DETERMINACINDEENTEROBACTERIAS

Las Enterobacterias forman, desde el punto de vista filogentico, un grupo

homogneo dentro de las gammaproteobacterias. Son bacilos Gram, anaerobios
facultativos, no formadores de endosporas, que bien son inmviles o se mueven
mediante flagelos peritricos. Son oxidasa negativas, tienen requerimientos
nutricionalessencillosyfermentanazcares.Sedistinguendossubgrupossegneltipo
de fermentacin que lleven a cabo: fermentacin cidomixta o fermentacin
butanodilica.
Se pueden aislar a partir de muestras de suelo y agua, pero muchas de las
especiesaparecenasociadasaltractogastrointestinaldediversosanimales,incluidoel
hombre.Puedencausarinfeccionestantoeneltractogastrointestinalcomoenotras
zonasdelorganismo,comoenelsistemarespiratoriooelsistemagnitourinario.

El objetivo de la prctica consiste en la determinacin de una Enterobacteria
problemaaniveldegnero,yenalgunoscasosinclusoaniveldeespecie.

Actualmente, los laboratorios de microbiologa utilizan para este propsito la
batera de pruebas API 20 E. Se trata de un sistema estandarizado que permite la
identificacin de Enterobacterias y otros bacilos Gram no exigentes, que incluye 21
testsbioqumicosminiaturizados,ascomounabasededatos.Estesistemapresenta
lasventajasdeserrpido,eficazydepermitirrealizarnumerosaspruebasalavez.
La galera del sistema API 20 E se compone de 20 microtubos que contienen los
substratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica distinta. Los
microtubos se inoculancon una suspensin bacteriana querehidrata los medios. Las
reaccionesproducidasduranteelperododeincubacinvanadarlugaracambiosde
color,biendemodoespontneooalserreveladosmediantelaadicindereactivos.La
interpretacindeestoscambiossellevaacaboutilizandounaTabladelecturaenla
queseindicaquecolorcorrespondearespuestapositivaonegativaencadaunadelas
pruebas.

PROTOCOLO

1)Preparacindelagalera.
- Reunir fondo y tapa de una cmara de incubacin y repartir 5 ml de agua
destiladaestrilenlosalvolosparacrearunaatmsferahmeda
- Rotularlainformacinnecesariaenlalengetalateraldelacmara
- Sacarlagaleradelenvaseycolocarlaenlacmaradeincubacin

2)Preparacindelinculo
- Conelasadesiembratomarunacoloniaaisladadelmicroorganismoproblema
yresuspenderlahomogneamenteen5mldesolucinsalina(NaCl0,85%)ode
aguadestiladaestriles

3)Inoculacindelagalera
- Utilizando una micropipeta provista de una punta estril, introducir la
suspensin bacteriana en los tubos de la galera (para evitar la formacin de
burbujasenelfondodelostubos,colocarlapuntadelapipetasobrelapared
delacpula,inclinandoligeramentecmaradeincubacin):

- Cerrarlacmaradeincubacin
- Incubara36oC(+/2oC)durante1824horas

4)Lecturaeinterpretacindelosresultados
- Lalecturadelagalerasehacecomparandoelcolordecadapocilloconeldela
Tabladelectura(Verfiguras1y2)
* Antes de comenzar a aadir los reactivos es necesario comprobar que al
menos3delosensayosquedesarrollancolorespontneamentesonpositivos,
yaqueencasocontrarioesnecesarioincubarlagalera24horasms.
- Cuando 3 o ms ensayos son positivos se anotan en la Hoja de resultados
todas las reacciones espontneas y despus se revelan los ensayos que
necesitanlaadicindereactivos:
Prueba TDA: agregar una gota del reactivo TDA (perclorato de hierro
3,4%).Uncolormarrnrojizoindicareaccinpositiva.
Prueba VP: agregar una gota de los reactivos VP1 (hirdxido sdico
40%)yVP2(naftol6%enetanol).Esperarunmnimode10minutos.
Uncolorrosaorojoindicaunareaccinpositiva,mientrasqueunadbil
coloracinrosadeberserconsideradacomonegativa.
Prueba IND: agregar una gota del reactivo de JAMES (R1: HCl 1N; R2:
componente confidencial J 2183 0,66%). Un color rosado que se
difuminaentodalacpulaindicaunareaccinpositiva.*Estapruebaha
derealizarseenltimolugar,pueslareaccinliberagasesquepueden
alterarlainterpretacindelasotraspruebasdelagalera.Novolvera
colocarlatapadelacmaradespusdeagregarelreactivo.
- Determinacin del perfil numrico: en la Hoja de resultados (Figura 3), los
testsestnseparadosengruposdetresconloqueentotalhay7tripletes(el
test nmero 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da le
valor0,1,2o4segncorresponda(siesnegativo0,ysiespositivo:1siocupa
la1posicineneltriplete,2siocupala2y4siocupa la3).Sesumanlos
valoresdecadatripleteyseobtieneuncdigodesietecifras.
*LaFamiliaEnterobacteriaceaeesoxidasa:valor0eneltestdelaoxidasa
- Identificacin:elperfilnumricoobtenidosebuscaenlabasededatosparaas
identificardequeespeciesetrata.(Ejemplo,Tabla1)




