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VETTORI UTILIZZATI NEL CLONAGGIO


Si tratta di vettori di diverso tipo:
1) vettori plasmidici
2) vettori lambda (batteriofago)
3) vettori cosmidici
4) vettori BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
5) vettori YAC (Yeast Artificial Chromosome)
I primi quattro si possono riprodurre in cellule procariotiche, mentre lultimo tipo ha un ospite di tipo
eucariotico.

Inoltre, i vettori hanno una capacit di clonaggio diversa. Ovvero, la capacit di clonare frammenti
piccoli:
plasmidi: fino a 10 kb
lambda: tra 10 e 20 kb
cosmidici: tra 30 e 45 kb
BAC: fino a 300 kb
YAC: tra 300 kb fino a 2 Mb

Dunque questi vettori hanno un utilizzo differente a seconda dell'obiettivo del ricercatore.
- Se vogliamo inserire dei frammenti piccoli, sono pi utili i vettori plasmidici, che si inseriscono rendendo
le cellule competenti.
- Il vettore lambda un batteriofago, quindi inserisce il DNA mediante infezione batterica (mentre nei
plasmidi si rendono le cellule competenti).
I vettori sono comunque tutti rimaneggiati: hanno parti del DNA prese dalle molecole originali: i plasmidi
hanno delle grandi porzioni che derivano dall'HFR (da una normale molecola circolare che costituisce un
ospite normalmente presente nel batterio; quindi sequenze "tollerate" dall'organismo. Ovviamente, ci
sono delle porzioni delle molecole originali che sono state tolte per inserire delle sequenze di interesse,
come i siti di clonaggio: i siti che devono essere utilizzati per tagliare e inserire il DNA esogeno.

Per fare libreria di DNA genomico (quindi con tutto il genoma) i frammenti non devono essere troppo
piccoli, altrimenti il numero di cloni totali necessari sarebbe enorme. Quindi si preferisce usare dei vettori
che possono ospitare dei frammenti abbastanza grandi: o i vettori cosmidici, oppure i BAC o YAC.

A COSA SONO DOVUTI I PICCOLI FRAMMENTI POSSIBILI?


PLASMIDI: Tale range di dimensioni (fino a 10 kb) dovuto al fatto che il plasmide, se diventa troppo
grande (2 kb di plasmide + circa 10 kb di inserto) non riesce ad entrare nella cellula quando questa diventa
competente.
Quindi deve essere della dimensione giusta per entrare nella cellula ospite, facendo delle piccole
interruzioni nella parete e membrana del batterio.

LAMBDA: Il vettore lambda ha un capside, al cui interno c' il normale DNA del batteriofago (50 kb). Quindi
bisogna togliere una parte del DNA del lambda, mettere il DNA di interesse, ma non si pu superare una
quantit di 50 kb altrimenti non si riesce ad inserire nel capside e quindi trasferire poi nell'ospite.

COSMIDI: sono un intermedio tra lambda e plasmide, e hanno bisogno di una dimensione che non superi le
45 kb.

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1) VETTORI PLASMIDICI
I plasmidi sono molecole di DNA circolare a doppio filamento che esistono nei batteri (e nei nuclei di
alcune cellule eucariotiche).
Non sono autosufficienti per quanto riguarda la replicazione, e eventualmente l'espressione delle proteine
che portano all'interno come cDNA, ma hanno bisogno di utilizzare l'apparato di replicazione e traduzione
di una cellula batterica.

CARATTERISTICHE COMUNI A TUTTI I VETTORI PLASMIDICI:


- Origine autonoma di replicazione: presenza di una origine, cio un punto da cui parte la replicazione del
DNA, che usa una DNA polimerasi del batterio.

- Geni per la selezione: sono i geni che conferiscono resistenza a uno o due antibiotici, che il ricercatore
inserisce nella molecola circolare. Questi geni permettono di capire se il batterio ha inserito o meno il
vettore al suo interno: se un batterio che all'inizio non resistente all'ampicillina ( ampS) diventa
resistente solo se ha inserito il vettore che conferisce resistenza all'antibiotico ampicillina.
Ci sono poi dei geni utili per la selezione del plasmide ricombinante. Ovvero, non si vuole solo sapere se il
plasmide entrato nella cellula procariotica, ma si vuole sapere se quello che ha anche inglobato al suo
interno il DNA esogeno (oppure se un plasmide che dopo digestione si richiuso su se stesso e non ha
inglobato nessuno frammento di DNA esogeno da inserire: plasmide non ricombinante, bens wild-type).

