DENGUE C

CURSO:
BIOLOGA MOLECULAR

DOCENTE:
JULIO CESAR DELGADILLO
ARONE

INTEGRANTES:
ARROYO ALIAGA, Jessenia Jhajahira
CCOICCA CASAVERDE, Briceth Lorena
CHAMBERGO MATUTE, Ingrid Madeleyn
ESCATE CORDOVA, Andres
ORTIZ CUNZA , Kathiuska Yolanda
RAMOS MENDEZ, Heidi vanesa
VILLALON LIAN, Diana Yamila
VILLANUEVA ABANTO, Jose Wilmer
YLLISCA CHIPANA, Sonia Sofia

TURNO: MB

SEDE: LIMA

LOCAL: SAN BORJA

CICLO: 2016
-I

JULIO 2016 - LIMA

PER
AGRADECIMIENTO

En este presente informe se lo agrademos a nuestros padres,

por su apoyo moral y econmico para poder estudiar

en la universidad y encaminarnos a ser buenas personas.

Tambin agradecemos a la Universidad Privada San Juan Bautista

por estar formndonos para qu en un futuro ser buenos mdicos

y por brindarnos buenas instalaciones para poder seguir aprendiendo

cada da ms.

De igual forma agradecemos a nuestro profesor por guiarnos

en las clases que nos ense y para poder presentar este informe.

DENGUE Pgina 1
INDICE
INTRODUCCION.............................................................................................. 4
MARCO TEORICO............................................................................................ 7
CAPITULO 1................................................................................................. 7
Epidemias de dengue.................................................................................. 7
Epidemiologa.......................................................................................... 8
El vector y modo de transmisin del virus...............................................9
Clasificacin de la infeccin...................................................................10
Genmica y factores de virulencia del virus del dengue...........................10
Virus del dengue....................................................................................... 11
Protenas estructurales y no estructurales................................................12
Protenas estructurales..........................................................................13
Protenas no estructurales.....................................................................15
Serotipos del virus..................................................................................... 19
Clasificacin de la fiebre por dengue.....................................................19
Formas clnicas del dengue....................................................................20
Fiebre por dengue.................................................................................. 21
Dengue hemorrgico (FHD)...................................................................21
Sndrome de choque por dengue (SCD).................................................22
CAPITULO 2.................................................................................................. 23
Replicacin de ARN viral........................................................................... 23
Ensamblaje, maduracin y liberacin del DENV........................................24
Protenas estructurales..........................................................................25
Protena C.................................................................................................. 25
Protena precursora de membrana (prM) y protena de membrana (M)....25
Protena de envoltura E............................................................................. 26
Protenas no estructurales.....................................................................26
La NS1....................................................................................................... 27
La NS2A..................................................................................................... 27
La NS3....................................................................................................... 27
La NS5....................................................................................................... 28
Patogenia del dengue............................................................................ 29
Linfocito T................................................................................................. 29
CAPITULO 3............................................................................................... 32
REV CUBANA MED TROP 2011;63(3):211-9...............................................32
RESUMEN............................................................................................... 40

DENGUE Pgina 2
 ARTCULO ORIGINAL.................................................................................. 41
RESUMEN............................................................................................... 50
CONCLUSIONES............................................................................................ 51
BIBLIOGRAFIA............................................................................................... 53
ANEXOS........................................................................................................ 56
Epidemiologia en Per 2016..................................................................56
Mapa de incidencia de dengue por distritos Per 2016.............................57
Tendencia de Casos de dengue segn tipo de diagnostico por semana
epidemiolgica Per 2014 2016.............................................................58
Caractersticas epidemiolgicas de las muertes por dengue en el Per,
2016 SE8................................................................................................... 59
Ciclo de virus del dengue..........................................................................60
Dengue hemorrgico................................................................................. 60

INTRODUCCION
El dengue es una enfermedad viral de gran importancia en la salud pblica. El
virus del dengue (DENV) es el agente causal de la enfermedad conocida como

DENGUE Pgina 3
el dengue, que es la principal enfermedad viral transmitida por artrpodos en el
mundo. El DENV pertenece al serocomplejo dengue, gnero flavivirus,
perteneciente a la familia flaviviridae. Este serocomplejo est conformado por
cuatro serotipos denominados: DENV1, DENV2, DENV3, DENV4. Los cuatro
serotipos circulan peridicamente en reas endmicas e hiperendmicas y si
distincin alguna, todos causan la enfermedad. El DENV ingresa por
endocitosis y se replica en el citoplasma de la clula infectada, originando tres
protenas estructurales y siete protenas no estructurales, sobre las cuales se
conocen solo algunas de sus funciones en la replicacin viral o en la infeccin.
El DENV es transmitido por mosquitos hembra del gnero Aedes (especie
aegypti albopictus), distribuidos actualmente en todos los pases tropicales y
subtropicales del mundo, lo que permite que circulen, cada vez con menos
restricciones ecolgicas, tanto el virus como el mosquito. La circulacin del
DENV entre los humanos y mosquitos se presenta cuando el mosquito se
alimenta con la sangre de un individuo virmico. As, el mosquito, al ingerir
sangre humana infectada, favorece la infeccin de las clulas epiteliales de su
intestino; las partculas virales producidas en estas clulas, son liberadas al
hemocele y hacia algunos rganos del mosquito, como las glndulas salivales,
las cuales se convierten en rganos reservorios para el virus. La infeccin en el
ser humano se presenta cuando este mosquito infectado pica nuevamente para
alimentarse, liberando saliva y virus. La infeccin ocasionada por el virus del
dengue es considerada hoy en da una emergencia epidemiolgica, debido, por
una parte, al incremento de las reas geogrficas endmicas y, por otra, a los
cambios que se han presentado en el patrn de presentacin de la infeccin, la
cual es cada vez ms agresiva, ya que es comn la presencia de hemorragia y
choque, lo que indudablemente incrementa el riesgo de morbilidad y mortalidad
de esta infeccin.
En Per, el aumento de casos por dengue en los ltimos 7 aos ha sido
considerable.
El Equipo de Enfermedades Metaxnicas Virales Instituto Nacional de Salud
reporto que para el ao 2015 reporto los departamentos ms afectados por la
enfermedad: Tumbes que tuvo ms presencia del serotipo DENV 2, Piura con
los serotipos DENV 1 2, Lambayeque con los serotipos DENV 1 2 3 4,
La Libertad con los serotipos DENV 1 2, San Martin con los serotipos DENV 2

DENGUE Pgina 4
-1, Ucayali con el serotipo DENV 2, Hunuco con los serotipos 1 2 3,
Amazonas con el serotipo DENV 2, Junn con los serotipos DENV 1 2,
Ancash con el serotipo 1 y Cajamarca con los serotipos DENV 1 2 3. Esta
situacin pone de relieve que en nuestro pas el dengue sigue siendo una seria
preocupacin en salud, pues los factores que agudizan el problema estn lejos
de solucionarse.
En el Per, hasta la semana epidemiolgica (SE) 8, se han notificado 6254
casos de dengue al sistema de vigilancia, lo cual es un 82% ms casos que en
el mismo periodo de 2015 (3427). Se observa una tendencia pronunciada al
aumento de casos. El 30,0 % (1877) de los casos son confirmados y el 70,0 %
(4377) corresponden a casos probables. La distribucin de los casos desde el
punto de vista clnico es: 86,3 % (5399) son casos de dengue sin signos de
alarma, 13,3 % (830) de casos de dengue con signos de alarma y 25 (0,4 %)
casos graves. Los casos proceden de 16 de los 24 departamentos. El 89,1 %
(4 245) de los casos de dengue en este ao fueron notificados por los
departamentos de Ayacucho, Piura, Madre de Dios, Junn, Lambayeque, La
Libertad, Cusco, Tumbes, Hunuco y Loreto. La incidencia acumulada a nivel
del pas es de 19,8 casos por cada 100 000 habitantes. Los departamentos de
Madre de Dios, Tumbes y Ayacucho reportan las tasas de incidencias
acumuladas ms altas. El 89,1 % (4 245) de los casos de dengue en este ao
fueron notificados por los departamentos de Ayacucho, Piura, Madre de Dios,
Junn, Lambayeque, La Libertad, Cusco, Tumbes, Hunuco y Loreto. La
incidencia acumulada a nivel del pas es de 19,8 casos por cada 100 000
habitantes. Los departamentos de Madre de Dios, Tumbes y Ayacucho reportan
las tasas de incidencias acumuladas ms altas. La distribucin del riesgo por
distritos a nivel del pas, muestra una incidencia de ms de 30 casos por cada
100 000 Hab., en los distritos de los departamentos de la costa norte,
principalmente, Tumbes, Piura, en la regin nororiental selva central y sur.
Los casos de dengue se concentran, principalmente, en el grupo etario adulto
(38,0 %) y adulto joven (26,6 %). Asimismo, aunque en orden diferente, estos
son los grupos de mayor riesgo, porque el anlisis de la incidencia muestra que
los adultos jvenes tienen el mayor riesgo (24,5 por cada 100000 hab.),
seguido de los adultos (21,0 por 100 000 Hab). El 51,5 % (3220) de los casos
son varones.

DENGUE Pgina 5
Entre estos factores, que hacen previsible la continuidad en el aumento de la
morbilidad y mortalidad, se cuentan por ejemplo, la infestacin del mosquito en
ms de 80% del territorio, el cambio climtico y la circulacin simultanea de los
cuatro serotipos. El aumento de los ndices de presencia de mosquitos podra
deberse a la resistencia que han venido adquiriendo los vectores al insecticida
temefos, y a al poco impacto que tienen las polticas de prevencin y control del
vector en las reas endmicas y en riesgo.

DENGUE Pgina 6
MARCO TEORICO

CAPITULO 1

Epidemias de dengue
Las primeras epidemias informadas de fiebre del dengue ocurrieron en 1779-
1780 en Asia, frica, y Amrica del Norte; la ocurrencia simultnea de
erupciones en tres continentes indica que estos virus y su vector han tenido
una distribucin mundial en los trpicos. Durante ese tiempo, la fiebre del
dengue fue considerada benigna, con intervalos largos (10-40 aos) entre las
epidemias mayores. Una pandemia global de dengue comenz en el Sudeste
de Asia despus de la Segunda Guerra Mundial. Hasta la dcada de 1960, casi
todos los brotes de la enfermedad fueron a intervalos de uno o ms decenios y
posteriormente se acortaron. La primera epidemia de dengue clsico de las
Amricas documentada en laboratorios, fue con el serotipo 3 y afect a la
cuenca del Caribe y a Venezuela en 1963-1964. Anteriormente slo se haba
aislado el virus de dengue 2 en Trinidad en 1953- 1954, en una situacin no
epidmica. En 1968-1969 en otra epidemia en varias islas del Caribe se
aislaron los serotipos 2 y 3. En la dcada de 1970, Colombia se vio afectada
por brotes de los serotipos 2 y 3, que se hicieron endmicos en el Caribe.

En 1977, se introdujo en las Amricas el serotipo de dengue 1, que inicialmente

se detect en Jamaica y se propag a la mayora de las islas del Caribe,
causando brotes explosivos. Brotes similares se observaron en Sudamrica
septentrional, Amrica Central y Mxico. La transmisin autctona del dengue
1, durante la segunda mitad de 1980, fue tambin documentada en el estado
de Texas, EUA. En este perodo se notificaron cerca de 702,000 casos de
dengue. En Cuba el 42% de sus 10 millones de habitantes se infectaron con el
dengue 1. En la dcada de 1980, la magnitud del problema del dengue en las
Amricas aument considerablemente, caracterizndose por una marcada
propagacin geogrfica de la actividad de esta enfermedad en la regin. El
dengue en su forma hemorrgica fue descrito por primera vez en Filipinas, en
1953. Dos aos ms tarde en Bangkok (Tailandia) y en las tres dcadas
siguientes, en Camboya, China, India, Indonesia, Laos, Malasia, Sri Lanka y
Vietnam. Desde el punto de vista epidemiolgico, los pases de Amrica Latina

DENGUE Pgina 7
se encuentran en la misma situacin en que estaban hace dos o tres dcadas
varios pases asiticos: con epidemias a repeticin cada 3-5 aos y con un
progresivo aumento del nmero de casos de FHD, particularmente en pases
de Amrica central.

