Muestreo para anlisis microbiolgico de los alimentos

Cuando se elaboran alimentos o cuando se tiene que controlar su

calidad y/o seguridad, los anlisis microbiolgicos proporcionan
informacin muy valiosa, respecto a: la calidad de las materias primas,
las condiciones sanitarias en que se proces el alimento, y sobre la
efectividad del proceso, especficamente de los mtodos de
conservacin.
Como qumicos sabemos que antes de proceder a un anlisis es
indispensable:
- Tener claro el objetivo de un anlisis,
- Identificar los analitos adecuados y las tcnicas para determinarlos, y
- planear correctamente el tipo y la forma de muestreo y de manejo de
las muestras.

Para determinar la calidad de un alimento se debe tomar una muestra y

suponer que la calidad de esa muestra refleja la del lote del que fue
tomado. La validez de esta extrapolacin depender de la
representatividad de las muestras y de la exactitud y precisin del
anlisis. De ah la importancia de establecer un plan de muestreo
adecuado.
Es necesario entonces contar con un criterio microbiolgico para
determinar si un alimento es de buena o de mala calidad, evaluando la
seguridad del alimento, el seguimiento de buenas prcticas de
manufactura, la vida de anaquel o estante y la utilidad o adecuabilidad
de un alimento o ingrediente para cierto propsito (Smoot y
Pierson,1997

Planes de muestreo para anlisis microbiolgico en alimentos

Un plan de muestreo debe incluir un procedimiento de muestreo y un

criterio de decisin.
Una muestra es un grupo de unidades que se sustraen para estimar el
carcter de una poblacin.
La unidad de muestra es cada uno de los elementos que constituyen
la muestra.
Un plan de muestreo est descrito por 2 valores: n, que es el nmero de
unidades a analizar o examinadas de un lote, y c, nmero mximo
permitido de unidades de muestra defectuosas (Plan de dos clases), o
marginalmente aceptables (Plan de tres clases).
Un plan de muestreo es ms estricto mientras mayor sea el nmero de
unidades analizadas (n) y menor el nmero mximo de unidades
defectuosas a aceptar (c).
El plan de muestreo debe ser econmicamente factible.

Mtodos de muestreo
Existen diferentes tipos de datos:
En el caso de los de atributos, las decisiones se basan en la presencia o
ausencia de algn microorganismo o en el resultado positivo o negativo
de una prueba. En los de medida, la variable es continua, como una
concentracin o un nmero. Los de medida pueden ser convertidos en
los del tipo atributo estableciendo un valor lmite.

Existen dos tipos de planes de muestreo reconocidos internacionalmente,

definidos por la ICMSF (International Comission on Microbiological
Specification for Food):

Plan de dos clases, (por ejemplo: n = 5, c = 0 / n = 5, c = 2 , m =)

Plan de tres clases, (por ejemplo: n = 5, c = 2, m = 103 , M = 10 )

El Plan de dos clases es utilizado generalmente para patgenos, mientras

que el Plan de tres clases, es utilizado frecuentemente para el anlisis de
indicadores de higiene, donde es posible la cuantificacin (en unidades de
masa o de volumen).

Planes de 2 clases
Son aqullos en los que la muestra se divide en dos clases, despus de
analizar las unidades:
_ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se
consideran aceptables.
_ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de m se
consideran defectuosas.
Se pudo haber realizado una prueba para determinar la presencia o
ausencia de un Microorganismo, o una para determinar una cuenta
microbiana o la concentracin de una toxina. m es un valor crtico arriba
del cual la unidad analizada se considera defectuosa (rechazable)

Planes de 3 clases
Son aqullos en los que la muestra se divide en tres clases, despus de
analizar las unidades:
_ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se
consideran aceptables.
_ Las unidades con las que se obtengan valores entre m y M se
consideran marginalmente aceptables.
_ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de M se
consideran defectuosas (rechazable).
En ambos casos, la probabilidad de aceptacin depender de los valores
n y c seleccionados.
Las ventajas del uso de los planes de tres clases son:
- De acuerdo con la experiencia prctica, an observando buenas
prcticas de manufactura, algunas unidades pueden resultar en el rango
marginalmente aceptable, sin causar problemas, y se pueden aceptar.
- Se afectan menos por cambios en la distribucin de microorganismos
dentro de un lote, debidos a causas desconocidas.
- Permiten advertir aumentos en los riesgos, si existe una tendencia de
aumento en el nmero de unidades marginalmente aceptables.