- Sito multiplo di clonaggio: bisogna aver inserito all'interno del DNA del vettore delle sequenze
riconosciute da uno o pi enzimi di restrizione: questi siti serviranno per linearizzare il plasmide (aprirlo) e
poterlo richiudere con all'interno un frammento di DNA di interesse.

COME IL DNA ESOGENO VIENE INSERITO:


Il batterio normale deve essere trattato o con cloruro di calcio (CaCl2) oppure con elettroporazione, e
questo rende la cellula competente. Allora, si mette a contatto il plasmide e il DNA plasmidico entra nella
cellula; quindi si mescola insieme alla cellula competente, che stata cos trasformata.
Una soluzione con delle cellule pu essere piastrata e crescere su una capsula petri.
Per vedere se il batterio ha inglobato il vettore plasmidico, si usa un sistema di selezione con antibiotici.
All'interno della cellula batterica (che in partenza antibiotico-sensibile), se il plasmide contiene un gene
che conferisce resistenza ad un antibiotico, quando la cellula trasformata il gene viene espresso, dato
che si trova all'interno della cellula, e produce una proteine che conferisce resistenza all'antibiotico (lo
degrada)
Quindi quando si piastra su un terreno che, oltre al terreno nutritivo, contiene l'antibiotico -> se la cellula
ha inglobato il plasmide sopravvive, altrimenti in caso contrario le cellule muoiono.

Tuttavia, alcune cellule possono non inserire il gene giusto ma altri frammenti. Oppure, dopo la
trasformazione, in alcuni casi le cellule conterranno il vettore legato su se stesso (chiuso), che conferisce la
resistenza ma non ha inserito il gene che ci interessa.
Facendo una replica della piastra e una ibridazione, si potr usare una sonda che riconosce il frammento
per identificare quale colonia quella di interesse (cio che contiene il frammento con il gene in studio).

Si pu utilizzare anche un secondo sistema di selezione, che permette di vedere se il frammento si


effettivamente inserito (non solo l'ingresso del plasmide nel batterio, ma anche se il plasmide
ricombinante).
Due vettori che utilizzano questo sistema sono:
- pBR322
- vettori di tipo pUC

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pBR322
Si tratta di uno dei plasmidi pi antichi.
- Dimensione: La dimensione della sua molecola originaria di 4,3 kb e l'inserito di circa 6 kb: in
totale un plasmide piccolo da 10-11 kb.
- Sistema di selezione: Usa due sistemi con geni per due antibiotici.
- Metodo di inserimento: Trasformazione (inserimento con CaCl2 o elettroporazione).

famiglia pUC
- Dimensione: la molecola originaria di circa 2 kb e pu inserire 8 kb: in totale 10 kb
- Sistema di selezione: ci sono due sistemi, uno di resistenza ad antibiotico e un altro sistema detto
Lac Z
- Metodo di inserimento: trasformazione (inserimento con CaCl2 o elettroporazione).

pBR322
pBR322 un vettore plasmidico, ed uno dei primi ad essere stato usato come vettore di clonaggio in E.
Coli. E una molecola circolare al cui interno ci sono due zone importanti:
- un frammento contiene il gene per la resistenza all'ampicillina,
- un altro frammento contiene il gene che conferiscono resistenza alla tetraciclina.

Se questo vettore viene inserito da solo (senza nessun altro frammento interno) dentro una cellula
batterica conferisce resistenza ad entrambi gli antibiotici.
Dunque, un batterio che stato trasformato con questo vettore in grado di crescere su un terreno
contenente ampicillina e tetraciclina.

Il vettore contiene anche un sito di clonaggio, in cui c per esempio il sito di riconoscimento dell'enzima
BamHI. Se qui si fa un taglio e si inserisce il DNA esogeno diventa un plasmide ricombinante.
Nel momento in cui avviene la trasformazione i batteri diventano ampR, ma tetS perch con il clonaggio il
gene per la resistenza alla tetraciclina viene interrotto.