La rpida expansin de grandes centros urbanos, la ausencia de polticas

adecuadas de gestin del agua, la propagacin del virus por intermedio de
viajes e intercambios internacionales, as como la ineficacia de los programas
de lucha anti vectorial (cuando stos existen), se encuentran entre los factores
que explican la re-emergencia de esta enfermedad en el sud-este asitico, en
las islas del Pacfico occidental, en frica, en la regin oriental del mar
Mediterrneo y en Amrica Latina. El impacto del dengue y del dengue
hemorrgico es enorme y representa una significativa carga econmica sobre
la comunidad afectada, que se expresa en: prdida de vidas sin distincin de
edad, sexo o estrato social; gastos para la familia por hospitalizacin del
paciente; prdida del trabajo; gastos considerables para los municipios en
programas para controlar al mosquito; interrupcin de los servicios de atencin
de salud; impacto en la economa en trminos de prdida del turismo. (Cruz A,
Rolland L. El virus del dengue, 2014)

Epidemiologa
Una epidemia de dengue requiere la presencia de:

1. El mosquito vector generalmente (Aedes aegypti),

2. El virus
3. Un gran nmero de personas susceptibles.

Los brotes pueden ser explosivos o progresivos, dependiendo de la densidad y

susceptibilidad del vector, la cepa del virus de dengue, el nivel de inmunidad en
la poblacin humana, y la intensidad de contacto vector-humano. (Ortega LM.
Dengue: un problema siempre emergente. Epidemilogos Boletines IPK N 5 y
6 del 2002)

En la reciente epidemiologa de la enfermedad se han observado cambios

drsticos en el incremento de la morbilidad-mortalidad y la expansin
geogrfica, aparentemente asociados con aqullos que ocurren a los niveles
bioclimtico, sociodemogrfico y de conducta, que a su vez pueden llevar a una

DENGUE Pgina 8
mayor circulacin viral, a su virulencia y una mayor resistencia vectorial.
(Dengue y Dengue Hemorrgico Informacin para los Mdicos. Centro para el
Control y Prevencin de las Enfermedades de los Estados Unidos, 2004)

El vector y modo de transmisin del virus

Es transmitida al humano a travs de la picadura de la hembra hematfaga de
los mosquitos Aedes (aegypti y albopictus). Se conocen adems, otras
variedades de Aedes: Ae. aegypti var. formosus y Ae. aegypti var. que
enslandensis). Ae. albopictus, Ae. polyniensis y otras especies del complejo Ae.
scutellaris han sido incriminados como responsables de epidemias, pero menos
eficientes que A. aegypti .( Cruz A, Rolland L. El virus del dengue. Diagnstico,
2002)

La especie aegypti es la ms distribuida en el mundo. Su distribucin

geogrfica abarca una extensa franja tropical y subtropical, entre Estados
Unidos, toda Amrica hasta Argentina. Se encuentra en cerca de 100 pases
tropicales, y cubre la mayor parte de frica, Medio Oriente, Sudeste asitico,
norte de Australia, e incluso algunas zonas de Europa. Es un vector muy
eficiente para transmitir los virus dengue, es antropoflico y vive en la
proximidad del hbitat humano. Las invasiones del vector ocurren durante el
verano y se considera a los mosquitos en su fase de adulto no sobreviven al
invierno con fro intenso. Generalmente se encuentra entre las latitudes 35N y
35S y usualmente no se le encuentra por encima de 1,000 m de altitud, sin
embargo ha sido reportado a 2,121 m en India y a 2,200 en Colombia, incluso a
2,400 m en Eritrea. Un factor que dificulta su erradicacin es el hecho que los
huevos de este mosquito pueden resistir largos perodos de desecacin (hasta
ms de un ao). (Isturiz RE, Gubler DJ, Brea del Castillo J. Dengue and
dengue hemorrhagic fever in Latin America and the Caribbean. Infect Dis Clin
North Am, 2000)

En los aos 50 y 60, la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS) llev a

cabo un programa para evitar la fiebre amarilla urbana, logrando en la mayora
de los pases la erradicacin del Aedes aegypti. Pero en la dcada de los aos
70 comenz el deterioro del control, reinfectndose sucesivamente los pases,
hasta que en 1998 el panorama de distribucin del vector era similar al que

DENGUE Pgina 9
exista antes del inicio de la campaa continental. La dinmica de transmisin
del virus est determinada por la interaccin entre el ambiente y que estn
presentes de forma simultnea: el virus, el vector y el husped susceptible.
(Seijo A. Dengue grave: generalidades e inmunopatogenia. En: Dengue grave)

Clasificacin de la infeccin
Segn la OMS, la infeccin por el virus de Dengue puede clasificarse en:

- Primaria: se presenta en individuos que se exponen en contacto por primera

vez con alguno de los serotipos, los ttulos de anticuerpos generalmente no
exceden de 1:1280 y son relativamente monoespecficos.

- Secundaria: se presenta en individuos que se ponen en contacto con otro

serotipo del virus. En este caso los ttulos de anticuerpos son usualmente
mayores de 1:1280 y son heterlogos. (Henchal EA, Putnak JR. The Dengue
viruses)

Genmica y factores de virulencia del virus del dengue

El virin maduro tiene tres protenas estructurales: la protena C de la
nucleocpside, la protena M, asociada a la membrana y la protena E de la
envoltura y otras protenas no estructurales: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,
NS4B y NS5. Todas estas protenas se forman a partir de una gran poliprotena
(5 C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3- NS4A-NS4B-NS5 3), para la cual codifica
el genoma del virus (34, 35). El genoma del virus est constituido por una
molcula de cido ribonucleico (ARN) de cadena nica y aproximadamente 11
kilobases (kb) y de relativamente alta variabilidad genmica. Tiene un
coeficiente de sedimentacin de 42S y un peso molecular de 4,2 kD. El ARN
genmico es de polaridad positiva y funciona como ARN mensajero al
traducirse directamente en los ribosomas durante el proceso de replicacin.
Presenta una caperuza tipo I, con una estructura Gppp Amp cubriendo el
extremo 5 terminal, seguido por una secuencia dinucleotdica conservada AG.
El extremo 3 terminal carece de cola poliadenilada y termina con una
secuencia dinucleotdica conservada CU. Los cidos nuclicos genmicos, por
s mismos, son infecciosos, por lo que las autoridades de salud recomiendan

DENGUE Pgina 10
manejar este virus en el nivel de bioseguridad 2 (BLS-2, por sus siglas en
ingls). (Dengue, 2004; Valle RP, Falgout B. Mutagenesis of the NS3 Protease
of Dengue Virus Type 2. J Virol 1998]

Virus del dengue

El DENV es un virus icosaedro de 50 nm, aproximadamente, conformado por
una membrana lipdica (obtenida de las clulas del husped), sobre la cual se
inserta las protenas de membrana y de envoltura. El interior del virus contiene
el complejo riboproteico conformado por la protena de la cpside y el genoma
viral que consiste en una nica hebra de ARN de sentido positivo que codifica
para un polipptido nico, que contiene tanto las protenas estructurales, que
se harn parte de la partcula viral, con las protenas no estructurales, que
intervengan durante los procesos de ensamblaje y de replicacin del ARN
genmico, entre otras. En la organizacin del genoma del virus del dengue; es
un ARN de cadena sencilla como un nico marco abierto de lectura que
comienza hacia el extremo 5no traducido y que contiene los genes
estructurales y no estructurales. La poliprotena sintetizada que muestra lo
organizacin de las protenas estructurales (C, prM y E) y las no estructurales
(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).

Los alfavirus y los flavivirus se clasifican como arbovirus pues suelen

transmitirse a travs de vectores artrpodos. No obstante estos virus tienen un
amplio abanico de anfitriones, como organismos vertebrados (mamferos, aves,
anfibios, reptiles) e invertebrados (mosquitos, garrapatas). Las enfermedades
transmitidas por los animales o que tienen reservorio animal se denominan
zoonosis. En la siguiente cuadro (1) se citan algunos ejemplos de alfavirus y
flavivirus.

Los flavivirus tienen genoma ARN de cadena positiva y envoltura. Sin embargo,
los viriones de los flavivirus son ligeramente menores que los alfavirus
(dimetro de 37 a 50mn), el ARN no tiene secuencia de poliadenilato y el virus
carece de una estructura de cpside visible en el virin. La mayora de la
flavivirus estn serolgicamente interrelacionados y los anticuerpos frente a un
virus pueden neutralizar a otro. La adhesin y penetracin de los flavivirus se
produce por endocitosis mediada por receptores; a continuacin, la envoltura

DENGUE Pgina 11
vrica se fusiona con la membrana del endosoma tras la acidificacin de la
vescula con el fin de introducir la cpside y el genoma en el citoplasma celular.
Una vez liberados en el citoplasma, los genomas de los flavivirus se traducen
en una fase precoz y una tarda. Los dos tercios iniciales el ARN se traduce y
dan lugar a una poliprotena que posteriormente ser escindida por las
proteasas de 4 protenas precoces no estructurales (NPSA1 a 4). Cada una de
estas protenas contiene actividad de proteasa y una polimerasa de ARN
dependiente de ARN. Se sintetiza un ARN de 40S de sentido negativo de
longitud completa como molde para replicar el genoma, y se producen nuevas
molculas de ARNm de 40S en sentido positivo. Adems, a partir del molde
tambin se transcribe un ARNm de 28S, correspondiente a un tercio del
genoma. El ARN 28S codifica las protenas de la cpside (C) y de la envoltura
(E1 a E3). Ms adelante, durante el ciclo de replicacin, el ARN vrico puede
representar hasta el 90% del ARNm de la clula infectada. La abundancia de
ARNm tardo hace posible la produccin de una gran cantidad de protenas
estructurales necesarias para el empaquetamiento del virus. Las protenas
estructurales se forman como consecuencia de la escisin por una proteasa de
la poliprotena tarda sintetizada a partir del ARNm de 28S. La protena C se
traduce en primer lugar y es separada de la poliprotena. A continuacin se
elabora una secuencia sealizadora que asocia el polipptido en formacin al
retculo endoplasmtico. Se traducen las glucoprotenas de la envoltura, las
cuales son glucosiladas y separadas de la porcin restante de la poliprotena
para producir las puntas glucoproteicas E1, E2, E3. Las glucoprotenas son
procesadas por la maquinaria celular normal en el interior del retculo
endoplsmico y el aparato de Golgi y tambin se acetilan y alquilan con cidos
grasos de cadena larga. (Patrick R. Murray at el Ken S. Michael A.
MICROBIOLOGA MDICA 5ta ed. Editorial 2006 Elsevier Espaa pag. 637
644).

Protenas estructurales y no estructurales.

El genoma contiene un nico marco de lectura abierto (MLA) de ms de 10,000
bases, flanqueado por las regiones no codificantes (RNC) en ambos extremos
(3 y 5), que codifica para un precursor polipeptdico, que por sucesivos cortes
proteolticos, genera la formacin de las 10 protenas virales a travs de un

DENGUE Pgina 12
procesamiento postraduccional. Los genes que codifican las tres protenas
estructurales, ncleo (C), prM (el precursor a la membrana), membrana (M), y
envoltura (E), estn localizados hacia el extremo amino terminal (5) ocupando
la cuarta parte de la capacidad codificadora del ARN viral. Hacia el extremo
carboxilo terminal (3) se encuentran los genes que codifican la informacin de
las siete protenas no estructurales NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.
El orden de las diferentes regiones del gene en el virus es el siguiente: 5'NTR-
C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3- NS4A- NS4B-NS5-3'.NTR. La ruptura de
las uniones C-prM, prM-E, ENS1, y NS4A-NS4B es realizada por la enzima
signalasa retculo endoplsmica. (Leitmeyer KC, Vaughn DW, Watts DM, Salas
R, Villalobos I, de Chacon, Dengue virus structural differences that correlate
with pathogenesis. J Virol 1999)

Protenas estructurales
El virin maduro contiene 3 protenas estructurales: C, protena de la
nucleocpside o ncleo; M, protena asociada a la membrana y E, protena de
la envoltura. Los virus inmaduros contienen una protena conocida por prM; que
es un precursor de M. La protena C es componente bsico de la
nucleocpside, el primer polipptido viral sintetizado durante la traduccin,
tiene un peso molecular de 13.5 kd. Es rica en residuos de lisina y arginina los
que le confieren un carcter altamente bsico que permite su interaccin con el
ARN viral, con el que forma la nucleocpside como componente estructural. La
prM (22 kb) es el precursor glicosilado de la protena estructural M (8 kb). La
separacin proteoltica de este precursor por una proteasa del aparato de
Golgi, durante la maduracin viral, es lo que da origen a la formacin de la
protena M. Esta escisin parece estar ligada a la liberacin del virus, pero no
ocurre necesariamente en todas las molculas proteicas presentes en la
membrana viral, ya que en ocasiones aparece la protena M junto a la prM en el
virin maduro. Anticuerpos contra prM pudieran mediar inmunidad de tipo
protectora, quizs por la neutralizacin de los viriones liberados que contienen
prM no cortada.

