MANEJAR EL POTENCIAL DE LA BIODIVERSIDAD

GRACIAS A LA BIOTECNOLOGA

JOSE TEJEDOR
NDICE

QU ES LA BIODIVERSIDAD?

QU ES LA BIOTECNOLOGA?

SELECCIN DE MICROORGANISMOS

MEJORA DE MICROORGANISMOS

CONTROL DE MICROORGANISMOS
QU ES LA BIODIVERSIDAD?
 Variedad de especies animales y vegetales
R.A.E.
en su medio ambiente

Diversidad de especies de plantas, animales, hongos y microorganismos

que viven en un espacio determinado.
Su variabilidad gentica.

Los ecosistemas de los cuales forman parte estas especies.

Los paisajes o regiones en donde se ubican los ecosistemas.

Gentica o diversidad intraespecfica: diversidad de

los genes (alelos) y de su distribucin, base de las
variaciones interindividuales (la variedad de los
genotipos).

Diversidad interespecfica, que consiste en la

pluralidad de los sistemas genticos o genomas
que distinguen a las especies.

Diversidad Ecosistmica, la diversidad de las

comunidades biolgicas (biocenosis) cuya suma
integrada constituye la biosfera.
Y si hablamos de BIODIVERSIDAD en ENOLOGA

Levaduras: Funcin primaria/ Funcin Secundaria

No Saccharomyces:
Brettanomyces, Candida, Torulaspora,
Hansenula, Hanseniaspora, Klockera,
Kluyveromyces, Pichia, Rhodatorula ,
Zygosaccharomyces,

Bacterias : Fermentacin malolctica

Mohos : Vendimias tardas, vinos botritizados

Penicillium Aspergillus Botrytis
QU ES LA BIOTECNOLOGIA?
 Ciencias de Productos, bienes y
la vida servicios mediante
el empleo de
sistemas biolgicos

Ciencias de la
Microorganismos, clulas
ingeniera
animales y vegetales, animales
y plantas, o partes de ellos

Medicamentos y tratamientos personalizados. Sistemas

de diagnsticos ms rpidos, eficaces y seguros.
Diseo de vacunas biotecnolgicas.

Biocombustibles y productos renovables como

bioplsticos. Uso de biodetergentes. Tratamiento
de residuos y depuracin.

Mejoras en la eficiencia de los procesos

biotecnolgicos clsicos (vino, cerveza,
pan, productos lcteos). SELECCIN ,
MEJORA Y CONTROL de microrganismos
 HISTORIA DE LA BIOTECNOLOGA
Sociedades orientales descubren
7000 A.C
la fermentacin gracias a la
fabricacin de la cerveza

6000 A.C. Yogur y quesos realizados gracias a la

fermentacin con bacterias lcticas.

Los egipcios fabrican pan 4000 A.C.

gracias a levaduras

250 A.C. Los griegos practican la rotacin de

cultivos en para una mxima
optimizacin de los suelos

Los chinos utilizan el Crisantemo 100 A.C.

como un insecticida natural
 Louis Pasteur LA BIOTECNOLOGA MODERNA
1862
descubre el origen
de la fermentacin 1863 Gregor Mendel descubre las
leyes de la herencia gentica.
Creacin de 1895
LAFFORT
1928 Alexander Fleming
descubre la penicilina
Primeras cepas de levaduras 1930
seleccionadas en Enologa
1953 James D. Watson y Francis Crick
escriben la estructura del ADN.
Primera LSA en Enologa 1960

1983 Aparece la tcnica de la Polymerase

Chain Reaction (PCR).
1989
ZYMAFLORE VL1, F10
1993
1994 Identificacin y revelacin de
aromas de Sauvignon:
ZYMAFLORE VL3
Purificacin de enzimas frente a la
1996
actividad cinamol esterasa :
LAFASE HE GRAND CRU
2004 Tecnica de cruzamiento
(breeding) para levaduras:
ZYMAFLORE X5
Ecoseleccin de levaduras 2011
no-Saccharomyces :
ZYMAFLORE ALPHA TD
 SELECCIONAR
MICROORGANISMOS
SELECCIN, MEJORA Y CONTROL GNETICO DE LEVADURAS
Por qu seleccionar?
- Para aislar y caracterizar nuevas cepas
- Para obtener FA seguras, ptimas y con una calidad reproducible

