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UNIVERSIT DEGLI STUDI DI MILANO-BICOCCA

Scuola di Scienze
Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Industriali

Metodologie computazionali
per lo studio
di consorzi microbici

Relatore:
Chiar.mo Prof. Luca DE GIOIA

Tesi di Laurea di:


Giulio BONZI

Anno Accademico 2015-2016


Indice
Riassunto .............................................................................................................................................. 1

Abstract ................................................................................................................................................ 2

Introduzione ........................................................................................................................................ 3

1 Perch studiare i consorzi microbici?....................................................................................... 3

2 Comportamenti sociali nei microrganismi? ............................................................................. 4

3 Terminologia e teoria dellevoluzione sociale ......................................................................... 7


3.1 Teoria dellevoluzione sociale ......................................................................................... 8
3.2 Cooperazione e beni pubblici ......................................................................................... 9
3.3 Sociobiologia ................................................................................................................... 11
3.4 Cross-feeding .................................................................................................................. 12

4 La divisione del lavoro ............................................................................................................. 13


4.1 Lunione fa la forza (strenght in numbers) ................................................................. 13
4.2 Cos la divisione del lavoro?........................................................................................ 14
4.3 Perch dividersi il lavoro? ............................................................................................. 15
4.3.1 Vantaggi in efficienza ....................................................................................... 16
4.3.2 Allineamento degli interessi............................................................................. 16

5 La tragedia dei beni comuni .................................................................................................... 17


5.1 Vincoli metabolici creano conflitti sociali................................................................... 18
5.2 Modelli teorici ................................................................................................................. 19

6 The Black Queen Hypothesis ................................................................................................. 20


6.1 Come la BQH vede i cheaters? .................................................................................... 22

7 Strategie per il controllo dei cheaters ..................................................................................... 23


7.1 Strategie benefit-based................................................................................................... 25
7.1.1 Intrinsic defector inferiority ............................................................................ 25
7.1.2 Quorum sensing per controllare i cheaters ................................................... 25
7.1.3 Conditional misers ............................................................................................ 25
7.2 Strategie punishment-based .......................................................................................... 26
7.2.1 Sorveglianza (policing) ..................................................................................... 26
7.2.2 Colonizzazione .................................................................................................. 26

8 NetLogo ..................................................................................................................................... 27
8.1 Le variabili ....................................................................................................................... 28
8.2 Le procedure ................................................................................................................... 28

Materiali e metodi ............................................................................................................................. 29

9 Panoramica del modello ........................................................................................................... 29

10 Assunzioni.................................................................................................................................. 30

11 Ambiente .................................................................................................................................... 30

12 Setup ........................................................................................................................................... 32

13 Procedure ................................................................................................................................... 33
13.1 Uptake glucosio .............................................................................................................. 35
13.2 Produzione ATP............................................................................................................. 36
13.3 Produzione dei due metaboliti primari........................................................................ 37
13.4 Scambio di metaboliti con lesterno ............................................................................ 38
13.5 Sintesi di biomassa ......................................................................................................... 39
13.6 Replicazione .................................................................................................................... 40
13.7 Muoviti............................................................................................................................. 42
13.8 Costi di mantenimento .................................................................................................. 44

14 BehaviorSpace ........................................................................................................................... 44

Risultati ............................................................................................................................................... 46

15 Inizializzazione del modello .................................................................................................... 48

16 Primi campionamenti dello spazio delle fasi del modello ................................................... 51

17 Ulteriori analisi .......................................................................................................................... 57

18 riguardo i cheaters ................................................................................................................ 60

Discussione ........................................................................................................................................ 63

Conclusioni ........................................................................................................................................ 69

Bibliografia ......................................................................................................................................... 70
Riassunto
Nelle societ, la divisione del lavoro, ove individui si specializzano per compiere determinate
attivit di cui beneficia lintero gruppo, stata a lungo considerata come il caposaldo su cui si
basa levoluzione delle societ complesse. Negli ultimi anni, sono stati scoperti esempi di di-
visione del lavoro anche tra microrganismi, il che ha portato a ipotizzare che questa possa
essere una importante strategia adottata anche durante levoluzione di organismi inferiori.
Tale ipotesi fa sorgere numerose domande: come pu emergere un mercato stabile tra orga-
nismi che, a differenza degli scambi tra umani, non sono regolati da contratti, e quindi obblighi
per tutti gli attori attivi nel mercato? Come pu stipularsi un reciproco scambio di beni senza
che una parte sia tentata di approfittarne, prendendo pi di quanto concede eventualmente
non concedendo affatto, aumentando di fatto le proprie possibilit di riprodursi, ma al con-
tempo sfavorendo la crescita collettiva del gruppo? E come pu la comunit difendersi da
questa tentazione individuale?
Quasi tutto quello che oggi sappiamo sui microrganismi deriva da studi compiuti in laborato-
rio con colture pure di singole specie. Gli scambi di risorse che intercorrono tra differenti
microrganismi sono molto complessi da studiare, ma la comprensione di come avvengono
permetterebbe il design razionale di intere comunit batteriche da utilizzare in ambito indu-
striale, mantenendo il controllo sulla comunit e facendo previsioni su quali e quanti prodotti
di interesse si otterranno.
La scienza computazionale, e lo sviluppi dei relativi metodi, permette lo studio in silico di si-
tuazioni, che essendo particolarmente complesse, sono, a primo impatto, di difficile
comprensione e generalizzazione. Il loro utilizzo aiuta lanalisi esplorativa di sistemi modellati
per rispondere a quesiti pendenti, eventualmente poi verificabili per via sperimentale.

Largomento di tesi ha previsto lutilizzo del linguaggio di programmazione NetLogo, un soft-


ware di modellazione agent-based che permette la simulazione di un sistema in cui
leterogeneit degli agenti coinvolti ci che lo rende un tipo di modellazione innovativo.
In particolare, si proceduto alla costruzione di un modello cellulare avente un metabolismo
estremamente semplificato. Mantenendo unottica biologica si sono variati alcuni parametri,
sia ambientali che endogeni, nel tentativo di trovare quelle condizioni che potrebbero essere
le pi ideali allinstaurazione e alla stabilit di un mercato microbico, e che possibilmente non
potesse essere invaso da organismi che sfruttano gli sforzi altrui senza contribuirvi.

1
Abstract
The division of labour, whereby individuals within a group specialize in certain tasks, has long
been appreciated as central to the evolution of complex societies. In recent years, several
examples of division of labour in microorganisms have arisen, which suggests that this strat-
egy may also be important in microbial species.
More questions crop up: in which way a stable microbial market may arise, since they arent
regulated by any contract as it happens throughout trades between people? How may recip-
rocal good exchanges carry on in a way that no exploiters arise from any of the parts, getting
an increased growth rate itself, meanwhile decreasing the whole community growth rate? How
does the community defend itself from these exploiters?

Most of our knowledge of microorganisms comes from single species grown up in laboratory.
Metabolic exchanges between microorganisms are quite difficult to study, but their under-
standing might allow us to rationally design new microbial consortia relevant in the production
of high value-added products, while still holding a control on the consortium itself.

Computational science and its methods allows the in silico study of situations that are com-
plex to analyze and generalize. Their use helps us into the explorative analysis of models in
order to find out the answers we are looking for, verifiable passing through experimental
support.

The topic of my thesis needed, at first, to learn a programming language called NetLogo, an
agent-based modeling software used to model and simulate systems, in which heterogeneous-
ness of agents makes of it a novel modeling approach.
In particular, we had built a functional model able to simulate an extremely simplified cellular
metabolism. While still keeping a biological eye on it, we modified certain environmental and
endogenous parameters, trying to figure out the most suitable and basic conditions needed to
set up and retain a microbial market, which may also defend itself from exploiter cells.

2
Introduzione

1 Perch studiare i consorzi microbici?


I processi di produzione industriali catalizzati da microrganismi utilizzano, nella maggior parte
dei casi, colture pure di singole specie. Lo schema generale di questi processi prevede la con-
versione di un substrato, preferenzialmente a basso costo, in un prodotto ad alto valore
aggiunto ottenuto sfruttando il metabolismo dei microrganismi. Lutilizzo di questi metodi
biotecnologici perlopi limitato a una o poche reazioni dellintero processo di produzione,
quando i metodi chimici disponibili risultano svantaggiosi. Spesso, i microrganismi utilizzati
sono stati migliorati per mezzo dellingegneria genetica, al fine di aumentare la resa del pro-
dotto di interesse.

Nei propri habitat naturali, i microrganismi vivono in comunit multispecie, i cui membri
formano tra loro complesse interazioni metaboliche, che, a volte, sono fondamentali per la
sopravvivenza di alcuni membri della comunit. Questo spiegherebbe perch meno dell1%
della diversit microbica oggi conosciuta possa crescere come coltura axenica in laboratorio1.
Bench lutilizzo di colture pure di singole specie nei processi di produzione sia stato un ap-
proccio molto utile, ha delle limitazioni che potrebbero essere superate se si potessero
utilizzare interi consorzi batterici: (i) il numero di nuove funzionalit implementabili in un
singolo organismo limitato, per via dellinstabilit genetica, di interferenze con il metaboli-
smo innato dellorganismo, e la produzione di sottoprodotti indesiderati2. (ii) Le comunit
microbiche hanno maggiore flessibilit metabolica e possono catalizzare molti pi processi,
pi efficientemente, grazie alla combinazione di metabolismi differenti. (iii) In un consorzio
microbico pu emergere la divisione del lavoro tra i membri che la compongono, grazie alla
compartimentalizzazione delle vie metaboliche. Ci porta allottimizzazione delle funzionalit
individuali e a minori fardelli metabolici per i singoli organismi3.
Questi vantaggi possono rendere i processi di produzione pi robusti e stabili alle perturba-
zioni ambientali4.
Lutilizzo di consorzi preesistenti in natura fattibile nei casi in cui si abbia come obiettivo la
completa degradazione di un substrato, come il trattamento delle acque nere e il biorisana-
mento di aree inquinate. Nelle produzioni industriali, invece, la conversione di substrati in

3
prodotti di interesse non pu essere affidata a consorzi naturali, perch la conversione diffi-
cilmente si fermerebbe al prodotto desiderato.
perci necessario ingegnerizzare intere comunit microbiche, che alloccorrenza possono
sia contenere ceppi selvatici che non coesistono in natura, e/o ceppi modificati geneticamente.
Le nuove comunit microbiche saranno modellate in funzione della massimizzazione e della
prevedibilit nella resa del prodotto (o prodotti) che si desidera ottenere5.
Sebbene esempi di comunit microbiche sintetiche gi esistono in letteratura, una grande sfida
ancora aperta quella di comprendere come le interazioni tra gli individui nella comunit
avvengono, come evolvono, e come possono restare stabili nel tempo.

2 Comportamenti sociali nei microrganismi?


Per comportamento sociale di un microrganismo si intende una azione intrapresa da un
microrganismo per influenzare il modo in cui un altro microrganismo (il destinatario del com-
portamento sociale) cresce e si riproduce6. Solo se tale comportamento evoluto con la finalit
di influenzare gli altri dovrebbe essere considerato sociale7.
Consideriamo un microrganismo che espelle un prodotto di scarto che ne danneggia un altro.
Il fatto che espella questo prodotto senza dubbio un evento legato allevoluzione del suo
metabolismo, ma il fatto che tale sottoprodotto vada a danneggiarne un altro, influenzandone
la crescita, non necessariamente una strategia sociale attuata per influenzare la vitalit del
microrganismo sensibile a quel prodotto8.

I microrganismi secernono un gran numero di sostanze differenti, che, in un modo o nellaltro,


alterano la composizione dellambiente in cui vivono. Ci sono pi modi attraverso cui una
cellula secerne metaboliti, tra cui la diffusione passiva9, pompe di efflusso attive10, sistemi ve-
scicolari11, e anche quando una cellula danneggiata si rompe, rilasciando allesterno il proprio
contenuto12.
Espellendo determinate sostanze, i microrganismi possono creare un ambiente che ne favori-
sca la crescita, detto niche construction13. Ad esempio, quando la concentrazione di glucosio
presente nellambiente diminuisce, Saccharomyces cerevisiae secerne lenzima invertasi che idro-
lizza il legame glicosidico del saccarosio, producendo fruttosio e glucosio14, utilizzabili come
fonte di carbonio ed energia. Oppure, Pseudomonas aeruginosa, un batterio patogeno che colo-
nizza i polmoni di pazienti affetti da fibrosi cistica. P. aeruginosa rilascia molte sostanze utili per
linfezione, tra cui siderofori (chelanti del ferro), che provocano unanemia localizzata

4
nellospite, riducendo i livelli di ferro nel tessuto15.

Il cross-feeding sembra essere un tipo di interazione piuttosto comune tra i microrganismi16,


17
. Quando in una comunit ci sono molte specie interagenti, la rete delle interazioni di cross-
feeding raggiunge presto unalta complessit.
I microrganismi utilizzano i mezzi di secrezione anche per comunicare tra loro. Sebbene il
rilascio di una tossina che uccide unaltra cellula possa definirsi una forma di comunicazione
(bench rude), hanno evoluto altri sistemi meno estremi, ad esempio, per rilevare la densit
cellulare circostante. Questo sistema definito quorum sensing18, utilizzato da batteri e funghi,
dove molecole chiamate autoinduttori sono secrete da tutte le cellule, e quindi, maggiore sar
la densit cellulare, maggiore sar la concentrazione di autoinduttori nellambiente. Il quorum
sensing permette di regolare le future decisioni a livello di comunit, come la formazione di
spore in situazioni di carenza di cibo19, formazione di biofilm20, transizione da singole cellule
a strutture ifali nei funghi21, scambi di DNA22, e secrezione di molti prodotti come melma23,
chelanti del ferro24, e tossine25.
Ancora oggi non chiaro se il quorum sensing sia un sistema di comunicazione evoluto atti-
vamente, dato che alcuni autoinduttori sono semplici molecole di scarto, che dunque non
sono evolute per il fine di comunicare8, mentre in altri casi gli autoinduttori sono molecole
che hanno richiesto un costo da parte delle cellule che li secernono, rappresentando un sistema
di comunicazione attivo, evoluto per questo scopo26.
La possibilit di comunicare tramite quorum sensing non prerogativa unicamente delle cel-
lule di una stessa specie. Esiste un insieme di molecole che gli organismi utilizzano per la
comunicazione interspecie27-29.

Per molti microrganismi, le interazioni sociali risultano pi intense quando vivono gomito a
gomito in un gruppo, come nei biofilm. Queste strutture tridimensionali si formano quando
le cellule crescono su una superficie, e, raggiunta una soglia di quorum sensing, secernono
polimeri che formano una matrice attorno a esse30 (Figura 1). Tali strutture possono conte-
nere numerose specie differenti, come succede nella placca batterica adesa alla superficie
dentale.

5
Figura 1: A) Modello individual-based di biofilm microbico. Le cellule respirano, creando un gradiente di ossi-
geno che rallenta la crescita delle cellule nella parte pi profonda del biofilm. Le cellule verdi sono quelle che
hanno a disposizione pi ossigeno e crescono pi velocemente, quelle blu crescono pi lentamente. B) Biofilm
di P. aeruginosa, in cui le cellule metabolicamente attive sono colorate in giallo. C) La simulazione mostra cellule
rosse che secernono il polimero giallo, e altruisticamente spingono la loro progenie verso lalto del biofilm, verso
maggiori concentrazioni di ossigeno. D) Immagine confocale di un biofilm di P. aeruginosa con le cellule che si
spingono verso lalto del biofilm colorate in giallo, e quelle ferme colorate in blu. (Immagini A e C prese da Xavier
J. B. and Foster K. R.31, B da Stewart P.32 e D da Klausen et al.33)

Vivere allinterno di un biofilm porta ad una maggiore competizione per i nutrimenti, il che
provoca il rallentamento della crescita (Figura 1A-B). Il biofilm offre una considerevole pro-
tezione ai suoi abitanti, inclusa una maggiore resistenza agli antibiotici. I biofilm sono ambienti
dinamici, in cui le cellule possono spingere i propri discendenti perch si ritrovino in una
posizione pi favorevole, per ottenere maggiori nutrienti20, 31 (Figura 1C-D).

6
3 Terminologia e teoria dellevoluzione sociale
Di seguito una lista dei termini pi importanti e utilizzati nella teoria dellevoluzione sociale7:

Attore (actor): lindividuo che attua un comportamento.


Ricevente (recipient): lindividuo che influenzato dal comportamento dellattore.
Beni pubblici (public goods): una risorsa, che seppur costosa da produrre, condivisa con
il resto della comunit. Ci apporta un beneficio a tutti gli individui che ne usufruiscono.
Tragedia dei beni comuni (tragedy of the commons): una situazione in cui gli individui
potrebbero ricevere maggiori benefici a lungo termine se cooperassero, ma continuano a per-
seguire i propri interessi in maniera egoistica, ottenendo pi benefici a breve termine,
portando al punto di collasso del sistema.
Cheaters: individui che sfruttano i beni pubblici prodotti dalla collettivit in misura spropor-
zionatamente maggiore rispetto a quanto vi contribuiscono.
Similarit genetica (relatedness): la misura della similarit genetica tra organismi di specie
diverse, o tra ceppi della stessa specie.
Fitness: definisce il successo riproduttivo di un individuo o di un certo genotipo in una po-
polazione.
Fitness diretta: una componente della fitness di un individuo, il risultato dei comporta-
menti che intraprende, ed visibile come successo nella propria replicazione.
Fitness indiretta: la componente della fitness ottenuta per aver aiutato la riproduzione di
individui con alta similarit genetica.
Fitness inclusiva: leffetto delle azioni di un individuo sul numero di progenie dellintero
gruppo, pesata sulla similarit genetica dei suoi membri, ed la somma della fitness diretta e
indiretta.
Cooperazione: un comportamento che apporta un beneficio a un individuo della stessa spe-
cie a cui indirizzata lazione (il ricevente).
Mutualismo: cooperazione tra specie differenti.
Vantaggio reciproco (mutual benefit): un comportamento che apporta benefici sia allat-
tore che al ricevente.
Altruismo: un comportamento che accresce la fitness del ricevente a spese di quella dellattore
(la cooperazione in presenza di cheaters costituisce una forma di altruismo).
Egoismo (selfishness): un comportamento che vantaggioso per lattore ma costoso per il
ricevente.