SISTEMI DI SELEZIONE:
Facendo una replica delle colonie su una piastra, la quale contiene solo ampicillina: crescono delle colonie,
che sono quelle che hanno sicuramente inserito il vettore.
Ma quale di questi ha inserito, oltre al vettore, il frammento di tetraciclina? (Ovvero, quali sono i
ricombinanti?).
Dopo la selezione delle cellule che hanno inserito il vettore (= quelle che sono diventate ampR), si prende
una carta bipula, si tocca la superficie delle colonie e alcune delle colonie si trasferiscono sulla carta.
Si tocca poi un'altra piastra, all'interno della quale c' solo tetraciclina: si vede quali sono le colonie che
crescono e quelle che invece sono sensibili.
Le colonie resistenti a tetraciclina non sono quelle che stiamo cercando, quindi ritornando sulla piastra
originale si vanno ad identificare: sono quelle "non buone", perch hanno inserito solo il vettore e il gene
della tetraciclina non stato interrotto dal clonaggio.

QUINDI: attraverso questo sistema a due passaggi:


Prima ampicillina vedere quali hanno inserito il vettore;
Poi tetraciclina vedere quali hanno inserito il vettore ricombinante.
Si pu cos fare una scelta e prendere le colonie di interesse per lavorarci.

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pUC18
Sono delle piccole molecole circolari, di 2,5 kb, al cui interno hanno il gene per la resistenza all'ampicillina
e poi ha una regione che deriva dall'operone Lac: ha una sorta di promotore e un gene per la
-galattosidasi, ma un gene mutante che nell'ultima porzione contiene un sito di clonaggio multiplo.
Il gene Lac Z presente in pUC codifica per il polipeptide -galattosidasi che serve a idrolizzare il lattosio in
galattosio + glucosio.

Il vettore conferisce di per s la resistenza all'ampicillina. Dopodich serve un secondo sistema per vedere
se stato inserito un vettore ricombinante: questo si vede grazie alla presenza di Lac Z che pu essere
interrotto (se all'interno stato clonato un frammento esogeno) oppure in caso contrario mantenuto.
Il ceppo di E. Coli usato in questo esperimento ha un gene Lac Z mutante, che produce un peptide parziale.

Se le colonie di E. Coli Lac Z- inseriscono un vettore pUC con il gene lac Z non interrotto (= no clonaggio)
c' una complementazione tra i due peptidi parziali che fa s che si abbia un enzima -galattosidasi
attivo.
Se invece il ceppo di E. Coli mutante inserisce un vettore lac Z interrotto dal clonaggio allora non si
verifica complementazione e quindi l'enzima -galattosidasi non attivo.

Per vedere se l'enzima attivo o meno bisogna piastrare le cellule su un terreno contente ampicillina
(quindi si fa una prima selezione dei batteri che hanno inserito il vettore).
Dopodich c' un analogo del galattosio (X-Gal). X-Gal pu essere o meno metabolizzato dalla -
galattosidasi: se la -galattosidasi attiva, allora X-Gal viene metabolizzato e d una sostanza con
colorazione celeste, e quindi tutta la colonia apparir con una colorazione celeste.
Se invece la -galattosidasi non attiva, X-Gal non viene metabolizzato e la colonia rimane bianca.

Quello che ci interessa avere colonie bianche: la -galattosidasi stata inattivata dal clonaggio all'interno
del gene Lac Z del vettore.

Questi tipi di plasmidi portano il frammento di DNA esogeno, ma non lo fanno esprimere perch mancano
del promotore per la trascrizione del frammento (sono vettori di clonaggio). Esistono invece anche dei
vettori di espressione, che invece esprimono il gene contenuto nel frammento esogeno.

2) VETTORI LAMBDA
Il batteriofago formato da un involucro proteico (capside), del lambda originario ci sono rimaste solo 25
kb; le altre 25 sono di DNA esogeno (quindi in totale al massimo pu contenere 50 kb).

Il fago ha la capacit di aderire alla membrana del batterio: invece di entrare completamente all'interno
della cellula come un plasmide, nel fago il capside rimane esterno e attraverso degli enzimi che sciolgono
parzialmente il doppio strato lipidico, inietta al proprio interno il DNA che ha nel capside.
Questo metodo di introduzione nella cellula batterica prende il nome di INFEZIONE.
Il plasmide una volta entrato nella cellula procariotica non la uccide, mentre nell'infezione fagica una volta
inserito in DNA del batterio il batterio alla fine muore: si avr una lisi dell'ospite.

