UNIVERSIDAD AUTNOMA

METROPOLITANA UNIDAD XOCHIMILCO

Aislamiento e identificacin de
microorganismos con capacidad
amiloltica
Paloma Vallejo Armenta
 Tabla de contenido
Objetivos...................................................................................................................3
Objetivo general:................................................................................................................. 3
Objetivos especficos:......................................................................................................... 3
Marco terico...........................................................................................................3
Caractersticas estructurales y funcionales de las amilasas................................................4
-amilasa........................................................................................................................ 4
-amilasa........................................................................................................................ 5
y-amilasa......................................................................................................................... 5
Almidn............................................................................................................................... 5
Microorganismos productores de amilasas.........................................................................6
Importancia industrial de las amilasas.................................................................................7
Fundamentos de las tcnicas..............................................................................................8
Mtodos de siembra........................................................................................................8
Test de lugol.................................................................................................................... 8
Aplicacin espectrofotomtrica.......................................................................................9
Tincin de Gram.............................................................................................................. 9
Pruebas bioqumicas.......................................................................................................9
Justificacin...........................................................................................................10
Hiptesis.................................................................................................................10
Metodologa............................................................................................................10
1.1. Obtencin, transporte y procesamiento de la muestra...............................................10
1.1.1. Tierras frtiles y composta:.................................................................................10
1.1.2. Cscara de papa:................................................................................................11
1.1.3. Saliva humana:....................................................................................................11
2.1. Preparacin de medios de cultivo (g/L).......................................................................11
2.2. Inoculacin de las muestras en los medios de cultivo................................................12
2.2.1. Sembrado por esparcido.....................................................................................12
3.1. Aislamiento de las cepas por la tcnica sembrado por estra.....................................12
3.2. Identificacin semicuantitativa de la actividad amiloltica (revelado de la zona de
hidrolisis de almidn con lugol).........................................................................................12
3.3. Comparacin de los microorganismos amilolticos.....................................................12
4.1. Preparacin del caldo de almidn..............................................................................12
4.2. Inoculacin del caldo..................................................................................................13
4.3. Comparacin cuantitativa de la actividad amiloltica...................................................13
5.1. Identificacin de microorganismos con actividad amiloltica.......................................13
5.1.1. Tincin de Gram..................................................................................................13
5.1.2. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias con actividad amiloltica
...................................................................................................................................... 14
Referencias.............................................................................................................14

2
Objetivos
Objetivo general:
- Aislar e identificar microorganismos con capacidad amiloltica procedentes de
tierras frtiles, compostas, cscara de papa y saliva humana.

Objetivos especficos:
1. Recolectar y procesar muestras de diferentes fuentes para obtener
microorganismos productores de amilasas
2. Formular e inocular medios de cultivo de microorganismos productores de
amilasas
3. Aislar y seleccionar microorganismos productores de amilasa
4. Evaluar cepas mediante el test de lugol para seleccionar las de mayor actividad
amiloltica
5. Identificar cepas con mayor actividad amiloltica mediante pruebas bioqumicas.

Marco terico
La biotecnologa es la aplicacin de los principios cientficos y tcnicos al
tratamiento de materiales por los agentes biolgicos para obtener los productos
utilizados en las industrias farmacuticas, biomdicas, de alimentos y de
transformacin de materias primas. El uso de la biotecnologa desde la primera
mitad de nuestro siglo se fundamenta en las propiedades de las enzimas y
persigue principalmente mejorar las cualidades de los alimento (Lpez, 2014)
El uso de microorganismos en esta rama tiene como propsito la obtencin de
productos ampliamente usados en la industria; Las enzimas son polmeros
formados por aminocidos covalentemente unidos entre s, que catalizan en los
organismos una gran variedad de reacciones qumicas. Su actividad cataltica
depende de que mantengan su plegamiento y de la estructura tridimensional que
presentan; dicha estructura forma cavidades, llamadas sitios activos, los cuales
muestran afinidad por ciertas molculas especficas llamados sustratos. En
combinacin con los diferentes grupos funcionales que presenta el sitio activo y el
sustrato se generan interacciones covalentes y no covalentes, formando un
complejo llamado Enzima-sustrato que da lugar a un producto. Las enzimas se
encuentran clasificadas en 5 grandes clases o grupos, en funcin de su accin
cataltica especfica: xidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, ligasas
(Ramrez y Ayala, 2014).

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En el presente trabajo nos centraremos en las hidrolasas. Actan en la reaccin
de la degradacin del almidn

Caractersticas estructurales y funcionales de las amilasas

Las amilasas tienen una estructura tridimensional capaz de unirse al sustrato y por
la accin de grupos catalticos altamente especficos favorece la rotura de los
enlaces glucosdicos (Monteiro y Oliveira, 2010). Este tipo de enzimas se dividen
en 3 tipos: -amilasa, -amilasa y -amilasa.

