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DGE-InDRERNLSP
2015
ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMIT NACIONAL PARA LA
VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA (CONAVE).
DGE-InDRERNLSP
2015
DEFINICIONES OPERATIVAS
Caso sospechoso de tos ferina: persona de cualquier edad con tos, sin importar los
das de duracin y con asociacin con otros casos probables o confirmados. Esta
definicin se utiliza para la bsqueda activa de casos adicionales ante la presencia de
casos probables, confirmados o atpicos, portadores, defunciones y en brotes.
Caso probable de tos ferina: persona de cualquier edad, con tos de 14 o ms das
de evolucin y dos o ms de las siguientes caractersticas; tos paroxstica, en accesos,
espasmdica o estridor larngeo inspiratorio y uno o ms de los siguientes datos; tos
cianosante, hemorragia (conjuntival, petequias, epistaxis), leucocitosis con predominio
de linfocitos; o historia de contacto con casos similares en las ltimas 2 a 4 semanas
previas al inicio del padecimiento. Nota: En esta definicin se incluyen a los menores
de 3 meses que pueden manifestar slo episodios de apnea o cianosis con o sin tos.
Caso confirmado de tos ferina: todo caso que tenga aislamiento de Bordetella
pertussis por cultivo o PCR en el caso per se o cualquiera de sus contactos,
convivientes o personas con asociacin epidemiolgica.
Caso de tos ferina clnica: todo caso con datos clnicos caractersticos y que no
cuenta con muestra, independientemente de sus cinco contactos.
Caso de tos ferina atpico: todo caso sospechoso que tenga aislamiento de
Bordetella pertussis.
Portador asintomtico de Bordetella pertussis: toda persona sin signos o
sntomas de enfermedad respiratoria a quien se tom muestras por tener asociacin
epidemiolgica con un caso probable o confirmado y cuyos resultados de cultivo o PCR
son positivos a Bordetella pertussis.
Objetivos especficos
Generar y difundir informacin de laboratorio que contribuya a la prevencin y
control epidemiolgico de la Tos ferina.
Alcanzar difusin en las tcnicas del manejo del microorganismo as como la
integracin del formato nico para el estudio de cada paciente.
Realizar el diagnstico, control de calidad y referencia de Bordetella pertussis y
otras especies mediante las tcnicas de cultivo y PCR Tiempo Real Multiplex
(TRM).
Emitir lineamientos para la operacin de la RNLSP.
Asegurar la calidad del diagnstico del Laboratorio Nacional de Referencia a
travs de la participacin en programas internacionales de evaluacin externa
para Tos ferina.
Desarrollar y evaluar la competencia tcnica de los laboratorios de la red.
LESP capacitados en
mayo-junio 2012 en PCR
TR multiplex.
LESP capacitados en
PCR TR multiplex en
julio 2012.
Los LESP recibirn las muestras clnicas o los aislamientos presuntivos de Bordetella
pertussis o Bordetella spp procedentes de las unidades hospitalarias a fin de que se
realice el diagnstico o se confirmen las cepas. Los LESP se encargarn de transportar
Toma de muestra
Mtodo directo
o Toma de exudado nasofarngeo para cultivo y PCR
(1). El sistema bsico de triple embalaje consiste en la utilizacin de un recipiente primario, en el cual est contenida la muestra biolgica
(Exudado nasofarngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de
rosca) debe ser hermtico para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o nmero de muestra
del paciente. El recipiente primario deber rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente
secundario hermtico a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deber
usar una gradilla y material absorbente para evitar algn derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene
que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 C. Los recipientes secundarios debern llevar las etiquetas de
riesgo biolgico y seal de orientacin del recipiente, a su vez el recipiente secundario deber ir contenido en un paquete externo de envo (caja
de cartn o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente,
destinatario y seal de orientacin. La documentacin que se integre al triple embalaje deber colocarse en la parte interior del paquete.
Fuente: Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of
vaccine-preventable diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA,
2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/
Depositar el hisopo con la muestra para cultivo en el medio de transporte Regan Lowe
y cortar con tijeras el excedente del mango de aluminio que queda fuera del tubo, el
mango de aluminio no debe enrollarse dentro del tubo para evitar contaminacin de la
muestra.
Las muestras aceptadas para analizarse por PCR TRM, exudado o aspirado
nasofarngeo, deben de depositarse en medio de transporte de solucin salina con
Cefalexina a una concentracin final de 40 g/mL, y la muestra debe ser tomada con
hisopo de rayn o dacrn. (No emplear hisopos de alginato de calcio debido a que se
inhibe la accin de la Taq polimerasa y se pueden obtener resultados falsos negativos).
El tiempo de transporte no debe exceder ms de 3 das.