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CARATTERISTICHE DEL BATTERIOFAGO LAMBDA:
- Ha un DNA di 50 kb
- Ha due estremit dette "cos": estremit di 12 nucleotidi che hanno la capacit di far circolarizzare la
molecola di DNA, perch hanno delle estremit protrudenti (coesive) che si riconoscono e si appaiano per
complementariet, rendendo la molecola circolare.
Tuttavia siccome non hanno un legame covalente ma solo di formazione di legame H, la molecola di pu
essere lineare o circolare a seconda di come interagiscono le due estremit cos: quando entra lineare, e
una volta entrato le due estremit si richiudono e il batterio si circolarizza.

Il lambda dentro il procariote pu intraprendere due strade:


- ciclo litico
- ciclo lisogenico

Nel CICLO LITICO il DNA si replica attraverso il modello detto "a cerchio rotante".
Il fago replica il suo DNA, sintetizza tutte le proteine dell'involucro esterno, dopodich avviene il cosiddetto
packaging: le proteine del capside prendono la forma tipica del capside maturo, e il DNA si impacchetta
all'interno della struttura proteica.
Dopodich vengono anche prodotti degli enzimi dell'ospite, viene lisata la membrana e fuoriesce il
batteriofago pronto ad infettare le cellule circostanze (proseguendo il processo di infezione).

Nel CICLO LISOGENICO: nel batteriofago lambda esistono delle porzioni particolari che hanno delle
sequenze di riconoscimento complementari all'interno del cromosoma batterico. Quando avviene il
riconoscimento c' una sorta di ricombinazione: ovvero l'inserimento del DNA del fago all'interno del
cromosoma batterico il fago diventa cos un provirus: quiescente e integrato nel DNA batterico.
Pu rimanere quiescente, oppure in particolari circostanze (ad esempio condizioni di stress per la cellula) il
provirus pu di nuovo escindersi, sempre attraverso un meccanismo di unione e complementariet delle
estremit del frammento e va ad intraprendere il ciclo litico.

MODELLO DI REPLICAZIONE A CERCHIO ROTANTE:


Il primo passaggio la produzione di un taglio in una sola delle due eliche, all'origine di replicazione.
L'estremit 5' dell'elica tagliata lasciata allontanarsi dalla molecola circolare.

Il DNA circolare intatto agisce come stampo per l'elica leading (quella replicata in maniera continua). Con il
procedere della replicazione l'estremit 5' del filamento tagliato srotolata fuori come un filamento libero
di lunghezza crescente, subito ricoperto di proteine SSB (queste stabilizzano la struttura impedendo alle
due eliche di riassociarsi).

Mentre il cerchio ruota, la lingua a singola elica viene usata come stampo per un'elica lagging: la primasi
sintetizza brevi primer di RNA che sono allungati dalla DNA polimerasi III in direzione 5'-3'. Questi primer
vengono poi rimossi dalla polimerasi I e i vari frammenti infine sono uniti dalla DNA ligasi.
L'elica che funge da stampo leading non si linearizza, per cui alla fine della replicazione si pu avere una
molecola lineare di DNA a doppia elica pi lunga della circonferenza del cerchio, perch su questo la DNA
polimerasi pu continuare a replicare.

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COME SI RENDE LAMBDA UN VETTORE?
Si sfruttano le capacit intrinseche di infettare e replicare il DNA, dato che si vogliono tante copie del DNA
all'interno del fago; tuttavia, il fago deve essere ovviamente rimaneggiato, conferendo delle propriet utili
alla manipolazione.

La prima cosa la eliminazione dei geni del ciclo lisogenico: se facciamo un esperimento di clonaggio e poi
il fago si inserisce nel genoma batterico non pi possibile utilizzarlo.
Poi vengono eliminate alcune componenti del capside, che vengono invece fornite dal ricercatore al
sistema in modo che si possa decidere quando le particelle fagiche devono essere costituite.
Soprattutto, poi, si elimina ancora DNA di , in modo da avere pi spazio per inserire i frammenti di
interesse.

