Germinacin in vitro de Semillas y

Desarrollo de Plntulas de Orqudeas

Silvestres de Tabasco

Alberto Mayo Mosqueda

Jaime G. Czares Camero
Efran de la Cruz Lzaro
Alejandro Flores Hernndez
 Germinacin in vitro de Semillas y
Desarrollo de Plntulas de Orqudeas
Silvestres de Tabasco
 Candita Victoria Gil Jimnez
Rectora

Alma Catalina Berumen Alatorre

Directora de la Divisin Acadmica de Ciencias Agropecuarias
 Germinacin in vitro de Semillas y
Desarrollo de Plntulas de Orqudeas
Silvestres de Tabasco

Alberto Mayo Mosqueda

Jaime G. Czares Camero
Efran de la Cruz Lzaro
Alejandro Flores Hernndez

Universidad Jurez Autnoma de Tabasco

Divisin Acadmica de Ciencias Agropecuarias
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo de Plntulas de Orqu-
deas Silvestres de Tabasco / Alberto Mayo Mosqueda[et al.] Villa-
hermosa, Tabasco: Universidad Jurez Autnoma de Tabasco, 2010.

32 p.: IL. -- (Coleccin Jos N. Rovirosa, Biodiversidad,

Desarrollo Sustentable y Trpico Hmedo)

Incluye Referencias Bibliogrficas e ndice.

ISBN: 978-607-7557-30-2

1. Semillas Desarrollo \ 2. Germinacin.

I. Mayo Mosqueda, Alberto, Ed. II. Ttulo. III. Serie.

L.C. QK740 G47 2010

Primera edicin, 2010

Universidad Jurez Autnoma de Tabasco

Av. Universidad s/n
Zona de la Cultura, Col. Magisterial
Villahermosa, Centro. Tab. C.P. 86040

Queda prohibida la reproduccin parcial o total del contenido

de la presente obra, sin contar previamente con la autorizacin
expresa y por escrito del titular, en trminos de la Ley Federal
de Derechos de Autor.

ISBN: 978-607-7557-30-2

Impreso y hecho en Villahermosa, Tabasco. Mxico

 ndice

Agradecimientos 7

Introduccin 9

I.Cultivo in vitro de orqudeas 11
Biologa de la germinacin de semillas de orqudeas 11
Propagacin de orqudeas a partir de semillas 12

II. Medios de cultivo 13

III. Siembra de semillas 15

Colecta y almacenamiento de las semillas 15
Consideraciones sobre la siembra de cpsulas verdes 17
y cpsulas abiertas
Mtodo de siembra de cpsulas verdes 17
Mtodo de siembra a partir de cpsulas abiertas 19

IV. Induccin de germinacin in vitro 21

Crecimiento y emisin de races 21

V. Transplante a condiciones ex vitro 21

Bibliografa 27

ndice de Cuadros y Figuras 31

 Agradecimientos

Agradecemos a las personas que amable y desinteresadamente

permitieron el acceso a sus terrenos para realizar las colectas de
semillas y plantas de orqudeas. De igual forma a todos los estu-
diantes que participaron en los recorridos de campo, como en la
realizacin de experimentos en el laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales de la Divisin Acadmica de Ciencias Agropecuarias de
la UJAT.
Al fondo sectorial SAGARPA-CONACYT por su finan-
ciamiento para el desarrollo del proyecto Conservacin y propa-
gacin de orqudeas de Tabasco (clave C01 propuesta 12133), as
como tambin del financiamiento para la impresin del presente
documento.

