Tecnicas de Micros PDF

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Tcnicas de microscopa optica
F. Javier Diez Guerra

Arbor CLXXVII, 698 (Febrero 2004), 225-258 pp.
Introduccin
Durante los ltimos aos, las tcnicas de microscopa ptica y sus

aplicaciones h a n experimentado u n auge sin precedentes. Ms concre-
tamente, la difusin de sistemas de microscopa confocal d u r a n t e los 90
h a empujado con fuerza el desarrollo de la microscopa de fluorescencia
y abierto nuevos horizontes de investigacin. Este fenmeno h a venido
propiciado por varios motivos. Por u n a parte, los progresos en la tecno-
loga de detectores fotosensibles, tanto chips CCD (charge-coupled devi-
ces) como fotomultiplicadores (PMT), cada vez de mayor resolucin y
sensibilidad. E n segundo lugar, la amplia variedad de fluorocromos dis-
ponibles en todo el espectro visible, incluidas las protenas fluorescen-
tes de medusas (Aquarea Victoria, Renilla, etc) y, m s recientemente,
de corales. Finalmente, la evolucin imparable de los sistemas de ilu-
minacin, ahora basados en lseres, as como de los elementos pticos
(filtros de interferencia, prismas, rejillas de difraccin, etc) cada vez
ms eficaces.
Los recientes progresos de la microelectrnica e informtica tampoco
h a n quedado desapercibidos en el campo de la microscopa. El control au-
tomatizado de los sistemas de iluminacin (barrido por lser, obturado-
res y diafragmas, ruedas de filtros, etc), de los sistemas de enfoque y po-
sicionamiento, o de los tiempos de exposicin y ganancia de los
fotodetectores son aspectos que se ejecutan automticamente desde la
consola del ordenador. Tambin es relevante la aportacin de la in-
formtica en el anlisis y procesado de imgenes. La utilizacin conjun-
ta de la instrumentacin ms sofisticada junto con avanzados algoritmos
de anlisis y procesamiento de imgenes permite organizar y dar signifi-
cado a la informacin que fluye por el interior del microscopio.
(c) Consejo Superior de Investigaciones Cientficas http://arbor.revistas.csic.es

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F, Javier Diez Guerra
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Todos estos avances h a n resultado determinantes en la evolucin del

microscopio, que h a pasado de ser un instrumento dedicado en exclusiva
a la inspeccin ocular directa, a constituir un elemento ms dentro de un
sistema complejo que sirve tanto para la observacin directa de mues-
tras, como para realizar estudios cuantitativos y comparativos de aspec-
tos ms concretos. Entre ellos, podemos destacar la determinacin de la
localizacin y concentracin de mltiples constituyentes celulares, su
trasiego entre distintos compartimentos, su vida media o su interaccin
con otros componentes.
Una de las tendencias ms recientes es la observacin y anlisis de
preparaciones biolgicas in vivo, es decir, en u n a situacin similar a su
estado natural. La posibilidad de generar microentornos compatibles con
el mantenimiento normal de la vida (control de temperatura, nutrientes,
concentraciones salinas, pH, presin de gases como 0 2 y C 0 2 , etc) per-
mite analizar procesos fisiolgicos en distintas escalas temporales. La
medida en tiempo real de las variaciones de calcio intracelular en clulas
musculares o el seguimiento de linajes celulares durante el desarrollo de
Caenorabditis Elegans son experimentos perfectamente asequibles a da
de hoy. En el presente captulo, mi objetivo es realizar un repaso perso-
nal de las tcnicas de microscopa ptica desarrolladas ms reciente-
mente, sus fundamentos y sus posibilidades.
U n a b r e v e p e r s p e c t i v a histrica
Muy frecuentemente, cuando se recuer-

da o alude al descubridor del microscopio
como instrumento cientfico se menciona sin
dudar a Anthony van Leeuwenhoek (Delft,
Holanda). Sin embargo, antes de que Leeu-
wenhoek naciera, u n compatriota suyo Za-
charias Janssen y el britnico Robert Ho-
oke ya haban inventado y construido de
forma independiente los primeros microsco-
pios. Estos instrumentos tenan forma de Anthony van Leeuwenhoek
catalejo invertido y estaban formados por (1632-1723)
dos lentes: el ocular, que cuyo nombre se re-
laciona con su proximidad al ojo del observador, y el objetivo, lente pr-
xima al objeto o muestra.
Aunque no invent el microscopio, a Leeuwenhoek se le recuerda en
todos los libros de texto por sus enormes contribuciones en el campo de

Tcnicas de microscopa ptica
227
la Biologa. l fue el primero en observar y describir la existencia de bac-

terias, paramcies, espermatozoides, glbulos rojos y u n a serie intermi-
nable de organismos microscpicos (nematodes y rotferas). Su microsco-
pio, construido con u n a sola lente (microscopio simple) fue muy superior
a los microscopios compuestos de la poca, construidos con dos lentes,
tanto en poder resolutivo como en magnificacin. Leeuwenhoek lleg a
conseguir 200 aumentos frente a los 30 de los microscopios compuestos.
Las claves de su xito fueron, adems de su habilidad para pulir lentes
de alta calidad, su extraordinaria agudeza visual, su inagotable curiosi-
dad y el rigor y realismo de sus descripciones.
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Tras Leeuwenhoek, el concepto y diseo de microscopio compuesto,

presente tambin en instrumentos como prismticos o telescopios, se fue
abriendo paso, aunque su implantacin definitiva se produjo con bastan-
te lentitud. Las aberraciones pticas, especialmente esfrica y cromtica,
muy evidentes en sistemas compuestos, no se corrigen eficazmente has-
ta bien avanzado el siglo 18, cuando se comienzan a combinar en los ob-
jetivos lentes fabricadas con materiales de distinta dispersin ptica.
Durante el siglo 19, el progreso continu en el diseo y fabricacin de
microscopios de mayor resolucin y correccin. Para finales de siglo, va-
rias compaas dedicadas a su fabricacin y comercializacin estaban
bien establecidas y comenzaban a competir. Entre ellas, destac la com-
paa fundada por Cari Zeiss en 1846, que comenz construyendo mi-
croscopios simples, pero rpidamente opt por el desarrollo y construc-
cin de microscopios compuestos. Desde esta compaa, especialmente
tras la incorporacin de Ernst Abbe, se realizaron aportaciones decisivas
para la evolucin de la microscopa ptica. En 1872, Ernst Abbe formula
su teora sobre la formacin de imagen en microscopios, conocida como la
teora de ondas, y disea un sistema de iluminacin (condensador de
Abbe) que proporciona imgenes con una calidad y resolucin desconoc-

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das en la poca. Ms tarde, August Khler propuso u n mtodo de ajuste

(iluminacin Khler) capaz de extraer toda la capacidad resolutiva de los
objetivos y condensadores diseados por Ernst Abbe. Este mtodo se si-
gue utilizando rutinariamente hoy en da.
A pesar de las guerras mundiales, en el siglo 20 se produjeron avances
en los procesos de fabricacin y pulido de lentes, mejorando su apertura
numrica y por tanto su poder resolutivo. Pronto se descubrieron las ca-
rencias de unos instrumentos desarrollados para la inspeccin de mues-
tras teidas, que eran incapaces de revelar detalles de organismos unice-
lulares vivos, debido a su gran transparencia y bajo contraste. E n 1934, el
fsico holands Frits Zernicke (premio Nobel de isica en 1953) desarrolla
la tcnica de contraste de fases. Esta tcnica permite la observacin de ob-
jetos prcticamente transparentes como, por ejemplo, clulas en cultivo,
que no absorben ni desvan la luz significativamente, pero introducen un
pequeo retardo en su propagacin y, por tanto, u n cambio de fase. La tc-
nica de contraste de fases permiti, por primera vez, observar cromoso-
mas metafsicos en u n a clula viva y result determinante para estable-
cer las etapas de la mitosis y meiosis durante el ciclo celular.
En la misma poca, u n fsico francs llamado Georges Nomarski, de-
sarroll u n sistema de generacin de contraste que hoy se conoce genri-
camente como contraste de interferencia diferencial (DIC). Este sistema
convierte pequeos gradientes pticos en diferencias amplificadas de in-
tensidad en el plano de imagen y requiere luz polarizada y unos prismas
especiales (prismas de WoUaston). Las imgenes generadas dan la sen-
sacin de relieve y gozan de una resolucin muy elevada.
Contraste de fases Contraste de interferencia diferencial (DIC)
Microscopia de Fluorescencia
Sin embargo, en el rea de la biomedicina y, especialmente, la bio-

loga celular, la tcnica que mayor influencia est ejerciendo es la mi-

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croscopa de fluorescencia. La fluorescencia es un fenmeno conocido des-

de la antigedad, aunque inicialmente descrito de forma cientfica por
Georges Gabriel Stokes en 1852. Este cientfico britnico comprob como
los cristales de fluorita, al ser iluminados con luz ultravioleta, emitan
una intensa luz p r p u r a azulada. Stokes comprob tambin que la luz
emitida por el cristal presenta siempre u n a longitud de onda superior a
la luz de iluminacin. Este fenmeno, conocido como Stokes shift es
una caracterstica bsica de la fluorescencia, formulada en la ley que lle-
va su nombre. E n la actualidad, la fluorescencia se encuadra dentro de
un grupo de fenmenos conocidos colectivamente como luminiscencia,
que se define como la emisin de luz en respuesta a la absorcin previa
de energa. Esta energa puede ser lumnica, como es el caso de la fluo-
rescencia, qumica, elctrica o de cualquier otra ndole.
Los primeros microscopios de fluorescencia se construyen en Alemania
a principios del siglo 20, entre otros por August Khler. Estos primeros di-
seos fueron diascpicos, es decir, el observador se sita en lnea recta
frente a la fuente de iluminacin y, entre la muestra y el observador, se
coloca un filtro opaco para las longitudes de onda de la luz incidente (UV)
y transparente para la radiacin fluorescente, de mayor longitud de onda.
Este sistema se asemeja mucho a la observacin de un gel de DNA en u n
transiluminador de luz UV. Sin embargo, debido a la limitada efectividad
de los filtros, la sensibilidad de estos microscopios era muy escasa. Poste-
riormente, aprovechando que la fluorescencia es emitida en todas las di-
recciones del espacio, se modific el diseo pasando a u n a configuracin
de iluminacin episcpica, que es el modelo actual, en el que la luz de ex-
citacin y la fluorescencia emitida viajan en direcciones opuestas a travs
Filtros de
interferencia
Objetivo del
Microscopio
\i/
Fuente
de luz
IMicroscopa Fluorescencia lyAicroscopia Fluorescencia