Existe en 2 formas, dependiendo de la maduracin del virus:

Protena pre-M (prM): Clula-asociada o viriones inmaduros, glicosilada.

DENGUE Pgina 13
 Heterodimeriza con protena E: esencial para el propio plegamiento de
E.

La protena M madura, es una protena de membrana, extracelular o de virus

maduros, resultado de la protelisis de prM y eliminacin de la porcin amino
terminal, C-terminal no-glicosilado. Est estrechamente asociada a la envoltura
lipdica.
La formacin de M a partir de prM parece ser crucial en la morfognesis del
virus, lo que implica un incremento en la infectividad y la reorganizacin de la
estructura de la superficie viral. Hasta el presente el papel de M en el virin no
es bien conocido.
La protena E, es una glicoprotena con un peso molecular entre 51 y 60 kD, es
la mayoritaria de la envoltura, glicosilada y la ms conservada, la fusin con la
clula husped es inducida por pH bajo. Estn estrechamente asociada a la
envoltura lipdica.
Se presenta como un homodmero en la superficie del virin maduro e
intracelularmente se puede encontrar como un heterodmero junto a la protena
prM en forma de prM-E. Es el componente principal de las proyecciones de la
superficie del virin observadas por microscopa electrnica y contiene los
determinantes antignicos responsables de la neutralizacin del virus y la
hemaglutinacin de eritrocitos de ganso, induciendo respuesta inmunolgica en
el husped infectado. Los determinantes de la protena E estn tambin
involucrados en la unin de los viriones a los receptores celulares y
probablemente juegan un papel importante en la fusin intraendosomal a pH
bajo. Se ha propuesto que en ella estn localizados la mayora de los
marcadores moleculares para la patogenicidad. (Henchal EA, Putnak JR. The
Dengue viruses, 1990)

La comparacin de la secuencia nucleotdica del gen de la protena E de los

diferentes flavivirus ha mostrado una conservacin perfecta de los 12 residuos
de la cistena, los cuales forman 6 puentes disulfuro. El modelo estructural para
la protena E fue refinado por Mandl y colaboradores, quienes correlacionaron
las propiedades estructurales de diferentes eptopos con los puentes disulfuro.

DENGUE Pgina 14
Protenas no estructurales
Las siete protenas virales no estructurales (NS) fueron identificadas y se
confeccionaron mapas del ARN viral deducido por la secuencia aminoacdica.
La primera protena no estructural (NS1), es una glicoprotena de 48 kD; que
contiene 2 seales del tipo Asn -X-Ser/Thr, usada para la adicin de
carbohidratos, estos sitios parecen estar conservados en todos los flavivirus.
Puede estar en forma secretada y no secretada. Es sintetizada en el retculo
endoplsmico rugoso como una protena monomrica y en un perodo corto se
une formando un homodmero. Esta forma es ms hidrofbica y se desconoce
si el incremento de la hidrofobicidad es un resultado de la dimerizacin o
alguna modificacin postraduccional. Una vez formado este dmero, la
glicoprotena es transportada al aparato de Golgi donde sufre modificaciones y
de aqu pasa a la superficie celular, liberndose al medio extracelular. Estudios
de mutagnesis en la regin C terminal de NS1, han demostrado que esta
regin es importante en la estabilidad y la secrecin del dmero. La funcin de
la NS1 en la replicacin viral no ha sido bien dilucidada. Se ha planteado que
posee un papel en la replicacin temprana. Basada en anlisis mutacional se
ha relacionado con la morfognesis viral. A su vez, mutaciones de esta protena
afectan la virulencia de la partcula viral. Tambin se relaciona con la respuesta
inmune especfica de serotipo. La clula infectada expresa la protena en la
superficie celular, siendo diana de la citlisis inmunolgica, resultando
interesante su uso potencial en la proteccin del hombre contra la infeccin por
flavivirus. (Parrish CR, Woo WS, Wrigth PJ.Dimerization of the NS1 glyprotein,
1991)

La protena NS1 porta 2 3 sitios de glicosilacin en las especies virales,

induce una inmunidad protectora y adems, aporta eptopos especficos de
grupo y de tipo. En los virus de la encefalitis transmitida por garrapata las dos
formas de la NS1 estn asociadas a secuencias parciales de NS2a. Se tiene el
consenso que la NS1 induce inmunidad y que la inmunogenicidad es
verdaderamente dependiente de la estructura conformacional de la molcula.
La forma dimrica es ms antignica que la forma monomrica, pero se ha
observado que es destruida por el calor. Las enzimas y los pH cidos que
solamente participan en la reduccin de puentes de disulfuro. Los anticuerpos

DENGUE Pgina 15
inducidos por esta protena son esencialmente lticos en presencia del
complemento y dan la posibilidad de retardar la infeccin viral en los tejidos.
Por el contrario, la estimulacin de las clulas T citotxicas no ha podido ser
demostrada hasta el presente. Huang y colaboradores en 1999 demostraron un
reconocimiento cercano al 45 % por anticuerpos de pacientes a un pptido
sinttico de los 15 primeros aminocidos de la protena correspondientes a una
regin inmunodominante de la NS1. Durante un estudio dinmico, se pudo
constatar que a los dos das del comienzo de los sntomas en una infeccin
secundaria, es posible detectar anticuerpos contra este pptido. (Huang JH,
Wey JJ, Sun YC, Chin C, Chien LJ, Wu YC. J Med Virol, 1999)

En un trabajo publicado por Garca y colaboradores en 1997, se observ el

reconocimiento por parte de sueros de pacientes con infeccin primaria y
secundaria a cinco pptidos de la protena no estructural NS1 y un pptido de
NS3, lo que sugiere que estos eptopos se encuentran expuestos durante la
infeccin natural por dengue. La NS3 es la segunda protena en tamao, con
un peso molecular entre 68 y 70 kD, asociada a la membrana. Es altamente
conservada en los flavivirus y se piensa que sea un componente de la
maquinaria enzimtica de la replicacin del ARN viral. La comparacin de sus
secuencias nucleotdicas y los anlisis bioqumicos sugieren que es
trifuncional, conteniendo actividad de proteasa (contra la poliprotena), de
helicasa y de ARN trifosfatasa trifosfato (formacin de la estructura 5' cap). Su
extremo N terminal contiene el dominio cataltico de la proteasa NS2b-NS3,
parecido a la serina-proteasa de las subfamilias de las tripsinas. Esta triada
cataltica est conformada por His 51, Asp 75 y Ser 135. Se cree que la
actividad proteoltica de esta enzima sea la responsable del corte de NS2b,
NS3, NS4a, NS5 y del extremo carboxilo de la protena C. En esta protena
existen regiones homlogas con la familia de las helicasas, as como un
fragmento C terminal de 50 kD derivado de la proteolisis, que tiene actividad
ARN trifosfatasa y est involucrado en la formacin de la estructura de la
caperuza del extremo 5 del genoma del flavivirus. (Wengler G. The NS3
nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphatase activity.
Virology, 1993)

DENGUE Pgina 16
Las regiones hidrofbicas menos conservadas de la poliprotena son
procesadas en al menos 4 protenas no estructurales adicionales (NS2a, NS2b,
NS4a y NS4b). Poco se conoce de las funciones de estas en el ciclo de vida de
los flavivirus. Sin embargo, se conoce que la NS2b, de 27 kD, junto con la NS3
forma un complejo esencial para el procesamiento de todos los sitios de corte
de las protenas no estructurales y las estructurales. La ltima protena
codificada es la NS5, que es la ms grande de 103 a 104 kD, bifuncional y una
de las ms conservadas en los flavivirus. Es una protena bsica y se cree que
funciona como una ARN polimerasa dependiente del ARN, aunque no se ha
verificado directamente. Esto se basa en la presencia de una regin altamente
conservada (YF NS5 666- 668) caracterstica de este tipo de enzima presente
en los virus ARN con cadena positiva. Se ha sugerido que puede estar
involucrada en la metilacin de la estructura de la caperuza 5 terminal.
(Estructura del virus y ciclo de vida, 2004)

En los ltimos aos, se han realizado estudios en pacientes con infeccin

primaria y secundaria por dengue para definir las protenas involucradas en el
reconocimiento por anticuerpos. En pacientes con infeccin primaria en fase de
convalecencia y bajos ttulos de anticuerpos IgG a la protena E, existe
reconocimiento a NS3 y NS5. En pacientes con infeccin secundaria, en fase
de aguda, se encontraron anticuerpos IgG contra la protena E y en fase
convaleciente, altos ttulos de anticuerpos IgG a otras protenas, incluidas la
NS1, NS3, NS5 y C. Los anticuerpos contra las protenas E, NS3 y NS5
pueden ser detectados a los 5 das de la aparicin de los sntomas. Estas tres
protenas y los anticuerpos contra ellas pueden estar involucradas en los
mecanismos inmunopatognicos de esta enfermedad. La confirmacin de esta
enfermedad podra basarse en la identificacin de anticuerpos contra estas
protenas no estructurales. En la mayora de los casos con infeccin
secundaria, en fase convaleciente, se observan anticuerpos contra las
protenas no estructurales NS3 y NS5, y en cerca del 40 % contra la protena
NS1. (Churboonchart V, Bhamarapravati N, Peampramprecha S, Sirinavin S.
Antibodies against Dengue viral proteins in primary and secondary Dengue
hemorragic fever. Am J Med Hyg, 1991)

DENGUE Pgina 17
Determinantes antignicos. Recientemente se ha propuesto un modelo basado
en la cristalizacin de la protena E del virus de la encefalitis transmitida por
garrapata, segn el cual, esta protena presenta una estructura inusual cuando
se compara con otras protenas. Uno de los aspectos ms relevantes, es que
este modelo permite esclarecer la presentacin de diversos eptopos con
importantes funciones biolgicas. De igual forma ha permitido establecer las
bases estructurales para explicar el cambio que sufre esta protena de una
estructura dimrica a una estructura trimrica, as como la importancia de este
fenmeno para el reconocimiento de la protena por diversos anticuerpos frente
a variaciones de pH. (Rey FA, Heinz FX, Mand L, Hamson JC. The envelope
glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 resolution. Nature, 1995)

Estudios funcionales de la protena de la envoltura, han permitido caracterizar

los dominios responsables de la neutralizacin, de la hemaglutinacin (HA) de
los glbulos de gansos y de la fusin e interaccin del virus con los receptores
celulares especficos presentes en la superficie de las clulas. Por otra parte,
usando anticuerpos monoclonales, se han realizado mapas de eptopos
antignicos asociados con la neutralizacin. En ellos se pueden observar de 3
a 4 sitios antignicos mayores. Sin embargo, los eptopos
inmunodeterminantes en ratones pueden no serlo en humanos y viceversa. En
la actualidad se realizan esfuerzos significativos para determinar el tamao de
las cadenas, as como los cambios conformacionales a pH cido. Adems, para
localizar los eptopos neutralizantes en las regiones especficas de la protena
E, mediante el uso de pptidos sintticos, la expresin de las protenas en
bacteria y levaduras o por neutralizacin con anticuerpos monoclonales, de
variantes que escapan a los anticuerpos neutralizantes tradicionales. (Henchal
EA, Putnak JR. The Dengue viruses, 1990)

Se han podido definir grupos de eptopos empleando anticuerpos

monoclonales:

a) Eptopos conformacionales, ligados a la configuracin espacial de las

molculas que se juntan topolgicamente a partir de los residuos elongados en
la secuencia. Ellos son en s de la regin A y de la B, sensibles a la reduccin
de los puentes disulfuro y a la desnaturalizacin de la protena.

DENGUE Pgina 18
b) Eptopos lineares o secuenciales, independientes de la estructura
tridimensional de las protenas que presentan una especificidad de complejo
reconocimiento de la secuencia en el extremo Nterminal y en el lazo del
dominio B del virus del Dengue. (Mason PW, Zgel MU, Semproni AR, Fournier
MJ, Mason TL. The antigenic structure of Dengue type 1 virus envelope and
NS1 proteins expressed in Escherichia coli. J Gen Virol, 1990)

Serotipos del virus

El dengue es un arbovirosis ocasionado por cualquiera de los cuatro serotipos
diferentes del virus (Denv-1, Denv-2, Denv-3 y Denv-4), estrechamente
relacionados, pero serolgicamente distintos. Dentro de cada serotipo hay
varias cepas y genotipos, que probablemente son ms o menos virulentas,
pero los factores de virulencia no son totalmente conocidos. Por ejemplo el
Denv-2 presenta 2 genotipos (el del sudeste asitico y el americano) el primero
asociado al dengue hemorrgico y el segundo al dengue benigno. Cada
serotipo crea inmunidad especfica a largo plazo contra el mismo serotipo
(homlogo), de por vida. Y aun cuando son antignicamente similares, la
infeccin por un serotipo, no produce inmunidad contra los otros serotipos, slo
produce inmunidad parcial, o sea, no proveen inmunidad cruzada. (Fonseca
BA, Fonseca SN. Dengue virus infections. Curr Opin Pediatr, 2002)

Los cuatro serotipos son capaces de producir infeccin asintomtica,

enfermedad febril y cuadros graves que pueden conducir hasta la muerte, dada
la variacin gentica en cada uno de los cuatro serotipos. Algunas variantes
genticas parecen ser ms virulentas o tener mayor potencial epidmico. (Kour
G. El dengue, situacin actual en las Amricas. Perspectivas para su control,
2004)

Clasificacin de la fiebre por dengue

La OMS distingue 4 grados de severidad en la enfermedad

Grado I: fiebre, sntomas constitucionales no especficos, la prueba del

torniquete es positiva. Corresponde a la forma benigna (Fiebre de dengue).

