A.R. Cervantes-Villagrana et al.

/ Vaccine 31 (2013) 676 684

Prime-boost BCG con vacunas de ADN basadas en -defensin-2 y antgenos

micobacterianos ESAT6 o Ag85B mejoran la proteccin en un modelo
experimental de tuberculosis.
Alberto R. Cervantes-Villagrana a,b, Rogelio Hernndez-Pandoc, Arya Biragynd, Julio Castaneda-
Delgado a,b, Monica Bodogai d, Margarita Martnez-Fierroe, Eduardo Sadaf , Valentin Trujilloa,
Antonio Enciso-Morenoa, Bruno Rivas-Santiagoa,
a Unidad de Investigacin Mdica-Zacatecas, Instituto Mexicano del Seguro Social IMSS, Zacatecas, Mxico
b Departamento de Inmunologa, Facultad de Medicina, Universidad Autnoma de San Luis Potos, San Luis Potos, Mxico
c Seccin de Patologa Experimental, Departamento de Patologa, Instituto Nacional de Ciencias Mdicas y Nutricin "Salvador Zubiran", Ciudad de Mxico, Mxico
d Laboratorio de la seccin de Inmunoteraputica, Biologa Molecular e Inmunologa, Instituto Nacional de Envejecimiento, Instituto Nacional de Salud Baltimore,
Maryland, EE.UU.
e Laboratorio de Medicina Molecular, Unidad Acadmica de Medicina Humana y Ciencias de la Salud, Universidad Autnoma de Zacatecas, Zacatecas, Mxico
f Departamento de Investigacin en Microbiologa. Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, Ciudad de Mxico, Mxico

article inf o abstrac t

Article history: The WorldHealthOrganization (WHO) has estimated thatthere are about 8 million newcases annually of active Tuberculosis (TB).
Received 17 August 2012 Despite its irregular effectiveness (089%),the Bacillus Calmette-Gurin) BCG is the only vaccine available worldwide for
Received in revised form 2 November 2012 prevention of TB; thus,the design is important of novel and more efficient vaccination strategies. Considering that-defensin-2 is an
Accepted 13 November 2012 Available
antimicrobial peptide thatinduces dendritic cellmaturationthroughthe TLR-4receptor andthat bothESAT-6andAg85B are
online 26 November 2012
immunodominant mycobacterial antigens andefficient activators of the protective immune response, we constructed two DNA
vaccines by the fusionof the gene encoding -defensin-2andantigens ESAT6(pDE) and85B (pDA). After confirming efficient local
antigenexpression thatinduced highandstable Interferon gamma
Keywords:
Tuberculosis DNA (IFN-) production in intramuscular (i.m.) vaccinated Balb/c mice,groups of mice were vaccinated with DNA vaccines ina prime-boost
vaccine regimen withBCG and with BCG alone,and 2 months later were challenged with the mildvirulence reference strainH37Rv and the
BCG highly virulent clinical isolate LAM 5186. The level of protection was evaluated bysurvival, lung bacilli burdens,andextension of
Defensins tissue damage (pneumonia). Vaccination withbothDNA vaccines showed similar protection to thatof BCG. After the challenge with
Ag85B the highly virulent Mycobacterium tuberculosis strain,animals that were prime-boosted with BCG andthenboosted withboth DNA
ESAT6 vaccines showed significant higher survival and less tissue damage thanmice vaccinated only withBCG. These results suggest that
improvement of BCG vaccination, such as the prime-boost DNA vaccine, represents a more efficient vaccination scheme against TB.
2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduccin enfermedades activas en todo el mundo, 1,4

millones de muertes anuales [1], y se
considera una emergencia mundial debido a
la aparicin creciente de nuevas cepas
La tuberculosis es una infeccin que produce
altamente virulentas [2] y resistentes a
8,8 millones de nuevos casos de
frmacos [ 3,4]. Por lo tanto, es urgente la
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creacin de nuevas vacunas y / o esquemas defensin-2, un pptido antimicrobiano que

