Siti Fragili del cariotipo umano

1
 Oggi I siti fragili sono definiti come
punti sui cromosomi che presentano interruzioni o rotture non casuali quando le cellule sono
esposte a determinati agenti chimici o a specifiche condizioni di coltura.
regioni cromosomiche il cui DNA non ha compiuto il normale compattamento mitotico oppure
ha subito una despiralizzazione prematura (Sutherland, 1991).

Allestimento di metafasi da linfociti coltivati per errore in terreno TC199 un terreno povero in acido folico e timidina.
Presenza di rotture in siti non casuali.

Il termine sito fragile viene per la prima volta usato da

Hecht in riferimento ad una rottura ricorrente sul
braccio lungo del cromosoma 16
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 Sutherland et al. 1985
Laggiunta di acido folico al terreno TC199
riduce sensibilmente le rotture nelle regioni
fragili
Negli stessi anni allinterno di piccole famiglie un sito
di fragilit viene associato ad una forma di ritardo
mentale.
In queste famiglie il sito fragile nella regione Xq28
(Xq27.3) viene ereditato in associazione con il
ritardo mentale.
Il sito fragile viene osservato in metafasi di individui
affetti dalla patologia coltivando le cellule in
particolari condizioni: in assenza di acido folico nel
terreno di coltura.
Successivamente si comprese che lo stress indotto
dallassenza di acido folico ricadeva sul
metabolismo delle basi puriniche e pirimidiniche,
inibendo parzialmente la replicazione del DNA,
causando le rotture e non condensazioni visibili sui
cromosomi metafasici.
3
 Metabolismo cellulare
dellacido folico

timidina
monofosfato

folato - cofattore per la conversione

delluridina monofosfato in timidina
FRAXA
(UMP)
uridina
monofosfato 4
Queste discontinuit possono presentarsi unite da un sottile filamento di materiale visibile
al microscopio elettronico; in alcune metafasi invece si verifica una vera e propria rottura
in corrispondenza del sito fragile.

Sebbene i siti fragili siano talvolta espressi spontaneamente nei preparati cromosomici da
colture di linfociti, quasi tutti richiedono unalterazione delle condizioni di crescita in
grado di permetterne o di aumentarne lespressione (Sutherland, 1991).

Nomenclatura
es. FRA2G

2q24.3-31.1

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 Siti fragili

RARI o ereditabili COMUNI o costitutivi

Classificati in base alla frequenza con cui si ritrovano nella popolazione e in base alla loro ereditariet

Siti fragili rari

- sono presenti in una piccola percentuale della popolazione (< 5%);
- sono ereditati come carattere mendeliano semplice.

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 I siti fragili rari folato sensibili
Tutti i siti fragili rari indotti dal folato fino ad oggi caratterizzati presentano al loro interno una
ripetizione di trinucleotidi CGG il cui numero pu variare nei vari individui.
Il numero delle ripetizioni responsabile dellespressione del sito fragile.

Lespressione dei siti fragili rari stata associata ad una particolare classe di mutazioni, definite
mutazioni dinamiche, in cui una ripetizione di trinucleotidi pu essere soggetta ad espansione a causa di
diversi meccanismi molecolari nel corso delle generazioni

SINDROME DI MARTIN-BELL
SINDROME DELL X FRAGILE
forma pi comune di ritardo mentale dopo la sindrome di Down e la pi frequente fra quelle ereditarie
Sintomi
ritardo cognitivo ( incapacit linguaggio - ritardo mentale)
deficit dattenzione e iperattivit
ansia e umore instabile
ritardo nello sviluppo psicomotorio
Tratti somatici
viso stretto e allungato
fronte e mandibola prominenti
orecchie grandi e piedi piatti
macrorchidismo

Coltivando le cellule di individui affetti da sindrome dellX-fragile in un terreno povero di acido

folico, si osserva in una percentuale variabile di metafasi, lespressione di FRAXA
 Lubs, A marker X chromosome. Am J Hum Genet. 1969 May; 21(3): 231244.

FIG. 1.-Pedigree showing that each of the four retarded males had the
marker X chromosome.
Two females with the chromosome were normal. A third (II-3) must have
transmitted the chromosome to her son, but the secondary constriction
was not observed in 250 cells.
 Lubs, A marker X chromosome. Am J Hum Genet. 1969 May; 21(3): 231244.

FIG. 3.-Karyotype from the proband showing the marked secondary constriction
present in one-third of his cells.
The resulting satellites are smaller in diameter than the chromatid but larger
than any of the satellites on the acrocentric chromosomes.
 Lubs, A marker X chromosome. Am J Hum Genet. 1969 May; 21(3): 231244.

FIG. 4. The satellites appeared symmetrically at the end of the chromatids (left),
with displacement of one satellite to the other chromatid (left center),
as a single centrally placed satellite (center) or
rarely as tandem satellites (right).
 Lubs, A marker X chromosome. Am J Hum Genet. 1969 May; 21(3): 231244.