Iluminacin diascpica liuminacin episcpica

230
del objetivo. Este sistema presenta unos niveles mnimos de ruido lum-
nico y permite visualizar muestras con emisin fluorescente dbil.
En u n microscopio de fluorescencia, a diferencia de uno convencional,
se utiliza u n a fuente de iluminacin de intensidad elevada, generalmen-
te basada en u n a lmpara de arco de mercurio o de xenn que ilumina la
muestra a travs de un filtro interferencial (excitacin) y u n espejo di-
croico. Ambos seleccionan una banda del espectro ptima para la excita-
cin del fluorocromo, que emite luz (fluorescencia) a u n a longitud de onda
mayor. Esta luz es recogida por el objetivo, pasa el espejo dicroico y un
segundo filtro interferencial (emisin) y es enfocada en un plano para for-
m a r la imagen amplificada del objeto fluorescente, accesible al observa-
dor a travs de los oculares o a un dispositivo de captura de imagen (c-
m a r a de video, cmara digital CCD, etc) a travs de u n puerto especial.
As pues el microscopio de fluorescencia forma u n a imagen amplificada
de la muestra, pero utiliza nicamente la luz fluorescente emitida por los
fluorocromos presentes en ella.
Fluorocromos
Inicialmente, el microscopio de fluorescencia se utiliz p a r a analizar

muestras con fluorescencia endgena como minerales cristalizados y al-
gunas bacterias y protenas (elastinas, queratinas, etc). La disponibili-
dad de colorantes fluorescentes (fluorocromos) imprimi u n rumbo com-
pletamente distinto a la evolucin de esta tcnica. Inicialmente
desarrollados para la industria textil, los fluorocromos mostraron muy
pronto sus posibilidades en el campo de la Biologa. Su utilizacin en
muestras biolgicas permiti observar estructuras y morfologas con un
detalle h a s t a entonces indito. Fue entonces cuando se fraguaron los
principios de la microscopia de fluorescencia indirecta, basada en la uti-
lizacin de fluorocromos en disolucin para teir selectivamente compo-
nentes de la m u e s t r a y, de esta forma, revelar su estructura y composi-
cin con detalle.
A mediados del siglo 20, comienza el progreso ascendente de la mi-
croscopia de fluorescencia en la Biologa. Fluorocromos como la fluores-
cena o la rodamina, compuestos orgnicos constituidos por anillos arom-
ticos con gran nmero de electrones deslocalizados, emiten fluorescencia
con una alta eficiencia. La conjugacin de anticuerpos secundarios con es-
tos fluorocromos proporcion una poderosa herramienta para citlogos e
histlogos con varias ventajas sobre las tcnicas inmunocitoqumicas tra-
dicionales basadas en la peroxidasa de rbano (HRP). En primer lugar, la

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microscopa de fluorescencia tiene ma-

yor capacidad de resolver detalle pues-
to que la imagen se forma con la luz
emitida por el fluorocromo, mientras
que la inmunicitoqumica tradicional
utiliza un depsito o precipitado opaco,
generalmente, de diaminobenzidina.
En segundo lugar, hace posible la reali-
zacin de mareajes mltiples en la mis-
fsl=C- ma preparacin, pudiendo visualizar
Isotiocianato de Fluorescena varios componentes utilizando distin-
tas bandas del espectro visible (colo-
res). Antes, los estudios de colocaliza-
cin se realizaban utilizando cortes seriados y por tanto resultaban meras
extrapolaciones. Finalmente, comparando la sensibilidad de ambas tcni-
cas, la microscopia de fluorescencia h a progresado mucho, siendo ya posi-
ble detectar la fluorescencia emitida por una sola molcula. A ello h a n
contribuido no slo la utilizacin de fluorocromos optimizados o cascadas
de amplificacin de seal, tambin la ampliacin de los lmites de sensi-
bilidad de los fotodetectores que permiten el anlisis de fenmenos muy
rpidos (Vg. cambios de potencial de membrana) o de fenmenos que afec-
tan a un nmero muy limitado de molculas.
Aunque la utilizacin de anticuerpos conjugados con fluorocromos se
halla muy extendida, existen otras aplicaciones de los fluorocromos no
menos importantes. Desde los aos 60, se h a n venido desarrollando m-
todos para identificar y cuantificar compuestos orgnicos y macromol-
culas definidos por su interaccin reaccin qumica con otros compues-
tos que, fluorescentes o no, generan un producto fluorescente. En los aos
70, el mtodo de visualizacin de las catecolaminas noradrenalina y do-
pamina en tejido nervioso se encontraba muy extendido. El tratamiento
de cortes de tejido nervioso con vapores de paraformaldehido favorece su
condensacin con las catecolaminas y la formacin de productos (tetrahi-
droisoquinolonas) que reaccionan con protenas cercanas y forman
fluorforos (grupos qumicos fluorescentes). Esta tcnica sirvi para rea-
lizar un mapeo exhaustivo de las vas catecolaminrgicas del sistema
nervioso de varias especies. En la misma poca, se descubrieron com-
puestos (DAPI, Hoescht) que interaccionan fuertemente con cidos nu-
cleicos y forman complejos fluorescentes, permitiendo revelar de forma
especfica su localizacin en muestras biolgicas. Estos compuestos se in-
tercalan entre las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos y muestran
distintas preferencias para zonas ricas en pares AT o GC.

232
Ms recientemente, se h a n introducido varias familias de sondas li-

policas fluorescentes (Dil, DiO, FMl-43, FM4-64) con la particularidad
de que su fluorescencia solamente se produce en ambientes hidrofbicos.
Esta caracterstica las convierte en sondas idneas para la identificacin
y seguimiento de membranas biolgicas mediante microscopa de fluo-
rescencia. Existen adems, sondas para la identificacin y localizacin de
protenas de citoesqueleto, indicadores de la concentracin de iones como
Ca+^, Na+, Mg+^, etc, indicadores de pH y potencial de membrana; mar-
cadores de viabilidad y proliferacin celular, sondas para estudiar el tr-
fico intracelular de membranas o para identificar orgnulos y comparti-
mentos celulares.
Es por tanto evidente que las aplicaciones actuales de la microscopa
de fluorescencia son mltiples y, adems, se encuentran en constante
evolucin. Sin embargo, existen unos lmites que hay considerar y que
afectan principalmente a los fluorocromos. Un fluorocromo ideal debera
presentar espectros de excitacin y emisin lo ms estrechos posibles, as
como u n desplazamiento de Stokes elevado. Estas caractersticas permi-
tiran la utilizacin de u n mayor nmero de marcadores en la misma pre-
paracin, ya que su discriminacin sera ms sencilla y precisa. Por otra
parte, u n fluorocromo ideal debera tener u n elevado coeficiente de ex-
tincin molar, es decir, alta capacidad de absorcin en sus mximas de
excitacin, y preferiblemente, un valor de eficiencia cuntica (Qe) cerca-
no a la unidad. Este valor nos indica la proporcin de energa absorbida
por el fluorocromo que es posteriormente emitida en forma de fluores-
cencia. Cuanto mayor sea el coeficiente de extincin molar y la eficiencia
quntica de u n fluorocromo ms brillante ser su fluorescencia y, por
tanto, mayor la capacidad de detectarlo. Un fluorocromo ideal debera ser
qumicamente lo ms estable posible y, en especial, resistente a la foto-
xidacin (photobleaching). Este fenmeno es habitual y se produce por la
mayor reactividad qumica de los fluorforos en su estado excitado y por
el aumento de agentes oxidantes (radicales libres) producidos como con-
secuencia de iluminar a intensidades medias y altas en presencia de ox-
geno molecular. La fotoxidacin no debe confundirse con el apantalla-
miento o quenching que se puede producir por cambios de pH, de
concentraciones de iones o por la proximidad del fluorforo a otros gru-
pos aromticos. E n ambos casos se produce u n a prdida de fluorescencia;
sin embargo, en el caso del quenching la prdida es reversible, mien-
tras que en el caso de la fotoxidacin, no. La fotoxidacin implica una
transformacin qumica del grupo fluorforo, en la que intervienen radi-
cales libres, que lo inhabilita irreversiblemente para emitir fluorescen-
cia.

