MACROMOLCULAS DE LA LEVADURA

Vasquez David Felipe-1626623, Torres Jorge-1631517, Silva Santiago-1623126

Palabras claves: levadura, extraccin, centrifugacin, macromolculas, pruebas

cualitativas.

INTRODUCCIN

Los organismos formados por organizacin supramolecular, tejidos y rganos estn compuesto de
una cantidad de moleculas y macromoleculas que le permiten su funcionamiento, el estudio de
estas macromolculas, su identificacin, separacin y comportamiento son necesarias para
entender los organismos clasificados como vivos, las macromolculas son utilizadas para la
realizacin de importantes procesos como catlisis enzimticas, provisin de materiales
estructurales, almacenamiento de energa y manejo de informacin (Mathews et al., 2013). Las
macromolculas son molculas grandes, altamente organizadas, pueden llegar a contener varios
millones de tomos de carbono. Se pueden dividir en cuatro categoras principales: carbohidratos,
cidos nucleicos, protenas y lpidos. Estas macromolculas se construyen a partir de monmeros
(elementos de bajo peso molecular) mediante un proceso de acoplamiento y a su configuracin se
le confieren sus caractersticas y funciones. La estructura bsica y funcin de cada familia de
macromolculas es muy similar en todos los organismos, desde las bacterias hasta los vertebrados
(Curtis et al., 2006). Las macromolculas se encuentran en su mayora en las clulas y se
clasifican en cuatro grandes grupos, lpidos, carbohidratos, protenas y cidos nucleicos, aunque
todas las clulas tengan protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos, los tipos particulares
de macromolculas son especficos para cada especie en particular.

Cada macromolcula posee caractersticas y configuraciones diferentes, lo cual cambia

propiedades fsicas como energa requerida para cambios de estado, reaccin frente a otros
compuestos tanto orgnicos como inorgnicos, acidez y alcalinidad, solubilidad, la identificacin de
la estructura permite obtener conocimiento suficiente para lograr separarlas, modificarlas y aun
sintetizarlas en un laboratorio. (Heart et al,. 2003)

MARCO TERICO

Los carbohidratos son macromolculas de gran importancia biolgica, constituidos por

monosacridos unidos en cadenas largas compuestas por carbono, hidrogeno y oxigeno con
mltiples grupos hidroxilo (-OH) dentro de su estructura qumica. Pueden cumplir una funcin
estructural como la celulosa o pueden ser fuente de energa como la glucosa. Su unidad bsica es
la molcula de azcar o monosacrido, unidos por enlaces O-glucosdicos. En algunos todas las
unidades monomricas son idnticas, un ejemplo de ello es el glucgeno, constituido
exclusivamente de unidades de glucosa, aquellos que contienen tienen ms de seis unidades
monosacridos son llamadas polisacridos, como por ejemplo la celulosa, el almidn y el
glucgeno (Solomon, 2008). La forma ms importante de almacenamiento de energa en las
clulas animales y fngicas es el glucgeno (Figura 1). El glucgeno es un polisacrido de
almacenamiento; una reserva de glucosa. Est formado por unidades de glucosa unidas por
enlaces (1-4) y ramificaciones (1-6). El glucgeno se almacena dentro de vacuolas en el
citoplasma de las clulas durante una buena alimentacin que luego es utilizado para la gluclisis.
Estas vacuolas contienen las enzimas necesarias para la hidrlisis de glucgeno a glucosa, el cual
es liberado por fosforlisis (glucogenlisis) durante una situacin de ayuno o desgaste energtico
(Diez et al., 2007).

Figura 1. Estructura molecular del glucgeno

Los lpidos son molculas orgnicas con una parte de su estructura hidroflica y una parte
hidrofbica, que al igual que los carbohidratos pueden desempear papeles importantes en el
almacenamiento de energa y como componentes estructurales. Este grupo comprende
compuestos como las grasas, los aceites, los fosfolpidos, los glucolpidos, las ceras, el colesterol y
otros esteroides. Los fosfolpidos son los principales componente en las membranas celulares
(Chang y Collegue, 2002).

