Caracterizao da Urase

I. INTRODUO

Enzimas so protenas que apresentam atividade cataltica. A complexa

estrutura molecular enzimtica majoritariamente constituda por uma parte
proteica, porm a ela podem estar integradas outras molculas, como carboidratos
e lipdeos, estas molculas podem ou no participar na atividade cataltica da
enzima.

As enzimas aceleram a velocidade das reaes por diminuir sua energia de

ativao. Sem a catlise, a maioria das reaes qumicas nos sistemas biolgicos
seriam muito lentas para fornecer produtos na proporo adequada para sustentar
a vida.

Uma enzima pode ficar, temporariamente, ligada covalentemente molcula

que est sendo transformada durante estgios intermedirios da reao, mas no
final da reao a enzima estar na sua forma original, quando o produto liberado.

A reao, propriamente dita, ocorre em uma regio pequena e bem definida

da enzima, chamada de stio ativo. Este formado por resduos de aminocidos e
constitui uma cavidade com forma definida, que permite enzima reconhecer seu
substrato.

A urease uma enzima que, em meio aquoso, catalisa a hidrlise da uria em

amnia e dixido de carbono (Figura 2) e ocorre em algumas sementes, tais como
soja, melo, melancia, entre outras. Algumas enzimas requerem um componente
no protico para sua atividade denominado cofator. O cofator enzimtico da
urease o on metlico Ni2+ (Ciurli e cols., 1999), portanto, a presena de ons de
nquel ativa o stio da urease e essencial tanto para a atividade funcional como
para a integridade estrutural dessa enzima. (Almeida, 2008)

Alm de ter sido a primeira enzima isolada na forma cristalina, em 1926, a

urease uma substncia extensamente estudada, devido sua aplicabilidade na
agricultura e na medicina. Atualmente a urease utilizada em procedimentos de
diagnsticos clnicos, na determinao de uria em fludos biolgicos como urina e
sangue. A hidrlise da uria, empregando essa enzima como biocatalisador, na
temperatura de 20C, at 1014 vezes mais rpida que a hidrlise realizada em
meio cido a uma temperatura de 60 C (Souza e Fatibello-Filho, 2006).

A urina humana constituda de 2 a 5% em uria. Essa a forma utilizada

pelo metabolismo do organismo para eliminar os resduos nitrogenados indesejveis
produzidos a partir das protenas. Atualmente, a uria utilizada como suplemento
na alimentao de animais, na agricultura (como fertilizante), na fabricao de
plsticos, na indstria farmacutica, entre outros (Peruzzo e Canto, 1999).
II. MATERIAIS & MTODOS
MATERIAIS
Soluo de urease
cido ntrico concentrado
Tampo fosfato 1 mmol/L, pH
7,0
Tampo fosfato 1 mmol/L, pH
7,0, contendo 1 % de uria
Tampo fosfato 1 mmol/L, pH
7,0, contendo 1 % de tiouria
Reativo do biureto
Cloreto de mercrio a 0,01%
Vermelho de fenol
10 tubos de ensaio + galeria
(estante de tubos de ensaio)
1 pipeta graduada de 2 mL
1 pipeta graduada de 1 mL
3 pipetas graduadas de 5 mL
3 conta-gotas
1 bquer de vidro de 600 mL
Aquecedor eltrico


MTODOS

Foram realizados cinco mtodos de caracterizao da urase,

cada um com um objetivo distinto, so eles:
1. REAO DO BIURETO

Em um tubo, com a marcao A1, foram misturadas 2

gotas da soluo de urase e 4 mL do reativo de biureto. Em outro
tubo, denominado B1, foram adicionadas 2 gotas de gua destilada
mais 4 mL do reativo de biureto. Logo aps um curto intervalo de
tempo, foram comparados os dois tubos.
2. TESTE DE ATIVIDADE DA ENZIMA
Em um tubo, indicado como A2, foram misturados 3 mL de
tampo fosfato (1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1% de uria) e 2 gotas
de urease. Em outro tubo, B2 (branco), foram adicionados 3 mL de
tampo fosfato (1 mmol/L pH 7,0, sem uria) e 2 gotas de urease. Em
ambos os tubos foi adicionada uma gota de soluo de vermelho de
fenol. Aps a agitao, aguardou-se 5 minutos foi observada a
mudana no sistema.
3. EFEITO DO CALOR

