi, un gruppo di proteine che mediano il legame delle proteine
dellMCM allORC.

Il processo di autorizzazione alla replicazione assicura che, dopo che il DNA si replicato
a unorigine di replicazione, in quel punto non sia pi autorizzato a replicarsi unaltra volta fino
al termine della mitosi. Lautorizzazione fornita dalle proteine MCM che si legano allorigine
di replicazione: dopo che la replicazione iniziata le proteine MCM si staccano dal DNA e
vengono inibite. Un ruolo chiave svolto dalla Cdk (chinasi dipendente da ciclina), un enzima
essenziale sia per attivare la sintesi del DNA dalle origini autorizzate, sia per prevenirne la
sintesi da quelle non autorizzate; essa infatti blocca lautorizzazione catalizzando la
fosforilazione e quindi inibendo la funzione di proteine necessarie per la replicazione (ORC e
caricatori dellelicasi).
Negli eucarioti pluricellulari esiste unaltra proteina, la geminina, che blocca il legame delle
proteine MCM al DNA.

Allungamento

Lallungamento del DNA effettuato dagli enzimi primasi, DNA polimerasi e ligasi. Il
complesso proteico deputato allallungamento detto replisoma. Lattivit e il movimento
del repli soma sono alimentati dallenergia derivata dallidrolisi dei nucleosidi trifosfati (sia
quelli usati dalla DNA polimerasi e dalla DNA primasi come unit costitutive per la sintesi del
DNA e dellRNA, sia lATP idrolizzato da diverse altre proteine coinvolte nella replicazione del
DNA tra cui lelicasi, la girasi, e la ligasi). Per sintetizzare i due nuovi filamenti del DNA in
direzioni opposte il replisoma ripiega il filamento ritardato in unansa, ci permette alla DNA
polimerasi di muoversi fisicamente nella stessa direzione, anche se i due filamenti stampo
sono orientati con polarit opposte.
La sintesi del DNA inizia con la formazione di corti inneschi (primer) di RNA, sintetizzati dalle
primasi.
- La primasi una specifica RNA polimerasi in grado di formare un breve filamento di RNA,
chiamato innesco o primer lungo circa 10 bp, a partire da un filamento stampo di DNA. Sono
quindi in grado di iniziare una nuova catena polinucleotidica complementare ad un filamento
senza bisogno di un innesco.
[In E. coli la primasi rimane relativamente inattiva se non accompagnata da altre sei
proteine che svolgono il DNA parentale e riconoscono le sequenza da cui deve iniziare la
replicazione. Proteine e primasi formano il primosoma.
Nelle cellule eucariote la primasi non cos strettamente associata alle cellule che svolgono
il DNA, ma strettamente legata alla DNA polimerasi , la principale DNA polimerasi coinvolta
nella fase di inizio della replicazione].

Dopo che si formato un innesco di RNA la sintesi del DNA pu procedere e la DNA polimerasi
(III procarioti; seguita da o eucarioti) pu aggiungere, uno dopo laltro, i
desossinucleotidi allestremit 3 dellinnesco.

- La DNA polimerasi un enzima capace di sintetizzare un nuovo filamento di DNA in


direzione 53 a partire da un filamento stampo. Essa per ha due limiti: 1) non in grado di
cominciare la sintesi di un filamento ex novo, ma richiede la presenza di un primer; 2) pu
aggiungere nuovi nucleotidi soltanto allestremit 3 e mai alla 5.
DNA PROCARIOTA
Kornberg scopr che la DNA polimerasi I, in presenza di una piccola quantit di DNA da stampo, catalizza
lallungamento dei filamenti di DNA, utilizzando come substrati i desossinucleosidi trifosfati (deossiNTP o dNTP)
derivati dalle quattro basi presenti nel DNA (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
Quando uno di questi incorporato nel filamento in formazione, i suoi due gruppi fosfato terminali vengono rilasciati e
lenergia rilasciata dalla rottura di questi legami fosforici spinge la reazione, altrimenti termo dinamicamente
sfavorevole, verso la polimerizzazione. Ogni nuovo nucleotide viene legato al filamento crescente con un legame
fosfoesterico tra il gruppo fosfato del suo carbonio 5 e il gruppo idrossilico (OH) sul carbonio 3. Lallungamento
procede in direzione 53.

- La Dna polimerasi I catalizza laddizione di nucleosidi trifosfato allestremit 3 OH di un filamento.


- La polimerizzazione procede sempre in direzione 53. Perch se procedesse al contrario rimarrebbe appeso
allestremit un gruppo pirofosfato che idrolizza facilmente, estremamente instabile; per cui la possibilit che perda
il gruppo pirofosfato altissima, per cui dovrei buttare lintero filamento che si sta formando.
- La DNA polimerasi non capace di iniziare la sintesi de novo ma ha bisogno di un innesco, un piccolo filamento di
RNA che si associa al filamento stampo in modo da lasciare un gruppo OH disponibile per lattacco.

DeLucia e Cairns scoprirono la presenza di altri enzimi che sintetizzano il DNA. In particolare la DNA polimerasi III
si dimostr il principale responsabile della replicazione del DNA nei batteri mentre gli altri tipi di DNA polimerasi
batteriche (II, IV e V) rivestono ruoli pi specializzati negli eventi associati alla riparazione del DNA. La DNA
polimerasi I in aggiunta alla III possiede attivit esonucleasica.