PLAN DE MUESTREO DE DOS CLASES

n = nmero de unidades a analizar
c = nmero mximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar
m = cantidad que distingue aceptables de defectuosas

m
_____________________________|_______________________________
Aceptables | Defectuosas

Figura 1: Planes de muestreo de dos clases

PLANES DE TRES CLASES

Resultados cuantitativos
Concentraciones

m M
____________________|____________________|___________________
aceptables | marginalmente | defectuosas
aceptables

Figura 2: Planes de muestreo de tres clases

Diagrama de flujo sugerido por el ICMSF (2002) para la seleccin del

tipo de plan de muestreo:

Medicin del microorganismo por

Pruebas de presencia o ausencia Pruebas de

concentracin
|
Plan de dos clases
Plan de tres clases
|
|
Es posible aceptar la presencia de Seleccionar
nyc
ste microorganismo en el alimento?
| |
NO SI
c=0 c> 0
| |
Seleccionar Seleccionar
n nyc

Figura 3 Seleccin del tipo de plan de muestreo

Seleccin del plan de muestreo

Para seleccionar un plan de muestreo adecuado, es necesario

considerar:

1. La seriedad del tipo de riesgo segn el microorganismo a analizar.

2. Las condiciones a las que se expondr el lote del alimento.

Tipo de riesgo
El plan de muestreo deber ser ms estricto mientras mayor sea el
riesgo que implique el tipo de microorganismo a analizar. Los factores a
considerar en el tipo de riesgo son:
Mdicos y epidemiolgicos, que incluyen la severidad clnica de la
enfermedad producida, su frecuencia, duracin, la infectividad del
microorganismo, la posibilidad de ocurrencia del estado portador y la
extensin potencial.
Etiolgicos, como la asociacin inherente con riesgos severos, como
ocurre en el caso de Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Shigella
dysenteriae, Entamoeba histolytica, Taenia solium y Taenia saginata,
que sobreviven y se multiplican en el hombre, daan su salud,
amenazan su vida y presentan dosis infectivas pequeas, o como
Clostridium botulinum, que produce una toxina fatal.
Factores clnicos: se debern tomar en cuenta las altas tasas de
mortalidad ocasionadas por enfermedades como la disentera y el
botulismo, las secuelas severas de la accin de Streptococcus beta-
hemoltico, la convalescencia larga de enfermedades como la fiebre
tifoidea, la paratifoidea, la brucelosis y la vulnerabilidad de nios,
ancianos y enfermos.
Factores epidemiolgicos: la frecuencia de ciertos tipos de
microorganismos patgenos de encontrarse distribuidos ampliamente en
el reino animal, las costumbres locales, los estndares de higiene, la
asociacin entre ciertos tipos de patgenos con ciertos alimentos, las
costumbres dietticas y de la preparacin de los alimentos.
Se clasifica entonces a los microorganismos o grupos de
microorganismos de acuerdo al tipo de riesgo que representan en:

Sin riesgo a la salud. Se incluye aqu a los grupos microbianos

responsables de la descomposicin de alimentos, que disminuyen su
aceptabilidad, su vida de anaquel o estante, pero que como grupo de
microorganismos no se considera que causen dao a la salud.
Riesgo indirecto. Se considera a los microorganismos indicadores,
como los microorganismos mesfilos aerobios, los coliformes totales y
fecales, los enterococos y Staphylococcus aureus, que indican (de
manera indirecta) la posible presencia de microorganismos patgenos.

Riesgo moderado de extensin moderada. Son microorganismos

ubicuos en la naturaleza y la enfermedad que producen est relacionada
con nmeros grandes del patgeno.

Riesgo moderado de extensin amplia. Incluye microorganismos

que presentan riesgos epidemiolgicos severos. Son diseminados por
alimentos especficos, pero pueden introducirse al alimento por
contaminacin ambiental o cruzada. La enfermedad resulta de inculos
relativamente pequeos.