En el caso de extraccin del ADN sta se realiza empleando las columnas de QIAamp
ADN Mini and Blood Kit de la marca QIAGEN, cuando se procesan 10 muestras como
mximo. Si el nmero de muestras es mayor se debe realizar la extraccin
automatizada (por robot) para evitar el riesgo de contaminacin cruzada. Una vez
realizada la extraccin del ADN, se efecta el corrimiento de la PCR TRM por el grupo
de expertos.
Mtodo indirecto
o Toma de muestra para serologa
Condiciones para la toma de las muestras para serologa
Para la prueba de Ensayo por Inmunoabsorcin Ligado a Enzimas [Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay, (ELISA), por sus siglas en ingls] se requiere de una muestra
de suero, la muestra de sangre se debe tomar a partir de las 2 semanas o hasta las 8
semanas de iniciada la tos.
Para obtener la sangre se deben utilizar tubos con tapn de gel que permitan
separar los componentes de la sangre despus de la centrifugacin.
Mtodo directo
El mtodo de cultivo es considerado por la OMS como el estndar de oro para la
recuperacin y confirmacin del microorganismo de casos por laboratorio, es sensible
hasta el 60%. El xito de la tcnica de cultivo est basado en su especificidad y en la
oportunidad para la toma de la muestra, que debe ser dentro de las dos a tres primeras
semanas del inicio de la tos.
El mtodo de PCR presenta la ventaja de ser ms sensible que el cultivo bacteriano y
adems, disminuye el tiempo en la obtencin de resultados, no obstante, es importante
seguir realizando el cultivo para analizar la evolucin de este microorganismo
patgeno y vigilar variantes que puedan ser antignicamente diferentes a las cepas
vacunales actuales, porque a que a travs de la PCR esto no se podra evaluar.
La tincin de inmunofluorescencia directa con anticuerpos especficos a partir de
secreciones nasofarngeas no se debe realizar ni se recomienda por su inespecificidad
ya que frecuentemente se obtienen resultados falsos positivos y negativos (ver figura
5).
Mtodo indirecto
Para el diagnstico por mtodo indirecto (serologa) anteriormente se requera de una
muestra inicial en la fase aguda de la enfermedad y de una segunda muestra en la fase
de convalecencia. Sin embargo, hoy en da existen diferentes inmunoensayos dirigidos
contra diferentes factores de virulencia de B. pertussis entre ellos estn la
Hemaglutinina filamentosa, la Pertactina y la toxina Pertussis, este ltimo antgeno ha
demostrado en diferentes investigaciones realizadas por el Centro de Control y
Prevencin de Enfermedades [Centers for Disease Control and Prevention (CDC), por
sus siglas en ingles] de Atlanta, ser el inmungeno ms sensible y especfico
comparado con los otros factores de virulencia de B. pertussis. La presencia de altas
concentraciones de anticuerpos IgG anti-toxina Pertussis en el suero de pacientes no
vacunados, indica infeccin.
Inicialmente las pruebas serolgicas de tos ferina fueron diseadas para la evaluacin
de la respuesta de anticuerpos contra diferentes componentes de las vacunas,
Pruebas bioqumicas
Estndar del servicio
15 das
Conservacin a -70 C en Stainer Sholtter
Muestra clnica
Extraccin de ADN,
manual o
automatizada
Reportar negativo
PCR en tiempo real Negativo
multiplex Resultado
Diagnstico
diferencial con virus
respiratorios
Positivo
Reporta
r
PCR en tiempo real
para toxina ptx1
Reportar de acuerdo al
criterio de interpretacin
CAPTURA DE DATOS
Los datos que acompaan a la muestra en el formato nico para el envo de muestras
biolgicas del InDRE o en la historia clnica, o en la solicitud correspondiente son
revisados y cotejados inicialmente por el personal del departamento de recepcin de
muestras del InDRE, en donde se realiza la clasificacin y distribucin al laboratorio
que corresponda y se depositan en el registro general de muestras del laboratorio.
En caso de que las muestras o cepas no cumplan con las condiciones de envo se realiza
el rechazo correspondiente de muestras el cual depende de su calidad, de acuerdo con
lo especificado en el formato de rechazo definitivo de las muestras. Este se entrega en el
rea de recepcin de muestras para que se informe al usuario y se solucione el
problema administrativo o bien, que se enve otra muestra.
CAPTURA DE RESULTADOS
Todos los resultados emitidos por los diferentes niveles de los integrantes de la
RNLESP deben cumplir con las siguientes caractersticas.
Los resultados deben ser legibles, sin errores de trascripcin e informados a las
personas autorizadas para recibir y utilizar la informacin mdica.
El informe de resultados debe incluir y sin estar limitado la siguiente
informacin:
o Identificacin clara y sin ambigedad del examen.
o Identificacin del laboratorio que emite el informe.
o Identificacin nica, ubicacin del paciente y destino del informe.
Nombre u otra identificacin nica del solicitante y la direccin del mismo.
Fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando est disponible y sea
pertinente para el cuidado del paciente, as como la hora de recepcin en el
laboratorio.
Fecha y hora de la liberacin del informe, las cuales si no estn en el informe,
deben estar fcilmente accesibles cuando sea necesario.
Tipo de muestra primaria.
Resultados de los exmenes.
Otros comentarios (calidad de la muestra primaria condiciones que puedan
haber comprometido el resultado).
Identificacin de la persona que autoriza la liberacin del informe.
Si es pertinente, los resultados originales y los corregidos.
Los resultados producidos a nivel nacional o estatal deben ser enviados por este ltimo
nivel a su homnimo de las otras instituciones del sector salud.
Es importante mencionar que los criterios empleados durante los aos 2005 al 2009
que se emplearon para evaluar el desempeo de los paneles del primero al sptimo,
fueron modificados a partir del 2010 con el fin de mejorar el desempeo de los LESP
participantes.
La clasificacin del desempeo se realiz empleando los criterios que se especifican en
el cuadro 4.
Una vez caracterizadas las cepas aisladas y enviadas al InDRE, y despus de la emisin
del informe correspondiente; se conservarn a mediano y a largo plazo el 100% de las
cepas de B. pertussis y B. parapertussis o alguna otra especie aislada de casos
probables de tos ferina, con el objetivo de crear un banco de material biolgico para:
Monitorear cambios fenotpicos o genotpicos de cepas circulantes a nivel
nacional, en apoyo a la vigilancia epidemiolgica de este padecimiento.
Evaluar el impacto de las vacunas disponibles en el pas.
Desarrollar proyectos de investigacin en colaboracin con instituciones que
permitan el fortalecimiento de los participantes de la RNLSP, manteniendo cada
estado la propiedad de sus colecciones.
Todas las cepas sern conservadas, a excepcin de las que no cumplan los siguientes
criterios de inclusin para ingresar a la coleccin de cepas del InDRE.
Criterios de inclusin
Cepas caracterizadas que han sido aisladas y relacionadas con la aparicin de
brotes.
Cepas que enva la RNLSP al InDRE para su confirmacin y control de calidad y
referencia.
Cepas resistentes a los antibiticos de primera eleccin (macrlidos) que se
emplean para el tratamiento de la tos ferina.
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Atlanta, GA, 2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/
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Biologicals. Laboratory Manual for Diagnosis of Whooping cough caused by
Propsito
Establecer la metodologa para el aislamiento e identificacin de Bordetella pertussis y
otras especies de Bordetella spp a partir de muestras clnicas de casos sospechosos y
contactos intrafamiliares, as como cepas puras aisladas previamente en otros
laboratorios y que son enviadas al InDRE para referencia o control de calidad.
Es toda muestra de exudado nasofarngeo y cepas (cultivos puros) que son enviadas al
laboratorio para la bsqueda o confirmacin de B. pertussis u otras especies de
Bordetella spp.
Equipo
Agitador tipo vrtex
Balanza semi analtica
Incubadora con rango de temperatura de 35 a 37 C
Micropipeta de volumen variable de 10 a 100 L.
Microscopio ptico
Nefelmetro de McFarland.
Refrigerador con rango de temperatura de 4 a 6 C
Microscopio estereoscpico
Material
Aplicadores de madera
Asas bacteriolgicas
Bolsas de plstico
Cubrebocas
Reactivos
Antisueros especficos anti B. pertussis y anti B. parapertussis
Placas con medio de cultivo BordetGengou, Bordet-Gengou+cefalexina Agar
Charcoal y Agar Charcoal + Cefalexina
Medio de transporte (Solucin salina + Cefalexina a una concentracin de 40
g/mL)
Reactivos para determinacin de oxidasa, catalasa y nitratos
Medio de Citrato de Simmons
Medio para ureasa
Medio Movilidad Nitratos
Agar Charcoal (AC)
Agar sangre de carnero
Agar Mac Conkey
Agar Soya Tripticasena (TSA)
Medio para movilidad
Reactivos para tincin de Gram
Reactivo de coaglutinacin para sensibilizar con antisueros anti B. pertussis y
anti B. parapertussis
Solucin desinfectante (hipoclorito de sodio al 1%)
Solucin salina 0.85% estril
Material biolgico
b. Morfologa microscpica
Hacer un frote a partir de las colonias sospechosas, teir con la tcnica de Tincin de
Gram y buscar la presencia de cocobacilos Gram negativos.
d. Pruebas bioqumicas
Las pruebas para la diferenciacin de especie de Bordetella ssp se realizan por medio
de la utilizacin de una fuente de carbono diferente (citrato) para su metabolismo, as
como por la capacidad para reducir los nitratos a nitritos, movilidad (por la presencia
de cilios) y la capacidad de producir la enzima ureasa para la utilizacin de la urea.
