4.

Materiales en fase slida

Los materiales en fase slida comnmente usados son placas de
microtitulacin de 96 pocillos de poliestireno. Para fines del inmunoensayo,
las microplacas son previamente cubiertas con protenas de captacin como
anticuerpos que permitan la inmovilizacin del analito. Sin embaro, la
adsorcin directa de los anticuerpos en la superficie plstica puede influir
negativamente en la ejecucin de la prueba en cuanto a reproducibilidad,
sensibilidad, costo, etc. Zhao y colaboradores desarrollaron dos diferentes
fases slidas basados en el sistema avidina-biotina y el sistema
fluorescena-isotiocianato(FITC)-anti FITC para la determinacin de la
albmina en orina. La avidina o el anticuerpo anti-FITC cubran las
microplacas para proporcionar una fase slida universal la cual mejoraba la
variabilidad y sensibilidad. Para las dos fases slidas, el rango lineal y el
lmite de deteccin fueron 0.15-15 ug/ml y 0.089 ug/ml. Posteriormente, Lin
y colaboradores usaron el sistema FITC-anti FITC como fase slida y el
sistema biotina-estreptavidina como sistema de amplificacin de seal para
desarrollar un mtodo CLIA altamente sensitivo para la determinacin del
17-estradiol (E2) y la hormona TSH. Los lmites de deteccin fueron 1,5
pg/ml y 0,01 mU/L respectivamente.
Las microesferas magnticas tienen muchas ventajas sobre las microplacas
en fase slida convencionales. Por ejemplo, las microesferas pueden
proporcionar un rea de superficie relativamente ms grande la cual
permitira utilizar una mayor concentracin para capturar anticuerpos,
incrementando la sensibilidad de la prueba; las microesferas cubiertas por
anticuerpos estn libremente suspendidas en el medio que contiene al
antgeno y esto resulta en velocidades de reaccin ms rpidas y reduce el
tiempo de la prueba al agitar la mezcla. El aislamiento de las microesferas
que contienen los inmunocomplejos puede ser fcil y rpidamente
ejecutado bajo un simple campo magntico; las microesferas
inmunomagnticas son capaces de capturar pequeas cantidades de
analitos de un volumen grande y diluido de muestra. De esta manera,
cuando las microesferas magnticas son recogidas, la cantidad total de
analito ser efectivamente concentrada. La tabla 4 muestra las partculas
magnticas que se han usado como fases slidas para el CLIA. Lin y
colaboradores, usando las microesferas magnticas como segundo agente
anticuerpo separador y la primera superficie slida de anticuerpos,
desarrollaron la prueba altamente sensible de CLIA para la determinacin
del estriol, alfafetoprotena, antgeno carniembrionario, CA-50 en humanos
con alta sensiblidad, especificidad, rapidez y reproducibilidad. Zhao y
colaboradores desarrollaron una prueba CLIA con microplacas magnticas
mediante la combinacin de las microplacas con microesferas magnticas
como fase slida para la deteccin de la HCG en sangre y saliva. Para el
17betaestradiol en muestras ambientales, usaron el separador magntico
de microplacas diseado por ellos mismos, el cual puede lograr anlisis de
alto rendimiento sin tratamiento previo de la muestra.
Bacterias magnticas han sido aisladas de sedimento marino y se sabe
que producen partculas magnticas. Muchas investigaciones se han
realizado acerca del mecanismo de produccin de estas partculas
magnticas y su funcin como compases de navegacin in vivo. Las
partculas magnticas bacterianas (BMPs) son pequeas en tamao (50-100
nm) y se dispersan muy bien debido a que estn cubiertas de una
membrana lipdica estable. Enzimas y anticuerpos han sido inmovilizados en
las BMPs usando para ambas reactivos bifuncionales y glutaraldehdo y se
ha descubierto que presentan ms actividad que aquellas quefueron
inmovilizadas en partculas magnticas artificiales. Matsunaga y
colaboradores desarollaron una CLEIA usando anticuerpos inmovilizados de
BMPs para la determinacin de IgG de ratones, estradiol,
alquilfenoletoxilatos (APEs), bisfenol A (BPA) y sulfonatos alquilbencnicos
(LASs) en agua ambiental. Para evitar la necesidad de la inmovilizacin del
anticuerpo de la BMP mediante enlaces covalentes, complejos de protena
A-BMP oobtenidos de AMB-1 transconjugado fueron unidos
subsecuentemente con anticuerpos a travs de enlaces especficos entre el
dominio Z de la protena A y el componente Fc de la IgG para formar los
complejos protena A-BMP. Estos complejos fueron muy dispersos y esto
result en alta seal y bajo ruido en el inmunoensayo. Lu y col. Introdujeron
poli-N-isopropilacrilamida (PNIP) y microesferas magnticas como
portadores de inmovilizacin biomoleculares para separar diferentes dianas
mediante el aprovechamiento de la respuesta trmica al emplear ELISA
homognea no competitiva formada por los ancituerpos inmovilizados al
inicio en la superficie de las microesferas magnticas y PNIP, antgenos
como IgG e IgA en la muestra y anticuerpos secundariamente cubiertos con
HRP. Adems, la deteccin de HRP con CL altamente sensible fue aplicada y
los lmites de deteccin de IgG e IgA fueron bajas (2,0 y 1,5 ng/ml
respectivamente).