Riesgo severo. Los microorganismos incluidos en este grupo presentan

riesgos severos a la salud. Ms adelante, se presenta una clasificacin
de microorganismos y parsitos de acuerdo con los criterios anteriores.
Se debe mencionar que sta no es una clasificacin rgida, ya que se
debe tomar en cuenta que lo que para un adulto normal representa un
riesgo moderado, para un adulto, un beb o un enfermo puede ser un
riesgo severo.

Efecto de las condiciones a las que se expondr el alimento.

Dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la del alimento,
existen condiciones que pueden provocar:

- Aumento del riesgo. ste puede ocurrir por recontaminacin despus

del procesamiento, uso de tal manera que permita la multiplicacin de
microorganismos, cuando la coccin no ocurre inmediatamente antes del
consumo.
- El riesgo no se modifica.
- Disminucin del riesgo. Por ejemplo, cuando se sabe que se aplicar al
alimento un procesamiento trmico.
Combinando estos dos aspectos, el ICMSF propone que se consideren 15
casos, as como un plan de muestreo para cada uno (Tabla 1).

Determinacin de los valores m y M.

El valor m se define como el nivel de microorganismos aceptable y

obtenible con buenas prcticas de manufactura. Puede tener un valor de
cero o de ausencia de cierto microorganismo, o el nivel de detectabilidad
de una prueba, o un valor numrico.
El valor M es un nivel de contaminacin riesgoso, provocado por malas
prcticas higinicas.

Microorganismos de descomposicin: sern los niveles de

microorganismos que producen una descomposicin detectable (olor o
sabor), o una vida de anaquel o estante,
inaceptablemente corta.

Indicadores de sanidad: niveles que indican una condicin de sanidad

inaceptable.

Microorganismos que presentan un riesgo a la salud: los niveles

de microorganismos (o concentracin de toxinas) que producen
enfermedades. Tabla 1 Agrupacin de microorganismos y de parsitos
de acuerdo al tipo de severidad del riesgo (Smoot y Pierson, 1997).

Tipo de riesgo y organismo

Riesgo severo
Clostridium botulinum tipos A, B, E y F
Shigella dysenteriae
Salmonella typhi. serotipos paratyphi A y B
Escherichia coli enterohemorrgica
Virus de la hepatitis A y E
Brucella abortus, Brucella suis
Vibrio cholerae
Vibrio vulnificus
Taenia solium

Riesgo moderado de extensin potencialmente amplia

Listeria monocytogenes
Salmonella spp.
Shigella spp.
Otras cepas enterovirulentas de E. coli
Streptococcus pyogenes
Rotavirus
Virus del grupo Norwalk
Entamoeba histolytica
Diphyllobotrium latum
Ascaris lumbricoides
Criptosporidium parvum

Riesgo moderado de extensin limitada:

Bacillus cereus
Campylobacter jejuni
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolitica
Giardia lamblia
Taenia saginata

Tabla 1 Planes de muestreo sugeridos por el ICMSF (2002) para las

diferentes combinaciones de riesgo a la salud y condiciones de uso.

Condiciones en las que se espera que el alimento

sea manejado y consumido despus del muestreo
Grado de Condiciones Condiciones Condiciones
riesgo que reducen el que no que
riesgo modifican el incrementan el
riesgo riesgo
Sin riesgo Vida de anaquel Sin cambio Vida de anaquel
directo, vida de o estante o estante
anaquel, los m.o. aumenta Caso 2 disminuye
solo producen Caso 1 Plan de 3 clases Caso 3
descomposicin Plan de 3 clases n = 5, c = 2 Plan de 3 clases
del n = 5, c = 3 n = 5, c = 1
alimento
Riesgo a la Riesgo Riesgo no Riesgo
salud disminuye cambia aumenta
Bajo, indirecto Caso 4 Caso 5 Caso 6
(m.o. Plan de 3 clases Plan de 3 clases Plan de 3 clases
indicadores) n = 5, c = 3 n = 5, c = 2 n = 5, c = 1
Moderado, Caso 7 Caso 8 Caso 9
directo, Plan de 3 clases Plan de 3 clases Plan de 3 clases
de extensin n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 n = 10, c = 1
limitada
Moderado, Caso 10 Caso 11 Caso 12
directo, Plan de 2 clases Plan de 2 clases Plan de 2 clases
de extensin n = 5, c = 0 n = 10, c = 0 n = 20, c = 0
amplia
Severo, directo Caso 13 Caso 14 Caso 15
Plan de 2 clases Plan de 2 clases Plan de 2 clases
n = 15, c = 0 n = 30, c = 0 n = 60, c = 0

PREPARACIN Y DILUCIN DE LA MUESTRA

Las muestras que van a examinarse por mtodos microbiolgicos deben

procesarse en el menor tiempo posible y en forma asptica.