Para la inoculacin de las pruebas diferenciales, tomar con una asa desechable
estril o hisopo de rayn o dacrn las colonias de un cultivo de 48 horas y
preparar una suspensin bacteriana en solucin salina estril al 0.85%.
Igualar visualmente a una turbidez del tubo 4 del Nefelmetro de Mc Farland.
Inocular cada una de las pruebas diferenciales (urea, citrato de Simmons y
nitratos) adicionando 4 gotas de esta suspensin (9.5.1.) a cada una de las
pruebas. Para la prueba de reduccin de nitratos, una vez inoculado, se realiza
una picadura en el agar para visualizar la movilidad.
Incubar a 35 2 C en condiciones de aerobiosis.
Procedimiento
Para cada una de las pruebas y medios de cultivo se registran los resultados en los
formatos para control de calidad (registro del control de calidad de las pruebas y/o
reactivos).
4. Interpretacin de resultados
Reaccin positiva
Una reaccin positiva se detecta por la formacin de grumos visibles a simple vista. El
tiempo de aparicin de los grumos depende de la concentracin de antgeno.
Reaccin negativa
En el caso de una reaccin negativa, no habr aglutinacin es decir, no hay formacin
de grumos y mantendr su apariencia homognea (discretamente lechosa).
Resultados no interpretables
Una reaccin es no interpretable cuando la cepa aglutina con el control de solucin
salina o cuando aglutina con ms de un antisuero. En estos casos es aconsejable
resembrar las cepas nuevamente y repetir la prueba; en caso de confirmarse el mismo
resultado; realizar la extraccin del ADN de estas cepas y despus enviarla al
laboratorio de bacteriologa molecular para que sean identificadas por la tcnica de
PCR TRM.
5. Control de calidad
a. Interferencias
c. Intervalo reportable
Cepa no viable: Aplica para aquellas cepas enviadas para control de calidad o
referencia, que no se desarrollan en los medios de cultivos inoculados a las 96
horas de incubacin. Si este es el caso, realizar la identificacin por la tcnica de
PCR y pedir al laboratorio solicitante que enve nuevamente el cultivo.
No aplica
7. Medidas de bioseguridad
8. Fuentes de variabilidad
Con excepcin del gen ACT, estas sondas son especficas de especie, algunas pruebas
de PCR son especficas para B. pertussis, otras permiten la deteccin de B. pertussis y
B. parapertussis y otras la deteccin de estas dos ltimas adems de B. bronchiseptica.
A pesar de esta gran diversidad de iniciadores disponibles, la sensibilidad reportada
para cada uno de ellos es similar.
Recomendaciones
1. Las muestras aceptadas para realizar PCR TRM son el exudado o el aspirado
nasofarngeo, el medio de transporte debe ser Solucin Salina con Cefalexina
(SSCC) a una concentracin final de 40 g/mL, O bien, depositar la muestra en
Nota: Tener en mente que el rea de toma de muestras para PCR debe ser un rea
independiente del rea en donde se aplican las vacunas contra la Tos ferina (DPT o la
vacuna acelular contra Pertussis), en el caso de que las muestras sean tomadas en
centros de salud u hospitales.
Propsito
Realizar el diagnstico de Bordetella spp. de las muestras (exudado
nasofarngeo, aspirado nasofarngeo, biopsia) con sospecha de caso probable o
sospechoso de Bordetella mediante RT-PCR tiempo real.
Realizar la confirmacin de las muestras con resultado negativo y positivo a
Bordetella que envan los LESP y los Institutos Nacionales de Salud Pblica al
InDRE para control de calidad.
Cada muestra de ADN extrada reacciona con cada uno de los cuatro conjuntos
de cebador/sonda en dos reacciones por separado. Estos conjuntos de
cebador/sonda componen la prueba IS481/pIS1001/hIS1001 y el ensayo ptxS1.
La prueba multiplex de IS481/pIS1001/hIS1001 es especfica para la secuencia
de insercin IS481, que est presente en varias copias en B. pertussis (50-238
copias por genoma) y B. holmesii (8-10 copias por genoma). La de pIS1001 est
presente solamente en B. parapertussis (20-23 copias por genoma) y hIS1001
en B. holmesii (3-5 copias por genoma). El conjunto ptxS1 es especfico para la
subunidad S1 del gen que codifica para la toxina de pertussis, con una sola copia
en B. pertussis y B. parapertussis.