DNA EUCARIOTA
Anche le cellule eucariote possiedono diversi tipi di DNA polimerasi:
- DNA polimerasi Sintesi del DNA nucleare, forma un complesso con la primasi e inizia la sintesi di entrambi i
filamenti di anticipato e ritardato a partire dallestremit 3 degli inneschi di RNA;
- DNA polimerasi Sintesi del DNA nucleare, esonucleasi 35 (correzione di bozze); coinvolta nella sintesi di
entrambi i filamenti anticipato e ritardato;
- DNA polimerasi Sintesi del DNA nucleare, esonucleasi 35 (correzione di bozze); si pensa sia coinvolta nella
sintesi di entrambi i filamenti anticipato e ritardato;
- DNA polimerasi solamente nei mitocondri, sintesi del DNA mitocondriale;

La capacit del DNA polimerasi di allungare il filamento solo in direzione 53 fa si che la


sintesi proceda in modo diverso sui due filamenti stampo: solo un filamento (quello in
direzione 53; filamento anticipato) sar sintetizzato in modo continuo mentre laltro
(filamento ritardato) verr costruito in modo discontinuo da parti separate unite in seguito.
Infatti, mano a mano che la polimerasi si allontana in direzione 3, il tratto non duplicato
aumenterebbe, per questo motivo il filamento complementare al 35 viene sintetizzato un
frammento alla volta via via che la forcella si apre. Questi brevi segmenti di DNA detti
frammenti di Okazaki vengono poi uniti dalla DNA ligasi.

Questi segmenti costituiscono il cosiddetto filamento ritardato perch la primasi deve


sintetizzare un primer per ogni frammento. Invece, il filamento sintetizzato in modo continuo
che ha bisogno di un solo innesco dopo il quale si allunga speditamente, chiamato
filamento anticipato.

Al termine della duplicazione i primer devono essere rimossi (nei procarioti dallattivit
esonucleasica 53 della DNA polimerasi I) e gli spazi vuoti vengono riempiti allungando i
frammenti adiacenti, che una volta vicini possono essere uniti tra loro dalla ligasi.
- La DNA ligasi unisce i frammenti di DNA catalizzando la formazione ATP-dipendente di un
legame fosfoesterico tra lestremit 3 di una catena nucleotidica e lestremit 5 di unaltra.

Terminazione
DNA CIRCOLARE (procarioti, plasmidi, mitocondri e cloroplasti)

Il filamento anticipato continua a crescere in direzione 53 fino a che la sua estremit 3


non va a legarsi allestremit 5 del filamento ritardato, che arriva dalla direzione opposta. Sul
filamento ritardato, lultimo tratto di DNA che deve essere sintetizzato, quello che sostituisce
linnesco di RNA dellultimo frammento di Okazaki, si lega allestremit 3-OH del filamento
anticipato che arriva dalla direzione opposta.

DNA LINEARE (eucarioti)

Quando un filamento ritardato, allungandosi, raggiunge lestremit del DNA e una attivit
esonucleasica 53 rimuove lultimo innesco di RNA, questultimo intervallo non pu essere
colmato, non esistendo unestremit 3-OH a cui la polimerasi possa aggiungere nucleotidi. Di
conseguenza, le molecole di DNA lineare, ad ogni replicazione, rischiano di generare molecole
figlie sempre pi corte, per linformazione contenuta nei geni non viene compromessa grazie
alla presenza del telomero, una sequenza di DNA altamente ripetute alle estremit di ciascun
cromosoma lineare, che non codifica per alcun gene. Essi consistono in corte sequenze
ripetute ricche della base G. Nelluomo i telomeri contengono di solito da 100 a 1500 copie in
tandem della sequenza TTAGGG (sequenza telomerica TEL).

Gli organismi pluricellulari possiedono una polimerasi particolare, la telomerasi, che catalizza
la formazione di copie addizionali della sequenza telomerica, compensando cos il graduale
accorciamento che si verifica alle due estremit. Essa attiva quasi esclusivamente nelle
cellule germinali alle quali consente di dividersi indefinitamente senza che i telomeri si
accorcino. La telomerasi stata identificata anche nelle cellule tumorali.

Poich nella maggior parte delle cellule non si verifica attivit telomerasica, in esse avviene il
progressivo accorciamento dei telomeri ad ogni divisione. Quando i telomeri si accorciano
troppo, espongono un DNA a doppia elica nudo, la cui presenza attiva un sistema di
segnalazione che induce lapoptosi.

Correzione di bozze

Durante la replicazione del DNA circa 1 su 10 5 nucleotidi incorporati appaiato in modo


scorretto con lo stampo. La maggior parte di questi errori viene eliminata da un meccanismo
di correzione delle bozze portato avanti dallattivit esonucleasica 35 della DNA polimerasi
che consente la rimozione del nucleotide appaiato scorrettamente e altri 2-3 vicini
dallestremit 3 del filamento nascente. Ci riduce la probabilit di un appaiamento sbagliato
ad uno su 106-7.