7
 Introduccin

Las orqudeas son plantas que pertenecen a la familia Orchida-

ceae, con aproximadamente 700 a 800 gneros y 25,000 a 35,000
especies (Arditti, 1979). Taxonmicamente representan una de
las familias ms evolucionadas entre las monocotiledoneas, en su
mayora presentan flores atractivas y en algunos casos aunque no
presenten flores cautivadoras ni de gran tamao, tienen importan-
cia desde el punto de vista ecolgico. En general son consideradas
como flores exticas. Es por ello que la industria de flores de corte
y macetas se ha convertido en un mercado creciente, tanto para
mercados locales como de exportacin. Adicionalmente, el desa-
rrollo de nuevos hbridos y el cultivo comercial de orqudeas se ha
convertido en una industria lucrativa en Europa, Hawaii, Australia,
Tailandia, Japn, Singapur, Sri Lanka y Kenia (Luan, et al., 2006).
Esta familia aunque es muy numerosa, algunas especies se encuen-
tran amenazadas o en peligro de erradicacin, debido al saqueo
indiscriminado, destruccin de espacios, contaminacin ambiental
y deforestacin, aunado a los problemas de lento crecimiento y
baja tasa de germinacin en condiciones naturales.
En Tabasco, existen algunas especies con potencial orna-
mental; sin embargo, hay que disear estrategias de reproduccin
debido a que por mtodos convencionales es un proceso lento. La
propagacin vegetativa a partir de rizomas, separacin de brotes
generados del tallo o seudobulbos, es muy lenta, adems de obte-
nerse pocos brotes despus de dos a tres aos de iniciado el proce-
so.
Las orqudeas nativas merecen atencin para su conserva-
cin, dado que se encuentran en peligro debido a la accin extrac-
tiva de pobladores locales. La conservacin ex situ de los recursos
genticos vegetales se puede lograr mediante el almacenamiento in

9
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo

vitro. Esta tcnica ofrece la oportunidad de conservar germoplas-

ma selecto a corto y mediano plazo. El germoplasma conservado
debe ser regenerado a plantas y para ello se necesitan establecer
protocolos de micropropagacin antes de la conservacin.

10
 I. Cultivo in vitro de orqudeas
La propagacin y cultivo de las orqudeas fue revolucionado des-
pus del descubrimiento de Knudson (1922) en donde las semi-
llas pudieron ser germinadas en un medio simple con azcar. Este
trabajo demostr que la germinacin de semillas de orqudeas en
condiciones in vitro fue posible sin la asociacin con hongos. Pos-
teriormente, el mismo autor propuso una nueva solucin con la
adicin de nutrientes para la germinacin de semillas de orqu-
deas en 1946. A partir de este momento muchas orqudeas se han
regenerado y propagado a partir de segmentos de hoja (Murthy
Pyati, 2001), segmentos nodales de plntulas provenientes de se-
millas germinadas in vitro (Chen et al., 2002) nudos florales (Chen
et al., 2002), pices (Saiprasad y Polisetty, 2003), rizomas (Martin,
2003) y microsecciones apicales (Lakshmanan et al., 1995).

Biologa de la germinacin de semillas de orqudeas

Para que las semillas de orqudeas germinen en un medio natural,
se hace necesaria la simbiosis con hongos micorrzicos (Hadley,
1997). Las semillas de orqudeas son pequeas y contienen po-
cas o ninguna reserva para llevar a cabo su germinacin (Singh,
1981), adicionalmente presentan pequeas cantidades de lpidos
y protenas como material de reserva y no presentan endospermo
(Savina, 1974) y cotiledones (Arditti y Ernst, 1984). Es por ello,
que estratgicamente establecen una relacin simbitica con mi-
corrizas, en la que, despus de la infeccin se establece un flujo de
carbohidratos, minerales, vitaminas, hormonas y aminocidos que
contribuyen a la germinacin de semillas y desarrollo de las plan-
tas (Weber y Webster, 2001). Las plntulas de orqudeas epfitas
tambin pueden utilizar la simbiosis con hongos como una fuente
de resistencia a la desecacin, resultado de su pequeo tamao y
hbito arbreo (Yoder et al., 2000).