de vacunacin que puedan generar un efecto
profilctico eficaz o que potencien la
inmunidad protectora en los individuos
vacunados con Bacillus Calmette-Gurin
(BCG).
Mycobacterium bovis BCG, una cepa
micobacteriana atenuada viva, es la nica
vacuna disponible contra la tuberculosis
hasta la fecha. Se ha utilizado durante casi
100 aos y su proteccin es extremadamente
variable, de 0-89% [5-7]. Variabilidad en la
eficacia de BCG se asocia con mltiples
factores [8 - 10]. Se han propuesto diferentes
enfoques para generar nuevas y ms
eficaces vacunas, tales como Mycobacterium
tuberculosis (Mtb) mutantes [11, 12],
recombinante BCG, que expresa altamente
inmunognicos antgenos [13, 14], subunidad
vacunas basadas en la mayora de
inmungena Mtb Antgenos [15, 16], y las
vacunas de ADN [17, 18]. Sin embargo, se
ha logrado un xito limitado en este asunto.
Recientemente, hemos estado trabajando en
el papel que algunos pptidos
antimicrobianos juegan en la respuesta
inmune innata y la activacin de las
respuestas inmunes adquiridas en la TB
experimental. Este es el caso especfico de -
induce la maduracin de las clulas
dendrticas en un Toll-like (TLR) receptor 4
dependientes de manera [19 - 21].
Curiosamente, constructivo gentico de
codificacin de las secuencias de defensin-2
generar un polarizado y antgeno especfico
Th1 respuesta inmune [22 - 24]. Esto es
importante porque varios informes indican
que una respuesta inmune celular citotxica
Th1 / CD8 + es esencial para el control del
crecimiento Mtb [25]. Varios antgenos de
Mtb inducen una respuesta Th1 fuerte, tal
como la protena Antignica Antignica
Precoz-6 kDa (ESAT-6), que es un potente
inmungeno codificado por el complejo de
genes RD1 de Mtb [26] que est ausente en
BCG [27] . Del mismo modo, Ag85B es una
protena relacionada con la mycolyl
transferase secretada por Mtb y es un
antgeno altamente inmunognico que induce
una respuesta inmune citotxica [28 - 31].
Por lo tanto, en este trabajo se disearon
vacunas de ADN basadas en -defensina-2
fusionadas con ESAT6 o Ag85B, que en
realidad inducen una respuesta Th1 inmune
polarizada y su eficacia fue evaluada en un
modelo murino de TB pulmonar desafiado
con cepas de Mtb, que poseen diversa
virulencia Niveles.

Fig. 1Higo. 1. Cronologa de la vacunacin animal, infeccin y sacrificio.