7
Spite: un comportamento che diminuisce la fitness del beneficiario a costo della propria.
Regola di Hamilton (Hamiltons rule): predice quanto favorito un comportamento tra
due individui. Formalmente: (rb > c), dove r la similarit genetica tra gli individui che inte-
ragiscono, b il beneficio in fitness per il beneficiario, e c il costo per lattore che attua il
comportamento. Quando rb > c linterazione favorita.

3.1 Teoria dellevoluzione sociale


Perch un individuo dovrebbe intraprendere un comportamento cooperativo, costoso da at-
tuare, e che va a beneficio di altri individui?6.
Le teorie che cercano di spiegare levoluzione della cooperazione (e anche di altri tipi di com-
portamenti) possono essere raggruppate in due categorie, a seconda che apportino benefici
sulla fitness diretta o sulla fitness indiretta dellattore34 (Figura 2). Queste teorie seguono le
intuizioni di W. D. Hamilton6, per cui gli individui otterrebbero un guadagno di fitness inclu-
siva, tanto attraverso la loro stessa riproduzione (fitness diretta), quanto attraverso il loro
impatto sulla riproduzione degli altri individui, pesato sulla loro similarit genetica (fitness
indiretta).
La prima categoria (effetti sulla fitness diretta) ipotizza che gli individui che cooperano e aiu-
tano gli altri, otterrebbero un vantaggio diretto da ci. Ad esempio, la formazione di gruppi
pi grandi potrebbe favorire la propria sopravvivenza, rispetto a piccoli insediamenti suscet-
tibili a estinzione a seguito di perturbazioni. Per favorire lampliamento del gruppo, un
individuo sarebbe portato a cooperare con altri individui, eventualmente pur non appartenenti
alla propria specie35. Un altro modo per rafforzare la cooperazione potrebbe essere quello di
ricompensare i cooperatori, punendo i cheaters. Ci potrebbe avvenire in diversi modi: puni-
zione, sorveglianza, sanzioni, ricompense per i cooperatori e reciprocit (Figura 2 e
paragrafo 7).
Il secondo gruppo di teorie (effetti sulla fitness indiretta) cerca di spiegare come un vantaggio
in fitness possa derivare quando un individuo ne aiuta un altro a riprodursi. Quando individui
che portano il cosiddetto gene cooperativo6 si incontrano (il caso pi semplice perch que-
sto incontro avvenga ipotizzare che i genotipi di attore e ricevente siano identici), lindividuo
cooperatore, aiutando lindividuo geneticamente simile a riprodursi, starebbe, in qualche
modo, trasmettendo la propria linea genetica alla generazione successiva, sebbene indiretta-
mente. Ci potrebbe avvenire in due modi: con selezione parentale (kin selection), in cui la
cooperazione preferenzialmente diretta verso parenti stretti (cloni batterici, nel nostro caso

8
di interesse), oppure attraverso una limitata dispersione degli individui (population viscosity)36,
in cui una limitata dispersione manterrebbe i cloni vicini tra loro, permettendo alla coopera-
zione di essere indiscriminata verso tutti i vicini, dato che questi tenderebbero ad essere tutti
geneticamente simili.
Un altro modo per ottenere un vantaggio indiretto sarebbe quello di cooperare con individui
con cui, pur avendo bassa similarit genetica, potrebbero riconoscersi grazie allespressione di
un gene gene cooperativo. Questo detto effetto barba verde (green-beard effect)37, in cui
un gene (o un numero ristretto di geni collegati) attiverebbe il comportamento cooperativo, e
sarebbe riconosciuto da altri individui tramite un ben distinto marker fenotipico associato,
ovvero una ipotetica barba verde.

Figura 2: Classificazione delle ipotesi formulate per spiegare la cooperazione tra individui, separate principal-
mente sullidea che portino benefici diretti o indiretti agli individui che le attuano.

3.2 Cooperazione e beni pubblici


La cooperazione stata concettualizzata in due modi: sia come uninterazione tra un donatore
e un accettore, costosa per il donatore e benefica per laccettore, o come la produzione di un
bene pubblico, che viene reso liberamente disponibile a tutti gli individui nelle vicinanze. Per
quanto riguarda i microrganismi, questultima definizione ritenuta pi appropriata34.
In letteratura, ci sono pi significati anche riguardo lutilizzo del termine bene pubblico: gli
economisti definiscono un bene pubblico per la sua (i) non escludibilit nel consumo, ovvero, una

9
volta che il bene pubblico prodotto, difficile o impossibile impedirne la fruizione ai soggetti
che non hanno pagato per averlo (si pensi ad esempio all'illuminazione stradale), (ii) e allas-
senza di rivalit nel consumo, in cui il consumo di un bene pubblico da parte di un individuo non
implica l'impossibilit per un altro individuo di consumarlo, allo stesso tempo (si pensi ad
esempio a forme d'arte come la musica, la pittura, o leducazione). Poich in biologia i beni
prodotti sono tipicamente risorse finite, un bene pubblico da ritenersi non escludibile nel
consumo (prima condizione), ma non necessariamente esente da rivalit nel consumo (se-
conda condizione)38.

Il fatto che i beni pubblici siano resi disponibili a tutti gli individui in una comunit microbica
pu provocare lo sfruttamento da parte di individui che utilizzano questi beni, ma non danno
niente in cambio agli individui che hanno prodotto tali beni. Questi individui sono detti chea-
ters. In modelli in cui stato simulato un sistema dove tutti gli individui di una popolazione
sono ben mescolati tra loro (well-mixed system), in cui ogni individuo ha uguale probabilit
di interagire con tutti gli individui presenti, e uguale probabilit di accedere ai beni pubblici, si
visto che gli individui non cooperativi (i cheaters) hanno sempre una fitness maggiore ri-
spetto agli individui che cooperano, provocando lestinzione del fenotipo cooperativo e il
collasso del sistema39, fenomeno conosciuto come tragedia dei beni comuni40 (ripreso nel
paragrafo 5).
Questo esito pu essere evitato in pi modi: supponiamo che in una popolazione ci sia un
fenotipo che non utilizza il bene pubblico, e nemmeno lo produce, detti individui solitari
(loner). Questi individui non partecipano alla dinamica sociale tra cooperatori e cheaters,
quindi, quando i cheaters proliferano e portano gli individui con fenotipo cooperatore
allestinzione, le quantit di beni pubblici disponibili diminuiscono al diminuire del numero di
cooperatori, portando anche i cheaters ad avere sempre meno benefici dalla direzione verso
cui stanno portando il sistema. Gli individui solitari, dal canto loro, non essendo influenzati
dai livelli dei beni pubblici, otterranno benefici da questa situazione, in cui sia cooperatori e
cheaters diminuiscono numericamente: inizieranno perci a proliferare man mano che dimi-
nuisce il numero di cheaters, e questo permetter al fenotipo cooperativo di riemergere.
Questo crea una dinamica ciclica che permette la persistenza dei cooperatori allinterno della
comunit anche quando appaiono fenotipi defezionisti41.
Altre soluzioni ipotizzate per evitare la tragedia dei beni comuni e favorire levoluzione della
cooperazione richiederebbero una forma di selezione, che portasse i cooperatori ad avere pi
probabilit di interagire con altri cooperatori42, ovvero una struttura spaziale che limitasse la

10
dispersione degli individui, che permettesse ladesione tra cooperatori, o, almeno, al ricono-
scimento della similarit genotipica34.

3.3 Sociobiologia
I primi approcci allo studio della sociobiologia dei microrganismi furono di esaminare le con-
seguenze verso cui determinati tratti sociali conducono il sistema in un determinato contesto,
e determinare quali fossero i costi e i benefici per donatori e accettori.

Tipicamente, il primo passo determinare la fitness relativa del wild-type (lindividuo che
possiede il tratto sociale che si vuole studiare) e del mutante (che non possiede il tratto sociale,
ma che in grado di sfruttare i benefici derivanti dalla cooperazione), entrambi cresciuti sia in
monocolture e in colture miste (wild-type e mutante).
Successivamente, si fanno crescere le stesse colture sotto condizioni in cui il comportamento
sociale si presume sia richiesto, e condizioni in cui non lo 34. Per esempio, se il comporta-
mento in studio la produzione dellenzima invertasi, che idrolizza il legame glicosidico del
saccarosio liberando fruttosio e glucosio, utilizzabili come fonte di carbonio ed energia, allora
il vantaggio di questo comportamento pu essere alterato variando la concentrazione di glu-
cosio gi presente nel terreno di coltura43. Alte concentrazioni di glucosio dovrebbero rendere
il comportamento cooperativo (la produzione di invertasi) meno vantaggioso da attuare.
In condizioni in cui il comportamento necessario, i cooperatori cresceranno meglio dei chea-
ters nelle monocolture, ma i cheaters cresceranno meglio dei cooperatori nelle colture miste
(cooperatori e cheaters), specie fintanto che sono in minoranza e allinterno di popolazioni di
cooperatori molto dense.
Invece, se il comportamento cooperativo in uno specifico terreno dispensabile, i cooperatori
non avranno nessun vantaggio dal cooperare, nemmeno in monocoltura34.
Un esempio in cui sono stati utilizzati questi principi nella sintesi di pioverdina in Pseudomo-
nas. La pioverdina un chelante del ferro necessario per luptake di ioni ferrici44. Studi
sperimentali hanno confermato le predizioni appena descritte, in cui i produttori di pioverdina
sarebbero cresciuti meglio dei non produttori nelle monocolture, e i non produttori sarebbero
cresciuti meglio dei produttori nelle colture miste44.

11
3.4 Cross-feeding
Lo scenario in cui un organismo cresce utilizzando prodotti di scarto di un altro organismo,
facile da comprendere: una relazione di tipo commensalistico (0/+), dove lorganismo rice-
vente beneficia di quanto prodotto dallaltro, senza influire sulla crescita del produttore, il
quale da parte sua non ha sostenuto costi per produrre ed espellere il prodotto di scarto.
Questa interazione potrebbe diventare mutualistica (+/+) nel caso in cui laumento della con-
centrazione del prodotto di scarto avesse effetti negativi sulla crescita dellorganismo che lo
secerne, perci, la presenza di un organismo che ne mantenesse bassa la concentrazione,
avrebbe un effetto benefico anche sullorganismo che lo produce.
La situazione differente nel caso in cui il prodotto secreto abbia richiesto un costo di pro-
duzione da parte dellorganismo produttore: non si tratterebbe pi di una mera secrezione di
prodotti di scarto a costo zero. Questo tipo di interazione, detto cross-feeding, molto diffuso
tra i procarioti, ed frequentemente basato sul reciproco scambio di metaboliti45.
Lesistenza di interazioni di questo tipo fa emergere il solito dilemma: perch un organismo
dovrebbe produrre un metabolita costoso di cui beneficer un altro organismo, invece di
usarlo per se stesso?
Una risposta su base sperimentale difficile da ottenere poich necessaria la conoscenza
delle conseguenze sulla fitness dovute alla transizione da uno stile autonomo a uno di dipen-
denza verso i metaboliti prodotti da un altro organismo. Perci, si dovrebbe disporre sia
dellorganismo genitore allo stato non cooperativo, sia dellorganismo cooperativo, e ci non
sempre possibile46.

12
4 La divisione del lavoro

4.1 Lunione fa la forza (strenght in numbers)


Grandi eserciti conquistano piccoli eserciti, grandi stormi di uccelli migrano pi efficiente-
mente che non singoli uccelli.
Qual il valore aggiunto che si ha quando si in molti?
In alcuni casi si tratta di disporre di pura potenza, come un branco di leoni pi efficace nel
sopraffare una grossa preda. In altri casi, il vantaggio del numero deriva dal fatto che un pi
grande gruppo di individui pu compartire le attivit necessarie alla crescita del gruppo stesso,
diversificandosi in gruppi di specialisti coordinati, che stando insieme possono ottenere bene-
fici superiori alla somma delle loro parti.
Lidea della divisione del lavoro deriva dalleconomia, ma lidea centrale di uguale importanza
anche negli esseri viventi, e virtualmente, ad ogni scala dellorganizzazione della vita47. Gli
insetti sociali sono sempre stati un esempio lampante dellefficacia di questa strategia: le colo-
nie di formiche, che contengono potenzialmente milioni di individui, si dividono tra soldati
che difendono il fortino, cercatori di cibo che viaggiano anche lontano dal formicaio alla ri-
cerca di cibo, balie che allevano la prole, e molti altri tipi di mansioni48.
Gli organismi multicellulari (come luomo) sono caratterizzati dalla divisione del lavoro tra le
cellule dei diversi tessuti, dove ciascun tipo specializzato ha un proprio ruolo nel mantenere
lintero organismo nella migliore condizione.
La divisione del lavoro non comunque un privilegio solo degli animali. Molti microrganismi
dividono le attivit necessarie tra gli individui della popolazione, creando fenotipi anche molto
diversi, che coesistono tra loro al fine di massimizzare la fitness dellintero gruppo, proprio
come succede per gli organismi multicellulari e per le formiche.
La differenziazione fenotipica pu emergere attraverso sei possibili meccanismi (Box 1).
Ad esempio, quando cellule di Escherichia coli crescono in coltura, una porzione di queste ri-
mane quiescente, mentre le altre crescono normalmente49. Questa detta bet-hedging strategy
(diversificazione del rischio), in cui assumere differenti fenotipi allinterno della popolazione
sarebbe pi efficace in vista di potenziali situazioni di stress. Con questa strategia, le cellule
quiescenti avrebbero pi probabilit di sopravvivere agli stress, ad esempio in presenza di
antibiotici, e quindi il genotipo avrebbe pi probabilit di sopravvivenza50.
In altri casi, alcune cellule nella popolazione si specializzano per compiere funzioni di cui

13
beneficiano anche gli individui che non svolgono questa funzione. In colture di Bacillus subtilis
in fase stazionaria, una porzione di queste produce e secerne proteasi che degradano le pro-
teine nel mezzo di coltura in piccoli peptidi, utilizzabili come nutrienti51. Dato che le proteasi
e i peptidi diffondono liberamente, la produzione degli enzimi va a beneficio di tutta la popo-
lazione, e non solo delle cellule che producono lenzima.
Ci si domanda perch la selezione naturale favorisca la divisione del lavoro, e se non fosse
meglio che tutti gli individui compiessero la stessa attivit (secrezione di proteasi) ad un ritmo
pi basso.

Box 1: ci sono almeno sei possibili meccanismi per generare variazioni fenotipiche allinterno di una specie52:

Differenze genetiche: particolari mutazioni possono far emergere differenti fenotipi53.


Epigenetica: differenti fenotipi possono essere mantenuti nei discendenti tramite la meti-
lazione del DNA54.
Rumore: fluttuazioni casuali nelle reazioni biochimiche della cellula, se accoppiate a una
rete genica che amplifica piccole variazioni nei livelli delle reazioni, possono portare ad
avere variazioni fenotipiche51.
Segnalazione: alcuni individui allinterno di popolazioni di cianobatteri, sintetizzano e se-
cernono peptidi di segnalazione che inducono cellule vicine a svilupparsi come eterocisti
adibita alla fissazione dellazoto che va a vantaggio di tutta la popolazione. Questo produce,
allinterno della popolazione, dei pattern regolari di eterocisti e cellule che ne inducono la
differenziazione55.
Ambiente: variazioni fenotipiche possono essere generate anche dallambiente in cui la
popolazione vive. I cianobatteri, oltre al meccanismo della segnalazione, possono differen-
ziarsi in eterocisti a causa di alti livelli di azoto presenti nellambiente55.
Condizioni di dipendenza: una variazione fenotipica pu essere generata da differenti
condizioni cellulari. In Volvox carteri, una serie di divisioni cellulari asimmetriche durante le
prime fasi dello sviluppo embrionale porta alla generazione di cellule di piccole e grandi
dimensioni con ruoli differenti56.

4.2 Cos la divisione del lavoro?


La divisione del lavoro si manifesta quando individui cooperanti si specializzano per compiere
specifiche attivit. Possiamo considera un comportamento come divisione del lavoro se sus-
sistono tre condizioni: (i) che gli individui cooperanti svolgano tra loro mansioni differenti,
(ii) che gli individui cooperanti svolgano mansioni che vanno a beneficio anche degli altri
individui (cooperazione), e (iii) che la divisione del lavoro apporti un qualche vantaggio in

14
fitness a tutti gli organismi coinvolti nel rapporto, ovvero sia agli individui che svolgono la
funzione, sia a quelli che ne ricevono i vantaggi 47.
La seconda e terza condizione distinguono la divisione del lavoro da quei casi in cui una va-
riazione fenotipica sia emersa da necessit egoistiche degli individui, come ad esempio la
diversificazione fenotipica al fine di sfruttare nuove nicchie.