Los cidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden
encontrar en las clulas asociados a protenas formando complejos llamados ncleo-protenas.
Estas protenas tienen carcter bsico mientras que los cidos nucleicos son cidos. Las protenas
son polmeros de -aminocidos, en donde cada aminocido contiene un grupo amino y un grupo
carboxilo que sirven para la unin de las molculas formando largas cadenas mediante un enlace
peptdico (McGilvery, 1977). En el caso de los cidos nucleicos, estos son molculas esenciales
para las funciones de las clulas, en las cuales existen dos tipos: el cido desoxirribonucleico
(DNA) en el que se localiza la informacin gentica y el cido ribonucleico (RNA) que participa en
la expresin gnica y sntesis de protenas. Los cidos nucleicos estn constituidos por
nucletidos, y estos a su vez estn formados por un cido fosfrico, una pentosa y una base
nitrogenada unidos covalentemente (Pea, 2004).

El ADN se caracteriza porque la pentosa en su esqueleto es la 2-desoxirribosa. Las bases que se

distribuyen a lo largo de su esqueleto son la adenina, timina, citosina y guanina. El ADN se
compone de dos hebras de polinucletidos, de manera que la secuencia de bases en una hebra
determina la secuencia complementaria en la otra hebra. Es a la secuencia de bases lo que se
denomina informacin gentica (McGilvery,1997).
El ARN se caracteriza porque la pentosa en su esqueleto es la ribosa y porque contiene uracilo en
lugar de timina. Se forma mediante la copia de una sola cadena de ADN por lo cual el ARN no
forma doble hlice. La informacin de la secuencia contenida en el ADN se transfiere
especficamente a travs de los ARNmensajero (ARNm) de forma que cada aminocido es
representado por una secuencia de tres nucletidos sucesivos antiparalelos a los de la hebra de
ADN de la que fue transcrita la cadena de ARN. Los tripletes del ARNm se conocen como codones,
mientras que los tripletes antiparalelos, los de la hebra de ADN, se conocen como anticodones.
Una molcula de ARN contiene solo la informacin para formar una sola cadena peptdica,
mientras que una molcula de ADN contiene una cantidad mucho mayor de informacin, en
ocasiones puede contener toda la informacin gentica de la clula. Es decir la masa la de una
molcula de ADN es mucho mayor que la masa de una molcula de ARN, sin embargo en el
citoplasma se encuentran mayor cantidad de molculas de ARN que de ADN (McGilvery, 1997)

Otro tipo de macromolculas abundantes en todas las clulas son las protenas, constituyen ms
de la mitad del peso seco de las clulas. Estas desempean un papel activo en el metabolismo y
son el principal instrumento de reconocimiento molecular y de catlisis (Chan y Collegue, 2002).
Existe gran variedad de protenas tales como las enzimas y las hormonas, y otras que realizan
funciones estructurales y de regulacin de paso a molculas en las membranas. Las molculas de
protena son muy grandes y contienen miles de tomos de carbono, nitrgeno, oxgeno, hidrgeno
y azufre. Las protenas son polmeros, y como tal tienen una unidad bsica, esta unidad son los
aminocidos. Existen veinte aminocidos diferentes, cada uno distinto del otro debido a una
cadena lateral unida al carbono . Las propiedades de las protenas estn dadas por la secuencia
de aminocidos que la conforman, esto se llama estructura primaria. La estructura primaria
determina la estructura secundaria y terciaria de las protenas, esto es la disposicin espacial que
adopta la cadena de aminocidos. La estructura cuaternaria se refiere a la disposicin espacial de
las protenas que estn compuestas por ms de una cadena peptdica. (Wade, 2004)

Estas macromolculas, presentes en todas las clulas, suelen ser especficas y varan de un
organismo a otro. En la prctica se trabaj con la especie Saccharomyces cerevisiae que es una
levadura comercial ampliamente utilizada en la produccin de bebidas alcohlicas y en panadera.
Es un organismo unicelular que presenta un genoma de cromosomas lineales, pared celular
externa, compuesta principalmente de polisacridos como glucanos, protenas y quitina y otras
macromolculas como cidos nucleicos, carbohidratos y lpidos. (Togores, 2002). En esta prctica
se tuvo como objetivo por medio de pruebas cualitativas separar y confirmar las principales
macromolculas presentes en la levadura.

