EXPERINCIA 2: TRANSFORMAO DE BACTRIAS COM

PLASMDEOS CONTENDO GENES DE RESISTNCIA A ANTIBITICOS.

FUNDAMENTO

A tcnica de transformao permite a introduo de plasmdeo em uma bactria e

sua manuteno como um elemento autnomo auto-replicativo. Este plasmdeo pode
conferir bactria hospedeira certas propriedades (por exemplo resistncia a drogas) que
podem ter valor seletivo no meio. Vrias tcnicas so disponveis para transformar uma
bactria. Na aula prtica usaremos o mtodo do CaCl2. Neste mtodo as bactrias so
submetidas a um tratamento num meio hipotnico contendo clcio que as torna
competentes para a transformao pelo DNA do plasmdeo. Usaremos o plasmdeo
pBR322 (ver mapa).
O plasmdeo pBR322 comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de
fragmentos de genes.. Alm da origem de replicao que permite sua propagao em
bactrias (E.coli) o pBR322 apresenta duas marcas genticas, ou seja, genes que
codificam para protenas que conferem resistncia a ampicilina (amp r) e tetraciclina (tetr).
Portanto a introduo de pBR322 em E.coli que normalmente sensvel tanto ampicilina
como tetraciclina, leva ao aparecimento de bactrias capazes de crescer em meio
(lquido ou slido) contento estes antibiticos.
Note que a introduo de genes exgenos no stio da enzima de restrio Pst I leva
perda da resistncia ampicilina, uma vez que este stio est localizado na regio amp r.
Da mesma forma, clonagem no stio da enzima Bam HI leva perda da resistncia a
tetraciclina.
Transformao de bactrias que so sensveis a um antibitico, em resistentes, ser
revelada atravs de plaqueamento (inoculao) de bactrias em placas de gar contendo
meio LB (meio rico de Luria Bertani) na ausncia e na presena de antibiticos: placas
LB-A ou LB-tet. Contendo 50 mg/ml ampicilina ou 12,5 mg/ml tetraciclina.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

O ideal que a experincia seja realizada em ambiente assptico (fluxo laminar),

para evitar contaminao. Manipule convenientemente o material estril fornecido. NO
ABRA AS PLACAS DE GAR AT O MOMENTO DE USO.
As bactrias competentes para transformao so preparadas a partir de uma
cultura em fase exponencial do crescimento e atravs de sucessivas lavagens do
precipitado de bactrias com uma soluo de CaCl2. As bactrias competentes assim
preparadas podem ser armazenads a 80C, para uso posterior.

1. Inocular 5 ml de meio LB lquido com uma colnia de bactrias HB101 (E.coli) e

incubar 37C at o dia seguinte sob agitao forte (200-250 rpm).
2. Diluir a pr-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar 37C sob agitao at
OD600nm=0,3 (fase logartmica de crescimento).
3. Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactrias por centrifugao (4000 rpm, 5
min). Ressuspender o sedimento de bactrias em 5 ml de tampo acetato de sdio (frio)
20mM pH6,5 contendo CaCl2 0,1 M. Incubar no gelo por 20 minutos.
4. Coletar as bactrias (4000 rpm, 5 min 4 C) e ressuspender em 1 ml do mesmo
tampo (frio).
5. Aps pelo menos 30 min. No gelo estas BACTRIAS COMPETENTES podem ser
transformadas.
6. Para transformar, distribuir 0,1 ml/tubo da suspenso de bactrias competentes
para cada um de 2 tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 g DNA de pBR322 em
10l de tampo 10mM Tris pH7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo
ser usado como controle (bactria apenas).
7. Incubar em gelo por 15 min. Antes de dar o choque trmico (42C por exatamente
90 segundos) . Transferir os tubos para o gelo por 2 min.
8. Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37C sem agitao, em banho-maria,
por uma hora.
9. Transferir 25l ou 250l da suspenso para placas de gar LB e LB-A (LB contendo
ampicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactrias
com o auxlio de uma ala de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na
prpria tampa da placa de Petri.

Nmero de Colnias / Placas

Placa LB Placa LB-A
# 1 Bactrias controle 25l -------------------------------------
# 2 Bactrias controle 250l -------------------------------------

# 3 Bactrias transformadas 25l -------------------------------------

# 4 Bactrias transformadas 250l -------------------------------------
ANLISE DOS RESULTADOS

1. Preencher a tabela com o nmero de colnias obtido em cada caso:

Nmero de Colnias / Placas
Placa LB Placa LB-A
# 1 Bactrias controle 25l -------------------------------------
# 2 Bactrias controle 250l -------------------------------------

# 3 Bactrias transformadas 25l -------------------------------------

# 4 Bactrias transformadas 250l -------------------------------------

QUESTES

1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactrias
competentes?

2. Qual o papel do choque trmico?

3. Por que as bactrias devem ser incubadas por 60 min. a 37C antes de espalh-las
em placas de gar?

4. Que utilidade teria esta tcnica do ponto de vista biotecnolgico? D um exemplo.