Un altro esempio di divisione del lavoro proposto da Salmonella typhimurium quando infetta
un ospite vertebrato: una sottopopolazione del batterio rimane nel lume intestinale per ripro-
dursi, mentre unaltra porzione invade i tessuti dellintestino, rilasciando un fattore che innesca
la risposta infiammatoria dellospite, portando alleliminazione di una parte dei batteri presenti,
aumentando le possibilit di colonizzazione da parte delle cellule di salmonella che sono ri-
maste nel lume a replicarsi57. Questo un esempio di divisione del lavoro, che costoso per
le cellule che invadono il tessuto (muoiono), ma va a beneficio delle cellule che sono rimaste
a riprodursi nel lume intestinale. Laumento nella possibilit di colonizzazione apporta un
elevato vantaggio allintero genotipo di Salmonella typhimurium, superando i costi.

Un esempio di cosa invece non costituisce divisione del lavoro la variazione fenotipica che
si vista in colture di Pseudomonas fluorescens cresciute in mezzo di coltura liquido, dove le cellule
diversificano il proprio fenotipo per sfruttare le diverse nicchie disponibili: certe crescono
nella fase liquida, altre sullinterfaccia liquido-aria, e altre sul fondo58.
Questo esempio, pur mostrando variazione fenotipica non da ritenersi divisione del lavoro,
perch i differenti fenotipi non beneficiano lun laltro delle mansioni compiute da ciascuno,
ma solo un espediente con finalit personali53.

4.3 Perch dividersi il lavoro?


Perch la selezione naturale dovrebbe favorire la divisione del lavoro, in cui i diversi individui
compiono diverse attivit? Non sarebbe meglio se tutti gli individui compiessero le stesse
attivit ad un ritmo inferiore?
Consideriamo il semplice caso in cui ci siano due attivit da compiere, A e B. Il tempo e le
risorse investite per compiere lattivit A non potranno essere investite nellattivit B. Ad
esempio, lattivit A potrebbe essere la riproduzione, e lattivit B potrebbe essere la secre-
zione di un fattore che causa una risposta infiammatoria nellospite, come visto nel caso di S.
typhimurium. In questo caso la divisione del lavoro favorita quando si ha un vantaggio in
termini di efficienza nellavere differenti individui che compiono differenti mansioni, e

15
quando gli interessi riproduttivi di tutti gli individui coinvolti sono allineati.

4.3.1 Vantaggi in efficienza


Perch la divisione del lavoro sia favorita, serve che si abbia un vantaggio rispetto alla situa-
zione in cui gli individui compiono individualmente tutte le attivit di cui necessitano per
sopravvivere59-61. Come mostrato in Figura 3, perch la divisione del lavoro risulti favorita
necessario che la relazione tra la quantit di risorse allocate per compiere lazione A dia un
ritorno sempre maggiore per ogni ulteriore risorsa investita, ovvero che la pendenza del gra-
fico acceleri59. Questo succede quando unattivit diventa sempre pi efficiente allaumentare
delle risorse allocate per compierla.
Invece, se allocando sempre pi risorse in quellattivit si ha meno rientro per ogni ulteriore
risorsa investita, saranno favorite le cellule con fenotipo non cooperativo in grado di compiere
entrambe le attivit.

Figura 3: sullasse delle ascisse rappresentata la quantit di risorse allocate per svolgere una determinata fun-
zione, sullasse delle ordinate il ritorno che la cellula ha da questo investimento. Da notare i differenti colori delle
cellule, che indicano specializzazione o meno.

4.3.2 Allineamento degli interessi


La divisione del lavoro richiede che gli interessi dei diversi individui siano allineati, altrimenti
linterazione tra gli individui potrebbe essere destabilizzata. Una esempio sarebbe uno scenario
in cui un ceppo di S. typhimurium che produce pi cellule che restano nel lume intestinale e
meno cellule che migrano nel tessuto per attivare la risposta infiammatoria dellospite: linne-
sco della risposta infiammatoria dellospite potrebbe non avvenire per linsufficiente

16
produzione del fattore.
Il modo pi semplice per avere interessi comuni quando gli individui che si dividono il
lavoro hanno tra loro alta similarit genetica6. Questa idea, conosciuta come selezione paren-
tale (kin selection), propone che un individuo, aiutando un suo prossimo geneticamente simile
a riprodursi, starebbe, in qualche modo, trasmettendo la propria linea genetica alla generazione
successiva, sebbene indirettamente (Figura 4).

Figura 4: maggiore la similarit genetica tra gli individui, e maggiore la possibilit che si instauri la divisione
del lavoro.

La regola di Hamilton (rb > c), gi accennata nel paragrafo 2, predice che tratti altruistici
(come la porzione di cellule di S. typhimurium che invade il tessuto intestinale per innescare la
risposta infiammatoria) saranno favoriti allaumentare della similarit genetica tra gli individui,
ammesso per che i benefici superino i costi. Questo comporta che sebbene la divisione del
lavoro sia favorita allinterno di popolazioni clonali (r = 1), non si esclude che non possa
instaurarsi anche tra specie differenti (r < 1).

5 La tragedia dei beni comuni


Quando individui hanno accesso a risorse comuni che possono essere sfruttate sia in maniera

rapida , che efficiente , sorge un dilemma:

la fitness media di tutto il gruppo pi alta se tutti gli individui sfruttano le risorse efficiente-
mente, ma anche vero che la velocit di riproduzione di un singolo individuo massimizzata
quando esso consuma le risorse pi velocemente rispetto agli altri62.

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Hardin (1968)40 ipotizz che vi sia un maggior beneficio nel consumare le risorse in maniera
egoistica, e quindi questa scelta sarebbe favorita. Quando per le risorse scarseggiano, un ul-
teriore aumento della velocit di sfruttamento porterebbe meno benefici rispetto ai costi.
Ad esempio, si consideri il caso di una competizione tra due individui che utilizzano due dif-
ferenti tipi di strategie per sfruttare delle risorse comuni: una strategia che definiamo

prudente consuma le risorse ad una velocit di , avendo una resa di

, e una strategia che definiamo egoistica che consuma risorse ad una ve-


locit di con una resa di .

Il vantaggio di agire in maniera egoistica uguale a s, ma il costo di tale strategia, in situazioni

di risorse limitate, si riversa su tutta la popolazione, ed di , dove N la dimensione


della popolazione, visto che tutti gli individui della popolazione hanno uguale accesso alle
risorse.
La logica della tragedia dei beni comuni predice che massimizzare un beneficio individuale
(strategia egoistica), ad un certo punto, quando le risorse diverranno limitanti, porter a con-
seguenze disastrose per la popolazione.
In uno scenario estremo, il conflitto sociale tra interesse individuale e quello del gruppo por-
terebbe plausibilmente allestinzione della popolazione. Cosa previene che ci si verifichi?
Nella competizione di risorse si genera un conflitto sociale, e ci deve essere un compromesso
(trade-off) tra il beneficio che un individuo ottiene dallo sfruttamento delle risorse, e il bene-
ficio che ne ottiene il gruppo.
Nel caso di microrganismi, un compromesso tra la velocit e la resa di un metabolismo un
aspetto fondamentale nellutilizzo delle risorse, il che rende i microrganismi un sistema mo-
dello ideale per investigare i conflitti sociali creati dalla competizione per le risorse.

5.1 Vincoli metabolici creano conflitti sociali


I microrganismi eterotrofi generano lenergia richiesta per crescere e riprodursi utilizzando vie
metaboliche che convertono risorse extracellulari con alta energia libera, in prodotti a pi
bassa energia libera, conservando parte di questa differenza energetica sotto forma di ATP.
Consideriamo una reazione catabolica che converte i substrati S e ADP nei prodotti P e ATP
(Figura 5). La termodinamica ci dice che la velocit della reazione linearmente correlata alla
differenza in energia libera tra substrati e prodotti. Perci, se tutta la differenza di energia

18
libera tra S e P fosse conservabile in ATP (resa = 1) non ci sarebbe differenza di energia libera
tra i due substrati e i due prodotti (S + ADP P + ATP), e la reazione non procederebbe.
Consideriamo invece una reazione in cui solo una parte della differenza di energia libera
conservata sotto forma di ATP (resa < 1). Lenergia libera dei prodotti (P + ATP) sar infe-
riore a quella dei substrati (S + ADP), e la reazione procederebbe ad una velocit > 0, con
resa < 1.

Figura 5. Rappresentazione schematica del trade-off tra velocit e resa nella produzione di ATP in una reazione
catabolica.

5.2 Modelli teorici


Nei primi studi teorici ci si era chiesti quali potessero essere le conseguenze evolutive tra
microrganismi con differenti trade-off di velocit e resa.
Si usarono ceppi ipotetici che consumavano delle risorse utilizzando le strategie prudente
ed egoistica. Da questi modelli si concluse che in uno stato di competizione per una risorsa
comune, i ceppi che utilizzano la strategia egoistica, e quindi producono ATP pi velocemente
ma con basse rese, hanno sempre il sopravvento sui ceppi prudenti che usano le risorse con
resa di ATP maggiore63.
Il risultato cambia quando gli individui competono coi loro vicini per sfruttare le risorse in
piccole nicchie, come accade in popolazioni strutturate come quelle dei biofilm64. In questo
caso, ceppi con alta resa di ATP (che utilizzano la strategia prudente) possono prevalere sui
competitori con alta velocit di produzione di ATP (strategia egoistica), grazie alla loro capa-
cit efficiente di sfruttare le risorse locali63. In questo scenario, il metabolismo pi rapido
continua a essere correlato a un vantaggio di fitness, ma il costo del maggior sfruttamento
delle risorse non diviso dallintera popolazione, ma solo dal piccolo gruppo di cellule, il che

19
comporta costi superiori rispetto ai benefici che ottenuti dal consumare le risorse con la stra-
tegia egoistica.
Sebbene questi modelli differiscano tra loro per le differenti assunzioni fatte, tutti predicono
che interazioni ecologiche spazialmente strutturate (biofilm) siano la chiave per prevenire la
tragedia dei beni comuni nelle comunit microbiche. Questi risultati sono coerenti con le teo-
rie della selezione parentale (discussa nei paragrafi 3 e 4), che ipotizza che la proliferazione di
un gene cooperativo sia favorita quando rb > c, dove r la similarit genetica tra gli individui
interagenti (relatedness), b il beneficio per il ricevente, e c il costo sostenuto dallattore che
attua il comportamento. Nelle popolazioni spazialmente strutturate, le interazioni sono pi
forti tra i vicini, i quali saranno molto probabilmente cloni dellattore, e avranno dunque il
coefficiente r uguale a 1.
In popolazioni mescolate (well-mixed systems), le interazioni tra individui avvengono in ma-
niera casuale, il che risulta in una bassa r e una debole selezione per laltruismo.
Una delle assunzioni fatte in questi modelli che i metabolismi degli organismi a confronto
abbiano velocit e rese fisse, anche se nella realt, a seconda delle condizioni in cui i micror-
ganismi si trovano a crescere65, la plasticit fenotipica pu alterare sia velocit che resa di un
metabolismo.

6 The Black Queen Hypothesis


Questa ipotesi, formalizzata nel 201266, sostiene che la perdita della funzionalit di un gene
potrebbe fornire un vantaggio evolutivo ad un organismo, quando pu procurarsi in altro
modo le risorse necessarie a sopperire alla perdita di quella funzionalit.
In natura ci sono esempi di evoluzione riduttiva, in cui organismi semplici derivano da ge-
notipi pi complessi, come ad esempio parassiti e simbionti, che tendono a perdere la capacit
di sintetizzare certi metaboliti che gli vengono forniti dallospite67. Ad esempio, batteri asso-
ciati al proprio ospite, come Lactobacillus spp. non sono pi in grado di sintetizzare certi
amminoacidi68.
La spiegazione del perch una tale forza sia favorita, che un genoma pi leggero, e quindi
meno proteine e metaboliti da produrre, ridurrebbe la necessit di carbonio e altri nutrienti
limitanti richiesti per produrre una nuova cellula69, 70.
La BQH (Black Queen Hypothesis) specifica le condizioni sotto cui vantaggioso per un
organismo smettere di espletare una funzione. Qualunque perdita di funzione porta ad un

20
potenziale costo in fatto di fitness, quindi, per proliferare nella popolazione, una perdita di
funzione deve fornire un vantaggio di fitness che superi il costo della sua perdita.
Il vantaggio di fitness determinato dal risparmio energetico e/o di risorse che si risparmiano
dallaver perso la capacit di compiere tale funzione, rispetto al progenitore.
Per esempio, la perdita del gene codificante lenzima katG nel batterio Prochlorococcus, una os-
sidoreduttasi con quattro gruppi ferrosi necessaria per proteggere la cellula da specie reattive
dellossigeno come il perossido di idrogeno, porta Prochlorococcus ad avere una richiesta di ferro
circa 0.2% inferiore rispetto al suo progenitore katG+ 71. Assumendo che la richiesta di ferro
sia il fattore limitante per la crescita del batterio, il beneficio per aver perso questa funzione
dunque di ~0.2% in termini di fitness. Se assumiamo che questo risparmio porti ad un pro-
porzionale aumento nella velocit di crescita, allora, in assenza di pressione selettiva, quel
mutante potrebbe invadere la popolazione ancestrale, portando allestinzione del progenitore.
Il costo in fitness che deriva dalla perdita di una funzione calcolato partendo dalla fitness
del mutante posto in un ambiente in cui il bene pubblico prodotto dalla funzionalit in oggetto
assente, e aggiustato per un fattore che misura il grado con cui gli altri membri della comunit
possono fornire tale bene, ovvero quanto aiuto si riceve dalla comunit circostante.
Nel caso di un mutante che prolifera in un ambiente occupato solo da se stesso e dal proge-
nitore, il mutante proliferer solo fino a che il progenitore raggiunger una concentrazione
minima che fornisca esattamente una quantit di bene pubblico che renda identica le velocit
di crescita di entrambi. Questo perch, seppur la perdita di una funzione porta un vantaggio
di fitness al mutante, si crea una dipendenza tra mutante e progenitore che fornisce il bene, e
si creer una condizione di coesistenza.
Invece, in una situazione in cui ci siano organismi diversi che contribuiscono a fornire tale
bene ad un livello sufficiente, e che non siano in competizione per tale bene con il mutante e
il suo progenitore, ci si aspetta che il progenitore si estingua, lasciando spazio al mutante e agli
altri organismi che possono fornire il bene.

La Black Queen Hypothesis predice che allinterno di comunit con pi specie differenti e
ben mescolate tra loro, perdite funzionali nelle specie si avranno sempre fintanto che per tutti
gli organismi i vantaggi risulteranno maggiori o uguali ai costi che derivano dalla loro perdita.
Nel momento in cui la perdita di una funzionalit avr un costo superiore ai benefici, il sistema
diventer instabile.
Dopo che il mutante rimpiazza il progenitore wild-type, si crea una dipendenza e la comunit

21
diviene popolata di soli aiutanti e beneficiari, come nel caso di Prochlorococcus e dei suoi coabi-
tanti marini.
La BQH utilizza lassunzione che gli individui stiano in un ambiente ben mescolato, e che
dunque abbiano tutti lo stesso accesso ai medesimi beni comuni. Rilassando questa assun-
zione, lanalisi dei costi-benefici diventa pi complessa. Ad esempio, la disponibilit dei beni
pubblici sar minore dove ci sia una pi alta densit di mutanti, e maggiore dove ci sia minore
densit, e quindi, meno richiesta di tali beni. Una simile analisi ovviamente pi complessa di
quella in cui si assume lomogeneit del sistema, sebbene studi abbiano evidenziato che la
struttura spaziale giochi un ruolo fondamentale nellevoluzione e nel mantenimento di intera-
zioni di certi fenotipi microbici72.

6.1 Come la BQH vede i cheaters?


Nella Black Queen Hypothesis, i beneficiari sono quelli che ottengono un vantaggio dagli
aiutanti. Questa relazione porta a chiedersi se i cheaters siano da considerarsi semplici bene-
ficiari, oppure sfruttatori.
I cheaters sono comunemente considerati come mutanti che, allinterno di un popolazione,
smettono di svolgere una funzione costosa per lindividuo, ottenendo cos un beneficio per
se stessi a spese altrui34. Questa dinamica sicuramente simile a quanto appena discussa ri-
guardo la BQH, bench essa non implichi che beneficiari e aiutanti siano geneticamente
correlati; infatti, potrebbero appartenere a differenti specie, a differenti livelli della catena tro-
fica, e addirittura a differenti domini.
Inoltre, lidea del cheating implica che ci sia un effetto negativo dei cheaters a discapito dei
cooperatori. Nella BQH non si assume che la fitness degli aiutanti sia necessariamente intac-
cata. I beneficiari danneggerebbero gli aiutanti solo se entrambi gli organismi fossero in
competizione per la stessa risorsa limitante, e se la crescita pi rapida dei beneficiari rendesse
sempre meno disponibili le risorse agli aiutanti.
Il termine cheater potrebbe essere applicato allesempio delliniziale invasione del mutante di
Prochlorococcus allinterno della popolazione ancestrale, visto che entrambi si trovano a essere
limitati dalle stesse risorse, e il ceppo mutante sfrutta quanto prodotto dal wild-type senza
contribuire.
Nel caso invece in cui aiutanti e beneficiari utilizzino substrati differenti, ciascuno dei quali
non utilizzato dallaltra popolazione, la relazione che viene a crearsi sarebbe di tipo com-
mensale, in cui il beneficiario approfitta del nutrimento o degli scarti dellaiutante senza che la

22
fitness di questo necessariamente diminuisca.
Ad esempio, negli oceani, Prochlorococcus e i suoi aiutanti eterotrofi probabilmente non compe-
tono per le stesse risorse di carbonio ed energia, con gli aiutanti eterotrofi che probabilmente
dipendono da Prochlorococcus per ottenere fonti di carbonio organico. Si pensa che i batteri
eterotrofi negli oceani siano limitati dalla disponibilit di carbonio organico73, processo prin-
cipalmente regolato da Prochlorococcus in molte regioni oceaniche74. Se la riduzione genomica
derivante dalla perdita di katG avesse permesso a Prochlorococcus di aumentare la velocit delle
sue altre funzioni metaboliche, ne risulterebbe che la fissazione del carbonio potrebbe aumen-
tare sensibilmente, e cos anche il numero della comunit eterotrofa. In questo caso,
lassociazione tra Prochlorococcus e i suoi aiutanti porterebbe benefici ad entrambe le parti, e la
relazione da commensalistica diverrebbe mutualistica. Perci, la BQH descrive un processo
evolutivo da un punto di vista generale, che a volte pu includere il cheating, mentre in altri
contesti pu includere uninterazione tra due specie, che pu essere neutrale o positiva.