Cmo ?
de la flora autctona
- Mediante screening a partir
o una LSA
LAS TCNICAS UTILIZADAS
La seleccin clonal - masal de individuos

1) A partir de la flora autoctona

Seleccin en Seleccin en mosto

el viedo de FA espontaneas
Aislamiento de clones
de Saccharomyces y
de no-Saccharomyces

Identificacin, Caracterizacin Microvinificacin

a partir de un
- PCR, QPCR y PCR inter
- PCR RFLP de ADN mitocondrial cultivo puro
- PCR asociada a -satlites (single cell origin)

Anlisis, degustacin y posterior

seleccin de clones de inters
2) A partir de cepas comercializadas (LSA)
Evidencia de mutantes (espontneos) a partir de una cepa haploide con el fin de
visualizar mutaciones regresivas Pueden utilizarse agentes mutgenos externos:
UV, rayos X,
CMO IDENTIFICAR?
 MUESTRA

ANLISIS DIRECTOS ANLISIS INDIRECTOS

(sin cultivo) (con cultivo)

AISLAMIENTO BIOMASA
PCR EPIFLUORESCENCIA
DE COLONIAS CULTIVABLE
CULTIVABLES

Determinacin Determinacin de la Determinacin de PCR / Q-PCR / Inter

de especies cantidad de clulas cantidad de especies Determinacin de la
viables. de poblaciones especie y de la
Determinacin de segn el medio de cantidad de la especie
especies de cultivo; (Q-PCR).
poblaciones y
morfologa;

Diversidad interespecifica de la Diversidad interespecifica de la

POBLACION VIABLE POBLACION VIABLE Y CULTIVABLE
CONTROL, SELECCION Y MEJORA GENETICA DE LEVADURAS
Por qu seleccionar?
- Para aislar y caracterizar nuevas cepas
- Para obtener FA seguras, optimas y con una calidad reproducible

Cmo ?
- Mediante screening a partir de la flora autctona una LSA

Por qu mejorar ?
- Porque la levadura enolgica perfecta no existe.todava
 MEJORA DE
MICROORGANISMOS
 CARACTEREISTICAS NO DESEABLES

Azcares

NH4+
Amino cidos

Urea,
Carbamato de etilo

H2S y
exceso Produccin de espuma
de SO2

Etanal y cido
compuestos que Actico
combinan el SO2
Azucares
Reductores
Alcohol
 CARACTEREISTICAS DESEABLES

Tolerancia a Azcares Tolerancia

Temperaturas al SO2
NH4+
Killer Amino cidos

Tioles y Terpenos

POF - Esteres y Alcoholes

Superiores
Glicerol
Autlisis

Resistencia al
Hsp12
choque osmtico
Alcohol
CONTROL, SELECCION Y MEJORA GENETICA DE LEVADURAS
Por qu seleccionar?
- Para aislar y caracterizar nuevas cepas
- Para obtener FA seguras, optimas y con una calidad reproducible

Cmo ?
- Mediante screening a partir de la flora autctona o una LSA

Por qu mejorar ?
- Porque la levadura enolgica perfecta no existe.todava
Cmo ?
- Mediante dos enfoques complementarios:
la gentica clsica (hibridacin, retrocruzamiento, rare-mating)
- Enfocada a caractersticas complejas,
- Falta de especificidad
- No necesita conocer el genoma.
la tecnologa del ADN recombinante (electroporacin, biolistica)
- Busca caractersticas simples, bien definidas genticamente
- Permite intervenciones precisas
- Necesita conocer la secuencia del gen codificador
 LA GENTICA CLSICA

Ventajas:

Mejora de una caracterstica compleja, genticamente si esta

codificada por un gen o un nmero pequeo de genes.

