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Biologia Molecolare Clinica

Trattamento dei campioni biologici


per
l’analisi degli acidi nucleici

Renata Paleari
Università degli Studi di Milano

Fase pre-analitica
La rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo,
trasporto, trattamento e conservazione del campione è condi-
zione preliminare ed essenziale per garantire l’attendibilità
dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare.

Percorso pre-analitico del campione


- prelievo
- conservazione (temperatura, tempo)
- trasporto
- trattamento del campione (estrazione acidi nucleici)
- conservazione acidi nucleici

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Errore pre-analitico
• Errore introdotto:
- contaminazione crociata (falsi positivi)
- frammentazione DNA per errata manipolazione

• Errore non eliminato:


- inibitori della reazione di amplificazione

Prevenzione contaminazione (1/2)


• Suddivisione fisica aree di lavoro
1. Area di preparazione del campione
(isolamento cellule, estrazione a. nucleici)
2. Area di preparazione della reazione della PCR
(preparazione soluzioni, aliquote, mix reazione)
3. Area di amplificazione e analisi degli amplificati
(PCR, EF, tecniche ibridazione, sequenziamento)

• Comportamenti operatore
- muoversi secondo il flusso area1--->area2--->area3
- mai entrare nell’area 1 o 2 con prodotti amplificati
- lavorare con i guanti (che vanno cambiati quando si cambia area)
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Prevenzione contaminazione (2/2)
• Organizzazione del lavoro
- distribuzione materiale in funzione del tipo di
lavoro (pipette, puntali, accessori differenti per ogni area)
- strumentazione dedicata per ogni area
- vetreria sterilizzata, materiale usa e getta
- puntali con filtro (contaminazione canale pipette con aerosol
contenenti a. nucleici)
- soluzioni suddivise in piccole aliquote
- pulizia superfici lavoro e apparecchiature con
soluzioni decontaminanti (ipoclorito 2%)

Frammentazione del DNA


• Danneggiamento a causa sollecitazioni meccaniche
- maneggiare con delicatezza
- no vortex a velocità elevata
- no pipettamento eccessivo e vigoroso

• Digestione da parte di nucleasi cellulari


- lavorare con i guanti
- soluzioni e materiali sterili
- soluzioni contenenti EDTA

• Azione metalli pesanti (rottura legami fosfodiesterici)


- soluzioni contenenti EDTA

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Inibitori della reazione della PCR
In quasi tutti i campioni biologi sono presenti sostanze con
azione inibitoria sulla PCR che devono essere eliminate nella
fase di preparazione del campione.

• Hb e suoi prodotti di degradazione


• Metalli pesanti (Fe++)
• Proteine
• Lactoferrina
• Complessi polisaccaridici
• Eparina

TIPO DI CAMPIONE
• Sangue (leucociti)
• Tessuti (biopsie, in paraffina, villi coriali)
• Liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL)
• Liquidi biologici: - urina
- liquor
- saliva
- liquido amniotico
- liquidi cavitari
• Bulbo di capello
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Fase di preparazione del campione
• Scopo: ottenere materiale in condizioni ottimali per
indagini di tipo molecolare

• Requisiti:
- Non danneggiare: non introdurre errori
- Rilasciare ac. nucleici
- Concentrare: ottenere una quantità adeguata di a. nucleici
- Eliminare inibitori PCR
- Stabilizzare: tempo, temperatura, luce deteriorano
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Separazione dei leucociti da sangue


(buffy coat)
- Sangue in EDTA (5 mL)
- Centrifugazione (1000 g, 10 min, temp ambiente)
- Prelievo buffy coat
- Lisi RBC (1 mL ammonio cloruro, K bicarbonato, EDTA, pH 7.4)
- Centrifugazione, scartare il surnatante
- Lavaggi con PBS
- Pellet di leucociti
- Conservare a -20 °C

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Separazione dei linfociti da sangue
Centrifugazione in gradiente di densità di FICOLL
- Diluizione sangue (1:2 con PBS)
- Stratificazione sangue su FICOLL (d=1.077 g/mL)

- Centrifugazione
(1000 g, 30-40 min, 20°C)
- 4 strati: - plasma
- anello di linfociti
- FICOLL
- RBC sul fondo
- Raccolta linfociti
- Lavaggi, conservare a –20°C
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Preparazione altri tipi di campione


•Urina, liquidi cavitari:
- centrifugazione (separazione componente cellulare e
frazione liquida)
•Liquor:
- concentrazione (molecole PM>100 dalton)