Se inmunizaron grupos de al menos 6 animales mediante la administracin de 50 g de vacuna de ADN en los msculos
de los muslos. La electroporacin se aplic en el sitio de vacunacin. La vacunacin con Bacillus Calmette-Gurin (BCG) se
realiz con 8 103 bacilos viables al da 60 antes de la infeccin, como se muestra en el grfico de la lnea de tiempo.
Sesenta das despus de la inmunizacin con vacuna de ADN, vehculo, BCG o una combinacin de cualquiera de estos
ltimos, los ratones se infectaron con cualquiera de las dos cepas de Mtb: H37Rv y LAM 5186. Los ratones infectados se
sacrificaron en diferentes momentos despus de la infeccin con Mtb , Dependiendo de la virulencia de cada cepa. Esta
estrategia se utiliz para todos los experimentos. Se llevaron a cabo al menos tres experimentos independientes.
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2. Materiales y mtodos
2.1. La clonacin de genes, la fusin y
las construcciones plasmdicas
Las construcciones de ADN se hicieron por
amplificacin y clonacin de el gen de
inters; El gen para murino maduro -
defensin-2 (mBD2) se clon de piel de ratn
tratada con LPS (10 ng / ml) por RT-PCR a
partir de ARN total utilizando cebadores
especficos: -defensin-2 (Defb2) F-5 -
ACCATGGAACTTGACCACTGCCACACC- 3
,R-5-
TGAATTCAAGATCTTTCATGTACTTGCAAC
AGGGGTTGTT, ESAT6 (esxA) F-5 -
TATCTCGAGACCACC-3 , R-5 -
CACCACCATCACCATCACTAAGGATCCCG
G GTAA-3 , Ag85B (fbpB) F-5-
ATGGATCCTATGTCGACCACATGACAGAC
GT GAGCCGAAAGATT-3 , R-5 -
ATCCCGGGAAGGGTCCTTAGTGATGGTG
ATG
GTGGTGGCCGGCGCCTAACGAACTCTGC
A-3 , and GAPDH F-5 -
CTGGTGCTGAGTATGTCGTG-3 R-5 -
CAGTCTTCTGAGTGGCAGTG-3 . La
amplificacin de los genes esxA y fbpB fue
realizado a partir del ADN genmico de la
cepa Mtb H37Rv, aislado como informado en
otro lugar [32]; Estas secuencias codifican
para ESAT6 o Ag85B, respectivamente. Las
construcciones de ADN se basan en un
vector pCMV; Las caractersticas especficas
de la construccin fueron informado
previamente por nuestro grupo [23, 33]. Las
siguientes cuatro Construcciones fueron
generadas: pCMV-mDF2B-esxA (pDE);
PCMVmDF2B-fbpB(PDA); PCMV - esxA
(pE); PCMV-fbpB (pA), y el vaco pCMV
vector que se utiliz como control. Las
construcciones se analizaron por PCR,
digestin enzimtica y secuenciacin con el
fin de confirmar la insercin y abrir el marco
de lectura(ORF). Las bacterias XL10 Gold
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) fueron
transformado con cada constructo y cultivado
en base de caldo LB Medio (Invitrogen). La
purificacin del plsmido se realiz con el
Endofree Plasmid Maxi kit como referido por
el proveedor (QIAGEN, Hilden, Alemania).
Los plsmidos se eluyeron en forma estril
libre de pirgenos Tampn de Fosfato
(SIGMA, Steinheim, Alemania).
2.2. Vacunacin
Todos los estudios en animales fueron
aprobados por la tica institucional de
conformidad con las directrices de la
Comisin Mexicana de Normativa Nacional
de Cuidado y Experimentacin Animal NOM
062-ZOO-1999. Ratones BALB / c de edades
comprendidas entre las 6 y 8 semanas de
edad fueron anestesiados con sevoflurano
(Abbott, Quebec, Canad). A continuacin, el
plsmido respectivo se administr por va
intramuscular(I.m.) en el muslo derecho,
empleando 100 l de PBS estril como
vehculo. Con el fin de aumentar la eficacia
de la vacunacin de ADN, fue aplicado en el
sitio de la inyeccin un choue elctrico con el
CYTOPULSE Sistema de electroporador
PulseAgile Modelo PA-3000, segn las
sugerencias del fabricante. La cantidad de
vacuna de ADN se determin con una curva
dosis-respuesta. El mejor perfil de expresin
se observ a 50 g para la vacuna de ADN
sola y para la coadministracin, esto era 25
g de ADN de cada vacuna. Una segunda
dosis de la vacuna de ADN se aplic 8 das
despus de la primera vacunacin como un
impulso. En el caso de la vacunacin con
BCG, se inyectaron por va subcutnea (s.c.)
8 103 clulas bacterianas viables de la
subcaptacin de BCG Phipps en la base de
la cola. Este substracto de BCG fue el ms
protector de 10 cepas ensayadas en el
modelo de ratones BALB / c de Tuberculosis
pulmonar [34]. El calendario de inmunizacin
se representa en detalle en la Fig. 1.
2.3. RT-PCR para la expresin de
mRNA evaluacin de la construccin
de ADN
Uno, 3, 8 y 14 das despus de la
vacunacin, los animales fueron sacrificados
y los msculos del muslo fueron extirpados
inmediatamente; Un fragmento se fij por
inmersin en formaldehdo al 10% disuelto en
PBS para la inmunohistoqumica, y el
fragmento de tejido restante se conserv en
TRIzol(Invitrogen) para el anlisis de genes.
Para la purificacin de cidos nucleicos, el
tejido se homogeneiz en un aparato Ultra-
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Turrax T-10 (IKA, Wilmington, NC, EE.UU.).

El mini kit RNAeasy con DNAasa (QIAGEN,
Dsseldorf, Alemania) se emple para 2.4. Inmunohistoqumica
RNAisolation de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se utilizaron cien Para la inmunohistoqumica, las secciones de
nanogramos de ARN purificado para la 5 m de espesor se deparaf-finized y la
sntesis de cADN utilizando el kit de sntesis peroxidasa endgena quenched con 0,03%
de cDNA Omniscript (QIAGEN) y se de H2O2.
sometieron a PCR.

Fig. 2 Cintica de ESAT6 y Ag85B ARNm y expresin de protenas en el msculo de ratones inmunizados.