Exudado nasofarngeo
Aspirado nasofarngeo
Equipos
Equipo Marca Modelo No. de serie
4:275012203
5:275012200
Applied 7500 Fast Real-Time 7:275012207
Termociclador AB
Biosystems PCR System 9:275012187
10:275012215
12:2750112262
Nuaire NU-425-400 128665020309
Nuaire NU-425-400 128602013009
Nuaire NU-126-300 132022072809
Cabinas para PCR
Nuaire NU-126-301 131984072409
Micropipetas
automticas de Thermo Finnpipette V97235
intervalo 0.5 a 10 L
H0815835G
Rainin Classic
F0866336G
Gilson Pipetman P61453J
Micropipetas
Brand Transferpette 07D3235
automticas de
Brand Transferpette 07D3121
intervalo 1.0 a 10 L
Rainin Classic K0757138G
Thermo Labsystems T32562
Rainin Classic J0747480G
400 Heracus
Centrfuga para placas Labofuge 40578332
Intruments
Centrfuga (minispin) Eppendorf Minispin Plus 5452Y1047904
Amersham
Crosslinker UVC500 20121306
Bioscienses
Labnet Mixer S0100 61016017
Agitador vrtex
Velp Scientifica Mixer 140449
Bordetella pertussis
Bordetella parapertussis
Bordetella holmesii
Toxina ptxS1
ARNsa P Humana
ARNse Away
ADN away
Controles positivos (ACF y ptxS1 con diluciones 10-6 y 10-3 respectivamente)
Los iniciadores y sondas se reciben liofilizados. Previo a su uso deben hidratarse con
agua grado biologa molecular, la cantidad de agua depender de la concentracin
inicial de los iniciadores y sondas para obtener una concentracin de trabajo. Mezclar
con la punta de la micropipeta (cargar y descargar la micropipeta) aproximadamente
20 veces y posteriormente mezclar en el vrtex durante cinco segundos. Una vez
hidratados los reactivos se almacenan a -20 C en alcuotas de 200 L o 500 L si el
uso no es tan frecuente, si su uso es muy frecuente se mantienen a 4 C.
NOTA: Mantener todos los reactivos en bloques de enfriamiento para tubos durante
todo el montaje de la prueba.
ptxS1 F
RP G
H
NTC = Negative Template Control
b. Posteriormente colocar 4.0 L de agua grado biologa molecular en los pozos 1A,
1B, 1C Cuadro 13, esto servir como control negativo (NTC, Negative Template
Control) de los reactivos de la mezcla de reaccin.
c. Ajustar las tapas pticas nicamente a los pozos marcados como NTC, cada
placa se rotula con las iniciales de la persona que la prepar y se cubre con papel
aluminio para proteger de la luz, manteniendo en temperatura de refrigeracin
hasta su uso.
d. Se elaborarn las hojas de registro (formato DITI-F-25) de acuerdo al orden en
que se colocan los extractos en las placas (ver cuadro 14) y colocar los nmeros
que le corresponden a cada extracto de los cidos nucleicos.
D
E M1 M3 M5 M7 M9 M11 M13 M15 M17 M19 M21 ACF
IS481/pIS1001/hIS1001
10-3
F M1 M3 M5 M7 M9 M11 M13 M15 M17 M19 M21 ptxS1
ptxS1
10-3
RP G M1 M3 M5 M7 M9 M11 M13 M15 M17 M19 M21 RP
I. Acceso al software
Encender la Lap-top y el equipo ABI 7500 Fast (DITI-I-09).
Abrir el programa 7500 Fast SDS software, dar doble clic sobre el acceso directo
que se encuentra en el escritorio de la computadora ver Figura 1.
2) Programacin de la corrida
En esta nueva ventana se inicia la programacin de la corrida. En el parmetro
Template (plantilla/formato templado), del lado derecho de esta opcin, buscar
el botn de Browse (navegacin) y dar clic para seleccionar la plantilla
previamente programada y seleccionar la opcin Open (abrir) que se encuentra
en la parte inferior derecha de la ltima ventana que se abri.
Verificar que los pasos anteriores son correctos y dar clic en el botn de Finish
(terminar) que se encuentra en la parte inferior derecha de la ventana.
La plantilla elegida aparece en la pantalla con los marcadores por detectar (ver
Figura 4), Programar las claves de los templados o extractos de ARN por
analizar en esta plantilla.
Una vez programadas las muestras y verificados los marcadores a detectar, dar
clic en la pestaa Instrument (instrumento) que se encuentra en la parte
superior izquierda de la ventana por debajo de la barra de mens.
Programacin: Positivo
3) Control de calidad
Realizar peridicamente la identificacin de paneles de evaluacin externa que
enva el CDC.
Un control sin templado con agua estril en lugar del ADN se debe incluir en
cada ensayo para garantizar que no hay contaminacin cruzada durante el PCR.
Este NTC tambin sirve como control negativo.
Los testigos positivos en cada placa deben presentar los valores de Ct esperados
(valores menores a 35) para que se consideren confiables. En los testigos
negativos no deber presentarse amplificacin.
4) Interferencias
No aplica
Intervalo reportable
Positivo o negativo.