RESULTADOS

Punto 1.
La levadura tena una apariencia granulada de color beige y una ms fina de color blanca. Posterior
al triturado, obtuvo una apariencia polvorosa y fina de color caf claro. Al adicionar el cido
tricloroacetico al 5% y volver a triturar, la dilucin present una coloracin amarillenta turbia, con
presencia de pequeos grumos. Luego de centrifugar se obtuvo un sobrenadante amarillento y
traslcido, junto con un sedimento blanquecino y compacto.
Punto 2.
Cuando se aade etanol al sobrenadante, se aclara un poco, pero sigue presentando una
coloracin amarillenta. Al centrifugar se obtuvo un sedimento arenoso, blanco y fino. Se prepar
tres tubos, uno con una disolucin del sedimento, otro con agua destilada y el ltimo con una
solucin de almidn al 0.5%, a cada uno se le adiciono reactivo de yodo, presentaron las siguientes
coloraciones respectivamente: Caf oscuro, coloracin del lugar y negro intenso. (Figura 2)

Figura 2. Prueba de lugol.

Debido al cambio de coloracin, se identific la presencia de glucgeno en la muestra del

sedimento y en la solucin de almidn.

Punto 3.
Al calentar y agregar cloruro de sodio al sedimento extrado en el primer punto de la prctica, se
observ una apariencia lechosa blanquecina. Posterior al centrifugado de la misma, se obtuvo un
sobrenadante translcido un poco denso y un sedimento blanco compacto.

Punto 4.
Al aadir alcohol etlico fro al sobrenadante obtenido en el punto anterior, se percibi una
apariencia traslcida un poco turbia. Luego de la centrifugacin, se obtuvo un poco de sedimento
fino y blanco. Se diluy en amortiguador salino y se prepararon cuatro tubos con la muestra,
amortiguador salino solo, patrn de ADN y patrn de ARN. Luego de agregar reactivo de orcinol y
calentar cada tubo se obtuvieron las siguientes coloraciones respectivamente: Verde oscuro,
amarillo, verde claro y amarillo. (Figura 3)
 Figura 3. Prueba con orcinol.

El cambio en la coloracin en la muestra indica la presencia de cidos nucleicos.

Punto 5.
En un tubo de ensayo se tom una porcin de sedimento de protenas y se resuspendi en una
solucin de cloruro de sodio, en otro tubo se adiciono solucin salina sola, a ambos se le adiciono
sulfato cprico e hidrxido de sodio, en ambos casos el tubo de la muestra adquiri una coloracin
azul oscura, por otro lado, la solucin salina se torn azul claro, (figura 4).

Figura 3. Prueba de sulfato cprico.

El cambio en la coloracin de la muestra evidencia la presencia de protenas.

General.
La abundancia relativa de componentes que se pudo observar a travs de los experimentos
realizados es en orden descendente: Protena, Glucgeno y cidos Nucleicos.
DISCUSIN

Para estudiar la estructura y las funciones metablicas de los distintos compartimentos celulares,
puede ser necesario aislarlos del resto de los orgnulos. Para ello se rompe la membrana
plasmtica y la disolucin resultante es un homogeneizado celular o extracto crudo. A partir del
extracto crudo, combinando diversas tcnicas de separacin como la centrifugacin y la
cromatografa, se puede purificar el orgnulo o la macromolcula deseada. Existen varios mtodos
para romper la membrana plasmtica y su eficacia relativa depende del tipo de clula que se est
investigando. Los mtodos fsicos ms utilizados son el choque osmtico, los ultrasonidos y la
trituracin mecnica, esta ltima fue la utilizada para el tratamiento a las clulas de levadura y logr
la lisis celular de la levadura (Voet, 2004).

En laboratorio el glucgeno se separ de las otras biomolculas presentes en las clulas mediante
la adicin de cido tricloroactico (ATC) el cual posee tres tomos de cloro en el carbono los
cuales por efecto inductivo aumentan la considerablemente la acidez del cido actico. Los
protones disociados del cido interaccionan con los grupos hidroxilos de las unidades de glucosa
que conforman el glucgeno mientras que las bases conjugadas del cido forman puentes de
hidrgeno con los hidrgenos del glucgeno, por esta razn el glucgeno se solubiliza en el cido.
(Campbell, 2004). Las protenas en presencia del ATC se desnaturalizan ya que por el pH de este
reactivo, desaparecen algunas de las cargas de las protenas, reduciendo drsticamente las
interacciones electrostticas que normalmente estabilizaron la forma activa de la protena. La
desnaturalizacin de las protenas que recubren a los cidos nucleicos posibilit la sedimentacin
de los ltimos (Wade, 2004). El ATC disminuyendo la solubilidad de las protenas, aumentando su
densidad y adems diluy el glucgeno, permitiendo la precipitacin de sustancias de peso
molecular elevado como protenas y cidos nuclicos, en tanto que el glucgeno continuo disuelto;
llevando dicha solucin al proceso de centrifugacin, se obtuvo un sedimento con cidos nuclicos
y protenas (Diez et al., 2007)