233
Stoke's shift
40 H
I 30-
.2 20-4
10-
j^ V.
300 400 500 600
longitud de onda (nm)
Espectros de Absorcin y Emisu del Europio
Los fluorocromos que ms se aproximan al ideal estn constituidos

por elementos denominados tierras raras o lantnidos. El Europio es
bien conocido por su gran desplazamiento de Stokes (SOOnm), mximo de
excitacin alrededor de los 330 nm y mximo de emisin por encima de
los 610 nm, su larga vida media de fluorescencia (Imsec). A pesar de su
baja eficiencia quntica, su fluorescencia no es susceptible de photoble-
aching, como es el caso de los fluorocromos orgnicos. Ms reciente-
mente, u n a generacin nueva de fluorforos con aplicaciones ms direc-
tas para la microscopa est emergiendo. Se t r a t a de los denominados
quantum dots (Qdots) constituidos por nanocristales de seleniuro de
cadmio (CdSe) de dimetro inferior a 10 nm, recubiertos por u n a capa ex-
terna de suliro de zinc (SZn). P a r a aumentar su solubilidad, estos com-
plejos se t r a t a n con polmeros orgnicos (grupos carboxilo) que favorecen
su hidratacin y aportan grupos funcionales para su conjugacin con an-
ticuerpos, estreptavidina, etc. El tamao final de las nanopartculas se
encuentra en el entorno de 10-15 nm, similar al tamao de muchas pro-
tenas celulares. El funcionamiento de los Qdots es el mismo que el de los
pigmentos coloidales utilizados en las vidrieras coloreadas de las anti-
guas iglesias y catedrales. Absorben luz en amplias franjas del espectro
y emiten fluorescencia por las transiciones energticas de un nmero
electrones compartidos y confinados en el interior del nanocristal. Pre-
sentan un espectro de emisin ms estrecho que los fluorforos orgni-
cos, cuyas caractersticas dependen del tamao y composicin del nano-
cristal. Son excitados mejor a longitudes de onda situadas en el entorno
de los 420 nm, aunque su espectro de absorcin es muy amplio. Son ex-
tremadamente fotoestables y no experimentan photobleaching, lo que
les hace apropiados para experimentos in vivo con capturas frecuentes
de imagen o periodos largos de seguimiento. Los Qdots presentan u n a efi-

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ciencia quntica elevada y una fluorescencia brillante, que supone un au-

mento significativo de la relacin seal-ruido en la imagen. Finalmente,
otra ventaja importante es que su espectro de emisin puede disearse a
la carta, a diferencia de los fluorocromos orgnicos, introduciendo varia-
ciones en la composicin y, especialmente, el tamao de los nanocrista-
les.
Espectro tbsorcft Q^M Espearo etmtt Q<b

1
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loi^tud de onda {nmj
Protenas Fluorescentes
Ahora bien, la verdadera revolucin de los ltimos aos h a venido de

la mano del descubrimiento y aplicaciones de las protenas fluorescentes
y h a incidido especialmente en el campo de la biologa celular. La prote-
na verde fluorescente (GFP) fue descubierta en 1962 por Shimomura, en
la medusa Aequorea Victoria presente en el Pacfico Norte. Esta medusa
es prcticamente transparente y presenta la peculiaridad de emitir luz
verde cuando se estimula de forma mecnica (contacto). E n realidad, la
bioluminiscencia natural que se produce en esta medusa necesita otra
protena, la aequorina, cuyo grupo prosttico se oxida en presencia de
calcio y emite luz a 470 nm (azul). Esta luz es capturada por la GFP que,
a su vez, emite a 508 nm (verde). Es decir, la GFP acta como transduc-
tor de la aequorina y su significado sera emitir luz muy brillante para
desconcertar a posibles depredadores que entren en contacto con la me-
dusa. Lo ms sobresaliente de esta protena es que no necesita ningn
grupo prosttico para emitir fluorescencia. Su fluorforo se encuentra co-
dificado en su secuencia y se genera durante la sntesis al plegarse for-
mando u n a estructura caracterstica en forma de lata de refresco jalona-
do por lminas beta (estructura p-can). La propia cadena polipeptdica,

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sin necesidad de protenas auxiliares, se pliega y cataliza u n a reaccin de

oxidacin y delacin que resulta en la formacin del elemento fluores-
cente en el que intervienen los residuos Ser65-TyT66-Gly67 y se sita ho-
rizontalmente en el interior de la lata beta. Estas caractersticas h a n
atrado fuertemente la atencin y servido de base para mltiples aplica-
ciones, especialmente a partir de 1992 cuando Prasher clona GFP por
primera vez y demuestra con claridad que su fluorescencia depende ex-
clusivamente de su secuencia, ya que el gen expresado en otras especies,
incluso en bacterias, genera protena con exactamente las mismas carac-
tersticas.
100 OWtGFP
67 m EGFP
H R
65 R
o
I O
H
H
350 400 450 500 550 600

longitud de onda (nm)
GFP es u n a protena muy estable y de pequeo tamao (238 aa). Du-

rante los ltimos aos el esfuerzo dedicado a mejorar y/o modificar sus
caractersticas h a sido increble. Se h a n introducido mutaciones para
humanizar sus codones y aumentar su nivel de expresin, mejorar su
plegamiento a 37C (Phe64Leu), evitar su dimerizacin a altas concen-
traciones (Ala206Lys, Leu221Lys, Phe223Arg) o acelerar la formacin
del fluorforo y convertir los distintos picos de absorbancia en u n slo a
489 nm (Ser65Thr). Todas estas mutaciones se h a n combinado para pro-
ducir u n a GFP mejorada (enhanced GFP, EGFP), en la que la estabilidad
y, sobre todo, la brillantez de la fluorescencia son superiores a las de la
protena nativa (wtGFP). Desarrollos posteriores h a n permitido desarro-
llar formas m u t a n t e s de E G F P con distintos espectros de absorcin y
emisin. La protena fluorescente azul (BFP) se genera por la mutacin
T3rr66His. Esta variante no es muy utilizada debido a que su fluorescen-
cia es dbil y su fotoxidacin rpida. La variante de color azul claro
(cyanFP, CFP) es ms brillante y estable que BFP y lleva la mutacin
T5n:-66Trp. Recientemente se h a introducido una nueva versin de ECFP,
mCerulean, que presenta dos veces ms fluorescencia. La variante ama-

236
rilla (EYFP) presenta mltiples mutaciones y es an ms brillante que

EGFP. Sin embargo, su maduracin en Golgi es ms lenta y su fluores-
cencia es sensible a bajo pH y a concentraciones inicas. Recientemente,
se h a n desarrollado dos versiones de EYFP (Venus y Citrina) igualmen-
te brillantes, pero sin los inconvenientes de EYFP. Los esfierzos para ge-
nerar variantes rojas a partir de GFP de A. Victoria no h a n tenido xito.
Sin embargo, la investigacin en otros organismos marinos como los co-
rales Discosoma y Heteractis Crispa h a n dado como resultado el desa-
rrollo de dos protenas, DsRed y HcRed respectivamente, con espectros
de emisin en el rojo. Los avances realizados con las protenas fluores-
centes rojas son muy recientes. La mutacin Lys83Met desplaza el pico
de emisin de DsRed dede 583 nm a 602 nm, mejorando su separacin
con otras protenas fluorescentes. Sus mayores inconvenientes, hasta
ahora, venan motivados por su lenta maduracin y ierte tendencia a
oligomerizar en forma de tetrmeros. La introduccin de 33 mutaciones
en DsRed, la mayor parte de ellas argininas, h a dado como resultado la
generacin de m R F P l , u n a protena roja fluorescente monomrica, de
maduracin rpida aunque con menor brillantez y fotoestabilidad que la
DsRed nativa.
100
300 400 500 600 400 SQQ ^!Q 700

longitud de onda (nm) longitud d e onda (nm)
Las aplicaciones surgidas a raiz de la disponibilidad de las protenas

fluorescentes (FPs) son numerosas y no se limitan a u n campo concreto
de la Biologa. La diferencia fundamental crucial entre las FPs y otros
fluorforos es su utilizacin en organismos o preparaciones vivas. Las
FPs se utilizan como reporteros para identificar, localizar y cuantificar la
actividad de promotores in vivo, para realizar seguimientos de linaje ce-
lular durante el desarrollo y diferenciacin celular o, ms frecuentemen-
te, para marcar o etiquetar con fluorescencia otras protenas cuya vida

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media, localizacin subcelular, translocacin entre compartimentos, in-

teraccin con otras molculas o protenas se quiera analizar. El abordaje
utilizado en estos casos es generar construcciones para la expresin de
protenas de fusin que incluyan alguna de la FPs.
Las protenas fluorescentes de desarrollo ms reciente presentan
fluorescencia variable y son idneas para analizar patrones temporales
de expresin y vida media de protenas. Una de ellas es timer, una va-
riante de la protena fluorescente roja drFP583 que t r a s su sntesis es
verde y en el transcurso de varias horas se transforma en u n a protena
fluorescente roja. Analizando la relacin entre fluorescencia verde y roja
se puede extrapolar la vida media de la protena de fusin correspon-
diente. Otras son protenas fluorescentes fotoactivables que presentan
inicialmente u n a fluorescencia muy baja o nula, y aumentan su fluores-
cencia tras ser irradiadas con u n a longitud de onda diferente a su pico de
excitacin. PA-GFP (GFP fotoactivable), generada por la mutacin
Thr203His, es capaz de incrementar hasta 100 veces su fluorescencia por
excitacin a 488 nm, t r a s ser iluminada con luz a 413 nm. Kaede es una
protena fluorescente identificada en el coral Trachyphyllia geoffroyi.
Tras ser irradiada a 400 nm, Kaede pasa de 508/518 nm a 572/582 nm en
sus picos de excitacin/emisin, lo que quiere decir que se transforma de
protena fluorescente verde a roja, presentando ratios de fluorescencia
roja/verde 2000 veces mayores tras su fotoactivacin. Kaede, sin embar-
go, an presenta problemas de oligomerizacin, lo que limita sus posibi-
lidades y aplicaciones en la actualidad.
Microscopa Confocal
Uno de los avances que ms ha impactado en la microscopa reciente

ha sido el microscopio confocal. Aunque la idea original se atribuye a
Nipkow, fue realmente Marvin Minsky en 1957 quin dise, construy
y patent un instrumento en el que se aplicaban los principios bsicos de
la microscopa confocal. Treinta aos ms tarde, Brad Amos and John
White (Cambridge, UK) construyen el primer microscopio confocal di-
seado para muestras biolgicas, movidos por la necesidad de visualizar
y reconstruir en el espacio los planos de divisin celular durante el desa-
rrollo de C. Elegans, utilizando anticuerpos anti-tubulina e inmunofluo-
rescencia. La microscopa confocal parte de los principios de la micros-
copa de fluorescencia y los mejora con un diseo capaz de eliminar la
fluorescencia fuera de foco, es decir, procedente de planos superiores e in-
feriores al plano focal. El microscopio confocal por tanto captura exclusi-