Valores de alerta crticos
Una vez seleccionados los controles PTC y NTC verificar que los parmetros que se
encuentran en el lado derecho de la ventana estn debidamente programados para
realizar una lectura adecuada de los resultados de la rRT-PCR, de acuerdo con los
siguientes parmetros:
El threshold se fija al dar clic en el botn Analyze (analizar), que se encuentra del
lado derecho de la ventana de las curvas de amplificacin y por debajo de los
parmetros antes establecidos. Cada vez que se realice alguna modificacin sobre
la corrida es necesario dar clic en Analyze para que los cambios sean aplicados.
Figura. 12. Muestra que no amplifico, es decir muestra con resultado NA.
6) Medidas de bioseguridad
Para el desarrollo de esta tcnica se deben de tomar en cuenta las siguientes
consideraciones:
Fuentes de variabilidad
Utilizar equipos de amplificacin y reactivos para PCR en tiempo real fuera de los
evaluados por el InDRE para esta tcnica.
Desarrollar el proceso en forma unidireccional para evitar la contaminacin de las
reas contiguas.
Almacenar reactivos inadecuadamente, contaminacin de reactivos, preparacin
incorrecta de reactivos y contaminacin cruzada en reas.
No seguir estrictamente los lineamientos de Bordetella establecidos para el
diagnstico.
PRINCIPIO
La amplificacin de una secuencia de insercin presente en varias copias
exclusivamente en el genoma de Bordetella pertussis por la tcnica de reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) en cido desoxirribonucleico (ADN) extrado de
muestras de exudado nasofarngeo o cultivo puro. La especificidad de la amplificacin
se confirma usando la enzima de restriccin Alu I.
Objetivo
Deteccin de Bordetella pertussis en casos de tosferina y sus contactos utilizando la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Materiales y equipo
Equipo
Termociclador
Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A
Cabina para PCR
Cmara de electroforesis horizontal
Foto documentador
Materiales
Micropipeta 1-10 L
Micropipeta 2-20 L
Micropipeta 20-200 L
Micropipeta 100-1000 L
Guantes desechables
Tubos tipo eppendorf de 0.2 mL, 0.5 mL y 1.5 mL
Puntas para micropipeta de 10, 200 y 1000 L
Tubos para centrifuga de 50 mL
Pipetas desechables de 5 y 10 mL
Marcadores indelebles
Gradillas para tubos eppendorf
Bolsas de polipropileno
Contenedores para desecho de puntas
Gasas
Metodologa
1. Enviar el ADN de las muestras al laboratorio en tubo para microcentrfuga de 1.5
mL tipo eppendorf a temperatura ambiente cuando se ha extrado recientemente
y congelado cuando tenga ms de 2 h de haberse extrado.
2. Almacenar la muestra de ADN a -20 C.
Procedimiento
1. Realizar una siembra masiva de la cepa en el medio de cultivo de Bordet Gengou
o Agar Charcoal y agar Regan Lowe.
2. Incubar de 48 a 72 horas a 35-37 C en aerobiosis, dependiendo de la especie de
Bordetella.
3. Cosechar el desarrollo con asa estril o con hisopo de dacrn o rayn e
introducir el hisopo en un tubo que contiene el medio de transporte de AMIES
con carbn, cerrar el tubo, sellar con Parafilm y rotular el tubo con la clave del
microorganismo, anexar la informacin solicitada (formato nico de envo de
muestras al InDRE). Utilizar el sistema bsico de triple embalaje Enviar
inmediatamente por un medio confiable de mensajera y avisar por va
telefnica al laboratorio de referencia del envo de las cepas. En caso de que no
sea posible el envo inmediato, se puede mantener la cepa en este medio a
temperatura de refrigeracin durante 5 das como mximo.
Prueba de la catalasa
a) Principio
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y
oxgeno. Es una hemoprotena de estructura similar a la hemoglobina, excepto porque
los cuatro tomos de hierro de su molcula estn en el estado oxidado (Fe +) en lugar
del estado reducido (Fe+). Excepto los estreptococos, la mayor parte de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.
El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales de oxidacin del
metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule, resulta
letal para las clulas bacterianas. La reaccin que se lleva a cabo es la siguiente:
b) Reactivos
1. Perxido de hidrgeno al 3 % almacenado en botellas color mbar.
2. Un cultivo de 18 a 24 horas del microorganismo que se va a probar.
c) Controles
El reactivo perxido de hidrgeno se debe probar con microorganismos control
negativos y positivos, todos los das o inmediatamente despus de probar bacterias
desconocidas.
Control positivo: Staphylococcus aureus.
Control negativo: especies de Streptococcus.
d) Procedimiento
1. Con una aguja de inoculacin o con un palillo de madera, transferir parte del
centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos.
2. Los eritrocitos poseen catalasa, tener cuidado de no tomar eritrocitos junto con
el material de la colonia. Agregar una gota de perxido de hidrgeno al 3% y
observar la formacin de burbujas.
e) Interpretacin
La aparicin rpida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una reaccin
positiva. Debido a que algunas bacterias poseen enzimas distintas de la catalasa que
pueden descomponer el perxido de hidrgeno, la observacin de pocas burbujas
pequeas despus de 20 a 30 segundos no se considera un resultado positivo.