•Campioni delle vie respiratorie (BAL, espettorato):


- fluidificazione con enzimi mucolitici
- concentrazione delle cellule (centrifugazione)

•Campioni da biopsie:
- disgregazione tessuto (bisturi, omogenizzatore)
- eventuale lisi RBC presenti
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Conservazione campioni
• Per estrazione DNA
- Sangue: +4°C (24-48 ore)
“ -20°C (anni)
- Leucociti: -20°C
- Pellet: -20°C
- Liquor : +4°C
trattato: -20°C
- Tessuti: N2 liquido

• Per estrazione RNA


- Tutti i campioni a -80°C
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Estrazione del DNA


• Scelta del metodo
- tipo di campione
- grado di purificazione richiesto
- tecnica impiegata per l’identificazione
- tempo richiesto
- numero di campioni da processare

• Metodo ideale
- elevata purezza
- elevato recupero
- sicuro: no reagenti pericolosi
- economico
- rapida esecuzione
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Estrazione del DNA: fasi

1. Lisi cellulare ed inativazione delle nucleasi


2. Purificazione del DNA
3. Precipitazione DNA
4. Valutazione del DNA estratto
5. Conservazione

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1. Lisi cellulare
Lo scopo di questa fase è di liberare il DNA dai nuclei e
dalle proteine istoniche ed inoltre di inattivare le proteasi

- Disgregazione meccanica:
- lisi ipotonica
- omogenizzazione
- Trattamento con soluzioni di lisi contenenti:
- detergenti: solubilizzazione membrane cellulari
(SDS, Sarcosyl, Nonidet P40)

- agenti caotropici: denaturazione delle proteine


(urea, ioduro di sodio, guanidina tiocianato)

- proteinasi K: digestione enzimatica delle proteine


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2. Purificazione DNA
Lo scopo di questa fase è la separazione del DNA dalle componenti
cellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e sostanze interferenti

- Utilizzo di solventi organici


Fenolo (denatura le proteine)
Cloroformio (solubilizza i lipidi)
Isobutanolo
- Metodo del salting out
- Metodi cromatografici
A scambio anionico (matrice carica positivamente)
Per adsorbimento (matrice di silice)
Gel filtrazione
Per affinità
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3. Precipitazione DNA
Lo scopo di questa fase è di concentrare, desalificare e recuperare
il DNA in forma solida permettendone il successivo ridiscioglimento
nella soluzione desiderata

- Trattamento con alcooli


- etanolo: in presenza di alte concentrazioni di sali
monovalenti (sodio acetato, ammonio acetato)
- isopropanolo: non richiede alte concentrazioni saline
ma è meno facilmente eliminabile
dell’etanolo

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Purificazione DNA con fenolo-cloroformio
Metodo di estrazione classico basato sulla diversa solubilità delle
molecole in soluzione (DNA/contaminanti) tra due fasi non miscibili

- Lisi campione
- 1-10 milioni cellule (si ottengono da 1.0 mL sangue)
- Tampone contenente SDS, EDTA, proteinasi K (500 μL)
- Overnight 55°C
- Estrazione DNA
- Trattamento 1:1 con fenolo-cloroformio alcool isoamilico pH 8.0
( a pH 7.5-8.0 il DNA è nella fase acquosa; a pH 5.0-6.0 il DNA è nella fase organica)
- Centrifugazione
- 3 fasi: - fase acquosa contenente DNA
- interfaccia contenente proteine denaturate
- fase organica contenente i lipidi
- Prelevare la fase acquosa superiore
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- Precipitazione DNA
- Aggiunta etanolo assoluto (1 mL) e tampone ad alta forza ionica (50 μL)
(Na acetato 3 M pH 5.2)
- Precipitazione DNA (formazione gomitolo)
- Centrifugazione a velocità alta (12.000 rpm)
- Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 mL) per rimuovere sali in eccesso
- Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno
15 min a provetta aperta
- Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20°C.

- Risospensione DNA precipitato


- Il DNA viene risospeso in H2O o nel tampone previsto
dalla metodica.
- Può essere conservato a +4°C per qualche settimana o a
- 80°C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti
che danneggiano il DNA)

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Metodo del salting out
Il metodo è basato sull’utilizzo di elevate concentrazioni di sali.
Procedura rapida, sicura e poco costosa.