Se inmunizaron dos grupos de seis ratones BALB / c por grupo con pDE o pDA y se sacrificaron a 1, 3, 8 y 14 das. (A)
RT-PCR para la expresin de mRNA de ESAT6 a partir de muestras de msculo de muslo extradas de ratones
vacunados. La expresin de ARNm de GAPDH por RT-PCR se us para la determinacin de la expresin basal; (B)
Micrografas que muestran la expresin antignica de la protena y la inmunohistoqumica para ESAT6 con un
aumento de 20 veces. El control positivo fue de ratones infectados con cepa H37Rv con un aumento de 10 veces.

De manera similar, los paneles representan la expresin de la protena a los 1, 3, 8 y 14 das despus de la vacunacin;
(C) RT-PCR para la expresin de ARNm de Ag85B extrado del msculo de ratones inmunizados.

La expresin de mRNA de GAPDH por RT-PCR se utiliz para la determinacin de la expresin basal; (D) expresin de
protena antignica Ag85B analizada por inmunohistoqumica con un aumento de 20x. Control positivo de ratones
infectados con H37Rv con un aumento de 10 veces. Se ilustra la expresin de protenas a 1, 3, 8 y 14 das despus de la
vacunacin. Se muestran resultados representativos de tres experimentos independientes
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A continuacin, las secciones se bloquearon
con PBS suplementado con suero de pool
humano al 2%. Las secciones musculares se
incubaron con anticuerpo policlonal anti
ESAT6 de conejo y anti Ag85B (Abcam,
Cambridge, Reino Unido) policlonal de
conejo y posteriormente se incubaron con un
2.5. Inmunogenicidad de las vacunas
de ADN
Grupos de seis ratones BALB / c se
vacunaron con pDE, pDA, pE, pA, pCMV o
PBS y se sacrificaron a los 14, 21 y 40 das
despus de la vacunacin. Las suspensiones
celulares de ganglios linfticos inguinales,
bazo y pulmones se cultivaron y estimularon
con antgenos de filtrado de cultivo
micobacteriano (CFA), rESAT-6 o rAg85B,
como se inform previamente [35]. Los
cultivos para la produccin de citocinas (1 x
105 clulas en 100 \ mu l de medio de
cultivo) se realizaron en placas de 96 pocillos
de fondo plano con 5 \ mu g de CFA, rESAT6
o rAg85B. Despus de 72 h, se recogieron
los sobrenadantes y se utilizaron para la
cuantificacin de Interferon gamma (IFN-) por
medio de una enzima comercial enlazada
Kit de ensayo de inmunoabsorcin (ELISA)
(Pharmingen, San Diego, CA,
ESTADOS UNIDOS).
2.6. Modelo experimental de la
tuberculosis pulmonar progresiva
El modelo experimental de la tuberculosis
pulmonar progresiva se ha descrito
previamente en detalle [14]. Los grupos de
ratones vacunados fueron desafiados 60 das
despus de la primera inmunizacin con
cepas de M. tuberculosis H37Rv o con el
aislado mediterrnea Latinoamericana (LAM)
clnica (5186 cepa), el cual es altamente
virulento en este modelo de ratn [2,36].
Cada animal fue anestesiado con sevoflurano
y fue por va intratraqueal (i.t.) instillated con
2,5 105 clulas bacterianas viables en
suspensin en 100 L de agua estril, PBS
libre de pirgenos. Para determinar la
eficacia de la vacunacin, grupos de seis
ratones en dos experimentos independientes
fueron sacrificados despus de 30, 60, o 120
das de desafo; Se emplearon sus pulmones
anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con
biotina. Los anticuerpos unidos se detectaron
con avidina-biotina peroxidasa (Biocare
Medical, Concord, CA, EE.UU.) y se
contracoloraron con hematoxilina.
para determinar las cargas de los bacilos
mediante la cuantificacin de la unidad
formadora de colonias (UFC) y la histologa /
morfometra, determinando as el porcentaje
de superficie pulmonar afectada por
neumona. Los ratones infectados se
sacrificaron en diferentes puntos de tiempo
despus de la infeccin de Mtb, dependiendo
de la virulencia de cada cepa. Otro grupo de
10 ratones se dej intacto y se registr la
mortalidad para construir curvas de
supervivencia.
2.7. Determinacin de unidades
formadoras de colonias y anlisis
histopatolgico de pulmones
infectados
Los pulmones derechos de seis ratones en
cada punto de tiempo en al menos dos
Se utilizaron experimentos independientes
para las cuantificaciones de CFU.
Brevemente, los pulmones se
homogeneizaron con un politrn (Kinemat -
Ica, Lucerna, Suiza) en tubos estriles de 50
ml que contenan 3 ml
De solucin salina isotnica. Se diseminaron
cuatro diluciones de cada homogeneizado
sobre duplicados que contienen placas de
agar Bacto Middlebrook 7H10 enriquecido
con OADC. Las placas se incubaron a 37 C
y la CFU se contaron al da 21.
Para el anlisis histopatolgico, los pulmones
se perfundieron con Etanol absoluto, inmerso
durante 24 h, e incorporado en parafina.
Las secciones de cinco m de espesor
tomadas a travs del hilo se tieron con
L. En estas diapositivas, el rea
(m 2) ocupada por el inflamatoria
El infiltrado se determin utilizando un
analizador de imgenes (Axiovert 200 M
Con Axiovision ver.4.3; Carl Zeiss, Jena,
Alemania)
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Fig. 3 La cuantificacin de interfern gamma (IFN-) en sobrenadantes de cultivo de clulas mononucleares de ratones
inmunizados estimulados con antgenos micobacterianos especficos.