7 Strategie per il controllo dei cheaters


I potenziali benefici ottenuti dai microrganismi quando cooperano possono essere resi vani
quando appaiono genotipi non cooperativi che sfruttano i vantaggi della cooperazione senza
contribuire (cheaters). Dunque, se i benefici ottenuti da un comportamento sociale possono
essere sfruttati senza contribuire, i cheaters hanno pi possibilit di proliferare a danno dei
gruppi con comportamenti sociali, riducendo i vantaggi complessivi ottenuti della coopera-
zione, e potenzialmente causare un collasso del sistema.
Perch la cooperazione rimanga una strategia evolutivamente vantaggiosa per gli individui che
la attuano, quindi necessario che gli effetti negativi introdotti dai cheaters siano prevenuti o
mitigati dagli stessi individui cooperativi.
Sono stati ipotizzati diversi meccanismi con cui la propagazione di cheaters potrebbe essere
limitata da parte dei genotipi cooperatori, sebbene alcuni dei quali richiederebbero un alto
grado di complessit e sofisticazione da parte degli stessi75.

Possibili meccanismi anti-cheating potrebbero dipendere da specifici segnali intercellulari ne-


cessari per innescare una cooperazione.
Generalmente, questo genere di segnali sono divisi in personali o diffusibili (intimate e
diffusive): i segnali personali sono fisicamente associati al cooperatore, ad esempio il C-
factor, una proteina di membrana posseduta da Myxococcus xanthus, induce la formazione di

23
corpi fruttiferi e sporulazione (un comportamento cooperativo) quando una porzione degli
individui rileva un ambiente carente di nutrienti76.
stato ipotizzato che questi segnali potrebbero servire anche da identificatori di partner coo-
perativi, permettendo di rilevare la presenza, o meno, di possibili partner, attraverso un ben
determinato marker fenotipico (alleli barba verde), che in questo caso il C-factor.
I segnali diffusibili, invece, sono rilasciati e diffondono nellambiente circostante e possono
legarsi ai fattori C delle altre cellule che li possiedono, quindi, legandosi ai recettori, la con-
centrazione dei segnali nellambiente diminuirebbe, e le cellule produttrici potrebbe rilevare
quanti cooperatori sono presenti nelle immediate vicinanze.

Genotipi cooperativi potrebbero utilizzare due tipi di strategie principali per proteggersi dalla
proliferazione dai cheaters: strategie benefit-based e punishment-based.
Nelle strategie benefit-based, gli individui che contribuiscono al successo del comportamento
sociale accederebbero a vantaggi che non sono altrimenti disponibili ai non cooperatori. Ad
esempio, lallele codificante il comportamento cooperativo potrebbe essere strettamente ac-
coppiato allallele codificante un meccanismo che si attiva solo quando presente un partner
cooperante, ad esempio con lautostop genetico (genetic hitchhiking)77.
Nelle strategie punishment-based, gli individui che non contribuiscono al fenotipo sociale
sarebbero attivamente puniti dai cooperatori. Queste strategie sarebbero pi difficili da attuare
rispetto alle precedenti, sia dal punto di vista dei cheaters che devono raggirarle, sia dal punto
di vista dei cooperatori che devono attuarle. Perch siano applicabile, servirebbe che almeno
una porzione dei cooperatori possedesse tratti killer simili a quelli delle cellule T dellimmu-
nit innata nei mammiferi, che riconoscono le cellule tumorali e le uccidono78. Ad esempio,
alcuni ceppi di Escherichia coli producono batteriocine, come la colicina, codificata da geni in
stretta vicinanza con un cluster di tre geni codificanti proprio per limmunit alla colicina.
Cellule che non possiedono questi geni, quindi con bassa similarit genetica, muoiono per
azione della colicina.
in entrambe le strategie (benefit-based e punishment-based), i cheaters si verrebbero a trovare
in una situazione di svantaggio rispetto ai cooperatori.

24
7.1 Strategie benefit-based

7.1.1 Intrinsic defector inferiority


Il modo pi efficace per alleli sociali di proliferare e persistere nella popolazione sarebbe di
rendere la loro perdita intrinsecamente costosa per la cellula. Questo potrebbe essere ottenuto
nellevoluzione di uno stretto accoppiamento tra laccessibilit ai benefici del gruppo, e i mec-
canismi di segnalazione intimate e diffusivi.

7.1.2 Quorum sensing per controllare i cheaters


Quando i cheaters sono fisiologicamente capaci di sfruttare i segnali personali e diffusibili
dei cooperatori, il quorum sensing potrebbe fornire un ulteriore livello di difesa.
Ipotizziamo un meccanismo di segnalazione a cascata di almeno due segnali, per esempio,
X e Y, che agiscono a differenti, ma consecutivi stadi di un processo cooperativo (X per
primo), e supponiamo che i cheaters non producano X ma producano Y. Supponiamo anche
che il contributo di Y sia vantaggioso solo quando X presente ad almeno una concentrazione
soglia. Sotto queste condizioni sarebbe vantaggioso per i collaboratori che usano Y rendere la
produzione di Y dipendente dalla concentrazione di X.
Questo non solo preverrebbe il costo per produrre Y quando la densit della popolazione
troppo bassa, ma anche quando la frequenza dei cheaters che non producono X troppo alta.
Utilizzando questo meccanismo, i collaboratori potrebbero valutare la densit di cheaters e
collaboratori nelle vicinanze, e valutare se sia conveniente attuare il meccanismo cooperativo.

In questo scenario, raramente cheaters potrebbero invadere una popolazione composta di


cooperatori, e anche se la densit di cheaters dovesse aumentare, e quindi la concentrazione
di X diminuire, essendo la produzione di Y dipendente da X, la produzione di Y cesserebbe
e i cooperatori smetterebbe di collaborare, non subendo sfruttamento da parte dei cheaters.

7.1.3 Conditional misers


Questa strategia utilizza i segnali personali: ipotizziamo che per essere innescata, la coope-
razione richieda segnali a cascata, con lespressione iniziale di un segnale Q, seguito dalla
successiva espressione di un segnale R, essenziale per ottenere il vantaggio sociale prodotto
dalla cooperazione. Se una cellula non produce il segnale personale, ovvero il fattore C (pro-
teina di membrana che aiuta Myxococcus a valutare la presenza di collaboratori), a cui
ipotizziamo si leghi il segnale Q, queste cellule non potrebbero nemmeno produrre R, la cui

25
produzione innescata dal legame del segnale Q al fattore C, e quindi gli sarebbe negato
laccesso ai vantaggi della cooperazione.

7.2 Strategie punishment-based

7.2.1 Sorveglianza (policing)


Genotipi cooperativi potrebbero agire attivamente e in maniera aggressiva contro i defezioni-
sti, attuando azioni che non si limitano alla mera esclusione di questi ultimi dai benefici della
cooperazione, ma intraprendendo azioni che diminuiscono la fitness dei cheaters, lasciando
inalterata quella dei cooperatori. Ad esempio, il rilascio di una tossina a cui solo i cheaters (e
non i cooperatori) sono suscettibili. Questa misura avrebbe un costo per le cellule che la at-
tuano, e potrebbe sia essere attuata da tutte le cellule che rispondono al segnale, oppure solo
da una frazione di esse (divisione del lavoro), ma i costi sarebbero pi che compensati dalla
sicurezza di non poter essere sfruttati dai cheaters.

7.2.2 Colonizzazione
Se gli effetti del cheating sono particolarmente deleteri per la comunit, allora la selezione
contro i cheaters potrebbe potenzialmente avvenire a livello della struttura della comunit.
Gli ipotetici meccanismi visti finora non rispondono alleventualit che un cheaters possa for-
marsi dallinterno della popolazione, a causa di una singola mutazione che lo rendesse non
cooperativo, bench identico in tutte le altre caratteristiche fenotipiche ai membri cooperatori
di quella popolazione. Perci, la selezione contro il cheating sarebbe inefficace in tutti gli sce-
nari descritti sopra. In questi casi, la mitigazione dei cheaters potrebbe avvenire a livello di
popolazione: popolazioni con nessuno o pochi cheaters, oppure popolazioni che hanno bassa
frequenza di mutazione e producono pi raramente cheaters dallinterno, avrebbero un van-
taggio selettivo su quelle che, viceversa, sono spesso perturbate da alte frequenze di
mutazione, e, quindi, sarebbero pi inclini ad essere colonizzate dalla nuova popolazione.

26
8 NetLogo

Figura 6: Logo di NetLogo

NetLogo un ambiente di modellazione programmabile che consente di simulare fenomeni


naturali e sociali. un software open source che a tuttoggi aggiornato e rinnovato (ultima
versione, NetLogo 6.0 Dicembre 2016).
Il software particolarmente adatto alla modellazione di sistemi complessi che si sviluppano
in modo continuo nel tempo. I creatori dei modelli sono in grado di dare istruzioni a centinaia
di Agents (agenti) che agiscono in maniera autonoma, interagendo sia tra loro, che con lam-
biente, il quale costituisce un mondo allinterno del quale gli agenti possono muoversi.
utilizzato sia in economia, studi sociali, ed ecologia. In Figura 7, si riporta un modello in
cui si simulano le frequenze con cui possono avvenire dei furti. Nel modello ci sono i poli-
ziotti, i ladri e persone che possono subire i furti. Il modello valuter lincidenza che la quantit
di persone che camminano per strada avr sulla frequenza dei furti, cos come il numero, la
posizione e il movimento dei poliziotti.

Figura 7: snapshot del modello Robbery-with-qlearn scaricabile dal sito di NetLogo

NetLogo usa un proprio linguaggio di programmazione di alto livello (un meta-linguaggio


molto simile allinglese parlato), basato sul Java (un noto linguaggio di programmazione ob-
ject oriented), ma con una struttura fatta di una sequenza di procedure contenenti il codice
del programma79.

27
Si pu accedere al codice attraverso lapposita sezione Procedures (Figura 8).

Figura 8: le pagine principali di NetLogo sono due: la pagina Interface, da cui viene avviata la simulazione, e
la pagina Procedures, in cui si scrive il codice del modello.

8.1 Le variabili
In NetLogo si possono definire tre tipi di variabile:
Le variabili globali esistono in esemplari unici e sono visibili da qualunque punto del codice.
Vengono dichiarate allinizio del codice, fuori da ogni altra procedura, oppure direttamente
dallinterfaccia di sviluppo attraverso gli Sliders, gli Switch, o i Chooser, (Figura 9) e sono
aggiornate con la riga di comando: set nome_variabile value

Figura 9: Linterfaccia di NetLogo permette un alto grado la custumizzazione.

Le variabili locali, esistono anchesse come esemplari unici allinterno del codice, ma sono
visibili solo allinterno della procedura dove sono state dichiarate per mezzo della riga di co-
mando: let nome_variabile value

Le variabili proprietarie (built-in variables) esistono in molte copie diverse (istanze), una per
ciascuna turtle (turtles-own), per ogni patch (patches-own), o link (links-own), ovviamente
ciascuna con valori diversi.

8.2 Le procedure
In NetLogo il codice racchiuso in una sequenza di procedure, ovvero blocchi contenenti
una lista di comandi che dicono alle turtles come muoversi e/o alle patches come comportarsi.
Una volta definita una procedura, la si pu richiamare ovunque allinterno del programma (o
dallinterfaccia grafica), semplicemente scrivendone il nome.

28
Materiali e metodi
In NetLogo, il mondo (world) composto da una superficie a due dimensioni di forma toroidale
(Figura 10), mentre leffettiva visualizzazione quando si utilizza il programma appare come
un semplice quadrato in cui i bordi superiore e inferiore sono collegati, e cos i bordi laterali.
Questa superficie suddivisa da una griglia, che forma le patches, su cui gli agenti (che nel
nostro caso sono i microrganismi) si muovono, interagendo sia tra di loro, che con lambiente.

Figura 10: forma toroidale del mondo NetLogo

9 Panoramica del modello


Quello che ricerchiamo in questo studio sono le condizioni che favoriscono la divisione del
lavoro allinterno di una popolazione batterica che inizialmente autonoma, ovvero i micror-
ganismi non hanno alcun tipo di dipendenza verso gli altri, e producono da soli tutto ci che
gli occorre per crescere e replicarsi.
Il metabolismo disegnato per simulare microrganismi che si nutrono e si replicano estrema-
mente semplificato: dal glucosio assorbito si ottengono essenzialmente tre prodotti, chiamati
ATP, A e B, necessari per sintetizzare biomassa. Ogni volta che il valore della biomassa rad-
doppia, la cellula si divide, producendo unaltra cellula che pu variare lievemente il peso delle
due vie metaboliche che producono i metaboliti A e B. Dopo molte generazioni si pu stabilire
un rapporto di dipendenza tra individui che si sono specializzati nella produzione di un solo
metabolita e hanno smesso di produrre laltro, potendo trovare questultimo dallambiente
extracellulare.

29
Nel modello, i microrganismi non presentano plasticit fenotipica, quindi il nuovo set dei pesi
delle variabili di un agente, assegnata durante la replicazione, rispetto alle condizioni ambien-
tali in cui si trovano, determiner lidoneit dellagente a vivere in quellambiente. Una cellula
figlia avr valori di certe variabili lievemente differenti rispetto alla cellula madre, i quali reste-
ranno costanti fino alla loro morte. Se la loro combinazione risulter favorevole allambiente
in cui si trova, lindividuo vivr pi a lungo e si replicher pi volte, confermando nella popo-
lazione la sua migliore condizione.

10 Assunzioni
Le quantit utilizzate nel modello sono valori fittizi e non rappresentano delle concentrazioni,
poich il volume delle patches in cui le cellule crescono adimensionale, cos come il volume
delle cellule. Quando la cellula scambia molecole con lambiente, la quantit di materia che
viene spostata identica sia nella sottrazione al sito da cui viene spostata, sia alladdizione al
sito in cui viene spostata.
Tali quantit potrebbero essere comparabili a delle concentrazioni solamente assumendo che
il volume della patch che contiene la cellula sia uguale al doppio del volume della cellula, in
modo che lo spostamento di materia da un compartimento allaltro determini la medesima
variazione di concentrazione. Di conseguenza, si dovrebbe anche assumere che man mano le
cellule crescono non aumentino il loro volume.
Perci, pi semplice considerare queste quantit come fittizie e non come delle concentra-
zioni.

11 Ambiente
Alcune patches allinterno del mondo sono impostate per erogare costantemente glucosio,
che diffonde su tutta la superficie del modello (Figura 11). Sia il numero di patches designate
per erogare glucosio, sia la quantit erogata ad ogni tick, sono valori arbitrari, mentre la posi-
zione che assumono nel mondo casuale, sebbene lutente abbia la facolt di impostare a suo
piacimento la loro posizione. Nel nostro modello il numero di fonti di glucosio e la quantit
che erogano sono mantenute fisse durante tutte le simulazioni eseguite: ogni volta che il mo-
dello caricato, il programma sceglie casualmente dove allocare 50 erogatori di glucosio, che
ad ogni tick erogheranno 0.5 glucosio (ricordando che i valori non sono concentrazioni, ma

30
valori fittizi scelti arbitrariamente).
La diffusione del glucosio tra le patches unaltra variabile impostabile dallutente. Nel nostro
studio, la diffusione del glucosio stata campionata, per scoprire leffetto che la maggiore o
minore diffusione del glucosio pu avere sullevoluzione della specializzazione.

Figura 11: esempio di una simulazione dove la patch posta al centro una sorgente da cui diffonde il glucosio.

Oltre al glucosio, nellambiente diffondo anche due metaboliti prodotti e secreti dalle cellule,
e che mai sono forniti dallesterno. Questi due metaboliti, che chiamiamo per semplicit A e
B, possono essere intesi come qualunque metabolita primario di cui una cellula necessita per
crescere. Per semplicit possiamo assumere si tratti di due amminoacidi.
Quando glucosio, A e B si trovano allinterno della cellula sono etichettati col suffisso _in,
viceversa, _out quando si considerano le quantit esterne.

Per permettere ai nutrienti di diffondere tra le patches, si utilizza la variabile Diffuse, una pri-
mitiva preesistente in NetLogo, che comanda a ciascuna patch di suddividere e diffondere la
stessa quantit nelle 8 patches confinanti.
In questo esempio, 0.2 indica che solo il 20% della quantit contenuta in una patch sar sud-
divisa e diffusa (si dovrebbero utilizzare valori compresi tra 0 e 1).

31
12 Setup

Setup si occupa di impostare il sistema al t0, secondo le impostazioni definite dallutente.


Quando il modello caricato, nellambiente presente una minima quantit di glucosio, ne-
cessario affinch le cellule che ad inizio simulazione sono collocate molto distante dagli
erogatori di glucosio non muoiano subito, ma abbiano la possibilit di posizionarsi nei din-
torni degli erogatori.
Le quantit iniziali di A e B sono impostate a 0. I loro livelli variano solo a causa dei micror-
ganismi che li producono e li consumano.