El precipitado de glucgeno se consigui agregando etanol (precipit polisacridos y elimin

monosacridos solubles) y se llev nuevamente la solucin a la centrifugadora, dando como
resultado el glucgeno precipitado debido a la insolubilidad de ste en la muestra alcohlica (Diez
et al., 2007). Al tener una cadena corta de hidrocarburos con un grupo hidroxilo, el alcohol etlico
form enlaces de hidrgeno con las molculas de agua lo que le confiri gran solubilidad al
glucgeno; (McCarty, 1988).

Figura 4. Estructura molecular del etanol

Cuando se realiz la prueba para confirmar la presencia del glucgeno el sobrenadante form al
igual que el almidn complejos coloreados con el yodo, debido a la absorcin de yodo en sus
cadenas (Quesada, 2007). Ambos polisacridos se comportaron de manera diferente con el yodo,
ya que la conformacin ms usual de las uniones alfa de la amilosa del almidn es en forma de
hlice con seis residuos por vuelta. Las molculas de yodo quedaron atrapadas dentro de la hlice
no ramificada para formar un complejo soluble de almidn y yodo de color negro intenso (Campbell,
2004). Para el caso del control negativo que fue agua y lugol, observamos que el color del reactivo
se torn ms claro al diluirse en el agua dando un tono caramelizado.

Para disociar las protenas de los cidos nucleicos, se utilizaron como agentes desnaturalizantes el
cloruro de sodio y el calor. As cuando se agreg el cloruro de sodio al sedimento de cidos
nucleicos y protenas, las protenas se precipitaron ya que la solubilidad de la protena se redujo
por la accin de la fuerza inica elevada (Voet, 2004). Este fenmeno es conocido como salting out
(reduccin de la solubilidad por sales) resultado de la competencia por las molculas de
solvatacin entre los iones salinos agregados y los otros solutos disueltos. As las interacciones
entre protenas se volvieron ms fuertes que las que se produjeron entre las protenas y el cloruro
de sodio, lo que condujo a la precipitacin de protenas (Voet, 2004). Adems de aislar las
protenas, el cloruro de sodio tambin pudo eliminar el material citoplasmtico y componente
lipdico restante dentro de la solucin. Con ayuda de la centrifugacin, las molculas ms pesadas
(protenas) se sedimentaron, quedando en el sobrenadante los cidos nucleicos (Freifelder, 1981).

Del procedimiento anterior se obtuvo un sobrenadante que contena cidos nuclicos, cloruro de
sodio y agua. Al aadir el etanol al 96% frio, ayuda a la precipitacin de los cidos nucleicos, para
ello antes de agregar el etanol se mantuvo el tubo en un bao de hielo para facilitar la precipitacin
de los cidos nuclicos, que fueron las molculas ms densas, Entre los iones de cloro y sodio, las
molculas de agua, de etanol y las macromolculas de cido nucleico las ms pesadas son los
cidos nucleicos, as que luego de la centrifugacin el sedimento era en su mayor parte cidos
nucleicos. Para comprobar la presencia de cidos nucleicos en el sedimento se utiliz una reaccin
cualitativa con reactivo de orcinol, y se calent durante algunos minutos. Hasta obtener un color
verde, donde la intensidad del color depende de la concentracin de cidos. A esta reaccin se le
conoce como la prueba de Bial (Quesada, 2007). En esta parte de la prueba se debe tener en
cuenta no dejar mucho tiempo en calor, ya que podra dar un falso positivo cambiando de
coloracin an sin presencia de cidos nucleicos si no de otro compuestos orgnicos el cual
reacciona frente a una adicin considerablemente grande de energa en forma de calor.