Em um tubo de ensaio foram colocados 2 mL de gua destilada e

2 gotas de urease. Aps a agitao e aquecimento a 100C durante
15 minutos, foram adicionados 3 mL de tampo fosfato (1 mmol/L,
pH 7,0, contendo 1 % de uria) e 1 gota da soluo de vermelho de
fenol. Misturou e aguardou 5 minutos para observar as mudanas do
sistema. Logo aps, comparou o resultado com o resultado do teste
2.
4. EFEITO DE SAIS DE MERCRIO
Em um tubo de ensaio foram misturados 2 mL de gua destilada,
2 gotas da soluo de urase. Aps a agitao, foram adicionadas,
cuidadosamente, 3 gotas de cloreto de mercrio a 0,01%.
Novamente o sistema foi agitado e foram adicionados 3 mL de
tampo fosfato (1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1% de uria) e 1 gota da
soluo de vermelho de fenol. Aguardou 5 minutos e foi observado a
mudana no sistema, comparando este resultado com o resultado do
teste 2.
5. ESPECIFICIDADE DA ENZIMA
 Foram utilizados dois tubos de ensaio, A5 e B5. No tubo A5 foram
adicionados 3 mL de tampo fosfato (1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1%
de uria) e 2 gotas de urease. No tubo B5 foram misturados 3 mL de
tampo fosfato (1 mmol/L, pH 7,0, contendo tiouria) e 2 gotas de
urease. Em ambos os tubos adicionar 1 gota da soluo de vermelho
de fenol. Aps a agitao e passados 5 minutos, foram observadas
as mudanas no sistema. O resultado desse teste foi comparado com
o resultado do teste 2,

III. RESULTADOS E DISCUSSES

1. Reao do biureto

O teste do tubo A, contendo urease, apresentou mudana de cor, adquirindo um

tom de azul mais escuro mais prximo ao violeta.

O reativo de biureto formado por biureto e sulfato de cobre, de modo que o

biureto forma um complexo com os ons cobre, como mostrado na figura 1

Figura 1: interao biureto/Cu2+

Quando submetido presena de protenas ou peptdeos, os ons Cu 2+ formam

um complexo com as ligaes peptdicas destes, atravs de interaes com os seus tomos de
nitrognio (Figura 2)


Figura 2: interao ligao peptdica/ Cu2+

O complexo formado faz com que a soluo adquira uma colorao violeta.
Quanto maior for quantidade de protenas, maior ser a intensidade da cor.

A colorao violeta adquirida pela amostra no experimento comprova, portanto,

a natureza protica da urease.

2. Teste de atividade da enzima

A soluo de vermelho fenol usada como um indicador de pH: sua cor exibe
uma gradual transio do amarelo ao vermelho na faixa de pH entre 6.6 e 8.0. Acima de pH 8.1,
vermelho fenol vira em uma cor rosa brilhante (magenta). Esta mudana de cor observada
porque o vermelho de fenol perde prtons (e muda de cor) a medida que o pH aumenta.

A soluo do tubo A, que continha ureia, adquiriu colorao rosa, carcterstica de

pH acima de 8, ou seja, o pH que antes era neutro, garantido pelo tampo de fosfato, sofreu um
aumento. Isto se justifica pelo fato de que a ureia foi hidrolisada, por meio da ao da urease, de
acordo com a equao, formando carbonato de amnio:

CO(N H 2 )2+2 H 2 O urease ( N H 4)2 C O 3

Desta forma, o meio torna-se bsico e, por ao do vermelho de fenol, adquire
uma coloo rosa, como mostrado na figura.

No tubo B, a enzima no foi ativada, j que o meio no apresentava o seu

substrato, a uria. Portanto, a soluo manteve seu pH neutro, relativo soluo tampo de
fosfato. A soluo adquiriu uma colorao amarelada, cor caracterstica do indicador vermelho
de fenol em pH prximo a 7.

Portanto, pode-se concluir que a enzima apresentou atividade no meio contendo

a uria, o seu substrato,

IV. REFERNCIAS