32
13 Procedure
Levoluzione temporale in NetLogo scandita dalle ticks, nelle quali sono eseguite tutte le
procedure che riguardano gli individui e lambiente, e le interazioni tra di loro.
Le procedure che abbiamo prodotto hanno il fine di simulare un metabolismo batterico, che
permettano ai microrganismi di muoversi nellambiente alla ricerca di cibo, utilizzandolo per
sopravvivere e crescere (Figura 12). La lista di procedure lanciate in sequenza ad ogni tick
sono:

- Uptake del glucosio


- Produzione di ATP
- Produzione dei due metaboliti primari
- Scambio di metaboliti con lambiente
- Sintesi di nuova biomassa
- Replicazione
- Costi di mantenimento

33
Figura 12: rappresentazione grafica dei possibili fenotipi che i microrganismi possono assumere nel modello.
(A) Esempio di cellule non cooperative. Il modello al t0 contiene solo questo tipo di cellule, che producono da
s tutti i metaboliti di cui necessitano per crescere. (B) Due cellule cooperative che possono emergere dopo il
sistema evoluto a sufficienza. Queste cellule possono produrre solo uno dei due metaboliti necessari alla cre-
scita, e devono necessariamente assorbire laltro dallambiente.

34
13.1 Uptake glucosio
Lassorbimento del glucosio nel modello, avviene solo tramite diffusione passiva, che dunque
pu essere assorbito solo quando nella cellula c meno glucosio rispetto allambiente. La
quantit di glucosio che dallambiente passa al citoplasma dipende sia dalla quantit esterna,
sia dalla quantit interna, quindi se due cellule avranno a disposizione la stessa quantit di
glucosio esterno, ma una ha pi glucosio intracellulare, questultima ne assorbir meno ri-
spetto alla prima.
Se tra ambiente e citoplasma vi una grande differenza nella quantit di glucosio, e quindi
potenzialmente sarebbe necessario trasportarne una grande quantit per raggiungere lequili-
brio, per evitare che questo avvenga -e il modello assuma sfumature irrealistiche-, la funzione
utilizzata non lineare, il che permette di avere un valore massimo di glucosio trasportabile
ad ogni tick.
Nel modello, tale soglia impostata per essere uguale a 0.3.
Inoltre, una volta che il glucosio entrato nella cellula, non potr pi uscire.

Il grafico della funzione mostrato in Figura 13.

Figura 13: Rappresentazione grafica della funzione utilizzata per luptake del glucosio.

35
Nel caso in cui la quantit di glucosio extracellulare sia inferiore a quella intracellulare, e quindi
la cellula non potr assorbire glucosio, si muover altrove per cercare condizioni migliori.
La procedura Muoviti utilizzata per far muovere la cellula descritta successivamente.

13.2 Produzione ATP

Nel modello, la variabile ATP gestisce la sopravvivenza della cellula, e nel caso in cui siano
presenti tutti i metaboliti necessari alla crescita, LATP sar utilizzato anche per sintetizzare
biomassa.
Le condizioni necessarie perch questa reazione abbia luogo, sono che nella cellula sia pre-
sente del glucosio substrato, e che la quantit di ATP disponibile sia inferiore alla quantit di
metaboliti A e B presenti nella cellula, o comunque inferiore ad una soglia fissata arbitraria-
mente. Il valore di questa soglia 0.5, e la massima quantit di glucosio trasformabile in ATP
ad ogni tick impostato per essere di 0.1.
Non in tutte le tick si avr produzione di ATP, specie quando non sono presenti sia A che B
e quindi la cellula non sta crescendo. Quando invece cresce, il pathway sar molto attivo.
La soglia minima di ATP (0.5) serve affinch la cellula abbia possibilit di sopravvivere anche
quando si trova in regioni del modello in cui presente poco glucosio. Come gi detto nella
procedura precedente per luptake di glucosio, quando la quantit di glucosio presente nellam-
biente inferiore a quella cellulare, la cellula si muover per cercare migliori condizioni,
clausola che diventa inutile se non ha una riserva di ATP che gli permetta di sfuggire a regioni
povere di glucosio.
Ovviamente, se le condizioni di starving si protraggono a lungo, la cellula destinata a morire,
ovvero a sparire dal modello.

36
Il grafico della funzione non lineare, come mostrato in Figura 14.

Figura 14: Rappresentazione grafica della funzione utilizzata per la reazione Glucosio_in ATP.

13.3 Produzione dei due metaboliti primari


Dopo aver prodotto lATP necessario per sopravvivere, il glucosio rimanente utilizzato per
produrre i due metaboliti necessari alla crescita. Perci, una cellula prima pensa a sopravvivere,
e poi a crescere. La sintesi di questi ipotetici metaboliti descritta da una singola reazione per
ciascun metabolita, anche se generalmente le vie metaboliche reali sono composte da un nu-
mero maggiore di reazioni.

Nel caso in cui i calcoli dovessero produrre valori dei prodotti che risultino superiori alla reale
quantit di glucosio disponibile, un parametro correttore aggiusta tali valori affinch solo lef-
fettiva quantit di glucosio disponibile sia consumato.

Lunica condizione necessaria affinch i due metaboliti siano prodotti che nella cellula sia
presente glucosio. Le reazioni non subiscono dunque inibizione da prodotto.
Landamento della funzione il medesimo della procedura che sintetizza lATP (Figura 14).

37
Le due reazioni sono pesate con due parametri, pathway_Glucosio2A e pathway_Glucosio2B, pa-
rametri genetici che sono variati durante la replicazione e assumono valori compresi tra 0 e 1.
La loro somma sempre uguale a 1, e sono perci complementari: quando uno aumenta,
laltro diminuisce. Questo perch si assume che i metabolismi lavorino sempre al massimo
delle loro possibilit, per cui, se il peso di un pathway diminuisce, laltro aumenter.

Allinizio della simulazione le cellule avranno entrambi i parametri pathway_Glucosio2A e


pathway_Glucosio2B impostati a 0.5, che indicano autonomia di crescita e bilanciamento del
metabolismo. Durante le generazioni questi potranno variare, arrivando, nel caso di cellule
specializzate, ad assumere anche valori di 0 e 1, che indicano che la completa dismissione di
un pathway e la specializzazione del microrganismo nella produzione di un solo metabolita.

13.4 Scambio di metaboliti con lesterno


La procedura permette alle cellule con un eccesso di metaboliti, di espellerli allesterno.
Cellule non cooperative, che cio hanno valori dei pathway A e B simili, espelleranno meno
metaboliti, perch essendo le loro quantit intracellulari simili, saranno principalmente consu-
mati per produrre biomassa.
Cellule con pesi sbilanciati dei pathway produrranno un metabolita pi dellaltro, che accu-
mulandosi sar secreto, mentre quello in difetto, se presente nellambiente, sar assorbito
(ovviamente dopo essere stato secreto da unaltra cellula che produce in eccesso tale metabo-
lita) ed entrambi utilizzati per sintetizzare biomassa.

Come nella procedura di uptake del glucosio, anche gli scambi di questi metaboliti avvengono
per diffusione passiva verso gradiente, bench in questa procedura i metaboliti possono sia
entrare che uscire dalle cellule.

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Come si legge nel testo della procedura, a differenza delle precedenti, qui il valore massimo
della reazione riportato con la variabile DiffMax, questo perch la quantit che pu essere
diffusa dalle cellule ad ogni tick stata oggetto di analisi.
Dallinterfaccia di NetLogo, lutente ha la possibilit di creare una serie di tasti, slider, monitor
personalizzati, necessari a facilitare linterazione dellutente con il proprio modello (vedi In-
troduzione). Creando questa variabile e uno slider ad essa associato, dallinterfaccia si potr
variare il valore di questa variabile, e dunque la permeabilit massima delle membrane, senza
avere bisogno di ritoccare il codice ogni volta che se ne sente la necessit.

13.5 Sintesi di biomassa


La crescita della cellula avviene linearmente in funzione del metabolita limitante tra A e B. Le
condizioni necessarie affinch la cellula cresca sono che la cellula non abbia gi raggiunto il
valore massimo della variabile Biomassa, che impostato per essere uguale a 2. Inoltre, deve
esserci una quantit di ATP che sia superiore alla quantit almeno uno tra A e B. Questa
condizione serve ad evitare che il metabolita limitante possa essere lATP, e quindi che la
crescita possa consumare ATP ad un ritmo maggiore di quanto venga effettivamente pro-
dotto, provocando la morte della cellula.

La procedura confronta i valori di A e B presenti nella cellula e determina il limitante. Una


frazione di questo metabolita (corrispondente alla variabile %Biomassa) calcolata per essere
la quantit di nuova biomassa sintetizzata, che verr aggiunta alla biomassa gi sintetizzata in
precedenza. La sintesi di biomassa necessita che uguali quantit di ATP, A e B siano convertite
simultaneamente per produrre una uguale quantit di biomassa.
La reazione : ATP + A + B Biomassa

Per raddoppiare la biomassa sono necessari una quantit di ATP, una di A e una di B.

39
13.6 Replicazione
Quando la variabile biomassa raggiunge il valore 2 (quindi la dimensione della cellula rad-
doppiata), la cellula si replica, dividendo i propri metaboliti tra cellula madre e figlia.
La cellula figlia si sposter in una delle patches adiacenti che siano libere, scelta in maniera
casuale. Nel caso in cui nessuna delle 8 patches adiacenti siano libere, si attiva una procedura,
definita di scansamento, che permette alla cellula figlia di posizionarsi in una delle patches
vicine alla madre, e nel contempo scansare in unaltra patch adiacente la cellula di cui sta
prendendo il posto. Nello scenario in cui la cellula che stata scansata si trovi a sua volta nella
situazione in cui nessuna delle 8 patches adiacente risulti libera, questa scanser a sua volta
una delle cellule vicine in unaltra patch libera, e cos via fino a che ogni patch contenga solo
una cellula. Questa procedura (descritta successivamente), una delle pi onerose dal punto
di vista computazionale, specialmente quando ci sono tante cellule nel sistema, e si trovano
ammassate a formare una colonia.

Ad ogni replicazione cellulare, il modello considera leventualit che una mutazione possa
compromettere la funzionalit di uno, o entrambi i pathway (pathway_Glucosio2A e path-
way_Glucosio2B).
Leventualit che ci accada lasciata al caso: si genera un numero casuale allinterno di un
intervallo definito dallutente, e se il valore risultante lo stesso necessario a rendere vera la
condizione che permette di far avvenire la mutazione, allora il pathway sar disattivato. Mag-
giore lintervallo nel quale il numero casuale generato, e minore la probabilit che il
pathway sia disattivato.
Nel modello, lintervallo in cui il numero random generato compreso tra 1 e 10000, e solo
quando generato il valore 1 il pathway viene disattivato.
Quando un pathway disattivato, il suo valore diventa 0, mentre il valore dellaltro pathway
diviene uguale a 1.

40
Se la cellula perde entrambi i pathway, e quindi smette di produrre entrambi i metaboliti A e
B, nel nostro modello assume la qualifica di cheater.

Nelle simulazioni utilizzate per studiare le condizioni che favoriscono la divisione del lavoro
tra le cellule, non ho attivato la possibilit di perdere un pathway per via di una mutazione
casuale, e le cellule che si sono specializzate lo hanno fatto solo attraverso la variazione dei
parametri genetici, generazione dopo generazione. comunque una potenziale caratteristica
potenzialmente attivabile.

Le variabili che identificano se un pathway attivo o inattivo (pathway_A e pathway_B) pos-


sono assumere solo i valori booleani true|false (1|0), e solo quando entrambe sono vere, una
cellula pu variare geneticamente i valori dei due pathway durante le generazioni. Cellule che
hanno perso la funzionalit di almeno un pathway manterranno tali valori per il resto della
simulazione.
Non possedendo plasticit fenotipica, queste variazioni sono le uniche che permettono al si-
stema di evolvere, e alle cellule pi idonee di vivere pi a lungo rispetto a quelle meno idonee,
replicandosi anche pi volte.

41
13.7 Muoviti
Allinterno di alcune procedure richiesto alle cellule di muoversi da una patch allaltra, nel
caso sussistano, o eventualmente manchino, certe condizioni. Ad esempio, nella procedura
Uptake_Glucosio si richiede che le cellule si muovano se si trovano in un ambiente carente di
glucosio. Oppure, quando una cellula si replica, dato che in una patch si deciso possa essere
presente solo una cellula. La cellula figlia, che il programma crea nella stessa patch della cellula
madre, subito dopo la sua creazione sar spostata in una delle patch adiacenti.
Inoltre, se associata ad un generatore di numeri random, pu essere utilizzata per simulare e
regolare la motilit delle cellule nellambiente.
Tutte queste necessit sono sbrigate da questa procedura che abbiamo chiamato Muoviti.

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Nel caso in cui la cellula a cui richiesto di muoversi in una patch adiacente disponga di una
patch vicina non occupata, semplicemente vi si sposter. Nel caso in cui tutte le patch adia-
centi siano occupate, si attiver una sottoprocedura che scanser loccupante della patch scelta
casualmente in unaltra patch, lasciando libera la patch per il nuovo occupante. Comunque, la
procedura preferenzialmente sposta la cellula che si deve muovere verso una patch libera.

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13.8 Costi di mantenimento
Sono stati inseriti dei costi in ATP che la cellula deve pagare ad ogni tick, sulla base dei valori
dei pathway che producono i metaboliti A e B. I costi sono pagati esclusivamente dalle varia-
bili di questi due pathway perch sono le sole che evolvono, mentre tutti gli altri parametri
sono costanti.

14 BehaviorSpace
Allinterno di NetLogo sono presenti vari strumenti che permettono al software di aumentare
le proprie potenzialit, fornendo la possibilit di automatizzare le simulazioni e il campiona-
mento dello spazio delle fasi del modello sotto studio.
Dato che il campionamento dei parametri che si ritengono interessanti produce velocemente
un grande numero di combinazioni, lutilizzo di questo strumento alleggerisce enormemente
questa tappa obbligata.
BehaviorSpace permette di variare sistematicamente i valori dei parametri che lutente ritiene
necessario campionare per esplorare lo spazio delle fasi del modello. Come si vede in Figura
15, nella parte superiore della finestra di impostazione si specificano quali sono i parametri
che si desidera campionare, inserendo gli specifici valori, o un intervallo con il relativo incre-
mento. Si pu scegliere quante volte ripetere uno specifico esperimento, e quali output si
desidera siano salvati per le successive analisi.
Lutente pu anche decidere se salvare i dati relativi alla simulazione conclusa, o salvare i dati
di ogni tick.

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Figura 15: finestra di impostazione di BehaviorSpace

Ogni volta che una simulazione termina, il file in cui sono salvati tutti i dati relativi alle simu-
lazioni aggiornato, e una nuova simulazione inizia automaticamente.
BehaviorSpace uno strumento molto utile, dato che il numero delle combinazioni dei para-
metri che si pu voler campionare, pu raggiungere velocemente lordine delle migliaia. Ad
esempio, lesperimento impostato in Figura 15 impostato per lanciare 1215 simulazioni, di
cui 243 combinazioni, e 5 repliche di ciascuna.

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Risultati
Nella modellistica agent-based, ciascun agente presente nel sistema si comporta secondo pro-
pri criteri (parametri), sia nellinterazione con lambiente (le patches), sia con gli altri individui.
Questo metodo di modellazione richiede che siano date delle istruzioni su come le interazioni
debbano avvenire, da cui, attraverso levoluzione temporale del sistema dettata dalle ticks, si
possono vedere emergere comportamenti collettivi dettati dallinterazioni tra tutti gli individui
e il loro ambiente.
Nel nostro caso, questo si traduce nel creare microrganismi aventi un metabolismo che si
compone di numerose parti, formalizzate tramite procedure (vedi Materiali e metodi). Ad ogni
tick queste procedure sono reiterate, simulando un periodo temporale.
Di generazione in generazione i valori di certi parametri cellulari sono impostati per variare
lievemente, e, date le condizioni ambientali in cui le cellule si trovano a crescere, queste varia-
zioni potranno rendere il microrganismo pi o meno idoneo a crescere e riprodursi.
Lasciando evolvere il sistema abbastanza a lungo si potr capire se tali condizioni sono favo-
revoli o meno alla specializzazione cellulare.
Il modello descritto nel capitolo Materiali e Metodi stato disegnato per simulare e studiare
la specializzazione batterica in un contesto il pi generalizzato possibile, quindi non conside-
rando fattori come il quorum sensing o la formazione di biofilm.
I parametri che inizialmente si ipotizzato potessero essere rilevanti in questo studio sono:

Motilit cellulare: inteso come la probabilit che ad ogni tick una cellula possa muo-
versi liberamente nellambiente tramite movimento attivo. I valori campionati sono
1/1, 1/30, 1/100, dove 1/1 permette alle cellule di muoversi ad ogni tick, e 1/100
permette il movimento mediamente una volta ogni cento tick.
Diffusione del glucosio: questo un parametro ambientale. Nellambiente ci sono
patches che fungono da fonti di glucosio. Dopo essere stato erogato, diffonde
nellambiente circostante. I valori di diffusione campionati sono 0.1, 0.3, 0.5 0.8, 1,
dove 1 permette al glucosio di diffondere molto velocemente nellambiente. Al con-
trario, 0.1 indica che ad ogni tick solo il 10% del glucosio presente in una patch sar
diffuso nelle patch vicine, e ci vorr molto pi tempo perch il glucosio nel sistema
raggiunga lequilibrio.