11
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo

Aunque las semillas contenidas en una cpsula de orqudea

pueden ser numerosas (2-3 millones), se considera que solo un
2-3% de semillas pueden germinar en condiciones naturales (Luan
et al., 2006).
Debido a las limitaciones anteriores, la germinacin y el
desarrollo en condiciones in vitro, se plantea como una alternativa
que puede ser ms eficiente en la regeneracin de plantas, ya que
se realiza en condiciones controladas y aspticas.

Propagacin de orqudeas a partir de semillas

Desde el punto de conservacin ex situ de los recursos genticos
vegetales, las semillas de orqudeas representan variabilidad gen-
tica, lo que las convierte en un material apropiado para ser inclui-
do en programas de conservacin.
La primera propagacin exitosa de orqudeas en condicio-
nes in vitro a partir de la germinacin de semillas fue lograda por
Knudson (1922) con especies de Cattleya y ms recientemente
Lo et al. (2004) con Dendrobium tosaense y Damon et al. (2004) con
Cattleya aurantiaca, Encyclia chacoensis y Brassavola nodosa.
La germinacin in vitro de semillas de orqudeas puede ser
efectuada por dos vas:
a) Co-cultivo de las semillas con diversos hongos mico-
rrzicos para establecer una relacin simbitica. Para ello
es necesario el aislamiento y cultivo del hongo en un me-
dio de cultivo especfico.

b) Inoculacin de las semillas en un medio de cultivo,

que en ausencia de hongos simbiticos, proporciona los
nutrientes requeridos para el desarrollo de la semilla.

12
 II. Medios de cultivo

Para la germinacin de semillas de orqudeas se reportan en la

literatura algunos medios de uso generalizado como Knudson
C (Knudson, 1946), MS (Murashigue y Skoog, 1962), Hutner
(1953), Dalla Rosa y Laneri (Dalla Rosa y Laneri, 1977), VW (Va-
cin y Went, 1949) y Lindemann (1970). Sin embargo, los requeri-
mientos pueden ser muy diversos, incluso en especies del mismo
gnero. En el Cuadro 1 se muestra el contenido de elementos de
cada medio de cultivo.
En resultados obtenidos con especies del estado de Tabas-
co (Catasetum integerrimun Hook, Encyclia alata, Encyclia cordigera,
Epidendrum flexuosum, Epidendrum chlocorymbos, Epidendrum stamfor-
dianum, Myrmecophila sp., Trichocentrum ascendens, Trichocentrum car-
thagenense, Oncidium sphacelatum, Prosthechea cochleata, Nidema boo-
thii, Trichocentrum lindenii), se han obtenido resultados aceptables
con promedios de germinacin de semillas de un 70 a 90% em-
pleando los medios VW, MS, y MS a la mitad de su concentracin,
todos ellos adicionados con 0.1% de carbn activado. Para la etapa
de desarrollo de las plntulas, se ha utilizado el medio Knudson C
(Mayo et al., 2008).

13
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo

Cuadro 1. Formulacin de medios de cultivo, empleados en el cultivo

in vitro de orqudeas

14
 III. Siembra de semillas

Colecta y almacenamiento de las semillas

Las semillas pueden ser colectadas a partir de cpsulas verdes o
cpsulas maduras. En una cpsula verde que est en proceso de
maduracin, debe estimarse la edad promedio para cosecharla (el
tiempo requerido para madurar es diferente para cada especie), de
lo contrario pudiera ser que se encuentre en un estadio inicial de
maduracin, lo que afectara negativamente el proceso de germi-
nacin. Algunos de los indicadores para determinar si una cpsula
presenta semillas maduras, son el cambio de coloracin (general-
mente inicia la presencia de tonalidades amarillas), la base de la
cpsula en el lugar del relicto floral se encuentra seco y cuando se
presiona no se deforma debido a que se encuentra llena de semillas
(Seaton y Ramsay, 2005).
En la Figura 1, se muestran cpsulas maduras de diferen-
tes especies, listas para germinar in vitro. Note la tonalidad parda
en los bordes de la cpsula y la cicatriz de la flor completamente
seca en la parte distal.