Diluyentes

a- Agua de peptona al 0,1%

- Se disuelve 1 g de peptona en 1 l de agua destilada y se ajusta el pH a
7 0,1. Se llenan los frascos o tubos de dilucin con volmenes
predeterminados y se esteriliza; si la muestra es homognea es posible
realizar la dilucin en ellos. Ej. 225 ml, 9 ml, etc.

b- Agua peptonada salina

- Se disuelve 1 g de peptona y 8,5 g de ClNa en 1 l de agua destilada y
se ajusta el pH a 7 0,1. Se llenan los frascos o tubos de dilucin con
volmenes predeterminados y se esteriliza.

Procedimiento

- Se tara el vaso de una licuadora estril, y luego se pesan 50 0,1 g de

muestra
representativa.
- Si el contenido del envase no es homogneo (por ejemplo comida
congelada). Se toma una muestra de 50 g de un homogeneizado de toda
la muestra, o analizar cada porcin de alimento diferente por separado,
dependiendo del propsito de la prueba.
- Se adiciona al vaso de la licuadora 450 ml del diluyente recomendado.
Esto provee una dilucin de 1/10.
- Se licua el alimento y se lo digiere rpidamente. Se comienza a
velocidad baja, luego se aumenta la velocidad durante algunos
segundos, gradualmente en pocos seg. incrementar a mx. voltaje, en
un tiempo total de 2 min.
- Se mide 1 ml de la dilucin o 10 del material licuado, evitando la
espuma, se lleva a frascos de dilucin que contienen 99 ml, o 90 ml,
segn la alcuota tomada.
- Se agita esta dilucin y las subsiguientes vigorosamente por lo menos
25 veces en un arco de 30 cm.
- Se repite este procedimiento utilizando las diluciones de 10 -1, 10-2, 10-
3, y 10-4.

2- DETERMINACIN DEL NMERO DE MICROORGANISMOS

AEROBIOS MESFILOS

Enumeracin de microorganismos aerobios mesfilos- Mtodo del

recuento estndar en placa. ICMSF Microorganismos de los Alimentos-Vol
I- Tcnicas de anlisis microbiolgicos- Parte II-

Preparacin del Medio de Cultivo

Se pesan 22,5 g de Agar Plate Count (agar peptona de casena - extracto

de levadura) y se suspenden en un litro de agua destilada, se deja
remojar durante 15 min. y luego se hierve hasta disolucin total.
Posteriormente se esteriliza en autoclave (15 min. a 121 C). Conservar
en heladera hasta el uso.

Procedimiento

- Se prepara la muestra como se recomend en el punto 1.

- Se pipetea por duplicado en cajas de Petri estriles, alcuotas de 1 ml,
a partir de las diluciones, 10-1, 10-2 , 10-3 , 10-4. - Se licua el Agar Plate
Count en un bao de agua hirviente sin exponerlo a altas temperaturas,
ni a perodos prolongados de calentamiento.
- Se atempera el agar a 44 - 46 C y se controla su temperatura
cuidadosamente para evitar la muerte de las bacterias y se agrega
rpidamente a las cajas de Petri (10 - 15 ml). El tiempo transcurrido
desde la preparacin de la dilucin hasta la adicin del agar no debe
exceder los 20 minutos.
- Se debe mezclar bien por rotacin (5 veces para un lado 5 veces para
el otro).
- Una vez solidificado el agar, se invierten las cajas y se las incuba a
30C durante 48 3 hs.
- Se debe computar el recuento estndar en placa.
Para ello:
a- Se seleccionan las cajas correspondientes a la dilucin que contenga
entre 30 y 300 colonias.
b- Utilizando un contador de colonias se cuentan las colonias que
aparecen en la caja.
c- Se toma la media aritmtica de los recuentos y se multiplica por el
factor de dilucin (recproco de la dilucin utilizada).
d- Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos
menores de 30 y mayores de 300, se toma el promedio de los dos
recuentos y se saca la media aritmtica.