-amilasa
Las -amilasas pertenece a una familia de endo-amilasas que cataliza la hidrlisis
inicial del almidn en oligosacridos ms cortos a travs de la escisin de enlaces
-D- (1-4) glicosdicos como se muestra en la figura1.
Los productos finales de la accin de la -amilasa son oligosacridos de longitud
variable con una configuracin y dextrinas -limitadas, que constituyen una
mezcla de maltosa, maltotriosa y oligosacridos ramificados de 6-8 unidades de
glucosa que contienen tanto - 1,4 y -1,6 Otras enzimas amilolticas participan en
el proceso de descomposicin del almidn, pero la contribucin de la -amilasa es
la ms importante para el inicio de este proceso (Monteiro y Oliveira, 2010). La
actividad hidrolitica se encuentra a un pH de 7 (Sundarram y Krishna, 2014).

Figura 1. Enlace -1,4 en el almidn

Fuente: Marshall University

-amilasa
Las -amilasas son enzimas exo-hidrolasas que acta a partir del extremo no
reductor de una cadena polisacrida por hidrlisis de enlaces -1, 4-glucano para
producir unidades sucesivas de maltosa. Dado que es incapaz de escindir enlaces

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ramificados en polisacridos tales como glicgeno o amilopectina, la hidrlisis es
incompleta y quedan unidades de dextrina. Las fuentes primarias de -amilasa
son las semillas de las plantas superiores y las papas. El pH de la enzima oscila
entre 4,0 y 5,5 (Sundarram y Krishna, 2014).

y-amilasa
Las -amilasas escinden los enlaces glucosdicos (1-6), adems de romper los
ltimos enlaces (1-4) glicosdicos en el extremo no reductor de amilosa y
amilopectina, a diferencia de las otras formas de amilasa produciendo glucosa. La
obtencin de este tipo de amilasa es ms eficiente a un pH de 3 (Sundarram y
Krishna Murthy, 2014).

Almidn
El almidn es un polmero de glucosa unido entre s a travs del enlace entre el
oxgeno y C1, conocido como enlace glicosdico. Este enlace glicosdico es
estable a pH alto, pero se hidroliza a pH bajo. Al final de la cadena polimrica est
presente un grupo aldehdo latente. Este grupo se conoce como el extremo
reductor.
En el almidn estn presentes dos tipos de polmeros de glucosa: (i) amilosa y (ii)
amilopectina. La amilosa es un polmero lineal que consta de hasta 6000 unidades
de glucosa con enlaces 1-4 glicosdicos (Van der Maarel et.al, 2002).

Microorganismos productores de amilasas

Las amilasas son las enzimas termoestables ms ampliamente utilizadas que se
desarrollan en varios escenarios, comnmente halladas en animales y plantas; sin
embargo, para fines industriales las ms empleadas son aquellas aisladas de
microorganismos (Snchez, Meja, 2004).
Gran variedad de bacterias emplean enzimas extracelulares o intracelulares
capaces de convertir almidn o glicgeno que pueden servir como fuentes de
energa y carbono. Hay bsicamente cuatro grupos de enzimas de conversin del
almidn: (i) endoamilasa; (Ii) exoamilasas; (Iii) enzimas desramificadoras; y (iv)
transferasas (Van der Maarel, et.al, 2002). Las cuales se muestran en la figura 2

5
 Figura 2 Diferentes enzimas involucradas en la degradacin del almidn

Fuente: Van der Mareel M., et.al (2002)

Las bacterias y hongos tienen una adaptabilidad extraordinaria ya que pueden

colonizar habitats terrestres y marinos, producen enzimas degradadoras de
protenas, lpidos y carbohidratos. Estos microorganismos con caractersticas
enzimticas brindan una opcin en la obtencin de metabolitos que puedan ser
usados, ampliamente para la produccin y estudio de la hidrlisis del almidn La
actividad amiloltica de los microorganismos se da principalmente por medio de la
accin de enzimas extracelulares como es el caso del gnero Bacillus (Snchez,
y Meja, 2004),Clostridium thermosacharolyticum, Cl. Thermohydrosulfuricum y
Pseudomonas sp. (Basma et.al., 2015).