238
vmente la fluorescencia que se genera en el plano focal, y consigue me-

jor contraste y resolucin. Los elementos necesarios para conseguirlo son
varios. En primer lugar, un sistema de iluminacin secuencial de la
muestra que puede estar basado en un barrido lser XY mediado por es-
pejos galvanomtricos o en un disco de Nipkow (barrido secuencial en
distintos puntos simultneamente). En segundo lugar, es necesario ubi-
car u n diafragma (pinhole) de apertura variable en u n unto del camino
ptico (punto focal de la lente de tubo) para impedir el progreso hacia el
fotodetector de la fluorescencia emitida desde planos superiores e infe-
riores al plano focal. Existe una relacin estrecha entre la apertura del
diafragma y el grosor de la seccin confocal, es decir, a mayor apertura,
mayor es el grosor de la seccin ptica analizada.
En los sistemas que utilizan barrido lser XY, el detector es un foto-
multiplicador constituido por u n nico fotoelemento que acumula la
energa de los fotones incidentes y la amplifica y transforma en una seal
elctrica a u n a frecuencia determinada. La coordinacin entre el sistema
de barrido y la frecuencia del fotomultiplicador, define la posicin e in-
tensidad de cada seal (pixel) en el plano de imagen. En el sistema ba-
sado en el disco de Nipkow el funcionamiento es el mismo, con la salve-
dad de que esta operacin se realiza en varios puntos simultneamente.
La luz incidente se proyecta sobre un disco en rotacin que contiene ml-
tiples lneas de pequeos diafragmas colocados en espiral. La fluorescen-
cia emitida desde cada punto vuelve a travs de los mismos diafragmas
y es proyectada sobre una matriz bidimensional de fotodetectores (CCD).
dafragma
Pinhole
Fundamento de !a
Microscopa Confocai

239
Compaftiva entre microscopia de fluorescncia y confocal
Ambos sistemas, el barrido XY y el disco giratorio, generan resultados

equivalentes, es decir, secciones pticas a distintas alturas que sirven
para reconstruir en 3 dimensiones un objeto fluorescente. De esta forma,
la microscopa confocal introduce la tercera dimensin (eje z) en la mi-
croscopa, que nos permite comprender e interpretar relaciones estructu-
rales en el espacio. Otra consecuencia del rechazo de la fluorescencia fue-
ra de foco es el aumento de la resolucin de la imagen, considerada sta
como la capacidad de discriminar dos puntos fluorescentes muy prximos
entre si. Este aspecto, por s slo, ya justifica la adopcin de este sistema
de microscopa ya que permite realizar estudios de localizacin mltiple
de fluorforos (colocalizacin) con una precisin antes desconocida.
Fundamento e la Dos abordajes a fa microscopa confoca

mterascopa
confocal
1. Barrido 2. Disco giratorio
Laser (spining disk. Npl<ow)
diafTctgrria
T
J j; OSCO C
CZ ^^
lente del
objetivo
/''
^ Y
:^y
'0Ci3l
,' Muesfa
ao 'oco

240
La eleccin entre el sistema de barrido o disco giratorio, depende en

gran medida de las aplicaciones a desarrollar. El sistema de barrido per-
mite controlar el tamao del diafragma (pinhole) para cada canal de fluo-
rescencia de forma independiente y, por tanto, consigue mejor resolucin
en el eje z. Este sistema se utiliza mucho para visualizar y analizar
muestras fijadas y procesadas por inmunofluorescencia. El sistema de
disco giratorio es ms apropiado para estudios in vivo que requieran con-
focalidad, ya que produce menos fototoxicidad y, gracias al barrido ml-
tiple que realiza, consigue mayor velocidad de adquisicin (del orden de
10-30 fps, dependiendo de la fluorescencia). Adems, este sistema per-
mite observar directamente la imagen confocal en los oculares, opcin
que no es posible en ningn otro sistema.
La difusin masiva de la microscopa confocal en la dcada de los 90
supone u n cambio radical en la forma de analizar muestras biolgicas al
microscopio. Antes, el estudio de la localizacin espacial requera seccio-
nar la m u e s t r a con un microtomo y obtener cortes seriados que tras su
procesado individual servan para reconstruir la muestra en tres dimen-
siones. El rechazo de la luz procedente de planos fuera de foco, carac-
terstica del microscopio confocal, permiti por primera vez analizar es-
tructuras y componentes celulares en preparaciones intactas. Un ejemplo
muy claro es la localizacin intranuclear. Antes del confocal era imposi-
ble precisar sin margen de error la localizacin intranuclear de marca-
dores, a no ser que se realizara un estudio de microscopa electrnica en
cortes ultrafinos. Actualmente, la microscopa confocal permite obviar
ese estudio y asegurar la presencia intranuclear con gran fiabilidad.
R@ndrl2a{lo 3D
Secciones pticas seriadas do un grano de polen obtenidas por microcopia confocal

241
E n los ltimos aos se h a n introducido gran cantidad de mejoras y

adelantos en los sistemas de microscopa confocal. Actualmente, la va-
riedad de fuentes de luz lser disponible es mucho mayor que hace esca-
samente 5-6 aos. La tendencia actual es ir sustituyendo los lseres ba-
sados en gases nobles (argn, helium-nen, kriptn, etc) por lseres
basados en diodos, ms estables y duraderos. La calidad de la ilumina-
cin es cada vez mayor. Los lseres actuales emiten luz coherente (en
fase), colimada (haz paralelo) y polarizada con unas tolerancias muy re-
ducidas. Constantemente aparecen nuevos lseres de mayor vida til,
que van poblando los huecos que quedan en el espectro visible. La tecno-
loga h a evolucionado en la regulacin de la intensidad del lser, cuya po-
tencia de bombeo es siempre constante (mxima). Antes, la intensidad se
atenuaba mediante filtros neutros de distinta densidad colocados des-
pus del lser. E n la actualidad, se utilizan filtros optoacsticos (AOTFs)
basados en cristales de xido de telurio que, orientados adecuadamente,
son capaces de atenuar la luz que transmiten en funcin de la frecuencia
e intensidad de los ultrasonidos aplicados. Adems, los AOTFs se usan
para rechazar la transmisin de la luz en bandas concretas del espectro,
con gran precisin de corte de banda (de O a 100% transmitancia, en 1
nm) y la posibilidad de conmutarlos a gran velocidad (transicin cerra-
do/abierto = 1 s eg).
Otro avance implementado recientemente en los sistemas de ltima
generacin es el anlisis espectral, que se basa en la utilizacin de un ele-
mento de dispersin de luz, bien sea u n prisma o u n a red de difraccin
(grating), para descomponer y proyectar el espectro de la fluorescencia
sobre los fotodetector es. Existen dos abordajes distintos: uno es acotar
franjas (slits) de paso utilizando espejos mviles frente a los fotodetecto-
res y el otro es proyectar toda la lnea espectral sobre u n array de foto-
detectores mltiples, de m a n e r a que cada uno captura u n a banda fija del
espectro. Estos sistemas permiten analizar los patrones espectrales de
emisin de fluorforos o del ruido de fondo (background), archivarlos y
utilizarlos despus para separar mezclas (spectral unmixing) mediante
algoritmos apropiados. Esta tcnica facilita mucho el anlisis en tejidos
que tpicamente presentan autofluorescencia como el cerebro, tejidos ve-
getales, etc. Tras analizar y archivar su patrn espectral, ste es sus-
trado automticamente durante la captura para generar u n a imagen
limpia del fluorforo utilizado. Los sistemas con anlisis espectral per-
miten del mismo modo separar fluorforos con perfiles de fluorescencia
cercanos y, por tanto, posibilitan el acomodo de mayor nmero de mar-
cadores en la misma muestra.

242
No todo son ventajas en la microscopia confocal. Una de sus desven-

tajas es su alta fototoxicidad. Como se apunt anteriormente, en el mi-
croscopio confocal, slo u n a parte de la fluorescencia alcanza el fotode-
tector, la mayor parte es rechazada por el diafragma (pinhole) a fin de
obtener secciones pticas confocales. Esto no puede ser de otra manera si
se pretende conseguir confocalidad. Por tanto, para obtener relaciones
seal/ruido suficientes e imgenes con cierta calidad, es necesario incre-
mentar la intensidad de la excitacin. Por este mismo motivo se utilizan
lseres en los sistemas confocales, ya que permiten obtener intensidades
puntuales de iluminacin muy elevadas. As, u n microscopio confocal ne-
cesita u n a fuente de iluminacin con una intensidad varias veces supe-
rior a la de uno convencional para obtener u n a imagen con un nivel de
saturacin comparable. A mayor intensidad, mayor fototoxicidad y por
tanto mayor fotoxidacin y prdida de fluorescencia. Este aspecto debe
ser considerado cuidadosamente, especialmente cuando se trabaja con
muestras difciles de replicar, porque su mera inspeccin para realizar
los ajustes necesarios de potencia, ganancia o averaging puede arrui-
narla completamente.
Este problema se agrava en gran medida cuando se pretende hacer
seguimiento de muestras in vivo (clulas en cultivo, desarrollo embrio-
nario, etc). E n estos experimentos, la intensa iluminacin de la muestra
necesaria para la captura de imagen se debe repetir u n a y otra vez, afec-
tando no slo la fotoxidacin sino tambin otros factores que afectan la
viabilidad. Entre ellos, hay que destacar la generacin de fotoproductos
derivados de la riboflavina (vitamina B2), triptfano, tirosina y otros, que
aumenta con la intensidad de la luz, su longitud de onda (ms nociva por
debajo de 540 nm) y la concentracin de oxgeno. E n casi todos los casos,
la produccin de radicales libres seguida de la generacin de perxidos,
como el agua oxigenada (H202), es el causante de la citoxicidad. La pre-
vencin de estos efectos requiere un estudio cuidadoso de la composicin
del medio de cultivo, la inclusin de compuestos antioxidantes como el
acido ascrbico (vitamina C) o la vitamina E junto con mezclas apropia-
das de enzimas (catalasa, superoxide dismutasa), la utilizacin de longi-
tudes de onda de excitacin en el rojo o infrarrojo y, sobre todo, dosificar
la exposicin a la luz todo lo posible.
Desde el punto de vista instrumental, la utilizacin de sistemas con-
focales basados en el disco giratorio de Nipkow contribuye a reducir los
niveles de fototoxicidad y mejorar la viabilidad en experimentos in
vivo. Este sistema resulta menos daino esencialmente por su mayor ra-
pidez de adquisicin de imagen, propiciada por el barrido mltiple y la
deteccin mediante CCDs. En general, cuanto ms eficiente y sensible