Grado II: Grado I + sangrando espontneo (la piel, las encas, el tracto
digestivo). Tambin corresponde a la forma benigna.

DENGUE Pgina 19
Grado III: Grado II + fallo circulatorio y agitacin. Corresponde a la forma
severa (puede expresarse como "Dengue Hemorrgico" (DHF) o como
"Sndrome de choque Hipovolmico por Dengue (SCD) que puede ser mortal.

Grado IV: Grado III + el choque profundo, pulso y tensin arterial no

detectables. Tambin corresponde a la forma severa.

Formas clnicas del dengue

El dengue presenta un amplio espectro clnico, las diferentes formas clnicas
de este arbovirus han sido comparadas, con un iceberg en cuya base se
encuentran las infecciones asintomticas, en el nivel intermedio la forma
benigna (DC, 95% de los casos) y en los superiores, la forma hemorrgica
(DHF) y el sndrome de choque hipovolmico por dengue (SCD), que
constituyen el 5% de los casos. Est reportado que en los casos de FHD el
ataque es abrupto en todos los pacientes. El 97% presenta dolor de cabeza
intenso, el 90% mialgia, el 40% salpullido superficial, el 29% vmitos y el 9%
artralgia en la rodilla y junturas de la cadera. Tambin anuria, linfoadenopata,
hepatomegalia, esplenomegalia. (Scott H. Dengue. Aspectos clnicos y
etiopatogenia. Exposiciones de Taller Dengue en la UCV, 2004)

En el rango de la forma benigna, se observa principalmente en menores de 15

aos, casos de infeccin asintomtica o con sintomatologa leve (fiebre leve o
moderada, presencia o no de rash cutneo). Los factores de edad, sexo y raza,
merecen un anlisis cuidadoso y profundizar en los estudios epidemiolgicos y
genticos. Hay quienes afirman que la predisposicin a la forma severa del
dengue, desciende de manera significativa pasados los 12 aos de edad y
otros que el incremento de la edad favorece el riesgo de desarrollar las formas
severas de la arbovirosis; en cuanto al sexo, las mujeres enfermaran con ms
frecuencia que los hombres y en la raza, la caucsica se afectaran ms a
menudo que los de raza negra. (Kubelka C. Febre do Dengue e Dengue
Hemorrgico, 2002)

DENGUE Pgina 20
Fiebre por dengue
Se presenta un cuadro clnico caracterizado por aparicin repentina de fiebre
as como la presencia de signos y sntomas no especficos, incluyendo dolor
frontal de cabeza, retroorbital, articular y muscular, nuseas, vmitos y
debilidad, erupcin en la piel, molestia a la luz, enrojecimiento de la faringe,
conjuntivitis, dolor abdominal leve, nuseas, vmito, diarrea, alteraciones del
gusto, prurito generalizado, insomnio, temor, depresin, as como bradicardia
relativa y adenopatas. (Inmunopatologa (Grupo de consenso nacional para la
prevencin y control del dengue en Venezuela). Dengue, 2004)

Dengue hemorrgico (FHD)

Durante la fase aguda es difcil diferenciarlo de la fiebre por dengue, pero en la
fase crtica del FHD, se manifiestan sntomas de falla circulatoria o se pueden
presentar manifestaciones hemorrgicas cuando decrece la temperatura hasta
un estado normal. Los sntomas incluyen: hemorragias epiteliales, de mucosas
y de rganos internos (petequias, prpura, esquimosis, hematuria, epistxis,
sangrado de encas, sangrado intestinal y gstrico, prueba del torniquete,
positiva a causa de las micro-hemorragias de los capilares de la piel), ascitis,
derrame pleural, hepatomegalia y un aumento en la permabilidad vascular, que
puede ocasionar choque hipovolmico debido a la "fuga" de plasma hacia el
espacio extravascular e intersticial. El perodo de shock dura slo uno o dos
das y la mayora de pacientes responde rpidamente a una vigilancia estrecha
con oxigenoterapia, rehidratacin y otras medidas. (Sosa GL, Sena CA,
Ramrez HM, Alegre GB. Dengue: Un problema emergente, 2002)

En la forma benigna de esta infeccin, hay una respuesta inmunitaria con

predominancia de la subpoblacin linfocitaria TH1 y que en cambio en su forma
severa, es la actividad de tipo TH2 la que influencia el desarrollo de la
enfermedad

DENGUE Pgina 21
Sndrome de choque por dengue (SCD)
Es la forma ms grave de dengue, necesariamente requiere tratamiento
hospitalario, ya que el sistema circulatorio del paciente se ve muy
comprometido, aparecen signos de insuficiencia circulatoria, la piel se torna
fra, a menudo hay cianosis, pulso dbil y rpido, el paciente puede presentar
letargo, inquietud y luego entra en la etapa de choque que se caracteriza por
pulso acelerado y dbil, reduccin de la presin del pulso (20 mmHg o 2,7 kPa
o inferior) o hipotensin marcada con piel fra, hmeda y agitacin. Estos
pacientes estn en peligro de muerte si no se les administra enseguida el
tratamiento adecuado. La mayora se mantienen conscientes casi hasta la
etapa final. Esta etapa es corta, el paciente puede morir de 12 a 24 h o
recuperarse con rapidez despus del tratamiento; no corregido puede llevar a
la acidosis metablica, hemorragia grave del aparato digestivo o cualquier otro
rgano con un pronstico desfavorable. Puede aparecer tambin encefalopata
por alteraciones metablicas y electrolticas. La convalescencia en el FHD con
o sin choque suele ser corta, an en casos de choque profundo. Una vez
corregido ste, los pacientes se recuperan entre 48 a 72 h. (Ortega LM.
Dengue: un problema siempre emergente. RESUMED 2001)

Dengue hemorrgico sin choque

Las manifestaciones clnicas son semejantes a las del dengue clsico, es decir,
fiebre alta, vmitos, cefalea, artralgias, mialgias, anorexia, etc. La epigastralgia,
la sensibilidad en el reborde costal derecho y el dolor abdominal son comunes.
La temperatura es alta del 2 al 7 da y posteriormente baja a nivel normal o
subnormal. En ocasiones sube a 40C o ms y puede acompaarse de
convulsiones febriles. La manifestacin hemorrgica ms comn es una prueba
del torniquete positiva. En muchos casos se encuentran hemorragias en sitios
de venipuncin. En la etapa inicial podemos ver petequias finas diseminadas
por las extremidades, axila, cara y paladar blando. Puede verse erupcin
maculopapular al principio y al final de la enfermedad. Las epistaxis y la
hemorragia gingival son poco frecuentes. Puede existir hepatomegalia de 2 a 4
cm, dolorosa a la palpacin. (Mndez A, Gonzlez G. Dengue haemorrhagic
fever in children: ten years of clinical experience. Biomedica, 2003)

DENGUE Pgina 22
CAPITULO 2

Replicacin de ARN viral

Cuando la nucleocpside se halla libre en el citoplasma, se inician los procesos
de traduccin y replicacin del ARN. El ARN genmico viral del DENV es
monocatenario de sentido positivo, con un nico marco de lectura que traduce
un polipptido completo, el cual es procesado en el retculo endoplsmico por
proteasas celulares y la actividad NS3pro, que libera de forma ordenada a las
tres protenas estructurales (C, prM/M y E) y las siete protenas no
estructurales (NS1, NS2A, NS2B. NS3, NS4A, NS4B, NS5) encargadas de la
replicacin del genoma y el ensamblaje viral.

La replicacin del ARN viral es un proceso que no est totalmente entendido;

sin embargo, in vitro se han detectado tres especies de ARN, denominadas
ARN de 20S, 20/28S y 40S, segn el valor del coeficiente de sedimentacin.
Los ARN de 20S conocidos como formas de replicacin, no son degradados
por las ARNasas y estn constituidos por dos cadenas de ARN cada una con
polaridad contraria (negativa y positiva). La existencia de las formas de
replicacin sugiere que estas formas incluyen los intermediarios negativos que
actan como plantilla para la generacin de los ARN de sentido positivo. El otro
tipo de ARN, los ARN heterogneos de 20 a 28S, son denominados
intermediarios de replicacin y corresponden a hebras de ARN de sentido
positivo en proceso de elongacin. Por ltimo, los ARN de 40S pueden ser
degradados por ARNasas y, al parecer, es el ARN genmico encontrado en los
virus ensamblados; por lo tanto, estos ARN pueden ser utilizados para la
traduccin proteica o para conformar, junto con protena C la
ribonucleoprotena, los nuevos viriones. Durante la traduccin, el polipptido
recin sintetizado es acompaado por las protenas chaperonas BiP, calnexina
y calreticulina; luego, cada una de las protenas virales se organiza en la
membrana del retculo endoplsmico y es procesada por proteasas como la
furina, la signalasa o la NS3Pro, para finalmente ser modificadas despus de la
transduccin (plegamiento y glucosilacin). (Kyle J, Harris E. Global spread and
persistence of dengue. Annual Rev Microbiol. 2008;62:71-92.)

DENGUE Pgina 23
Ensamblaje, maduracin y liberacin del DENV
Los mecanismos que promueven, regulan y coordinan el ensamblaje del virus,
no son conocidos completamente. Sin embargo, por microscopa electrnica y
criomicroscopa, se ha sugerido que el proceso de ensamblaje de las partculas
del DENV sucede en distensiones del retculo endoplsmico denominadas
membranas convolutas (convolute), donde ocurre de forma simultnea la
traduccin de la protena y el ensamblaje del virus.

El proceso de ensamblaje comienza con la formacin de la nucleocpside

gracias a la interaccin del ARN genmico y la protena C en presencia de
pequeas gotas de lpidos; sobre esta primera estructura luego se asocian las
protenas prM/M y E, que deben estar inmersas en la membrana del retculo
endoplsmico. Posteriormente, suceden dos etapas de maduracin de la part-
cula viral. Primero se organizan de forma hete rodimrica las protenas prM/M y
E, en donde la primera recubre a la segunda; este recubrimiento le confiere un
aspecto rugoso a la superficie del virus cuando se observa por microscopa
electrnica. En el segundo paso, esta partcula inmadura transita desde el
retculo endoplsmico hasta las regiones cis y trans del aparato de Golgi,
donde se inicia la segunda etapa de maduracin. En esta ltima etapa, los
cambios de conformacin y de rotacin de la protena E generan homotrmeros
antiparalelos de la misma, lo que le da una apariencia lisa a la superficie del
virus. Por ltimo, un nuevo procesamiento proteoltico sobre la protena prM/M
por la proteasa furina, independiza el pptido pr y la protena M. Esta nueva
modificacin estabiliza los homotrmeros de E y mantiene unido al pptido pr.
Finalmente, cuando el virus es liberado, el pH neutro del espacio
extracitoplsmico induce el desprendimiento del pptido pr y la protena E
adquiere la conformacin final que puede ser reconocida por las molculas
receptoras de la clula sensible e iniciar un nuevo ciclo de infeccin en otra
clula. (Hung S, Lee P, Chen H, Chen L, Kao C, King C. Analysis of the steps
involved in dengue virus entry into host cells. Virology. 1999;257:156-67)

DENGUE Pgina 24
Protenas estructurales

Protena C
La protena de la cpside, tambin conocida como protena core o de cubierta,
pesa 11 kDa, aproximadamente. Su estructura secundaria consiste en cuatro
hlices alfa que cumplen diferentes funciones: las hlices 3 y 4 son
hidrofbicas y anclan la protena a la membrana del retculo endoplsmico. La
hlice 1, ubicada en el extremo N-terminal de la protena y orientada hacia el
citoplasma, posee aminocidos de carcter bsico que se asocian y unen
fuertemente al ARN genmico recin sintetizado; de esta manera, se forma el
complejo riboproteico o nucleocpside que protege al ARN viral de la
degradacin y promueve la organizacin del ARN en el interior de la partcula
viral en formacin. La nucleocpside se estabiliza por la interaccin de varios
homodmeros antiparalelos de la protena C, que rodean con gran afinidad y
especificidad a la hebra de ARN viral. La hlice 2 posee una naturaleza muy
hidrof- bica que interviene durante el ensamblaje de la ribonucleoprotena y de
la partcula viral. En el primer caso, acta como una bisagra que favorece el
acercamiento del ARN viral al resto de la protena C anclada en la membrana
del retculo endoplsmico. Por otro lado, la hlice 2 recluta pequeas gotas
lipdicas (lipid droplets), presentes en el citoplasma, que promueven la
formacin de la partcula viral. Adems, la protena de la cpside anclada en el
retculo endoplsmico interacta con las protenas precursora de membrana
(prM) y de envoltura, para favorecer y completar el ensamblaje de las partculas
virales.