Quindi con l'eliminazione dei geni del ciclo lisogenico e i geni componenti del capside si pu creare uno
spazio fino a 23 kb: questo pu essere un frammento esogeno che troviamo all'interno di lambda.
Il fago che si ottiene detto "lambda di sostituzione".

Quando inseriamo il DNA esogeno in queste regioni, abbiamo di nuovo ottenuto una molecola di 50 kb
(dimensione massimo). Si forniscono le componenti del capside e si fa un packaging in vitro: le molecole di
lambda riconoscono il capside, si inseriscono all'interno, e a quel punto abbiamo una particella fagica
matura con cui poter fare l'infezione batterica per far riprodurre il DNA esogeno.

RICORDA: Il sito di clonaggio deve essere unico: il DNA del vettore deve essere solo linearizzato, non
tagliato in pi punti, per poi far includere all'interno il frammento esogeno. Affinch il DNA sia integro, si
deve poi aggiungere la ligasi che catalizza il legame fosfodiesterico.
Questo serve anche poi per eventualmente tirare fuori il frammento di DNA plasmidico: il DNA plasmidico
viene digerito con lo stesso enzima, su fa correre su gel di agarosio, e si vedr da un lato il DNA lineare del
vettore dall'altra il frammento.

INSERZIONE DI PIU FRAMMENTI:


Questo il caso di inserzione di un frammento unico. Nel caso in cui si abbia invece tanti frammenti di DNA
da inserire (ad esempio per una libreria genomica) tutti hanno come estremit il sito EcoRI.
Allora si producono tante molecole di DNA . Se le due estremit cos si aprono, come se si avessero due
bracci che con la ligasi si formano delle strutture dette "catenali": l'estremit cos sono molto mobili, e alla
fine si formano dei bracci destri e sinistri di lambda che hanno da un lato cos e dall'altro il sito per EcoRI.

Dunque se includono tutti questi vari frammenti di una libreria di tutto il DNA genomico, si ha la
formazione di questi catenali.

Se si in vitro, si pu aggiungere una miscela di packaging, cio una miscela di proteine che servono per
ricostruire il capside. Le molecole di hanno la capacit di entrare all'interno del capside; poi al livello
dell'estremit cos si staccano e all'interno di ognuna di queste particelle entra solo una molecola che inizia
e finisce con questa estremit cos.
A questo punto quindi, sia se si clonato un solo frammento sia se tanti frammenti diversi, si ha la
produzione di particelle fagiche mature.

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Si pu ora passare all'infezione di E. Coli: si piastrano queste particelle fagiche su una capsula petri dove
c' un tappeto di batteri una crescita di batteri quasi uniforme; ognuno dei fagi infetter una colonia
batterica e si svilupper al suo interno.
Dopo 24 ore, quello che si osserva sulla piastra sono delle "placche di lisi". Sono dei punti in cui c' pi una
patina biancastra, ma una zona limpida: dove il fago ha infettato e ha lisato le cellule batteriche.
Per recuperare le particelle fagiche in tale zona si mette della soluzione salina nei punti dove c' la placca
di lisi. Ovviamente bisogna cercare di non prendere placche di lisi troppo vicine, perch altrimenti si
potrebbero mescolare pi fagi insieme.

Per trovare tra i vari fagi quello che ha inserito un particolare frammento di interesse:
si usa un filtro che una "placca di lisi hybridization": ci sono tantissime particelle fagiche, ognuna
derivante da una singola particella che ha infettato un batterio.
Si mette a contatto la piastra con un filtro, si trasferiscono le particelle fagiche e si fanno aderire al filtro. Il
filtro viene poi ibridato con una sonda di DNA che va a pescare all'interno del DNA dei vari fagi
esattamente il frammento di interesse.
Dopo aver ibridato, si torna sulla piastra originale, e con una pipetta si recuperano delle particelle fagiche
nella specifica pozione. A questo punto queste si mettono a fare una grande crescita in una coltura liquida
con dei batteri: i batteri vengono infettati dalle particelle fagiche; con ogni placca di lisi diversa si infetta
una beuta diversa, e alla fine si avr una grandissima quantit di nuovi fagi che contengono il DNA di
interesse.