Ejemplo:

350 colonias dil. 10-1 = 3.500 colonias

26 colonias dil. 10-2 = 2.600 colonias

Promedio = 3050 colonias = 31 x 102 UFC /gramo

e- Si el nmero de colonias de las cajas de dos diluciones consecutivas

estn dentro del rango de 30 a 300, se computa el recuento para cada
una de las diluciones y se reporta el promedio de los dos valores
obtenidos, pero si el recuento mayor contiene dos veces o ms al menor,
se reportar el recuento del menor, especificando recuento estndar en
placa estimado.

3- DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES

El grupo de los coliformes totales incluye bacterias con forma de bacilos

o bastones, Gram negativos no esporulados aerobios o anaerobios
facultativos, capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas en
24 o 48 hs. a 35 C.
En los medios lquidos, el nmero de coliformes presentes puede ser
estimado mediante la tcnica de tubos mltiples de fermentacin del
NMP (nmero ms probable).

Tcnica de los tubos mltiples o del NMP

En el procedimiento de tubos de fermentacin para la determinacin de

la densidad de coliformes se deben considerar tres etapas:
- La prueba presuntiva
- La prueba confirmatoria
 - La prueba complementaria.

En la prueba presuntiva, la actividad metablica de las bacterias se

estimula vigorosamente y se lleva a cabo una seleccin densa de los
organismos que utilizan la lactosa. Luego de la incubacin, un cultivo de
cada tubo gas positivo en la prueba presuntiva se transfiere a un tubo
de medio para la prueba confirmativa. Esta prueba reduce la posibilidad
de resultados falsos que pueden ocurrir por la actividad metablica de
los microorganismos formadores de esporas o por la produccin
sinergista de gas debido a que algunas cepas bacterianas no pueden,
individualmente producirlo a partir de la fermentacin de la lactosa.

Procedimiento de la prueba presuntiva

Medio de Cultivo

-Prueba presuntiva de la presencia de coliformes: produccin de gas en caldo

LST (lauryl sulfato Triptosa)
- Se prepara la muestra segn el procedimiento recomendado en el punto 1.
- Se inocula 1 ml de cada una de las diluciones decimales de la muestra
en cada uno de 3 tubos de caldo y se incuba los tubos a 35 - 37 C, por
24 - 48 hs.
-Se interpreta como positivo los tubos con produccin de gas generada por
fermentacin de lactosa.

Prueba confirmativa

- Caldo Brila (caldo verde brillante-bilis-lactosa). La bilis y el verde

brillante inhiben notablemente el crecimiento de la flora acompaante
indeseable, inclusive clostridios degradadores de lactosa. La
fermentacin con produccin de gas como ndice de la presencia de
coliformes, se investiga mediante tubos de fermentacin (tubos
Durham).
- Todos los tubos positivos (con formacin de gas) de la prueba
presuntiva se someten al ensayo confirmativo, para lo cual se siembra
una ansada de cada tubo positivo en caldo verde brillante-bilis-lactosa.
-Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.
-Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de incubacin
de 24 a 48 h.

Prueba complementaria.
Se siembra en estras en pacas con agar EMB de Levine o agar ENDO C y
se incuba a 35 C.

4- DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES DE ORIGEN

FECAL

Se utiliza la determinacin de coliformes fecales para diferenciar los

coliformes de origen fecal (intestinos de animales de sangre caliente) de
los coliformes de otras fuentes.
Se siembra en caldo EC, un inculo que proviene de tubos gas positivos
en caldo LST (lauryl sulfato Triptosa) y se incuba a 44 0,1C, por 24 hs,
determinando el crecimiento por produccin de gas.
Los tubos positivos (con formacin de gas) se someten al ensayo
confirmativo, para lo cual se siembra por estras en pacas con agar EMB
de Levine o agar ENDO C. Las colonias de E. coli, en EMB, aparecen de color gris
metlico con un centro oscuro o incluso negro Las colonias tpicas, se deben aislar
y a partir de colonias puras, se hace coloracin de Gram y las pruebas
bioqumicas cuando se desea confirmar presencia de E.coli.