Importancia industrial de las amilasas

Las amilasas son una de las principales enzimas utilizadas en la industria. Tales
enzimas hidrolizan las molculas de almidn en polmeros compuestos de
unidades de glucosa.
Dentro de los usos de las -amilasas se encuentra la hidrlisis del almidn para la
produccin de jarabes de fructosa y glucosa. En la industria de detergentes las
amilasas son el segundo tipo de enzimas utilizadas en la formulacin para mejorar
la capacidad de los detergentes en la eliminacin de manchas difciles y hacer

6
que el detergente sea ambientalmente seguro. As mismo se emplea en la
produccin de alcohol. Las -amilasas tambin se utilizan en la industria de la
panadera, en la industria textil para el proceso de desensado y en la industria del
papel para la modificacin de almidn de papel revestido (Monteiro y Oliveira,
2010).

Por su parte las -amilasa se emplean en estudios estructurales de almidn y

molculas de glucgeno. Se utiliza para la fermentacin en la industria cervecera y
de destilacin y en la produccin de jarabes de maltosa (Monteiro y Oliveira,
2010).

Fundamentos de las tcnicas

Mtodos de siembra
Existen varias tcnicas de aislamiento; basadas en el uso de un medio de cultivo
slido, en el cual los microorganismos dan origen a colonias separadas
Entre los mtodos de aislamiento ms frecuentes se encuentran:

Siembra por diseminacin en superficie: Este mtodo consiste en

colocar 0.1 mL del inculo en el centro de una placa de Petri con medio de
cultivo. Se extiende con esptula de Drigalsky , mientras se hace girar la
placa, se tapa, se invierte la placa y se lleva a incubar (Negroni, 2009).
Siembra por estra: Se trata de un mtodo rpido y simple de agotamiento
progresivo y contino del inculo (material microbiano utilizado para
sembrar un medio de cultivo) sobre un medio slido contenido en una caja
de Petri. A medida que se realizan estras las bacterias pasan del asa al
medio en un nmero cada vez menor, de manera que las estras iniciales
proporcionan un crecimiento confluyente, mientras que a lo largo de las
ltimas estras se desarrollan colonias bien aisladas .

Test de lugol
Las cepas productores de enzimas hidrolticas del almidn se detectan al observar
un halo de degradacin del almidn, es decir, un crculo claro alrededor de las

7
colonias amloliticas. Este halo se produce debido a la ausencia de almidn en el
medio; ya que en la presencia de almidn el lugol se acompleja con el polisacrido
dando una coloracin negra azulada (Gonzlez, 2004).

Aplicacin espectrofotomtrica
Dicho mtodo tiene una aplicacin espectrofotomtrica en la que la absorbancia
se puede leer despus de que se haya terminado la reaccin del sustrato
enzimtico. Esto da una medida de la magnitud de hidrlisis del almidn por -
amilasa (Sundarram y Krishna, 2014).

Tincin de Gram
Esta tcnica diferencia las bacterias en dos variedades fundamentales de clulas.
Se dice que las bacterias que conservan la coloracin inicial por el cristal violeta
(prpura) son "gram-positivas", mientras que las que se decoloran y se tien de
safranina se dice que son "gram-negativas". Esta respuesta de tincin se basa en
las caractersticas qumicas y estructurales de las paredes celulares de las
bacterias. Los gram positivos tienen una pared gruesa y relativamente
impermeable que resiste la decoloracin y est compuesta por peptidoglicano y
polmeros secundarios; mientras que los gram negativos tienen una delgada capa
de peptidoglicano ms una bicapa lipoproteica conocida como membrana externa
que puede ser decolorada (Beveridge, 2001).

Pruebas bioqumicas
La identificacin del microorganismo se realiza con una serie de pruebas de
caracterizacin que incluye: forma y disposicin celular, tipo de metabolismo,
propiedades tintoriales, etc. aunado a las pruebas bioqumicas, las cuales
permiten determinar las caractersticas metablicas de las bacterias para su
clasificacin. Algunas de estas pruebas son tcnicas rpidas, ya que evalan la
presencia de una enzima preformada y su lectura vara en funcin de los
reactivos, las condiciones de incubacin y el tiempo de lectura (Cantn, 2010).

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Justificacin
Hoy en da, el potencial uso de microorganismos como fuente biolgica de
enzimas industrialmente econmicas ha estimulado el inters en la explotacin de
la actividad enzimtica extracelular en varios microorganismos. (Basma et.al.,
2015). Debido a la importancia que conlleva el uso de enzimas que hidrolizan
polmeros complejos como el almidn para la obtencin de azcares de inters
industrial, surge la necesidad de encontrar nuevas fuentes enzimticas en
microorganismos como las bacterias. Por lo que la presente investigacin se basa
en el aislamiento, comparacin e identificacin de bacterias con actividad
amiloltica, a partir de fuentes ricas en almidn.