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Diffusione dei metaboliti primari A e B: quando una cellula rilascia un metabolita
nellambiente, questo pu diffondere tra le patches a una determinata velocit. I valori
campionati sono 0.1, 0.3, 0.5 0.8, 1.
Velocit massima di produzione di biomassa: questo parametro rappresenta la
velocit con cui la biomassa sintetizzata. Il modello considera quale dei metaboliti
necessari a crescere limitante in quel momento, e crescer in funzione di questo
metabolita. Lintervallo compreso tra 0 e 1, dove 1 fa s che la cellula utilizzer il
100% del metabolita limitante per sintetizzare biomassa, mentre 0.8 e 0.5 indicano
rispettivamente che la cellula utilizzer l80% o il 50% del metabolita limitante per
crescere. I valori campionati sono 0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.
Soglia massima per lo scambio dei metaboliti tra il citoplasma e lambiente
esterno: questo parametro indica la quantit massima di metaboliti che una cellula
pu scambiare con lambiente ad ogni tick. Sono stati campionati i valori 0.001, 0.01,
0.1, dove minore il valore di questo parametro, e minore sar la quantit massima
di metaboliti che la cellula rilascer nellambiente, ma allo stesso tempo anche la
quantit massima di metaboliti che potr assorbire dallesterno.

Saranno campionate tutte le combinazioni di questi cinque parametri, che portano ad una
combinazione di parametri di 1125 combinazioni (3 * 5 * 5 * 5 * 3).
La scelta di considerare questi cinque parametri e non altri arbitraria. Si sarebbero potuti
considerare molti pi parametri, ma la mole di combinazioni da testare sarebbe cresciuta enor-
memente, e anche lanalisi dei dati, che sebbene qualitativa, sarebbe diventata molto pi
complessa.
Le simulazioni sono sempre inizializzate con un gruppo di cellule non cooperative, ovvero
che crescono autonomamente, che vanno a piazzarsi nel sistema in maniera casuale, e che, di
generazione in generazione, possono variare il peso dei pathway che producono i due meta-
boliti primari necessari alla crescita.
Gli output che si ottengono alla fine di ogni simulazione saranno il numero di cellule auto-
nome e di cellule che si sono specializzate nella produzione di un solo metabolita.
Lanalisi di tutte le combinazioni dei parametri che abbiamo considerato essere potenzial-
mente rilevanti per linstaurarsi della divisione del lavoro dovrebbe consigliarci su quali sono
le condizioni che la favoriscono, e quali quelle che la sfavoriscono.

47
15 Inizializzazione del modello
Dopo aver impostato e caricato il modello, la visuale che appare simile a quella riportata in
Figura 16, in cui si vedono dei quadrati neri, che sono le fonti da cui erogato il glucosio, e
dei cerchi viola che rappresentano le cellule autonome con i pathway per i metaboliti A e B
aventi valori di 0.5.

Figura 16: esempio della visuale del modello a t0

Dopo un certo numero di generazioni, se le condizioni con cui il sistema stato lanciato sono
favorevoli, si vedranno apparire cellule specializzate, rappresentate coi colori verde e marrone
(Figura 17), oppure possono persistere le cellule autonome con colore viola (Figura 18).

48
Figura 17: Esempio della visuale del modello in cui cellule autonome si sono specializzate.

In particolare, le cellule verdi producono il metabolita A, che colora la patch in azzurro se A


presente tre volte pi di B, e le cellule marroni producono il metabolita B, che colora la
patch in giallo, se B presente tre volte pi di A. Quando A e B sono presenti in quantit
paragonabili, il colore della patch appare verde.

49
Figura 18: Quando le condizioni sono sfavorevoli alla specializzazione, persistono i microrganismi con fenotipo
autonomo, di colore viola. Si nota come a differenza della situazione in cui le cellule si specializzano, le cellule
autonome rilasciano piccolissime quantit dei metaboliti A e B che producono, e pertanto il colore delle patch
risulta in un verde leggerissimo.

Il colore che assumono le cellule dunque determinato dai valori dei pesi dei pathway path-
way_Glucosio2A e pathway_Glucosio2B. Si deciso di considerare come specializzate che
avessero il valore di uno dei due pathway superiore a 0.8, e visto che la somma dei due pathway
sempre uguale a 1, il valore dellaltro pathway, in una cellula specializzata sar inferiore a 0.2.
Perci, una cellula considerata non specializzata se i valori di entrambi i suoi pathway sono
compresi tra 0.2 e 0.8.
Mentre la simulazione attiva, oltre al colore che assumono i microrganismi, si pu osservare
la specializzazione attraverso un istogramma, come mostrato in Figura 19 e Figura 20.

50
Figura 19: Istogramma che pone sullasse delle ascisse il valore del peso del pathway, il cui valore va da 0 a 1, e
sullasse delle ordinate il relativo numero di microrganismi con quel fenotipo. Essendo i due pathway comple-
mentari, listogramma relativo al peso del pathway_Glucosio2B sar complementare a questo.

Figura 20: Similmente a Figura 19, listogramma rappresenta la distribuzione dei fenotipi, in questo caso listo-
gramma di un fenotipo cooperativo in cui i microrganismi hanno diviso il lavoro di produzione dei metaboliti A
e B tra loro. Il raggruppamento a sinistra indica dei microrganismi che hanno smesso di produrre il metabolita
A, a destra le cellule che producono solo il metabolita A.

16 Primi campionamenti dello spazio delle fasi del modello


La prima analisi del modello servita principalmente per capire se i valori di alcuni dei cinque
parametri considerati potessero essere rese costanti, o comunque diminuire lintervallo entro
cui sono stati arbitrariamente parametrizzati.
Per fare ci, dopo aver lanciato tutte le simulazioni con tutte le varie combinazioni dei diversi
parametri considerati, si impostato NetLogo perch raccogliesse tutti i dati come mostrato
in Tabella 1, in cui ci sono tante righe quanti sono gli esperimenti fatti, e tante colonne quanti
sono i parametri campionati e gli output relativi alla simulazione. Ovviamente, Tabella 1 mo-
stra solo una piccola porzione del database prodotto, il cui numero di righe molto pi esteso.
Come si vede, difficile estrapolare informazioni da dati organizzati in questa maniera. Perci,
con lausilio delle tabelle pivot, questi dati saranno organizzati in maniera da poter fare unana-
lisi qualitativa dello spazio delle fasi del sistema, e trovare degli schemi generali che ci indichino
le condizioni che favoriscono la specializzazione (Tabella 2).

51
Tabella 1
[runnumber] diffusioneCellule %Biomassa diffusioneG diffusione DiffMax Autonome ProduttorimetabolitaB ProduttorimetabolitaA Totalecellule
1 0 0.5 0.2 0.2 0.001 612 0 0 612
2 0 0.5 0.2 0.2 0.01 558 0 77 635
3 0 0.5 0.2 0.2 0.1 0 371 391 762
4 0 0.5 0.2 0.5 0.001 643 0 0 643
5 0 0.5 0.2 0.5 0.01 336 273 75 684
6 0 0.5 0.2 0.5 0.1 0 413 384 797
7 0 0.5 0.2 0.8 0.001 564 0 0 564
8 0 0.5 0.2 0.8 0.01 538 76 0 614
9 0 0.5 0.2 0.8 0.1 0 362 412 774
10 0 0.5 0.2 1 0.001 614 0 0 614
11 0 0.5 0.2 1 0.01 0 427 310 737
12 0 0.5 0.2 1 0.1 0 372 386 758
13 0 0.5 0.5 0.2 0.001 687 1 3 691
14 0 0.5 0.5 0.2 0.01 585 42 35 662
15 0 0.5 0.5 0.2 0.1 0 485 465 950
16 0 0.5 0.5 0.5 0.001 709 2 0 711
17 0 0.5 0.5 0.5 0.01 373 41 320 734
18 0 0.5 0.5 0.5 0.1 0 501 462 963
19 0 0.5 0.5 0.8 0.001 710 2 3 715
20 0 0.5 0.5 0.8 0.01 170 291 322 783
21 0 0.5 0.5 0.8 0.1 0 496 426 922
22 0 0.5 0.5 1 0.001 700 0 1 701
23 0 0.5 0.5 1 0.01 652 6 10 668
24 0 0.5 0.5 1 0.1 0 399 447 846
25 0 0.5 0.8 0.2 0.001 732 23 16 771
26 0 0.5 0.8 0.2 0.01 0 459 451 910
27 0 0.5 0.8 0.2 0.1 0 459 521 980
28 0 0.5 0.8 0.5 0.001 718 20 25 763
29 0 0.5 0.8 0.5 0.01 142 362 284 788
30 0 0.5 0.8 0.5 0.1 0 495 496 991
31 0 0.5 0.8 0.8 0.001 773 0 0 773
32 0 0.5 0.8 0.8 0.01 0 426 457 883
33 0 0.5 0.8 0.8 0.1 0 494 554 1048
34 0 0.5 0.8 1 0.001 776 0 0 776
35 0 0.5 0.8 1 0.01 80 321 367 768
36 0 0.5 0.8 1 0.1 0 475 490 965
37 0 0.5 1 0.2 0.001 759 0 2 761
38 0 0.5 1 0.2 0.01 723 10 20 753
39 0 0.5 1 0.2 0.1 0 538 551 1089
40 0 0.5 1 0.5 0.001 788 15 10 813
41 0 0.5 1 0.5 0.01 0 580 277 857
42 0 0.5 1 0.5 0.1 0 507 625 1132
43 0 0.5 1 0.8 0.001 643 76 77 796
44 0 0.5 1 0.8 0.01 0 568 325 893
45 0 0.5 1 0.8 0.1 0 551 569 1120
46 0 0.5 1 1 0.001 693 32 104 829
47 0 0.5 1 1 0.01 650 50 64 764
48 0 0.5 1 1 0.1 0 556 503 1059
49 10 0.5 0.2 0.2 0.001 582 0 0 582
50 10 0.5 0.2 0.2 0.01 594 0 0 594
51 10 0.5 0.2 0.2 0.1 554 0 0 554
52 10 0.5 0.2 0.5 0.001 619 0 0 619
53 10 0.5 0.2 0.5 0.01 576 0 0 576
54 10 0.5 0.2 0.5 0.1 169 200 214 583
55 10 0.5 0.2 0.8 0.001 611 0 0 611
56 10 0.5 0.2 0.8 0.01 561 0 0 561
57 10 0.5 0.2 0.8 0.1 0 249 349 598
58 10 0.5 0.2 1 0.001 575 0 0 575
59 10 0.5 0.2 1 0.01 571 0 0 571
60 10 0.5 0.2 1 0.1 0 299 297 596
61 10 0.5 0.5 0.2 0.001 664 0 0 664
62 10 0.5 0.5 0.2 0.01 642 0 0 642
63 10 0.5 0.5 0.2 0.1 596 17 18 631
64 10 0.5 0.5 0.5 0.001 633 0 0 633
65 10 0.5 0.5 0.5 0.01 634 0 0 634
66 10 0.5 0.5 0.5 0.1 0 349 393 742
67 10 0.5 0.5 0.8 0.001 653 0 0 653
68 10 0.5 0.5 0.8 0.01 613 0 0 613
69 10 0.5 0.5 0.8 0.1 0 300 439 739
70 10 0.5 0.5 1 0.001 670 0 0 670

Tabella 1: una porzione del database creato dal campionamento delle cinque variabili.

52
Tabella 2
Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate
0.001 0.01 0.1
0 0 0
0.2 0.2 0.2
0.5 0.5 0.5
0.2 612 0 0.2 558 77 0.2 0 762
0.5 687 4 0.5 585 77 0.5 0 950
0.8 732 39 0.8 0 910 0.8 0 980
1 759 2 1 723 30 1 0 1089
0.5 0.5 0.5
0.5 0.5 0.5
0.2 643 0 0.2 336 348 0.2 0 797
0.5 709 2 0.5 373 361 0.5 0 963
0.8 718 45 0.8 142 646 0.8 0 991
1 788 25 1 0 857 1 0 1132
0.8 0.8 0.8
0.5 0.5 0.5
0.2 564 0 0.2 538 76 0.2 0 774
0.5 710 5 0.5 170 613 0.5 0 922
0.8 773 0 0.8 0 883 0.8 0 1048
1 643 153 1 0 893 1 0 1120
1 1 1
0.5 0.5 0.5
0.2 614 0 0.2 0 737 0.2 0 758
0.5 700 1 0.5 652 16 0.5 0 846
0.8 776 0 0.8 80 688 0.8 0 965
1 693 136 1 650 114 1 0 1059
10 10 10
0.2 0.2 0.2
0.5 0.5 0.5
0.2 582 0 0.2 594 0 0.2 554 0
0.5 664 0 0.5 642 0 0.5 596 35
0.8 705 0 0.8 701 0 0.8 149 606
1 706 0 1 698 0 1 0 851
0.5 0.5 0.5
0.5 0.5 0.5
0.2 619 0 0.2 576 0 0.2 169 414
0.5 633 0 0.5 634 0 0.5 0 742
0.8 637 0 0.8 683 0 0.8 0 824
1 720 0 1 702 0 1 0 834
0.8 0.8 0.8
0.5 0.5 0.5
0.2 611 0 0.2 561 0 0.2 0 598
0.5 653 0 0.5 613 0 0.5 0 739
0.8 706 0 0.8 643 0 0.8 0 783
1 714 0 1 694 0 1 0 766
1 1 1
0.5 0.5 0.5
0.2 575 0 0.2 571 0 0.2 0 596
0.5 670 0 0.5 637 0 0.5 0 642
0.8 705 0 0.8 624 0 0.8 0 807
1 724 0 1 700 0 1 0 854
100 100 100
0.2 0.2 0.2
0.5 0.5 0.5
0.2 564 0 0.2 558 0 0.2 559 0
0.5 630 0 0.5 600 0 0.5 538 34
0.8 694 0 0.8 683 0 0.8 624 40
1 732 0 1 704 0 1 635 62
0.5 0.5 0.5
0.5 0.5 0.5
0.2 551 0 0.2 555 0 0.2 499 31
0.5 624 0 0.5 599 0 0.5 438 151
0.8 674 0 0.8 651 0 0.8 350 316
1 736 0 1 693 0 1 276 466
0.8 0.8 0.8
0.5 0.5 0.5
0.2 589 0 0.2 550 0 0.2 358 156
0.5 617 0 0.5 603 0 0.5 87 575
0.8 662 0 0.8 648 0 0.8 72 606
1 682 0 1 707 0 1 38 715
1 1 1
0.5 0.5 0.5
0.2 570 0 0.2 550 0 0.2 249 301
0.5 631 0 0.5 571 0 0.5 39 622
0.8 682 0 0.8 607 0 0.8 12 668
1 719 0 1 661 0 1 57 651

Tabella 2: riorganizzazione dei dati di Tabella 1 ottenuti usando una tabella pivot. Per alleggerire la visione, in
questo tabella si riportano solo i dati in cui la variabile Biomassa fissata a 0.5.
Legenda:
Sogliamassimadiffusionedimetabolititracitoplasmaeambiente
Motilitcellulare
Diffusionedelglucosio
DiffusionedeimetabolitiprimariAeB
Velocitmassimadiproduzionedibiomassa

53
Dopo aver riorganizzato i dati grezzi di Tabella 1 in una tabella pivot (Tabella 2), e colorando
opportunamente in funzione del numero di cellule, dove rosso indica un numero basso e
verde un numero alto, con relative graduazioni di colore, appare subito evidente che quando
il parametro soglia massima di diffusione di metaboliti tra citoplasma e ambiente ha un
valore di 0.001, la divisione del lavoro sempre sfavorita, a prescindere dai valori di qualunque
altra variabile.
Per valori di diffusione citoplasma/ambiente pi alti, si ha che la variazione dei valori degli
altri parametri inizia ad incidere sul comportamento. Specialmente, la variazione del parame-
tro motilit cellulare appare essere significativa: maggiore il movimento delle cellule e pi
risulta essere favorita la divisione del lavoro.

Una ulteriore semplificazione dei dati della Tabella 2 si pu ottenere rinunciando a visualizzare
la variabile diffusione del glucosio. In Tabella 3, ora appare ancora pi evidente come la
soglia di diffusione dei metaboliti tra il citoplasma e lambiente incida sulla divisione del lavoro.
Questo risultato non sorprende, dato che un limitato scambio di metaboliti tra il citoplasma e
lambiente ovviamente previene linstaurarsi di un comportamento in cui il fine proprio lo
scambio di metaboliti.
per utile come esempio, per mostrare come grazie alla modellazione agent-based, da una
serie di relativamente limitata di istruzioni, possano emergere comportamenti collettivi che
sono superiori alla somma delle istruzioni date, e che sono dati dallinterazione di tutti gli
individui presenti nel sistema.

