21/03/2017

ESPECTROFOTOMETRA

ESPECTROFOTOMETRA
Definicin de la espectrofotometra
Espectro Electromagntico
Longitud de Onda y Frecuencia
Ley de Lambert y Beer
Componentes del espectrofotmetro
Curva de calibracin

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QU ES LA ESPECTROFOTOMETRA?
Es una tcnica de anlisis basada en las interacciones que se
establecen entre la radiacin electromagntica (espectro de
luz) y las molculas.

Colorimetra determinacin cualitativa (al

ojo).

Espectrofotometra determinacin
cuantitativa, utiliza un sistema fotoelctrico.
Puede depender de la presencia de color en
la solucin.

IMPORTANCIA EN LABORATORIO CLNICO

COD 12533
ALANINE
5 x 40 mL + 5 x 10 mL
AMINOTRANSFERASE
(ALT/GPT)
CONSERVAR A 2-8C
Permite medir la concentracin de una molcula o analito
Reactivos para medir la concentracin de ALT/GPT ALANINA AMINOTRANS
disuelto
Slo paraenuso un lquido
in vitro biolgico
en el laboratorio clnico (suero sanguneo, orina, LCR
entre otros)
La deteccin de las molculas puede ser:
FUNDAMENTO DEL MTODO CALIBRATION Type of calibration m
DIRECTAS Calibrator replicates
La alanina aminotransferasa (ALT o GPT) cataliza la transferencia del grupo amino de la
alanina al 2-oxoglutarato, Blank replicates
Protenas + formando
Bradfordpiruvato y glutamato.
Complejo La concentracin cataltica se
Protena-Reactivo
determina, empleando la reaccin acoplada de la lactato deshidrogenasa (LDH), a partir de la Calibration curve
velocidad de desaparicin del NADH, medido a 340 nm1,2,3. OPTIONS Blank absorbance limit 1
INDIRECTAS
ALT Kinetic blank limit
Alanina + 2 - Oxoglutarato Piruvato + Glutamato Linearity limit
LDH
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda el uso de los Sueros Control Bioqumica nivele
COMPOSICIN II (cod. 18007, 18010 y 18043), para verificar la funcionalidad d
A. Reactivo: 5 x 40 mL. Tris 150 mmol/L, L-alanina 750 mmol/L, lactato deshidrogenasa 1350 Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Con
U/L, pH 7,3. procedimientos de correccin en el caso de que los controle
B. Reactivo: 5 x 10 mL. NADH 1,3 mmol/L, 2-oxoglutarato 75 mmol/L, hidrxido de sodio 148 aceptables.
mmol/L, sodio azida 9,5 g/L.
CARACTERSTICAS METROLGICAS
Nocivo (Xn): R22: Nocivo por ingestin. R31: En contacto con cidos libera gases txicos.
S28.1: En caso de contacto con la piel, lvese inmediata y abundantemente con agua. S45: Los datos siguientes se obtuvieron usando un analizador A2
En caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al mdico. los del A15. Los detalles sobre los datos de evaluacin estn d
Lmite de deteccin: 3,1 U/L = 0,05 mol/L
CONSERVACIN 2
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Al medir los analitos utilizando un reactivo coloreado, en

general, hay una relacin directamente proporcional entre
la intensidad del color de la solucin y la cantidad de
analito disuelto en un lquido

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LA LUZ COMO RADIACIN

Tiene Naturaleza Corpuscular y Ondulatoria

Algunos parmetros:
1. Longitud de onda ()
2. Amplitud (A)
3. Perodo ()
4. Frecuencia ()

ESPECTRO ELECTROMAGNTICO

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RELACIN ENTRE ENERGA DE LA RADIACIN CON

LONGITUD DE ONDA Y FRECUENCIA
La energa de radiacin se relaciona:
Directamente con la frecuencia
E= h* = h*(c / )
Inversamente con la longitud de onda

La energa de una radiacin puede ser reflejada (E1), difundida

(E2), absorbida (E3) y transmitida (E4).

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LUZ VISIBLE longitudes

de onda () medidas entre
350 y 700 nm

RELACIN ENTRE CONCENTRACIN ANALITO Y

RADIACIN TRANSMITIDA

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RELACIN ENTRE CONCENTRACIN ANALITO

Y RADIACIN TRANSMITIDA
Transmitancia es la fraccin de radiacin
incidente que consigue atravesar la muestra.
Vara de 0 a 1

I1
= Transmitancia (T)
I0

I1
x100 = % Transmitancia (%T)
I0

RELACIN ENTRE CONCENTRACIN ANALITO Y

RADIACIN TRANSMITIDA
Absorbancia es la cantidad de radiacin absorbida

A= log I0 = log 1 x100

I T
I0 I

A= 2 log T

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RELACIN ENTRE ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA

A = - log T x 100 = log 1 x100
T

LEY DE LAMBERT - BEER

Relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una
sustancia, la concentracin de la sustancia, y con la longitud del
cuerpo que la luz atraviesa
Luz incidente
Camino ptico

I0
Absorbancia AT,= - log =bc Concentracin
I1
Absortividad
Luz transmitida

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ABSORTIVIDAD O COEFICIENTE DE EXTINCIN

MOLAR
Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de
concentracion
Cuando el analito tiene una concentracin 1 M en un recorrido de
luz de 1 cm, la cantidad de luz absorbida por este es igual a la
Absorbancia medida
Es un valor constante
Se representa como y se expresa L/mol*cm o M-1cm-1 o en
L/g*cm

ABSORTIVIDAD O COEFICIENTE DE
EXTINCIN MOLAR
ES ESPECIFICO PARA CADA COMPUESTO A UNA
LONGITUD DE ONDA DETERMINADA

DEPENDE DE:
1. Caractersticas del disolvente
2. Especie que absorbe luz
3. Longitud de onda utilizada