5- DETERMINACIN DE STAFILOCOCCUS AUREUS

Recuento de estafilococos coagulasa positiva. ICMSF. Microorganismos

de los Alimentos-Vol I- Tcnicas de anlisis microbiolgicos- Parte II-S.
aureus-

Un gran nmero de medios se han formulado para la numeracin de St.

aureus. Ellos difieren principalmente en la naturaleza de los agentes
selectivos usados, entre ellos estn el Telurito de sodio, el Cloruro de litio
azida de sodio, glicina y polimixina.
Determinar la presencia de este microorganismo, es importante porque
adems de ser indicativo de la calidad microbiolgica del alimento,
algunas de sus cepas tienen la capacidad de formar enterotoxina,
responsable, esta ltima de la mayora de los casos de intoxicaciones
alimentarias.

- Numeracin de St. coagulasa positivos. Mtodo de recuento en placa.

Procedimiento

- Se preparan las muestras segn lo recomendado en el punto 1.

- Se plaquean placas con agar Baird Parker y se seca la superficie de las
mismas en estufa.
- Se pipetea por duplicado, 0,1 ml de las diluciones de la muestra en la
superficie de cada placa de agar y se dispersa cada porcin mediante
una esptula de vidrio estril, hasta que la superficie del medio parezca
seca.
- Se incuban las placas invertidas a 35 -37 C por 30 - 48 hs.
- Se marcan las posiciones de estas colonias y se incuba otras 18 hs.
- Luego de las 48 hs. se seleccionan las placas que presenten de 20 a
200 colonias separadas y se cuentan todas las colonias negras y
brillantes con un margen blanco angosto y rodeadas de zonas claras
extendidas en el medio opaco. Existe una alta probabilidad de que estas
colonias sean de Staphyloccus aureus.
- Se marca la posicin de estas colonias e incuba otras 18 hs.
- Luego de 48 hs se cuentan todas las colonias negras brillantes con o
sin margen blanco y sin zonas claras. Se somete un nmero significativo
de colonias sospechosas (no menos de 5) a la prueba de la coagulasa.
- Se cuentan las colonias que producen zonas claras despus de 30 hs
de incubacin y la proporcin de aquellas no caractersticas que dieron
coagulasa positiva y se calcula por las diluciones usadas, el nmero de
St. aureus /g de alimento.
- Es importante efectuar la lectura de los resultados a las 30 hs. y no a
tiempos menores.

Como medio alternativo puede usarse Agar Chapman (medio selectivo,

donde las colonias se observan de color dorado), siguiendo el mismo
procedimiento para la siembra. El conteo se realiza a las 48 hs.

6- DETERMINACIN DE SALMONELLA

No es posible recomendar un solo mtodo para el aislamiento de

Salmonella que sea completamente satisfactorio para todos los
alimentos y para todos los serotipos. Los mtodos que se utilizan son
similares en esencia y constan de los siguientes pasos.
a- Pre-enriquecimiento
b- Enriquecimiento
c- Siembra en placa de agar selectivo
d- Identificacin taxonmica de colonias sospechosas de ser Salmonella.

La complejidad del proceso se debe a que estos grmenes se diseminan

fundamentalmente en las materias fecales, de modo directo o indirecto.
Por esta razn, Salmonella est por lo general, presente en los alimentos
junto a otros microorganismos, en particular con miembros de las
enterobacteriaceaes.
Los alimentos ms frecuentemente contaminados son los de origen
animal (huevos, carnes rojas y blancas). Los alimentos procesados
pueden ser vehculo de salmonellas, si contienen un ingrediente
contaminado y el procedimiento es inadecuado o si se contaminan luego
del proceso por operarios portadores o por roedores o insectos, o
contaminacin cruzada con alimentos crudos.
La finalidad del enriquecimiento no selectivo, es permitir que las clulas
bacterianas comiencen el proceso de recuperacin y de multiplicacin
normal, sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que
pueden ser txicas para estos microorganismos.
El empleo de caldos de enriquecimiento tiene como fin estimular la
multiplicacin de las salmonellas y reducir o inhibir el crecimiento de los
microorganismos competidores.