243
sea el sistema de captura, menor fototoxicidad, ya que podremos traba-

jar con intensidades de excitacin inferiores. Las dos tecnologas dispo-
nibles de fotodeteccin, CCDs y PMTs, estn evolucionando de forma
convergente. Por u n lado, los PMTs estn incrementado sensiblemente
su eficiencia (Qe) utilizando nuevos materiales (arseniuro de galio) y sis-
temas de reflexin interna por prismas pticos, que incrementan el por-
centaje de fotones que inciden con xito en el fotodetector. Por otro lado,
los CCDs, tradicionalmente ms eficientes que los PMTs pero de ganan-
cia limitada, estn evolucionando hacia los denominados ECCDs (en-
hanced CCDs). En los ECCDs, la carga acumulada por el impacto de fo-
tones en cada fotoelemento es amplificada en el mismo chip con un nivel
mnimo de ruido para alcanzar ganancias que exceden los 3 rdenes de
magnitud. Si a estos niveles de amplificacin aadimos eficiencias de
ms del 90%, tpicas de los back-illuminated thin CCDs, los niveles de
sensibilidad son suficientes para detectar la fluorescencia procedente de
una sola molcula. P a r a reducir el ruido generado por efecto trmico
(dark current) estos chips necesitan ser refrigerados a -40C o menos.
Actualmente, estos detectores se utilizan en cmaras de video ultrarr-
pidas, capaces de generar secuencias de video a razn de m s de 1000
imgenes por segundo en condiciones normales de iluminacin. La im-
plementacin de estos chips en sistemas basados en el disco de Nipkow
est permitiendo utilizar fuentes de iluminacin basadas en lmparas de
xenn, sin necesidad de recurrir al lser. Esto supone, no slo un menor
costo, sino tambin una mayor flexibilidad para escoger longitudes de
onda de excitacin, que pueden seleccionarse utilizando filtros pasaban-
da o, mejor aun, un monocromador de apertura variable; sin necesidad
de utilizar lseres con longitudes de onda fija, mucho ms costosos y me-
nos flexibles.
Adems de los sistemas de barrido, existen formas alternativas de
generar imgenes confocales. Un sistema que se est imponiendo cada
vez ms, debido a su sencillez y bajo coste, se fundamenta en utilizar ilu-
minacin estructurada. Segn abandonamos el concepto clsico del mi-
croscopio, en el que debe haber un plano de muestra y u n plano de ima-
gen (amplificada) con toda la informacin, las posibilidades se
multiplican. Este es el caso de la iluminacin estructurada, que utiliza
una rejilla para proyectar u n fino patrn de bandas sobre la muestra. La
rejilla es desplazada verticalmente por un dispositivo mecnico piezo-
elctrico de gran precisin. P a r a conseguir una imagen confocal es nece-
sario capturar 3 imgenes en tres posiciones, cada una de ellas despla-
zada un tercio del periodo de la rejilla respecto de la siguiente. De cada
captura se descarta la luz procedente de planos fuera de foco, presente en

244
el patrn opaco de la rejilla. Tras combinar las tres imgenes parciales

se obtiene u n a imagen en la que un porcentaje alto de luz fuera de foco
h a sido eliminado. Este sistema rene gran simplicidad, elevada eficien-
cia lumnica y baja fototoxicidad. No requiere iluminacin lser ni tam-
poco diafragmas (pinoles). Se puede instalar en cualquier microscopio y
permite obtener imgenes confocales en tcnicas de fluorescencia y refle-
xin. Ahora bien, como sucede en los sistemas de barrido, la imagen no
puede observarse en los oculares. Es necesario disponer de u n sistema de
captura digital y u n software que procese las imgenes parciales. Con los
algoritmos actuales y la potencia de los ordenadores actuales es posible
observar la imagen confocal en el monitor prcticamente a tiempo real.
Grano d polm (canwo claro) PrayiKddn ii itootuti tptAi B 30 mkr
<t-t>
rejilla
llumnaciii
Estructurada iiumtnacin umlnacin
3 muestra convencional strucUtrada
Microscopia multifotn
La microscopa multifotn es un desarrollo reciente dentro de la mi-

croscopa de fluorescencia cuyo desarrollo presenta u n enorme potencial.
El fenmeno de la emisin de fluorescencia por absorcin de dos o ms fo-
tones fue descrito por Maria Goppert Mayer, premio Nobel de fsica en
1963, en su tesis doctoral (1931). Treinta aos despus, la disponibilidad
de los primeros lseres pulsados de rub permite demostrar experimen-
talmente la propuesta de Goppert Mayer, logrndose excitar por dos fo-
tones u n a sal de Europio (CaF2:Eu). Aos despus, ya en los 70, se con-
sigue la excitacin por 3 fotones de fluorocromos orgnicos. La idea del
microscopio confocal multifotn es propuesta por el grupo liderado por
Colin Sheppard y Tony Wilson en Oxford (UK) en los aos 80, y desarro-

245
liada por Winfried Denk, J a m e s Strickler y Watt Webb en la Universi-

dad de Cornell (Ithaca, NY), que patentan la tecnologa en 1991.
Un fluorforo puede conseguir la energa necesaria p a r a emitir fluo-
rescencia de varias maneras. Una de ellas, es la absorcin de u n fotn con
u n a energa o longitud de onda (A.) determinada. Este fenmeno est bien
estudiado y define a cada fluorforo por su espectro de excitacin (mono-
fotn) caracterstico. Otra alternativa, menos probable, es la absorcin
secuencial de varios fotones de menor energa (mayor ) de m a n e r a que,
entre todos, logren alcanzar el estado de excitacin necesario para la
emisin de u n fotn fluorescente. P a r a que se produzca esta acumulacin
de energa es necesario que la absorcin de los fotones se produzca en u n
intervalo muy corto de tiempo, del orden de 10 attosegundos. Este inter-
valo se corresponde con la vida media de relajacin de los estados energ-
ticos provocados por la absorcin de cada fotn individual. Por tanto, si 2
o ms fotones son absorbidos en este lapso de tiempo su energa se acu-
mular y se podr emitir fluorescencia. De otro modo, el fluorforo libe-
rar la energa absorbida en forma de calor o cambios en la velocidad de
rotacin molecular (spin).
S
Fluorsciicia vs duracin de pulso
{n |ot#nd <otiitint}
h'-^
Pos fotones
Tres fotones
EKCftdcin pm un fotn
h'%
s 20D 400 600 aOQ
duracin de pulso (fentos^g,)

1000
incitacin pm eos fotones
La fluorescencia por excitacin multifotn no se produce de forma

natural porque la probabilidad de que dos fotones sean absorbidos por la
misma molcula en u n lapso inferior a 0.1 femtosegundo es bajsima.
P a r a que este fenmeno se produzca es necesario a u m e n t a r la densidad
de fotones (intensidad de iluminacin) varios rdenes de magnitud. La
probabilidad de excitacin por dos fotones depende linealmente del cua-
drado de la intensidad de la iluminacin. Se calcula que la densidad de

246
fotones necesaria para excitar la fluorescencia en u n sistema multifotn

es de 6 rdenes de magnitud superior que la excitacin por un fotn. So-
lamente los lseres pulsados de estado slido son capaces de alcanzar las
intensidades necesarias para producir excitacin multifotn. Los lseres
ms habitualmente usados son los de titanio:zafiro (Vg SP Tsunami) ca-
paces de entregar ms de 100 miliwatios en pulsos de 50 femtosegundos,
cada 10 nanosegundos en un rango de longitudes de onda variable entre
690 a 1060 nm. E n la actualidad, existe gran inters y tambin compe-
tencia para desarrollar lseres cuyos pulsos sean lo ms cortos posible,
ya que la densidad de fotones vara de manera inversa con la duracin
del pulso.
Cules son las ventajas que aade la microscopa multifotn? La
principal caracterstica del multifotn es que la excitacin se limita al
punto donde el objetivo concentra la mayor densidad de fotones. Por de-
bajo de u n a densidad fotnica determinada no se produce excitacin y,
por tanto, tampoco fluorescencia. Esta peculiaridad limita drsticamen-
te la fototoxicidad derivada de la iluminacin, puesto que los fluorforos
situados en planos superiores e inferiores no son excitados. En el mi-
croscopio confocal convencional el haz de luz produce excitacin en todo
su recorrido y, por tanto, mucha mayor fototoxicidad. Cuanto mayor sea
la magnificacin y apertura del objetivo, menor ser el volumen del pun-
to de excitacin en el microscopio multifotn. Por regla general, la exci-
tacin por dos fotones requiere longitudes de onda algo inferiores a dos
veces sus mximos de excitacin por un fotn. Por ejemplo, si la fluores-
cena presenta u n mximo de excitacin por un fotn a 488 nm, el pico de
excitacin por dos fotones debera situarse en torno a los 850-900 nm. Si
la excitacin fuera por tres fotones, entonces la longitud de onda ptima
de excitacin se movera en torno a los 1200 nm, es decir, menos del tri-
ple de su mximo a 488 nm. Por lo general, los espectros de excitacin por
dos o tres fotones no presentan picos abruptos como los de excitacin por
un fotn, sino picos mucho ms suaves que permiten u n amplio margen
de posibilidades de excitacin. La excitacin por longitudes de onda ubi-
cadas en el espectro infrarrojo presenta varias ventajas. En primer lugar,
la radiacin infrarroja penetra con mayor facilidad en el interior de la
muestra ya que su grado de absorcin y desviacin (scattering) es muy
reducido (comparado con la radiacin visible). En segundo lugar, debido
a su baja absorcin, la radiacin infrarroja no produce prcticamente fo-
totoxicidad, y se adeca mejor a estudios de muestras in vivo.
Otra caracterstica destacable del microscopio multifotn es la ausen-
cia de diafragmas (pinoles) para rechazar la fluorescencia procedente de
planos fuera de foco. La confocalidad en el microscopio multifotn viene