De la misma manera que las levaduras mutantes, los hbridos no

son OGM, (es decir no contienen ADN extranjero).

Limites:

Caractersticas bajo control polignico: por ejemplo la utilizacin

de azcares, floculacin,

En determinados casos mejora de una caracterstica en detrimento

de una otra, por la falta de particularidad.

Control mitocondrial parcial de ciertas caractersticas: utilizacin de

sacarosa, floculacin.

TCNICAS:
 HIBRIDACIN Y RETROCRUZAMIENTOS

Para qu sirve la hibridacin?

Cruce de dos esporas de dos cepas
Introgresin en una cepa el carcter de una otra

LA condicin: conocer a nivel gentico donde se encuentra

el carcter a introducir - QTL = Quantitative Trait Loci

Chr A Chr B Chr E Chr G Chr H Chr I

Chr C Chr F (POF-)

Fructofilo/ Resistancia AV- POF- Fase de +++

velocidad temperatura latencia 4MMP
de FA corta

P.Marullo,
BREEDING Y RETROCRUZAMIENTOS DIRIGIDOS
Cepa B :
Cepa A : capacidades fermentativas
Debil produccion de SO2 y compuestos
Pureza aromatica y gustativa que combinan el SO2
Cruzamiento
HERRAMIENTAS
Cepa AB (50 % A + 50 % B)

Cruzamiento
Micro-
manipulador
Cepa A+ (75 % A + 25 % B)
para realizar los
Cruzamiento cruzamientos

Cepa A2+ (87,5 % A + 12,5 % B)

Cruzamiento Mini-
fermentadores
para experimentar
Debil SO2 y Cepa A3+ (93,75 % A + 6,25 % B) los cruzamientos
compuestos que lo
combinan.
Perdida de alguna Cruzamiento Cepa C :
capacidad fermentativa Capacidad fermentativa

CEPA A3+C (50 % A3+ + 50 % C) : ZYMAFLORE XPURE

Pureza aromatica y volumen gustativo.

Debil produccion SO2 y compuestos que lo combinan
 CONTROL DE
MICROORGANISMOS
 CONTROL DE LA FLORA DE LOS MOSTOS
Existen alrededor de 50 especies diferentes de microorganismos en los racimos
de uvas. Las principales especies contabilizadas son:
Saccharomyces cerevisiae : menos de 5%
No - Saccharomyces: Kloeckera/Hanseniaspora (50 - 75%)
Candida, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula ,Torulaspora
Mohos, Bacterias

Factores que afectas dichas poblaciones :

Climticos
Estado de madurez de la uva
Presencia de pesticidas
Bayas daadas

S. cerevisiae no es dominante a la entrada de la uva, en la recepcin del mosto. Su

poblacin aumenta durante la FA gracias a la contaminacin con el material de bodega.
Contaje de Levaduras Log10 cel/mL)

o S cerevisiae
Kloeckera/Hanseniaspora
Candida

Tiempo de Fermentacion (dias)

(Fleet, 1990)
 ATENCIN A LOS RESULTADOSANALITICOS DE LA
FLORA AUTCTONA

Species Ethanol (%) Propanol Isobutanol (mg/L) Isoamylalcohol (mg/L) 2-Phenylethanol

(mg/L) (mg/L)
S. cerevisiae 6-23 9-170 5-78 17-330 5-83
K. apiculata 5-6.5 16-32 4-38 4-17 21-27
C. stellata 4.5-6.5 4-8 13-21 - 6-11
H. anomala 0.2-4.5 3-15 18-29 11-25 27

Species Acetic acid (g/L) Ethyl acetate (mg/L) Isoamylacetate (mg/L) Acetaldehyde (mg/L)
S. cerevisiae 0.3-0.8 10-100 0.1-16 50-120
K. apiculata 1-2.5 25-375 0.4-5 6-40
C. stellata 1-1.3 7-25 0.1-0.4 -
H. anomala 1-2 137-2150 1-11 -