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ESQUEMA DE LOS COMPONENTES DE UN

ESPECTROFOTMETRO

TIPOS DE ESPECTROFOTMETROS

DE UN SOLO HAZ: solo podemos poner UNA cubeta

medida, por lo tanto hay que restar el valor del blanco a
todos los valores de absorbancia obtenidos de los distintos
tubos de ensayo

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ESPECTROFOTMETRO DE MONO HAZ

Lmpara monocromador colimador prisma detector

Seal
elctrica

Deuterio: UV
Wolframio:Visible

TIPOS DE ESPECTROFOTMETROS

DE DOBLE HAZ: despus del colimador tiene un divisor de haz

de luz en dos de idntica intensidad, pudiendo medir as la
muestra frente a una cubeta blanco (la mquina entrega ambos
resultados)

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ESPECTROFOTMETRO DE DOBLE HAZ

Lmpara Monocromador Colimador Prisma Fotomultiplicador

blanco Seal
elctrica

Deuterio: UV Seal
Wolframio:Visible muestra
elctrica

COMO SABEMOS A QUE LONGITUD DE ONDA ABSORBE

UN COMPUESTO?
La absorcin de la luz por parte de las sustancias depende
exclusivamente de la estructura qumica del compuesto
absorbente, determinada por grupos funcionales

Compuesto Longitud onda (nm)

Benceno 255
Tolueno 262
Clorobenceno 264
Nitrobenceno 261,233
Fenol 275
Acido Benzoico 271, 279
Anilina 284

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COMO SABEMOS A QUE LONGITUD DE ONDA ABSORBE

UN COMPUESTO?
Cada compuesto posee un espectro de absorcin nico, el que
se obtiene realizando la determinacin de la absorbancia (A) de
la molcula a distintas longitudes de onda.

COMO SABEMOS A QUE LONGITUD DE ONDA

ABSORBE UN COMPUESTO?
ESPECTRO DE ABSORCIN

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SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA

Si se utilizan valores de longitud de onda incorrectos, se
producen grandes errores en la mediciones

A
A A C
A
C B
B

concentracin

EJEMPLO: NAD +/NADH

Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+

NAD+ absorcin 265 nm

NADH absorcin 255 y 340 nm. 1,2

1,0

0,8
Absorbancia

0,6

Cmo puedo determinar slo la 0,4

presencia de NADH?
0,2

0,0
240 260 280 300 320 340 360

Longitud de onda nm

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CMO SE HACE UNA CURVA DE

CALIBRACIN?
Soluciones o Estndares de concentraciones conocidas para
la molcula de inters.
Medir mnimo 3 veces las diluciones (ideal >5 mediciones)
Diluciones se hacen distribuidas uniformemente dentro del
rango del mtodo.
La medicin de cada punto de la curva se hace por
duplicado.
Dilucin del estndar puede hacerse en forma directa o
seriada

CMO SE HACE UNA CURVA DE CALIBRACIN?

Para la medicin necesito un tubo blanco (todos los
componentes del ensayo, SIN el analito)
Las diluciones deben contemplar la menor cantidad de
pipetas y micropipetas posibles para evitar demasiados
errores
De la medicin se obtiene una ecuacin de la recta

y = bx + a

b es la pendiente y a la ordenada al origen.

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CURVA DE CALIBRACIN

y y = bx + a
Y
Linealidad del
X Y
b mtodo
X

a
x

TIPOS DE CURVA DE CALIBRACIN

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LIMITACIONES LEY DE LAMBERT - BEER

La luz utilizada debe ser monocromtica

La longitud de onda utilizada para la deteccin del analito
debe coincidir con el mximo de absorcin de este
La ley se cumple en un determinado intervalo de
concentraciones (soluciones muy diluidas o muy concentradas
presentan errores en la deteccin).

DESVIACIONES LEY DE LAMBERT-BEER

Absorbancia
respuesta debido
a la autoabsorcin
o a la escasa luz que
atraviesa la cubeta

respuesta del blanco,

interferencias o escasa
sensibilidad

Concentracin

Es preciso asegurar que se est trabajando en el

intervalo lineal!!

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CALCULO DE CONCENTRACIONES DE UN ANALITO

O MUESTRA DESCONOCIDA

CALCULO DE CONCENTRACIONES DE UN ANALITO

O MUESTRA DESCONOCIDA

o Ecuacin de la recta obtenida de la curva de calibracin

o Interpolando en el grfico de la curva de calibracin

o Con el valor de concentracin de un estndar

o Utilizando directamente la Ley de Lambert-Beer (A= *b*c)

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CONCENTRACIN DE UNA MUESTRA

UTILIZANDO LA CURVA DE CALIBRACIN
A partir de la ecuacin de la recta que se obtiene de los datos.
Interpolando en la curva de calibrado el valor de absorbancia
obtenido para la muestra
0,7

0,6

0,5 Coeficientes:
a: 0,0252
Absorbancia

0,4

b: 0,0717
0,3
R: 0,9925
0,2

0,1

0,0
0 2 4 6 8 10

gr BSA

CONCENTRACIN DE UNA MUESTRA UTILIZANDO

UN VALOR ESTNDAR (REGLA DE TRES)

Si un estndar comercial de una concentracin de 1 mg/ml

presenta una absorbancia de 0,23 y la muestra problema tiene
una absorbancia de 0,38,
Cul es la concentracin de la muestra problema?

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CONCENTRACIN DE UNA MUESTRA UTILIZANDO

LAMBERT - BEER

Una muestra de 2-Nitrofenol (ONP) tiene una absorbancia de

0,68. y el valor de del compuesto es 4500 M-1cm-1

Cul es la concentracin muestra?

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