Figura 1. Cpsulas maduras. 1) Oncidium Sphacelatum,

2) O. luridum, 3) C. integerrimum.

15
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo

Una vez abierta la cpsula, se desprenden con facilidad

las semillas de las paredes con solo agitar al momento de la inocu-
lacin en el medio de cultivo. Las cpsulas pueden ser almacena-
das por algunas semanas si se envuelven en papel peridico y se
colocan en refrigeracin a 4C. Es importante no utilizar bolsas
plsticas para almacenar cpsulas o semillas ya que se presentar
condensacin y consecuentemente pudriciones.
En la medida de lo posible, es mejor colectar cpsulas que
han estado expuestas a un da seco. Cuando se dispone de suficien-
te material y no es posible sembrar la totalidad, se sugiere extraer
las semillas en un rea estril y deshidratarlas con slica gel en un
desecador por dos das. Posteriormente, se colectan las semillas en
tubos de vidrio con tapa hermtica (Figura 2) y se pueden almace-
nar en un refrigerador a 4C por varios meses, siempre y cuando
no se abra el contenedor.

Figura 2. Extraccin de semillas y deshidrata-

cin con slica gel. a) Deshidratacin por dos
das; b) Almacenamiento en contenedor de vi-
drio con tapa hermtica a 4 C.

16
 de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco

Consideraciones sobre la siembra de cpsulas verdes y cpsulas abier-

tas
Siembra a partir de cpsulas verdes. De forma general se
considera que el interior de una cpsula de orqudea conserva las
condiciones de asepsia si est intacta. Sin embargo, en la prctica
se sugiere que al momento de realizar la diseccin, se ponga aten-
cin en el color y textura del interior, en algunas ocasiones al abrir
la cpsula, las semillas pueden estar necrticas o contaminadas de-
bido a daos mecnicos que no son visibles a simple vista.
Se considera que al esterilizar la parte externa y abrirla en
condiciones aspticas, las semillas estn estriles listas para inocu-
larse en el medio de cultivo, por lo que ya no se requiere esterilizar
las semillas. Una consideracin a esta opcin es que las semillas
sembradas a partir de cpsulas que no han madurado lo suficiente
podran germinar lentamente o simplemente no germinar.

Siembra a partir de cpsulas abiertas. Las cpsulas abiertas,

contienen en su interior semillas secas, pero como han estado
expuestas al ambiente, este material presenta contaminacin por
hongos y bacterias. Para este material es necesario realizar este-
rilizacin, por lo que con frecuencia se tienen problemas con los
protocolos, dado que no existe alguno de forma general, sino que
hay que establecer para cada especie las condiciones especficas.
La eleccin de alguna de las opciones anteriores, estar en
funcin de la disponibilidad de material vegetal.

Mtodo de siembra para cpsulas verdes

El mtodo general para sembrar semillas a partir de cpsulas ver-
des es el siguiente:
1. Con un bistur o tijera, cortar cuidadosamente los
restos de la flor muerta de la cpsula.
2.Lavar la cpsula con una solucin de etanol al 70%
por un minuto.

17
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo

3.Esterilizar la cpsula por 5 minutos en una solucin

de hipoclorito de sodio al 2.5 %, adicionando una gota
de detergente Tween 20 por 100 ml.
4. Retirar de la solucin de cloro. En condiciones asp-
ticas, sumergir en alcohol al 70 % por 30 segundos, y a
continuacin flamear hasta que el alcohol se queme. Esta
operacin se puede realizar de una a tres veces depen-
diendo del tamao de la cpsula. En caso de realizar un
mayor nmero se corre el riesgo de daar las semillas.
5. Realizar uno o dos cortes en forma longitudinal y
abrir la cpsula con un bistur, cuidando de no introdu-
cirlo demasiado para no tocar el interior.
6. Tomar la mitad de la cpsula y con una esptula o bis-
tur golpearla para esparcir las semillas sobre el medio
de cultivo. Normalmente, cuando las semillas se en-
cuentran maduras se desprenden con facilidad (Figura
3). De no ser as, con un bistur se deben raspar, cuidan-
do de no incluir tejido de las paredes de la cpsula.

