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OBJETIVOS
INTRODUCCIN
CLCULOS
Concentracin [g/ml]
24.627
C= 22500 x 1 cm = 1094.53 g/ml
24.627 = X g/ml
X=1231.35 g/ml
24.627
Pureza= 11.755 = 2.095
Volumen Cantidad
Concentracin
Absorbancia obtenido obtenida
[g/ml]
L g
Equipo Pureza
C=
As 260 nm 1As260nm
260nm 280nm
Ae x b =50g/ml
230 10.276
240 16.03
250 23.216
260 24.627
270 19.154
280 11.755
290 4.759
300 0.87
30
25
20
15
Absorbancia
10
0
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310
DISCUSIN
Se obtuvo una muestra de la cepa W3350 de Escherichia coli y se centrifug para
separar del cultivo de caldo Luria. El paquete celular se suspendi en TE
(Tris/EDTA) pH 7.8, para eliminar los restos celulares este paso tiene la funcin de
ser un lavado, el EDTA es un agente quelante el cual quela al cofactor Mg 2+ y as
impide la accin de las nucleasas. Se centrifugo de nuevo eliminando el
sobrenadante y se resuspendi el precipitado en TE con ayuda de un vrtex para
separar todas las clulas y as aumentar la superficie de contacto y lograr que
todos los reactivos lleguen a la clula, la solucin de TE pH 7.8 tambin sirve para
proteger las RNAsas que se agregaran en el siguiente paso, ya que le
proporcionan al medio las condiciones adecuadas para que estas acten sobre el
RNA y se permita la purificacin del DNA.
Posterior a esto se agreg fenol a la solucin y se agit por inversin para formar
una emulsin, debe de intentar homogenizarse muy bien antes de que se
centrifugue, ya que la finalidad es que ambas partes interacten y se puedan as
separarse las protenas desnaturalizadas por accin del fenol en una interfase. Se
utiliza fenol ya que las protenas no son solubles en l.
Se realizaron dos lavados con fenol para eliminar la mayor cantidad de protenas
posibles. Despus se extrajo el sobrenadante que es la fase acuosa donde se
encuentra el DNA y se deposit en otro microtubo Posteriormente se agreg una
mezcla de cloroformo: alcohol isoamlico 24:1, este se agrega para desproteinizar,
precipitar todo lo que es soluble en cloroformo, como protenas restantes, lpidos
de las membranas, y el fenol residual. Es importante extraer todo el fenol de la
solucin, ya que este nos puede interferir en estudios posteriores que se quieran
realizar en la muestra de DNA por ejemplo en una PCR donde se ocupa a la DNA
polimerasa al ser una protena desnaturalizarla.