Prueba de la Oxidasa
a. Principio
La prueba de oxidasa determina la presencia de la enzima citocromo oxidasa, que
cataliza la transferencia de iones de compuestos donadores a receptores, generalmente
oxgeno. El substrato de esta prueba, para-fenilendiamina dihidroclorada, acta como
b. Reactivos
1. Para-fenilendiamina dihidroclorada 0.1 g
2. Agua destilada 10 mL
c. Procedimiento
1. Tomar una asada del crecimiento bacteriano con asa de plstico o de platino o
con la punta de una pipeta Pasteur y colocarla en un papel filtro previamente
impregnado con el reactivo (dejar secar el papel antes de depositar el inculo).
2. Usar como control positivo: Moraxella catarrhalis
3. Usar como control negativo: Escherichia coli
Microorganismo Incubacin
de referencia Temperatura( Resultado
Tiempo (h) C) Atmsfera
Bordetella pertussis 48-72 35-37 Aerbica Crecimiento
a. Almacenamiento y caducidad
Las placas ya preparadas son de color cereza brillante, se pueden guardar hasta por 30
das a temperatura de 2-8 C, lejos de la luz directa, no utilizar si hay seales de
deterioro, contaminacin o si la fecha de caducidad venci, proteger de la humedad y
el congelamiento.
Principio
La base de Agar Bordet Gengou, con la adicin de glicerol y sangre estril, se utiliza en
procedimientos cualitativos para la deteccin y el aislamiento de Bordetella pertussis a
partir de muestras clnicas como exudados o aspirados nasofarngeos, de las
secreciones bronquiales etc.
Frmula en g/L
Infusin de papa 4.5
Cloruro de Sodio 5.5
Agar 20.0
Agua destilada 850 mL
* Ajustada y/o complementada cuando sea necesario para cumplir con los criterios de
desempeo.
a. Control de calidad
Inocular las siguientes cepas de Bordetella en el medio de cultivo previamente
preparado, e incubar a 35 2 C durante 48-72 horas.
Nota: Se pueden usar dos frascos de Oxoid Bordetella Supplement en lugar de los 10
mL de la solucin de cefalexina.
Total 40.0
3. Control de calidad
Condiciones de incubacin
Incubacin
Microorganismo de
Tiempo Temperatura Resultado
referencia Atmsfera
(h) (C)
Staphylococcus aureus 18-24 35-37 Aerbica Crecimiento
4. Almacenamiento y caducidad
Las placas ya preparadas se pueden guardar hasta 7 das en refrigeracin (2-8
C) sin que las placas estn protegidas de la luz, y hasta 30 das protegiendo las
placas de la luz directa y en refrigeracin a 2-8 C. No utilizar las placas si hay
seales de deterioro, contaminacin o si la fecha de caducidad est vencida y
protegerlas de la humedad y congelacin.
Precauciones
Debe ser utilizado solamente por personal calificado y descartarlo como RPBI
cuando ya no se use. nicamente para uso diagnstico.
Frmula en g/L
Compuesto Cantidad (g/L)
Mezcla de peptonas 20.0
Lactosa 10.0
Bilis 5.0
Cloruro de sodio 5.0
Rojo neutro 0.05
Agar 13.5
Total 53.55
c. Control de calidad
Condiciones de incubacin
Microorganismo de Incubacin
referencia Tiempo (h) Temperatura (C) Atmsfera
Escherichia coli 24-48 35-37 Aerobia
d. Almacenamiento y caducidad
Las placas ya preparadas se pueden guardar a temperatura de 2-8 C, por hasta
30 das lejos de la luz directa. No utilizar si hay seales de deterioro,
contaminacin o si la fecha de caducidad se venci. Proteger de la humedad y el
congelamiento.
Precauciones
Este medio es para uso diagnstico, debe ser utilizado solamente por personal
calificado y una vez utilizado se desecha como RPBI.
Frmula en g/L
Compuesto Cantidad (g/L)
Agar agar 15.0
Azul de bromo timol 0.08
Citrato de sodio 2.0
Cloruro de sodio 5.0
Fosfato dihidrogenado de amonio 1.0
c. Control de calidad
Condiciones de incubacin
Microorganismo de Incubacin
referencia Tiempo (h) Temperatura (C) Atmsfera
Escherichia coli 24-48 35-37 Aerobia
Klebsiella pneumoniae 24-48 35-37 Aerobia
d. Almacenamiento y caducidad
Los tubos ya preparados se pueden almacenar hasta por 30 das a temperatura
de 2-8 C, lejos de la luz directa. No utilizar si hay seales de deterioro,
contaminacin o si la fecha de caducidad se ha vencido, proteger de la humedad
y el congelamiento.