Protena precursora de membrana (prM) y protena de membrana (M)

La protena precursora de membrana (prM) tiene un peso molecular de 26 kDa
y est presente en los viriones inmaduros y junto con la protena M, participa
fundamentalmente en el proceso de maduracin de la partcula viral. La
protena precursora de membrana es procesada despus de la transduccin
por la proteasa celular furina, que la divide en dos y genera, por un lado, el
pptido pr, y por otro, la protena M, que queda con un peso molecular de 8
kDa. La protena tiene dos dominios transmembrana y un ectodominio de 40
aminocidos, aproximadamente. Este ltimo, segn lo descrito por Catteau et
al., puede inducir apoptosis en diferentes lneas celulares tumorales. Con el fin

DENGUE Pgina 25
de precisar la regin del ectodominio que induce apoptosis, mediante tcnicas
de biologa molecular, estos investigadores identificaron un pptido de nueve
aminocidos que corresponde a los residuos 32 al 40 del dominio externo, que
fue llamado ApoptoM, como el responsable de inducir la muerte de las clulas.
La seal proapopttica de ApoptoM se induce solamente cuando este dominio
es transportado por la ruta secretoria de la clula y se puede inhibir cuando el
ectodominio se ancla al retculo endo plsmico o cuando se le adiciona el
pptido seal KDEL, que marca a las protenas para ser devueltas al retculo
endoplsmico. Estos resultados sugieren que el pptido ApoptoM de la protena
M podra estar involucrado en la muerte celular y el dao tisular sufrido durante
la infeccin.

Protena de envoltura E
La protena de envoltura tiene un peso molecular de 50 kDa, posee tres
dominios denominados I, II y III, y se distribuye sobre la superficie del virus,
formando complejos homodimricos de tipo cabeza-cola. Los dominios II y III
de cada uno de las protenas del homodmero son determinantes para las
interacciones entre el virus y los receptores de las clulas vulnerables. Por otra
parte, la glucoprotena E es el principal inmun- geno del virus, por lo tanto
estimula la respuesta inmune del individuo e induce la produccion de
anticuerpos neutralizadores. La importancia funcional de la protena E radica en
que es la nica protena viral que interacta con las molculas receptoras de la
membrana plasmtica de las clulas vulnerables que favorecen la endocitosis
del virus. Por lo tanto, las mutaciones y modificaciones posteriores a la
transduccin que sufre esta protena en cada ciclo de replicacin, pueden
afectar directamente la eficiencia de la replicacin, la virulencia y el tropismo
del DENV, al igual que puede regular el establecimiento y el control de la
infeccin por parte del sistema inmunitario.

Protenas no estructurales
NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5. La funcin o funciones de cada
una de las protenas no estructurales (NS, non structural proteins) del DENV se
han definido parcialmente.

DENGUE Pgina 26
La NS1
La protena NS1 (46 kDa) forma dmeros o hexmeros asociados a balsas
lipdicas (rafts) de la membrana plasmtica. Tambin, se puede hallar soluble
en el citoplasma y en el espacio extracelular; por esta razn, la NS1 puede
estimular al sistema inmunitario. Varios autores han demostrado en el suero de
pacientes infectados con DENV o con el virus de encefalitis japonesa (JVE), la
presencia de inmunoglobulinas dirigidas contra la protena NS1. Estos sueros
se han evaluado in vitro y se ha demostrado que las Ig contra la protena NS1
de ambos virus pueden estimular la lisis mediada por el complemento y
dependiente de anticuerpos, tanto en clulas infectadas como no infectadas.
Este ltimo fenmeno podra explicar, por lo menos en parte, los daos
funcionales del endotelio, que conducen al sangrado y a la extravasacin
plasmtica, como se ha demostrado en los pacientes con diagnstico de
dengue grave.

La NS2A
Es una protena de 22 kDa, aproximadamente, que in vitro promueve el
ensamblaje y la replicacin viral. Al parecer, la NS2A coordina de un modo an
no muy bien definido, si el ARN genmico producido en cada ciclo de
replicacin se utiliza como nueva plantilla para generar las formas replicativas y
los intermediarios replicativos o si se asocia dentro de la nucleocpside durante
el ensamblaje viral. Por su parte, la protena NS2B (14 kDa) posee una regin
hidrofbica que ancla a la membrana del retculo endoplsmico el complejo
NS2B/NS3 y luego, por un procesamiento proteoltico, un pequeo dominio
hidroflico de NS2B recin liberado interacta con el dominio proteasa de la
protena NS3 para actuar como cofactor de sta.

La NS3
Es protena (70 kDa) es una protena bipartita que posee en el extremo N-
terminal un dominio proteasa similar a la tripsina (NS3pro) y en el extremo C-
terminal posee un dominio con diferentes actividades enzimticas, que acta
como trifosfatasa de nucletidos estimulada por ARN (NTPase) y como
helicasa del ARN (NS3Hel); ambas funciones son indispensables en la
replicacin viral. El dominio NS3Pro acta hidrolizando los complejos
NS2A/NS2B, NS2B/NS3, NS3/NS4A y NS4B/ NS5 del polipptido.

DENGUE Pgina 27
Como se coment anteriormente, la funcin del dominio NS3Pro depende de
su asociacin con la protena NS2B, que le confiere estabilidad du rante su
actividad proteoltica, mientras que la funcin helicasa permanece inhibida. Ms
recientemente, se encontr que la protena NS3 es la encargada de generar el
ambiente lip- dico apropiado alrededor del retculo endoplsmico, al reclutar
enzimas celulares de la va de sntesis de lpidos (Fatty Acid Synthase), lo cual
garantiza el inicio del ensamblaje.

Por otra parte, se ha sugerido que la protena NS3 puede participar durante los
procesos de ensamblaje y de transporte intracelular de los flavivirus. Esta
funcin ha sido sugerida por Patkar et al. (2008), quienes demostraron que la
mutacin W349A en el dominio helicasa de la protena NS3 del virus de la
fiebre amarilla (YFV) afecta el ensamblaje de las partculas virales sin disminuir
la capacidad de replicacin del ARN. Por otro lado, Chiou et al, (2003)
evidenciaron que la protena NS3 del JEV se precipita simultneamente con la
protena TSG101 (Tumor Susceptibility Gene 101), que hace parte del complejo
ESCRT I (Endosomal Sorting Complex Required for Transport). Este complejo
se forma en el citoplasma y participa en la generacin de los cuerpos
multivesiculados de la clula, los cuales intervienen en procesos de reciclaje y
degradacin de protenas. La protena TSG101 ha sido reportada como una de
las principales protenas celulares que promueven el ensamblaje del virus de
inmunodeficiencia humana-1 (HIV-1) y el virus del bola. La otra funcin de la
protena NS3 es actuar como helicasa (NS3Hel), desenrollando las estructuras
secundarias que se forman en el extremo 3 del ARN viral, para favorecer la
unin de la polimerasa NS5 sobre el ARN y dar inicio a la replicacin.

La NS5
Es la protena ms conservada entre todos los flavivirus. Esta protena es
multifuncional, ya que el extremo N-terminal posee actividad enzimtica de
metiltransferasa y guanidiltransferasa, responsables del capping y la metilacin
del extremo 5 del ARN genmico, mientras que, en el extremo C-terminal, se
ubica el dominio de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps). Por lo
tanto, la protena NS5 acta como la nica polimerasa durante la replicacin y
transcripcin virales. Aunque estos procesos suceden exclusivamente en el
citoplasma de la clula infectada, se ha identificado una seal de localizacin

DENGUE Pgina 28
nuclear en la protena NS5 que facilita su importacin al ncleo; sin embargo, la
razn y la funcin de la NS5 en el ncleo no se conocen.

Patogenia del dengue

Linfocito T
Los linfocitos T desempean un papel preponderante en el establecimiento y
control de la respuesta inmunitaria frente al virus. Tanto los linfocitos CD4+
como los CD8+ estimulados por diferentes citocinas, como el IFN (tipo I y II) y
el factor de necrosis tumoral alfa (TNF), se activan y secretan citocinas que
pueden tener un carcter proinflamatorio o antiinflamatorio. En resumen, esta
respuesta inmunitaria es la que normalmente se presenta en los pacientes
infectados por primera vez que logran resolver la infeccin; sin embargo, en los
pacientes que sufren una nueva infeccin con un serotipo diferente al que
caus la primera (frecuente en zonas endmicas donde circula ms de un
serotipo de DENV), ocurre un fenmeno que estimula y exacerba la respuesta
inmunitaria del paciente, lo que aumenta las probabilidades de que desarrolle
dengue grave, con manifestaciones hemorrgicas o sin ellas. El desarrollo del
dengue grave y su asociacin con las reinfecciones est bien argumentada
clnica y experimentalmente. Una de las teoras ms aceptadas y polmica, se
denomina potenciacin de la infeccin dependiente o mediada por anticuerpos,
que se presenta cuando los anticuerpos producidos y dirigidos contra el
serotipo de DENV que caus la infeccin por primera vez, reconocen y forman
complejos con el segundo serotipo de virus causante de la reinfeccin. Estos
complejos virus-anticuerpos se unen a los monocitos y macrfagos mediante
los receptores Fc, favoreciendo la penetracin del virus. Este mecanismo
incrementa la proporcin de clulas infectadas, la viremia y la capacidad de
dispersin del virus en el organismo. Esto explica por qu algunos pacientes
con dengue grave poseen ttulos virales ms altos en comparacin con los
pacientes con dengue sin signos de alarma. Adems, el fenmeno de la
potenciacin de la infeccin dependiente o mediada por anticuerpos estimula la
activacin en clulas como linfocitos y macrfagos, induciendo la liberacin de
citocinas y otros factores solubles que alteran, entre otros aspectos, la fisiologa
del tejido endotelial, lo que facilita la extravasacin y la formacin de edemas,
petequias y hemorragias.