247
Microscopio Microscopio
Confocal Muitifotn
DETECTOR
dtaff^rn ^
' - J^-^
^-'>
(pmhote)
"^^^"^"
espsfo , , f^
dicroico

y^"^'' /- , 4-
ôbjetivo\
\
rnuhfotn confocai
r^^ ^^ 1
dada porque la excitacin se limita a los fluorforos situados en un mis-
mo plano focal. Por tanto, no dispone ni necesita elementos p a r a restrin-
gir el paso de fluorescencia al fotodetector. A resultas de elio, la coleccin
de fotones es mucho ms eficiente. En la microscopa multifotn, el gro-
sor de la seccin ptica depende de las caractersticas del objetivo (au-
mentos y apertura) y de la potencia de lser que se aplique en cada pul-
so. Cuanto mayor sea la potencia aplicada mayor ser el grosor del plano
barrido por el lser. Adems de ser ms eficiente en capturar la fluores-
cencia emitida, la microscopa confocal se caracteriza por su mayor capa-
cidad de penetracin en el interior de muestras con u n cierto grosor como
pueden ser cortes de tejido, embriones completos, etc. La razn de esta
mayor capacidad de penetracin reside en la longitud de onda utilizada.
Como se apunt anteriormente la radiacin infrarroja presenta menor
absorcin y desviacin a su paso por la muestra. En el microscopio con-
focal convencional la luz de excitacin es fuertemente absorbida por la
muestra, de m a n e r a que segn se penetra en su interior la intensidad de-
cae rpidamente. Dependiendo de la muestra y la longitud de onda de ex-
citacin el confocal convencional experimenta una disminucin notable
de eficiencia a partir de los 30 pan de profundidad. Sin embargo, en si-
milares condiciones, el microscopio multifotn comienza a experimentar
prdidas de brillantez a partir de los 80 jttm de profundidad. Con el sis-
tema multifotn, se h a n llegado a conseguir imgenes de clulas marca-
das en el interior de la corteza cerebral de un organismo vivo a u n a pro-
fundidad de h a s t a 500 /xm. Idealmente, la excitacin por tres fotones
puede conseguir u n a mayor penetracin y resolucin. Sin embargo, tam-
bin la potencia de lser necesaria es mucho mayor. E n la actualidad,
slo es posible excitar con tres fotones fluorforos cuyos mximos de ab-
sorcin (monofotn) se encuentran en el ultravioleta (DAPI, Hoescht,
NADPH, etc). Por otra parte, la excitacin con tres fotones sera an me-

248
nos nociva p a r a muestras in vivo, ya que cuanto mayor sea la longitud

de onda de excitacin, menor absorcin presentar la muestra y por tan-
to, menor fototoxicidad.
Qu desventajas presenta el mi-
croscopio multifotn? Evidentemen-
te la primera de ellas es su elevado
coste de adquisicin y mantenimien-
to. El coste del lser pulsado supone
en la mayora de las ocasiones ms
de la mitad del costo del equipo. Por
lo dems, el principal cuidado que
hay que tener es evitar el sobreca-
lentamiento de las muestras. Este se
produce cuando las muestras poseen
algn compuesto que absorbe en las
longitudes de onda que normalmente
se utilizan (infrarrojo).
Otra ventaja del multifotn es la
posibilidad de trabajar en confocal
con fluorforos que absorben en el
UV, sin necesidad de excitarlos con
luz UV que presenta muy baja pe-
netracin en el tejido, baja transmi-
tancia en las lentes normalmente
empleadas en los objetivos y una fo-
totoxicidad elevadsima en experi-
mentos in vivo. La utilizacin de
longitudes de onda en el infrarrojo
es capaz de producir excitacin de
estos fluorforos obviando todos los
problemas.
Microscopa de fluorescencia por reflexin i n t e r n a total

(TIRFM)
No solamente la la microscopa confocal h a experimentado progresos

en los ltimos aos. La aparicin y desarrollo de nuevas tcnicas es una
constante en el campo de la microscopa de fluorescencia. Un ejemplo de
ello es u n a tcnica, relativamente novedosa, pero de implantacin muy
reciente que se est imponiendo para el estudio de fenmenos que acn-

249
tecen en la m e m b r a n a plasmtica celular o sus cercanas. La microscopa

de fluorescencia por reflexin interna total (TIRFM), se basa en el prin-
cipio de la reflexin total y generacin de u n a onda evanescente. Muy
brevemente, al proyectar u n haz de luz sobre u n a superficie pulida cons-
tituida de u n material transparente con distinto ndice de refi:'accin, es
posible encontrar u n ngulo de incidencia tal que la totalidad de la luz
proyectada es reflejada. Este ngulo se denomina ngulo crtico y en el
punto donde se produce la reflexin total se genera u n a onda electro-
magntica (la onda evanescente), de igual fi:ecuencia que la luz inciden-
te, que progresa perpendicularmente hacia el lado de opuesto y decae ex-
ponencialmente con la distancia de avance. La onda evanescente es
capaz de excitar aquellos fluorforos que se encuentren a u n a distancia
no superior a 200 n m de la superficie de reflexin.
Adliesiones focales celulares
MICROSCOPIA DE PLUORESCENCIA POR REFLEXION INTERNA TOTAL
O n d a evanescente
medio
acuoso
(n=t.33)
aceite inmersn/vidrto Luz reflejada M. fluorescencia TIRFM

n=1.518
Hace unos aos, instalar u n sistema TIRFM era u n a tarea complica-

da y costosa. Entonces, el sistema de iluminacin estaba basado obliga-
toriamente en u n lser y necesitaba aadir condensadores especiales
para lograr ngulos de incidencia compatibles con la reflexin total. E n
la actualidad, gracias a la disponibilidad de objetivos de alta apertura
(NA de h a s t a 1.45 en aceite de inmersin) el mismo objetivo puede actuar
como condensador y como colector de fluorescencia. Adems, el grado de
sensibilidad que alcanzan actualmente los fotodetectores permite utili-
zar lmparas de mercurio o xenn en lugar de lseres. Las aplicaciones
de esta tcnica se asocian con mucha fi:*ecuencia a estudios de muestras
in vivo. Sus ventajas derivan de la capacidad de excitar, de forma ex-
clusiva, u n a fi:'anja de aproximadamente 100-200 n m en contacto con la
superficie de reflexin, la baja fototoxicidad que presenta, su alta rela-
cin seal/ruido en la captura de imagen y la posibilidad de visualizar la
imagen directamente en los oculares. El resto de la muestra, situado por
encima de la fi:'anja de excitacin, simplemente no se visualiza porque no

250
es excitada. E n este sentido, la microscopa TIRF funciona como si de un

confocal se t r a t a r a pero con u n a capacidad de resolucin axial superior
aunque, eso s, limitado a la superficies de contacto
TIRFM se utiliza en estudios de seguimiento de endocitosis y exocito-
sis, formacin de adhesiones focales y otros complejos de adhesin celu-
lar y en la localizacin y dinmica de protenas de membrana, como re-
ceptores, etc. La preparacin ms adecuada para esta tcnica son clulas
cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio. Su principal limitacin reside en
su incapacidad de visualizar ms all de la zona afectada por la onda
evanescente. Sin embargo, los microscopios de fluorescencia actuales
permiten conmutar sin dificultad y con rapidez entre tcnicas de TRIFM
y microscopa de fluorescencia convencional. Las desventajas que pre-
senta TIRFM estn relacionadas con la interpretacin de los resultados.
La intensidad de la onda evanescente disminuye exponencialmente con
la distancia que recorre. Por tanto, la variacin de fluorescencia en un
punto determinado puede ser interpretada tanto como u n movimiento la-
teral de difusin o concentracin de fluorforo, como por u n desplaza-
miento vertical entrando y saliendo de la franja til de excitacin. Cada
caso debe ser estudiado con cuidado a fin de obtener las conclusiones co-
rrectas.
T r a n s f e r e n c i a d e e n e r g a por r e s o n a n c i a fluorescente (FRET)
La microscopa de fluorescencia puede utilizarse tambin para estu-

diar y cuantificar interacciones entre componentes celulares a nivel mo-
lecular. FRET es la transferencia de energa no-radiante que se produce
entre dos fluorforos (donador y aceptor) con espectros de emisin (dona-
dor) y excitacin (aceptor) solapantes, tras la excitacin del donador. La
eficiencia del FRET decae con la sexta potencia de la distancia entre
fluorforos (radio de Forster). A distancias superiores a 10 nm, no se pro-
duce transferencia significativa. Por otra parte, la transferencia es ms
eficaz cuanto mayor solapamiento se produzca entre los espectros de ex-
citacin-emisin de donador y aceptor y cuanto ms favorable sea la
orientacin espacial relativa de los (dipolos) fluorforos.
Cuando se produce FRET, el donador disminuye su intensidad de
emisin, puesto que u n a parte de la energa absorbida es cedida al acep-
tor. Al mismo tiempo, se detecta un aumento de emisin en el aceptor
que, a las longitudes de onda tpicas de excitacin del donador, emite de
forma muy escasa o nula. El seguimiento del FRET en el microscopio de
fluorescencia o confocal se puede hacer de varias m a n e r a s distintas. La