(Fleet, 1993)
PERO TAMBIEN. EXPLORACIN DE LA BIODIVERSIDAD
Especies utilizadas Objetivo Proceso Referencias

S. cerevisiae Reduccin de la Castelli (1969); Herraiz et al.

produccin Cultivos Secuenciales (1990); Ciani et al. (2006); Salmon
T. delbrueckii de cido actico et al. (2007); Bely et al. (2008)

S. cerevisiae Cultivos secuenciales Snow & Gallender (1979); Magyar

Degradacin de cido
& Panyik (1989); Yokotsuka et al.
S. pombe
mlico
Clulas inmovilizadas (1993); Ciani (1995)
Una levadura no-
Saccharomyces
S. cerevisiae Aumento del Pretratamiento o Ciani & Ferraro (1996); Ciani &
contenido de cultivos Ferraro (1998); Ferraro et al.
sin defectos
C. cantarellii glicerol secuenciales (2000) organolepticos y
Herraiz et al. (1990); Zironi et al. compatible con
S. cerevisiae
La simulacin de la Mezcla o cultivo (1993); Moreira (2005); Ciani et al. S. cerevisiae
fermentacin natural secuencial (2006); Moreira et al. (2008);
H. uvarum (K. apiculata)
Mendoza et al. (2007) (neutra vis--vis de
S. cerevisiae
Reduce la produccin la toxina killer K2)
de Cultivos Mora et al. (1990); Ciani et al.
Aumento de la acidez secuenciales (2006); Kapsopoulou et al. (2007)
K. thermotolerans
titulable
S. cerevisiae Reduccin del
Fermentacin
contenido de Kim et al. (2008)
mixta
Issatchenkia orientalis cido mlico

Incremento del
S. cerevisiae
volumen y Cultivos
Clemente-Jimnez et al. (2005)
complejidad secuenciales
Pichia fermentans
aromtica
S. cerevisiae
Fermentacin
Aumento tiol varietal Anfang et al. (2009)
mixta
Pichia kluyveri

S. cerevisiae Mejorar el perfil

Fermentacin Zohre & Erten (2002); Jolly et al.
aromtico
mixta (2003)
Candida pulcherrima del vino

S. cerevisiae Aumento de la
Fermentacin
concentracin de Garca et al. (2002)
mixta
Debaryomyces vanriji geraniol

(P. Renault, 2010)

 VENTAJAS NATURALES Y SELECCIN :
PRODUCCIN DBIL DE AV - FENOLES VOLTILES
2,0
1,8

Acidez Voltil (g/L cido actico)

1,6 240 g/L 350 g/L (Medio sintetico)
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
SB C D E F N H J K O P R G I

S. cerevisiae T. delbrueckii Renault et al.,2009

(mg/L)

35

30
volatils (mg/L)

25
voltiles

20

15
Phnols
Fenoles

10

0
POF+ POF- V C D E F W L M N O X B A R G H I J K S T Y U

S. cerevisiae T. delbrueckii
Renault et al.,2009

Gran variedad fenotpica : consideracin importante para una buena seleccin de cepa
 UNA GRAN VARIEDAD FENOTIPICA

Renault et al.,2009
Distribucin de cepas de T. delbrueckii strains en funcin del vigor fermentativo a 17 C
(n=11) y 24 C (n=16) en medio sinttico 240 g/L.