H3-thymidine was added

to one bottle from each
culture four hours prior
to harvesting

Fig. 5 Autoradiograph from III-I. The Karyotype with the emulsion in place is shown below
the usual karyotype.
The only chromosome with heavy labeling also was the chromosome with satellites (lower right).
 The FMR1 Gene

Fragile X syndrome (FXS) is the most common

known cause of inherited intellectual disability.
FXS affects both males and females. However,
females often have milder symptoms than males.
Number of people who have FXS is unknown, but
it has been estimated that about 1 in 5,000 males
are born with the disorder.
When the stretch of DNA expands beyond a
certain length, the gene is switched off and does
not produce the protein that it is normally makes.
This gene change is called a full mutation. A male
who inherits a full mutation exhibits Fragile X
syndrome because his only X chromosome contains
the mutated gene. A female may not be as severely
affected because each cell of her body needs to
use only one of its two X chromosomes and
randomly inactivates the other.
Fragile X is Inherited
Each child of a carrier woman has a 50% chance of
inheriting the mutated gene.
A mother who is a carrier of Fragile X has a 50%
chance of passing the mutated gene on to each of her
children. Those children can in turn also be carriers or
they might be fully affected with Fragile X syndrome.
Carrier men will pass the premutation to all their
daughters but none of their sons. These daughters are
carriers but they do not have Fragile X syndrome. The
Fragile X premutation can be passed silently down
through generations in a family before a child is born
with the syndrome.
 Causa
causata dallalterazione del gene FMR1 (Fragile Mental Retardation 1) situato sul cromosoma X (q27.3)
Ipermetilazione della regione 5-UTR del gene (CpG)

FMR1p

FMR1
17 esoni
lungo 38 Kb
tripletta CCG ripetuta nel 1 esone
il numero di ripetizioni della tripletta CCG polimorfico tra gli individui normali
il numero di ripetizioni della tripletta CCG del 1 esone determina lo stato di metilazione del gene

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 FMR1 e il ritardo mentale
FMR1p ha una funzione neurone specifica: in grado di legare specifici RNA riconoscendo una
sequenza consenso di legame
Regola la localizzazione e la traduzione di specifici mRNA essenziali nelle sinapsi nervose
Lassenza di FMR1p causa una diminuizione dello stimolo sinaptico
La perdita della funzione sinaptica ottimale potrebbe spiegare il ritardo mentale presente negli
individui che esprimono FRAXA
Oostra & Willemsen, A fragile balance: FMR1 expression levels. Hum Molec Genetics. 12(suppl. 2):R49-R57, 2003. doi: 10.1093/hmg/ddg298

Modello molecolare

NTs: neurotransmitters
NTFs: neurotrophic factors
NLS: nuclear localization signal
NES: nuclear export sequence
AMPA: (-amino-3-hydroxy-5-methyl
-4-isoxazole propionic acid)
mGluR5: metabotropic glutamate
receptors
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 MUTAZIONE DINAMICA

tipo di mutazione che cambia da generazione a generazione e nellindividuo durante le

fasi precoci dellembriogenesi

Individui portatori

Individui malati

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MUTAZIONI DINAMICHE e PATOLOGIE UMANE

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DIAGNOSI

Espansione delle triplette

Slittamento replicativo
Scambio tra cromatidi fratelli (SCE)
Errori di crossing-over durante la meiosi/
riparo
Conversione Genica:

scambio non reciproco fra sequenze per

effetto del quale una sequenza (accettrice)
diventa identica alla sequenza donatrice che
rimane inalterata.
Pu avvenire fra sequenze alleliche
(conversione genica interallelica) o non alleliche
(conversione genica interlocus)

R 17
Slittamento replicativo

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 Sister chromatid exchange (SCE)
is the exchange of genetic material between two identical sister chromatids.
A) Mechanism for occurrence of SCE when the leading strand
of a replication fork encounters a SSB or gap.

Steps 1 and 2: fork approaches a SSB.

Step 3: fork breaks.
Step 4: repair synthesis occurs at the gap in the unbroken chromatid. The curved black arrow signifies
a conformational change to facilitate visualization of subsequent events.
Step 5: processing of the broken duplex creates a 3 single-strand tail.
Step 6: Rad51 mediates strand invasion.
Step 7: resolution of the Holliday junction in the orientation shown by the green arrows results in SCE,
as illustrated by the red/blue color junctions in the new parental strands. Resolution in the
orientation shown by the purple arrowheads would not produce an SCE.
Step 8: the replication fork is restored.

Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 616(12):11-23, 2007.

http://dx.doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2006.11.017 19
Crossing over ineguale

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Conversione genica

21
 Come avviene lespansione?
Durante la meiosi, in particolare quella femminile

Sembra essere presente una selezione negativa nella conversione tra stadio pre-mutato a stadio mutato nella
gametogenesi maschile
La premutazione espande in mutazione piena quando trasmessa da una femmina portatrice ma non da un maschio
portatore perch lespansione della premutazione in mutazione piena avviene solo durante la meiosi dei gameti
femminili perci un mnaschio portatore ha solo alleli con premutazione nel suo sperma
le figlie di un maschio portatore non sono a rischio di manifestare il fenotipo dellX fragile
quasi tutti i maschi con mutazione piena presentano i sintomi della malattia mentre circa la met delle femmine
presentano ritardo mentale di grado variabile

GENETICA DELLA SINDROME DELLX FRAGILE

La sindrome dellX Fragile una sindrome legata allX
a trasmissione dominante con penetranza ridotta ( 80% - 30% )

Differenza tra e Variazioni nellespressione del fenotipo

associato
Espressivit Variabile, diventando pi
Frequenza grave nelle generazioni successive
1/4000 maschi
1/6000 femmine

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 Nelle cellule somatiche dei pazienti X-FRA linstabilit mitotica delle ripetizioni della mutazione piena
del gene FMR1 causa delle espansioni pi corte o pi lunghe, perci tutti i pazienti sono

MOSAICI SOMATICI

mosaicismo di lunghezza n di ripetizioni mutazione piena - premutazione)

mosaicismo di metilazione stato di metilazione (mutazione piena)

Differenze tra maschi e femmine

I maschi che presentano uno stato di mutazione piena manifestano il fenotipo

Le femmine con mutazione piena presentano un fenotipo pi lieve

46,XX un allele produce la proteina WT

Inattivazione casuale dell X

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 Basi molecolari della fragilit

Strutture secondarie inusuali Esclusione dai complessi istonici

Blocco replicativo Difetti di condensazione

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Linterferenza con il processo di replicazione induce a livello delle regioni fragili
unulteriore rallentamento della replicazione causando in tali siti rotture e
sottocondensazioni
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Altri siti fragili rari

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 Caratteristiche dei siti fragili rari clonati

Locus Agente Ripetizione Numero ripetizioni
inducente

Normale Premutazione Mutazione
piena

FRAXA
(Xq27.3) Acido folico CCG 6-52 59-230 230-2000

FRAXE
(Xq28) Acido folico CCG 4-39 31-60 200-900

FRAXF
(Xq28) Acido folico CCG 7-40 ? 306-1000

FRA11B
(11q23.3) Acido folico CCG 11 80 100-1000

27
28
 Siti fragili rari BrdU sensibili
Analogo strutturale della timidina,
alogenata in posizione 5
Il suo maggiore ingombro sterico rispetto alle altre basi cambia la conformazione
della cromatina in una forma pi aperta, impedendo il riconoscimento della doppia
elica da parte di numerosi enzimi, tra cui la DNA polimerasi

Tutti i siti fragili rari indotti dalla BrdU fino ad oggi caratterizzati mostrano a livello
della rottura/sottocondensazione, unespansione di dinucleotidi AT

FRA10B
non associato ad alcuna patologia o fenotipo
colocalizza con un minisatellite polimorfico ricco in AT
la cui sequenza consenso di circa 42bp, in grado di
ripiegarsi in una struttura non-B stabile
il numero delle ripetizioni variabile tra individui diversi:
Alleli normali a basso numero di copie (circa il 66% degli alleli
fino a1 kb)
Alleli normali a medio numero di copie
(circa il 33% degli alleli fino a 4 kb)
Alleli normali ad alto numero di copie
(circa l1% degli alleli fino a 5 kb)
FRA10B minisatellite consensus sequence 29
In un processo simile a quello proposto per FRAXA il numero di copie del mini-satellite pu
espandere ad un livello critico (sopra le 5Kb) manifestandosi a livello citogenetico come sito fragile

Interferenza con la replicazione

Difetti di condensazione

Siti fragili rari Distamicina A sensibili

Antibiotico oligopeptidico in grado di legarsi a sequenze ricche in A/T
esternamente al solco minore della doppia elica. Il legame della distamicina A
al DNA ne altera la normale conformazione, interferendo con lattivit della
DNA polimerasi.

Anche i siti fragili rari indotti dalla distamicina A fino ad oggi caratterizzati mostrano
a livello della rottura/sottocondensazione, unespansione di dinucleotidi AT

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 FRA16B

non associato ad alcuna patologia o fenotipo

colocalizza con un minisatellite polimorfico ricco in AT la cui
sequenza consenso di 33bp, in grado di
ripiegarsi in una struttura non-B stabile
il numero delle ripetizioni variabile tra individui diversi:
Alleli normali (circa 7-12 copie)
Alleli che esprimono il sito fragile
(circa 2000 copie)

Quindi

I siti fragili rari presentano un sito specifico di rottura a livello dellespansione di tri- e di-
nucleotidi
Lespansione responsabile delle rotture o sottocondensazioni in quanto interferisce con il
processo di replicazione del DNA e con la formazione delle strutture di ordine superiore della
cromatina

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