Los ratones se inmunizaron con pE, pA, pDE, pDA o pCMV. Las clulas mononucleares extradas de ratones inmunizados
se cultivaron en placas de 96 pocillos y se expusieron a antgenos tales como

Como antgeno de filtrado de cultivo (CFA), rESAT6 o rAg85B durante 72 h. Los sobrenadantes de clulas se emplearon
para determinar la produccin de IFN por ELISA. Las clulas se aislaron del ganglio linftico inguinal a los 14, 21 y 40 das
despus de la vacunacin (A, B y C, respectivamente); Las clulas del bazo se aislaron a los das 14, 21 y 40 das despus
de la vacunacin (D, E y F, respectivamente). Se realiz el mismo procedimiento para clulas aisladas de los pulmones de
ratones vacunados (G, H, e I). Cada grupo de animales consista en 6 ratones en dos experimentos independientes.
ANOVA de dos vas y post-test de Bonferroni se realiz con el fin de identificar las diferencias entre los grupos; Los valores
de p <0,05 se consideran estadsticamente significativos.

2.8. anlisis estadstico Datos no paramtricos, una prueba de

comparaciones mltiples de Kruskal-Wallis
La normalidad de los datos se evalu a Fue empleado con el post-test de
travs de la Kolmogorov-Smirnov Dunn. Ensayos de inmunogenicidad
prueba. Los datos de distribucin normal se Basados en datos de produccin de
analizaron con una va Anal- interfern gamma se analizaron con ANOVA
Ysis de varianza (ANOVA) y el post-test de bidireccional usando el post-test de
Bonferroni. Para CFU Bonferroni. El anlisis estadstico de
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Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier valores de 0,05 se consideraron

se realizaron usando la prueba Log-rank. P significativos

Fig. 4 Tasa de supervivencia de animales vacunados desafiados con diferentes cepas de Mtb.

Varios grupos de animales fueron vacunados con construcciones de ADN, controles y BCG. Los animales inmunizados
fueron desafiados con la cepa H37Rv (A) y la cepa 5186 (B). Se registr diariamente la muerte de los animales. Veinte
animales fueron incluidos en cada grupo en dos experimentos independientes. Se realizaron curvas de supervivencia de
Kaplan-Meier, adems del anlisis estadstico usando el test log-rank; Un valor de p <0,05 se consider significativo.

3. Resultados determinada por inmunohistoqumica se

ilustra en la Fig. 2B y D; Ambas protenas
3.1. Las construcciones de vacunas fueron detectadas especficamente en el
de ADN se expresan y se traducen en citoplasma de clulas musculares estriadas
localizadas en el sitio de vacunacin
las clulas musculares de ratones