5. Combinacin con otras tecnologas
5. 1 Inyeccin de flujo
El anlisis CL con las tcnicas de anlisis de inyeccin de flujo (FIA) e
inmunoensayo combinan todas las ventajas de la alta sensiblidad, precisin,
velocidad y selectividad. Ha sido ampliamente aplicado a muchos campos
incluyendo monitoreo ambiental, seguridad alimentaria, anlisis
farmacutico y diagnstico clnico, debido al pequeo costo de la muestra,
manejo simple de muestras, reutilizacin aceptable, buena reproducibilidad,
menor tiempo y fcil automatizacin y alto rendimiento de la muestra. Esta
tcnica puede ser ejecutada en sistemas tanto homogneos como
heterogneos. En inmunoensayos con inyeccin de flujo heterogneos, la
seal ha de ser modulado durante la formacin de los inmuncomplejos. Los
ensayos heterogneos son ms adecuados para el inmunoensayo con
inyeccin de flujo (FIIA) porque el paso de separacin puede ser efectuado
online en el sistema FIIA. Este paso de separacin puede realizarse
mediante un reactor de lecho empaquetado. Por lo tanto, la eleccin de un
soporte slido apropiado para el reactor es una de las decisiones cardinales.
Los soportes ms comnmente usados incluyen materiales como slice,
agarosa, sefarosa, poliestireno y membranas o partculas magnticas. Un
sistema FIIA heterogneo consiste en una bomba peristltica de mltiples
canales, una vlvula de inyeccin, una columna inmunoreactora y el
detector. La figura 3 muestra un inmunosensor CL con inyeccin de flujo
para el CA-19-9 basado en la inmovilizacin del CA-19-9 de la membrana del
quitosano. Luego de una incubacin offline del analito CA-19-9, la mezcla
fue inyectada en el inmunosensor, lo cual lleva al atrapamiento del CA-19-9
cubierto de HRP libre mediante el antgeno inmovilizado en el inmunosensor.
El anticuerpo cubierto de HRp atrapado es detectado por el CL debido a su
actividad cataltica en la reaccin entre el luminol y el perxido de
hidrgeno. Bajo ptimas condiciones la seal CL disminuida del
inmunosensor es proporcional a la concentracin CA-19-9 en un rango de
2,0-2,5 U/ml con un lmite de deteccin de 1,0 U/ml. Adoptando el mismo
esquema de CLIA con inyeccin de flujo, el grupo desarroll las diferentes
inmunoafinidades del reactor con microesferas de vidrio modificado con
epoxilano (wtf!! XDD), sefarosa y esferas de resina carboxlica para la
determinacin de analitos clnicos.
La nueva variacin de FIa, el anlisis de inyeccin secuencial (SIA)
introducido por Ruzicka y Marshall tambin se aplica junto a CLIA. A
diferencia de FIA, en el SIA, las diferentes soluciones son secuencialmente
aspiradas en un solo canal de reaccin usando una bomba de pistn con
flujo sinusoidal dirigido por una cmara en conexin con un multiposicin-
multipuertos. Imato y col. Desarrollaron un inmunoensayo rpido y sensible
basado en SIA usando microesferas magnticas para la determinacin de
sulfonatos alquilbencnicos lineales (LASs) y polietoxilatos alquilfenoles
(APnEOs) (como se muestra en la figura 4). La introduccin, atrapamiento y
liberacin de las microesferas magnticas en la celda de flujo eran
controladas por medio de un imn de neodimio y ajustando el flujo de la
solucin. El inmunoensayo estaba basado en una inmunoreaccin
competitiva indirecta de un anticuerpo mononuclear anti-LAS (o anti-
APnEO)en las esferas magnticas y la muestra LAS o APnEO (cubierta o no
por HRP), y estaba basada en la reaccin CL subsecuente del HRP con el
H2O2 y el p-iodofenol, en una solucin de luminol. Bajo ptimas
condiciones, el tiempo requerido para el anlisis era menos de 15 minutos.