Figura 5. estructura molecular del orcinol

El reactivo de orcinol es una mezcla entre cido clorhdrico y orcinol. En medio acuoso el cido
clorhdrico produce una deshidratacin intramolecular de los carbohidratos que tengan 5 o ms
carbonos y los transforma en furfural o derivados de furfural. La ribosa y la desoxirribosa, los
azcares del esqueleto del ARN y el ADN, son pentosas por lo cual permite la formacin del
furfural. Posterior a la formacin del furfural este reaccion con el orcinol y La solucin patrn de
ARN que cambi a color verde claro casi amarillo, indicando la presencia de pentosas en la
muestra. La solucin patrn de ADN dio un verde ms oscuro indicando que la concentracin de
pentosas era mayor que en la muestra de ARN, y la solucin Blanco permaneci con tono amarillo
claro, debido a que no contena cidos nuclicos y no reacciono con el orcinol (Battaner, 2000).

Las protenas no son ms que polipptidos de un gran peso molecular, estas molculas estn
compuestas por varios aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos. La adicin de sulfato
cprico se realiz con la intencin de provocar una reaccin coloreada, muy utilizada para el
reconocimiento cualitativo de la presencia de este tipo de molculas, la reaccin de Biuret. El
hidrxido de sodio crea un medio alcalino, favorable para la interacciones que se llevan a cabo
entre los iones Cu+2 del sulfato cprico y los pares electrnicos no compartidos del nitrgeno del
enlace peptdico de la protena. Est interaccin crea un complejo de coordinacin, el cual se ve
representado a rasgos generales en la Figura 4. Est tipo de pruebas da un resultado positivo en
todos los compuestos que tenga dos o ms enlaces peptdicos consecutivos. En est caso, las
protenas que generaron un resultado positivo, pueden provenir de mltiples orgenes, desde la
membrana celular, hasta todo el contenido del citosol, puesto que, las protenas son una de las
macromolculas ms abundantes. La coloracin que se observ, azul oscura en la prueba positiva,
se debe a que la absorcin de los electrones del complejo formado, est en su mximo en
aproximadamente 450 nm, por lo cual refleja la longitud de onda que pertenece a la coloracin azul
oscura-violeta. (UNLP, 2017)

Figura 6. Reaccin de Biuret

CONCLUSIONES

Considerando que las soluciones patrones tenan una concentracin de 1000 mg/L y que la
coloracin de la muestra fue ms intensa que la coloracin de las soluciones patrones, se puede
concluir que la concentracin de cidos nucleicos en la muestra era mayor a 1000 mg/L.

La separacin de las macromolculas es un hecho que permite no solo extraer para propsitos
cualitativos en la clula, pero para estudiar su composicin, comportamiento, estructura, y funcin
dentro de la misma
BIBLIOGRAFA

Hart, Harold, Organic Chemestry. Eleventh Edition. Houghton Mifflin Company. 2003. 1-6,283,
448, 479, 515

Mathews, Christopher k. Biochemistry. Fourth Edition, Pearson toronto. 2013. 2-5

Battaner, E. 2000. Biomolculas. 1a ed. Ediciones Universidad de Salamanca. Salamanca

Campbell, M. 2004. Bioqumica. Thomson. Espaa. 117-119.

Chang, R., & College, W. (2010). QUMICA Dcima edicin. Mexico D.F.: McGRAWHILL.

CURTIS, H., S. BARNES, A. SCHNEK, G. FLORES (2006). Invitacin a la Biologa (6a ed.). Ed.
Mdica Panamericana, Buenos Aires-Madrid.

Diez Dapena, Jess, Carmen Alicia Padilla Pea, Emilia Martnez Galisteo, Jos Antonio
Brcena Ruiz, Concepcin Garca Alfonso. 2007. Aislamiento y cuantificacin de glucgeno
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Espaa.

McGilvery, R. 1997. Conceptos bioqumicos. Editorial reverte S.A. Espaa. 26-27.

SOLOMON, E. P., L. R. BERG & D. W. MARTIN (2008). Biologa (8a ed.). McGraw-Hill, Mxico.

Pea, A. 2004. Bioqumica. Limusa Ed. Mxico, Mxico. Pp 25.

Quesada, S. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para bioqumica. Editorial

Universidad Estatal a Distancia, Costa Rica. 21,52-53.

Togores, J. 2002. Tratado de Enologa. Aedos Ed. Barcelona, Espaa. Pp 489-490.

Wade, L. 2004. Qumica orgnica. Pearson educacin. Espaa. 1114-1155.

UNLP. En Ctedras Qumica. [En lnea] Disponible en:

http://www.academia.edu/18173462/Bioquimica_proteinas [Tomado el 10 de marzo del 2017]