251
mmiri^cm Microscopa
FRET
longitud de onda (A)
forma ms fiable y tambin ms costosa es medir la vida media de la

fluorescencia del donador. Cada fluorforo posee u n patrn temporal ca-
racterstico de decaimiento de emisin que determina u n valor de vida
media, es decir, el tiempo que t a r d a en decaer h a s t a emitir la mitad de
la fluorescencia inicial (mxima). Los valores de vida media de los
fluorforos orgnicos, incluidas las protenas fluorescentes, se encuen-
t r a n en el entorno de unos pocos nanosegundos. Cuando se produce
FRET entre fluorforos, la vida media de fluorescencia del donador dis-
minuye, siendo este valor indicativo de la eficiencia de FRET. Ahora
bien, antes de utilizar este mtodo es necesario descartar otras posibles
causas, ya que la vida media tambin puede verse afectada por las con-
centraciones de oxgeno, iones, pH o interacciones con otros compuestos
no fluorescentes. U n a vez descartados posibles artefactos, este mtodo
es extraordinariamente sensible y fiable, con la ventaja aadida de no
depender de la concentracin de fluorforo ni de la intensidad de la emi-
sin. El segundo mtodo es el mtodo de los ratios. Consiste en captu-
rar imgenes independientes con la emisin del donador y del aceptor
tras excitar selectiva y nicamente al donador. Cuando se est produ-
ciendo FRET, la emisin del donador disminuye mientras que la emisin
del aceptor aumenta. Si dividimos la seal del aceptor por la del dona-
dor en cada pixel o en u n rea determinada, obtendremos un valor
numrico indicativo de la eficiencia de FRET al que se denomina ratio.
Cuanto mayor sea ese nmero, mayor ser la eficiencia de FRET y vice-
versa. El mtodo de los ratios es el ms utilizado debido a su sencillez
y facilidad de implementacin. Sin embargo, para obtener resultados
fiables, es necesario realizar u n a serie de pruebas previas encaminadas
a asegurar u n a intensidad de emisin similar para cada fluorforo y u n a
relacin molar lo m s parecida posible. El tercer mtodo p a r a determi-
nar FRET consiste en capturar imgenes de la emisin del donador an-
tes y despus de eliminar la fluorescencia del aceptor mediante photo-

252
bleaching. E n caso de producirse FRET, tras eliminar la absorcin del

aceptor, la emisin del donador debera ser m s intensa. E s t a prueba
slo puede realizarse u n a vez ya que, tras quemar el aceptor, es im-
posible capturar de nuevo la imagen inicial. La determinacin de FRET
mediante photobleaching se utiliza muy a menudo como prueba irre-
futable de su existencia, ya que no se ve afectado por factores que su-
gieren su presencia artefactual.
La microscopa FRET se utiliza para estudiar y confirmar interaccio-
nes protena-protena, protena-DNA, etc. La estrecha relacin inter o in-
tramolecular necesaria para que se produzca FRET, junto con su fuerte
dependencia de la distancia entre donador y aceptor, determina su ex-
quisita sensibilidad a mnimos cambios de conformacin. La pareja do-
nador: aceptor ms utilizada para medir FRET es la constituida por las
protenas fluorescentes E C F P y EYFP. Estas protenas presentan espec-
tros de absorcin y emisin con suficiente solapamiento (aunque no pti-
mo). Entre estas dos protenas los valores mximos de FRET se hallan li-
mitados por el hecho de que los fluorforos se encuentran en el interior
de la estructura tridimensional caracterstica de las protenas fluores-
centes derivadas de A. Victoria (p-can), de m a n e r a que la mayor aproxi-
macin posible se sita en torno a los 5 nm. Continuamente se estn de-
sarrollando nuevas parejas donador/aceptor FRET con supuestos
mejoras de brillantez en los fluorforos, solapamiento de sus espectros,
distancias de aproximacin y eficiencia de transferencia en general.
Una m a n e r a de estudiar interaccin entre protenas in vivo es cons-
truir quimeras independientes con ECFP y EYFP para establecer pare-
jas donador/aceptor FRET. Sin embargo, aunque las construcciones son
sencillas de realizar, en muchas ocasiones no es posible demostrar FRET
por mucho que la interaccin entre ambas protenas est suficientemen-
te demostrada por otros mtodos. Los motivos ms habituales de esta fal-
ta de eficiencia tienen que ver con la ubicacin de las protenas fluores-
centes en la estructura de las protenas de fusin, muchas veces
incompatible con la proximidad necesaria para el FRET. Tambin es ha-
bitual topar con dificultades para determinar los niveles de FRET debi-
do a que la expresin e intensidad de fluorescencia de donador y aceptor
son muy heterogneas. E n estos casos, se suele variar la cantidad relati-
va de cada vector de expresin en las transfecciones. Puesto que, en mu-
chas ocasiones, el FRET es una cuestin de ensayo y error, u n abordaje
utilizado con frecuencia es la construccin de los denominados sensores
o sondas FRET. Estos estn constituidos por u n a cadena polipeptdica
que incluye E C F P e EYFP y adems incorpora entre ellas secuencias o
dominios relevantes, que pueden ser secuencias de corte por proteasas.

253
de fosforilacin por quinasas o dominios de interaccin con ligandos como

iones, nucletidos u otras protenas. Una de las primeras sondas FRET
en desarrollarse fue la denominada Yellow-Chamaleon, constituida por
una molcula de Calmodulina (CaM), flanqueada por E C F P y EYFP, y en
cuyo interior se insert la secuencia de interaccin con Ca+2/CaM de la
quinasa de la cadena ligera de miosina (MLCK). La protena de fusin re-
sultante admite dos conformaciones; u n a en presencia de calcio, en la que
CaM interacciona con la secuencia de MLCK, se produce u n acercamien-
to entre E C F P e EYFP y, por tanto, FRET y, otra, en ausencia e calcio,
en la que los fluorforos estn separados y no se produce FRET. En este
sensor, las variaciones de FRET se correlacionan directamente con cam-
bios en las concentraciones de calcio intracelular.
^4priin
CCaU
, S35 n;fi
Yeltow * y^; ^Ht
chamaleon v /
44Dnm
fîn
FLIM, F R A P y F L I P
Los acrnimos FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy),

FRAP (fluorescence recovery after photoblaching) y FLIP (fluorescence
loss in photobleaching) empiezan a escucharse con frecuencia, Bobre todo,
en el campo de la biologa celular. La vida media de fluorescencia de u n
fluorforo (x) es u n a propiedad fsica caracterstica y distintiva de cada
fluorforo. FLIM es u n a tcnica de microscopa que mide la vida media
de los fluorforos presentes en una muestra. Su inters fundamental ra-
dica en que el valor de x no depende de la concentracin de fluorforo ni
de la intensidad de iluminacin y, por tanto, se puede utilizar para ana-

254
lizar la composicin de fluorforos en muestras complejas, especialmen-

te, all donde otros mtodos como el anlisis espectral no resultan efecti-
vos. Las primeras medidas de vida media de fluorescencia se realizaron
en 1926 utilizando espectrofluormetros. Su introduccin en la micros-
copa es mucho ms reciente y coincidi con la disponibilidad de fotode-
tectores ms rpidos y sensibles (cmaras CCDs intensificadas).
Los valores de vida media pueden verse modificados por varios facto-
res del entorno. Como regla general, la vida media disminuye cuando
parte de la energa del fluorforo excitado es transferida a su entorno en
vez de emitirse en forma de fluorescencia. Cuanta m s energa se trans-
fiera al entorno, ms se reducir el valor de vida media. Uno de los fac-
tores ambientales que ms afectan la vida media es la concentracin de
oxgeno. El oxgeno apantalla la emisin de muchos fluorforos y ab-
sorbe buena parte de su energa. Existen sondas fluorescentes especial-
mente sensibles a quenching por oxgeno que permiten determinar in-
directamente su concentracin a travs de la medida de su vida media.
El valor de x tambin se afecta por otros factores entre los que cabe des-
tacar la interaccin o conjugacin del fluorforo con otras molculas (Vg.
protenas), su proximidad a otros fluorforos con espectros de absorcin
adecuados (FRET), el pH o la concentracin inica.
E n microscopa, la vida media de fluorescencia se puede medir en el
dominio tiempo o en el dominio frecuencia. En el primer caso, la
muestra se excita con un pulso corto de luz (puede ser por absorcin de
uno o varios fotones) generalmente producido por u n lser pulsado y, a
continuacin, u n a cmara ultrarrpida y sensible realiza capturas a va-
rios tiempos para muestrear la cada de la emisin. Este proceso se repi-
te muchas veces h a s t a conseguir un valor promedio fiable. Estas cma-
ras estn dotadas de un intensificador frente al CCD (que amplifica la
seal h a s t a 10^ veces) y un sistema de compuerta electrnico (gating) que
reduce los tiempos de captura h a s t a 0,1 nanosegundos. El segundo m-
todo no requiere disponer de un equipo t a n costoso como el primero. Se
t r a t a de aplicar u n patrn de excitacin en forma de ondas con una fre-
cuencia y modulacin constantes y registrar los cambios de fase y modu-
lacin producidos en la emisin. La comparacin de estos parmetros en-
tre excitacin y emisin permite obtener los valores de vida media (x).
La amplia difusin de protenas fluorescentes as como de herra-
mientas para la manipulacin gentica h a posibilitado la realizacin de
estudios de localizacin y comportamiento cintico de protenas en clu-
las vivas. Las tcnicas relacionadas con la microscopa en especmenes
vivos se agrupan bajo la denominacin microscopa 4D, que tras introdu-
cir la tercera dimensin con la microscopa confocal, hace alusin a la va-

255
riable tiempo como la cuarta dimensin. De todas ellas, adems de la ya

comentada TIRFM, las m s utilizadas son la microscopa FRAP y FLIP.
Al observar al microscopio de fluorescencia o confocal clulas vivas
que expresan protenas fluorescentes, uno se percata rpidamente de que
la mera observacin o captura secuencial de imgenes no aporta infor-
macin real sobre los movimientos de una protena en el interior celular.
Debido en buena parte a la sobrexpresin pero tambin a la imposibili-
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
photobleach
geo
@)HS)--
o) 40
20 40 60 80 100
tiempo
Fluorescence Loss fn Photobleaching (FLIP)
photobteach
(m^KBX9> I o 20 40 M 80 100
tiempo
Fotoactivacin (PA-GFP)
20 40 60 80 100
tiempo
dad de distinguir grupos o pools dentro de la poblacin total en base a

algn criterio, resulta imposible obtener informacin sobre sus carac-
tersticas cinticas, vida media, etc. Una protena podra estar anclada
en el citoesqueleto, traslocndose continuamente entre compartimentos
o libre para difundir en el citoplasma y, en todos los casos, obtendramos
secuencias de imgenes equivalentes. Para discernir entre estas posibili-
dades es preciso que u n pequeo grupo o pool de la protena pueda dis-
tinguirse del resto para as poder analizar su comportamiento cintico.
La microscopa FRAP persigue este objetivo y consiste en producir pho-
tobleaching en u n rea especfica y limitada de la clula para, a conti-
nuacin, realizar un seguimiento del patrn y la rapidez con los que la
fluorescencia se r e s t a u r a en el rea irradiada. Tras el photobleaching,
una fraccin de la protena se hace invisible y se altera el estado estacio-
nario de la distribucin de fluorescencia pero no el de la distribucin de