Precauciones
Es para uso diagnstico, debe ser utilizado solamente por personal calificado y
una vez usado se desecha como RPBI.
Frmula en g/L
Extracto de carne 3.0
Caldo nutritivo
Peptona de casena 5.0
Agar agar 3.0
Agua destilada 1000 mL
Nitrato de potasio 1.0
pH final 7.60.1
c. Control de calidad
Positivo: Escherichia coli
Negativo: Acinetobacter bawmannii
Reactivos A y B
cido sulfanlico y alfa naftilamina para nitritos
Solucin A
cido sulfanlico 0.8 g
cido actico 5N 100 mL
Disolver con calentamiento suave
Precaucin
La alfa naftilamina es carcinognico. En NN, dimetil-1-naftilamina no se ha
comprobado lo anterior por lo cual, se debe trabajar con precaucin evitando formar
aerosoles, pipetear con la boca y el contacto con la piel.
8. Urea de Christensen
La urea es una diamida del cido carbnico. Todas las amidas se hidrolizan
fcilmente con liberacin de amonaco y dixido de carbono. La ureasa es una
enzima que poseen muchas especies de microorganismos que hidroliza la urea.
El amoniaco que se produce reacciona en solucin para formar carbonato de
amonio, produce una alcalinizacin y un aumento de pH. La fenolftalena que
contiene el medio vira de incolora a un pH menor de 8.1 y a color rosa a un pH
mayor de 8.1.
Los microorganismos que hidrolizan la urea rpidamente, dentro de dos o tres
horas, dan reacciones positivas que se manifiestan por un color rojo en todo el
medio (Proteus), los degradadores lentos inicialmente solo el pico de flauta y
despus el resto del medio (Klebsiella). Si el medio se conserva amarillo, indica
una prueba negativa.
c. Control de calidad
Control positive: Klebsiella
Control negativo: Escherichia coli
d. Almacenamiento y caducidad
Los tubos ya preparados se pueden guardar hasta por 30 das a temperatura de
2-8 C, lejos de la luz directa. No utilizar si hay seales de deterioro,
contaminacin o si la fecha de caducidad se venci, proteger de la humedad y el
congelamiento.
Precauciones
Es para uso diagnstico, debe ser utilizado solamente por personal calificado y
una vez usado se descarta como RPBI.
a. Procedimiento
c. Daos
1. Sensibilidad: por inhalacin, contacto con la piel o si es ingerido.
2. Irritacin: al contacto con los ojos, sistema respiratorio y piel.
Indicacin: En caso del contacto con los ojos, enjuague inmediatamente con agua
suficiente y consulte a su mdico.
Precaucin: Usar la ropa de proteccin conveniente.
b. Procedimiento
1. Transferir 25.5 g de agar carbn Oxoid a un matraz Erlenmeyer de 2.0 L y
aadir 890 mL de agua desionizada y esterilizada. Agregar una barra magntica
al matraz para agitar la solucin.
2. Colocar en una parrilla de agitacin con calentamiento para agitar soluciones y
ajustar la velocidad de agitacin para mantener el agar en suspensin. Cubrir el
matraz con papel de aluminio.
3. Calentar lentamente la solucin hasta llegar a ebullicin para disolver el agar.
Tener cuidado de no quemar la solucin.
4. Esterilizar el agar en autoclave por 15 minutos a 121 C y 15 lb de presin.
5. Colocar el matraz con el agar estril en un bao de agua para que se enfre hasta
50 C. Este paso es necesario para prevenir que se deteriore la sangre de caballo
y la cefalexina cuando se agregue a la solucin.
6. Una vez que el agar se ha enfriado, aadir aspticamente 100 mL de sangre de
caballo estril y desfibrinada o 150 mL de sangre estril desfibrinada de carnero.
Procedimiento
1. Tomar una asada de un cultivo puro de 24 horas de incubacin e inocularla
masivamente en una placa del medio de cultivo adecuado dependiendo del
microorganismo que se trate (ver cuadro 13); incubar de 35 a 37 C por 24 horas en
tensin parcial de (5-10%) de CO2.
2. Verificar la pureza de la cepa como se describi anteriormente.
3. Etiquetar un tubo de medio de transporte de Amies por cada cepa a conservar con la
clave o nmero de laboratorio y la fecha de conservacin.
4. Cosechar con un hisopo de rayn o dacrn estril todo el desarrollo bacteriano y
depositarlo hasta el fondo de un tubo que contiene medio de transporte de Amies
previamente etiquetado.
5. Sellar el tapn del tubo con Parafilm y colocarlo en una gradilla a temperatura
ambiente.
6. Realizar resiembras una vez por semana, o las veces que sea necesario segn el
nmero de pruebas que realicen semanalmente, en el medio apropiado y mantener
los microorganismos a temperatura ambiente sellando las placas o tubos con
Parafilm para evitar la desecacin del medio de cultivo.