Tabella 3
Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate
0.001 0.01 0.1
0 0 0
0.2 2790 45 0.2 1866 1094 0.2 0 3781
0.5 2858 72 0.5 851 2212 0.5 0 3883
0.8 2690 158 0.8 708 2465 0.8 0 3864
1 2783 137 1 1382 1555 1 0 3628
10 10 10
0.2 2657 0 0.2 2635 0 0.2 1299 1492
0.5 2609 0 0.5 2595 0 0.5 169 2814
0.8 2684 0 0.8 2511 0 0.8 0 2886
1 2674 0 1 2532 0 1 0 2899
100 100 100
0.2 2620 0 0.2 2545 0 0.2 2356 136
0.5 2585 0 0.5 2498 0 0.5 1563 964
0.8 2550 0 0.8 2508 0 0.8 555 2052
1 2602 0 1 2389 0 1 357 2242

Legenda:
Sogliamassimadiffusionedimetabolititracitoplasmaeambiente
Motilitcellulare
DiffusionedeimetabolitiprimariAeB

54
Nella prima colonna di Tabella 3 i microrganismi non instaurano mai un comportamento
cooperativo, dovuto, come detto, alla limitata diffusione dei metaboliti attraverso la mem-
brana. Quando aumentiamo la diffusione tra citoplasma e ambiente (0.01 e 0.1), iniziano ad
emergere gruppi in cui la divisione del lavoro allinterno della popolazione favorita in certe
condizioni e sfavorita in altre.
In particolare, la motilit delle cellule nel sistema (valore 0 indica che possono muoversi libe-
ramente, valori pi alti indicano che il movimento sempre pi limitato) risulta essere un
parametro (tra i cinque arbitrariamente considerati rilevanti) importante per linstaurarsi della
divisione del lavoro. Una spiegazione pu essere che muovendosi liberamente nellambiente,
le cellule hanno accesso ai metaboliti di cui necessitano sulla base di tutto lambiente, e non
un accesso prettamente limitato allarea in cui si troverebbero stando immobili.

Unaltra osservazione che si estrapola da tutte queste tabelle, che maggiore la motilit
cellulare allinterno del sistema e maggiore il numero di microrganismi che il sistema pu
reggere. Una spiegazione possiamo darla se ipotizziamo che la limitata motilit cellulare nel
modello, sia qui paragonabile a quella che le cellule sperimentano quando si trovano a vivere
allinterno di un biofilm. Come riportato nel paragrafo 2 - Comportamenti sociali nei micror-
ganismi?: vivere allinterno di un biofilm porta ad una maggiore competizione per i nutrimenti, il che
provoca il rallentamento della crescita.

Perch ho specificamente riportato lanalisi della variabile scambio di metaboliti ci-


toplasma/ambiente, dato che di per s pu risultare ovvio che maggiore lo scambio
di metaboliti e maggiore sar la facilit con cui i microrganismi instaurano un rap-
porto di cooperazione?
Come detto in precedenza, questo modello stato creato con lottica di essere il pi genera-
lizzato possibile, per cercare di capire quali sono le condizioni che favoriscono la
specializzazione delle cellule, non in specifici casi o per specifici microrganismi, ma puntando
a massimizzare la generalizzazione.

Quando la simulazione avviata, sono presenti delle fonti che forniscono il glucosio allam-
biente, e, sia il numero di fonti, sia la quantit di glucosio che erogano, nonch la sua diffusione
nel resto dellambiente, sono valori decisi arbitrariamente.
Quando una cellula sente che nellambiente presente glucosio, lo assorbe seguendo spe-
cifiche regole, come ad esempio, la soglia massima che indica quanto glucosio pu essere

55
assorbito, oppure il fatto che il glucosio sia assorbito solo attraverso diffusione passiva, op-
pure, che una volta assorbito non potr pi uscire dalla cellula, nemmeno se la concentrazione
esterna risultasse inferiore a quella interna, sono tutte regole arbitrarie.

Tutto ci stato deciso arbitrariamente durante la costruzione del modello, cercando di ri-
spettare la fisiologia cellulare, ma sempre cercando di non perdere di vista lobiettivo per cui
il modello stato disegnato.
Seppur appaia ovvio che maggiore sar la soglia massima con cui una cellula scambia meta-
boliti con lambiente, e dunque maggiore sar la possibilit che le cellule si possano
specializzare, porre arbitrariamente un valore alto a questa variabile significherebbe favorire
sempre la specializzazione, cos come scegliere un valore basso non permetterebbe mai di
osservare una specializzazione, portando a conclusioni deviate, come ad esempio, che tutte le
condizioni testate favoriscono la specializzazione, o, al contrario, che nessuna la favorisce.
Il disegno del modello ha dunque richiesto di assegnare molte costanti su base arbitraria. Sulla
base di questa pletora di scelte arbitrarie, la scelta dellintervallo migliore in cui parametrizzare
questa importante variabile non stato lasciato a decisioni personali, ma, attraverso la prece-
dente analisi, si deciso che i valori ottimali di questo parametro, sulla base di tutti gli altri
posti costanti, dovrebbero essere compresi tra 0.01 e 0.1.

56
17 Ulteriori analisi
Sapendo ora che i valori ottimali del parametro Scambio di metaboliti tra citoplasma e am-
biente sono compresi tra 0.01 e 0.1, e sapendo che il valore 0.01 tender a reprimere
lievemente la specializzazione, mentre il valore 0.1 tender a favorirla leggermente, si utilizzer
come primo livello della tabella pivot questo parametro, e si cerca la combinazione degli altri
quattro che permette di clusterizzare al meglio i dati, ovvero di ottenere gruppi di valori che
siano il meno dispersivi possibile (Tabella 4). Quando si ottengono dei cluster grandi, signi-
fica che i parametri pi influenti sono stati messi in ordine dal pi influente al meno influente.

Tabella 4
Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate
0.01 0.1
0 100 0 100
0.2 0.2 0.2 0.2
0.2 0.2 0.2 0.2
0.1 565 9 0.1 554 0 0.1 0 723 0.1 518 0
0.5 583 5 0.5 567 0 0.5 0 824 0.5 460 94
1 586 29 1 566 0 1 0 851 1 575 0
0.5 0.5 0.5 0.5
0.1 511 97 0.1 524 0 0.1 0 716 0.1 499 41
0.5 444 187 0.5 562 0 0.5 0 805 0.5 468 30
1 557 41 1 570 0 1 0 828 1 553 0
0.8 0.8 0.8 0.8
0.1 126 519 0.1 577 0 0.1 0 670 0.1 484 27
0.5 566 0 0.5 529 15 0.5 0 815 0.5 427 90
1 496 115 1 544 0 1 0 765 1 308 222
0.5 0.5 0.5 0.5
0.2 0.2 0.2 0.2
0.1 430 250 0.1 576 0 0.1 0 864 0.1 534 27
0.5 30 757 0.5 610 0 0.5 0 925 0.5 601 16
1 167 634 1 628 0 1 0 955 1 565 62
0.5 0.5 0.5 0.5
0.1 639 52 0.1 591 0 0.1 0 871 0.1 454 112
0.5 76 706 0.5 598 0 0.5 0 869 0.5 348 250
1 0 863 1 604 0 1 0 945 1 590 16
0.8 0.8 0.8 0.8
0.1 0 1024 0.1 611 0 0.1 0 728 0.1 418 204
0.5 430 284 0.5 581 0 0.5 0 884 0.5 223 396
1 14 775 1 593 0 1 0 966 1 290 318
0.8 0.8 0.8 0.8
0.2 0.2 0.2 0.2
0.1 693 8 0.1 655 0 0.1 0 974 0.1 215 509
0.5 168 627 0.5 673 0 0.5 0 1004 0.5 449 237
1 0 995 1 661 0 1 0 1068 1 689 0
0.5 0.5 0.5 0.5
0.1 490 273 0.1 637 0 0.1 0 992 0.1 477 183
0.5 0 881 0.5 665 0 0.5 0 1058 0.5 289 373
1 0 903 1 657 0 1 0 1037 1 296 397
0.8 0.8 0.8 0.8
0.1 0 838 0.1 639 0 0.1 0 929 0.1 238 481
0.5 0 864 0.5 678 0 0.5 0 965 0.5 48 652
1 0 872 1 641 0 1 0 1020 1 174 473

Legenda:
Sogliamassimadiffusionedimetabolititracitoplasmaeambiente
Mobilitcellulare
Diffusionedelglucosio
DiffusionedeimetabolitiprimariAeB
Velocitmassimadiproduzionedibiomassa

57
Appare subito evidente come la combinazione tra ridotto scambio dei metaboliti (0.01) e bassa
motilit cellulare (100) (ovvero le simulazioni del secondo blocco) sfavoriscano sempre la di-
visione del lavoro, mentre la combinazione tra alto scambio metaboliti (0.1) e alta motilit
cellulare (terzo blocco) favoriscano sempre la divisione del lavoro.
Le rimanenti combinazioni (primo e quarto blocco) permettono di osservare limportanza
degli altri parametri che abbiamo campionato, che non avendo un peso come quello della
motilit cellulare e della quantit di scambio di metaboliti con lambiente, appaiono rilevanti
solo in certi casi.
I dati possono essere rielaborati per assorbire i valori della variabile Biomassa, fornendo
una tabella di pi semplice lettura, senza che cambi la tendenza appena osservata (Tabella 5).

Tabella 5
Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate
0.01 0.1
0 100 0 100
0.2 0.2 0.2 0.2
0.2 1734 43 0.2 1687 0 0.2 0 2398 0.2 1553 94
0.5 1512 325 0.5 1656 0 0.5 0 2349 0.5 1520 71
0.8 1188 634 0.8 1650 15 0.8 0 2250 0.8 1219 339
0.5 0.5 0.5 0.5
0.2 627 1641 0.2 1814 0 0.2 0 2744 0.2 1700 105
0.5 715 1621 0.5 1793 0 0.5 0 2685 0.5 1392 378
0.8 444 2083 0.8 1785 0 0.8 0 2578 0.8 931 918
0.8 0.8 0.8 0.8
0.2 861 1630 0.2 1989 0 0.2 0 3046 0.2 1353 746
0.5 490 2057 0.5 1959 0 0.5 0 3087 0.5 1062 953
0.8 0 2574 0.8 1958 0 0.8 0 2914 0.8 460 1606

Legenda:
Sogliamassimadiffusionedimetabolititracitoplasmaeambiente
Mobilitcellulare
Diffusionedelglucosio
DiffusionedeimetabolitiprimariAeB

Consideriamo ora solo il primo e il quarto blocco. Possiamo osservare una tendenza che an-
dando dallalto verso il basso rende la specializzazione sempre pi favorita.
Quando la diffusione dei metaboliti tra citoplasma e ambiente ridotta e la motilit cellulare
alta (primo blocco), oppure quando la diffusione dei metaboliti tra citoplasma e ambiente
elevata e la motilit cellulare ridotta (quarto blocco), si nota che i parametri diffusione del
glucosio e dei metaboliti A e B nellambiente diventano rilevanti per la specializzazione.
Nel primo caso, immaginiamo cellule che rilasciano nellambiente solo una frazione dei me-
taboliti che producono (1%) (primo blocco). Queste stesse cellule hanno alta motilit. Quando
il glucosio che erogato dalle fonti diffonde lentamente, e cos anche i metaboliti che le cellule

58
rilasciano, la specializzazione sfavorita, ma quando glucosio e metaboliti diffondono velo-
cemente in tutto lambiente, pur essendo la soglia di scambio ridotta, la specializzazione
favorita.
Lo stesso avviene quando le cellule hanno ridotta motilit, ma rilasciano nellambiente parte
considerevole dei metaboliti che producono (10%) (quarto blocco). Maggiore la diffusione
di glucosio e metaboliti nellambiente, e pi la specializzazione risulta favorita.

Inizialmente si era pensato che quando la motilit cellulare ridotta, la difficolt dei micror-
ganismi nello specializzarsi fosse dovuta al fatto che le microcolonie che si formano (vedi
Figura 17 e Figura 18) fossero costituite da cellule con differenziamento simile, visto che
essendo la possibilit di mutazione piccola, cellule madri e cellule figlie avranno valori simili,
e quindi, avendo una bassa motilit, gli organismi vicini che formano la microcolonia fossero
simili, mentre gruppi di cellule con differenziamento opposto avrebbero formato una micro-
colonia in unaltra regione.
Questo avrebbe potuto spiegare il motivo per cui la limitata motilit cellulare risulta essere un
fattore che ostacola la specializzazione, ovvero, che essendo immobili, non si possono for-
mare microcolonie con microrganismi con specializzazione opposta.
Per dimostrarlo sono state inizializzate delle simulazioni in cui fossero gi presenti microrga-
nismi specializzati, insieme a microrganismi autonomi che si differenziano durante le
generazioni, e, nel caso in cui la cooperazione fosse favorita dalla bassa motilit, ma impedita
dal fatto che non si possono formare microcolonie con microrganismi con specializzazione
opposta, dato che le cellule di una colonia hanno tutte specializzazione simile, visto che di-
scendono tutte dalla stessa cellula madre, allora inizializzando il sistema con gi presenti cellule
specializzate che si piazzano casualmente sulla superficie del modello, con alta probabilit di
formare microcolonie composte da entrambi i tipi specializzati, avrebbe dovuto portare alla
formazione di colonie composte dai due tipi specializzati, e portare ad estinzione gli autonomi.
Il risultato delle simulazioni stato il medesimo di quelle in cui le simulazioni sono inizializzate
solo con microrganismi autonomi: ripetendo le simulazioni con tutte le combinazioni dei pa-
rametri del secondo blocco di Tabella 5, si sono ottenuti gli stessi risultati di quando il sistema
inizializzato con il solo fenotipo autonomo, concludendo che lipotesi in cui la specializza-
zione di cellule con bassa motilit fosse impedita dal fatto che si formano microcolonie
composte da cellule madri e cellule figlie con specializzazione simile, infondata.

59
18 riguardo i cheaters
Come gi discusso nellIntroduzione, i cheaters invadono sistemi in cui altri organismi stanno
cooperando tra loro, e sfruttano i vantaggi che derivano da questo comportamento.
In questo modello i cheaters sono microrganismi i cui pathway A e B hanno entrambi peso
uguale a 0, e pertanto non producono i metaboliti A e B, e utilizzano glucosio unicamente per
produrre lATP necessario a sopravvivere, e possono crescere solo nel caso in cui possano
reperire dallambiente i metaboliti A e B scambiati dai microrganismi specializzati.
Questo comporta che la loro persistenza in un sistema varia in funzione delle quantit dei
metaboliti A e B extracellulari. Come visto nelle Figure 17 e 18, lambiente ricco di meta-
boliti solo quando sono presenti microrganismi specializzati, ed povero quando sono
autonomi, il che ragionevole, visto che il fenotipo autonomo non ha bisogno di scambiare
metaboliti per crescere.
Lunico modo individuato per mantenere basso il numero di cheaters senza che le cellule
debbano attuare contromisure evolute per tale scopo, come quelle ipotetiche viste nellIntro-
duzione (paragrafo 7 - Strategie per il controllo dei cheaters), una crescita non sincrona delle
due cellule cooperative: consideriamo lo scenario in cui ci siano due tipi di cellule specializzate
nella produzione dei metaboliti A e B. Quando uno di questi tipi ha, rispetto allaltro tipo
specializzato, a disposizione una maggior quantit del metabolita limitante la crescita (suppo-
niamo sia il metabolita che non produce da s e che deve necessariamente ottenere
dallambiente), allora questo tipo specializzato potr crescere pi velocemente rispetto allal-
tro, rilasciando nellambiente maggiori quantit del metabolita che produce in eccesso, e allo
stesso tempo diminuendo la concentrazione del metabolita che usano per crescere. Ad un
certo punto, questo metabolita esaurisce e la crescita di questo tipo specializzato si fermer.
Nellambiente ora si trova abbastanza metabolita per permettere la crescita dellaltro tipo spe-
cializzato, e mentre il numero del primo tipo diminuisce, questaltro tipo specializzato
aumenta, seguendo la stessa dinamica seguita dal precedente.
Con tale andamento, lunico momento in cui i cheaters potranno crescere sar quando
nellambiente sono presenti entrambi i metaboliti, ovvero, solo a brevi intervalli intermittenti.
I tipi specializzati sono limitati da un solo metabolita, perci quando questunico sar presente,
potranno crescere e produrre da s laltro metabolita, mentre i cheaters sono limitati da due
metaboliti, quindi i loro momenti di crescita saranno pi rari, e seppure abbiano una fitness
pi alta dei cooperatori in ambiente ricco di nutrienti, risultano pi deboli negli ambienti ca-
renti di anche uno solo dei due metaboliti.

60
In un terreno in cui le quantit dei nutrienti variano ciclicamente, i cheaters risulteranno sfa-
voriti nella maggior parte del tempo.
Nel grafico in Figura 21 si vedono queste oscillazioni in controfase, sia relativi ai microrgani-
smi, che relativi alle quantit dei metaboliti che esse producono e consumano in alternanza.
In questa simulazione la motilit cellulare era molto ridotta, e le cellule restano praticamente
immobili, compresi i cheaters. Questo comporta che un cheaters subir le variazioni ambien-
tali delle immediate vicinanze, e come si vede destinato ad estinguersi presto.

Figura 21: nel primo grafico riportato il numero delle cellule specializzate (verdi e marroni) e dei cheaters
(viola). La simulazione inizializzata con un numero di cheaters superiore a quello degli specializzati, cos da
facilitare leventuale invasione del sistema da parte dei cheaters.
Nel secondo grafico riportata la concentrazione dei metaboliti: A (blu), B (rosso).
Come si vede, loscillazione in controfase dei due tipi specializzati, e ricordando che in questa simulazione la
motilit delle cellule era impostata per essere molto ridotta (1/100), ne risulta che linvasione dei cheaters al
sistema placata.