Figura 3. Siembra a partir de cpsulas verdes. a) Lavado en solucin

con jabn b) Inmersin en hipoclorito de sodio, c) Diseccin de la
cpsula y d) Esparcimiento de semillas sobre el medio de cultivo.

18
 de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco

Mtodo de siembra a partir de cpsulas abiertas

Se dispone de diferentes mtodos para la siembra a partir de se-
millas secas. Por destacar, existe el mtodo de la jeringuilla (ms
empleado), de la funda de papel, dentro de una pipeta o filtracin
a travs de un embudo. Cada tcnica vara de acuerdo a la especie,
tiempo de esterilizacin y la concentracin de los esterilizantes.
En el laboratorio de cultivo de tejidos de la Divisin Aca-
dmica de Ciencias Agropecuarias de la UJAT, se ha utilizado con
buenos resultados la tcnica de Dixon (1987). Consiste en la utili-
zacin de una solucin de 5 ml de hipoclorito de sodio al 6%, 5 ml
de etanol al 95% y 90 ml de agua destilada. Las semillas se colocan
en esta solucin por un minuto (agitando vigorosamente) y poste-
riormente se enjuagan 2 veces en agua destilada estril, dando un
minuto por cada enjuague. Despus del segundo lavado, se dejan
sedimentar ligeramente las semillas y con una pipeta estril se to-
man de 0.1 a 0.2 cc, depositando sobre el medio de cultivo con
esta tcnica una cantidad de 50 a 300 semillas por cada contenedor
de cultivo (Figura 4).

Figura 4. Esterilizacin de semillas secas.

19
 IV. Induccin de germinacin in vitro

Al disponer de semillas (independientemente del origen) se deben

cultivar a una temperatura de 27 C 2, con iluminacin difusa,
y se debe eliminar aquellos cultivos contaminados o que presenten
problemas de fenolizacin. En las especies de Tabasco que se hace
referencia anteriormente se observan las semillas germinando des-
pus de 2 a 3 meses de iniciado el cultivo.

Crecimiento y emisin de races

Una vez que se ha presentado la germinacin, se sugiere realizar
una transferencia de las plntulas a un medio de cultivo renovado.
En caso de no presentar problemas, puede ser en el mismo medio
que el primero; o bien, realizar un cambio a un medio Knudson C.
En esta etapa algunos autores recomiendan la utilizacin de sustan-
cias indefinidas como pulpa de banano (Lo et al., 2004) o agua de
coco (Arias et al., 2006).
Dependiendo del desarrollo del cultivo, se deben utilizar
contenedores de cultivo de acuerdo al tamao de las plntulas,
para permitir un adecuado desarrollo. De igual forma debe consi-
derarse la utilizacin de una mayor intensidad lumnica o luz natu-
ral, para permitir que se adapten con mayor facilidad a condiciones
naturales.

V. Transplante a condiciones ex vitro

Para esta etapa, deben separarse aquellas plantas con presencia de
crecimiento radicular, hojas y rizoma (Figura 5).
Las condiciones especiales durante el cultivo in vitro trae
como resultado modificaciones en la morfologa y fisiologa de las
plantas micropropagadas. Es por ello que deben seguirse algunos

21
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo

cuidados durante la transferencia a condiciones ex vitro, para asegu-

rar el mximo porcentaje de sobrevivencia.
Al extraer las plantas del contenedor de cultivo, debern
lavarse con agua corriente en forma abundante hasta eliminar los
restos del medio de cultivo, de igual forma deben eliminarse hojas
y races daadas o necrosadas. Tratar las plantas con una solucin
de fungicida con Mancozeb (Manzate) a una concentracin de
1gl l-1 durante 10 minutos, para tratar de evitar problemas causa-
dos por hongos durante el proceso.