 Figura1.Tabladelectura
Componente
Prueba Reaccin/Enzimas Negativo Positivo
activo
2nitrofenilbD
ONPG galactopiranosidoBetagalactosidasa sincolor amarillo

ADH Larginina Argininadihidrolasa amarillo rojoonaranja

LDC Llisina Lisinadescarboxilasa amarillo rojoonaranja
ODC Lornitina Ornitinadescarboxilasa amarillo rojoonaranja
azul oscuro o
CIT citratotrisdico Utilizacindelcitrato verde
turquesa
sin
precipitado
H2S tiosulfatosdico ProduccindeH2S precipitado
negro
negro
URE urea Ureasa amarillo rojoonaranja
TDA Ltriptfano Triptfanodesaminasa amarillo marrnrojo
color rosa o
IND Ltriptfano Produccindeindol amarillo anillo rosa
rojo
Produccin de acetona
VP piruvatosdico
(VogesProskauer)
sincolor rosarojo

gelatina (origen difusin de

GEL bovino)
Gelatinasa sindifusin
pigmento
Fermentacin/oxidacin de
GLU Dglucosa
glucosa
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
MAN Dmanitol
manitol
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
INO inositol
inositol
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
SOR Dsorbitol
sorbitol
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
RHA Lramnosa
ramnosa
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
SAC Dsacarosa
sacarosa
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
MEL Dmelibiosa
melobiosa
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
AMY amigdalina
amigdalina
azuloverde amarillo

Fermentacin/oxidacin de
ARA Larabinosa
arabinosa
azuloverde amarillo

OX Citocromooxidasa

Figura2.Tabladelectura

Figura3.Hojaderesultados
Tabla1.Perfilnumrico
0104140Shigellaflexneri
0104452SalmonellaparatyphiA
0104504Pasteurellamultocida
0104521Yersiniaenterocolitica
0140004Pasteurellamultocida
0144042Shigellaboydii
0206042Acinetobactercalcoaceticus
0210004Achromobactersp.
0210004Alcaligenesfaecalis
0210004Alcaligenessp.
0314000Proteusmirabilis
0504512SalmonellaparatyphiA
0676001Proteusvulgaris
0776000Proteusmirabilis
1000004Pasteurellasp.
1014743Klebsiellaozaenae
1104112Shigellasonnei
1214012Yersiniapseudotuberculosis
1214773Klebsiellapneumoniae
2206004Pseudomonasaeruginosa
2504752Salmonellaspp.
3005573Enterobactercloacae
3246527Aeromonashydrophilia
4004550Salmonellacholerasuis
4004550Salmonellatyphi
4104100Salmonellagallinarun
4357106Vibrioparahemolyticus
4404112Salmonellagallinarum
4404510Salmonellacholerasuis
4404540Salmonellatiphy
4504010Salmonellapullorum
4604552Salmonellaspp.
4704500Salmonellacholerasuis
5004024Pseudomonascepacea
5044124Vibriocholerae
5046753Serratiaodorifera
5100100Yersiniaruckeri
5104111Hafniaalvei
5104542Salmonellaarizonae
5144572Escherichiacoli
5207323Serratiarubidae
5255573Klebsiellaoxytoca
5346761Serratiamarcescens
5314173Enterobactergergoviae
5317761Serratiamarcescens
5704412Salmonellaarizonae
5704552Salmonellaarizonae
6004540Salmonellatyphi
6144204Plesiomonasshigelloides
6404112Salmonellaspp.
6504750Salmonellaspp.
6604512Salmonellaspp.
6704342Salmonellaspp.
6704532Salmonellaspp
6704752Salmonellagallinarum
7244126Aeromonashydrophila
7305773Enterobactercloacae
7704752Salmonellaarizonae
7704752 Salmonella spp.