DENGUE Pgina 29
La evidencia clnica de la potenciacin de la infeccin dependiente o mediada
por anticuerpos est dada por los cientos de casos de dengue grave con
manifestaciones hemorrgicas que se han descrito en Tailandia, donde el
dengue es hiperendmico y la poblacin ms vulnerable a la infeccin son los
menores de 15 aos quienes han sufrido por lo menos una infeccin por DENV
(70). Por otra parte, los menores de un ao que presentan signos de dengue
grave al ser infectados por primera vez por un serotipo de DENV, desarrollan
estos signos por la presencia de anticuerpos anti-DENV transmitidos
verticalmente por sus madres. Sin embargo, la literatura tambin reporta casos
de dengue grave con manifestaciones hemorrgicas en pacientes infectados
por primera vez. Esto sugiere que el desarrollo de estas manifestaciones puede
tener otras causas adicionales, como la edad de los pacientes, el sexo y
factores genticos del individuo, como la raza y algunos polimorfismos
asociados a los genes HLA, TNF-, y CD209. Por otra parte, el serotipo y el
genotipo del virus tambin pueden estar relacionados con la gravedad de la
enfermedad. Otro mecanismo que se ha asociado al desarrollo de dengue
grave, es la lisis de las clulas endoteliales, mediada por complemento y
dependiente de anticuerpos, especialmente aquellos dirigidos contra NS1, que
reconocen un antgeno an no identificada presente en la superficie del
endotelio. Esta interaccin activa el sistema de complemento que altera la
permeabilidad vascular, induce la disfuncin del tejido y lisis de las clulas
endoteliales. Por otro lado, la gravedad de la enfermedad puede deberse a las
grandes concentraciones y a la constante permanencia de algunas de citocinas
producidas y liberadas por clulas como linfocitos, macrfagos y endoteliales,
entre otras. Como se dijo anteriormente, las clulas infectadas y las no
infectadas, responden al estmulo inducido por IFN de tipo I y II que activan
sobre stas, la proliferacin, la diferenciacin y la apoptosis. Adems, pueden
estimular la expresin de algunas molculas de adhesin y de receptores que
promueven de nuevo la expresin de citocinas y otros mediadores solubles.
Esta activacin inmunitaria constante sostiene una sealizacin que afecta a
las clulas, alterando la funcin del endotelio, de los linfocitos y de los
macrfagos. Entre los mediadores solubles que se han detectado en pacientes
infectados con DENV, se encuentran citocinas de tipo Th1 y Th2 (T helper
lymphocytes) secretadas por linfocitos CD4+ o CD8+. En pacientes con

DENGUE Pgina 30
diagnstico de dengue sin signos de alarma, se detectan citocinas de tipo Th1
como IFN e interleucina 2 (IL-2), mientras que, en los pacientes con dengue
grave, se detectan citocinas de tipo Th2, como las IL-4, IL-6, IL-8 e IL-10.
Particularmente, la IL-8 se presenta en grandes concentraciones en el suero de
estos pacientes y, en algunos casos, este incremento se asocia con un
aumento en la permeabilidad vascular, la efusin pleural y la muerte de los
pacientes. El otro grupo de molculas que se expresa en exceso en las clulas
infectadas y no infectadas, son las molculas de adhesin como ICAM-1,
VCAM-1, E, L y P-selectina, entre otras. Estas molculas facilitan el
reconocimiento, la unin y la posterior diapdesis de clulas como los
monocitos, que atraviesan la barrera endotelial y circulan en los espacios
intersticiales. Esto permite, por un lado, la propagacin del virus a otras clulas
y tejidos, y, por otro, el paso de lquido y mediadores solubles que estimulan los
procesos inflamatorios. En resumen, esta respuesta inmunitaria es la que
normalmente se presenta en los pacientes infectados por primera vez que
logran resolver la infeccin; sin embargo, en los pacientes que sufren una
nueva infeccin con un serotipo diferente al que caus la primera (frecuente en
zonas endmicas donde circula ms de un serotipo de DENV), ocurre un
fenmeno que estimula y exacerba la respuesta inmunitaria del paciente, lo que
aumenta las probabilidades de que desarrolle dengue grave, con
manifestaciones hemorrgicas o sin ellas

DENGUE Pgina 31
CAPITULO 3
REV CUBANA MED TROP 2011;63(3):211-9
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL PEDRO KOUR
Propiedades biolgicas de cepas de virus dengue
serotipo 2 aisladas durante la epidemia en Santiago de
Cuba, 1997
Dra. C. Rosmari Rodrguez-Roche,1 MSc. Liudmila Lpez Matilla,2 Dra. C. Mayling Alvarez Vera,1 MSc.
Luis Morier
Daz,1 Dra. C. Mara G. Guzmn Tirado1
INTRODUCCIN

DENGUE Pgina 32
DENGUE Pgina 33
DENGUE Pgina 34
DENGUE Pgina 35
DENGUE Pgina 36
DENGUE Pgina 37
 RESUMEN
D urante la epidemia cubana de
dengue, ocurrida en Santiago de
Cuba, 1997, se evidenci un
incremento de la severidad en el
tiempo en trminos y la proporcin
de casos graves y muertes por
dengue hemorrgico, que pudiera
estar dado por la aparicin de
mutantes de escape a la
neutralizacin, con mayor potencial virulento. El estudiar algunas propiedades
biolgicas de cepas aisladas en diferentes momentos de la epidemia de
Santiago de Cuba en 1997, se estudiaron 9 cepas de DENV-2, donde se evalu
el efecto citopatognico y el crecimiento viral en las lneas celulares C6/36 HT y
Vero, tamao de las placas virales, sensibilidad a la temperatura,
neurovirulencia en ratones lactantes y la influencia del pH en la unin del virus
a la clula, as como en el medio de multiplicacin.Las cepas del final de la
epidemia mostraron propiedades que las diferencian de las aisladas al inicio,
entre las cuales se encuentran un mayor efecto citopatognico en clulas
C6/36 HT, ttulos virales superiores y una mayor neurovirulencia en ratones
lactantes. Por otra parte, en la unin del virus a la clula las cepas del inicio de
la epidemia resultaron favorecidas por un pH cido mientras que a las cepas
del final de la epidemia las favoreci un pH bsico. Pudiendo asi demostrarse

DENGUE Pgina 38
que adems de los cambios genotpicos observados, existen diferencias
fenotpicas entre las cepas de distintos momentos de la epidemia, que pudieran
estar asociados con diferencias en cuanto a la adecuacin viral de estas y en
su potencial virulento.

ARTCULO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

Deteccin molecular y tipificacin del virus dengue por

RT-PCR y PCR anidada usando oligonucletidos
mejorados

Molecular detection and typing of dengue virus by RT-PCR and

nested PCR using degenerated oligonucleotides

Jos A. Usme-Ciro1,2, Alba M. Gmez-Castaeda2, Juan C. Gallego-Gmez1,2

1
Viral Vector Core and Gene Therapy, rea de Neurobiologa Celular y Molecular, Grupo
de Neurociencias, Sede de Investigacin Universitaria SIU, Facultad de Medicina,
Universidad de Antioquia. Medelln (Colombia).

2
Grupo de Medicina Molecular y de Translacin, Facultad de Medicina, Universidad de
Antioquia. Medelln (Colombia).

INTRODUCCIN privilegiados por la alta biodiversidad y

Los pases en desarrollo ubicados en el
cinturn tropical tenemos una realidad
muy paradjica, pues vivimos en sitios
recursos naturales pero al mismo
tiempo esta abundancia es tambin
vlida para los agentes biolgicos que
producen y/o estn implicados en
enfermedades.

DENGUE Pgina 39
Los trpicos podran ser considerados
como los laboratorios evolutivos del
mundo, y de forma experimental hemos
sido testigos de la rpida diversificacin
del virus dengue (DENV) a nivel local
(1,2).
El dengue es una enfermedad viral
transmitida por artrpodos
predominante en pases tropicales y
subtropicales, con un estimado de 50 -
100 millones de casos y alrededor de 25
000 muertes cada ao a nivel mundial
(3). Esta enfermedad es causada por el
DENV, un miembro del
gnero Flavivirus perteneciente a la
familia Flaviviridae, conformada por
virus envueltos de estructura
icosahdrica con genoma ARN de
cadena sencilla y polaridad positiva
(ssARN+) 4.
Existen 4 serotipos de DENV
estrechamente relacionados: DENV-1,
-2, -3 y -4, los cuales ocasionan
diferentes grados de severidad de la
enfermedad (5, 6), haciendo necesaria
su identificacin no solo para garantizar
un tratamiento oportuno previo al inicio
de las complicaciones de la enfermedad,
sino tambin til en los programas de
vigilancia epidemiolgica. El DENV es el
agente causal del dengue clsico (DF),
as como de las manifestaciones
severas: el dengue hemorrgico (DHF) y
el sndrome de choque por dengue
(DSS) (6), ahora consideradas dengue
grave (7).
Teniendo en cuenta la importancia de la
potenciacin dependiente de
anticuerpos (ADE), como resultado de
infecciones secundarias con serotipos
heterlogos (8 - 10), se hace necesario
mantener y reforzar los programas de
vigilancia epidemiolgica que permitan
conocer la dinmica de circulacin de los
distintos serotipos y, por ende, la
historia de retos inmunolgicos de las
diferentes poblaciones que las
predisponen a efectos adversos ante la
entrada de un serotipo diferente; de
DENGUE Pgina 40
esta forma es posible anticipar las
medidas de control y tratamiento a la
poblacin afectada o potencialmente
vulnerable ante el ingreso de un nuevo
serotipo.
Desafortunadamente, el aislamiento
viral no permite realizar un diagnstico
en la fase aguda de la enfermedad,
debido a que requiere ms de 7 das
para la obtencin de los resultados (11-
12). Por otro lado, aunque las pruebas
serolgicas permiten obtener datos en
menor tiempo, su uso se limita a la fase
convaleciente y depende de la
capacidad de respuesta del sistema
inmune del individuo y el tiempo de
infeccin para poder obtener ttulos
detectables de anticuerpos (13-14),
siendo an muy difcil serotipificar el
DENV debido a la posibilidad de reaccin
cruzada (15).
Debido principalmente a la
infraestructura, equipamiento y personal
requerido para la implementacin de
tcnicas moleculares, el diagnstico de
dengue se realiza principalmente a
partir de pruebas serolgicas y
aislamiento viral en cultivos celulares,
tcnicas que proveen informacin
cuando los pacientes ya han pasado el
cuadro clnico, limitndose su relevancia
a la vigilancia epidemiolgica y estudios
virolgicos posteriores. Existe, por lo
tanto, una necesidad urgente de
implementar mtodos de diagnstico
molecular para uso temprano en la
enfermedad, conducentes a la adopcin
de medidas adecuadas para el
tratamiento y manejo del paciente.
En pases como Colombia, donde la
investigacin y adquisicin de nueva
tecnologa han cobrado importancia, el
uso de tcnicas moleculares se
convierte en una alternativa al alcance
no solo para el diagnstico temprano de
la enfermedad sino tambin para
anlisis evolutivos y epidemiolgicos
(1,2, 16-19), derivando en nuevas
estrategias de prevencin y control. Las
tcnicas de RT- PCR y PCR convencional,
si bien requieren personal capacitado y
adquisicin de equipos para su
implementacin en el laboratorio clnico,
son una excelente alternativa de
deteccin y tipificacin del DENV, debido
a que permiten obtener resultados en
pocas horas, siendo su sensibilidad
mayor al detectar pocas copias del
genoma viral en el suero del paciente,
inclusive provenientes de partculas
virales inactivas o unidas a anticuerpos
(20).La Organizacin Panamericana de
la Salud (PAHO/OPS) recomienda el uso
de la tcnica de Lanciotti y comparacin con los obtenidos por el
colaboradores (21), o su variante de
Harris y colaboradores (22), para la
deteccin y tipificacin del DENV en
toda su rea de influencia (11). El
funcionamiento de estos
oligonucletidos ha sido avalado durante
aos; sin embargo, debido a que el
DENV est constituido por un genoma
de tipo ARN, con una ARN polimerasa
dependiente de ARN carente de
actividad correctora (23), la
acumulacin de cambios, y por ende, la
desactualizacin de los oligonucletidos
es relativamente rpida, lo cual conlleva
un incremento en la probabilidad de
generar resultados falsos negativos por
ineficiencia en la hibridacin de
oligonucletidos con las secuencias de
las cepas circulantes. En vista de ello,
este estudio pretende hacer uso de las
herramientas bioinformticas actuales,
as como de la creciente disponibilidad
de secuencias de las cepas de DENV que
circulan mundialmente, para el rediseo
racional de los oligonucletidos
convencionalmente usados en
diagnstico y tipificacin del DENV (21);
as como la estandarizacin y evaluacin
de los oligonucletidos sobre muestras
de ARN obtenidas a partir de
sobrenadantes de cultivos celulares
infectados y en prueba piloto sobre
sueros de pacientes con diagnstico
clnico de dengue.
MATERIALES Y MTODOS
Seleccin de secuencias y
procesamiento bioinformtico
Por medio del programa ClustalW (24)
integrado al paquete MEGA versin 3.1
(25) se realiz el alineamiento de la
regin C-PrM/M de las secuencias del
DENV correspondientes a los cuatro
serotipos, disponibles en la base de
datos GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/
) (Release 155.0), para posteriormente
redisear los oligonucletidos y
mejorarlos tericamente por
programa HintPCR versin 3.0 (26).
A partir del alineamiento se analizaron
las posiciones de los oligonucletidos
previamente reportados (21) en el
contexto de toda la variabilidad
presente y se verificaron diferentes
parmetros: la posicin de codn en el
nucletido del extremo 3' de cada
oligonucletido, respecto al marco de
lectura de la poliprotena del DENV, la
frecuencia de cada polimorfismo en el
conjunto total de secuencias analizadas,
Tm (temperatura de melting),
estructuras secundarias y especificidad
de secuencia.
Muestras de virus
Para realizar los ensayos de
estandarizacin de la RT-PCR y PCR
anidada se utilizaron cepas
correspondientes a los cuatro serotipos
del DENV (M1, M2, M3 y M4),
previamente crecidas en clulas de
mosquito Aedes albopictus clon C6/36
(27).
Muestras clnicas
Se incluyeron en el anlisis un total de
15 muestras clnicas (sueros) de
pacientes con diagnstico presuntivo de
dengue, las cuales fueron colectadas en
el rea metropolitana del Valle de
Aburr entre 2005 y 2007. Por otro
lado, para soportar los hallazgos en la