Mtodo para el aislamiento de Salmonella

Comprende tres fases fundamentales.

a- Enriquecimiento no selectivo
b- Enriquecimiento selectivo
c- Siembra en placas de medios selectivos

a- Pre-enriquecimiento de Salmonella
Medio de cultivo

- Caldo lactosa

Procedimiento

- Se mezcla la muestra con 9 volmenes de medio de enriquecimiento.

- Si la muestra no es soluble en el medio de cultivo o si no se dispersa
fcilmente, se lica la muestra con el medio de enriquecimiento.
- Para productos crnicos, se pican 25 g y se los coloca en un vaso
mezclador estril y se adicionan 225 ml del medio.
- Se incuba el medio de preenriquecimiento por 18-24 hs a 35-37 C.

b- Enriquecimiento Selectivo de Salmonella

Medio de cultivo

- Caldo de enriquecimiento tetrationato

Procedimiento

- Se inocula 1 ml del cultivo efectuado en el medio de enriquecimiento

no selectivo, en 10 ml de caldo de enriquecimiento tetrationato.
- Se incuba a 35-37 C durante 18-24 hs.

c- Aislamiento por siembra en placa de agar selectivo

Medio de cultivo

- Agar BPLS (agar - verde brillante - rojo de fenol- lactosa - sacarosa)

- Agar bismuto sulfito
- Agar SS

Procedimiento

- Se transfiere una ansada del medio de enriquecimiento selectivo a la

superficie de una placa de cada uno de los medios slidos de agar
selectivo y se siembra en estras de modo que se obtengan colonias
aisladas.
- Se incuban las placas a 37 C por 24 hs.

Interpretacin en agar SS

Las colonias lactosa-negativa son incoloras. Shigella y la mayora de

Salmonella.
Los grmenes lactosa-positivos presentan coloracin rosada hasta rosa.
E coli.
Los microorganismos formadores de H 2S presentan colonias con centro
negro. Proteus.

d- Pruebas bioqumicas de verificacin de Salmonella

Medio de cultivo

- Agar lisina hierro (LIA)

- Agar hierro tres azcares (TSI)

Procedimiento

- Se pica con una aguja de inoculacin estril, dos o ms colonias tpicas

sospechosas de los medios slidos de agar selectivo a tubos con agar
TSI y LIA.
- Se inocula los medios por estras sobre la superficie de la parte
inclinada y por picadura en la columna.
- Se incuban los cultivos durante 24 hs a 35-37 C.
- Se desechan los cultivos que no den reacciones tpicas de Salmonella
en los medios ensayados.
Las reacciones tpicas en el agar LIA consisten en superficie inclinada
violeta (reaccin de descarboxilacin) y una columna vertical violeta
(cido, por fermentacin de la glucosa) con produccin de cido
sulfhdrico positiva.
Las reacciones tpicas en el agar TSI consisten en una parte roja
(reaccin alcalina) y una columna de medio amarilla (cido, por
fermentacin de la sacarosa) con produccin de cido sulfhdrico y a
veces de gas.

7- DETERMINACIN DE MOHOS Y LEVADURAS

Todos los mohos y levaduras crecen bien en valores de pH de 5 o

menores, tolerando alguno de ellos valores de actividad de agua bajos.

Medio de cultivo

- Agar patata-glucosa
- Agar YGC

Procedimiento

- Se prepara la muestra del alimento segn el punto 1.

- Se pipetea por duplicado a placas de Petri estriles, alcuotas de las
diluciones 10-2 , 10-3 , 10-4 .
- Inmediatamente se adicionan a las placas 10-15 ml de medio de
cultivo licuado y temperado a 44-46 C.
- Se mezclan las alcuotas con el agar mediante movimientos de vaivn
y rotacin.
- Una vez solidificado el agar, se invierten las placas y se las incuba a
20-24 C durante 3-5 das.
- Se cuentan las colonias de las placas que contengan entre 20 y 100.
- Se computa el nmero de hongos y levaduras /g ml del alimento.
Tabla1. Numero ms probable NMP intervalo de confianza a un nivel de
95 % de probabilidad para diversas combinaciones de tubos positivos en
series de 3 y de 5 tubos. Cantidad inoculada de muestra: 1,0 0,1
0,01gramos o ml.