5.2 Electroforesis capilar (EC)
El inmunoensayo con electroforesis capilar (CEIA), que combina el poder de
separacin efectivo de la EC con la especificidad del ligando del
inmunoensayo, ha demostrado ser una tcnica poderosa de separacin y
anlisis de compuestos biolgicos. Comparado al inmunoensayo
convencional, CEIA se caracteriza por su alta eficiencia, menos muestras,
tiempo de anlisis corto y fcil automatizacin. Ha sido exitosamente
aplicado en la determinacin de ciertos marcadores tumorales, hormonas y
abuso de drogas (hGH, insulina, morfina, cortisol y digoxina).
Hacia la dcada pasada, las investigaciones sobre la combinacin de la EC
con la deteccin del CL se han incrementado significativamente debido a su
alta sensiblidad, fcil manejo y reactivos y aparatos de bajo costo. Y se ha
prestado atencin a su aplicacin en CEIA. Tsukagoshi y col. Mostraron un
experimento de CEIA usando IgG de raton y anticuerpos IgG de raton
marcados con HRP en un nuevo tipo de deteccin CL en lotes para EC. Wang
y col. Detectaron exitosamente BMP-2 en musculo liso vascular de ratas con
un formato no competitivo de CEIA basado en la deteccin incrementada de
CL. El complejo HRP-Ab2-mAb-BMP-2 y el HRP libre fueron inicialmente
separados y detectados con limites de deteccin de 4.4x10^-12 mol/L para
HRP y 6,2 para BMP-2. Ji y col. Desarrollaron un mtodo CEIA con deteccin
de CL para la determinacin de CLB basado en una reaccin competitiva
entre CLB marcado con HRP y CLB libre con una cantidad limitada de
antisuero anti-CLB. Bajo ptimas condiciones, el marcador HRP-CLB y el
inmunocomplejo fueron separados y el rango lineal y el lmite de deteccin
para CLB fueron de 5-40 nmol/L y 1,2 noml/L. CEIA basado en CL fueron
tambin exitosamente aplicados para la determinacin del marcador
tumoral CA-125, HBsAg y HBsAc en humanos.
5.3 Electroforesis capilar en chip
Mtodos de inmunoensayo miniaturizados usando electroforesis capilar en
chips como mtodo de separacin para la deteccin ptica se han descrito
con ventajas de cierta reproducibilidad y tiempos de reaccin ms cortos.
Sin embargo, los anticuerpos marcados con tinte fluorescente se observan
en la EC como amplios picos debido a la carga heterognea del anticuerpo
mismo, y esto afecta el lmite de deteccin al disminuir el radio de ruido-
seal.
Tsukagoshi y col. Desarrollaron un microsistema de anlisis total (u-TAS)
incorporando la deteccin CL para marcadores tumorales. El sistema de
anlisis ejecuta los 3 sgts procesos en un microchip: reaccin inmune
altamente selectiva, electroforesis para la formacin y transporte de la
muestra y la deteccin de CL con alta sensibilidad. Estos 3 procesos fueron
integrados compactamente en un microchip. Este microchip contiene dos
microcanales que se cruzan en una interseccin, mientras que las
terminaciones de los microcanales dan a cuatro depsitos. Como el primer
proceso, la reaccin inmune se ejecuta usando una esfera de vidrio de
anticuerpos inmovilizados. Esta es colocada en uno de los depsitos junto al
antgeno (analito) y una cantidad determinada de antgeno marcado con
ILITC para iniciar una reaccin inmune competitiva. Para la electroforesis,
como el segundo proceso, el reactante producido es sometido a
electroforesis en la interseccin resultante de la muestra. La muestra luefo
es colocada en otro depsito que contiene una solucin de H2O2. En este
momento, la deteccin CL se realiza como tercer proceso: al antgeno
marcado se mezcla con H2O2 y el catalizador se incluye en el buffer para
producir CL. CL es detectado por un tubo fotomultiplicadores localizados
bajo el depsito. El u-TAS descrito es capaz de determinar, con alta
selectividad y sensibilidad, albumina srica o protenas inmunosupresoras
como marcadores tumorales en suero.
Enneus y col. Usaron un microchip de silicona como matriz para incorporar
un inmunoensayo enzimtico microfluidico usando una deteccin FI-CL
incrementada de marcador HRP, catalizando la reaccin entre el luminol,
H2O2, p-iodofenol (PIP) basado en microchips de silicona cubiertos con
anticuerpos. Como se muestra en la figura 6, anticuerpos anti-atrazina
policlonales fueron emparejados a la superficie de los microchips y el
principio del ensayo se bas en un formato heterogneo competitivo en el
cual el analito y una enzima marcadora como la atrazina compiten para
inmovilizar los sitios de unin del anticuerpo, seguido de la separacin y
deteccin del marcador unido, generando la seal CL directamente en el
chip.