DENGUE Pgina 41
tipificacin molecular de DENV a partir
de ARN obtenido directamente de
sueros y ARN extrado de sobrenadantes
de cultivos de C6/36 inoculados con
dichos sueros se realiz intento de
aislamiento viral e inmunofluorescencia
a cada una de las 15 muestras en
clulas C6/36 con 500 L de una
dilucin 1/10 de cada muestra en D-
MEM y un periodo de incubacin de 9
das. Finalmente, los fragmentos
correspondientes a muestras positivas
fueron purificados y secuenciados para
corroborar nuevamente la
correspondencia de los serotipos.
Extraccin de ARN viral
El ARN viral de las cepas de DENV-1 a
-4 y de las muestras de suero de
pacientes fue extrado usando el
estuche comercial QIAamp Viral RNA
minikit (Qiagen), siguiendo las
recomendaciones del fabricante. El ARN
extrado fue almacenado a -20C hasta
su posterior utilizacin.
RT-PCR y PCR anidada
La RT-PCR dirigida a la regin C-PrM/M
se llev a cabo utilizando el estuche
QIAGEN One-Step RT-PCR kit (Qiagen)
y los oligonucletidos D1_Modif y
D2_Modif, diseados en este estudio
(Tabla 1). El perfil trmico consisti en
un paso de transcripcin reversa a 41C
por 45 minutos, un paso de activacin
de la Hot Start Taq DNA polimerasa a
94C por 15 minutos, 40 ciclos (94C
por 30 segundos para desnaturalizacin,
58C por 1 minuto para la hibridacin
de oligonucletidos y 72C por 30
segundos para la extensin), seguido
por una extensin final a 72C por 5
minutos. El volumen final de la reaccin
fue de 25 L. El producto amplificado
corresponde a un fragmento de 509 pb.
El producto de la RT-PCR fue diluido
(1/100) con agua libre de nucleasas,
con el fin de disminuir las
amplificaciones inespecficas por exceso
DENGUE Pgina 42
de ADN durante la PCR anidada. La PCR
anidada fue realizada a partir de 1 L de
la dilucin, utilizando los
oligonucletidos D1_Modif, TS1_Modif,
TS2_Modif, TS3_Modif y TS4_Modif. El
volumen final de la reaccin fue 25 L.
Se utilizaron 2.5 L de tampn Taq DNA
polimerasa 10x, 1 mM de MgCl 2, 0.4 mM
de cada dNTP, 10 pmoles de cada
oligonucletido y 1.25 unidades de la
enzima Taq DNA polimerasa
(Fermentas). El perfil trmico fue de 2
minutos a 94C, 40 ciclos (30 segundos
a 94C, 1 minuto a 55C y 30 segundos
a 72C), finalizando con una extensin a
72C durante 5 minutos.
Anlisis de los productos
amplificados
Para la visualizacin del producto de
amplificacin del DENV (deteccin - RT-
PCR) y los productos correspondientes a
cada uno de sus serotipos (tipificacin -
PCR anidada) se prepararon geles de
agarosa al 1.5% en tampn TAE,
utilizando 10 L del producto obtenido
de la RT-PCR y/o PCR anidada y
bromuro de etidio para la visualizacin.
Para diferenciar las bandas obtenidas en
la RT-PCR (509 pb) y PCR anidada:
DENV-1: 487 pb; DENV-2: 122 pb;
DENV-3: 299 pb y DENV-4: 391 pb, se
utiliz un marcador de peso molecular
de 100 pb (Fermentas).
RESULTADOS
Rediseo de oligonucletidos El oligonucletido D2_Modif fue
modificado en el extremo 3', de tal
En el diseo de los oligonucletidos forma que coincidiera con la primera
D1_Modif y D2_Modif para la RT-PCR se posicin de codn.
utilizaron 795 y 910 secuencias
obtenidas del GenBank El nucletido en el extremo 3` de los
respectivamente. Para el diseo de los oligonucletidos TS1, TS3 y TS4
oligonucletidos especficos de serotipo coincidi con la tercera posicin de
se utilizaron 85, 151, 335 y 201 codn, la cual presenta una alta
secuencias para TS1_Modif, TS2_Modif, variabilidad reflejada en los
TS3_Modif y TS4_Modif alineamientos (datos no mostrados).
respectivamente. Sus versiones aqu modificadas,
TS1_Modif, TS3_Modif y TS4_Modif, por
su parte, coinciden con la primera o

DENGUE Pgina 43
segunda posicin de codn, interferir con la
garantizando su hibridacin con una correcta
mayor probabilidad. El oligonucletido serotipificacin
TS2_Modif fue modificado, de tal modo del DENV (datos
que su nucletido en el extremo 3` no mostrados).
coincidiera con la segunda posicin de Sin embargo, al
codn, la cual presenta hacer dilucin
significativamente menor variabilidad, 1/100 del
debido a que una sustitucin a este producto de la
nivel conllevara a un cambio de RT-PCR, bajo las
aminocido con importantes condiciones
implicaciones en el fenotipo del virus. normales de
reaccin, la
Una vez se obtuvo el rediseo tcnica mejor
preliminar de los oligonucletidos
basado en la variabilidad gentica
reflejada en los alineamientos, se
procedi a la evaluacin in silico de los
mismos, teniendo en cuenta algunos
parmetros termodinmicos
importantes (energa libre, formacin de
homodmeros, heterodmeros,
estructuras secundarias y temperatura
de melting), y se mejor tericamente
el diseo por comparacin con los
candidatos hallados por medio del
paquete HintPCR versin 3.0 (26) para
la misma regin, usando siempre una
secuencia (serotipo) como blanco y las
secuencias de los otros tres serotipos
utilizadas simultneamente durante la
bsqueda para excluir candidatos
presentes en al menos una de ellas. En
la tabla 1 se muestran en detalle las
modificaciones en cada uno de los
oligonucletidos luego de todo el
proceso de optimizacin.

Deteccin especfica de cada

serotipo de DENV
Con el propsito de demostrar que la
especificad de cada oligonucletido no
ha sido afectada con el rediseo de los
mismos, se realiz la RT-PCR (figura 1a)
y PCR anidada del DENV (figura 1b)
usando ARNs extrados de cultivos
celulares infectados. Cuando se utiliz
como molde para la PCR anidada el
producto de la RT-PCR sin dilucin se
obtuvo una amplificacin con diferentes
bandas inespecficas, que podran
considerablemente y se logr tipificar
correctamente cada uno de los serotipos
del DENV (figura 1b).Al excluir el
oligonucletido TS1_Modif de la reaccin
se obtuvo el resultado esperado, con
una ausencia de amplificacin
correspondiente al DENV-1, lo cual
indica que los oligonucletidos
TS2_Modif, TS3_Modif y TS4_Modif
presentes en la mezcla de PCR anidada
no hibridan inespecficamente en la
secuencia de DENV-1 (figura 2a).
Resultados similares fueron obtenidos

DENGUE Pgina 44
cuando se eliminaron los correspondiente (figura 2b-d). Los
oligonucletidos TS2_Modif, TS3_Modif controles negativos no mostraron
y TS4_Modif, con ausencia de bandas de amplificacin.
amplificacin del serotipo

DENGUE Pgina 45
Tipificacin de DENV en muestras
clnicas
De las 15 muestras con diagnstico
presuntivo de dengue incluidas en la
prueba piloto, 2 pudieron ser detectadas
directamente a partir del producto de
RT-PCR (#13 y #27) (figura 4a), 3
permitieron la tipificacin de DENV
luego de la PCR anidada,
correspondiendo a los serotipos DENV-2
(#26) y -3 (#13 y #27) (figura 4b).
Adicionalmente, 3 muestras positivas
pudieron ser detectadas nicamente al
evaluar la tcnica con ARNs obtenidos a
partir de sobrenadantes de clulas
C6/36 inoculadas con los sueros,
correspondiendo a los serotipos DENV-2
(#1291 y #28) y -3 (#25) (datos no
mostrados). La correcta tipificacin fue
confirmada por inmunofluorescencia
utilizando anticuerpos especficos para
cada serotipo y mediante secuenciacin
(datos no mostrados).
DISCUSIN
En este estudio se muestra el rediseo
de los oligonucletidos para la deteccin
y tipificacin del DENV con el propsito
de aumentar la cobertura en la
deteccin, de acuerdo con la variabilidad
que han acumulado las cepas durante
un periodo de ms de 15 aos. Los
oligonucletidos reportados por Lanciotti
y colaboradores (21) actualmente son
recomendados por la OPS, y su
desempeo en muestras clnicas ha
demostrado su efectividad (28, 29).
Aunque se han desarrollado diferentes
tcnicas con el mismo propsito, estas
se basan en el uso de sondas,
fluorforos y equipos de PCR en tiempo
real (30-38), los cuales an no estn
disponibles en muchos laboratorios de
salud pblica. Por lo tanto, tcnicas
simples como la PCR convencional
continuarn demostrando su utilidad,
sobre todo en pases en desarrollo,
donde acceder a equipos de ltima
tecnologa puede ser difcil.
Estudios anteriores han realizado
modificaciones a los oligonucletidos
utilizados convencionalmente (22, 30,
39), logrando incluso la deteccin y
tipificacin en el mismo tubo de
reaccin y disminuyendo, por ende, la
probabilidad de contaminacin (22); sin
embargo, se hicieron necesarias
modificaciones adicionales que
permitieran adaptarlos a las secuencias
actualmente circulantes a nivel mundial.
Los oligonucletidos D1_Modif y nucletidos.
D2_Modif mostraron un buen
desempeo luego de realizarles las
modificaciones correspondientes. La
presencia de una nica banda en el
producto de la RT-PCR de muestras de
los cuatro serotipos es una clara
evidencia de que la especificidad se
mantiene a pesar de las degeneraciones
(figura 1a). El extremo 3' de los
oligonucletidos de D1_Modif y
D2_Modif coincide con la segunda y
primera posicin de codn
respectivamente, por lo cual, los
frecuentes cambios en la tercera
posicin de codn en las diferentes
cepas no alteraran su hibridacin y
amplificacin.
El extremo 3' de los oligonucletidos
especficos de serotipo TS1, TS3 y TS4
descritos previamente (21) coincide con
la tercera posicin de codn, mientras
que TS2 hibrida en la primera posicin
de codn. Aproximadamente, el 30% de
los cambios en la tercera posicin de
codn son no sinnimos, cambios en la
primera posicin son no sinnimos en el
96% de los casos y en la segunda
posicin de codn los cambios son
siempre no sinnimos, llevando, por
ende, a un cambio en el aminocido
codificado (40).
Los cambios de aminocidos pueden
tener un efecto en las propiedades de
las protenas (fenotipo) y pueden estar
sujetos a presin selectiva, lo que
conlleva restricciones al cambio. Aunque
la regin utilizada (C-PrM/M) se
considera conservada, es una regin
codificante con un comportamiento
tpico, presentando alta variabilidad en
sitios sinnimos como son las terceras
posiciones de codn. El gen de la
cpside, as como gran parte del
genoma de DENV, est sujeto a una
fuerte seleccin negativa (purificadora)
(41), reflejada en pocos cambios en la
secuencia de aminocidos, sin que esto
impida la ocurrencia de cambios
sinnimos en la secuencia de
Los nucletidos en
segundas posiciones de codn (y en
menor medida en primeras posiciones)
permanecen relativamente constantes a
travs del tiempo, lo cual puede ser
evidenciado en los alineamientos de
cualquier regin codificante del genoma
viral.
Los oligonucletidos fueron modificados
de tal forma que el extremo 3'
coincidiera con la segunda o primera
posicin de codn, con respecto al
marco de lectura, logrando, de este
modo, disminuir la probabilidad de
incompatibilidad con secuencias de
cepas que posean alta variabilidad,
representada principalmente en la
tercera posicin de codn; de esta
forma, el extremo 3' de los
oligonucletidos TS1_Modif, TS2_Modif
y TS4_Modif corresponde a la segunda
posicin de codn, quedando para
TS3_Modif en la primera posicin de
codn por razones de estabilidad del
oligonucletido.
Como se esperaba, las modificaciones
realizadas en estos oligonucletidos no
alteraron su desempeo en la
serotipificacin del DENV, logrando
amplificar especficamente la regin de
cada serotipo sin presentar reacciones
cruzadas entre ellos que conlleven a
hibridacin de alguno de los
oligonucletidos con dos o ms
serotipos (figura 2a-d).
Debido a que el tamao esperado del
producto amplificado correspondiente a
DENV-2 es de 122 pb, la optimizacin
de la cantidad de oligonucletidos en la
reaccin es un factor decisivo, ya que la
presencia de una banda a este nivel
podra ser confundida con un exceso de
los mismos y/o la formacin de dmeros.
La concentracin final de
oligonucletidos de 0,4 M (10 pmoles)
permiti obtener una buena
amplificacin de la regin C-prM/M del
DENV, facilitando la identificacin de la
banda correspondiente a DENV-2. La
correcta deteccin y tipificacin del
DENV utilizando 5 pmoles de cada
oligonucletido garantiza la utilizacin
de 10 pmoles sin llevar al lmite la
tcnica.
Por otro lado, el desempeo de la
tcnica en la prueba piloto, al utilizar
ARNs provenientes de sueros, es similar
al obtenido en el proceso de
estandarizacin, validando, por ende, su
utilidad en el diagnstico de la infeccin
por el DENV. El incremento en la
sensibilidad, al realizar la RT-PCR con
ARNs obtenidos a partir de
sobrenadantes de cultivos inoculados
con las muestras clnicas, es acorde con
el proceso de amplificacin que pueden
sufrir los virus presentes en la muestra
luego de su inoculacin en la lnea
celular permisiva C6/36. La deteccin de
2 serotipos (DENV-2 y -3) en muestras
clnicas de una misma rea geogrfica y
tiempo es de gran relevancia si se tiene
en cuenta que las infecciones
secundarias con serotipos heterlogos
podran ser responsables de la mayora
de casos severos (8-10). Este resultado
es esperado en pases hiperendmicos
como Colombia, donde es frecuente la
cocirculacin de serotipos en gran parte
del territorio (1, 2,41 - 43).
Tericamente, el rediseo tiene en
cuenta la variabilidad acumulada en los
ltimos 15 aos y la evaluacin
experimental demuestra su correcto
funcionamiento sobre muestras clnicas.
En estudios posteriores, sin embargo, el
uso de cepas altamente variables
(pertenecientes a los diferentes
genotipos dentro de cada serotipo)
permitir determinar su ventaja en la
deteccin y serotipificacin respecto a
los oligonucletidos usados
convencionalmente. De igual forma, se
abre una nueva oportunidad para la
implementacin de la tcnica sobre
muestras de mosquitos como
complemento a los programas de
vigilancia entomolgica con miras a
determinar las zonas de mayor prioridad
para las fumigaciones e instauracin de
programas de prevencin (44).
A pesar de las limitaciones en cuanto al
nmero de muestras clnicas analizadas,
la informacin obtenida con este trabajo
deja ver la importancia de la evaluacin
y seguimiento constante de las tcnicas
moleculares, ms aun cuando se trata
de identificacin de virus ARN, cuyas
rpidas tasas de evolucin pueden llevar
a la disminucin de la eficiencia de
dichas tcnicas diagnsticas.
Adicionalmente, se convierte en un
modelo del diseo e implementacin de
tcnicas similares para cualquier otro
tipo de virus, principalmente con
genomas ARN.
Para 2010, en Colombia el Sistema de
Vigilancia Nacional (SIVIGILA) report
un total de 157 152 casos probables de
dengue, de los cuales 9482 casos fueron
clasificados como dengue grave (42), de
acuerdo con la nueva clasificacin de
casos avalada por la OMS (7). Esta
situacin, sumada a la identificacin de
al menos dos serotipos en casi todo el
territorio colombiano, hace necesaria la
intensificacin de acciones de vigilancia
epidemiolgica, donde el uso de
herramientas moleculares de rpida
deteccin y tipificacin sera de rpida y
oportuna ayuda para la puesta en
marcha de planes de contingencia,
dirigidos a organizar los servicios de
salud y brindar una atencin adecuada
al paciente con dengue.
RESUMEN
Al modificar los oligonucletidos comnmente utilizados para la deteccin y
tipificacin del virus dengue. A partir del alineamiento de secuencias
disponibles en el GenBank para la regin C-prM/M se determin la variabilidad
gentica dentro de cada serotipo del virus dengue, lo cual permiti realizar
modificaciones a los oligonucletidos convencionalmente usados en la
tipificacin. Tales modificaciones incluyeron la adicin y eliminacin de
nucletidos en el extremo 3', teniendo en cuenta la posicin del codn, as
como la inclusin de sitios degenerados en posiciones altamente variables. Los
oligonucletidos se evaluaron en diferentes concentraciones sobre ARNs
extrados, a partir de cultivos celulares infectados y posteriormente de sueros
de pacientes con diagnstico probable de dengue. Los oligonucletidos se
amplificaron especficamente en cada serotipo del virus dengue, tanto desde
sobrenadantes de cultivo como desde muestras clnicas en prueba piloto.

