PRACTICA:

HONGOS FILAMENTOSOS LIGNOLTICOS Y

CELULOLTICOS
I. INTRODUCCIN.

Los hongos ligninolticos mineralizan la lignina basados en la produccin

de radicales libres, principalmente por medio de las enzimas
extracelulares lignino peroxidasa, manganeso peroxidasa y lacasa. Se ha
probado la eficiencia de estas enzimas en la degradacin de
hidrocarburos poliaromticos (PAHs), fenoles clorados, plaguicidas y
otros compuestos de inters ambiental.

La lacasa cataliza procesos de polimerizacin o depolimerizacin a

travs del mecanismo de transferencia de electrones del sustrato al
oxgeno que es reducido a agua, lo que le confiere una ventaja sobre las
otras enzimas que requieren de perxido para funcionar. Sin embargo,
debido al bajo potencial redox de la lacasa (entre 0.7 y 0.8), el rango de
sustratos es pequeo. Su actividad se puede expandir hacia compuestos
ms difciles de oxidar usando mediadores. Un mediador puede ser una
molcula pequea de bajo peso molecular que acta como una especie
de lanzadera de electrones: una vez que es oxidado por la enzima, se
difunde lejos del sitio cataltico y a su vez, oxida cualquier sustrato que,
debido a su tamao, no podra entrar directamente al sitio cataltico.

Dependiendo de la estructura qumica, los mediadores actan por medio

de los mecanismos (i) Por transferencia de electrones, (ii) por
transferencia de hidrgeno radical, para los sustratos que son ms
difciles de oxidar, (iii) por medio de una oxidacin inica.

Dada la importancia de este mecanismo, se pretende descubrir nuevos

mediadores para la degradacin de plaguicidas y entender los
mecanismos de accin de los mismos para poder ser aplicados a
procesos de degradacin de contaminantes.

II. OBJETIVOS.

Determinar la presencia de hongos filamentosos lignoliticos.

III. MATERIALES:

PIPETA
MADERA

PAPEL TOALLA MECHERO

FRASCO DE PAPILLA ESTERIL BOTELLA

IV. METODOLOGIA:

Hongos lignolticos y celulolticos

Deteccin de hongos filamentosos degradadores de lignina

Para la deteccin de la degradacin de lignina, segn Saldarriaga

& Pineda (2001), los hongos filamentosos sern cultivados en PDA a 30
C, por 72 horas y un fragmento de 0,5 cm de cada micelio se sembrar
en el centro de frascos de vidrio con 15 mL de agar extracto de malta
2,5 % inclinado, siendo incubados a 30 C por 1 semana. A
continuacin, se tomar un bloque de madera de 4x1x0,5 cm,
previamente esterilizado en autoclave y se depositar en el extremo
final del medio de cultivo, tal que se mantenga un ngulo de 45 de
separacin respecto a la superficie. Despus de la incubacin a 30 C
por 2 semanas, se investigar el desarrollo de los hongos sobre los
bloques de madera, considerndose preliminarmente como
degradadores de lignina, aquellos que formen micelio visible
macroscpicamente.

Valoracin indirecta de la degradacin de la lignina

Para la valoracin indirecta de la degradacin de la lignina segn

Saldarriaga & Pineda (2001), en frascos de vidrio conteniendo 25 mL de
agar agua inclinado se depositar una capa superficial de 0,5 mL de
agar extracto de malta 2,5 % y sobre sta se sembrar un fragmento de
0.5 cm del micelio del hongo filamentoso. Despus de 72 horas de
incubacin a 30 C, se depositar un bloque de madera y se incubar a
30 C, durante 2 meses. Transcurridos 15,30 y 60 das se observar el
desarrollo del micelio sobre el bloque de madera, calificndolo segn
una escala convencional elaborada para tal fin, donde 0-25 % del rea
colonizada corresponder a colonizacin escasa, 26-50 % a colonizacin
regular y 51-100 % a colonizacin buena.

Deteccin y valoracin de la degradacin de celulosa

Segn la metodologa descrita por Constantino & Manayay, se

detectarn hongos degradadores de celulosa y se valorar la
degradacin, calificando el rea colonizada y degradada en el papel de
filtro el papel de filtro, as como tambin se determinar el peso
perdido.

Obtencin del inculo

Cada hongo filamentosos se cultivar en PDA, a 30 C, por 72

horas y luego se obtendr una suspensin de conidias en solucin salina
esterilizada (NaCl 0,87 % p/v), cuya concentracin se estandarizar a 2
x 10 7 celmL-1, mediante la cmara de contaje de Levy con el rayado de
Neubauer.

Siembra de hongos filamentosos en papel filtro

En tubos de ensayo de 20 mL de capacidad, con 2 mL de caldo

sales minerales, se depositarn verticalmente tiras de papel filtro
whatman N1 de 6x1cm, con un peso inicial previamente determinado
(Pi). A continuacin, cuidadosamente se inocularn 0,2 mL de la
suspensin de conidios, tratando que se distribuya uniformemente en el
papel filtro y los tubos sern incubados a 30 C, con agitacin diaria,
durante 15 minutos por 25 das.

Calificacin del rea del papel filtro colonizada

Transcurridos 25 das de incubacin, se observar el micelio

desarrollado sobre el papel filtro y se calificar con una escala
convencional elaborada, donde 0-25 % del rea colonizada
corresponder a colonizacin escasa, 26-50 % a colonizacin regular y
51-100% a colonizacin buena.

Calificacin del rea del papel filtro degradada

Cada papel filtro ser extraido con una pinza y con ayuda de un
ansa bacteriolgica y una piseta ser retirado cuidadosamente el micelio
adherido. Luego se determinar el porcentaje del rea degradada y se
calificar con una escala convencional elaborada, donde 0 % del rea
degrada corresponder a degradacin no observable, 1-40 % a
degradacin regular, 41-80 % a degradacin buena y 81-100% a una
degradacin muy buena.

Determinacin de la prdida del peso del papel filtro

 Cada papel filtro ser secado en estufa a 40 C, hasta alcanzar
peso constante, obtenindose luego el peso final (Pf). La diferencia entre
el peso inicial y final se expresar como porcentaje de peso perdido.

V. PROCEDIMIENTO:

LOS HONGOS FILAMENTOSOS SERN CULTIVADOS EN PDA A 30 0C X 72

HORAS

PDA

En agar extracto de malta

2,5 % inclinado haciendo
una incubacin a 300C por
una semana

SE TOMARA UN BLOQUE DE MADERA DE 4X1X0.5 CM PREVIAMENTE

ESTERILIZADO
 Se depositara en un extremo Se incubara a 300C por dos
final del medio de cultivo tal que semanas, se investigara el
mantenga un ngulo de 450 de
desarrollo de los hongos sobre el
separacin respecto a la
bloque de la madera
superficie
VI. RESULTADOS:

SE OBSERV
CRECIMIENTO
RESTO DE GRUPOS:
VII. CONCLUSIONES:
En esta prctica se llev a cabo el estudio de mtodos para el
lograr el reconocimiento de hongos limnoliticos.
Se concluy con xito la prctica pues se logr el crecimiento de
estos, en la madera.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

http://www.smbb.com.mx/congresos
%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_I/Carteles/CI-3.pdf

http://www.scielo.org.pe/pdf/rpb/v16n1/a18v16n1

http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/productos_vitrina.php?c=315
https://www.google.com.pe/?
gws_rd=ssl#q=introduccion+a+la+microbiologia+deL+suelo
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20ambiental/000-
introduccion%20micro%20aambient.htm