Con el fin de determinar si las clulas

musculares fueron transfectadas eficazmente 3.2. Las vacunas de dna de pDA y pDE
por electroporacin con vacuna de ADN, se inducen una respuesta inmune Th1
evalu la expresin in situ del ARNm y la especfica contra antgenos
protena del antgeno. La cintica para micobacterianos.
ESAT6 o Ag85B mRNA se representan en la
Fig. 2A y C, respectivamente. Posteriormente, probamos la
La expresin de ambas construcciones es inmunogenicidad de las construcciones
ms fuerte en el da 1, que presenta una vacunales.
disminucin progresiva hasta el da 14, Los ratones se inmunizaron mediante ADN
cuando se observ ms bajo de expresin. con las construcciones pE, pA, pDE, pDA y
La cintica de expresin de protena similar pDE + pDA evaluando la produccin de IFN
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de clulas T 14, 21 y 40 das despus de la
inmunizacin, midiendo los niveles de
citoquinas en los sobrenadantes de
suspensiones celulares de linfa inguinal
Nodos, bazo y pulmn despus de la
estimulacin con rESAT6, rAg85B o CFA. La
produccin de IFN a partir de clulas de
ganglios linfticos inguinales de animales
vacunados con cualquiera o ambas pDE y
pDA DNA vacunas demostr que hay una
respuesta especfica de estas clulas
cultivadas a estos antgenos
micobacterianos. Se han demostrado
diferencias significativas en animales
vacunados con pCMV, pE y pA en
comparacin con los vacunados con pDE y
pDA (p <0,0001), lo que confirma el papel
eficiente de mBD2 como coadyuvante que
induce una respuesta inmune ms fuerte.
Niveles similares de IFN- se detectaron en
los diferentes rganos a lo largo del
experimento, lo que indica que hay un efecto
sostenido en la produccin y elicitacin de
esta citocina (Fig. 3A-C).
3.3. Efecto protector de las vacunas
de ADN
Despus de confirmar la eficacia de
inmunogenicidad de nuestras vacunas de
ADN, las vacunas pE y pA no se emplearon
para experimentos adicionales porque tenan
diferencias no significativas con el control
(pCMV). Los animales fueron vacunados y
desafiados (Fig. 1) con cepas de diferentes
niveles de virulencia y genotipo. Se
analizaron la supervivencia, las cargas de los
bacilos pulmonares y las extensiones de
dao tisular (neumona) en cada punto de
sacrificio.
Higo. 4 muestra las curvas de supervivencia:
los animales control que recibieron slo el
vector vaco y que fueron desafiados con la
cepa de referencia H37Rv comenzaron a
morir despus de 2 meses y el 85%
sobrevivieron hasta el final del experimento.
Los animales vacunados con pDE
presentaron respuestas similares a pCMV,
mientras que los ratones vacunados con pDA
o ambos
PDE + pDA mostraron mejor supervivencia
(90%) que los del grupo control. Los ratones
vacunados con BCG y reforzados con ambas
vacunas de ADN mostraron una
supervivencia del 100% despus de 4 meses
de exposicin y hubo una diferencia
estadstica (p <0,04) cuando se compararon
con ratones vacunados con pCMV (Figura
4A). Se observaron resultados similares
cuando los ratones fueron desafiados con la
cepa LAM 5186 altamente virulenta; Los
ratones vacunados con pCMV murieron
despus de 30 das de i.t. infeccin, Y se
observaron tendencias de supervivencia
similares en ratones vacunados con pDE.
Los animales vacunados con pDA, BCG o
pDE + pDA murieron a los 40 5 das
despus de la estimulacin. En contraste, se
observ una supervivencia significativa en
animales vacunados primero con BCG y
reforzados con pDA y pDE, que demostr
una supervivencia doble (80 das; P <0,0001)
en comparacin con BCG solo.
Las curvas de supervivencia fueron
consistentes con las cargas de los bacilos
pulmonares, ya que los ratones inmunizados
con cualquier tipo de vacuna y desafiados
con la cepa H37Rv mostraron cargas de
bacilos significativamente menores que el
grupo de control en ambos puntos de tiempo,
con el menor en el grupo potenciado
inicialmente (Figura 5A y B). Se observaron
resultados similares en animales vacunados
desafiados con la cepa LAM 5186 altamente
virulenta. El grupo de animales vacunados
con pDA + pDE present cargas de bacilos
pulmonares mayores, pero no significativos
que el grupo vacunado con BCG, mientras
que este ltimo grupo present cargas de
bacilos ms altas pero no significativas que el
grupo previamente vacunado con BCG y
potenciado con Ambas vacunas de ADN
(figura 5C). Todos los grupos mostraron una
reduccin considerable en el rea neumnica
en comparacin con los ratones control, esto
es ms evidente al da 120.
Se observ una proteccin similar entre los
grupos vacunados con ambas vacunas de
ADN y el grupo vacunado con BCG, mientras
que este ltimo grupo mostr un rea
neumnica significativa cinco veces mayor
que el grupo previamente vacunado con BCG
y potenciado con ambas vacunas de ADN
(figura 6A y B). Se observaron resultados
comparables en ratones vacunados
desafiados con el virus altamente
virulento(Fig. 6C). Por lo tanto, la vacunacin
con las vacunas de ADN y la vacuna
potenciada con BCG confiere mayor
proteccin significativa al dao tisular que la
vacuna BCG sola.
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Fig. 5 Determinacin de unidades formadoras de colonias (UFC) en ratones inmunizados y sometidos a ensayo con dos
cepas de Mycobacterium tuberculosis diferentes.