El rediseo de los oligonucletidos se consider en la variabilidad gentica

acumulada en ms de 15 aos, mostrndose experimentalmente su valor y
utilidad en la deteccin y tipificacin del virus dengue.
CONCLUSIONES

Respondidas las incgnitas teloneras de la investigacin, se puede

hablar de lo que es "El dengue", es una enfermedad que es transmitida
por el insecto Aedes Aegypti enemigo pblico. Estos nmeros aumentan
de forma alarmante, en Amrica ya se ha convertido en un tema
importante por el intento de prevencin, sin embargo a nivel mundial ya
esta enfermedad se ha vuelto una crisis. Una crisis que se toma muy en
serio desde la OMS.

En las ltimas cinco dcadas, la incidencia de dengue se ha

incrementado 30 veces documentndose casos en reas previamente
no afectadas. Cada ao surgen cientos de miles de casos de dengue
grave, con aproximadamente 20 000 muertes. Entre estas
determinantes deben considerarse: el cambio climtico, la escasa
disponibilidad de agua para consumo, el crecimiento poblacional
sostenido, las intensas migraciones de reas endmicas a reas no
endmicas de dengue, la persistencia de actividad epidmica en el
interior del pas y en los pases limtrofes, la urbanizacin no controlada
ni planificada, viviendas inapropiadas en centros urbanos, inadecuada
disposicin de residuos, uso cada vez mayor de envases no
biodegradables en el medio as como neumticos en desuso, el
inadecuado saneamiento ambiental, el trnsito urbano, interprovincial y
areo intenso. Igualmente, se debe destacar la an deficiente
 coordinacin intersectorial y la poca participacin de organizaciones y
poblacin, por considerar que el problema del dengue es un problema
del sector salud.

Si nos damos cuenta hasta el momento ningn pas ha logrado la

erradicacin total del vector del dengue, pero creemos que el control de
las epidemias puede lograrse, controlando los vectores mediante
campaas de fumigacin, campaas de educacin de la poblacin y
tambin de saneamiento del medio ambiente. Mientras no exista una
vacuna que proteja contra la infeccin de cualquiera de los 4 serotipos
del virus, estas medidas son fundamentales para controlar al mosquito y
prevenir su propagacin.

Si esto contina as, es probable que la enfermedad afecte cada vez a

ms personas y se extienda an ms en nuestro pas. Para impedir la
expansin de esta enfermedad. Para ello debemos actuar entre todos y
cada uno participar en la prevencin del dengue para evitar ms
contagiados y tambin nuevas muertes.
BIBLIOGRAFIA
Monath TP. Flaviviruses, En Fields BN, Knipe DM editors. Virology. New
York: Raven Press, Ltd., 1990. p. 763-814.
Dengue en Centroamrica. Las epidemias del 2000. [en lnea] 2001
[fecha acceso 5 abril 2004] URL disponible en
http://www.geosalud.com/enfermedades_infecciosas/ dengue_
centroamerica.htm.
Delgado I, Vzquez S, Bravo JR, Guzmn MG. Prediccin del serotipo
del virus del dengue mediante la respuesta de anticuerpos IgM. Rev
Cubana Med Trop 2002; 54:113-117.
Ortega LM. Dengue: un problema siempre emergente. Epidemilogos
Boletines IPK N 5 y 6 del 2002. [en lnea] [fecha acceso 20 febrero
2004] URL disponible en http://
www.dhsint.com/epidemiologos/Buscador/abstract/106/ 106.asp.
da Fonseca BA, Fonseca SN. Dengue virus infections. Curr Opin Pediatr,
2002; 14:67-71.
Sangasang A, Wibulwattanakij S, Chanama S, Orapinpatipat A,
Anuegoonpipat A, Anantapreecha S, et al. Evaluation of RT-PCR as a
 tool for diagnosis of secondary dengue virus infection. J Infect Dis 2003;
56:205-9.
Isturiz RE, Gubler DJ, Brea del Castillo J. Dengue and dengue
hemorrhagic fever in Latin America and the Caribbean. Infect Dis Clin
North Am, 2000; 14:121-40.
Branch SL, Levett PN. Evaluation of four methods for detection of
immunoglobulin M antibodies to dengue virus. Clin Diagn Lab Immunol
1999; 6:555-7.
Cruz A, Rolland L. El virus del dengue. Diagnstico [en lnea] 2002
[fecha de acceso 20 enero 2004] 41(4):165-172. URL disponible en
http://www.fihu-diagnostico.org.pe/ revista/numeros/2002/julago02/165-
172.html.
Dengue: Manual Prctico. Grupo de consenso nacional para la
prevencin y control del dengue en Venezuela. [en lnea] 2001 [fecha
acceso 20 febrero 2004] URL disponible en
http://www.reinaldogodoyeditor.com/subpaginas/ manualDengue.htm.
Dengue y Dengue Hemorrgico Informacin para los Mdicos. Centro
para el Control y Prevencin de las Enfermedades de los Estados
Unidos. [en lnea] 2000 [fecha acceso 20 febrero 2004] URL disponible
en . http:// geosalud.com/enfermedades_infecciosas/dengue_
hemorragico.htm.
Valds L. Dengue. En: Enfermedades emergentes y reemergentes. C.
Habana: Ministerio de Salud Pblica; 1998. p. 178-95.
Dengue. En: El control de las enfermedades transmisibles en el hombre.
Informe oficial de la Asociacin Estadounidense de Salud Pblica. Ed. A.
Benenson. Publicacin Cientfica No. 538. OPS, Washington D.C; 1996.
p. 82-6.
Martnez E. Dengue y Dengue Hemorrgico. Ed. Universidad Nacional
de Quilmes. 1998; 269 pginas.
Kour G. El dengue, situacin actual en las Amricas. Perspectivas para
su control. Exposiciones de Taller Dengue en la UCV. Temas para el
mdico. [en lnea] 2004 [fecha acceso 20 febrero 2004] URL disponible
en http:// www.reinaldogodoyeditor.com/subpaginas/ tallerdengue.htm.
Seijo A. Dengue grave: generalidades e inmunopatogenia. En: Dengue
grave. Asociacin de Alergia, Asma e Inmunologa "Buenos Aires". Junio
1999.
 OPS/OMS. Dengue y dengue hemorrgico en las Amricas: guas para
su prevencin y control. Organizacin Panamericana de la Salud.
Publicacin Cientfica No. 548. Washington DC; 1995. p. 109.
Castle T, Amador M, Rawlins S, Figueroa JP, Reiter P. Absence of impact
of aerial malathion treatment on Aedes aegypti during a dengue outbreak
in Kingston, Jamaica. Rev Panam Salud Pblica 1999; 5:100-5.
Sosa GL, Sena CA, Ramrez HM, Alegre GB. Dengue: Un problema
emergente Revista de Postgrado de la VIa Ctedra de Medicina, 2002
N122 : 10-17.
Fruttaldo L, Schettino G, Mongio F, Gatti G, Deambrogio V. A case of
dengue from Pune, India. J Travel Med 2000; 7:46-7.
Henchal EA, Putnak JR. The Dengue viruses. Clin Microbiol Rev 1990;
3:376-96.
Leitmeyer KC, Vaughn DW, Watts DM, Salas R, Villalobos I, de Chacon,
et al. Dengue virus structural differences that correlate with
pathogenesis. J Virol 1999; 73:4738-47).
Senz E, Vquez M, Lara J, Espinosa E, Vargas L, Gamboa F. El
laboratorio en el diagnstico del Dengue. Unidad de Inmunologa y RIA,
INCIENSA, Ministerio de Salud.
Valle RP, Falgout B. Mutagenesis of the NS3 Protease of Dengue Virus
Type 2. J Virol 1998; 72: 624-32.
ANEXOS

Epidemiologia en Per 2016

Mapa de incidencia de dengue por distritos Per 2016
Tendencia de Casos de dengue segn tipo de diagnostico por
semana epidemiolgica Per 2014 2016
Caractersticas epidemiolgicas de las muertes por dengue en el
Per, 2016 SE8
Ciclo de virus del dengue

Dengue hemorrgico