ENFERMEDAD BLAD

(DEFICIENCIA EN LA ADHESION LEUCOCITARIA BOVINA)

ASIGNACION : GENETICA Y MEJORAMIENTO ANIMAL

PROFESOR : GUIDO LAVALLE PEA

ALUMNO : DREYFUS ANGULO, ALEX DANIEL

MANRIQUE QUIONES, XIOMARA ABIGAIL
MONDRAGON BARTOLO, LUZ STEPHANIE

CICLO : IV

SEMESTRE ACADEMICO: 2016-I

LIMA-PER
ENFERMEDAD BLAD (DEFICIENCIA EN
LA ADHESION LEUCOCITARIA BOVINO)
Dreyfus Angulo, Alex Daniel, Manrique Quiones, Xiomara Abigail
Mondragn Bartolo, Luz Stephanie
RESUMEN
El presente trabajo pretende exponer una de
las enfermedades genticas ms relevantes de
la ganadera bovina, ya que cada vez es mayor
la demanda de alimentos entre la poblacin
humana, unida a una mayor necesidad de
sostenible y fiable fuentes de alimentacin.
La deficiencia de Adhesin leucocitaria bovina
(BLAD), que hoy presentaremos es de gran
importancia ya que la utilizacin de ganado en
gran escala en reproductores portadores puede
incrementar y generar importantes prdidas
econmicas; por otra parte, aqu la importancia
de divulgar tanto entre investigadores mdicos
y entre los productores la utilizacin
importancia del conocimiento de
enfermedad.
En base a la amplificacin del ADN mediante
reaccin en cadena de polimerasa (PCR) y
posterior digestin con enzimas de restriccin
tag I hae III, fue posible visualizar, mediante
electroforesis en gel de agarosa al 4%, los
fragmentos de restriccin caractersticos para
bovinos normales, portadores o enfermos. La
tcnica de PCR acoplada a la digestin con
enzimas de restriccin (hae II y taq I) ha
demostrado que identifica inequvocamente el
genotipo del ganado en un locus determinado y
permite el diagnstico certero y precoz de
aquellos animales enfermos y/o portadores del
defecto hereditario conocido como BLAD.
(ARTICULO N 5). Anexo (2)
ABSTRAC
The adhesion deficiency of bovine leukocytes
to antigen, know as BLAD (bovine leukocyte
adhesion deficiency), is a hereditary genetic
disease which is lethal for the holstein breed. It
is a recesive autosomal disease that can be
trasmitted to the offspring. The objectiveof this
research was to standardize the molecular
techniques to diagnose BLAd and also to get a
first approximation of the genetic frequency of
the mutated allele inthe bull population of the
IXth and Xth regions. DNA amplification using
polymerase chain reaction (PCR) and posterior
digestion with restriction enzymes tag I and
hae III was performed. The digested product
was analyzedby 4 % agarose gel
electrophoresis and ethidium bromide staining
to show the typical restricction fragments
e presents in normal, carrier and infected cattle.
esta The diagnostic tecnique of PCR and the
digestion of the amplification product with two
restriccin enzymes (taq Iand hae III) has
indentified with accuracy the genotye of cattle
at a specific locus and allows an early
identification of the genetic defect know as
BLAD in infected and carrier animals.
ARTICULO N 5
INTRODUCCION
Las enfermedades genticas, causadas por la
transmisin vertical de los genes defectuosos a
la descendencia, pueden conducir a las
significativas prdidas en el rendimiento
agrcola durante animales agricultura. Los
avances tecnolgicos que se han producido en
los campos de la gentica molecular y
bioinformtica durante las ltimas dcadas han
permitido a la identificacin en el ganado
lechero de los genes responsables para un
nmero de enfermedades genticas
importantes con un origen monognica. En la
mayora de los casos, el alelo defectuoso lleva
una mutacin que resulta en la sntesis de una
variante de la protena no funcional, lo que
conduce a desarrollo o trastornos metablicos.
Cuando este alelo es, heterocigoto (portador)
los animales recesivos tienen un fenotipo
normal, pero puede pasar el defecto gentico a
su descendencia; individuos portadores dentro
de las especies bovina animales de granja, por
lo tanto, implica la transmisin silenciosa de
defectos genticos y, por tanto, un aumento en
las posibilidades de aparicin de defectos
genticos entre los becerros, con sus
implicaciones econmicas asociadas. Desde el
punto de vista de los agricultores y criadores,
los trastornos genticos constituyen una
amenaza insidiosa cuyas consecuencias a
menudo se hacen evidentes slo despus de
varias generaciones de cruce, cuando a corto
plazo, las soluciones de bajo costo ya no son
posibles.
Los cambios o alteraciones subyacentes de
muchas enfermedades hereditarias son
actualmente conocidos, por lo que es posible
no slo para entender su desarrollo sino
tambin diagnosticar su presencia antes de la
aparicin de sntomas reales. Nuevos
enfoques metodolgicos y molecular que se
han utilizado en animales por la ciencia por un
nmero de aos han dotado a los genetistas
con las herramientas necesarias para la
erradicacin de trastornos genticos
especficos de poblaciones de animales
ayudado por el uso de mtodos de diagnstico
basados en gentica molecular con el fin de
realizar cruces dirigidos para la obtencin de
los terneros libres de la enfermedad. El
presente trabajo pretende revisar algunos
aspectos tericos relativos a las enfermedades
genticas ms relevantes de ganado vacuno,
que estn ganando una mayor importancia en
la situacin actual de una cada vez mayor
demanda de alimentos entre la poblacin
humana, unida a una mayor necesidad de
sostenible y fiable fuentes de alimentacin.
ARTICULO N1
El BLAD es una enfermedad hereditaria letal
(EHL) que produce infecciones bacterianas
recurrentes con muerte prematura en terneros
de 2 a 8 meses de edad, siendo un problema
en el campo por las infecciones inespecficas
que presentan los terneros. La etologa es la
deficiencia en la Adhesin leucocitaria bovina
de tipo I. Es una mutacin autosmica recesiva
que fue descrita por primera vez por Shuster y
col. (1992) quien demostr que la enfermedad
se deba a una mutacin sin sentido en el gen
CD18 que codifica una glicoprotena de
membrana del leucocito llamada beta-2
integrina. Esta familia de glicoprotenas son
molculas de adhesin leucocitaria que
permiten el pasaje de las clulas de defensa
del sistema vascular al sitio de infeccin. Las
clulas leucocitarias (neutrfilos) de los
terneros homocigotos para el gen CD18 SINTOMAS Y LESIONES
(padre y madre portadores heterocigoto) no
pueden realizar la migracin ni la fagocitosis.
Los sntomas de esta enfermedad no se
En la raza Hollando la enfermedad es
manifiestan hasta el sptimo da despus del
producida por la sustitucin de un aminocido
nacimiento. Hasta entonces, los terneros
por otro en la posicin 128 de la protena. Esta
pueden parecer totalmente sanos, pero tras la
sustitucin se produce por la mutacin
primera semana de vida, comienzan los
adenina(A) a Guanina (G) en el exn 4
siguientes sntomas y lesiones.
producindose un cambio al aminocido acido
asprtico por glicina en dicha protena que - Anorexia, caquexia y retrasos en el crecimiento
detallaremos ms adelante. Keherli y col - Infecciones bacterianas continuas y fiebre