- Lisi campione:
- con tampone contenente detergenti, proteinasi K

- Trattamento con soluzione di NaCl 6 mol/L:


- diminuzione della solubilità delle proteine che precipitano
- il DNA è contenuto nel surnatante

- Precipitazione DNA:
- con etanolo

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Purificazione DNA su gel di silice


Il metodo è basato sulla proprietà degli a. nucleici di adsorbirsi
alla silice, a differenza delle proteine e di altri composti organici

- Lisi campione:
- con tampone contenente detergenti, proteinasi K, sali coatropici
56°C per 10 min.
- Adsorbimento DNA al gel di silice contenuto in una colonnina
- in presenza di etanolo e sali cautropici il DNA si lega alla silice

- lavaggi con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere


le proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare
il DNA legato alla silice

- Eluizione DNA: con H2O o soluzioni a bassa concentrazione salina

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Campione

Lavaggio
Tampone
di lisi

centrifugazione

Legame DNA
alla silice Eluizione
DNA

centrifugazione

centrifugazione

Eliminazione
contaminanti DNA

Nota: il DNA ottenuto è molto puro ma la resa è inferiore rispetto al


metodo classico con solventi

4.1 Valutazione qualitativa DNA estratto


Elettroforesi su gel di agarosio
a bassa concentrazione

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4.2 Valutazione quantitativa DNA estratto

• Concentrazione DNA
- Diluizione in tampone alcalino
- Assorbanza 260 nm dsDNA: 1.0 A = 50 μg/mL
ssDNA: 1.0 A = 33 μg/mL
- DNA, μg/mL= A260 x f.dil x 50 RNA: 1.0 A = 40 μg/mL
oligo: 1.0 A = 33 μg/mL

• Purezza (contaminazione da proteine)


- Rapporto A260/A280
- Purezza ottimale, A260/A280 1.7 - 1.9

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La resa del DNA genomico proveniente da campioni di sangue


intero dipende dal volume del campione e dal numero di globuli
bianchi. Partendo da buffy coat la resa è circa 5 volte superiore.

1.0 mL sangue intero (5-10 milioni leucociti)

Una cellula eucariota contiene:


6 pg DNA, 10-30 pg RNA
25 - 50 μg di DNA

• PCR: 0.1 - 2 μg DNA

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5. Conservazione del DNA
Il Dna estratto e purificato è in genere risospeso in H2O distillata
sterile ultrapura o in soluzioni a bassa concentrazione salina
a pH 7.4.

+4°C: stabile per alcune settimane


-20°C: stabile più a lungo
(evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento
che possono danneggiare il DNA)

-80°C: stabile per molti anni

• RNA sempre a -80°C

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Manipolazione RNA: precauzioni (1/2)

• Molecola instabile
- presenza ossidrile libero in posizione 2’ sul ribosio
- idrolisi in soluzione acquosa alcalina

• Particolarmente suscettibile azione RNasi

• RNasi estremamente attive


- non necessitano di alcun cofattore
- molto resistenti alle alte temerature (autoclavaggio)
- presenti ovunque (operatore, ambiente lavoro, soluzioni)

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Manipolazione RNA: precauzioni (2/2)
• Inattivazione RNasi endogene
(utilizzo inibitori, denaturanti)
- Sali di vanadio complessati con ribonucleosidi: inibitore
- Rnasina: inibitore specifico
- Guanidina isotiocianato: agente denaturante

• Prevenzione contaminazione RNasi esogene


(ambiente Rnasi-free)
- Aree lavoro separate con materiali, soluzioni, pipette dedicate
- Materiale plastico monouso RNasi-free
- Vetreria: - temperatura > 180°C
- trattamento con dietil-pirocarbonato (DEPC) 0.1%
- autoclavaggio
- prodotti commerciali per decontaminazione
- Soluzioni: - DEPC 1 mL/L e autoclavaggio
- Soluzioni e Kit pronto uso
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Estrazione e purificazione RNA


L’RNA deve essere estratto il più rapidamente possibile subito
dopo la raccolta del campione
• Lisi cellulare
- In presenza di guanidina isotiocianato (agente caotropico)
e β-mercaptoetanolo (agente riducente)
• Purificazione
- Trattamento con fenolo-cloroformio pH 5-6
- 3 fasi:- fase acquosa contenente RNA
- interfaccia contenente proteine denaturate
- fase organica contenente DNA e lipidi
• Precipitazione
- Con isopropanolo, lavaggi con etanolo 75%
• Risospensione
- Con H2O o tampone a bassa forza ionica, conservare
a -80°C 30