Combinacin Serie de 3 tubos Serie de 5 tubos

de tubos Intervalo de confianza (95 Intervalo de confianza (95

%) %)
positivos NMP / g Mnimo Mximo NMP/ g Mnimo Mximo
0-0-0 <0,3 < 0,05 < 0,9 < 0,2 < 0,05 < 0,7
0-0-1 0,3 < 0,05 0,9 0,2 < 0,05 0,7
0-1-0 0,3 < 0,05 1,3 0,2 < 0,05 0,7
0-2-0 - - - 0,4 < 0,05 1,1
1-0-0 0,4 < 0,05 2,0 0,2 < 0,05 0,7
1-0-1 0,7 0,1 2,1 0,4 < 0,05 1,1
1-1-0 0,7 0,1 2,3 0,4 < 0,05 1,1
1-1-1 1,1 0,3 3,6 0,6 < 0,05 1,5
1-2-0 1,1 0,3 3,6 0,6 < 0,05 1,5
2-0-0 0,9 0,1 3,6 0,5 < 0,05 1,3
2-0-1 1,4 0,3 3,7 0,7 0,1 1,7
2-1-0 1,5 0,3 4,4 0,7 0,1 1,7
2-1-1 2,0 0,7 8,9 0,9 0,2 2,1
2-2-0 2,1 0,4 4,7 0,9 0,2 2,1
2-2-1 2,8 1,0 15 - - -
2-3-0 - - - 1,2 0,3 2,8
3-0-0 2,3 0,4 12 0,8 0,1 1,9
 3-0-1 3,9 0,7 13 1,1 0,2 2,5
3-0-2 6,4 1,5 38 - - -
3-1-0 4,3 0,7 21 1,1 0,2 2,5
3-1-1 7,5 1,4 23 1,4 0,4 3,4
3-1-2 12 3 38 - - -
3-2-0 9,3 1,5 38 1,4 0,4 3,4
3-2-1 15 3 44 1,7 0,5 4,6
3-2-2 21 3,5 47 - - -
3-3-0 24 3,6 130 - - -
3-3-1 46 7,1 240 - - -
3-3-2 110 15 480 - - -
3-3-3 240 > 15 > 480 - - -
4-0-0 - 1,3 0,3 3,1
4-0-1 - 1,7 0,5 4,6
4-1-0 - 1,7 0,5 4,6
4-1-1 - 2,1 0,7 6,3
4-1-2 - 2,6 0,9 7,8
4-2-0 - 2,2 0,7 6,7
4-2-1 - 2,6 0,9 7,8

Combinacin Serie de 3 tubos Serie de 5 tubos

de tubos
Intervalo de confianza (95 Intervalo de confianza (95
positivos
%) %)
NMP / g Mnimo
positivos
4-3-0 - 2,7 0,9 8,0
4-3-1 - 3,3 1,1 9,3
4-4-0 - 3,4 1,2 9,3
5-0-0 - 2,3 0,7 7,0
5-0-1 - 3,1 1,1 8,9
5-0-2 - 4,3 1,5 11,4
5-1-0 - 3,3 1,1 9,3
5-1-1 - 4,6 1,6 12
5-1-2 - 6,3 2,1 15
5-2-0 - 4,9 1,7 13
5-2-1 - 7,0 2,3 17
5-2-2 - 9,4 2,8 22
5-3-0 - 7,9 2,5 19
5-3-1 - 11 3,1 25
5-3-2 - 14 3,7 34
5-3-3 - 18 4,4 50
5-4-0 - 13 3,5 30
5-4-1 - 17 4,3 49
5-4-2 - 22 5,7 70
5-4-3 - 28 9,0 85
5-4-4 - 35 12 100
5-5-0 - 24 68 75
5-5-1 - 35 12 100
5-5-2 - 54 18 140
5-5-3 - 92 30 320
5-5-4 - 161 164 580
5-5-5 - - - -