COME FARE IL PACKAGING IN VITRO:


Il primo packaging per fare l'infezione batterica viene fatta in vitro: vengono aggiunte in provetta le
proteine che poi si assemblano a formare il capside maturo.
1) Tali proteine da aggiungere si producono creando del DNA di difettivo. Cio si possono alterare dei
DNA, creando quindi dei fagi difettivi, che hanno ad esempio delle estremit cos alterate.
In un batterio normale questa molecola di lambda non si riesce a replicare, perch i siti cos sono alterati,
quindi pu solamente sintetizzare proteine del capside: le proteine si accumulano senza che si formi la
particella fagica matura.
Quindi lo sperimentatore pu recuperare queste proteine per fare il packaging in vitro.

2) Oppure si possono produrre le proteine del capside attraverso due fagi difettivi: si alterano i geni per
alcune proteine in fagi diversi, in modo che un fago difettivo produce alcune proteine, e l'altro fago
difettivo ne produce altre.
Queste non sono sufficienti per fare la particella matura. Da questi fagi difettivi si estraggono le proteine,
utilizzate per fare packaging in vitro.

Fago M13
E' un fago filamentoso che ha una particolare struttura allungata; E' abbastanza piccola, con una
dimensione di 6,4 kb e pu inserire non molte kb.
Come sistema di selezione ha Lac Z, come pUC18, e il metodo di introduzione si chiama trasfezione.
Il fago M13 viene utilizzato nel phage-display, un metodo usato per identificare coppie di geni i cui prodotti
proteici interagiscono tra loro.

La struttura del fago bastoncellare: il DNA interno e tutto intorno ha una struttura proteica che
protegge tutto il suo DNA.

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M13 entra nell'ospite sfruttando la presenza sulla cellula batteriche di pili: non una infezione, ma una
trasfezione.

La particolarit del fago filamento avere due stati del DNA:


- DNA a singolo filamento
- DNA a doppio filamento
M13 passa da una forma all'altra a seconda delle fase in cui si trova nella cellula batterica.
Quando viene iniettato, legandosi ad un pilo, il DNA entra come singolo filamento. Immediatamente
all'interno della cellula batterica, sfruttando quindi tutto il macchinario dell'ospite, il fago produce il
secondo filamento ristabilendo la molecola di DNA a doppio filamento (forma replicativa, RF).
In questa forma il DNA si pu riprodurre e fare tante copie di se stesso.

Poi quando devono essere prodotti nuovi capsidi, e quindi delle particelle fagiche di nuovo mature,
all'interno non si inserisce il DNA a doppio filamento, bens a singolo filamento. Dopodich avviene la lisi
cellulare, e cos fuoriesce la particella fagica M13 matura che riprende il ciclo.

La diversit di M13 rispetto ad un lambda che M13 non distrugge completamente la cellula procariotica,
ma questa viene rallentata nelle sue capacit di replicazione. Quando si piastra quindi un fago filamentoso
su un tappeto batterico, si hanno delle zone non completamente limpide bens i batteri continuano
lentamente a crescere.

COME E' FATTO IL DNA DI UN FAGO FILAMENTOSO:


Contiene Lac Z, dunque usa lo stesso sistema di pUC.
In un fago filamentoso, rispetto ad un fago wild-type, stata inserita una cassetta con il gene Lac Z
difettivo che pu complementare quello difettivo di E. Coli. A questo punto, da 4 kb si arriva a 7 kb.
Quando bisogna clonare un frammento di DNA, e usare quindi il fago come vettore, si apre utilizzando uno
degli enzimi di restrizione, si inserisce il DNA esogeno. Quindi si utilizza il DNA di M13 quando in forma
replicativa, cio in doppia elica.
A questo punto, una volta che si fatta la ligazione e si ottenuto l'M13 ricombinante, bisogna fare una
trasfezione. Anche in questo caso, si fa il packaging dall'esterno. I fagi sono poi utilizzati su un tappeto
batterico per far inserire il fago filamentoso dentro i batteri.

RICORDA: quando si parla di vettori, bisogna sempre dire che ceppi di ospiti vanno utilizzati. Si usa un
vettore che ha il gene per la resistenza all'ampicillina se si usa un ceppo batterico che sensibili.
Quindi vanno sempre accoppiati i genitori: quello del vettore e quello del tipo di batterio.