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1. Introduccin
2. Espectrometra de fluorescencia molecular
a. Fundamento
b. Relacin entre intensidad de fluorescencia y concentracin
c. Factores que afectan a las mediciones fluorimtricas
d. Instrumentacin
e. Aplicaciones clnicas
3. Espectrometra de quimioluminiscencia molecular
a. Fundamento
b. Factores que afectan a las mediciones de quimioluminiscencia
c. Instrumentacin
d. Aplicaciones clnicas
1. Introduccin
La luminiscencia es un fenmeno de emisin de luz debido a un proceso de relajacin
de un estado excitado a un estado de menor energa (generalmente el estado
fundamental)
La espectrometra de luminiscencia molecular (ELM) se basa en la medida de la luz
emitida por molculas. Para que las molculas pasen a un estado excitado ser
necesario aportarles energa y dependiendo de la fuente de energa que utilicemos
para la excitacin distinguimos dos tipos de fenmenos luminiscentes:
2.1. Fundamento
La fluorescencia y fosforescencia son dos formas de luminiscencia que tienen lugar
cuando una molcula (o tomo) absorbe energa luminosa de una determinada
longitud de onda y cuando vuelve a su estado fundamental reemite esa energa en
forma de luz.
La radiacin de fluorescencia puede ser de la misma longitud de onda que la radiacin
de excitacin, en este caso se denomina fluorescencia resonante o puede ser que la
longitud de onda sea mayor que la radiacin de excitacin y en este caso se llama
fluorescencia no resonante. Esta ltima es la que se produce con mayor frecuencia en
molculas. A este desplazamiento de la longitud de onda de emisin respecto a la de
absorcin se denomina desplazamiento de Stokes.
La energa absorbida por las molculas adems de ser emitida como energa radiante,
energa luminosa, puede ser liberada en forma de calor.
La competencia entre otras formas de desexcitacin y la emisin de energa radiante
es la que va a determinar que una molcula sea fluorescente o no.
Experimentalmente se ha observado que no todos los fotones absorbidos son emitidos
como fluorescencia. Con el fin de relacionar la intensidad de la radiacin emitida con la
intensidad de la radiacin absorbida, se ha definido una constante, , que se
denomina rendimiento cuntico o eficacia cuntica y relaciona el nmero de molculas
que emiten fluorescencia con el nmero de molculas excitadas o lo que es lo mismo,
la intensidad de radiacin emitida en relacin con el nmero de fotones absorbidos.
IF
=
I Ab
IF = (Io It)
A= b c ;
LogT = b c
It
Log = b c ; donde la fraccin de luz transmitida es:
Io
It
= 10 bc
Io
I t = I 0 10 bc ; sustituyendo en la primera ecuacin considerada, obtenemos:
IF = (I (I
0 o 10 bc ))
I F = I 0 (1 10 bc )
I F = I 0 2,3 b c
Si consideramos que Io se mantiene constante a lo largo de toda la prueba y
agrupamos esta ltima junto con las constantes , y b, podremos concluir diciendo
que:
IF = K c
Esto slo se cumple cuando las muestras son soluciones muy diluidas en las que la
intensidad absorbida es inferior a un 2 % de la intensidad inicial de la radiacin.
Mtodos fluorimtricos:
Las ventajas que tienen son que es mucho ms sensible y las desventajas son
que es menos preciso y menos exacto.
En general se utiliza para determinar sustancias que se encuentran en
concentraciones mnimas en lquidos biolgicos (enzimas, hormonas, frmacos,
vitaminas, etc).
Casi todas estas determinaciones se realizan por fluoroinmunoanlisis.
Mtodos fosforimtricos:
3.1. Fundamento
Se produce cuando por medio de una reaccin qumica se genera un producto
intermedio o final excitado que al volver al estado fundamental emite luz.
La reaccin ms sencilla sera:
A + B C * +D C* C + h U
F* F+ h x
I cl = cl d c
dc
Velocidad de reaccin
dt dt
1. Luz ambiental.- Debe estar cerrado hermticamente para evitar que entre la
luz.
2. Que existan en la muestra otras sustancias que absorban o que emitan luz.
3. La temperatura, el pH del medio y tambin que exista en la muestra otros
componentes que reaccionan directamente en la reaccin de
quimioluminiscencia.
4. Concentracin elevada de sales y tampones, sobre todo en el caso de las
enzimas de los marcadores bioluminiscentes porque se puede inhibir la
reaccin enzimtica.