(1992) desarrollaron un diagnstico molecular elevada.

- Dermatitis, ulceras de decbito y alopecias.
utilizando la tcnica de PCR-RFLP - Neutrofilia progresiva y muy temprana en el
(Polymerase Chain Reaction- Restriction curso de la enfermedad
Fragment Length Polymorphism) para - Neumona crnica.
- Diarrea crnica.
identificar el alelo mutado del alelo normal - Muerte alrededor de las siete semanas,
permitiendo detectar as animales portadores aunque en algunos casos pueden sobrevivir
de BLAD. (4) durante meses.

El gen CD18, est localizado en el cromosoma Tras la muerte, en la necropsia a nivel

1, en la regin q12-q14. Se han descrito 2 macroscpico se puede observar lo siguiente:
mutaciones puntuales del gen CD18. Una
- Adenitis y necrosis de ganglios linfticos en la
silenciosa en la base 88, de citosina a timina,
correspondiente al aminocido 259 leucina, mayora de las vsceras, particularmente en el

que permanece inalterado. La otra mutacin es mesenterio.

- Pielonefritis granulomatosa
una sustitucin de adenina por guanina en el - Serositis en rumen.
nucletido 488 del cDNA, que lleva a la - Mucosa necrosada en leon, con hiperplasia de

sustitucin de aspartato por glicina en la folculos linfoides.