1. Buena capacidad fermentativa para una no-Saccharomyces

2. Tasa de crecimiento y cintica fermentativa mas lenta que S.
cerevisiae.
3. Rendimiento alcohol equivalente al de S. cerevisiae
4. Produccin etanol dbil por lo que no es una
solucin fermentativa completa
5. Desarrrollo de una levadura no- Saccharomyces
 Ensayos en laboratorio y en bodega

Precisin del protocolo de inoculacin

Objetivo: IMPACTO DE AlphaTD SOBRE LOS

AROMAS EN BLANCOS Y TINTOS

Rol de AlphaTD sobre la revelacin de tioles

Rol de AlphaTD sobre el aspecto afrutado

 Rol de AlphaTD sobre la revelacion de tioles
Vinificaciones en laboratorio
Inoculacin secuencial / inoculacin simultanea / cepas puras
Medicin de tioles varietales

Una perspectiva original : el seguimiento de pre

+++AlphaTD +++S.c.
Pgsh-3SH Pcys-3SH 3SH
 Rol de AlphaTD sobre el aspecto afrutado
Vinificaciones en laboratorio
Inoculacin secuencial / inoculacin simultanea / cepas puras
Medicin de esteres fermentativos
T. delbrueckii pure Sequential mixed Simultaneous S. cerevisiae pure
Compounds
culture culture mixed culture culture

Main esters (g/L)

Butyrate dthyle 29.15 3.88 219.59 13.53 343.01 15.75 286.38 20.14
Hexanoate dthyle 119.83 9.82 671.19 27.35 1195.13 59.87 1300.69 95.82
Octanoate dthyle 186.95 12.78 580.44 41.33 1364.16 90.75 1407.30 130.36
Decanoate dthyle 457.74 69.36 532.73 17.09 878.01 38.26 613.79 40.85
Actate disoamyle 63.90 1.38 3834.19 101.47 4956.73 83.85 1828.01 62.74
Actate dhexyle 3.89 0.98 178.80 16.95 219.20 16.32 235.94 15.59
Phnylthyle dactate 53.15 10.02 454.61 68.87 539.70 31.46 435.16 3.50

Sum 914.62 104.37 6471.56 286.63 9495.95 336.30 6107.29 369.02

Minor esters (g/L)

Proponoate dthyle 195.23 31.69 233.22 8.13 110.15 13.99 37.05 10.05
Isobutyrate dthyle 24.05 1.94 41.24 2.60 24.49 2.04 8.84 1.07
Actate de propyle 11.14 1.98 56.15 10.53 53.37 3.42 35.81 3.87
Actate disobutyle 11.58 0.94 98.59 8.75 102.60 5.34 50.69 2.67
2-mthylbutyrate d'thyle 0.49 0.08 1.38 0.22 0.87 0.04 0.87 0.08
Isovalerate dthyle 0.34 0.05 1.28 0.07 1.11 0.09 2.04 0.13
Actate de butyle 0.12 0.01 2.74 0.23 5.14 0.63 2.75 0,00
Ethyl trans 2-hexanoate 0.25 0.04 1.73 0.11 1.24 0.06 0.71 0.02
Actate doctyle 0.05 0.04 0.21 0.03 0.71 0.06 0.81 0.16
Dodecanoate dthyle 9.26 0.85 15.00 3.30 40.74 2.76 43.22 3.19
Phnylactate dthyle 0.10 0.00 0.27 0.05 0.20 0.00 0.43 0.06
Dihydrocinnamate d'thyle 14.00 1.35 1.26 0.19 0.336 0.04 0.20 0.01
Cinnamate dthyle 1.12 0.00 1.08 0.03 1.04 0.01 1.08 0.01

Sum 268 2.94 454 35.56 342 29.97 185 22.49

Total sum 1182 107.32 Proporcin

6925 322.20mas 9837 366.27 6291 391.52
importante
 Que incidencia AROMTICA?
Ensayos en Bodega sobre Merlot
Inoculacin secuencial / inoculacin S. cerevisiae pura
Ajuste del ensayo S. cerevisiae pura al nivel de 3 esteres menores de la
modalidad secuencial

AlphaTD S.c.
+ S.c. Propanoate
dthyle
S.c. Isobutyrate
dthyle
Hydrocinnamate
Carcter Frutal Complejidad dthyle Carcter Vegetal

