El ELISA es una tcnica que se basa en el uso de un antgeno o un anticuerpo marcado

con una enzima; al estar uno estos componentes marcado y fijado a un soporte, se
interrumpe la reaccin antgeno-anticuerpo, posteriormente se le agrega un sustrato
especifico sobre la enzima que producir un color determinado observable a simple vista o
cuantificable por un espectrofotmetro o analizar la reaccin antgeno anticuerpo. Existen
diversos tipos de ELISA

En cuanto a los pasos generales de un ELISA primero se tapizada el antgeno o

anticuerpo, luego se agrega la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos,
se une el antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno ya tapizado, lavado para
eliminar el exceso no unido. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima , unin
del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo ,lavado del pocillo para eliminar el exceso
de enzima no adherida , adicin del substrato, unin del substrato a la enzima, para luego
obtener la coloracin color

ELISA directo: En este se fija el antgeno al soporte, se lava para eliminar los no fijados,
luego se adicionan los anticuerpos marcados con la enzima para que reaccin con el antgeno
y que solubilizado el complejo, se lava para eliminar anticuerpos que no reaccionaron y se
agrega un sustrato especfico para la enzima, al final se observa la coloracin. ELISA indirecto:
En este la diferencia viene dad que a nivel que el elemento marcado por la enzima es un anti-
anticuerpo que va a reaccionar con el anticuerpo, que reacciono junto al antgeno
previamente fijado; finalmente agrega un sustrato especfico para la enzima, se lava y se
observa la coloracin.

ELISA sndwich doble: Se fija al soporte el anticuerpo especficos del antgeno en el

suero problema, posteriormente se aade el suero problema y los antgenos de fijan a los
anticuerpo, luego se lava para eliminar elementos no fijados, posteriormente se aaden
anticuerpos conjugados con una enzima(de diferente eptopo a los previamente fijados) estos
reaccionan con los antgenos de la muestra problema que se encuentran fijados a los otros
anticuerpos, se lava la muestra y se aade un sustrato a la enzima marcadora y se observa
el color visual o por colorimetra, en cuanto al ELISA sndwich triple la diferencia viene dada
por que los segundos anticuerpos que se colocan no son marcados con la enzima, si no que
luego se coloca anti-anticuerpos conjugados con la enzima que reaccionaran con los
anticuerpo que se colocaron luego, posteriormente se lava y se coloca el sustrato especifico
para la enzima.

ELISA Competitivo: Fijacin de anticuerpos especficos al soporte anticuerpos, adicin

en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso
anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos (objeto de estudio).Al mismo
tiempo, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con
una enzima, lavar. Agregar un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto
final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas
son iguales, el antgeno a estudio no tiene nada que ver con los anticuerpos empleados en el
soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio,
est relacionado con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de
absorbancia o densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema.

Mtodos especficos

Para lograr el tapizado de antgenos y anticuerpos de diluye el antgeno o anticuerpo en

tampn carbonato (pH 9,6) y se incuba luego durante 3h a 37C o 16h a 4C, tambin de
puede incubar a 40-50C en tampn fosfato (PBS) o en agua fisiolgica tamponada pH 7,2-
7,4. En cuanto a la solucin de lavado se elaborara una solucin salina con Tween 20 como
agente tensioactivo8, 5gr. De igual forma se debe conjugar la enzima, esta debe de poder
unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos, un substrato cromognico o fluorognico
conveniente. Las enzimas ms utilizadas son las fosfatas alcalina, peroxidasa de rbano y -
galactosidasa.

SISTEMA ENZIMA-SUSTRATO

Conjugados. La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y

anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato
cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin. Las enzimas ms utilizadas
son fosfatas alcalina, peroxidasa de rbano y -galactosidasa; a continuacin se muestra una
tabla con las ventajas y desventajas de cada una as como los substratos que se emplean con
cada una de ellas.

Las operaciones de marcado o conjugacin, llevan implcitas dos etapas: Purificacin de los
anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacin generalmente salina de
las protenas del antisuero, seguida de una dilisis y purificacin de la fraccin de anticuerpos
mediante filtracin molecular, cromatografa o separacin en gradiente de densidad mediante
ultracentrifugacin. Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a
una dosis de 1mg/mL. Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un
agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehdo o el del mperiodato sdico
(apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales).
Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccin
de IgGs y es la utilizacin de protena A o G marcadas con peroxidasa.

Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacin;
esta conservacin se suele realizar mediante liofilizacin, congelacin a 70C o filtrado
estril y conservacin a -20C mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado estril.

La bsqueda de la concentracin ptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA

empleado; para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados, se suele probar
diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones
de antisuero en placas tapizadas con antgeno a concentracin idnea. Aquella dilucin del
conjugado que produzca menor reaccin inespecfica (menor color de fondo o background)
con muestras negativas e implique una clara distincin de las muestras positivas, ser la
ptima. La eleccin de una concentracin de conjugado ptima va completamente ligada a
planteamientos econmicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro del conjugado an a
costa de aumentar el tapizado.

La eleccin del substrato es de gran importancia para la estandarizacin del mtodo ELISA y
hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, repetibilidad,
facilidad de lectura y complejidad de preparacin, as como estabilidad despus de la
reaccin.