Questo ipotetico meccanismo di difesa contro i cheaters per perso quando le cellule pos-
sono muoversi liberamente nel sistema (Figura 22): pur crescendo in maniera asincrona, i
due tipi specializzati subiscono linvasione da parte dei cheaters. Questo dovuto al fatto che
a differenza della precedente simulazione, ora i cheaters hanno virtualmente accesso ai meta-
boliti di tutto il sistema, e il fatto che in un certo momento in una regione del sistema manchi

61
uno o laltro metabolita non pi un fattore limitante la loro crescita.
Come si vede in Figura 22, linvasione dei cheaters provoca lestinzione dei due tipi specia-
lizzati, dovuto al fatto che i cheaters interferiscono, utilizzando per s i metaboliti che i
microrganismi specializzati si scambiano per crescere.
Nel modello, i microrganismi non sottostanno a eventi morte programmata, muoiono sola-
mente quando lATP diventa minore di 0. Dato che lATP prodotto a partire da glucosio,
che nel momento in cui i tipi specializzati si estinguono e i metaboliti terminano sar pi
utilizzato unicamente dai cheaters per produrre ATP, la quantit di glucosio nel sistema ini-
zier ad aumentare gradualmente in tutte le regioni del sistema, impedendo ai cheaters di
morire. Essendosi estinti i microrganismi che producevano i metaboliti necessari alla crescita,
non si avr pi crescita dei cheaters, e quindi il loro numero rester stabile. Inserendo una
variabile che porti alla morte programmata dopo un certo numero di tick, dato che in assenza
dei due metaboliti i cheaters non possono replicarsi, ad un certo punto si osserverebbe anche
linesorabile estinzione dei cheaters.

Figura 22: nel primo grafico riportato il numero delle cellule specializzate (verdi e marroni) e dei cheaters
(viola). Nel secondo grafico sono riportate le quantit dei metaboliti: A (blu), B (rosso).
In questa simulazione il parametro che determina la motilit cellulare settato per permettere alle cellule di
muoversi liberamente nel sistema. Seppur si osservi loscillazione delle cellule specializzate descritta precedente-
mente come un possibile sistema che possa limitare la propagazione dei cheaters nel sistema, il fatto che questi
abbiano virtualmente a disposizione i metaboliti di tutto il sistema, ne favorisce linvasione.

62
Discussione
La divisione del lavoro permette a una porzione degli individui che vivono in una comunit,
di svolgere una funzione e di condividere i prodotti di tale funzione con gli individui incapaci
di svolgerla, consentendo di alleggerire il carico generale delle funzioni che ciascun individuo
della comunit deve attuare per poter crescere e replicarsi.
Bench la divisione del lavoro sia alla base della nostra economia, ed da tempo stabilito che
anche animali e insetti abbiano sviluppato comportamenti cooperativi, la divisione del lavoro
nei microrganismi rimasta a lungo un punto interrogativo. La visione semplicistica che si ha
dei microrganismi solitamente di organismi solitari che si comporteranno allo stesso modo
sia che si trovino a crescere da soli, sia che si trovino in gruppo, magari convivendo assieme
ad altre specie, sottintendendo in questo modo che ciascuno di questi organismi dovr cre-
scere soddisfacendo da s i propri bisogni, utilizzando quello che casualmente riescono a
ricavare dallambiente. Oggi sappiamo che le cellule hanno evoluto sistemi di comunicazione
sia intraspecie che interspecie, e che sono in grado di modellare gli ambienti in cui vivono
(niche construction13).

Nel presente studio abbiamo investigato quali possono essere le condizioni che favoriscono
levoluzione della divisione del lavoro tra microrganismi. Abbiamo costruito un modello di
metabolismo batterico e lo abbiamo applicato a un ambiente in cui questi possono crescere
ed eventualmente sviluppare comportamenti sociali. Nello specifico, il comportamento so-
ciale che questi microrganismi dovrebbero instaurare prevede lo scambio di risorse che sono
necessarie per produrre biomassa e replicarsi. Inizialmente ciascun microrganismo in grado
di produrre da s tutto ci di cui necessita per crescere, ma se le condizioni sono favorevoli,
potrebbero emergere nuovi fenotipi specializzati nella produzione di una risorsa, che oltre a
utilizzare per se stessi, scambiano con altri fenotipi specializzati nella produzione di unaltra
risorsa.

Variando le condizioni, sia endogene che ambientali, si osservato, in maniera qualitativa,


quali possono essere gli effetti che hanno sullinstaurazione di un sistema cooperativo.
In particolare, si sono considerati rilevanti cinque parametri del modello, che sono stati cam-
pionati variando sistematicamente i loro valori e analizzandone gli effetti.

63
I parametri campionati sono: la velocit di diffusione del glucosio e dei metaboliti nellam-
biente, la velocit di diffusione dei nutrienti tra lambiente e il citoplasma, la velocit di sintesi
di biomassa, e la motilit cellulare nellambiente.
I dati ottenuti dal campionamento sistematico di questi parametri sono stati analizzati in ma-
niera qualitativa mediante lausilio di tabelle pivot.

Un primo risultato ottenuto stato che pi le cellule scambiano metaboliti con lambiente, e
pi la divisione del lavoro favorita, il che un risultato ovvio, che per servito a determi-
nare un intervallo allinterno del quale il modello non governato completamente dal valore
di questo parametro, e quindi non vada a coprire gli effetti degli altri parametri, che per loro
natura, hanno un peso inferiore.
Da questo punto di partenza (microrganismi che scambiano poco hanno la tendenza a non
instaurare rapporti di dipendenza con altri, mentre microrganismi che scambiano molto in-
staurano pi facilmente un rapporto), abbiamo fatto successive analisi, mantenendo come
primo livello di organizzazione dei dati proprio la capacit delle cellule di scambiare materia
con lambiente.
Abbiamo visto (Tabella 5) che quando le cellule scambiano poca materia con lambiente, e
quindi levoluzione di un comportamento sociale lievemente sfavorita, esistono comunque
condizioni in cui questa limitatezza non impedisce lo sviluppo del comportamento collabora-
tivo.
Similmente, simulazioni in cui i microrganismi scambiano molto con lambiente, e quindi pos-
siedono il tratto che favorisce il comportamento collaborativo, possono trovarsi in situazioni
in cui, seppur intrinsecamente favorito, il comportamento non ha potuto instaurarsi.

64
Tabella 5
Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate Autonome Specializzate
0.01 0.1
0 100 0 100
0.2 0.2 0.2 0.2
0.2 1734 43 0.2 1687 0 0.2 0 2398 0.2 1553 94
0.5 1512 325 0.5 1656 0 0.5 0 2349 0.5 1520 71
0.8 1188 634 0.8 1650 15 0.8 0 2250 0.8 1219 339
0.5 0.5 0.5 0.5
0.2 627 1641 0.2 1814 0 0.2 0 2744 0.2 1700 105
0.5 715 1621 0.5 1793 0 0.5 0 2685 0.5 1392 378
0.8 444 2083 0.8 1785 0 0.8 0 2578 0.8 931 918
0.8 0.8 0.8 0.8
0.2 861 1630 0.2 1989 0 0.2 0 3046 0.2 1353 746
0.5 490 2057 0.5 1959 0 0.5 0 3087 0.5 1062 953
0.8 0 2574 0.8 1958 0 0.8 0 2914 0.8 460 1606

Legenda:
Sogliamassimadiffusionedimetabolititracitoplasmaeambiente
Mobilitcellulare
Diffusionedelglucosio
DiffusionedeimetabolitiprimariAeB

Nello specifico, si nota che quando i microrganismi scambiano poca materia con lambiente
(valore di scambio 0.01), se associato a bassa motilit cellulare (secondo blocco di Tabella 5),
non si ottiene mai una divisione del lavoro, rendendo ininfluenti gli effetti dei parametri con
peso minore.
Quando invece questi microrganismi hanno spiccata motilit e possono esplorare lambiente
senza limitazioni (primo blocco di Tabella 5), seppur sfavoriti da un basso livello di scambio,
si sono trovate condizioni in cui il sistema evoluto favorendo la divisione del lavoro, ovvero,
in condizioni in cui i metaboliti nellambiente diffondo con alta velocit.
Quindi, alta motilit cellulare e alta velocit di diffusione ambientale di glucosio e metaboliti
necessari alla crescita favoriscono la divisione del lavoro anche quando le cellule hanno ridotta
capacit di scambiare metaboliti con lesterno.
Uno scenario in cui potremmo collocare lalta motilit cellulare e lalta diffusione ambientale
dei metaboliti del nostro modello in un sistema reale, potrebbe essere quello di comunit
microbiche che vivono in forma planctonica in ambienti acquatici, dove sia i nutrienti, sia le
cellule, diffondono liberamente nel sistema. In questo caso, pur scambiando una piccola fra-
zione dei loro prodotti con lambiente, il fatto che cellule e metaboliti diffondano liberamente,
pu essere condizione sufficiente per avere divisione del lavoro. Ovviamente, cellule con alta
propensione allo scambio poste nel medesimo sistema (terzo blocco di Tabella 5), evolvono
ancora pi facilmente comportamenti cooperativi.
Una differenza tra il modello e un ambiente reale come quello marino, potrebbe esseree che
il modello un sistema chiuso (almeno in uscita, visto che ad ogni tick si fornisce glucosio

65
dallesterno), in cui niente della materia prodotta pu uscire dal sistema. In un oceano, se la
comunit microbica si stabilisce in una regione, questa inevitabilmente collegata al resto
delloceano, e ci causa linevitabile luscita di materia dal sistema (il termine sistema qui
inteso come nicchia in cui la comunit cresce).

Invece, nella situazione in cui le cellule abbiano invece motilit limitata, supponiamo uno sce-
nario paragonabile a quello di cellule che crescono allinterno di una matrice polimerica come
pu essere quella di un biofilm, si visto che nelle condizioni in cui queste fossero per loro
natura poco capaci di scambiare metaboliti con lesterno (secondo blocco di Tabella 5), non
si crea mai un sistema in cui c divisione del lavoro.
Quando invece queste cellule immobili hanno buona propensione a scambiare metaboliti
con lambiente (quarto blocco di Tabella 5), risultato che il comportamento pu instaurarsi
con pi facilit se glucosio e metaboliti necessari alla crescita diffondono liberamente nellam-
biente.
Questo suona strano se vogliamo paragonare le condizioni di limitata motilit del nostro mo-
dello al limitato movimento che le cellule sperimentano quando vivono in un biofilm, dato
per forza di cose dobbiamo tenere conto che in questa matrice anche i metaboliti diffondono
pi lentamente32.
Ora, dobbiamo ricordare che nel modello i volumi delle patches sono adimensionali, e cos le
distanze tra i microrganismi. Il fatto che un sistema in cui cellule immobilizzate necessitino di
alta velocit di diffusione dei metaboliti scambiati pu essere riveduto in un contesto di bio-
film nel seguente modo: dato che in un biofilm la velocit di diffusione dei metaboliti
limitata, questo limite pu essere bypassato dalla vicinanza tra gli organismi allinterno della
matrice, ovvero, pi essi staranno vicini e meno la limitata diffusione di un metabolita sar un
fattore che limita lo scambio.
Il nostro modello permette ai batteri di porsi uno su ciascuna patch, e seppure nel modello
risultino visivamente vicini (Figura 18), si tratta comunque di distanze adimensionali. Ipotiz-
zando di conoscere la costante di diffusione dei nostri ipotetici metaboliti allinterno di un
biofilm, variare il parametro che determina quanto un metabolita si sposta da una patch allal-
tra, significherebbe che un basso valore di questo parametro sottintende una maggior distanza,
e che un alto valore invece indichi una distanza ravvicinata, e quindi questo risultato (quarto
blocco di Tabella 5) potrebbe indicare che lo scambio di metaboliti allinterno di biofilm ne-
cessiti di una stretta vicinanza tra i microrganismi, al fine di rendere la ridotta diffusione un
fattore non limitante.

66
Una rivisitazione del modello potrebbe essere quella di permettere a pi cellule di occupare la
stessa patch, simulando in questo modo una maggiore vicinanza tra le cellule, visto che quando
un metabolita secreto, se il ricevente si trova nella stessa patch avr subito a disposizione il
metabolita di cui ha bisogno, e non dovr aspettare che questo diffonda da una patch allaltra.

notabile anche il fatto che quando le cellule possono muoversi liberamente, nel sistema c
sempre un numero maggiore di cellule, rispetto a quando queste sono obbligate a restare pres-
soch immobili. Questo risultato converge con la vita nei biofilm, in cui i microrganismi,
trovandosi a vivere a stretto contatto sono costantemente in competizione per i nutrienti co-
muni, il che porta ad una limitata crescita collettiva, un effetto negativo che
abbondantemente superato da tutti gli effetti positivi che questo stile di vita comporta, che
non elencher qui, e che sono gi stati citati nellintroduzione.

Il modello stato infine utilizzato per capire se fosse possibile individuare condizioni che
sfavoriscono la proliferazione dei cheaters, ovvero cellule che smettono di produrre i meta-
boliti che possono trovare nellambiente, e, nel caso in cui questi metaboliti si trovino
nellambiente perch altri organismi se li stanno scambiando, lo sfruttamento di queste risorse
da parte dei cheaters porter ad un certo punto al collasso del sistema.
I risultati riportano che quando organismi specializzati nella produzione di certi metaboliti
subiscono linvasione da parte dei cheaters, questa invasione resa pi difficile se il sistema
permette una limitata motilit, come pu essere in un biofilm, mentre quando possono muo-
versi liberamente, inesorabilmente i cheaters invadono il sistema e portano i microrganismi
specializzati allestinzione.
Questo concorda con quanto riportato in letteratura39, 41, in cui un sistema ben mescolato
pi propenso a subire linvasione da parte dei cheaters, rispetto a un sistema che limita il
movimento, come pu essere un biofilm.
Nel modello, comunque, ci che limita la propagazione dei cheaters si ottiene esclusivamente
quando i due tipi di microrganismi specializzati crescono in maniera asincrona. Ipotizziamo
un sistema composto da due tipi di microrganismi specializzati ciascuno nella produzione di
un metabolita che scambiano nellambiente, e che per crescere necessitano di un metabolita
prodotto dallaltro tipo specializzato.
Crescendo in maniera asincrona, si osservano continue oscillazioni nelle quantit dei due me-
taboliti scambiati, e questo impedisce ai cheaters di crescere, visto che a differenza delle cellule
specializzate, essi sono dipendenti dalle fluttuazioni dellambiente per entrambi i metaboliti.

67
Il fatto che questo ipotetico sistema di difesa contro i cheaters abbia effetto solo quando le
cellule hanno limitata motilit dovuto al fatto che se la crescita dei due tipi cellulari avviene
controfase, nella maggior parte del tempo, lambiente sar carente di almeno uno dei metabo-
liti necessari alla crescita, e i cheaters, incapaci di produrre entrambi, avranno a disposizione
solo limitate finestre temporali in cui entrambi i metaboliti sono presenti allo stesso tempo.
Invece, in un sistema planctonico in cui le cellule possono muoversi liberamente, la crescita
controfase dei due tipi specializzati non avr effetto nel limitare la proliferazione dei cheaters,
dato che potendosi muovere nel sistema, hanno pi probabilit di trovare regioni in cui i
metaboliti sono presenti, e complessivamente riescono ad avere una crescita continua.
Tali oscillazioni potrebbero essere una valida strategia per impedire la propagazione dei chea-
ters in un sistema, anche se risultato efficace solo quando il sistema limita il movimento
cellulare, come nei biofilm, e bench in letteratura non si sia trovato alcun riferimento a cre-
scite cellulari controfase.

68
Conclusioni
Il modello qui presentato risultato essere in grado di ricalcare abbastanza bene le situazioni
reali in cui lo abbiamo collocato, seppur possa peccare di eccessiva semplificazione e adimen-
sionalit dello spazio e delle distanze tra i microrganismi, il che pu rendere linterpretazione
dei dati difficoltosa.
Possibili sviluppi futuri di questo modello potrebbero essere proprio laggiunta di dimensio-
nalit, meccanismi di quorum sensing e la possibilit per gli organismi di produrre biofilm, o
aggiungere ulteriori vincoli, sia per le cellule, che per lambiente, che ne diminuiscano la gene-
ralit, ma che potrebbero renderlo pi performante verso specifici casi di studio.
Lanalisi del modello stata qualitativa. Un modello che riuscisse a descrivere situazioni par-
ticolari potrebbe essere analizzato con tecniche quantitative di analisi multivariata, e sarebbe
possibile valutarne la bont confrontando i dati ottenuti con dati sperimentali.

Nel 2013, Biggs & Papin80 hanno pubblicato un articolo in cui presentavano un nuovo tool,
chiamato MatNet, in grado di fare da ponte tra NetLogo e MATLAB. Il software MATLAB
(matrix laboratory), oltre che a essere utilizzato in ingegneria, utilizzato anche in bioinfor-
matica per simulare interi metabolismi cellulari con la tecnica Flux Balance Analysis (FBA), la
quale si basa sul calcolo matriciale. Il tool MatNet permetterebbe dunque di utilizzare con-
temporaneamente NetLogo per disegnare la parte ecologica del modello, e MATLAB per
simulare i flussi di un intero metabolismo su scala genomica.
Lutilizzo di una simile combinazione di metodi ancora oggi troppo onerosa dal punto di
vista computazionale. Su un computer casalingo la simulazione di poche decine di cellule che
interagiscono in un ambiente di poche centinaia di patches impiega circa unora per simulare
circa 20 ore di crescita cellulare (la tecnica FBA considera la variabile temporale), che in
NetLogo corrispondono a 240 tick, mentre il nostro modello simulerebbe un sistema di uguali
dimensioni in meno di un secondo.

Sebbene il nostro studio sia risultato essere piuttosto teorico, studi di questo genere potranno
trovare risvolti anche in ambito pratico. Ad esempio, capendo quali sono le condizioni che
favoriscono la divisione del lavoro tra ceppi o specie microbiche, si potranno avere a disposi-
zione delle linee guida che permetteranno di massimizzare la robustezza di consorzi microbici
da utilizzare in industria, disegnati ad hoc per la produzione di molecole ad alto valore aggiunto.

69
Bibliografia
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3. Pandhal, J. & Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol
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