Hiptesis

Los microorganismos con mayor actividad amilolica obtenidos de muestras de

composta y tierra frtil tendrn mayor actividad amiloltica en comparacin de las
muestras de cscara de papa y saliva humana

Metodologa
1.1. Obtencin, transporte y procesamiento de la muestra
1.1.1. Tierras frtiles y composta:
a) Recolectar las muestras de distintos tipos de suelo, introducir la
pala aproximadamente 20 cm y transferir la muestra a una bolsa
resellable. (Tomar varios puntos de muestreo en un mismo lugar
para formar una muestra compuesta).
b) Transportar a temperatura ambiente.
c) Una vez en el laboratorio suspender 1g de la muestra (1X10 8
UFC/g) (Calvo y Zuiga, 2008) en 10 mL de agua destilada con
agitacin mecnica durante 15 minutos.
d) A partir de la suspensin preparada realizar una dilucin 1:10.

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 e) Repetir el inciso (d) 4 veces ms para llegar a una dilucin 1X10 2
UFC/mL

1.1.2. Cscara de papa:

a) Recolectar la cscara de papa de un puesto de frituras una
semana antes de iniciar con el trabajo en laboratorio, dejar a la
intemperie en una superficie plana y sin exposicin al sol.
b) Transportar en una bolsa resellable a temperatura ambiente
c) Colocar 1g (1x106 UFC/g) del material en 10 mL de agua
destilada con agitacin mecnica durante 15 minutos.
d) A partir de la solucin preparada realizar una dilucin 1:10.
e) Repetir el inciso (d) 3 veces ms para llegar a una dilucin 1X10 2
UFC/ml

1.1.3. Saliva humana:

a) Con un hisopo tomar la muestra de saliva hacindolo rotar por
toda la cavidad bucal.
b) Inocular en un tubo de ensaye con 3 ml de caldo de almidn

2.1. Preparacin de medios de cultivo (g/L)

a) Pesar 10 g de almidn, 5 g de NaCl, 12 g de agar, 0.6 mg de
NH4NO3 y 0.2 g de cicloheximida
b) Disolver con ayuda de agitacin mecnica en aproximadamente
400 mL de agua destilada el NaCl, despus el almidn (esperar
hasta disolver los grumos formados), a continuacin, disolver el
NH4NO3 y finalmente el agar (calentar para disolver completamente
todos los componentes)
c) Llevar a un volumen total de 1000 mL, mezclar bien
d) Dividir el agar preparado en 2 porciones iguales, adicionar 0.2 g de
cicloheximida solo a una porcin.
e) Medir pH (6-8)
f) Esterilizar en autoclave por 15 min a 121C
g) Vaciar el agar con cicloheximida en 20 cajas Petri de 20 mL, dejar
enfriar y voltear.
h) Vaciar los 500 mL restantes (sin cicloheximida) en 50 cajas Petri de
10 mL, dejar enfriar y voltear.

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2.2. Inoculacin de las muestras en los medios de cultivo
2.2.1. Sembrado por esparcido
a) Colocar 100 L de las 3 ltimas disoluciones de cada muestra en el
centro de una placa de agar almidn con cicloheximida.
b) Extender con varilla de vidrio estril (o esptula de Drigalsky)
mientras se hace girar la caja.
c) Invertir la placa e incubar de 24 36 horas.

3.1. Aislamiento de las cepas por la tcnica sembrado por estra

a) Tomar con un asa estril un fragmento de la colonia a resembrar
b) Trasladarlo al medio de cultivo sin cicloheximida
c) Deslizar el asa suavemente sobre el agar en forma de zigzag

3.2. Identificacin semicuantitativa de la actividad amiloltica (revelado

de la zona de hidrolisis de almidn con lugol)
a) De la cepas aisladas tomar una pequea fraccin de cada colonia y
transferirla a una nueva caja Petri grande (6 colonias distintas por
caja)
b) Incubar durante 12 -14 hrs
c) Anadir lugol sobre la superficie de crecimiento
d) Dejar transcurrir 5 minutos
e) Interpretar los resultados (NOTA)
f) Medir el dimetro de los halos de hidrolisis con ayuda de una regla

NOTA: una prueba negativa de hidrolisis de almidn se torna color azul-morado

mientras que la positiva se observa color marrn o transparente

3.3. Comparacin de los microorganismos amilolticos

a) Comparar las cepas amilolticas con base en los dimetros de los
halos de hidrolisis, tomar solamente las de mayor actividad amilolitica
en poco tiempo (24 h).