- Edema en las reas paracorticales del
posicin 128. As respecto a la mutacin en la
encfalo. ARTICULO N 2
posicin 128, son posibles tres genotipos y dos
fenotipos: D128/D128 (normal) D128G/D128G MATERIALES Y METODOS
(enfermo, homocigoto) y D128/D128G
A) Obtencin de muestras
(portador heterocigoto), ya que el alelo normal
es dominante sobre el mutante que slo causa Se utilizaron muestras de sangre de 37 toros
la enfermedad en estado homocigoto. de la raza Frisn Negro Chileno y de 3 vacas
ARTICULO N 3. Anexo 1 de la misma raza, cuyos pedigres permitan
sospechar la presencia de ejemplares
portadores de esta enfermedad, en atencin
 que eran descendientes de toros introduce en el producto de amplificacin, un
pertenecientes a centros de inseminacin, que nuevo sitio de restriccin para la enzima Taq I,
posteriormente se identificaron en los con lo cual se obtiene un producto de
correspondientes catlogos como portadores amplificacin de 101 pb de dicho gen. La
de BLAD. Adems se utilizaron 19 muestras de reaccin estndar de PCR para un volumen
sangre de toros seleccionados para ser final de 30 L-1 contiene: 1x de tampn de PCR
evaluados para la inseminacin artificial, (500 mM KCl, 100 mM tris- HCl pH 8,3 y 25
representativos de algunos de algunos mM MgCl2), 100 M de cada dNTP, 0,75u de
criaderos ubicados en la IX y X regin. La Taq ADN polimerasa, 0,2 M de cada partidor,
obtencin de las muestras de sangre se realiz 30 ng de ADN y H 20 desionizada estril hasta
de acuerdo a mtodos convencionales de completar el volumen. Las muestras se
extraccin (5 a 10 mL por animal), usando amplificaron en un termociclador Perkin- Elmer
-1
como anticoagulante 1,5 mg mL EDTA- 9700. Se inicia la reaccin con la
potsico. ARTICULO N 5 desnaturalizacin a 94C/5min, seguida de 10
ciclos, donde cada ciclo consta de la
B) Extraccin de ADN
El aislamiento y purificacin de ADN a partir de desnaturalizacin a 94C durante 30 seg, la

sangre total el cual rinde ADN en cantidad y fase de hibridacin a 60C (56C) durante 60

calidad suficiente para la reaccin de seg y la fase de extensin a 72C durante 30

polimerasa en cadena (PCR). Este fue el seg, seguidos de 27 (25) ciclos a 90C/30seg,

procedimiento de extraccin utilizando 60C (56C)/60 seg, 72C/30 seg, para

inicialmente y aplicado a las tres vacas. En los finalizar con una extensin de 72C/5 min.

toros se utiliz un mtodo alternativo de ARTICULO N 5

extraccin de ADN a partir de sangre total, el D) Digestin del producto amplificado

cual no requiere de extensivas etapas de Para diferenciar las variantes allicas se

purificacin en el cual se aprovecha la utilizaron dos endonucleasas de restriccin.

capacidad quelante que tiene la resina Para ello se tomaron del producto de

chelex-100 para extraer ADN desde clulas amplificacin 10L que fueron trasferidos a dos

sanguneas. ARTICULO N 5 tubos sometindolos a reaccin, adicionando

en un tubo 5U de Hae III y en el otro 5U de Taq
C) Amplificacin de ADN in vitro
En base a la secuencia del ADNc del gen C18 I y 10% del volumen final de reaccin del

del bovino (M81233, numero de acceso de la tampn 10X React 2 de Gibco BRL (10mM

base de datos de genBank) se sintetizaron Tris- HCl pH 7,5; 10 mM MgCl 2; 50 mM NaCl; 1

(centro de sntesis de oligonucletidos o mM DTT) a cada uno de ellos. Se continu con