Se inmunizaron grupos de ratones con vacunas de ADN, BCG y controles de acuerdo con la descripcin esquemtica de la
Fig. 1. Entonces, los animales fueron desafiados con varias cepas de Mtb y la determinacin de UFC se realiz en los
pulmones de animales infectados en diferentes puntos temporales. (A) Los animales fueron desafiados con la cepa H37Rv
y sacrificados a los das 60 y (B) 120 despus de la infeccin; (C) Se inmunizaron los ratones y despus se desafiaron con
la cepa 5186 y se sacrificaron a los 30 das despus de la infeccin. Se sacrificaron grupos de seis ratones por grupo en los
tiempos especificados, y los experimentos se repitieron tres veces independientemente. ANOVA de una va con la prueba
de mltiples comparaciones de Bonferroni se realiz para establecer la significacin estadstica. Los valores de P <0,05 se
consideraron estadsticamente significativos.

4. Discusin antgeno derivadas de ganglios linfticos

En este trabajo se utiliz una nueva
estrategia de vacunacin para inducir una
mayor respuesta protectora frente a Mtb
basada en el uso de una vacuna de ADN
conformada por mBD-2 y los antgenos
micobacterianos inmunodominantes ESAT-6
y Ag85B. Nuestros resultados de
inmunogenicidad basados en la liberacin de
IFN- a partir de clulas T especficas de
inguinales, bazo y pulmn confirman esta
propiedad demostrando que en la vecindad
inmediata del sitio de vacunacin (ganglio
linftico inguinal), en el sistema sistmico
Tanto en el medio (bazo) como en el pulmn,
ambas construcciones pDE o pDA indujeron
una mejor respuesta inmune en comparacin
con las construcciones que codificaban slo
los antgenos Ag85B (pA) y ESAT6 (pE), lo
que indica que la defensina-
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2 aument la respuesta inmune especfica
cuando se emple como
Adyuvante en el ADN construir, de forma
similar a los datos anteriormente informados
de otros antgenos objetivos, tales como el
VIH gp120 protena [22]. Este efecto es
probablemente debido a la maduracin ms
eficaz y la activacin de las clulas
dendrticas inmaduras (iDC) mediada por
mBD-2 en un TLR4 dependientes de la forma
[20]. Estos resultados son tambin
coherentes con los informes publicados en
los modelos de cncer, en el que las vacunas
de ADN que expresan -defensin-2 aument
la respuesta inmune especficamente contra
antgenos neoplsicos fuertes o poco
inmunognicos en diferentes tipos de cncer
[23, 24, 37]. Se ha demostrado en modelos
experimentales que la proteccin BCG
depende de la virulencia del organismo
infectante [38, 39].
De acuerdo con esto, las cargas de
neumona y bacilos determinadas a partir de
ratones vacunados con pDE o pDA
mostraron diferencias dependiendo de la
cepa de Mtb utilizada para el desafo. Estas
diferencias podran probablemente tambin
ser debidas a diferencias en la expresin de
ESAT6 o Ag85B, considerando que las cepas
con mayor expresin de antgenos ESAT6 o
Ag85B seran mejor reconocidas por los
animales vacunados con pDE y pDA. Sin
embargo, se necesitan ms estudios para
aclarar esta cuestinCuando pDA y pDE
fueron co-administrados, mostraron un efecto
protector similar en animales en comparacin
con los ratones vacunados con BCG,
particularmente cuando los animales estaban
infectados con la cepa 5186 altamente
virulenta. Esto es probablemente debido a
una mayor expresin de ESAT-6 y Ag85B por
esta cepa y tal vez por el papel de ambos
antgenos en la virulencia micobacteriana
[40, 41]. Por otra parte, varios informes
indican que uno de los factores que
participan en la variabilidad de la eficacia de
BCG est probablemente asociado con la
baja expresin y la ausencia de Ag85B y
ESAT6, respectivamente [9, 42]. Debido a
que la mayora de la poblacin humana en el
mundo en desarrollo ya est vacunada con
BCG, una estrategia atractiva sera impulsar
esta respuesta inmune existente. Adems,
los nios de pases endmicos donde la
vacunacin con BCG es una prctica
generalizada estn altamente sensibilizados
debido a la combinacin de la vacunacin
con BCG, las micobacterias ambientales y la
infeccin latente por TB. En estos A. R.
Cervantes-Villagrana et al. / Vacunacin 31
(2013) 676-684 683 ajustes, la revacunacin
BCG no aument la proteccin y por lo
general no se recomienda [43]. Esto est de
acuerdo con los estudios en animales que
muestran que la revacunacin con BCG
disminuye la eficacia [44] o puede producir
por interleucina (IL) -17 mediada por la
necrosis [45].
Por lo tanto, BCG, a pesar de su eficacia
variable, puede ser empleado como un
agente de cebado para un esquema de
vacunacin de refuerzo [46]. Por lo tanto, se
realiz la coadministracin de BCG ms pDE
+ pDA con el fin de complementar el
repertorio antignico necesario para generar
una mayor respuesta inmune. Considerando
la diversidad gentica entre las diferentes
sub-cepas de BCG que han mostrado
diversos niveles de proteccin, la eleccin de
la cepa BCG utilizada para la vacunacin es
un tema muy importante; Utilizamos el
substracto Phipps porque era el ms eficiente
en conferir proteccin entre 10 diferentes
cepas BCG en nuestro modelo murino [34].
Curiosamente, los ratones vacunados con
BCG Phipps potenciados con ambas
vacunas de ADN y estimulados con la cepa
5186 altamente virulenta mostraron una
proteccin significativamente mayor que los
ratones con una nica vacunacin de BCG,
lo que sugiere una mejora del repertorio
antignico por la respuesta inmune
polarizante de mBD2 Th-1 a ESAT6, Ag85B,
ms los antgenos BCG
 A.R. Cervantes-Villagrana et al. / Vaccine 31 (2013) 676 684