4.1. Preparacin del caldo de almidn

a) Pesar 2.5 g de almidn, 1.5 g de NaCl y 0.15 mg de NH 4NO3
b) Disolver en el siguiente orden el NaCl, el almidn y el NH 4NO3 en 150
mL de agua destilada (calentar hasta disolver completamente todos
los componentes)
c) Medir pH (6-8)

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 d) Del caldo preparado anteriormente aadir 25 mL a cada matraz
Erlenmeyer (10 matraces de 50 ml)
e) Esterilizar por 15 min a 121C

4.2. Inoculacin del caldo

a) Tomar una fraccin de las colonias aisladas (cajas pequeas) y
suspenderlas en el caldo de almidn
b) Incubar de 12-14 hrs

4.3. Comparacin cuantitativa de la actividad amiloltica

a) Del inoculo anterior tomar aproximadamente 1 mL de cultivo y
aadirlo a una celda espectrofotomtrica
b) Leer la densidad ptica hasta obtener 0.5-0.6 (Usar como referencia
caldo de almidn sin inoculo)
c) Una vez obtenida la D.O. transferir 2 mL del cultivo a tubos de
ensaye rotulados
d) A cada tubo aadir una gota de lugol
e) Dejar transcurrir 5 min
f) Leer en un intervalo de entre 405-610 nm (Usar como referencia
caldo de almidn sin inoculo con lugol)
g) Comparar las D.O.

5.1. Identificacin de microorganismos con actividad amiloltica

5.1.1. Tincin de Gram
a) Realizar un frotis. Secar y fijar a la flama.
b) Cubrir la preparacin con cristal violeta y dejar actuar 1 min. Lavar y
secar.
c) Tratar con lugol durante 1 minuto. Lavar y secar.
d) Decolorar con alcohol/acetona durante 20 s. Lavar y secar
e) Efectuar la coloracin de fondo con safranina, dejar actuar 1 minuto.
Lavar y Secar.
f) Observar al microscopio.

5.1.2. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias con

actividad amiloltica como se observa en la figura 4

Figura 4. Esquema de identificacin bacteriana

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 Fuente: Manual de Bergey

Referencias

o E. Basma T., El-Sawy M., Gamal R.F, Abou-Taleb K.A. (2015). Production
of amylases from Bacillus amyloliquefaciens under submerged
fermentation using some agro-industrial by-products. ELSEVIER,
60(2), pp 193-202.

o Bailn Lira Lucia; Gonzlez Melndez Roberto (2003) Atlas de pruebas

Bioqumicas para identificar bacterias, Universidad Nacional Autnoma de

Mxic

13
o Beveridge TJ. (2001). Use of the gram stain in microbiology. Biotech
Histochem, 76(3), pp 111-8.

o Calvo V., P., Reymundo M., L., & Zuiga D., D. (2008). Estudio de las
poblaciones microbianas de la rizsfera del cultivo de papa (Solanum
tuberosum) EN ZONAS ALTOANDINAS. Ecologa Aplicada , 141-148.

o Cantn R., C. E. (2010). Recomendaciones de la Sociedad Espaola de

Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. Procedimientos en
Microbiologa Clnica

o Gonzlez S., (2004) Evaluacin de la actividad amilsica como

indicador del grado de biotransformacin de residuos orgnicos
procedentes de la industrializacin de papa congelada. Universidad de
la Sabana. pp 9-15.

o Lpez M., (2014). Biotecnologa en los alimentos de maana. Revista

Digital Universitaria UNAM.15 (8). Pp

o Monteiro de S. P. y Oliveira M. P, 2010. Application of microbial -

amylase in industry A review. Brazilian Journal of Microbiology,
41(4), pp 850861.

o Negroni M. (2009) Microbiologa estomatolgica: fundamentos y gua

prctica -2da ed- Buenos Aires: Mdica Panamericana. pp 557

o Ramrez R. J., Ayala A. M. Enzimas: Que son y Cmo funcionan?

(2014). Revista UNAM, 15(12), pp. 1607 - 6079.

14
o Snchez, C., Mejia, C., Figueroa, M., Esquivia, M. Agudelo, L., Zapata, N.
(2004) Estudio de cepas nativas amiloliticas. Revista de la facultad de
qumica farmaceutica, 12(2), pp 21-28.

o Sundarram A., Krishna M. T.P (2014). -Amylase Production and

Applications: A Review. Journal of Applied & Environmental
Microbiology, 2(4), pp 166-175.

o Van der Maarel M., Van der Veen B., Uitdehaag J., Leemhuis H., Dijkhuizen
L. (2002). Properties and applications of starch-converting enzymes of
the -amylase family. Journal of Biotechnology, 94(2), pp 137-155.

15