PACs

Para superar algunos de los problemas asociados con el uso de sistemas csmidos o
YAC, se ha desarrollado un mtodo para clonar y empaquetar fragmentos de ADN usando
un sistema bacterifago P1 que ofrece la capacidad de clonar grandes fragmentos de
ADN genmico de entre 70 y 95 kpb de tamao. El bacterifago P1 tiene un genoma
mucho mayor que el fago (en el intervalo de 110-115 kbp), y se han diseado vectores
con los componentes de replicacin esenciales de P1 incorporados en un plsmido
(Ioannou et al., 1994). Al infectar E. coli, el bacterifago P1 puede expresar sus funciones
lticas, producir 100-200 nuevas partculas de bacterifago y lisar la bacteria infectada, o
el bacterifago infectante puede reprimir sus funciones lticas, y el genoma del
bacterifago se mantiene como un gran, estable, Plsmido de baja copia. El fago P1 tiene
dos orgenes de replicacin: uno para controlar la replicacin del ADN ltico y el otro para
mantener el plsmido durante el crecimiento no ltico. Durante el ciclo ltico, se produce
nuevo ADN de fago y se escinde en un sitio pac antes de la insercin en partculas de
fago.
La clonacin de fragmentos de ADN extraos en un vector P1, o cromosoma artificial P1
(PAC), se muestra en la figura 3.19. El vector PAC se digiere con las enzimas de
restriccin ScaI y BamHI para generar dos brazos vectoriales: un brazo corto y un brazo
largo. El ADN genmico se digiere parcialmente con MboI (secuencia de reconocimiento 5
\ alpha - GTAC - 3 \ alpha, que da lugar a los extremos de la etiqueta compatibles con
BamHI) y se selecciona en un gradiente de sacarosa. Se aislan fragmentos entre 70 y 95
kb de longitud y se ligan entre los brazos vectoriales para generar una serie de molculas
lineales. Si la ligadura se produce entre dos brazos cortos, la molcula resultante no
contendr ni los orgenes de replicacin P1 ni el gen KANR, y ser no viable. Si ambos
brazos son largos no habr sitio de pac y no habr empaquetado en los cabezales del
fago. La nica combinacin que se obtendr ser la de la secuencia de insectos flota- da
tanto por un brazo corto como por un brazo largo.
Phage P1 utiliza una estrategia de empaquetamiento 'full-head' y puede acomodar una
longitud de DNA total de aproximadamente 110-115 kbp. Esto significa que cualquier
inserto de ms de 95-100 kpb dar como resultado el truncamiento del ADN envasado
antes de que ambos sitios loxP se inserten en el fago y la molcula no pueda circularizar
tras la transfeccin en el husped. Una vez inyectada en la clula husped cre + E. coli, la
protena Cre circulariza el ADN en los sitios loxP y el ADN se replica usando el origen de
replicacin del plsmido. El sitio de enzima de restriccin BamHI del vector original, en el
que se insert el ADN extrao, se encuentra dentro del gen sacB bacteriano (que codifica
la levansacarasa). La expresin de este gen es txica para clulas de E. coli que crecen
en sacarosa. Por lo tanto, el crecimiento de sacarosa proporciona un mecanismo de
seleccin positiva para aquellos PAC que contienen insertos. La propagacin de las
clulas de E. coli que albergan las colonias recombinantes de PAAC en la que se obtiene
la glucosa, genera colonias de colonias con insertos de ADN.
Clonacin en un vector PAC. El vector PAC contiene el plsmido de bacterifago P1 y los
replicones lticos, junto con un sitio de escisin de pac para permitir el ensamblaje del
ADN en las partculas de fago. Adems, el vector contiene el gen de resistencia a la
replicacin (ori) y de ampicilina pUC para la propagacin y seleccin del propio vector.
Estas secuencias se pierden en el PAC recombinante. Los insertos de ADN grandes se
clonan en el gen del saco B (cuya funcin se puede seleccionar contra) y se envasan in
vitro en partculas de fago P1. La transfeccin de las partculas de fago P1 en una clula
de E. coli que alberga una copia de la recombinasa Cre resultar en la circularizacin del
PAC recombinante en los sitios lox P. La forma circular se mantiene entonces a bajo
nmero de copias usando el replicn de plsmido P1.
Los PACs recombinantes se mantienen como plsmidos dentro de E. coli usando la
resistencia a la kanamicina como marcador de seleccin. El nmero de copias del
plsmido puede incrementarse ms de 25 veces mediante la induccin de -D-
tiogalactopiranosido de isopropilo (IPTG) de un replicn ltico P1 de alta copia controlado
por promotor lac que est presente dentro del PAC recombinante (Pierce et al., 1992). Las
molculas de ADN recombinante se aslan entonces como plsmidos usando mtodos
tradicionales. Utilizando el sistema de empaquetamiento de ADN P1, el ADN genmico de
70 a 95 kb puede ser fcilmente clonado y manipulado. Las mejoras en el diseo de
vectores han permitido la produccin de PAC que pueden acomodar insertos de 130-150
kbp. Las principales ventajas del mtodo de envasado de ADN P1 sobre otros mtodos de
clonacin genmica son
el gran tamao de los fragmentos de ADN que pueden insertarse en los vectores, no se
produce reordenamiento o delecin de ADN metilado debido al uso de cepas husped de
restriccin-menos y
El ADN recombinante se recupera fcilmente como plsmidos para su posterior cribado
y manipulacin.