Fig. 6 rea neumnica en ratones inmunizados y desafiados con cepas de Mtb.

Los ratones fueron inmunizados con pDE, pDA, o pCMV ADN vacunas, empleando el vehculo como control. Sesenta das
despus de la vacunacin, los animales se infectaron con la cepa H37Rv o 5186. Los animales se sacrificaron entonces y
los pulmones izquierdos se fijaron con etanol y se embebieron en parafina. Despus de la tincin con Hematoxilina-
eosina (H & E), se determin el rea neumnica en el software de anlisis de imgenes. (A) Muestra el anlisis de rea
neumnica de ratones desafiados con la cepa H37Rv y sacrificados a los das 60 y (B) 120 despus de la infeccin; (C)
Despus de la inmunizacin, los ratones se desafiaron con la cepa 5186 y se sacrificaron a los 30 das despus de la
infeccin. Cada grupo consista en seis ratones, y tres experimentos se llevaron a cabo de forma independiente. ANOVA
unidireccional con post-test de Bonferroni se realiz para la evaluacin de las diferencias. P valores de p <0,05 se
consideraron estadsticamente significativos

5. Conclusin nueva estrategia podra mejorar en gran

Nuestros datos sugieren que el uso de
vacunas de ADN que contienen secuencias
codificantes para la defensina 2 induce una
respuesta adaptativa Th1 frente a antgenos
altamente inmunognicos de Mtb y cuando
estas vacunas de ADN se utilizaron para la
inmunizacin de refuerzo despus de la
vacunacin con BCG, fue producido. Esta
medida la eficacia de la vacuna BCG contra
cepas altamente transmisibles y virulentas,
como la cepa LAM 5186, lo que sugiere que
la mejora de la vacunacin con BCG
combinada con las vacunas de ADN en un
esquema de prime-boost es una buena
opcin para el diseo racional de un Eficaz
contra la tuberculosis.
 A.R. Cervantes-Villagrana et al. / Vaccine 31 (2013) 676 684
Conflictos de inters
Los autores declaran que no hay conflicto de
intereses
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por el Consejo
Nacional de Ciencia
Tecnologia-Mxico (CONACyT-Mxico
otorga CB-2007-01-82424 a BR-S y 84456 a
RH-P.
Los autores reconocen al Dr. Felipe
Villagrana-Flix por su ayuda en anestesia
animal. ARC-V reconoce al CONACyT-
Mxico por su nmero de beca 203661 / CVU
208395.
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