5.4 Retos al combinar tecnologas
El futuro de las diversas tecnologas en inmunoensayo es, por lo general,
dirigido por las necesidades de los campos mdicos, clnicos, ambientales y
biolgicos. Aparentemente, las muestras biolgicas (saliva, plasma, suero,
LCR y biopsias) contienen importantes biomarcadores o protenas presentes
en una matriz caotica, donde tanto la concentracin minuto como el rando
dinamico de cada antgeno deben considerarse. La tecnologa emergente de
la actualidad de deteccin de antgenos clnica y ambientalmente relevantes
es muy esperanzadora en cuanto a los limites de deteccin que se
aproximan a un menor nivel y a la determinacin simultanea de multiples
analitos. Ademas ha habido tendencias significativas hacia la
microminiaturizacion, automatizacin, efectividad de costo y anlisis
multiple. As, los dispositivos microfluidicos para inmunoensayo poseen
caractersticas destacables tales como un radio de superficie-volumen alto y
un volumen de microcanal de nanolitros. Sin embargo, la tecnologa EC-CLIA
con microchip se ha restringido al CLIA dentro de un dispositivo
microfluidico donde los antgenos y anticuerpos son llevados dentro de un
microcanal por flujos de presin y electroquinesis. Los avances actuales
apuntan hacia la actuacin pasiva de bombas, vlvulas y mezcladores. Esto
no sorprende dado que hace que el control de fluido sea fcil al eliminar
otras partes mviles macroscpicas, realizando un microchip efectivo en
cuanto a su costo. Ahora, la fabricacin de chips de inmunoensayo
microfluidicos busca dispositivos de diagnosticos simples y porttiles como
lo muestran las tendencias a usar material polimerico, control de fluidos
pasivo y deteccin de chips. Ademas, la combinacin de microparticulas
magnticas y NPs han demostrado ser un par formidable que permite no
solo incrementar la seal sino facilitar la manipulacin del fluido en
presencia de un campo magntico especialmente en el microfluido del
inmunoensayo.
6. Futuras perspectivas
La tendencia en la quimica analitica ha sido a la microminiaturizacion, el
mejoramiento de la sensibilidad y el anlisis multiple. Reactivos de CL
miniaturizados, vesculas de reaccin de alta densidad y analizadores
basados en microchips, los cuales requieren muy pequeas cantidades de
muestras y reactivos, se han desarrollado. La alta detectabilidad y rapidez
de las tcnicas CL, junto con la disponibilidad de dispositivos analticos
basados en microarrays permiten el desarrollo de ensayos de alto
rendimiento, en el cual simultneamente, la deteccin multiple de analitos
se ejecuta en multiples muestras.
Las mejoras en la sensibilidad analtica probablemente conllevara al
descubrimiento de nuevos analitos para la contaminacin ambiental o
deteccin de enferemedades. El incremento de las tcnicas mantiene la
prmesa de detectar extremadamente bajas concentraciones en sangre
usando NPs como marcadores y deteccin CL. La unin de oligonucletidos
a NPs tiene una promesa particular. El uso de estas muy pequeas
partculas permite una alta sensibilidad. Zhang y col. Usando como
marcadores el oro y el CuS y deteccin CL para la deteccin de ADN,
encontraron que la sensibilidad se incrementa 6 veces comparado con otros
mtodos. El uso de inmunoensayos NP ha permitido la deteccin de 18-20
moleculas alfafetoproteina en 10 uL, mas alto que lo convencional.
El anlisis multiple permite que la medida simultanea de muchos analitos
que son conmunmente agrupados. Analisis multivariado en microchips,
donde diferentes haptenos o anticuerpos fueron inmovilizados en reas
distintas en una superficie de vidrio, se ha usado para realizar la deteccin
de multiples analitos basado en los procedimientos convencionales CL. El
anlisis del patrn espacial de la salida de luz, medida mediante un
dispositivo acoplado de carga de imgenes permite la deteccin de
diferentes analitos. Trabajos recientes incluyen el ensayo sensor de afinidad
paralela, el cual usa el inmunoensayo multianalitico automatizado con chips
con un formato de ELISA competitivo indirecto y una reaccin de CL
monitorizada por un dispositivo acoplado de carga de imgenes para la
deteccin simultanea de antibiticos en leche y diagnostico de alergias y el
desarrollo de sistemas separados de EC miniaturizado y deteccin de CL
usando la fabricacin de microchips miniaturizados.