AlphaTD S.c S.c.+ AlphaTD S.c S.c.+ S.c S.c.+

AlphaTD
S.c. Adiciones S.c. Adiciones S.c. Adiciones

La inoculacin secuencial AlphaTD y S. cerevisiae, va la

produccin de esteres especficos, contribuye a :
Aumentar la fruta y la complejidad de los vinos
Pulir las notas vegtales
 Ensayo en bodega : Inoculacin secuencial
--

Zymaflore Alpha TD y Zymaflore RX60

Introduccin de S. cerevisiae 36 horas despus de la inoculacin de T.

delbrueckii.

1. 30 g/hL Zymaflore Alpha TD n.sacch.

Importante : rehidratacin en agua a 25 -30 C sin Superstart.

2. 36h despus introduccin de Zymaflore Alpha TD

Adicion de 20 g/hL de Zymaflore RX60 y Superstart Rouge.

 TEMPRANILLO BAIGORRI RIOJA ESPAA
12.5% vol, ph 3.7, , AM 2.9 g/L 1 bazuqueo/dia Trasiego Inoculacin con Fin FML
AT 5.7 g/L A.Tartrique durante la FA 05 Oct 450 PreAc (1 g/hL) 01 Nov

1110
RX60
1090
Alpha + RX60 (36h)
1070

1050
Densidad

1030

1010

990
23-9-10
24-9-10
25-9-10
26-9-10
27-9-10
28-9-10
29-9-10
30-9-10
1-10-10
2-10-10
3-10-10
4-10-10
5-10-10
Zymaflore Alpha
RX60 + Superstart +RX60 avec
Superstart (+36)

AT (g/L ac tartrique) 4,9 4,6

AV (g/L H2S04) 0,19 0,21
Ac tatrique (g/L) 2,81 2,72
Ac lactique (g/L) 2,02 2,03
Ac malique (g/L) 0,59 0,52
Sucres rducteurs (g/L) <1,5 <1,5
Fructose + glucose (g/L) <1,2 <1,2
Glycrol (g/L) 6,96 9,41
TAV (% vol) 12,4 12,6
pH 3,8 3,9
 RESULTADOS DE DEGUSTACIN

Persistencia RX60
Persistance
Aromtica
aromatique Alpha + RX60 Frutos rojos
Fruits rouges
5,0 5,0
4,0 4,0
3,0 3,0
2,0 Volumen Vegetal 2,0 Frutos negros
Amargor
Amertume Volume Vgtal Fruits noirs
1,0 1,0
0,0 0,0

Acidit Astringence Bois

Roble Fracheur aromatique
Frescor Aromtico
Acidez Astringencia

Degustacin asociacin de enlogos de Bordeaux, 16 meses despus de FA

TEST DE PREFERENCIA

13 degustadores /16 han preferido la modalidad Alpha+RX60 +36 horas

ZYMAFLORE ALPHA - UNA CEPA ESPCIFICA
Torulaspora delbrueckii Saccharomyces cerevisiae

Microscopio Electronico, Aumento X 24000

Bordeaux Imaging Center - Ple d'Imagerie Electronique - Universit Bordeaux 2.

Dbil produccin de acidez voltil.

No produce fenoles voltiles (POF -).
Dbil produccin de Etanal y de acetato de etilo.
Dbil produccin de H2S
Perfil organolptico complejo
Impacto neto y positivo en el volumen y la
duracin en boca
Pureza y complejidad aromtica importantes
 TAKE HOME MESSAGE
TECNOLOGIA de ltima generacin:

CONOCIMIENTO y SAVOIR FAIRE - Expertos en

BIOTECNOLOGA

BIODIVERSIDAD Levaduras Saccharomyces y No-

Saccharomyces,

No -Saccharomyces: Torulaspora
delbrueckii,

Trabajo exhaustivo de bio-seleccin :

ZYMAFLORE ALPHA TD
MUITO OBRIGADO!!