256
protena que continua siendo el mismo. Los estudios cuantitativos de mi-

croscopa FRAP con quimeras de protenas fluorescentes nos permiten
estimar sus coeficientes de difusin (D^^) y su fraccin mvil (Mp. Para
analizar la movilidad se calcula un valor D^^ terico, inversamente pro-
porcional al tamao de la protena, que correspondera al desplazamien-
to aleatorio de u n a protena ideal que no inter acciona con su entorno. Va-
lores experimentales de D^^ por debajo del terico pueden indicar
aumentos de viscosidad en el medio, asociacin de la protena a u n com-
plejo o agregado de mayor tamao o interaccin con ligandos anclados en
la estructura celular (Vg citoesqueleto). Valores de D^^por encima del va-
lor terico podran indicar menor viscosidad o transporte mediado por
protenas motoras. Por otra parte, el porcentaje mximo de fluorescencia
que difunde al interior de la zona irradiada (Mf) tambin puede revelar
informacin importante. Un descenso en el valor de Mf puede indicar un
anclaje de la protena, su inclusin en agregados inmviles o su confina-
miento en u n compartimiento separado. Un aumento del valor de Mf pue-
de indicar, por otra parte, su liberacin de u n a estructura compleja o su
exportacin dirigida desde otro compartimiento.
La microscopa FLIP consiste en la irradiacin repetida de u n a zona
de la clula al tiempo que se continan recogiendo imgenes de la distri-
bucin de la fluorescencia. Al analizar la fluorescencia en las zonas no
irradiadas se pueden realizar seguimientos de la movilidad de la quime-
ra fluorescente y de la continuidad entre compartimentos celulares. As
por ejemplo, si sometemos a photobleaching continuado la regin del
aparato de Golgi podemos encontrarnos con u n patrn de prdida pro-
gresiva de fluorescencia en toda la clula. Este protocolo nos permitira
acotar pools definidos de protena y realizar seguimientos de su movi-
lidad y cintica en el interior celular.
Dentro de la microscopa 4D hay que incluir tambin otras modalida-
des de microscopa, como son la utilizacin de las nuevas variantes de
protenas cuya fluorescencia puede alterarse por efecto de la iluminacin
en el entorno de 400 nm, como es el caso de las ya descritas PA-GFP y
Kaede. Otras tcnicas emergentes en este grupo son la microscopia de co-
rrelacin de fluorescencia (FCM) y la microscopia de fluorescencia de
speckle (motas) (FSM). La microscopia de correlacin de fluorescencia
(FCM) registra y analiza en el tiempo las fluctuaciones de fluorescencia
en u n volumen muy reducido de la muestra (del orden de femtolitros). Si
el tamao del volumen monitorizado es suficientemente pequeo, las
fluctuaciones pueden interpretarse como movimientos de entrada y/o sa-
lida de fluorforos individuales en el espacio definido por la excitacin. A
travs del anlisis de estas fluctuaciones se puede obtener informacin

257
sobre la movilidad de protenas en u n a localizacin o compartimiento de-

terminado, o determinar sus constantes de disociacin con otros ligandos.
Como la movilidad por difusin depende del tamao molecular, cuando
u n a protena marcada con u n fluorforo interacciona con otra, el tamao
del complejo fluorescente aumenta y los cambios de movilidad pueden de-
tectarse mediante FCM. Esta tcnica h a evolucionado de la espectrosco-
pia de correlacin de fluorescencia (FCS) cuyo tratamiento matemtico
es esencialmente el mismo. La posibilidad tcnica real de llevar a cabo
estas mediciones en clulas vivas mediante microscopa confocal y multi-
fotn est empujando con fuerza la implantacin de FCM.
La microscopa de fluorescencia de speckles (motas) o FSM es tam-
bin u n a tcnica de microscopa catalogada como 4D. Se utiliza para es-
tudiar el movimiento, ensamblaje y desensamblaje de estructuras y ma-
cromolculas celulares como, por ejemplo, el citoesqueleto. Esta tcnica
fue descubierta casi por accidente al observar en imgenes de alta resolu-
cin de clulas microinyectadas con tubulina-rodamina que los microtu-
bules (MTs) presentaban va-
Microscopa defluorescenciade "motas''(speckles) naciones de intensidad de
fluorescencia a lo largo de su
estructura como si estuvie-
ran salpicados (speckled)
de fluorescencia. Posterior-
mente, se comprob que este
patrn de fluorescencia de-
penda del porcentaje de
Incorporacin 1,25% tubuina-rodamna
monmeros fluorescentes
5|im
(tubulina-rodamina) incor-
porados en los MTs. Si la in-
corporacin de monmeros
fluorescentes es elevada (en
torno al 20%), los MTs apa-
recen marcados con u n a
fluorescencia uniforme. Sin
embargo, si la incorporacin
es baja (en torno al 1%), en-
tonces los MTs aparecen mo-
teados, indicando as que el
patrn de motas se debe a la
proporcin de fluorforos incorporados. A menor incorporacin, menor
ser el nmero de motas visibles a lo largo del MT, pero mayor ser el
contraste entre ellas. La situacin ptima sera que cada mota se debie-

258
r a a la emisin de u n fluorforo. Sin embargo, estas condiciones se al-

canzaran slo en porcentajes muy bajos de incorporacin de monmeros
fluorescentes. La sensibilidad del sistema de deteccin, los niveles de rui-
do y la propia dinmica (rapidez) del proceso de ensamblaje y desensam-
blaje limitan la posibilidad de alcanzar este punto. E n la prctica, las mo-
tas estn generadas por grupos de molculas fluorescentes que, una vez
incorporadas a la estructura (el MT), generan u n patrn de distribucin
que permanece constante hasta que se produzca el desensamblaje de la
estructura. Por tanto, los patrones de motas fluorescentes registrados en
los MTs actan como marcas de referencia, que permiten detectar la mo-
vilidad de estructuras enteras en el interior celular, su aparicin y su de-
saparicin. E n la actualidad, la tcnica de FSM est impactando con
fuerza en el rea de la biologa celular, especialmente en aquellas lneas
dedicadas a entender y explicar la motilidad celular en base a la dinmi-
ca del citoesqueleto de actina y tubulina.
R e f e r e n c i a s bibliogrficas
FRET Imaging. E. A. JARES-ERIJRNAN y T. M. JOVIN. Nature Biotechnology 21, 1387-
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cells. Y. SAKO y T. UYEMURA. Cell Structure and Function 27, 357-365 (2002).
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A. N A I ^ N O . Cell Structure and Function 27, 349-355 (2002).
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nion in Neurobiology 12, 593-601 (2002).


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225

Tcnicas de microscopa optica

F. Javier Diez Guerra

Durante los ltimos aos, las tcnicas de microscopa ptica y sus

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Todos estos avances h a n resultado determinantes en la evolucin del

Muy frecuentemente, cuando se recuer-

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la Biologa. l fue el primero en observar y describir la existencia de bac-

Tras Leeuwenhoek, el concepto y diseo de microscopio compuesto,

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das en la poca. Ms tarde, August Khler propuso u n mtodo de ajuste

Contraste de fases Contraste de interferencia diferencial (DIC)

Sin embargo, en el rea de la biomedicina y, especialmente, la bio-

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croscopa de fluorescencia. La fluorescencia es un fenmeno conocido des-

IMicroscopa Fluorescencia lyAicroscopia Fluorescencia

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Inicialmente, el microscopio de fluorescencia se utiliz p a r a analizar

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microscopa de fluorescencia tiene ma-

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Ms recientemente, se h a n introducido varias familias de sondas li-

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Los fluorocromos que ms se aproximan al ideal estn constituidos

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ciencia quntica elevada y una fluorescencia brillante, que supone un au-

Espectro tbsorcft Q^M Espearo etmtt Q<b

Ahora bien, la verdadera revolucin de los ltimos aos h a venido de

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sin necesidad de protenas auxiliares, se pliega y cataliza u n a reaccin de

350 400 450 500 550 600

GFP es u n a protena muy estable y de pequeo tamao (238 aa). Du-

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rilla (EYFP) presenta mltiples mutaciones y es an ms brillante que

300 400 500 600 400 SQQ ^!Q 700

Las aplicaciones surgidas a raiz de la disponibilidad de las protenas

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media, localizacin subcelular, translocacin entre compartimentos, in-

Uno de los avances que ms ha impactado en la microscopa reciente

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vmente la fluorescencia que se genera en el plano focal, y consigue me-

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Compaftiva entre microscopia de fluorescncia y confocal

Ambos sistemas, el barrido XY y el disco giratorio, generan resultados

Fundamento e la Dos abordajes a fa microscopa confoca

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La eleccin entre el sistema de barrido o disco giratorio, depende en

Secciones pticas seriadas do un grano de polen obtenidas por microcopia confocal

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E n los ltimos aos se h a n introducido gran cantidad de mejoras y

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No todo son ventajas en la microscopia confocal. Una de sus desven-

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sea el sistema de captura, menor fototoxicidad, ya que podremos traba-

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el patrn opaco de la rejilla. Tras combinar las tres imgenes parciales

Grano d polm (canwo claro) PrayiKddn ii itootuti tptAi B 30 mkr

La microscopa multifotn es un desarrollo reciente dentro de la mi-

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liada por Winfried Denk, J a m e s Strickler y Watt Webb en la Universi-

s 20D 400 600 aOQ

duracin de pulso (fentos^g,)