Figura 5. Plntulas con presencia de hojas y races suficientes para iniciar el

proceso de aclimatizacin.

Respecto al sustrato a utilizar existe a nivel comercial

una amplia gama a utilizar, entre los que incluyen corteza de pino,
musgo, perlita, tezontle, poliestireno, carbn vegetal, arcilla, etc.
El sistema utilizado incluye la utilizacin de charolas pls-
ticas con perforaciones en el fondo (Figura 6). Como primer paso
se coloca en el fondo una capa de tepetzil grueso, material de ori-
gen volcnico, utilizado para construccin de casas, pero que por
su peso liviano y poca retencin de agua, se utiliza para permitir un
mayor drenaje (Figura 7). Se requiere lavar abundantemente, para
no llevar partculas de polvo, que ms tarde pueden retener agua.

22
 de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco

Figura 6. Charola plstica con perforaciones.

Figura 7. Tepetzil. Despus de cribarlo se separa por tamaos. 1)

menor de 0.5 cm; 2) de 0.5 a 1 y 3) mayor de 1 cm.

Despus de la primer capa, se coloca la mezcla de sus-

trato, que puede ser alguna de las siguientes: corteza de macuilis
(Tabebuia rosea) con peat moss 2:1 (v/v), tepetzil grado 1 o fibra de
coco.

23
 Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo

Posteriormente de sembrar las plntulas deben cubrirse

con un domo plstico (Figura 8) para evitar la desecacin y colo-
carlas bajo sombra al 50 % con un nivel de luz promedio de 100
a 200 mol m-2 s-1. Cuando estas condiciones no sean posibles,
se debe escoger una temporada donde la temperatura no sea muy
elevada (no ms de 30 C) y con media sombra.

Figura 8. Cobertura de charolas con domos pls-

ticos para evitar la desecacin.

Despus de dos semanas de iniciar el proceso, se remueve

el domo parcialmente y a la siguiente se retira completamente (Fi-
gura 9). El riego debe realizarse en forma de spray con intervalos
de 2 a tres das, dependiendo de las condiciones. Despus de un
mes las plntulas pueden ser fertilizadas semanalmente con 150
ppm de fertilizante NPK (Peters 20- 20- 20, Scotts Company,
Marysville, OH) . De esta forma pueden crecer las plantas hasta
obtener la talla adecuada para ser transferidas a maceta, lo cual est
en funcin de la velocidad de crecimiento de la especie.

24
de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco

Figura 9. Plntulas establecidas sobre diferentes sustratos.

(a) Tepetzil; (b) Fibra de coco.

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30
 ndice de Cuadros y Figuras

Cuadro 1. Formulacin de medios de cultivo, 14

empleados en el cultivo in vitro de orqudeas

Figura 1. Cpsulas maduras 15

Figura 2. Extraccin de semillas y deshidratacin 16

en slica gel

Figura 3. Siembra a partir de cpsulas verdes 18

Figura 4. Esterilizacin de semillas secas 19

Figura 5. Plntulas con presencia de hojas y races suficien- 22

tes para iniciar el proceso de aclimatizacin

Figura 6. Charola plstica con perforaciones 23

Figura 7. Tepetzil despus de cribarlo se separa por tama- 23

os

Figura 8. Cobertura de charolas con domos plsticos para 24

evitar la desecacin

Figura 9. Plntulas establecidas sobre diferentes sustratos 25

31
Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo de
Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco se ter-
min de imprimir en Grficos Cnovas, Juan
lvarez, 505, Centro, el 25 de febrero de 2010,
con un tiraje de 400 ejemplares. En la ciudad
de Villahermosa, Tabasco, Mxico. El cuidado
de la edicin estuvo a cargo de los autores y el
Fondo Editorial Universitario.
Universidad Jurez Autnoma de Tabasco

978- 607- 7557- 30- 2