partidores) (5- la incubacin de 1h a 37C para Hae III y a

GTCAGGCAGTTGCGTTCAA-3) Y (5- 65C para Taq I. La reaccin se detuvo

GAGGTCATCCACCATcGAGT-3). Este ltimo agregando 1L de tampn de carga (0.25%

presenta un cambio en una base, por lo cual azul de bromofenol 0,25% de xilen cyanol, 30%
de glicerol) y tampn TAE 6X. la identificacin
del genotipo para cada muestra se realiz por
visualizacin de las bandas
de ADN producidas despus de la digestin del
producto amplificado y la separacin de ellas,
mediante electroforesis en geles de agarosa al
4% en tampn TAE 1X con un voltaje de 2,5 V
cm-1 durante 2h. Finalmente los geles se
tieron con bromuro de etidio 0,5 g mL-1 y se
fotografiaron en un trasnsimulador de UV.
ARTICULO N 5.
Anexo 3
RESULTADOS Y DISCUSION
La identificacin del alelo mutado versus el
alelo normal para el locus CD18, responsable
de la enfermedad gentica conocida como
BLAD, se realiz mediante la amplificacin
PCR de un fragmento de 101pb del gen CD18
y posterior digestin del fragmento amplificado
por las enzimas de restriccin Taq I y Hae III
El anlisis de los datos aportados por los 37
toros permite sealar que la frecuencia
genotpica de los toros portadores de la
enfermedad, en los criaderos de la IX y X
regin, es del 1, 79%, y la frecuencia gnica o
allica del alelo mutado un 0,89%. La
frecuencia genotpica de los portadores es
inferior al 14,1% por Shuster et al (1992) para
EE.UU. La diferencia puede deberse a que la
frecuencia allica observada en el sur de chile
involucra solo una pequea parte de los
reproductores machos usados en chile,
aquellos provenientes de criaderos inscritos en
los registros genealgicos, y no a la masa total
de reproductores usados en ambas regiones,
ya que no puede descartarse absolutamente
que se haya podido producir una mutacin del
gen CD18 en alguno de los reproductores
nacionales usados en algn momento.
Actualmente es posible encontrar en catlogos
de inseminacin de semen de toros portadores
de BLAD, los cuales estn relacionados con
un ancestro comn, el toro Osborndale
Ivanhoe, nacido en 1952. En chile se prohibi
el ingreso de semen de toros portadores, no
obstante es importante tipificar para el gen del
BLAD aquellos reproductores de origen
nacional, con el fin que la frecuencia gnica
disminuya en la poblacin bovina. ARTICULO
N5.
CONCLUSION
Como Mdico Veterinario Zootecnista es
importante saber que esta enfermedad es una
transmisin de genes en una poblacin
determinada y que generalmente puede llegar
a tener consanguinidad, la mutacin del gen
CD18 puede llegar a afectar en grandes
prdidas econmicas, por lo que es
conveniente evitar la aparicin de este gen en
las poblaciones de ganado, esta enfermedad
puede ser identificada con marcadores
genticos por lo que la gentica en la mejora
del ganado y erradicacin de enfermedades
como BLAD es de gran importancia para el
trabajo que llevamos a cabo.
BIBLIOGRAFIA
1. MOLECULAR DIAGNOSIS AND CONTROL
STRATEGIES FOR THA RELEVANT HENTIC
 DISEASES O CATTLE/ Septiembre-2008/
Publicado 2009.
2. DEFICIENCIA DE ADHESIN LEUCOCITARIA
BOVINA ( BLAD)
Trabajo presentado por Manuel felez en la
asignatura de biotecnologa aplicada a la
patologa.
3. OBTENCION DE DNA PARA EL ESTUDIO DE
BLAD EN TOROS DE ARGENTINA Y
ESPAA/ Publicado 5 de Octubre del 2000.
4. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE
ENFERMEDADES HEREDITARIAS BOVINAS
EN EL URUGUAY/ Publicado 13 de Agosto del
2012.
ANEXO
ANEXO 1
Imagen referencial del artculo (2)
5. DETECCION DE UN DEFECTO GENETICO
EN BOVINOS MEDIANTE UNA PRUEBA DE
ADN/ Publicado en Enero del 2001.
6. PCR SCREEINIG AND ALLELE FREQUENCY
ESTIMATION OF BOVINE LEUKOCYTE
ADHESION DEFICIENCY IN HOLSTEIN AND
GIR CATTLE IN BRAZIL/ Publicado el 23 de
Abril 2000.
7. ENFERMEDADES DE BOVINOS BLAD/
Genetica- Facultad de Veterinaria-UdeLAr-
Uruguay.
8. Biotecnologia Aplicada/ Version en lnea/
Biotech Apl v.26 n.3 La Habana/ Julio-
Septiembre. 2009.
9. Enfermedades Hereditarias de Rumiantes/Blog
de la Dra. PhD Silvia Llambi Dellacasa
ANEXO 2
Imagen referencial del artculo (2)
Lugares de restriccin de las enzimas Hae III
y Taq I en los alelos D128 y D128G del gen
CD18.
 Imagen referencial del artculo (3)

ANEXO 3

Electroforesis en gel de agarosa y controles

homocigoto y heterocigoto para BLAD. M es
un marcador comercial de DNA de longitud
Conocida.